MXPA03005325A - Metodo para identificar sustancias que influencian positivamente las condiciones inflamatorias de las enfermedades cronicas inflamatorias de las vias respiratorias. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a las proteinas involucradas en los procesos inflamatorios y a la modulacion de la funcion de una proteina asi para influenciar positivamente las enfermedades inflamatorias.

Description

METODO PARA IDENTIFICAR SUSTANCIAS QUE INFLUENCIAN POSI IVAMENTE LAS CONDICIONES INFLAMATORI S DE LAS ENFERMEDADES CRONICAS INFLAMATORIAS DE LAS VIAS RESPIRATORIAS Introducción. La presente invención pertenece al campo de la modulación de los procesos inflamatorios, en particular de las enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, en los que los macrófagos juegan un papel importante. Los procesos inflamatorios pueden ser modulados de acuerdo con la invención a través de influenciar la actividad biológica de una proteina que se ha identificado como involucrada en el proceso inflamatorio.

Un ejemplo de las enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias, en las que 'los macrófagos juegan un papel importante, es la bronquitis crónica (BC) . La BC puede ocurrir con o sin limitación del flujo de aire e incluye la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, siglas en inglés, o EPOC) . La BC es una enfermedad compleja que abarca síntomas de varios desórdenes: bronquitis crónica, que se caracteriza por tos e hipersecreción mucosa, enfermedad de vias respiratorias pequeñas, incluyendo inflamación y fibrosis peribronquial, enfisema, y limitación de flujo de aire. La BC se caracteriza por una declinación acelerada e irreversible de la función pulmonar. El factor de mayor riesgo para desarrollar BC es el fumar cigarrillos continuamente. Dado que sólo cerca del 20% de todos los fumadores están afectados con BC, parece que también hay una predisposición genética que contribuye a la enfermedad.

Los eventos iniciales del acceso temprano de CB son las inflamaciones, que afectan las vias respiratorias pequeñas y grandes. Una irritación causada por el fumar cigarrillos atrae a los macrófagos y neutrófilos, cuyo número está incrementado en el esputo de los fumadores. El fumar continuamente lleva a una respuesta inflamatoria progresiva en el pulmón, liberando los mediadores de los macrófagos, neutrófilos y células epiteliales que restablecen las células inflamatorias en los sitios dañados. Hasta ahora no hay terapia disponible para revertir el curso de la BC . El dejar de fumar puede reducir la declinación de la función pulmonar.

Sólo se conocen unas cuantas drogas que proporcionan algún alivio a los pacientes. Los antagonistas ß2 de larga duración y los anticolinérgicos se aplican para lograr una broncodilatación transitoria. Una variedad de antagonistas para los eventos inflamatorios, como los inhibidores LTB4-, se encuentran bajo investigación.'' Hay una continua necesidad de proporcionar drogas para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias. Las enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias pueden ser atribuidas a células inmunes inflamatorias activadas, p. ej . , macróf gos . Por lo tanto hay una necesidad de drogas que modulen la función de los macrófagos, con objeto de eliminar una fuente de procesos inflamatorios.

Descripción de la Invención. En la presente invención se encontró que los macrófagos involucrados en un proceso inflamatorio, particularmente en una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias, más particularmente en la bronquitis crónica o la EPOC, muestran un patrón de secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresado que difiere del patrón de la expresión de los genes de los macrófagos entre donadores sanos o donadores en estado irritado, pues estos últimos contienen macrófagos en estado activado. Por lo tanto, los macrófagos muestran diferentes niveles de activación bajo diferentes condiciones inflamatorias . Por ejemplo, en la presente invención se muestra que los macrófagos involucrados en un proceso inflamatorio en fumadores con EPOC muestran patrones diferentes de expresión genética que los macrófagos de los fumadores saludables, indicando que los macrófagos de fumadores con EPOC están en un estado diferente, que de aqui en adelante llamaremos "hiperactivado" . La presente invención provee la posibilidad de inhibir la hiperactivación o reducir el estado hiperactlvo de un macrófago, permitiendo la identificación de sustancias que modulan una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS , Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, todas descritas más adelante en el Listado de Secuencia, involucradas en la hiperactivación o el mantenimiento del estado hiperactivo de un macrófago.

El término "enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias" como se usa aqui incluye, por ejemplo, la Bronquitis Crónica (BC) y la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) . El significado preferible del término "enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias" es BC y EPOC, el significado más preferible es CB o EPOC.

La invención está basada en la identificación de una secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente en un macrófago hiperactivado comparado con un macrófago que no está hiperactivado. Una secuencia tal de ácido nucleico codifica una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2 , Estearil-CoA-Desaturasa y Glucosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, cuya proteina está involucrada en la hiperactivación o en la conservación del estado hiperactivo de un macrófago involucrado en un proceso inflamatorio, preferiblemente en una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias. Esta secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente o la proteina codificada por esta secuencia de ácido nucleico también es llamada en adelante secuencia de ácido nucleico expresada dif rencialmente o proteina de la invención, respectivamente. En particular, la presente invención enseña un enlace entre los cambios fenotipicos en los macrófagos debidos a la secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente y al patrón de expresión de la proteina y al involucramlento de los macrófagos en el proceso inflamatorio y, por lo tanto, provee una base para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la presente invención provee un método y un sistema de prueba para determinar el nivel de expresión de una proteína de macrófago de la invención o de la secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente de la invención, y por lo tanto provee p. ej . de métodos para la diagnosis o el monitoreo de los procesos inflamatorios con involucramiento de los macrófagos hiperactivados en los mamíferos, preferiblemente en los seres humanos, especialmente aquellos seres que sufren de un proceso inflamatorio, preferiblemente en una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias. La invención también se refiere a un método para identificar una sustancia por medio de una secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente o proteina de la invención, sustancia que modula, p. ej . , actúa como un inhibidor o activador de la secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente o proteina de la invención, y por lo tanto influencia positivamente los procesos inflamatorios crónicos a través de la inhibición de la hiperactivación o la reducción del estado hiperactivo de los macrófagos, y por lo tanto permite el tratamiento de los mamíferos, preferiblemente de los seres humanos, que sufren de esta enfermedad. La invención también se refiere a un método para modular selectivamente tal secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente o proteina de la invención en un macrófago, método que comprende la administración de una sustancia determinada para ser un modulador de esta proteina o secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente . La presente invención incluye el uso de las mencionadas sustancias para tratar a los seres con la necesidad de un tratamiento para un proceso inflamatorio, preferiblemente una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias.

