MXPA05012591A

MXPA05012591A - Medios para prevenir y tratar la muerte celular y sus aplicaciones biologicas

Info

Publication number: MXPA05012591A
Application number: MXPA/A/2005/012591A
Authority: MX
Inventors: Chauvier David; Borgne Annie; Jacotot Etienne; Langonne Alain; Hervelecoeur; Rebouillat Dominique
Original assignee: Borgne Annie; Chauvier David; Jacotot Etienne; Langonne Alain; Lecoeur Herve; Rebouillat Dominique; Theraptosis Sa
Priority date: 2003-05-22
Filing date: 2005-11-22
Publication date: 2006-10-17

Abstract

Inhibidores para prevenir, ennegrecer/silenciar la actividad de caspasa 2 en muerte celular.

Description

MEDIOS PARA PREVENIR Y TRATAR LA MUERTE CELULAR Y SUS APLICACIONES BIOLÓGICAS La invención se refiere a medios, métodos y productos, para bloquear, prevenir o tratar la muerte celular, particularmente la muerte celular neuronal . La muerte celular neuronal ocurre durante embriogénesis para remover el exceso de neuronas para asegurar las conexiones pre- y post-sinápticas apropiadas y permitir la formación de un cerebro adulto funcional. Además de la muerte post-mitótica relacionada con el envejecimiento normal, los factores ambientales o mutaciones genéticos pueden inducir muerte neuronal en humano adulto durante lesiones agudas (por ejemplo, hipoxia-isquemia , apoplejía, lesión de la médula espinal, trauma) o enfermedades neurodegenerativas crónicas. La muerte celular asociada con estos desórdenes puede ocurrir por tres mecanismos distintos, mostrando características morfológicas y biotérmicas de necrosis, autofagía o apoptosis. Tanto la muerte neuronal fisiológica como patológica con frecuencia se asocian con regulación de apoptosis defectuosa, y las trayectorias de señalización que conducen a este mecanismo suicida celular activo pueden dividirse en trayectorias dependientes de proteasa específica de aspartato de cisteinilo (caspasa) contra trayectorias independientes de caspasa en células de mamífero. La apoptosis neuronal es un mecanismo suicida celular activo que puede dividirse en fases secuenciales , incluyendo inicio, decisión, ejecución y degradación. Esta cascada de eventos se acciona por la activación de una maquinaría específica, que incluye tanto la activación de proteasas específicas de aspartato dependiente de cisteína (caspazas) y el mitocondrión que puede actuar como un organelo regulador decisivo (o amplificador) . Sin embargo, las alteraciones mitocondriales incluyen pérdida de gradiente electroquímico de membrana interior mitocondrial (??m) y liberación de factores apoptogénicos tales como citocromo c, Smac/Diablo y factor inductor de apoptosis. Una vez que se liberan de la mitocondria, estos efectuores accionan la desmantelación nuclear y citoplásmica independiente de caspasa y/o dependiente de caspasa. Por lo tanto, los factores itocondriales combinados con caspazas contribuyen a la fase de degradación de apoptosis, resultando en encogimiento celular, condensación celular, emisión de cuerpos apoptóticos y apariencia de señales de "cómeme" tales como transubicación de fosfatidil-serinas a la hojilla exterior de la membrana de plasma. En la ausencia de fagocitos, las células incluidas en apoptosis finalmente experimentan necrosis secundaria denominada interrupción de membrana de plasma no específica. La contribución respectiva de mitocondria, caspazas y otros eventos durante la apoptosis neuronal aún no se produce, particularmente con respecto a un par de tipo celular /inductor de muerte dado. Hasta hace poco, la apoptosis y necrosis de células neuronales se ha investigado principalmente por dos tipos de planteamientos: el primer grupo de técnicas (bioquímicas) evalúa los últimos eventos de muerte neuronal generalmente por evaluación colorimétrica de actividad de dehidrogenasa de succinato mitocondrial (análisis MTT) o liberación extracelular de actividad de dehidrogenasa de lactato (análisis LDH) . Estas técnicas cuantitativas monoparamétricas de rutina no dan información concerniente al mecanismo de muerte celular y no pueden combinarse con la detección de otros procesos bioquímicos. Más recientemente, algunos procedimientos de fraccionamiento de célula adaptados a la neurona se publican para la valoración bioquímica de transubicación de citocromo c mediante inmunomanchado y activación de caspazas utilizando substratos flurogénicos . Tales métodos recientes dan informaciones semi-cuantitativas en poblaciones de neuronas pero excluyen análisis en tiempo real y multiparamétrico . ET segundo grupo de técnicas utiliza lectura de microscopía de fluorescencia (FM) para detectar modificaciones del organelo o proteínas relacionadas con apoptosis. La mayoría de estos estudios FM se enfocan en alteraciones nucleares posteriores incluyendo visualización de morfología de cromatina (coloración Hoechst) y/o detección bioquímica de fragmentación de ADN (análisis TÜNEL) . En pocos estudios FM recientes en neuronas, la inmuno-ubicación de citocromo c (en células fijas), se reportan, pero en contraste a otros campos de biología celular, un número limitado de estudios en neuronas utilizó la detección in si t u de alteraciones mitocondriales y activación de caspasa. Cuando se aplican a neuronas primarias cultivadas, los análi-sis a base de FM consumen tiempo, son laboriosos, y la cuantificación se dificulta por agregados de cuerpo celular y sobreposición de redes de neurita. Además, el foto-blanqueado de sondas fluorescentes sensibles podría conducir a malas interpretaciones dramáticas y excluir seguimiento en tiempo real de eventos relacionados con muerte temprana. De esta manera, las características de biología celular de los eventos apoptóticos clave no se documentan completamente y se ordenan en neuronas primarias. Los inventores han entonces desarrollado un planteamiento complementario y cuantitativo para analizar las dinámicas de fenómeno de apoptósis útiles, particularmente, para neuronas corticales primarias, o estirpes de célula neuronal, o estirpes de célula no neuronal. Tal planteamiento conduce a los inventores a desarrollar un nuevo método para organizar y analizar los eventos moleculares relacionados con apoptosis. Para evaluar con este método la cronología y jerarquía de eventos relacionados con apoptosis en células neuronales, los inventores han elaborado un modelo de muerte celular aguda experimental para determinar el punto de control reversible más próximo para interferir con proceso apoptótico y aplicar dicho método a este modelo. Ventajosamente, esta evaluación puede realizarse en células neuronales, estirpes de célula neuronal, así como también en células neuronales y estirpes de célula no neuronal . El objeto de la invención es entonces proporcionar una plataforma de formación de imágenes y analítica multiparamétrica para identificar el punto de control in cel l ul a para prevenir la muerte celular y para el uso del mismo para bloquear y prevenir la muerte celular. Otro objeto de la invención es que los inventores proporciona métodos para seguimiento en tiempo real de una o más marcas apoptóticas en neuronas o estirpes de célula. Otro objeto de la invención es proporcionar nuevos compuestos que inducen el gen silenciador caspasa-2 (también denominada Nedd-2; Ich-1), o inhiben la actividad de caspasa-2 pro-apoptótica (o interferir con procesos dependientes de caspasa-2 aguas abajo) . Otro objeto de la invención es proporciona composiciones farmacéuticas y métodos de tratamientos de enfermedades y lesiones donde se incluye caspasa-2. De acuerdo a un aspecto, la invención se refiere a un método para prevenir la muerte celular comprendiendo la determinación, dependiendo de una manera de inducción dada, en un tipo celular dado, de la jerarquía de eventos relacionados con apoptosis y el bloqueo del punto de control reversible más próximo para interferir con proceso apoptótico. Este método se lleva a cabo ventajosamente al combinar citometría de flujo cuantitativa rápida y análisis de microscopía de fluorescencia cuantitativa/cualitativa en neuronas . También debe llevarse a cabo en células no neuronales. Dicho método también puede utilizarse en estirpes de célula neuronal. El uso de ambas tecnologías permite la co-detección de las fases de decisión, efectuadora, degradación temprana y posterior de la apoptosis.

Como se ilustra por los ejemplos, la invención proporciona medios para desarrollar un monitoreo citométrico de flujo en tiempo real confiable de ??m y membranas de plasma, granulación morfológica celular y nuclear y cambios de tamaño de la célula en respuesta a ataques neurotóxicos incluyendo tratamiento MPTP. Utilizando sondas fluorescentes no soprepuestas , y/o anticuerpos específicos y/o agentes farmacológicos, la invención proporciona medios útiles que permiten el estudio de la biología celular de apoptosis y caracterizar nuevas moléculas protectoras. La privación de suero en cultivo celular se utiliza por los inventores como un modelo experimental para estudiar las trayectorias de muerte neuronal e identificar el punto de control aguas arriba. Durante el desarrollo neuronal y patología, las neuronas que fallan en encontrar los metabolitos u objetivos apropiados (oxígeno, glucosa, potasio, factores de crecimiento o neurotrópicos , nutrientes) y fuentes de factores neurotrópicos derivados del objetivo experimentan muerte celular apoptótica (Deck erth et al . , 1996; Deshmuck et a l . , 1996 y 1998; Lipton; 1999; Plenisla et a l . , 2001; Chang et a l . , 2002) . Al utilizar dicha plataforma analítica de formación de imágenes y multiparamétrica y al estudiar el papel selectivo de caspazas (inhibición farmacológica, eliminación de genes ARN que interfieren pequeños) en el contexto de muerte celular neuronal inducida por privación de suero aguda (SD), los inventores han encontrado que la caspasa-2 es un regulador aguas arriba de MMP dependiente de Bax. De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere particularmente al método en donde el punto de control es caspasa-2. El término "caspasa" como se utiliza en la descripción y las reivindicaciones, comprende las diversas formas obtenidas por separación alternativa . Como se muestra por los inventores, la activación de caspasa-2 temprana se requiere para transubicación Bax itocondrial , interrupción potencial de membrana mitocondrial (??m) / activación dependiente de liberación de citocromo c de caspasa-9 /caspasa-3 , alteraciones nucleares, exposición de fosfatidilserina y permeabilización final de la membrana de plasma (PMP) . De acuerdo a otra modalidad de la invención, dicho punto de control es una caspasa. De acuerdo con aún otra modalidad, dicho punto de control es activación de caspasa sin relacionar . La invención de esta manera también se refiere a moléculas capaces de prevenir o bloquear la actividad de caspasa-2 (y/o interacción de caspasa-2 /bax) , para silenciar la expresión de caspasa-2, y composiciones farmacéuticas útiles para tratar enfermedades y lesiones donde se incluye caspasa-2, particularmente para tratar lesiones por isquemia (hipoxia-). De acuerdo a otro aspecto, la invención se refiere a inhibidores de caspasa-2 y un método para inhibir/silenciar caspasa-2 en muerte celular neuronal . En una modalidad preferida de la invención, los inhibidores de caspasa-2 son «_ moléculas de ARN de doble filamento, aisladas capaces de tener como objetivo específicamente mARN de caspasa-2 para reducir o suprimir expresión de caspasa-2. La invención particularmente se refiere a la reducción o supresión de actividad de caspasa-2 en neuronas primarias o estirpes de célula neuronal, especialmente de origen humano y de ratón . También se refiere a la reducción o supresión de actividad de caspasa-2 por dichos inhibidores en células no neuronales, incluyendo células de tumor. Las moléculas de ARN de doble filamento utilizadas - para silenciar la expresión de caspasa-2 son dúplex compuestos de filamentos complementarios de 15-25 nucleótidos, preferentemente 19-25 nucleótidos.

Preferentemente, la interferencia pequeña del extremo de los filamentos se estabiliza contra degradación . siARN ventajoso para silenciamiento de caspasa-2 comprende dúplex de SEQ ID N°l y SEQ ID N°2 complementarias. Otro siARN ventajoso comprende dúplex de SEQ ID N°6 y SEQ ID N°7 complementarias . En otra modalidad preferida, los inhibidores de caspasa-2 son shARN . La invención de esta manera se refiere a cualquier construcción de shARN en base a las secuencias de siARN como se define arriba, que conduce in cel ull a a silenciamiento de caspasa-2 en células, preferentemente en neuronas y estirpes de célula. Las construcciones shARN preferidas comprenden la inserción de ambas, SEQ ID N°l y SEQ ID N°2, o ambas SEQ ID N°6 y SEQ ID N°7, o ambas SEQ ID N°8 y SEQ ID N°9 o ambas SEQ ID N°10 y SEQ ID N°ll. Dicho siARN o shARN se obtienen por síntesis o se producen en la célula de doble filamento . Como se ilustra por el ejemplo, la eliminación del gen a base de shARN o siARN previene completamente la muerte de neurona cortical inducida por privación de suero. La invención también se refiere a la síntesis de cada filamento de ARN, y la combinación de los filamentos para formar una molécula de doble filamento capaz de tener como objetivo específicamente caspasa-2 de mARN in cell ul a . Las moléculas de ARN sintentizadas se introducen en origen humano o animal o humano, bajo condiciones para expresión de caspasa-2 inhibidor. La etapa de producción comprende el uso de vehículos adecuados o se realiza por inyección.

Alternativamente, los vectores conteniendo la información genética para expresar dicho ARN se utilizan. Tales vectores y también en el alcance de la invención. Los inhibidores de la invención bloquean la muerte celular de ya sea tipo apoptótico o necrótico, o autofágico. Los inventores también han desarrollado herramientas farmacológicas (inhibición directa de actividad de caspasa-2 por péptido específico, preferente pero no exclusivamente pentapéptidos ) para atenuar muerte celular in vi tro mediada por caspasa-2. Dichas herramientas se describen en una solicitud pendiente de EE.UU. provisional. Ya que la separación de Bax y actividad de caspasa-2 ocurren aguas arriba de la itocondria en neuronas corticales inducidas para morirse por privación de suero y que la inhibición de actividad de caspasa-2 conduce a supervivencia a través de la inhibición de la separación de Bax, esta etapa de regulación se utiliza por los inventores para desarrollar nuevas moléculas capaces de proteger a las células contra muerte. Como se menciona arriba, los inventores han demostrado que las trayectorias dependientes de caspasa-2 se requieren en modelos exacto de muerte neuronal in vi tro y apoplejía in vivo . Los inventores han mostrado también que la inhibición específica de caspasa-2 es más eficiente para proteger las neuronas in vivo en comparación con la inhibición de caspasa de amplio espectro. Como se muestra en los Ejemplos, la caspasa-2 es un punto de verificación principal aguas arriba para inhibición de muerte celular neuronal (especialmente apoptosis) en situación patológica in vivo , incluyendo lesiones de hipoxia-isquemia (H-I) . La invención de esta manera se refiere a la inhibición in vi tro de actividad de caspasa-2 con molécula teniendo SEQ ID N°5. También se refiere a la inhibición in vi vo de actividad de caspasa-2, con la molécula teniendo SEQ ID N°5. Particularmente, la invención se refiere a moléculas capaces de interrumpir la interacción-entre Bax y caspasa-2 o para prevenir la separación de Bax dependiente de caspasa-2. Los péptidos preferidos son derivados de secuencia Bax con una longitud de 3 a 40 aminoácidos incluyendo la secuencia IQD (por ejemplo, SEQ ID 12-23) . Las secuencias particularmente preferidas comprenden: SEQ ID N°12: KTGAFLLQGFIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°13: GAFLLQGFIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°14: FLLQGFIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°15: LQGFIQDRAGR AGETP SEQ ID N°16: GFIQD AGRMAGETP SEQ ID N°17: FIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°18: IQDRAGRMAGETP SEQ ID N°19: IQDRAGRMAGE SEQ ID N°20: IQDRAGRMA SEQ ID N°21: IQDRAGR SEQ ID N°22: IQDRA SEQ ID N°23: IQDR La invención también comprende cualquier molécula capaz de interrumpir la interacción entre Bax y caspasa-2 o para prevenir la separación de Bax dependiente de caspasa-2, combinada en N-ter o C-ter con moléculas peptídicas o no peptídicas produciendo moléculas quiméricas capaces de introducir células (siguiendo o no un reconocimiento específico) para interrumpir la interación entre caspasa-2 y Bax. También comprende moléculas combinadas en N-ter o C-ter con moléculas peptídicas o no peptídicas produciendo moléculas quiméricas capaces de introducir células (siguiendo o no un reconocimiento específico) para prevenir o tratar apoptosis o proporcionar efectos citoprotectores protectores por mitocondría. Otras moléculas de péptidos derivadas de la molécula capaces de interrumpir la interacción entre Bax y caspasa-2 o prevenir la separación Bax dependiente de caspasa-2 tiene una longitud de 3 a 10 aminoácidos incluyendo la secuencia IQD combinada en N-eter o C-ter con marcador (por ejemplo: fluorogénico (AMC, AFC, PE..), colorimétrico (pNA... ) o substratos bíoluminescentes , radioisótopos.. ) . Es otro objeto de la invención proporcionar composiciones farmacéuticas que contienen inhibidores de caspasa-2 específicos. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un inhibidor de caspasa-2 como se define arriba, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención particularmente se refiere a composiciones farmacéuticas comprendiendo moléculas shARN y siARN tal como se definen arriba . También se refiere a composición farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de SEQ ID N°5. Las composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad efectiva de al menos una molécula capaces de interrumpir la interacción entre Bax y caspasa-2 o prevenir la separación Bax dependiente de caspasa-2, particularmente a los péptidos derivados de secuencia Bax como se define arriba, particularmente aquellas teniendo la secuencia SEQ ID N°12 a SEQ ID N°23 y las moléculas derivadas de las mismas. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención se proponen ventajosamente para la administración por administración oral, local (intracerebroventricular , implantación intracerebral de Gelfoam® impregnado con compuestos o composiciones farmacéuticas, implantación intracerebral de instrumentación para suministro mecánico, por ejemplo) o sistémica (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa) para reducir la muerte celular. La administración de los inhibidores comprendiendo dúplex de ARN se lleva a cabo ventajosamente en línea con métodos clásicos para introducir un ácido nucleico en una célula obj etivo . La administración intraperitoneal de un inhibidor específico de caspasa-2 reduce fuertemente el tamaño de infarto en crías de rata sometida a lesión cerebral de hipoxia-isquemia transitoria . Dichas composiciones farmacéuticas son particularmente útiles para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones por hipoxia-isquemia (H-I) H-I (isquemia con o sin hipoxia/hipolglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo) . También existe gran interés para ' el tratamiento situación patológica incluyendo lesiones por hipoxia-isquemia cerebral (H-I) (isquemia con o sin - hipoxia/hipoglicemia ) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . Las composiciones farmacéuticas de la invención también son útiles para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones H-I, global o focal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo ) . También son particularmente ventajosas para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-i neonatal o adulta (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . También son útiles para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I neonatal o adulta (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo ) . También pueden utilizarse para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I permanente o transitoria (isquemia con o sin hipoxia/hipoglícemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . Dichas composiciones farmacéuticas también son útiles para el tratamiento de lesiones por H-I particularmente muerte neuronal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía, lesiones cerebrales con o sin situación de reperfusión (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . Pueden utilizarse para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en Oclusión Arterial Cerebral Media (MCAO) . Las composiciones farmacéuticas arriba definidas son de mayor interés para el tratamiento de muerte neuronal particularmente cuando al menos uno o más de los eventos patológicos se combinan; H-I global o focal, transitoria o permanente, adulta o neonatal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) en nivel cerebral, o en el nivel de cuerpo total) con o sin reperfusión. Otras aplicaciones de las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden su uso: - para prevenir y/o tratar apoptosis durante enfermedades degenerativas crónicas, por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinobulbar , enfermedad de prión, o - para prevenir y/o tratar apoptosis durante la lesión de la médula espinal, o para prevenir y/o tratar apoptosis resultante de lesión cerebral traumática, o 5 - para proporcionar efecto neuroprotector, o para proporcionar efecto cerebroprotector , o para prevenir y/o tratar célula citotóxica T y apoptosis mediada por la célula asesina natural asociada con enfermedad autoinmune y rechazo de transplante, o para prevenir la muerte celular de células cardiacas incluyendo falla cardiaca, cardiomiopatía, infección viral o infección bacteriana de corazón, isquemia miocardial, infarto miocardial, e isquemia miocardial, injerto de bypass en la arteria coronaria, o para prevenir y/o tratar toxicidad del medicamento mitocondrial, por ejemplo, como un resultado de quimioterapia o terapia de VIH, para prevenir la muerte celular durante la infección viral o infección bacteriana, o para prevenir y/o tratar la inflamación o enfermedades inflamatorias, enfermedad del intestino inflamatoria, sepsis y choque séptico, o para prevenir la muerte celular de etapas de folículo a ovocito, de etapas de ovocito a huevo maduro y esperma (por ejemplo, métodos para congelar y transplantar el tejido ovárico, fecundación artificial), o - para preservar la fertilidad en mujeres y hombres después de quimioterapia, o para preservar la fertilidad en animales hembras y machos, o para prevenir y/o tratar, degenerescencia macular y glaucoma, o para prevenir y/o tratar hepatitis aguda, hepatitis activa crónica, hepatitis B, y hepatitis C, o - para prevenir la pérdida de cabello, y dicha pérdida de cabello debido a calvicie de patrón macho, radiación, quimoterapía o tensión emocional, o para tratar o mejorar el daño de la 5 piel (debido a exposición al alto nivel de radiación, calor, quemaduras, químicos, sol, y enfermedades autoinmunes), o para prevenir la muerte celular de las células de médula ósea en síndromes mielodisplásticos (MDS), o para tratar pancreatitis, o para tratar síndrome respiratorio, o para tratar osteoartritis, artritis reumatoide, psoriasis, glomerulonofritis , ateroesclerosis , y enfermedad de injerto contra huésped, o para tratar apoptosis de pericito retinal, glaucoma de apoptosis de neuronas retínales, daños retínales resultantes de isquemia, retinopatía diabética, o para tratar estados de enfermedad asociados con un incremento de apoptosis, o para prevenir la muerte celular en vegetales (por ejemplo: plantas, flores, talofitos (hongos, alga marina ) ... ) De acuerdo con todavía otro aspecto, la invención se refiere a un método para bloquear o-prevenir la muerte celular in vi tro comprendiendo seleccionar terapéuticamente moléculas con respecto a muerte celular, particularmente apoptosis . Otras características y ventajas de la invención se dan en los siguientes datos con referencia a las figuras, que representan: Figura 1 : Microscopia de fluorescencia combinada y detección de citometria de flujo de permeabilización de membrana de plasma (PMP) durante apoptosis de neuronas primarias privadas de suero . (A) Contraste de fase y micrográficas de fluorescencia de neuronas corticales cultivadas sometidas o no (Co.) a 24 horas de privación de suero (SD) . Las células se colorearon con el ligando de ADN fluorescente permeable a célula Hoechst 33342 (Ho. 342, fluorescencia azul) y 7-amino-actinomicina D intercalante de ADN fluorescente impermeable a célula (7-AAD-; fluorescencia roja) . Las neuronas corticales primarias representando el fenotipo dominante (>60% de células sometidas a SD) se muestran. En neuronas SD, fluorescencia morada (mezcla de rojo y azul) es indicativa de la co-presencia de 7-AAD y Hoechst 33342 en núcleos condensados (fluorescencia morada en fusión), correlacionado así PMP con apoptosis nuclear. (B) Efecto de tritón en PMP y estado de cromatina de neuronas cultivadas. Las neuronas cultivadas se colorean con 7-AAD, Hoechst 33342 y el tinte fluorescente CellTracker Green™ no tóxico. Las micrográficas representativas de neuronas muestran ya sea fusión de contraste de fase con tanto Hoechst 33342 y 7- AAD (paneles superiores) o CellTracker Green™ solo (paneles inferiores) en la ausencia (Co.) o después de 5 minutos de tratamiento con 0.02% de tritón. (C) Ausencia de PMP después de tripsinización de neuronas. Las neuronas cultivadas se colorearon con 7-AAD, Hoechst 33342 y CellTracker Green™, se sometieron a procedimiento a base de tripsina de separación cuidadosa (como se describe en materiales y métodos) . Las micrográficas representativas de neuronas tripsinizadas analizadas como en (B) se muestran junto con cuantificación FC de fluorescencia de CellTracker Green™ asociada con neurona a 0, 1, 3 y 4 horas después de tripsinización. (D) Análisis FM de PMP y piknosis nuclear de neuronas después de SD. La icrográfica representativa de neurona cultiva sometida a 24 horas SD muestra fusión de contraste de fase con tanto Hoechst 33342 y 7-AAD. El porcentaje de neuronas positivas PMP (teniendo núcleos morados) se indica. (E) Análisis FC de PMP. Las muestras de neuronas analizadas en (D) se tripsinizan subsecuentemente y se someten inmediatamente a cuantificación FC de PMP. El diagrama de puntos representativo (FSC/FL3) se muestra. El porcentaje calculado por FC de neuronas positivas PMP se indica. La inserción muestra una micrográfica de contraste de fase representativa de neurona cortical tripsinizada .

