MXPA04006363A - Composiciones y metodos relacionados con pak5. - Google Patents

Abstract

Esta invencion proporciona acidos nucleicos que codificada proteinas relacionadas con PAK5 de mamifero, y proporciona las proteinas codificadas. Esta invencion tambien proporciona vectores, celulas y composiciones. Finalmente, esta invencion proporciona metodos para inducir y para inhibir varios procesos celulares usando los acidos nucleicos y las proteinas de la presente.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS RELACIONADOS CON PAK5 CAMPO DE LA INVENCION ? lo largo de esta solicitud, se citan varias referencias. La descripción integra de estas referencias se incorpora a la presente como referencia en esta solicitud para describir más completamente el estado del arte al cual pertenece esta invención ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las GTPasas de la familia de Rho, incluyendo Cdc42, Rae y Rho, se identificaron primero como proteínas que tienen papeles calves en la regulación del citoesqueleto de actina en fibroblastos de mamíferos (18, 35, 37, 38) . La microinyeccion de Cdc42 activada en fibroblastos causa la inducción de filopodia, mientras que Rae activada conduce a la formación de lamelipodia, y Rho activada causa la formación de fibras portadoras. Ambas Cdc42Hs y Rae también se ha mostrado que tiene un papel en la disolución de las fibras portadoras (10, 18, 26), lo cual puede reflejar un antagonismo entre estas dos GTPasas y Rho (19, 39) . Aunque inicialmente se caracterizaron en fibroblastos, las Rho GTPasas ha mostrado también que regulan las morfologías de otros tipos de células. Por ejemplo, las Rho GTPasas han mostrado tener papeles importantes en la regulación de la prolongación de neuritas en C. elegans, drodophila, pollo, y neuronas y lineas celulares (5, 8, 14, 19, 22, 25, 47, 53) primarias de mamíferos. Esto se debe probablemente, al menos en parte al hecho de que la filopodia y la lamelipodia desempeñan papeles claves en el alargamiento de las neuritas (24) . Estudios previos han indicado que factores neurotrópicos, tales como NGF, BDGF, NT-3, NT- , y quimioatrayentes tales como netrin-1, pueden inducir la prolongación de neuritas o regular la conducta del axon (3, 45) . En líneas celulares neuronales de mamíferos, Cdc42 y Rae parecen actuar de manera antagonista con Rho. La introducción de mutantes activos constitutivamente de Cdc42 y de Rae en células de neuroblastoma NIE-115, conduce a la formación de neuritas (40, 51) y la producción de filopodia y de lamelipodia en conos de crecimiento desarrollador (19) , mientras que la introducción de mutantes negativos dominantes de Cdc42 y de Rae inhiben la prolongación de las neuritas en células NIE-115 y en células PC12 (8, 19, 40, 51) . En contraste, RhoAV14 activada causa la retracción de las neuritas en células PC12 y en células NIE-115, mientras que la inhibición de RhoA estimula la producción de neuritas en células N1E-115 (11, 19, 49-51) . Estos resultados sugieren que la inactivación de RhoA actualmente conduce a la activación de Cdc42 y de Rae, conduciendo asi a la producción de neuritas (19) . Consistente con esto, las células N1E-115 forman neuritas cuando son desarrolladas en ausencia de suero, pero no cuando son desarrolladas en la presencia de suero. Esto es presumiblemente porque los componentes en el suero, específicamente LPA, Rho activada, las cuales a su vez bloquean la producción de neuritas en respuesta a Cdc42 y a Rae (19) . Aunque Cdc42 y Rae claramente tienen papeles importantes en la regulación de los cambios morfológicos que controlan la formación del cono de crecimiento y la prolongación de neuritas, los mecanismos por los cuales opera la GTPasa en células neuronales aún no son completamente comprendidos. La identificación y la caracterización de objetivos moleculares para las Rho GTPasas es una etapa importante al determinar como controlan la morfología celular tanto en células neuronales como en células no neuronales. Elementos de la familia de la quinasa activada p21 ("PAK") de mamíferos de las serina/treonina quinasas constituyen una familia de quinasas que enlaza a Rae y a Cdc42, pero no a Rho (para revisión ver (7, 17, 43) ) . Los elementos de la familia PAK pueden ser colocados en dos categorías basadas en sus secuencias de aminoácidos. La primera categoría incluye PAK1 y PAK2 humanas y PAK3 de ratón. Cada una de estas tres proteínas quinasas tienen una región quinasa del carboxilo terminal y una región reguladora del amino terminal . En la región reguladora está una región de enlace GTPasa '("GBD") que enlaza a Cdc42 activada y a Rae. La región reguladora también contiene dos a tres regiones ricas en prolina que enlazan a las proteínas que contienen la región SH3 que incluyen la proteína adaptadora Nck y el factor de intercambio PIX (7), y un motivo que puede enlazar a las sububidades ß? de la proteína G (7) . Los elementos de esta familia son todas muy similares en la secuencia, que exhibe 73 % de identidad de secuencia total y aproximadamente 92 % de identidad de secuencia en la región GBD y quinasa (43) . Se piensa que los elementos de esta subfamilia de PAKs tienen papeles importantes al regular la morfología celular y la organización citoesquelética, aunque pueden no mediar específicamente el efecto citoesquelético que se activa por medio de Cdc42 y Rae. (13, 21, 44, 46) . PAK4 es el primer elemento de la familia PA que fue identificado como perteneciente a una segunda categoría de PAKs basada en su secuencia (1) . PAK4 contiene una GBD en el aminoácido terminal y una región quinasa en el carboxilo terminal, pero no enlaza a PIX o a Nck y no tiene un motivo (l)de enlace de ß? de la proteina G. Además, las regiones quinasa y GBD de PAK4 tienen solamente aproximadamente 50 % de identidad con las de las otras PAKs, y la región reguladora del lado exterior de PAK4 de la GBD es completamente diferente de las otras PAKs (1) . A diferencia de otras PAKs, PAK4 mostró ser un enlace entre la formación de filopodia y Cdc42 (1) . Además de la formación de filopodia, PAK4 puede también tener otras funciones. Por ejemplo, una mutante de PAK4 constitutivamente activa también conduce a la disolución de fibras portadoras y de adhesiones focales, muy probablemente al inhibir la actividad de RhoA (36) .

SUMARIO DE IA INVENCION Esta invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica a una región de PAK5 de mamífero, con la condición de que el ácido nucleico no codifique a la PAK5 de extensión total humana.

Esta invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica a una región que enlaza a la GTPasa de PAK5 de mamífero y una región reguladora de PAK5 de mamífero, pero no a una región quinasa de PAK5 de mamífero. Esta invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica a una región que enlaza a GTPasa de Pak5 de mamífero y a una región quinasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región reguladora de PAK5 de mamífero. Esta invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica a una región reguladora de PAK5 de mamífero y a una región quinasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región que enlaza a GTPasa de PA 5 de mamífero. Esta invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico aislado que híbrida específicamente a un ácido nucleico que codifica a una PA 5 de mamífero. Esta invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica a PA 5 de mamífero unida operativamente a un elemento regulador exógeno . Esta invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica a una PAK5 de mamífero unida operablemente a un elemento regulador exógeno. Esta invención proporciona adicionalmente un vector que comprende (a) uno de los ácidos nucleicos que codifican a la proteína de la presente o (b) un ácido nucleico que codifica al ácido nucleico de la presente el cual híbrida al mismo.

Esta invención proporciona adicionalmente una célula que comprende uno de los ácidos nucleicos unidos al elemento regulador de la presente. Esta invención proporciona adicionalmente proteínas codificadas por cada uno de los ácidos nucleicos de la presente . Esta invención proporciona adicionalmente composiciones, cada composición que comprende un portador aceptable farmacéuticamente junto con uno de los. ácidos nucleicos de la presente o una de las proteínas de la presente . Esta invención proporciona adicionalmente métodos para regular células usando los ácidos nucleicos o proteínas de la presente cuando sea apropiado. Estos métodos incluyen métodos de inducir e inhibir la formación de protrusión por medio de una célula de mamífero, causando la reorganización citoesquelética en una célula de mamífero, inducir e inhibir la formación de arrugas en una célula de mamífero inducir e inhibir la migración de una célula de mamífero, e inducir e inhibir la proliferación de una célula de mamífero. Esta invención proporciona adicionalmente un método de inhibir la transcripción de una molécula de DNA que codifica a PAK5 de mamífero usando uno de los ácidos nucleicos de la presente.