En la presente invención, en un primer paso se identifica una secuencia de ácido nucleico expresado diferencialmente de la invención, el cual tiene un patrón de expresión diferente en un macrófago hiperactivado, comparado con un macrófago que no está hiperactivado. Por seguridad en la concisión, esta descripción trata particularmente con la investigación de macrófagos involucrados en la EPOC; sin embargo, pueden obtenerse resultados equivalentes con muestras de sujetos que sufren de otras enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, p. ej . , otros síntomas de bronquitis crónica. La investigación de los diferentes patrones de expresión lleva a la identificación de unas series de secuencias de ácidos nucleicos expresados diferencialmente dependientes del estado de activación de un macrófago involucrado en un proceso inflamatorio, como se ejemplifica en los Ejemplos de abajo.

Brevemente, la secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente de la invención se identifica a través de experimentos de comparación de perfiles de expresión, usando una célula o un extracto celular de un macrófago hiperactivado, p. ej . , del lugar de la inflamación en la EPOC y del sitio correspondiente de un sujeto de control que no sufra de esta enfermedad, pero que sufra de la misma condición de irritación como la exposición al humo del cigarrillo.

En un segundo paso se identifican las proteínas que son codificadas por la secuencia de ácido nucleico expresado diferencialmente, p. e . , proteínas que jueguen un papel en la mediación de la hiperactivación o en la conservación del estado hiperactivado . Un grupo de secuencias de ácido nucleico expresadas diferencialmente de la invención, puede ser identificado por codificar una proteina que se selecciona entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-Co-A-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP. Una proteina como la mencionada está involucrada en la hiperactivación o en la conservación del estado hiperactivo que se caracteriza en que se expresa en un macrófago que está hiperactivado de acuerdo con la invención a un nivel menor o mayor que el nivel de control en un macrófago que no está hiperactivado.

De acuerdo con ello, la invención concierne a una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-Co-A-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP. Una proteina seleccionada del grupo mencionado será llamada también, de aqui en adelante, proteina de la invención. Las mencionadas proteínas de la invención se ilustrarán de aqui en adelante en el Listado de Secuencia.

La actividad biológica de la MIF (SEQ ID NO. 1,2) de acuerdo con la presente invención, p.ej., mediando el involucramiento de un macrófago en un proceso inflamatorio de acuerdo con la invención, p. ej . , a través de la inhibición de la migración del macrófago, depende, por ejemplo, de los efectos supresivos contrarrestantes de los glucocorticoides y/o de otra función MIF, como la de inducir la respuesta inflamatoria a la invasión de bacterias o cualquier otra función de la MIF relevante por su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La invención también concierne a un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de MIF. En este contexto, funcional significa que tiene una función de la MIF que está involucrada en su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La actividad biológica de la DAD1 (SEQ ID NO. 3,4) de acuerdo con la presente invención, p. ej . , mediando el involucramiento de un macrófago en un proceso inflamatorio de acuerdo con la invención depende, p. ej . , del enlace con un complejo oligosacariltransferasa y/o de cualquier otra función DAD1 relevante para su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La invención también concierne a un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de DAD1 En este contexto, funcional significa que tenga una función de DAD1 que esté involucrada en su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La actividad biológica de la ARL4 (SEQ . ID NO. 5,6) de acuerdo con la presente invención, p. e . , mediando el involucramiento de un macrófago en un proceso inflamatorio de acuerdo con la invención depende, por ejemplo, de la interacción con las proteínas involucradas en el intercambio vesicular y de membranas y/o de cualquier otra función de la ARL4 relevante para su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La invención también concierne a un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de ARL . En este contexto, funcional significa que tiene una función de ARL4 que está involucrada en su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La actividad biológica de GNS (SEQ ID NO. 7,8) de acuerdo con la presente invención, p. ej . , mediando el involucramiento de un macrófago en un proceso inflamatorio de acuerdo con la invención depende, por ejemplo, del enlace y/o el reconocimiento de un substrato, p. ej . , heparano y/o de su actividad hidrolitica y/o de cualquier otra función GNS relevante para su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La invención también concierne a un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de GNS. En este contexto, funcional significa que tiene una función de GNS que está involucrada en su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La actividad biológica de la Transglutaminasa 2 (SEQ ID NO. 9,10) de acuerdo con la presente invención, p. ej . , mediando el involucramiento de un macrófago en un proceso inflamatorio de acuerdo con la invención depende, por ejemplo, de la formación de enlaces de isopéptidos (?-glutamil) lisina y/o de cualquier otra función de la Transglutaminasa 2, p. ej . , reconocimiento del substrato, relevante para su actividad biológica de acuerdo on la invención.