(F) Cuantificación comparativa (n=30) de PMP utilizando FM (conteo óptimo antes de tripsinización) y FC (conteo automático después de tripsinización) . (G) Correlación lineal entre cuantificación de PMP a base de FM y FC .

Figura 2: Detección combinada de PMP, exposición PS y modificaciones nucleares durante apoptosis neuronal . (A) Micrográficas de fluorescencia de neuronas corticales cultivadas sometidas a 24 horas de SD. Las células se colorean con 7-AAD (fluorescencia roja) y anexina V conjugada con FITC (fluorescencia verde) . Las neuronas corticales primarias se dividen en 3 su-bconj untos apoptóticos principales: apoptótico temprano (anexina V*,7-AAD", subconjunto 1), apoptótico posterior (anexina V*,7-AAD+, subconjunto 2) y apoptótico en etapa final (anexina V~,7-AAD+, subconjunto 3) . (B) Detección FC de exposición PS y PMP. El análisis de diagrama de puntos representativo de subconjunto de neuronas 1, 2 y 3. Neuronas vivas no muestran transubicación PS (MFI anexina V = 81.4 +/- 17.9) y son impermeables a 7-AAD (neuronas negativas dobles, subconjunto L) . (C) Cinéticas FC de la apariencia de los subconjuntos apoptóticos por todo SD (n=4; +/-desviación estándar). (D) Determinación a base de FM de perímetro nuclear combinado con análisis a base de FC de tamaño de neurona (FSC) entre subconjuntos apoptóticos. Las neuronas corticales cultivadas sometidas a 245 horas de SD se colorean con Hoechst 33342, 7-AAD y anexina V conjugada con FITC. Los campos múltiples se adquieren durante observaciones FM y muestras donde entonces se procede a análisis FC de tamaño celular utilizando el parámetro difusor en avance (FSC) . La coevaluación del perímetro nuclear (n=15; +/-desviación estándar) y FSC (n=7; +/- desviación estándar) se presenta en la base de por-subconjunto. (E) Análisis detallado de FSC, SSC y características nucleares de neuronas vivas (subconjunto L) y muertas (subconjuntos 1, 2, 3).

Los asteriscos denotan efectos altamente significativo (p<0.0001) y § denota significativos (p<0.05) en comparación con el subconjunto previo. Figura 3 : Detección y ordenamiento molecular de caspasa-9 activada, caspasa-3, exposición PS y PMP (A) Micrográficas de fluorescencia de neuronas corticales cultivadas sometidas a 24 horas de SD. Las células se colorean con FAM- DEVD-fmk (FLICA; fluorescencia verde), 7-AAD (fluorescencia roja) y Hoechst (fluorescencia azul). Cuatro fenotipos distintos se detectan: neuronas apoptóticas vivas (Caspasa-3", 7-AAD", subconjunto L), apoptóticas tempranas (Caspasa-3+, 7-AAD", subconjunto 1), apoptóticas posteriores (Caspasa-3+, 7-AAD+, subconjunto 2), y apoptóticas en etapa final (Caspasa-3", 7-AAD+, subconjunto 3) . (B) Co-detección FC de PMP y actividad similar a caspasa-3. Análisis de diagrama de puntos representativo de subconjuntos de neuronas L (en azul), 1 (en verde), 2 (en amarillo) y 3 (en rojo) . (C) Neuroprotección en la presencia del inhibidor de pan-caspasa Q-VD-OPH. Micrográficas de fluorescencia de neuronas corticales cultivadas se preparan y marcan como en "A". (D) Efectos de compuestos reguladores de apoptosis en activación de caspasa-3 y PMP. Las neuronas se tratan con el inhibidor de proteasa de serina Pefabloc, Ba bloqueador ANT o inhibidores de caspasa indicados (z-DEVD-fmk, z-VAD-fmk, Q-VD-OPH) y se someten a 24 horas de privación de suero. Las células se colorean con 7-AAD (fluorescencia roja) e inmunocolorean para caspasa-3 activada, y después se somete a análisis FC . Los resultados son valores promedio (desviación estándar +_) de tres experimentos independientes. (E y F) . Análisis de cinéticas FM y FC de actividad de caspasa-3 y exposición PS por toda la privación de suero. Las células se colorean con FLICA conjugado con sulforhodamina • (fluorescencia roja), anexina V conjugada con FITC (fluorescencia verde), y Hoechst (fluorescencia azul). Las micrográficas de fluorescencia presentas en (E) corresponden a los subconjuntos "a" a ?d" indicados en los diagramas de puntos (F) . (G) Micrográficas de fluorescencia de neuronas corticales cultivadas sometidas a 24 horas de extracción de suero en la ausencia (SD) o presencia (+LEED) del inhibidor de caspasa-9 z-LEHD-fmk. Las células se colorean con Hoescht (fluorescencia azul) y co-colorean' con FAM-LEHD-fmk (FLICA; fluorescencia verde) en los paneles 1 o co-colorean con anexina V conjugada con FITC (fluorescencia verde) en los paneles 2. (H) Jerarquía entre punto de control similar a ANT, actividad similar a caspasa-9 y PMP. Las neuronas se tratan con BA de bloqueador ANT o z-LEHD-fmk y se someten a 24 horas de SD. Las células se colorean con 7-AAD (fluorescencia roja), co-colorean con FAM-LEHD-fmk, y después se someten a análisis FM . Los resultados son valores promedio (desviación estándar +_) de tres experimentos independientes. Figura 4 : Detección combinada de ??m y PMP en neuronas .

(A) Micrográficas de fluorescencia de neuronas primarias cultivadas por el periodo indicado, en la ausencia o presencia (control de 24 hr; Co) de suero. Las células se colorean con Hoechst 33342 (fluorescencia azul) y el tinte sensible a ??m JC-1 (fluorescencia naranja de mitocondria con un alto ??m, fluorescencia verde de mitocondria con un bajo ??m) . Las neuronas representando el fenotipo dominante se muestran (>50%) . Dec, fase de decisión; Eff , fase efectuora; Deg, fase de degradación. (B) Análisis de diagrama de puntos FC de ??m y PMP. Neuronas SD se colorean con 7-AAD y JC-1, tripsinizan y se someten inmediatamente a análisis FC . Diagramas de puntos FL2 (JC-1)/FL3 (7-AAD) revelan dos subconjuntos de neurona de bajo ??m; Subconjunto II' impermeable a 7-AAD, y II", 7-AAD positivo.

(C) Visualización FM de subconjuntos I, II'. II" a través de la co-detección de ??m (JC-1) y permeabilidad de membrana de plasma (7-AAD) . (D) Monitoreo en tiempo de FC de subconjuntos II' y II" en neuronas privadas de suero. (E) Neuroprotección por BA pero no z-DEVD-fmk evaluado por FC . Los histogramas indican ya sea el porcentaje de neuronas de bajo ??m (subconjuntos II'+II'', histogramas azules), o el porcentaje de neuronas positivas 7-AAD (subconjunto II'', histogramas negros) después de 24 horas de SD en la ausencia o presencia de BA o z-DEVD-fmk. Los resultados son el promedio de 3 experimentos independientes (promedio +/- desviación estándar) . Figura 5. Detección en tiempo real de variación de ??m en neuronas corticales primarias . (A) Fotoblanqueado JC-1 inducido por irradiaciones repetitivas FM . Las micrográficas de fluorescencia de neuronas coloreadas con JC-1 después de 1, 3, 5, 10 y 15 irradiaciones (1.2 s; 5 Watts) . El intevalo entre dos irradiaciones fue de 1 min. Observe la desaparación progresiva de la fluorescencia naranja. (B) Regresión logarítmica de intensidad de fluorescencia naranja JC-1 valorada en el campo irradiado. (C) Procedimiento para monitoreo FC en tiempo real de ??m y PMP utilizando sondas JC-1 y 7-AAD. La micrográfica de fluorescencia insertada muestra una visualización representativa de neuronas primarias co-coloreadas con hoechst, JC-1 y 7-AAD después de tripsinización. Observe que en estas condiciones experimentales sin PMP, no son detectables ni la pérdida de ??m (neuritos y cuerpo celular), ni la condensación nuclear. (D) Aplicación a neuronas primarias. (DI) Micrográficas de fluorescencia de neuronas tratadas o no (Co.) con mCICCP (100 µM; 30 min) . (D2) Monitoreo FC en tiempo real de fluorescencias verde JC-1 y naranja JC-1. La línea blanca corresponde a la fluorescencia promedio de neuronas. (D3) Cursos en el tiempo de depolarización mitocondrial (naranja JC-1), PMP (7-AAD) y tamaño ( FSC ) /granulación (SSC) variaciones obtenidas en las mismas muestras (Control, línea punteada y tratada con mCICCP, línea plana) . Figura 6. Análisis FC en tiempo real de modificaciones de ??m e inducción PMP por diferentes moléculas neurotóxicas (A-l) FM de tiempo fijo del ??m y estado de membrana de plasma. Las neuronas se tratan (o no; Co.) con 0.6 mM SNP o 1 mM MPTP o 20 mM etanol (etOH) por 45 minutos. La célula se colorea con JC-1 (fluorescencia naranja de mitocondria con un alto ??m, fluorescencia verde de mitocondria con un alto ??m) , Hoechst (fluorescencia azul), y 7-AAD (fluorescencia roja) . (A-2) Análisis FC en tiempo real de ??m (fluorescencia naranja JC-1) por 15 minutos de tratamiento con medio solo (Co.), 0.6 mM SNP, 1 M MPTP o 20 etOH. Eventos naranjas corresponden a neuronas de alto ??m y eventos verdes corresponden a neuronas de bajo ??m. (A-3) Análisis FC en tiempo real de PMP (fluorescencia 7-AAD) . (B) Cuantificación por FC en tiempo real. (B-l) Análisis de proporción FSC/SSC de neuronas tratadas con MPTP. Las líneas rojas corresponden al valor promedio de proporción FSC/SSC en neuronas de alto ??m y líneas verdes punteadas corresponden al valor promedio de proporción FSC/SSC de neuronas de bajo ??m (como se define en A-2) . La línea negra plana corresponde al valor promedio de proporción FSC/SSC en población total de neuronas. (B-2) Análisis de intensidad de fluorescencia promedio naranja JC-1 (MFI) en neuronas tratadas con MPTP. Líneas rojas planas y líneas verdes punteadas corresponden a MFI naranja JC-1 entre neuronas con bajo y alto ??m, respectivamente. La línea negra plana corresponde a MFI naranja JC-1 en población total de neuronas. (B-3) Análisis de la intensidad de fluorescencia promedio 7-AAD (MFI) en neuronas tratadas con etOH. Figura 7 Jerarquía de eventos relacionados con apoptosis durante muerte neuronal inducida por SD . Las fases principales de apoptosis se indican junto con sus evenetos subcelulares correspondientes. Una vista artística de conducta neuronal durante la muerte celular se presenta.

Las neuronas vivas se dibujan con núcleos azules (etiquetado Hoechst) y mitocondria roja (etiquetado JC-1, ??m alto) . Durante la mitocondria verde de fase de decisión también aparece (etiquetado JC-1; ??m bajo) . La fase efectuora se asocia con enco?gimiento nuclear y activación de caspasa-3 difusa (citosol rosa difuso) . La fase de degradación se asocia con, frenos de neuritos, exposición PS (membrana de plasma verde) y caspasa-3 activada citosólica discreta. La etapa final de degradación se asocia con permeabilización de membrana de plasma final (PMP) conduciendo a incorporación de 7-AAD nuclear (núcleos encogidos rojos) . Separación Baz y transubicación apareció aguas arriba de la mitocondria pero aguas abajo de la actividad de caspasa-2. El punto de impacto de inhibidores específicos se indica. Figura 8. Inhibición de pan-caspasa promueve la supervivencia de neuronas córticas primarias inducidas para morirse por privación de suero. (A) Respuestas en tiempo para características apoptóticas por todos los cultivos de neuronas córticas privadas de suero (SD) 48 hr (DIV6) . Las cinéticas de apariencia de neuronas con bajo ??m (n=30), apoptosis nuclear (NA) (n=30), permeabilidad de la membrana de plasma (PMP) (n=30) o exposición de hojilla exterior de' residuos de fosfatidilserina (PS) (n=7) se determinan por tanto microscopía de fluorescencia y análisis de citometría de neuronas marcadas con JC-1, Hoechst 33342, 7-actinomicina D (7-AAD) o anexina v conjugada con FITC, respectivamente (como se describe previamente en Lecoeur et a l . , 2004) . Observar la disminución progresiva en neuronas positivas PS después de 24 horas, ya que se indica la transición de un subconjunto de bajo ??ra/Na+/7-AAD+/FITC-anexina V+ a un subconjunto terminal de bajo ??m/Na+/7-AAD+/FITC-anexina V" (Lecoeur et a l . , 2004) . (B) Análisis comparativo de diferentes inhibidores de pan-caspasa para neuroprotección. Las neuronas se someten a SD concomitante con el inhibidor de caspasa de espectro amplio, Q-VD-OPH, Z-VAD-FMK (ZVAD) o BOC-D-FMK (BOC-D) (todos en 100 µm) . Los histogramas indican el porcentaje de neuronas con bajo ??m (n=12), NA (n=12), exposición PS (n=7) y PMP (n=12) permaneciendo cerca del nivel de control (Co.) . (C) Q-VD-OPH altamente conserva tanto morfología nuclear como la integridad de los neuritos después de 24 hr-SD. Los campos representativos para control (Co.), neuromas tratadas con SD y Q-VD-OPH (100 µm) ; paneles superiores, micrográficas de contraste de fase; paneles inferiores, contraste de fase y fluorescencia Hoechst nuclear azul se fusionan. Observe que la falta de tanto neuritos pronunciados y condensación/fragmentación nuclear en presencia del inhibidor de pan-caspasa. (D) Cuatro caspazas son al menos activadas durante 24 hr-SD. La activación de Caspasa-2 (n=14), Caspasa-8 (n=3), Caspasa-9 (n=8) se detectan al utilizar FLICAs, FAM-VDVAD-FMK, FAM-LETD-FMK y FAM-LEHD-FMK, respectivamente. La activación de Caspasa-3 se detecta con ya sea anticuerpo policlonal de caspasa-3 anti-separado conjugado con ficoeritrina (n=5) o FAM-DEVD-FMK (n=12), los dos planteamientos correlacionándose bien. Observe que el bajo nivel de activación de caspasa-8 durante SD. Todas estas caspazas se inactivan completamente por 100 µm Q-VD-OPH) . (E) Los inhibidores de caspasa de espectro amplio fallan en prevenir neuronas significativamente corticales de NA y PMP inducida por ß-amiloide (25-35) (ßA) , l-metil-4-fenil-l, 2, 3, 6-tetrahidropiridina (MPTP) , ácido 3-nitropropiónico (3-NPA), nitroprusida de sodio (SNP) o ionomicina (Iono.) . Las neuronas corticales se tratan en ausencia o presencia de 100 µm Z-VAD-FMK (ZVAD) o Q-VD-OPH (QVDOPH) por 24 horas con yonomicina (6 µm) o ßA25-35 (60 µm) ; 48 hrs con MPTP (2 mM), 3-NPA (100 µm) o SNP (500 µm) . Las neuronas desplegando tanto NA como PMP como en (A) se cuentan. La prueba de Student impar se realiza: #, p=0.01. Figura 9. Actividad como caspasa-2 pre mitocondrial se requiere para muerte celular apoptótica de neuronas corticales inducida por privación de suero (A) Actividad similar a caspasa-2 es el caso más temprano detectado durante muerte celular inducida por SD. Los inhibidores específicos de caspasa-3, caspasa-9, caspasa-8 y caspasa-2 se agregan al inicio de SD, respectivamente a 100 µM : Z-DEVD-FMK (DEVD) (n=8), Z-LEHD-FMK (LEED) (n=6), Z-LETD-FMK (LETD) (n04), Z-VDAD-FMK (VDVAD) (n=10) . La caída en ??m, NA, exposición PS y PMP se determinan a 24 hrs después de coloraciones con anexina V conjugada con FITC, 7-AAD, Hoechst 33342 y JC-1, respectivamente. VDVAD elimina estas marcas de apoptosis contrarias a DEVD y LETD. Mientras previene exposición PS, NA y PMP, LEED no deteriora la caída ??m. Los asteriscos se refieren a fenotipo nuclear particular en neuronas tratadas con LEED como se representa en la figura 2B. Los resultados se expresan como % de efecto inhibidor. (B) Micrográficas de fluorescencia representativa para núcleos de neuronas tratadas con inhibidores de caspasa específicos. En contraste a DEVD y LETD, núcleos coloreados con Hoechst 33342 de neuronas tratadas con VDVAD muestran morfología similar como controles. Los núcleos de neuronas tratadas con LEED tienen un tamaño reducido correspondiente a la condensación de etapa I (de acuerdo a la clasificación de Susin; Susin et a l . , 1999) . (C) Activación similar a Caspasa-2 precede la caída de ??m en neuronas SD. Las cinéticas de activación de caspasa-2 y alteraciones de ??m se evalúan por microscopía de fluorescencia después de co-colorear con tanto FAM-VDVAD-FMKI (verde) y CMXRos de tinte sensible a ??m (rojo) . La actividad similar a Caspasa-2 (2 hrs) se detecta antes de la caída ??m progresiva (8.5 hrs) . mCICPP (100 µM, 45 min) se utiliza como control positivo para depolarización de membrana mitocondrial completa. (D) Evaluación de la jerarquía entre caspasa-2, caspasa-3, caspasa-9. Cada inhibidor de caspasa indicado (100 µM) y el Pefabloc inhibidor de proteasa de serina (100 µM) , se agrega al inicio de SD y actividades similares a caspasa se detectan 24 hrs después al utilizar FLICAs específicas. Los hisotagramas representan % de inhibición para caspasa-2, caspasa-3, caspasa-9 (n=4) . Figura 10. Determinación del mejor patrón para neuroprotección inducida por VDVAD o QVDOPH. La muerte celular neuronal corresponde a neuronas que despliegan simultáneamente bajo ??m (verde JC-1), fenotipo NA (Hoechst 33342) y PMP (incorporación de fluorescencia roja 7-AAD) después de 24 hr SD en presencia de inhibidores de caspasa reportados para cultivos SD desprovistos de inhibidores. El panel izquierdo muestra la respuesta de dosis para cada inhibidor agregado al inicio de SD, y confirma que 100 µM se requieren para supervivencia óptima. Además los efectos protectores (a t=24 hrs) de ya sea 100 µM VDVAD o QVDOPH progresivamente se reducen cuando se agrenan 2, 4, o 6 .hrs después del comienzo de SD (panel derecho) . Las neuronas se cuentan por microscopía de fluorescencia (n=3) . Figura 11. Prueba genética para apoptosis mediada por caspasa-2 inducida por privación de suero; eliminación de caspasa-2 por planteamiento de interferencia de ARN. (A) Silenciamiento de gen de caspasa-2 de murino por ARN de interferencia pequeña. Las neuronas en DIV6 se transfectan con siARNs por 6 hr's como se describe en sección experimental antes de la incubación adicional en medio N5. Paneles superiores: expresión genética de ca spa sa -2 endógeno en 24 hrs después de transfección se determina por análisis RT-PCR. Obsérvese que siARN C2 wt disminuye la expresión de ca spa sa -2 sin ningún efecto secundario en otros genes ( ca spa sa -9 , GAPDH) ; paneles inferiores: eliminación de pro-caspasa-2 en neuronas de control por siARN C2 wt valorado por western blotting. SiARN C2 m es el control negativo para silenciamiento de gen. GAPDH se utiliza como un control de carga igual. (B) Monitoreo in cel l ul a de eliminación de caspasa-2 mediante inmunocoloración (106C) . La intensidad de fluorescencia se disminuye al 70% por 24 hrs después de transfección con siARN C2 wt y progresivamente se recupera a 72 hrs. La extinción de fluorescencia se sigue bajo FM (5 campos correspondientes a 150 células elegidas aleatoriamente por condición por experiencia) al utilizar la opción Medidordesonda de software Leica Q Fluoro. Observe que la eliminación ocurre en todas las neuronas. (C) Los parámetros de actividad de caspasa-2 y de muerte celular se eliminan después de interferencia de ARN en neuronas SD. Las neuronas transfectadas en DIV6 por 6 hrs con siARNs, se re-cultivan en medio rico en suero por 16 hrs, antes de 24 hrs más de acondicionamiento en medio libre de suero. Las micrográficas fluorescentes representativas: condensación nuclear /fragmentación (Hoechst; azul), actividad de caspasa-2 ( FAM-VDVAD-FMK, verde; subconjunto 1) y PMP (7-AAD, rojo, subconjunto 3); subconjuntos 2 se refieren tanto a caspasa-2 como neuronas positivas 7-AAD.

Diferente a siARN C2n, siARN C2 wt evita la activación de caspasa-2 (n=5) . (D) Actividad de caspasa-2 es crítica para muerte celular neuronal inducida por SD pero no de yonomicina. Interferencia ARN evita otras marcas de muerte celular SD. La cuantificación de los parámetros de muerte celular en ausencia o presencia de los inhibidores indicados (100 µM) o siARNs (n=5). Las neuronas se tratan como en (C) para interferencia de ARN. Caída en ??m, NA, exposición PS y PMP se determinan por coloraciones con anexina V conjugada con FITC, 7-AAD, Hoechst 33342, y JC-1, respectivamente. La trayectoria de muerte celular inducida por tratamiento por 24 hrs con 6 µM del yonofero Ca2+ es independiente de caspazas-2; Observe la ausencia de protección por VDVAD o siARN C2 wt (n=3) . (E) Anaglíficos representando los efectos protectores de siARN C2 wt en PMP (incorporación de 7-AAD), nuclear (Hoechst 33342; azul) y morfologías de neurita después de SD en contraste al tratamiento de yonomicina (6 µM, 24 hrs); resultados de fluorescencia rosa de fusión de Hoechst y 7-AAD. Las fluorescencias se fusionan con imágenes de contraste de fase.

