MXPA05013544A - Reactivos y metodos para la formacion de enlaces bisulfuro y la glicosilacion de proteinas - Google Patents

Abstract

Se describen métodos y reactivos para la formación de enlaces bisulfuro, particularmente en proteínas, péptidos y aminoácidos. Los métodos y reactivos son particularmenteútiles para la glicosilación controlada de proteínas, péptidos y aminoácidos. Los métodos utilizan compuestos de tiosulfonato o selenenil sulfuro como reactivos o intermediarios. Algunas proteínas o péptidos que comprenden grupos selenenil sulfuro también forman parte de la invención.

Description

REACTIVOS Y MÉTODOS PARA LA FORMACIÓN DE ENLACES BlSULFURO Y LA GLICOSILACION DE PROTEÍNAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a reactivos y métodos para la formación de enlaces bisulfuro y/o para la modificación química de proteínas, en particular reactivos y métodos para su uso en la glicosilación de proteínas.

Antecedentes de la Invención La glicosilación co-traduccional y post-traduccional de proteínas, juega un papel vital en su comportamiento y estabilidad biológica (R. Dwek, Chem. Rev. , 96:683-720 (1996)). Por ejemplo, la glicosilación juega un papel importante en procesos biológicos esenciales tales como la señalización y regulación celular, desarrollo e inmunidad. El estudio de estos eventos se hace difícil por el hecho de que las glicoproteínas se presentan naturalmente como mezclas de las denominadas glicoformas que poseen la misma columna de péptidos pero difieren en la naturaleza y el sitio de glicosilación. Adicionalmente, ya que la glicosilación de proteínas no está bajo un control genético directo, la expresión de las glicoproteínas terapéuticas en cultivo de células de mamíferos conduce a mezclas heterogéneas de glicoformas. La capacidad de sintetizar glicoformas de glicoproteínas homogéneas por lo tanto no es solamente un prerequisito para propósitos precisos de investigación, sino es de creciente importancia cuando se preparan glicoproteínas terapéuticas que se comercializan actualmente como mezclas de multiglicoformas (por ejemplo, eritropoyetina e interleucina) . Otras modificaciones post-traduccionales de proteínas tales como la fosforilación y metilación también son de importancia. El control del grado y naturaleza de tal modificación de µna proteína, permite por lo tanto la posibilidad de investigar y controlar su comportamiento de sistemas biológicos (B.G. Davis, Science, Vol 303, p 480-482, 2004) . Se conocen diversos métodos para la glicosilación de proteínas incluyendo la síntesis química. La síntesis química de glicoproteínas ofrece ciertas ventajas, no menos la posibilidad de acceso a gliformas puras de glicoproteínas. Un método sintético conocido utiliza reactivos de carbohidratos selectivos de tiol, reactivos de glicosilmetano tiosulfonato (glico-MTS) . Tales reactivos de glicosilmetano tiosulfonato reaccionan con los grupos tiol en una proteína para introducir un residuo de glicosilo ligado a una proteína por medio de un enlace de bisulfuro (ver por ejemplo, WOOO/01712) . Sin embargo, los reactivos glico-MTS padecen de diversas desventajas, incluyendo ocasionalmente rendimientos moderados por reacción, dificultades en su preparación y problemas con la estabilidad bajo condiciones básicas en las cuales se utilizan a menudo. Por lo tanto hay una necesidad de reactivos adicionales para su uso" en la glicosilación de proteínas que se preparen fácilmente, estables y que den alto rendimiento de producto glicosilado de proteínas. Existe también una necesidad de métodos alternativos para la glicosilación de proteínas que den altos rendimientos del producto de proteínas glicosiladas, sean selectivos en el sitio y permitan la glicosilación en sitios sencillos y múltiples en un alto intervalo de proteínas diferentes. Se ha encontrado ahora sorprendentemente que ciertos reactivos de glicosilación que contienen azufre y selenio son relativamente directos para preparar, son generalmente más estables que los reactivos correspondientes de glico-MTS y se pueden usar en la glicosilación de un amplio intervalo de compuestos que contienen tiol incluyendo proteínas en alto rendimiento . En un primer aspecto, la invención proporciona por lo tanto un método de formación de enlaces bisulfuro (-S-S) , el método comprende reaccionar un compuesto orgánico que comprende al menos un grupo tiol (-SH) con un compuesto de fórmul I : R-S-X-R1 I en donde : X denota S02 o Se, preferiblemente Se; R denota una porción orgánica por ejemplo un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un "grupo alquinilo, o una porción de carbohidrato; y R1 denota un grupo alquilo opcionalmente substituido, un grupo fenilo opcionalmente substituido, un grupo piridilo opcionalmente substituido o un grupo naftilo opcionalmente substituido; con la condición de que cuando X denota S02 luego R1 no denota alquilo opcionalmente substituido. Preferiblemente, el compuesto orgánico que comprende al menos un grupo tiol es un aminoácido, péptido o proteína. En un segundo aspecto, la invención proporciona además un método para modificar químicamente una proteína, péptido o aminoácido que comprende al menos un grupo tiol (-SH) , el método comprende reaccionar la proteína, péptido o aminoácido con un compuesto de fórmula I como se define previamente. Todavía en un aspecto adicional, la invención proporciona compuestos de fórmula I en donde R denota una porción de carbohidrato. Cuando R denota un alquenilo o grupo alquenilo, hay la posibilidad de que el compuesto de bisulfuro formado por la reacción con el compuesto de fórmula I pueda ser además elaborada por reacción en el enlace C=C o C=C en el grupo R.

Se ha encontrado también sorprendentemente que una proteína que contiene tiol, puede ser convertida al selenenil sulfuro correspondiente, y que el carácter electrofílico del azufre en el enlace S-Se así creado/ lo hace susceptible a la substitución nucleofílíca por compuestos que contienen tilo, incluyendo carbohidratos . En un tercer aspecto, la invención por lo tanto proporciona un método de modificación química de una proteína, péptido o' aminoácido que comprende al menos un grupo tiol (-S-H) , el método comprende convertir el grupo tiol en un grupo selenenil sulfuro (-S-Se-R2) . El método por lo tanto permite la preparación de una proteína, péptido o aminoácido que comprende al menos un grupo selenenil sulfuro. Tales proteínas, péptidos y aminoácidos que comprenden al menos un grupo selenenil sulfuro forman una característica adicional de la invención. Particularmente preferidos son las proteínas o péptidos que comprende al menos un grupo selenenil sulfuro. Un grupo selenenil sulfuro en una proteína, péptido o aminoácido puede además reaccionar con un compuesto orgánico que comprende un grupo tiol para dar además proteínas, péptidos o aminoácidos químicamente modificados en los cuales el grupo orgánico se une a la proteína, péptido o aminoácido por medio de un enlace bisulfuro. Preferiblemente, el compuesto orgánico que contiene el grupo tiol es un compuesto de carbohidrato, suministrando así un método para la glicosilación de un aminoácido, péptido o proteína. Como se usa en la presente, "glicosilacíón" se refiere al proceso general de adición de una unidad de* glicosilo a otra porción por medio de un enlace covalente. En un cuarto aspecto, la invención por lo tanto proporciona un método de modificación química de una proteína, péptido o aminoácido que comprende al menos un grupo tiol (-S-H), el método comprende: (a) convertir el grupo tiol en un grupo selenenil sulfuro (-S-Se-R2) ; y (b) reaccionar el grupo selenenil sulfuro con un compuesto orgánico que contiene un grupo tiol . El (los) método (s) de acuerdo con el primero, segundo, tercero y cuarto aspectos de la invención se referirá de aquí en adelante como el primer método, el segundo método, el tercer método y el cuarto método respectivamente. A menos que se establezca de otra manera, todas las características y definiciones preferidas en la presente se refieren a todos estos métodos. Adicionalmente, la presente invención incluye algunas y todas las combinaciones posibles de algunas características referidas aquí, ya sea que tales combinaciones se describan o no específicamente.

Un Esquema de Reacción generalizado para la formación del enlace bisulfuro de acuerdo con el primero y segundo métodos se muestra en el Esquema de Reacción 1 : Esquema de Reacción 1 Preferiblemente, la porción orgánica mostrada en el Esquema de Reacción 1 es una proteína, péptido o aminoácido.

Un Esquema de Reacción generalizado para la introducción de un grupo selenenil sulfuro en una proteína, péptido o aminoácido de acuerdo con el tercero y cuarto métodos se muestra en el Esquema de Reacción 2 : Q = proteína, péptido o aminoácido -S— Se— ir Esquema de Reacción 2 El método de Esquema de Reacción 2 resulta en un enlace covalente de un grupo R2 a la proteína, péptido o aminoácido por medio de un enlace selenenil sulfuro (-S-Se-) . Tales proteínas, péptidos o aminoácidos forman una característica adicional de la invención. Las proteínas y péptidos que" comprenden un grupo de selenenilsulfuro pueden ser útiles en la determinación de una estructura de proteínas por medio de técnicas de difracción de rayos X. Actualmente, las técnicas de MAD (dispersión anómala de longitud de onda múltiple) involucra la conversión de algunos residuos de metionina en la proteína en la selenometionina. La comparación de los patrones de difracción de rayos X de las proteínas modificadas y no modificadas, luego permite una determinación de la estructura de la proteína sin modificar a llevarse a cabo. El método de la invención permite un acceso fácil y conveniente a proteínas o péptidos alternativos que contienen selenio que se pueden usar en tales técnicas. Los métodos de la invención proporcionan un método fácil para introducir un metal pesado en una estructura de proteínas, haciendo así la interpretación de los datos de difracción de rayos X más fácil. Las proteínas, péptidos o aminoácidos que contienen selenenilsulfuro se pueden además hacer reaccionar con compuestos orgánicos que contienen tiol de acuerdo con el cuarto método como se muestra en el esquema de reacción generalizado en el esquema de reacción 3 : -S— Se— BT Q= proteína, péptido o aminoácido xr? ,- porción ^ . orgánicg -s— s- porción orgánica Esquema de Reacción 3 El método del esquema de reacción 3, resulta en una ligadura covalente de la porción orgánica a la proteína, péptido o aminoácido por medio de un enlace bisulfuro (-S-S) . En este método, la proteína, péptido o aminoácido actúa como un electrófilo mientras que el compuesto orgánico que contiene tiol actúa como un nucleófilo. En contraste, las reacciones conocidas que utilizan los reactivos glíco-MTS involucran la reacción del grupo nucleofílico en la proteína, péptido o aminoácido con el reactivo electrofílico glico-MTS. El método de la invención, proporciona por lo tanto una estrategia complementaria a las estrategias de modificación de proteínas conocidas utilizando los reactivos glico-MTS. Como se usa en la presente, alquilo preferiblemente denota un grupo alquilo ramificado o de cadena lineal que contiene 1-10 átomos de carbono preferiblemente 1-6 átomos de carbono. Los grupos alquilo preferidos incluyen metilo y etilo. Como se usa en la presente, alquenilo denota preferiblemente un grupo hidrocarburo ramificado o de cadena lineal que comprende al menos un doble enlace carbono-carbono y contiene 2-20 átomos de carbono, preferiblemente 2-10 átomos de carbón y más preferiblemente 2-6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo preferidos incluyen - (CH2) CH=CH2, CH2CH2CH=CH2, preniK (CH3)2C=CHCH2-) y farnesil ( (CH3)2C=CH[CH2CH2C(CH3 =CH]2CH2-) . Como se usa en la presente, alquinilo preferiblemente denota un grupo hidrocarburo ramificado o de cadena recta que comprende al menos un triple enlace carbono-carbono y contiene 2-10 átomos de carbono, preferiblemente 2-6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo preferidos incluyen CH2C=CH y CH2CH2C=CH. Cuando R1 denota una porción opcionalmente substituida, los substituyentes adecuados incluyen algunos substituyentes que no interfieren con la formación del compuesto de fórmula I o con la reacción formadora de un enlace bisulfuro de acuerdo con el primero o segundo métodos, por ejemplo, -N02, -S03H, -C02H, - (CH2CH20)nH y - (CH2CH20) nMe en donde n denota 1-100, preferiblemente 1-50, más preferiblemente 1-20, y todavía más preferiblemente 1-10. El grupo R1 se puede sustituir independientemente por 1-5, y preferiblemente 1 ó 2 substituyentes . El grupo R1 también puede enlazarse opcionalmente a, o formar parte de, un soporte sólido por ejemplo una resina tal como una resina de poliestireno.

Un grupo R1 preferido es fenilo. Cuando el grupo R1 y los compuestos de fórmula I es fenilo u otro grupo aromático, luego existe la ventaja adicional de que se puede observar el avance de la reacción con el compuesto que contiene tiol de acuerdo con el primero y segundo métodos utilizando espectroscopia UV. Así por ejemplo, el cromóforo Ph~S02-despliega un máximo en el espectro UV a aproximadamente 265nm. La porción Ph-S02- está presente en el compuesto de fórmula I y el Ph-S02- que es el subproducto de la reacción formadora de enlace bisulfuro, pero los coeficientes de extinción asociados difieren suficientemente para el avance de la reacción a monitorearse usando UV. Similarmente, el tercero y cuarto método de la invención se pueden monitorear por espectroscopia UV cuando el grupo R2 es fenilo u otro grupo aromático. En los compuestos de fórmula I el grupo R puede ser cualquier porción orgánica, particularmente cualquier porción orgánica que sea adecuada para la ligadura a una proteína péptido o aminoácido. No hay una limitación particular sobre la naturaleza de R. Por ejemplo, el grupo -S-X- puede ser primario, secundario o terciario. R puede ser aromático o alifático. El grupo R puede estar opcionalmente substituido por ejemplo por substituyentes fosforilo o sulfonilo. Cuando X es Se, R, también puede ser una proteína, péptido o aminoácido, dando la posibilidad de ligar una proteína, péptido o aminoácido a otra proteína péptido o aminoácido por medio de una ligadura bisulfuro. Un grupo R preferido es farnesilo. La farnesilación es una modificación natural posterior "a la traducción asociada con muchas proteínas incluyendo la proteína oncogénica Ras. Los métodos de la invención por lo tanto permiten la preparación de proteínas. péptidos y aminoácidos farnesilados . También preferiblemente, R es una porción de carbohidrato, unida opcionalmente por medio de una ligadura a un grupo -S-X- . La ligadura puede contener de 1 a 10 átomos entre la porción carbohidrato y el grupo -S-X-. Por ejemplo, la ligadura puede ser un grupo alquileno (por ejemplo, grupo -(CH2)t- en donde t denota 1 a 10) , o un grupo alquenileno (por ejemplo, (un grupo - (CH2) CH=CH- ó CH2CH2CH=CH-) . Se prefieren los compuestos en los cuales el grupo -S-X- está en la posición anomérica de un residuo de sacárido o se une al carbón anomérico por medio de una ligadura. Las porciones adecuadas de carbohidratos incluyen monosacáridos, oligosacáridos, y polisacáridos e incluyen cualquier porción de carbohidratos que esté presente en glicoproteínas que se presentan naturalmente o en sistemas biológicos. Se prefieren derivados de glicosilo o de glicosido protegidos opcionalmente, por ejemplo, derivados de glucosilo, glucósido, galactosilo, o galactósido protegidos opcionalmente. Los grupos glicosilo y glicósido incluyen ambos grupos a y ß . Las porciones adecuadas de carbohidratos incluyen glucosa, galactosa, fucosa, GlcNAc, GalNAc, ácido siálico, y mañosa, y oligosacáridos o polisacáridos que comprenden al menos una glucosa, galactosa, fucosa, GlcNAc, GakBAc, ácido siálico y/o residuo de mañosa. Algunos grupos funcionales en la porción de carbohidratos pueden protegerse opcionalmente usando grupos protectores conocidos en el arte (ver por ejemplo, Greene et al, "Protecting groups in organic synthesis", 2nd Edition, Wiley, New York, 1991, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia) . Los grupos protectores adecuados para algunos grupos OH en la proción de carbohidratos incluyen acetilo (Ac) , bencilo (Bn) , pivolilo (piv) , sililo (por ejemplo, tert-butilo dimetilsililo (TBDMSSi) y tert-butildifenilsililo (TMDPSSi) ) , acétales, cetales, y metoximetilo (MOM) . Algunos grupos protectores se pueden retirar antes o después de la unión de la porción carbohidrato al aminoácido, péptido o proteína. Las porciones carbohidrato particularmente preferidas incluyen Glc(Ac)4ß-, Glc(Bn)4ß-, Gal(Ac)4ß~, Gal(Bn)4ß-, Glc(Ac)4a(l,4)Glc(Ac)3a(l,4)Glc(Ac)4ß-, ß-Glc, ß-Gal, a-Man, a-Man(Ac)4, Man (1, 6) Mana- , Man (1-6) Man (1-3) Mana, (Ac)4Man(l-6) (Ac)4Man(l-3) (AC)2Mana-, -Et-ß-Gal, -Et-ß-Glc, Et-a-Glc, -Et-a-Man, -Et-Lac, -ß-Glc(Ac)2, -ß-Glc(Ac)3, Et-a-Glc (Ac) 2, -Et-a-Glc (Ac) 3, -Et-a-Glc (Ac) 4, -Et-ß-Glc (Ac) 2, -Et-ß-Glc (Ac) 3, -Et-ß-Glc(Ac)4, -Et-a-Man(Ac)3, -Et-a-Man (Ac) 4, -Et-ß-Gal(Ac)3, -Et-ß-Gal (Ac)4, -Et-Lac (Ac) 5, -Et-Lac (Ac) 6, -Et-Lac (Ac)7, y sus equivalentes desprotegidos. Preferiblemente, algunas uniones de sacáridos que constituyen la porción de carbohidrato que se derivan de azúcares que se presentan naturalmente estarán cada una de la forma enantiomérica que se presentan naturalmente que puede ser la forma D (por ejemplo, D-glucosa o D-galactosa) , o la forma L (por ejemplo, L-ramnosa o L-fucosa) . Algunas ligaduras anoméricas pueden ser ligaduras a- o ß-. El compuesto que comprende un grupo tiol usado en el primero y segundo métodos puede ser cualquier compuesto orgánico que comprenda al menos un grupo tiol . El grupo tiol puede ser primario, secundario o terciario. El compuesto puede ser aromático o alifático. Si está presente más de un grupo tiol del compuesto, se formará potencialmente un enlace bisulfuro en cada uno de tales grupos tiol . Preferiblemente, el compuesto es un aminoácido, un péptido o una proteína. Como se usa en la presente, un péptido contiene un mínimo de dos residuos de aminoácidos ligados juntos por medio de un enlace amida. Cualquier aminoácido comprendido en la proteína, péptido o aminoácido es preferiblemente un a-aminoácido . Cualquier aminoácido puede estar en la forma D o L, preferiblemente la forma L. El aminoácido, péptido o proteína puede ser cualquier aminoácido, péptido o proteína que se presenta naturalmente que comprenda un grupo tiol por ejemplo, debido a la presencia de uno o más residuos de cisteína. Alternativamente, el aminoácido, péptido o proteína se puede preparar por modificación química de un aminoácido; péptido o proteína que contiene un precursor que no es de tiol. Alternativamente, un péptido o proteína que contiene tiol se puede preparar por medio de mutagénesis dirigida al sitio para introducir un residuo de cisteína. La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica conocida en el arte (ver por ejemplo, O00/011712 y J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Labortory Manual, 3rd Edition, Cold Springs Harbour Laboratory Press, 2001, las descripciones de la cual se incorporar en la presente como referencia) . Las proteínas preferidas incluyen enzimas, la selectividad de las cuales se puede modificar por una glicosilación controlada utilizando los métodos y reactivos de acuerdo con la invención y las proteínas terapéuticas. Otras proteínas preferidas incluyen albúminas de suero y otras proteínas de la sangre, hormonas, interferones, receptores, anticuerpos, interleucinas y eritropoyetina. Se ha encontrado que los compuestos de fórmula I son normalmente selectivos de tiol y así que la presencia de otros grupos funcionales en el compuesto orgánico que contiene tiol no interfiere normalmente con la reacción. Sin embargo, se pueden opcionalmente proteger algunos otros grupos funcionales usando algunos grupos protectores conocidos en el arte que sean estables bajo las condiciones de reacción. La reacción de formación del enlace bisulfuro en el primero o segundo método se lleva a cabo generalmente en presencia de una solución amortiguadora a un pH básico o neutral (alrededor de pH 7 alrededor de 9.5), con pH ligeramente básico se prefiere (alrededor de pH 8 a alrededor de 9) . Las soluciones amortiguadoras adecuadas incluyen HEPES, CHES, MES y Tris. Si el compuesto que contiene tiol es una proteína, péptido o aminoácido, el pH debe ser tal que poca o ninguna desnaturalización indeseable se presente durante la reacción. Similarmente, la temperatura de reacción se debe seleccionar para evitar cualquier daño importante a algunos compuestos sensibles a la temperatura. Por ejemplo, una reacción con una proteína o péptido se lleva a cabo preferiblemente a temperatura ambiente o inferior para evitar cualquier desnaturalización. Se pueden usar sistemas de solvente orgánico o acuoso, prefiriéndose los sistemas de solvente acuoso para la reacción de proteínas, aminoácidos o péptidos para asegurar su disolución. La reacción es generalmente bastante rápida por ejemplo, a menudo toma menos de 1 hora.

En general, se usara un exceso del compuesto de fórmula I por ejemplo, 10-20 equivalentes con base en el compuesto que contiene tiol. En contraste, la reacciones con los reactivos glico-MTS requieren a" menudo del uso de aproximadamente 30 equivalentes agregado al costo de los reactivos . Se ha encontrado que los compuestos de fórmula I en donde R denota una porción de carbohidratos, X denota S02 y R1 denota fenilo son generalmente más estables a condiciones básicas que los compuestos correspondientes glico-MTS. Cualquier compuesto en exceso o sin reaccionar de fórmula I se puede recuperar por lo tanto a partir de la reacción para usar nuevamente que es particularmente ventajoso cuando R denota una porción de carbohidrato ya que tales compuestos pueden ser relativamente costosos y/o que consumen tiempo en su preparación. Además, los compuestos de fenil tiosulfonato de la fórmula I son generalmente más baratos y fáciles de preparar que los compuestos correspondientes MTS . Los compuestos de fórmula I se pueden preparar por diversos métodos diferentes. Los compuestos en donde X denota S02 se pueden preparar al reaccionar un compuesto de fórmula II: M (SS02RX)k en donde: M denota un metal, por ejemplo Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Zn, o Al, preferiblemente Na o K; y k denota 1, 2 o 3; con un compuesto de fórmula III: R - L III en donde : R es como se define para los compuestos de fórmula I y L denota un grupo de partida. Cualquier grupo de partida L puede ser utilizado con tal de que el anión resultante L", no interfiera indebidamente de ninguna manera con la reacción, por ejemplo al reaccionar con el producto . Los grupos de partida preferidos L incluyen halo y sulfonatos tales como toluenesulfonato (tosilato) , metansulfonato (mesilato) y trifluorometaño sulfonato (triflato) , en particular cloro y bromo. Los compuestos de fórmula III están comercialmente disponibles o se pueden preparar usando métodos conocidos en el arte, por ejemplo métodos para la formación de halo-azúcares en general y 1-halo-azúcares en particular. Preferiblemente el compuesto de fórmula III es un haluro de glicosilo. Ejemplos de compuestos adecuados de fórmula III basados en glucosa y galactosa se muestran genéricamente a continuación: en donde : cada Rs independientemente denota H, una porción de sacárido, o un grupo protector adecuado por ejemplo Ac o Bn, preferiblemente cada R5 denota H; uno de R3 y R4 denota H y el otro denota OH, grupo O-protector o porción O-sacárido, preferiblemente H o porción O-sacárido; y t denota 1 a 10, preferiblemente 1 a 6, más preferiblemente 2 ó 3. La reacción se puede llevar a cabo en cualquier sistema de solventes en el cual el compuesto de fórmula III sea soluble. Preferiblemente, el compuesto de fórmula II también es al menos parcialmente soluble en el sistema de solventes.