La invención también concierne a un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de Transglutaminasa 2. En este contexto, funcional significa que tiene una función de Transglutaminasa 2 que está involucrada en su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La actividad biológica del Estearyl-Co-A-Desaturasa (SEQ ID NO. 11,12) de acuerdo con la presente invención, p. ej . , mediando el involucramiento de un macrófago en un proceso inflamatorio de acuerdo con la invención depende, por ejemplo, del enlace a un substrato, p. ej . , palmitoil-CoA y/o estearil-Co-A y/o de su actividad oxidante y/o de cualquier otra función de la Estearil-CoA-Desaturasa, p. e . , reconocimiento del substrato, relevante para su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La invención también concierne a un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de Estearil-CoA-Desaturasa . En este contexto, funcional significa que tiene una función de Estearil-CoA~Desaturasa que está involucrada en su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La actividad biológica de la Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP (SEQ ID NO. 13,14) de acuerdo con la presente invención, p. ej . , mediando el involucramiento de un macrófago en un proceso inflamatorio de acuerdo con la invención depende, por ejemplo, del enlace a un substrato, p. ej . , glucosa UDP y/o ceramida y/o de su actividad de transferencia y/o de cualquier otra función de la Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, p. e . , reconocimiento del substrato, relevante para su actividad biológica de acuerdo con la invención.

La invención también concierne a un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP. En este contexto, funcional significa que tiene una función de Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP que está involucrada en su actividad biológica de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la presente invención, la actividad biológica de una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL , GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, si se expresa a un nivel más bajo que el nivel del control, es preferiblemente activada para inhibir la hiperactivación o reducir el estado hiperactivado de un macrófago, y si se expresa a un nivel más alto que el nivel del control, es preferiblemente inhibida para inhibir la hiperactivación o reducir un estado hiperactivado de un macrófago.

En una representación, la presente invención concierne a un método de prueba para determinar una sustancia que sea un activador o inhibidor de la proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa ceramida UDP. Dado que una proteina asi está involucrada en una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias y juega un papel en la mediación de la inflamación, puede usarse una sustancia que module la actividad biológica de esa proteina para tratar unas enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias, o puede usarse como un compuesto conductor para la optimización de la función de la sustancia de forma que la sustancia optimizada sea adecuada para tratar las enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias. Para realizar un método de la invención, puede usarse un sistema de prueba de acuerdo con la invención.

La presente invención también concierne a un sistema de prueba para determinar si una sustancia es un activador o un inhibidor de una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1 , ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glucosiltransferasa de Glucosa ceramida UDP. Un sistema de prueba útil para realizar un método de la invención comprende un sistema celular o libre de células. Por ejemplo/ una representación de la invención concierne a un sistema de prueba que está diseñado de forma que permite la prueba de sustancias que actúan en el nivel de expresión de la secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente, p. ej . , usando la expresión de un gen reportero, p. ej . , gen luciferasa o similar, como una lectura mensurable. Otra representación de la invención concierne a un sistema de prueba que está diseñado de forma que permite la prueba de sustancias que interaccionan directamente con una función respectiva de una proteina de la invención o que interfieren con la respectiva activación de una función de una proteina de la invención a través de un activador natural o artificial pero apropiado de la proteina respectiva, seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, P. EJ., una quinasa apropiada o similar.

Un sistema de prueba de acuerdo con la invención comprende una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, o un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteina de la invención, un ácido nucleico que codifique una proteina asi o un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteina de la invención y/o elementos reguladores, en los que un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteína de la invención o un ácido nucleico que codifique a la mencionada proteina o a un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteína de la invención sea capaz de interactuar con una sustancia que debería ser probada de forma que la interacción directa conduzca a un indicador mensurable legible para el cambio de una actividad biológica respectiva de la proteína de acuerdo con la invención y/o para el cambio de expresión de la inencionada proteina de la invención.

Un sistema de prueba de la invención comprende, por ejemplo, elementos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sistemas libres de células pueden incluir, por ejemplo, una proteina mencionada o un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteina de la invención, un ácido nucleico que codifique esta proteina o que codifique un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteina de la invención en forma soluble o aglutinada o en compartimentos o vesículas celulares. Los sistemas celulares adecuados incluyen, por ejemplo, una célula procariótica o eucariótica adecuada, p. ej . , que comprenda la proteína de la invención o un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteína de la invención, un ácido nucleico que codifique esta proteína o que codifique un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteína de la invención. Una célula adecuada para su uso en el sistema de prueba de la invención puede ser obtenida por técnicas recombinantes, p. ej . , después de la transformación o la transfección con un vector recombinante adecuado para la expresión de una proteina deseada de la invención o de un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteína de la invención, o puede ser p. ej . una línea celular o una célula aislada de una fuente natural que exprese una proteina deseada de la invención o un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de la proteína. Un sistema de prueba de la Invención puede incluir un ligando natural o artificial de la proteína seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS , Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP si es deseable o necesario para probar si una sustancia de interés es un inhibidor o activador de la proteína de la invención.

Un método de prueba de acuerdo con la invención comprende medir una lectura, p. e . un cambio fenotípico en el sistema de prueba, por ejemplo, si se usa un sistema celular, un cambio fenotípico de la célula. Este cambio puede ser un cambio en una respuesta que ocurre naturalmente, p. ej . , un gen reportero de la activación o inhibición de la célula hacia una proteína elegida entre el grupo consistente de: MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, p. e . , como se detalla en los Ejemplos de abajo.

Un método de prueba de acuerdo con la invención puede ser útil, por una parte, para pruebas de alto rendimiento adecuadas para determinar si una sustancia es un inhibidor o activador de la invención, pero también p. ej . , para pruebas secundarias de validación de una sustancia idónea o conductora identificada en la prueba de alto rendimiento.