Figura 12. Caspasa-2 se requiere tanto para liberación de citocromo c post-mitocondrial y transubicación Bax pre-mitocondrial en neuronas privadas de suero por 24 hr (A) VDVAD y siARN C2 wt reducen la liberación de citocromo. c post-mitocondrial. Panel izquierdo: micrográficas fluorescentes correspondientes a los efectos de inhibidores de caspasa selectivos (100 µM) . Las neuronas tratadas o no por inhibidores durante la extracción de suero por 24 hr se colorean con Hoechst 33342 (azul) y el anticuerpo monoclonal (6H2.B4) reconociendo el citocromo c (rojo) . SD acciona la liberación de citocromo c citoplásmico (coloración difusa) de mitocondria (coloración acentuada) . Panel derecho: Cuantificaciones correspondientes por FM para liberación de citocromo. c (n=4). Para análisis siARNs, las neuronas en DIV6 se transfectan por 6 hrs con siARNs, después- se cultivan en medio completo N5 antes de SD por 24 hr adicional. Observe que Pefabloc (100 µM) , LEHD de' inhibidor de caspasa-9 y DEVD de inhibidor de caspasa-3 fallan en deterior la liberación de citocromo c. (B) Interferencia de ARN elimina la activación de caspasa-2 y evita la activación dependiente de liberación de citocromo c aguas agua de caspasas-9 y caspasa-3. Las neuronas se tratan como en A, o con 100 µM QVDOPH o VDVAD y se colorean con FAM-VDVAD-FMK, FAM-DEVD-FMK y FAM-LEHD-FMK (n=4) . Observe que la trayectoria de muerte celular inducida por yonomicina (6 µM) por 24 hrs es dependiente de activación de caspasa-2 en neuronas corticales. (otras actividades de caspasa no se probaron) . (C) Micrográficas representantivas para inactivación de caspasa-3 in cel l ul a por siARN C2 wt : paneles superiores, fluorescencia Hoechst nuclear azul y fluorescencia verde de caspasa-3 (citoplásmica) se fusionan; paneles inferiores, fluorescencia nuclear 7-AAD rojo resultante de PMP y fluorescencia verde de caspasa-3 citoplásmico se fusionan. SiARN C2 wt completamente elimina la activación de caspasa-3, NA y PMP. (D) VDVAD y siARN C2 wt reducen transubicación Bax pre-mitocondrial. Las micrográficas fluorescentes (panel izquierdo) y cuantificación correspondiente (panel derecho) de los efectos de inhibidores de caspasa selectiva (100 µM) y siARNs. Las neuronas sin tratar y las neuronas tratadas como en A por ya sea los inhibidores de siARNs, se colorean con Hoechst 33342 (azul) y el anticuerpo ?21 policanol reconociendo Bax (verde) en extracción de suero por 24 hr, antes de clasificarse bajo FM (10 campos correspondientes a 150-300 células aleatoriamente elegidas por condición por experiencia (n=4) . La reubicación Box de citoplasma (coloración difusa) en mitocondria (coloración acentuada) se previene por VDVAD. QVDOPH y siARN C2 wt . Observe que Prefabloc, LEED y DEVD fallan en deteriorar la reubicación de Bax. Figura 13. Colocación de los efectos protectores de VDVAD contra furosemida tanto en transubicación Bax y actividad de caspasa-2 (A) La actividad de caspasa-2 está aguas arriba de la transubicación Bax. Las neuronas se incuban al inicio de 24 hr-SD con 2 mM furosemida (Furo.) o 100 µM VDVAD. Las neuronas se marcaron con Hoechst 33342 (Azul) e inmunocolorearon para Bax con anticuerpo ?21 (panel superior; verde) o se marcaron con FAM-VDVAD-FMK (panel inferior; verde) . Las micrográficas de fluorescencia representant ivas muestran que la reubicación de Bax mitocondrial en SD se previene parcialmente por fuorese ida sin deteriorar la actividad de caspasa-2. En contraste, VDVAD bloquea tanto la activación de caspasa-2 como la reubicación de Bax. (B) Cuantificación por FM en neuronas desplegando reubicación Bax o actividad de caspasa-2 (n=4) después del tratamiento como en (A) . Pefabloc es control negativo. (C) Inhibición de transubicación de Bax por furosemida resulta en deterioro de la caída de ??m, NA, PMP y liberación de citocromo c .' Las neuronas tratadas al inicio de SD por 24 hrs con 2 mM furosemida o 100 µM VDVAD se marcan con JC-1, Hoechst 33342, 7-AAD y anticuerpo monoclonal reconociendo el citocromo c (6K2.B4) . Las células se clasifican por FM (n=3-8) . Figura 14. Separación a de Bax es tanto dependiente de la caspasa-1 citoplásmica como independiente de calpaína durante SD (A) mARN de caspasa-2 se analiza por RT-PCR en neuronas SD por 24 hrs, no revelando alteración en el nivel de ARN. La expresión de GAPDH se utiliza como control de carga. (B) Caracterización de separación de Bax mediada por caspasa-2. Las neuronas se someten a SD por 2, 5, 8, 15 y 24 hrs y el curso de tiempo de la separación de Bax se analiza por Western Blotting utilizando el anticuerpo policlonal de conejo elevado contra Bax a de ratón eliminado para los 21 aminoácidos de terminal carboxi (?21) . Bax p22 nativo se separa temprana y progresivamente como Bax pl8. (C) Separación de Bax en una foma 18 kDa ocurre en el término n durante SD. Panel derecho: Comparación de análisis Western Blot de las mismas muestras (control y neuronas SD) al utilizar el anticuerpo policlonal de conejo elevado contra Bax de ratón eliminado para los 21 aminoácidos de termínale 'arboxi (?21) y el anticuerpo policlonal de conejo elevado contra un trazado de péptido en el término amino de Bax a (N20) . Ambos anticuerpos reconocen Bax nativo mientras Bax separado solamente se detecta con ?21. (D) El perfil de inhibidito de proteasa de separación de Bax se caracteriza en la presencia de 100 µM VDVAD o siARNc2wt (3.8 µg) para SD por 24 hrs. VDVAD y siARN C2 wt evitan la separación de Bax. La separación de Bax depende tanto de la presencia de caspasa-2 como de la actividad de caspasa-2. Western Blotting se realiza al utilizar el anticuerpo ?21. (E) Privación de suero induce la transubicación de Bax de Bax pl8 separado en mitocondria, sugiriendo que pl8 Bax es la forma activa para promover alteraciones mitocondriales adicionales. La fracción mitocondrial y cytosol de neuronas SD se aislan y la transubicación de Bax se detecta por Western Blotting al utilizar el anticuerpo anti-Bax ?21. El anticuerpo anti-HSP60 de ratón se utiliza para verificar la fracción mitocondrial. p22 Bax está presente en citosol de neuronas SD por 24 hrs. Sin embargo, Bax se separa parcialmente en SD por 24 hrs en una forma pl8 que se desubica de citosol a mitocondria. siARN C2 wt o VDVAD evita la integración de pl8 Bax en membrana mitocondrial. (F) Separación Bax mediada por caspasa-2 es específica del estímulo en neuronas corticales. Las neuronas se tratan por 8, 15 o 24 hrs por estaurosporina (STS, 10 µM) o yonomicina en presencia o ausencia del anticuerpo ?21. STS y yonomicina inducen separación Bax independiente de caspasa-2 en neuronas corticales. (G) Separación Bax no se media por calpaínas . La habilidad de inhibidores de calpaína específicos (25 µM ALLN para calpaína I; 25 µM ALLM para calpaína II) y espectro amplio (25-50 µM E64d) para bloquear separación Bax inducida por SD por 24 hr se examina como en B. Estos inhibidores son incapaces de prevenir la separación Bax en contraste con 100 µM QVDOPH. Western Blotting se realiza al utilizar el anticuerpo ?21. (H) Estabilización del pl8 Bax por inhibición de actividad proteasomal. Las neuronas se cultiva en medio libre de suero por 24 hrs en ausencia o presencia de inhibidores de proteasoma: Lactacistina 1-10 µM (Lact.) y Epoxomicina 10 µM (Epox.). Western Blotting se realiza al utilizar el anticuerpo ?21. Estado de caspasa (I-J) en neuronas SD por 24 hr:análisis por RT-PCR (I) y Western Blotting (J) utilizando el anticuerpo de caspasa-2 anti-ratón monoclonal de rata (11B4) . VDVAD (100 µM) se agrega al inicio de SD. El contenido de proteína pro-caspasa-2 disminuye durante SD sin alterar el nivel de mARN en caspasa-2. GAPDH se utiliza como un control de carga igual. La proteína pro-caspasa-2 no se supra o subregula pero la pro-caspasa-2 se procesa preferentemente como una forma pl4 en una manera dependiente de VDVADasa. (K) Ubicación de caspasa-2 atípica durante SD: caspasa-2 permanece difusa en el citoplasmade neuronas corticales primarias de ratón durante SD. Las neuronas en DIV6 se cultivan en medio libre de suero por 8, 16 y 24 hrs antes de la coloración con anticuerpo de caspasa-2 anti-ratón monoclonal de rata (10C6; rojo) . Los núcleos se contracolorean con 1 µM Hoechst 33342 (azul) . (L) Distribución citoplásmica de caspasa-2 durante lesión es dependiente del estímulo. Las neuronas se tratan por concentraciones citotóxicas de la yonomicina de yonóforo Ca2+ (6 µM), la estaurosporina del inhibidor de quinasa (STS, 10 µM) , la canfototecina del inhibidor de topoisomerasa I (CPT, 10 µM) o se cultivan en medio libre de suero por 24 hrs, antes de la coloración como en (J) . SD no similar, reubicación nuclear completa de caspasa-2 ocurre durante el tratamiento con yonomicina y STS. La reubicación nuclear es parcial para CPT. Figura 15. Inhibición de caspasa-2 específica por Q-VDVAD-OPH proporciona mejor neuroprotección que la inhibición de pan-caspasa por Q-VD-OPH contra lesión cerebral isquémica neonatal (A) Separación VDVAD-MAC in Vi tro por caspasa-2 recombinante. La separación de 50 µM VDVAD-AMC por caspasa-2 humana recombinnate (125 U) se mide después de 30 min a 37°C antes de la incubación con inhibidores de pan-caspasa o selectivos (2 µM) (n>_2) . La actividad de separación de caspasa-2 se bloquea por el compuesto prototipo, Q-VDVAD-OPH, tan eficientemente como inhibidores de caspasa-2 (Ac-VDVAD-Cho, Z-VDVAD-FMK) y Q-VD-OPH. Aunque la inhibición de separación por Z-VAD-FMK es menos importante, BOC-D-FMK es completamente inactivo contra caspasa-2. El inhibidor de calpaínas, E64d, se utiliza como control negativo. (B) Q-VDVAD-OPH promueve la supervivencia de cultivo de neurona cortical SD. Q-VDVAD-OPH se administra a neuronas a DIV16 en el inicio de SD por 24 horas. La actividad de caspasa-2, pérdida de ??m, NA y PMP se determinan por coloración con FLICA, JC-1, Hoechst 33342, y 7-AAD, respectivamente (n=2). La inhibición de caspasa-2 (C-E) proporciona neuroprotección contra lesión cerebral isquémica in vi vo neonatal: Efecto de Q-VD-OPH y Q-VDVAD-OPH en volumen de infarto se mide 48 hrs después de isquemia. El fármaco se da 5 minutos antes del inicio de isquémico y consiste de una inyección intraperitoneal única del inhibidito (100 µg/10 g en 10% DMSO, n=lß y 12, respectivamente). Ratas isquémicas de control (n=15) también se estudian. (C) Secciones coronarias representativas en el nivel del hipocampo dorsal (placa 21) y comisura anterior (placa 12) se obtienen de control isquémico y animales tratadas con Q-VDVAD-OPH y se colorean por violeta cresilo. Observe el infarto marcadamente reducido en la rata tratada (animal con un volumen de infarto del 2%) . La flecha indica la presencia y ausencia de un infarto en el mismo animal tratada con Q-VDVAD o isquémico, respectivamente. La barra representa 130 µM . (D) Volúmenes de infarto medio en los diferentes grupos. Los datos son promedio +_ SEM. Q-VD-OPH y Q-VD-VAD-OPH indujeron respectivamente un 44 y 74% de reducción ( * **=p<0.001 , prueba Kruskall-Wallis) . (E) Tratamientos con Q-VDVAD-OPH y Q-VD-OPH proporcionan dos grupos con animales desplegando ya sea nivel alto/total o bajo de protección. Los datos de volumen de infarto único se diagraman. Las barras en negritas y horizontales delgadas representan la media de grupo y promedio, respectivamente. Observe que 4 y 8 animales no mostraron infarto después del tratamiento con Q-VD-OPH y Q-VDVAD-OPH, respectivamente . Figura 16. Separación VDVAD-AMC ip V± tro por caspasa-2 recombinante humana La separación de 50 µM VDVAD-AMC por caspasa-2 humana recombinante (125 U) se mide después de 30 min a 37°C antes de la incubación con inhibidores de pan-caspasa o selectivos (2 µM) (n>2) . La actividad de separación de caspasa-2 se bloquea por el compuesto prototipo, Q-VDVAD-OPH, tan eficientemente como inhibidores de caspasa-2 específicos (Ac-VDVAD-Cho, Z-VDVAD-FMK) e inhibidor de pan-caspasa Q-VD-OPH. Aunque la inhibición de separación por Z-VAD-FMK es menos importante, BOC-D-FMK es completamente inactivo contra caspasa-2. Otros inhibidores específicos para caspasa-3 (Z-DEVD-FMK), caspasa-9 (Z-LEHD-FMK) y caspasa-8 (Z-LETD-FMK) no interfiere altamente con actividad de caspasa-2. E64d, ALLN, ALLM que inhiben calpaínas se utilizan como control negativo. Figura 17. Modelo hipotético para trayectoria depediente de caspasa-2 pre-mitocondrial Describimos una nueva trayectoria intrínseca en la cual la activación pre-mitocondrial de caspasa-2 se requiere para promover apoptosis en neuronas corticales. La extracción de suero es capaz de accionar la trayectoria apoptótica, en la cual la activación de caspasa-2 puede mediar el control aguas arriba de Bax, un miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2. Bax transubica e integra en la membrana exterior mitocondrial para inducir la caída de ??m y promover la liberación de citocromo c en una manera dependiente de caspasa-2. Por lo tanto la inactivación de caspasa-2 elimina también los eventos aguas bajo, como activación dependiente de liberación de citocromo de caspasas-9 y caspasa-3, alteraciones morfológicas nucleares, exposición de serina de fosfatidilo y permeabilización térmica de la membrana de plasma. La ubicación citoplásmica exclusiva de la caspasa-2 activa por toda la privación de suero pone en evidencia un mecanismo peculiar de activación. Figura 18. Caspasa-2 se incluye durante la muerte celular inducida por daño de ADN y precede a pérdida de ??m y PMP. La respuesta de dosis de VP16 en ausencia o presencia de inhibidores de caspasa: A y B mostraron el efecto protector de inhibición similar a caspasa-2 por inhibidor de caspasa-2 específico (VDVAD = Z- VDVAD-FMK) . El efecto del inhibidor de pan-caspasa (OPH=Q-VD-OPH ) también se investiga. (A) n=3, coloración JC-1/7AAD; (B) n=l, DÍOC6/PI.

Figura 19. Activación de caspasa-2 precede pérdida de ??m y activación de caspasa (s) subsecuente. (A) El panel izquierdo muestra las características apoptóticas para pérdida de ??m (JC-1) y alteraciones nucleares (Hoechst) en células Jurkat tratadas con VP16 (10 µM, 7hrs) . El panel derecho muestra el efecto del inhibidor de pan-caspasa Q-VD-OPH o inhibidores similares a caspasa-2 específicos ( VDVAD=Z-VDVAD-FMK) , similares a caspasa-3 ( DEVD=Z-DEVD-FMK) , similares a caspasa-9 (LEHD=Z-LEHD-FMK) , similares a caspasa-8 (LETD=Z-LETD- FMK) , respectivamente en pérdida de ??m (JC-1), activación de caspasa-2 y caspasa-3 (FLICAs), PMP, y alteraciones nucleares. Todos los inhibidores se prueban a 50 µM . (B) Cuantificación por citometría de flujo del efecto de estos inhibidores de pérdida de ??m (JC-1) y PMP (7AAD) (8 hrs) . ciclohexamida ; BA= ácido bongkréico; DIDS= sal de disodio de ácido 4, 4'-Diisotiocianastilbeno-2 , 2 ' -disulfónico ; ActD= actinomicina D. (n=2-4) Figura 20. Eliminación del gen de Caspasa-2 por un siARN específico. (A) Paneles izquierdos y derechos muestran que hsiARN C2 wt es capaz de disminuir el grupo de proteín de pro-caspasa-2 en células HeLa y Jurkat cells, respectivamente (análisis Western Blot; clon 11B4 para detección de caspasa-2) . (B) Producción de transfección se verifica in cell ula por detección de fluorescencia (citometría de flujo, FL-1) de siARN-FITC: casi 100 % ha incorporado siARN (24 hrs) . Figura 21. Eliminación del gen de caspsa-2 por un siARN específico resulta en la supervivencia de células Jurkat tratadas con VP16. (A) Efecto protector de siARN (humano) en Jurkats tratadas con VP16 (7-8 hrs-10 µM) (n=3) . Los perfiles de citometríade flujo mostrando que las células rescadas de Z-VDVAD-FMK- y siARN C2 wt han conservado la morfología (difusor en avance) y que estas células son viables (exclusión 7AAD) . Lipo = lipectamina 2000. Figura 22. Secuencia y estructura del derivado de inserción sh de la secuencia de siARN C2 de murino. (A) Los oligonucleótidos de avance y de reversa se diseñan para templarse entre sí. Las secuencias en el caso inferior representan las secuencias de sentido y antisentido de siARN dirigidas contra mARN C2 de murino. Salientes Xbal y BamH I se agregan respectivamente en los términos 5' y 3' para mejorar la clonación en el vector pGE-1. (B). La estructura de shARN templada ilustra las diferentes regiones funciones de la Inserción shARN. Figura 23. Nivel de exresión de caspasa-2 en células 3T3 después de la transfección de construcciones shARN-6 y shARN-9. El análisis Western Blot de 3T3 extractos totales (15 µg por vía) 24 o 48 horas después de la transfección con pGE-1 vacío como un control (vía pGE-1) o con vector pGE-1 conteniendo la inserción shARN (clones shARN-6 y shARN-9, vía shARN6 y shARN9) . Un control con lipofectamina sola se ha hecho (vía lipo) . Las vías NT representan las células no tratadas . Figura 24. Secuencia y estructura de la inserción sh derivada de la secuencia siARN C2 humana (A) . Los oligonucleótidos de avance y de reversa se diseñan para templarse entre sí. Las secuencias en el caso inferior representan secuencias de sentido y antisentido de siARN dirigido contra mARN C2 humano. Salientes Xbal y BamH I se agregan respectivamente en los términos 5' y 3' para mejorar la clonación en el vector pGE-1.