Los solventes adecuados incluyen alcanoles tales como etanol y metanol, N,N-dimetilformamida (DMF) y acetonitrilo, siendo el acetonítrilo particularmente preferido.

Los compuestos de fórmula II se pueden preparar al reaccionar la sal de sulfinito correspondiente (fórmula VII) con azufre, como se muestra en el Esquema de Reacción 4: MÍSOaR1) + S "^ M(SS02R1) VII II Esquema de Reacción 4 Los compuestos de fórmula II que son cristalinos se prefieren por facilidad de purificación, especialmente a una gran escala. Las sales de sulfinito de fórmula VII están comercialmente disponibles (por ejemplo bencensulfinito de sodio) o se pueden preparar por métodos conocidos en el arte (ver por ejemplo JP 61205249, y M. Uchino et al, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1978,26 (6), 1837-45, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Por ejemplo, la sal de tiolato correspondiente R1S- puede prepararse por desprotonación del compuesto de tiol correspondiente RXSH usando una base adecuada, por ejemplo metil litio. La sal de tiolato luego puede oxidarse a la sal de sulfinito correspondiente usando un agente de oxidación adecuado, por ejemplo, 2- (fenilsulfonil) -3-feniloxaziridina (el "reactivo de Davis", Sandrinelli et al, Organic Letters (1999), 1 (8), 1177-1180, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia) . Alternativamente, los compuestos de fórmula I en los cuales X denota S02 se pueden preparar al reaccionar un bisulfuro de fórmula VIII con un anión de sulfinito R1S02~ en presencia de iones de plata, como se muestra en el Esquema de Reacción 5 : + R- S -S-R + RaS02~ R-S-SOa-R1 Ag VIII Esquema de Reacción 5 Los compuestos de bisulfuro de fórmula VIII están comercialmente disponibles o se pueden preparar usando métodos conocidos en el arte . Los compuestos de fórmula I en donde X denota Se pueden ser formados por reacción de un compuesto de fórmula V: R-SH V en donde R es como se definió para loscompuestos de fórmula I, con un compuesto de fórmula Vía o VIb: R1SeL2 RxSe (OH) 2 Vía VIb en donde R1 es como se definió para los compuestos de fórmula I, y L2 denota un grupo despartida, por ejemplo OH, Br, Cl, CN, o I, preferiblemente Br. La reacción se puede llevar a cabo en diclorometano anhidro y luego apagarse por la adición de trietilamina. Un compuesto preferido de fórmula IVa es PhSeBr y un compuesto preferido de fórmula VIb es PhSe(OH)2. Los compuestos de fórmula VI están comercialmente disponibles (e. g. PhSeBr, PhSeCl , PhSeCN, 2-nitrofenil selenocianato) o se pueden preparar por métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, MeSeBr se puede preparar de acuerdo con el método de Hope, Eric G. ; Kemmitt, Tim; y Levason, illiam, en el Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2: Physical Organic Chemistry (1912 -1999 ) (1987), (4), 487-90, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia . Los compuestos orgánicos que contienen al menos un grupo tiol, incluyendo compuestos de fórmula V, están comercialmente disponibles o se puede preparar usando métodos conocidos en el arte, por ejemplo métodos para la preparación de compuestos de tiol en general, y tio-azúcares en particular. Por ejemplo, los tio azúcares se puede preparar a partir de los halo azúcares correspondientes por tratamiento del halo azúcar con tiourea para resultar la sal de isotiouronio correspondiente (W. A. Bonner, J. E. Kahn, J. Am. Crew. Soc. 19517 73) seguido por hidrólisis moderada con metabisulfito de sodio para dar el tiol correspondiente. Si es necesario, los grupos protectores adecuados pueden usarse durante la síntesis de cualquiera de los tio-azúcares. Cuando R en el compuesto de fórmula V denota una porción de carbohidrato, el grupo tiol puede estar en cualquier posición en la porción. Preferiblemente, está en la posición anomérica de un sacárido o se une al carbón anomérico por medio de una ligadura. Ejemplos de compuestos adecuados de fórmula V basados en glucosa y galactosa se muestran genéricamente a continuación: en donde : cada R5 independientemente denota H, una porción de sacárido, o un grupo protector adecuado, por ejemplo Ac o Bn, preferiblemente cada R5 denota H; uno de R3 y R4 denota H y el otro denota OH, grupo 0-protector o porción O-sacárido, preferiblemente H o porción O-sacárido ; y r denota 2 a 10, preferiblemente 2 a 6, más preferiblemente 2 ó 3. Los compuestos de fórmula V son también adecuados para su uso como el compuesto que contiene tiol en el cuarto método de la invención. En la reacción de los compuestos de fórmula V con los compuestos de fórmula VI, algunos otros grupos funcionales en el compuesto de fórmula V puede estar desprotegido, o puede estar protegido por grupos protectores conocidos en el arte.

La conversión de al menos un grupo tiol en la proteína, péptido o aminoácido a un grupo de selenenilsulfuro de acuerdo con el tercero o cuarto método es altamente selectiva. Además, la reacción de un compuesto orgánico que contiene tiol con el grupo selenenilsulfuro es altamente selectiva del sitio. Por lo tanto no es normalmente necesario par algunos otros grupos funcionales en la proteína, péptido o aminoácido, o en el compuesto orgánico que contiene tiol protegerse mientras se practican los métodos de la invención. Esto puede ser altamente ventajoso ya que evita la necesidad de algunas etapas posteriores de desprotección para llevarse a cabo en el producto. Si la proteína, péptido o aminoácido comprende más de un grupo tiol, entonces cada uno de tales grupos tiol se convertirá potencialmente al grupo correspondiente de selenenilsulfuro. Cada uno de tales " grupos de selenenilsulfuro puede luego reaccionar potencialmente con un compuesto orgánico que contiene tiol, lo que conduce al enlace de compuesto orgánico por medio de una ligadura de bisulfuro a la proteína, péptido o aminoácido en sitios múltiples. Los métodos de la invención por lo tanto proporcionan un método conveniente para la modificación química de una proteína, péptido o aminoácido en sitios múltiples. En particular, los métodos de la invención permiten la glicosilación de una proteína, péptido o aminoácido en sitios múltiples. La conversión del grupo tiol en la proteína, péptido o aminoácido a un grupo selenenil sulfuro en el tercero o cuarto métodos se lleva a cabo convenientemente al reaccionar la proteína, péptido o aminoácido con un compuesto de fórmula Xa o Xb: R2-Se-L2 o R -Se(OH)2 Xa Xb en donde : L denota un grupo de partida, por ejemplo OH, Br, CN, Cl o I, preferiblemente Br; y R2 denota un grupo alquilo opcionalmente substituido, un grupo fenilo opcionalmente substituido, un grupo bencilo opcionalmente substituido, un grupo piridilo opcionalmente substituido o un grupo naftilo opcionalmente substituido. Un grupo R2 preferido es fenilo, un' compuesto preferido de fórmula Xa es PhSeBr y un compuesto preferido de fórmula Xb es PhSe(OH)2. Cuando R2 denota una porción opcionalmente substituida, los substituyentes adecuados incluyen algunos substituyentes que no interfieren con la reacción con la proteína, péptido o aminoácido que contiene tiol, y preferiblemente tampoco interfieren con ninguna reacción subsiguiente de la proteína péptido o aminoácido, por ejemplo reacción con un compuesto orgánico que contiene tiol. Los substituyentes adecuados incluyen -N02, -S03H, -C02H, - (CH2CH20)nH, y - (CH2CH20) nMe en donde n denota 1-100, preferiblemente 1-50, más preferiblemente 1-20, y todavía más preferiblemente 1-10. El grupo R2 puede ser independientemente substituido por 1-5, y preferiblemente 1 o 2, substituyentes. El grupo R2 puede también opcionalmente unirse a, o formar parte de, un soporte sólido. Por ejemplo, el compuesto de fórmula Xa o Xb puede ser derivado de una resina tal como una resina de poliestieno, como se muestra a continuación: Los compuestos de fórmula Xa y Xb están comercialmente disponibles o se pueden preparar por métodos conocidos en el arte, como se discutió previamente para los compuestos de fórmula Vía y VIb. Al menos un equivalente mol del compuesto de fórmula Xa o Xb por grupo tiol en la proteína, péptido o aminoácido se debe usar, para asegurar la conversión de cada grupo tiol tal al grupo selenenil sulfuro correspondiente. La reacción preferiblemente se lleva a cabo en un solvente acuoso (tal como una mezcla de agua y acetonitrilo) en presencia de una solución amortiguadora (por ejemplo MES, pH 9.5) . El pH y temperatura de la reacción se deben escoger de manera que se evite la desnaturalización indeseable de la proteína o- péptido. Preferiblemente, la reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente o inferior, a un pH ligeramente básico (por ejemplo, alrededor de un pH 8 a alrededor de un pH 9.5) .

El compuesto orgánico que contiene un grupo tiol puede ser cualquier compuesto orgánico que sea 'adecuado para enlazar a una proteína, péptido o aminoácido, y en el cual el átomo de azufre del grupo tiol * pueda actuar como un nucleófilo para reaccionar con un grupo selenenil sulfuro. No hay una limitación particular sobre la naturaleza del compuesto orgánico. Por ejemplo, el grupo tiol puede ser primario, secundario o terciario. El compuesto puede ser aromático o alifático. Por ejemplo, el compuesto puede ser un alquilo, alquenilo (por ejemplo, farnesilo) o alquinil tiol. Preferiblemente, el compuesto contiene solamente un grupo tiol . Las porciones orgánicas adecuadas para unión a una proteína, péptido o aminoácido incluyen cualquier grupo que puede ser útil en modificar las propiedades físicas o químicas de la proteína, péptido o aminoácido. Las porciones adecuadas incluyen etiquetas (por ejemplo etiquetas fluorescentes) o grupos para ayudar a la estabilidad, procesamiento o solubilidad de la proteína, péptido o aminoácido. El compuesto orgánico también puede ser una segunda proteína, péptido o aminoácido, dando la posibilidad de ligar una proteína, péptido o aminoácido a otra proteína, péptido o aminoácido por medio de un enlace de bisulfuro usando los métodos de la invención. Preferiblemente, el compuesto orgánico que contiene al menos un grupo tiol es un derivado de farnesilo, o es una porción de carbohidrato como se definió previamente, unida opcionalmente por medio de una ligadura al grupo tiol (-S-H) . La ligadura puede contener 1 a 10 átomos entre la porción carbohidrato y el grupo -SH. Por ejemplo, la ligadura puede ser un grupo alquileno (por ejemplo un grupo -(CH2)t- en donde t denota 1 a 10), o un grupo alquenileno (por ejemplo un grupo -(CH2)CH=CH- o grupo -CH2CH2CH=CH- ) . Se prefieren los compuestos en los cuales el grupo tiol está en la posición anomérica de un residuo de sacárido o se une al carbón anomérico por medio de una ligadura. Cualesquiera grupos funcionales en la porción carbohidrato pueden protegerse opcionalmente usando grupos protectores conocidos en el arte como se discutió previamente . Algunos grupos protectores pueden ser removidos antes o después de la unión de la porción carbohidrato al aminoácido, péptido o proteína. Preferiblemente, se retiran antes de la reacción con el compuesto de selenenil sulfuro, para eliminar la necesidad de algunas etapas de desprotección posteriores al enlace. Una ventaja adicional del método de glicosilación de la invención es que permite la ligadura de porciones carbohidrato no protegidas a un aminoácido, péptido o proteína. La reacción del grupo selenenil sulfuro con el compuesto orgánico que contiene un grupo tiol de acuerdo con el cuarto método (esto es, la reacción de formación del enlace bisulfuro) se lleva a cabo generalmente en presencia de una solución amortiguadora a un pH neutro o básico (por ejemplo alrededor de un pH 7 a alrededor de un pH 9.5), con pH ligeramente básicos como preferidos (por ejemplo, alrededor de pH 8 a alrededor de pH 9) . Las soluciones amortiguadoras adecuadas incluyen HEPES, CHES, MES y Tris. El pH debe ser tal que suceda poca o ninguna desnaturalización indeseable de la proteína o péptido durante la reacción. Similarmente, la temperatura de reacción debe seleccionarse para evitar cualquier daño importante a algunos compuestos sensibles a la temperatura. Por ejemplo, una reacción con una proteína o péptido preferiblemente se lleva a cabo a temperatura ambiente o abajo para evitar la desnaturalización. Los sistemas solventes orgánicos o acuosos pueden ser usados, siendo preferidos los sistemas solventes acuosos para asegurar la disolución de la proteína, aminoácido o péptido. Los sistemas solventes acuosos también se prefieren ya que permiten el uso de compuestos de carbnohidratos no protegidos como el compuesto orgánico. La reacción generalmente es bastante rápida, por ejemplo a menudo toma menos de 1 hora. En general, un exceso del compuesto orgánico que contiene al menos un grupo tiol se usará por ejemplo, 10-20 equivalentes con base en la proteína aminoácido o péptido. Sin embargo, tan poco como un equivalente mol se puede usar en algunos casos*. Los compuestos de carbohidratos pueden ser costosos y consumidores de tiempo para obtenerse en grandes cantidades. Por lo tanto, cuando el compuesto orgánico que contiene al menos un grupo tiol que es un compuesto de carbohidrato, es deseable por razones de economía utilizar el número mínimo posible de equivalentes. Los métodos del arte previo para la glicosilación de proteínas, requieren a menudo del uso de un exceso muy grande de compuesto de carbohidrato, por ejemplo, a menudo del orden de 1000 equivalentes (B. G. Davis, Curr. Opin. Biotechnool . 2003, 14, 379) . El método de la invención por lo tanto permite ventajosamente el uso de menores equivalentes del compuesto de glicosilo que los métodos del arte previo. La invención se ilustrará además por los siguientes ejemplos no limitativos.

Experimental General Se registraron los puntos de fusión en un bloque caliente Klofler y están sin corregir. Los espectros de resonancia magnética nuclear (dH) a 400 MHz se asignaron usando COSY. Los espectros de resonancia magnética nuclear de carbono (dH) se asignaron usando HMQC . Las multiplicidades se asignaron usando la secuencia DEPT. Todos los giros químicos se citan en la escala de d en ppm usando solvente residual como el estándar interno. Se registraron máximas de absorción de espectros infrarrojo en números de onda (cm"1) y se clasificaron como s (fuertes) y br (amplios) . Se registraron espectros de masas de baja resolución usando ionización de electrorocío (ESI) o usando ionización química (NH3,CI) como técnicas, como se establece. Se registraron los espectros de masas de alta resolución utilizando técnicas de ionización química (NH3,CI) o usando técnicas de ionización por electrorocío (NH3,CI) o usando ionización de campo (FI+) como se establece. Los valores M/z se reportan en Daltones y se siguen por su abundancia en porcentaje en paréntesis. Se midieron las rotaciones ópticas en un polarímetro con una longitud de trayectoria de 1 dm. Se dan las concentraciones en g/100 mL . Se llevó a cabo la cromatografía en capa delgada (c.c.d) en placas con respaldo de vidrio precubiertas Merck Kieselgel 60F254. La visualización de las placas se logró utilizando una lámpara UV (?max = 254 ó 365 nm) , y/o molibdato de amonio (5% en 2M H2 S04) o ácido sulfúrico (5% en EtOH) . Se llevó a cabo la cromatografía en columna instantánea usando sílice Sorbsil C60 40/60. Se destiló el diclorometano (DCM) a partir del hidruro de calcio. Se destiló la acetona a partir de sulfato de calcio anhidro. Los solventes "anhidros restantes se adquirieron de Fluka . "Gasolina" se refiere a la fracción de éter de petróleo que ebulle en el intervalo de 40-60°C. Espectrometría de Masas de Proteínas : La cromatografía líquida/espectrometría de masas se efectuó en un Mícromass LCT (ESI-TOF-MS) acoplado a un CLAR Waters Alliance 2790 usando una columna Phenomenex Júpiter C5 (150 x 2.1 mm x 5 µm) . El agua (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) , que contienen cada uno 0.5% de ácido fórmico, se usaron como la fase móvil a una relación de flujo de 0.2 ml min"1. El gradiente se programó como sigue: 95% A (3 min isocrático) hasta 100% B después de 16 min luego isocrático durante 2 min. La fuente de electrorocío del LCT se operó con un voltaje capilar de 3 kV y un voltaje de cono de 30 V. Se usó el nitrógeno como el nebulizador y gas de desolvatación a un flujo total de 400 1 hr"1. La mioglobina (corazón de caballo) se usó como un estándar de calibración y para probar la sensibilidad del sistema.

Ejemplo 1: Bromuro de (2,3,4, 6-Tetra-O-acetil-S-D-alucopiranosil) -1-isotiouronio Bromuro de 2, 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosilo (11.0 g, 26. 4 mmol) y tiourea (3.10 g, 41.9 mmol) se disolvieron en acetona anhidra (30 mL) bajo argón y se calentó hasta 60°C. Después de 20 min precipitó un sólido blanco. El precipitado se removió por filtración, el filtrado se regresó hasta reflujo, este proceso se repitió hasta que el sólido cesó de precipitar. Los cristales blancos descoloridos se combinaron y recristalizaron de acetona/gasolina para resultar el compuesto del título (11.4 g, 76%) como un sólido cristalino blanco p.f. 194-196°C [Lit. 191°C (H. Beyer, U. Schultz, Chem. Ber. 1954, 87, 78)] ; [a] D25 -5.6 (c, 1.0 en H20) [Lit. [a] D25 -7.6 (c, 1.4 en H20) (W.A. Bonner, J.E. Kahn, J Am Chem Soc, 1951, 73, 2241)]; dH (400 MHz, DMSO-dg) 1.97, 2.00, 2.02, 2.06 (12H, 4 x s, 4 x CH3) , 4.06-4.25 (3H, m, H-5, H-6, H-6'), 5.07-5.12 (2H, m, H-2, H-4), 5.31 (1H, at, J 9.5 Hz, H-3), 5.77 (1H, d, Jx,2 9.9 Hz, H-1), 9.13 (2H, brs, NH2) , 9.29 (2H, brs, NH2) .

Ejemplo 2: l-tio-2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosa Bromuro de (2 , 3 , , 6-Tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosil) -1-isotiouronio (9.0 g, 18.8 mmol) y Na2S205 (4.93 g, 26.0 mmol) se agregaron a una mezcla agitada de DCM (150 mL) y agua (70 mL) . La mezcla se calentó hasta reflujo bajo argón. Después de 1.5 h la reacción se enfrió hasta temperatura ambiente (RT) y las fases se separaron. La capa acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 50 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (50 mL) , se secaron sobre MgS0 , se filtraron y el solvente se removió in vacuo para resultar el compuesto del título (6.14 g, 90%) como un sólido blanco, p.f. 112-114°C [Lit. 113-114°C (R.J. Ferrier, R.H. Furneaux, Carbohydr. Res. 1977, 57, 73)]; [a] D24 +6.3 (c, 1.2 en CHC13) [Lit. [a]D20 +5.0 (c, 1.1 en CHC13) (R. J. Ferrer, R. H. Furneaux, Carbohydr. Res. 1977, 57, 73)]; dH (400 MHz, CDC13) 1.99, 2.00, 2.05, 2.06 (12H, 4 x s, 4 x CH3) , 2.30 (1H d, JlfSH 10.2 Hz, SH) , 3.71 (1H, ddd, J4,s 10.0 Hz, Js,6 2.4 Hz, J5,6< 4.7 Hz, H-5) , 4.10 (1H, dd, J6?6. 12.3 Hz, H-6) , 4.22 (1H, dd, H-6') , 4.53 (1H, at, J9,9 Hz, H-l) , 4.95 (1H, at, J9.5 Hz, H-2) , 5.08 (1H, at , J 9.8 Hz, H-4) , 5.17 (1H, at, J 9.4 Hz, H-3) .

Ejemplo 3: Bromuro de (2,3,4, 6-Tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosil) -1-isotiouronio Bromuro de 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-D-ß-galactopiranosil (5.4 g, 13.0 mmol) y tiourea (1.25 g, 16. 8 mmol) se disolvieron en acetona anhidra (40 mL) bajo argón y se calentó hasta 60 °C. Después de 1 h la reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente y el residuo resultante se filtró y recristalizó de acetona/gasolina para resultar el compuesto del título (4.6 g, 70%, 2 etapas) como un sólido cristalino blanco p.f. 134-137°C [Lit. 170°C de isopropanol (W.A. Bonner, J.E. Kahn, J Am Chem Soc 1951, 73, 2241)]; [a]D25 +40.4 (c, 1.0 en H20) [Lit. [a] D25 +16.0 (c, 1.6 en EtOH, (W.A. Bonner, J.E. Kahn, J Am Chem Soc 1951, 73, 2241)); dH (500 MHz, DMSO-de) 1.96, 2.02, 2.09, 2.15 (12H, 4 x s, 4 x CH3) 4.06-4.13 (2H, m, H-6, H-6'), 4.45 (1H, t, J 6.2 Hz, H-5) , 5.12 (1H, at , J9.9 Hz, H-2), 5.24 (1H, dd, J2,3 10.0 Hz, J3,4 3.6 Hz, H-3), 5.39 (1H, d, J3,4 3.1 Hz, H-4) , 5.71 (1H, d, Jlt2 10.2 Hz, H-l) , 9.12, 9.36 (2 x 2H, 2 x brs, 2 x NH2) .

Ejemplo 4: "l-Tio-2 , 3 , 4 , ß-tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosa Bromuro de (2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosil) -1-isotiouronio (4.4 g, 8.8 mmol) y Na2S205 (2.02 g, 10.6 mmol) se agregaron a una mezcla agitada de DCM (60 mL) y agua (30 mL) . La mezcla se calentó hasta reflujo bajo argón. Después de 2.5 h la reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y las fases se separaron. La capa acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 50 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (100 mL) , salmuera (100 mL) , se secó sobre MgS04, filtró y el solvente se removió in vacuo para resultar el compuesto del título (2.65 g, 81%) como un sólido blanco, p.f. 83-84°C [Lit. 86.5-88°C (J. Frgala, M. Cerny, J. Stanek, Collect. Czech. Chem. Commun. 1975, 40, 1411)]; [a]D24 +30.1 (c, 1.0 en CHC13) [Lit. [a] D19 +32.0 (c, 3.5 en CHC13) (J. Frgala, M. Cerny, J. Stanek, Collect. Czech. Chem. Commun. 1975, 40, 1411)]; dH (400 MHz, CDC13) 1.99, 2.06, 2.10, 2.17 (12H, 4 x s, 4 x CH3) , 2.38 (1H, d, JI.SH 10.3 Hz, SH) , 3.95 (1H, dt , J4/5 1.2 Hz, J5,s 6.6 Hz, J5_6< 6.6 Hz, H-5) , 4.09-4.14 (2H, m, H-6, H-6') , 4.53 (1H, at , J9.9 Hz, H-l) , 5.02 (1H, dd, J2,3 10.1, J3,4 3.4 Hz, H-3) , 5.19 (1H, at, J 10.0 Hz, H-2) , 5.44 (1H, at , dd, J3,4 3.7 Hz, J4,5 1.2 Hz, H-4) .