La presente invención también concierne a una sustancia identificada en un método de acuerdo con la invención para ser un inhibidor o activador de una proteína seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1 , ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP. Una sustancia de la presente invención es cualquier compuesto que sea capaz de inhibir preferiblemente una función de una proteína seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL , GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP. Un ejemplo de una forma de activar o inhibir una función de una proteína seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearíl-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, es influenciando el nivel de expresión de la proteína seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, A L4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP. otro ejemplo de una forma de activar o inhibir una función de una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, es aplicar una sustancia que aglutine directamente una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, activando o bloqueando asi los dominios funcionales de la proteina de la invención, lo cual puede hacerse de modo reversible o irreversible, dependiendo de la naturaleza de la sustancia aplicada.

De acuerdo con ello, una sustancia útil para activar o inhibir la actividad biológica de una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, incluye una sustancia que actúe en la secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente, por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico que hibride con el gen o la secuencia regulatoria correspondiente y por lo tanto influencie la expresión genética, o una sustancia que actúe en una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4 , GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, por si misma o en su activación o inhibición a través de otros componentes celulares de ocurrencia natural, p. ej . , una otra proteina que actúe enzimáticamente sobre la proteina de la invención, p. ej . una proteina quinasa.

Por consiguiente, la invención concierne, por ejemplo, a una sustancia que es una secuencia de ácido nucleico codificando para el gen de una proteina de la invención, o un fragmento, derivado, mutante o variante de la mencionada secuencia de ácido nucleico, secuencia de ácido nucleico, o fragmento, derivado, mutante o variante de la misma que es capaz de influenciar el nivel de expresión del gen, p. ej . , una molécula de ácido nucleico adecuada como ácido nucleico de contrasentido, ribozima, o para formación de hélice triple.

La invención también concierne a una sustancia que es, p. e . , un anticuerpo o un compuesto orgánico o inorgánico que aglutine directamente a o interfiera con la activación de una proteina seleccionada entre el grupo consistente de MIF, DAD1, ARL4, GNS, Transglutaminasa 2, Estearil-CoA-Desaturasa y Glicosiltransferasa de Glucosa Ceramida UDP, y que por lo tanto afecte su actividad biológica .

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a un método para determinar un nivel de expresión de un ácido nucleico que codifique para una proteina de la invención, preferiblemente un mensajero de ARN, o la propia proteina de la invención, en una célula, preferiblemente un macrófago, más preferiblemente en un macrófago aislado de un sitio de inflamación, aún más preferiblemente de un sitio de inflamación en un sujeto que sufra de una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias. Un método asi puede usarse, por ejemplo, para probar si una sustancia es capaz de influenciar los niveles de expresión de la secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente en un método bosquejado arriba para determinar si una sustancia es un activador o inhibidor de acuerdo con la presente invención. Un método para determinar un nivel de expresión de acuerdo con la invención puede usarse también, sin embargo, para probar el estado de activación de un macrófago, p. ej . , para propósitos de diagnóstico o para la investigación del éxito del tratamiento para una enfermedad que es causada por el macrófago hlperactivado . El mencionado macrófago es preferiblemente de un mamífero, más preferiblemente una célula humana. De acuerdo con ello, los macrófagos de la presente invención se obtienen preferiblemente del sitio de la inflamación en un mamífero y más preferiblemente del sitio de la inflamación en un ser humano. De acuerdo con ello, la invención también se refiere a un método para el diagnóstico de la enfermedad inflamatoria crónica, o a la supervisión de dicha enfermedad, p. e . , la supervisión del éxito en el tratamiento de sujetos con la necesidad de tratamiento para esa enfermedad, comprendiendo el determinar un nivel de expresión de un ácido nucleico que codifique para una proteína de la invención, preferiblemente un mensajero de ARN, o la propia proteína de la invención en un macrófago.

Un método para determinar los niveles de expresión en un ácido nucleico que codifique para una proteína de la invención, preferiblemente un mensajero de ARN, o la propia proteína de la invención puede, dependiendo del propósito de determinación del nivel de expresión, ser realizado a través de procedimientos conocidos tales como medir la concentración de los transcritos de ARN a través de técnicas de hibridación o a través de un gen reportero, dirigiendo ensayos tales como ensayos de luciferasa o midiendo la concentración de proteína de la proteína de la invención, usando los anticuerpos respectivos .

La presente invención también se refiere al uso de una sustancia de acuerdo con la invención, para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias. Otra representación de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprenda al menos una de las sustancias de acuerdo con la invención, determinadas para ser un activador o un inhibidor. La composición puede ser manufacturada de una forma que es conocida por si misma, p. ej . , por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, héchura de piezas para chupar, levigación, pulverización, emulsificación, encapsulado, entrampado o liofilización.

Para usar las sustancias que activan o inhiben de acuerdo con la invención, como drogas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias, las sustancias pueden ser probadas en modelos animales, por ejemplo, en un animal que sufra de un desorden inflamatorio de las vias respiratorias o un animal transgénico que exprese la proteina de la invención. toxicidad y la eficacia terapéutica de una sustancia de acuerdo con la invención puede determinarse a través de procedimientos farmacéuticos estándar, que incluyen el conducir un cultivo de células y experimentos con animales para determinar los IC50, LD50 y ED50- Los datos obtenidos se usan para estimar el rango de la dosis animal o preferiblemente humana, que también dependeré de la forma de dosificación (tabletas, cápsulas, roclos en aerosol, ampolletas, etc.) y de la via de administración (por ejemplo transdérmica, oral, bucal, nasal, entérica, parenteral, inhalada, intratraqueal o rectal) .