(B) . La estructura de shARN templada ilustra las diferentes regiones funciones de la Inserción shARN. Abreviaciones: 7-AAD, 7-Amino Actinomicina D; 4-(2-Aminoetil ) bencenosulfonil fluoruro, AEBSF, Pefabloc; ANT, transubicador de nucleótido de adenina; BA, ácido bonkreico; mCICCP, m-clorofenilhidrazona carbonilcianuro ; ??m, potencial de transmembrana mitocondrial; FACS Clasificación de Célula actividad por fluorescencia; FLICA, Inhibidor marcado con fluorocromo de caspasa; FSC, difusor de avance; FC, citometría de flujo; FM, microscopía de fluorescencia; JC-1, 5,5', 6, 6 ' -tetracloro-1 , 1', 3 , 3 ' -tetraetilbenzimidazolilcarbocianuro yoduro; MFI, intensidad de fluorescencia promedio; PMT, tubo foto-multiplicador; SD, privación de suero; SSC, difusor lateral; MPTP, l-metil-4-fenil-1 , 2 , 3 , 6-tetrahidropiridina; PS, fosfatidil-serina ; PTP, poro de transición de permeabilidad; Quinolina-Val-Asp (OMe ) -CH2-0-Ph, Q-VD-OPH ; SNP nitropursida de sodio; z-DEVD-fmk, N-benciloxicarbonil-Asp-Glu ( Orne ) -His-Asp (Ome)-fluorometil cetona; z-VAD-fmk, N-benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp (Orne)-fluorometilcetona . Ejemplo 1: Métodos para identificar el punto de control; análisis dinámico y multiparamétrico de apoptosis neuronal por citofluorometría en tiempo real y fijo Hasta hace poco, la apoptosis y necrosis de células neuronales se han investigado principalmente por dos tipos de planteamientos: el prime grupo de técnicas (bioquímicas) evalúa los últimos eventos de muerte neuronal generalmente por evaluación colorimétrica de actividad de dehidrogenasa de succinato mitocondrial (análisis MTT9 o liberación extracelular de actividad de dehidrogenasa de lactato (análisis LDH) (Johnson, 1995). Estas técnicas cuantitativas monoparamétricas no dan informaciones concernientes al mecanismo de muerte celular y no pueden combinarse con la detección de otros procesos bioquímicos. Más recientemente, algunos procedimientos de fraccionamiento celular adaptados a neurona se publicaron para la valoración bioquímica de transubicación de citocromo c por inmunomanchado y activación de caspasas utilizando substratos fluorogénicos (Ethell and Green, 2002). Tales métodos recientes dan informaciones semi-cuant itativas en poblaciones de neuronas pero excluyen el análisis en tiempo real y multiparamétrico. El segundo grupo de técnicas utilizan lectura de microscopía de fluorescencia (FM) para detectar modificaciones de organuelos o proteínas relacionadas con apoptosis. La mayoría de estos estudios FM se enfocan en las últimas alteraciones nucleares incluyendo visualización de morfología de cromatina (coloración Hoechst) y/o detección bioquímica de fragmentación de ADN (análisis TÚNEL) . En estudios FM poco recientes en neuronas, la inmuno-ubicación de citocromo c (en células fijas), se reportan, pero en contraste con otros campos de biología celular, un número limitado de estudios en neuronas utilizaron la detección in si t u de alteraciones mitocondriales y activación de caspasa. Cuando se aplica a neuronas primarias cultivadas, los análisis a base de FM consumen tiempo, son laboriosos, y la cuantificación se dificulta por agregados de cuerpo celular y sobreposición de redes de neurito. además, el foto-blanqueado de sondas fluorescentes sensibles podría conducir a malas interpretaciones dramáticas y excluir el seguimiento en tiempo real de eventos relacionados con muerte temprana. De esta manera, para nuestro conocimiento, las características de biología celular de los eventos apoptóticos no se han documentado completamente y ordenado en neuronas primarias . Citometría de flujo (FC) ofrece un amplio rango de aplicaciones, y se ha vuelto una herramienta principal para biología celular y apoptosis. Aunque se aplica extensivamente a células sanguíneas primarias y estirpes de célula de cáncer, esta tecnología permanece sin usar en neurociencas y se limita generalmente para evidenciar la última pérdida de contenido de ADN en células fijas (Yan et a l . , 1999; Fall and Bennet, 1999) . La falta de aplicaciones de citometría de flujo apropiadas probablemente resulta de las suposiciones de que la separación requerida de neuronas de su substrato podría alterar la integridad de membrana de plasma, destruir neuritos y/o accionar anoiquis, previniendo así el análisis confiable de apoptosis. Para superar esto limitaciones específicas (de neuronas), utilizamos un simple método de tripsinización para la separación no invasiva de neuronas prmarias que mantiene la integridad de las neuronas y conserva una alta proporción de sus neuritos. Entonces, hemos desarrollado un método que combina FC cuantitativo con análisis FM detallados, permite la co-detección de las fases de decisión, efectuadota, degradación temprana y posterior de apoptosis. utilizando sondas (vitales) fluorescentes seleccionadas, esta doble lectura permite detectar antes (por FM) y después (por FC) el estado potencial de transmembrana mitocondrial-tripsinización (??m) , activación de caspasa in si t u , exposición de superficie de residuos de fosfatidilserina, y pérdida de integridad de membranas de plasma. Utilizando neuronas corticales primarias de ratón inducidas para morirse por privación de suero como un modelo de sistema, se demuestra que FC es solamente no concordante con FM sino que también es una tecnología rápida, sensible y cuantitativa para establecer el orden cronológico de eventos apoptóticos neuronales. Además, el área de análisis FC se extiende a monitoreo en tiempo real innovador de modificaciones de ??m neuronal temprana y permeabili zación de membrana de plasma (PMP) dentro de minutos después de la adición de compuestos activos en mitocondrio. Tanto FC en tiempo real y tiempo fijo para superar las limitaciones de FM y ayudarán al documento y desarrollar la biología celular de apoptosis neuronal . - Análisis citofluorométrisa de neuronas primarias vivas y muertas Las neuronas corticales primarias aisladas de ratones embriónicos de 14 días pueden mantenerse vivos por más de 10 días cuando se cultivan en cavidades recubiertas con polietilenoamina en un medio ad ho c conteniendo una mezcla de glucosa, suero de caballo y suero de bovino fetal (Kawamato and Barrett, 1986) . En estas condiciones experimentales, evaluación microscopía de fluorescencia (FM) de tanto condensación de cromatina (Hoechst 33342; fluorescencia azul) como de integridad de membrana de plasma utilizando 7-amino-actinomicina D intercalante de ADN fluorescente impermeable a célula (7-AAD; fluorescencia roja) indica que la privación de suero conduce a permeabilización de membrana de plasma progresiva (PMP) de neuronas cultivadas (Fig. 1A) . Este PMP es un evento post-apoptótico ya que ocurre solamente en neuronas encogidas con cromatina condensada y neuritos desmantelados (Fig. 1A) . En contraste, cuando PMP primario (es decir, necrosis) se induce por baja concentración de Tritón, sin encogimiento celular no condensación de cromatina detectándose (contraste de fase y fluorescencia Hoechst), pero 7-AAD rápidamente entra en neuronas y marca los núcleos (Fig. IB) . Para cuantificar no ambiguamente encogimiento neuronal y PMP en cualquier tiempo elegido durante muerte celular, las condiciones de tripsinización se establecieron, las cuales permiten mantener integridad de neurona como se tiene como objetivo tanto por la ausencia de coloración con 7-AAD y retención neuronal estable del tinte fluorescente CellTracker Green™ no tóxico (Fig. 1 B,C) . De esta manera, las neuronas pueden marcarse primero en su substrato y observarse por FM, después se tripsiniza de manera segura, y tercero se somete inmediatamente a análisis de citometría de flujo (FC) (Fig. 1D-G) . Además de las neuronas negativas 7-AAD intactas ( tripsinizadas ) (88.4%, +/- 7.6) en muestras de control, 47.1 % (+/- 18.1) de neuronas privadas de suero por 24 horas presenta PMP (7-AAD+), correlacionando con observaciones microscópicas y contando antes de tripsinización (Fig. 1E-G) . Detección de las fases efectuoras y de degradación en neuronas corticales primarias apoptóticas La co-detección en base a FM de PMP (coloración 7-AAD) y exposición de fosfatidil-serina relacionada con apoptosis (PS) (anexina V conjugado con FITC; fluorescencia verde) indica que en neuronas privadas de suero aparecen tres poblaciones celulares: un subconjunto con tanto coloración con FITC-anexina V y 7-AAD (subconjunto 2; Fig. 2A) , y dos subconjuntos con ya se coloración 7-AAD (subconjunto 3) o coloración con FITC-anexa V (subconjunto 1). Los mismos subconjuntos también se detectan después de tripsinización por FC, y el seguimiento cinético muestra que el suconjunto 1 precede al subconjunto 2 que precede al subconjunto 3 (Fig. 2B, C), conduciendo así a la conclusión de que la exposición PS ocurre antes de PMP. El primer evento nuclear detectable es una reducción nuclear progresiva significativa (perímetro) que parece preceder las modificaciones del tamaño de neurona (Fig. 2D, E) . Este análisis de tiempo fijo de neuronas puede extenderse a activación de caspasa (Fig. 3) . Sin embargo, la co-detección in si tu de actividad similar a caspasa-3 utilizando un Inhibidor de caspasa marcado fluorescente verde (FLICA, FAM-DEVD-FMK) y PMP (coloración 7-AAD) da resultados similares con FM (antes de tripsinización) y FC (después de tripsinización) para mostrar que una actividad similar a caspasa es detectable antes de PMP (Fig. 3A,B) . Los resultados similares se obtienen cuando la detección a base de FLICA de la actividad de caspasa-3 se reemplaza por detección a base de anticuerpo in si t u de la caspasa-3 activada (no mostrada) . Cuando se agrega a neuronas al comienzo de la caspasa, tanto el nuevo inhibidor de amplio espectro de caspasa, Quinolina-Val-Asp (Orne) -CH2-0-Ph (Q-VD-OPH) (Melnikov et al . , 2002) como el inhibidor transubicador de nucleótido de adenina mitocondrial (ANT), ácido bongkréico (BA) , evitan fuertemente activación de caspasa, y apoptosis nuclear (Figs. 3 C, D) . La cuantificación FC que en contraste al inhibidor de proteasa de pan-serina 4- (2-Aminoetil ) -bencenosulfonil fluoriro (AEBSF, Pefabloc) , Q-VD-OPH injibe 95.3 +/- 5.6% de actividad similar a caspasa-3 y 93.9 +/- 3.8% de PMP (7-AAD) se induce por privación de suero (Fig. 3D) . Una cuestión no trivial es determinar, en un modelo de muerte celular dado, la jerarquía entre la activación de caspasa y exposición PS. La co-detección FM in si t u (antes de tripsinización) y FC (después de tripsinización) de actividad similar a caspasa-3 utilizando FLICA conjugado con sulforhodamina (fluorescencia roja) y exposición PS utilizando FITC-anexina V (fluorescencia verde) son concordantes para demostrar que, después de la privación de suero, la actividad similar a caspasa-3 precede la exposición PS en neuronas primarias (Fig. 3 E, F) . Debe observarse que el análisis simultáneo de estado de cromatina (Hoechst; fluorescencia azul) por FM indicó que la actividad de caspasa-3 temprana se asocia temporalmente con una primer etapa de condensación nuclear (etapa I de acuerdo con clasificación de Susin; Susin et a l . , 1999), aunque (Fig. 3E, 4E) la fragmentación del núcleo terminal en cuerpos apoptóticos discretos (morfología en etapa II, Susin et a l . , 1999) ocurre después del comienzo de exposición PS . De manera intrigrante, tanto el inhibidor de caspasa pan de marca fija z-VAD-fmk y el inhibidor similar a caspasa-3 más restringido z-DEVD-fmk fuertemente inhiben la activación de caspasa-3, pero sin la fase de degradación (es decir, exposición PS, condensación nuclear y PMP) de apoptosis neuronal (Fig. 3D) , indicando así que la actividad relacionada con casp'asa-3 no es esencial para la muerte neuronal en estas condiciones experimentales. En contrate, la co-detección in si t u de estado de cromatina (Hoechst), y actividad similar a caspasa-9 utilizando un Inhibidor de Caspasa Marcado Fluorescente Verde (FLICA, FAM-LEHD-FMK) en la presencia o ausencia dek inhibidor de caspasa-9 z-LEHD-fmk revela que la eliminación de actividad similar a caspasa-9 conduce a un fenotipo intermedio de apoptosis nuclear en la cual los núcleos se detienen en la primer etapa de condensación nuclear (etapa I; Fig. 3G) . Además, tanto el análisis FM como FC son concordantes para mostrar que la inhibición de caspasa-9 elimina la exposición PS y PMP (Fig. 3 G, H) . De esta manera, ya que BA evita la activación similar a caspasa-9 (Fig. 3H), el planteamiento de doble lectura sugiere fuertemente que el punto de ejecución de caspasa-9 en este modelo experimental está aguas abajo de la mitocondria y aguas arriba de exposición PS y apoptosis nuclear en etapa II. Detección de la fase mitocondrial/decisión de apoptosis neuronal La coloración de las neuronas cultivadas primarias con el tinte JC-1 sensible a ??m seguido por análisis FM revela una pérdida progresiva de ??m. De esta manera, antes de la privación de suero, la mitocondria de neuronas posee un alto ??m (fluorescencia JC-1 naranja, Fig. 4A) , mientras que la mitocondria de neuronas privadas de suero por 8-24 horas tienen un bajo ??m (fluorescencia JC-1 verde; Fig. 4A) . La pérdida de ??m progresa heterogéneamente sin ninguna jerarquía geográfica aparente, dando origen a un fenotipo intermedio transitorio en el cual la heterogeneidad es detectable en la misma neurona (Fig. 4A; Dec) . Esto sugiere que al menos en este sistema experimental no existe pérdida de ??m, pero preferentemente una transmisión progresiva de la señal de colapso de mitocondria a mitocondria. La interrupción de ??m completa se observa antes de cualquier señal de apoptosis nuclear como se tienen el objetivo por coloración Hoechst (Fig. 4a; fluorescencia azul) . Como se espera, la co-cuantificación en base a FC y FM de pérdida ??m (JC-1) y PMP (coloración 7-AAD) son concordantes para demostrar que la pérdida de ??m se inhibe por BA y precede a PMP en neuronas privadas de suero (Fig. 4B-E) . Los experimentos cinéticos en base a la co-detección de ??m (utilizando el tinte sensible a ??m CMX-Ros) y actividad similar a caspasa-3 (FLICA, FAM-DEVD-FMK) , sugieren que la pérdida de ??m precede la activación de caspasa-3 (no mostrada) . De acuerdo con lo anterior, la inhibición de activación de caspasa-3 por z-DEVD-fmk no tiene efecto en pérdida de ??m inducida por SD (Fig. 4E) . - Detección en tiempo real de ??m La inclusión temprana de mitocondria en apoptosis requiere el monitoreo de respuestas de ??m rápidas a la exposición al fármaco. La detección en tiempo real de ??m por FM puede falsear los análisis ya que las adquisiciones repetitivas provocan un fotoblanqueado dramático de la sonda (detectada como una caída en fluorescencia naranja JC-1), que podría atribuirse fuertemente a pérdida de ??m relacionada con apoptosis (Fig. 5A, B) . Para superar esta desventaja instrumental, un planteamiento FC en tiempo real se desarrolla en el cual, en contraste al procedimiento FC en tiempo fijo, las neuronas se tripsinizan primero y segundo se marcan para detectar ??m (JC-1) y PMP (7-AAD) con el tiempo (Fig. 5C) . En estas condiciones, las observaciones FM revelan que las neuronas tripsinizadas no presentan PMP y mantienen ??m alto hasta 3 horas (Fig. 5C) . Debe observarse que ninguna señal de anoiquis es detectable durante las primeras 5 horas post-tripsinización . FC grabando por 20 minutos confirma que las neuronas tripsinizadas aún tienen un ??m elevado y son impermeables a 7-AAD, es decir, mantienen una membrana de plasma intacta (Fig. 5D2-3) . La adición del desacoplador de la cadena respiratoria, m-clorofenilhidrazona de cianuro carbonilo (mCICCP), a neuronas no tripsinizadas induce la interrupción de ??m (Fig. 5D-1) . El monitoreo FC en tiempo real revela que la pérdida de ??m de población neuronal es máxima después de 2 minutos de tratamiento con mCICCP (Fig. 5D-2, 3). La co-detección FM de PMP (7-AAD) y ??m (JC-1) de cultivos de neurona no tripsinizada tratadas con la toxina mitocondrial l-metil-4-fenil-1 , 2 , 3 , 6-tetrahidropiridina (MPTP), indica que después de 45 minutos la mayoría de las neuronas son de bajo ??m sin ninguna señal de PMP (Fig. 6A-1) . En contraste, las neuronas corticales tratadas o no con SNP inductor de óxido nítrico mantienen un ??m elevado (Fig. 6) . Como se espera, etanol induce un PMP rápido como se tiene como objetivo por incorporación de 7-AAD masiva en neuronas cultivadas (Fig. 6A-1) . Cuando FC en tiempo real se aplica a evaluación simultánea de PMP, ??m, tamaño de célula y granulación de neuronas córticas, esta técnica indica que, después de 15 minutos, 49.6% ( + /- 8.2; n=4) de neuronas tratadas con MPTP son bajo ??m, mientras que 16.2% (+/- 1.2) de neuronas sin tratar y 15.0% ( + /- 6.2) neuronas tratadas con SNP son de bajo ??m. FC en tiempo real revela que, en contraste a MPTP y SNP, el tratamiento de etanol induce la necrosis primaria. Sin embargo, el etanol accional un PMP muy rápido (98% después de 5 minutos) que precede a la pérdida de ??m (75% después de 5 minutos) (Fig. 6) . De manera interesante, la pérdida de ??m inducida por MPTP es heterogénea ya que las neuronas que experimentan caída de ??m rápida presentan un incremento de granulación significativo, mientras que las neuronas que experimentan una reducción de ??m ligera no presentan modificaciones morfológicas (Fig. 6) . Tomados juntos, estos resultados muestran que análisis FC en tiempo real es un planteamiento simple para seguir cuantitativamente eventos PMP a corto plazo y modificaciones de ??m en una base pre-neurona. Utilizando neuronas corticales primarias de ratón privadas de suero como un modelo de sistema muestra entonces que: 1) muestras neuronales pueden multi-marcarse con sondas relacionadas con apoptosis y se analizan sucesivamente por FM, se separan de manera segura de su soporte y se estudian cuantitativamente por FC sin fijación, 2) informaciones farmacológicas y cinéticas obtenidas con esta metodología de doble lectura permite describir y ordenar de manera no ambigua las fases principales (decisión, ejecución y degradación) de apoptosis neuronal, 3) neurona puede también separarse de su soporte, después marcarse con sondas vitales y analizarse por FC en tiempo real por 3 horas, ofreciendo así la posibilidad de valorar eventos a corto plazo de muerte neuronal incluyendo discriminación entre necrosis primaria (es decir, cuando PMP precede a la pérdida de ??m) y respuestas de célula relacionada con apoptosis para dar un estímulo dado . FC ofrece algunas ventajas específicas (Tabla 1) . Primero, cualquiera que sea el nivel inicial de agregación de neuronas en cultivo, FC permite obtener rápidamente una cuantificación representativa de apoptosis y eventos relacionados en un alto número de neuronas (40,000 por muestra en este estudio) . Segundo, FC puede detectar sondas intracelulares con bajos niveles de fluorescencia que podrían evidenciarse duramente por FM . Esta ventaja puede atribuirse a la mejor habilidad de los tubos fotomultiplicadores de citómetro (FC) para discernir las células débilmente fluorescentes, comparativamente para cargar la cámara de dispositivo acoplado (CCD) (FM) . Tercero, FC también supera los problemas clásicamente inducidos durante observaciones FM incluyendo fotoblanqueo de sondas (como es el caso para detección de ??m por JC-1), daño celular inducido por iluminación de epifluorescencia larga y/o efectos fototérmicos . Por ejemplo, el fotoblanqueado JC-1 es mínimo con FC debido a que la irradiación de neurona débil (15 milli-Watt s , longitudes de onda policromáticas) y el paso de célula extremadamente corta (y única) a - través de haz láser. Cuarto, FC en tiempo real autoriza el análisis cuantitativo de membrana de plasma en muy corto plazo y modificaciones de membrana interior mitocondrial dentro de los minutos siguientes a la adición de cualquier fármaco neuro-activo . Quinto, el análisis multiparamétrico puede alargarse por el uso de más citómetros poderosos que pueden investigar hasta 14 parámetros individuales . También se demuestra que neuronas SD experimenta un proceso apoptótico que obedece a las siguientes reglas (Figura 7) . Primero, las neuronas SD manifiestan señales de disipación de ??m a través de un proceso dependiente relacionado con ANT. Segundo, disipación ??m ocurre la activación de caspazas 3 y 9 aguas arriba. Tercero, exposición PS y condensación nuclear completa (etapa II) son subordinadas a una actividad similar a caspasa-9 pero no dependen de la actividad similar a caspasa-3. Paradójicamente, las neuronas SD por 24 h rtratadas con Z-VAD.fmk no presentan actividad similar a caspasa-3 pero experimentan exposición a PS, apoptosis nuclear etapa II y PMP final, mientras que todos estos' eventos se bloquean completamente por la tercer generación de inhibidor Q-VD-OPH de pan-caspasa. Por lo tanto, los resultados anteriores revelan una trayectoria de caspasa dependiente de mitocondria inusual que se activa en neuronas corticales primarias durante apoptosis inducida por extracción de suero. Esta tecnología citofluorométrica también se utiliza para investigar las dinámicas de apoptosis de neuronas en respuesta a otro estímulo, incluyendo cerámida, péptidos de amiloide ß, ácido 3-nitropropiónico , glutamato y proteínas virales. El análisis también se extiende para detectar la activación de- otras caspazas incluidas en apoptosis neuronal. Estos análisis citofluorométricos también pueden permitir mejor caracterización de tipos aún poco conocidos de muerte, tales como la forma no apoptótica de muerte programada de neuronas primarias corticales, estriatales e hipocampales primarias tratadas por la substancia P, y hace posible diferenciar entre muertes similares a necrosis y apoptosis en modelos donde ambos coexisten, tal como lesión isquémica. Por lo tanto, las tecnologías desarrolladas de acuerdo a la invención son poderosas para investigar la biología celular de apoptosis neuronal y proporcionan una herramienta cuantitativa multiparamétrica para la exploración y caracterización de compuestos neuroprotectores y neurotóxicos . Procedimientos experimentales Aislamiento y cultivo de neuronas corticales Las neuronas corticales primarias se aislan de neocortices de ratones Swiss de 14 días embriónicos (Janvier, Le Genest-St-Isle , Francia ) . Las neuronas se coloran en placas a una densidad de 7.105 células vidas por cm2 en 500 µl de Medio Básico de Eagle (EBM, Eurobio, Les Ulis, Francia) complementado con 5% de suero de caballo (HS, Eurobio) y 2.5% de suero de bovino fetal (FCS, Eurobio) sobre placas de 24 cavidades (Sarstedt, Orsay, Francia) o cubiertas de vidrio alojadas Lab-Tek (Nalge Nunc International, Naperville, IL, USA) revestidas con polietilamina (PEÍ, 1 mg/mL, Sigma, St Quentin Fallavier, Francia) . Después de 2 días, el medio de cultivo se reemplaza con medio N5 (Kawamato and Barrett, 1986) conteniendo 180 mg/L glucosa, 5% HS y 1% FCS, y 3 µM de citosina ß-D-arabinofuranosida (Ara C, Sigma) y 1 µM de 5-metil-10, ll-dihidro-5H-dibenzociclohepten-5, 10-imina maleato (MK-801, Research , Biochemicals International) (Knusel et a l . , 1990) y se cambia diariamente. La apoptosis se induce en cultivos de 5 días por extracción de suero (Macleod et a l . , 2001) . La pureza de cultivo (> 95%) se valora con un anticuerpo monoclonal anti-Microtúbulo Asociado con proteína 2 (MAP-2, Sigma) y anticuerpo policlonal de Proteína Acida Fibrilar anti-Glial (GFAP, Dako) . Tripsinización de neuronas corticales La separación enzimática de neuronas se realiza después de un enjuague cuidadoso en medio N5 libre de suero e incubación con 250 µl de 37°C Tripsina-EDTA (Gibco BRL, UK) . por 15 min a 37°C. La unión celular se realiza por 5 lavados suaves, utilizando puntas de 100 µl (Wilson) . Los agregados de neurona restantes se desasocian a través de una punta de 200 µl por 10 lavados suaves en 500 µl de medio N5. Para la validación del procedimiento de tripsinización, neuronas adherentes se colorean por 10 - µM CellTracker Green™ (Molecular Probes, Eugene, OR) por 15 min a 37°C, enjuagado en medio N5, y se presentan a tripsinización. El análisis de neuronas se realiza por citometría de flujo (canal FL-1) una microscopía (BP 480/40 para excitación y BP 527/30 para emisión) . El tratamiento Tritón X-100 (Sigma) (0.02%) se utiliza como control positivo para interrupción de membrana de plasma. Instrumentación La clasificación celular activada por fluorescencia se realiza utilizando un citómetro FACSCalibur de 3 colores equipado con un láser de argón 488 nm enfriado con aire 15 mW (Becton Dickinson, San José, CA) . Para cada muestra, los datos de 40,000 neuronas se registran, y se analizan con el sotware CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) . La velocidad de flujo de muestra se fija a 12 µl +/- 3 µl/min para análisis en tiempo real, y a 60 µl +/- 3 µl/min para experimentos en tiempo fijo. La microscopía de fluorescencia (FM) se realiza con un microscopio de fluorescencia invertido DM IRB (Leica, Rueil-Malmaison, Francia) equipado con una lámpara de arco corto de mercurio 100 W y un objetivo de PLANO L 40 N o un objetivo de PLANO N x 100 (Leica, Wetzlar, Alemania) . Las imágenes se adquieren a una resolución de 1300 x 1030 pixeles con una cámara de color CCD (Leica DC 300F, Leica, Francia) y se controlan por el software Leica Qfluoro (Leica Microsystem AG, Suiza) . Los datos se almacenan para análisis fuera de línea con software IM1000 (Leica Microsystems AG) para llevarse a cabo utilizando el sofware Leica Qfluoro. Detección de la fase de degradación de apoptosis a través de la incorporación de 7-Amino Actinomicina D La pérdida de la integridad de membrana de plasma se detecta a través de la permeabilidad incrementada a 7-Amino Actinomicina D (7-AAD, Sigma) (Schmid et al . , 1992; Carpenter et a l . , 1997; Lecoeur et a l . , 2002) . 20 µg/ml 7-AAD se agregan a neuronas cultivadas por 15 min a 37°C. El análisis FM se realiza a través de una excitación de 100 ms utilizando un filtro BP 515-560 y fluorescencia 7-AAD se detecta a través de un filtro de largo paso LP 590. Las células se tripsinizan y analizan inmediatamente en la citometría de flujo (canal Fl-3, ?> 650 nm, PMT=333) . Los cuerpos /residuos apoptóticos se descartan del análisis como se describe para células creciendo en suspensión (Lecoeur et al . , 1997) . Detección de fases de degradación temprana y posterior utilizando FITC-anexina V y 7-AAD La exposición de fosfatidilserina (PS) a la capa exterior de la membrana de plasma se detecta a través de la fijación de anexina V conjugada con FITC (equipo de detección de apoptosis, R&D System) . 20 µg/ml 7-AAD y IX anexina V se agregan en 200 µl de regulador enriquecido con Ca2+ (equipo de detección de apoptosis) por 20 min a RT . Para experimentos FM, anexina V-FITC se excita a través del filtro BP 480/40 y la luz emitida se recolecta a través del filtro BP 527/30. La detección FC de fluorescencia de FITC-anexina V se realiza en el canal Fl-1 (530 +/- 15 nm) y se analiza en el modo de amplificador lineal, (voltaje PMT = 867, obtención de amplificación = 9.00) . Sobreposición espectral se evita al ajustar la red de compensación como sigue: FL2-22.9% FL1 y FL2-41.7% FL3. Detección combinada de las fases efectuadora y degradación utilizando FLICA, anexina V y 7-AAD Caspasa-9 y caspasa-3 activadas se detectan utilizando FAM-DEVD-FMK y FAM-LEHD-FMK, ambos Inhibidores de Caspasa Marcados con Fluorocromo (FLICA) (equipos de actividad de caspasa de fluorescina CaspaTag™, Intergen, NY) (Lecoeur et al . , 2002; Smolewski et al . , 2002). Las neuronas se incuban con 1/150 de la solución de reserva DMSO de FLICA por 1 hr a 37°C. 7-AAD y Hoechst se agregan durante al menos 15 minutos. Las neuronas se lavan tres veces en regulador de enjuague (equipo CaspaTag™) . Para formación de imágenes FM, FLICAs se excitan a través del filtro BP 480/40 y la luz emitida se recolectó a través del filtro BP 527/30. Para análisis FC, fluorescencia FLICA se recolecta a través del canal Fl-1 (voltaje PMT = 501, red de compensación: FLl-7.8% FL2, FL2-40.8% FL1 y FL2-45.4% FL3) . La caspasa-3 separada se evidencia en la célula por inmunodetección utilizando anticuerpos policlonales conjugados con ficoeritrina (PE) (Beckton Dickinson) . Las neuronas se colorean por 7-AAD, tripsinizan y se fijan en PBS conteniendo 1% PFA y 20 µg/ml Actinomicina D (AD) por 20 min. Después, las neuronas se resuspenden en 100 µM PBS, 1% BSA, 20 µg/ml AD, 0.05% saponina Quillaja (Sigma) y 20 µl de los anticuerpos anti-caspasa-3 por 30 min a RT (Lecoeur et al . , 2001) . Después de los enjuagues en PBS, la fluorescencia relacionada con PE se analiza en el citómetro (canal Fl-2), Z-val-Ala-Asp (OMe)-FMK (Z-VAD-FMK), Quinolina-Val-Asp (OMe) -CH2-0-Ph (Q-VD-OPH), Z-DEVD-FMK (Z-leu-Glu (OMe) -His-Asp- (OMe) -fmk, ICN) y Z-LEHD-FMK (Z-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -FMK, todas compradas de ICN (Orsay, Francia), y 4- (2-aminoetil) -bencenosulfonil fluoruro (AEBSF, Pefabloc SC, Roche, Meylan, Francia) se agregan a 100 µM al inicio de la privación de suero. Sulforhodamina-DEVD-FMK (equipo de actividad roja CaspaTag™) permitió detectar la caspasa-3 activada y FITC-Anexina V. Las neuronas se incuban con 1/900 de la solución de reserva DMSO de FLICA, y IX FITC-anexina V en 200 µl de regulador de anexina por 30 min a 37°C. Entonces las neuronas se enjuagan tres veces en un regulador compuesto de 50% de regulador de enjuague y 50% de regulador de anexina. La actividad de caspasa-3 se detecta en el canal Fl-2 (585 +/- 21 nm) . Para FM, FLICA se excita a través del filtro BP515-560 y su fluorescencia se recolecta a través del filtro de emisión de paso largo LP590.

