MXPA05003558A - Vacuna de adn que codifica al menos dos proteinas tempranas no estructurales de papilomavirus. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones utiles en el tratamiento y prevencion de infecciones de virus de papiloma humano. En particular, la invencion se refiere a moleculas de acido nucleico que codifican E1 y/o E2 y vectores adecuados para el suministro de vacunas de ADN, y composiciones farmaceuticas que los contienen. Tambien se contemplan metodos para la elaboracion de dichas moleculas, vectores y composiciones.

Description

VACUNA DE ADN QUE CODIFICA AL MENOS DOS PROTEÍNAS TEMPRANAS NO ESTRUCTU RALES DE PAPI LOM AVI RUS La presente invención se refiere a métodos y composiciones útiles en el tratamiento y prevención de las infecciones por los virus del papiloma humano. En particular la invención se refiere a moléculas de ácidos nucléicos que cod ifican típicamente una poliproteína basada en antígenos Tempranos de d iferentes cepas H PV, y vectores adecuados para el su ministro de vacu na de ADN , y composiciones farmacéuticas que los contienen . Los métodos para fabricar dichas moléculas , vectores y composiciones también se contemplan , como su uso en med icina.

ANTECEDENTES DE LA I NVENC IÓN El papilomavirus es altamente específico de especies y tejidos. I nfecta las células epiteliales básales y se replica y completa su ciclo vital entero dentro del núcleo de la célula . La expresión de los genes virales está estrechamente ligada a la diferenciación de las células epiteliales y el ensamblaje y la maduración de la cápsida ocurre sólo en células epiteliales plenamente d iferenciadas en las capas superiores de las células epiteliales . Los genotipos i nfecciosos de los papilomavirus hu manos presentes en las verrugas genitales se sabe q ue son o bien el genotipo 6b o bien el genotipo 1 1 . La mayoría (-90% ) de las verrugas genitales están i nfectadas con H PV6b, mientras q ue aproximadamente el 10% están infectadas con HPV11. Los genotipos infecciosos primarios presentes en las infecciones relativas al carcinoma cervical son HPV16 y 18. Las verrugas genitales humanas pueden desarrollarse en el lugar de la infección y pueden llegar a ser crónicas, persistiendo durante períodos de tiempo prolongados o, alternativamente, pueden retornar espontáneamente resolviéndose completamente sin dejar cicatrices. Los factores que disparan esta regresión son indefinidos pero se ha postulado que la respuesta celular puede estar involucrada en el proceso de resolución de la enfermedad. Los papilomavirus no son muy inmunógenos por naturaleza y durante el curso de la infección natural los anticuerpos sólo pueden darse muy tarde (durante o tras la resolución), y en una fracción de los pacientes, mientras algunos pacientes pueden resolver la enfermedad sin desarrollar anticuerpos detectables del todo. La vacunación utilizando antígenos tempranos de papilomavirus se ha estudiado ampliamente en varios modelos animales diferentes. Sin embargo, sólo hay algunos documentos que estudien la inmunización terapéutica. Por ejemplo, el ganado vacuno inmunizado terapéuticamente con un cóctel de proteínas que incluye proteínas del papilomavirus bovino (BPV) E1, E2, E4 y E7 mostró una carga reducida de enfermedad por papiloma en una proporción de animales comparada con controles. Las infecciones por papilomavirus se han observado en una variedad de especies, incluyendo ovejas, perros, conejos, monos, ganado vacuno y humanos. Los papilomavirus humanos (HPV) se han clasificado en más de 80 tipos [Epidemiology and Biology of Cervical Cáncer Seminars in Surgical Oncology, 1999, 16:203-211. Wolfang, M., Schoell M.D., Janlcek, M.F. y Mirhashemi, R.], algunos de los cuales además se dividen en subtipos (por ejemplo, los tipos 6a y 6b), basándose en la extensión de la homología de la secuencia de ADN. Los papilomavirus infectan generalmente epitelios, pero los diferentes tipos de HPV causan enfermedades diferentes. Por ejemplo, los tipos 1-4, 7, 10 y 26-29 causan verrugas benignas, los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 están asociados con cánceres cervicales y los tipos 6 y 11 están implicados en verrugas genitales (condilomas no malignos del tracto genital). El HPV ha demostrado ser difícil de crecer en cultivos de tejido, por lo que no hay ninguna vacuna viral tradicional viva o atenuada. El desarrollo de una vacuna para el HPV también se ha disminuido por la falta de un modelo animal adecuado en el cual pueda estudiarse el virus humano. Esto es porque los virus son altamente específicos de especie, de este modo es muy difícil infectar un animal con un papilomavirus de un huésped de una especie diferente, como se requeriría para probar con seguridad una vacuna antes de probarse primero en humanos. Los papilomavirus tienen un genoma de ADN el cual codifica los genes "tempranos" y "tardíos" designados de E1 a E7, L1 y L2. Las secuencias de los genes tempranos han mostrado tener funciones relativas a la replicacion y transcripción del ADN viral, la evasión del sistema inmune del huésped, y alteración del ciclo celular normal del huésped y otros procesos. Por ejemplo la proteína E1 es una ADN-helicasa dependiente de ATP, y está involucrada en la iniciación de los procesos de replicación del ADN mientras que E2 es una proteína reguladora que controla tanto la expresión de los genes virales como la replicación del ADN. A través de su capacidad para unirse tanto a E1 como al origen viral de replicación, E2 causa una concentración local de E1 en el origen, estimulando así la iniciación de la replicación del ADN viral. La proteína E4 parece tener un número de funciones escasamente definidas, pero entre éstas puede estar la unión al citoesqueleto de la célula huésped, mientras que E5 parece impedir la acidificación de los endosomas lo que da como resultado una expresión incrementada del receptor EGF en la superficie celular, y tanto E6 como E7 se conocen por unirse a las proteínas celulares p53 y pRB respectivamente. Las proteínas E6 y E7 que forman parte de los tipos de HPV asociados con el cáncer cervical son oncogenes conocidos. L1 y L2 codifican las dos proteínas estructurales (cápsida) del virus. Históricamente, las vacunas se han visto como una forma de prevenir la infección por un patógeno, estimulando al sistema inmune para reconocer el patógeno y neutralizarle si ocurriera una infección. La vacuna incluye uno o más antígenos del patógeno, comúnmente el organismo entero, o bien muerto o bien en una forma debilitada (atenuada), o péptidos antigénicos seleccionados del organismo. Cuando el sistema inmune se expone al (a los) antígeno(s), se generan células las cuales retienen una "memoria" inmunológica del (de los) antígeno(s) por el tiempo de vida del individuo. La exposición subsiguiente al mismo antigeno (por ejemplo, después de una infección por el patógeno) estimula una respuesta inmune específica la cual da como resultado la eliminación o inactivación del agente infeccioso. Hay dos armas de la respuesta inmune: una respuesta humoral (anticuerpos) y una respuesta mediada por las células. Los antígenos proteicos derivados de patógenos que se replican intracelularmente (virus y algunas bacterias) se procesan dentro de la célula huésped infectada liberando pequeños péptidos los cuales son subsecuentemente presentados en la superficie de la célula infectada en asociación con las moléculas de Histocompatibilidad de clase I principales (MCH I). Cuando este complejo asociado de MCH I y péptido se pone en contacto con las células T CD8+ específicas del antígeno la célula T se activa, adquiriendo actividad citotóxica. Estas células T citotóxicas (CTL) pueden destruir por lisinas a las células huésped infectadas, limitando así la replicación y propagación del patógeno infectante. Otro arma importante de la respuesta inmune se controla por las células T CD4 + . Cuando los antígenos derivados de patógenos se liberan dentro del medio extracelular, pueden recogerse por células especializadas presentadoras de antígeno (APCs) y presentadas sobre la superficie de estas células en asociación con las moléculas de MHC II. El reconocimiento de antígeno en estos complejos estimula a las células T CD4+ a segregar factores solubles (citoquinas) las cuales regulan los mecanismos efectores de las otras células T. El anticuerpo se produce por las células B. La unión del antígeno al anticuerpo segregado puede neutralizar la infectividad de un patógeno y la unión de un antígeno a un anticuerpo unido a membrana en la superficie de las células B estimula la división de las células B amplificando asi las respuesta de las células B. En general, las respuestas de anticuerpos buenas se requieren para el control de infecciones bacterianas y tanto las respuestas inmunes mediadas por anticuerpos como las mediadas por células (CD8+ y CD4+) se requieren para controlar infecciones por virus. Se cree que puede ser posible utilizar el sistema inmune por vacunación, incluso después de la infección por un patógeno, para controlar o resolver la infección mediante inactivación o eliminación del patógeno. Tales vacunas "terapéuticas" requerirían una respuesta mediada por células para ser efectivas, e idealmente recurrirían a ambas respuestas inmunes, la humoral y la mediada por células. Se ha demostrado (Benvenisty, N. y Reshaf, L, PNAS 83 9551-9555) que la inoculación de ratones con ADN precipitado con fosfato de calcio da como resultado la expresión de los péptidos codificados por el ADN. Subsecuentemente, la inyección intramuscular en ratones de un plásmido de ADN el cual no ha precipitado se mostró resultando en un incremento de ADN en las células musculares y en expresión de la proteína codificada. Debido a que la expresión de ADN dio como resultado la producción de las proteínas codificadas por los patógenos dentro de las células del huésped, como en una infección natural, este mecanismo puede estimular la respuesta inmune mediada por células requerida para la vacunación terapéutica. Las vacunas de ADN se describen en WO90/11092 (Vical, Inc.). La vacunación con ADN puede ser suministrada por mecanismos aparte de la inyección intramuscular. Por ejemplo, el suministro dentro de la piel toma ventaja del hecho de que los mecanismos inmunes están altamente activos en tejidos que son barreras contra la infección, tales como la piel y las membranas mucosas. El suministro en la piel puede ser vía inyección, vía inyector a propulsión (el cual fuerza a un líquido a entrar en la piel bajo presión) o vía bombardeo de partículas, en el cual el ADN puede ser recubierto en partículas de suficiente densidad para penetrar en el epitelio (Patente de EE.UU. No. 5371015). La proyección de estas partículas dentro de la piel da como resultado una transfección directa tanto de las células epidérmicas como de las células epidérmicas de Langerhan. Las células de Langerhan son células presentadoras de antígenos (APC) las cuales recogen el ADN, expresan los péptidos codificados, y procesan estos para presentarlos en las proteínas MHC de la superficie celular. Las células de Langerhan transfectadas migran hacia los nodulos linfáticos donde presentan los fragmentos de antígeno mostrados a los linfocitos, invocando una respuesta inmune. Se requieren cantidades muy pequeñas de ADN (0,5 - 1 µg) para inducir una respuesta inmune vía suministro de partículas dentro de la piel, y esto contrasta con las cantidades conocidas en miligramos de ADN que se requieren para generar respuestas inmunes subsiguientes a una inyección intramuscular directa. Se ha reportado, por ejemplo en estudios utilizando partículas similares a virus formadas a partir de las proteínas de la cápsida L1 y L2 o usando esas proteínas solas (1), que el HPV es escasamente inmunogénico. Además, los genes HPV han demostrado expresarse difícilmente en células humanas o de otros mamíferos, lo que conduce a dificultades al desarrollar vacunas con subunidades de proteínas. La proteína E1 monocistrónica ha probado ser particularmente resistente a la expresión de promotores heterólogos en células de mamíferos (J. Virology, 1999, 73, 3062-3070; Remm M., Remm A., y Mart Ustav.; Human papilloma virus type 18 E1 is translated from polycistronic mRNA by a discontinuous scanning mechanism). La expresión de E1 es detectada lo más a menudo posible usando replicación in vitro de ADN de un HPV original que contiene un plásmido como un sustituto (Lu, JZJ, Sun et al., J. Virol. 1993, 67, 7131-7139 y Del Vecchio AM et al., J. Virol. 1992, 66, 5949-5958). La solicitud de patente internacional WO 02/08435 proporciona un polinucleótido HPV en donde la secuencia se ha optimizado para parecerse a los patrones de uso de un gen humano altamente expresado. En particular, se han descrito el codón optimizado HPV6bE1 y el HPV 11 E2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona construcciones novedosas de ácidos nucleicos que son útiles en la profilaxis y más particularmente en el tratamiento de las verrugas genitales inducidas por papilomavirus, u otras secuelas Inducidas por HPV. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica para una poliproteína que contiene epítopos de al menos dos genes Tempranos distintos. Preferentemente, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica una poliproteína comprendiendo epítopos de tres antígenos Tempranos diferentes. Tales construcciones se han mostrado, por los presentes inventores, que son más eficaces en modelos animales que el procedimiento con la proteína sola.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Las construcciones preferidas incluyen ácidos nucleicos que codifican para E2 de dos genotipos diferentes de HPV, tales como HPV6b y E2 de HPV - 11. Adicionalmente, se prefiere que una secuencia codificadora de E1 esté presente. Preferentemente, la E1 es de HPV 6 u 11. La construcción preferida incluye una molécula de ácido nucleico que tiene la siguiente disposición: 1) HPV6bE1 - HPV6bE2 - HPV11E2 2) HPV6bE2 - HPV6ÓE1 - HPV11E2 3) HPV6bE2 - HPV11 E2 - HPV6bE1 Más preferentemente, toda la secuencia de ácidos nucleicos de la poliproteína anterior ha sido optimizada en el codón para parecerse al uso del codón de un gen humano altamente expresado. Preferentemente los genes E1 y E2 están sustancialmente con su longitud completa o más preferentemente con su longitud completa. Se codifica al menos el 85% y preferentemente el 90% del polipéptido E1 y E2, por medio de la longitud sustancialmente completa. Sorpresivamente, tales construcciones se expresan a los niveles equivalentes de expresión de las proteínas individuales con el codón optimizado, y tienen la ventaja de que un sólo plásmido que codifica las poliproteínas es más barato y fácil de fabricar que tres plásmidos individuales. Se prefiere que estos genes estén optimizados en el codón de tal forma que el patrón de uso del codón se parezca al de actina, un producto genético humano altamente expresado. La secuencia de polinucleótidos puede ser una secuencia de ADN, por ejemplo, una secuencia de ADN de cadena doble. Preferentemente la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido HPV de HPV tipo 6, 11, 16, 18, 33 ó 45, más preferentemente de tipo 11, subtipo 6a o subtipo 6b. En ciertas modalidades la secuencia de aminoácidos codificada es una secuencia de aminoácidos de HPV de tipo salvaje. En modalidades alternativas, la secuencia codificada de aminoácidos es una secuencia de aminoácidos de un HPV mutado, incluyendo la secuencia de tipo salvaje con cambios en los aminoácidos, por ejemplo mutaciones puntuales en los aminoácidos, suficientes para reducir o inactivar una o más de las funciones biológicas naturales del polipéptido. La secuencia de aminoácidos mutada retendrá deseablemente la inmunogenicidad del polipéptido de tipo salvaje. Las proteínas codificadas por los polinucleótídos de la invención constituyen también un aspecto de la presente invención. En el caso de E1, el papel biológico primario es iniciar la replicación de ADN específica de virus en las células infectadas. Se prefiere que E1 esté mutado para inactivar su potencial de replicación. Las mutaciones preferidas son: G 482 D K 83 G R 84 G Se incluyen preferentemente una o dos mutaciones. Se incluyen como lo más preferible tres mutaciones. En el caso de E2, este es un sitio específico de unión a proteína nuclear que funciona como el origen primario de replicación de reconocimiento de proteína y ayuda en el ensamblaje del complejo de preiniciación de la replicación. Se prefiere que la proteína E2 esté inactivada. Una mutación preferida para lograr este objetivo es la K111 A. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el patrón de uso de los codones del polinucleótido excluirá preferentemente a los codones con un valor de RSCU de menos de 0,2 en genes altamente expresados en humanos. Un valor de uso de codón relativamente sinónimo (RSCU) es el número observado de codones dividido entre el número esperado si todos los codones para ese aminoácido se usaran de forma igualmente frecuente. Un polinucleótido de la presente invención tendrá generalmente un coeficiente de uso del codón para genes humanos altamente expresados mayor de 0.3, preferentemente mayor de 0.4, y lo más preferible es que sea mayor de 0.5. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión el cual comprende y es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la invención, dicho polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene epítopos para uno o más antigenos Tempranos. El vector puede ser adecuado para dirigir la expresión del ADN heterologo en las células bacterianas, de insectos o de mamíferos, particularmente en células humanas. En una modalidad, el vector de expresión es p7313PLc. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de vacuna que incluye una proteína, o vector, o secuencia polinucleótido de la invención. Preferentemente, la composición de la vacuna incluye un vector de ADN de acuerdo con la presente invención. En las modalidades preferidas la composición de la vacuna comprende una pluralidad de partículas, preferentemente partículas de oro, recubiertas de ADN que comprende un vector que contiene una secuencia de polinucleótidos, la cual codifica un polipéptido que tiene epítopos de dos o más antígenos tempranos. En modalidades alternativas, la composición de la vacuna incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable y un vector de ADN de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención. La composición de la vacuna incluye asimismo un adyuvante. En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para fabricar una composición de vacuna que incluye la construcción de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene epítopos de uno o más antígenos tempranos y que se formula con un excipiente farmacéuticamente aceptable. También se proporciona el uso de un polinucleótido o de un vector de acuerdo con la invención, en el tratamiento o profilaxis de una infección HPV, preferentemente una infección de HPV tipo 6, 11, 16 ó 18. La invención proporciona también el uso de un polinucleótido, un vector de acuerdo con la invención, en el tratamiento o profilaxis de verrugas cutáneas (de la piel), verrugas genitales, células escamosas atipicas de importancia indeterminada (ASCUS), displasia cervical, neoplasia intraepitelial cervical (CIN) o cáncer cervical. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona también el uso de un polinucleótido o de un vector de acuerdo con la invención en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o profilaxis de una infección de HPV o cualesquiera síntomas o cualquier enfermedad asociados con ella. La presente invención también proporciona métodos de tratamiento o prevención de infecciones de HPV o de cualesquiera síntomas o enfermedades asociados con ellas incluyendo la administración de una cantidad efectiva de proteína, polinucleótido o un vector de una vacuna de acuerdo con la invención. La administración de una vacuna puede tomar la forma de una o más dosis individuales, por ejemplo en un régimen de "estímulo por cebado". En ciertos casos la vacunación "principal" puede ser vía administración de una vacuna de ADN, en particular vía administración mediada por partículas de ADN de un polinucleótido de acuerdo con la presente invención, preferentemente incorporado dentro de un vector derivado de plásmido y el "estímulo" mediante la administración de un vector viral recombinante que comprende la misma secuencia de polinucleótidos. Alternativamente, una aproximación de proteína adyuvante puede actuar como parte de la aproximación de preparación o estimulación, con el ADN preparado como la otra arma del régimen del estímulo por cebado (siendo la proteína la misma que la proteína codificada por el ADN). A lo largo de toda la presente especificación y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender" e "incluir" y variaciones de las mismas tales como "comprende", "comprendiendo", "incluye" e "incluyendo" están para interpretarse de forma inclusiva. Eso es, estas palabras se desean para expresar la posible inclusión de otros elementos o elementos completos no específicamente enumerados, donde el contexto lo permita. El termino "variante" hace referencia a un polinucleótido que codifica la misma secuencia de aminoácidos que otro polinucleótido de la presente invención, pero el cual, por la redundancia del código genético, tiene una secuencia de nucleótidos diferente mientras que mantiene el mismo patrón de uso de codones, por ejemplo teniendo el mismo coeficiente de uso de codones o un coeficiente de uso de codones dentro de un 0,1, preferentemente dentro de un 0,05 de diferencia con el otro polinucleótido. El término "patrón de uso de los codones" se refiere a las frecuencias medias para todos los codones en la secuencia de nucleótidos, gen o clase de genes bajo discusión (por ejemplo, genes de mamíferos altamente expresados). Los patrones de uso de codones para mamíferos, incluidos los humanos puede hallarse en la literatura (véase por ejemplo Nakamura et al., Nucleíc Acids Research, 1996; 24: 214-215). En los polinucleótidos de la presente invención, el patrón de uso del codón se altera del típico del papilomavirus humano a representar más cercanamente el codón de propensión de un humano. El "coeficiente de uso de codones" es una medida de como de cercanamente se parece el patrón de codones de una secuencia de polinucleótidos dada al de la especie objetivo. Las frecuencias de codón pueden obtenerse de fuentes literarias para los genes altamente expresados de varias especies (véase Nakamura et al., Nucleic Acids Research, 1996; 24: 214-215). Las frecuencias de codón para cada uno de los 61 codones (expresadas como el número de veces que aparece por cada 1.000 codones de la clase seleccionada de genes) están normalizadas para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, así que el valor para el codón más frecuentemente usado para cada aminoácido está fijado en 1, y las frecuencias para los codones menos comunes están en una escala que está entre cero y 1. De esta manera, se ha asignado a cada uno de los 61 codones un valor de 1 o menor para los genes altamente expresados de las especies objetivo. Con el fin de calcular un coeficiente de uso de codones para un polinucleótido específico, relativo a los genes altamente expresados de esas especies, se indica el valor en escala para cada codón del polinucleótido específico y se toma la medía geométrica de todos esos valores (mediante división de la suma de los logaritmos naturales de estos valores entre el número total de los codones y tomando el antílogaritmo). El coeficiente tendrá un valor entre 0 y 1 y los codones que tengan más alto el coeficiente en el polinucleótido serán los codones más frecuentemente usados. Si una secuencia de un polinucleótido tiene un coeficiente de uso de codones de 1, todos los codones son el codón "más frecuente" para los genes expresados altamente en las especies objetivo. Las secuencias de polinucleótido más cortas se encuentran dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede codificar un fragmento de una proteína HPV. Un polinucleótido que codifica un fragmento de al menos 8, por ejemplo de 1 a 10 aminoácidos, o hasta 20, 50, 60, 70, 80, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud, se considera que cae dentro del alcance de la invención mientras que el polinucleótido codifica un polipéptido que demuestra la antigenicidad HPV. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención comprende el caso en donde el polinucleótido codifica un fragmento de una secuencia completa de una proteína de HPV y puede representar uno o más epítopos discretos de esa proteína. Como se discutió anteriormente, la presente invención incluye vectores de expresión que comprenden las secuencias de nucleótidos de la invención. Tales vectores de expresión se construyen rutinariamente en la técnica de la biología molecular, y pueden, por ejemplo, implicar el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tales como por ejemplo señales de poliadenilación, las cuales pueden ser necesarias, y las cuales se colocan en la orientación correcta, con el fin de permitir la expresión de la proteína. Otros vectores adecuados podrían ser evidentes para personas expertas en la técnica. Por medio de otro ejemplo en este aspecto nos referimos a Sambrook eí al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual; 2nd Edition; CSH Laboratory Press. (1989). Preferentemente, un polinucleótido de la invención o para usar en la invención, esté unido operablemente en un vector a una secuencia control la cual es capaz de mantener la expresión de la secuencia codificadora en la célula huésped, es decir, el vector es un vector de expresión. El término "unido operablemente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma deseada. Una secuencia reguladora, tal como un promotor, "unido operablemente" a una secuencia codificadora se posiciona de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se logra bajo condiciones compatibles con la secuencia reguladora. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores tipo plásmido, cromosoma artificial, virus o fago provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores de selección, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina o kanamicina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Los vectores pueden usarse m vitro, por ejemplo para la producción de ADN o NA, o pueden usarse para transfectar o transformar una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped de mamífero. Los vectores pueden también adaptarse para usarse in vivo, por ejemplo en un procedimiento de vacunación con ADN o de terapia de gen. Los promotores y otras señales de regulación pueden seleccionarse para ser compatibles con la célula huésped para la cual se diseña la expresión. Por ejemplo, los promotores de mamíferos incluyen el promotor de la metalotioneína, el cual puede inducirse en respuesta a metales pesados tales como el cadmio, y el promotor de la ß-actina. Pueden usarse también los promotores virales tales como el promotor del antígeno T grande del SV40, el promotor temprano inmediato (IE) del citomegalovirus (CMV) humano, el promotor de LTR del virus del sarcoma de Rous (promotor de adenovirus), o un promotor de HPV, particularmente la región reguladora cadena arriba (URR). Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores virales del virus herpes simple, vectores del virus de la vacuna o de virus alfa y retrovirus, incluyendo lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados. Las técnicas de transferencia de los genes que usan estos virus son conocidas para aquellos expertos en la técnica. Los vectores retrovirales, por ejemplo, pueden usarse para integrar establemente el polinucleótido de la invención dentro del genoma del huésped, aunque tal recombinación no es preferida. Los vectores de adenovirus defectivos en replicación, en contraste, permanecen episomales y, por lo tanto, permiten la expresión transitoria. Los vectores capaces de dirigir la expresión en células de insectos (por ejemplo, los vectores baculovirus), pueden usarse en células humanas o en bacterias con el fin de producir cantidades de la proteína HPV codificadas por los polinucleótidos de la presente invención, por ejemplo para usar como subunidades de vacunas. Los vectores virales preferidos son aquellos que derivan de adenovirus de primates no humanos tales como el adenovirus C68 de chimpancé (documento US 6.083.716) conocido de otra manera por Pan 9. Donde los polinucleótidos de la presente invención encuentran uso como agentes terapéuticos, por ejemplo en la vacunación con ADN, el ácido nucleico se administrará al mamífero, por ejemplo al ser humano, a vacunar. El ácido nucleico, tal como ADN o RNA, preferentemente ADN, se proporciona en la forma de un vector, tal como aquellos descritos anteriormente en este documento, el cual se expresará en las células del mamífero. Los polinucleótidos pueden administrarse mediante cualquier técnica disponible. Por ejemplo, el ácido nucleico puede introducirse mediante una inyección con aguja, preferentemente intradermalmente, subcutáneamente o intramuscularmente. Alternativamente, el ácido nucleico puede administrarse directamente a través de la piel al usar un dispositivo de administración de ácido nucleico tal como la administración de ADN mediada por partículas (PMD). En este procedimiento, las partículas inertes (tales como perlas de oro) son recubiertas con un ácido nucleico, y se aceleran a velocidades suficientes para permitirles penetrar una superficie de un destinatario (por ejemplo, piel), por ejemplo por medio de descargas bajo altas presiones a partir de un dispositivo de proyección, (las partículas recubiertas con una molécula de ácido nucleico de la presente invención están dentro del ámbito de la presente invención, como los dispositivos que están cargados con tales partículas). Las técnicas adecuadas para introducir el polinucleótido o vector desnudo dentro de un paciente incluyen la aplicación tópica con un vehículo apropiado. El ácido nucleico puede administrarse tópicamente a la piel, o a las superficies mucosas, por ejemplo mediante administración intranasal, oral, intravaginal o intrarectal. El polinucleótido o vector desnudo puede presentarse conjuntamente con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón fosfato salino (PBS). La aceptación de ADN puede además facilitarse mediante la adición de agentes facilitadores tales como bupivacaína a la composición. Otros métodos de administración del ácido nucleico directamente a un receptor incluyen ultrasonidos, estimulación eléctrica, electroporación y microsembrado, los cuales se describen en el documento US-5,697,901. La aceptación de las construcciones de ácido nucleico puede aumentarse mediante varias técnicas de transfección, por ejemplo aquellas que incluyen el uso de agentes de transfección. Ejemplos de dichos agentes son agentes catiónicos, por ejemplo, fosfato de calcio y DEAE-Dextrano y agentes de lipotransfección, por ejemplo, lipofectam y transfectam. La dosis a administrarse del ácido nucleico puede alterarse. Típicamente, el ácido nucleico se administra en una cantidad dentro del intervalo de 1 pg a 1 µg, preferentemente de 1 pg a 10 µg de ácido nucleico para la administración de genes mediada por partículas y de 10 µ9 a 1 mg para otras rutas. Una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención puede administrarse también por medio de vectores de administración especializados útiles en terapia de gen. Las aproximaciones de la terapia de gen se discuten por ejemplo en el documento de Verme eí al., Nature 1997, 389: 239-242. Se pueden usar tanto los sistemas virales como los no virales. Los sistemas basados en virus incluyen sistemas basados en retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, Canarypox y virus de la vacuna. Los sistemas no basados en virus incluyen los sistemas de administración directa de ácidos nucleicos y los sistemas basados en liposomas. Una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención puede administrarse también por medio de células transformadas. Tales células incluyen células recogidas de n sujeto. El polinucleótido desnudo o el vector de la presente invención puede introducirse dentro de tales células in vitro y las células transformadas pueden ser devueltas más tarde al sujeto. El polinucleótido de la invención puede integrarse dentro de ácidos nucleicos ya presentes en una célula mediante eventos de recombinación homologa. Una célula transformada puede, si se desea, dejarse crecer in vitro y una o más de las células resultantes pueden usarse en la presente invención. Las células pueden proporcionarse en un sitio apropiado en un paciente mediante técnicas quirúrgicas o microquirúrgicas conocidas (por ejemplo, injerto, microinyección, etc.). Las composiciones de vacuna en la presente invención pueden incluir compuestos adyuvantes los cuales pueden servir para incrementar la respuesta inmune inducida por la propia proteína o la que es codificada por el plásmido de ADN. La alteración del codón que influye conviniendo a la especie vacunada se propone en este documento como un medio de incrementar la expresión y, de este modo, estimular la respuesta inmune, pero un adyuvante puede, sin embargo, ser deseable, porque, mientras que las vacunas de ADN tienden a trabajar bien en modelos de ratones, hay evidencia de una potencia algo más débil en especies mayores, tales como primates no humanos, lo cual se piensa que es predictivo de la probable potencia en humanos. La composición de las vacunas de la invención puede incluir también un adyuvante, tal como, por ejemplo, en una modalidad, imiquimod, tucaresol o alumbre. El adyuvante se administra preferentemente al mismo tiempo que la invención, y en las modalidades preferidas se formulan juntos. Tales agentes adyuvantes contemplados por la invención incluyen (pero esta lista no pretende ser exhaustiva y no excluye a otros agentes): imidazoquinolinas sintéticas tales como imiquimod [S-26308, R-837], (Harrison eí al., "Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine", Vaccine19: 1820-1826, (2001)); y resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos eí al., "Adjuvant activates of inmune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN", Cellular inmunology 204: 64-74 (2000)), las bases de Schiff de carbonilos y aminas que se expresan constitutivamente en las superficies de la célula presentadora de antígeno y las células T, tales como tucaresol (Rodees, J. eí al., "Therapeutic potentiation of the inmune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs", Nature 377: 71-75 (1995)), citoquinas, quimioquinas y moléculas coestimuladoras, inductores de Th1 tales como ¡nterferón gamma, IL-2, IL-12, IL-15 e IL-18, inductores de Th2 tales como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 y otros genes de quimioquinas y moléculas coestimuladoras, tales como MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 y CD40L, otros ligandos inmunoestimuladores fijados como objetivo, tales como CTLA-4 y L-selectina, proteínas estimuladoras de apoptosis y péptidos tales como Fas, (49), adyuvantes basados en lipidos sintéticos, tales como vaxfectina (Reyes eí al., "Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type inmune responses to plasmid ADN inmunization", Vaccine 19: 3778-3786), escualeno, tocoferol-alfa, polisorbato 80, DOPC y colesterol, endotoxina, [LPS], (Beutler, B., "Endotoxin, Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity ", Current Opinión in Microbiology 3: 23-30 (2000)); CpG oligo y dinucleótidos (Sato, Y. eí al., "Immunostimulatory ADN secuences necessary for effective intradermal gene inmunization", Science 273 (5273): 352-354 (1996); documento de Hemmi, H. Y col., "A Toll-like receptor recognizes bacterial ADN", Nature 408: 740-745, (2000)) y otros ligandos potenciales que activan a los receptores Toll para producir citoquinas inducidas por Th1, tales como lipoproteinas micobacterianas sintéticas, proteína micobacteríana p19, peptidoglicano, ácido teicoico y lípido A. Ciertos adyuvantes preferidos para obtener una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, un derivado del Lípido A tal como monofosforil lípido A, o preferentemente monofosforil lípido A 3-de-O-acilado. Los adyuvantes MPL® están disponibles de la Corixa Corporation (Seattle, WA; véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y $.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los cuales el dinucleótido CpG está sin metilar) inducen también una respuesta predominantemente de Th1. Tales oligonucleótidos se conocen bien y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.008.200 y 5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también se describen, por ejemplo, por Sato et al., Science 273:352, 1996. Otros adyuvantes preferidos incluyen una saponina, tal como Quil A, o derivados de ella, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escin, Digitonin; o las saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. En una modalidad, el adyuvante comprende un oligonucleótido CpG inmunoestimulador, tal como se describe en el documento (W096102555). Los típicos oligonucleótidos inmunoestimuladores estarán entre 8-100 bases de longitud e incluirán la fórmula general X! CpGX2 donde y X2 son bases nucleotídicas, y C y G estaban sin metilar. Los oligonucleótidos preferidos para el uso de adyuvantes o vacunas de la presente invención contienen preferentemente dos o más motivos dinucleótido CpG, preferentemente separados por al menos tres nucleótidos, más preferentemente separados por al menos seis o más nucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una modalidad preferida el internucleótido en el oligonucleótido es el fósforoditioato, o más preferentemente un puente fósforotioato, aunque los puentes fosfodiéster y otros puentes internucleótido están dentro del ámbito de la invención incluyendo oligonucleótidos con enlaces internucleótido mezclados, por ejemplo, fósforotioato/fosfodiésteres mezclados. Pueden usarse otros puentes internucleótido, los cuales estabilizan el oligonucleótido. Los métodos para producir oligonucleótidos fósforotioato o fósforoditioato se describen en los documentos US5.666.153, US5.278.302 y WO95/26204. Los ejemplos de los oligonucleótidos preferidos tienen las siguientes secuencias. Preferentemente, las secuencias contienen enlaces fósforotioato modificados. OLIGO 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) (SEQ ID NO 24) OLIGO 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) (SEQ ID NO 25) OLIGO 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEQ ID NO 26) OLIGO 4: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) (SEQ ID NO 27) OLIGO 5: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) (SEQ ID NO 28) Alternativamente, los oligonucleótidos CpG pueden comprender las secuencias preferidas anteriores, en las que tienen supresiones o adiciones a ellas que son inconsecuentes. Los oligonucleótidos CpG usados en la presente invención pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, EP 468520). Convenientemente, tales oligonucleótidos podrán sintetizarse usando un sintetizador automático. Una formulación adyuvante que contenga oligonucleótido CpG puede comprarse a Quiagen bajo el nombre comercial "ImmunEasy". Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención, con referencia a las figuras acompañantes, en las cuales: La figura 1 es una vista esquemática de la construcción vacuna inmunoterapéutica HPV de la invención. La figura 2 es un mapa plasmídico de P70776be2, que codifica HPV 6b E2, el cual se ha optimizado en su codón y mutado. La figura 3 es un mapa plasmídico de p73p1c6be1, que codifica HPV 6b E1, el cual se ha optimizado en su codón y mutado. La figura 4 es un mapa plasmídico de P707711e2, que codifica HPV 11 E2, el cual se ha optimizado en su codón y mutado. La figura 5 es un mapa plasmídico de HPV 102 que codifica HPV 11 E2 en el desarrollo de p7313. La figura 6 es un mapa plasmídico de HPV 104 -fusión entre E2 de HPV 6b y E2 de HPV 11 en el desarrollo de p7313. La figura 7 es un mapa plasmídico de HPV 105 -fusión entre E2 de HPV 6b con el codón optimizado y mutado y E2 de HPV 11. La figura 8 es un mapa plasmídico de HPV 108 - HPV 6b E1 con el codón optimizado y mutado en el desarrollo de p7313.