Esta invención proporciona adicionalmente un método de inhibir la translación de una molécula de mRNA que codifica a PAK5 de mamífero usando una de las moléculas de ácido nucleico de la presente. Esta invención proporciona adicionalmente un método de incrementar la prolongación neuronal en un sujeto que comprende administrar al sujeto una de ciertas composiciones de la presente cuando sea apropiado, en una cantidad efectiva para incrementar la prolongación neuronal en el sujeto. Esta invención proporciona aún adicionalmente un método de inhibir la prolongación neuronal en un sujeto que comprende administrar al sujeto una de ciertas composiciones de la presente cuando sea apropiado, en una cantidad efectiva para inhibir la prolongación neuronal del sujeto. Esta invención proporciona adicionalmente un método de determinar si una habilidad reducida de células de mamífero para formar protrusiones es debida al bloqueo de la transducción de señales ya sea desde el extremo 5' hacia 3 ' en el sentido de la hebra de DNA dúplex o al nivel de PAK5, el cual comprende: (a) introducir PAK5 en la célula; y (b) determinar si su número de protrusiones incrementa, dicho incremento indica que la habilidad reducida de las células para formar protrusiones es debida al bloqueo de la transducción de señales ya sea desde el extremo 5' hacia 3 ' en el sentido de la hebra de DNA dúplex o al nivel de PAK5. Finalmente, esta invenció proporciona un mamífero transgénico no humano cuyas células somáticas carecen de DNA que codifica a PAK5.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1A Se muestran el ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de PAK5 humana. Las regiones subrayadas de la secuencia de aminoácidos corresponden a la región GBD (aminoácidos 10-30) y región quinasa (aminoácidos 452-702). Figura IB Alineación de secuencia múltiple de la secuencia de aminoácidos de PAK5 con las secuencias de aminoácidos de PAK4 y de PAK6. Las identidades están realzadas. Figura 1C Se sondeó un tinción Northern de mRNA de tejido múltiple humano con cDNA que contiene parte de la región quinasa de PAK5. Se indica una banda de aproximadamente 5.5 kb. Figura ID Se muestran las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de PAK5 de ratón. Figura 2 PAK4 y PAK5 interactúa con Rae y Cdc42 activadas. Se transíectaron células 293 con cantidades iguales de vectores de expresión que codifican a las siguientes proteínas marcadas con Myc: PA 4 de tipo salvaje (Myc-PA 4 ) , PA 5 de tipo salvaje (Myc-PA 5) , o PAK5AGBD . Después de la expresión transitoria, las proteínas marcadas con Myc fueron inmunoprecipitadas desde lisados de células completas usando un anticuerpo anti-Myc de ratón y proteína A Sepharose. Se separaron los inmunocomplejos por medio de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las membranas fueron entonces sondeadas con RhoV14, RaclV12 o Cdc42V12 purificadas, como se indicó. Se pre-cargaron las GTPasas con [y-32P]GTP como se describió en los Materiales y Métodos. Una porción del lisado se usó para análisis por tinción Western (WB) con un anticuerpo anti-Myc para medir la cantidad de cada proteína transfectada en los lisados. Figura 3A ? 3B Los autofosforilatos de PAK5 y fosforilatos de histona H4 (HH4) . Se transíectaron células 293 con cantidades iguales ya sea del vector de GFP o vectores de expresión que contienen una de las siguientes proteínas marcadas con Myc: PAK4, PAK5, o PAK5 (S573N) . Después de expresión transitoria, las cantidades de proteínas marcadas con Myc se normalizaron por medio de tinciones Western sondeadas con un anticuerpo anti-Myc de ratón. Aproximadamente cantidades iguales de Myc-PAK4, Myc-MAK5, y Myc-PAK5 (S573N) fueron inmunoprecipitadas desde lisados celulares completos usando un anticuerpo anti-Myc de ratón y proteina A Sepharose. Los inmunocomplejos se incubaron entonces con histona H4 y [?-32?]??? en regulador de quinasa in vitro. Se analizó la fosforilación y la autofosforilación del substrato después de SDS-PAGE (gel al 15 %) y autoradiografia . Se indicaron tanto la autofosforilación de PAK4, PAK5, PAK5(S573N) como la fosforilación de histona H . En el Grupo A se expuso el gel por 15 minutos, y en el Grupo B, el gel se expuso por 2 horas. Los tinciones Western mostraron la expresión de Myc-PAK5 y Myc-PAK4 se mostraron en el grupo del fondo (gel al 10 %) . Figura 4 PAK5 activa la ruta de JNK. Se transíectaron las células 293 ya sea con el vector vacio, o con 5 g del vector de expresión que contenia el JNK (HA-JNK) marcado con HA ya sea solo o con dosis crecientes de vectores de expresión que contenían PAK5 marcado con Myc (1, 3, y 5 9) , o vectores de expresión que contenían Rac2L61 (2.5 µ?) , o ????1? (2.5 µg) . Después de expresión transitoria, se Usaron las células, y se normalizaron las cantidades de HA-JNK por tinción Western sondeada con un anticuerpo ant-HA de ratón. Cantidades iguales de HA-JNK fueron entonces inmunoprecipitadas desde lisados celulares completos usando un anticuerpo anti-HA de ratón y proteína A Sepharose. Los inmunoprecipitados se incubaron entonces con GST-c-Jun recombinantes en la presencia de [?-32?]??? en regulador de quinasa in vitro. Se analizó la fosforilación del substrato después de SDS-PAGE y autoradiografía . Se indicó la fosforilación de GST-C-jun. El número indica las veces de activación de JNK por medio de PAK5, Rac2L61 y ????1? cuantificadas por medio del formador de imágenes fosforiladas . Figura 5 PAK5 induce la prolongación de neuritas y filopodia. Los vectores de expresión que contienen EGFP (control) , PAK5, PAK5(S573N), PAK4, PAK4 (S445N) o PAK1(T423E) se transfectaron en células N1E-115. Los vectores que contienen PAK4 y PAK5 fueron ya sea co-transfectados con un vector de EGFP en una proporción de 1:3 (EGFP : PAK5) o bien expresados como fusiones de EGFP, con resultados similares. Se co-transfectó PAK1 (T423E) con EGFP. Se visualizaron las células por medio de microscopía por fluorescencia 20 horas después de transfección. Las células se fotografiaron entonces usando un lente con objetivo de 100X. Donde se muestran más de una célula , las células transfectadas, como se observa por microscopía por fluorescencia, se indicaron por una flecha. Las células transfectadas con EGFP, PA 1 (T423E) , o PA 4 del vector vacio, se muestran en los grupos a, b, y c, respectivamente. Los campos respectivos de las células que expresan a PAK5, PAK5(S573N), y ???4 (S445N) que exhibieron filopodia pero no neuritas se muestran en los grupos d, e, y f, respectivamente. Los campos representativos de células que exhiben neuritas diferenciadas y extendidas se muestran en los grupos g, h, e i, respectivamente. Figuras 6A y 6B La cuantificación de los efectos de PAK5 sobre la formación de neuritas. En el Grupo A, las células fueron transfectadas con vectores de expresión de EGFP que codifican a las proteínas indicadas junto con un exceso de tres veces ya sea de JNK negativo dominante, RhoV14, o C3 transferasa como se indicó. Después de transfección las células fueron desarrolladas en la presencia de suero. Las células que poseen neuritas se contaron y se indicó el porcentaje de células transfectadas que tuvieron neuritas. La co-transfección del vector de PAK5(S573N) con el vector de EGFP dio resultados similares que (EGFP-PAK5 (S573N) (no se. muestran los datos) . En el Grupo B, después de transfección con los vectores de expresión indicados, se cultivaron las células en medio libre de suero por 72 horas y las células que poseyeron neuritas se contaron como en el Grupo A. Se contaron en cada experimento aproximadamente 100 células transíectadas . Los resultados son un promedio de al menos dos experimentos diferentes para cada condición. Figura 7 PAK5 activada inhibe la actividad de Rho. Se transíectaron células 293 con el vector de expresión de Myc-RhoA de tipo salvaje junto con cantidades iguales ya sea del vector vacio, vectores de expresión de EGFP-PA 5 de tipo salvaje, o EGFP-PAK5 (S573N) (sin marcas de Myc) . Después de expresión transitoria, los Usados celulares se incubaron con los complejos GST-Rhotekin glutatión agarosa, los cuales enlazan específicamente a RhoA cargada con GTP. Los complejos fueron entonces lavados y separados por SDS-PAGE, y el contenido de GTP RhoA se analizó por inmunotinción Western usando el anticuerpo anti-Myc. El contenido de RhoA total se muestra en el grupo del fondo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Como se usa en esta solicitud, excepto se exprese de otra manera en la presente, cada uno de los términos siguientes tendrá el significado expuesto posteriormente. "Administrar" significará liberar, lo cual es efectuado o realizado usando cualquiera de los métodos y sistemas de liberación conocidos por los expertos en la materia. Administrar, se puede efectuar, por ejemplo, intravenosamente, pericardialmente, oralmente, vía implante, transmucosamente, transdérmicamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intraperitonealmente, intraraquídeamente, intralinfáticamente, intralesionalmente, o epiduralmente . Administrar, puede efectuarse, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces, y/o durante uno o más periodos prolongados. "Reorganización citoesquelética", significará un cambio en los filamentos o microfilamentos citoplásmicos de una célula. La reorganización citoesquelética incluye, sin limitación, un incremento en la proporción de filamentos F- a la G-actina monomérica, la formación de capas de actina condensada y la polimerización de la actina intracelular . "Célula inmune", significará una célula involucrada específicamente en una respuesta inmune, incluyendo pero no limitándose a células B, células T, linfocitos, células presentadoras de antígeno y macrófagos. "Inhibir la translación", significará reducir la cantidad o la velocidad de la translación, o detener completamente la translación. "Inhibir la expresión", significará reducir la cantidad o la velocidad de la expresión, o detener completamente la expresión. "Células de mamíferos", significará cualquier célula de mamífero. Las células de mamíferos incluyen, sin limitación, células que son normales, anormales y transformadas, y se ejemplifican por medio de las neuronas, células epiteliales, células musculares, células sanguíneas, células inmunes, células germinales, osteocitos, células endoteliales y células de blastos. "Migración" de una célula, significará el movimiento o la extensión de la célula de un punto a otro. "Prolongación de neurita" significará una prolongación desde una neurona, como se ejemplificó por medio de los axones y dendritas. "Prolongación" significará, con respecto a una célula, un proceso