Ejemplo 5: Cloruro de (3 , 4 , 6-Tri-0-acetil-2-acetamido-2-desoxi-ß-D-glucopiranosil) -1-isotiouronio Cloruro de 3 , 4 , 6-Tri-0-acetil-2-acetamido-2-desoxi-a-D-glucopiranosoil (3.0 g, 8. 2 mmol) y tiourea (1. 21 g, 14.6 mmol) se disolvieron en acetona anhidra (25 mL) bajo argón y se calentó hasta 60° C. Después de 2h un sólido blanco se precipitó. El precipitado se removió por filtración, el filtrado se regresó hasta reflujo, este proceso se repitió hasta que el sólido cesó de precipitar. Los cristales blancos descoloridos se combinaron y recristalizaron de acetona/gasolina para resultar (el compuesto del título (2.19 g, 61%) como un sólido cristalino blanco p.f. 134-137°C [Lit. 179-181°C de EtOH (D. Horton, M. L. Wolfrom, J. Org. Chem. 1962, 27, 1794)]; [a]D2S -25.2 (c, 1.0 en H20) [Lit. [a] D25 -29.3 (c, 1.1 en MeOH) (D. Horton, M.L. Wolfrom, J. Org. Chem. 1962, 27, 1794)]; dH (400 MHz, DMS0-d6) 1.80 (3H, s, NHCOCH3), 1.94, 1.98, 2.08 (9H, 3 x s, 3 x CH3) , 4.05 (1H, dd, J5_6 2.4 Hz, J6?6' 12.4 Hz, H-6) , 4.17 (1H, dd, J5,5- 5.0 Hz, J6#6. 12.3 Hz, H-6'), 4.26 (1H, ddd, J4/5 10.2 Hz, J5,6 2.3 Hz, J5,6< 4.7 Hz, H-5) , 4.93 (1H, a , J 9 . 9 Hz, H-4), 5.12 (1H, at , J 9 . 9 Hz, H-3), 5.73 (1H, d, Ja,2 10.4 Hz, H-l) , 8.48 (1H, d, J4.7 Hz, NHAc) , 9.13 (2H, brs, NH2) , 9.29 (2H, brs, NH2) .

Ejemplo 6: l-tio-3 , 4 , 6-tri-0-acetil-2-acetamido-2-desoxi-ß-D-glucopiranosa Cloruro de (3,4, 6-Tri-0-acetil-2-acetamido-2-desoxi-ß-D-glucopiranosil) -1-isotiouronio (1.75 g, 39.8 mmol) y Na2S205 (0.91 g, 4.8 mmol) se agregaron a una mezcla agitada de DCM (30 mL) y agua (15 mL) . La mezcla se calentó hasta reflujo bajo argón. Después de 2 h la reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y las fases se separaron. La capa acuosa se volvió a extraer con DCM (2 x 50 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (50 mL) , salmuera (50 mL) , se secó sobre MgS04, filtraron y el solvente se removió in vacuo. La recristalización a partir de EtOAc/gasolina resultó en el compuesto del título (1.00 g, 68%) como un sólido blanco, p.f. 165-167°C [Lit. 167-168°C (W.M. zu Reckendorf, W.A. Bonner, J. Org. Chem. 1961, 26, 4596)]; [a] D25 -24.8 (c, 1.0 en CHC13) [Lit. [a] D2S -14.5 (c, 0.9 en CHC13) (W.M. zu Reckendorf, W.A. Bonner, J. Org. Chem. 1961, 26, 4596)]; dH (400 MHz, CDC13) 1.99, 2.03, 2.05, 2.10 (12H, 4 x s, 4 X CH3) , 2 . 57 ( 1H, d, J1 [ SH 9 . 2 Hz , SH) , 3 . 67 ( 1H, ddd, J4 / 5 9 . 7 Hz , J5 / 6 4.8 Hz, J5(6. 2.3 Hz, H-5) , 4.09-4.17 (2H, m, H-2, H-3) , 4.24 (1H dd, J5,s 4.8 Hz, J6,6< 12.4 Hz, H-6) , 4.59 (1H, at, J 9.8 Hz, H-l) , 5.06-5.15 (2H, m, H-4, H-6') , 5.72 (1H, d, J 9.2 Hz, NH) .

Ejemplo 7: 1-tio-ß-D-galactopiranosa l-Tio-2 ,3,4, 6-tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosa (3.00 g, 7.3 mmol) y NaOMe (40 mg, 0.73 mmol) se agregaron a una solución agitada de MeOH (40 mol) . Después de 2 h, la c.c.d (EtOAc/gasolina 1: 1) indicó la formación de un producto (Rf 0.0) con el consumo completo del material de partida (RfO. 5) . La reacción se neutralizó con la adición de Dowex® 50, resina de intercambio iónico, punto después del cual la reacción se filtró y se concentró in vacuo. La recristalización a partir de MeOH/EtOAc resultó en el compuesto del título (1.41 g, 98%) como un sólido cristalino blanco p.f. 100-102 °C; [a] D22 +47.6 (c, 1.0 en MeOH; dH (400 MHz, CD3OD) , 2.62 (1H, d, JljSH 8.3 Hz, SH) , 3.47-3.49 (2H, m, H-2, H-3), 3.57 (1H, at , J 5.9 Hz, H-5), 3.68 (1H, dd, J5,6 5.0 Hz, J6,6< 11.4 Hz, H-6) , 3.75 (1H, dd, J5?6. 6.9 Hz, J6,6-11.5 Hz, H-6'), 3.91 (1H, bs, H-4), 4.37 (1H, bd, J 7.7 Hz, H-l) ; dc (100 MHz, CD3OD) , 61.6 (t, C-6) , 69.6 (d, C-4) , 74.4, 74.8 (2 x d, C-2, C-3) , 80.1 (d, C-5) , 81.4 (d, C-1); m/z (ES-) 196 (100%, M-H+) ; m/z HRMS (ES-) calculado para C6H1205S (M-H+) 195.0327. encontrado 195.0323'.

Ejemplo 8: l-Tio-2-acetamido-2-desoxi-ß-D-glucopiranosa 3,4, 6-Tri-0-acetil-2-acetilamino-2-desoxi-ß-D-glucopiranosil tiol (400 mg, 0. 98 mmol) y metóxido de sodio (18 mg, 0.3 mmol) se agregaron a una solución agitada de metanol (10 ml) . Después de un periodo de 30 min, la c.c.d. (acetato de etilo) indicó la formación de un producto (Rf 0.0) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.2) . La reacción se neutralizó con la adición de Dowex®-50, resina de intercambio iónico punto después del cual la reacción se filtró y se concentró in vacuo. Recristalización de metanol/acetato de etilo resultó en el producto del título (230mg, 98%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 85-88°C [Lit. 86-88°C]18; [a]D22 -10.4 (c, 1.0 en MeOH) [Lit. [a]D25 +177.1 (c, 1.45 en CHCl3)]18; dp (400 MHz, MeOH), 2.00 (3H, s, CH3) , 3.27-3.37 (2H, m, H-4, H-5) , 3.42 (1H, a J 9.1 Hz, H-3) , 3.64-3.73 (2H, m, H2 , H-6) , 3.87 (1H, dd, J5,6 2.1 Hz, J6j6. 12.0 Hz, H-6'), 4.56 (1H, d, Jlf2 10.0 Hz, H-l), 8.11 (1H, bd, JNH,2 9.1 Hz, NH) .

Ejemplo 9: 1 , 2 , 3 , 6-tetra-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4- 0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -D-glucopiranosa Acetato de sodio (700 mg, 8. 3 mmol) se agregó a anhídrido acético (50 L) y se calentó hasta reflujo, punto en el cual maltotriosa (3.00 g, 6.0 mmol) se agregó y agitó vigorosamente. Después de 90 min, la c.c.d. (gasolina: acetato de etilo, 1:2) indicó la formación de un producto (Rf 0.3) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0). La reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente y diluyó con DCM (50 mL) y se dividió con agua (100 mL) . Las fases se separaron y la capa acuosa se volvió a extraer con DCM (2 x 50 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio (400 mL de una solución acuosa saturada) hasta que un pH 8 se obtuvo, salmuera (200 mL) , secado (MgS0) , se filtró y concentró in vacuo para resultar el producto del título como una mezcla de anómeros (a/ß, 2/11) como un sólido blanco amorfo; para el compuesto ß: dH (500 MHz, CDC13) 2.05, 2.07, 2.10, 2.14, 2.15, 2.19, 2.21, 2.27 (30H, 8 x s, 10 x OAc) , 3.92 (1H, ddd, J4,5 9.5 Hz, J5,6 2.9 Hz, J66 4.1 Hz, H-5a) , 3.95-4.01 (3H, m, H-4b, H-5b, H-5c) , 4.05 (1H, at, J 9.1 Hz, H-4a) , 4.09 (1H, dd, J5,6 2.5 Hz, J6fß. 12.7 Hz, H- 6c), 4.21 (1H, dd, J5,6 3.4 Hz, J6/6. 12.6 Hz, H-6b) , 4.29 (1H, dd, J5,6 3.4 Hz, J6,6. 12.4 Hz, H-6'c), 4.35 (1H, dd, J5,6 4.3 Hz, JSj6. 12.3 Hz, H-6a) , 4.48-4.52 (2H, m, H-6'a, H-6'b) , 4.78 (1H, dd, J?,2 4.1 Hz, J2 3 10.3 Hz, H-2b) , 4.90* (1H, dd, J12 4.1 Hz, J2<3 10.6 Hz, H-2c) , 5.01 (1H, dd, J1#2 8.0 Hz, J2,3 9.0 Hz, H-2a) , 5.11 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4c) , 5.31 (1H, d, J1¡2 3.9 Hz, H-lb) , 5.32-5.44 (3H, m, H-3a, H-3b, H-3c) , 5.45 (1H, d, J1/2 4.1 Hz, H-lc) , .79 (1H, d, Jx,2 8.2 Hz, H-la) ; para el compuesto a solamente los datos seleccionados: dH (500 MHz, CDC13) 2.08, 2.09, 2.12, 2.18, 2.21, 2.23, 2.26 (30H, 8 s, 10 x OAc), 5.07 (1H, at, J 9.9 Hz) , 6.28 (1H, d, J?,2 3.8 Hz, H-la). Las señales restantes se encuentran en las siguientes regiones de multiplete, 3.85-3.89, 3.90-3.98, 3.99-4.07, 4.15-4.18, 4.23-4.27, 4.29-4.32, 4.43-4.49, 4.74-4.76, 4.84-4.87, 4.98-4.94, 5.25-5.54; m/z (ES+) 984 (MNH4+, 30%) , 989 (MNa+, 100%) ; m/z HRMS (ES+) calculado para C4oH58027N(MNH4+) 984.3196 encontrado 984.3199.

Ejemplo 10: Bromuro de 2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-O-acetil-4-O- (2,3,4, -tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosilo 1,2,3 , 6-Tetra-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-O-acetil-4-0-(2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0~glucopiranosil) - -D-glucopiranosil) -D-glucopiranosa (200 mg, 0.21 mmol) se disolvió en DCM anhidro (5 mL) . A esto, bromuro de hidrógeno (33% en ácido acético, 2 mL) se agregó. La mezcla se dejó bajo argón a temperatura ambiente. Después de un periodo de 30 min, la c.c.d. (gasolina: acetato de etilo, 1: 2) indicó la formación de un producto (Rf 0.6) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3). La mezcla de reacción 'se dividió entre DCM (10 mL) y agua (10 L) , y la capa acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 10 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio (20 mL de una solución acuosa saturada) hasta que un pH 8 se obtuvo, salmuera (20 mL) , secado (MgS04) , se filtró y concentró in vacuo para resultar el producto del título (203 mg, 98%) como una espuma blanca; [a] D22 +152. 2 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 2.03, 2.05, 2.06, 2.08, 2.10, 2.13, 2.18, 2.21 (30H, 10 x C0CH3) , 3.93-3.99 (3H, m, H-4b, H-5a, H-5b) , 4.05- 4.10 (2H, m, H-4c, H-6a) , 4.20 (1H, dd, J5,6 1.8 HZ, J6?6. 12.2 Hz, H-6b) , 4.26-4.34 (2H, m, H-5c, H-6a?) , 4.35 (1H, dd, J5/6 3.5 Hz, J6,6' 12.7 Hz, H-6c) , 4.52 (1H, dd, J5,s 0.6 Hz, J6,S' 12.2 Hz, H-6b') , 4.57 (1H, dd, J5,6 2.1 Hz, J6/6< 12.4 Hz, H-6c") , 4.74 (1H, dd, J1>2 4.1 Hz, J2,3 9.9 Hz, H-2c) , 4.78 (1H, dd, J1(2 4.2 Hz, J2,3 10.2 Hz, H-2b) , 4.88 (1H, dd, J1|2 4.0 Hz, J2,3 10.5 Hz, H-2a) , 5.10 (1H, at , J 9.7 Hz, H-4a) , 5.32 (1H, d, J?,2 4.0 Hz, H-lb) , 5.39 (1H, at , J 9.9 Hz, H-3q) , 5.43-5.46 (1H, m, H-3b) , 5,45 (1H, d, Ji/2 3.8 Hz, H-la) , 5.64 (1H, at, J 9.5 Hz, H-3c) , 6.53 (1H, d, Jl?2 3.9 Hz, H-lc) .

Ejemplo 11: l-Tio-2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosa Bromuro de 2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-O- (2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosilo (2.10 g, 2.10 mmol) se disolvió en acetona anhidra (60 mL) . A esto, tiourea anhidra (315 mg, 4.2 mmol) se agregó y luego se calentó hasta reflujo bajo una atmósfera de argón. Después de un periodo de 6.5 h, la c.c.d. (gasolina: acetato de etilo, 1:2) indicó la formación de un producto (Rf 0. 0) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3) . La reacción se concentró in vacuo y tituló con DCM para remover los compuestos orgánicos de la tiourea en exceso. El filtrado se concentró in vacuo y el residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo/metanol, 9: 1) para resultar el intermediario bromuro de 2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosíl-1-ísotiouronio (1.14g, 50%) que se obtuvo sin caracterización. Este intermediario (100 mg, 0.09 mmol) y Na2S205 (22 mg, 0.11 mmol) se agregaron a una mezcla agitada de DCM (30 mL) y agua (15 mL) . La mezcla se calentó hasta reflujo bajo argón. Después de 2.5 h, la c . c . d. (gasolina : acetato de etilo, 1:2) indicó la formación de un producto (Rf 0.4) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0), punto en el cual la reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se separaron las fases. La capa acuosa se volvió a extraer con DCM (2 x 20 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 mL) , secado (MgS04) , filtró y el solvente se removió in vacuo para resultar el producto del título (74 mg, 84%) como un sólido blanco amorfo; [a] D22 +99.5 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.99, 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.05, 2.10, 2.15, 2.18 (30H, 9 x s, 10 x C0CH3) , 3.72-3.76 (1H, m, H-5a) , 3.90-4.00 (4H, m, H-4a, H-4b, H-5b, H-5c) , 4.05 (1H, dd, Js,6 2.2 Hz, J6_e. 12.3 Hz, H-6c) , 4.17 (1H, dd, J5,6 3.3 Hz, J6<6. 12.3 Hz, H-6b) , 4.25 (1H, dd, J5,6 3.6 Hz, J6 ¡ 6. 12.5 Hz, H-6c'), 4.30 (1H, Js>6 4.3 Hz, Je,6- 12.2 Hz, H-6c), 4.44 (1H, dd, J5/6 2.2 Hz, J6,6' 12.1 Hz, H-6al), 4.46 (1H, dd, J5/6 2.2 Hz, Js,6< 12.2 Hz, H-6b'), 4.59 (1H, d, J1/2 9.7 Hz, H-la), 4.74 (1H, dd, J1;2 4.1 Hz, J2,3 10.6 Hz , H-2b) , 4.80 (1H, at , J9.0 Hz, H-2a) , 4.85 (1H, dd, J?,2 4.1 Hz, J2,3 10.6 Hz, H-2c) , 5.07 (1H, at , J 9.9 Hz, H-4c) , 5.25 (1H, at , J 9.0 Hz, H-3a) , 5.26 (1H, d, Jlf2 4.1 Hz, H-lb) , 5.35 (1H, at , J 10.0 Hz, H-3b) , 5.37-5.41 (2H, m, H-lc, H-3c) .

Ejemplo 12: l-Tioacetil-2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-O-acetil-4-O- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosa Bromuro de 2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-O- (2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosilo (11.2 g, 11.6 mmol) y tioacetato de potasio (3.96 g, 34. 8 mmol) se suspendieron en THF anhidro (40 ml) y calentaron hasta reflujo bajo una atmósfera inerte de argón. Después de 14 h, la c.c.d. (gasolina/EtOAc, 1:2) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.45) . La reacción se diluyó con agua (80 mL) y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. Las fases se separaron y la fase acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 40 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaHC03 saturado (50 mL) hasta que un pH de 8 se obtuvo, salmuera (50 mL) , se secó sobre MgS04, se filtró y concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina/EtOAc, 1:4) para resultar el compuesto del título (8.08 g, 71%) como una espuma blanca; [a] D25 +86.4 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 2.01, 2.02, 2.05, 2.08, 2.11, 2.17 (27H, 6 x s, 9 x OAc), 2.40 (3H, s, SAc) , 3.88 (1H, ddd, J4,5 9.8 Hz, J5,6 4.0 Hz, JSf6. 2.7 Hz, H-5a) , 3.92-4.01 (4H, m, H- 4a, H-4b, H-5b, H-5c) , 4.07 (1H, dd, J5_5 2.4 Hz, J6,6. 12.3 Hz, H-6c) , 4.19 (1H, dd, J5,6 3.5 Hz, Js,6- 12.2 Hz, H-6b) , 4.27 (1H, dd, J5,6' 3.8 Hz, J6/S. 12.3 Hz, H-6'c) , 4.30 (1H, dd, J5,6 4.2 Hz, J6,6- 12.4 Hz, H-6a) , 4.46 (1H, dd, JB,S' 2.6 Hz, J6;6. 12.3 Hz, H-6'b) , 4.47 (1H, dd, J5,6' 2.2 Hz, Je,6< 12.2 Hz, H-6'a) , 4.76 (1H, dd, Jl?2 3.9 Hz, J2,3 10.0 Hz, H-2b) , 4.87 (1H, dd, Jl?2 3.8 Hz, J2,3 10.6 Hz, H-2c) , 5.99 (1H, dd, J1#2 10.3 Hz, J2,3 9.1 Hz, H-2a) , 5.08 (1H, at , J9.9 Hz, H-4c) , 5.27 (1H, d, J?,2 4.0 Hz, H-lb) , 5.31 (1H, d, Jlf2 10.0 Hz, H-la) , 5.33-5.43 (4H, m, H-lc, H-3a, H-3b, H-3c) ; dc (125 MHz, CDC13) 20.7, 20.8, 20.9, 21.0, 21.1 (5 X q, 10 x COCH3, SCOCH3) , 31.0 (q, SCOCH3) 61.9 (t, C-6c) , 62.7 (t, C-6b) , 63.3 (t, C-6a) , 68.4 (d, C-4c) , 69.0 (d, C-5b) , 69.5 (d, C-5c) , 69.8 (d, C-3c) , 70.3 (d, C-2a) , 70.5 (d, C-2c) , 70.9 (d, C-2a) , 72.1 (d, C-3b) , 73.0 (d, C-4b) , 74.1 (d, C-4a) , 76.6 (d, C-3a) , 76.9 (d, C-5a) , 80.2 (d, C-la) , 96.1 (d, C-lc) , 96.4 (d, C-lb) , 169.4, 169.6, 169.8, 169.9, 170.3, 170.5, 170.6 (7 x s, 10 X COCH3) , 196.0 (s, SCOCH3) ; m/z (ES+) 1000 (MNH4+, 60%), 1003 (MNa+, 100%) .

Ejemplo 13: 1-Tio-ß-D-maltotriosa l-tioacetil-2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -1-tio-ß-D-glucopiranosa (600 mg, 0.6 mmol) y NaOAc (18 mg, 0. 18 mmol) se agregaron a una solución agitada de MeOH (10 ml). Después de 10 min, la c.c.d. (EtOAc/MeOH, 9:1) indicó la formación de un producto (Rf 0 . 0) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.9) . La reacción se neutralizó con la adición de Dowex®-50, resina de intercambio iónico, punto después del cual la reacción se filtró y se concentró in vacuo para resultar el compuesto del título (305 mg, 98%) como un sólido amorfo; [a] D25 +123 (c, 1.0 en MeOH); dH (400 MHz, D20) , 3.15 (1H, at , J9.2 Hz, H-2a) , 3.26 (1H, at, J9.3 Hz) , 3.41-3.82 (16H, m, H-2b, H-2c, H-3a, H-3b, H-3c, H-4a, H-4b, H-4c, H-5a, H-5b, H-5c, H-6a, H-6b, H-6c, H-6'a, H-6'b, H-6'c), 4.42 (1H, d, J1/2 9.6 Hz, H-la), 5.23 (1H, d, J1/2 1.7 Hz, H-l), 5.24 (1H, d, J1/2 1.8 Hz, H-l); dc (100 MHz, D20) , 60.8, 70.0 (2 x t, C-6a, C-6b, C~6c) , 69.6, 71.5, 71.8, 72.1, 73.0, 73.2, 73.6, 76.0, 77.1, 77.6, 79.0 (11 x d, C-2a, C-2b, C-2c, C-3a, C-3b, C-3c, C-4a, C-4b, C-4c, C-5a, C-5b, C~5c) , 80.2 (d, C-la) , 99.8, 100.1 (2 x d, C-lb, C-lc) ; m/z (ES-) 519 (100%, M-H+) ; m/z HRMS (ES-) calculado para C18H31Oa5S (M-H+) 519.1384. encontrado 519.1389.

Ejemplo 14: 1 , 2 , 3 , 6-Tetra-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-O-acetil-4-O- (2,3, -tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -D-glucopiranosa Acetato de sodio (420 mg, 5.2 mmol) se agregó a anhídrido acético (30 mL) y se calentó hasta reflujo, punto en el cual maltoheptosa (1.00 g, 0. 86 mmol) se agregó y la reacción agitó vigorosamente. Después de 90 min la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 1:3) indicó la formación de un producto (Rf 0.3) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0) . La reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, diluyó con DCM (50 mL) y se dividió con agua" (100 mL) . Las fases se separaron y la capa acuosa se volvió a extraer con DCM (2 x 40 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio (200 mL de una solución acuosa saturada) hasta que un pH de 8 se obtuvo, salmuera (100 mL) , secado (MgS0 ), se filtró y concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo, 1:3) para resultar el producto del título como un sólido blanco amorfo como una mezcla de anómeros (a/ß, 15/85); dH (500 MHz, CDC13) 2.02, 2.03, 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.08, 2.10, 2.13, 2.19, 2.22, 2.24 (66H, 12 x s, 22 x OAc), 3.89-4.14 (13H, m, H-4a, H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5a, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4.25-4.34, 4.39 (1H, dd, J4.0 Hz, J 12.3 Hz), 4.52-4.56 (13H, m, H-6a, H-6a', H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e' , H-6f, H-6F, H-6d, H-6g' ) , 4.75-4.79 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2e, H-2, 4.90 (1H, dd, J1#2 3.7 Hz, J2,3 10.5 Hz, H-2g) , 5.00 (1H, at , J9.4 Hz, H-4g) , 5.31-5.45 (13H, m, H-3a, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g, H-lb, H-lc, H-ld, H-le, H-lf, H-lg) , 5.79 (0.85H, d, Jl?2 8.1 Hz, H-la ß) , 6.28 (0.15H, d, J1#2 4.0 Hz, H-laa) .

