MXPA05003673A - Composiciones, organismos y metodologias que emplean una cinasa humana novedosa. - Google Patents

Composiciones, organismos y metodologias que emplean una cinasa humana novedosa.

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Abstract

Esta invencion proporciona composiciones, organismos y metodologias que emplean una proteina cinasa humana novedosa, NRIIK1. La proteina cinasa novedosa es codificada por un gen humano que comprende 21 exones. El gen humano se localiza en o cerca del sitio 9q34 del cromosoma humano 9. la similitud de secuencia entre la proteina humana novedosa y la secuencia de consenso de la cinasa relacionada con NIMA indica que la proteina humana novedosa puede funcionar como una cinasa relacionada con NIMA.

Description

COMPOSICIONES, ORGANISMOS Y "METODOLOGIAS QUE EMPLEAN UNA CINASA HUMANA NOVEDOSA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones, organismos y metodologías que emplean una proteína cinasa humana, cinasa humana relacionada con NIMA 1 (NRHK1) , la cual tiene homología de secuencia con el dominio catalítico de la tirosina proteína cinasas y serina/treorina proteína cinasas, y esta relacionada distantemente con proteína cinasa relacionadas con NIMA. Esta invención puede ser usada para diagnosticar, pronosticar y tratar enfermedades relacionadas con cinasas y, en particular con enfermedades asociadas con la expresión aberrante de NRHK1. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las.. proteínas cinasas regulan muchos procesos de proliferación, diferenciación y señalización celular diferentes agregando grupos fosfato a proteínas. La señalización descontrolada ha sido implicada en una variedad condiciones de enfermedad incluyendo la inflamación, cáncer, arteriosclerosis y psoriasis. La fosforilación reversible de proteína es la estrategia principal para controlar actividades de células eucarióticas . Se estima que más de 1,000 de las 10,000 proteínas activas en una célula de mamífero típica están fosforiladas . El fosfato de alta energía, el cual dirige Eef 162922 la activación, es transferido" generalmente de moléculas de trifosfato de adenosina (ATP) a una proteina particular o proteínas cinasas y removido de esa proteína por proteína fosfatasas. La fosforilación ocurre en respuesta a señales extracelulares (hormonas, neurotransmisores , factores de crecimiento y diferenciación, etc.), puntos de verificación del ciclo celular y esfuerzos o tensiones ambientales o nutricionales . El proceso de fosforilación es aproximadamente análogo al encendido de un interruptor molecular. Cuando el interruptor es encendido, la proteina cinasa apropiada activa una enzima metabólica, proteína reguladora, receptor, proteína citoesquelética, canal o bomba de iones o factor de transcripción . Las cinasas comprenden el grupo de proteínas más grande conocido, una superfamilia de enzimas con una amplia variedad de funciones y especificidades. Ellas usualmente son nombradas después de su sustrato, sus moléculas reguladoraa, o algún aspecto de un fenotipo mutante . Con respecto a los sustratos, las proteínas cinasas, pueden ser divididas aproximadamente en dos grupos: aquellas que fosforilan residuos de tirosina (proteína tirosina cinasas, PTK) y aquellas que fosforilan residuos de serina o treorina (serina-treonina cinasas, STK) . Unas cuantas proteínas cinasas tienen doble especificidad y fosforilan residuos de treonina y tirosina. Casi todas las cinasas contienen un dominio catalítico similar de 250-300 aminoácidos. La estructura primaria de los dominios de cinasa esta conservada y puede ser subdividida además en 11 subdominios . El N-terminal del dominio de cinasa, el cual contiene los subdominios I-IV, generalmente se pliega en una estructura similar a un lóbulo que se une a y orienta la molécula donadora de ATP (o GTP) . El C terminal del dominio de cinasa forma un lóbulo más grande, el cual contiene los subdominios VI-XI, se une al sustrato protéico y lleva a cabo la transferencia del fosfato gamma del ATP al grupo hidroxilo de residuo de serina, treonina o tirosina. El subdominio V abarca los dos lóbulos. Cada uno de los 11 subdominios contiene residuos específicos y motivos o patrones de aminoácidos que son característicos de ese subdominio y están altamente conservados. Las cinasas pueden ser categorizadas en familias por las diferentes secuencias de aminoácidos (generalmente entre 5 y 100 residuos) localizadas sobre cualquier lado de, o insertadas en las espiras, de, el domino de cinasa. Esas secuencias de aminoácidos agregadas permiten la regulación de cada cinasa puesto que esta reconoce e interactúa con su proteína Objetivo. La presencia de una porción de fosfato modula la función de la proteína en formas múltiples . Un mecanismo común implica cambios en las propiedades catalíticas (Vmax y Km) de una enzima, que conduce a la activación o inactivación.
Un segundo mecanismo" ampliamente reconocido implica promover interacciones proteína-proteina . Un ejemplo de esto es la autofosforilación de la tirosina de la tirosina cinasa del receptor de EGF activada por el ligando. Este evento activa la unión por alta afinidad al residuo de fosfotirosina sobre el domino intracelular C-terminal del receptor al motivo SH2 de una molécula adaptadora Grb2. La Grb2 , a su vez, se une a través de su motivo SH3 a una segunda molécula adaptadora, como la SHC. La formación de este complejo activa los eventos de señalización que son responsables de los efectos biológicos del EGF. Bien se ha reconocido recientemente que los eventos de fosforilación de la serina y trionina ejercen su función biológica a través de eventos de interacción proteina-proteína que son mediados por la unión de alta afinidad de la fosfoserina y fosfotrionina a los motivos WW presentes en una gran variedad de proteínas . Un tercer resultado importante de la fosforilación de proteína son los cambios en la localización subcelular del sustrato. Como un ejemplo, los eventos de importación y exportación nuclear en una gran diversidad de proteínas son regulados por la fosforilación de proteína . Muchas cinasas están implicadas en cascadas reguladoras donde sus sustratos pueden incluir otras cinasas cuyas actividades son reguladas por su estado de fosforilación. Finalmente las actividades de algunos efectores corriente abajo son modulados 'por la fosforilación resultante de la activación de esa via. SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención describe composiciones, organismos y metodologías que emplean una cinasa de proteína humana novedosa. La proteína cinasa de proteína humana novedosa comparte homología de secuencia con la secuencia del consenso de los dominios catalíticos de las serina/treonina proteína cinasas, pcinasas, y tirosinas cinasas . La nueva proteína también muestra homologías con el dominio de cinasa de una cinasa relacionada con NIMA. El gen que codifica para esta proteína se localiza cerca del sitio 9 o 34 del cromosoma humano 9. Este nuevo gen es referido aquí posteriormente como gen de cinasa humana relacionada con ???? l(NRHKl), y sus proteínas codificadas son referidas como NRHK1 o cinasa NRHK1. El dominio de cinasa en NRHK1 muestra una alineación de secuencia del 100% con las secuencias del consenso de los dominios catalíticos de las serina/treonina proteína cinasas, una alineación de secuencia del 100% con la secuencia de consenso del dominio de pcínasa, una alineación de secuencia del 87.5% con las secuencias de consenso del dominio catalítico de las tirosinas cinasas, y una alineación de secuencia del 28% con el dominio de cinasa de una proteína cinasa relacionada con NIMA. Las utilidades de varios dominios de cinasa son conocidas en la técnica. La única secuencia peptídica, y las secuencias de ácido nucléico que codifican para los péptidos, pueden ser usadas como modelos para el desarrollo de objetivos terapéuticos humanos, ayuda en la identificación de proteínas terapéuticas, y sirven como objetivos para el desarrollo de agentes terapéutico humanos que modulen la actividad de cinasa en células y tejidos que exprese la cinasa . En un aspecto, la invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica para NRHKl o una variante de NRHKl. En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de NRHKl o una variante de NRHKl. En otro aspecto más, la invención proporciona agentes que modulan el nivel de expresión del gen NRHKl o una actividad de NRHKl. La invención también proporciona métodos para (a) detectar polinucleótidos que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica para NRHKl o una variante de NRHKl y (b) detectar polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de NRHKl o .una variante de NRHKl en una muestra biológica . La invención proporciona además métodos para seleccionar agentes que modulan el nivel de expresión del gen de NRHKl o una actividad de NRHKl.
La invención proporciona además lineas celulares que albergan el gen de NRHKl, animales transgénicos para el gen de NRHKl, y animales con el gen de NRHKl interrumpido (animales con NRHKl alterado) . Esas líneas celulares y animales pueden ser usados para estudiar las funciones de NRHKl . En otro aspecto más, la invención proporciona polinucleótidos capaces de inhibir la expresión del gen de NRHKl por interferencia del ARN. La invención proporciona además métodos para inhibir la expresión del gen de NRHKl introduciendo ARNsi u otras secuencias de ARNi en células blanco. Las modalidades preferidas de la invención son descritas más adelante en la Descripción Detallada de la Invención. A menos que se haga notar específicamente, se pretende que las palabras y frases en la especificación y reivindicaciones den el significado común y acostumbrado para aquellos expertos en la técnica en la técnica o técnicas aplicables. Si se pretende cualquier otro significado, la especificación establecerá específicamente que está siendo aplicado un significado especial a una palabra o frase. Además se pretende que las invenciones no se limiten únicamente a la estructura, materiales o métodos específicos que son descritos en las modalidades preferidas, sino que incluyen cualquier y todas las estructuras, materiales o métodos que efectúan la función reclamada, junto con cualquiera y todas las estructuras, materiales o métodos equivalentes conocidos o desarrollados posteriormente para efectuar la función reclamada. Existen ejemplos adicionales a través de la descripción, y no es la intención de la solicitante excluir del alcance de ~esta invención el uso de las estructuras, materiales o métodos que no sean identificados expresamente en la especificación, a menos que no sean capaces de efectuar una función reclamada. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las invenciones de esta solicitud son comprendidas mejor en conjunto con los siguientes figuras, en las cuales: La Figura 1 compara los aminoácidos residuales 28 a 297 de RHK1 con el dominio catalítico de una familia de Ser/Thr proteína cinasas . La Figura 2 muestra la alineación de secuencia entre los aminoácidos residuales - 28 a 296 de NRHK1 y el dominio de proteína cinasa de pcinasas. La Figura 3 muestra la alineación de secuencias de los aminoácidos residuales 58 a 294 de RHK1 y el dominio catalítico de una familia de tirosina cinasas. La Figura 4 ilustra la alineación de la secuencia entre los aminoácidos residuales 25 a 285 de NRHK1 y los aminoácidos residuales 1 a 246 de una proteína cinasa relacionada con NIMA.
La Figura 5 muestra "el perfil de hidrofobicidad de NERHK1. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La siguiente descripción detallada se presenta para permitir a cualquier experto en la técnica hacer y usar la invención. Para propósitos de explicación, se expone una nomenclatura específica para proporcionar una comprensión completa de la presente invención. Sin embargo, será evidente a un experto en la técnica que esos detalles específicos no se requieren para practicar la invención. Las descripciones de aplicaciones específicas se proporcionan únicamente como ejemplos representativos. Varias modificaciones a las modalidades preferidas serán fácilmente evidentes a un experto en la técnica, los principios generales definidos aquí pueden ser aplicados a otras modalidades y aplicaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. No se pretende que la presente invención se límite a las modalidades mostradas, sino de acuerdo al más amplio alcance posible consistente con los principios y características descritas aquí. La presente invención se basa en la información de secuencia' obtenida de una línea de predicción genómica recién desarrollada. De manera breve, las estructuras cristalinas de rayos X de los dominios catalíticos de las proteínas cinasas fueron recolectadas y alineadas juntas de acuerdo a sus identidades/similitudes estructurales. La alineación fue convertida en una "matriz de" puntaje" la cual contiene el perfil estructural de los dominios catalíticos de cinasa. Esta matriz de puntaje fue usada entonces para buscar en la base de datos Celera Human Genome y extraer las secuencias que tengan dominios catalíticos de cinasa. Sobre la base de este análisis, la presente invención proporciona la secuencia de aminoácidos de un péptido de cinasa humana que contiene un dominio de cinasa que es altamente homologo a las secuencias de consenso del dominio catalítico de serina/treonina proteína cinasas, secuencias de ADNc y secuencias genómicas que codifican para el péptido de cinasa, e información acerca de la proteína/péptido/dominio conocido de la técnica más cercana que tiene homología estructural o secuencia con la cinasa de la presente invención. El péptido de la presente invención puede ser usado para el desarrollo de productos y servicios comercialmente importantes . Varios aspectos de la invención son descritos con detalle en las siguientes subsecciones . No significa que el uso de subsecciones límite la invención. Cada subsección se aplica a cualquier aspecto de la invención. Definiciones y términos Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se define un número de términos y frases.
Como se usa aquí, un"polinucleótido o un polipéptido est "aislado" si este es removido de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido es aislado a través de un proceso de purificación de modo que el polinucleótido o polipéptido esté sustancialmente libre de material celular o libre de precursores químicos. El polinucleótido/polipéptido de la presente invención puede ser purificado hasta la homogeneidad u otros grados de pureza. El nivel de purificación se basará en el ' uso pretendido. Como es apreciado por un experto en la técnica, un polinucleótido/polipéptido puede efectuar sus funciones deseadas aún en presencia de cantidades considerables de otros componentes o moléculas . En algunos usos, un polinucleótido/polipéptido que está "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones las cuales . tienen menos dé aproximadamente 30% (en peso) de otros polinucleótidos/polipéptidos , incluyendo polinucleótidos/polipéptidos contaminantes. Por ejemplo, las preparaciones pueden tener menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5% de otros polinucleótidos/polipéptidos. Si una preparación de polinucleótido/polipéptido es producida de manera recombinante, esta puede estar sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, representando los componentes del medio de cultivo menos de aproximadamente 20% en peso de la preparación de polinucleótido/polipéptido . El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos" incluye preparaciones en las cuales el polinucleótido/polipéptido es separado de precursores químicos u otros compuestos químicos que están implicados en al síntesis del polinucleótido/polipéptido. En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos" incluye preparaciones de cinasa que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso) , menos de aproximadamente 20% (en peso) , menos de aproximadamente 10% (en peso) , o menos de aproximadamente 5% (en peso) de precursores químicos u otros compuestos químicos usados en la síntesis . Como se usa en la presente invención, un polinucleótido producido en una célula es un polinucleótido aislado. De igual modo, un polipéptido expresado de un vector introducido en una célula es también un polipéptido aislado. Un "polinucleótido" puede incluir cualquier número de nucleótidos. Por ejemplo, un polinucleótido puede tener al menos 10, 20, 25, 30, 40, 50, 100 o más nucleótidos. Un polinucleótido puede ser de ADN o ARN, de doble hebra o una sola hebra. Un polinucleótido codifica para un polipéptido si el polipéptido es capaz de ser transcrito y/o traducido del polinucleótido. Las secuencias reguladoras transcripcionales y/o traslacionales , como los promotores y/o mejoradores, pueden ser agregadas al polinucleótido antes de que ocurra la transcripción y/o traducción. 'Además, si el polinucleótido es de una sola hebra, el ADN de doble hebra correspondiente que contiene el polinucleótido original y su secuencia complementaria puede ser preparado antes de la transcripción y/o traducción. Como se usa aquí, "una variante de un polinucleótido" se refiere a un polinucleótido que difiere del polinucleótido original en una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones. Por ejemplo, una variante de un polinucleótido puede tener 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, o más sustituciones, adiciones o supresiones nucleotídicas . Preferiblemente, la modificación está en el marco, es decir, que el polinucleótido modificado puede ser transcrito y traducido al codon original o detenido pretendido. Si el polinucleótido original codifica para un polipéptido con una actividad biológica, el polipéptido codificado por una variante de las variantes polinucleotídicas originales retiene sustancialmente esa actividad. Preferiblemente, la actividad biológica es reducida/mejorada por menos de 50%, o mas preferiblemente, menos de 20%, con relación a la actividd original. Una variante de un polinucleótido puede ser un polinucleótido que sea capaz de hibridarse al polinucleótido original, o la secuencia complementaria del mismo, bajo condiciones de rigurosidad reducida, preferiblemente condiciones rigurosas, o de manera más preferible, condiciones altamente rigurosas. Los ejemplos de condiciones de diferente rigurosidad se listan en la Tabla 1. Las condiciones altamente rigurosas son aquellas que son al menos tan rigurosas con las condiciones A-F; las condiciones rigurosas son al menos tan rigurosas como las condiciones G-L, y las condiciones de rigurosidad reducida son al menos tan rigurosas como las condiciones M-R. Como se usa en la Tabla 1, la hibridación se llevó a cabo bajo una condición de hibridación dada durante aproximadamente 2 horas, seguida por dos lavados de 15 minutos bajo las condiciones de lavado correspondientes. Tabla 1. Condiciones de Rigurosidad Condición de Poli- Longitud Temperatura y Temp. de Lavado rigurosidad nucleótido del Amortiguador" de y Amortiguador" híbrido híbrido Hibridación (pb)1 ? ADN : ADN > 50 65°C; lxSSC -o- 42°C, 65°C; 0.3xSSC IxSSC, formamida al 50% B AD : ADN < 50 TB*; IxSSC TB*; IxSSC C AD : ARN > 50 67°C; IxSSC -o- 45°C; 67°C; 0.3xSSC IxSSC, formamida al 50% D AD : ARN < 50 TD*; IxSSC TD*; IxSSC E ARN : ARN > 50 70°C; IxSSC -o- 50°C; 70°C; 0.3xSSC IxSSC, formamida al 50% F AR : ARN < 50 TF*; IxSSC Tf*; IxSSC G AD : ADN > 50 65°C; 4xSSC -o- 42°C, 65°C; IxSSC 4xSSC, formamida al 50% H AD : ADN < 50 TH*; 4xSSC TH*; 4xSSC Condición de Poli- Longitud Temperatura de Temp. de rigurosidad nucleótido del Amortiguador11 de Lavado y híbrido híbrido Hibridación Amortiguador11 (pb)1 I AD : ARN > 50 67 °C; 4xSSC -o- 45° C; 67°C; lxSSC 4xSSC; formamida al 50% J AD : RN < 50 Tj*; 4xSSC Tj*; 4xSSC K AR : RN > 50 70°C; 4xSSC -o- 45°C; 67°C; lxSSC 4xSSC, formamida al 50% L AR : ARN < 50 ¾,*; 2xSSC TL*; 2xSSC M AD : ADN > 50 50°C; 4xSSC -o- 40°C; 50°C; 2xSSC 6xSSC, formamida al 501 N ADN : ADN < 50 ¾*; 6xSSC TN*; 6xSSC 0 AD : ARN > 50 55 °C; 4xSSC -o- 42 °C; 55°C; 2xSSC 6xSSC, fomamida al 50% P ADN : ARN < 50 TP*; 6xSSC TP*; 6XSSC Q AR : ARN > 50 60 °C; 4xSSC -o- 45°C; 60°C; 2xSSC 6xSSC, formamida al 50% R ARN: ARN < 50 ¾*; 4XSSC TR*; 4xSSC : La longitud del híbrido es la que se anticipó para las regiones 'hibridadas de los polinucleótidos hibrxdantes. Cuando se híbrida un polinucleótido a un polinucleótido blanco u objetivo de secuencia desconocida, se asume que la longitud del híbrido es la del polinucleótido hibridante. Cuando son hibridados polinucleótidos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede ser determinada alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencia óptima. H: El SSPE (IxSSPE es NaCl 0.15M, NaH2P04 10 mM, y EDTA 1.25 mM, pH 7.4) puede ser sustituido por SSC (lxSSC es NaCl 0.15M y citrato de sodio 15 mM) en los amortiguadores de hibridación y lavado. TB*-TR*: La temperatura de hibridación para los híbridos que se a'nticipó serán de menos de 50 pares de bases en longitud deberá ser 5-10°C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm es determinada de acuerdo a las siguientes ecuaciones . Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm(°C)=2(# de bases A + T) + (# de bases G + C) . Para híbridos de entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(°C)=81.5 + 16.6 (log10Na+) +0.41 (%G+C) - (600/N) , donde N es el número de bases en el híbrido, y Na+ es la concentración de iones sodio en amortiguador de hibridación para (Na+ para lxSSC = 0.165M) . Será apreciado por aquellos expertos en la técnica, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas variantes polinucleotídicas que codifican para el mismo polipéptido. Algunas de esas variantes polinucleotídicas contienen una homología de secuencia mínima con el polinucleótido original. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso del codón son contemplados específicamente por la presente invención.
Como se usa aguí, "un "polipeptido" puede incluir cualquier número de aminoácidos residuales. Por ejemplo, un polipeptido puede tener al menos 5, 10, 15, 10, 30, 40, 50 o más ácidos residuales . Como se usa aquí, una "variante de un polipeptido" es un polipeptido que difiere del polipeptido original en una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones.