Detección en tiempo fijo de la fase de decisión de apoptosis utilizando JC-1 y 7-AAD El potencial de transmembrana mitocondrial (??m) se valoró por incorporación de 5,5' ,6,6'-tetracoloro-l,l,3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina yoduro (JC-1, Sondas Moleculares, Eugene, OR) . Las neuronas se co-colorean con 1 µM JC-1 y 7-AAD por 15 min a 37°C. Los monómeros JC-1 se detectan por FC en el canal Fl-1 (voltaje PMT = 644) . Los agregados J se detectan a través del canal Fl-2 (voltaje PMT = 451) (Reers et a l . , 1991). El voltaje PMT para detección 7-AAD fue de 326. La red de compensación: FLl-0.0% FL2, FL2-22.9% FL1, FL2-41.7% FL3, y FL3-0.7% FL2. Para análisis FM, las fluorescencias verde y naranja se graban simultáneamente grabada después de 1.2 s excitación (BP 450-490 excitación / LP 515 filtros de emisión de paso largo) . Fotoblanqueado se evita por atenuación de la irradiación a 5% de lá luz incidente inicial por un filtro de densidad neutral N20. Ácido bongkréico (BIOMOL), se prueba a 25 µM. Detección en tiempo real de (??a) potencial de transmembrana y morfología neuronal Los experimentos en tiempo real se realizan en neuronas de cultivo de 5 días de edad después de tripsinización. Las neuronas se resuspenden en medio N5, ajustan a 0.7 106 células/ml y se cargan con 800 nM JC-1 por 15 minutos a 37°C. Después, las muestras se diluyen a 1/8 en medio N5 y 20 µg/ml 7-ADD se agregan. La morfología básica y ??m y permeabilidad de membrana se registran por 5 minutos, y los medicamentos se agregan; 100 µM cianuro carbonilo m-florofenilhidrazona (mCICCP, Sigma) , 1 µM 1-metil-4-fenil-l, 2, 3, 6-tetrahidropiridina (MPTP, Sigma), y 0.6 µM de nitroprusida de sodio (SNP, Sigma) . MPTP es una toxina de complejo I mitocondrial y un inductor de apoptosis utilizado in vi vo para reproducir parquinsonismo en ratones y primates (Speciale, 2002) . Las variaciones de cada parámetro se graban por los siguientes 15 min. Las curvas se dibujan utilizando el software Microsoft Excel. Coloración del núcleo por Hoechst 33342 y mediciones del perímetro nuclear Las neuronas se incuban por 15 min con 1 µM Hoechst 33342 (Ho 342, Sigma) y se analiza por FM (exposición de 5 milisegundos (BP 340-380 filtro de exciptación/LP 425 filtro de paso largo) . El perímetro de núcleos se mide al crear regiones individuales de marcas de procesamiento de interés utilizando software Leica Q Fluoro, como se expresa en unidades arbitrarias. Análisis estadístico Las estadísticas se realizan utilizan el software Microsoft Excel. Las correlaciones se calculan por análisis de regresión lineal. Para cada análisis, R2 se indica. La prueba de Student impar se realiza para comparar porcentajes de células en las diferentes etapas de apoptosis. Un valor p < 0.05 se considera como significativo. EJEMPLO 2: inhibición de caspasa-2/silenciamiento en muerte celular in vivo e ±n vi tro La inhibición de pan-caspasa promueve supervivencia de neuronas corticales primarias inducidas para morirse por privación de suero. Durante el desarrollo neuronal y patología, las neuronas que fallan en encontrar soporte trófico apropiado y fuentes de factores tróficos derivados ' del objetivo experimentan muerte celular apoptótica. Privación de suero (SD) de neuronas corticales primarias, un modelo in vi tro para lesión neuronal aguda, conduce a muerte celular apoptótica. El estudio de la jerarquía y ordenación temporal de marcas apoptóticas durante SD, una trayectoria similar intrínseca se ha descrito en la cual la interrupción potencial de membrana mitocondrial (??m) ocurrió aguas arriba de apoptosis nuclear (NA) (condensación/fragmentación en cuerpos apoptóticos), de exposición de fosfatidilserina (PS) a la hojilla de membrana de plasma exterior, y permeabilización de terminal de la membrana de plasma (PMP) . Dichos resultados demuestran las respuestas en tiempo para tales marcas apoptóticas a través de 50 hrs SD (Figura 8A) . Para claridad, las cinéticas de apariencia de neuronas con ??m bajo, NA, ecto-exposición PS o PMP reflejan todos los subconjuntos intermediarios con alteraciones progresivas. En estas condiciones experimentales, la mayoría de las neuronas se embragan al mismo tiempo en cada proceso. Debido del papel crítico de caspasas en varios paradigmas de apoptosis, el requerimiento de caspaza se ha evaluado durante SD en neuronas corticales. Cuando se agregan al inicio de la extracción de suero, las neuronas SD se rescatan principalmente por tratamiento continuo con Quinolina-Val-Aps (OMe) -CH2-0-Ph (Q-VD-OPH), nueva generación de inhibidor de caspasa de espectro amplio, resultando en alta preservación de ??m, y morfología nuclear, membrana de plasma intacto así como también ausencia de exposición PS (figura 8B) . En contraste, ni Z-VAD-FMK ni BOC-D-FMK (BOC-D) es capaz de retrasar o abrogar muerte celular asociada a SD (Figura IB) . Debe observarse que la morfología nuclear y tanto la integridad de neurito como la red neurítica parecen conservarse lo suficiente en neuronas rescatadas en 24 hrs por Q-VD-OPH (Figura 8C). Sin embargo, su soma es ligeramente más pequeña. Utilizando substratos fluorescentes específicos, actividades similares a caspasa-2, similares a caspasa-3, similares a caspasa-8 y similares a caspasa-9 in cel l ula se detectan en SD 24 hr (Figura 8D) . El bajo nivel de activación similar a caspasa-8 durante SD sugiere que la trayectoria extrínsica no es preponderante en este modelo. Todas estas actividades de caspasa se inactivan completamente por co-tratamiento con Q-VD-OPH (Figura 8D) . Las investigaciones se llevaron a cabo para determinar si la supervivencia puede mejorarse por Q-VD-OPH durante retos por otros estímulos neurodegenerativos dependientes de caspasa sin relacionar: yonomicina de yonoforo Ca2+ ( excitotoxicidad) , la nitroprusida de sodio donadora de NO (SNP), péptido ß-amiloide (25-35) (ßA) y toxinas mitocondriales tales como 1-metil-4-fenil-1, 2 , 3 , 6-tetrahidropiridina (MPTP) o el ácido 3-nitropropiónico (3-NPA) . Estos medicamentos inducen la apoptosis (NA y PMP se monitorean), pero el tratamiento concomitante con ya sea Z-VAD-FMK o Q-VD-OPH falla en proporcionar la protección, excepto por ß-amiloide, que está de acuerdo con reporte previo (Figura 8E) . Estos descubrimientos refuerzan la inclusión específica de caspasas durante SD en neuronas corticales. Para asegurar la importancia de activación de caspasa primaria en el modelo de sistema probado, la inhibición farmacológica de varias trayectorias metabólicas y señalización se realizan utilizando las siguientes familias de compuestos (Tabla 1) : agentes objetivo de poro de transición de permeabilidad y mitocondria (PTP), modulador de toma de calcio mitocondrial, quelador de calcio citoplásmico, inhibidores de proteasa (calpaínas, proteasas de serina, proteasoma o catepsinas lisosomales ) , los inhibidores del ciclo celular, inhibidores de quinasas y fosfatasas incluidas en trayectorias de transducción de señal, agentes que interfieren con endocitosis y procesos de autofagía, antioxidantes, inhibidor de exportación nuclear de proteína. Casi todos los compuestos probados fallan en prevenir la muerte celular evocada por SD. Ya que, los agentes pleiotrópicos de cicloheximida y actinomicina D, que inhibieron la traducción y traslación, promueven la supervivencia de neurona cortical sometida a SD (Tabla I) . Actividad de caspasa-2 pre-mitocondrial se requiere para muerte celular apoptótica de neuronas corticales inducida por privación de suero El hecho de que un caso anterior, tal como pérdida de ??m, se previene por Q-VD-OPH que origina las cuestiones de tanto la importancia de caspasa (s) (pre-mitocondrial) en el modelo presente y la especificidad de Q-V-D-OPH. Para identificar la actividad de caspasa más próxima responsable de la muerte celular en modelo SD, un panel de inhibidores de caspasa selectiva se utiliza y su impacto se analiza en varios perímetros de muerte celular (Figura 9A) : Z-DEVD-FMK, Z-LEHD-FMK, Z-VDVAD-FMK y Z-LETD-FMK que inhibe respectivamente las actividades similares a caspasa-3, -9, -2 y -8. Parece que solamente Z-VDVAD-FMK, un inhibidor de actividad similar a caspasa-2 eficiente (Figura 9D) , es capaz de tanto eliminar la pérdida de pérdida de ??m así como también otras marcas de apoptosis (NA, PMP, exposición PS) y proteger' las neuronas contra muerte (Figuras 9A y 9B) . Para caracterizar mejor el perfil inhibidor de Q-VD-OPH y Z-VDVAD-FMK, un mejor patrón para neuroprotección se determinó. La apoptosis se inhibe por Q-VD-OPH y Z-VDVAD-FMK en una manera dependiente de concentración, reforzando que la cascada de caspasa se activa durante SD en neuronas corticales (Figura 10) . Considerando la alta densidad del cultivo (7xl05 por cm2), el efecto protector más alto se proporciona por 100 µM de cada inhibidor, que es la concentración utilizada en este estudio. La adición de estos inhibidores (100 µM) en el inicio de SD es el mejor patrón para neuroprotección inducida por Q-VD-OPH o Z-VDVAD-FMK, ya que los tratamientos con inhibidores retrasados por 2-6 hrs después de la extracción de suero son menos eficientes (Material Complementario; figura 10).

Además, la activación similar a caspasa-2 se detecta de 2 hrs de SD y precede tanto a las primeras señales de caída de ??m (8 hrs) y además alteraciones nucleares (Figura 9C) . Juntos, estos descubrimientos de alguna manera de una actividad similar a la caspasa-2 pre-mitocondrial es la actividad de caspasa más próxima requerida para apoptosis inducida por SD en neuronas corticales. La actividad similar a caspasa-2 se elimina por Z-VDVAD-FMK pero no por Z-DEVD-FMK, Z-LEHD-FMK o Z-LETD-FMK (Figura 9D). En contraste las actividades similares a caspasa-3 y caspasa-9 se inhiben por Z-VDVAD-FMK de esta manera demostrando que la activación similar a caspasa-2 está aguas arruba de tanto actividades similares a caspasa-3 como caspasa-9 (Figura 9D). Mientras se eliminan respectivamente las actividades similares a caspasa-3 y caspasa-8 (Figura 9D) , Z-DEVD-FMK y Z-LETD-FMK falló en proteger las neuronas de SD (Figuras 9A y 9B), indicando de esta manera que la actividad relacionada con caspasa-3 y que el reclutamiento de caspasa-8 no son esenciales para degeneración neuronal. Además, el inhibidor de caspasa-3 falla también en bloquear la activación de las caspasas-2, -3 y 9 (Figura 9D) . El inhibidor de caspasa-9, Z-LEHD-FMK no deteriora la caída de ??m aunque retrasa y evita la formación de cuerpos apoptóticos pero sin exposición PS en la condensación en etapa I (NA) y PMP (Figuras 9A y 9B) . Estos datos muestran que la caspasa-2 actúa aguas arriba de MMP y que la caspasa-9 actúa aguas abajo MMP durante SD. Para confirmar esta valoración, la prueba genética para apoptosis mediada por actividad de caspasa-2 inducida por SD se ha investigado. El análisis de secuencia de caspasa-2 de murino condujo al diseño de ARN de interferencia pequeño específico (siARN C2 wt ) dirigido contra caspasa-2 de murino, que induce específicamente la eliminación de expresión de caspasa-2, como se valora por RT-PCR y Western blotting (Figura 11A) . Como' un control, un siARN irrelevante con 4 mutaciones (siARN C2m) se diseña. siARN C2 wt dúplex es: SEQ ID N°l 5 ' -caccuccuagagaaggacadTdT-3' SEQ ID N°2 5 ' -uguccuucucuaggaggugdTdT-3 ' siARN C2 m dúplex es: SEQ ID N°3 5 ' -caucuacucgagacggacadTdT-3 ' SEQ ID N°4 5 ' -uguccgucucgaguagaugdTdT-3 ' La detección en base a anticuerpo in si t u confirma alto silenciamiento de gen de caspasa-2 de murino ya que siARN C2 wt disminuye la expresión de caspasa-2 en todas las neuronas (Figura 11B) . La excitación es máxima a post-transfección por 24 hrs con recuperación progresiva de expresión de caspasa-2 a 72 hrs (Figura 11B) . Sorprendentemente, la eliminación de caspasa-2 por siARN C2 wt resulta en la supervivencia de neuronas corticales después de SD, como se valora in cel ul l a por inactivación de caspasa-2 (Figuras 11C y 11D) así como también conservación de ??m, NA, simetría PS, integridad de membrana de plasma y red neurítica (Figuras 11C-E) . En contraste agudo, el siARN C2m de control no evita ni la expresión de gen/proteína (Figuras HA) ni la apariencia de estas marcas de apoptosis (Figuras 3C y 3D) . Además el impacto de inhibición de caspasa-2 o extinción en la supervivencia celular es específica de SD ya que las neuronas tratadas con yonomicina no se protegen contra muerte celular (figuras 11D y HE) . De esta manera, el tratamiento con este yonofero Ca2+ es un control independiente de caspasa-2 útil para probar la especificidad de siARN C2 wt ya que la caspasa-2 no se activa (ver abajo) y Z-VDVAD-FMK i siARN C2 wt no proporciona efecto protector (Figuras 11D y 11E) . Estos resultados demuestran que la activación de caspasa es un punto de control pre-mitocondrial crucial en este modelo. Caspasa-2 controla la liberación de citocromo c y transubicación de Bax en mitocondria Las investigaciones se realizan para determinar si un evento dependiente de MMP, tal como liberación de citocromo c se previene o no por inhibición de caspasa-2 o eliminación. SD acciona la liberación de citocromo c citoplásmico de mitocondria que se bloquea eficientemente por Q-VD-OPH, Z-VDVAD-FMK y siARN C2 wt (Figura 12A) .