La figura 9 es un mapa plasmídico de HPV 110 - HPV 6b E2, HPV 11 E2 con el codón optimizado y mutado en el desarrollo de p7313. La figura 10 es un mapa plasmídico de HPV 116 - HPV 6b E1, HPV 6b E2, HPV 11 E2. La figura 11 es un mapa plasmídico de HPV 117 - HPV 6b E2, HPV 11 E2, HPV 6b E1. La figura 12 es un mapa plasmídico de HPV 118 - HPV 6b E2, HPV 11 E2, HPV 6b E1. La figura 13 es un análisis Western Blot de tres construcciones de poliproteína de la invención en las células T 293. La figura 14 muestra la incapacidad de la E2 mutada de KIIIA en un ensayo informador transcripcional de CAT in vitro. La figura 15 muestra la respuesta inmune celular en ratones contra E1. La figura 16 muestra la respuesta inmune celular contra E1. La figura 17 - datos del ensayo de CTL con HPV 18 después de PMID. La figura 18 muestra la reducción de las verrugas después de la administración de E1/E2 en el modelo COPV. 1. Plásmido: pWRG70776be2 c/o mutado Gen de interés: El gen HPV6be2 es aproximadamente un tamaño de 1.1 Kb, y una secuencia de codón optimizada (para la expresión en humanos) se creó usando un programa de visual básico llamado Syngene. Además, la secuencia incluye un cambio en el codón en la posición de aminoácido 111, por lo cual un residuo de lisina (AAG) en el tipo salvaje se cambió por un residuo de alanina (GCA) creando un gen mutado. Este cambio inactiva la actividad transcripcional de 6be2. Los cebadores que se superponen incorporan el gen completo en sitios de restricción seleccionados a ambos extremos 5'y 3' que se diseñaron de acuerdo con ello.

Clonación: El fragmento de PCR de 1,1 Kb fue purificado en un gel y digerido con las enzimas de restricción Not I y Bam Hl para la ligazón dentro del vector pWRG7077 (Powerject). El gen está bajo control del promotor completo temprano Inmediato CMV y tiene una cola de poli A de la hormona de crecimiento bovina. Los clones se secuenciaron indicando un número de errores en las bases. Un número de clones adecuados se identificaron para posibilitar la construcción de la secuencia de genes correcta mediante el uso de digestiones de restricción. Desde el reclonaje, se encontró que un clon C7 sólo tenía una base errónea en la posición 497 (T por C). Otros clones estuvieron bien en este área y se necesitó justamente un simple cambio de fragmento para corregir el error. Se confirmó que el clon final C7a es 6b2 mutado optimizado en el codón. (Véase Fig. 2).

Secuencia 6be2 en pWRG7077 (Secuencia I D No. 1 ) ATGGAAGCTATTG CCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCT GGAGCTGTACGAGGAAAACAGCACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGC ACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTG CTCCTGTACAAGGCCAAG CAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGA AGGTGAGCGAAGCCAAGG GCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCA CCTGGAGAGCCTGCTG CG GACCGAATACAGCATGGAGCCCTGGACT CTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTG GCAGACTCCTCCGAAGCGCTG TTTCGCAAAGCGCG GCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCG CAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGATGTCTACGTGCAG GACAATGACACCTGG GTGAAGGTACATAGTATGGTG GATGCCAAGGG CATCTATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGT CAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCAAGCACTGGGAGGTGTGTT ACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACC CAGGAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAAC GAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCACCAAGGAGGACG CCGTCCAGACG CCCCC CCGGAAGAGG GCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG CCCTGTGCGTTG CTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAAT CTCATCACGAACAACCACGACCAG CACCAAAGGCGCAACAACTCTAA CAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAG GGG GAGTCCAACTGCC TCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTC GACTTGATCAGTTCCACGTGGCACTGGG CCAGCAG CAAGGCG CCCC ACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACGACTCCGAGGAGCAGAGG CAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAA GCTTGGCTTCATGTCCCTGCACCTGCTGTGA Secuencia de aminoácidos (Secuencia ID No.2) MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL GFMSLHLL 2. Plásmido: p7313plc 6be1 c/o mut Gen de interés: El gen HPV6be1 tiene un tamaño de 2 Kb aproximadamente y se creó una secuencia de tipo salvaje (abreviadamente wt) de codón optimizado (para E. coli y expresión humana) usando un programa estadístico de visual basic llamado Syngene. Por consiguiente se diseñaron los cebadores de superposición que incorporan el gen entero con sitios de restricción seleccionados en ambos extremos 5' y 3'. Después el gen sintetizado se digirió con enzimas de restricción Bam Hl y Not I para ligarse en el vector pCIN4. A partir de los datos de secuenciación de numerosos clones seleccionados, se descubrieron numerosos errores de bases. Se generó un clon correcto combinando un fragmento correcto Pst I -Bam Hl del clon no. 24 y un fragmento Not I - Pst I del clon no. 21 en p7313 - pie. Se confirmó un clon correcto (no. 1) mediante secuenciación. Para los cebadores de mutagénesis se diseñaron cambiar los siguientes aminoácidos; lisina (AAA) hasta glicina (GGA) en la posición 83, arginina (CGC) hasta glicina (GGC) en la posición 84 y glicina (GGC) hasta asparagina (GAC) en la posición 482.