Ejemplo 15 : Bromuro de 2,3,6 -Tri- -0- •acetil-4 -0- - (2,3,6- -tri-0-acetil- 4-0- (2,3, 6-tri- -0- acetil- -4-0- (2 ,3, 6-tri- -0- acetil- -4-0- (2,3,6- tri- 0-acetil-4- -0- (2,3,6- -tri- 0- acetil-4- -0- (2,3,4, 6-tetra-0 i-acetil-a-O-glucopiranosil) - -a- D-glucopiranosil) - a-D-glucopiranc isil) -a-D-gluc :opiranosil) -a .-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosilo 1,2,3, 6-Tetra-0-acetil-4 -O- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri -0-acetil-4-O- (2,3, 6-tri-0-acetil-4 -O- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -D-glucopiranosa (100 mg, 0.05 mmol) se disolvió en DCM anhidro (5 mL) . A esto, bromuro de hidrógeno (33% en ácido acético, 0.5 mL) se agregó. La mezcla se dejó agitando bajo una atmósfera de argón a temperatura ambiente. Después de un periodo de 40 min, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 1:3) indicó la formación de un producto (Rf 0.7) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3). La mezcla de reacción se dividió entre DCM (10 mL) y agua (10 mL) , y la capa acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 10 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio (150 mL de una solución acuosa saturada) hasta que un pH de 7 se obtuvo, salmuera (20 mL) , secado (MgS04) , se filtró y concentró in vacuo para resultar el producto del título (98 mg, 96%) como una espuma blanca; [a] D22 +162.0 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 2.02, 2.03, 2.04, 2.06, 2.08, 2.10, 2.11, 2.14, 2.19, 2.23, 2.24, 2.25 (66H, 12 x s, 22 x OAc), 3.94-4.04 (12H, m, H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g) , 4.08 (1H, dd, J5 6 2.2 Hz, J6?6. 12.6 Hz, H-6) , 4.19-4.33, 4.53-4.60 (12H, m, H-5a, H-6b, H-6b', H-6c, H-6c' , H-6d, H-6d' , H-6e, H-6e' , H-6f, H-6f , H-6g, H-6g' ) , 4.12 (1H, at, J 9.5 Hz, H-4a) , 4.40 (1H, dd, J5,6 3.1 Hz, J6#6' 12.7 Hz, H-6a) , 4.64 (1H, dd, J5,6 2.3 Hz, J6>6- 12.5 Hz, H-6a , 4.74 (1H, dd, Jl?2 3.9 Hz, J2,3 9.7 Hz, H-2a) , 4.75-4.97 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2f ) , 4.89 (1H, d, Jl?2 4.0 Hz, J2,3 10.6 Hz, H-2g) , 5.11 (1H, at , J 9.9 Hz, H-4g) , 5.32-5.47 (12H, m, H-lb, H-lc, H-ld, H-le, H-lf, H-lg, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g) , 5.65 (1H, at , J 9.4 Hz, H-3a) , 6.54 (1H, d, J1/2 4.3 Hz, H-la) .

E j empl o 16 : 1- Tio-2 ,3,6 -tri -0- -acetil -4 -o- -(2. ,3,6 -tri- -0-acetil- 4-0- -(2 ,3,6- •tri -0- -acetil- -4-0- -(2 ,3, 6-tri- -0- ace stil- •4- -0- (2,3,6-tri- -0- acetil-4 -0- (2, 3,6- -tri- -0- acetil- •4- -0- (2, 3,4, 6- -tetra-0-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosa Bromuro de 2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0- (2 ,3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosilo (1.08 g, 0.5 mmol) y yoduro de tetrabutil amonio (19 mg, 0. 05 mmol) se disolvieron en acetona anhidra (50 mL) . A esto, tiourea seca (52 mg, 0.7 mmol) se agregó y la reacción luego se calentó hasta reflujo bajo una atmósfera de argón. Después de un periodo de 8h, la c.c.d. (gasolina: acetato de etilo, 1:4) indicó la formación de un producto menor (Rf 0.0) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.6) . La reacción se concentró in vacuo y tituló con DCM para remover los compuestos orgánicos de la tiourea en exceso. El filtrado se concentró in vacuo y él residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo/metanol, 9: 1) para resultar el intermediario bromuro de 2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-O-acetil-4-O- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosil-1-isotiouronio (212 mg, 19%) que se llevó hacia adelante sin caracterización. Este intermediario (210 mg, 0.09 mmol) y Na2S2Os (22 mg, 0.11 mmol) se agregaron a una mezcla agitada de DCM (10 mL) y agua (5 mL) . La mezcla se calentó hasta reflujo bajo argón. Después de 4.5 h, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 1:2) indicó la formación de un producto (Rf 0.2) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0), punto en el cual la reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se separaron las fases. La capa acuosa se volvió a extraer con DCM (2 x 10 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 mL) , secado (MgS04) , filtró y el solvente se removió in vacuo para resultar el producto del título (185 mg, 90%) como un sólido blanco amorfo; [a] D24 +128.1 (c, 1.0 en CHCl3) ; dH (500 MHz, CDC13) , 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.04, 2.05, 2.07, 2.08, 2.12, 2.17, 2.19, 2.21, 2.22, 2.23 (66H, 14 x s, 22 x COCH3) , 2.27 (1H, d, JÍ.SH 9.8 Hz, SH) , 3.76 (1H, dat, J4,? 9.7 Hz, J 3.5 Hz, H-5a) , 3.92-4.08 (12H, m, H-4a, H-4b, H-4c", H-4d, H-4e, H-4f, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g) , 4.17-4.36, 4.49-4.56 (12H, m, H-6b, H-6b', H-6c, H-6c' , H-6d, H-6d' , H-6e, H-6e' , H-6f, H- 6f , H-6g, H-6g') , 4.39 (1H, dd, J5,s 3.6 Hz, JS/6< 12.2 Hz, H- 6a) , 4.48 (1H, dd, J5/6 3.2 Hz, J6?6. 12.3 Hz, H-6a) , 4.62 (1H at, J 9.5 Hz, H-la) , 4.73-4.78 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2f ) , 4.82 (1H, at , J 9.5 Hz, H-2a) , 4.88 (1H, dd, J1<2 4.0 Hz, J2?3 10.4 Hz, H-2g) , 5.09 (1H, at , J9.9 Hz, H-4g) , 5.27 (1H, at, J9.1 Hz, H-3a) , 5.30-5.44 (12H, m, -Ib, H-lc, H-ld, H-le, H-lf , H-lg, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f , H-3g) .

Ejemplo 17: Preparación de SBLCysl56-S-SePh Se investigó la modificación de sitio sencillo usando un modelo de proteína que contiene cisteína, serina proteasa subtilisina de mutante de Bacillus lentus S156C (SBLCysl56) . SBLCysl56 (10 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). PhSeBr (5 mg, 0.02 mmol) se disolvió en acetonitrilo (200 µL) , del cual 150 µL (40 eq) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo . Después de 30 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman (G. L. Ellman, K.D. Courtney, V. Andrés, R.M.

Featherstone, Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88) . La reacción se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo por 30 min adicionales, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L durante 30 minutos) , para resultar SBLS156C-S-SePh; m/z (ES+) encontrado 26864 calculado 26870.

Ejemplo 18: Preparación de SSßGCys344Cys432- (S-SePh) 2 Se investigaron modificaciones de sitio múltiple, usando un mutante de la ß-glicosidasa termofílica de arquea Sulfolobus solf taricus que contiene dos residuos de cisteína (SSßG-Cys344Cys432) . SSßG-Cys344Cys432 (1 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). PhSeBr (2 mg, 0.02 mmol) se disolvió en acetonitrilo (200 µL) , del cual 20 µL (74 eq) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y eluyó con (70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0) para resultar SSßGCys344Cys432- (S-SePh)2; m/z (ES+) encontrado 57700 calculado 57697.

Ejemplo 19: Glicosilación Representativa de Proteínas con tioles de Azúcar y Reacción con otros tioles SBLCysl56-S-SePh (1 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 M CaCl2, pH 9.5) . El tiol de azúcar u otro tiol se disolvió en agua y agregó a la solución de proteínas en las cantidades establecidas (ver Tabla a continuación para equivalentes) y la mezcla se colocó en un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h la reacción se analizó por espectrometría de masas Conv. = conversión como se determina por ESI-EM 1 Activada por reacción con bromuro de fenil selenio para dar el compuesto correspondiente de la proteína -S-Se-Ph o proteína- (S-Se-Ph) 2 previo a la adición del tiol. 2 Reaccionó con PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) previo a la glicosilación para evitar la degradación de proteínas debida a la actividad proteolítica.

Los resultados en la tabla anterior demuestran que el método de la invención, proporciona un alto porcentaje de conversión a los productos deseados usando tan poco como un equivalente de compuesto de tiol. Además, los resultados demuestran que el método de la invención se puede usar para glicosilaciones de proteínas de sitios múltiples y sencillos. Los tres sitios de glicosilación en SBL-Cys 156 y SSßGCys344Cys432 se encontraron en estructuras de proteínas muy variables y ambientes con diferentes niveles de exposición, ilustrando la amplia aplicación del método de la invención.

Ejemplo 20: Glicosilación Representativa de proteínas de SBLCys 156 usando GlcGlcGlcGlcGlcGlcGlc-SH l-tio-2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0'-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-O-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosa (15 mg, 0.007 mmol) y metóxido de sodio (2 mg, 0.007 mmol) se agregaron a una solución agitada de MeOH (2 ml) . Después de 2 h, la c.c.d. (gasolina : EtOAc, 1:2) indicó la formación de un producto (Rf 0.0) con el consumo completo del material de partida (Rf 0. 2) . La reacción se neutralizó con la adición de Dowex®-50, resina de intercambio iónico, punto después del cual la reacción se filtró y concentró in vacuo. La 1-tio-ß-D-maltoheptaosa cruda se llevó en agua (5 mL) de la cual 300 µL (11 eq) se agregó a una solución de SBLCys 156-S-SePh (1 mg) en 500 µL de solución amortiguadora acuosa (70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) . La solución resultante se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó para resultar GlcGlcGLcGlcGlcGlcGlc-SBLCysl56; m/z (ES+) encontrado 27878 calculado 27881.

Ejemplo 21: Extensiones Enzi áticas de SBLCysl5ß-S-GlcNAc A. GIcNAc-SBLCysl56 (3 mg) se disolvió en 1 mL de agua amortiguadora acuosa. Fluoruro de Fenilmetilsulfonilo (PMSF) se agregó (50 µL de una solución de 100 mg/mL en acetonitrilo; exceso de 500 veces) . La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente por 30 minutos y se purificó sobre una columna de desalado Sephadex® G-25 (PD-10) . La pureza de la proteína desactivada se evaluó por espectrometría de masas ESI (encontrado: 27100, cale. 27104) . La fracción de proteínas se liofilizó y se volvió a disolver en 1.0 mL de solución amortiguadora de cacodilato de sodio 0.1 M (pH 7.52) . Se agregaron MnCl2.4H20 (3.2 mg ; 16 umol) y uridina difosfato-galactosa (UDP-galactosa, 2.3 mg; 3.4 µmol , Kyowa Hakko ; exceso de 30 veces) . ß-1 , 4-galactosiltransferasa recombinante de bovino de Spodoptera Frugiperda (EC 2.4.1.22, 100 mU, Calbiochem) se agregó y la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente por 40 min para resultar Galßl, 4GlcNAc-S-SBL-Cysl56 (ESI-MS, encontrado 27265, cale. 27266) .

B. GDP-fucosa (3mg, Kyowa Hakku) y a-1,3-fucosiltransferasa humana de Spodoptera Frugiperda (EC 2.4.1.65, 10 mU, Calbiochem) se agregaron y la mezcla de reacción se incubó durante la noche a temperatura ambiente para resultar Lewis X-S-SBL-Cys 156 (ESI-MS, encontrado 27410, cale. 27412) . Este Ejemplo demuestra que las proteínas glicosiladas preparadas de acuerdo con el método "de la invención, se puede modificar además por la reacción con enzimas adecuadas modificadoras de carbohidratos, por ejemplo glicosiltransferasas tales como ß-1, 4-galactosiltransferasa la cual selectivamente forma la ligadura Galßl, 4GlcNAc.

Ejemplo 22: Feniltiosulfonato de sodio (NaPTS) Bencensulfinato de sodio (10 g, 61 mmol) y azufre (1.95 g, 61 mmol) se disolvieron en piridina anhidra (60 mL) para dar una solución amarilla. La reacción se agitó bajo argón y después de 1 h dio una suspensión blanca. La reacción se filtró y lavó con éter dietílico anhidro. La recristalización de etanol anhidro resultó en el producto del título (10.5 g, 88%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 305-306°C [Lit. 287°C, Sato, R.; Goto, T.; Takikawa, Y.; Takizawa, S. Synthesis 1980, 615]; dH (200 MHz, DMS0-d6) 7.28-7.76 (5H, m, Ar-H) .

Ejemplo 23 2,3,4, 6-Tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosil feniltiosulfonato Bromuro de 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-a-D-glucopiranosilo (207 mg, 0.5 mmol) se disolvió en acetonitrilo anhidro (5 mL) . A esto se agregaron feniltiosulfonato de sodio (201 mg, 1 mmol) y bromuro de tetrabutilamonio (61 mg, 0. 05 mmol) . La mezcla resultante se agitó bajo argón a 70° C. Después de un periodo de 4.5 h, cromatografía en capa delgada (c.c.d.) (gasolina : acetato de etilo, 1:1) indicó la formación de un producto (Rf 0.5) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3) . La solución se concentró in vacuo. El sólido crudo se dividió entre diclorometano (DCM, 20 mL) y agua (20 mL) , y la capa acuosa se volvió a extraer con DCM (2 x 20 mL) . Los compuestos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (20 mL) , se secó sobre MgS04, se filtró y concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo, 1:1) para resultar el producto del título (225 mg, 88%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 129-130°C; [a] D25 +51.2 (c, 1.0 en CHCl3) ; umax (KBr) 1754 (s, C=0) , 1376 (s, C=C) cm"1; dH (400 MHz, C6D6) 1.68, 1.72, 1.73, 1.75 (4 x 3H, 4 x s, 4 x OAc), 3.09 (1H, ddd, J4 s 10.2 Hz, J5,6 2.4 Hz, Js<6. 4.2 Hz, H-5) , 3.83 (1H, dd, J5/6 2.4 Hz, J6,6< 12.7 Hz, H-6) , 4.08 (1H, dd, J5t6. 4.2 Hz, J6,6< 12.6 Hz, H-6') , 5.17-5.23 (2H, m, H-2, H-4) , 5.40 (1H, d, J?,2 10.2 Hz, H-l) , 5.44 (1H, at, J9.4 Hz, H-3) , 6.98-7.03 (3H, m, Ar-H) , 7.90-7.92 (2H, m, Ar-H) . La estructura del producto se confirmó además por difracción de rayos X de cristal sencillo.

Ejemplo 24 : 2,3,4, 6-Tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosil feniltiosulfonato Bromuro de 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-a-D-galactopiranosilo (2.0 g, 5 mmol) se disolvió en acetonitrilo anhidro (80 mL) . A esto se agregaron feniltiosulfonato de sodio (2.02 g, 10.3 mmol) y bromuro de tetrabutilamonio (160 mg, 0.5 mmol). La mezcla resultante se agitó bajo argón a 70° C. Después de un periodo de 5 h, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 1:1) indicó la formación de un producto (Rf 0.4) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.6) . La solución se concentró in vacuo. El aceite crudo se dividió entre DCM (50 mL) y agua (50 mL) , y la capa acuosa se volvió a extraer con DCM (2 x 50 mL) . Los compuestos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (100 mL) , secado (MgS0 ) , se filtró y concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina .-acetato de etilo, 2:1) para resultar el producto del título (1.7 g, 65%, 2 etapas) como un sólido cristalino blanco; p.f. 53-54°C; [a] D27 +24.2 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.98, 2.03, 2.06, 2.11 (4 x 3H, 4 x s, 4 x OAc), 3. 85 (1H, dd, J5/6 8.8 Hz, J6,s- 14.0 Hz, H-6) , 3.95-4.00 (2H, m, H-5, H-6) , 5.11 (1H, dd, J2,3 9.7 Hz, J3 4 3.3 Hz, H-3) , 5.23 (1H, at , J 10.3 Hz, H-2), 5.25 (1H, d, J?,2 10.2 Hz, H-l), 5.43 (1H, dd, J3,4 3.6 Hz, J4,5 1.0 Hz, H-4), 7.54-7.68 (3H, m, Ar-H), 7.93-7.97 (2H, m, Ar-H).

Ejemplo 25: 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-l-ditio-ß-D-glucopiranosil bisulfuro de etilo Método 1: 2, 3, 4, 6-Tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosil feniltiosulfonato (100 mg, 0.2 mmol) y trietilamina (0. 03 mL, 0.2 mmol) se disolvieron en DCM anhidro (10 mL) y agitaron a temperatura ambiente (RT) bajo una atmósfera de argón. Una solución de etano tiol (0. 016 mL, 0.2 mmol) en DCM anhidro (10 mL) se agregó lentamente gota a gota por medio de una bomba de jeringa durante un periodo de 30 min. Después de un periodo de 40 min, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 1:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.5) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina: acetato de etilo, 1:1) para resultar el producto del título (70 mg, 82%) como un áólido cristalino blanco; p.f. 95-96°C [Lit. 100-102°C, (Davis, B.G.; Ward, S.J.; Rendle, P.M. Chem. Commun. 2001, 189)]; [a]D22-164.9 (c, 0.2 en CHC13) [Lit. [a] D24 -178.0 (c, 1.0 en MeOH) (Davis, B.G.; Ward, S.J.; Rendle, P.M. Chem. Commun. 2001, 189)]; dH (400 MHz, CDC13) 1.30 (1H, t, J 7.4 Hz, CH3) , 2.00, 2.02, 2.03, 2.06 (4 x 3H, 4 X s,4 x CH3) , 2.79 (2H, dq, JCH3-H 7.5 Hz, JHH 2.7 Ho) , 3.73 (1H, ddd, J4,5 10.2 Hz, J5,6 2.5 Hz, J5?6. 4.8 Hz, H-5) , 4.14 (1H, dd, J5,6 2.4 Hz, J6#s. 12.4 Hz, H-6) , 4.22 (1H, dd, J5,6' 4.7 Hz, J6?6. 12.4 Hz, H-6') , 4.52 (1H, d, J1/2 9.8 Hz, H-l) , 5.10 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4) , 5.21-5.26 (2H, m, H-2, H-3) .

Método 2: Fenil 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-l-selenilsulfuro- D-ß-glucopiranósido (75 mg, 0.15 mmol) y trietilamina (30 µL, 0.15 mmol) se disolvieron en DCM recientemente destilado (10 mL) . La solución se agitó a RT bajo una atmósfera de argón.

Una solución de etanotiol (11 µL, 0.15 mmol) en DCM anhidro (10 mL) se agregó gota a gota sobre 2.5 h. Después de 3 h, la c.c.d. (gasolina: EtOAc, 1:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.5) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.5). La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina: EtOAc, 5:3) para resultar el producto del título (50 mg, 82%) como un sólido cristalino blanco.

Ejemplo 26: Bisulfuro de 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-l-ditio-ß-D-galactopiranosilo de etilo Método 1: 2,3,4, 6-Tetra-O-acetil-a-D-galactopiranosilfeniltiosulfonato (100 mg, 0.2 mmol) y trietilamina (0.03 mL, 0.2 mmol) se disolvieron en DCM anhidro (10 L) y se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Una solución de etanotiol (0.016 mL, 0.2 mmol) en DCM anhidro (10 mL) se agregó lentamente gota a gota por medio de una bomba de jeringa durante un periodo de 30 min. Después de un periodo de 40 min, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 1:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina: acetato de etilo, 1:1) para resultar el producto del título (78 mg, 91%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 65-66°C; [a] D2S -52.1 (c, 1.4 en CHC13) ; ?ma? (KBr) 1746 (s, C=0) cm"1; dH (400 MHz, CDCl3) 1.30 (1H, t, J7.4 Hz, CH3) , 1.95, 2.01, 2.02, 2.13 (4 x 3H, 4 x s, 4 x CH3) , 2.79 (2H, dq, JCH3-H 7.2 Hz, JHH 1.7 Hz) , 3.94 (1H, td, J4/5 0.9 Hz, J5/S 6.3 Hz, J5,6- 7.0 Hz, H-5) , 4.06 (1H, dd, J5/6 6.3 Hz, J6f6. 11.3 Hz, H-6) , 4.12 (1H, dd, Js,6- 7.0 Hz, J6,6- 11-2 Hz, H-6'.) , 4.51 (1H, d, Jlf2 9.9 Hz, H-l) , 5.05 (1H, dd, J2/3 9.9 Hz, J3,4 3.6 Hz , H-3) , 5.35-5.40 (2H, m, H-2, H-.4) .

Método 2: Fenil 2 , 3 , 4 , 6-tetra-0-acetil-l-selenilsulfuro-D-ß-galactopiranósido ('75 mg, 0.15 mmol) y trietilamina (30 µL, 0.15 mol) se disolvieron en DCM recientemente destilado (10 mL) . La solución se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Una solución de etanotiol (11 µL, 0.15 mmol) en DCM anhidro (10 mL) se agregó gota a gota durante 2.5 h. Después de 3 h, la c.c.d. (gasolina : EtOAc, 1:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.5) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.5) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : EtOAc, 5:3) para resultar el compuesto del título (50 mg, 82%) como un sólido cristalino blanco.

Ej emplo 27 : Bisulfuro de 3 , , 6-tri-0-acetil-2 -acetamido-2- desoxi-ß-D-glucopiranosilo de etilo - El 3 , 4 , 6-tri-0-acetil-2-acetamido-2~desoxi-l- selenilsulfuro-D-ß-glucopiranósido de fenilo (100 mg, 0.19 mmol) y trietilamina (0.03 mL, 0.19 mmol) se disolvieron en DCM recientemente destilado (20 mL) . La solución se agitó a 0 temperatura ambiente bajo argón. Una solución de etanotiol (0.014 mL, 0.19 mmol) en DCM anhidro (10 mL) se agregó gota a gota durante 1 h. Después de 3 h, la c.c.d. (EtOAc) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.5). La 5 solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (EtOAc) para resultar el producto del título. (75 mg, 93%) como un sólido blanco " amorfo, [a] D25 -70.1 (c, 2.5 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) , 1.32 (3H, d, JCH,CH3 6.6 Hz, CHCH3) , 1.96, 2.04, 2.05, 2.08 0 (12H,. 4 x s, 4 X COCH3) , 2.82 (2H, q, J 7.4 Hz, CH2) , 3.75 (1H, ddd, J4,5 10.1 Hz, J5,6 2.5 Hz, J5,6< 4.7 Hz, H-5) , 4.12- 4.25 (3H, m, H-2, H-6, H-6'), 4.73 (1H, at, J1/2 10.4 Hz, H- 1),;5.10 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4) , 5.30 (1H, at, J 9.9 Hz, H- 3), 5.70 (1H, d, JNH, 9.1 Hz, NH) . 5 Ejemplo 28: Ester de metilo de bis-N-Acetil-L-cisteinil-1-serina El éster de metilo de bis-L-cisteinil-1-serina (100 mg, 0.23 mmol) se disolvió en metanol (5 mL) . A esta solución se agregaron anhídrido acético (0.09 mL, 0.92 mmol) y piridina (0.075 mL, 0.92 mmol) . Después de un periodo de 15 min, la c.c.d. (acetato de etilo:metanol 5:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.5) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.1). La reacción se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo: metanol 5: 1) para resultar el producto del título (60 mg, 50%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 145-147°C; [a] D25 -33.4 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 2.04 (3H, s, C0CH3) , 2.96 (1H, dd, JCH,H 13.9 Hz, JCH.CXH 4.7 Hz, CysCHH) , 3.23 (1H, dd, JCH,H 13.9 Hz, JCH.aH 4.7 Hz, CysCHH), 3.76 (3H, s, OMe), 3.83 (1H, dd, JCH,H 11.4 Hz, JCH.CXH 4.1 Hz, SerCHH) , 3.93 (1H, dd, JCH,H 11.3 Hz, JCH.C_H 4.9 Hz, SerCHH), 4.55 (1H, t, J 4.3 Hz, aHSer) , 4.87 (1H, t, J4.8 , aHCys) .