Preferiblemente, esas modificaciones no cambian sustancialmente (por ejemplo, reducen o mejoran) la función biológica original del polipeptido. Por ejemplo, una variante puede reducir o mejorar o mantener las actividades biológicas del polipeptido original. Preferiblemente, las actividades biológicas de la variante son reducidas o mejoradas en menos del 50%, o de manera mas preferible, menos del 20%, en relación al polipeptido original . De manera similar, la capacidad de una variante para reaccionar con antisueros específicos del antígeno puede ser mejorada o reducida en menos del 50%, preferiblemente menos del 20%, en relación al polipeptido original. Esas variantes pueden ser preparadas y evaluadas modificando la secuencia polipeptídica original y determinando la reactividad del polipeptido modificado con los anticuerpos o antisueros específicos del antígeno. Preferiblemente, un polipéptido variante contiene una o más sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es una en la cual un aminoácido está sustituido por otro aminoácido el cual tiene propiedades similares, de modo _que un experto en la técnica esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido sustituido no cambie sustancialmente . Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden ser efectuadas sobre la base de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfifática de los residuos. Los aminoácidos cargados negativamente incluyen al ácido aspártico y ácido glutámico, y los aminoácidos cargados positivamente incluyen a la lisina y arginina. Los aminoácidos que tienen grupos con cabezas polares no cargadas y valores de hidrofilicidad similares incluyen a la leucina, isoleucina y valina, o glicina y alanina, o asparagina y glutamina, o serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden producir cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp., gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser,tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante polipeptídica también puede contener cambios no conservadores. Las variantes polipeptídicas pueden ser preparadas mediante la supresión y/o adición de aminoácidos que tengan influencia mínima sobre la actividad biológica, inmunogenicidad, estructura secundaria y/o naturaleza hidropática del polipéptido. Las variantes pueden ser preparadas, por ejemplo, sustituyendo, modificando, suprimiendo o agregando uno o más aminoácidos residuales en la secuencia original . Las variantes polipeptídicas preferiblemente exhiben al menos aproximadamente 70%, de manera más preferida al menos aproximadamente 90%, y de manera más preferible al menos aproximadamente 95% de homología de secuencia con el polipéptido original . Las variantes polipeptídicas incluyen polipéptidos que son modificados a partir de los polipéptidos originales por un proceso natural, como una modificación postraslacional o por una modificación química. Esas modificaciones son bien conocidas en la técnica. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar en el polipéptido, incluyendo la estructura principal o esqueleto, las cadenas laterales de aminoácidos y el amino o carboxi terminales. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o varios grados en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos postraslacionales naturales o pueden ser producidos a través de métodos sintéticos. Las modificaciones adecuadas para esta invención incluyen la acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de ""flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o un derivado lipidico, unión covalente de fosfatidilinositol , reticulación, ciclización, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisterna, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas como la arginilación y ubiquitinacion. Como se usa aquí, el término "modulación" incluye la sobrerregulación, inducción, simulación, potenciación, inhibición, desregulación o supresión o liberación de la inhibición. Una secuencia nucleotídica está "ligada operativamente" a otra secuencia nucleotídica si las dos secuencias son colocadas en una relación funcional. Por ejemplo, una secuencia codificadora está ligada operativamente a una secuencia reguladora 5' si la secuencia reguladora 5' puede iniciar la transcripción de la secuencia codificadora en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula anfitriona. "Ligado operativamente" no requiere que las secuencias de ADN que están ligadas estén contiguas entre sí . Pueden existir secuencias intervinientes entre dos secuencias ligadas operativamente. Como se usa aquí, un humano "libre de enfermedad" se refiere a un humano que no tiene enfermedades relacionadas con NRHK-1. Las células, tejidos o muestras libres de enfermedad se refieren a células, tejidos o muestras obtenidas de esos humanos libres de enfermedad. Un polinucleótido es "capaz de hibridarse" a un gen si el polinucleótido puede hibridarse a al menos una de las siguientes secuencias: (1) la secuencia de un transcripto de ARN del gen, (2) la secuencia complementaria de un transcripto de ARN del gen, (3) la secuencia de ADNc de un transcripto de ARN del gen, (4) la secuencia complementaria de la secuencia de ADNc de un transcripto de ARN del gen, (5) una secuencia genómica del gen, y (6) la secuencia complementaria - de una secuencia genómica del gen. Como se usa aquí, la "identidad" de secuencia en una alineación puede ser determinada por el programa BLAST proteína-proteína estándar (blastp) , el programa BLAST nucleótido-nucleótido estándar (blastn) o el programa de secuencias BLAST2. Los programas BLAST adecuados pueden encontrarse en el sitio en la red mantenido por el National Center of Biotechnology Information (NCBI) , National Library of Medicine, Washington DC, EUA.
Gen de la NRHK1 Humana y la Ciñasa NRHK1 La presente invención identifica un nuevo gen humano (gen de RHK1) que codifica para una proteina que contiene secuencias homologas a las secuencias de consenso del dominio catalítico de serina/treonina cinasas, pcinasas y tirosina cinasas . La nueva proteína también está relacionada distantemente con una proteína cinasa relacionada con NIMA.. La secuencia nucleotídica que codifica para NRHKl y la secuencia de aminoácidos de RHK1 son descritas en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. El gen de NRHK1 se localiza en el sitio 9q34 del cromosoma humano 9. Específicamente, el gen de NRHK1 se localiza entre los genes LOC157890 y LOC57109, y superpuesto con el gen LOC169436. El sitio 9q34 del cromosoma humano y la regiones vecinas han sido asociadas con enfermedades múltiples, incluyéndose pero sin limitarse a, cáncer de colon, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, adenocarcinoma pulmonar, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, linfoma no Hodgkin de células T, insulinoma, tumores adenocorticales infantiles, leucemia mieloide crónica, esclerosis tuberosa, síndrome de uña-patella, distrofia reticular Tipo II, distonia de torsión primaria, lipodistrofia generalizada congénita, y esclerosis lateral amiotrofica juvenil. El gen de la RNHK1 humana tiene 21 exones. Los exones se trazaron en un mapa de las secuencias nucleotídicas del cromosoma humano 9 en la base 'de datos genómica Celera (SEQ ID NO: 3) . Los exones 1-29, 31 y 32 también se trazaron en un mapa de los nucleótidos 110001 a 137201 en el cromosoma humano 9 de la Base de Datos de Secuencia del Genoma Humano Entrez mantenida por el NCBI . La Tabla 2 lista la ubicación de cada uno de esos 21 exones en la secuencia genómica SEQ ID NO: 3. La tabla 2 también ilustra la ubicación correspondiente de cada exón en la secuencia codificadora de NRHK1, la SEQ ID NO: 1. Tabla 2. Exones en el Gen de la RHKl Humana Números de Secuencia correspondiente Secuencia correspondiente Exón en la SEQ ID NO: 3 en la SEQ ID NO: 1 1 1-87 1-87 2 2563-2469 88-174 3 8734-8778 175-219 4 10495-10569 220-294 5 12325-12426 295-396 6 14404-14474 397-467 7 15547-15662 468-583 8 18710-18828 584-702 9 20019-20182 703-866 10 21583-21841 867-1125 11 23864-23951 1126-1213 12 24833-24949 1214-1330 13 25277-25418 1331-1472 14 26158-26298 1473-1613 15 26640-26725 1614-1699 16 27298-27432 1700-1834 17 27841-27930 1835-1924 18 28115-28243 1925-2053 Números de Secuencia correspondiente Secuencia correspondiente Exon en la SEQ ID NO: 3 en la SEQ ID NO: 1 19 28335-28462 2054-2182 20 29204-29344 2183-2323 21 29667-29836 2324-2493 Una búsqueda del dominio conservado usando el programa RPS-BLAST (RPS-BLAST 2.2.3 [Abril 24, 2002], disponible en el sitio en la red BLAST mantenido por NCBI) , demostró que NRHK1 contenia secuencias homologas a las secuencias de consenso de varios dominios de proteina cinasa. Específicamente, los aminoácidos residuales 28 a 297 de la NRHK1 son altamente homólogos a un dominio catalítico de una familia de Ser/Thr proteína cinasas (número de acceso Entrez : smart00220) . Esta familia de cinasas incluye la cinasa N-terminal C-Jun ( JNK3) ," tirosina cinasa de abelson, una proteína cinasa similar a la proteína (1G5) , asociada con la vesícula, que se une a la calmodulina, serina/treonina-proteína cinasa prp4, la subfamilia Cdc2/Cdc28 de Ser/Thr proteína cinasas en C. elegans, y cinasa S6 ribosomal de C elegans. La FIGURA 1 muestra que las dos secuencias comparten una alineación del 100.0% con un puntaje de 130 bits y un valor de E de 2 x 10"31. Como se usa en otras figuras de esta invención, "Interrogante" denota la secuencia de NRHK1 y "Sujeto" se refiere a la secuencia que está siendo comparada con la secuencia de NRHK1.
La FIGURA 2 demuestra que los aminoácidos residuales 28 a 296 de NRHK1 también se alinearon 100.0% con el dominio de proteína cinasa de pcinasa (número de acceso Entrez pfam00069) . La alineación tiene un puntaje de 119 bits, y un valor de E de 3 x 10"28. Esta familia de pcinasa incluye a la proteina cinasa Ck2 , la proteína cinasa es similar a eel (WEElhu) , y la tirosina-proteína cinasas RY . La FIGURA 3 muestra la alineación de secuencia entre los aminoácidos residuales 59 a 294 de RHK1 y el N-terminal de una familia de tirosina cinasa (número de acceso Entrez: smart00219) . Esta familia incluye el dominio de tirosina cinasa del receptor del factor de crecimiento de los fibroblastos 1, tirosina-proteína cinasa (subfamilia KIN15/ IN16) y un miembro de la familia de proteína-tirosina cinasa del receptor de Drosophila (drl-Pl) . Los aminoácidos residuales 59-294 en el dominio de cinasa RHK1 tiene identidades de secuencia del 87.5% a smart00219 , con un puntaje de 75.4 bits y un valor E de 4 x 10~15.' La FIGURA 4 ilustra la alineación de secuencia entre los aminoácidos residuales 25 a 285 de RH 1 y el N-terminal de una proteína cinasa relacionada con ???? de Populus x casiescens (número de acceso Entrez: AF469649_1) . Las dos secuencias comparten identidades de secuencia de 28% con un puntaje de 87.8 y un valor de E de 5 x 10"16. Las cinasas relacionadas con NIMA son un grupo de proteína cinasas que comparten identidades de secuencias de aminoácidos altas con NIMA (nunca en el gen de la mitosis A) el cual controla la mitosis en Aspergillus nidulans. Específicamente, NIMA controla la condensación de cromatina mitótica a través de la fosforilación de la histona H3 en la serina 10. Las cinasas relacionadas con NIMA también pueden regular el ciclo celular en otros eucariotes, como la expresión de NIMA puede promover eventos mitóticos en levaduras, células de rana o humano. Además, las versiones de dominio negativo de NIMA pueden afectar de manera adversa el progreso de la mitosis en células humanas. Nek6 Humana (hNek6) , un miembro de las cinasas relacionadas con NIMA de mamífero se localiza en el cromosoma humano 9q33-34, la misma región en el cromosoma 9 donde se localiza NRHK1. La FIGURA 5 muestra el perfil de hidrofobicidad de NRHK1. El análisis de hidrofobicidad indica que la ciñasa NRHK1 probablemente no es una proteína de la membrana o transmembranal . La NRHK1 muestra una homología de secuencia significativa con una proteína similar a la proteína cinasa humana SGK0771 (número de acceso Entrez : AX056458, la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos de SGK071 son descritas en la SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente), la cual fue descrita en la solicitud de patente PCT WO00/73469. El análisis usando el algoritmo BLAST de apareamiento reveló que NRHKl y SGK071 comparten identidades de secuencia del 84% a nivel de aminoácidos (blastp, matriz: BL0SUMS2 , espacio abierto; 11, extensión del espacio: l,x_bajada; 50, esperar: 10.0, tamaño de palabra; 3, filtro: no verificado), e identidades de secuencia del 90% del nivel nucleotídico (blastn, apareamiento; 1, desapareamiento; -2, espacio abierto; 5, extensión de espacio: 0; x_bajada: 50, esperar: 10.0, tamaño de palabra: 11, filtro: no verificado) . La existencia en la expresión del gen NRHKl en humanos es apoyada por varias secuencias de EST. Por ejemplo, los nucleótidos 1-583 de la SEQ ID NO: 1 son apoyados por secuencias de EST descritas bajo los números de acceso del GenBank BI458908, AL044935, BM015576, AI799141, y el número de acceso Incyte 6854652H1; los nucleótidos 584-866 de la SEQ ID NO: 1 son apoyados por las secuencias de EST descritas bajo los números de acceso del GenBank AV763896, AI936591, AW183662 y AI554166; los nucleótidos 867-949 de la SEQ ID NO: 1 son apoyados por las secuencias de EST descritas bajo el número de acceso del GenBank AW629230 y los números de acceso Incyte 6854652H1 y 6883792H1; los nucleótidos 1565-1707 de la SEQ ID NO: 1 son apoyados por la secuencias de EST descritas bajo el número de acceso Incyte 6140228F8; los nucleótidos 2426-2593 de la SEQ ID NO: 1 son apoyados por las secuencias de EST descritas bajo el número de acceso del GenBank BQ184985.
Utilidad de las Proteínas Cinasas Las proteínas cinasas están implicadas en la regulación de muchos procesos biológicos críticos como las vías de transducción de señales . El mal funcionamiento de la señalización celular ha sido asociado con muchas en ermedades. La regulación de la transducción de señales por citocinas y la asociación de moléculas señal con protooncogenes y genes supresores de tumores han sido el objeto de investigación intensa. Ahora pueden ser desarrolladas muchas estrategias terapéuticas a través de la síntesis de compuestos que activan o inactivan proteínas cinasas. La importancia de las cinasas en la etiología de enfermedades ha sido bien establecida. Las proteínas cinasas son un blanco mayor para la acción y desarrollo de fármacos . Un estudio de Enero de -2002 de ensayos clínicos en curso en los Estados Unidos reveló más de 100 ensayos clínicos que implican la modulación de cinasas. Los ensayos se están efectuando en una amplia variedad de indicaciones terapéuticas incluyendo el asma, Parkinson, inflamación, psoriasis, artritis reumatoide, lesiones de la medula espinal, condiciones musculares, osteoporosis, enfermedad del injerto contra el huésped, trastornos cardiovasculares, trastornos autoinmunes, desprendimiento retinal, apoplejía, epilepsia, isquemica/reperfusión, cáncer de mama, cáncer de ovario, glioblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer cerebral, sarcoma de Kaposi, cáncer pancreático, cáncer de hígado y otros tumores. Numerosos tipos de moduladores de la actividad de cinasa están actualmente en ensayos clínicos incluyendo moléculas antisentido, anticuerpos, moléculas pequeñas, y aún terapia genética. En consecuencia, es valioso para el campo del desarrollo farmacéutico identificar y caracterizar miembros previamente conocidos de proteínas de la familia de las cinasas . La presente invención hace avanzar el estado de la técnica proporcionando proteínas cinasas humanas previamente identificadas las cuales están relacionadas estructuralmente con proteínas cinasas relacionadas con NIMA. Muchas estrategias terapéuticas están dirigidas a componentes críticos de las vías de transducción de señales. Los métodos para regular la expresión de genes de cinasa incluyen oligonucleótidos antisentido específicos para inhibir el procesamiento prostranscripcional del ARN mensajero, productos que ocurren naturalmente y sus derivados químicos para inhibir la actividad de cinasa y anticuerpos monoclonales para inhibir cinasas ligadas al receptor. En algunos casos, los inhibidores de cinasa también permiten que otros agentes terapéuticos con un tiempo adicional se vuelvan efectivos y actúen de manera sinérgica con los tratamientos actuales. Entre las áreas de investigación farmacéutica que están recibiendo actualmente una gran cantidad de atención están el papel de la fosforilación en el control transcripcional , apoptosis, degradación de proteína, importación y exportación nuclear, regulación citoesquelética y señalización del punto de verificación. La acumulación de conocimiento acerca de redes de señalización y las proteínas implicadas se pondrá en uso práctico en el desarrollo de moduladores farmacológicos potentes y específicos de la señalización dependiente de la fosforilación. El diseño basado en la estructura racional y el desarrollo de moduladores de cinasa altamente específicos se está volviendo rutina y los fármacos que interceden en las vías de señalización se están convirtiendo una clase principal de fármacos . Las funciones de algunas de las cinasas se describen más adelante. Las proteínas cinasas dependientes del segundo mensajero median principalmente los efectos de segundos mensajes como el AMP cíclico (AMPc) , G P cíclico, trifosfato de inositol, fosfatidilinositol , 3 , 4 , 5-trifosfato , ADPribosa cíclica, ácido araquidónico, diacilglicerol y calcio-calmodulina. Las proteínas cinasas dependientes del AMP cíclico (PKA) son miembros importantes de la familia de STK. La AMP cíclico es un mediador intracelular de acción hormonal en todas las células procarióticas y animales que han sido estudiadas . Esas respuestas celulares inducidas por hormonas incluyen la secreción de hormona tiroidea, secreción de cortisol, secreción de progesterona, degradación de glicógeno, resorción ósea y regulación del ritmo cardiaco y fuerza de contracción del músculo cardiaco. Las PKA se encuentran en todas las células animales y se piensa que contribuyen a los efectos del AMP cíclico en la mayoría de esas células. La expresión de PKA alterada está implicada en una variedad de trastornos y enfermedades incluyendo el cáncer, trastornos tiroideos, diabetes, aterosclerosis y enfermedad cardiovascular . Las proteínas cinasas dependientes de calcio-calmodulina (CaM) son también miembros de la familia de STK. La calmodulina es un receptor de calcio que media muchos procesos regulados por el calcio uniéndose a proteínas objetivo en respuesta a la unión del calcio. La proteína blanco principal en esos procesos es proteína cinasa dependiente de CaM. Las CaM-cinasas están implicadas en la regulación de la contracción del músculo liso (MLC cinasa) , degradación de glicógeno (fosforilasa cinasa) , y neurotransmisión (CaM cinasa I y CaM cinasa II) . La CaM cinasa I fosforila una variedad de sustratos incluyendo las proteínas relacionadas con el neurotransmisor sinapsínas I y II, el regulador de la transcripción genética, CREB, y la proteína reguladora de la conductancia de la fibrosis cística, CFTR. La CaM II cinasa también fosforila la sinapsina en diferentes sitios, y controla la síntesis de catecolaminas en el cerebro a través de la fosforilación y activación de la tirocina idroxilasa. Muchas de las Ca'M cinasas son activadas por la fosforilación además de unirse a CaM. La cinasa puede autofosforilarse a si misma, o ser fosforilada por otra cinasa como parte de una "casada de cinasas" . Otra proteína cinasa activada por el ligando es la proteína cinasa activada por 5'-AMP (AMPK). La AMPK de mamífero es un regulador de la síntesis de ácido graso y esterol a través de la fosforilación de las enzimas acetil-CoA carboxilasa e hidroximetílglutaril-CoA reductasa y medias respuestas de esas vías a esfuerzos celulares como choque térmico y agotamiento de glucosa y ATP. La AMPK es un complejo heterotrimérico comprendido de una subunidad alfa catalítica y dos subunidades beta y gamma no catalíticas que se cree regulan la actividad de la subunidad alfa. Las subunidades de la AMPK tienen una distribución mucho más amplia en tejidos no lipogénicos, como el cerebro, corazón, bazo, y pulmón, de la esperada. Esta distribución sugiere funciones de la AMPK pueden extenderse más allá de la regulación del metabolismo de lípidos únicamente. Las proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAP) también son miembros de la familia de 3TK. Las MAP cinasas también regulan vías de señalización intracelular. Ellas median la traducción de señales de la superficie celular al núcleo vía cascadas de fosforilación. Han sido identificados varios grupos, y cada uno manifiesta diferentes especificidades de sustrato y "responden a distintos estímulos extracelulares . Las vías de señalización de MAP cinasa están presentes en células de mamífero así como en levaduras . Los estímulos extracelulares que activan las vías de los mamíferos incluyen el factor del crecimiento epidérmico (EGF) , luz ultravioleta, medio hiperosmolar, choque térmico, lipopolisacárido endotóxico (LPS) , y citocinas proinflamatorias, como factor de la necrosis tumoral (TNF) e interleucina-1 (IL-1) . El receptor de EGF se encuentra en más de la mitad de tumores de mama que no responden a hormonas . El EGF se encuentra en muchos tumores, y el EGF puede requerirse para el crecimiento de células tumorales. Los anticuerpos para EGF redujeron el crecimiento de xenoinjertos de tumor en ratones. Un oligonucleótido antisentido para la anfirregulina inhibió el crecimiento de la línea celular de cáncer pancreático. El tamoxifen, un inhibidor de la proteína cinasa C con actividad antiestrogeno, es actualmente un tratamiento estándar para el cáncer de mama dependiente de hormonas. El uso de este compuesto puede incrementar el riesgo de desarrollar cáncer en otros te idos como el endometrio. El raloxifeno, compuesto relacionado, ha mostrado proteger contra la osteoporosis . La especificidad tisular de los inhibidores debe ser considerada cuando se identifiquen blancos terapéuticos.
La transducción de s'eñales al núcleo en respuesta a estímulos extracelulares por un factor del crecimiento implica a las proteínas cinasas activadas por mitogeno (MAP) . Las MAP cinasas son una familia de proteínas serina/treoina cinasa las cuales median la traducción de señales de los receptores extracelulares o choque térmico o radiación UV. La proliferación y diferenciación celular en células normales están bajo la regulación y control de múltiples cascadas de MAP cinasas. El funcionamiento aberrante y desregulado de las MAP cinasas puede iniciar y soportar la carcinogénesis . La insulina y el IGF-1 también activan una vía de MAP cinasa mitogénica que puede ser importante en la resistencia adquirida en la insulina que ocurre en la diabetes del tipo 2. Muchos cánceres se vuelven refractarios a la quimioterapia desarrollando una estrategia de sobrevivencia que implica la activación constitutiva de la cascada de señalización fosfatidilinositol 3-cinasa proteína cinasa B/Akt. Esta vía de señalización de sobrevivencia se vuelve de este modo un blanco importante para el desarrollo de inhibidores específicos que bloquearían su función. La señalización PI-3cinasa/Akt es igualmente importante en la diabetes . La vía activada por RTK regula posteriormente la glicógeno sintasa 3 (GSK3) y la absorción de glucosa. Puesto que la AKT tiene menor actividad en la diabetes tipo 2 , proporciona un blanco terapéutico.