Secuencia mutada de codón optimizado 6be1 (SEC ID No. 3) ATGGCAGACGATTCCGGTACTGAGAACGAAGGTTCTGGTTGTACCGG TTGGTTCATGGTTGAAGCAATCGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGAT CTCCGATGACGAAGACGAAGAAGTTGAAGATTCTGGTTACGACATGG TTGACTTCATCGATGACTCCAACATCACTCATAACTCTCTGGAAGCAC AGGCTCTGTTTAACCGCCAGGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGTTC AGGACCTGGGAGGCAAATATCTGGGCTCTCCGTACGTTTCCCCGATC AACACTATCGCAGAAGCAGTTGAGTCTGAAATCTCCCCGCGCCTGGA CGCTATCAAACTGACTCGTCAGCCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCTGTT CCAGACTCGTGAACTGACCGACTCCGGTTACGGTTATAGCGAAGTTG AGGCTGGCACCGGCACCCAGGTTGAAAAACACGGTGTACCGGAAAA CGGCGGCGACGGTCAGGAAAAGGACACCGGCCGCGACATCGAGGGT GAGGAACACACCGAAGCTGAAGCTCCGACTAACTCTGTTCGTGAACA CGCAGGTACTGCGGGTATCCTGGAACTGCTGAAATGCAAAGACCTGC GCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATGCTTCGGCCTGTCTTTC ATTGACCTGATCCGTCCGTTTAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTGGAC TGGGTTGTAGCAGGCTTCGGCATCCACCACTCTATCTCTGAAGCATTC CAGAAACTGATCGAGCCGCTGTCTCTGTACGCGCACATCCAGTGGCT GACTAACG CTTGG GGTATGGTTCTGCTGGTACTG CTGCGCTTTAAAG TAAACAAATCTCGTTCCACTGTTGCTCGTACTCTG GCTACCCTGCTGA ACATCCCGGAGAACCAGATGCTGATCGAACCGCCGAAAATCCAGTCT GGTGTAGCTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACGCTAG CACTGTTATCGGTGAAGCACCGGAATG GATCACTCGTCAGACCGTTA TCGAACACGGTCTGGCAGATTCTCAGTTCAAACTGACTGAAATGGTTC AGTGGGCATACGACAACGACATCTGCGAGGAATCTGAAATTGCGTTC GAATACGCTCAGCGTGGCGACTTCGACTCCAACG CTCGTGCTTTCCT GAACAGCAACATGCAGGCTAAATACGTAAAAGACTGCGCTACCATGT GCCGTCACTACAAACACGCGGAAATGCGTAAAATGTCTATCAAACAGT GGATCAAGCACCGCGGTTCTAAAATCGAAGGTACCGGTAACTGGAAA CCGATCGTTCAGTTCCTGCGCCATCAGAACATCGAATTCATCCCGTTC CTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACGGTACCCCGAAAAAAAACTG CATCGCTATCGTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTTCTGTAT GTCCCTGATCTCTTTCCTGGGCGGCACTGTAATCTCTCACGTTAACTC TTCCTCCCATTTCTGGCTGCAGCCACTGGTAGACGCGAAAGTAGCTC TGCTGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATCTACATGGATACTTAC ATGCGCAACCTGCTGGACGGTAACCCGATGTCTATCGACCGTAAACA CAAAGCGCTGACTCTGATCAAGTGCCCGCCGCTGCTG GTAACTTCTA ACATCGACATCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCTGCATACCCGTG TTACTACCTTTACTTTCCCGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTAACGGTA ACGCTGTTTACGAACTGTCCAACACTAACTG GAAATGCTTCTTCGAGC GTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGACTCTGAAGATGAAGAAGAT GGTTCTAACTCTCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTGTTCGT ACTCTGTGA Secuencia de aminoácidos (Secuencia ID No.4) MADDSGTENE GSGCTGWFMV EAIVQHPTGT QISDDEDEEV EDSGYDMVDF IDDSNITHNS LEAQALFNRQ EADTHYATVQ DLGGKYLGSP YVSPINTIAE AVESEISPRL DAIKLTRQPK KVKRRLFQTR ELTDSGYGYS EVEAGTGTQV EKHGVPENGG DGQEKDTGRD IEGEEHTEAE APTNSVREHA GTAGILELLK CKDLRAALLG KFKECFGLSF IDLIRPFKSD KTTCLDWVVA GFGIHHSISE AFQKLIEPLS LYAHIQWLTN AWGMVLLVLL RFKVNKSRST VARTLATLLN IPENQMLIEP PKIQSGVAAL YWFRTGISNA STVIGEAPEW ITRQTVIEHG LADSQFKLTE MVQWAYDNDI CEESEIAFEY AQRGDFDSNA RAFLNSNMQA KYVKDCATMC RHYKHAEMRK MSIKQWIKHR GSKIEGTGNW KPIVQFLRHQ NIEFIPFLTK FKLWLHGTPK KNCIAIVGPP DTDKSYFCMS LISFLGGTVI SHVNSSSHFW LQPLVDAKVA LLDDATQPCW I YMDTYMRNL LDGNPMSIDR KHKALTLIKC PPLLVTSNID ITKEDKYKYL HTRVTTFTFP NPFPFDRNGN AVYELSNTNW KCFFERLSSS LDIQDSEDEE DGSNSQAFRC VPGTVVRTL 3. Plásmido: WRG7077 11e2 c/o mut Gen de interés: El gen HPV11e2 tiene un tamaño de 1,1 Kb aproximadamente y se creó una secuencia de codón optimizado (para expresión humana) usando un programa estadístico de visual basic llamado Syngene. Además la secuencia incluía un cambio de codones en el aminoácido de la posición 111, en la que el residuo de lisina (AAG) en el tipo salvaje se cambiaba al residuo de alanina (GCC) creando un gen mutado. Este cambio se ha mostrado en la bibliografía que inactiva la actividad transcripcional de la proteína E2. Por consiguiente se diseñaron los cebadores de superposición que incorporan el gen entero con sitios de restricción seleccionados en ambos extremos 5' y 3', y se utilizaron para ensamblar el mutante sintético de codón optimizado 11e2.

Clonación: El fragmento de PCR de 1.2 kb se purificó en gel y se digirió con enzimas de restricción Not y Bam Hl para su ligazón en el vector pWRG7077 (Powderject). El gen está bajo control del promotor completo temprano inmediato de CMV y tiene una cola de poli A de la hormona de crecimiento bovina. Los clones que se secuenciaron habían indicado numerosos errores de bases, éstos se corrigieron posteriormente. Se encontró un clon final F1 que era 11E2 mutado de codón optimizado.

Secuencia 11e2 en pWRG7077 (Secuencia ID No.5) ATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGC TCGAGCTGTACGAGGAGAACAGCATTGACATCCATAAGCACATCATG CACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGAGCGTGCTGTTGCACAAGGCCAA GCAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTCCCCCCTCTGA CCGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCAC CTCGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACG GCGTGGAGCCATGGACCC TGCAGGACACCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGC TTCGCCAAACAGGGCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGA GGATAACGTTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGG ACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGG CATCTACTATACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAA CAAAGAGGCCCAAAAGTATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCT ATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTG CGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGA CGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAG CGCTCCACCCAG GAAGCGTGCGAGGGGCCCAAG CACCAACAACACC CTCTGTGTGGCGAACATTCGCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACAT CGTGACGGATAACTATAACAAGCACCAGAGG CGTAACAACTGTCACT CTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTG CCTT AAGTGCTTCCGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAG CTCGCCTCGTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACA AGAACGCCATCGTCACTCTCACTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAG CAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATAAGGT CGGCTTCATGTCACTGCATCTCCTGTGA Secuencia de aminoácidos (Secuencia ID No. 6) MEAIAKRLDA CQ DQLLELYE ENS I D I H KH I MHW KC I RLES VLLH KAKQMG LSH IGLQVVP PLTVSETKGH NAI EMQMHLE SLAKTQYGVE PWTLQDTSYE MWLTP PKRC F AKQGNTVEVK FDGCEDNVME YVVWTH IYLQ DN DSWVKVTS SVDAKG IYYT CGQFKTYYVN FNKEAQKYGS TNHWEVCYGS TVICSPASVS STVREVSIAE PTTYTPAQTT APTVSACTTE DGVSAPPRKR ARGPSTNNTL CVANIRSVDS TINNIVTDNY NKHQRRNNCH SAATPIVQLQ GDSNCLKCFR YRLNDKYKHL FELASSTWHW ASPEAPHKNA IVTLTYSSEE QRQQFLNSVK IPPTIRHKVG FMSLHLL 4. Plásmido: HPV102 (p7313me 11e2 c/o mut) Gen de interés: El codón optimizado 11e2 se transfirió desde pWRG7077 11e2 c/o mut a otro vector de expresión p7313me.

Clonación: El fragmento 11e2 c/o mut se recortó del vector pWRG7077 11e2 mediante enzimas de restricción Bam Hl y Not I. Después este fragmento se ligó en el vector p7313me usando estos sitios.

Secuencia 11e2 en HPV102 (SEC ID No.7) ATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGC TCGAGCTGTACGAGGAGAACAGCATTGACATCCATAAGCACATCATG CACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGAGCGTGCTGTTGCACAAGGCCAA GCAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTCCCCCCTCTGA CCGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCAC CTCGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCC TGCAGGACACCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGC TTCGCCAAACAGGGCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGA GGATAACGTTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGG ACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGG CATCTACTATACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAA CAAAGAGGCCCAAAAGTATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCT ATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTG CGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGA CGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAG CGCTCCACCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACC CTCTGTGTGGCGAACATTCGCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACAT CGTGACGGATAACTATAACAAGCACCAGAGGCGTAACAACTGTCACT CTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTGCCTT AAGTGCTTCCGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAG CTCGCCTCGTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACA AGAACGCCATCGTCACTCTCACTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAG CAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATAAGGT CGGCTTCATGTCACTGCATCTCCTGTGA Secuencia de am inoácidos (SEC ID No.8) MEAIAKRLDA CQDQLLELYE ENSIDIHKHI MHWKCIRLES VLLHKAKQMG LSHIGLQVVP PLTVSETKGH NAIEMQMHLE SLAKTQYGVE PWTLQDTSYE MWLTPPKRCF AKQGNTVEVK FDGCEDNVME YVVWTHI YLQ DNDSWVKVTS SVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FNKEAQKYGS TNHWEVCYGS TVICSPASVS STVREVSIAE PTTYTPAQTT APTVSACTTE DGVSAPPRKR ARGPSTNNTL CVANIRSVDS TINNIVTDNY NKHQRRNNCH SAATPIVQLQ GDSNCLKCFR YRLNDKYKHL FELASSTWHW ASPEAPHKNA IVTLTYSSEE QRQQFLNSVK IPPTIRHKVG FMSLHLL 5. Plásmido: HPV104 (p7313me 6b/11e2 c/o mut) Gen de interés: Una proteína de fusión 6be2 y 11e2 se construyó usando 2x PCR con HPV102 y HPV110 como moldes y cebadores diseñados adecuados. El fragmento de fusión de -2.2 kb se clonó en el vector de expresión p7313me con el 6be2 en el comienzo de la proteína de fusión.

Clonación: La fusión de 2.2 kb se digirió con enzimas de restricción Bam Hl y Not I y se ligaron en el vector de expresión p7313me. Los clones aislados se comprobaron mediante secuenciación e indicaban que no se habían incorporado ningún error.

Secuencia de fusión 6b/11e2 en HPV104 (SEC ID No.9) ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCT GGAGCTGTACGAGGAAAACAGCACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGC ACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCTGTACAAGGCCAAG CAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGA AGGTGAGCGAAGCCAAGGGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCA CCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGCATGGAGCCCTGGACT CTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTG TTTCGCAAAGCG CG GCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCG CAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGATGTCTACGTGCAG GACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGG CATCTATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGT CAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCAAGCACTG GGAGGTGTGTT ACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACC CAGGAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAAC GAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCACCAAGGAGGACGCCGTCCAGACG CCCCCCCGGAAGAG GGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG CCCTGTGCGTTG CTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGG GAACCACAAT CTCATCACGAACAACCACGACCAGCACCAAAGGCG CAACAACTCTAA CAGCTCCG CAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAACTGCC TCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTC GACTTGATCAGTTCCACGTGG CACTGG GCCAGCAGCAAGGCGCCCC ACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACGACTCCGAG GAGCAGAG G CAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAA GCTTGGCTTCATGTCCCTGCACCTGCTGATGGAAGCCATCGCGAAGA GGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTCGAGCTGTACGAGGAGAA CAGCATTGACATCCATAAGCACATCATGCACTGGAAGTGCATTCGCCT GGAGAGCGTGCTGTTGCACAAGGCCAAGCAGATGGGCCTGTCCCAC ATAGGCCTTCAG GTGGTCCCCCCTCTGACCGTGTCAGAGACAAAGGG CCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCACCTCGAGTCGCTGGCGAAAA CACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCTGCAGGACACCTCGTACGA AATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGCTTCGCCAAACAGGGCAACA CAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGAGGATAACGTTATGGAGTAT GTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGGACAACGACAGTTGGGTGAA GGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGGCATCTACTATACCTGTGGG CAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAACAAAGAGGCCCAAAAGTAT GGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCTATGGGAGCACGGTGATTTG CTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTGCGCGAGGTGAGCATTGCC GAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGACGACCGCTCCGACCGTGT CTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAGCGCTCCACCCAGGAAGCG TGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACCCTCTGTGTGGCGAACATTC GCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGACGGATAACTATAACA AGCACCAGAGGCGTAACAACTGTCACTCTGCCGCAACCCCCATCGTG CAGCTCCAGGGAGACAGCAATTGCCTTAAGTGCTTCCGCTATCGCCT CAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAGCTCGCCTCGTCGACGTGGC ACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACAAGAACGCCATCGTCACTCTC ACTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAGCAGTTTCTGAACAGCGTGAA GATCCCACCGACGATCCGTCATAAGGTCGGCTTCATGTCACTGCATC TCCTGA Secuencia de am inoácidos (SEC ID No. 10) MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK FDGCANNT D YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL GFMSLHLLME AIAKRLDACQ DQLLELYEEN SIDIHKHIMH WKCIRLESVL LHKAKQMGLS HIGLQVVPPL TVSETKGHNA IEMQMHLESL AKTQYGVEPW TLQDTSYEMW LTPPKRCFAK QGNTVEVKFD GCEDNVMEYV VWTHIYLQDN DSWVKVTSSV DAKGIYYTCG QFKTYYVNFN KEAQKYGSTN HWEVCYGSTV ICSPASVSST VREVSIAEPT TYTPAQTTAP TVSACTTEDG VSAPPRKRAR GPSTNNTLCV ANIRSVDSTI NNIVTDNYNK HQRRNNCHSA ATPIVQLQGD SNCLKCFRYR LNDKYKHLFE LASSTWHWAS PEAPHKNAIV TLTYSSEEQR QQFLNSVKIP PTIRHKVGFM SLHLL 6. Plásmido: HPV105 (p7313me 11/6be2 c/o mut) Gen de interés: Una proteína de fusión de 6be2 y 11e2 se construyó usando 2x PCR con HPV102 y HPV110 como moldes y cebadores diseñados adecuados. El fragmento de fusión de -2.2 kb se clonó en el vector de expresión p7313me y con el 11 e2 en el comienzo de la proteína de fusión.