que se extiende desde el cuerpo de la célula. Las prolongaciones incluyen, pero no se limitan a, procesos fusiformes prolongados, procesos fusiformes cortos, procesos de espesamiento prolongados, procesos de espesamiento cortos, procesos de adelgazamiento prolongados, procesos de adelgazamiento cortos. "Substrato de quinasa PAK5" significará un substrato que puede ser fosforilada por PAK5. Substratos de quinasa PA 5 incluyen, pero no se limitan a, PAK5 e histona H . "Actividad de la quinasa PAK5" significará la fosforilación de PAK5 de un substrato de quinasa PAK5. Los "portadores aceptables farmacéuticamente" son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, regulador de fosfato 0.01 - 0.1 M y preferiblemente 0.05 M o solución salina al 0.8 %. Adicionalmente, dichos portadores aceptables farmacéuticamente pueden ser soluciones, suspensiones, y emulsiones acuosas o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilén glicol, polietilen glicol, aceites vegetales tales como aceites de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones acuosas/alcohólicas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio regulado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, aceites fijados o de Ringer lacteados. Los vehículos intravenosos incluyen rellenos de nutrientes y fluidos, rellenos de electrolitos tales como los basados en la dextrosa de Ringer, y los similares. Pueden también estar presentes los conservadores y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes secuestrantes, gases inertes, y los similares . "Formación de protrusión" significará, con respecto a una célula, cualquier crecimiento externo a la superficie celular. La formación de protrusiones incluye, pero no se limitan a filopodia, lamelopodia, prolongación y espiciformes . "Formación de arrugas" significará, con respecto a una célula, la formación de proyecciones en el borde conductor de la célula. La formación de arrugas se observa especialmente en arrugamientos celulares que parecen ser arrugadas . "Espiciforme" significará, con respecto a una célula, una proyección desde el borde de la célula, "espiciforme" incluye, por ejemplo, conos de crecimiento de nervios y "microespiciformes", los cuales son espiciformes que miden aproximadamente 100 nm y 5-10 µp? y apoyados por microfilamentos atados de manera libre. "Sujeto" significará cualquier mamífero que incluya, sin limitación, un ratón, una rata, un perro, un cobayo, un conejo y un primate. En la modalidad preferida, el sujeto es un ser humano.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Esta invención proporciona diez ácidos nucleicos. El primer ácido nucleico es un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica una región PAK5 de mamífero, con la condición de que el ácido nucleico no codifique a PAK5 humana de extensión total. En una modalidad del primer ácido nucleico, la región PA 5 es seleccionada del grupo que consiste de una región que enlaza a GTPasa de PA 5 de mamífero, una región reguladora de PAK5 de mamífero y una región de quinasa PAK5 de mamí fero . El segundo ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región que enlaza a GTPasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región de la quinasa PAK5 de mamífero o a una región reguladora de PAK5 de mamífero. El tercer ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región de quinasa PAK5 de mamífero, pero no a una región que enlace a GTPasa de PAK5 de mamífero o a una región reguladora de PAK5 de mamífero. El cuarto ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región reguladora de PAK5 de mamífero, pero no a una región que enlaza a GTPasa de PAK5 de mamífero o a una región quinasa de PAK5 de mamífero. El quinto ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región que enlaza a una GTPasa de PAK5 de mamífero y una región reguladora de PAK5 de mamífero, pero no a una región quinasa de PAK5 de mamífero. El sexto ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región que enlaza a GTPasa de PAK5 de mamífero y a una región quinasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región reguladora de PAK5 de mamífero.

El séptimo ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región reguladora de PAK5 de mamífero y a una región quinasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región que enlaza a GTPasa de PAK5 de mamífero. En una modalidad del primero, quinto, sexto y séptimo ácidos nucleicos, la PAK5 de mamífero es una PAK5 humana. En otra modalidad del primero, quinto, sexto y séptimo ácidos nucleicos, la PAK5 es una PAK5 de roedor. En una modalidad del primer ácido, nucleico, el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una PAK5 de roedor.

El octavo ácido nucleico es un ácido nucleico humano que híbrida específicamente al ácido nucleico que codifica a una PAK5 de mamífero. En una modalidad del octavo ácido nucleico, el ácido nucleico es DNA. En otra modalidad del octavo ácido nucleico, el ácido nucleico es RNA. El noveno ácido nucleico comprende una secuencia de PAK5 de mamífero operativamente unida a un elemento regulador exógeno. El décimo ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a PAK5 de mamífero unida operativamente a un elemento regulador endógeno. En una modalidad del noveno y décimos ácidos nucleicos, el ácido nucleico es DNA. En otra modalidad del noveno y décimo ácidos nucleicos, el ácido nucleico es RNA. Esta invención proporciona adicionalmente un vector que comprende (a) el primero, quinto, sexto, séptimo, noveno o décimo ácido nucleico o (b) un ácido nucleico que codifica al octavo ácido nucleico. En una modalidad, el vector es seleccionado del grupo que consiste de un plásmido, un cósmido, un bacteriófago y un virus eucariótico. En una modalidad adicional, el virus eucariótico antes mencionado es un adenovirus o un retrovirus . ¦ Esta invención también proporciona una célula que comprende el noveno o el décimo ácido nucleico. En una modalidad de esta célula, la célula es seleccionada del grupo que consiste de una célula bacteriana, una célula fúngica y una célula animal. En una modalidad adicional, la célula animal anteriormente mencionada es seleccionada del grupo que consiste de una neurona, una célula epitelial, una célula muscular, una célula sanguínea, una célula inmune, una célula germinal, un osteocito y una célula endotelial. Esta invención proporciona adicionalmente cada una de las proteínas codificadas por el primero hasta el séptimo ácidos nucleicos. Esta invención proporciona adicionalmente composiciones, cada composición comprende un portador aceptable farmacéuticamente y uno de los ácidos nucleicos o proteínas de la presente. Esta invención proporciona métodos para afectar a células con los ácidos nucleicos y proteínas de la presente. Para fines de conveniencia, los ácidos nucleicos y proteínas siguientes se mencionan colectivamente como "agentes inductores": (a) el primer ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región quinasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región que enlaza a GTPasa de PAK5 de mamífero; (b) el sexto, noveno, y décimo ácidos nucleicos; (c)la proteína codificada por el ácido nucleico de (a); y (d)la proteína codificada por el sexto ácido nucleico. También para fines de conveniencia, los ácidos nucleicos y proteínas siguientes se menciona colectivamente como "agentes inhibidores": (a) el primer ácido nucleico que comprende (i) una secuencia que codifica a una región que enlaza a GTPasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región quinasa de PA 5 de mamífero o a una región reguladora de PAK5 de mamífero, o (ii) una secuencia que codifica a una región reguladora de PAK5 de mamífero, pero no a una región que enlaza a GTAasa de PAK5 de mamífero o a una región quinasa de PAK5 de mamífero; (b)el quinto, séptimo, y octavo ácidos nucleicos; (c) las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos de (a); y (d) las proteínas codificadas por el quinto, séptimo, y octavo ácidos nucleicos. Composiciones que comprenden dichos agentes se mencionan en la presente como composiciones "inhibidoras" o "inductoras", según sea apropiado.

El primer método proporciona un método de inducir la formación de protrusión por medio de una célula de mamífero que comprende poner en contacto una célula con un agente inductor en una cantidad efectiva para causar la formación de protrusión por medio de una célula. En una modalidad de este método, la protrusión es una espiga, una prolongación, filopodia o lamelipodia. En la modalidad preferida, la prolongación es una prolongación de neurita. El segundo método es un método de causar la reorganización citoesquelética en una célula de mamífero que comprende poner en contacto la célula con un agente inductor en una cantidad efectiva para causar la reorganización citoesquelética en la célula. El tercer método es un método de inducir la formación de arrugas sobre una célula de mamífero, que comprende poner en contacto la célula con un agente inductor en una cantidad efectiva para inducir la formación de arrugas en la célula. El cuarto método es un método de inducir la migración de una célula de mamífero, que comprende poner en contacto la célula con un agente inductor en una cantidad efectiva para inducir la migración de la célula. El quinto método es un método de inducir la proliferación de una célula de mamífero, que comprende poner en contacto la célula con un agente inductor en una cantidad efectiva para inducir la proliferación d ela célula . El sexto método comprende proporcionar un método de inhibir la formación de protrusión por medio de una célula de mamífero, que comprende poner en contacto a la célula con un agente inhibidor en una cantidad efectiva para inhibir la formación de protrusión por medio de la célula. En una modalidad de este método, la protrusión es una espiga, una prolongación, filopodia o lamelipodia. En la modalidad preferida, la prolongación es una prolongación de neurita. El séptimo método es un método de inhibir la reorganización citoesquelética en una célula de mamífero, que comprende poner en contacto a la célula con un agente inhibidor en una cantidad efectiva para inhibir la reorganización citoesquelética en la célula. El octavo método es un método de inhibir la formación de arrugas sobre una célula de mamífero, que comprende poner en contacto a la célula con un agente inhibidor en una cantidad efectiva para inhibir la formación de arrugas sobre la célula. El noveno método es un método de inhibir la migración de una célula de mamífero que comprende poner en contacto a la célula con un agente inhibidor en una cantidad efectiva para inhibir la migración de la célula.