Los inhibidores de" proteina cinasa proporcionan mucho de nuestro conocimiento acerca de la regulación in vivo y coordinación de las funciones fisiológicas de los inhibidores peptídicos endógenos. Una secuencia de pseudosustratos dentro de la PKC actúa inhibiendo la cinasa en ausencia de su activador lipídico. Un inhibidor de PKC, como la queleritrina, actúa sobre el dominio catalítico para bloquear la interacción del sustrato, mientras que la calfostina actúa sobre el dominio regulador para imitar la secuencia de pseudosustrato y bloquear la actividad de la ATPasa, o inhibir la unión del cofactor. Aunque algunas proteínas cinasas no tienen, a la fecha, un sistema conocido de regulación fisiológica, muchas son activadas o inactivadas por autofosforilación o fosforilación por proteínas cinasas corriente arriba. La regulación de las proteínas cinasas también ocurre durante los procesos dé "transcripción, post-transcripción y posttranslación. El mecanismo de la regulación postranscripcional es el empalme alternativo de AR m precursor. Por ejemplo, las proteínas cinasas C ß? y ß?? son dos isoformos de un solo gen de PKCp derivado de diferencias en el empalme del exón que codifica para los aminoácidos 50-52 C-terminales . El empalme puede ser regulado por una casada de cinasa en respuesta a hormonas peptídicas, como la insulina e IGF-1. Las PKC ß? y ß?? tienen diferentes especificidades por miembros fosforilantes de la familia de la proteína cinasa activada por mitógeno (MAP) , para la glicógeno cintasa 3ß, para factores de transcripción nuclear, como TLS/Fus, y para otras cinasas nucleares. Inhibiendo el empalme alternativo postranscripcional el ARNm de PKC ß??, se inhiben los procesos dependientes de PKC ß?? . El desarrollo de oligonucleotidos antisentido para inhibir la expresión de varias proteínas cinasas ha sido exitoso. Los oligonucleotidos antisentido son longitudes cortas de ADN o ARN fabricados sintéticamente, modificados químicamente, diseñados para interactuar específicamente con transcriptos de ARNm que codifican para proteínas blanco. La interacción de la porción antisentido con el ARNm inhibe la traducción de proteínas y, en algunos casos, el procesamiento postranscripcional (por ejemplo, empalme alternativo y estabilidad) del ARNm. Han sido desarrollados oligonucleotidos antisentido para alterar el empalme alternativo de formas de ARNm para inhibir la traducción de PKCo¡. Los isoformos de la proteína cinasa C han sido implicados en cambios celulares observados en las complicaciones vasculares de la diabetes. La hiperglicemia esta asociada con el incremento de los niveles de los isoformos de PKCa y ß en los glomérulos renales en ratas diabéticas. La administración-- oral de un inhibidor de ???ß previno el incremento de la expresión de ARNm de TGF-ß? y genes de componentes de la matriz extracelular. La administración del inhibidor de ???ß especifico (LY333531) también normalizó los niveles de citocinas, caldesmon y hemodinámica del flujo de sangre retinal y renal. La sobre expresión de un isoformo ???ß en el miocardio dio como resultado hipertrofia e insuficiencia cardiaca. El uso de LY333531 para prevenir los efectos adversos de la sobreexpresión de ???ß cardiaca en sujetos diabéticos esta bajo investigación. El compuesto también esta en ensayos clínicos en la fase l/II para la retinopatía diabética y edema macular diabético indicando que puede ser farmacológicamente activo . La PRK (cinasa relacionada con la proliferación) es una STK inducible por suero/citocina que esta implicada en la regulación del ciclo celular y la proliferación celular en células megacariocíticas humanas. La PRK esta relacionada con la familia de polo (derivado de un gen del polo humano) de STK implicadas en la división celular. La PRK es desregulada en tejido pulmonar tumoral y puede ser un proto-oncogen cuya expresión desregulada en tejido normal conduzca a transformación oncogénica. La expresión de AP cinasa alterada esta implicada en una variedad de condiciones de enfermedad incluyendo el cáncer, inflamación, trastornos inmunes y trastornos que afectan al crecimiento y desarrollo. La proteína cinasa dependiente de ADN (ADN-PK) esta implicada en la reparación de rompimientos de la doble hebra en células de mamífero. Esta enzima requiere los extremos del ADN de doble hebra o transiciones de ADN de una sola hebra a doble hebra para actuar como una serina/treonina cinasa. Las células con actividad de ADN-PK defectuosa o deficiente son incapaces de reparar rompimientos de la doble hebra de ADN inducidos por radiación y en consecuencia son muy sensibles a los efectos letales de la radiación ionizante. La inhibición del ADN-PK tiene el- potencial de incrementar la eficacia de tratamiento antitumoral con radiación o agentes quimioterapéu icos . Las proteínas cinasas dependientes de ciclina (CDK) son otro grupo de STK que controlan el progreso de las células a través del ciclo celular. Las ciclinas son proteínas reguladoras pequeñas que actúan uniendo y activando CDK que activan entonces varias fases del ciclo celular fosforilando y activando proteínas seleccionadas implicadas en el proceso mitótico. Las CDK son únicas dado que requieren múltiples entradas para ser activadas. Además de la unión de ciclina, la activación de las CDK requiere la fosforilación de un residuo de treonina específico y la desfosforilación de un residuo de tirosina específico. Los inhibidores celulares de CDK también juegan un papel principal en el progreso del ciclo celular. Las alteraciones en la expresión, función y estructura de la ciclina y CDK se encuentran en el fenotipo del cáncer. Por lo tanto, las CDK pueden ser blancos importantes para nuevos agentes terapéuticos para el cáncer. Las células resistentes a la quimioterapia tienden a escapar de la apoptósis. Bajo ciertas circunsatncias, la activación inapropiada de la CDK puede promover aún la apoptósis alentando el progreso del ciclo celular bajo condiciones desfavorables, es decir, intentando la mitosis aunque el daño al ADN no este en gran medida reparado. Las purinas y análogos de purina actúan como inhibidores de CDK. El flavopiridol es un flavonoide que produce una inhibición del 50% del crecimiento de células tumorales a 60nM. También inhibe al EGFR y la proteína cinasa A. El flavopiridol usa la apoptósis e inhibe el crecimiento de células de cáncer linfoide, mieloide, de colon y próstata con células crecidas in vivo como xenoinjertos en ratones desnudos . La estaurosporina y su derivado, UCN-01, además de inhibir á la proteína cinasa C, inhibe a la ciclina B/CDK (CI50 = 3 a 6 nM) . La estaurosporina es tóxica, pero su derivado la 7-hidroxiestaurosporina (UCN-01) tiene propiedades antitumorales y esta en ensayos clínicos. La UCN-01 afecta la fosforilación de CDK y altera el funcionamiento del punto de verificación del ciclo celular. Esos compuestos ilustran que los blancos intracelulares múltiples pueden ser afectados cuando la concentración de un inhibidor se incremente dentro de las células. Las proteínas tirosinas cinasas, PTK, fosforilan específicamente residuos de tirosinas sobre sus proteínas blanco y pueden dividirse en PTK transmembranales , receptoras y PTK no transmembranales, no receptoras. Las proteínas tirosinas cinasas transmembranales son receptores para la mayoría de los factores del crecimiento. La unión de un factor del crecimiento al receptor activa la transferencia a un grupo fosfato del ATP a cadenas laterales de la tirosina seleccionada del receptor y otras proteínas específicas. Los factores del crecimiento (GF) asociados con las PTK receptoras incluyen GF epidérmico, GF derivado de las plaquetas, GF fibroblásticQ, GF hepatocítico, insulina y GF similares a la insulina, GF nervioso, GF vasculoendotelial , y factor estimulante de la colonia de los macrófagos . Puesto que las TK estimulan la proliferación de células tumorales, los inhibidores de RTK pueden inhibir el crecimiento y proliferación de esos cánceres. Los inhibidores de RTK también son útiles para prevenir la angiogénesis tumoral y pueden eliminar el soporte del tejido anfitrión dirigiendo RTK localizada sobre células vasculares, como células endoteliales de ¦ vasos sanguíneos y fibroblastos estromales . Por ejemplo, el VEGF estimula el crecimiento de células endoteliales durante la angiogénesis, e incrementan la permeabilidad de la vasculatura tumoral de modo que las proteínas y otros factores del crecimiento se vuelvan accesibles al tumor. Se ha reportado la eficacia antitumoral de amplio espectro de una forma de dosificación oral del inhibidor de la señalización de VEGF. De este modo, la inhibición de la señalización del receptor de VEGF presenta un blanco terapéutico importante. Un receptor extracelular también puede ser un blanco para la inhibición. Por ejemplo, la familia del receptor de VEGF y sus ligandos son sobreexpresados y existen como una espiga autocrina en muchos tipos de tumores. El incremento del conocimiento de la estructura y mecanismo de activación de RTK y las vías de señalización controladas por tirosina cinasas proporcionó la posibilidad del desarrollo de fármacos específicos para el blanco y nuevas terapias anticáncer. Los métodos para la prevención o intercepción de la señalización de RTK desregulada incluye el desarrollo de componentes selectivos que hacen blanco en el dominio de unión de ligando extracelular o la región de unión del sustrato intracelular . La estrategia más exitosa para matar selectivamente células tumorales es el uso de anticuerpos monoclonales (Acm) que son dirigidos contra el dominio extracelular de RTK, los cuales están implicados, de manera crítica, en el cáncer y son expresados en la superficie de células tumorales. En los años pasados, la tecnología de anticuerpos recombinantes ha experimentado un enorme progreso en el diseño, selección y producción de anticuerpos recién modificados. También es posible generar anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o biespecíficos de humano-ratón para la terapia del cáncer dirigida. Desde el punto de vista mecanístico, los Acm anti-RTK pueden funcionar bloqueando la interacción ligándoreceptor y por lo tanto inhibir la señalización de RTK inducida por el ligando e incrementar la desregulación e infernalización de RTK. Además, la unión de Acm a ciertos epítopes sobre las células cancerosas puede inducir respuestas mediadas de manera inmune, como la opsonización y lisis mediada por el complemento, y activar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo por macrófagos o células asesinas naturales . En años recientes se volvió evidente que los Acm controlan el crecimiento tumoral alterando el patrón de señalización intracelular dentro de la célula tumoral objetivo, conduciendo a la inhibición del crecimiento y/o apoptosis. Además, los anticuerpos biespecíficos pueden formar puentes con moléculas superficiales seleccionadas sobre una célula blanco con receptores sobre una célula efectora, activando de este modo respuestas citotóxicas contra la célula blanco. A pesar de la toxicidad se ha observado en ensayos clínicos de anticuerpos bioespecíficos , los avances en el diseño o modificación de los anticuerpos, caracterización de antígenos tumorales e inmunología pueden ayudar a producir anticuerpos bioespecíficos modificados racionalmente para la terapia anticáncer. Otro método prometedor para inhibir la señalización de RTK aberrante es desarrollar fármacos de molécula pequeña que interfieren selectivamente con la actividad de tirosina cinasa intrínseca y por lo tanto bloqueen la autofosforilacion y activación del receptor de transductores de señales corriente abajo. Las tirofostinas , las cuales pertenecen a las quinazolinas , son un grupo importante de esos inhibidores que compiten por el ATP por el sitio de unión de ATP por el dominio de tirosina cinasa del receptor y algunos miembros del grupo han mostrado inhibir específicamente al EGFR. Han sido desarrollados inhibidores potentes y selectivos de receptores implicados en la neovascularización y ahora están experimentando evaluación clínica. Se han desarrollado nuevas clases de inhibidores de tirosina cinasa (TKI) con mayor potencia y selectividad, mayor eficacia y mayor toxicidad in vitro e in vivo usando las ventajas del diseño de fármacos basados en la estructura, información de la estructura cristalográfica, química combinada y selección de alto rendimiento . Las inmunotoxinas recombinantes proporcionan otra posibilidad de diseño de fármacos selectivos para el blanco, las inmunotoxinas recombinantes están compuestas de una toxina de bacteria o planta fusionada o conjugada químicamente a un ligando específico, como los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del Acm o con un factor del crecimiento. Las inmunotoxinas pueden contener toxinas bacterianas, como la exotoxina A de Pseudomonas o la toxina de la difteria, o toxinas de plantas, como la ricina A o la davina. Esas moléculas recombinantes pueden matar selectivamente sus células blanco cuando se internen después de unirse a los receptores de la superficie celular de las células blanco. El uso ¦ de oligonucleótidos antisentido representa otra estrategia para inhibir la activación de proteínas cinasas receptoras (RTK) . Los oligonucleótidos antisentido son piezas cortas de ADN o ARN sintético que están diseñadas para interactuar con el ARNm para bloquear la transcripción y de este modo la expresión de las proteínas blanco. Los oligonucleótidos antisentido interactúan con el ARNm por el apareamiento de bases de atson-Crick y por lo tanto son altamente específicos para la proteína objetivo. Varios estudios preclínicos y clínicos sugieren que la terapia antisentido puede ser terapéuticamente útil para el tratamiento de tumores sólidos. El potencial de las RTK y su señalización relevante como blancos anticáncer selectivos para la intervención terapéutica ha sido reconocida. Como consecuencia, se ha desarrollado una variedad de fármacos específicos del blanco exitosos como Acm e inhibidores del RTK y actualmente están siendo evaluados en ensayos clínicos. La Tabla 3 resume los fármacos más exitosos contra la señalización de tirosina cinasa receptora que están siendo actualmente evaluados en fases clínicas o ya han sido aprobados por la FDA. Tabla 3. Fármacos de RTK Actualmente Bajo Evaluación Clínica RTK Fármaco Compañía Descripción Estado EGFR ZA18539 Iressa AstraZeneca TKI que inhibe la Fase III señalización de EGFR EGFR Cetuximab C225 ImClone Acm dirigido Fase III Systems contra EGFR EGFR Proteina de Seragen Proteína de fusión Fase III fusión EGF de toxina de la difteria-hEGFR recombinante HER2 Trastuzumab Genetech Acm dirigido Aprobado Herceptina contra HER2 por la FDA en 1998 IGF-IR INX-4437 INEX USA IGR-IR que dirigen Fase I oligonucleótidos antisentido VEGFR SU5416 SUGEN TKI que inhibe Fase II VEGFR2 VEGFR/ SU6668 SUGEN Inhibición de Fase I FGFR/ VEGFR2, FGFR y PDGFR PFGFR por RTK Las PTK no receptoras carecen de regiones transmembranales y, en su lugar, forman complejos con las regiones intracelulares de los receptores de la superficie celular. Los receptores que funcionan a través de PTK no receptoras incluyen aquellos para citocinas, hormonas (hormona del crecimiento y prolactina) y receptores específicos del antígeno sobre linfocitos T y B. Muchas de las PTK fueron identificadas primero como los productos de oncogenes mutantes en células cancerosas donde su activación no era ya objeto de controles celulares normales. En efecto, alrededor de un tercio de los oncogenes conocidos codifican para PTK, y es bien sabido que la transformación celular (oncogénesis) es con frecuencia acompañada por un incremento de la actividad de fosforilación de la tirosina. Muchos inhibidores - de la tirosina cinasa, como el flavopiridol , genistem, erbstatina, lavedustina A, estaurosporina; y UCN-01, son derivados de productos naturales . También se encuentran disponibles inhibidores dirigidos a la unión de ATP. Las señales de las RTK también pueden ser inhibidas en otros sitios blanco como las tirosinas cinasas nucleares, anclajes membranales (inhibición de la farnesilación) y factores de transcripción. La dirección del potencial de señalización de las tirosina cinasas que promueven el crecimiento como EGFR, HER2, PDGFR, src, y abl, bloqueará el crecimiento del tumor mientras que el bloqueo de IGF-I y TRK interferirá con la sobrevivencia de la célula tumoral . La inhibición de esas cinasas conducirá a una contracción del tumor y apoptosis . Las Fkl/KDR y src son cinasas necesarias para la neovascularización (angiogénesis) de tumores. La inhibición de esas cinasas detendrá el crecimiento del tumor y hará disminuir la metástasis. Los inhibidores de PTK suprimen el desarrollo del tumor previniendo la migración celular, invasión y metástasis. Esos fármacos probablemente incrementen el tiempo requerido para el progreso del tumor, y pueden inhibir o atenuar la agresividad de la enfermedad pero no pueden dar como resultado inicialmente una regresión medible del tumor. Un ejemplo del cáncer que surge de una tirosina cinasa defectuosa es una clase de linfomas positivos ALK referidos como "ALKomas" los cuales presentan la expresión inapropiada de una tirosina cinasa específica neural, cinasa de linforna anaplásico (ALK) . El Iressa (ZD1839) es -un inhibidor de EGF-R selectivo activo oralmente. Este compuesto perturba la señalización implicada en la proliferación de células cancerosas . La eficacia clínica de este agente muestra que es bien tolerado por pacientes sometidos a ensayos clínicos en la Fase I/II. El compuesto ha mostrado citotoxicidad prometedora hacia varias líneas celulares de cáncer.