Clonación: La fusión de 2.2 kb se digirió con enzimas de restricción Bam HI y Not I y se ligó en el vector de expresión p7313me. Los clones aislados se comprobaron mediante secuenciación e indicaban q ue no se ha b ían incorporado n ing ú n error.

Secuencia de fus ión 1 1 /6bE2 en H PV105 (SEC I D No. 1 1 ) ATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGC TCGAGCTGTACGAGGAGAACAGCATTGACATCCATAAGCACATCATG CACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGAGCGTG CTGTTG CACAAGGCCAA GCAGATGGGCCTGTCCCACATAG GCCTTCAGGTG GTCCCCCCTCTGA CCGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCAC CTCGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCC TGCAGGACACCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGC TTCGCCAAACAG GGCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGA GGATAACGTTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGG ACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTG GACGCGAAGGG CATCTACTATACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAA CAAAGAGGCCCAAAAGTATGGCTCCACCAACCACTG GGAGGTCTG CT ATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTG CGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGA CGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAG GACGGCGTGAG CGCTCCACCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACC CTCTGTGTGGCGAACATTCGCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACAT CGTGACGGATAACTATAACAAGCACCAGAGGCGTAACAACTGTCACT CTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTGCCTT AAGTGCTTCCGCTATCG CCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAG CTCGCCTCGTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACA AGAACGCCATCGTCACTCTCACTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAG CAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATAAGGT CGGCTTCATGTCACTGCATCTCCTGATGGAAGCTATTGCCAAGCGAC TGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCTGGAGCTGTACGAGGAAAACAG CACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACG AGTCAGTGCTCCTGTACAAGGCCAAGCAGATGGGGCTGTCCCACATC GGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGAAGGTGAGCGAAGCCAAGGGCC ACAACGCTATCGAGATGCAGATGCACCTGGAGAGCCTGCTGCGGACC GAATACAGCATGGAGCCCTGGACTCTCCAGGAGACGTCCTACGAAAT GTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTGTTTCGCAAAGCGCGGCAAGACA GTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGT GGTGTGGACCGATGTCTACGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAG GTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGGCATCTATTACACCTGCGGGCA GTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAGTATG GTTCCACCAAGCACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGC AGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACCCAGGAAGTGAGCATTCCGG AGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAACGAGCACGCTCGTCAGCAG CAGCACCAAGGAGGACGCCGTCCAGACGCCCCCCCGGAAGAGGGCC CGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATGCCCTGTGCGTTGCTCACAT CGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAATCTCATCACGAACAACCACG ACCAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATA GTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAACTGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCG CCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTCGACTTGATCAGTTCCACGT GGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGAC GGTGACCTACGACTCCGAGGAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTC GTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAAGCTTGGCTTCATGTCCCT GCACCTGCTGA Secuencia de aminoácidos (SEC ID No. 12) MEAIAKRLDA CQDQLLELYE ENSIDIHKHI MHWKCIRLES VLLHKAKQMG LSHIGLQVVP PLTVSETKGH NAIEMQMHLE SLAKTQYGVE PWTLQDTSYE MWLTPPKRCF AKQGNTVEVK FDGCEDNV E YVVWTHIYLQ DNDSWVKVTS SVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FNKEAQKYGS TNHWEVCYGS TVICSPASVS STVREVSIAE PTTYTPAQTT APTVSACTTE DGVSAPPRKR ARGPSTNNTL CVANIRSVDS TINNIVTDNY NKHQRRNNCH SAATPIVQLQ GDSNCLKCFR YRLNDKYKHL FELASSTWHW ASPEAPHKNA IVTLTYSSEE QRQQFLNSVK IPPTIRHKVG FMSLHLLMEA IAKRLDACQE QLLELYEENS TDLHKHVLHW KCMRHESVLL YKAKQMGLSH IGMQVVPPLK VSEAKGHNAI EMQMHLESLL RTEYSMEPWT LQETSYEMWQ TPPKRCFAKR GKTVEVKFDG CANNTMDYVV WTDVYVQDND TWVKVHSMVD AKGIYYTCGQ FKTYYVNFVK EAEKYGSTKH WEVCYGSTVI CSPASVSSTT QEVSIPESTT YTPAQTSTLV SSSTKEDAVQ TPPRKRARGV QQSPCNALCV AHIGPVDSGN HNLITNNHDQ HQRRNNSNSS ATPIVQFQGE SNCLKCFRYR LNDRHRHLFD LISSTWHWAS SKAPHKHAIV TVTYDSEEQR QQFLDVVKIP PTISHKLGFM SLHLL 7. Plásmido: HPV108 (p7313ie 6be1 c/o mut) Gen de interés: El codón optimizado mutado 6be1 se transfirió desde el clon p7313plc 6be1 c/o mut clone N al vector p7313ie.

Clonación: El fragmento 6be1 c/o mut se recortó del clon p7313plc 6be2 mediante digestiones de restricción Not y Bam Hl. Después este fragmento se ligó en el vector p7313ie usando estos sitios. El gen está bajo control del promotor ie (temprano inmediato cmv + exón 1) y seguido de una señal de poliadenilación de 6-globina de conejo.

Secuencia 6be1 en p7313ie (SEC ID No. 13) ATGGCAGACGATTCCGGTACTGAGAACGAAGGTTCTGGTTGTACCGG TTGGTTCATGGTTGAAGCAATCGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGAT CTCCGATGACGAAGACGAAGAAGTTGAAGATTCTGGTTACGACATGG TTGACTTCATCGATGACTCCAACATCACTCATAACTCTCTGGAAGCAC AGGCTCTGTTTAACCGCCAGGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGTTC AGGACCTGGGAGGCAAATATCTGGGCTCTCCGTACGTTTCCCCGATC AACACTATCGCAGAAGCAGTTGAGTCTGAAATCTCCCCGCGCCTGGA CGCTATCAAACTGACTCGTCAGCCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCTGTT CCAGACTCGTGAACTGACCGACTCCGGTTACGGTTATAGCGAAGTTG AGGCTGGCACCGGCACCCAGGTTGAAAAACACGGTGTACCGGAAAA CGGCGGCGACGGTCAGGAAAAGGACACCGGCCGCGACATCGAGGGT GAGGAACACACCGAAGCTGAAGCTCCGACTAACTCTGTTCGTGAACA CGCAGGTACTGCGGGTATCCTGGAACTGCTGAAATGCAAAGACCTGC GCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATGCTTCGGCCTGTCTTTC ATTGACCTGATCCGTCCGTTTAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTGGAC TGGGTTGTAGCAGGCTTCGGCATCCACCACTCTATCTCTGAAGCATTC CAGAAACTGATCGAGCCGCTGTCTCTGTACGCGCACATCCAGTGGCT GACTAACGCTTGGGGTATGGTTCTGCTGGTACTG CTGCGCTTTAAAG TAAACAAATCTCGTTCCACTGTTGCTCGTACTCTGGCTACCCTGCTGA ACATCCCGGAGAACCAGATGCTGATCGAACCGCCGAAAATCCAGTCT GGTGTAGCTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACGCTAG CACTGTTATCGGTGAAGCACCGGAATGGATCACTCGTCAGACCGTTA TCGAACACGGTCTGGCAGATTCTCAGTTCAAACTGACTGAAATGGTTC AGTGGGCATACGACAACGACATCTGCGAGGAATCTGAAATTGCGTTC GAATACGCTCAGCGTGGCGACTTCGACTCCAACGCTCGTGCTTTCCT GAACAGCAACATGCAGGCTAAATACGTAAAAGACTGCGCTACCATGT GCCGTCACTACAAACACGCGGAAATGCGTAAAATGTCTATCAAACAGT GGATCAAGCACCGCGGTTCTAAAATCGAAGGTACCGGTAACTGGAAA CCGATCGTTCAGTTCCTGCGCCATCAGAACATCGAATTCATCCCGTTC CTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACGGTACCCCGAAAAAAAACTG CATCGCTATCGTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTTCTGTAT GTCCCTGATCTCTTTCCTGGGCGGCACTGTAATCTCTCACGTTAACTC TTCCTCCCATTTCTGGCTGCAGCCACTGGTAGACGCGAAAGTAGCTC TGCTGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATCTACATGGATACTTAC ATGCGCAACCTGCTGGACGGTAACCCGATGTCTATCGACCGTAAACA CAAAGCGCTGACTCTGATCAAGTGCCCGCCGCTGCTGGTAACTTCTA ACATCGACATCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCTGCATACCCGTG TTACTACCTTTACTTTCCCGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTAACGGTA ACGCTGTTTACGAACTGTCCAACACTAACTGGAAATGCTTCTTCGAGC GTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGACTCTGAAGATGAAGAAGAT GGTTCTAACTCTCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTGTTCGT ACTCTGTGA Secuencia de aminoácidos (SEC ID No.14) MADDSGTENE GSGCTGWFMV EAIVQHPTGT QISDDEDEEV EDSGYDMVDF IDDSNITHNS LEAQALFNRQ EADTHYATVQ DLGGKYLGSP YVSPINTIAE AVESEISPRL DAIKLTRQPK KVKRRLFQTR ELTDSGYGYS EVEAGTGTQV EKHGVPENGG DGQEKDTGRD IEGEEHTEAE APTNSVREHA GTAGILELLK CKDLRAALLG KFKECFGLSF IDLIRPFKSD KTTCLDWVVA GFGIHHSISE AFQKLIEPLS LYAHIQWLTN AWGMVLLVLL RFKVNKSRST VARTLATLLN IPENQMLIEP PKIQSGVAAL YWFRTGISNA STVIGEAPEW ITRQTVIEHG LADSQFKLTE MVQWAYDNDI CEESEIAFEY AQRGDFDSNA RAFLNSNMQA KYVKDCATMC RHYKHAEMRK MSIKQWIKHR GSKIEGTGNW KPIVQFLRHQ NIEFIPFLTK FKLWLHGTPK KNCIAIVGPP DTDKSYFC S LISFLGGTVI SHVNSSSHFW LQPLVDAKVA LLDDATQPCW IYMDTYMRNL LDGNPMSIDR KHKALTLIKC PPLLVTSNID ITKEDKYKYL HTRVTTFTFP NPFPFDRNGN AVYELSNTNW KCFFERLSSS LDIQDSEDEE DGSNSQAFRC VPGTVVRTL 8. Plásmido: HPV110 (p7313ie 6be2 c/o mut) Gen de interés: El codón mutado optimizado 6be2 se transfirió desde pWRG70776be2 al vector p7313ie.

Clonación: El fragmento 6be2 c/o mut se recortó del clon pWRG7077 6be2 mediante digestiones de restricción Not y Bam Hl. Después este fragmento se ligó en el vector p7313ie usando estos sitios. El gen está bajo control del promotor ie (temprano inmediato cmv + exón 1) y seguido de una señal de poliadenilación de 6-globina de conejo.

Secuencia 6be2 en p7313ie (SEC ID No. 15) ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCT GGAGCTGTACGAGGAAAACAGCACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGC ACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCTGTACAAGGCCAAG CAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGA AGGTGAGCGAAGCCAAGGGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCA CCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGCATGGAGCCCTGGACT CTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTG TTTCGCAAAGCGCGGCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCG CAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGATGTCTACGTGCAG GACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGG CATCTATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGT CAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCAAGCACTGGGAGGTGTGTT ACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACC CAGGAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAAC GAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCACCAAGGAGGACGCCGTCCAGACG CCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG CCCTGTGCGTTGCTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAAT CTCATCACGAACAACCACGACCAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAA CAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAACTGCC TCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTC GACTTGATCAGTTCCACGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCC ACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACGACTCCGAGGAGCAGAGG CAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAA GCTTGGCTTCATGTCCCTGCACCTGCTGTGA Secuencia de aminoácidos (SEC ID No.16) MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNNI HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLD V KIPPTISHKL GFMSLHLL 9. Plásmido: HPV116 (p7313ie 6be1.6be2.11e2) Gen de interés: El gen para la poliproteína en la construcción HPV116 una proteína de fusión triple comprendida por orden de todos los codones optimizados y mutados 6be1, 6be2, 11e2. El gen de la poliproteína se ensambló mediante PCR a partir del uso de 2 fragmentos previos con PCR; 6be1 y 6b/11e2. El tamaño del gen es -4.1 kb, produciendo una poliproteína de -170 kD, observado mediante PAGE y Western Blot.

Clonación: El gen de la poliproteína se digirió con enzimas de restricción Bam Hl + Not I y se ligó en el vector p7313ie. El análisis de secuenciación de los clones seleccionados había indicado el cambio de bases 'impares', pero esto se superó mediante intercambio de diversos fragmentos. Se encontró que un clon resultante hpv116 no. 1 no tenía ningún error.