Una composición farmacéutica que contenga al menos una sustancia de acuerdo con la invención como un ingrediente activo, puede formularse de una forma convencional. Los métodos para hacer estas formulaciones puede encontrarse en manuales, p. ej . , "Remington Pharmaceutical Science". Los Ejemplos para los ingredientes que son útiles para formular al menos una sustancia de acuerdo con la presente invención, también se encuentran en la patente WO 99/18193, que se incorpora aqui como referencia .

En un aspecto más, la presente invención concierne a un método para tratar una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias. Este método comprende la administración a un sujeto, preferiblemente a un ser humano con la necesidad de este tratamiento, una cantidad adecuada de una composición farmacéutica que comprenda al menos una sustancia determinada para ser un activador o inhibidor, a través de un método de acuerdo con la invención.

En otra representación, la invención se refiere a un método para modular selectivamente la concentración de una proteina de la invención en un macrófago, comprendiendo el administrar una sustancia determinada para ser un activador o inhibidor de la proteina de la invención.

Los siguientes Ejemplos pretenden ilustrar la presente invención; sin embargo, no serán construidos como limitación. Sin embargo, los Ejemplos describen las representaciones más preferibles de la invención.

Ej emplos Ejemplo 1: perfil Comparativo de Expresión Lo siguiente es una ilustración de cómo puede realizarse el perfil comparativo de expresión para identificar la proteina de la invención. 1.1. Selección de Sujetos Se estudiaron tres grupos de sujetos: no fumadores saludables, fumadores saludables y pacientes con EPOC .

Para evaluar la función pulmonar, los sujetos deben realizar la espirometría. Se usa un simple cálculo basado en la edad y la estatura para caracterizar los resultados. Los sujetos EPOC se incluyen si su FEVi% predicho < 70%. Los fumadores saludables son de edades e historias de fumador equivalentes a las de los sujetos EPOC, pero tienen una función pulmonar normal. Los no fumadores saludables tienen una función pulmonar normal y nunca han fumado. Este último grupo tiene un estimulo de metacolina para excluir asma. Esta técnica requiere el aumentar la dosis de metacolina que va a darse a un sujeto, con espirometría entre cada dosis. Cuando el FEVi cae 20% se detiene la prueba y se calcula el PC20- Esta es la dosis de metacolina que causa una calda de 20% en el FEVi y requeriremos un valor de >32 como evidencia de la ausencia de asma. Todos los sujetos tienen pruebas de punción de piel para los alergénicos comunes, y se requiere que tengan resultados negativos. Esto excluye a los individuos atópicos. Se monitorean las historias clínicas de los sujetos, para excluir enfermedades concomitantes. 1.2. Procedimiento LBA (lavado broncoalveolar) Antes del LBA los sujetos son sedados con midazolam. Se usa anestesia local en aerosol para anestesiar la parte de atrás de la garganta. Se usa un broncoscopio Olympus de 7 mm. El área de lavado es el lóbulo medio. Se instilan 250 mi de salina estéril y se aspira inmediatamente. El aspirado resultante contiene macrófagos . 1.3. Procesamiento LBA El LBA se filtra a través de una gasa estéril para remover los sedimentos. Las células se lavan dos veces en HBSS, se resuspenden en 1 mi de HBSS (siglas en inglés de Solución de Sal balanceada de Hank) y se cuentan. Los macrófagos se hacen girar hasta convertirlos en pelotillas usando 15 mi de polipropileno de cubierta azul Falcon, se resuspenden en reagente Trizol (Gibco BRL Life Technologies)/ a una concentración de 1 mi de reagente Trizol por 10 millones de células, y después se congelan a -70°C. 1.4. Análisis de Expresión Diferencial del Gen Se extrae todo el ARN de las muestras de macrófagos obtenidas de acuerdo con el Ejemplo 1.3. Las suspensiones de células en Trizol se homogeneizan a través de pipeteo y se incuban a temperatura ambiente por 5 minutos. Se añaden 200 µ? de cloroformo por mi de Trizol, la mezcla se mezcla cuidadosamente por 15 segundos y se incuba por 3 minutos más a temperatura ambiente. Las muestras se hacen girar a 10000 g por 15 minutos a 4°C. La fase superior se transfiere dentro de un nuevo tubo de reacción y se precipita el ARN añadiendo 0.5 mi de isopropanol por mi de Trizol, durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Luego, el precipitado se convierte en pelotillas usando un microcentrifugador durante 10 minutos a 4°C con 10000 g; la pelotilla se lava dos veces con 75% de etanol, se seca al aire y se resuspende en DEPC-H20.

Se realiza una limpieza de ARN con un equipo Qiagen RNeasy de aislamiento total de ARN (Qiagen) , para mejorar la pureza del ARN. La pureza del ARN se detrmina a través de gelelectroforesis de agarosa y se mide la concentración por absorción de UV a 260 nm.