Ejemplo 29: Ester de metilo de N-Acetil-1-cisteinil-L-serina El éster de metilo de bis-N-Acetil-L-cisteinil-L-serina (1.92 g, 3.96 mmol) se disolvió en cloroformo húmedo (100 mL) y metanol (10 mL) y se agitó. A esta solución agitada, la tributilfosfina (1.1 mL, 4.36 mmol) se agregó. Después de un periodo de 2 h, la c.c.d. (acetato de etilo : metanol 10:1) indicó la formación de un producto (Rf 0.6) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3) . La reacción se concentró in vacuo. Recristalización de acetato de etilo/metanol resultó en el producto del título (1.77 g, 93%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 127-128°C; [a] D25 -32.0 (c, 1.0 en MeOH); dH (400 MHz, CDC13) 1.89 (1H, at , J 8.9 Hz, SH) , 2.06 (3H, s, COCH3) , 2.84-2.93 (1H, m, CysCHH), 2.97-3.04 (1H, m, CysCHH), 3.79 (3H, s, OMe), 3.91 (1H, dd, JCH.H 11-4 Hz, JCH,aH 3.1 Hz, SerCHH), 4.03 (1H, dd, JCH.H 11.7 Hz, JCH,C.H 4.2 Hz, SerCHH), 4.61-4.65 (1H, m, aHSer) , 4.71-4.76 (1H, m, aHCys), 6.93 (1H, d, JaH,NH 7.8 Hz, NHCys) , 7.73 (1H, d, JaH.M 7.4 Hz, NHSer) .

Ejemplo 30: Ester de metilo de N-Acetil-L-cisteína (2,3,4,6-tetra-O-acetil-l-ditio-ß-D-glucopiranosil bisulfuro) -1-serina El feniltiosulfonato de 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosilo (61 mg, 0. 12 mmol) se disolvió en DCM anhidro (5 mL) y se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. A este éster de metilo de N-acetil-1-cisteína-1-serina (32 mg, 0.12 mmol) y trietilamina (0.015 mL, 0.11 mmol) en DCM anhidro (10 mL) y metanol anhidro (0.5 mL) se agregaron lentamente gota a gota por medio de una bomba de jeringa durante un periodo de 4 h. Después de un periodo de 5 h, la c.c.d. (acetato de etilo : metanol, 10:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.5) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3, (sistema c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 1:1)). La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo:metanol, 10:1) para resultar el producto del título (75 mg, 99%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 126-128°C [Lit. 125-128°C (Davis, B.G.; Ward, S.J.; Rendle, P.M. Chem.

Commun. 2001, 189)]; [a] D25 -47.9 (c, 0.7 en CHC13) [Lit. [a]D24 -178.0 (c, 1.0 en MeOH) (Davis, B.G.; Ward, S.J.; Rendle, P.M. Chem. Commun. 2001, 189)] ; dH (400 MHz, CDC13) 2.03, 2.06, 2.07, 2.11 (5 X 3H, 4 x s, 5 x CH3) , 3.05 (1H, dd, JCH.H 13.9 Hz, JCH,C.H 8.8 Hz, CysCHH) , 3.28 (1H, dd, JCH,H 13.9 Hz, JCH.CXH 4.8 Hz, CysCHH) , 3.80 (3H, s, OMe) , 3.89 (1H, ddd, J4,5 10.0 Hz, J5,6 2.2 Hz, J5,6< 4.1 Hz, H-5) , 3.94 (1H, dd, JCH.H 11.7 Hz, JCH.aH 3.0 Hz, SerCHH) , 4.00 (1H, dd, JCH,H 13.8 Hz, JCH.CXH 3.7 Hz, SerCHH) , 4.23 (1H, dd, J5,e 4.2 Hz, J6,6< 12.4 Hz, H-6) , 4.38 (1H, dd, JS?6. 2.0 Hz, J6,6< 12.5 Hz, H-6'), 4.62-4.65 (1H, m, aHSer) , 4.64 (1H, d, J1 2 9.5 Hz, H-l) , 4.90-4.94 (1H, m, aHCys) , 5.18 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4) , 5.24-5.29 (2H, m, H-2, H-3) , 6.94 (1H, d, JNH,H 7.9 Hz, NHAc) , 7.52 (1H, d, JNH,H 7.6 Hz, NHSer) .

Ejemplo 31: Éster de metilo de N-Acetil-L-cisteína (2,3,4,6-tetra-O-acetil-l-ditio-ß-D-galactopiranosil bisulfuro) -L-serina 2,3,4, 6-Tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosil feniltiosulfonato (50 mg, 0.1 mmol) se disolvió en DCM anhidro (5 mL) y se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Una solución de éster de metilo de N-acetil-1-cisteína-l-serina (31 mg, 0. 12 mmol) y trietilamina (0. 015 mL, 0. 1 Immol) en DCM anhidro (10 mL) y metanol anhidro (0.5 mL) se agregó lentamente gota a gota por medio de una bomba de jeringa durante un periodo de 2 h. Después de un periodo de 2 h, la c.c.d. (acetato de etilo : metanol , 10:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0. 5) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.5, sistema c.c.d. gasolina : acetato de etilo, 1:1) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo:metanol, 10:1) para resultar el producto del título (59 mg, 95%) como un sólido blanco amorfo; [a] D25 -48.8 (c, 0.25 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.99, 2.04, 2.05, 2.08, 2.18 (5 x 3H, 4 x s, 5 x CH3) , 2.80 (1H, bs, OH) , 2.99 (1H, dd, JCH,H 14.1 Hz, JCH.CXH 9.2 Hz, CysCHH) , 3.32, 3.77 (3H, s, OMe) , 3.92 (1H, dd, JCH.H 11-7 Hz, JCH,C.H 3.0 Hz, SerCHH) , 4.01 (1H, dd, JCH.H 11.7 Hz, JC , H 3.7 Hz, SerCHH) , 4.06-4.14 (2H, m, H-5, H-6) , 4.20-4.26 (1H, m, H-6') , 4.61-4.63 (1H, m, aHSer) , 4.65 (1H, d, J1;2 9.8 Hz, H-l) , 4.88-4.93 (1H, m, aHCys) , 5.11 (1H, dd, J2/3 9.8 Hz, J3/4 3.3 Hz, H-3) , 5.42-5.47 (2H, m, H-2, H-4) , 6.68 (1H, d, JNH,H 7.8 Hz, NHAc) , 7.28 (1H, d, JNH,H 8.1 Hz, NHSer) .

Ejemplo 32 : Bromuro de 2,3,4, 6-Tetra-O-bencil-a-D-glucopiranosilo La 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-bencil-D-glucopiranosa (1.0 g, 1.9 mmol) se disolvió en DCM anhidro (6 mL) y DMF anhidro (0. 4 mL) bajo argón. La solución resultante se agitó a 0°C.

Bromuro de oxalilo (4 mL, 2M en DCM, 24 mmol) se agregó gota a gota durante un periodo de 5 min. La reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de un periodo de 40 min, la c.c.d. (gasolina: acetato de etilo, 2: 1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.7) . La reacción se enfrió hasta 0°C y se apagó con agua fría en hielo (30 mL) agregada durante un periodo de 5 min. La reacción se dividió entre DCM (20 mL) y agua. La capa acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 20 mL) , las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (40 mL) , secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron in vacuo para resultar el producto del título (1.10 g, 95%) como un aceite amarillo crudo; dH (400 MHz, CDC13), 3.57 (1H, dd, J?/2 3.5 Hz, J2,3 9.1 Hz, H-2), 3.68 (1H, dd, J5,6 2.1 Hz, J6,6' 11-0 Hz, H-6) , 3.79-3.84 (2H, m, H-4, H-6'), 4.07 (1H, at, J 9.1 Hz, H-3), 4.07-4.11 (1H, m, H-5), 4.47-4.62 (3H, m, PhCH2) , 4.74 (s, 2H, PhCH2), 4.84-4.89 (2H, m, PhCH2) , 5.10 (1H, d, J 11.1 Hz, PhCH2) , 6.46 (1H, d, H-l), 7.15-7.41 (20H, m, Ar-H).

Ejemplo 33: Feniltiosulfonato de 2 3 , 4 , 6-Tetra-O-bencil-ß-D-glucopiranosilo El bromuro de 2 , 3 , 4, 6-Tetra-O-bencil-D-a-glucopiranosilo (3.55 g, 5.88 mmol) y feniltiosulfonato de sodio (4.76 g, 24.3 mmol) se disolvieron en 1,4 dioxano anhidro (90 mL) . La reacción se calentó hasta 70°C bajo argón. Después de 20 h, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 2:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.6) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.7) . La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y filtró, se lavó el precipitado con gasolina/acetato de etilo y el filtrado se concentró in vacuo . El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo, 4:1) para resultar feniltiosulfonato de 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-bencil-D-glucopiranosilo (3.18 g, 78%) como una goma blanca viscosa como una mezcla de compuestos a,ß en una relación de de 3:1. La recristalización selectiva de acetato de etilo/gasolina resultó en feniltiosulfonato de 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-bencil-ß-D-glucopiranosilo puro como un sólido cristalino blanco; p.f. 106-108°C; [a] D22 +21.4 (c, 0.35 en CHC13) ; dH (500 MHz, C6DS) 3.21 (1H, ddd, J4,s 9.7 Hz, J5,s 1.4 Hz, J5_6> 3.8 Hz, H-5) , 3.29 (1H, dd, J5,6 1.4 Hz, J6,s- 11.1 Hz, H-6) , 3.34 (1H, dd, Jl?2 9.9 Hz, J2/3 8.7 Hz, H-2) , 3.49 ' (1H, dd, J5/ß 3.8 Hz, J6,6-11.1 Hz, H-6') , 3.51 (1H, at, J9. Hz, H-3) , 3.60 (1H, at , J9.4 Hz, H-4) , 4.15, 4.25 (2H, ABq, J 12.1 Hz, PhCH2) , 4.52, 4.58 (2H, ABq, J 11.0 Hz, PhCH2) , 4.72, 4.76 (2H, ABq, J 11.3 Hz, PhCH2) , 4.78, 4.52 (2H, ABq, J 11.3 Hz, PhCH2) , 5.25 (1H, d, Jlf2 10.2 Hz, H-l) , 6.82-6.88 (3H, m, Ar-H) , 7.05-7.26 (20H, m, Ar-H) , 7.96-7.98 (2H, m, Ar-H) .

Ejemplo 34: Bisulfuro de 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-bencil-l-ditio-ß-D-glucopiranosilo de etilo El feniltiosulfonato de 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosilo (100 mg, 0.14 mmol) y trietilamina (0.02 mL, 0.14 mmol) se disolvieron en DCM anhidro (10 mL) y se agitaron a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. A este etano tiol (11 µL, 0.14 mmol) en DCM anhidro (10 mL) se agregó lentamente gota a gota por medio de una bomba de jeringa durante un periodo de 90 min. Después de un periodo de 90 min, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 6:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.2) . La_ solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina: acetato de etilo, 7:1) para resultar el producto del título (83 mg, 95%) como un aceite transparente; [a] D22 -164.9 (c, 0.2 en CHC13) [Lit. [a]D25 -80.0 (c, 3.0 en MeOH) (Davis, B.G.; Ward, S.J.; Rendle, P.M. Chem. Commun. 2001, 189)]; dH (400 MHz, CDC13) 1.22 (1H, t, J 7.3 Hz, CH3) , 2.68-2.86 (2H, m, CH2) , 3.24 (1H, ddd, J4,5 9.7 Hz, J5,6 3.3 Hz , J5, 6- 2.1 Hz, H-5) , 3.56-3.60 (2H, m, H-6, H-6'), 3.61 (1H, at , J 9.1 Hz, H-3), 3.72 (1H, at, J9.4 Hz, H-4), 3.89 (1H, at , J 9.1 Hz, H-2), 4.34 (1H, d, Jlj2 9.7 Hz, H-l), 4.37, 4.31 (2H, Abq, J 12.2 Hz, PhCH2) , 4.56, 4.83 (2H, Abq, J 11.3 Hz, PhCH2) , 4.77-4.83 (2H, m, PhCH2) , 4.90 (1H, d, J 11.1 Hz, PhCHH) , 4.97 (1H, d, J 10.7 Hz, PhCHH), 7.07-7.21 (14H, m, Ar-H), 7.25-7.27 (2H, m, Ar-H) , 7.29-7.31 (2H, m, Ar-H), 7.36-7.38 (2H, m, Ar-H).

Ejemplo 35: Ester de metilo de N-Acetil-L-cisteína (2,3,4,6-tetra-O-bencil-l-ditio-ß-D-glucopiranosil bisulfuro) -L-serina El feniltiosulfonato 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-bencil-ß-D-glucopiranosilo (50 mg, 0.07 mmol) se disolvió en DCM anhidro (5 mL) y se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de Ar. A este éster de metilo de N-acetil-L-cisteína-L-serina (19 mg, 0.07 mmol) y trietilamina (11 µL, 0.08 mmol) en DCM anhidro (5 mL) y metanol anhidro (0.5 mL) se agregó lentamente gota a gota por medio de una bomba de jeringa durante un periodo de 5 h. Después de un periodo de 5 h, la c.c.d. (acetato de etilo) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.6) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.9) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo) para resultar el producto del título (48 mg, 82%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 96-97°C; [a] D22 +56.2 (c, 1 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 2.03 (3H, s, COCH3), 3.19 (1H, dd, JCH,H 14.0 Hz , JCH,C.H 8.3 Hz, CysCHH), 3.37 (1H, dd, JCH.H 14.3 Hz , JCH,aH 6.0 Hz, CysCHH), 3.64 (1H, ddd, J4,5 9.6 Hz, J5,6 1.8 Hz, JS ? 6. 3.9 Hz, H-5), 3.72 (1H, at , J 9.2 Hz, H-4) , 3.77 (1H, at, J 8.8 Hz, H-3), 3.82 (3H, s, OMe), 3.84-3.90 (4H, m, SerCHH, H-2, H-6, H-6'), 3.96 (1H, dd, JCH.H 11.7 Hz, JCH, H 3.3 Hz, SerCHH), 4.50 (1H, d, J1>2 9.6 Hz, H-l), 4.51, 4.70 (2H, ABq, J 11.6 Hz, PhCH2) , 4.55, 4.85 (2H, ABq, J 10.4 Hz, PhCH2), 4.59-4.62 (1H, , aHSer) , 4.81, 4.87 (2H, ABq, J 10.6 Hz, PhCH2), 4.91, 4.97 (2H, ABq, J 11.0 Hz, PhCH2), 4.93-4.98 (1H, m,aHCys), 6.88 (1H, bd, JNH,H 7.9 Hz, NHAc) , 7.13-7.39 (20H, , 20 x Ar-C) , 7.48 (1H, d, JNH.H 7.6 Hz, NHSer) .

Ejemplo 36: Feniltiosulfonato dé 2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0-(2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosilo El bromuro de 2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosilo (200 mg, 0.21 mmol) se disolvió en acetonitrilo anhidro (10 mL) . A esto se agregaron bencenotiosulfonato de sodio (80 mg, 0.41 mmol) y yoduro de tetrabutil amonio (10 mg, 0.02 mmol) . La mezcla resultante se agitó bajo argón a 70 °C. Después de un periodo de 2 h, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo, 1:2) indicó la formación de un producto activo UV (Rf 0.5) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.5) . Punto en el cual la solución se dejó enfriar hasta temperatura ambiente y filtró, el filtrado se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo, 1:2) para resultar el producto del título (140 mg, 62%) como un sólido blanco amorfo; [a] D22 +69.9 (c, 0.75 en CHC13) ; dH (500 MHz, CDCl3) 2.03, 2.04, 2.06, 2.08, 2.11, 2.15, 2.19, (30H, 10 x COCH3) , 3.77-3.79 (1H, m, H-5a) , 3.94-4.00 (4H, m, H-4a, H-4c, H-5b, H-5c) , 4.10 (1H, dd, J5,6 2.1 Hz, J6,6< 12.4 Hz, H-6b) , 4.17-4.22 (3H, m, H-6a, H-6c, H-6a') , 4.29 (1H, dd, J5,6 3.3 Hz, J6,6- 12.6 Hz, H-6b') , 4.46 (1H, dd, J5,s 1.9 Hz, J6,6< 12.4 Hz, H-6C) , 4.76 (1H, dd, J1/2 3.9 Hz, J2,3 10.4 Hz, H-2a) , 4.89-4.94 (2H, m, H-2b, H-2c) , 5.12 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4b) , 5.28 (1H, d, J1/2 3.8 Hz, lila) , 5.34 (1H, d, J?,2 9.7 Hz, H-lc) , 5.37 (1H, at, J9-1 Hz, H-3c) , 5.41 (1H, at, J 10.1 Hz, H-3b) , 5.41-5.45 (2H, m, H-lb, H-3a) , 7.62-7.65 (2H, m, Ar-H) , 7.71 (1H, m, Ar-H) , 8.00-8.02 (2H, m, Ar-H) .

Ejemplo 37: 2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -1-ditio-ß-D-glucopiranosil bisulfuro de etilo El feniltiosulfonato 2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-0-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosilo (50 mg, 0.05 mmol) se disolvió en DCM anhidro (10 mL) y se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Una solución de trietilamina (7 µL, 0.05 mmol) y etano tiol (3 µL, 0.05 mmol) y DCM anhidro (10 mL) se agregó lentamente gota a gota por medio de una bomba de jeringa durante un periodo de Ih.

Después de un periodo de lh, la c.c.d. (gasolina: acetato de etilo, 1:2) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.6) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.4) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo, 1: 2) para resultar etilo el producto del título (43 mg, 93%) como un aceite transparente; [a]D24 +26.4 (c, 1.5 en CHC13) ; dH (500 MHz, CDC13) 1.30 (1H, t, J7.2 Hz, CH3) , 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.10, 2.14, 2.19, 2.20 (30H, 8 x s, 10 x C0CH3) , 2.75-2.87 (2H, m, CH2H3) , 3.77- 3.81 (1H, m, H-5a) , 3.96-4.00 (3H, m, H-4b, H-5c, H-5b) , 4.03 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4a) , 4.10 (1H, dd, J5/6 2.3 Hz, J6,6< 12.6 Hz, H-6c) , 4.22 (1H, dd, J5,6 2.9 Hz, JG 6< 12.4 Hz, H-6b) , 4.29 (1H, dd, J5,s 3.7 Hz, J6<6. 12.4 Hz, H-6'c) , 4.33 (1H, dd, J5,6 4.4 Hz, J6/6. 12.4 Hz, H-6a) , 4.51 (1H, dd, J5f6. 1.8 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6b' , 4.57 (1H, dd, J5,6 2.3 Hz, J6,6- 12.4 Hz, H-6a') , 4.58 (1H, d, J1#2 9.9 Hz, H-la) , 4.79 (1H, dd, J1/2 4.1 Hz, J2,3 10.6 Hz, H-2b) , 4.90 (1H, dd, Jl?2 4.3 Hz, J2/3 10.4 Hz, H-2c) , 5.11 (1H, at , J 9.9 Hz, H-4c) , 5.16 (1H, at, J 9.5 Hz, H-2a) , 5.33 (1H, d, J?,2 4.1 Hz, H-lb) , 5.37 (1H, at , J 8.9 Hz, H-3a) , 5.38-5.44 (2H, m, H-3b, H-3c) , 5.45 (1H, d, Jlj2 4.1 Hz, H-lc) .

Ejemplo 38: éster de metilo de N-butoxicarbonil-L-cisteína (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -1-ditio-ß-D-glucopiranosil bisulfuro) -L-serina El feniltiosulfonato de 2 , 3 , 6-Tri-0-acetil-4-0- (2 , 3 , 6-tri-O-acetil-4-O- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosilo (89 mg, 0.08 mmol) se disolvió en DCM anhidro (5 mL) y se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Una solución de trietilamina (0. 014 mL, 0.2 mmol) y éster de metilo de N-butoxicarbonil-1-cisteinil-l-serina (30 mg, 0.09 mmol) en DCM anhidro (10 L) y metanol anhidro (1 mL) se agregó lentamente gota a gota por medio de una bomba de jeringa durante un periodo de 3 h. Después de un periodo de 3 h, la c.c.d. (acetato de etilo) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.6) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.7). La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo) para resultar el producto del título (66 mg, 74%) como un sólido blanco amorfo; [a] D24 +25.1 (c, 1.25 en CHC13) ; dH (500 MHz, CDC13) 1.47 (9H, s, C(CH3)3), 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.06, 2.09, 2.15, 2.18 (30H, 8 x s, 10 x COCH3) , 2.75-2.87 (1H, m, CHHCys) , 3.16-3.19 (1H, m, CHHCys) , 3.27 (1H, t, J 6.2 Hz, OH) ,' 3.81 (3H, s, OMe) , 3.83-3.85 (1H, m, H-5a) , 3.92-4.01 (6H, m, H-4b, H-5b, H-5c, H6a, H-6a', CHHSer) , 4.06 (1H, dd, J5 6 2.2 Hz, J6/6< 12.2 Hz, H-6c) , 4.09-4.16 (2H, m, H-4a, H-6b) , 4.25 (1H, dd, J5,s 3.2 Hz, J6,e< 12.3 Hz, H-6c'), 4.39-4.41 (1H, , CHHSer), 4.52-4.67 (4H, m, aHSer, aHCys, H-la, H-6'b) , 4.74 (1H, dd, J1/2 4.1 Hz, J2/3 10.3 Hz, H-2b) , 4.85 (1H, dd, J1/2 3.7 Hz, J2/3 10.5 Hz, H-2c), 5.07 (1H, at, J 9.9 HZ, H-4c) , 5.11-5.13 (1H, m, H-2a) , 5.28 (1H, d, J?,2 4.1 Hz, H-lb) , 5.32-5.41 (4H, m, H-3a, H-3b, H-3c, NHCys) , 5.42 (1H, d, J1#2 3.9 Hz, H-lc) , 7.25 (1H, bd, JNH.CCH 6.7 Hz, NHSer) .

Ejemplo 39: Fenil 2 , 3 , 6-tri-0-acetil-l-selenilsulfuro-4-Q- (2,3, 6 -tri -O- acetil-4 -O- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranósido El 2,3, 6-Tri -O-acetil-4 -O- (2,3, 6 -tri-O-acetil-4-O- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosiltiol (500 mg, 0.53 mmol) y bromuro de fenil selenio (200 mg, 0.9 mmol) se disolvieron en DCM anhidro (20 ml) . Después de un periodo de 5 min, la c.c.d. (gasolina : acetato de etilo 1:2) indicó la formación de un producto import nte (Rf 0.4) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.3) . La reacción se apagó con la adición de tpetilamina (5 ml) y luego se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo 1:2) para resultar el producto del título (527 mg, 91%) como un sólido blanco descolorido amorfo; [a] D25 -2.6 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) , 1.99, 2.01, 2.02, 2.04, 2.06, 2.10, 2.14 (30H, 9 x s, 10 x OAc), 3.79 (1H, dat, J4,5 9.7 Hz, J3.4 Hz, H-5a) , 3.92 (3H, m, H4b, H-5b, H-5c), 4.00 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4a) , 4.05 (1H, dd, J5,6 2.8 Hz, J6,s- 12.8 Hz, H-6c) , 4.15 (1H, dd, J5,s 2.8 Hz, J6,6. 12.6 Hz, H-6b) , 4.22 (1H, dd, J5/6 3.7 Hz, J6<6. 12.0 Hz, H-6a) , 4.25 (1H, dd, J5,e 3.3 Hz, J6,6- 12.0 Hz , H-6C) , 4.42-4.46 (2H, m, H-6a' , H-6b' ) , 4.66 (1H, d, J1#2 9.9 Hz, H-la) , 4.74 (1H, dd, Jlf2 4.1 Hz, J2,3 10.4 Hz, H-2b) , 4.86 (1H, dd, J1¡2 4.1 Hz, J2/3 10.5 Hz, H-2c) , 5.06 (1H, at, J 9.6 Hz, H-4c) , 5.07 (1H, at, J 9.8 Hz, H-2a) , 5.27 (1H, d, J1/2 4.4 Hz, H-lb) , 5.32-5.39 (3H, m, H-3a, H-3b, H-3c) , 5.41 (1H, d, Jlf2 4.2 Hz, H-lc) , 7.27-7.29 (3H, m, Ar-H) , 7.64-7.67 (2H, m, Ar-H) .