Secuencia de poliproteína en HPV116 (SEC ID No. 17) ATGGCAGACGATTCCGGTACTGAGAACGAAGGTTCTGGTTGTACCGG TTGGTTCATGGTTGAAGCAATCGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGA TCTCCGATGACGAAGACGAAGAAGTTGAAGATTCTGGTTACGACATG GTTGACTTCATCGATGACTCCAACATCACTCATAACTCTCTGGAAGCA CAGGCTCTGTTTAACCGCCAGGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGT TCAGGACCTGGGAGGCAAATATCTGGGCTCTCCGTACGTTTCCCCGA TCAACACTATCGCAGAAGCAGTTGAGTCTGAAATCTCCCCGCGCCTG GACGCTATCAAACTGACTCGTCAGCCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCT GTTCCAGACTCGTGAACTGACCGACTCCGGTTACGGTTATAGCGAAG TTGAGGCTGG CACCGGCACCCAGGTTGAAAAACACG GTGTACCGGA AAACGGCGGCGACGGTCAGGAAAAGGACACCGGCCGCGACATCGAG GGTGAGGAACACACCGAAGCTGAAGCTCCGACTAACTCTGTTCGTGA ACACGCAGGTACTGCGGGTATCCTGGAACTGCTGAAATGCAAAGACC TGCGCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATGCTTCG GCCTGTCT TTCATTGACCTGATCCGTCCGTTTAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTG GACTGGGTTGTAGCAGGCTTCGGCATCCACCACTCTATCTCTGAAGC ATTCCAGAAACTGATCGAGCCGCTGTCTCTGTACGCGCACATCCAGT GG CTGACTAACGCTTGGGGTATGGTTCTGCTGGTACTGCTGCGCTTT AAAGTAAACAAATCTCGTTCCACTGTTGCTCGTACTCTGG CTACCCTG CTGAACATCCCGGAGAACCAGATGCTGATCGAACCG CCGAAAATCCA GTCTGGTGTAGCTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACG CTAGCACTGTTATCGGTGAAGCACCG GAATGGATCACTCGTCAGACC GTTATCGAACACGGTCTGGCAGATTCTCAGTTCAAACTGACTGAAATG GTTCAGTGGGCATACGACAACGACATCTGCGAGGAATCTGAAATTGC GTTCGAATACGCTCAGCGTGGCGACTTCGACTCCAACGCTCGTGCTT TCCTGAACAGCAACATGCAGGCTAAATACGTAAAAGACTGCGCTACC ATGTGCCGTCACTACAAACACGCGGAAATGCGTAAAATGTCTATCAAA CAGTGGATCAAGCACCGCGGTTCTAAAATCGAAGGTACCGGTAACTG GAAACCGATCGTTCAGTTCCTGCGCCATCAGAACATCGAATTCATCC CGTTCCTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACGGTACCCCGAAAAAA AACTGCATCG CTATCGTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTT CTGTATGTCCCTGATCTCTTTCCTGGGCGGCACTGTAATCTCTCACGT TAACTCTTCCTCCCATTTCTGGCTGCAGCCACTGGTAGACGCGAAAG TAGCTCTGCTGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATCTACATGGAT ACTTACATGCGCAACCTGCTGGACGGTAACCCGATGTCTATCGACCG TAAACACAAAGCGCTGACTCTGATCAAGTGCCCGCCGCTGCTGGTAA CTTCTAACATCGACATCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCTGCATA CCCGTGTTACTACCTTTACTTTCCCGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTA ACGGTAACGCTGTTTACGAACTGTCCAACACTAACTGGAAATGCTTCT TCGAGCGTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGACTCTGAAGATGAA GAAGATGGTTCTAACTCTCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCG GGTACTGTT GTTCGTACTCTGATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTG GACGCCTGCCA GGAGCAGCTGCTGGAGCTGTACGAGGAAAACAGCACAGACCTCCAC AAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCT GTACAAGGCCAAG CAGATG G GGCTGTCCCACATCGGGATGCAG GTC GTGCCCCCGCTGAAGGTGAGCGAAGCCAAG GGCCACAACGCTATCG AGATGCAGATGCACCTGGAGAGCCTGCTGCG GACCGAATACAGCAT G GAGCCCTG GACTCTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACT CCTCCGAAGCGCTGTTTCGCAAAG CGCGGCAAGACAGTTGAGGTGA AATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACC GATGTCTACGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAG GTACATAGTAT GGTGGATGCCAAG GG CATCTATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGT ACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCAAG CACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCT CCGTGTCGTCCACCACCCAGGAAGTGAGCATTCCGGAGAGACCACAT ACACCCCGGCCCAAACGAGCACGCTCGTCAGCAG CAGCACCAAGGA GGACGCCGTCCAGACGCCCCCCCGGAAGAGGGCCCG GGGGGTCCA GCAGTCTCCCTGCAATGCCCTGTG CGTTGCTCACATCG GCCCTGTCG ATTCTGGGAACCACAATCTCATCACGAACAACCACGACCAGCACCAA AGGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATAGTG CAGTTCCA GGGGGAGTCCAACTGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACC GCCACCGCCACCTGTTCGACTTGATCAGTTCCACGTGGCACTGGGCC AGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACG ACTCCGAGGAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCT CCGACAATCAGCCACAAGCTTGGCTTCATGTCCCTG CACCTGCTGAT GGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTC GAGCTGTACGAGGAGAACAGCATTGACATCCATAAG CACATCATGCA CTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGAGCGTGCTGTTGCACAAGGCCAAG CAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTCCCCCCTCTGAC CGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATG CAGATGCACC TCGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCT GCAGGACACCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATG CT TCGCCAAACAGGGCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGA G GATAACGTTATG GAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGG ACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTG GACGCGAAG GG CATCTACTATACCTGTG GGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAA CAAAGAGGCCCAAAAGTATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCT ATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTG CGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGA CGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAG 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Plásmido: HPV117 (p7313ie 6be2.6be1.11e2) Gen de interés: El gen para la poliproteína en la construcción HPV117 es una proteína de fusión triple comprendida por todos los codones optimizados y mutados, en el orden 6be2, 6be1, 11e2. El gen de la poliproteína se ensambló mediante PCR a partir del uso de 3 fragmentos previos de PCR; 6be1 y 6be2 y 11e2. El tamaño del gen es -4.1 kb, produciendo una poliproteína de -170 kD, observada mediante PAGE y Western Blot.

Clonación: El gen de la poliproteína se digirió con enzimas de restricción Bam Hl + Not I y se ligó en el vector p7313ie. El análisis de secuenciación de clones seleccionados había indicado el cambio de bases 'impares', pero esto se superó mediante intercambio de diversos fragmentos. Se encontró que un clon resultante hpv117 no. 6 no tenía ningún error.

Secuencia de poliproteína en HPV117 (SEC ID No. 19) ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCT GGAGCTGTACGAGGAAAACAGCACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGC ACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCTGTACAAGGCCAAG CAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGA AGGTGAGCGAAGCCAAGGGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCA CCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGCATGGAGCCCTGGACT CTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTG TTTCGCAAAGCGCGGCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCG CAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGATGTCTACGTGCAG GACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGG CATCTATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGT CAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCAAGCACTGGGAGGTGTGTT ACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACC CAGGAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAAC GAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCACCAAGGAGGACGCCGTCCAGACG CCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG CCCTGTGCGTTGCTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAAT CTCATCACGAACAACCACGACCAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAA CAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAACTGCC TCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTC GACTTGATCAGTTCCACGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCC ACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACGACTCCGAGGAGCAGAGG CAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAA GCTTGGCTTCATGTCCCTGCACCTGCTGATGGCAGACGATTCCGGTA CTGAGAACGAAGGTTCTGGTTGTACCGGTTGGTTCATGGTTGAAGCA ATCGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGATCTCCGATGACGAAGACGA AGAAGTTGAAGATTCTGGTTACGACATGGTTGACTTCATCGATGACTC CAACATCACTCATAACTCTCTGGAAGCACAGGCTCTGTTTAACCGCCA GGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGTTCAGGACCTGGGAGGCAAAT ATCTGGGCTCTCCGTACGTTTCCCCGATCAACACTATCGCAGAAGCA GTTGAGTCTGAAATCTCCCCGCGCCTGGACGCTATCAAACTGACTCG TCAGCCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCTGTTCCAGACTCGTGAACTGA CCGACTCCGGTTACGGTTATAGCGAAGTTGAGGCTGGCACCGGCACC CAGGTTGAAAAACACGGTGTACCGGAAAACGGCGGCGACGGTCAGG AAAAGGACACCGGCCGCGACATCGAGGGTGAGGAACACACCGAAGC TGAAGCTCCGACTAACTCTGTTCGTGAACACGCAGGTACTGCGGGTA TCCTGGAACTGCTGAAATGCAAAGACCTGCGCGCGGCTCTGCTGGGC AAATTCAAAGAATGCTTCGGCCTGTCTTTCATTGACCTGATCCGTCCG TTTAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTGGACTGGGTTGTAGCAGGCTTC GGCATCCACCACTCTATCTCTGAAGCATTCCAGAAACTGATCGAGCC GCTGTCTCTGTACGCGCACATCCAGTGGCTGACTAACGCTTGGGGTA TGGTTCTGCTGGTACTGCTGCGCTTTAAAGTAAACAAATCTCGTTCCA CTGTTGCTCGTACTCTGGCTACCCTGCTGAACATCCCGGAGAACCAG ATGCTGATCGAACCGCCGAAAATCCAGTCTGGTGTAGCTGCACTGTA CTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACGCTAGCACTGTTATCGGTGAAGC ACCGGAATGGATCACTCGTCAGACCGTTATCGAACACGGTCTGGCAG ATTCTCAGTTCAAACTGACTGAAATGGTTCAGTG GGCATACGACAACG ACATCTGCGAGGAATCTGAAATTGCGTTCGAATACGCTCAGCGTGGC GACTTCGACTCCAACGCTCGTGCTTTCCTGAACAGCAACATGCAGGC TAAATACGTAAAAGACTGCGCTACCATGTGCCGTCACTACAAACACG C GGAAATG CGTAAAATGTCTATCAAACAGTGGATCAAGCACCGCGGTT CTAAAATCGAAGGTACCG GTAACTGGAAACCGATCGTTCAGTTCCTG CGCCATCAGAACATCGAATTCATCCCGTTCCTGACCAAATTCAAGCTG TGGCTGCACGGTACCCCGAAAAAAAACTGCATCGCTATCGTAGGTCC ACCGGACACTGACAAGTCTTACTTCTGTATGTCCCTGATCTCTTTCCT GGGCGGCACTGTAATCTCTCACGTTAACTCTTCCTCCCATTTCTGGCT GCAGCCACTGGTAGACGCGAAAGTAGCTCTGCTGGACGACGCGACC CAGCCGTGCTGGATCTACATGGATACTTACATGCGCAACCTGCTGGA CG GTAACCCGATGTCTATCGACCGTAAACACAAAGCGCTGACTCTGA TCAAGTGCCCG CCGCTGCTGGTAACTTCTAACATCGACATCACCAAG GAAGATAAATACAAGTACCTGCATACCCGTGTTACTACCTTTACTTTC CCGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTAACGGTAACGCTGTTTACGAACT GTCCAACACTAACTGGAAATGCTTCTTCGAGCGTCTGTCTTCCTCCCT GGACATCCAGGACTCTGAAGATGAAGAAGATGGTTCTAACTCTCAGG CTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTGTTCGTACTCTGATGGAAGCCA TCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTCGAGCTGTA CGAGGAGAACAG CATTGACATCCATAAGCACATCATGCACTGGAAGT GCATTCGCCTGGAGAGCGTGCTGTTGCACAAGGCCAAGCAGATGG G CCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTCCCCCCTCTGACCGTGTCAG AGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATG CAGATGCACCTCGAGTCG CTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCTGCAGGACA CCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGCTTCGCCAAA CAGGGCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGAGGATAACG TTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGGACAACGAC AGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGGCATCTACTA TACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAACAAAGAGGC CCAAAAGTATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCTATGGGAGCA CGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTGCGCGAGGTG AGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGACGACCGCTC CGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAGCGCTCCACC CAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACCCTCTGTGTG GCGAACATTCGCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGACGGA TAACTATAACAAGCACCAGAGGCGTAACAACTGTCACTCTGCCGCAA CCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTGCCTTAAGTGCTTC CGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAGCTCGCCTC GTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACAAGAACGCC ATCGTCACTCTCACTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAGCAGTTTCT GAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATAAGGTCGGCTTCA TGTCACTGCATCTCCTGTGA Secuencia de aminoácidos (SEC ID No.20) MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL GFMSLHLLMA DDSGTENEGS GCTGWFMVEA IVQHPTGTQI SDDEDEEVED SGYDMVDFID DSNITHNSLE AQALFNRQEA DTHYATVQDL GGKYLGSPYV SPINTIAEAV ESEISPRLDA IKLTRQPKKV KRRLFQTREL 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Plásmido: HPV118 (p7313ie 6be2.11e2.6be1) Gen de interés: El gen para la poliproteína en la construcción HPV118 es una proteina de fusión triple comprendida por todos los codones optimizados y mutados en el orden 6be2, 11e2, 6be1. El gen de la poliproteína se ensambló mediante PCR a partir del uso de 2 fragmentos previos con PCR; 6be1 y 11/6be2. El tamaño del gen es -4.1 kb, produciendo una poliproteína de -170 kD, observada mediante PAGE y Western Blot.

Clonación: El gen de la poliproteína se digirió con enzimas de restricción Bam Hl + Not I y se ligó en el vector p7313ie. El análisis de secuenciacion de clones seleccionados había indicado el cambio de bases 'impares', pero esto se superó mediante intercambio de diversos fragmentos. Se encontró que un clon resultante hpv118 no. 6 no tenía ningún error.