Puesto que la mayoría de las proteínas cinasas son expresadas en el cerebro, con frecuencia en una forma especifica de la neurona, la fosforilación de la proteína debe jugar un papel clave en el desarrollo y función del sistema nervioso central de los vertebrados . De este modo las cinasas específicas de las neuronas están bien establecidas como blancos para el desarrollo de moduladores farmacológicamente activos . Las cinasas relacionadas con NIMA. son un grupo de proteínas cinasas que comparten identidades de secuencias de aminoácido altas con NIMA (nunca en el gen A de la mitosis) , una proteína cinasa que, en conjunto con la protelna cinasa p34Cdc2, regula la mitosis en Aspergillus nidulans. Ambas de la p34cdc2/ciclina B y NIMA han sido activadas correctamente antes de que la mitosis pueda ser iniciada en estas especies, y la p34cdc2/ciclina B juega un papel en la activación específica en la mitosis de NIMA. Además, ambas cinasas tienen que ser destruidas proteolíticamente antes de pueda ser completada la mitosis. NIMA regula la condensación mitótica de la cromatina a través de la fosforilación de la histona H3 en la serina 10. Las cinasas relacionadas con NIMA también pueden regular el ciclo celular en otros eucariotes, puesto que la expresión de NIMA puede promover eventos mitóticos en levaduras, células de rana o humanos. En ovocitos de Xenopus, NIMA induce la degradación de la vesícula germinal sin activar la cinasa Mos, CDC2 o MAP. '"En células HeLa, o versiones negativas dominantes de ???? tienen efectos adversos sobre el progreso hacia la mitosis produciendo una interrupción de G2 específica. La mutación de la treonina 199 (conservada en todas las cinasas relacionadas con NIMA) inhibió la actividad de la beta-caseína cinasa NIMA y abolió su función in vivo. Este sitio se conforma en un sitio de fosforilación de consenso mínimo para NIMA (FXXT) y es análogo al sitio de autofosforilación de las proteínas cinasas dependientes del AMP cíclico. Las mutaciones en un gen de cinasa relacionada con NIMA, Nekl, producen efectos pleiotrópicos que incluyen una enfermedad renal poliquística progresiva en ratones. Dentro de la familia de las cinasas humanas relacionadas con NIMA (Nek)-, la proteína cinasa Nek2 es la NIMA de Aspergillus nid.ula.ns conocida más cercana en relación a los mamíferos . Las dos cinasas comparten identidades de secuencias del 47% sobre sus dominios catalíticos y presentan un pico de expresión dependiente del ciclo celular similar en la transición de la fase G2 a M. Se encontró que la Nek2 recombinante se activa como serina/treonina proteína cinasa y puede experimentar autofosforilación. Tanto la Nek2 humana como la NIMA micótica se fosforilan en conjunto similar, aunque no idéntico, de proteínas y péptidos sintéticos, y se encontró que la betacaseína es un sustrato adecuado para ensayar la Nek2 in vivo. En células HeLa, la actividad de Nek2 es paralela a su abundancia, siendo baja durante las fases M y Gl pero alta durante S y G2. La Nek2 humana se localiza en el centrosoma. La sobreexpresión de la Nek2 activa induce una extraña división de los centrosomas , mientras que la expresión prolongada de la Nek activa o inactiva conduce a la dispersión del material centrosomal y pérdida de una actividad enfocada nucleante de los microtúbulos . Esos resultados indican que una función de la Nek2 humana se relaciona con el ciclo de centrosoma. La Nek3 humana fue clonada por RT-PCR. Se detectó un alto nivel de expresión de Nek3 en testículos, ovario, y cerebro, con un bajo nivel de expresión siendo detectado en la mayoría de los otros tejidos. El AR m de Nek3 fue detectado en todas las líneas celulares proliferantes estudiadas, y .la cantidad no cambió durante el ciclo celular. Al gen de la Nek3 humana se le asignó el cromosoma humano 13 por híbridos de células somáticas y 13ql4.2 por trazo del mapa híbrido por radiación. La Nek6 humana se localiza en el cromosoma humano 9q33-34, la misma región donde se localiza la NRHK1. Los transcriptos de NekS parecen ser expresados en la mayoría de los tejidos. La Nek7 humana es 77% idéntica a la Nek6 humana. El análisis filogenético sugiere la Nek6, Nek7 y F19H6.1 C. elegans constituyen una subfamilia dentro de la familia NIMA de proteínas cinasas . La expresión de Nek7 se restringió a un subconjunto de tejidos que contienen al pulmón, músculo, testículos, cerebro, corazón, hígado, leucocitos y bazo. El gen de la Nek7 humana se le asignó el cromosoma humano 1 por híbridos de células somáticas y lq31.3 por trazo del mapa híbrido por radiación. Recientemente, la Nek8 humana, una nueva cinasa relacionada con NIMA., y su sustrato candidato Bicd2 fueron aislados y clonados. La Nek8 contiene un dominio catalítico N-terminal homólogo a la familia Nek de proteínas cinasas, un dominio central con homología con RCC1 , un factor de intercambio del nucleótido guanina para la GTPasa Ran, y un dominio de espira enrollada C-terminal . Al igual que la Nek2 , la Nek8 prefiere la beta-caseína sobre otros sustratos hexógenos, tiene requerimientos bioquímicos compartidos por la actividad de cinasa, y es capaz de autofosforilarse y oligomerizarse . La actividad de la Nek8 no es regulada por el ciclo celular, pero al igual que la Nek3 , los niveles son consistentemente altos en células con G(0) interrumpidas. La Bicd2 es ' una proteína cocromatografiada con la actividad de Nek8. Esta proteína en un homólogo humano en proteína Bicaudal D de Drosofila, una proteína de espira enrollada. La Bicd2 es fosforilada por Nek8 in vitro, y las proteínas endógenas se asociación in vivo. La Bicd2 se localiza en las estructuras del citoesqueleto, y su localización subcelular depende de la morfología del microtúbulo. El tratamiento de las células con nocodazol conduce a una reorganización dramática de Bicd2, y se correlaciona con la fosforilación de Nek8. De este modo parece ser que tanto Nek8 como Bicd2 están asociadas con la dinámica de los microtúbulos independientemente del ciclo celular . En resumen, las proteínas cinasas son un blanco principal para la acción y desarrollo de fármacos. En consecuencia, es valioso para el campo del desarrollo farmacéutico identificar y caracterizar miembros previamente conocidos de proteínas cinasas. La presente invención hace avanzar el estado de la técnica proporcionando una proteína cinasa humana no identificada anteriormente que tiene similitudes de secuencia y estructura con el dominio catalítico de las proteínas cinasas. Específicamente, el dominio de cinasa en la NRHK1 comparte altas identidades de secuencia con los dominios correspondientes en la serina/treonina cinasas, pcinasas y una familia de tirosina cinasas. El dominio de cinasa en RHK1 está también relacionado distantemente con las secuencias de cinasas relacionadas con NIMA. Estudios funcionales en diversas especies han implicado a la cinasa relacionada con NIMA en el progreso de G(2)/M, condensación de cromatina y regulación del centrosoma. El dominio de cinasa en NRHK1, ya sea en su forma nativa o en una forma mutantey puede ser usada para efectuar la función del dominio correspondiente en otras cinasas. Este dominio también puede ser usado para fosforilar sustratos adecuados. Los péptidos del sustrato pueden ser conjugados con anticuerpos, y los grupos fosfatos agregados a los péptidos del sustrato pueden ser marcados radiactivamente o de manera fluorescente. Los anticuerpos asi marcados pueden ser usados en varios ensayos de detección, como es apreciado por un experto en la técnica. El gen de RHK1 y el producto del gen puede ser usado como un marcador molecular para diagnosticar, pronosticar y verificar el tratamiento de trastornos relacionados con la expresión aberrante de RHK1. Además, el gen de RHK1 puede ser usado para seleccionar agentes o fármacos potenciales capaces de mejorar o inhibir la expresión del gen NRHK1 en células humanas . Los productos del gen de RHK1 (polinucleótidos o polipéptidos) pueden ser usados para seleccionar agentes o fármacos potenciales capaces de mejorar o inhibir la actividad de NRHK1. Además, pueden ser diseñados varios métodos terapéuticos para tratar trastornos relacionados con la expresión aberrante de RHK1 sobre la base del gen de RHK1 , sus variantes, o los agentes/f rmacos que afectan la expresión del gen de NRHK1 o la actividad de los productos del gen de NRHK1. Las siguientes subsecciones ilustran ejemplos de las utilidades del gen de NRHKl humano y la cinasa NRHK1. Varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la presente invención se volverán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la presente descripción. Polinucleótidos y variantes de los mismos Un aspecto de la invención pertenece a sondas polinucleotídicas aisladas capaces de hibridarse al gen de NRHKl o sus transcriptos, como ARNm de NRHKl. Esas sondas pueden ser usadas para detectar el nivel de expresión del gen de NRHKl en tejidos o células humanas. La presente invención también contempla fragmentos polinucleotídicos para usarse como cebadores de PCR para la amplificación o mutación del gen de NRHKl o las secuencias que codifican para la cinasa NRHKl. Otro aspecto de la invención pertenece a polinucleótidos aislados que codifican para NRHKl, o un fragmento o mutante del mismo. Esos polinucleótidos pueden ser usados para expresar NRHKl, un fragmento o mutante de la misma. Los productos de la proteina asi expresados pueden ser usados para seleccionar agente/fármacos que modulen una actividad de la NRHKl. Además, esos polinucleótidos pueden ser usados para diseñar vectores de terapia genética que dirijan la expresión del gen de NRHKl o una actividad del NRHKl en humanos. Un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 puede ser preparado usando técnicas de biología molecular estándar como es apreciado por un experto en la técnica. Por ejemplo, pueden ser usado cebadores derivados de los extremos 5' y 3' de la SEQ ID NO: 1 para amplificar los ARNm aislados de tejidos humanos. El ADNc así producido contiene la SEQ ID NO: 1. De igual modo, los cebadores para amplificar la secuencia genómica humana que contiene la SEQ ID NO: 3 puede ser diseñada y usada para preparar la secuencia genómica del gen de NRHK1. Una variante (como un homologo) o un fragmento de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 puede ser preparado de manera similar. De manera alternativa, pueden ser diseñadas sondas para seleccionar bibliotecas de secuencias de ADNc o genómico para identificar moléculas polinucleotídicas que comprendan la longitud completa o fragmento de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. Las moléculas así identificadas pueden ser usadas para crear vectores adecuados que comprendan la longitud completa de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. Los polinucleótidos capaces de hib idarse al gen de NRHK1 pueden ser preparados por técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado. Preferiblemente, las sondas polinucleotídicas pueden hibridarse al gen de NRHK1 bajo condiciones de rigurosidad reducida, condiciones rigurosas, condiciones altamente rigurosas. En una modalidad, los polinucleótidos comprende al menos 15, 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1. Puede ser usado cualquier fragmento de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3 como sondas de hibridación y cebadores de PCR para el gen de NRHKl o sus transcriptos . Las sondas/cebadores pueden ser purificados de manera sustancial . En una modalidad preferida, la sonda de hibridación para el gen de NRHKl comprende un grupo marca. El grupo marca puede ser un radio isótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima. Las sondas así marcadas pueden ser usadas como parte de un equipo de diagnóstico para determinar el nivel de expresión del gen de NRHKl en tejidos humanos . Esta invención abarca homólogos del gen de NRHKl humano en otras especies . Esos homólogos pueden ser determinados buscando en diferentes bases de datos de secuencias, como las bases de datos de secuencias Entrez/GenBank mantenidas por el NCBI . La invención también abarca moléculas polinucleotídicas las cuales son estructuralmente diferentes de las moléculas descritas anteriormen e, pero que tienen las mismas propiedades sustanciales que las moléculas descritas anteriormente. Esas moléculas incluyen variantes alélicas, las cuales serán descritas más adelante con mayor detalle. Existe polimorfismo en la secuencia de ADN en el gen de la NRHKl humana entre diferentes individuos debido a las variaciones alélicas naturales. Por lo tanto existe un grupo de genes los cuales se ocurren alternativamente en un sitio genético dado. También existen polimorfismos del ADN que afectan el nivel de expresión del ARN del gen de NRHK1, por ejemplo, a través de afectar la regulación o degradación de la expresión del gen. La presente invención contempla todas las variantes alélicas de gen de NRHK1 humano. Las variantes alélicas y otros homólogos del gen de NRHK1 pueden ser aisladas usando sondas/cebadores derivados de la SEQ ID NO: 1 0 al SEQ ID NO : 3. Por supuesto, deberá comprenderse que la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 pueden ser modificadas. Los polinucleótidos modificados pueden comprender una o más mutaciones. Esas mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de 1, 2, 2 , 5, 10, 15, 20 o más residuos nucleotídicos en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. Pueden ser usadas técnicas estándar, como la mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, esas mutaciones crean sustituciones conservadoras de aminoácidos. De manera alternativa, las mutaciones pueden ser inducidas aleatoriamente a lo largo de todo o parte del gen de NRHK1 o su ADNc, como por mutagénesis de saturación. Después de la mutagénesis, las proteínas codificadas pueden ser expresadas de manera recombinante y sus actividades pueden ser determinadas. En una modalidad, pueden ser introducidas sustituciones nucleotídicas que conduzcan a sustituciones de aminoácidos en aminoácidos residuales "no esenciales" . Un aminoácido residual "no esencial" es un residuo que puede ser alterado sin cambiar la actividad biológica de la proteína. En contraste, un aminoácido residual "esencial" es requerido para la actividad biológica de la proteína. Los aminoácidos residuales que se encuentran conservados entre variantes alélicas u homologas del gen de NRHKl de diferentes especies preferiblemente no cambiaron en la presente invención. En consecuencia, otro aspecto de la invención pertenece a proteínas de NRHKl que contienen cambios en los aminoácidos residuales que no son esenciales para la actividad biológica de la NRHKl. Esas proteínas difieren en la secuencia de aminoácidos de la cinasa NRHKl humano original, pero retiene su actividad biológica. En una modalidad, la proteína modificada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 98% o más homólogos con la SEQ ID NO : 2. En otra modalidad, las proteínas de NRHKl contienen mutaciones en los aminoácidos residuales las cuales dan como resultado la inhibición de la actividad de NRHKl. Esas proteínas de NRHKl mutantes pueden ser usadas para inhibir la actividad de NRHKl en pacientes con trastornos relacionados con la expresión aberrante de NRHKl. Un polinucleótido de esta invención puede ser modificado adicionalmente para" incrementar su estabilidad in vivo. Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de fosforotioato o 2-o-metilo en lugar de enlaces fosfodiéster en la estructura o esqueleto; y/o la inclusión de bases no tradicionales como la inosina, queosina, y wybutosina, así como acetil- metil-, tio- y otras formas modificadas de la adenina, citidina, guanina, timina y uridina . Pueden ser preparadas moléculas polinucleotídicas que sean antisentido al gen RHK1. Un polinucleótido "antisentido" comprende una secuencia nucleotídica que es complemen aria a un polinucleótido "sentido" el cual codifica para una proteína. Un polinculeotido antisentido puede unirse vía enlaces de hidrógeno al polinculeotido sentido. Los polinucleótidos antisentido de la invención pueden ser designados de acuerdo a las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula polinucleotídica antisentido puede ser complementaria a toda la región codificadora o parte de la región codificadora del gen de HK1. La molécula polinucleotídica antisentido también puede ser complementaria a una "región no codificadora" en la hebra codificadora del gen de NRHK1. Preferiblemente, el polinucleótido antisentido es un oligonucleótido el cual es antisentido a únicamente a una porción del gen de NRHK1. Un polinucleotido antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 nucleótidos de longitud. Un polinucleotido antisentido de la invención puede ser construido usando síntesis química y reacciones ligación enzimática como es apreciado por un experto en la técnica. Por ejemplo, un polinucleotido antisentido puede ser sintetizado químicamente usando nucleótidos naturales o varios nucleótidos modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los polinucleótidos antisentido y sentido. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden ser usados para generar el polinculeótido antisentido incluyen al 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroximetil) uracilo, 5~carboximetilaminometil-2 -tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, díhidrouracilo, beta-D-galactosilquerosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5^ metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5 ' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, ácido unacil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, querosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-rtiuracilo, 4-tiuracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, 3- (3 -amino-3 -?-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina . También pueden ser usados derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. De manera alternativa, un polinucleotido antisentido puede ser producido biológicamente usando un vector de expresión en el cual un polinucleotido ha sido subclonado en una orientación antisentido (es decir, el AR transcripto del polinucleotido insertado será de una orientación antisentido al polinucleotido blanco de interés) . Los polinucleótidos antisentido de la invención pueden ser administrados a un sujeto o aplicados in situ, de modo que se hibriden o unan a los AR m celulares y/o ADN genómicos que codifican para la cinasa NRHK1, inhibiendo por lo tanto la expresión de la cinasa RHK1. La hibridación puede dar como resultado un dúplex estable vía la complementariedad nucleotídica convencional. Una ruta ejemplar para administrar los polinucleótidos antisentido incluyen la inyección directa en un sitio tisular. Los polinucleótidos antisentido también pueden ser modificados primero, y entonces administrados sistémicamente . Por ejemplo, para la administración sistémica, las moléculas antisentido pueden ser modificadas de modo que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada. Las modificaciones adecuadas incluyen enlazar los polinucleótidos antisentido a péptidos o anticuerpos que se unan a los receptores o antigenos de la superficie celular. Además, los nucleótidos antisentido pueden ser proporcionados a las células usando vectores . Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, pueden ser usados promotores fuertes pol II o pol III en los vectores. En una modalidad, los polinucleótidos antisentido son polinucleótidos a-anoméricos . Una molécula polinucleotídica -anomérica forma un híbrido de doble hebra específico con el AR complementario en el cual, contrario a las unidades ß usuales, las hebras corren paralelas entre sí. La molécula polinucleotídica antisentido también puede comprender un 2-o-metilribonucleótido o un análogo de AR -ADN quimérico. En otra modalidad, el polinculeótido antisentido es un ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa las cuales son capaces de escindir un polinucleótido de una sola hebra, como un ARNm, con el cual tiene una región de compleme tariedad. De este modo, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas cabeza de martillo descritas en Haselhoif and Gerlach Nature 334:585-591, 1988) pueden ser usadas para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm de NRHK1 para inhibir su expresión. Una ribozima que tiene especificidad por el gen de NRHK1 o sus transcriptos puede ser diseñada sobre la base de la SEQ ID NO: 1 ó 3. Los ARNm transcritos del gen de NRHKl pueden ser usados para seleccionar un conjunto de moléculas de ARN un ARN catalítico que tenga actividad de ribonucleasa específica. De manera alternativa, la expresión del gen de NRHKl puede ser inhibida usando la complementariedad de secuencias nucleotídicas con la región reguladora (por ejemplo, el promotor y/o mej oradores) . Esas secuencias nucleotídicas pueden formar estructuras helicoidales triples que prevengan la transcripción del gen en las células blanco. La expresión del gen de NRHKl también puede ser inhibida usando ARN de interferencia ("ARNi"). El ARNi es un fenómeno en el cual la introducción del ARN de doble hebra (ARNdh) en ciertos organismo o tipos de células produce la degradación del ARNm homólogo . Descubierto por primera vez en el nematodo Caenorhabditis elegans, se ha encontrado desde entonces que el ARNi opera en una amplia gama de organismos. Por ejemplo, en células de mamífero, la introducción de ARNdh largo (> 30 nt) puede iniciar una respuesta antiviral potente, ejemplificada por la inhibición no específica de la síntesis de proteína y degradación de ARN. El ARN de interferencia proporciona un mecanismo de silenciamiento genético al nivel del ARNm. En años recientes, el ARNi se ha vuelto una técnica de silenciamiento específica del gen endógeno y potente que usa ARN de doble hebra (ARNdh) para marcar un transcripto particular para la degradación in vivo. También ofrece un método eficiente y ampliamente aplicable para al alteración genética. Además, la tecnología del ARNi puede ser usada para propósitos terapéuticos. Por ejemplo, el ARNi que dirige la apoptósis mediada por Fas ha mostrado proteger a los ratones contra la hepatitis fulminante. La tecnología del ARNi ha sido descrita en numerosas publicaciones, como las Patentes Estadounidenses Nos. 5,919,619, 6,506,559 y las Publicaciones PCT Nos. W099/14346, WOOl/70949, WOOl/36646, WO00/63364, WOOO/44895, WOOl/75164, WOOl/92513, WOOl/68836 y WOOl/29058. En una modalidad preferida, son usados ARN de interferencia cortos (ARNic) . Los ARNic son ARNdh que tienen 19-25 nucleótidos. Los ARNic pueden ser producidos de manera endógena por la degradación de moléculas de ARNdh más grandes por una nucleasa relacionada con la RNasa III llamada Dicer. Los ARNic también pueden ser introducidos en una célula de manera exógena o por la transcripción de un plásmido recombinante de expresión. . Una vez formados los ARNic se montan con los componentes de la protelna en complejos que contienen endorribonucleasa conocidos como complejos silenciadores inducidos por ARN (RISC) . Un desenrollamiento generado por ATP del ARNic activa los RISC, los cuales a su vez dirigen al transcripto de ARNm de complementariedad por apareamiento de bases de Watson-Crick, escindiendo y destruyendo por lo tanto al ARNm. La escisión del ARNm toma lugar cerca de la parte media 'de la región unida por la hebra del ARNic . Esta degradación del ARNm específico de la secuencia da como resultado el silenciamiento del gen. Pueden ser empleadas al menos dos formas para lograr el silenciamiento del gen mediado por ARNic. Primero, los ARNic pueden ser sintetizados in vitro e introducidos en células para suprimir de manera transitoria la expresión del gen. ARNic sintético proporciona una forma fácil y eficiente de lograr ARNi . Los ARNic son dúplex de poligonucleótidos cortos mezclados los cuales pueden incluir, por ejemplo, 19 nucleótidos con extensiones de dos dinucleótidos 3" simétricas. Usando dúplex de ARNic de 21 bp sintéticos (19 bases de ARN seguidas por una extensión de UU o dTdT3'), puede ser logrado el silenciamiento del gen específico de la secuencia en células de mamífero. Esos ARNic pueden suprimir específicamente la traducción dirigida del gen en células del mamífero sin activación de la proteína cinasa dependiente del ADN (PKR) por ARNdh más grandes, lo cual puede dar como resultado la represión no específica de la traducción de muchas proteínas. Segundo, los ARNic pueden ser expresados ín vivo de vectores . Este método puede ser usado para expresar de manera estable ARNic en células o animales transgénicos . En una modalidad, los vectores de expresión de ARNic son diseñados o modificados para dirigir la transcripción de ARNic a partir de unidades de transcripción de "polimerasa III (pol III) . Las unidades de transcripción de Pol III son adecuadas para la expresión de AR ic del rizo, puesto que presentan un sitio de terminación de la transcripción rico en AT corto que conduce a la adición de las extensiones de dos pb (UU) a los ARNic del rizo - una característica que es útil para la función del ARNic . También pueden ser usados vectores de expresión de Pol III para crear ratones transgénicos que expresen ARNic. En otra modalidad, los ARNic pueden ser expresados en una forma específica del tejido. Bajo este método, los -ARNic de doble hebra (ARNdh) son expresados primero a partir del promotor (como CMV(pol II)) en los núcleos de líneas celulares o ratones transgénicos seleccionados . Los ARNdh largos son procesados en ARNic en los núcleos (por ejemplo, por Dicer) . Los ARNic salen del núcleo y median el silenciamiento específico del gen. También puede ser usado un método similar en conjunto con promotores específicos del tejido (pol II) para crear ratones con alteraciones específicas en tejidos. Puede ser usada cualquier extensión . dinucleotídica 3', como UU, para los ARNic. En algunos casos, los residuos de G en la extensión pueden ser evitados debido al potencial de que los ARNic sean escindidos por RNasa a residuos de G de una sola hebra. Con respecto a la secuencia de ARNic en sí, se ha encontrado que los ARNic con " un contenido de 30-50% de GC pueden ser más activos que aquellos que no han contenido el G/C mayor en ciertos casos. Además, puesto que una extensión de poli (T) de 4-6 nucleótidos puede actuar como una señal de terminación para la pol III de ARN, extensiones de > 4 Ts o As en la secuencia blanco pueden ser evitadas en ciertos casos cuando se diseñen secuencias que van a ser expresadas a partir de un promotor de pol III de ARN. Además, algunas regiones del ARNm pueden estar altamente estructuradas o unidas por proteínas reguladoras. De este modo puede ser útil seleccionar los sitios blanco de ARNic en diferentes posiciones a todo lo largo de la longitud de la secuencia del gen. Finalmente, los sitios blanco potenciales pueden ser comparados con las bases de datos de genomas apropiados (humano, ratón, rata, etc.) . Cualesquier secuencias blanco con más de 16-17 pares de bases contiguos de homología u otras secuencias codificadoras pueden ser eliminadas por consideración en ciertos casos. En una modalidad, el ARNic puede ser diseñado de modo que tenga dos repeticiones invertidas separadas por una secuencia separadora corta y finalizar con una cadena de Ts que sirva como sitio de terminación de la transcripción. Este diseño produce un transcripto de ARN que según se predijo se plegará a un ARNic . La selección de la secuencia blanco de ARNic, la longitud de las repeticiones invertidas que codifican para el tallo de un rizo putativo, el orden de las repeticiones invertidas, la 'longitud y composición de la secuencia separadora que codifica para la espira del rizo, y la presencia o ausencia de extensiones 5' , puede variar para lograr resultados deseables. Los blancos de ARNic pueden ser seleccionados explorando la secuencia de AR m por dinucleótidos de AA y registrando los 19 nucleotidos inmediatamente corriente debajo de AA. También pueden ser usados otros métodos para seleccionar blancos de ARNic. En un ejemplo, la selección de la secuencia blanco de ARNic es determinada de manera puramente empírica (véase por ejemplo, Sui et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520, 2002), en tanto que la secuencia blanco comienza con GG y no comparte una homología de secuencia significativa con otros genes analizados por búsqueda BLAST. En otro ejemplo, se empleo un método más elaborado para seleccionar la secuencia blanco de ARNic. Este procedimiento explota una observación de que cualquier sitio accesible en el ARNm endógeno puede ser dirigido para la degradación por método de oligodesoxirribonucléotido sintético/RNasa H (Lee et al., Nature Biotechnology 20:500-505, 2002} . En otra modalidad, se construyó el cásete de expresión del ARNic del rizo de modo que tuviera la hebra sentido del blanco, seguida por un separador corto, la hebra antisentido del blanco, y el 5-6 Ts como terminador de la transcripción. El orden de las hebras sentido y antisentido dentro de los cuales los plásmidos recombinantes de expresión de ARNic pueden ser alterados sin afectar las actividades silenciadoras del gen del AR ic de rizo. En ciertos casos, la reversión del orden puede producir la reducción parcial de las actividades silenciadoras del gen. La longitud de la secuencia nucleotídica que sea usada en el tallo del cásete de expresión de la ARNic puede fluctuar, por ejemplo, de 19 a 29. El tamaño de la espira puede fluctuar de 3 a 23 nucleótidos. También pueden ser usadas otras longitudes y/o tamaños de espira. En otra modalidad más, puede ser usada una extensión 5' en el constructo del ARNic del rizo, siempre que el ARNic del rizo sea funcional en el silenciamiento del gen. En un ejemplo específico, la extensión 5' incluye aproximadamente 6 residuos nucleotídicos . En una modalidad preferida, la secuencia blanco del ARNi es un fragmento de secuencia del 21-mer seleccionado de la SEQ ID NO : 1. El extremo 5' de la secuencia blanco tiene el dinucleótido "NA", donde "N" puede ser cualquier base y "A" representa adenina. La secuencia 19-mer restante tiene un contenido de GC de entre 45% y 55%. Además, la secuencia 19-mer restante no incluye (1) ninguna 3 bases idénticas consecutivas (es decir, GGG, CCC, TTT, o AAA) ; (2) siete "GC" en un papel; y (3) cualesquier secuencias palindrómicas con 5 o más bases. Además, la secuencia blanco tiene una homología de secuencia baja con otros genes humanos. En un ejemplo específico, las secuencias blanco potenciales son buscadas por BLASTN contra la base de datos de secuencias agrupadas UniGen humanas del NCBI . La base de datos UniGen humanas contiene conjuntos no redundantes de grupos orientados por genes. Cada grupo UniGen incluye secuencias que representan un gen único. Los fragmentos de la SEQ ID N0:1 que no producen ningún acierto u otros genes humanos bajo la búsqueda con BLASTN son seleccionados como las secuencias candidatas preferidas para el ARNi. Durante la búsqueda, el valor de e puede ser fijado como un valor riguroso (como "1") . La Tabla 4 enlista las secuencias blanco del gen de NRHK1 ejemplares para el ARNi preparado usando los criterios descritos anteriormente. También se describe la secuencia de ARNi para cada secuencia blanco (la hebra sentido y la hebra antisentido) . Además, se identifica la ubicación del extremo 5' de cada secuencia blanco en la SEQ ID NO : 1 ("Extremo 5'") .