De manera similar Q-VD-OPH, Z-VDVAD-FMK y siARN C2 wt elimina la activación de caspasa-2 y evita la activación dependiente de liberación de citocromo c aguas abajo de las caspasas-9 y caspasa-3 (Figuras 12B y 12C) . La muerte celular inducida por yonomicina es independiente de la activación de caspasa-2 en neuronas corticales (Figura 12B), que están de acuerdo con la ausencia de efecto protector en otras marcas de apoptosis por Z-VDVAD-FMK y siARN C2 wt (Figuras 12D y 12E) . ' Debe observarse que la inhibición de caspasas más distales como, caspasa-9 (por Z-LEHD-FMK) y caspasa-3 (Figura 12A) mientras que Z-LEHD-FMK puede retrasar las últimas características apoptóticas, como se observa por frecuencia más alta de bloqueo en una etapa preliminar de condensación nuclear (etapa I) (Figura 12A) . Junto con el hecho de que Z-LEHD-FMK no deteriora la caída de ??m mientras previene la activación de caspasa-9 y características terminales de apoptosis, es decir, exposición PS, NA y PMP (Figuras 9A, 9B y 9D), estos resultados soportan la formación del apoptosoma clásico implicando citocromo c, caspasa-9 y la activación de caspasa-3 subsecuente. El papel de Bax relativamente para caspasa-2 fue entonces estudiado, ya que esta proteína pro-apoptótica de la familia Bcl-2, se requiere durante desarrollo neuronal y puede también ser crítico para promover la liberación de citocromo c mitocondrial y la muerte celular en neuronas después del factor trófico. La detección basada en anticuerpo in si t u de Bax se realiza en neuronas SD y muestra transubicación Bax de citosol (patrón difuso) en compartimentos similar a mitocondria (punteada) (Figuras 12D) , demostrando que Bax también puede participar en el inicio de la muerte celular. De manera importante, la colocación de la activación de caspasa-2 contra transubicación Bax es crucial para entender si (i) transubicación Bax es dependiente en caspasa-2; (ii) si la actividad de caspasa-2 es dependiente en Bax; (iii) si ambas se incluyen independientemente en control pre-mitocondrial de muerte celular inducida por SD. Se observa que Bax permanece difusa en el citosol de neuronas SD tratadas por Z-VDVAD-FMK, sugiriendo así que caspasa-2 puede controlar transubicación Bax para promover la muerte celular (Figura 13A) . Por el contrario, Z-LEHD-FMK que actúa en caspasa-9, la caspasa más próxima activada aguas abajo de mitocondria, no previene la reubicación Bax mitocondrial. De acuerdo con esto, el tratamiento con Z-VDVAD-FMK, Q-VD-OPH o eliminación de caspasa-2 por siARN C2 wt deteriora la transubicación Baz a mitocondria (Figura 12D) , confirmando que la caspasa-2 puede ejercer un control aguas abajo de Bax para promover la muerte celular. Para caracterizar mejor la relación putativa entre Bax y caspasa-2, neuronas corticales primarias inducidas para morirse por SD se trataron con furosemida del inhibidor de canal de cloruro. Sin embargo, la transubicación de Bax parece requerir pH y cambios conformacionales sensibles a intensidad iónica, y furosemida se ha mostrado que reduce la transubiación de Bax dentro de las células tratadas con estaurosporina, Factor de necrosis de tumor a o etopósido. Al interferir con transubicación Bax (Figuras 13A y 13B), furosemida (que puede actuar en el nivel o aguas arriba de Bax) reduce las marcas de apoptosis, (es decir, pérdida de ??m, liberación de citocromo c, NA, PMP) en neuronas SD (Figura 13C) . Además, las observaciones cinéticas revelan que la reubicación de Bax parcial en mitocondria ocurre en 5 hrs SD (casi concomitante con activación de caspasa-2; Figura 9C) , antes de la pérdida de ??m en 8 hrs y liberación de citocromo c de mitocondria en 15 hrs (datos no mostrados), sugiriendo que Bax media MMP en paradigma SD. De manera importante, aunque furosemida bloque la transubicación Bax, evita parcialmente la reubicación Bax mitocondrial en SD pero no deteriora la actividad de caspasa-2 (Figura 13b) . Debe remarcarse que furosemida proporciona solamente una protección parcial comparada con Z-VDVAD-FMK o siARN C2 wt, que también puede atribuirse a la limitación de dosis (más de 3 mM es tóxico para neuronas corticales) y el hecho de que furosemida no es un agente de interferencia Bax. La actividad de caspasa-2 es no nuclear y permanece difuso en la soma y neuritos de neuronas SD así como también en aquellos tratados con furosemida, no sugiriendo actividad de caspasa-2 específica de organelo. Esta observación es crucial ya que Z-VDVAD-FMK o siARN C2 wt deterioran tanto la transubicación Bax como la actividad de caspasa-2 (Figura 13B) . Aunque, estos datos sugieren una redistribución dependiente de caspasa-2 aguas arriba de Bax de citosol a mitocondria, que a su vez inicia una secuencia lineal de eventos en cuya pérdida ??m, la activación dependiente de liberación de citocromo c aguas abajo de caspasa-9 y caspasa-3, NA, exposición PS y PMP final ocurren. Sin embargo, una acción independiente Bax indirecta o directa putativa de caspasa-2 en membrana mitocondrial en neuronas no puede excluirse, como se sugiere en sistemas libres de célula. Separación Bax inducida por SD es dependiente de caspasa-2 citoplásmica pero es independiente de calpaína Para establecer precisamente la conexión entre Bax y caspasa-2, la expresión de caspasa-2 y Bax en neuronas SD se verificó en mARN y el nivel de proteína y la búsqueda se enfoca para precisar la localización celular de caspasa-2 a través de SD. Bax concerniente, no mARN Supra/sub regulación (Figura 14A) ni incremento de contenido de proteína Bax p22 se detectan después de SD de 24 hr (Figura 14B) . Sorprendentemente, además de p22 Bax de longitud completa, a través de SD por 24 hr, la apariencia progresiva de una segunda banda correspondiente a una proteína de 18 kDa se observa cuando se detecta por Western Blotting utilizando el anticuerpo policlonal (?21) originado contra Bax de ratón completo eliminado para los 21 aminoácidos de terminal carboxi (ver el curso de tiempo en Figura 14B) . Una inmunomancha comparativa de bandas relacionadas de p22 y pl8 Bax se realiza con anticuerpo ?21 y el anticuerpo policlonal N20 elevado contra un péptido que se traza en el término amino de Bax a (Figuras 14B y 14C) . N20 no permite la detección de banda pl8 (Figura 14C) , sugiriendo que p22 Bax se separa en la porción de término N en una forma 18 kDa. Debe observarse que esta separación temprana (Figura 14B) ocurre con cinéticas similares que la actividad de caspasa-2 (Figura 9C) . De manera sorprendente, la inhibición de caspasa-2 o su extinción genética a base de siARN completamente elimina la separación Bax mientras siARN C2 m no tiene efecto (Figura 14D) , demostrando que la activación de caspasa-2 se requiere para separación Bax después de SD. El fraccionamiento celular se realiza entonces para identificar si la muerte celular inducida por Bax durante SD se relaciona principalmente con la activación de caspasa-2 y para verificar si Bax se integra con la membrana mitocondrial para promover la caída de ??m en neuronas corticales. El contenido de Bax se analiza por Western Blotting en tanto fracciones de membrana pesada enriquecida con mitocondria y citosólica soluble obtenida de neuronas córticas sometidas a SD por 24 hr con o sin Z-VDVAD-FMK o siARN C2 wt . p22 Bax nativa se encuentra tanto en fracciones enriquecidas con mitocondrias y soluble en SD por 24 hr mientras que pld Bax se detecta exclusivamente en la fracción enriquecida por mitocondria (Figura 14E) . Bax nativa se conserva en un grado menor en (exterior) membrana mitocondrial (Figura 14E) . Dichos datos muestran que ambas formas de Bax pueden participar en la muerte celular evocada por SD. Las investigaciones se llevaron entonces a cabo para determinar si la separación Bax dependiente de caspasa-2 puede ocurrir en neuronas corticales en respuesta a otros estímulos. De manera efectiva, la separación de Bax también ocurre durante el tratamiento por estaurosporina o yonomicina, pero en estas situaciones pl8 Bax se genera en una manera independiente de caspasa (Figura 14F) , • confirmando que otras proteasas pueden ser responsables de la separación Bax en estos modelos (Wood et a l . , 1998; Choi et a l . , 2001). De acuerdo a lo anterior, la muerte celular inducida por estaurosporina o yonomicina (Figura 3D) no se evita por Q-VD-OPH o Z-VDVAD-FMK. El perfil inhibidor de proteasa de separación de Bax se cuestiona más precisamente ya que Bax puede separarse directamente por otras proteasas de cisteína, calpaínas o a través de activación de calpaína dependiente de caspasa (Choi et al . , 2001) . Para verificar si las calpaínas son responsables de la separación de Bax durante SD en neuronas el efecto de inhibidores de calpaínas (ALLN, ALLM y E64D) en separación Bax se investiga por Western-blot . En contraste a Q-VD-OPH, la inhibición de actividad de calpaínas no se media directa o indirectamente por calpaínas durante SD (Figura 14G) . De manera interesante pld Bax parece estabilizarse por inhibición de actividad proteosomal por lactacistina y epoximicina (Figura 14H) , reforzando el efecto apoptótico previamente reportado de pl8 Bax. Todos estos datos coinciden con un modelo en el cual la activación de caspasa-2 resulta en separación Bax en forma activa. Dichos resultados han mostrado que Bax necesita que caspasa-2 se procese. De esta manera, las investigaciones se llevaron a cabo para determinar el estado bioquímico y distribución celular de caspasa-2 a través de SD. Parece que no existe supra-regulación de mARB de caspasa-2 siguiendo SD (Figura 141) . En contraste, el contenido de proteína de procaspasa-2 disminuye en neuronas SD en comparación con neuronas sin tratar y esta disminución parece ser el resultado de una auto-separación de caspasa-2 ya que el tratamiento con Z-VDVAD-FMK lo previene (Figura 14J) . Sin embargo, la forma pl4 procesada de caspasa-2 se inmunodetecta en neuronas SD, pero no en neuronas SD tratadas con Z-VDVAD-FMK (Figura 14J) . Un producto intermediario de separación también puede detectarse en 33 kDa. El análisis cinético de ubicación de caspasa-2 durante SD muestra que la caspasa-2 es estrictamente citoplásmica, aún en etapa posterior, de está manera regulando una función nuclear de caspasa-2 en muerte celular SD (Figura 14K) . En contraste, varios medicamentos apoptogénicos tal como yonomicina de yonofero Ca2+, la estaurosporina de inhibidor de quinasa, canptotecina del inhibidor de topoisomerasa I, accionan la ubicación nuclear parcial o completa de caspasa-2 (Figura 14L) . De esta manera, la distribución citoplásmica de caspasa-2 en neuronas es dependiente del estímulo demostrando una función peculiar de caspasa-2 en el citoplasma de neuronas SD. Inhibición de caspasa-2 específica proporciona fuerte neuroprotección durante lesión cerebral isquémica Los resultados anteriores demuestran que la activación de caspasa-2 aguas arriba y temprana son un punto de control crucial en dicho modelo in vi tro . Los experimentos se llevaron a cabo para determinar si tal trayectoria puede tenerse como objetivo eficientemente in vivo durante la tensión neuronal aguda. Para proceder, la síntesis común de un nuevo prototipo de inhibidor de caspasa-2 permeable a célula se realiza, nombrado Q-VDVAD-OPH, en la base de VDVAD pentapéptido combinado con grupo quinolina minoterminal y grupo O-fenoxi carboxiterminal , que puede mejorar tanto el potencial inhibidor como permeabilidad. SEQ ID N° 5, Q-VDVAD-OPH: Quinolinilcarbonil-L-valinil-L-aspartilo (éster metil ) -L-Vanilil-L-Alaninil-L-Aspartil (éster metil) 2,6-difluorofenil éster. La especificidad de Q-VDVAD-OPH se prueba contra caspasa-2 recombinante (Figura 15A) . Separación VDVAD-AMC in vi tro por caspasa-2 se bloquea por Q-VDVAD-OPH, tan eficientemente como Q-VD-OPH y caspasa-2 reversible específica (Ac-VDVAD-Cho) o inhibidores irreversibles (Z-VDVD-FMK) . Aunque la inhibición por separación por Z-VAD-FMK es menos importante, BOC-D-FMK es completamente inactivo contra caspasa-2, demostrando así potencias inferiores de inhibidores de pan-caspasa usuales contra caspasa-2. Caspasa-2 no se inactiva fuertemente por Z-DEVD-FMK, el inhibidor similar a caspasa-3 no por Z-LEHD-FMK, Z-LETD-FMK, inhibidores similares a caspasa-3/9/8 respectivamente (Figura 15A) . Inhibidores E64d, ALLN, ALLM de otras proteasas de cisteína, calpaínas, son incapaces de deteriorar la actividad de separación (Figura 16) . Cuando se prueba en paradigma SD (pero no muerte inducida por yonomicina), Q-VDVAD-OPH promueve la supervivencia de neuronas corticales (Figura 15B) como Q-VD-OPH, Z-VDVAD-FMK o siARN C2 wt lo hicieron (Figuras 8B, 9A, y 11D y 11B) , proporcionado así un inhibidor de caspasa-2 específico para experimentos in vivo . En contraste BOC-D-FMK y Z-VAD-FMK son ineficientes contra muerte celular neuronal inducida por SD (Figura 8A) . Q-VDVAD-OPH se prueba entonces en un modelo agudo de lesión hipóxica-isquémica en el cerebro en desarrollo, en el cual la muerte celular ocurrió por apoptosis preferentemente. En este modelo de isquemia focal unilateral transitoria, las crías de rata experimentan oclusión de la arteria cerebral intermedia izquierda, permanente en asociación con oclusión transitoria de la arteria carótida común izquierda con reperfusión. El efecto de neuroprotección de inhibidores específicos de pan-caspasa (Q-VD-OPH) y caspasa-2 (Q-VDVAD-OPH) se examina entonces cuando se administra en este modelo isquémico perinatal. Una dosis de Q-VD-OPH o Q-VD-VAD-OPH se examina entonces cuando se administra en este modelo isquémico perinatal. Una dosis de Q-VD-OPH o Q-VD-VAD-OPH (100 µg/animal) o vehículo se administra i.p. antes del inicio isquémico. Los cerebros se analizan entonces 48 horas después, un punto de tiempo en el cual el infarto se estabiliza sin edema significativo (no más de 1.5%) . La isquemia indujo un volumen de infarto de 55.0 +_ 3.4 mm3 , que representa un daño de 22.1 +_ 1.4% en el hemisferio ipsilateral lesionado. Los volúmenes de infarto parecieron distribuirse normalmente (entre 15 y 26%) (Figuras 15C y 15D) . Una dosis única de Q-VD-OPH dado antes de isquemia, significativamente redujo el volumen de infarto por 44% (12.4 + 2.6%, p<0.05 en comparación con el grupo de control en la prueba Newman-Keul ) , con volúmenes distribuidos entre 0 y 31 (Figuras 15D y 15E) . Q-VDVAD-OPH, en la misma dosis, indujo una reducción del 74% altamente significativa en volumen de infarto (5.7 +_ 2.3%, p<0.01 en comparación con el control y grupos Q-VD-OPH en la prueba de Newman-Keul) (Figuras 15C y 15D) . En los 12 animales estudiados, 8 mostraron un infarto más pequeño muy marcado (promedio de 0.5%) visible en el nivel de la oclusión MCA (niveles correspondientes a las placas 12 y 13) pero no en aquel del dorsal) e hipocampo (placa 21) en comparación con los animales de control isquémico (Figura 15C y 15E) . Los cuatro otros mostraron un infarto con un promedio de 16.5 +_ 1.32%, un valor inferior a aquel obtenido en animales de control isquémico. Para concluir, nuestros datos demuestran que el bloqueo específico de iniciador de caspasa-2 proporciona fuerte neuroprotección, que es más eficiente que la inhibición de pan-caspasa contra lesión cerebral isquémica. Discusión Actividad de caspasa-2 pre-mitocondrial se requiere para apoptosis neuronal La invención de esta manera describe un nuevo subtipo de trayectoria intrínseca en el cual la apoptosis inducida por SD de neuronas corticales primarias es dependiente de la activación aguas arriba del iniciador de caspasa-2 que procede a través del control de disfunción mitocondrial inducida por Bax y destrucción de neurona dependiente de caspasa subsiguiente (Figura 17 ) . Este modelo se soporta por las siguientes líneas de evidencia: (1) Jerarquía y ordenaciones temporales de apoptosis mostraron una manera similar a intrínseca en la cual Bax citosólico transubica y se integra en la membrana mitocondrial exterior para inducir la caída de ??m, para promover la liberación de citocromo c y .eventos aguas abajo, como activación dependiente de liberación de citocromo c de caspasas-9/caspasa-3 , condensación/fragmentación nuclear, exposición PS y PMP terminal. Los resultados obtenidos de acuerdo a la invención pueden soportar la formación de la apoptosoma clásica con citocromo c y caspasa-9. Sin embargo, la caspasa-9 puede también incluirse en la activación de otras caspasas ejecutoras aguas abajo que permanece por identificarse ya que la inhibición de caspasa-3 no previene marcas terminales de apoptosis. (ii) Z-VDVAD-FMK promueve supervivencia más alta de neuronas inducidas para morirse por SD que los inhibidores selectivos de caspasa-3, -8 y -9. (iii) La activación de caspasa-2 temprana se detecta antes de MMP e independientemente de otras caspasas. La activación de caspasa-2 pre-mitocondrial se requiere para muerte celular inducida por SD ya que la eliminación de caspasa-2 por siARN específico o inhibición farmacológica de actividad de caspasa-2 (Z-VDVAD-FMK, Q-VD-OPH) elimina toda marca apoptótica. (iv) inhibición de actividad de caspasa-2 debe realizarse al inicio de SD para proporcionar citoprotección , reforzar el papel temprano y crucial jugado por caspasa-2. (v) ya que la apoptosis inducida por SD también es dependiente de Bax, la activación de caspasa-2 puede mediar el control aguas arriba de Bax al permitir la separación de Bax nativo en fragmento pl8, independientemente de calpaínas. Sin embargo, tanto Bax separado como nativo transubican como se integran en membrana mitocondrial exterior para inducir la caída de ??m y promover la liberación de citocromo c y eventos aguas abajo en una manera dependiente de caspasa-2. (vi) Caspasa-2 se procesa en una forma pl4 como un resultado de auto-separación y permanece estrictamente difusa en el citoplasma durante SD, regulando así la función nuclear o específica de organelo de caspasa-2. La ubicación citoplásmica exclusiva de caspasa-2 a través de puntos SD largos pone en evidencia un mecanismo peculiar de activación durante SD. Muerte celular neuronal dependiente de caspasa contra independiente de caspasa De los inhibidores de caspasa de amplio espectro probados, solamente Q-VD-OPH, proporciona inhibición de caspasa significativa y supervivencia en neuronas SD corticales. Esta tercer generación de inhibidor de pan-caspasa muestra propiedades anti-apoptóticas mejoradas, no limitadas a neuronas, probablemente debido a la mejor permeabilidad (grupo quinolina aminoterminal) , especificidad y efectividad del grupo O-fenoxi carboxiterminal (sobre fluorometi/clorometil cetona clásica). De esta manera, Q-VD-OPH parece de mayor uso para neurobiología que los inhibidores de la vieja generación, Z-VAD-FMK y BOC-D-FMK. La inhibición de multi-caspasa en modelos de cultivo neuronal proporcionó generalmente protección parcial o transitoria sin conservación de todas las marcas apoptóticas. Las razones de esto se deben probablemente a las trayectorias independientes de caspasa mitocondrial parciales o activación de (independientes de caspasa mitocondrial) trayectorias mitocondriales en las cuales la inhibición de caspasa (s) incluidas aguas abajo del punto de control mitocondrial no previene la liberación de citocromo c, pero preferentemente extiende el compromiso de muerte. Por ejemplo, las neuronas simpatéticas salvadas por BOC-D-FMK privadas del factor de crecimiento nervioso (NGF) mostró una conservación de morfología, sin restauración de síntesis de proteína y de propiedades de membrana de plasma electrofisiológica . De manera conversa, parece que si la inactivación de caspasa-2 específica o eliminación ocurre en el nivel pre-mitocondrial y de esta manera previene la liberación de citocromo c y eventos dependientes aguas abajo, las neuronas SD muestran morfología casi conservada (soma y red neurítica) . Como opuesto a la activación de caspasa, el papel de MMP en regulación de muerte celular en desordenes neurodegenerativos crónicos y agudos se ha reportado. Sin embargo, como se observa de la Tabla I), ninguna de la interferencia directa con mitocondria o PTP proporciona supervivencia significativa en neuronas SD. La ausencia de protección significativa por tales compuestos indica que el mitocondrión improbablemente es el punto de control más aguas arriba en el paradigma SD. Los datos obtenidos de acuerdo a la invención soportan que en algunos modelos de muerte neuronal, caspasa-2 actúa aguas arriba de mitocondria, y el ejecutor de caspasa-3 y -9 actúan aguas abajo de la mitocondria. Además, la inhibición farmacológica de otras trayectorias principales metabólicas y de señalización fallaron en prevenir la muerte celular evocada por SD (ver Tabla I) . No puede excluirse que el efecto de los compuestos totales se desvían y que elaboran combinación que puede proporcionar citoprotección . Finalmente, como se espera, solamente actinomicina D y ciclohexamida promueven la supervivencia de neurona cortical sometida a SD, sugiriendo que los eventos post-transcripcional/de traducción pueden incluirse en este modelo de muerte. Sin embargo, la transcripción de n ovo y traducción de macromoléculas son indispensables a muerte celular en varios modelos apoptóticos neuronales: Cicloheximida previno tanto la pérdida de ??m y liberación de citocromo c en simpatético privado de NGF y actinomicina D bloqueó la muerte celular de células PC12 diferenciadas y naturales privadas de NGF/suero. Activación de caspasa-2 pre-mitocondrial en neuronas corticales SD La invención soporta un modelo para el requerimiento inicial de caspasa-2 pre-mitocondrial que promueve alta supervivencia de neuorona (Z-VDVAD-FMK) o silencia (siARN C2wt) ( Figura 8 ) . Los ratones _ ~ de caspasa-2 son viables y no muestran fenotipo neuronal anormal excepto reducción del número de neuronas motoras faciales (causadas por apoptosis acelerada en etapas neonatales y no por una reducción en formación de neuronas) . Sorprendentemente, aunque las neuronas simpatéticas experimentaron apoptosis en extracción de NGF y se protegen por caspasa-2 antisentido, neuronas simpatéticas deficientes de caspasa-2 experimentaron apoptosis más eficientemente que las neuronas tipo silvestre. Además, las neuronas de hipocampo de estos ratones fueron resistentes a µ+amiloide. La inducción de eliminación transitoria de caspasa-2 en neuronas corticales por interferencia de ARN evita los mecanismo compensatorios, que permitieron demostrar claramente la inclusión de caspasa-2 en muerte neuronal . Aunque la ubicación subcelular de caspasa-2 puede dar una vista interior del mecanismo de su activación, su distribución subcelular precisa es aún controversial (complejo Golgi, mitocondria, núcleo y citoplasma), probablemente debido a las diferencias en el tipo celular, muerte por estímulos, sobreexpresión de proteína de fusión GFP y antisueros utilizados para detectar caspasa-2. Sorprendentemente, caspasa-2 se detecta constitutivamente en neuronas corticales tanto como grupo citoplásmico o difuso, aún durante SD largo, regulando así una función específica de organelo o nuclear de caspasa-2 en muerte celular SD en neuronas corticales. Tanto la ausencia de redistribución de caspasa-2 en el núcleo durante SD como el hecho de que la distribución citoplásmica de caspasa-2 en neuronas corticales es dependiente de estímulo, sugiere un mecanismo de activación de caspasa-2 en el citoplasma de neuronas SD. De manera interesante, la muerte neuronal inducida por extirpación también se reduce por Z-VDVAD-FMK un modelo en el cual caspasa-2 se detecta tanto en citoplasma como núcleos de neuronas de hipocampo. La coloración de caspasa-2 también fue principalmente citoplásmica con uno o dos lugares en muchos núcleos en células PC12 y este patrón no cambia substancialmente en células privadas de NGF. Junto con paradigma SD, estos datos están a favor del papel jugado por caspasa-2 para inducir la apoptosis del citosol, que cambia el consenso actual para activación de muerte celular mediada por caspasa-2 del nivel nuclear. Utilizando tinte ??m sensible, se mostró que la actividad de caspasa-2 in cel l ul a precede a interrupción de ??m y liberación de citocromo c en neuronas SD, que es compatible con un papel jugado por miembros Bcl-2 pro-apoptóticos . Dichos datos son consistentes con los resultados previos mostrando que Bax se requiere durante desarrollo neuronal y también puede ser crítico para promover liberación de citocromo c mitocondrial y muerte celular en neuronas después de privación del factor trófico. Caspasa-2 como un objetivo durante isquemia in vivo Tomando en cuenta la dificultad de suministrar siARNs en el cerebro, el primer péptido a base de 0-fenoxi y quinolina que podría inhibir específicamente la caspasa-2 se diseña para probar el concepto para intervención terapéutica in vivo en el nivel de caspasa-2. Recientemente introducido (Melnikov et a l . , 2002; Caserta et al . , 2003; Lecoeur et al . , 2004), Q-VD-OPH fue el único inhibidor a base de 0-fenoxi y quinolina disponible, pero no fue selectivo. La ausencia de neuroprotección por Z-VAD-FMK en paradigma SD, combinado con el hecho de que bloquea la actividad de separación in vi tro de la caspasa-2, subraya la ganancia en permeabilidad proporcionada por el grupo quinolina aminoterminal . El templado Q-VDVAD-OPH utilizado por los inventores bloquea bien la actividad de caspasa-2 in vi tro y in cel ulla , promoviendo así la supervivencia de las neuronas SD. SD, hipoxia o privación en glucosa son componentes de isquemia miocardial o cerebral in vivo . Existe evidencia en modelos neonatales de hipoxia-isquemia (H-I) para apoptosis masiva en número y penumbra en lugar de necrosis. Isquemia cerebral neonatal conduce a muerte celular retrasada con daño de ADN y mecanismos apoptóticos de muerte celular. Isquemia focal transitoria con reperfusión en la cría de rata P7 conduce a fragmentación de ADN, características morfológicas de apoptosis y activación de la trayectoria mitocondrial. Los inventores han demostrado que 5mg/kg i.p. administración de Q-VDVAD-OPH, altamente efectiva e inhibidor de caspasa-2 permeable a célula, reduce masivamente el tamaño de infarto (74%) en crías de rata sometidas a tal lesión H-I transitoria neonatal experimental. La eficacia extrema de Q-VDVAD-OPH contrasta severamente con los resultados previos obtenidos en este modelo, mostrando que el inhibidor de pan-caspasa, BOC-D-FMK, no induce tal reducción significativa en volumen de infarto. Ya que este modelo H-I parece dependiente de caspasa-2, estos descubrimientos pueden ser consistentes con nuestras observaciones en la infectividad relativa de BOC-D-FMK en neuronas SD y contra actividad VDVADase in vi tro de caspasa-2 recombinante. Además, este compuesto no fue neuroprotector, a pesar de un trabajo previo demostrando protección significativa después de hipoxia-isquemia en el modelo Rice-Vannucci. De hecho, BOC-D-FMK ofreció preferentemente agravación en 60% de animales en modelo Renolleau. Las evidencias sugieren que la activación de caspasa no letal y fisiológica contribuye a guía axón y remodelación sináptica ya que (i) algunas proteínas (GluRl-4, subunidades receptoras de AMPA) , quinasa Cam, proteína de interacción PKC, MAP y quinasas tirosinas) implicadas en plasticidad sináptica también son substratos para caspasas y (ii) ratones tratados con Z-VAD-FMK mostraron memoria deteriorada. La inhibición de pan-caspasa en organismo vivo podría cambiar de apoptosis a necrosis, tumorigenesis , o interrupción de homeostasis celular, que podría resultar en agravación por daño, cáncer o enfermedades autoinmunes. De esta manera, la alteración de activación de caspasa fisiológica, la toxicidad y efectos secundarios debido a administración prolongada de inhibidores de pan-caspasa también podrían limitar su uso en el tratamiento de neurodegeneración crónica, reforzando así el requerimiento para inhibición selectiva preferencial de caspasa (iniciador) para enfermedades tanto agudas como crónicas. Si la reducción parcial en lesión H-I podría proporcionarse por inhibición de pan-caspasa, ya sea debido a que la inhibición de caspasas pro-apoptóticas o pro-inflamatorias o ambos no fue clara. De manera interesante, ya que este modelo de apoplejía neonatal con reperfusión es particularmente relevante , clínicamente de encefalopatía hipóxica-isqué ica humana neonatal en nacimiento, la inhibición de caspasa-2 por inhibidores peptídicos pequeños puede ofrecer alguna alternativa terapéutica para conservación de neuronas en apoplejía neonatal sin efectos secundarios que pueden ocurrir durante inhibición de pan-caspasa. Además, como inhibición específica de procesamiento mediado por caspasa-1 pro-inflamatoria de IL-lß y Poli (ADP-ribosa ) sintasa (PARS) redujo también moderadamente la muerte celular después de lesión isquémica, esto puede proporcionar un racional para combinar inhibidores PARS o caspasa-1 con inhibición de caspasa-2. En vista de los resultados obtenidos por los inventores, la interferencia selectiva con caspasa-2 pre-mitocondrial parece ser una herramienta relevante para atenuar la muerte celular neuronal. Estos resultados permite reconciliar la trayectoria intrínseca con activación de caspasa-2 huérfana, al menos en paradigmas de muerte celular neuronal, y para eliminar una nueva conexión entre caspasa iniciadora y trayectoria mitocondrial intrínseca. La apoptosis neuronal aguda puede ser dependiente en activación aguas arriba de caspasa-2 iniciadora que procede a través del control de disfunción mitocondrial inducida por Bax y destrucción de neurona dependiente de caspasa subsiguiente. Se demuestra que la caspasa-2 también es un objetivo relevante con buen pronóstico neuroprotector en apoplejía neonatal, ya que la inactivación in vivo de caspasa-2 resulta en reducción masiva de volumen del infarto durante la isquemia focal transitoria.