El décimo método es un método de inhibir la proliferación de una célula de mamífero que comprende poner en contacto a la célula con un agente inhibidor en una cantidad efectiva para inhibir la proliferación de la célula . Esta invención proporciona adicionalmente un método de inhibir la transcripción de una molécula de DNA que codifica a PAK5 de mamífero que comprende hibridar al octavo ("hibridar") ácido nucleico en la molécula de DNA bajo las condiciones que podrían de otra manera permitir la transcripción del DNA de modo de inhibir la transcripción de la molécula de DNA. Esta invención proporciona adicionalmente un método de inhibir la translación de una molécula de mR A que codifica a PAK5 de mamífero que comprende hibridar al octavo ("hibridar") al ácido nucleico en la molécula de mRNA bajo condiciones que podrían de otra manera permitir la translación del mRNA de modo de inhibir la translación de la molécula de mRNA. Esta invención proporciona adicionalmente métodos de uso para las composiciones de la presente en un sujeto. El primer método proporciona un método de incrementar la prolongación neuronal en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición inductora en una cantidad efectiva para incrementar la prolongación neuronal en el sujeto. En una modalidad de este método, el sujeto es seleccionado del grupo de un ratón, una rata, un conejo, un perro, un cobayo y un primate. En la modalidad preferida, el sujeto es un humano. El segundo método proporciona un método de inhibir la prolongación neuronal en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición inhibidora en una cantidad efectiva para incrementar la prolongación neuronal del sujeto. En una modalidad de este método, el sujeto es seleccionado del grupo de un ratón, una rata, un conejo, un perro, un cobayo y un primate. En la modalidad preferida, el sujeto es un humano. Esta invención proporciona un método de determinar si una habilidad reducida de célula de mamífero para formar protrusiones es debida al bloqueo de la transducción de señal ya sea desde el extremo 5 ' hacia 3 ' en el sentido de la hebra de DNA dúplex o al nivel de PAK5, que comprende : (a) introducir PAK5 en la célula; y (b) determinar si su número de protrusiones aumenta, indicando dicho incremento que la habilidad reducida de la célula para formar protrusiones es debido al bloqueo de la transducción de señal ya sea desde el extremo 5' hacia 3 'en el sentido de la hebra de DNA dúplex o al nivel de PAK5. En una modalidad de este método, la célula es una célula de ratón, una célula de rata, una célula de conejo, na célula de perro, una célula de cobayo o una célula de primate. En la modalidad preferida, la célula es una célula humana. También en la modalidad preferida, la célula es seleccionada del grupo que consiste de una neurona, una célula epitelial, una célula muscular, una célula sanguínea, una célula inmune, una célula germinal, un osteocito y una célula endotelial. Finalmente, esta invención proporciona un mamífero transgénico no humano cuyas células somáticas carecen del DNA que codifica a PAK5. En la modalidad preferida, el mamífero es un ratón. Se comprenderá mejor esta invención desde los Detalles Experimentales que siguen. Sin embargo, un experto en la materia apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos discutidos son meramente ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones que siguen a continuación. Detalles Experimentales Esta invención proporciona nuevos ácidos nucleicos que codifican a una quinasa activada p21, PAK5, y a las proteínas relacionadas que pueden inducir o inhibir varias funciones celulares incluyendo pero no limitándose a: prolongaciones celulares, migración celular, proliferación celular, formación de protrusión celular y reorganización citoesquelética . PAK5 comparte aproximadamente 85 % de identidad de secuencia con PAK4 en su región quinasa y el motivo GBD, pero es completamente diferente de PAK4 a lo largo del resto de su región reguladora. Como PAK4, PAK5 cae en la segunda categoría de PAKs basada en su secuencia de aminoácidos predicha. A diferencia de PAK4, no obstante, que es expresada en la mayoría de los tejidos, PAK5 es expresada en solamente un número limitado de tejidos y es especialmente muy expresada en el cerebro. Esto es de particular interés porque PAK5 es similar a MBT de Drosophila (28) . Se piensa que MBT tiene un papel en el desarrollo, proliferación, o supervivencia de células en el cuerpo fungiforme, una estructura cerebral de Drosophila . Activadamente, la expresión de PAK5 reforzó tanto la formación de filopodia como la prolongación de neuritas en células N1E-115. PAK5 constitutivamente activa tuvo aún más efecto dramático que PAK5 de tipo salvaje, mientras que mutantes de PAK5 negativa dominante inhibieron la prolongación de neuritas. En contraste a PAK5, PAK5 activada no efectuó prolongación de neuritas en estas células. Los resultados de la presente sugieren que PAK5 es un mediador importante en la ruta de señalización' por medio de la cual GTPasas de Rho controlan los cambios citoesqueléticos que son necesarios para promover la prolongación de neuritas. Materiales y Métodos Clonación de PAK5 Se cribó la base de datos EST usando una búsqueda de BLAST a fin de identificar nuevos elementos de la familia de PAK. El clornts97b05.xl de EST mostró similaridad con la región quinasa de PAK4 de mamífero desde el aminoácido 483 hasta el codón de detención. Para obtener el extremo 5' del clon correspondiente, se llevó a cabo una reacción de RT-PCR usando derivados de cDNA de R A total de testículos humanos como un molde. El cebador de 5' fue un oligonucleótido degenerado correspondiente a la secuencia APSNFEH (SEC ID NO: 5) en la región GBD de PAK4 y el cebador de 3', agtagggagtgccaaccaat (SEC ID NO: 6) fue un oligonucleótido correspondiente a una región en ts97b05.xl que difiere de PAK4. El producto de PCR resultante fue clonado y secuenciado. El cribado adicional de la base de datos reveló que tanto el producto de PCR como ts97b05.xl fueron homólogos al mRNA humano por KIAA1264. Para obtener el cDNA de extensión total en una pieza, se llevó a cabo otra reacción de PCR usando los oligonucleótidos correspondientes a los extremos 5' y 3' de KIAA1264. El producto de PCR de extensión total fue designado PAK5. Esta PAK5 también se encontró que era cercanamente idéntico al clon ABO40812 de GenBank. Plásmidos CDNAs que codifican a PAK5, PAK5RD, y PAK5RDAGBD fueron subclonados entre los sitios Clal y EcoRI en el vector de expresión pCAN-Myccl que contiene una marca del epitope de Myc. PAK5RD, correspondiente al aminoácido 1 al 451, es la parte amino-terminal de PAK5 sin la región quinasa, yse generó por PCR usando cDNA de PAK5 como el molde . PAK5RDAGBD, correspondiente a los aminoácidos 31 a 451, carece tanto de la región quinasa como la región GBD, y fue generada por PCR usando cDNA de PAK5 como el molde. PAK5(S573N) activo constitutivamente en pCAN-Mycl se generó por mutagénesis en sitio dirigido (equipo de Stratagene QuickChange) y contiene una substitución de serina a ácido glutámico en el aminoácido 602 que es un sitio de autofosforilación putativo, y una substitución de serina a asparagina en el aminoácido 573 en la región quinasa. PAK5(K478M) se generó también por mutagénesis en sitio dirigido y contiene una substitución de lisina a metionina en el aminoácido 478. cDNAs que codifican a PAK5, PAK5(S573N), y PAK5(K478M) fueron también subclonados entre los sitios HindIII y SacII en el vector de expresión pEGFP-C3 (Clontech) para obtener los vectores de PAK5-EGFP. Se describe en (1) PA 4 marcado con Myc. ????1?, GST-c-Jun y JNK marcado con HA se describen en (31) . JNK negativo dominante tiene mutaciones puntuales en los cuales sus dos sitios de fosforilación (Thr-183 y Tyr-185) se convirtieron a Ala y Phe, respectivamente, y se describen en (9) . Cdc42V12, RacV12, y RhoV14 se describen en (30) . Tinción Northern Se efectuó el análisis Northern usando una tinción de RNA de tejido múltiple humano (Clontech) . Se llevaron a cabo la hibridación y los lavados como recomendó el fabricante. La sonda fue un fragmento de 400 bp de la región quinasa de PAK5 que difiere en la secuencia de PAK4 o cualesquier otra secuencias en la base de datos de GenBank. La sonda fué marcada con [a-32P] dCTP (Amersham) por utilización de un equipo de cebado aleatorio (Stratagene) . Ensayo de Sobreposición Se describe el ensayo de sobreposición en (27) . Brevemente, se transíectaron células 293 con 10 µg de vector vacio, Myc-PA 4, o Myc-PAK5. PAK4 y PAK5 fueron entonces inmunopurificados usando anticuerpo anti-Myc (9E10, Santa Cruz) y las proteínas inmunopurificadas fueron separadas en SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se lavó entonces y se bloqueó con solución salina regulada con fosfato (PBS) que contenía albúmina de suero bovino al 1 % (BSA) y 100 mM de ditiotretitol (DTT) . Se precargaron GTPasas recombinantes (2 µg) con [y-32P]GTP y se incubaron por 5 minutos con la membrana de PVDF. Se lavó la membrana por 5 minutos y se expuso a una película por 2 horas. Producción de la proteína de fusión GST-C21 y Ensayos de actividad de GTPasa de Kho GST-C21 contiene 90 aminoácidos N-terminales de la proteína realizadora de Rho Rhotekin, que consiste de la región de enlace de Rho. BL21 de Escherichia coli transformada con la construcción GST-C21 fue desarrollada a 30 °C a una densidad óptica a 600 nm de 0.30. La expresión y la purificación de la proteína de fusión y los ensayos de actividad de GTPasa fueron efectuados como se describe en Sander y colaboradores (1999) . Abreviando, los lisados fueron preparados desde células 293 que fueron transfectadas con el vector de expresión de Myc-RhoA junto con ya sea el vector vacío, PAK5, o el vector de PAK5 activada. Los lisados fueron entonces incubados con proteínas de fusión GST-C21 expresadas bacterianamente enlazadas a perlas de agarosa acopladas con glutatión. Las perlas y las proteínas enlazadas fueron lavadas tres veces con un exceso de regulador de lisis y luego se eluyeron con regulador de la muestra de Laemmli. Las proteínas de Rho enlazadas fueron analizadas por tinción Western con anticuerpo contra la marca de Myc. Una porción del lisado fue salvada para análisis por tinción Western directo con el anticuerpo anti-Myc.