Tabla 4. Secuencias blanco de ARNi ejemplares del gen de RHK 1 y los ARNic correspondientes En otra modalidad más, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser modificados en la porción base, porción del azúcar o esqueleto de fosfato para mejorar la estabilidad, hibridación o solubilidad de las moléculas. Por ejemplo, el esqueleto de fosfato de desoxirribosa de la molécula polinucleotidica puede ser modificado para generar polinucleótidos peptidicos (véase- Hyrup B. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:523, 1996). Como se usan aqui, los términos "polinucleótidos pepetidicos" o "PNA" se refieren a imitadores polinucleotidicos, por ejemplo, imitadores de ADN, en los cuales el esqueleto de fosfato desoxirribosa está reemplazado por un esqueleto pseudopeptidico y únicamente las cuatro nucleobases naturales" son retenidas. El esqueleto neutro de los PNA ha mostrado permitir la hibridación específica a ADN y ARN bajo condiciones de fuerza iónica baja. Los oligómeros de PNA pueden ser sintetizados usando protocolos de síntesis peptídica en fase sólido o estándar. Los PNA pueden ser usados en aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. Por ejemplo, los PNA pueden ser usados como agentes antisentido para la modulación específica de la secuencia de la expresión del gen de NRHK1. Los PNA también pueden ser usados en el análisis de mutaciones de pares de bases únicas en un gen, (por ejemplo, sujeción de PC dirigida por PNA) ; como enzimas de restricción artificiales cuando se usan en combinación con otras enzimas, (por ejemplo nucleasas SI) ; o como sondas o cebadores para el secuenciamiento o hibridación de ADN. En una modalidad., los PNA pueden ser modificados para mejorar su estabilidad o absorción celular uniendo grupos lipofílicos u otros auxiliares a los PNA, por la formación de quimeras de PNA-ADN, o por el uso de liposomas u otras técnicas de liberación de fármacos conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse quimeras de PNA-ADN de polinculeótidos de la invención. Esas quimeras permiten a las enzimas el reconocimiento del ADN, como las RNasa H y ADN polimerasas, para interactuar con la porción del ADN, mientras que la porción del PNA proporciona una alta afinidad y especificidad de unión. Las 'quimeras de PNA-ADN pueden ser ligadas usando enlazantes de longitudes apropiadas que sean seleccionados sobre la base de apilamiento de bases, número de enlaces entre las nucleobases y orientaciones. Las quimeras de PNA-ADN pueden ser sintetizadas como sigue. Se sintetiza una cadena de ADN sobre un soporte sólido usando la química de acoplamiento de la fosforoamidita estándar y análogos nucleosidicos modificados . Los monómeros de PNA son entonces acoplados por pasos para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA 5' y un segmento de ADN 3' . De manera alternativa, las moléculas quiméricas pueden ser sintetizadas con un segmento de ADN 5' y un segmento de PNA 3' . En otras modalidades, los polinucleótidos de esta invención pueden incluir otros grupos anexos como péptidos (por ejemplo, para dirigir receptores de células anfitrionas in vivo) , o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular o la barrera renal sanguínea (véanse, por ejemplo, la Publicación PCT No. WO89/10134) . Además, los polinculeótidos pueden ser modificados usando agentes de escisión dirigidos por la hibridación o agentes intercalantes. Hasta este punto, los polinucleótidos pueden ser conjugados con otra molécula (por ejemplo, un péptido, un agente reticulante activado por la hibridación, agente de transporte o agente de escisión activado por la hibridación) . Además, el polinucleótido puede ser marcado de manera detectable.
Polipéptidos y Variantes de los Mismos Varios aspectos de la invención pertenecen a polipéptidos de RHK1 aislados y polipéptidos de NRHK1 imitantes capaces de inhibir la actividad normal de NRHK1. La presente invención también contempla fragmentos polipeptídicos inmunogenicos adecuados para producir anticuerpos anti-NRHKl. En una modalidad, los polipéptidos de NRH 1 nativos pueden ser aislados de fuentes celulares o tisulares usando técnicas de purificación de proteínas estándar. Los métodos de purificación estándar incluyen a la electroforesis , técnicas moleculares, inmunológicas y cromatográficas . Los ejemplos específicos incluyen a la cromatografía de intercambio iónico, hidrofóbica, de afinidad o CLAP en fase inversa, y cromatoenfoque . En una modalidad, los polipéptidos de NRHK1 son purificados usando una columna de afinidad estándar acoplada con anticuerpos anti-NHKl. También pueden ser usadas técnicas de ultrafiltración y diafiltración. El grado de purificación depende del propósito del uso de los polipéptidos de RHK1. En algunos casos, no es necesaria la purificación. En otra modalidad, los polipéptidos de NRHK1 o polipéptidos de NRHK1 mutantes capaces de inhibir la actividad normal de RH 1 son producidos por técnicas de ADN recombinante . De manera alternativa la expresión recombinante, los polipéptidos de RHK1 o polipéptidos de NRHK1 mutantes pueden ser sintetizados químicamente usando técnicas de síntesis peptídica estándar. La invención proporciona polipéptidos de NRHKl codificados por el gen de NRHKl humano, u homólogos del mismo'. Los polipéptidos de la invención pueden ser sustancialmente homólogos a la cinasa NRHKl humana (SEQ ID NO: 2) . Preferiblemente, esos polipéptidos retienen la actividad biológica de la cinasa NRHKl nativa. En una modalidad, los polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos la cual es al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 98%, o más homologa a la SEQ ID NO: 2. La comparación de la secuencia y determinación del por ciento de identidad entre dos secuencia puede ser lograda usando un algoritmo matemático. El por ciento de identidad entre las secuencias de aminoácido puede ser determinado usando el algoritmo de Needleman y unsch (J. Mol. Biol . 48:444-453, 1970), o el programa GAP y el paquete de programas y sistemas de programación GCG el cual usa una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. El por ciento de identidad entre dos secuencias nucleotídicas puede ser determinado usando un programa GAP en el paquete de programas y sistemas de programación GCG, el cual usa una matriz NWSgapdna . CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de l, 2, 3, 4, 5 ó 6. El por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleotldicas también puede" ser determinado usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17, 1989) los cuales han sido incorporados en el programa ALIGN (versión 2.0), o el programa BLAST de apareo de bases disponible en el sitio de la red BLAST de NCBI . Las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas de la presente invención pueden ser usadas como secuencias interrogantes para buscar bases de datos publicas para identificar secuencias similares . La búsqueda puede ser conducida usando los programas BLAST, como BLAST para proteínas, BLAST para nucleótidos, BLAST para pares bases, BLAST genómico, que se encuentran disponibles en el sitio en la red BLAST mantenido por la NCBI. Cuando se usan los programas BLAST, también pueden ser usados los parámetros predeterminados de los programas respectivos . La invención proporciona además polipéptidos de NRHK1 quiméricos o de fusión. Un polipéptido de NRHK1 de fusión contiene el polipéptido relacionado con NRHK1 y un polipéptido no NRHK1. Los polipéptidos .relacionados con NRHKl incluyen toda o una porción de la SEQ ID NO: 2 o su variante. Puede ser empleada una secuencia enlazante peptidica para separar el polipéptido relacionado con NRHK1 de los componentes polipeptídicos no NRHK1 por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundaria y terciaria nativas. Esa secuencia enlazante peptldica es incorporada en la proteína de fusión usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Las secuencias enlazantes peptídicas estándar pueden ser elegidas sobre la base de los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera interactuar con epítopes funcionales sobre el polipéptido relacionado con NHK1 y un polipéptido no NRHK1; y (3) la ausencia de residuos hidrofóbicos o cargados que pueden reaccionar con los epítopes funcionales del polipéptido. Las secuencias enlazantes polipeptídicas preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. Pueden ser usados otros aminoácidos casi neutros, como Thr y Ala en la secuencia enlazante. Las secuencias de aminoácidos adecuadas como enlazantes incluyen aquellas descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al.., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 83:8258-8262, 1986; Patente Estadounidense No. 4,935,233 y Patente Estadounidense No. 4,751,180. Las secuencias enlazantes pueden ser de 1 hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. No se requieren secuencias enlazantes cuando el polipéptido relacionado con NRHK1 o el polipéptido no NRHK1 no tiene regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que pueden ser usadas para separar los dominios funcionales respectivos y por lo tanto prevenir la interferencia esférica.
En una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-NRHK1 en la cual una secuencia relacionada con NRHKl, como la SEQ ID NO: 2, está fusionada al C-terminal de la secuencia de GST. Esta proteína de fusión puede facilitar la purificación de la NRHKl recombinante . Las proteínas de fusión de NRHKl de la invención pueden ser incorporadas en composiciones farmacéuticas y administradas a un sujeto. Las proteínas de fusión de NRHKl pueden ser usadas para afectar la biodisponibilidad de un sustrato de NRHKl. Las proteínas de fusión de NRHKl también pueden ser usadas para el tratamiento o prevención de los daños causados por (i) modificación aberrante o mutación de la NRHKl, o (ii) modificación postraslacional aberrante de la NRHKl . También es concebible que pueda ser usada una proteína de fusión que contenga un polipéptido de NRHKl normal o mutante, o un fragmento del mismo, para inhibir la actividad de NRHKl en un sujeto humano. Además, las proteínas de fusión de NRHKl pueden ser usadas como inmunogenos paira producir anticuerpos anti-NRHKl. Ellas también pueden ser usadas para purificar ligandos de NRHKl y para seleccionar moléculas - capaces de inhibir la interacción entre NRHKl y sus sustratos . Preferiblemente, las proteínas quiméricas o de fusión de NRHKl de la invención son producidas usando técnicas de ADN recombinante estándar. Son usados vectores de expresión comercialmente disponibles que" codifiquen para una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST) . Puede ser usada una secuencia señal para facilitar la secreción y aislamiento de la proteína secretada u otras proteínas de interés. La secuencia señal se caracteriza típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrofóbicos los cuales son generalmente escindidos de la proteína madura. Esos péptidos señales contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia señal de las proteínas maduras cuando pasan a través de la vía secretora. La presente invención abarca polipéptidos de NRHKl que tienen una secuencia señal, las secuencias polinculeotídicas que codifican para los mismos. La presente invención también pertenece a mutantes de NRHKl que funcionan como antagonistas para NRHKl. En una modalidad, los antagonistas de NRHKl son usados como agentes terapéuticos. Por ejemplo, un mutante de NRHKl que forma un dímero no funcional con una NRHKl tipo extendida (el llamado mutante negativo dominante) hace disminuir la actividad de NRHKl y puede aliviar enfermedades en un sujeto donde la NRHKl esté anormalmente incrementada en nivel o actividad. Los mutantes de NRHKl negativas dominantes pueden ser generados usando mutagénesis, como es apreciado por un experto en la técnica . Los mutantes de NRHKl que funcionan como agonistas o antagonistas de NRHKl pueden ser identificados por la selección de bibliotecas combinadas de mutantes. Puede ser producida una biblioteca diferenciada de mutantes de NRHKl, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias genéticas de modo que un conjunto degenerado de secuencia de NRHKl potenciales sean expresables como polipéptidos individuales o, de manera alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes que contenga el conjunto de secuencias de NRHKl de la presente. Existen una variedad de métodos los cuales pueden ser usados para producir bibliotecas de mutantes potenciales de NRHKl a partir de una secuencia oligonucleotídicá degenerada. Una secuencia genética degenerada puede ser sintetizada químicamente usando un sintetizador de ADN automático. El gen sintético puede entonces ser ligado en un vector de expresión apropiado. En una modalidad, una biblioteca de secuencias codificadoras puede ser generada usando nucleasas . Por ejemplo, los fragmentos de PCR de doble hebra de la secuencia codificadora de NRHKl pueden ser tratados por una nucleasa que produzca aproximadamente una muestra por molécula. Los ADN de doble hebra son entonces sometidos a un ciclo de desnaturalización y renaturalización. Los ADN recién formados nuevamente, los cuales pueden incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos cortados, son tratados con nucleasa SI para' remover porciones de una sola hebra. Usando este método, puede ser derivada una biblioteca de expresión que codifique para fragmentos N-terminal, C-terminal o interno de NRHK1. Además, la mutagénesis de montaje recursivo (REM) , una técnica que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede ser usada para preparar mutantes de NRHK1 (Delgrave et al., Protein Engineering 6:327-331, 1993) . Los fragmentos de NRHK1, o variantes de los mismos, también pueden ser generados usando medios sintéticos, como métodos de síntesis' en fase sólida. Preferiblemente, los fragmentos sintetizados tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, o de manera preferible, menos de aproximadamente 50 aminoácidos. Anticuerpos De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, son preparados anticuerpos específicos para KRHK1 o sus variantes . Se considera que un anticuerpo se une "específicamente" a un antígeno si la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno es igual, o mayor que 105 IVT1. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales . Preferiblemente, los anticuerpos son monoclonales. De manera más preferible, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Los anticuerpos policlonales anti-NRHKl pueden ser preparados inmunizando un sujeto adecuado con NRHK1 o fragmentos de la misma. El título de anticuerpo an i-NRHKl en el sujeto inmunizado puede ser verificado con el tiempo usando técnicas estándar, como ELISA. El anticuerpo anti-NRHKl puede ser aislado del sujeto inmunizado usando técnicas bien conocidas . En una modalidad, se preparan hibridomas capaces de producir anticuerpos anti-NRHKl. La NRHK1 purificado o sus variantes, o fragmentos de la misma, son usados para inmunizar un vertebrado, como un mamífero. Los mamíferos adecuados incluyen ratones, conejos y ovejas. Preferiblemente, el fragmento usado para la inmunización comprende al menos 8 aminoácidos residuales, de manera más preferible al menos 12 aminoácidos residuales, de manera altamente preferible al menos 16 aminoácidos residuales, de manera más preferible al menos 20 aminoácidos residuales. Los fragmentos inmunogenicos (epítopes) de la NRHK1 pueden ser identificados usando técnicas bien conocidas. En general, puede ser usado cualquier fragmento de la SEQ ID NO: 2 para producir anticuerpos específicos para NRHK1. Los epítopes preferidos son regiones que se localizan sobre la superficie de NRHK1. Esas reacciones usualmente son hidrofílicas . Los esplenocitos son aislados de los vertebrados inmunizados y fusionados con una línea celular inmortalizada (como un mieloma) para formar '"hibridomas . Preferiblemente, la línea celular inmortal es derivada de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, los hibridomas murinos pueden hacerse fusionando una línea celular de ratón inmortalizada con linfocitos aislados de un ratón que sea inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas incluyen líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Las líneas celulares de mieloma adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las líneas de mieloma P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653 o Sp210-Agl4, todas las cuales se encuentran disponibles de la ATCC. En una modalidad, las líneas de .mieloma de ratón sensibles a HAT son fusionadas a esplenocitos de ratón usando polietilen glicol ("PEG") . Las células de hibridoma así producidas son seleccionadas contra medio HAT, el. cual mata células de mieloma no fusionadas o fusionadas de manera improductiva. Las células de hibridoma que producen anticuerpos anti-NRHKl monoclonales son entonces detectadas tamizando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma. Un anticuerpo monoclonal anti-NRHKl también puede ser preparado seleccionando una biblioteca de inmunoglobulina combinada recombinante (por ejemplo, una biblioteca presentadora de fases de anticuerpos) . Los equipos para generar y seleccionar bibliotecas presentadoras de fagos se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo No. 27-9400-01; y el Stratagene SurfZAPm Phage Display Kit, Catálogo No. 240612) . Los anticuerpos anti-NRH l de la presente invención también incluyen "Fv de una sola cadena" o "scFv" . Los fragmentos scFv comprenden los dominios de VH y VL de un anticuerpo. Generalmente, el polipéptido de scFv comprende además un enlazante polipeptídico entre los dominios VH y VL. El enlazante polipeptídico permite al scFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Adicionalmente, los anticuerpos anti-NRHKl recombinantes, como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, pueden ser preparados, como es apreciado por un experto en la técnica. Los anticuerpos humanizados son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab' , F(ab' )2 u otras subsecuencias de unión de antígeno de anticuerpo) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados son derivados de inmunoglobulinas humanas en las cuales los residuos que forman las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) son reemplazadas por los residuos de CDR de un anticuerpo no humano, como un anticuerpo de ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de estructura de Fv de la inmunoglobulina humana son remplazadas por residuos no humanos cor-respondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor ni en el CDR o secuencias de la estructura importadas. El anticuerpo humanizado puede comprender al menos dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones constantes son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado preferiblemente comprende al menos una porción de la región constante de inmunoglobulina (Fe) de una inmunoglobulina humana . Los anticuerpos humanizados pueden ser producidos usando ratones transgénicos que sean incapaces expresar las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina endógena pero que pueden expresar las cadenas ligera y pesada humanas . Los ratones transgénicos son inmunizados en la forma normal con .un antigeno seleccionado. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno pueden ser obtenidos usando la tecnología del hibridoma convencional . Los transgenes humanos de inmunoglobulina albergados en los ratones transgénicos se rearreglan durante la diferenciación de las células B, y posteriormente experimentan un cambio de clase y mutación somática. Usando esta técnica, pueden ser preparados anticuerpos IgG, IgA e IgE terapéuticamente útiles. Además, los anticuerpos humanizados que reconocen un epitope seleccionado pueden ser generados usando una técnica referida como "selección guiada" . En este método se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo murino, para guiar la selección de un anticuerpo humanizado que reconozca al mismo epitope. En una modalidad preferida, los anticuerpos para NRHK1 son capaces de reducir o eliminar la función biológica de NRHK1. Preferiblemente, los anticuerpos reducen al menos 25% de la actividad de RHK1. De manera más preferible, los anticuerpos reducen al menos aproximadamente el 50% de la actividad. De manera altamente preferible, los anticuerpos reducen aproximadamente 95-100% de la actividad de RHK1. Los anticuerpos anti-NRHKl pueden ser usados para aislar HK1. Los métodos adecuados incluyen la cromatografía de afinidad e inmunoprecipitación. Además, los anticuerpos anti-NRHKl pueden ser usados para evaluar el nivel de expresión de NRHK1. Los anticuerpos NRHK1 también pueden ser usados para verificar el nivel de NRHK1 como parte de un procedimiento clínico de prueba, o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento" dado. La detección puede ser facilitada por el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias en2imas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen a la peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuado incluyen a la estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen a la umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un e emplo de un material luminiscente 'incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen a la luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen al 125I, 131I, 35S o 3H. Los anticuerpos anti-N HKl también son útiles para dirigir un agente/fármaco terapéutico a una célula o tejido particular. El agente/fármaco terapéutico puede ser acoplado a un anticuerpo, ya sea de manera covalente o no covalente. Por ejemplo, un agente terapéutico puede ser acoplado a un anticuerpo vía un grupo enlazante. Un grupo enlazante puede funcionar como un grupo separador para el anticuerpo del agente para evitar la interferencia con las capacidades de unión del anticuerpo. El grupo enlazante también puede servir para incrementar la reactividad química de un sustituyente sobre el agente o el anticuerpo, y de este modo incrementar la eficiencia del acoplamiento. Puede ser empleada una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales , ya sea homo- o hetero-funcionales (como aquellos descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co . , Rockford, III.), como el grupo enlazante. El acoplamiento puede ser efectuado, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos' de carbohidratos oxidados. Existen numerosas referencias que describen esta metodología. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,671,958. Donde un agente terapéutico es más potente cuando está libre del anticuerpo, puede ser deseable usar un grupo enlazante que sea escindible durante y después de la internalización hacia la célula blanco. Han sido descritos numerosos grupos enlazantes escindibles diferentes." Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de esos grupos enlazantes incluyen la escisión por reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,489,710), por irradiación de un enlace fotolábil ¦ (por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,625,014), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivadas (por ejemplo. Patente Estadounidense No. 4,638,045), por hidrólisis mediada por el complemento en suero (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,671,958), o por hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,569,789). También puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una modalidad, son acoplados agentes múltiples a una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, son acoplados al menos dos tipos diferentes de agentes a un anticuerpo. Sin importar la modalidad particular, son preparados inmunoconjugados acoplados con más de un agente en una variedad de formas, como es apreciado por un experto en la técnica . Vectores, Vectores de Eicpresión y Vectores de Liberación de Genes Otro aspecto pertenece a vectores que contienen un polinucleótido que codifica para NRHK1 o una porción de la misma. Un tipo de vector es un "plásmido" , el cual incluye un ADN de doble hebra circular en el cual pueden ser introducidos segmentos de ADNc adicionales . Los vectores también incluyen vectores de expresión y vectores de liberación de genes. Los vectores de expresión de la presente invención comprenden un polinucleótido que codifica para NRHK1 o una porción de la misma. Los vectores de expresión también incluyen una o más secuencias reguladoras ligadas operativamente al polinucleótido que esté siendo expresado. Esas secuencias reguladoras son seleccionadas sobre la base del tipo de células anfitrionas. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión depende de factores como la elección de las células anfitrionas y los niveles de expresión deseados . La NRHK1 puede ser expresada en células bacterianas como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus) , células de levadura o células de mamífero. El vector de expresión también puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras promotoras de 11 y polimerasa de T7. La expresión de proteínas en procariotes se lleva a cabo con mayor frecuencia en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de cualesquiera de las proteínas de fusión o sin fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a una proteína codifica en ellos, usualmente al amino terminal de la proteína recombinante . Esos vectores de fusión típicamente sirven para tres propósitos: 1) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; 3) para ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. Con frecuencia, los vectores de expresión de fusión, es introducido un sitio de escisión proteolítica en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína'" recombinante de la porción de fusión después de la purificación de la proteina de fusión. Las enzimas de escisión adecuadas incluyen al factor Xa, trombina y enterocinasa . Los ejemplos de vectores de expresión de fusión incluyen al pGEX (Pharmacia Piscataway, NJ) , pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRITS (Pharmacia Piscataway, NJ) . Las proteínas de fusión purificadas pueden ser utilizadas en ensayos de actividad de NRHK1, o para generar anticuerpos específicos para NRHK1. Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli sin fusión inducibles adecuados incluyen al pTrc y pETlld. La expresión del gen blanco del vector pTrc depende de la transcripción del ARN polimerasa del anfitrión de un promotor de fusión trp-lac híbrida. La expresión del gen blanco del vector pET lid depende de la transcripción del promotor de fusión gnlO-lac T7 mediada por una ARN polimerasa viral expresada (T7 gnl) . Esta polimerasa viral es proporcionada por las cepas anfitrionas BL21(DE3) o HSLE174(DE3) de un profago residente que alberga un gen de T7 gnl bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5. Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante E. coli es expresar la proteína en bacterias anfitrionas que tengan una capacidad deteriorada para la escisión proteolítica para la proteína recombinante. Otra estrategia es alterar la secuencia polinucleotídica que codifica para la proteína de modo que los codones individuales para cada aminoácido sean aquéllos preferiblemente utilizados en E. coli En otra modalidad, el vector de expresión de RHK1 es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores de expresión de levadura incluyen pYepSecl, pMFa, pJRF88, pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) , y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA) . De manera alternativa, la RHK1 o sus variantes pueden ser expresadas en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus . Los vectores de baculovirus adecuados incluyen a la serie del pAc y la serie del pVL. En otra modalidad más, la N HK1 o su variante es expresada en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen el pCDM8 y el pMT2PC. Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son con frecuencia proporcionadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados son derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simio 40. En otra modalidad, el vector de expresión de mamífero contiene elementos reguladores específicos para el tejido. Los ejemplos de promotores específicos para el tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina específico del hígado, promotores específicos linfoides, promotores de receptores de células T e inmunoglobulinas , y promotores específicos para las neuronas (por ejemplo, promotor de neurofilamento) , promotores específicos para el páncreas, promotores específicos para la glándula mamaria (por ejemplo, promotor del suero de leche) . También son contemplados los promotores regulados de manera desarrollística los cuales incluyen, por ejemplo, el promotor de a-fetoproteína . La presente invención también proporciona un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido el cual codifica para NRHK1 pero que es clonado en el vector de expresión en una orientación antisentido. Pueden ser elegidas secuencias reguladoras que estén ligadas de manera operativa al polinucleótido orientado en dirección antisentido para dirigir la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células. Las secuencias reguladoras adecuadas incluyen promotores y/o mejoradores virales. Las secuencias reguladoras también pueden ser elegidas para dirigir la expresión específica del tejido específico del tipo de célula, constitutiva, directa, del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido, o virus atenuado en el cual los polinucleótidos antisentido sean producidos bajo el control de una región reguladora altamente eficiente.
La presente invención proporciona además vehículos para la liberación de genes para liberar polinucleótidos a mamíferos . La secuencia polinucleotídica de la invención puede ser administrada local o sistémicamente vía un vehículo de liberación de genes. La expresión del polinucleotido puede ser inducida usando promotores de mamífero endógenos o heterólogos . La expresión del polinucleotido in vivo puede ser constituida o regulada. Los vehículos para la liberación de genes preferiblemente son vectores virales, incluyendo vectores retrovirales , lentivirales, adenovirales , virales adenoasociados (AAV) , virales de herpes o alfavirus. Los vectores virales también pueden ser vectores de astrovirus, coronavirus, ortomixovirus , papovavirus, paramixovirus , parvovirus , picomavirus , poxvirus o tagovirus . La liberación de constructos para la terapia genética no se limita a los vectores virales mencionados anteriormente . También pueden ser empleados otros métodos de liberación. Esos métodos incluyen vectores de expresión de ácido nucleico, ADN condensado policatiónicamente ligado o no liado a adenovirus muertos, ADN ligado a ligando, conjugados de liposoma-ADN, cañones genéticos, radiación ionizante, neutralización de la carga nucléica, o fusión con membranas celulares. También puede ser empleado ADN puro. La eficiencia de la absorción del ADN puro puede ser mejorada usando perlas de látex biodegradables . Este método puede ser mejorado aún tratando las perlas para incrementar su hidrofobicidad. Sistemas de Expresión Regulables Otro aspecto de la presente invención pertenece al uso de sistemas de expresión regulables para expresar los polinucleótidos o polipéptidos deseables en células. Los sistemas adecuados para esta invención son descritos de manera breve a continuación: Sistema activo/inactivo de Tet. El sistema Tet se basa en dos elementos reguladores derivados del operon de resistencia a la tetraciclina del transposon TnlO de E. coli: la proteina represora de Tet (TetR) y la secuencia de ADN del operador de Tet (teto) a la cual se une TetR (Gossen et al., Science 268:1766-1769, 1995) . El sistema consiste de dos componentes, un plásmido "regulador" y uno "reportero" . El plásmido "regulador" codifica para una proteina híbrida que contiene un expresor de Tet mutante (rtetR) fusionado al dominio de activación de VP16 del virus del herpes simple. El plásmido "reportero" contiene un elemento sensible al tet (TRE) , el cual controla el gen "reportero" de elección. La proteína de fusión rtetR-VP16 puede unirse únicamente a TRE, activando por lo tanto la transcripción del gen "reportero" en presencia de tetraciclina. El sistema ha sido incorporado en un número de vectores virales incluyendo retrovirus, adenovirus y AAV. Sistema de ecdisona. El sistema de ecdisona se basa en el sistema de inducción de" muda encontrado en Drosophila, pero modificado para la expresión inducible en células de mamífero. El sistema usa un análogo de la hormona esteroidea ecdisona de Drosophila, muristerona A, para activar la expresión del gen de interés vía el receptor nuclear heterodimérico . Se ha reportado que los niveles de expresión exceden de 200 veces los niveles básales sin efecto sobre la fisiología de la célula del mamífero (No et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 93:3346-3351, 1996). Sistema de progesterona. El receptor de progesterona es estimulado normalmente para unirse a una secuencia de ADN específica y para activar la transcripción a través de una interacción con su ligando de hormona. Por el contrario, la mifepristona antagonista de la progesterona (RU486) es capaz de bloquear el transporte nuclear inducido por la hormona y la unión de ADN subsecuente. Ha sido generada una forma mutante del receptor de progesterona que puede ser estimulada para unirse a través de una interacción con RU486. Para generar un factor de transcripción regulable, específico, el dominio de unión de RU486 del receptor de progesterona ha sido fusionado al dominio de unión de ADN del factor de transcripción de levadura GAL4 y el dominio de transactivación de la proteína HSV VP16. El factor quimérico es inactivo en ausencia de RU486. La adición de la hormona, sin embargo, induce un cambio conformacional en la proteína quimérica, y este cambio permite la unión a un sitio de unión" de GAL4 y la activación de la transcripción de promotores que contienen el sitio de unión de GAL4 (Wang et al., Nat . Biotech 15:239-243, 1997). Sistema de rapamicina. Los agentes inmunosupresoras , como el FK506 y la rapamicina, actúan uniéndose a proteínas celulares específicas y facilitando su dimerización. Por ejemplo, la unión de rapamicina a la proteína de unión FK506 (FKBP) da como resultado su heterodimerización con otra proteína de unión de rapamicina FRAP, la cual puede ser invertida por la remoción del fármaco. La capacidad para poner dos proteínas juntas mediante la adición de un fármaco potencia la regulación de un número de procesos biológicos, incluyendo la transcripción. Se ha fusionado un dominio de ADN quimérico a la FKBP, lo cual permite la unión de la proteína de fusión a la secuencia de unión de ADN específica. También ha sido fusionado un dominio de activación transcripcional a FRAP. Cuando esas dos proteínas de fusión son coexpresadas en la misma célula, puede ser formado un factor de transcripción completamente funcional por la heterodimerización mediada por la adición de rapamicina. El factor de transcripción quimérico dimerizado puede entonces unirse a una secuencia promotora sintética que contenga copias de la secuencia de unión de ADN sintética. Este sistema ha sido integrado exitosamente en vectores adenovirales y de AAV. Ha sido lograda la expresión genética regulable a largo plazo en ratones y babuinos (Ye et al., Science 283:88-91, 1999) ."" Métodos de Detección Un paciente con trastornos relacionados con la expresión aberrante de NRHKl . El nivel de expresión de NRHKl puede ser usado como un indicador para detectar la presencia de enfermedades relacionadas con NRHKl en humanos. La detección y medición de la cantidad relativa del producto del gen de NRHKl puede ser llevada a cabo usando varios métodos conocidos en la técnica. Las metodologías típicas para detectar el nivel de transcripción del gen incluyen extraer ARN de una muestra de célula o tejido, hibridar una sonda marcada para el ARN extraído o derivado del mismo (ADNc o ARNc) y detectar la sonda. Los métodos adecuados incluyen la electroinmunotransferencia Northern y RCR cuantitativa o RT-PCR. La hibridación in si tu puede ser usada para detectar un nivel de transcripción del gen de NRHKl en tej idos humanos . Las metodologías típicas para detectar un polipéptido incluyen extraer proteínas de una muestra de célula o tejido, unir un anticuerpo al polipéptido objetivo y detectar el anticuerpo. Los métodos adecuados incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISAS) , electroinmunotransferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia . El anticuerpo puede ser policlonal o preferiblemente monoclonal . El anticuerpo puede ser un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo Fab o F(ab')2) · El anticuerpo puede ser marcado con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, un cofactor de enzima o un ligando detectable. Se entiende que el término "marcado", con respecto a una sonda o anticuerpo, abarque la marcación directa, a través del acoplamiento covalente, así como la marcación indirecta como la mediada por otro reactivo que sea marcado directamente. Los ejemplos de marcación indirecta incluyen la marcación de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secuendario marcado de manera luorescente, o la unión de una sonda de ADN con una biotina que pueda ser detectada, por ejemplo, por estreptavidina marcada con fluorescencia. Preferiblemente, la afinidad de unión del anticuerpo a RHK1 es de al menos 105 M-l. De manera más preferible, la afinidad de unión es de al menos 106 M-l. También pueden ser usados otros métodos como la electroforesis, cromatografía o secuenciamiento directo para detectar la cantidad de un polipéptido en una muestra biológica. Los anticuerpos anti- RHK1 también pueden ser inducidos directamente a un sujeto. El anticuerpo puede ser marcado con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en el sujeto pueda ser detectada usando técnicas de formación de imágenes estándar. En una modalidad, las copias genómicas del gen de N HK1 en el genoma de un sujeto humano puede indicar la presencia o predisposición de "una enfermedad. La detección de la presencia o número de copias del gen de NRHKl en el genoma puede ser efectuado usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Esta puede ser evaluada usando la electroinmunotransferencia Southern. Las sondas para la electroinmunotransferencia Southern pueden ser marcadas con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima. En el campo de los ensayos de diagnóstico, los métodos de detección descritos anteriormente pueden ser usados para determinar la severidad de las enfermedades relacionadas con NRHKl. Es aislada una muestra biológica de un sujeto de prueba y es evaluada la presencia, cantidad y/o actividad de NRHKl en la muestra en relación a una muestra libre de enfermedad o control. El nivel de expresión de NRHKl en la muestra biológica puede indicar la presencia o severidad de enfermedades relacionadas con NRHKl en el sujeto de prueba. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células o fluidos biológicos aislados del sujeto. Una muestra biológica preferida es una muestra de suero aislada del sujeto usando medios convencionales." Métodos de selección La presente invención también proporciona métodos para identificar moduladores de NRHKl . Los moduladores adecuados incluyen compuestos o agentes que comprenden entidades terapéuticas como péptidos, peptidomiméticos, peptoides, polinucleótidos, moléculas pequeñas u otros f rmacos. Esas entidades pueden unirse a NRHKl, o tener un efecto modulador (por ejemplo, estimulador o inhibidor) sobre la actividad de NRHKl. En una modalidad las entidades tienen efecto modulador sobre las interacciones de NRHKl con uno o más de sus sustratos naturales . Esas entidades también pueden ejercer un efecto modulador sobre la expresión de NRHKl. Los ensayos de selección de la presente invención comprenden detectar las interacciones entre los componentes de NRHKl y de prueba . Los compuestos de prueba de la presente invención pueden ser moléculas pequeñas o agentes bioactivos . En una modalidad preferida el compuesto de prueba es una molécula orgánica o inorgánica pequeña. En otra modalidad preferida, los compuestos de prueba son polipéptidos , oligopéptidos, polisacáridos, nucleótidos o polinucleótidos. De acuerdo con un aspecto de esta invención, se proporcionan métodos para seleccionar compuestos que inhiben las actividades biológicas de NRHKl. Las composiciones farmacéuticas que comprenden esos compuestos pueden ser preparadas posteriormente. El método de selección comprende (1) poner en contacto la muestra con un compuesto y (2) comparar perfil de expresión o actividad biológica de NRHKl en la muestra para determinar si el compuesto hace disminuir sustancialmente el nivel de expresión o actividades de NRHKl . El método de selección puede llevarse a cabo in vivo o in vi tro . La presente invención incluye además un método para seleccionar compuestos capaces de modular la unión entre NRHKl y un par de unión. Como se usa aquí, el término "par de unión" se refiere a un agente bioactivo que sirve como un sustrato para NRHKl, o un ligando que tiene afinidad de unión por NRHKl. El agente bioactivo puede ser seleccionado de una variedad de compuestos, proteínas, péptidos, polisacáridos , nucleótidos o polinucleótidos naturales o sintéticos. Los inhibidores de la expresión, actividad o capacidad de unión de NRHKl pueden ser usados como composiciones terapéuticas. Esos inhibidores pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas adecuadas, como se describe más adelante. La presente invención también proporciona métodos para conducir la selección de altos rendimientos para compuestos capaces de inhibir la actividad o expresión de NRHKl. En una modalidad, el método de selección de alto rendimiento implica poner en contacto compuestos de prueba con NRHKl y entonces detectar el efecto de los compuestos de prueba sobre NRHKl. Pueden ser empleados ensayos funcionales, como ensayos basados en el microfisiómetro citosensor, ensayos de flujo de calcio, (por ejemplo, FLIPR®, Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA) , o el " ensayo TUNEL, para medir la actividad celular de NRHK1. Pueden ser usadas técnicas basadas en fluorescencia para la selección de alto rendimiento o rendimiento ultra alto. Ellas incluyen, pero no se limitan a BRET® y FRET® (ambas por Packard Instrument Co., Meriden, CT) . En una modalidad preferida, los ensayos de selección de alto rendimiento usan la tecnología de resonancia del plasmon libre de marca como el proporcionado por BIACORE® systems (Biacore Internacional AB, Uppsala, Suiza) . La resonancia libre de plasmon ocurre cuando ondas plasmónicas superficiales son excitadas en una interfaz metal/líquido . Reflejando la luz dirigida desde la superficie como el resultado del contacto con una muestra, la resonancia plasmónica superficial produce un cambio en el índice de refracción en la capa superficial. El cambio del índice de refracción para un cambio dado de la concentración másica en la capa superficial es similar para muchos agentes bioactivos (incluyendo proteínas, péptidos, lípidos y polinucleotidos) , y puesto que la superficie del detector BIACORE® puede ser funcionalizada para unirse a una variedad de esos agentes bioactivos, puede ser efectuada de este modo la detección de una amplia selección de compuestos de prueba. Eficacia de la Verificación de un Fármaco Durante Ensayos Clínicos Usando los métodos de detección de NRH 1 de esta invención, puede ser verificada la eficacia de un agente terapéutico para enfermedades relacionadas con NRHKl durante ensayos clínicos. El agente terapéutico puede ser un fármaco, molécula pequeña, agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido o polinucleótido . Los cambios en la expresión o actividad del gen de NRHKl en respuesta al tratamiento del agente pueden ser usados para evaluar el efecto terapéutico" del agente sobre pacientes con enfermedades relacionadas con NRHKl. Además, la expresión o la actividad de la NRHKl en respuesta al agente puede ser medida en varios puntos durante el ensayo clínico. En una modalidad preferida, el método para verificar la eficacia del agente terapéutico incluye los pasos de (i) obtener una muestra previa a la administración de un sujeto; (ii) detectar el nivel de expresión o actividad de NRHKl en la muestra previa a la administración; (iii) obtener una o más muestras posteriores a la administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de NRHKl en las muestras después de la administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de NRHKl en la muestra previa la administración con el nivel de expresión o actividad de NRHKl en las muestras después de la administración. La dosis o frecuencia de la administración del agente puede ser ajustada sobre la base de la efectividad del agente o paciente particular. Por lo tanto la expresión o actividad de NRHKl puede ser usada como un indicador de la efectividad del agente terapéutico para enfermedades relacionadas con RHK1, aún si el agente no produce una respuesta fenotípica observable . Ensayos de Pronóstico Los métodos de detección descritos aquí pueden ser usados para identificar sujetos que tengan o estén en riesgo de desarrollar enfermedades relacionadas con RHK1. Además, los métodos de detección pueden ser usados para determinar si un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, péptidomimético, proteína, péptido, polinucleótido, molécula pequeña u otro fármaco candidato) pueden ser administrados a un sujeto para tratar o prevenir efectivamente enfermedades relacionadas con NRHK1. Los perfiles de expresión de RHK1 a diferentes etapas de progreso de las enfermedades relacionadas con RHK1 pueden ser establecidas. Además, los perfiles de expresión de NRHK1 en diferentes pacientes que tienen diferentes respuestas a un tratamiento con fármaco son determinadas. Puede emerger un patrón tal que un perfil de ."expresión particular pueda ser correlacionado con un incremento en la probabilidad de un pronóstico pobre. Por lo tanto, el ensayo de pronóstico de la presente invención puede ser usada para determinar si el sujeto es sometido a un tratamiento para una enfermedad relacionada con RHK1 tiene una expectativa pobre de sobevivencia a largo plazo o progreso de la enfermedad.