Ejemplo 40: éster de metilo de bis-N-Butoxicarbonil-L-cisteinil-L-treonina La bis-N-butoxicarnoil-1-Cisteína (4.0 g, 9.1 mmol), éster de metilo de L-treonina (2.42 g, 18.2 mmol), DCC (3.75 g, 18. 2 mmol), HOBt (2.46 g, 18. 2 mmol) y DIPEA (2.5 ml, 18.2 mmol) se disolvió en DCM recientemente destilado (150 mL) . Después de un periodo de 18 h, la c.c.d. (acetato de etilo:metanol 9:1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.5) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0) . La reacción se diluyó con agua (2 x 100 ml) y las fases se dividieron. Los compuestos orgánicos se lavaron con salmuera (100 ml) , secado (MgS04) , filtraron y el solvente se removió in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo: metanol 9:1), y la recristalización de metanol/éter dietílico resultó en el producto del título (3.26 g, 60%) como un sólido cristalino blanco; p.f. 145-147°C; [a] D25 +20.8 (c, 1.0 en CHC13) ; dp (400 MHz, CDCl3) , 1.23 (3H, d, JCH.CHS 6.6 Hz, CHCH3) , 1.44 (9H, s, C(CH3)3), 3.11-3.12 (2H, m, CH2Cys) , 3.26 (1H, bs, OH), 3.75 (3H, s, OMe), 4.32-4.36 (1H, m, CHCH3) , 4.61 (dd, JNH.a r 8.7 Hz, JOH,CHCH3 2.15 Hz, CHCH3) , 4.63-4.68 (1H, m, aCys) , 5.75 (1H, d, JNH.OHCYS 7.4 Hz, NHCys) , 7.56 (1H, d, JNH.a hr 8.6 Hz, NHThr) .

Ejemplo 41: Ester de metilo de N-butoxicarbonil-L-cisteinil-L-treonina El éster de metilo de bis-N-butoxicarbonil-1-cisteinil-1-treonina (2.0 g, 3.3 mmol) se disolvió en cloroformo húmedo (100 mL) y metanol (10 mL) y se agitó. A esta solución agitada la tributilfosfina (1.0 mL, 4.0 mmol) se le agregó. Después de un periodo de 2 horas, la c. c. d. (acetato de etilo :metanol 9:1) indicó la formación de un producto (RfO.8) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.7) . La reacción se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo) para resultar el producto del título (2.0 g, 99%) como una espuma blanca; [a] D25 -11.4 (c, 1.0 en CHCl2) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.09 (3H, d, JCH.CHS 6.4 Hz, CH3), 1.34 (9H, s, C(CH3)3), 1.65 (1H, at , J 8.7 Hz, SH) , 2.72-2.89 (2H, m, CH2) , 3.66 (3H, s, OMe), 3.96 (1H, m, OH), 4.24-4.28 (1H, m, CHCH3) , 4.34-4.36 (1H, m, aHCys), 4.49 (1H, dd, JaHThr.NH 8.5 Hz, JaHthr,cHCH3 2.7 Hz , aHThr) , 5.82 (1H, d, JaHCys, H 8.2 Hz, NHCys) , 7.38 (1H, d, JaHthr,NH 8.5 Hz, NHThr) .

Ejemplo 42: éster de metilo de N-Butoxicarbonil-L-cisteína (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-l-ditio-ß-D-glucopiranosil disulfuro) -L-treonina El 2,3,4, 6-tetra-O-acetil-1- selenilsulfuro-D-ß-glucopiranósido de fenilo (130 mg, 0.25 mmol) y trietilamina (0.02 mL, 0. 18 mmol) se disolvieron en DCM recientemente destilado (10 mL) . La solución resultante se agitó a temperatura ambiente. Una solución de éster de metilo de N-butoxicarbonil-L-cisteína-L-treonina (30 mg, 0. 089 mmol) en metanol anhidro (4 mL) se agregó lentamente a la solución anterior. Después de un periodo de 10 minutos, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 1: 2) indicó la formación de un producto (Rf 0.2) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.5) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina: acetato de etilo, 1:2) para resultar el producto del título (32 mg, 51 %) como un sólido blanco amorfo; [a] D25 -81.2 (c, 0.25 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.28 (3H, d, JCHCHB 6.7 Hz, CHCH3) , 1.51 (9H, s, C(CH3)3), 2.06, 2.08, 2.10 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc) , 2.86 (1H, bs, OH) , 3.06 (1H, dd, JCHaH 8.8 Hz, JCHCH 13.4 Hz, CHHCys) , 3.31 (1H, dd, JCHaH 4.2 Hz, JCHCH 13.1 Hz, CHHCys) , 3.82 (3H, s, OCH3) , 3.87-3.89 (1H, m, H-5) , 4.32-4.38 (2H, m, H-6, H-6') , 4.39 (1H, dd, JCHCHS 6.4 Hz, JCHCCH 2.5 Hz, CHOH) , 4.60-4.65 (3H, m, H-l, aHThr, a HCys) , 5.20-5.32 (3H, m, H-2, H-3, H-4) , 5.42 (1H, d, JNHaH 8.0 Hz, NHCys) , 7.12 (1H, d, JNHaH 8.9 Hz, NHThr) .

Ejemplo 43: éster de metilo de N-butoxicarbonil-L-cisteín (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-l-ditio-ß-D-galactopiranosil disulfuro) -L-treonina El 2,3,4, 6- tetra- O-ac etil -1- se lenil sulf uro- D-ß-galactopiranósido de fenilo (140 mg, 0.27 mmol) y trietilamina (0.01 mL, 0.089 mmol) se disolvieron en DCM recientemente destilado (5 mL) . La solución resultante se agitó a temperatura ambiente. Una solución de éster de metilo de N-butoxicarbonil-L-cisteína-L-treonina (26 mg, 0.077 mmol) en DCM anhidro (5 mL) y metanol anhidro (4 mL) se agregó lentamente a la solución anterior. Después de un periodo de 10 minutos, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 1: 2) indicó la formación de un producto (Rf0.2) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.6) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina: acetato de etilo, 1: 2) para resultar el producto del título (49 mg, 93%) como un sólido blanco amorfo; [a] D25 -81.2 (c, 0.25 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.24 (3H, d, JCH.CHS 6.4 Hz, CH3) , 1.46 (9H, s, C(CH3)3), 2.01, 2.06, 2.08, 2.20 (12H, 4 x s, 4 x OAc) , 2.79 (1H, bd, JCH.OH 4.1 Hz, OH) , 2.99 (1H, dd, JaH,cH2 8.8 Hz, JC ,H 13.9 Hz, CHHCys) , 3.32-3.35 (1H, m, CHHCys) , 3.76 (3H, s, OCH3) , 4.04 (1H, at, J6.2 Hz, H-5) , 4.10-4.16 (1H, m, H-6) , 4.19 (1H, dd, J5,6< 6.1 Hz, J6,e- 10.8 Hz, H-6') , 4.36-4.46 (1H, m, CHOH) , 4.56 (1H, dd, JaHthr,cH 2.4 Hz, JaH,NH 8.9 Hz, aHThr) , 4.57-4.64 (1H, m, aHCys) , 4.65 (1H, d, J1/2 9.0 Hz, H-l) , 5.13 (1H, dd, J2/3 9-8 Hz, J2,3 9.8 Hz, H-3) , 5.31 (1H, d, JaHCys. H 8.3 Hz, NHCys) , 5.47 (1H, d, J3,4 3.2 Hz, H-4) , 5.52 (1H, at , J9.6 Hz, H-2) , 6.91 (1H, d, JaHT r.NH 9-0 Hz, NHThr) .

Ejemplo 44: éster de metilo de butoxicarbonil-L-cisteinil- (S- 3,4, 6-tri-0-acetil-2-acetamido-2-desoxi-ß-D-glucopiranosil disulfuro) -L-treonina El producto del título se obtuvo (55mg, 88%) como un sólido blanco amorfo por un método análogo al del Ejemplo 43 utilizando 3 , 4 , 6-tri-0-acetil-2-acetamido-2-desoxi-l-selenilsulfuro-D-ß- fenilo como material de partida. [a]D25-47.1 (c, 0.1 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.17 (3H, d, JCH,CH3 6.4 Hz, CH3) , 1.49 (9H, S, C(CH3)3) , 1.91, 2.00, 2.02, 2.07 (12H, 4 x s, 4 x, C0CH3) , 2.99 (1H, dd, JCHH,CHH 13.5 Hz, JaH,CH 10.0 Hz, CHH) , 3.38 (1H, dd, JaH,cH 4.8 Hz, JCHH.CHH 13.5 Hz, CHH) 3.88-3.91 (1H, m, H-5) , 4.16-4.32 (4H, m, H-2, H-6, H-6' , CHCH3) , 4.45 (1H, d, JaH,cH 2.7 Hz, aHThr) , 4.54 (1H, dd, JaH,cHH 9.7 Hz, JaH,cHH 4.7 Hz, aHCys) , 4.79 (1H, d, J?,2 10.1 Hz, H-l) , 5.06 (1H, at, J 9.7 Hz, H-4) , 5.28 (1H, at, J 9.7 Hz, H-3) .

Ejemplo 45: éster de metilo de N-Butoxicarbonil-L-cisteinil-(S-1-ß-D-glucopiranosil disulfuro) -L-treonina 1-selenilsulfuro-D-ß-glucopiranósido de fenilo (70 mg, 0.2 mmol) y trietilamina (0.01 mL, 0.1 mmol) se disolvieron en MeOH (8 mL) . La solución resultante se agitó a temperatura ambiente. Una solución de éster de metilo N-butoxicarbonil-L-cisteína-L-treonina (22 mg, 0.07 mmol) en MeOH (5 mL) se agregó lentamente a la solución anterior. Después de 10 min, la c. c. d. (EtOAc : MeOH, 9: 1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (EtOAc : MeOH, 9: 1) para resultar el compuesto del título (32 mg, 91%) como un sólido blanco amorfo; [a]D25-139.5 (c, 0.6 en MeOH); dH (500 MHz, CD3OD) 1.19 (3H, d, JCH.O? 6-2 Hz, CHCH3) , 1.49 (9H, s, C(CH3)3), 2.93 (1H, dd, JCHCH,CHH 13.5 Hz, JCH,OH 9.5 Hz, CH2Cys) , 3.32-3.46 (4H, m, H-3, H-4, H-5, CHH), 3.60-3.63 (1H, m, H-2) , 3.73-3.77 (1H, m, H-6) , 3.78 (3H, s, OMe), 3.92-3.94 (1H, m, H-6'), 4.31-4.36 (1H, m, CHCH3) , 4.39 (1H, d, Jl, 2 9.3 Hz, H-l), 4.48 (1H, d, JOH.CH 2.9 Hz, aHThr) , 4.69 (1H, dd, JOH.CHH 9.0 Hz, JaH.cHH 5.2 Hz, aHCys) .

Ejemplo 46: éster de metilo de N-butoxicarbonil-L-cisteinil-(S-2-acetamino-2-desoxi-l-ß-D-glucopiranosil " disulfuro) -L-treonina El compuesto del título (32 mg, 91 %) se obtuvo como un sólido blanco amorfo por un método análogo al del Ejemplo 45 utilizando 2 -acetamido-2-desoxi-l-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido de fenilo como material de partida. [a] D25 +6.21 (c, 0.45 en MeOH) ; dH (500 MHz, CD3OD) 1.19 (3H, d, JCHCHS 6.7 Hz , CHCH3) , 1.49 (9H, s, C(CH3)3) , 1.99 (3H, s, COCH3) , 2.97 (1H, dd, JCH,H 13.8 Hz, JCHKH 9-6 Hz , CHHCys) , 3.31-3.33 (1H, m, CHH) , 3.38-3.41 (1H, m, H-5) , 3.45 (1H, at , J9.3 Hz , H-4) , 3.54 (1H, dd, J2,3 8.6 Hz, J3,4 9.8' Hz, H-3) , 3.76-3.77 (1H, m, H-6) , 3.78 (3H, s, OMe) , 3.79-4.01 (2H, m, H-2, H-6') , 4.33 (1H, dq, JCHCHS 6.3 Hz, JCHC.H 3.0 Hz, CHCH3) , 4.48 (1H, d, JaH,cH 3.0 Hz, aHThr) , 4.59 (1H, d, J1#2 10.3 Hz, H-l) , 4.63-4.67 (1H, m, aHcys) .

Ejemplo 47: fenil-1-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido El 1-tio-ß-D-glucopiranósido (200 mg, 0.9 mmol) y bromuro de fenilselenenilo (230 mg, 1.0 mmol) se agregaron a 1,4-dioxano anhidro (5 mL) se agita bajo una atmósfera de argón. Después de un periodo de 1 minuto, la c. c. d. (acetato de etilo) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.2) . La reacción se apagó con la adición de trietilamina (2 mL) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo: metanol, 9:1) para resultar el producto del título (165 mg, 57%) como un sólido amorfo blanco opaco; [a]D22 +56.2 (c, 1 en CHC13) ; dH (400 MHz, MeOD) 3.31-3.33 (2H, m, H-3, H-5) , 3.39-3.45 (2H, , H-2, H-4), 3.62 (1H, dd, J5/6 5.3 Hz, J6,6- 12.1 Hz, H-6) , 3.83 (1H, dd, J5,6' 1-9 Hz, J6,6-12.2 Hz, H-6) , 4.47 (1H, d, Jlf2 9.4 Hz, H-l), 7.27-7.34 (3H, m, Ar-H), 7.75-7.78 (2H, m, Ar-H).

Ejemplo 48: 1-selenilsulfuro-ß-D-galactopiranósido de fenilo El compuesto del título se obtuvo (193mg, 20%) como un sólido amorfo blanco opaco por un método análogo al del Ejemplo 47 utilizando 1-tio-ß-D-galactopiranósido como material de partida. [a] D25 -111.4 (c, 1 en MeOH); dH (400 MHz, CD3OD) 3.52 (1H, dd, J2,3 9.4 Hz, J3/4 3.3 Hz, H-3), 3.56 (1H, at, J4,5 0.9 Hz, J6.5 Hz, H-5) , 3.67-3.69 (2H, d, J 6.0 Hz, H-6, H-6'), 3.74 (1H, at , J 9.3 Hz, H-2), 3.91 (1H, dd, J3/4 3.2 Hz, J4,5 0.7 Hz, H-4), 4.45 (1H, d, J1#2 9.7 Hz, H-l), 7.27-7.30 (3H, m, Ar-H), 7.76-7.79 (2H, m, Ar-H).

Ejemplo 49: 2,3,4, 6-tetra-O-acetil-l-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido de fenilo La l-tio-2 , 3,4, 6-tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosa (200 mg, 0.6 mmol) y PhSeBr (150 mg, 0.6 mmol) se agregaron a DCM recientemente destilado (5 mL) y se agitó bajo argón a temperatura ambiente. Después de 5 min, la c. c. d. (gasolina: EtOAc, 1: 1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.5) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.4) . La reacción se apagó con la adición de trietilamina (2 mL) y se agitó durante 5 min. El residuo se dividió entre DCM (5 mL) y agua (10 mL) y la fase acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 5 mL) . Los orgánicos combinados se lavaron con salmuera (10 mL) , se secaron sobre MgS0 , se filtraron y el solvente se removió in vacuo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : EtOAc, 2: 1) para resultar el producto del título (260 mg, 93%) como un sólido cristalino amarillo p.f. 111-112°C; [a] D25 -250.1 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 2.02, 2.01, 2.00 (12H, 4 x s, 4 x CH3) , 3.75 (1H, ddd, J4;S 9.9 Hz, J5,6 2.4 Hz, J5,6. 4.6 Hz, H-5) , 4.08 (1H, dd, J5,6 2.6 Hz, J6?6. 12.4 Hz, H-6) , 4.16 (1H, dd, J5;6. 4.5 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6'), 4.62 (1H, d, J1/2 9.8 Hz, H-l) .12 (1H, at, J 9.7 Hz, H-4) , 5.20-5.30 (2H, m, H-2, H-3) , 7.25-7.28 (3H, m, Ar-H), 7.67-7.70 (2H, m, Ar-H).

Ejemplo 50: 2,3,4, 6-tetra-O-acetil-l-selenilsulfuro-ß-D-galactopiranósido de fenilo El compuesto del título (402 mg, 95%) se obtuvo como un sólido cristalino amarillo usando un método análogo al del Ejemplo 49 utilizando l-tio-2 , 3 , 4 , 6- tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosa como material de partida. p.f. 123-125°C; [a]D25 -172.4 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.99, 2.02, 2.16 (12H, 4 x s, 4 x CH3 ) , 3.94-4.03 (3H, m, H-5, H-6, H-6') , 4.64 (1H, d, J1/2 10.1 Hz, H-l) , 5.04 (1H, dd, J2,3 10.2 Hz, J3,4 3.3 Hz, H-3) , 5.40-5.45 (2H, m, H-2, H-4) , 7.27-7.30 (3H, m, Ar-H) , 7.69-7.71 (2H, m, Ar-H) .

Ejemplo 51 : 3,4, 6-tri-0-acetil-2-acetamido-2-desoxi-l-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido de fenilo El compuesto del título (300 mg, 66%) se obtuvo como un sólido cristalino blanco usando un método análogo al del Ejemplo 49 utilizando l-tio-3 , 4 , 6-tri-0-acetil-2 -acetamido-2-desoxi-ß-D-glucopiranosa como material de partida, p.f. 177-179°C; [a] D25 -134.0 (c, 1.0 en CHC1 ) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.90 (3H, s, NHCOCH3), 1.99, 2.00, 2.03 (9H, 3 x s, 3 x CH3) , 3.76 (1H, ddd, J4,5 10.1 Hz, J5,6 2.3 Hz, J5(6. 4.7 Hz, H-5) , 4.07 (1H, dd, J5,6 2.3 Hz, J6f6> 12.3 Hz, H-6) , 4.15 (1H, dd, J5,6 4.6 Hz , J6,6. 12.2 Hz , H-6'), 4.19-4.24 (1H, m, H-2), 4.78 (1H, d, J1/2 10.1 Hz, H-l), 5.09 (1H, at, J 9.7 Hz, H-4), 5.28 (1H, at , J 9.5 Hz, H-3), 5.79 (1H, d, J 9.1 Hz, NHAc), 7.24-7.28 (3H, m, Ar-H), 7.68-7.70 (2H, m, Ar-H) .

Ej emplo 52 : fenil-2-acetilamino-2 -desoxi-l-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido El l-tio-2-acetilamino-2-desoxi-ß-D-glucopiranósido (230 mg, 0.98 mmol) y bromuro de fenilselenenilo (250 mg, 1.08 mmol) se agregaron a 1,4 -dioxano anhidro (5 mL) y metanol anhidro (3 ml) se agita bajo una atmósfera de argón. Después de un periodo de 1 minuto, la c. c. d. (acetato de etilo : metanol, 9: 1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) . La reacción se apagó con la adición de trietilamina (5 mL) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo: metanol, 9:1) para resultar el producto del título (270 mg, 70%) como un sólido blanco amorfo; [a] D22 -174.0 (c, 1 en MeOH); dH (400 MHz, MeOD) , 1.96 (3H, s, CH3 ) , 3.31-3.39 (2H, m, H-4, H-5) , 3.51 (1H, at, J 8.1 Hz, H-3), 3.65 (1H, dd, J5,6 5.0 Hz, J6,e. 11.7 Hz, H-6), 3.82-3.90 (2H, m, H-2, H-6'), 4.65 (1H, d, J1/2 10.2 Hz, H-l), 7.27-7.34 (3H, m, ArH) , 7.72-7.74 (2H, m, ArH) .

Ejemplo 53: 1-tio-ß-D-glucopiranosil disulfuro de etilo El 1-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido de fenilo (140 mg, 0.4 mmol) se disolvió en MeOH (10 mL) y se agitó a temperatura ambiente. A esta solución se le agregaron etanetiol (10 µL, 0.1 mmol) y trietilamina (60 µL, 0.4 mmol) en MeOH (5 mL) gota a gota durante 1 h. Después de 1 h, la c. c. d. (EtOAc: MeOH, 9: 1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) junto con el consumo completo del material de partida (Rf 0.5) . La solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (EtOAc : MeOH, 5: 1) para resultar el producto del título (30 mg, 90%) como un sólido blanco amorfo; [a] D22 -65.3 (c, 0.4 en CHCl3); dH (500 MHz, CD3OD) 1.33 (3H, t, J 7.4 Hz, CH3 ) , 2.86 (2H, q, J 7.4 Hz, CH2) , 3.30-3.34 (2H, m, H-4, H-5), 3.41 (1H, at, J 9.0 Hz, H-3), 3.49 (1H, at, J Hz, H-2), 3.67 (1H, dd, J5,6 5.3 Hz, J6,6- 12.0 Hz, H-6), 3.88 (1H, dd, J5,6' 2.1 Hz, J6;6, 12.0 Hz, H-6'), 4.35 (1H, d, J1/2 9.1 Hz, H-1) .

Ejemplo 54 : 2 -acetamido-2 -desoxi-1-disulfuro- -D-glucopiranósido de fenilo El 2 -acetamido-2-desoxi-l -selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido de fenilo (140 mg, 0.4 mmol) se disolvió en MeOH (10 mL) y se agitó a temperatura ambiente. A esta solución se le agregaron etanetiol (10 µL, 0.13 mmol) y trietilamina (55 µL, 0.4 mmol) en MeOH (5 mL) gota a gota durante 1 h. Después de 1 h, la c. c. d. (EtOAc : MeOH, 9 : 1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.2) . La solución se concentró in vacuo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (EtOAc: MeOH, 9:1) para resultar el producto del título (38 mg, 99%) como un sólido blanco amorfo; [a]D25 -7.9 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CD3OD) 1.30 (3H, t, J 7.3 Hz, CH3) , 2.01 (3H, s, OAc), 2.83-2.86 (2H, m, CH2) , 3.31-3.39 (2H, m, H-4, H-5), 3.51-3.56 (1H, m, H-3) , 3.68-3.72 (1H, m, H-6), 3.84-3.91 (2H, m, H-2, H-6'), 4.57 (1H, d, J?,2 10.3 Hz, H-l).

Ejemplo 55: Procedimientos de glicosilación de proteína usando reactivos de tiosulfato A. El mutante SBLS156C (24 mg, 0.89 µmol) se disolvió en solución amortiguadora acuosa (2.4* mL, 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 6.9). El 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosil feniltiosulfonato (50mg, 0.1 mmol) se disolvió en agua/acetonitrilo (1.6 mL, 9/7 v/v). Una porción de la solución de azúcares (50 µL) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 25 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman (Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70), punto en el cual otra porción de solución de azúcar (50 µL) se agregó. La reacción se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo durante 5 minutos adicionales, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min), para resultar el producto glicosilado m/z (ES) encontrado 27072 calculado 27078.