Preparación de proteínas recombinantes Se prepararon GST-c-Jun, GST-RaclV12 y GST-Cdc42V12 recombinantes, como se describe en (42) . Cultivo celular y transfeccion Todas las células fueron desarrolladas a 37 °C en C02 al 5 %. Se cultivaron células 293 y N1E-115 en medio Dulbecco's Modified Eagle' s (D EM) que contenia suero bovino fetal al 10 % (GibcoBRL) . Para transíecciones en células 293, se transfectaron un total de 10 µg de DNA en las células en placas de 10 cm (confluentes de 60 %) usando el método de precipitación con fosfato de calcio. Para las células N1E-115, se transfectaron 4 µ? de DNA total en las células, usando FuGENE6 (Roche), en pocilios de 35 mm (se sembraron 1 x 104 células por pocilio) que contenían cubreobjetos que fueron pre-recubiertos con 10 µg/ml de laminina de ratón (GibcoBRL) por 1 hora a 37 °C. Tinciones Western Se llevaron a cabo los tinciones Western como se describe en (1) . Ensayos de la proteína quinasa Para el ensayo de fosforilación de histona H4 (HH4) por medio de las PAKs, se transfectaron células 293 con 10 µg de vector vacio, vectores de Myc-PAK4, o Myc-PAK-5 (de tipo salvaje o activa constitutivamente) . Se cosecharon las células en regulador de M2 (32) 48 horas después de transíección . Cantidades iguales de las proteínas marcadas con Myc, como se ensayaron con tinción Western, se inmunopurificaron entonces desde aproximadamente 100 g de extractos celulares usando el anticuerpo generado contra el epitope marcado con Myc (9E10, Santa Cruz) y la proteina A Sepharose. Después de 2 hr de incubación a 4 °C, los inmunoprecipitados fueron lavados dos veces en regulador de M2 y dos veces en un regulador que contenia 20 mM de HEPES (pH de 7.5) y 10 mM de MgCl2 luego se incubaron junto con 5 µg de HH4, en un regulador que contenia 20 mM de HEPES (pH de 7.5), 10 mM de MgCl2, 20 mM de fosfato de ß-glicerol, 10 mM de PNPP, 1 mM de DTT, 50 µ? de Na3V04, 20 µ? de ATP, y 5 µ?? de [?-32P]ATP por 20 minutos a 30 °C. Se terminó la reacción con regulador de la muestra de SDS-PAGE, seguido por SDS-PAGE y autoradiografia . Para analizar la actividad quinasa de JNK marcada con hemaglutinina (HA), se transfectaron células 293 ya sea con 10 µg de vector vacio o bien con 5 µg del vector de expresión de JNK marcado con HA en la ausencia o la presencia de dosis crecientes de Myc-PAK5 (1, 3, y 5 µg) , o vectores de expresión que contienen Rac2L61 (2.5 µg) , o ????1? (2.5 µg) . La cantidad total de DNA en cada transfección fue conservada en 10 µg usando el vector vacío. Las células fueron cosechadas 48 horas después de transfección y la cantidad de HA-JNK en Usados celulares se normalizó por tinción Western. Cantidades iguales de HA-JNK se inmunopurificaron entonces desde aproximadamente 100 µg de lisados celulares usando un anticuerpo anti-HA (12CA5, Boehringer Mannheim) y proteina A Sepharose en regulador 2 a 4 °C por 2 horas. Las perlas de proteína A Sepharose fueron entonces lavadas dos veces en regulador de M2, y dos veces en un regulador que contenga 20 mM de HEPES (pH de 7.5) y 10 mM de MgCls, luego se incubaron en un regulador que contenía 20 mM de HEPES (pH de 7.5), 10 mM de MgCl2, 20 mM de fosfato de ß-glicerol, 10 mM de PNPP, 1 mM de DTT, 50 µ? de Na3V0, 20 µ? de ATP, y 5 µ?? [?-32P]ATP, junto con 2 g de GST-c-Jun recombinante purificado por 20 minutos a 30 °C. Se terminó la reacción con regulador de la muestra de SDS-PAGE, seguido por SDS-PAGE y autoradiografía. La fosforilación de c-Jun se cuantificó por medio del análisis por medio del fosfoformador de imágenes Inmunofluorescencia Después de transfección transitoria, células N1E-115 se fijaron en paraformaldehido al 3 % por 20 minutos, se permeabilizaron en Tritón X-100 al 0.1 %, y se bloquearon con suero de cabra al 5 % por 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se tiñeron por la presencia de Myc-PAK5, Myc-PAK5 (K4 8M) , Myc-PAK5RD, Myc-PAK5RDAGBD, o Myc-Cdc42N17 con anticuerpo anti- yc de ratón (9E10, Santa Cruz) , luego se incubaron con conjugado de IgG anti-ratón de cabra con rodamina (PIERCE) . Ensayo de calificación de la prolongación de neuritas Se desarrollaron células N1E-115 sobre cubreobjetos prerecubiertos con laminina de ratón, en pocilios de 35 mm, y se transfectaron con 4 µg de los vectores de expresión indicados. 20 horas después de la transfección, se examinaron las N1E-115 por microscopía por fluorescencia para detectar la presencia de las células verdes fluorescentes que contenían los plásmidos transfectados . Se contaron las células transfectadas que poseen estructura similar a neurita con una longitud de al menos un cuerpo celular y se calificaron como el porcentaje de células transfectadas totales. Las imágenes se tomaron ya sea con un microscopio invertido Nikon DIAPHOT 300 con fijaciones de epi-fluorescencia y una cámara CCD de color usando un lente con objetivo de 10X, o con un microscopio para fluorescencia OPTIPHOT-2 y una cámara digital que usó un lente con objetivo de 60X. Generación de ratones agotados de PAK5 y de PAK4 Se generó un vector objetivo de PA 5 al reemplazar el exon 3, el cual contiene la parte crítica de la región quinasa, con un gen con resistencia a la neomicina. Este vector fue electroforado en células ES, y se aislaron clones resistentes G418.E1 análisis por tinción Southern reveló que tres clones contuvieron el evento de recombinación homólogo deseado. Estos clones fueron inyectados en blastocistos para generar quimeras. Las quimeras fueron entonces cruzadas para generar heterocigotos de PAK5. Los ratones heterocigóticos con PAK5 cruzados dieron origen a ratones sin PRK5. Se generó un vector objetivo alternativo en el cual el exon 1 es eliminado en vez del exon 3. El exon 1 contiene el codón de inicio y la región de enlace de GTPasa. Usando procedimientos similares a los descritos anteriormente, las quimeras se generaron usando este vector. Estas quimeras se retrocruzaron para generar heterocigotos de PAK5 y PAKy agotados como se describió anteriormente. Resultados Identificación de ???5, un nuevo elemento de la familia PAK de quinasas Se clonó el cDNA de PAK5 como se describió en la sección de Materiales y Métodos. La secuencia de PAK5 de extensión total y la secuencia de aminoácidos predicha se* muestran en la Figura 1A. La región quinasa, que comprende los aminoácidos 10-30, y la región de GBD, que comprende los aminoácidos 452-702, son subrayados en la figura. Una comparación entre las secuencias de aminoácidos de estas regiones y de aquellas de hPAK4, MBT , hPAK6 y hPAKl demostraron que PAK5 comparte sorprendentemente homología con la proteína MBT de Drosophila es expresada en el cuerpo fungiforme, una estructura cerebral de Drosophila . Por ejemplo, la región quinasa de PAK5 comparte un 80 % de identidad de secuencia con la misma región de MBT (de los aminoácidos 371-620 de MBT) . Esto es solamente ligeramente inferior al 84 % de identidad de secuencia de que PAK4 comparte con la misma región de PAK4 (de los aminoácidos 324-573 de PAK4) , y significativamente mayor que su 76 ¾ y 57 % de identidad con las regiones quinasas de PAK6 y de PAK1, respectivamente (de los aminoácidos 273-523 de PAK1; y de los aminoácidos 420-659 de PAK6) . PAK5 comparte homología de secuencia con alta similaridad con MBT en la región GBD. La región GBD comparte 86 %, 76 %, 70 %, y 57 % de identidad con las regiones correspondientes de ???5 (de los aminoácidos 10-30 de PAK4), MBT (de los aminoácidos 10-30 de MBT), PAK6 (de los aminoácidos 10-30 de PAK6) y PA 1 (de los aminoácidos 74-94 de PA 1) , respectivamente. Afuera de las regiones GBD y quinasa, hay una pequeña homología de secuencia entre PA 5 y ya sea PAK4 o cualesquier otras proteínas conocidas. Además, no hay sitios de reconocimiento de la región SH3 obvios o regiones de enlace de ?