Para la síntesis de cADN se usan 5 g de cada ARN. La primera y la segunda síntesis de cordón se realizan con el sistema Superscript Choice (Gibco BRL Life Technologies) . En un volumen total de ??µ? de ARN y ?µ? de primer 100 µ? TI- (dt) 2<¡, se calienta la primera secuencia mostrada en SEQ ID NO. 15, hasta 70°C por 10 minutos, y luego se enfria en hielo por 2 minutos . El primer regulador de cordón a una concentración final de lx, DTT a una concentración de 10 mM y una mezcla dNTP a una concentración final de 0.5 mM/ se añaden a un volumen total de 18 µ?. La mezcla reacción es incubada a 42 °C por 2 minutos y se añaden 2 µ? de transcriptasa inversa Superscript 11(200 U/µ?) . Para la síntesis del segundo cordón, 130 µ? de una mezcla que contiene 1.15x de regulador de segundo cordón, 230 uM de dNTPs, 10 U de ligasa de ADN de E. coli (10?/µ1), RNase H (2?/µ1) se añaden a la reacción de la síntesis del primer cordón y se mezcla cuidadosamente con una pipeta. La síntesis del segundo cordón se realiza a 16°C por 2 horas, luego se añaden 2µ1 de polimerasa T4 de ADN (5 U/µ?), se incuba por 5 minutos a 16°C y la reacción se detiene añadiendo 10 µ? de EDTA 0.5 M.

Antes de la síntesis de cARN, se purifica el cADN de doble cordón. El cADN se mezcla con un volumen igual de fenol : cloroformo : isoamilalcohol (25:24:1) y se hace girar en un microcentrifugador a través de la matriz de gel de geles de cierre de fase (Eppendorf ) , para separar el cADN de los nucleótidos no aglutinados. La fase acuosa se precipita con acetato de amonio y etanol. Subsecuentemente, se usa el cADN para transcripción in vitro. La sintesis de cARN se realiza con el equipo ENZO BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit de acuerdo con el protocolo del fabricante (ENZO Diagnostics) . Brevemente se incuba el cADN con regulador de reacción lx HY, ribonucleótidos etiquetados lx biotin, DTT lx, Mezcla de Inhibidor lx RNase y Polimerasa de ARN lx T7, en un volumen total de 0µ1 por 5 horas a 37 °C. Luego, la mezcla reacción se purifica via columnas RNeasy (Quiagen) , el cARN se precipita con acetato de amonio y etanol y finalmente se resuspende en agua tratada con DEPC. La concentración se determina vía espectrometría UV a 260 nm. El cARN remanente se incuba con regulador de fragmentación lx (regulador de fragmentación 5x: 200 mM de acetato Tris, pH 8.1, 500 mM de OAc, 150 mM de MgOAc) , a 94°C durante 35 minutos.

Para la hibridación del chip de ADN se usan 15 g de cARN, mezclados con 50 pM de oligonucleótido B2 de ncontrol etiquetado con biotin, la secuencia mostrada en SEQ ID NO. 16, coctel cARN lx, 0.1 mg/ml de ADN de esperma de arenque, 0.5 mg/ml de BSA acetilado, regulador de hibridación lx MES (ácido 2-[N-morfolino]-etanosulfónico) en un volumen total de 300 µ?. La mezcla de hibridación se calienta hasta 99°C por 5 minutos, se enfria hasta 45°C por 10 minutos y se usan 200 µ? de la mezcla para llenar el arreglo de prueba. Se realiza la hibridación a 45°C, a 60 rpm, durante 16 horas.

Después de la hibridación, la mezcla de hibridación en el chip se reemplaza por 300 µ? de regulador de lavado no astringente (100 m de MES, 100 mM de NaCl, 0.01% de Tween 20). Se inserta el chip en una estación Affymetrix Fluidics y se realiza el lavado y el tintado de acuerdo con el protocolo EukGE-WS2. La solución colorante por chip consiste de 600 µ? de regulador de tinte lx (100 mM de MES, 1 M de NaCl, 0.05% de Tween 20), 2 mg/ml de BSA, 10 µ9/p?1 de SAPE (estreptavidin ficoeritrin) (Dianova), la solución de anticuerpo consiste de regulador de tinte lx, 2 mg/ml de BSA, 0.1 mg/ml de lgG de cabra, 3 g/ml de anticuerpo biotinilatado . Después del procedimi9ento de lavado y tintado, los chips se escanean en el escáner HP Gene Array Scanner (Hewlett Packard) .

Se realiza el Análisis de datos por comparaciones de pares entre los chips hibridizados con el ARN aislado de los fumadores EPOC y chips hibridizados con el ARN aislado de los fumadores sanos .

La siguiente es una ilustración de los genes expresados diferencialmente y de su función como se identificó de acuerdo a la propuesta de la presente invención.

Ejemplo 2: MIF Un gen identificado como consistentemente sobrerregulado en individuos con EPOC, codifica para la MIF. La MIF es secretada por las células pituitarias, los macrófagos y las células T, y su síntesis puede ser inducida a través de estímulos proinflamatorios tales como LPS, TNFa, e IFN-?. La MIF tiene por sí misma actividad proinflamatoria, al contrarrestar los efectos supresivos de los glucocorticoides e inducir la inflamación en respuesta a la invasión de bacterias. El neutralizar la MIF pued prevenir el choque séptico en cierytos modelos de ratones (Calandra et al. 1994, Bernhagen et al. 1998, Calandra et al. 2000) .

La MIF se encontró consistentemente sobrerregulada (42%) en fumadores con EPOC, comparados con fumadores sanos. Esto se muestra a través de valores de "cambios de doblez" (Tab. 1) . El valor de p para comparar a los fumadores con EPOC y a los fumadores saludables, es de 0.03.