B. El mutante SBLS156C (24 mg, 0.89 µmol) se disolvió en solución amortiguadora acuosa (2.4 mL, 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 6.9). El 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosil feniltiosulfonato (50mg, 0.1 mmol) se disolvió en agua/acetonitrilo (1.0 mL, relación 1/1). La solución de azúcares (50 µL) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 25 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, punto en el cual otra porción de solución de azúcar (50 1) se agregó. La reacción se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo durante 5 minutos adicionales, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min), para resultar el producto glicosilado m/z (ES) encontrado 27072 calculado 27078.

C. El mutante SBLS156C (10 mg, 0.37 mol) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (1 mL, 70 mM CHES, 5mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). El 2 , 3 , 6-tri-0-acetil-4-O- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-O-glucopiranosil) -ß-D-glucopiranosil) - (3 -D-glucopiranosil feniltiosulfonato (30mg, 0.03 mmol) se disolvió en acetonitrilo (150 µL) . La solución de azúcares (75 µL) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 30 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre a columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteírias se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8 , (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) , para resultar el producto glicosilado m/z (ES) encontrado 27654 calculado 27653.

D. El BSA (10 mg, 0.14 µmol) se disolvió en solución amortiguadora acuosa (1 mL, 50 mM Tris, pH 7.7). El 2,3,4,6-tetra-O-acetil-ß-D-glucopiranosil feniltiosulfonato (lOmg, 0.02 mmol) se disolvió en agua/acetonitrilo (1.0 mL, relación 8/2) . La solución de azúcares (150 µl) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador extremo sobre extremo. Después de 30 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua pura, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) , para resultar el producto glicosilado; m/z (ES) encontrado 66798 calculado 66794.

E. El BSA (10 mg, 0.14 µmol) se disolvió en solución amortiguadora acuosa (1 mL, 50 mM Tris, pH 7.7). El 2,3,4,6-tetra-O-acetil-ß-D-galactopiranosil feniltiosulfonato (25mg, 0.05 mmol) se disolvió en acetonitrilo (0.5 mL) . La solución de azúcares (75 µL) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 30 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua pura, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) , para resultar el producto glicosilado m/z (ES) encontrado 66792 calculado 66794.

Ejemplo 56: Procedimientos de glicosilación de proteína usando reactivos de selenilsulfuro A. El mutante SBLS156C (5 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). El 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-ß-D-selenilsulfuro glucopiranósido de fenilo (10 mg, 0.02 mmol) se disolvió en acetonitrilo (500 µl) . La solución de azúcares (500 µl) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) , para resultar el producto glicosilado. m/z (ES) encontrado 27074 calculado 27077.

B. El BSA (5 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). El 2,3,4, 6-tetra-O-acetil-ß-D-selenilsulfuro glucopiranósido de fenilo (10 mg, 0.02 mmol) se disolvió en acetonitrilo (800 µl) . La solución de azúcares (800 µl) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) , para resultar el producto glicosilado m/z (ES) encontrado 66792 calculado 66794.

C. El mutante SBLS156C (5 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). El 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-ß-D-selenilsulfuro galactopiranósido de fenilo (10 mg, 0.02 mmol) se disolvió en acetonitrilo (500 µl) . La solución de azúcares (500 µl) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se elüyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min), para resultar Glc (Ac) 4SBLS156C m/z (ES) encontrado 27074 calculado 27077.

D. El mutante SBLS156C (10 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). El fenil-1-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido (15 mg, 0.02 mmol) se disolvió en agua/acetonitrilo (0.8 mL, relación 1/1). La solución de azúcares (500 µl) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 30 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, la reacción se colocó sobre un rotador extremo sobre extremo durante 30 minutos adicionales, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) , para resultar AcGlcSBLS156C m/z (ES) encontrado 27072 calculado 26911.

E. El mutante SBLS156C (5 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (2.4 mL, 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 6.9). El 2-acetilamino-2-desoxi-l-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido de fenilo (5 mg, 0.01 mmol) se disolvió en acetonitrilo (200 µL, relación l/l) . La solución de azúcar (100, µl) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 30 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis Ellman, punto en el cual otra porción de solución de azúcar (100 µl) se agregó. La reacción se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo durante 30 minutos adicionales, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8 , (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) , para resultar HOGlcNAcSBLS156C m/z (ES) encontrado 26950 calculado 26950.

F. El mutante SBLS156C (5 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (1 mL, 70 mM CHES, 5 M MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). El 3 , 4 , 6-tri-0-acetil-2-acetilamino-2-desoxi-l-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido de fenilo (10 mg, 0.02 mmol) se disolvió en acetonitrilo (500 µl) . La solución de azúcares (500 µl) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua, (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) , para resultar AcGlcNAcSBLS156C m/z (ES) encontrado 27074 calculado 27078.

G. El SBLCysl56 (5 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (500 µL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). El 2 , 3 , 6-tri-0-acetil-l- selenilsulfuro-4-O- (2,3, 6-tri-0-acetil-4-0- (2,3,4, 6-tetra-O- acetil-a-O-glucopiranosil) -a-D-glucopiranosil) -ß-D- glucopiranósido de fenilo (15 mg, 0.015 mmol) se disolvió en acetonitrilo (300 µL, 75 eq) y esta solución se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 30 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman. La reacción se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo durante 30 minutos adicionales, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM ' HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) para resultar Glc (Ac) 4Glc (Ac) 3Glc (Ac) 3- SBLCysl56 m/z (ES+) encontrado 27644 calculado 27653.

H. El SBLCysl56 (5 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (500 µL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 M CaCl2, pH 9.5). El 1-selenilsulfuro-ß-D-galactopiranósido de fenilo (15 mg, 0.04 mmol) se disolvió en agua/acetonitrilo (600 µL, relación 1/3) . La solución de azúcares (600 µL, 230 eq) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 30 min, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, t8] la reacción se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo durante 30 minutos adicionales, punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12- 14 KDa) contra agua (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) para resultar Gal-SBLCysl56 m/z (ES+) encontrado 26908 calculado 26909.

I. La 1-tio-ß-D-maltotriosa (104 mg, 0.2 mmol) se disolvió en MeOH (5 mL) a la cual una solución de PhSeBr (70 mg, 0.3 mmol) en EtOAc (2 mL) se agregó. Después de 2 min, la trietilamina (2 mL) se agregó y la reacción se diluyó con agua (10 mL) y gasolina (5 mL) . Las fases se separaron y la fase acuosa se lavó con gasolina (3 x 10 mL) y se liofilizó. La 1-selenilsulfuro-maltotriosa de fenilo cruda (m/z 755,757 (M+Br, 100%) ) se tomó en agua (10 mL) de la cual 50 µL (25 eq) se agregó a una solución de SBLCysl56 (1 mg) en 500 µL de solución amortiguadora (70 mM CHES, 5 mM MES, "2 mM CaCl2, pH 9.5) . La solución resultante se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 2.5 h la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó para resultar GlcGlcGlc-SBLCysl56 m/z (ES+) encontrado 27226 calculado 27233.

J. El BSA (5 mg) se disolvió en solución amortiguadora acuosa desgasificada (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) . El 1-selenilsulfuro-ß-D-glucopiranósido de fenilo (6 mg, 0.02 mmol) se disolvió en agua/acetonitrilo (0.7 mL, relación 2/5) . La solución de azúcares (700 µL, 225 eq) se agregó a la solución de proteínas y se colocó sobre un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h, la ausencia de tiol libre se demostró por análisis de Ellman, [8] punto en el cual la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó y dializó (MWCO 12-14 KDa) contra agua (1 x 4L por 1 h, 2 x 2L por 30 min) para resultar Glc-BSA m/z (ES+) encontrado 66620 calculado 66625.

Resumen de reacción de glicosilación utilizando reactivos de sulfuro de selenenilo Ejemplo 57: Comparación de compuesto de la fórmula I con reactivos glico-MTS En las Tablas 1 y 2, MTS significa CH3-S02-S-, y PTS significa Ph-S02-S-.

Tabla 1: Preparación 1. del correspondiente carbohidrato precursor D-glucosa (Glc) , D-galactosa (Gal) o Glca (1 , 4 ) Glca (1 , 4 ) Glc . 2. Tomado de B . G. Davis, R. C. Lloyd and J. B. Jones, J. Org. Chem., 1998, 63, 9614, y B. G. Davis, M. A. T. Maughan, M. P. Green, A. Ullman and J. B. Jones, Tetrahedron Asymmetry, 2000, 11, 245. 3. Tomado de B . G. Davis, S. J. Ward and P. M. Randle, Chem. Commun., 2001, 189. Como se muestra en la Tabla 1, los reactivos glico-PTS de conformidad con la invención se sintetizaron en rendimientos superiores a los correspondientes reactivos glico-MTS. Por otro lado, los costos de los materiales de partida para la síntesis de los reactivos glico-PTS fue aproximadamente diez veces menor que para los correspondientes reactivos glico-MTS (en costos del 2003) . En la Tabla 2, SBL-Cysl56 es mutante S156C de Bacillus lentus subtilisina, y BSA-Cys58 es albúmina de suero de bovino.

Tabla 2. Comparación de reacciones de glicosilación de reactivos glico-MTS y glico-PTS Glc(Ac)4a(l,4) Glc(Ac)3a(l,4) 93 74 100 30 Glc(Ac)3ß-PTS 1. Et3N, DCM, TA, 1 equivalente (eq.) de tiosulfonato. 2. Et3N, DCM/MeOH (20:1), TA, 1 eq. de tiosulfonato; Péptido [P] -Cys-Ser-OMe, [P] = Ac excepto por la reacción con Glc(Ac)4a(l,4)Glc(Ac)3a(l,4)Glc(Ac)3ß-PTS donde [P] = Boc . 3.70mM CES, 5mM MES, 2mM CaCl2 pH 9.5 o 50mM Tris. HCl, pH 7.7, TA, -30 eq. para glico-MTS, -10 eq. para Glc (Ac) 4ß-PTS y Gal (Ac)4ß-PTS con SBL-Cysl56, -20 eq. para Glc (Ac) 4ß-PTS y Gal(Ac)4ß-PTS con BSA-Cys58, -40 eq. para Glc(Ac)4a(l,4)Glc(Ac)3a(l,4)Glc(Ac)3ß-PTS con SBL-Cysl56. 4. Tomado de B. G. -Davis, R. C. Lloyd and J. B. Jones, J. Org. Chem., 1998, 63, 9614, y B. G. Davis, M. A. T. Maughan, M. P. Green, A. Ullman and J. B. Jones, Tetrahedron Asym etry, 2000, 11, 245. 5. Tomado de B. G. Davis, S. J. Ward and P. M. Randle, Chem. Commun., 2001, 189. Como puede apreciarse de la Tabla 2 , los reactivos glico-PTS de la invención proporcionan generalmente un rendimiento mayor en la reacción de glicosilación que el del correspondiente compuesto glico-MTS.

Ejemplo 58 : Glicosilación de SBLCysl56 con GlcGlcGlc-S-SePh en pH variado Condiciones de reacción: SBLCysl56 se incuba durante 1 h con GlcGlcGlc-S-SePh (20 eq.) en [a] 10 mM Tris pH 7.5; [b] 70 mM CHES, 5mM MES, 2 M CaCl2, pH 8.5; [c] 70 M CHES, 5mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5.

Ejemplo 59: Proteína de Farnesilación Representativa El SBLCysl56 (10 mg) se " disolvió en solución amortiguadora acuosa (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). El PMSF (140 µL de una solución 100 mg/mL en acetonitrilo) se agregó. Después de 10 minutos la mezcla de reacción se concentró en un filtro centrífugo Vivaspin (10 Da MWCO, Sartorius) ; esta etapa se repitió 3 veces con la adición de 300 µL de agua Milu Q. Una porción del SBLCysl56 desactivado resultante (1 mg) se disolvió entonces en 200 µL de solución amortiguadora (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5). Los feniltiosulfonatos de farnesilo (56 µL de una solución 5 mg/mL en THF, 20 equivalentes) se agregaron. La mezcla se colocó en un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h la reacción se desaló usando filtros centrífugos Vivaspin (4 filtraciones con adición de agua Milu Q) y se analizó por espectrometría de masa. Este Ejemplo muestra que los métodos de la invención también pueden usarse para enlazar grupos farnesilo a proteínas. La farnesilación es una modificación post traduccional natural asociada con muchas proteínas .

Ej emplo 60 : Pentaacetato de D-manosa Se suspendió mañosa (50 g, 280 mmol) en una solución agitada de anhídrido acético (200 mL) y piridina (200 mL) . Después de 24 horas, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 1: 1) indicó la formación de un producto (Rf 0.3) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0). La reacción se diluyó con agua (400 mL) y se dividió con acetato de etilo (300 mL) . Las fases se separaron, y la capa acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (2 x 200 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con ácido clorhídrico diluido (2 L, 1M) , bicarbonato de sodio (500 mL de una solución acuosa saturada) , salmuera (300 mL) , se secó sobre (MgS04) , se filtró y concentró in vacuo para resultar el compuesto del título (107.3 g, 98%) como un aceite que es una mezcla de anómeros (a/ß 2:1); dH (400 MHz, CDC13) 1.95, 1.99, 2.05, 2.16 (15 H, 4 x s, C0CH3ß) , 1.96, 2.00, 2.04, 2.12, 2.13 (15 H, 5 x s, C0CH3a) , 3.78 (1H, ddd, J4,5 9.9 Hz, J5,s 2.3 Hz, J5f6i 5.4 Hz, H-5ß) , 3.99-4.03 (m, H-5a) , 4.05-4.10 (2H, m, H-6a, H-6ß) , 4.23 (1H, dd, J5,6' 5.0 Hz, Je,6. 12.1 Hz, H-6a) , 4.26 (1H, dd, J5,6> 5.3 Hz, Js,s. 12.4 Hz, H-6'b), 5.10 (1H, dd, J2,3 3.3 Hz, J3/4 10.3 Hz , H-3ß) , 5.20-5.21 (1H, dd, J?,2 2.1 Hz, J2 3 2.5 Hz, H-2a) , 5.24-5.30 (3H, m, H-3a, H-4a, H-4ß) , 5.43 (1H, dd, Jlf2 1.2 Hz, J2<3 3.2 Hz, H-2ß) , 5.83 (1H, d, J?,2 0.9 Hz, H-lß) , 6.03 (1H, d, Jlf2 2.1 Hz, H-la) .

Ejemplo 61 : Bromuro de 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranosoi1o El pentaacetato de D-manosa (103 g, 264 mmol) se disolvió en DCM anhidro (200 mL) . A esto se le agregó bromuro de hidrógeno (33% en ácido acético, 200 mL) . La mezcla se dejó bajo argón a temperatura ambiente. Después de un periodo de 2 horas, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 2: 1) indicó la formación de un producto (Rf 0.3) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.2) . La mezcla de reacción se dividió entre DCM (100 mL) y agua con hielo (200 mL) , y la capa acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 200 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio hasta que un pH 8 se obtuvo, luego con salmuera (300 mL) , se secó sobre (MgS04) , se filtró y concentró in vacuo. El compuesto del título resultante, un aceite claro, (106.6 g) se usó sin purificación; dH (400 MHzL CDC13) 1.96, 2.03, 2.06, 2.13 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.09 (1H, dd, J5,6 2.2 Hz, J6,6. 12.5 Hz, H-6) , 4.18 (1H, dd, J4,5 10.1 Hz, J5,6 2.2 Hz, J5,6' 4.8 Hz, H-5) , 4.28 (1H, dd, J5/6 4.9 Hz, J6,6' 12.5 Hz, H-6') , 5.32 (1H, at , J 10.1 Hz, H-4) , 5.39 (1H, dd, J?,2 1.6 Hz, J2,3 3.5 Hz, H-2) , 5.66 (1H, dd, J2/3 3.5 Hz, J3/4 10.1 Hz, H-3) , 6.26 (1H, bs, H-l) .

Ejemplo 62 : bromuro de (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil) -1-isotiouronio El compuesto del título (80.6 g, 60%, 2 etapas) se obtuvo como un sólido cristalino blanco usando un método análogo al del Ejemplo 3 utilizando bromuro de 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-bencil-D-a-manopiranosoil como material de partida, p.f. 123-126°C [Lit. 125-128°C (H20) ] ; [a] D26 +119.0 (c, 1.0 en MeOH) [Lit. [a]D27 +103 (c, 1.0 en Acetona)]; dH (400 MHz, DMSO-de) 1.95, 2.02, 2.03, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.08 (1H, dd, J5,6 2.4 Hz, J6,6> 12.3 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd, J5/6. 2.4 Hz, Js,s. 12.5 Hz, H-6') , 4.32 (1H, ddd, J4,5 10.0 Hz, J5/6 2.2 Hz, J5_G' 5.2 Hz, H-5) , 5.05 (1H, dd, J2,3 3.4 Hz, J3/4 10.0 Hz, H-3) , 5.17 (1H, at , J 10.0 Hz, H-4) , 5.36 (1H, dd, J1#2 1.5 Hz, J2,3 3.4 Hz, H-2) , 6.36 (1H, d, Ja,2 1.2 Hz, H-l) , 9.40 (4H, bs, 2 x NH2) .

Ejemplo 63: 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-a-D-manopiranosiltiol El compuesto del título (14.5 g, 98%) se obtuvo como un aceite incoloro por un método análogo al del Ejemplo 2 utilizando bromuro de (2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-D-manopíranosil) -1-isotiouronio como material de partida, [a] D24 + 68.7 (c, 1.5 en CHC13) [Lit. [a] D20 +78.6 (c, 0.8 en CHC13) ] ; dH (400 MHz, CDC13) 1.98, 2.04, 2.08, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc) , 2.28 (1H, d, JlfSH 6.7 Hz, SH) , 4.10 (1H, dd, J5,s 2.4 Hz, J6 6, 12.5 Hz, H-6) , 4.28 (1H, dd, Js,s, 5.1 Hz, J6#6. 12.0 Hz, H-6'), 4.32-4.36 (1H, m, H-5) , 5.26-5.34 (3H, m, H-2, H-3, H-4) , 5.54 (1H, d, Jl?SH 6.9 Hz, H-l) .

Ejemplo 65: 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-l-selenilsulfuro-a-D-manopiranósido de fenilo El compuesto del título (590 mg, 83%) se obtuvo como un aceite amarillo usando un método análogo al del Ejemplo 49 utilizando 2 , 3 , , 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranosil tiol como el material de partida, [a] D25 +13.4 (c, 1.0 en CHC13; dH (400 MHz, CDC13) 1.94, 1.94, 2.02, 2.10 (12H, 4 x s, 4 x OAc) , 3.52 (1H, dd, J5,6 2.4 Hz, J6/6, 12.4 Hz, H-6) , 3.94 (1H, ddd, J4,5 9.6 Hz, J5,6 2.5 Hz, J5,6. 3.9 Hz", H-5) , 4.07 (1H, dd, J5#6-3.9 Hz, J6f6' 12.4 Hz, H-6') , 5.23 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3/4 9.9 Hz, H-3) , 5.28 (1H, at , J9.7 Hz, H-4) , 5.38 (1H, d, Jlj2 1.6 Hz, H-l) , 5.40 (1H, dd, Jlj2 1.5 Hz, J2,3 3.1 Hz, H-2) , 7.26-7.28 (3H, m ArH) , 7.62-7.65 (2H, m, ArH) .

Ejemplo 66: 2 , 3 , 4 , 6-Tetra-O-acetil-a-D-manopiranósido El pentaacetato de D-manosa (26. 4 g, 67. 7 mmol) se disolvió en THF recientemente destilado (150 mL) y bencilamina (11.1 mL, 101.5 mmol) se agregó a la solución agitada. Después de un periodo de 24 horas, la c. c. d. (gasolina : acetato de etilo, 1: 1) indicó la formación de un producto (Rf 0.3) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.5) . La reacción se apagó con la adición de ácido clorhídrico diluido (100 mL, 1M) y se agitó durante 10 min. La reacción se dividió con DCM (100 mL) y las fases se separaron. La fase acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 100 mL) . Los orgánicos combinados se lavaron con ácido clorhídrico diluido (100 mL, 1M) , salmuera (100 L) y se secaron (MgS04) y concentraron in vacuo. El aceite anaranjado resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina: acetato de etilo, 1: 1). Los cristales blanco opaco se combinaron y recristalizaron a partir de gasolina/acetato de etilo para resultar el compuesto del título (12.4 g, 53%) como un sólido cristalino blanco p.f. 92-94 °C [Lit. 92 °C] ; [a] D25 +17.8 (c, 1.0 en CHC13) ; [Lit. [a]D25 +21.0 (c, 1.0 en CHC12) ] ; dH (400 MHz, CDC13) 1.98, 2.04, 2.08, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.09-4.14 (1H, m, H-6), 4.20-4.26 (2H, m, H-5, H-6'), 4.59-5.00 (1H, m, OH), .20-5.23 (2H, m, H-l, H-2), 5.27 (1H, at , J 9 . 9 Hz, H-4) , .39 (1H, dd, J2,3 2.7 Hz, J3,4 9.6 Hz, H-3).

Ejemplo 67: 1 ' , 1 ' , 1 ' -Tricloro acetimidato 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranósido El 2, 3,4, 6-tetra-O-acetil-a-D-mannopiranósido (1.01 g, 2.87 mmol), 1, 1, 1-tricloroacetonitrilo (2.9 mL, 28.7 mmol) y mallas moleculares 4A activados (ca. 500 mg) se suspendieron en DCM anhidro (20 mL) y se dejaron agitar a 0°C durante un periodo de 1 h. Punto en el cual el DBU (0.085 mL, 0.57 mmol) se agregó. Después de un periodo de 1.5 h, la c. c. d. (gasolina : acetato de etilo, 1: 1) indicó la formación de un producto (Rf 0.5) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.2) . La reacción se filtró a través de Celite® y se concentró in vacuo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo, 1:1) para resultar el compuesto del título (1.42 g, 99%) como un aceite claro; [a] D25 +42.7 (c, 1.0 en CHC13) [Lit. [a]D21 +50.0 (c, 1.0 en CHC13) ] ; dH (400 MHz, CDC13) 2.20, 2.07, 2.09, 2.29 (12g 4 x s, 4 x OAc), 4.15-4.22 (2H, m, H-5, H-6) , 4.28 (1H, dd, J5,G< 4.3 Hz, Je,6. 11.8 Hz, H-6'), .40-5.42 (2H, m, H-3, H-4) , 5.48 (1H, at , J2.1 Hz, H-2) , 6.29 (1H, d, Jl?2 1.9 Hz, H-l), 8.80 (1H, s, NH) .

Ejemplo 68: Bencil-a-D-manopiranósido La D-manosa (30 g, 167 mmol) y cloruro de acetilo (13 mL, 167 mmol) se disolvió en alcohol bencílico (250 mL) y se calentó hasta 50 °C durante 1 h. La solución resultante se concentró por destilación a baja presión. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo/metanol, 9:1) y se recristalizó a partir de isopropanol /gasolina para resultar el compuesto del título (29.34 g, 70%) como un sólido cristalino blanco p.f. 126-127°C [Lit 128-129°C] ; [a] D26 +102.0 (c, 1.1 en MeOH) ; [Lit. [a] D18 +73.1 (c, 1.4 en H20) ] ; dH (400 MHz, CD30D) 3.62 (1H, ddd, J4,5 9.5 Hz, J5/6 2.3 Hz, J5#6. 5.5 Hz, H-5) , 3.68 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4) , 3.73 3.78 (2H, m, H-3, H-6) , 3.85-3.88 (2H, m, H-2, H-6') , 4.75, 4.52 (2H, ABq, J 11.6 Hz, CH2) , 4.86 (1H, d, J1/2 1.8 Hz, H-l) , 7.28-7.38 (5H, m, ArH) .