ß? similares a los que en PAK1 son evidentes en PAK5. El análisis Northern de PAK5 indica que es expresada en cerebro y páncreas . Muy poco o nada de PAK5 podría detectarse en varios tejidos humanos diferentes que fueron examinados (no se muestran los datos) . PAK5 interactúa con Cdc42Hs y Rae enlazados a GTP El análisis por formación de secuencias indica que tiene un motivo GBD/CRIB putativo similar al de PAK . PAK4 enlaza fuertemente a Cdc42 y más débilmente a Rae a través de estas regiones. Para determinar si PAK5 interactúa con las GTPasas, se usó un ensayo de sobreposición en el cual los filtros que contenían PAK4 y PAK5 inmovilizadas fueron sondeados con RacIV12 o Cdc42VI2 cargadas con GTP. Se encontró que PA 5 interactúa tanto con Cdc42 como con Rae (Figura 2), lo que sugiere que PA 5 es un objetivo para estas GTPasas. Como PAK , no obstante, PAK5 pareció interactuar más estrechamente con Cdc42 que Rae. PAK5 no enlazó a RhoA cargada con GTP, y una mutante de PAK5 que carece del GBD (PAK5AGBD) no fue capaz de enlazar a Cdc42 o a Rae. ???5 autofosforiló y fosforiló un substrato exógeno Previamente, se mostró que PAK4 de tipo salvaje puede autofosforilar y fosforilar Histona H4 (HH4) (1), y que una PA 4 activa constitutivamente, PAK4(S445N), tuvieron actividad quinasa más fuerte que PAK4 de tipo salvaje (36). PA 4(S445N) tuvo una mutación de serina a ácido glutámico en el sitio de autofosforilación putativo (aminoácido 474) y una mutación de serina a asparagina en el aminoácido 445, lo cual se piensa que funciona por estabilización de la desviación catalítica (36, 48) .Estos mutantes tienen un nivel elevado de actividad quinasa, pero su especificidad de substrato no parece ser alterada y no induce cambios morfológico no específicos (36) . A fin de determinar si PAK5 funciona similarmente, se transfectaron células 293 con el vector de expresión de PAK5 (S573N) marcadas con Myc, que contiene las mutaciones análogas en PAK4 (S445N) . Se usó para la comparación el vector de expresión de PAK4 de tipo salvaje marcado con Myc. Cantidades iguales de PAK5, PAK5(S573N), y PAK4 (evaluadas por tinción Western) fueron inmunopurificadas desde lisados celulares y se incubaron con Histona H4 (HH4) en regulador de quinasa con [?-32?]???. La autofosforilación y la fosforilación de HH4 se analizaron después de SDS-PAGE y se radiografiaron (Figuras 3A y 3B) . Los resultados indican que tanto PAK5 como PAK5(S573N) podrían autofosforilar y fosforilar HH4, aunque la actividad quinasa de PAK5(S573N) fue más fuerte que la de PAK5 de tipo salvaje (Figura 3A) . PAK5 de tipo salvaje tuvo actividad significativamente más fuerte que una cantidad equivalente de PAK4. De hecho, el autoradiograma tuvo que ser sobreexpuesto en relación al la actividad de PAK5, a fin de detectar la actividad de PAK4 (Figura 3B) . ???5 activa la ruta de JNK Además la regulación del citoesqueleto de actina, una de las funciones de Cdc42Hs y Rae es activar la ruta de la quinasa MAP de JNK (2, 4, 6, 30, 52) . Ya que PAK5 interactúa con Rae y Cdc42, se probó su habilidad para activar JNK. Se transíectaron células 293 con un vector de expresión de JNK marcado con HA junto con dosis crecientes de un vector de expresión que contenia el cDNA de PAK5. Se usaron como controles positivos los vectores de expresión de MEKK1 y Rae activados. Después de expresión transitoria, JNK se inmunopurificó desde los Usados celulares, seguido por un ensayo de quinasa in vitro usando GST-c-Jun como un substrato. Los resultados indicaron que la sobre expresión de la PAK5 de tipo salvaje condujo a la activación de la ruta de JNK que fue casi tan fuerte como la activación por medio de Rae (Figura 4) . En contraste, la activación de JNK por PAK4 fue significativamente inferior que la activación de Rae (1) . PAK5 no activó la ruta de ERK y activó ineficientemente la ruta de p38 (no se mostraron los datos) . La expresión de PAK5 conduce a la formación de filopodia a los procesos de neuritas en células NlE-115 Para determinar si la expresión de PAK5 podría promover cambios morfológicos en células neuronales, células de neuroblastoma N1E-115 se desarrollaron en la presencia de suero se transfectaron transitoriamente ya sea con el vector vacío que contenga solamente GFP Mejorado (RGFP) o vectores de expresión que contengan PAK5 o PAK5(S573N) fusionadas a EGFP. Para comparación, se transíectaron las células con un vector que contenía PA 1(T423E) activada. Las células transfectadas con EGFP sola parecieron similares a células no transfectadas . La mayoría de las células tuvieron morfologías redondeadas, y aproximadamente 7 % de ellas tuvieron extensiones similares a neuritas. En contraste, al menos tres veces que muchas células que expresan a PAK5 tuvieron procesos similares a neuritas. Más notablemente, la expresión de P7AK5(S573N) condujo a la producción de procesos similares a neuritas largos en aproximadamente 70 % de las células transfectadas . Tanto las células que expresan a PA 5- y a PA 5(S573N), como las células que no tienen neuritas tuvieron una disminución dramática en filopodia. En contraste a PAK5, la expresión de PAKl (T423E) no condujo a la producción decreciente ya sea de filopodia o bien de neuritas en estas células. Las células representativas de cada condición visualizada a 60X de amplificación se muestran en la Figura 5A. La Figura 5B mostró campos de células que expresan al vector vacio, PA 1(T423E), o PA 5(S573N) visualizados a una amplificación de 10X. Los porcentajes de neurita que poseen células bajo las diferentes condiciones se resumen en la Figura 6A. Las rutas de Cdc42 y de Rae parecen funcionar antagonisticamente con la ruta de Rho en células N1E-115, donde Cdc42 y Rae son requeridos para la prolongación de neuritas y Rho causa la retracción de las neuritas (19, 40, 51) . Para ver si ?? 5 funciona antagonisticamente con Rho, las células fueron transfectadas con PAK5(S573N) junto con un vector de RhoAV14 activado. La expresión de RhoAV14 causó una reducción significativa en el porcentaje de células transfectadas de PAK5(S573N) que poseen neuritas (ver la Figura 6A) . En contraste, aproximadamente 90 % de células transfectadas con PAK5 y el inhibidor C3 transferasa de Rho tuvieron neuritas. J K negativo dominante no tuvieron efecto inhibidor sobre la prolongación de neuritas (ver la Figura 6A) , aunque efectivamente bloqueó la activación de MEKK del promotor de c-Jun (no se muestran los datos) . Los resultados indicaron que PAK5 activa la prolongación de neuritas por medio de una ruta que funciona antagonisticamente a la ruta de Rho y que es independiente de la activación de JNK. Para probar si PAK5 puede inhibir actualmente la actividad de RhoA, se transfectaron células 293 con RhoA de tipo salvaje junto con ya sea un vector vacio, PAK5 de tipo salvaje o PAK5(S573N), y se evaluó la actividad de RhoA por medio de un ensayo de enlace de Rhotekin. Como se muestra en la Figura 7, PAK5 activada causó una reducción significativa en la cantidad de Rho activada, pero no tuvo efecto sobre los niveles de RhoA total. PAK5 es necesaria para la prolongación de neuritas en células N1E-115 Para ver si PAK5 es necesaria para la prolongación de neuritas, se transíectaron células N1E-115 ya sea con el vector vacio o con vectores que contengan uno de tres imitantes de PAK5 negativos dominantes diferentes; PAK5(K478M) tuvo una sola mutación puntual en la región quinasa que vuelve a la quinasa inactiva, PAK5RD carece de la región quinasa, y PAK4RDAGBD carece de la región quinasa y de la región de GBD. Después de tranfección transitoria las células fueron cambiadas a medio libre de suero para inducir la prolongación de neuritas y las células fueron observadas 72 horas después. Mientras que aproximadamente 70 % de las células transíectadas en el vector vacio tuvieron neuritas, la expresión de cada uno de los itiutantes negativos dominantes condujo a una reducción en el porcentaje de células que poseen neuritas. Los niveles de inhibición por los imitantes de PAK5 negativos dominantes fueron similares al nivel de inhibición que resultó de la expresión de Cdc42N17 negativos dominantes. La expresión de PA 5 de tipo salvaje no causó alguna inhibición en la prolongación de neuritas. Estos resultados se resumen en la Figura 6B. Tomados juntos, estos resultados indican que PAK5 es tanto necesario como suficiente para inducir la prolongación de neuritas en células N1E-115. PAK5 heterocigóticos y ratones agotados