Tab. 1: Desrregulación de la MIF: los valores de "cambio de doblez" (FC, siglas en inglés) para cada paciente, se enlistan para las comparaciones entre fumadores obstruidos y sanos. comp FC comp FC comp FC comp FC 1 vs 2 -1.3 5 vs 43 3.9 39vs 57 -2.0 68 vs 66 2.8 1 vs 37 8.0 5 vs 56 1.9 39 vs 58 1.0 68 vs 69 2.3 1 vs 43 1.8 5 vs 57 1.5 39 vs 62 1.0 68 vs 76 5.0 1 vs 56 -1.3 5 vs 58 2.9 44 vs 2 1.4 68 vs 78 3.2 1 vs 57 -1.6 5 vs 62 2.0 44 vs 37 14.4 70 vs 65 1.1 1 vs 58 1.2 6 vs 2 -1.6 44 vs 43 3.0 70 vs 66 1.4 1 vs 62 -1.2 6 vs 37 6.5 44 vs 56 1.4 70 vs 69 1.1 3 vs 2 -1.6 6 vs 43 1.5 44 vs 57 1.1 70 vs 76 2.6 3 vs 37 6.3 6 vs 56 -1.6 44 vs 58 2.1 70 vs 78 1.6 3 vs 43 1.4 6 vs 57 -2.0 44 vs 62 1.5 71 vs 65 2.1 3 vs 56 -1.6 6 vs 58 1.0 64 vs 65 2.0 71 vs 66 2.7 3 vs 57 -2.1 6 vs 62 -1.5 64 vs 66 2.6 71 vs 69 2.2 3 V3 58 -1.1 39 vs 2 -1.6 64 vs 69 2.1 71 vs 76 4.9 3 vs 62 -1.5 39 vs 37 1.0 64 vs 76 4.7 71 vs 78 3.1 5 vs 2 1.9 39 vs 43 1.0 64 vs 78 3.0 5 vs 37 18.5 39 vs 56 -1.5 68 vs 65 2.1 2.1. Conación de MIF La MIF se clona a partir de ARN total, extraido de células THP-1 humanas. 5 g de ARN se transcriben inversamente dentro de cADN con 5 ng de primer oligo(dt)is, regulador lx de primer cordón, 10 mM de DTT, 0.5 mM de dNTPs y 2 U de Superscript II (gibco BRL) a 42 °C por 50 minutos. Luego la reacción se termina a 70°C por 15 minutos, y se determina la concentración de cADN a través de espectrofotometria UV. para la amplificación de la MIF, se usan para PCR 100 ng del cADN y 10 pmoles de primers de secuencia especifica para MIF (primer delantero, SEQ ID NO. 17 y primer inverso, SEQ ID NO 18) . Las condiciones de la reacción son: 2 minutos de 94°C, 35 ciclos con 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 53°C, 90 segundos a 72 °C, seguidos por 7 minutos a 72 °C con polimerasa de ADN Taq. La mezcla de la reacción se separa en un gel de agarosa al 2%, se corta una banda de cerca de 360bp y se purifica con el equipo de extracción QIAEX II (Qiagen) . Se determina la concentración de la banda purificada y se incuban alrededor de 120 ng con 300 ng de pDONR201, el vector donante del sitema Gateway (Life Technologies) , regulador lx BP de reacción clonasa, mezcla BP de enzima clonasa, en un volumen total de 20µ1 durante 60 minutos a 25°C. Después se incuban las reacciones con 2µ1 de proteinasa K y se incuba por 10 minutos a 3 °C. Luego la mezcla reacción de electropora en células DB3.1 competentes y se coloca en platinas contenedoras de Kanamicin. Los clones se verifican por secuenciado . Un clon, llamado pDORN-MIF, con secuencia idéntica a la entrada de la base de datos (acc. L19686) , se usa para experimentos posteriores. 2.2. Generación de un vector de transfección para MIF El vector que contiene MIF, descrito en 1.1, se usa para transferir el cADN para la MIF del vector de expresión pcADN3.1 (+) /attR, que contiene los sitios de recombinación "attRl" y "attR2" del sistema de clonación Gateway (Life Technologies), donde MIF se expresa bajo el control del promotor CMV. Se mezclan 150 ng del "vector de entrada" pDONR-MIF con 150 ng del "vector de destino" pcADN3.1 (+) /ATTR, 4µ1 de la mezcla de enzima Clonasa LR, 4µ1 de regulador de reacción Clonasa LR, añadido con TE (Tris/EDTA) a 20 µ? y se incuba a 25°C por 60 minutos. Luego, se añaden 2 µ? de solución de proteinasa K y se incuba por 10 minutos a 37 °C. 1 µ? de la mezcla reacción se transforma en 50 µ? de DH5 a través de un choque de calentamiento de 30 segundos a 42 °C después de incubar en hielo las células con ADN por 30 minutos. Después del choque por calentamiento de las células, se añaden 450 µ? de S.O.C. y se incuban las células a 37°C por 60 minutos. Las células (100 µ?) se colocan en platinas LB conteniendo 100 µg/ml de ampicilina, y se incuba durante la noche.

Una colonia que contiene pcADN3.1 (+) /ATTR con MIF como inserto, se designa pcADN/ IF fy se usa para estudios de transfección . 2.3. Expresión de MIF recombinante El vector que contiene MIF, descrito en 1.1, se usa para transferir el cADN para la MIF hacia los vectores de expresión gpET28abc/attR que contienen los sitios de recombinación "attRl" y "attR2" del sistema de clonación Gateway (Life Technologies) . Estos vectores permiten la expresión de la MIF recombinante etiquetada en lo alto en la bacteria, bajo el control hacia el promotor T7. Se mezclan 150 ng del "vector de entrada" pDONR-MIF con 150 ng del "vector de destino" gpET28abc/attR, 4 µ? de la mezcla de enzima Clonasa LR, 4 µ? de regulador de reacción Clonasa LR, añadidos con el TE (Tris/EDTA) a 20 µ? y se incuba a 25°C por 60 minutos. Luego, se añaden 2 µ? de solución de proteinasa K y se incuba por 10 minutos a 37 °C. 1 µ? de la mezcla reacción se transforma en 50 µ? de DH5oc a través de choque por calentamiento de 30 segundos a 42°C, después de incubar las células con ADN por 30 minutos en hielo.