Procedimientos experimentales Aislamiento y cultivo de neuronas corticales primarias Las neuronas corticales primarias se cultivan de embriones de ratones SWISS E14 (Janvier) . Los ratones se sacrifican por dislocación cervical y los embriones se remueven por cesárea. Las cortezas cerebrales se extraen y tejidos mecánicamente triturados 15 veces en medio L15 (Gibco BRL) al utilizar puntas 1000 µl (Eppendorff) , entonces los residuos se remueven, y la suspensión celular se centrífuga a 850 rpm por 10 min. Las neuronas se colocaron en placas (por 2 días a una alta intensidad (7.105 células vivas por cm2 ) en Medio Básico de Eagle (Eurobio) complementado con 1% glutamina, 5% suero de caballo (HS, Eurobio) y 2.5% suero de bovino fetal (FCS, Eurobio) sobre placas de 6 o 24 cavidades (Sarstedt), o portaobjetos alojados de 4 cavidades Lab-Tek® (Nalge Nunc International), previamente revestidos con Img/ l polietil-enimina (Sigma) . En DIV3, el medio se cambia diariamente y las neuronas se mantienen en medio completo N5 conteniendo 180 mg/1 glucosa, 5% HS y 1% FCS, y 3 µM citosina ß-D-arabinofuranosida (Sigma) y 1 µM 5-metil-l O , ll-dihidro-5H-dibenzociclohepten-5, 10-imina maleato (MK-801, Sigma) . La pureza de cultivo (>95%) fue controlada con una proteína asociada ant i-microtubulo 2 anticuerpo monoclonal (MAP-2, Sigma) y anticuerpo policlonal de proteína acida fibrilar anti-glial (GFAP, Dako) . Las neuronas se utilizan entre DIV6-DIV9. Inducción de apoptosis y análisis de neuroprotección por agentes farmacológicos La muerte celular se induce a DIV6 por privación de suero (SD). Brevemente, la extracción de suero se realiza como sigue: neuronas cultivadas en medio completo N5 se enjuaga rápidamente 3 veces en N5 desprovisto de tanto HS como FCS, y se incuban por 24 hrs en medio N5 sin suero, en ausencia o presencia de agentes farmacológicos. Alternativamente, la muerte celular también se indujo por tratamiento por 24-48 hrs con yonomicina, estaurosporina, canfotecina, l-metil-4-fenil-1 , 2 , 3 , 6-tetrahidropiridina (MPTP), ácido 3-nitropropiónico (3NPA), nitrprusida de sodio (SNP) (todo comprado de Sigma) o ß-amiloide péptido (25-35) (Bachem) .

Los reactivos para análisis de neuroprotección se agregan al inicio de SD o tratamiento de medicamento (en medio completo N5) . Se utilizaron en concentraciones que inducen efecto no citotóxico por si mismos. La ciclosporina A, sal de disodio de ácido 4 , 4 ' -diisotiocianastilbeno-2, 2' -disulfónico (DIDS), rojo rutenio, decilubiquinona, éster acetoximetilo de 1, ácido 2-bis (2 -aminofenoxi) etano-N,N,N' ,N' -tetraacético (BAPTA-AM) , 3-metiladenina, bafilomicina Al, rapamicina, leptomicina B, N-benciloxicarbonil-Phe-Phe-fluoro etilcetona (Z-FF-FMK), pepstatina, ácido ocadáico, microcistína LR, H-7, aspirina, wortmamina, genisteína, lactacistina, epoxomicina, Trolox®, N-acetil-cisteína, glutationa, actinomicina D, cicloheximida se compran de Sigma; N-benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp (Orne) -fluorometilcetona (Z-VAD-FMK), BOC-Asp (OMe ) -fluorometilcetona (BOC-D-FMK) , quinolina-Val-Asp (OMe) -CH2-0-Ph (Q-VD-OPH), N-benciloxicarbonil-Phe-Ala-fluorometilcetona (Z-FA-FMK) , N-be ciloxicarbonil-Asp-Glu (OMe) -His-Asp (OMe) -fluormetil-cetona (Z-DEVD-FMK) , N-benciloxicarbonil-Leu-Glu (Orne) -His-Asp (OMe) -fluormetilcetona (Z-LEHD-FMK) , N-benciloxicarbonil-Leu-Glu (OMe) -Thr-Aps (OMe) -fluorometilcetona ( Z-LETD-FMK) , N-benciloxi-carbonil-Val-Asp (Orne) -Val-Ala-Asp (OMe) -fluorometilcetona ( Z-VDVAD-FMK) fueron de ICN; síntesis de costumbre de Quinolina-Val-Asp (Orne) -Val-Ala-Asp (OMe) -CH2-0-Ph (Q-VDVAD-OPH9 se realiza por ICN; 4 - ( 2-aminoetil ) -bencenosulfonil fluoruro (AEBSF o Pefabloc SC) fue de Roche; N-Acetil-Leu-Leu-Norleu-al (Calpaina inhibidor I o ALLN), N-Acetil-Leu-Leu-Met-al (Calpaina inhibidor II o AALM) , trans-Epoxisuccinil-L-leucilamido- (4-guanidina) butano (E64d) , MDL-28170, SB 202190, PD 98059, SP 600125 fueron de Merck/VWR. Instrumentación para análisis dinámico de apoptosos en neuronas corticales primarias La microscopía de fluorescencia multisonda (FM) se realiza en neuronas previamente coloreadas utilizando un microscopio de fluorescencia invertida DM IRB (Leica) equipado con una lámpara de arco corto de mercurio 100 W y un objetivo de PLANO L a x 40 N o una inmersión en agua X 100 N objetivo PLANO. Usualmente, los estudios cuantitativos se realizan por ambos FM en aproximadamente 200-600 células/campo por puntuación 5-10 campos seleccionados aleatorios por experimento y citometría de flujo (FC) para rendimiento de muestra más alta. Para esto último, el análisis multiparamétrico de apoptosis y eventos relacionados se realiza después de tripsinización de neuronas coloreadas como se describe previamente (Lecoeur et a l . , 2004) . FC se realiza utilizando un citómetro FACSCalibur 3 colores equipado con un láser de argón de 488 nm enfriado en aire 15 mW (Becto Dickinson) . Análisis de multisonda de activación de caspasa ??m, exposición PS , PMP y NA Las mediciones se realizaron tanto por FC como FM, como se describe previamente (Lecoeur et al . , 2004) . El potencial de transmembrana mitocondrila (??m) se valora por la incorporación del tinte sensible a ??m 5 , 5 ' , 6, 6' -tetracloro-1 , 1 , 3 , 3 ' -tetraetilbencimidazolil carbocianina yoduro (JC-1, Sondas Moleculares) (Smiley et al . , 1991) . Las neuronas se cargan con 1 µM JC-1 por 30 min a 37°C. Para FM, fluorescencias verde (monómeros, bajo ??m) y naranja (agregados J, alto ??m) se adquirieron simultáneamente (BP 450-490 excitación/LP 515 filtros de emisión de paso largo) . Los monómeros JC-1 se detectan en el canal Fl-1 por FC . Los agregados J se detectan a través del canal Fl-2 (Lecoeur et al . , 2004). Alternativamente, ??m también se evaluó con 60 nM MitoTracker® Rojo (CMXRos; Sondas Moleculares) y se detecta por FM (BP 515-560 filtro excitación/LP 590 filtro de emisión) . El control positivo para colapso de ??m se realiza con carbonilcianuro m-clorofenilhidrazona (mCICCP, 100 µM, 45 min) . La caspasa-2, -3, -8 y -9 activada se detectan utilizando péptidos conjugados con FAM específicos (llamados Inhibidor Marcado con Fluorocromo de Caspasa, FLICA: equipos de actividad de caspasa fluoresceína CaspaTag™, Q-Biogen, Illkirch, Francia; equipos de detección de caspasa ApoFluor™, ICN, Orsay, Francia) : FAM-VDVAD-FMK, FAM-DEVD-FMK, FAM-LETD-FMK y FAM-LEHD-FMK, respectivamente. Las neuronas se incuban con FLICAs (1:150, CaspaTag™ o 1:500. ApoFluor™) por 1 hr a 37°C, después se enjuaga tres veces en regulador de enjuague. Para FM, péptidos conjugados con FAM se excitaron a través del filtro BP 480/40 y la luz emitida se recolectó a través del filtro BP 527/30. El análisis FC se realiza en el canal Fl-1 (Lecoeur et al . , 2004). La exposición fosfatidilserina (PS) a la hojilla externa de la membrana de plasma se detecta a través de la fijación de anexina V conjugada con FITC (Immunotech) . La permeabilidad de membrana de plasma (PMP) se detecta a través de la unión incrementada de 7-Amino Actinomicina D (7-AAD, Sigma) a ADN nuclear. Las coloraciones y análisis por FM y FC se realizan como previamente (Lecoeur et al . , 2004) . Los núcleos se colorean con 1 µM Hoechst 33342 (30 min) y se analizaron por FM (BP 340-380 filtro excitación/LP 425 filtro de paso largo) . La apoptosis nuclear (NA) se evalúa como se define previamente en neuronas (Lecoeur et a l . 2004) . In unodetección de citocromo c, Bax, caspasa-2 y caspasa-3 Las neuronas crecieron en portaobjetos de cámara Lab-Tek® se fijan en 4% paraformaldehído/ 0.19% ácido pícrico por 20 min, permeabilizadas con 0.01% Triton-XlOO en PBS por 5 min, después se bloquearon con 10% FCS en PBS por 30-45 min. Todas la's inmunocoloraciones se realizaron en RT . Los anticuerpo se diluyen en 1% de albúmina de suero de bovino (Sigma) en PBS. Después, las neuronas se colorean utilizando anti-citocromo IgGl monoclonal de ratón c (1 hr, 1:200, clon 6H2.B4, BD Pharmingen) y un frgmento Alexa Fluor® 594 F(ab')2 de IgG anti-ratón de cabra (1 hr, 1:200, Sondas Moleculares), como anticuerpo secundario. De manera similar, la transubicación Bax se investiga utilizando un anticuerpo policlonal de conejo originado contra Bax a de ratón eliminado para los 21 aminoácidos carboxiterminal (lh, 1:100, ?21, Santa Cruz Biotechnology) y se detecta con un anticuerpo IgG anti-conejo de cabra FITC (lh, 1:100; Sondas Moleculares) . Las células desplegan ya sea un citocromo c citoplásmico difuso o un marcado de Bax se cuenta bajo F en aproximadamente 10 campos correspondiente a 150-300 células aleatoriamente elegidas por condición por experiencia. Caspasa-2 se detecta in cel l ul a al utilizar el anticuerpo de caspasa-2 anti-ratón monoclonal de rata (10C6, Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA; 1:100, lh) y un fragmento AlexaFluor® 594 F(ab')2 de IgG anti-rata de cabra (1 hr, 1:100, Sondas Moleculares) como anticuerpo secundario. La caspasa-3 activada se evidencia in cell ul a por FC (Lecoeur et al . , 2004) . Para proceder, las neuronas se tripsínizan, fijan en PBS conteniendo 1% PFA y 20 µg/ml acitomicina D (Sigma) por 20 min. Después las neuronas se resuspenden en 100 µL PBS/1% BSA/0.05% saponina Quilaja (Sigma) conteniendo tanto 20 µg/ml 7-AAD y 20 µl del anticuerpo anti-caspasa-3 de conejo policlonal conjugado con ficoeritrina (BD Pharmingen) , por 30 in . Interferencia de ARN siARN de doble filamento corresponde a la secuencia del gen de Caspasa-2 de ratón (AACACCTCCTAG AGAAGGACA; nucleótidos 185-203; siARN C2 wt ) . siARN inactiva se designa con cuatro mutaciones en la misma secuencia (AACATCTACTCG AGACGGACA; siARN C2 m) . La secuencia de siARN C2 wt se somete a BLAST para asegurar su especificidad. Los dúplex siARNs templados (RP-HPLC purificado) se compraron de Proligo. Los cultivos neuronales en DIV6 en placas de 24 cavidades ( 7.106/cavidad) o portaobjetos de 4 cámaras Lab-Tek® (1.33.106/cavidad) se transfectan por 6h con siARNs (3.8 µg) utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) . Entonces las neuronas se enjuagan y regresan para completar el medio N5 por 15 hrs más, antes de someterse a, o no, tratamiento de ionomicina o SD por 24 hrs. Análisis RT-PCR Extracción de ARN se realiza directamente en placas de 24 cavidades (1.33xl06 neuronas) o 6 cavidades (7xl06 neuronas) con el equipo Rneasy mini (Qiagen) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. La transcripción inversa se realiza utilizando transcriptasa inversa de Supercript™ II Rnase H~ (Invitrogen) . Los cebadores PCR se compraron de Proligo: cebador de avance Bax 5'-AGAGGCAGCGGCAGTGAT-3' , cebador de reversa Bax 5'-AGACACAGTCCAAGGCAGTGG-3' ; cebador de avance de caspasa-2 5' -GAGCAATGTGCACTTCACTGG-3 ' , cebador de reversa caspasa-2 5 ' -CCACACCATGTGAGAGGAGTG-3 ' , cebador de avance caspasa-9 5'AGCTGGAGCCGTCACAGCC-3', cebador de reversa caspasa-9 5'-CTCCGCCAGAACCAATGTCC-30; cebador de avance GAPDH 5' -GGTCGGAGTCAACGG ATTTGGTCG-3 ' , cebador de reversa GAPDH 5 ' -CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3 ' . Las condiciones de amplificación fueron 94 °C por 1 min, seguido por:30 ciclos para Bax a 94°C por 30 s, 58°C por 30 s, 72°C por 1 min después de 72°C por 15 min; 35 ciclos para caspasa-2 y caspasa-9 o 25 ciclos para GAPDH y 94°C por 30 s, 54°C por 30 s, 72°C por 1 min entonces 72°C por 15 min. Después de PCR, 20 µl se someten a electroforesis en 1.5% geles de agarosa y bandas se visualizan por transiluminación UV con coloración de bromuro de etidio antes de la fotografía. GAPDH se utiliza como un control interno de amplificación. Fraccionamiento subcelular y preparación de citosol Neuronas (7xl06 en placa de 6 cavidades) se recolectan a 4°C en 50 µl de regulador CSF (220 M manitol, 68 mM sucrosa, 5 mM piruvato, 0.5 mM EGTA, MgCl2 2 M, NaCl 2 mM, KH2P0 2.5 M, ditiotreitol 1 mM, citocalasina B 20 µM y 10 Mm Hepes, pH 7.5) complementado con cocktail inhibidores de proteasa completa (Roche), después cinco ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido. Las muestras se centrifugan a 900g por 5 min a 4°C para remover los núcleos y células no rotas, seguido por centrifugación a 10,000 g por 30 min a 4°C para obtener la fracción de membrana pesada enriquecida en mitocondria. Después las muestras se centrifugan a 100,000 g por 10 min a 4 ° C para microsomas en pastilla. El material se resuspende en 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Tritón X-100 antes de la determinación de concentración de proteína por método de análisis Bradford. 10 µg de cada fracción se utiliza para análisis Western blot. Extracción de proteína y análisis Western Blot Las neuronas se lisan, a RT en 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Tritón X-100 complementado por cocktail de inhibidores de proteasa completa (Roche) . La concentración de proteína se determina utilizando el equipo de análisis de proteína Bio-Rad. Las proteínas (30 µg para caspasa-2; 10 µg para Bax) se separan en 12.5% geles de poliacrilamida y se transfieren a membranas PVDF (Amersham) . La inmunocoloración se revela utilizando ECL (Amersham Pharmacia Biotech.) . El anticuerpo de caspasa-2 anti-ratón monoclonal (11B4), Alexis Biochemicasl ) se utiliza en una dilución 1:1000: anticuerpo policlonal (?21, Santa Cruz Biotechnology) originado contra Bax a de ratón elimina los 21 aminoácidos carboxiterminal se utiliza en una dilución 1:200; anticuerpo policlonal (N20, Santa Cruz Biotechnology) originado contra el término amino de Bax a (reconociendo los residuos 11 a 30) se utilizan en dilución 1:1000. La actina (42kDA; SIGMA; 1:5000) se utiliza como un control de carga igual. Inmunomanchado de proteína de ataque por calor 60 (HSP60) con un anti-HSP monoclonal de ratón (Sigma, 1:400) se utiliza para verificar la pureza de la fracción de membrana pesada enriquecida en mitocondria.

Separación VDVAD-AMC in vi tro por caspasa-2 recombinante La actividad de caspasa-2 recombinante humana (Sistema de Análisis BIOMOL QuatiZy e™) se valora en 100 µl de regulador de análisis (50 mM HEPES, pH 7.4, lOOmM NaCl, 0.1% CHAPS, 10 mM DTT, lmM EDTA, 10% glicerol) . La separación de 50 µM VDVAD-AMC por caspasa-2 recombinante (125 U) se mide después de 30 min a 37°C en un lector de microplaca de fluorescencia al monitorear la emisión de fluorescencia a 510 nm después de excitación a 405 nm. Para inhibición de actividad VDVAasa, inhibidores (2 µM) se pre-incuban 30 min a 37°C en presencia de caspasa-2 antes de la incubación subsiguiente con 50 µM VDVAD-AMC (30 min, 37°C) . No se observa fluorescencia notable con VDVAD-AMC solo. Isquemia Perinatal Ratas Wistar recién nacidas (madre más 9 crías por litro) se obtienen de Janvier (Le Genest-St-I sle , Francia) cuando las crías fueron de 3-4 días de edad. Las crías se alojan con su madre bajo un ciclo de luz-obscuridad 12:12 h con alimentos y agua libremente disponible.- La experimentación se conduce de acuerdo a las directrices de la Comunidad Francesa y Europea para el cuidado y uso de animales experimentales. Isquemia se realiza en ratas de 7 días (17-21g), como se describe previamente (Renolleau et a l , . 1998) . Las crías de rata se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de hidrato cloral (350 mg/kg) . Las ratas anestesiadas se colocan en su espalda y se hace un corte medio en el cuello para exponer la arteria caritoide común izquierda. Las ratas se colocan entonces en el lado derecho y un corte de piel oblicua se hace entre la oreja y el ojo. Después del corte del músculo temporal, el hueso craneal se remueve de la sutura frontal a un nivel por debajo del arco zigomático. Después, la arteria cerebral intermedia izquierda, expuesta justo después de su apariencia sobre la fisura renal, se coagula en el nivel inferior de la vena cerebral. Después de este procedimiento, se coloca un clip para ocluir la arteria carotoide común izquierda. Las ratas se colocan entonces en un incubador para evitar hipotermia. Después de 50 min, el clip se remueve. La restauración de flujo sanguíneo caritoide se verifica con la ayuda de un microscopio. Los cortes de piel cranial y cuello se cierran entonces. Durante el procedimiento quirúrgico, la temperatura corporal se mantiene a 37-38°C. Las crías se transfieren en un incubador (32°C) hasta la recuperación después a sus madres . Los inhibidores de caspasa se administran intraperitonealmente a una dosis de 50 µg por lOg peso (en 100 µl ) 5 min antes del inicio isquémico (n= 15 por Q-VD-OPH, n=14 para Q-VDVAD-OPH) . Los animales de control recibieron un volumen equivalente de 0.9% de salina conteniendo 10% DMOS (n=15), el vehículo requirió solubilizar los inhibidores de caspasa (grupo tratado con vehículo) . La tasa de mortalidad durante isquemia o antes de su muerte no difiere entre grupos tratados con Q-VD-OPH, Q-VDVAD-OPH y vehículo (<4%) . Las ratas se mataron 48 horas después de reperfusión y los cerebros se removieron. La lesión de infarto (zona pálida) se clasifica visualmente por un observador para el tratamiento de animales. Los cerebros sin un zona pálida isquémica transparente se observan bajo un vidrio de magnificación. Aquellos no mostrando oclusión MCAS se descartan (2 animales en el grupo tratado con Q-VD-VAD) . Los cerebros se fijan entonces 2 días en 4% de formaldehído regulada. Secciones de cerebro coronal de cincuenta micrómetros se corta en un criostato y se recolectan en portaobjetos revestidos con gelatina. Dieciséis secciones de estrato anterior a hipocampo posterior (correspondiente a las placas 9 a 27 en el atl+as de cerebro de rata de Paxino) se seleccionan, tomadas a intervalos igualmente espaciados 0.5-mm. Las áreas de lesión se miden en secciones coloreadas de violeta cresilo utilizando un analizador de imagen (software de imagen NIH), y las distancias entre secciones coronarias respectivas se utilizan para calcular el volumen de infarto . El análisis estadístico se realiza como sigue. Suponiendo un riesgo beta de 0.2 y riesgo alfa de 0.05, se estima que 15-16 animales en cada grupo fueron necesarios para detectar un 50% de reducción del volumen de infarto entre dos grupos. Los datos se extraen de estudio previo (Ducroq et al . , 2000) . Debido a que tres grupos de animales se comparan en los experimentos, estos valores son solamente informativos. Una lista predeterminada con bloques de seis animales se utiliza para aleatorizar los animales entre los tres grupos. Un investigador para la condición de tratamiento hace todas las mediciones . La diferencia entre los medios se avalora por la prueba de comparación múltiple no paramétrica de Kruskall-Wallis , seguid por la prueba Newman-Keul para valores no paramétricos . Consideramos diferencias que son significativas al 5% de nivel (P<0.05) . EJEMPLO IV: Diseño de un siARN específico para silenciamiento de caspasa-2 humana siARN específica (hsiARNC2 wt ) para eliminación de gen de caspasa-2 humana se diseña para aplicaciones adicionales a enfermedades y lesiones de humanos (isquémicas y otras) . Este dúplex siARN se compone de las siguientes secuencias complementarias: SEQ ID N° 6 5 ' -caucuucuggagaaggacadTdT-3 ' SEQ ID N° 7 5 ' -uguccuucuccagaagaugdTdT-3 ' Un planteamiento experimental se desarrolla para probar dicho siARN en base al modelo de Robertson (Robertson et al . , 2002), que mostró que la inhibición de caspasa-2 por Z-VDVAD-FMK redujo parcialmente la liberación de citocromo c y exposición de residuos de fosfatidilserina en células Jurkat T. La inhibición de caspasa-2 farmacológica (Z-VDVAD-FMK, Q-VD-OPH, todas de ICN) o eliminación de gen de caspasa-2 (siARN) en células Jurkat tratadas con VP-16 se realizan entonces. Evaluación siARN en células humanas Pre-tratamiento por Q-VD-OPH de pan-caspasa (25-100 µM) o el inhibidor de caspasa-2 selectivo, Z-VDVAD-FMK (25-100 µM) previene la muerte celular inducida por el dañó de ADN e inhibidor de toposiomerasa II, VP16 (figura 18). La supervivencia a 7-8 hrs se obtiene contra un gran rango de concentración de VP16 (Figura 18) .

El hecho de que pérdida de ??m bloqueada por Z-VDVAD-FMK sugiere que la activación de caspasa-2 ocurre aguas arriba de mitocondria en este paradigma. De acuerdo con lo anterior en la Figura 19, los datos muestran que: (i) la pérdida de ??m progresiva no es elimina por Z-DEVD-FMK, Z-LEHD-FMK, Z-LETD-FMK, pero solamente por Z- VDVAD-FMK o Q-VD-OPH; (ii) Z-DEVD-VMK, Z-LEHD-FMK, Z-LETD-FMK no deterioran la activación de caspasa-2 sugiriendo que caspasa-2 es la caspasa estudiada más aguas arriba; (iii) inhibición de caspasa-9 previene la activación de caspasa-3 pero inhibición de caspasa-3 previene la activación de caspasa-9, mostrando que la caspasa-3 se activa a través 5 de la caspasa-9; (iv) alteraciones nucleares terminales y PMP se previenen mayormente por Z- VDVAD-FMK, Q-VD-OPH y a menor grado por Z-LEHD-FMK; 10 (v) el BA ANT-bloqueador , atenúa pérdida de ??m y PMP confirmando el papel de mitocondria para mediar el efecto pro-apoptótico de caspasa-2 activada; 15 (vi) muerte celular dependiente de VP15- caspasa-2 no es dependiente en traslación y transcripción, ya que CHX y ActD no previenen la perdida de ??m ni PMP; 20 (vii) trayectoria dependiente de caspasa- 8 no es importante en este modelo debido a que Z-LETD-FMK es incapaz de prevenir la pérdida ??m, activación de caspasa-2 y -3, alteración nuclear y PMP.

Finalmente, los datos totales ponen en evidencia un modelo en el cual la activación de caspasa-2 pre- mitocondrial induce la pérdida de ??m, y promueve eventos aguas abajo, como activación de activación de caspasas-9/caspasas- 3, conensación/fragmentación nuclear y PMP terminal. Este paradigma ha permitido la prueba y validación de siARN humano dirigido a caspasa-2.