Se generaron ratones heterocigóticos por eliminación de PA 5 como se describió en la sección de Métodos y no se generó ningún ratón de PAK5 se generó al inseminar los heterocigotos . Las cruzas entre dos heterocigotos de PAK5 dieron origen a descendencia con PAK5 heterocigótico (+/-) de tipo salvaje (+/+) , y PAK5 agotados (-/-), cuando se evaluó por análisis por PCR y análisis por tinción Southern de DNA de la cola. El análisis por tinción Western de lisados de cerebro se llevarán a cabo para confirmar la ausencia de la proteína PAK5 en el ratón (-/-) . Los ratones con PAK5 (-/-) fueron tanto viables como fértiles. Discusión Se describe en la presente la caracterización de un nuevo elemento de la familia PAK de mamíferos, PAK5, que interactúa específicamente con Cdc42 cargado con GTP y más débilmente con Rae. PAK5 comparte homología de secuencia con PAK4 en las regiones quinasa y GBD, aunque hay muy poca similaridad de secuencia entre estas dos proteínas quinasas afuera de estas regiones. A diferencia PAK4, PAK5 es solamente expresada en un número limitado de te idos, y es especialmente muy expresada en el cerebro. A este respecto, es intrigante que PAK5 comparta similaridad de secuencia con MBT de Drosophila (28) , una quinasa que se piensa que regula el crecimiento de células en el cuerpo fungiforme cerebral de Drosophila. Por consiguiente PAK5 es un excelente candidato para un objetivo de Cdc42/Rac que regula el crecimiento y la morfología en células neuronales . La organización citoesquelética es una parte crítica del desarrollo neuronal. Por ejemplo, filopodia y lamelipodia desempeñan papeles claves en la conducta de los conos de desarrollo neuronal hacia marcas atractivas y lejos de marcas repulsivas, y la extensión de las neuritas tiene lugar cuando se estabilizan la filopodia y la lamelipodia. La estabilización de estas estructuras por extensión de nuevas filopodias y lamelipodias de modo que el ciclo de la conducta y el desarrollo del axon pueda continuar (24, 33) . Porque la formación de filopodia y lamelipodia es tan importante para la prolongación de neuritas y el desarrollo de la conducta cónica , ha habido considerable interés en el posible papel de las GTPasas de Rho en estos procesos. Son de particular interés Cdc42 y Rae, las cuales se describieron primero como proteínas que regulan la formación de filopodia y de lamelipodia en fibroblastos. Subsecuentemente se encontró que tanto Cdc42 como Rae desempeñan papeles claves en todos los aspectos del desarrollo neural, incluyendo el desarrollo de la conducta cónica y la extensión de axones (24) . Las proteínas realizadoras que median los cambios morfológicos inducidos por las GTPasas de Rho en células neuronales no son aún definidas claramente. La serina/treonina quinasas de PAK son buenas candidatas porque son objetivos directos de Cdc42 y de Rae. Las PAKs 1, 2, y 3, no obstante, pueden no estar involucradas directamente en todos los cambios citoesqueléticos inducidos por estas GTPasas, y los mutantes realizadores de Cdc42 y Rae que no pueden enlazar a los que pueden aún inducir filopodia y lamelipodia (13, 21) . En contraste, PAK4, el cual es el elemento descubierto de un nuevo grupo de PAKs, regula directamente la formación de filopodia en respuesta a Cdc42. PAK4 tiene una Región de Enlace de GTPasa modificada (GBD) en comparación con las PAKs previamente identificadas, y puede aún enlazar a mutantes realizadores de Cdc42 que no enlazan a las PAKs 1, 2, y 3, vía esta región (1) . PAK5 es similar a PAK4 en secuencia, especialmente con las regiones GBD y quinasa, pero es expresada en el cerebro. Por consiguiente PAK5 es contemplada en esta invención como un objetivo para las GTPasas involucradas en la prolongación de neuritas. Aunque los elementos de la familia PAK de Drosophila, que incluye las PAK5 y MBT de Drosophila, se piensa que están involucradas en el desarrollo neuronal (12, 34), los papeles para PAKs de mamíferos en la neurogénesis son menos bien definidas. Se encontró que la expresión de PAK5 activada condujo a un incremento dramático en al formación de extensiones similares a neuritas en células N1E-115. Igualmente en el subgrupo de células que expresan a PAK5 en las que no se vieron neuritas, hubo una producción creciente de filopodia, la cual es una etapa importante en la producción de los procesos de neuritas. Los resultados de la presente sugieren, por consiguiente, que PAK5 de hecho es un objetivo importante para Cdc42, y posiblemente Rae, en células neuronales, que regulan la formación de filopodia y de los procesos de neuritas. Los trabajos previos han mostrado que PAK1 puede también activar la prolongación de neuritas en células PC12. Sin embargo, esto requiere que se lleve a cabo en la membrana por adición de una secuencia que termina en la membrana, y tiene lugar por medio de un mecanismo que no requiere su actividad quinasa o su región de enlace de Cdc42/Rac (GBD) . Por consiguiente PAK1 debe de funcionar como un tipo de proteina de obstrucción que reclutan a otras proteínas en la membrana donde pueden promover la prolongación de neuritas (8) . Se encontró aquí que PAK5 activada no promovió la prolongación de neuritas en células N1E-115. En contraste, PAK5 activó claramente tanto la formación de filopodia como la prolongación de neuritas en estas células. Esto no requirió el objetivo de membrana de PAK5, y la extensión de la prolongación de neuritas se relacionó directamente con el nivel de su actividad quinasa. Los resultados de la presente sugieren, por consiguiente, que PAK5 regula la morfología de estas células por proteínas fosforiladoras objetivo que están específicamente involucradas en la prolongación de neuritas . Los substratos para PA 5 y los mecanismos por los cuales activa la prolongación de neuritas en células N1E-115 permanece elucidada. Una posibilidad es que de manera similar a Cdc42 y Rae, PAK5 puede promover la prolongación de neuritas por medio del mecanismo que es antagonístico a Rho (19,40,51) . Consistente con esto, se encontró que la sobre expresión de un mutante Rho activo constitutivamente, RhoV14, bloquea la producción de neuritas por PAK5 activada. Por consiguiente, será interesante determinar, si PA 5 funciona al inhibir la actividad de Rho. Se encontró también que, a similitud de Cdc42 y Rae (2, 4, 6, 30, 52), PAK5 activa la ruta de JNK. No obstante, aunque JNK ha estado implicada en la diferenciación de las células PC12 (15, 16, 23), se mostró indispensable para la diferenciación de células N1E-115 (40) , y se encontró que una JNK inactiva a la quinasa no tuvo efecto inhibidor sobre la prolongación de las neuritas activado por PAK5. Por consiguiente estos resultados sugieren que JNK es parte de una ruta activada por PAK5 paralela, y no parte de la ruta que conduce a cambios morfológicos. La proteina MBT de Drosophila es muy similar a PAK5 en secuencia, específicamente en la región quinasa y en el motivo GBD. De manera interesante, la disrupción del gen mbt conduce a una reducción en el número de células en los cuerpos fungiformes de drosophila cerebral. Por consiguiente se propuso que MBT está involucrada en la regulación de la proliferación o la supervivencia de células neuronales (28) . De manera interesante se observó que la muerte celular en el desarrollo del sistema nervioso puede resultar de conexiones impropias, o falta de conexiones, entre neuronas y sus objetivos (41). Puesto que MBT es similar a PAK5 en secuencia, una posibilidad intrigante es que la muerte celular en moscas de mbt mutantes tiene lugar porque las células carecen de los axones de desarrollo apropiadamente y por consiguiente fallan al hacer sus propias conexiones. Otra posibilidad es que MBT y PAK5 podrían activar específicamente la ruta de la supervivencia celular. A este respecto es interesante que. JN activada por PAK5, ya que la ruta de JNK ha estado implicada en la regulación del desarrollo celular en células de mamíferos (29) y se piensa que contribuye tanto a la supervivencia como a la apoptosis en diferentes partes del cerebro (20) . References 1. Abo, A., J. Qu, M. S. Camarano, C. Dan, A.