Ejemplo 69: 4 , 6-di-O-pivolil-a-D-manopiranósido de bencilo El bencil-a-D-manopiranósido (30.0 g, 111. 0 mmol) se suspendió en piridina anhidra (200 mL) bajo una atmósfera de argón inerte. La suspensión resultante se enfrió hasta 0°C y el clorotrifenil metano (35 mL, 280 mmol) se agregó a gota a gota. Después de la adición del clorotrifenil metano, la c. c. d. (acetato de etilo) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.7) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0) . La reacción se dividió entre agua (50 mL) y acetato de etilo (100 mL) . Las fases se separaron y la fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (3 x 50 L) . Los orgánicos combinados se lavaron con ácido clorhídrico diluido (1L, 1M) , bicarbonato de sodio (800 mL de una solución acuosa saturada) hasta que el pH 7 se obtuvo, salmuera (200 mL) , se secó (MgS04) y se concentró in vacuo.

El residuo resultante se recristali'zó a partir de acetato de etilo/gasolina para resultar el compuesto del título (27.07 g, 56%) como un sólido cristalino blanco p.f. 133-135°C; [a]D25 +64.7 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.251, 1.254 (18H, 2 x s, 2 x C(CH3)3), 3.85 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4) , 3.92 (1H, ddd, J4/5 9.7 Hz, J5/6 5.6 Hz, J5f6. 2.5 Hz, H-5) , 4.05 (1H, dd, Jlf2 1.9 Hz, J2,3 2.1 Hz, H-2) , 4.37 (1H, dd, J5/6 .6 Hz, J6,6' 11-8 Hz, H-6) , 4.42 (1H, dd, Js,6. 2.7 Hz, j6f6, 12.0 Hz, H-6') , 4.53, 4.76 (2H, Abq, J 11.9 Hz, CH2) , 4.90 (1H, d, J?,2 1.8 Hz, H-l) , 5.14 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3,4 9.7 Hz, H-3) , 7.33-7.36 (5H, m, ArH) .

Ejemplo 70 2 , 4-di-0-bencil-3 , 6-di-O-pivolil-a-D-manopiranósido de bencilo El 4, 6-di-O-pivolil-a-D-manopiranósido de bencilo (15.0 g, 34.2 mmol) y tricloroacetimidato de benceno (17 mL, 91.4 mmol) se disolvieron en DCM anhidro (100 mL) y ciclohexano anhidro (100 mL) y se dejó agitar durante 1 h sobre mallas moleculares 4A (ca 5 g) bajo una atmósfera inerte de argón. Después de 1 hora, el sililtriflato de trimetilo (0.31 mL, 1.71 mmol) se agregó. Después de un periodo de 18 h, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 5: *1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0) . La reacción se apagó con trietilamina (ca 30 mL) y la solución se filtró a través de Celite y se concentró in vacuo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo, 5: 1) para resultar el compuesto del título (14. 4 g, 70%) como un aceite incoloro; - [a] D25 +29.0 (c, 2.0 en CHC13) ; dH (400 MHz, CDC13) 1.24, 1.25 (18g 2 x s, 2 x C(CH3)3), 3.97-4.04 (3H, m, H-2, H-4, H-5) , 4.25 (1H, dd, J5,6 4.8 Hz, J5,6. H.6 Hz, H-6) , 4.44 (1H, dd, Js#ß. 1.6 Hz, J6,d. 11.7 Hz, H-6'), 4.51, 4.74 (2H, ABq, J 12.0 Hz, BnCH2) , 4.55, 4.61 (2Hy ABq, J 11.7 Hz, BnCH2) , 4.57, 4.80 (2H, ABq, J 10.7 Hz, BnCH2) , 4.92 (1H d, J1/2 1.8 Hz, H-l), 5.37 (1H, dd, J2/3 3.1 Hz, J3,4 8.8 Hz, H-3), 7.28-7.35 (15H, m, ArH).

Ejemplo 71: 2 , 4-di-O-bencil-a-D-manopiranósido de bencilo El 2 , 4-di-0-bencil-3 , 6-di-O-pivolil-a-D-manopiranósido de bencilo (8.0 g, 12.9 mmol) y metóxido de sodio (1.75 g, 32.4 mmol) se disolvieron en metanol (100 mL) y se calentaron hasta reflujo. Después de un periodo de 20 horas, la c. c. d. (gasolina/acetato de etilo, 2: 1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.2) con 'el consumo completo del material de partida (Rf 0.8). La reacción se neutralizó con la adición de resina de intercambio iónico Dowex®-50 después de cuyo punto la reacción se filtró y se concentró in vacuo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina/acetato de etilo, 2: 1) para resultar el compuesto del título (4.50 g, 78%) como un aceite claro; [a]D25 +45.2 (c, 1.0 en CHC13) ; dH (500 MHz, CDC13) 2.83 (2H, bs, 2 x OH) , 3.83-3.86 (1H, m, H-5) , 3.90-4.00 (4H, m, H-2), H-4) , H-6, H-6'), 4.21-4.28 (1H, m, H-3), 4.58 (1H, d, J 12.1 Hz, CHH), 4.72-4.83 (4H, m, 4 x CH2Ar) , 5.04 (1H, d, J 11.1 Hz, CHH), 5.09 (1H, bs, H-l), 7.43-7.51 (15H, m, 15 x ArH) .

Ejemplo 71: 2 , 4-di-0-bencil-3 , 6-bis-O- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranósido) -a-D-manopiranósido de bencilo El 2 , 4-di-O-bencil-a-D-mannopiranósido de bencilo (255 mg, 0.57 mmol) en DCM (10 mL) " y l',!',!'- tricloroacetimidato-2 ,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D- manopiranósido (1.12 g, 2.27 mmol) en DCM (10 mL) se 5 agregaron a un matraz seco que contiene mallas moleculares 4Á activadas (ca 500 mg) por medio de una cánula. La solución resultante se agita durante 1 h, después de lo cual el trifluoroeterato de boro (90 µL, 0.85 mmol) se agregó. Después de un periodo de 16 h, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 2: 1) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.3) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.1) . La reacción se apagó con trietilamina (ca 5 mL) y la solución se filtró a través de Celite y se concentró in vacuo. El residuo resultante se ?5 purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina: acetato de etilo, 4:3) para resultar el compuesto del título (472 mg, 75%) como un sólido blanco amorfo; [a] D25 +81.5 (c, 1.0 en CHC13); dH (500 MHz, CDC13) 1.98, 2.02, 2.05, 2.07, 2.09, 2.10, 2.11, 2.19 (24H, 8 X s, 8 x OAc), 3.74-3.76 (1H, m, H-6a), 3.81-3.87 (3H, m, H- 2a, H-5a, H-6'a), 3.92-3.97 (3H, m, H-4a, H-5b, H-6b), 4.03-4.22 (4H, m, H-3a, H-5c, H-6'b, H-6c), 4.27 (1H, dd, J5,6 5.5 Hz, J6,6' 12.3 Hz, H-6'c), 4.54, 4.75 (2H, Abq, J 11.9 Hz, CH2) , 4.64, 4.81 (2H, Abq, J 12.2 Hz, CH2) , 4.65, 4.91 (2H, Abq, J 11.4 Hz, CH2) , 4.97 (1H, d, J1/2 1.7 Hz, H-lc) , 5.00 (1H, d, J1/2 1.6 Hz, H-la) , 5.19 (1H, d, Jlf2 1.7 Hz, H-lb) , 5.25 (1H, at , J 10.0 Hz, H-'4b) , 5.33 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4c) , 5.36 (1H, dd, J1/2 1.8 Hz, J2,3 3.3 Hz, H-2c) , 5.42 (1H, dd, Jl?2 1.5* Hz , J2,3 3.5 Hz, H-2b) , 5.44-5.47 (2H, m, H-3b, H3c) , 7.32-7.42 (15H, m, ArH) .

Ejemplo 72: Acetil 2 , 4-di-0-acetil-3 , 6-bis-O- (2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranósido) -a/ß-D-manopiranósido 2 , 4-di-0-bencil-3 ,6-bis-O- (2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranósido) -a-D-manopiranósido de bencilo (100 mg, 0.09 mmol) y catalizador Pearlman (Pd(OH)2, humedad, 35 mg) se disolvieron en etanol absoluto (5 mL) . La solución resultante se desgasificó y se purgó con gas de hidrógeno, luego se dejó agitar bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de un periodo de 4 días, la c . c. d. (acetato de etilo) indicó la formación de un producto importante (Rf 0.4) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.9) . La solución se filtró a través de Celite y se concentró in vacuo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo) para resultar el intermediario 3 , 6-bis- (2 , 3 , , 6-tetra-0-acetil-a-D-manopiranósido) -a/ß-D-manopiranósido (74 mg, 98%) como un sólido blanco amorfo; m/z HRMS (ES+) calculado para C34H8034Na (MNa+) 863.2433. encontrado 863.2440. Este intermediario (74 mg, 0.088 mmol) se volvió a suspender en anhídrido acético (5 mL) y piridina (5 mL) . Después de 24 horas, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 2:3) indicó la formación de un producto (Rf 0.4) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0). La reacción se diluyó con agua (20 mL) y se dividió con acetato de etilo (20 mL) y las fases se separaron. La capa acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (2 x 20 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con ácido clorhídrico diluido (500 mL, 1M) , bicarbonato de sodio (50 mL de una solución acuosa saturada) , salmuera (30 mL) , se secó sobre MgS04, se filtró y concentró in vacuo para dar el compuesto del título (83 mg, 98%) como una espuma amorfa siendo una mezcla de anómeros (a/ß 5:1) ; dH (500 MHz, CDC13) compuesto a, 2.00, 2.02, 2.08, 2.12, 2.17, 2.18, 2.19, 2.26 (33H, 8 x s, 11 x OAc), 3.59 (1H, dd, J5/6 3.0 Hz, J6,6- 11.1 Hz, H-6a) , 3.76 (1H, dd, J5/S. 5.2 Hz, J6,6' H.2 Hz, H-6'a), 3.92 (1H, ddd, J4,5 10.2 Hz, J5,6 3.0 Hz, Js,6- 5.2 Hz, H-5a), 4.04-4.16 (4H, m, H-5b, H-5c, H- 6b, H-6c) , 4.21 (1H, dd, J2,3 3.4 Hz, J3,4 9.9 Hz, H-3a) , 4.28 (1H, dd, J5,6. 5.5 Hz, Je,6< 12.2 Hz, H-6'b/c) , 4.31 (1H, dd, J5#6. 4.7 Hz, J6,6. 12.3 Hz, H-6'b/c) , 4.81 (1H, d, Ja,2 1.5 Hz, H-lc) , 5.06-5.07 (2H, H-lb, H-?) , 5.20-5.35 (8H, m, H-2a, H-2b, H-2c, H-3b, H-3c, H-4a, H-4b, H-4c) , 6.07 (1H, d, J1/2 1.8 Hz, H-la) . El compuesto ß sólo selecciona datos 3.64 (1H, dd, J5,6 3.7 Hz, J6/6. 10.8 Hz, H-6a) , 3.69-3.73 (1H, m, H-5a) , 3.76 (1H, dd, J5,6, 5.2 Hz, JS/6, 11.2 Hz, H-6'a) , 4.01 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3,4 9.7 Hz, H-3a) , 5.50 (1H, dd, J1/2 0.9 Hz, J2,3 3.2 Hz, H-2a) , 5.83 (1H, d, J?,2 0.9 Hz, H-la) .

Ejemplo 73: bromuro de 2 , 4-Di-O-acetil-bis-O- (2 , 3 , 6-tri-O-acetil-a-O-manopiranosil) -a-D-manopiranósilo El acetil 2 , 4-di-0-acetil-3 , 6-bis-O- (2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranósido) -a/ß-D-manopiranósido (87 mg, 0.09 mmol) se disolvió en DCM anhidro (5 mL) . A este bromuro de hidrógeno (33% en ácido acético, 1 mL) se agregó. La mezcla se agitó bajo argón a temperatura ambiente. Después de un periodo de 2 horas, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 1:4) indicó la formación de un producto (Rf 0.6) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.4) . La mezcla de reacción se dividió entre DCM (10 mL) y agua (10 mL) , y la capa acuosa se volvió a extraer con DCM (3 x 10 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio (20 mL de una solución acuosa saturada) hasta que un pH 8 se obtuvo, salmuera (20 mL) , se secó sobre MgS0 , se filtró y concentró in vacuo para resultar el compuesto del título (80 mg, 90%) como una espuma blanca la cual se tomó sin purificación adicional; dH (400 MHz, CDC13) 1.97, 1.99, 2.05, 2.06, 2.10, 2.12, 2.17, 2.24 (30H, 9 x s, 10 x OAc), 3.60 (1H, dd, J5.6 3.0 Hz, J6/6, 11.4 Hz, H-6a) , 3.77 (1H, dd, J5/S. 4.5 Hz, J6,6. 11.4 Hz, H-6'a) , 4.02-4.09 (5H, m, H-5a, H-5b, H-5c, H-6b, H-6c) , 4.24 (1H, dd, J5/6 6.8 Hz, J6/6. 12.2 Hz, H-6') , 4.29 (1H, dd, J5,s. 5.0 Hz, J6,6. 12.6 Hz, H-6') , 4.62 (1H, dd, J2,3 3.4 Hz, J3;4 10.0 Hz, H-3a) , 4.79 (1H, bs, H-lc) , 5.02-5.04 (2H, m, H-lb, H-3b) , 5.17-5.30 (5H, m, H-2b, H-2c, H-3c, H-4b, H-4c) , 5.39 (1H, at , J 10.1 Hz, H-4a) , 5.43 (1H, dd, Jx,2 1.5 Hz, J2,3 3.2 Hz, H-2a) , 6.34 (1H, bs, H-la) .

Ejemplo 74: l-tio-2 , 4-tetra-0-acetil-3 , 6-0-bis- (2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-O-manopiranosil) -a-D-manopiranosa Bromuro de 2 , 4-tetra-0-acetil-3 , 6-0-bis- (2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-O-manopiranosil) -a-D-manopiranosilo (850 mg, 0.85 mmol) se disolvió en acetona anhidra (20 mL) . Tiourea anhidra (115 mg, 1.56 mmol) se agregó y la mezcla se calentó hasta reflujo bajo una atmósfera de argón. Después de 18 h, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 1: 3) indicó la formación de un producto (Rf 0.0) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.4) . La reacción se concentró in vacuo y el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo/metanol, 9:1) para resultar el intermediario bromuro de 2 , 4-tetra-0-acetil-3 , 6-O-bis- (2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-acetil-a-O-manopiranosil) -a-D-manopiranosil-1-isotiouronio (550 mg, 60%) que se llevó a cabo. Este intermediario (550 mg, 0.51 mmol) y Na2S205 (122 mg, 0.62 mmol) se agregaron a una mezcla agitada de DCM (20 mL) y agua (10 mL) . La mezcla se calentó hasta reflujo bajo argón. Después de 2.5 h, la c. c. d. (gasolina: acetato de etilo, 1:3) indicó la formación de un producto (Rf 0.3) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.0), punto en el cual la reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y las fases se separaron. La capa acuosa se volvió a extraer con DCM (2 x 20 mL) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio (20 mL de una solución acuosa saturada) , salmuera (20 mL) , se secaron (MgS04) , se filtraron y el solvente se removió in vacuo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna instantánea (gasolina : acetato de etilo, 1:3) para resultar el compuesto del título (350 mg, 73%) como un sólido blanco amorfo; [a] D23 +58.1 (c, 1.2 en CHCl3; dH (500 MHz, C6D6) 1.74, 1.75, 1.78, 1.82, 1.91, 2.03, 2.06, 2.26 (24H, 8 x s, 10 x Oac) , 2.07 (1H, bs, SH) , 3.65 (1H, dd, J5,s 3.2 Hz, JS/6- 11-0 Hz, H-6a) , 3.93 (1H, dd, J5/6. 5.3 Hz, J6,6- 11-1 Hz, H-6'a) , 4.31-4.38 (4H, m, H-3a, H-5a, H-5b/c, H-6) , 4.43-4.45 (1H, m, H-6) , 4.51 (1H, dd, J5¡6. 5.6 Hz, Je, 6- 12.6 Hz, H-6') , 4.56-4.60 (2H, m, H-5b/c, H-6') , 4.91 (1H, d, J1/2 1.5 Hz, H-lc) , 5.20 (1H, d, J1 2 1.8 Hz, H-lb) , .43 (1H, dd, Jlf2 1.8 Hz, J2/3 3.1 Hz, H-2b) , 5.45 (1H, bs, H-l) , 5.65 (1H, dd, Jlf2 1.5 Hz, J2/3 3.1 Hz, H-2a) , 5.70- 5.82 (5H, m, H-2c, H-3b, H-4a, H-4b, H-4c) , 5.85 (1H, dd, J2/3 3.2 Hz, J3/4 10.2 Hz, H-3c) .

Ejemplo 75: Procedimientos representativos de glicosilación de proteína de SBLCysl56 usando Man (1-6) Man (1-3) ManSH La l-tio-2,4-tetra-0-acetil-3, 6-0-bis- (2,3,4, 6-tetra-0-acetil-a-O-manopiranosil) -a-D-manopíranosa (20 mg, 0.02 mmol) y metóxido de sodio (2 mg, 0.02mmol) se agregaron a una solución agitada de metanol (5 mL) . Después de 12 h, (gasolina: acetato de etilo, 1: 2) indicó la formación de un producto (Rf 0.0) con el consumo completo del material de partida (Rf 0.2) . La reacción se neutralizó con la adición de resina de intercambio iónico Dowex®-50 después de cuyo punto la reacción se filtró y se concentró in vacuo. El tiol de azúcar crudo se tomó en agua (5 mL) de lo cual 38 µL se agregaron a una solución amortiguadora acuosa (500 µL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) que contiene SBL156CysSePh (1 mg) . La solución resultante se colocó en un rotador de extremo sobre extremo. Después de 1 h la mezcla de reacción se cargó sobre una columna PD10 Sephadex® G25 y se eluyó con 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0. La fracción de proteínas se recolectó para resultar Man (Man) Man-S-SBLCysl56; m/z (ES+) encontrado 27878, calculado 27881. Se hace constar que con esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a cabo la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método de formación de un enlace bisulfuro, el método caracterizado porque comprende hacer reaccionar un compuesto orgánico que comprende al menos un grupo tiol con un compuesto de la fórmula I : R-S-X-R1 I en donde : X denota S02 o Se; R denota una porción orgánica; y R1 denota un grupo alquilo opcionalmente substituido, un grupo fenilo opcionalmente substituido, un grupo piridilo opcionalmente substituido o un grupo naftilo opcionalmente substituido; con la condición de que cuando X denota S02 entonces R1 no denota alquilo opcionalmente substituido.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto orgánico que comprende al menos un grupo tiol es un aminoácido, un péptido o una proteína.
3. 3. Un método para modificar químicamente una proteína, péptido o aminoácido que comprende al menos un grupo tiol, el método caracterizado porque comprende hacer reaccionar la proteína, péptido o aminoácido con un compuesto de fórmula I: R-S-X-R1 * I en donde : X denota S02 o Se; R denota una porción orgánica; y R1 denota un grupo alquilo opcionalmente substituido, un grupo fenilo opcionalmente substituido, un grupo piridilo opcionalmente substituido o un grupo naftilo opcionalmente substituido; con la condición de que cuando X denota S02 entonces R1 no denota alquilo opcionalmente substituido.
4. 4. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque R es un grupo carbohidrato .
5. 5. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque R1 es fenilo.
6. 6. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque X es Se.
7. 7. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque X es S02.
8. 8. Un compuesto de fórmula I : R-S-X-R-1 en donde : X denota S02 o Se; R denota una porción orgánica; y R1 denota un grupo alquilo opcionalmente substituido, un grupo fenilo opcionalmente substituido, un grupo piridilo opcionalmente substituido o un grupo naftilo opcionalmente substituido; con la condición de que cuando X denota S02 entonces R1 no denota alquilo opcionalmente substituido.
9. 9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque R1 es fenilo.
10. 10. El compuesto de conformidad con la reivindicación 8 o reivindicación 9, caracterizado porque X es Se.
11. 11. El compuesto de conformidad con la reivindicación 8 o reivindicación 9, caracterizado porque X es S02. 1 . El método para la preparación de un compuesto de fórmula I de conformidad con la reivindicación 11, el método caracterizado porque comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula II: M (SS02Ra)k II en donde : M denota un metal, por ejemplo Li , Na, K, Ca, Cs, Zn, Mg, o Al; y k denota 1, 2 ó 3; con un compuesto de fórmula III: R-L III en donde: L denota un grupo de partida. 13. El método para la preparación de un compuesto de fórmula I de conformidad con la reivindicación 11, el método caracterizado porque comprende hacer reaccionar un compuesto de bisulfuro de la fórmula VIII: R-S-S-R VIII con un anión de sulfinito de fórmula R1S02" en presencia de iones de plata. 14. El método para la preparación de un compuesto de fórmula I de conformidad con la reivindicación 10, el método caracterizado porque comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula V: R-SH V con un compuesto de fórmula Vía o VIb: R^-SeL2 R1Se(OH)2 Vía VIb en donde L2 denota Br, Cl, CN, o I. 15. El uso de un compuesto de fórmula I como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la formación de un enlace de bisulfuro. 16. El uso de un compuesto de fórmula I como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para modificar una proteína, un péptido o un aminoácido que comprende al menos un grupo tiol . 17. El uso de un compuesto de fórmula I como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para glicosilar una proteína, un péptido o un aminoácido que comprende al menos un grupo tiol . 18. Un método para modificar químicamente una proteína, péptido o aminoácido que comprende al menos un grupo tiol, el método caracterizado porque comprende convertir el grupo tiol en un grupo selenenil sulfuro. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la conversión se lleva a cabo al reaccionar la proteína, péptido o aminoácido que comprende al menos un grupo tiol con un compuesto de fórmula Xa o Xb: R2SeL2 R2Se(OH)2 Xa Xb en donde : L2 denota un grupo de partida; y R2 denota un grupo alquilo opcionalmente substituido, un grupo fenilo opcionalmente substituido, un grupo bencilo opcionalmente substituido, un grupo piridilo opcionalmente substituido o un grupo naftilo opcionalmente substituido, o R2 forma parte de, o se une a un soporte sólido. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R2 es fenilo. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto de fórmula Xa o Xb es PhSeBr. 22. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque además comprende reaccionar el grupo selenenil sulfuro en la proteína, péptido o aminoácido con un compuesto orgánico que contiene un grupo tiol. 23. Un método para modificar químicamente una proteína, péptido o aminoácido, que comprende al menos un grupo selenenil sulfuro, el método caracterizado porque comprende hacer reaccionar la proteína, péptido o aminoácido con un compuesto orgánico que comprende un grupo tiol . 24. El método de conformidad con la reivindicación 22 o reivindicación 23, caracterizado porque el compuesto orgánico es un compuesto de carbohidrato. 25. El método de conformidad con la reivindicación 22 o reivindicación 23, caracterizado porque el compuesto orgánico es una proteína, péptido o aminoácido. 26. Una proteína, péptido o aminoácido que comprende al menos un grupo selenenil sulfuro, caracterizado porque el-grupo selenenil sulfuro es un grupo de fórmula: -S-Se-R2, en donde R2 denota un grupo alquilo opcionalmente substituido, un grupo fenilo opcionalmente substituido un grupo bencilo opcionalmente substituido, un grupo piridilo opcionalmente substituido o un grupo naftilo opcionalmente substituido . 28. Una proteína, péptido o aminoácido, caracterizado porque comprende al menos un grupo selenenil sulfuro que se obtiene por el método de cualesquiera de las reivindicaciones 18 a 21. 29. Una proteína, péptido o aminoácido, caracterizado porque comprende al menos un enlace bisulfuro que se obtiene por el método de cualqesquiera de las reivindicaciones 22 a 25.