Primero, hsiARN C2 wt es capaz de disminuir la expresión de proteína de pro-caspasa-2 en células HeLa y Jurkat, respectivamente (como se muestra por el análisis Western Blot en la Figura 20A) .

Todas las células se transfectan como se valora por in cel l ul a por detección de fluorescencia de siARN-FITC por citometría de flujo. Una vez que estas células se transfectan, también se protegen contra tratamiento de 7 hr subsiguiente con VP16 (Figura 21A-B), demostrando la validez de hsiARN C2 wt . Sección experimental Cultivo celular: Células Jurkat se compran de ATCC (clon E6-1) y se cultivan en densidad de 100000-120000 células/cavidad (placa de 24 cavidades) en medio RMPI 1640 (rico en Glutamax) complementado con 10% de suero de bovino fetal. La célula Jurkat E6-1 (número ATTC: TIB-152) es un clon de Jurkat-FHCRC, un derivado de la estirpe de célula Jurkat (previamente establecido de sangre periférica de un niño de 14 años por Schneider et a l . , (1977) y que se designó originalmente JM) . Las células se utilizan en pasajes 7-14 por experimentos. Inducción de apoptosis y^ análisis de citoprotección Las células se pretratan con varios agentes farmacológicos para 30min-lhr, antes de tratamiento con VP16 subsiguiente (VP16 o etopósido; Sigma) (10-20 µM) por 7-8 hrs. Para experimentos siARN, las células se tratan por 24 hrs con 3.8 µg siARN (Proligo)/2 µL lipofectamina 2000 (en 500 µL), antes del tratamiento VP16. Caspasa-2 de murino (ID N°l-2 o ID N°3-4) se utiliza para control negativo. La producción de transfección se verifica in cell ula por detección de fluorescencia (citometría de flujo, FL-1) de siARN-FITC (ID N° 1-2, ID N°3-4 o ID N°6-7) . Estudios de parámetros de apoptosis por citometría de flujo y microscopía de luorescencia Citometría de flujo Coloración JC-1/7AAD doble: Potencial de transmembrana mitocondrial (??m) se valora por la incorporación del tinte sensible a DYm 5, 5', 6,6' -tetracloro-1, 1, 3, 3' -tetraetilbencimidazolil carbocianina yoduro (JC-1, Sondas Moleculares, 1 µM) . Fluorescencias, verde (bajo ??m) y naranja (alto ??m) , se adquirieron en canales FL-1 y FL-2, respectivamente. PMP se detecta por incorporación de 7-actinomicina D (7AAD; 0.02 mg; Sigma) (canales FL-3) . Alternativamente, coloración doble DioC5 (0.1 µM) /PT (5.10-3 mg) se realiza y detecta en canales FL-1 y FL-2, respectivamente, 7000 eventos se adquieren al menos para cada condición . Microscopía de fluorescencia Caspasa-2, -3 y -9 activadas se detectan utilizando péptidos conjugados con FAM específicos (llamado Inhibidor Marcado de Fluorocromo de Caspasa, FLICA: Equipos de Actividad de caspasa de fluoresceína CaspaTag™, Q-Biogen, Illkirch, Francia; Equipos de Detección de Caspasa ApoFluor™, ICN, Orsay, Francia) : FAM-VDVAD-FMJ, FAM-DEVD-FMK, FAM-LETD-FMK y FAM-LEHD-FMK, respectivamente. Las células se incubaron con FLICAs (1:150, CaspaTag™ o 1:500, ApoFluor™) por 1 hr a 37°C, después se enjuagan tres veces en regulador de enjuague. Para FM, péptidos conjugados con FAM se excitan a través de filtro BP 527/30. La permeabilidad de membrana de plasma (PMP) se detecta a través de unión incrementada de 7-Amino Actinomicina D (0.02 mg 7-AAD, Sigma) para ADN nuclear (excitada a través del filtro BP515-560 y fluorescencia recolectada a través de filtro de emisión de paso largo LP590) . Los núcleos se colorearon con 1 µM Hoechst 33342 (30min) y se anliza (filtro de excitación BP 340-380 /filtro de paso largo LP 425) . Potencial de transmembrana mitocondrial se valora por JC-1 (1 µM, 30 min9; fluorescencias, verde y naranja, se graban simultáneamente después de 1.2 s excitación (BP 450-490 excitación/filtros de emisión de paso largo LP 515) . EJEMPLO V: shARN Construcción de shARN y validación Aún si siARN son capaces de cruzar la barrera cerebral sanguínea, son inestables en fluidos biológicos, de esta manera el obstáculo difícil a superar será suministro intracelular in vivo . Recientemente, varias interrupciones tienen virus resaltados como excelentes vehículos para suministro de siARN. Por ejemplo, los retrovirus o adenovirus, los vectores de suministro de transgen de elección para muchos estudios de terapia de gen experimental, se han formado para suministrar y expresar establemente siARN terapéutico dentro de células, tanto in vi tro como in vivo . Sin embargo, versiones recombinantes de siARN: (sh)ARN pequeño (expresión de siARN constitutiva como versión de ciclo bajo control de un promotor ARN pequeño) se ha producido para circundar este problema. La expresión de shARN puede inducirse para transfectar establemente neuronas in vi vo , por administración cerebral local (inyección intracerebro-ventricular por ejempl) que podría conducir al silenciamiento permanente del gen objetivo. Orden Sin para generar estructura siARN estable in cel ull a , el concepto de estructura de pasador pequeño se ha desarrollado consistiendo de la expresión de las secuencias sentido y antisentido de siARN enlazado por una secuencia corta y seguido por la señal de terminación (HT) de la polimerasa pol III. Esta secuencia está bajo el control de promotores pol III de ya sea RnaseP Hl o genes ARN nucleares pequeños U6 y conducen a la expresión de una gran cantidad de siARN de pasador pequeño (shARN) en células transfectadas. Un rápido procesamiento de la parte de ciclo ciertamente por DICER conduce a la formación de siARN funcional. Recientemente, un plásmido (pGE-1) se ha desarrollado (Stratagene) y se utiliza este vector de expresión de mamífero shARN para proporcionar supresión a largo plazo eficiente del gen objetivo. shARN se genera de una transcripción ARN (controlada por un promotor U6) que consiste de filamentos de sentido y antisentido separados por una secuencia de ciclo. La transcripción ARN se dobla hacia atrás en si mismo para formar un pasador. El vector de expresión pGE-1 se ha optimizado para suprimir la expresión de genes objetivo en células mamíferas. Para obtener un vector de expresión conteniendo el shARN específico para dos oligonucleótidos de caspasa-2 de murino se diseñan (Figura 22A) , consistiendo de dos repeticiones invertidas separadas por una secuencia de ciclo y seguido por una cadena 6 nucleótido poli(T) que sirve como un terminador de transcripción para la polimerasa de ARN III. SEQ ID N° 8 5'~ GATCCCgcacctcctagagaaggacaGAAGCTTGtg ccttctctaggag gtgTTTTTT-3' SEQ ID N° 9 5'- CTAGAAAAAAcacc cctagagaaggacaCAAGCTTCtgtccttctctag gaggtgCGG-3' Después del templado de los dos oligonucleótidos se obtiene una inserción sh (Figura 22B) que se clona en los sitios BamH I y Xba I del vector pGE-1. Después de selección de colonias de positivas por PCR se seleccionan 2 clones (shARNd y shARN9) . Estos clones se secuencian y mostraron la inserción correcta de la secuencia sh bajo el control del promotor U6. Para validar estas construcciones de shARN como una herramienta para subregulación de caspasa-3, células 3T3 (células de murino) se transfectan con los vectores shARN6 y shARN9 y se verifica el nivel de expresión por Western Blot de caspasa-2 en extractos totales de las células 3T3 24 y 48 horas post-transfección (Fig. 23) . Parece que ambas construcciones shARN6 y shARN9 son capaces de subregular la expresión de caspasa-2 en células 3T3 48 horas después de la transfección. Este resultado muestra que una estrategia de shARN es útil como una herramienta para silenciamiento in vivo de expresión de caspasa-2. Sin embargo, la inserción que tiene como objetivo mARN de caspasa-2 podría introducirse en varas estructuras virales (lentivirus, adenovirs, virus Semliki o cualquier estructura viral con un campo terapéutico de aplicación) permitiendo así un suministro eficiente in vivo y un silenciamiento a largo plazo y eficiente de expresión de caspasa-2. Además, la construcción de shARN específica se ha obtenido para aplicación a humanos : SEQ ID N°10 5'- GATCCCGcatcttctggagaaggacaGAAGCTTGtgtccttctccagaag atgTTTTTT-30 SEQ ID N°ll 5'- CTGAAAAAAcatcttctggagaaggacaCAAGCTTCtgtccttctccaga agatgCGG-3' Sección experimental Dos oligonucleótidos complementarios con salientes 5' BamH y 3' Xba I se ha sintentizado (Proligo) . Después de una etapa de templado, estos oligonucleótidos se clonan en un vector pGE-1 predigerido (BamH I/Xba I) (Stratagene). Después de la selección PCR de clones positivos conteniendo la inserción, dos clones se amplificaron y sus secuencia se verificó (shARN6 y shARN9) . Células 3T3 colocadas en placas de 6 cavidades el día antes se transfectaron utilizando reactivo de lipofectamina 2000 y 0.8 µg de plásmdiso shARNd y shARN9 durante 6 horas. El nivel de transfección se monitorea utilizando un vector GFP. 24 y 48 horas después de la transfección, las células se recolectan en regulador lisis (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Tritón X-100) y concentración de proteína se determina utilizando el reactivo Bradford (BioRad) . Las proteínas (20 µg por muestra) se spearan en 12.5% de geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfiere en membranas PVDF (Amersham) . Después de probar con un anticuerpo monoclonal anti-ratón específico para caspasa-2 (11B4, Alexis Biochemicasl , utilizado como una dilución 1:1000), la inmunoreact ividad se detecta con un equipo quimoluminescente (ECL, Amersham) .

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Inhibición in vi tro de actividad de caspasa-2 con molécula teniendo SEQ ID N°5.
2. Inhibición in vi vo de actividad de caspasa-2 con molécula teniendo SEQ ID N°5.
3. Moléculas capaces de interrumpir la interacción entre Bax y caspasa-2 o para prevenir separación de Bax dependiente de caspasa-2.
4. Péptidos derivados de la secuencia Bax con una longitud de 3 a 40 aminoácidos incluyendo la IQD de secuencia (por ejemplo, SEQ ID 12-23) y que puede competir con el sitio putativo de separación de caspasa-2 en Bax SEQ ID N°12: KTGAFLLQGFIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°13: GAFLLQGFIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°14: FLLQGFIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°15: LQGFIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°16: GFIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°17: FIQDRAGRMAGETP SEQ ID N°18: IQDRAGRMAGETP SEQ ID N°19: IQDRAGRMAGE SEQ ID N°20: IQDRAGRMA SEQ ID N°21: IQDRAGR SEQ ID N°22: IQDRA SEQ ID N°23: IQDR Moléculas según la reivindicación 4 combinadas en N-ter o C-ter con moléculas peptídicas o no peptídicas produciendo moléculas quiméricas capaces de introducir células (siguiendo o no un reconocimiento específico) para interrumpir interacción entre caspasa-2 y Bax. 6. Moléculas según la reivindicación 4, combinadas en N-ter o C-ter con moléculas peptídicas o no peptídicas produciendo moléculas quiméricas capaces de introducir células (siguiendo o no un reconocimiento específico) para prevenir o tratar apoptosis, o proporcionar efectos protectores de mitocondria. 7. Moléculas según la reivindicación 4 con una longitud de 3 a 10 aminoácidos incluyendo IQD de secuencia combinada en N-ter o C-ter con marcador (por ejemplo: fluorogénico (AMC, AFC, PE .. ) , colorimétrico (pNA.. ) o substratos bioluminescentes , radioisótopos.. ) . 8. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido teniendo SEQ ID N°5 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 9. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una molécula según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6. 10. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9 para administración por vía oral, local ( intracerebroventricular , implantación intracerebral de Gelfoam® impregnado con compuestos o composiciones farmacéuticas, implantación intracerebral de instrumentación para suministro mecánico, por ejemplo) o administración sistémica (por ejemplo: intraperitoneal, intravenosa) para reducir la muerte celular. 11. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones por hipoxia-isquemia (H-I) H-I (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo) . 12. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones por hipoxia-isquemia (H-I) cerebral (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo ) . 13. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I focal o global (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . 14. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I adulta o perinatal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo ) . 15. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I adulta o perinatal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo) . 16. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I transitoria o permanente (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo) . 17. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H- I (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía, lesiones cerebrales con o sin situación de reperfusión (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . 18. Composición farmacéutica según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en Oclusión de Arteria Cerebral Media (MCAO) . 19. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 8 o 9, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente cuando al menos uno o más de los siguientes eventos patológicos se combinan, H-I , global o focal, transitoria o permanente, adulta o perinatal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) en nivel cerebral, o en el nivel del cuerpo completo) con o sin reperfusión. 20. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 8 a 19: para prevenir y/o tratar apoptosis durante enfermedades degenerativas crónicas, por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de 5 Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinobulbar , enfermedad de prión, o para prevenir y/o tratar apoptosis 10 durante la lesión de la médula espinal, o para prevenir y/o tratar apoptosis resultante de lesión cerebral traumática, o para proporcionar efecto 15 neuroprotector, o para proporcionar efecto cerebroprotector , o para prevenir y/o tratar célula citotóxica T y apoptosis mediada por 20 la célula asesina natural asociada con enfermedad autoinmune y rechazo de transplante, o para prevenir la muerte celular de células cardiacas incluyendo falla 25 cardiaca, cardiomiopat ía , infección viral o infección bacteriana de corazón, isquemia miocardial, infarto miocardial, e isquemia miocardial, injerto de bypass en la arteria 5 coronaria, o para prevenir y/o tratar toxicidad del medicamento mitocondrial, por ejemplo, como un resultado de quimioterapia o terapia de VIH, 10 - para prevenir la muerte celular durante la infección viral o infección bacteriana, o para prevenir y/o tratar la inflamación o enfermedades 15 inflamatorias, enfermedad del intestino inflamatoria, sepsis y choque séptico, o para prevenir la muerte celular de etapas de folículo a ovocito, de 20 etapas de ovocito a huevo maduro y esperma (por ejemplo, métodos para congelar y transplantar el tejido ovárico, fecundación artificial), o para preservar la fertilidad en 25 mujeres y hombres después de quimioterapia, o para preservar la fertilidad en animales hembras y machos, o para prevenir y/o tratar, degenerescencia 5 macular y glaucoma, o para prevenir y/o tratar hepatitis aguda, hepatitis activa crónica, hepatitis B, y hepatitis C, o para prevenir la pérdida de cabello, 10 y dicha pérdida de cabello debido a calvicie de patrón macho, radiación, quimoterapía o tensión emocional, o para tratar o mejorar el daño de la piel (debido a exposición al alto 15 nivel de radiación, calor, quemaduras, químicos, sol, y enfermedades autoinmunes), o para prevenir la muerte celular de las células de médula ósea en 20 síndromes mielodisplásticos (MDS), o para tratar pancreatitis, o para tratar síndrome respiratorio, o para tratar osteoartritis, artritis reumatoide, psoriasis, 25 glomerulonofritis , ateroesclerosis , y enfermedad de injerto contra huésped, o para tratar apoptosis de pericito retinal, glaucoma de apoptosis de neuronas retínales, daños retínales resultantes de isquemia, retinopatía diabética, o para tratar estados de enfermedad asociados con un incremento de apoptosis, o para prevenir la muerte celular en vegetales (por ejemplo: plantas, flores, talofitos (hongos, alga marina ) ... ) 21. Inhibidores para prevenir, ennegrecer/silenciar la actividad de caspasa-2 en muerte celular . 22. Inhibidores de caspasa-2 según la reivindicación 21, en donde dichas células son neuronas . 23. Inhibidores de caspasa-2 según la reivindicación 21, en donde dichas células son estirpes de célula neuronal. 24. Inhibidores de caspasa-2 según la reivindicación 21, en donde dichas células son estirpes de célula no neuronal. 25. Inhibidores de caspasa-2 según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en donde los inhibidores de caspasa-2 son moléculas de ARN de doble filamento aisladas capaces de tener como objetivo específicamente mARN de caspasa-2 para reducir o suprimir la expresión de caspasa-2. 26. Inhibidores de caspasa-2 según la reivindicación 25, para silenciar la expresión de caspasa-2 en neuronas. 27. Inhibidores de caspasa-2 según la reivindicación 25, para silenciar la expresión de caspasa-2 en estirpes de célula neuronal. 28. Inhibidores de caspasa-2 según la reivindicación 25, para silenciar la expresión de caspasa-2 en estirpes de célula no neuronal. 29. Molécula de ARN según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, comprendiendo dúplex de doble filamento compuestos de filamentos complementarios de 15-25 nucleótidos, preferentemente 19-25 nucleótidos. 30. Molécula de ARN según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, comprendiendo dúplex de SEQ ID N°l y SEQ ID N°2 complementarias o dúplex de SEQ ID N°6 y SEQ ID N ° 7 complementarias. 31. Molécula de ARN según la reivindicación 25, comprendiendo construcción de shARN en base a la secuencia de siARN según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, dicha construcción conduciendo a silenciamiento de caspasa-2 in cel ulla . 32. Molécula de ARN según la reivindicación 31, comprendiendo la inserción de tanto SEQ ID N°l como SEQ ID N°2 o tanto SEQ ID N°6 como SEQ ID N°7, o tanto SEQ ID N°8 como SEQ ID N°9 o tanto SEQ ID N°10 como SEQ ID N°ll. 33. Molécula de ARN según la reivindicación 31 o 32, que conduce a silenciamiento de caspasa-2 in cel l ul a en neuronas o estirpes de célula neuronal. 34. Molécula de ARN según la reivindicación 31 o 32, que conduce a un silenciamiento de caspasa-2 in cell ula en células no neuronales. 35. Composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un inhibidor de caspasa-2 de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 21 a 34 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable . 36. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 35, comprendiendo una cantidad efectiva de al menos un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30. 37. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 35, comprendiendo una cantidad efectiva de al menos un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34. 38. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 para administración por vía oral, local ( intracerebroventricular, implantación intracerebral de Gelfoam® impregnado con compuestos o composiciones farmacéuticas, implantación intracerebral de instrumentación para suministro mecánico, por ejemplo) o administración sistémica (por ejemplo: intraperitoneal, intravenosa) para reducir la muerte celular. 39. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones por hipoxia-isquemia (H-I) H-I (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . 40. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones por hipoxia-isquemia (H-I) cerebral (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo). 41. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I focal o global (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo ) . 42. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I adulta o perinatal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . 43. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I adulta o perinatal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo) . 44. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I transitoria o permanente (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía (cerebral, renal, falla cardiaca, por ejemplo). 45. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en lesiones por H-I (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) y situaciones similares a apoplejía, lesiones cerebrales con o sin situación de reperfusión (cerebral, renal, falla cardiaca, por ej emplo ) . 46. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente en Oclusión de Arteria Cerebral Media (MCAO) . 47. Composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, para el tratamiento de muerte neuronal particularmente cuando al menos uno o más de los siguientes eventos patológicos se combinan, H-I , global o focal, transitoria o permanente, adulta o perinatal (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia) en nivel cerebral, o en el nivel del cuerpo completo) con o sin reperfusión. 48. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 35 a 37: - para prevenir y/o tratar apoptosis durante enfermedades degenerativas crónicas, por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinobulbar , enfermedad de prión, o - para prevenir y/o tratar apoptosis durante la lesión de la médula espinal, o para prevenir y/o tratar apoptosis resultante de lesión cerebral traumática, o - para proporcionar efecto neuroprotector, o para proporcionar efecto cerebroprotector , o para prevenir y/o tratar célula 5 citotóxica T y apoptosis mediada por la célula asesina natural asociada con enfermedad autoinmune y rechazo de transplante, o para prevenir la muerte celular de 10 células cardiacas incluyendo falla cardiaca, cardiomiopatía, infección viral o infección bacteriana de corazón, isquemia miocardial, infarto miocardial, e isquemia miocardial, 15 injerto de bypass en la arteria coronaria, o para prevenir y/o tratar toxicidad del medicamento mitocondrial, por ejemplo, como un resultado de 20 quimioterapia o terapia de VIH, para prevenir la muerte celular durante la infección viral o infección bacteriana, o para prevenir y/o tratar la 25 inflamación o enfermedades inflamatorias, enfermedad del intestino inflamatoria, sepsis y choque séptico, o para prevenir la muerte celular de etapas de folículo a ovocito, de etapas de ovocito a huevo maduro y esperma (por ejemplo, métodos para congelar y transplantar el tejido ovárico, fecundación artificial), o 10 para preservar la fertilidad en mujeres y hombres después de quimioterapia, o para preservar la fertilidad en animales hembras y machos, o para 15 prevenir y/o tratar, degenerescencia macular y glaucoma, o para prevenir y/o tratar hepatitis aguda, hepatitis activa crónica, hepatitis B, y hepatitis C, o 20 para prevenir la pérdida de cabello, y dicha pérdida de cabello debido a calvicie de patrón macho, radiación, quimoterapía o tensión emocional, o para tratar o mejorar el daño de la 25 piel (debido a exposición al alto nivel de radiación, calor, quemaduras, químicos, sol, y enfermedades autoinmunes), o para prevenir la muerte celular de 5 las células de médula ósea en síndromes mielodisplásticos (MDS), o para tratar pancreatitis, o para tratar síndrome respiratorio, o para tratar osteoartritis, artritis 10 reumatoide, psoriasis, glomerulonofritis , ateroesclerosis , y enfermedad de injerto contra huésped, o para tratar apoptosis de pericito 15 retinal, glaucoma de apoptosis de neuronas retínales, daños retínales resultantes de isquemia, retinopatía diabética, o para tratar estados de enfermedad 20 asociados con un incremento de apoptosis, o para prevenir la muerte celular en vegetales (por ejemplo: plantas, flores, talofitos (hongos, alga 25 marina) ... ) 49. Método para bloquear o prevenir la muerte celular o comprender in vi tro seleccionar terapéuticamente moléculas con respecto a la muerte celular, particularmente apoptosis. 50. Método para prevenir la muerte celular comprendiendo la determinación, dependiendo de una manera de inducción dada, en un tipo celular dado, de la jerarquía de eventos relacionados con apoptosis y el bloqueo del punto de control reversible más próximo para interferir con proceso apoptótico. 51. Método según la reivindicación 50, comprendiendo combinar citometría de flujo cuantitativa rápida y análisis de microscopía de fluorescencia cuantitativa/cualitativa en neuronas . 52. Método según la reivindicación 50, comprendiendo combinar citometría de flujo cuantitativa rápida y análisis de microscopía de fluorescencia cuantitativa/cualitativa en células no neuronales . 53. Método según la reivindicación 50, comprendiendo combinar citometría de flujo cuantitativa rápida y análisis de microscopía de fluorescencia cuantitativa/cualitativa en estirpes de célula neuronal. 54. Método según la reivindicación 50 o 53, en donde dicho punto de control es caspasa-2. 55. Método según la reivindicación 50 o 53, en donde dicho punto de control es una caspasa . 56. Método según la reivindicación 50 o 53, en donde dicho punto de control es activación de caspasa sin relacionar. 57. Uso del método según cualquiera de las reivindicaciones 50 a 53, para desarrollar un monitoreo citométrico de flujo en tiempo real, confiable de ??m e integridad de membrana de plasma en respuesta a ataques tóxicos incluyendo tratamiento MPTP, o para tratamiento protector. 58. Uso del método según cualquiera de las reivindicaciones 50 a 53, para desarrollar un monitoreo citométrico de flujo en tiempo real de ??m e integridad de membrana de plasma en respuesta a ataques hidrotóxicos incluyendo tratamiento MPTP, o para tratamiento neuroprotector.