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un ácido ¦ nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica a una región de PAK5 de mamífero, con la condición de que el ácido nucleico no codifique a PAK5 de extensión total humana. 2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región de PA 5 es seleccionada del grupo que consiste de una región de enlace GTPasa de PAK5 de mamífero, una región reguladora de PA 5 de mamífero y una región quinasa de PAK5 de mamífero. 3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región de enlace GTPasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región quinasa de PAK5 de mamífero o a una región reguladora de PAK5 de mamífero. 4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región quinasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región de enlace GTP-asa de PAK5 de mamífero o a una región reguladora de PA 5 de mamífero. 5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica a una región reguladora de PAK5 de mamífero, pero no a una región de enlace GTPasa de PAK5 de mamífero o a una región quinasa de PA 5 de mamífero. 6. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende una secuencia que codifica a una región de enlace GTPasa de PA 5 de mamífero y a una región reguladora de PAK5 de mamífero, pero no a una región quinasa de PA 5 de mamífero. 7. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende una secuencia que codifica a una región de enlace GTPasa de PA 5 de mamífero y a una región quinasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región reguladora de PA 5 de mamífero. 8. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende una secuencia que codifica a una región reguladora de PA 5 de mamífero y a una región quinasa de PAK5 de mamífero, pero no a una región de enlace GTPasa de PAK5 de mamífero. 9. El ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1, 6, 7 u 8, caracterizado porque la PAK5 de mamífero es una PAK5 humana. 10. El ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1, 6, 7 u 8, caracterizado porque la PAK5 de mamífero es una PAK5 de roedor. 11. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica a una PAK5 de roedor. 12. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque específicamente híbrida al ácido nucleico que codifica a una PAK5 de mamífero. 13. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ácido nucleico es DNA. 14. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ácido nucleico es RNA. 15. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende una secuencia que codifica a PAK5 de mamífero unida operativamente a un elemento regulador exógeno. 16. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende una secuencia que codifica a PAK5 de mamífero unida operativamente a un elemento regulador endógeno. 17. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizado porque el ácido nucleico es DNA. 18. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizado porque el ácido nucleico es R A. 19. Un vector caracterizado porque comprende (a) el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1, 6, 7, 8, 15 o 16, o (b) un ácido nucleico que codifica al ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12. 20. El vector de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el vector es seleccionado del grupo que consiste de un plásmido, un cósmido, un bacteriófago y un virus eucariótico. 21. El vector de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el virus eucariótico es un adenovirus o un retrovirus. 22. Una célula caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 15 o 16. 23. La célula de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de una célula bacteriana, una célula fúngica y una célula animal . 24. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula animal es seleccionada del grupo que consiste de una neurona, una célula epitelial, una célula muscular, una célula sanguínea, una célula inmune, una célula germinal, un osteocito, y una célula endotelial. 25. La proteína caracterizada porque es codificada por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 26. La proteína caracterizada porque es codificada por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3. 27. La proteína caracterizada porque es codificada por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4. 28. La proteína caracterizada porque es codificada por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5. 29. La proteína caracterizada porque es codificada por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6. 30. La proteína caracterizada porque es codificada por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7. 31. La proteína caracterizada porque es codificada por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8. 32. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 y un portador aceptable farmacéuticamente. 33. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3 y un portador aceptable farmacéuticamente. 34. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4 y un portador aceptable farmacéuticamente. 35. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5 y un portador aceptable farmacéuticamente. 36. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6 y un portador aceptable farmacéuticamente. 37. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 y un portador aceptable farmacéuticamente. 38. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8 y un portador aceptable farmacéuticamente. 39. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 y un portador aceptable farmacéuticamente. 40. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 y un portador aceptable farmacéuticamente. 41. Una composición caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 16 y un portador aceptable farmacéuticamente. 42. Una composición caracterizada porque comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 25 y un portador aceptable farmacéuticamente. 43. Una composición caracterizada porque comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 26 y un portador aceptable farmacéuticamente. 44. Una composición caracterizada porque comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 27 y un portador aceptable farmacéuticamente. 45. Una composición caracterizada porque comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 28 y un portador aceptable farmacéuticamente. 46. Una composición caracterizada porque comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 29 y un portador aceptable farmacéuticamente. 47. Una composición caracterizada porque comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 30 y un portador aceptable farmacéuticamente. 48. Una composición caracterizada porque comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 31 y un portador aceptable farmacéuticamente. 49. Un método de inducir la formación de protrusión por medio de una célula de mamífero caracterizada porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 4, 7, 15, o 16, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 27 o 30, en una cantidad efectiva para inducir la formación de protrusión por medio de la célula. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la protrusión es una espiga, una prolongación, filopodia o lamelipodia. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la prolongación es una prolongación de neurita. 52. Un método para causar la reorganización citoesquelética en una célula de mamífero, caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 4, 7, 15 o 16, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 27 o 30, en una cantidad efectiva para causar la reorganización citoesquelética en la célula. 53. Un método para inducir la formación de arrugas sobre una célula de mamífero, caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 4, 7, 15 o 16, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 27 o 30, en una cantidad efectiva para inducir la formación de arrugas sobre una célula. 54. Un método para inducir la migración de una célula de mamífero, caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 4, 7, 15 o 16, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 27 o 30, en una cantidad efectiva para inducir la migración de la célula. 55. Un método para inducir la proliferación de una célula de mamífero caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 4, 7, 15 o 16, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 27 o 30, en una cantidad efectiva para inducir la proliferación de la célula. 56. Un método para inhibir la formación de protrusión por medio de una célula de mamífero caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 3, 5, 6, 8 o 12, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 26, 28, 29 o 31, en una cantidad efectiva para inhibir la formación de protrusión por medio de la célula. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la protrusión es una espiga, una en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición de conformidad con las prolongación, filopodia, o lamelipodia . 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la prolongación es una prolongación de neurita. 59. Un método para inhibir la reorganización citoesquelética en una célula de mamífero, caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 3, 5, 6, 8 o 12, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 26, 28, 29 o 31, en una cantidad efectiva para inhibir la reorganización citoesquelética en la célula . 60. Un método para inhibir la formación de arrugas sobre una célula de mamífero caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 3, 5, 6, 8 o 12, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 26, 28, 29 o 31, en una cantidad efectiva para inhibir la formación de arrugas sobre la célula. 61. Un método para inhibir la migración de una célula de mamífero caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 3, 5, 6, 8 o 12, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 26, 28, 29 o 31, en una cantidad efectiva para inhibir la migración de la célula. 62. Un método para inhibir la proliferación de una célula de mamífero, caracterizado porque comprende poner en contacto a la célula con el ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 3, 5, 6, 8 o 12, o con la proteína de conformidad con las reivindicaciones 26, 28, 29 o 31, en una cantidad efectiva para inhibir la proliferación de la célula. 63. Un método para inhibir la transcripción de una molécula de DNA que codifica a PAK5 de mamífero, caracterizado porque comprende hibridar al ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 en la molécula de DNA bajo condiciones que podrían de otra manera permitir la transcripción del DNA para inhibir así la transcripción de la molécula de DNA. 6 . Un método de inhibir la translación de una molécula de mRNA que codifica a PAK5 de mamífero, caracterizado porque comprende hibridar al ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 en la molécula de mRNA bajo condiciones que podrían de otra manera permitir la translación del mRNA para inhibir así la translación de la molécula de mRNA. 65. Un método de incrementar la prolongación neuronal en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición de conformidad con las reivindicaciones 34, 37, 40, 41, 44 o 47, en una cantidad efectiva para incrementar la prolongación neuronal en el suj eto . 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el sujeto es seleccionado del grupo que consiste de un ratón, una rata, un conejo, un perro, un cobayo y un primate. 67. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el sujeto es un humano. 68. Un método para inhibir la prolongación neuronal en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición de conformidad con las reivindicaciones 33, 35, 36, 38, 39, 43, 45, 46 o 48, en una cantidad efectiva para inhibir la prolongación neuronal en el sujeto. 69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el sujeto es seleccionado del grupo que consiste de un ratón, una rata, un conejo, un perro, un cobayo y un primate. 70. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el sujeto es un humano. 71. Un método para determinar si una habilidad reducida de célula de mamífero para formar protrusiones es debida al bloqueo de la transduccion de señal ya sea desde el extremo 5' hacia 3 ' en el sentido de la hebra de DNA dúplex o al nivel de PAK5, caracterizado porque comprende: (a) introducir PAK5 en la célula; y (b) determinar si su número de protrusiones incrementa, el incremento indica que la habilidad reducida de las células para formar protrusiones es debida al bloqueo de la transducción de señal ya sea desde la el extremo 5' hacia 3 ' en el sentido de la hebra de DNA dúplex o al nivel de PAK5. 72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la célula es una célula de ratón, una célula de rata, una célula de conejo, una célula de perro, una célula de cobayo o una célula de primate. 73. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la célula es una célula humana. 74. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de una neurona, una célula epitelial, una célula muscular, una célula sanguínea, una célula inmune, una célula germinal, un osteocito y una célula endotelial. 75. Un mamífero transgénico no humano caracterizado porque sus células somáticas carecen del DNA que codifica a PAK5. 76. El mamífero de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el mamífero es un ratón.