Preferiblemente, el pronóstico se efectúa brevemente después del diagnóstico, como dentro de unos cuantos días después del diagnóstico. El resultado del pronóstico puede entonces ser usado para contemplar un programa de tratamiento individualizado, mejorando por lo tanto la efectividad del tratamiento asi como la probabilidad de sobrevivencia para largo plazo. El método de la invención también puede ser usado para detectar alteraciones genéticas en el gen de NRHKl, determinando por lo tanto si un sujeto con el gen alterado está en riesgo de daños caracterizados por la regulación aberrante en la actividad o expresión de NRHKl. En una modalidad preferida, el método incluye detectar la presencia o ausencia de una alteración genética que afecta la integridad del gen de NRHKl, o detectar la expresión aberrante del gen de NRHKl. La alteración genética puede ser detectada determinando la existencia de al menos una de la siguientes: 1) supresión de uno o más nucleótidos del gen de NRHKl; 2) adición de uno o más nucleótidos al gen de NRHKl; 3) sustitución de uno o más nucleótidos del gen del NRHKl; 4) un rearreglo cromosomal en el gen de NRHKl; 5) alteración en el nivel del transcripto de ARN mensajero del gen de NRHKl, 6) modificación aberrante del gen de NRHKl, 7) la presencia del patrón de empalme no natural de un transcripto de ARN mensajero del gen de NRHKl, 8) nivel de NRHKl no natural, 9) pérdida alélica de un gen de NRHKl, y 10) modificación postraslacional inapropiada de NRHKl. En una modalidad, la detección de la alteración implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (como PCR de anclaje o RACE PCR) o de manera alternativa, en una reacción en cadena de ligación (LCR) . El LCR puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen de NRHKl. Este método incluye los pasos de recolectar una muestra de un sujeto, aislar polinucleótidos (por ejemplo, ADN genómico, ARNm, o ambos) de la muestra, poner en contacto el polinucleótido con uno o más cebadores que se hibridan específicamente al gen de NRHKl o producto genético, y detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de la amplificación y comparar su longitud con un control. Debe comprenderse que la PCR y/o LCR pueden ser usadas como un paso de amplificación preliminar en conjunto con cualesquier otras técnicas descritas aquí . Los métodos de amplificación alternativos incluyen: replicacion de secuencia autosostenida (Guatelli et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 87:1874-1878, 1990), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:1173-1177, 1989), y Q-Beta Replicasa (Lizardi et al. Bio-Technology 6:1197, 1988). En otra modalidad, las mutaciones en el gen de NRHKl pueden ser identificadas usando enzimas de restricción. Las diferencias en los patrones ""de digestión de la enzima de detección indican mutaciones en el gen RHK1 o sus transcriptos. Además, pueden ser usados ribozimas específicos de la secuencia para detectar la presencia de mutaciones específicas. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,498,531. En otra modalidad más, las mutaciones genéticas en el gen NRHK1 pueden ser identificadas usando arreglos de alta densidad que contengan un gran número de sondas oligonucleotídicas . Por ejemplo, las mutaciones genéticas en el gen de NRH 1 pueden ser identificadas en dos arreglos dimensionales. En este ejemplo es usado un primer arreglo de hibridación de sondas para buscar a _ través de extensiones grandes de ADN en una muestra y un control para identificar los cambios de bases entre las dos secuencias . Este paso permite la identificación de mutaciones puntuales . Este paso es seguido por un segundo arreglo de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas usando arreglos de sondas más pequeñas y especializados que pueden ser complementarios a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada arreglo de mutación está compuesto de conjuntos de sondas paralelos, uno complementario al gen natural y el otro complementario al gen mutante. En otra modalidad más, puede ser usada cualquier reacción de secuenciamiento conocido en la técnica para secuenciar directamente el "gen de NRHK1 para detectar mutaciones. Se contempló que pueden ser utilizados cualesquier procedimientos de secuenciamiento automatizados, incluyendo el secuenciamiento por espectometría de masas . En una modalidad, es usada una protección para los agentes de escisión para detectar bases mal apareadas en heterodúplex de ARN/ARN O ARN/ADN. En general, la técnica de "escisión de un mal apareamiento" implica formar heterodúplex hibridando un AR o ADN (marcado) que contenga la secuencia del gen NRHK1 natural a un ARN o ADN potencialmente mutante obtenido de una muestra tisular. Los dúplex de doble hebra son tratados con un agente el cual escinde regiones de una sola hebra del dúplex. El agente puede ser una RNasa (para dúplex de ARN/ADN) , o nucleasa SI (para híbridos de ADN/ADN) . En un caso, los dúplex de ADN/ADN o ARN/ADN son tratados con piperidina o hidroxilamina, o piperidina y tetróxido de osmio, para digerir regiones mal apareadas. Después de la digestión, el material resultante es -separado por tamaño sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante del cual pueden ser determinados los sitios de mutación. En una modalidad preferida, la reacción de escisión del mal apareamiento emplea una o más proteína que reconocen pares de bases mal apareados en el ADN de doble hebra. Los ejemplos de esas proteínas incluyen enzimas de "reparación del mal apareamiento del ADN" . Por ejemplo, la enzima mutY de E . coli escinde malos apareamientos de A a G/A, y la timidina ADN glicolasa de células HeLa escinde malos apareamientos de T a G/T. En un caso, los ADN son preparados a partir de ARNm aislados de células de prueba. Los ADNc son entonces hibridados a una sonda derivada del gen de NRHK1. El dúplex asi formado es tratado con enzima de reparación de mal apareamiento del ADN, y los productos de la escisión, si los hay, pueden ser detectados a partir de protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,459,039. En otra modalidad, las alteraciones en la movilidad electroforéticas son usadas para identificar mutaciones en el gen de NRHK1. Las diferencias en la movilidad electroforética entre los electronucleótidos mutantes y naturales pueden ser detectadas usando el polimorfismo de conformación de una sola hebra (SSCP) . La alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de un solo cambio de base . Los fragmentos de ADN pueden ser marcados o detectados con sondas. En un caso, la sensibilidad del ensayo es mejorada usando ARN, en el cual la estructura secundaria es más sensible a -un cambio en la secuencia. En una modalidad preferida, el ensayo usa el análisis de heterodúplex para separar moléculas heterodúplex de doble hebra sobre la base de cambios en la movilidad electroforética (Keen et al . , Trends Genet 7:5, 1991) .
En otra modalidad" más, el movimiento de los fragmentos mutantes o naturales es evaluado usando la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) . Para este propósito, los fragmentos de ADN pueden ser modificados para asegurar que no se desnaturalicen completamente. Por ejemplo, puede ser agregada una pinza de GC de aproximadamente 40 pares de bases rica en GC al fragmento de ADN usando PCR. En una modalidad más, es usado un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente desnaturalizante (Rosenbaum and Reissner, Biophys Chem 265:12753, 1987). Los ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, pero no se limitan a, la hibridación oligonucleotídica selectiva, amplificación selectiva, u extensión selectiva del cebador. En una modalidad, los cebadores oligonucleotídicos para la amplificación específica contienen la mutación de interés en el centro de la molécula (de modo que la amplificación depende de la hibridación diferencial) o en el extremo 3' de un cebador donde, bajo condiciones apropiadas, el mal apareamiento puede prevenir o reducir la extensión de la polimerasa. Véase, por ejemplo, Saiki et al., Proc. Nati. Acad. Sci EUA 86:6230, 1989. Además, puede ser deseable introducir un sitio de restricción novedoso en la región de la mutación para crear la detección basada en la escisión. Los métodos descritos aqui pueden ser efectuados usando equipo de diagnóstico preempaquetados que comprenden al menos una sonda polinucleotídica o un anticuerpo de la presente invención. Los equipos pueden ser usados en instalaciones clínicas para diagnosticar sujetos que exhiban síntomas o historia familiar de una enfermedad relacionada con NRHK1. Puede ser usado cualquier tipo de célula o tejido en el que se exprese NRHK1 para propósitos de pronóstico o diagnóstico. Métodos Profilácticos Esta invención también proporciona métodos para prevenir enfermedades asociadas con la expresión o actividad NRHK1 aberrante. Los métodos comprenden administrar a un sujeto blanco un agente que modula la expresión o actividad de NRHK1. Los sujetos en riesgo de enfermedades que son causadas por o atribuidas a la expresión de o la actividad de un HK1 aberrante pueden ser identificados usando los ensayos de diagnóstico o pronóstico descritos aquí. Un agente profiláctico puede ser administrado antes de la manifestación de los síntomas de la enfermedad relacionada con NRHK1 para prevenir o retrasar las enfermedades relacionadas con RH 1. Los agentes profilácticos adecuados incluyen proteínas NRHK1 mutantes, agentes antagonistas de RHK1, o polinucleótidos antisentido de RHK1. Los métodos profilácticos de esta invención pueden ser diseñados o modificados específicamente sobre la base del conocimiento obtenido del estudio de la farmacogenómica . La farmacogenómica incluye la aplicación de tecnologías genómicas, como el secuenciamiento de genes, genética estadística y análisis de expresión de genes, a fármacos que están en desarrollo clínico o en el mercado. La farmacogenómica puede ser usada para determinar la respuesta de un sujeto a un fármaco (por ejemplo el "fenotipo de respuesta al fármaco" o "genotipo de respuesta al fármaco" de un sujeto) . De este modo, otro aspecto de la invención es proporcionar métodos para diseñar un tratamiento profiláctico o terapéutico individual usando moduladores de NRHK1 de acuerdo al genotipo de respuesta al fármaco individual. La farmacogenómica permite a un clínico o médico dirigir tratamientos profilácticos o terapéuticos a sujetos que en su mayoría se beneficiarán del tratamiento y evitar tratamientos de sujetos que experimenten efectos laterales relacionados con fármacos tóxicos . Un método farmacogenómico para identificar genes que predicen respuestas a fármacos, conocido como "asociación a lo ancho del genoma" , depende principalmente de un mapa de alta resolución del genoma humano que consiste de sitios relacionados con el gen ya conocido (por ejemplo, un mapa marcador del gen "bialélico" que consiste de 60,000-100,000 sitios polimórficos o variables sobre el genoma humano, cada uno de los cuales tiene dos variantes) . Ese mapa genético de alta resolución puede ser comparado con un mapa del genoma de cada uno de un número estadísticamente sustancial de sujetos tomando parte en un ensayo de fármaco en Fase II/III para identificar genes asociados con una respuesta a un fármaco o efecto lateral observado en particular. De manera alternativa, ese mapa de alta resolución puede ser generado a partir de una combinación de unos diez millones de polimorfismos nucleotídicos únicos (SNP) conocidos en el genoma humano. Un "SNP" es una alteración común que ocurre en una sola base nucleotídica en una extensión de ADN. Por ejemplo, un SNP puede ocurrir una vez cada 1000 bases de ADN. Un SNP puede estar implicado en un proceso de enfermedad. Sin embargo, la basta mayoría de los SNP pueden no estar relacionados con enfermedades. Dado un mapa genético basado -en la ocurrencia de los SNP, los individuos pueden ser agrupados en categorías genéticas dependiendo de un patrón particular de SNP en su genoma individual. De esta manera, pueden ser diseñados regímenes de tratamiento para grupos de individuos genéticamente similares, tomando en cuenta rasgos que pueden ser comunes entre esos individuos genéticamente similares. De este modo, el trazo del mapa del gen de NRHK1 a mapas de SNP de pacientes con enfermedades relacionadas con NRHK1 puede facilitar la identificación de genes de predicción de respuesta a f rmacos .
De manera alternativa, puede ser utilizado el "método del gen candidato" para identificar genes que predigan la respuesta a un fármaco. De acuerdo a este método, si un gen que codifica para un blanco del fármaco es conocido, todas las variantes comunes de ese gen pueden ser identificados fácilmente en la población. Entonces puede ser determinado si una respuesta a un fármaco particular está asociada con una versión del gen contra otra. La actividad de las enzimas que metabolizan fármacos es un determinante mayor o principal de la intensidad y duración de la acción del fármaco. El descubrimiento de polimorfismos genéticos de enzimas que metabolizan fármacos (por ejemplo N-acetíltransferasa 2 (??? 2) y las enzimas citocromo P450 CYP2D6 y CYPZC19) ha proporcionado una explicación de porque algunos sujetos no obtienen el efecto del fármaco esperado o muestran una respuesta exagerada al fármaco y una toxicidad seria después de tomar la dosis estándar y segura de un fármaco. Esos polimorfismos son expresados en dos fenotipos en la población, metabolizador exhaustivo y metabolizador pobre. La prevalescencía de fenotipos de metabolizador pobre es diferente entre diferentes poblaciones. Por ejemplo, el gen que codifica para CYP2D6 es altamente polimórfico y han sido identificadas varias mutaciones en metabolizadores pobres, las cuales conducen a la ausencia del CYP2D6 funcional. Estos metabolizadores pobres de CYP2D6 y CYP2C19 muy frecuentemente experimentan una respuesta al fármaco exagerada y efectos laterales cuando reciben dosis estándar. Si un metabolito es la entidad terapéutica activa, los metabolizadores pobres no muestran respuesta terapéutica. Los otros extremos son los llamados metabolizadores ultrarrápidos que no responden a dosis estándar. Recientemente, han sido identificadas las bases moleculares del metabolismo ultrarrápido que se debe a la amplificación del gen de CYP2D6. En una modalidad, el método de "perfilamiento de la expresión genética" puede ser utilizado para identificar genes que predigan la respuesta al fármaco. A este respecto, el perfil de la expresión del gen de un animal dosificado con un fármaco puede dar una indicación de si las vías genéticas relacionadas con la toxicidad han sido activadas. La información generada de los métodos farmacogenómicos anteriores puede ser usada para determinar la dosis apropiada o' el régimen de tratamiento adecuado por un individuo particular. Este conocimiento puede evitar las reacciones adversas o falla terapéutica, y por lo tanto mejorar la eficiencia terapéutica o profiláctica cuando se trate a un sujeto con un modulador de RHK1. Métodos Terapéuticos Como se describió anteriormente, la presente invención incluye métodos terapéuticos para tratar un sujeto en riesgo de, susceptible a, o" diagnosticado con enfermedades relacionadas con NRHKl . Los métodos terapéuticos pueden ser diseñados individualmente sobre la base del genotipo de respuesta al fármaco del sujeto. Típicamente, los métodos terapéuticos comprenden modular la expresión o actividad de NRHKl en el sujeto. En una modalidad, el método comprende poner en contacto una pluralidad de células en el sujeto con un agente que inhiba la expresión o actividad de NRHKl. Los agentes adecuados incluyen polinucleotidos (por ejemplo, polinucleotidos antisentido de NRHKl) , polipéptidos (por ejemplo, un mutante negativo dominante de NRHKl) , o polisacáridos , moléculas blanco naturales de la proteína NRHKl (por ejemplo, un sustrato o receptor de la proteína NRHKl) , anticuerpos anti-NRHKl, antagonistas del NRHKl, u otra molécula orgánica e inorgánica pequeña. Ellos también pueden incluir vectores que comprendan polinucleotidos que codifican inhibidores o secuencias antisentido del NRHKl. Además, los agentes pueden ser anticuerpos anti-NRHKl conjugados con entidades terapéuticas . Los agentes adecuados pueden ser identificados usando los ensayos de selección de la presente invención-. Composiciones Farmacéuticas La presente invención está dirigida además a composiciones f rmacéuticas que comprenden un modulador de NRHKl y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, se pretende que un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluya cualquiera de todos los solventes, solubilizadores, cargas, estabilizadores, aglutinantes, absorbentes, bases, agentes amortiguadores, lubricantes, vehículos de liberación controlada, diluentes, agentes emulsificantes , humectantes, lubricantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos o antif ngales , agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, administración compatible con f rmacos. El uso de esos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocida en la técnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo en las composiciones está contemplado. También pueden ser incorporados agentes suplementarios en las composiciones. Una composición farmacéutica de la invención es formulada de modo que sea compatible . con su ruta de administración pretendida. Los ejemplos " de rutas de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral - (por ejemplo, inhalación) , transdérmica (tópica) , transmucosa y rectal . Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes : un diluente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilen glicoles, glicerina; propilen glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como el alcohol bencílico y metilparabenos ; antioxídantes como el ácido ascórbico o bisulfato de sodio; agentes quelantes como el ácido etilendiamintetraacético; amortiguadores como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad como el cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, como el ácido clorhídrico o hidróxido de sodio . La preparación parenteral puede ser encerrada en ampolletas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . En todos los casos, la composición inyectable deberá ser estéril y deberá fluir en el grado hasta el grado que salga fácilmente por una jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y debe ser preservada contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos . El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glice'rol, propilen glicol, y un polietilen glicol líquido, y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, por el mantenimiento al tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensoactivos . La prevención de la acción de los microorganismos puede ser lograda por varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como el manitol , sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede ser llevada a cabo incluyendo la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas incorporando el modulador activo (por ejemplo, un anticuerpo anti-NRHKl o un modulador de la actividad de NRHKl, o un vector para terapia genética que exprese el nucleótido antisentido para NRHKl) en la cantidad requerida en un solvente apropiado, seguido por la esterilización por filtración. De manera general, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente . En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y secado por congelamiento o liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más un ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada de manera estéril del mismo. Las composiciones orales generalmente incluyen un diluente inerte o un vehículo comestible. Ellas pueden ser encerradas en cápsulas de gelatina o comprimidas en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado con excipientes y usado en forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales pueden ser preparadas usando un vehículo fluido para usarse como un lavado bucal , donde el compuesto en el vehículo fluido es aplicado oralmente y expulsado y expectorado o tragado. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden ser incluidos como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante como la celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente como el almidón o lactosa, el agente desintegrante como el ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante como el estearato de magnesio o Stertes; un deslizante como el dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante como la sacarosa o sacarina; un agente saborizante como la menta piperita, salicilato de metilo, o sabor naranja. Para la administración por inhalación, los compuestos son proporcionados en forma de un rocío de aerosol y de un recipiente o dispersante presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas como dióxido de carbono, o un nebulizador. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos . Para la administración transmucosa o transdérmica, son usados penetrantes apropiados de las barreras a ser infiltradas en la formulación. Esos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede ser efectuada a través del uso de rocíos nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos bioactivos son formulados en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como es sabido de manera general en la técnica. Los compuestos también pueden ser preparados en forma de supositorios (por ejemplo, con bases para supositorio convencionales como la manteca de cacao u otros glicéridos) o enemas de retención para liberación rectal .
En una modalidad, las entidades terapéuticas, las cuales pueden contener un compuesto bioactivo, son preparadas con vehículos que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación mxcroencapsulados . Pueden ser usados polímeros biodegradables , biocompatibles , como el acetato de etilen vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de esas formulaciones serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Los materiales también pueden ser obtenidos corriereialmente de por ejemplo Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) también pueden ser usadas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Esas pueden ser preparadas de acuerdo a métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,522,811. Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o · parenterales en una forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. Las formas unitarias de dosificación como se usan aquí incluyen unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a ser tratado; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención es dictada por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser logrado, y las limitaciones inherentes en la técnica de composición de un compuesto activo para el tratamiento de individuos . La toxicidad y eficacia terapéutica de esos compuestos puede ser determinada por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva para el 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de DL50/DE50. Los compuestos que exhiben índices terapéuticos grandes son los preferidos . Aunque pueden ser usados compuestos que exhiban efectos laterales tóxicos, debe tenerse cuidado en diseñar el sistema de liberación que dirija esos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos laterales . Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y animales de experimentación pueden ser usados para formular una gama de dosis para usarse en humanos. La dosis de esos compuestos preferiblemente se encuentra dentro de un intervalo de las concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede ser formulada en modelos animales para lograr el intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI50, (es decir, la concentración _ del compuesto de prueba que logra una inhibición media máxima de los síntomas) de acuerdo a lo determinado en el cultivo celular. Esa información puede ser usada para determinar más exactamente las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden ser medidos, por ejemplo, por cromatografía de líquidos de alto desempeño. Las composiciones farmacéuticas pueden ser incluidas en un recipiente, paquete, o distribuidor junto con las instrucciones para su administración. Equipos La invención también abarca equipos para detectar la presencia de un producto de genético de NRHK1 en una muestra biológica. Un equipo ejemplar comprende reactivos para evaluar la expresión de NRHK1 a '" nivel de ARNm o proteína. Preferiblemente, los reactivos incluyen un anticuerpo o fragmento del mismo, donde el anticuerpo o fragmento se une específicamente a NRHK1. Opcionalmente, los equipos pueden comprender una sonda polinucleotídica capaz de unirse específicamente a un transcripto de MRHK1. El equipo también puede contener medios para determinar una cantidad de proteína RHK1 o ARNm en la muestra de prueba, y/o medios para comparar la cantidad de proteína NRH 1 o ARNm en la muestra de prueba con un control o estándar. El compuesto o agente puede ser envasado en un recipiente adecuado. La invención proporciona además equipos para evaluar la estabilidad de cada uno de la pluralidad de compuestos para inhibir enfermedades relacionadas con NRHK1 en células o sujetos humanos. Esos equipos incluyen una pluralidad de compuestos a ser probados, y un reactivo (como un anticuerpo específico para proteínas NRH 1, o una sonda o cebador polinucleotídico capaz de hibridarse al gen de NRHK1) para evaluar la expresión de NRHKl . Deberá comprenderse que las modalidades descritas anteriormente se dieron a manera de ilustración, no de limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente invención se volverán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la presente descripción.