Secuencia de pol iproteína en H PV1 1 8 (SEC I D N o. 21 ) ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTG CCAGGAGCAGCTGCT GGAGCTGTACGAGGAAAACAGCACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGC ACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTG CTCCTGTACAAGGCCAAG CAGATGGGG CTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGA AGGTGAGCGAAG CCAAG G GCCACAACGCTATCGAGATGCAGATG CA CCTGGAGAGCCTGCTGCG GACCGAATACAG CATG GAGCCCTGGACT CTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTG TTTCGCAAAGCGCGGCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCG CAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGATGTCTACGTGCAG GACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGG CATCTATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGT CAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCAAGCACTGGGAGGTGTGTT ACGGGAGTACTGTGATCTGCAG CCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACC CAGGAAGTGAG CATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAAC GAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCACCAAGGAGGACGCCGTCCAGACG CCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG CCCTGTGCGTTG CTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAAT CTCATCACGAACAACCACGACCAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAA CAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAACTG CC 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GGTATCCTGGAACTGCTGAAATGCAAA GACCTGCGCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATG CTTCGGCCT GTCTTTCATTGACCTGATCCGTCCGTTTAAGTCTGACAAAACTACCTG TCTGGACTGGGTTGTAGCAGGCTTCGGCATCCACCACTCTATCTCTG AAGCATTCCAGAAACTGATCGAGCCGCTGTCTCTGTACGCGCACATC CAGTGGCTGACTAACGCTTGGGGTATGGTTCTGCTGGTACTGCTGCG CTTTAAAGTAAACAAATCTCGTTCCACTGTTGCTCGTACTCTGGCTAC CCTGCTGAACATCCCGGAGAACCAGATGCTGATCGAACCGCCGAAAA TCCAGTCTGGTGTAGCTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTA ACGCTAGCACTGTTATCGGTGAAGCACCGGAATGGATCACTCGTCAG ACCGTTATCGAACACGGTCTGGCAGATTCTCAGTTCAAACTGACTGAA ATGGTTCAGTGGG CATACGACAACGACATCTG CGAG GAATCTGAAAT TGCGTTCGAATACGCTCAGCGTGGCGACTTCGACTCCAACGCTCGTG CTTTCCTGAACAGCAACATGCAGGCTAAATACGTAAAAGACTGCGCTA CCATGTGCCGTCACTACAAACACGCGGAAATG CGTAAAATGTCTATCA AACAGTGGATCAAGCACCGCGGTTCTAAAATCGAAGGTACCGGTAAC TGGAAACCGATCGTTCAGTTCCTGCGCCATCAGAACATCGAATTCATC CCGTTCCTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACGGTACCCCGAAAAA AAACTGCATCGCTATCGTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTT CTGTATGTCCCTGATCTCTTTCCTGGGCGGCACTGTAATCTCTCACGT TAACTCTTCCTCCCATTTCTGGCTGCAGCCACTGGTAGACGCGAAAGT AGCTCTGCTGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATCTACATGGATA CTTACATGCGCAACCTGCTGGACGGTAACCCGATGTCTATCGACCGT AAACACAAAGCGCTGACTCTGATCAAGTGCCCGCCGCTGCTGGTAAC TTCTAACATCGACATCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCTGCATAC CCGTGTTACTACCTTTACTTTCCCGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTAA CGGTAACGCTGTTTACGAACTGTCCAACACTAACTGGAAATGCTTCTT CGAGCGTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGACTCTGAAGATGAAG AAGATGGTTCTAACTCTCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTG TTCGTACTCTGTGA Secuencia de am inoácidos (SEC ID No.22) MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL GFMSLHLLME AIAKRLDACQ DQLLELYEEN SIDIHKHIMH WKCIRLESVL LHKAKQMGLS HIGLQVVPPL TVSETKGHNA IE QMHLESL AKTQYGVEPW TLQDTSYEMW LTPPKRCFAK QGNTVEVKFD GCEDNVMEYV VWTHI YLQDN DSWVKVTSSV DAKGIYYTCG QFKTYYVNFN KEAQKYGSTN HWEVCYGSTV ICSPASVSST VREVSIAEPT TYTPAQTTAP TVSACTTEDG VSAPPRKRAR GPSTNNTLCV ANIRSVDSTI NNIVTDNYNK HQRRNNCHSA ATPIVQLQGD SNCLKCFRYR LNDKYKHLFE LASSTWHWAS PEAPHKNAIV TLTYSSEEQR QQFLNSVKIP PTIRHKVGFM SLHLLMADDS GTENEGSGCT GWFMVEAIVQ HPTGTQISDD EDEEVEDSGY DMVDFIDDSN ITHNSLEAQA LFNRQEADTH YATVQDLGGK YLGSPYVSPI NTIAEAVESE ISPRLDAIKL TRQPKKVKRR LFQTRELTDS GYGYSEVEAG TGTQVEKHGV PENGGDGQEK DTGRDIEGEE HTEAEAPTNS VREHAGTAGI LELLKCKDLR AALLGKFKEC FGLSFIDLIR PFKSDKTTCL DW VAGFGIH HSISEAFQKL IEPLSLYAHI QWLTNAWGMV LLVLLRFKVN KSRSTVARTL ATLLNIPENQ MLIEPPKIQS GVAALYWFRT GISNASTVIG EAPEWITRQT VIEHGLADSQ FKLTEMVQWA YDNDICEESE IAFEYAQRGD FDSNARAFLN SNMQAKYVKD CATMCRHYKH AEMRKMSIKQ WIKHRGS IE GTGNWKPIVQ FLRHQNIEFI PFLTKFKLWL HGTPKKNCIA IVGPPDTDKS YFCMSLISFL GGTVISHVNS SSHFWLQPLV DAKVALLDDA TQPCWIYMDT YMRNLLDGNP MSIDRKHKAL TLIKCPPLLV TSNIDITKED KYKYLHTRVT TFTFPNPFPF DRNGNAVYEL SNTNWKCFFE RLSSSLDIQD SEDEEDGSNS QAFRCVPGTV VRTL La secuencia ColE1 cer se obtuvo a partir de un subclón del plásmido pDAH212 de David Hodgeson (Warwick University) y se amplificó mediante PCR utilizando cebadores para colocar sitios de restricción de EcoRi en los extremos de la secuencia. Después la secuencia cer se insertó en el sitio EcoRi de p7313-PL para producir el plásmido p7313-PLc. La secuencia de cer amplificado se verificó contra la entrada M11411 del Genbank.

EiemDlo 2 - Expresión en células de mamíferos 293T Se desarrollaron células de mamíferos 293T en fase logarítmica a una concentración final de 2 X105 células por placa de cultivo de tejidos de 6 pocilios Corning Costar™ (Corning Science Products, 10 The ValleyCentre, Gordon Road, High Wycombe, Bucks, UK) durante una noche a 37°C en 5% de C02. Se preparó la siguiente mezcla de transfección y se sometió a la formación de complejo durante 25 minutos: ADN de interés 2µg Hecho con agua estéril destilada doblemente 16 µ? OPTI-mem™ (Gibco BRL, Paísley, Escocia) 8µ? Lipofectamine™ (GibcoBRL) 6µ? Cada monocapa de células en un pocilio se lavó cuidadosamente dos veces con OPTI-mem™. Se añadieron a cada pocilio 800µ? de OPTI-mem™. Se añadieron a cada mezcla de transfección 200µ? de OPTI-mem™, se mezclaron y se añadieron poco a poco a una monocapa de células. Se incubó la placa durante 5 horas a 37°C en 5% de C02 después de lo cual se desecharon la mezcla de transfección y OPTI-mem™. Se lavaron poco a poco dos veces las monocapas de células con medio de desarrollo celular y finalmente las células transfectadas se incubaron durante 24 horas en medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 10% de suero de ternera fetal y 29,2 mg/ml de L-glutamina a 37°C en 5% de C02. Se rasparon las células en microtubos, se lavaron dos veces con PBS, se centrifugaron y el residuo celular se volvió a suspender en tinte de SDS Page Laemmli. Se hirvió el sedimento celular y se cargó en un gel de 10% de SDS Page, se sometió a electroforesis en tampón 1X Tris Clicina SDS. Después de la electroforesis, se transfirió el gel a membrana de nitrocelulosa (Amersham) y se sometió a Western Blot. Se bloqueó la membrana de nitrocelulosa con 5% de Marvel™ (Premier Beverages, Knighton, Adbaston, Stafford, Reino Unido) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavó dos veces con PBS y 0,1% de Tween 20. Un anticuerpo policlonal inducido contra la secuencia C-terminal de proteína de HPV6bE1 (secuencia proteica: CSSSLDIQDSEDEEDGSNSQAFR SEC ID No. 23) en conejos se diluyó en 5% de Marvel™ en PBS y se añadió a la membrana de nitrocelulosa. Se incubó esto a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. También se utilizó un anticuerpo policlonal contra HPV11E1 para comprobar la reactividad cruzada. Se retiró el anticuerpo diluido y se lavó la membrana tres veces con PBS y 0,1% de Tween 20. Un conjugado secundario, peroxidasa de rábano picante (abreviadamente HPR) (DAKO) de cerdo anti-conejo, se diluyó 1:20000 en PBS y 0,1% de Tween 20. Esto se añadió a la membrana lavada y se incubó con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la membrana se lavó abundantemente con PBS y 0,1% de Tween 20. Se usó un kit HRP quimioluminiscente (Amersham) para detectar las proteínas transferidas en la membrana.

Resultados: Los resultados (Fig. 13) muestran un tamaño correcto de proteína expresada mediante cada uno de HPV 116, 117, 118 que contenía las proteínas de HPV de codón optimizado. Las células HEK293T se transfectaron con -0.5 ug de ADN de las construcciones respectivas y se recogieron las células 24 horas después. Después estas muestras se analizaron primero mediante electroforesis en poliacrilamida y después con Western Blot. Se usaron dos anticuerpos de péptidos para detectar la expresión de proteínas (-180 kd); Anti-6bE1(no. 1097) y anti-6bE2 (no. 1101).

Ejemplo 3 Inactivación de antígeno E1 y confirmación experimental La proteína HPV E1 es una proteína nuclear bien conservada con unión de ADN no específico, ATPasa y actividades de helicasa. E1 también se une a la primasa polimerasa a de ADN celular del huésped y a la proteína HPV E2 que después 'engancha' E1 en el complejo de replicación de ADN viral de preiniciación. El papel principal de E1 es iniciar la replicación de ADN específico de virus en células infectadas. Las funciones de replicación de ADN de E1 (y E2) son relativamente no específicas y muchos estudios han mostrado ahora que las proteínas E1 y E2 de un genotipo pueden dirigir la replicación de ADN de origen específico de un plásmido que lleva la secuencia original de replicación de un genotipo diferente. Los estudios han mostrado que la introducción de E1 y E2 que se expresan altamente en el interior de las células que ya contienen un número bajo de copias del plásmido de HPV pueden dar como resultado una amplificación significativa de ese plásmido. Esta promiscuidad lleva consigo un pequeño riesgo potencial de seguridad que se pretende eliminar. Por consiguiente, se buscaron las mutaciones en E1 (y E2) que inactívan su potencial replicación. La mutación de E1 G482D se produce en una secuencia consenso de unión a ATP altamente conservada y la proteína E1 que lleva esta mutación ha mostrado tener múltiples pérdidas funcionales. Otras mutaciones, hacia el extremo N de la proteína (K83G, R84G) se ha mostrado que invalidan la localización nuclear de E1. El fallo para localizar el compartimiento nuclear también serviría para separar E1 de las proteínas de replicación del huésped y ADN viral, proporcionando un nivel adicional de incapacidad y seguridad. Estas mutaciones (G428D, K83G, R84G) se seleccionaron y se incorporaron en E1 como parte del vector E1 inmunoterapéutico de ADN de HPV. Se utilizó un ensayo de replicación de ADN de HPV in vitro para confirmar la inhabilitación de las funciones de replicación de ADN de E1 (como corolario también se puede confirmar en este mismo ensayo la inactivación mutacional de la actividad potenciadora de replicación de E2). Brevemente, tanto E1 como E2 activan cooperativamente el origen de HPV de replicación y las proteínas E1 y E2 de HPV 6b se sabía que activan y dirigen de novo la replicación de ADN desde el origen de HPV-11. Los plásmidos que codifican nuestras secuencias de E1 y E2 de codones optimizados se cotransfectaron en células 293 con un plásmido que lleva el origen HPV-11 de replicación (plásmido ori). La replicación dependiente de E1 y E2 de la entrada del plásmido ori se mide recogiendo ADN de células 48 horas después de la cotransfección (lisis Hirt). El ADN extraído se digiere con enzimas de restricción primero con Hind III y después con Dpn I que digiere ADN no replicado y no metilado. Después los ADN se someten a una transferencia Southern y se hibridizan con ADN de plásmido ori como sonda. Las bandas con un tamaño equivalente al plásmido ori después de la digestión con Dpni son marcadores para ADN de plásmido replicado in vitro de novo. E1 y E2 de tipo salvaje (HPV 119 + HPV 120) muestran una fuerte banda indicativa de ADN de plásmido de entrada replicado. Cada una de las tres construcciones líder es negativa, (HPV 16, HPV117 y HPV118) muestran resultados; no hay replicación. Conclusión: Las construcciones líderes HPV 116, HPV 117 y HPV 118 no tienen actividad de replicación de ADN. Ejemplo 4 La proteína E2 de papilomavirus es una proteína de unión de ADN de sitio específico que funciona como la proteína de reconocimiento original de replicación principal y asiste en el ensamblaje del complejo de replicación de ADN de preiniciación. La proteína E2 de longitud completa puede actuar también como un represor o activador de transcripción viral dependiendo de la posición (relativa a otros sitios de factores de transcripción) y la afinidad de la proteína para su sitio de unión afín. Se sabe también que E2 tiene influencia en la transcripción de diversos promotores celulares del huésped. La inactivación mutacional de E2 se ha estudiado ampliamente y una mutación en un punto en particular Lys 111 ? Ala (K111A) se ha mostrado que inactiva tanto las funciones transcripcionales como de replicación de E2. Esta mutación puede tener también el beneficio adicional de prevenir la translocación nuclear de la proteína. Esta mutación (K 11A) se incorporó en cada uno de los antígenos de E2 como parte del ADN de HPV inmunoterapéutico. Los autores tienen la intención de confirmar la incapacidad de E2 mutado K111A y cada construcción de poliproteína en un ensayo indicador transcripcional de CAT in vitro. Los autores usaron dos controles positivos (fuentes de proteína activa E2). Éstos eran una construcción que expresa la proteína E2 de HPV-11 E2 no mutada (activa), y un segundo vector que expresa la proteína E2 de BPV, un fuerte transactivador transcripcional. Estos datos se muestran en la figura 14. Conclusión: Estos datos muestran que la proteína expresada a partir del vector nativo HPV 6b E2 (no mutado) es transcripcionalmente activo, mientras que E2 (K111A) mutado es inactivo, como lo son cada uno de los vectores de poliproteínas HPV 116, 117 y 118.

Ejemplo 5 Expresión de y comparación con Construcciones de Gen individuales HPV 116, HPV 117 y HPV 118. Los estudios de expresión de Gen que comparan las construcciones líderes HPV 116, HPV 117 y HPV 118 fallaban para identificar cualquier diferencia clara en la expresión génica in vitro. Además, la expresión de la poliproteína era equivalente a la expresión del antígeno individual (no condensado) en un solo plásmido (HPV 110). Igualmente importante, la introducción de las mutaciones puntuales no tiene impacto en la expresión génica (HPV 108 y HPV 110).