Células Hospederas Otro aspecto de la invención pertenece a células anfitrionas en las cuales es introducida una molécula polinucleotídica de la invención, por ejemplo, un gen de RH 1 u homólogo del mismo, dentro de un vector de expresión, un vector de liberación del gen, o una molécula polinucleotídica de la invención que contenga secuencias que le permitan a ésta recombinarse de manera homologa en un sitio específico del genoma de la célula anfitriona. Los términos "célula anfitriona" y "célula anfitriona recombinante" son usados de manera intercambiable aquí. Debe comprenderse que esos términos se refieren no únicamente a la célula objeto particular sino a la progenie o progenie potencial de esa célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesoras debido a mutaciones o influencias ambientales, esa progenie puede, en efecto, no ser idénticas a las células madres, pero estar incluidas dentro del alcance del término como se usa aquí . Una célula hospedera puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un gen de RHK1 puede ser expresado en células bacterianas como E. coli, células de insecto, levadura o células de mamífero (como las células de ovario de hámster Chino (CHO) , células COS, células de rata Fischer 344, células de rata HLA-B27, células HeLa, células A549 o células 293) . Otras células anfitrionas adecuadas son conocidas por aquellos expertos en la técnica. El ADN del vector puede ser introducido en las células procarióticas o eucarióticas vía técnicas de transformación o transfección convencionales . Como se usan aquí, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir polinucleótidos ajenos (por ejemplo, ADN) en una célula anfitriona, incluyendo la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DAKD-dextran, lipofección o electroporación . Para la transfección estable de células de mamífero, es sabido que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transducción usada, únicamente una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN ajeno en su genoma. Para identificar y seleccionar esos integrantes, generalmente es introducido un gen que codifica para una marca seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células anfitrionas junto con el gen de interés. Las marcas seleccionables preferidas incluyen aquellas que confieren resistencia a fármacos, como G 18, higromicina y metotrexato. Un polinucleótido que codifica para una marca seleccionable puede ser introducido en una célula anfitriona por el mismo vector que codifica para NRHK1 o puede ser introducida por un vector separado. Las células transfectadas establemente con el polinucleótido introducido pueden ser identificadas por la selección del fármaco, (por ejemplo células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán) . Una célula anfitriona de la invención, como una célula anfitriona procariótica o eucariótica en cultivo, puede ser usada para producir (es decir, expresar) NRHKl. En consecuencia, la invención proporciona además métodos para producir NRHKl usando las células anfitrionas de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula anfitriona de la invención (en la cual ha sido introducido un vector de expresión recombinante que contiene un gen de NRHKl) en un medio adecuado de modo que se produzca NRHKl . En otra modalidad, el método comprende además aislar NRHKl del medio o la célula anfitriona. Animales Transgénicos y Alterados Las células anfitrionas de la invención también pueden ser usadas para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una modalidad, una célula anfitriona de la invención es un ovocito fertilizado o una célula no diferenciada embriónica en_.la cual han sido introducidas secuencias que codifican para NRHKl. Esas células anfitrionas pueden ser usadas entonces para crear animales transgénicos no humanos en los cuales han sido introducidas secuencias exógenas que codifican para NRHKl en su genoma o animales recombinantes homólogos en los cuales las secuencias endógenas que codifican para RHK1 han sido alteradas . Esos animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de NRHK1 y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad de RHK1. Como se usa aguí, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, de manera más preferible un roedor como una rata o ratón, en el cual una o más células del animal incluyen un transgen. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios y similares. Un transgen es ADN exógeno el cual es integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo por lo tanto la expresión de un producto genético codificado en uno o más tipos celulares o tej idos del animal transgénico . Como se usa aquí, un "animal recombinante homólogo" o "animal alterado" es un animal \no humano, preferiblemente un mamífero, de manera más preferible un ratón, en el cual ha sido alterado un gen de NRHK1 endógeno por recombinación homologa entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embriónica del animal, antes de desarrollo del animal. Un animal transgénico de la invención puede ser creado introduciendo un polinucleótido que codifique para NRHK1 en el pronúcleo apareado de un ovocito fertilizado, por ejemplo, por microinyección o infección retroviral, y permitiendo que el ovocito " se desarrolle en un animal silvestre hembra pseudopreñado . Pueden ser incluidas secuencias intrónicas y señales de poliadenilación en el transgen para incrementar la eficiencia de la expresión del transgen. Una secuencia reguladora específica del te ido puede ser ligada operativamente a un transgen para dirigir la expresión de NRHK1 a células particulares . Los métodos para generar animales transgénicos vía la manipulación embriónica y microinyección, particularmente animales como ratones, se han vuelto convencionales en la técnica. Son usados métodos similares para la producción de otros animales transgénicos. Un animal fundador transgénico puede ser identificado sobre la base de la presencia de un transgen de la invención en su genoma y/o expresión del ARNm correspondiente a un gen de la invención en tej idos o células de los animales . Un animal fundador transgénico puede entonces ser usado para crear animales adicionales que contengan el transgen. Además, los animales transgénicos que contienen un trangen que codifica para NRHK1 pueden ser cruzados además con otros animales transgénicos que contengan otros transgenes. Para crear un animal recombinante homólogo (un animal alterado) , se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de la invención en el cual ha sido introducida una supresión, adición o sustitución para alterar por lo tanto, por ejemplo, perturbar la funcionalidad, del gen. El gen puede ser un gen humano, pero de manera más preferible, es un homólogo no humano de un gen humano de la invención (por ejemplo, un homólogo del gen de RHK1) . Por ejemplo, puede ser usado un gen de ratón para construir una molécula polinucleotídica de recombinación homologa, por ejemplo, un vector adecuado para alterar un gen endógeno de la invención en el genoma del ratón. En una modalidad preferida, la molécula polinucleotídica de recombinación homologa es diseñada de modo que, tras la recombinación homologa, el gen endógeno de la invención es perturbado funcionalmente (es decir, que no codifica ya para una protelna funcional; también referida como un vector "alterado"). De manera alternativa, la molécula polinucleotídica de recombinación homologa puede ser diseñada de modo que, tras la recombinación homologa, el gen endógeno mute o sea alterado de otro modo pero codifique para una protexna funcional (por ejemplo, la región reguladora corriente arriba puede ser alterada para alterar por lo tanto la expresión del gen NRHK1 endógeno) . En la molécula polinucleotídica de recombinación homologa, la porción alterada del gen de la invención está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por la secuencia polinucleotídica adicional del gen de la invención para permitir que ocurra la recombinación homologa entre el gen exógeno portado por la molécula polinucleotídica de recombinación homologa y un gen endógeno en una célula, por ejemplo, una célula no diferenciada embriónica. La secuencia polinucleotídica flanqueante adicional es de longitud suficiente para la recombinación homologa exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varias kilobases del ADN flanqueante (ambas en los extremos 5' y 3') están incluidas en la molécula polinucleotídica de recombinación homologa. La molécula polinucleotídica de recombinación homologa es introducida en las células no diferenciadas embriónicas por electroporacion. Las células en las cuales el gen introducido ha sido recombinado de manera homologa con el gen endógeno son seleccionadas . Las células seleccionadas pueden entonces ser inyectadas en blastocitos de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación. Entonces puede ser implantado un embrión quimérico en un animal silvestre hembra pseudo preñado adecuado y el embrión llevado a término. La progenie que alberga al ADN recombinado homólogamente en sus células germinales puede ser usado para criar animales en los cuales todas las células de los animales contengan el ADN recombinado homólogamente por transmisión por línea germinal del ADN recombinado de manera homologa. Los métodos para construir moléculas polinucleotídicas de recombinación homologa, por ejemplo, vectores, o animales recombinantes homólogos son bien conocidos en la técnica. En otra modalidad, pueden ser producidos animales no humanos transgénicos que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada" del transgen. Un ejemplo de ese sistema es el sistema de recombinasa cre/loxP del bacteriófago Pl . Otro ejemplo del sistema de recombinasa es el sistema de recombinasa de FLP de Saccharomyces cerevisiae (véase por ejemplo, O'Gorman et al., Science 251:1351-1355, 1991). Si es usado un sistema de recombinasa cre/loxP para regular la expresión del transgen, los animales que contienen transgenes que codifican para la recombinasa Cre y una proteína seleccionada son requeridos . Esos animales pueden ser proporcionados a través de la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, apareando dos animales transgénicos , uno que contenga un transgen que codifique para una proteína seleccionada y otro que contenga un transgen que codifique para una recombinasa. Los clones de los animales transgénicos no humanos descritos aguí también pueden ser producidos de acuerdo a los métodos descritos en Wilmut, I. et al., Nature 385:810-813, 1997, y las Publicaciones PCT Internacionales Nos. WO97/07668 y W097/07669. En breve, una célula, por ejemplo, una célula somática, del animal transgénico puede ser aislada e inducida para salir del ciclo de crecimiento y entrar en fase G0. La célula inactiva puede entonces ser fusionada, por ejemplo, a través del uso de impulsos eléctricos, con un ovocito enucleado de un animal de la misma especie del cual se aisló la célula inactiva. El ovocito reconstruido es entonces cultivado de modo que se desarrolla hasta una mórula o blastocito y entonces es transferido a animales silvestres hembra pseudo preñados . La descendencia de este animal silvestre hembra tendrá una clona del animal del cual la célula, por ejemplo, la célula somática se aisló. Ej emplos Ejemplo 1: Identificación de la secuencia de NRHK1 en bases de datos del genoma humano. La secuencia de ácido nucleico de NRHK1 se obtuvo de una linea de predicción genómica recién desarrollada. De manera breve, se recolectaron las estructuras de los cristales de rayos X en los dominios catalíticos de proteínas cinasas y se alinearon en conjunto de acuerdo a su identidad/similitudes estructurales . La alineación fue convertida en una matriz de puntaje la cual contenía al perfil estructural de los dominios catalíticos de cinasa. Esta . matriz de puntaje fue usada entonces para buscar en la base de. .datos del Genoma Humano Celera secuencias que tengan dominios catalíticos de cinasa. Ejemplo 2: Análisis BLAST Las alineaciones de secuencia entre NRHK1 y otras secuencias en la base de datos de GenBank se efectuaron usando el BLAST (blastp) para proteína-proteína estándar, BLAST (blastn) para nucleótido-nucleótido estándar, secuencias BLAST2, y programas BLAST para el genoma humano que están disponibles en el sitio de la red del BLAST NCBI's.
Una búsqueda en el" BLAST para proteína-proteína estándar en la base de datos "nr" (disponible en el sitio de la red de BLAST NCBl's) con "Filter" en un estado no verificado, "Expect" fijo en 10.0, "Word Size", fijado en 3, "Matrix" fijado en BL0SUMS2 , "Gap costs" fijado en Existencia : 11 y Extensión: 1, identificó similitudes de secuencias de aminoácidos parciales entre NRHKl y un número de proteínas. Esas proteínas incluyen, pero no se limitan a, la proteína cinasa relacionada con NIMA de Populus x canescen (número de acceso Entrez : AF469649, alineación del 28% con los aminoácidos residuales 25-285 de NRHKl) , cinasa similar a LSTK-1 de L. Esculentum (Número de acceso Entrez: AF079103, alineación del 27% con los aminoácidos residuales 25-321 de NRHKl), proteína hipotética T07A9.3 C. Elegans (número de acceso Entrez: AF03S706, alineación del 25% con los aminoácidos residuales 27-307 de NRHKl) , y cinasa 1 relacionada con ???? humana (número de acceso Entrez : XM_048605, alineación del 24% con los aminoácidos residuales 25-297 de NRHKl) . Se efectuó una búsqueda de dominios conservados dentro de la búsqueda BLAST para proteína-proteína estándar con el programa RPS-BLAST 2.2.3 [Abril-24-2002] . Los aminoácidos residuales 28-297 de NRHKl comparten una alta homología con las secuencias de consenso del dominio catalítico de SER/THR proteína cinasa (número de acceso Entrez : smart00220, alineación del 100.0%), en dominio de cinasa de pcinasa (número de acceso Entrez: pfam00069, alineación del 100.0%), y el dominio catalítico de tirosina cinasa (número de acceso Entrez: smart00219, alineación del 87.5%) . Una búsqueda BLAST para nucleótido-nucleótido estándar en la base de datos nr (disponible en el sitio en la red BLAS de NCBI) con "Filter" en estado no verificado, "Expect" fijado en 10.0, "Word Size" fijado en 3, identificó únicamente una secuencia nucleotldica : un ADNc humano putativo LOC169436 (XM_095696, SEQ ID NO: 4) que mostró homología significativa con los nucleótidos 88-174 (identidades del 100%) , 174-583 (identidades del 100%) , y 575-2403 de NRHK1 (identidades del 99%) . Una búsqueda de BLAST para el nucleótido-nucleótido estándar en la base de datos "pat" (disponible en el sitio en la red de BLAST de NCBI) con "Filter" en estado no verificado, "Expect" fijado en 10.0, "Word Size" fijado en 3, identificó similitudes de secuencia nucleotídica significativas entre -NRHKl con una proteína SGK071 similar a al proteína cinasa humana (número de acceso Entrez: AX056458, SEQ ID NOS: 5 y 6) , la cual fue descrita en la solicitud de patente PCT WOOO/73469. El análisis adicional usando el algoritmo BLAST de apareamiento reveló que NRHKl y SGK071 comparten identidades de secuencia del 84% a nivel de aminoácido (blastp, matriz: BLOSUM62 , espacio abierto: 11, extensión del espacio: 1, x_bajado: 50, expect: 10.0, tamaño de palabra: 3, filtro: no verificado) , y 90% de identidades de secuencia a nivel de nucleótido (blastn, apareamiento: 1, mal apareamiento: -2, espacio abierto: 5, extensión del espacio: 0, x_bajado: 50, expect : 10.0, tamaño de palabra: 11, filtro: no verificado) . Se llevó a cabo una búsqueda del genoma humano usando el programa blastn con Expect fijado en 0.1, Filtro fijado en predeterminado, Descripciones fijadas en 100, y Alineación fijada en 100. Se trazó el gen de NRHK1 en el sitio 9q34 del cromosoma humano 9. Específicamente, el gen RHK1 se localiza entre los genes LOC157890 y LOC57109, y se superpone con el gen LOC169436 sobre el cromosoma 9. Los 21 exones del gen de RH 1 fueron trazados a los nucleótidos 110001 a 137201 en el cromosoma humano 9 de la Base de Datos de Secuencias del Genoma Humano Entrez es mantenida por la NCBI . Los exones también fueron trazados a la base de datos genómica Celera (SEQ ID NO: 3) . Los exones/introñes en el gen NRHK1 fueron determinados usando el programa "sim4" descrito por Florea et al . en "A computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence". Genome Res. 8:967-974, 1998. Ejemplo 3: Análisis de hidrofobicidad El perfil de hidrofobicidad de la secuencia de NRHK1 (Figura 5) fue generado usando la escala de hidrofobicidad GES (Goldman, Engelman y Steitz) (Engelman, D.M., Steitz, T.A. and Goldman, A. 1986. Identifying" nonpolar transmembrane hélices in amino acid sequences of membrane proteins. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15:321-353, 1986). De manera breve, la escala de GES es usada para identificar hélices transbicapa no polares . La curva es el promedio de una escala de hidrofobicidad especifica residual sobre una ventana de 20 residuos. Cuando la línea está en la mitad superior del cuadro (positiva) , indica una región hidrofóbica y cuando está en la mitad inferior (negativa) , una región hidrofílica. En la Figura 5, el eje X representa la longitud de la proteína en aminoácidos (aa) , mientras que el eje Y representa el puntaje de GES. La línea curva muestra el patrón de GES de toda la proteína, mientras que la línea recta representa cierto corte para los dominios que abarcan la membrana potencial . El perfil de hidrofobicidad indica que la NRHK1 probablemente no es una proteína membranal. Habiendo descrito las modalidades preferidas de las composiciones, organismos y metodologías que emplean un gen humano novedoso de RHK1 (los cuales se pretende sean ilustrativas y no limitantes) , debe notarse que pueden hacerse modificaciones y variaciones por expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, debe comprenderse que pueden hacerse cambios en las modalidades particulares descritas que estén dentro del alcance de lo que se describió de acuerdo a lo definido por las reivindicaciones anexas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a ¦ la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

  1. REIVI DTCACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2. 2. El polinucleótido de con ormidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico es seleccionada del grupo que consiste de : (a) la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1 ; (b) el componente de (a) , y (c) una secuencia de ácido nucleico que difiere de (a) o (b) debido a la degeneración del código genético. 3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico es seleccionada del grupo que consiste de : (a) la secuencia de ácido nucleico, mostrada en la
  3. SEQ ID NO: 3 ; (b) el complemento de (a) , y (c) una secuencia de ácido nucleico que difiere de (a) o (b) debido a la degeneración del código genético.
  4. 4. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una variante de una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de ácido nucleico codifica para la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2 y donde la variante y la secuencia de ácido nucleico tienen una identidad de secuencia de al menos el 91%.
  5. 5. El polinucleotido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la variante y la secuencia de ácido nucleico tienen una identidad de secuencia de al menos el 95%.
  6. 6. Un polinucleotido aislado que se híbrida bajo condiciones rigurosas al polinucleótido que consiste de la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma, caracterizado porque el polinucleótido consiste de al menos 1000 ácidos nucleicos y no incluye las secuencias nucleotidicas de las SEQ ID NO: 4-5 o el complemento de las mismas .
  7. 7. Un polinucleótido aislado que se híbrida bajo condiciones rigurosas al polinucleótido que consiste de la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma, caracterizado porque el polinucleótido consiste de al menos 2000 ácidos nucleicos y codifica para una proteína cinasa .
  8. 8. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende un fragmento de SEQ ID NO: 2, donde el fragmento comprende al menos 500 aminoácidos residuales consecutivos de la SEQ ID NO: 2.
  9. 9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el fragmento consiste de la SEQ ID NO: 2.
  10. 10. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una variante del fragmento de la SEQ ID NO: 2, donde el fragmento incluye al menos 500 aminoácidos residuales consecutivos de la SEQ ID NO: 2.
  11. 11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la variante y el fragmento tienen una identidad de secuencia de al menos el 95%.
  12. 12. Un anticuerpo caracterizado porque es capaz de unirse a la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2 con una afinidad de unión no menor de 105 M"1.
  13. 13. Un equipo de detección de NRHK1, caracterizado porque comprende : (a) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12 , o (b) una sonda que se híbrida a la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma.
  14. 14. Una célula hospedera, caracterizada porque contiene el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 o una variante del mismo.
  15. 15. Un animal no humano transgénico, caracterizado porque comprende el polinucléótido de conformidad con la reivindicación 1, o una variante del mismo.
  16. 16. Un animal no humano, caracterizado porque al menos un alelo de un gen en el genoma del animal está funcionalmente perturbado, y donde el gen codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con la SEQ ID NO: 2.
  17. 17. Un método para identificar un agente capaz de unirse a la cinasa NRHK1, caracterizado porque comprende poner en contacto un agente candidato con un polipéptido que comprende : (a) una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; (b) un fragmento de la SEQ ID NO: 2, o (c) una variante de (a) o (b) ; y detectar la unión entre el agente candidato y el polipéptido .
  18. 18. Un método para identificar un agente capaz de modular el nivel de actividad de la cinasa NRHK1, caracterizado porqae comprende poner en contacto un agente candidato con un polipéptido que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, o (b) un porción biológicamente activa de la SEQ ID NO: 2; y detectar un cambio e'n el nivel de una actividad del polipéptido .
  19. 19. Una composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades relacionadas con NRHKl, caracterizada porque comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un agente que modula una actividad de NRHKl o la expresión del gen de NRHKl.
  20. 20. El uso de una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad relacionada con NRHKl en un sujeto.
  21. 21. Un polinucleótido, caracterizado porque es capaz de inhibir la expresión del gen de NRHKl humano por el ARN de interferencia.
  22. 22. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende una hebra sentido de ARNic o una hebra antisentido de ARNic seleccionada de la Tabla 4.
  23. 23. Un método, caracterizado porque comprende introducir un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21, en una célula la cual expresa el gen de NRHKl humano, inhibiendo por lo tanto la expresión en la célula por el ARN de interferencia.
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Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4489710A (en) * 1981-06-23 1984-12-25 Xoma Corporation Composition and method for transplantation therapy
ATE75483T1 (de) * 1981-10-23 1992-05-15 Molecular Biosystems Inc Oligonukleotides heilmittel und dessen herstellungsverfahren.
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4625014A (en) * 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) * 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4638045A (en) * 1985-02-19 1987-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Non-peptide polyamino acid bioerodible polymers
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5459039A (en) * 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
US5498531A (en) * 1993-09-10 1996-03-12 President And Fellows Of Harvard College Intron-mediated recombinant techniques and reagents
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AU5173400A (en) * 1999-05-28 2000-12-18 Sugen, Inc. Protein kinases
CA2429641A1 (en) * 2000-12-06 2002-06-13 Incyte Genomics, Inc. Kinases and phosphatases
EP1485474A2 (en) * 2001-12-07 2004-12-15 Incyte Genomics, Inc. Kinases and phosphatases

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