Ejemplo 6 Estudios in vivo de inmunogenicidad en ratones Con el fin de comparar la inmunogenicidad de las tres diferentes construcciones HPV 116, HPV 117 y HPV 118 in vivo, se inmunizaron ratones usando PMID. Cada inmunización comprendía dos inyecciones de 0,5 g de ADN en el abdomen afeitado de ratones Balb/c (H-2Kd) o C57 BL6 (H-2Kb). Se cebaron los animales con 1 g de ADN, se estimularon 21 días más tarde con una dosis equivalente de y se sacrificaron 5-7 días después de la estimulación. Se tomaron sueros y bazos para análisis de la respuesta inmune humoral y celular generada después de PMID.

Ensayos humorales Los anticuerpos inducidos en ratones inmunizados con PMID se evaluaron utilizando métodos ELISA habituales y proteínas E1 y E2 recombinantes como antígeno de captura. Las respuestas de anticuerpo no se pueden detectar fiablemente excepto después de extensos programas de inmunización en ratones inmunizados con E2. Los autores no confirmaron la detección de anticuerpo para el antígeno E1 en ratones. Estas respuestas de anticuerpos débiles/indetectables están de acuerdo con la bibliografía publicada.

Ensayos celulares Los ensayos de ELISPOT se usaron para estudiar respuestas inmunes celulares en ratones. Esta técnica es adecuada para valorar la frecuencia de células en un cultivo de densidad conocida que son capaces de secretar citoquinas específicamente en respuesta a antígeno presentado en el contexto de moléculas de MHC singénicas. Brevemente, una sola suspensión de células de esplenocitos aislada de animales inmunizados se añade a placas de microtitulación especializadas cubiertas con anticuerpo de captura de anticitoquinas y se incuban durante una noche en presencia de antígeno presentado mediante células objetivo adecuadas. La citoquina es capturada por un anticuerpo unido a la placa en el área directamente alrededor de la célula y ésta permanece unida cuando las células se destruyen con lisinas y se lavan. La detección se consigue mediante el uso de un anticuerpo de anticitoquinas de tipo secundario biotinilado y un conjugado de fosfatasa alcalina y estreptavidina. La acción de esta enzima en un sustrato cromóforo permite la visualización de las células que producen citoquinas.

Ensayos y datos de ELISPOT de vacuna Debido a la ausencia de epítopos de células T definidos de tipo murino, se proporcionó antígeno en forma de virus de vacuna recombinantes modificados genéticamente para expresar antígenos diana. Dichos virus se utilizaron para infectar células objetivo apropiadas para la presentación de antígeno a células efectoras en ensayos de EISPOT. Se detectaron respuestas a HPV 6bE1 después de PMID de las tres construcciones candidatas a ratones C57BL/6. Se analizaron estadísticamente los resultados de dos experimentos separados. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la figura 15 y 16. Los datos de inmunogenicidad ilustrativos que usan construcciones líderes y PMD en ratones: Datos y ensayos de CTL Las células activadas CD8+ T son capaces de destruir por lisinas células en respuesta a un péptido específico presentado en el contexto de moléculas MHC I singénicas. Esta función se puede determinar mediante el bioensayo de liberación de Eu3 + , una modificación no radiactiva del ensayo tradicional de liberación de cromo. El uso de este ensayo para estos propósitos requería la identificación de un epítopo de células T CD8+ derivado de la secuencia principal de la proteína 6bE1 de HPV. Esto se logró mediante la selección de una librería de péptidos que consistía de 15 meros que se superponen por 11 usando ELISPOT de citoquinas. Las poblaciones de respuesta se identificaron como células T CD4+ o CD8+ mediante técnicas de flujo habituales. La base de esta técnica incluye lisis de células objetivo marcadas con Ey3+ pulsadas con un péptido afín. Durante el transcurso de una incubación de dos horas, Eu3 se libera en el sobrenadante del cultivo tras la lisis de células objetivo por células T citolíticas. Esto se detecta mediante fluorimetría de resolución en el tiempo. La lisis específica se expresa como porcentaje total de la cantidad de lisis detectada cuando las células objetivo se destruyen con lisinas por medios químicos.

Valoración de datos inmunológicos celulares La evaluación inmunológica de HPV 116, HPV 117 y HPV 118, comprende estudios de inmunización repetida con PMID en ratones con análisis de ensayos de ELISPOT y CTL de Vacuna como productos inmunológicos. Todos los candidatos inducían una respuesta inmune a cada antígeno. Colectivamente, los datos de ELISPOT de Vacuna muestran que las respuestas a E1 no están comprometidas por mutación o fusión a los componentes de antígeno de E2. Cuando se comparan las respuestas de E1 entre HPV-108 (construcción única 6b E1), HPV 116, HPV 117 y HPV 118 las respuestas no son estadísticamente diferentes. Sin embargo, los datos de ELISPOT de Vacuna revelan una diferencia en respuestas al componente antígénico de HPV-11 E2. Las respuestas específicas del antígeno de E2 son significativamente mayores en ratones inmunizados con HPV 118 que en ratones inmunizados HPV 116 o HPV 117. En base a esto el HPV 118 solo, parece ser un inmunógeno superior que HPV 116 o HPV 117. El análisis de lisis de CTL de antígeno específico de E1 también reveló una tendencia en potencia. El porcentaje de lisis específica era más alto usando células T de ratones inmunizados con HPV 118 que o bien con HPV 116 o bien con HPV 117. Esta observación es reproducible. Tomados en conjunto, y en base a los datos de lisis tanto de ELISOT como de CTL de vacuna, HPV 118 es el inmunógeno más fuerte.

Conclusión. Según los criterios puramente inmunológicos la construcción HPV 118 es la más inmunogénica de las poliproteínas.

EiemDlo 7 El suministro PMID de proteína de fusión COPV E1/E2 de codón optimizado es más eficaz en la protección contra la enfermedad de papilomavirus oral canino que bien E1 de codón optimizado o bien E2 de codón optimizado por separado. Introducción El modelo animal de papilomavirus oral canino (abreviadamente COPV) es una buena imitación de la enfermedad de papilomavirus humano mucosal. Las características de la enfermedad producida en perros por COPV son muy similares a las que se producen en seres humanos (Nicholls et al., Virology 2001, 283(1) 31 - 39). Es importante un modelo de enfermedad de papilomavirus. El virus COPV infecta el epitelio mucosal canino y, después de un período de retraso de unas pocas semanas aparecen verrugas que después volvían a aparecer espontáneamente después de un período adicional de algunas semanas. El virus de COPV codifica homólogos de cada uno de los genes de papilomavirus humano (E1, E2, E4, E6, E7, L1 y L2). El modelo de enfermedad mucosal de COPV de perro se ha usado previamente como un modelo clave para desarrollar la razón fundamental de vacunas de papilomavirus de partículas similares a virus (VLP) (Ghim ef al., Vaccines 1995 25, 375-379, Suzich eí al., PNAS 1995, 92 11553-11557). Las vacunas de VLP de virus de papilomavirus humano están ahora en desarrollo y las pruebas clínicas en fase temprana se han completado recientemente en seres humanos. Los autores muestran que el ADN plasmídico que codifica una fusión de codón optimizado de genes E1 y E2 cuando se administra mediante PMID reduce la gravedad de la enfermedad más eficazmente que un plásmido que codifica solamente E1 de codón optimizado o E2 de codón optimizado.

Métodos Construcción del vector de fusión E2/E1 de codón optimizado Un gen sintético que codifica una secuencia de COPV E2 de codón optimizado se generó utilizando los métodos anteriormente descritos. Éste se fusionó al gen COPV E1 de codón optimizado recuperado del clon pCOPVEI c/o y se insertó en el vector WRG7077 para generar un nuevo clon que se denominó pCOPVE2/E1 c/o. Este clon expresa una proteína que comprende una fusión de COPV E2 (terminal N) y COPV E1 (terminal C). La poliproteína es del tamaño esperado según se determina mediante Western Blot.

Inmunización de perros cachorro con pCOPVEI c/o, oCOPVE2 c/o, v DCOPVE2/E1 c/o Se inmunizaron perros cachorro mediante PMID con cada uno de los tres plásmidos purificados pCOPVEI c/o, pCOPVE2 c/o y, pCOPV E2/E1 c/o. Se inmunizaron los animales en 12 lugares subcutáneos, 6 lugares no superpuestos en cada lado de la línea media abdominal. Todas las vacunaciones se realizaron con anestesia general. Hubo cinco animales en cada grupo. Seis semanas después de la primera vacunación, se llevó a cabo una vacunación de estimulación de una manera idéntica, usando el mismo procedimiento. Los animales inmunizados se sometieron a desafío con virus de COPV infeccioso 2 semanas después de la inmunización final de inmunización. La mucosa del labio superior de cada animal se escarificó ligeramente. Se aplicaron 10 µ? de virus COPV purificado a cada uno de los diez sitios (cinco en cada lado del labio superior) y se dejó que se absorbieran durante cinco minutos. El aislamiento y purificación de virus COPV infeccioso se ha descrito (Virology 1999, 265 (2) 365-374). Después del desafío con virus COPV se examinaron los sitios de desafío mucosal semanalmente. Se midió el tiempo (después de desafío) de aparición de verrugas (papiloma) y tamaño de las verrugas (mm).

En animales inmunizados con pCOPVEI c/o los papilomas se desarrollaron en los sitios de desafío de la mucosa comenzando en la semana 7 después del desafío. Los papilomas continuaron creciendo en tamaño alcanzando un tamaño medio de > 3,5 mm en la semana 11. En animales inmunizados con pCOPVE2 c/o los papilomas aparecieron primero en la semana 8 pero el tamaño medio de papiloma alcanzaba 1.5 mm en la semana 11. En animales inmunizados con pCOPVE2/E1 c/o aunque los primeros signos de enfermedad son coincidentes con los de los otros grupos, la gravedad global de la enfermedad se reduce significativamente. Un animal (de cinco) en el grupo pCOPVE2/E1 c/o estaba totalmente protegido contra el desarrollo de la enfermedad mientras que otros animales en el grupo solamente desarrollaron muy pocos papilomas que volvían a aparecer en un corto período (1 - 2 semanas). El ADN plásmídico que codifica una fusión de COPVE1 y COPVE2 es más eficaz que COPV E1 o COPV E2 en la prevención del desarrollo de la enfermedad en este modelo animal de infección de papilomavirus. (Figura 18).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de papilomavirus humano (HPV) que tiene epítopos de al menos tres antígenos Tempranos o fragmentos de los mismos de al menos dos cepas diferentes de HPV y en donde el polinucleótido tiene un coeficiente de uso de codón para genes humanos de más de 0.4 y menos de 1.0. 2. Un polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un antígeno es de HPV E1 o un fragmento del mismo. 3. Un polinucleótido según la reivindicación 2, caracterizado porque al menos un antígeno es de HPV E2. 4. Una secuencia de polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque es una secuencia de ADN. 5. Una secuencia de polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque codifica un polipéptido de HPV de un tipo de HPV o subtipo asociado con cáncer cervical, verrugas cutáneas benignas o verrugas genitales. 6. Una secuencia de polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque codifica un polipéptido de HPV de uno de los tipos 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 49, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. 7. Una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 6, caracterizada porque codifica un polipéptido de HPV de un tipo HPV o subtipo que se asocia con cáncer cervical o verrugas genitales. 8. Una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 4 ó 5, caracterizada porque codifica un polipéptido de HPV de uno de los tipos 6, 11, 16, 18, 33 ó 45. 9. Una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 5, caracterizada porque codifica un polipéptido de HPV de un tipo HPV o subtipo seleccionado de HPV 11 , 6a ó 6b. 10 Una secuencia de polinucleótidos según cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque codifica un polipéptido de HPV mutado que tiene función biológica reducida. 11. Una secuencia de polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque codifica un polipéptido de HPV mutado que comprende una o más mutaciones puntuales mediante las cuales una o más de las funciones naturales biológicas del polipéptido se inactiva. 12. Una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 1, comprendiendo un epítopo de antígeno E1 de HPV 6b un epítopo de HPV 6b E2, y un epítopo de HPV 11 E2. 13. Una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 1 a 12 teniendo un coeficiente de uso de codón para genes humanos de más de 0.5 pero menos de 1. 14. Un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos según cualquier reivindicación precedente unida operativamente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de polinucleótidos mediante una célula huésped. 15. Un vector de expresión según la reivindicación 14, caracterizado porque es p7313PLc. 16. Una composición farmacéutica que comprende una secuencia de polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-13. 17. Una composición farmacéutica que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 14-15. 18. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16 ó reivindicación 17 que comprende una pluralidad de partículas de oro revestidas con ADN. 19. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 ó 18 que comprende además un adyuvante. 20. Una composición farmacéutica según la reivindicación 19, caracterizada porque el adyuvante se codifica como una fusión con el polipéptido de HPV codificado por el polinucleótido. 21. El uso un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 en el tratamiento o profilaxis de una infección por HPV. 22. El uso un vector según cualquiera de las reivindicaciones 14-15 en el tratamiento o profilaxis de una infección por HPV. 23. El uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 18-20 en el tratamiento o profilaxis de una infección por HPV. 24. El uso de un polinucleotido según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 14-15 o una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16-20 en el tratamiento o profilaxis de verrugas cutáneas (piel), verrugas genitales, células escamosas atípicas de importancia indeterminada (ASCUS), displasia cervical, neoplasia intraepitelial cervical (CIN) o cáncer cervical. 25. Un método para el tratamiento o prevención de infecciones por HPV o cualquiera de los síntomas o enfermedades asociadas con las mismas, comprendiendo administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 o una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16-20. 26. Un método para el tratamiento o prevención de infecciones por HPV o cualquiera de los síntomas o enfermedades asociadas con las mismas, comprendiendo administrar una composición farmacéutica según las reivindicaciones 16-20 en un régimen de dosificación de estímulo por cebado con un sistema a base de vector viral recombinante o no viral que comprende un polinucleotido según cualquiera de las reivindicaciones 1-13.