Después del choque por calentamiento de las células, se añaden 450 µ? de S.O.C. y las células se incuban a 37 °C por 60 minutos. Las células (100 µ?) se colocan en platinas LB conteniendo 100 g/ml de ampicilina y se incuban toda la noche.

Una colonia que contiene gpET28abc/attR con MIF fusionado a la etiqueta alta en el marco correcto de lectura, se designa como pgPET/MIF y se usa para la expresión de la MIF en las bacterias. 2.4. Purificación de MIF recombinante 1 1 de caldo LB incluyendo 100 µ /??1 de ampicilina, se inocula con 0.5 mi de un cultivo de toda la noche de E. coli M15(pREP4) que porta pQE/MIF. El cultivo se incuba a 37 °C con agitación vigorosa hasta que se induce la Expresión ODSoo de 0.6. Se induce la expresión añadiendo 1 mM de IPTG y el cultivo se hace crecer más por 4 horas. Las células se cosechan por centrifugación a 4000xg por 20 minutos, a 4°C. Las pelotillas se congelan a -20°C.

Las células se descongelan en hielo y se resuspenden en 2 ml/g de pelotillas de células de regulador de lisis (50 mM de NaH2P04, pH 8.0, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazola) . Luego se añade lisozima a 1 mg/ml y se incuba en hielo por 30 minutos. Después las células se someten a sonicación (seis estallidos de 10 segundos a 300 W) . Se añaden 10 µ?/??? de R ase A y 5 µg/ml de DNase I, y se incuba en hielo por 10 minutos. Luego, los lisatos se aclaran por sedimentos rotatorios a 10000xg por 20 minuots a 4°C. Luego, se añaden inhibidores de proteasa (40 g ml de bacitracina, 4 g/ml de leupeptina, 4 µg/ml· de quimostatina, 10 µg/ml de pefabloc, 100 µ? de PMSF) . Se añaden al lisato 3 mi de resina Ni-NTA (Qiagen) y se coloca dentro de una columna. Se permite el aglutinamiento a la resina durante 60 minutos a 4°C, durante un agitado suave. Luego se abre el desagüe de la ccolumna, la resina se lava dos veces con 12 mi de regulador de lavado (50 mM de Na2P04, pH 8.0, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazola) y se eluye cuatro veces de 3 mi de regulador de elusión (50 mM de Na2P04, pH 8.0, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazola). La fracción de elusión que contiene la proteina recombinante se determina a través de SDS-PAGE y la concentración de proteina de la proteina purificada se determina a través del método Bradford. 2.5. Purificación de células T CD4+ y de células mononucleares de sangre periférica Se diluyen 10 mi de sangre de voluntarios sanos con 25 mi de PBS y se colocan con cuidado como una capa sobre 15 mi de ficoll en un tubo Falcon de 50 mi. Se hace girar el tubo a 400x g por 40 minutos a temperatura ambiente. Se remueven las células con una pipeta de pasteur y se lavan en 50 mi de PBS a 500x g por 10 minutos, en RT.

Se aislan los linfocitos CD4+ con ayuda de gotas magnéticas. La fracción celular (como se describe en el párrafo anterior) se resuspende en 80 µ? de regulador MACS (PBSy 2 mM de EDTA, BSA al 0.5%) por lxlO7 células. Se aáden 20 µ? de gotas de separación CD4+ (Miltenyi Biotech) a lxlO7 células, se mezcla y se incuba a 4°C por 15 minutos. Luego se añaden 20 volúmenes de regulador MACS y se hace girar a 1000 rpm durante 10 minutos. Las pelotillas se resuspenden en 500 µ? de regulador MACS por lxlO8 células y se añaden a una Columna LS+ de Separación Miltenyi que está equilibrada con 3 mi de regulador MACS . Se exponen las gotas magnéticas a un campo magnético durante 30 segundos y se retienen las células CD4+ etiquetadas. Después, las columnas son separadas del campo magnético y las células CD4+ se lavan con 5 mi de regulador MACS. Las células se hacen girar hacia abajo y se resuspenden en RPMI1640, 10% de FCS) .

De modo similar, las células mononucleares humanas se aislan del total de la sangre por centrifugación de densidad ficoll. Después del sembrado, las células se lavan dos veces en 24 horas con RPMI 1640, 10% de FCS, para remover las células no adherentes . 2.6. Efectos fenotlpicos/celulares causados por la MIF Se realizaron los siguientes ensayos con líneas de células THP-1 (Tsuchiya et al. 1980), MonoMac 6 (Ziegler-Heitbroch et al. 1988) que son transitoria o establemente transfectadas con MIF y se comparan las lecturas con las células transfectadas por simulación. Además, se añaden las sustancias que de acuerdo con la invención estimulan la actividad de la MIF.

Producción y liberación de citocinas Las lineas de células monociticas/macrófagas se estimulan con MIF (1 µg ml) a densidades de células de entre 2,5 y 5 x 10* células/mi. Las células se cosechan después de 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48, y 72 horas, el flotante se congela para investigación posterior, las células se lavan con PBS, y se resuspenden en 400 µ? de regulador RLT (del Qiagen RNeasy Total RNA Isolation Kit, o Equipo de aislamiento total de ARN RNeasy de Qiagen) con 143 mM de ß-mercaptoetanol, cortando el ADN con una aguja de 20 g por al menos 5 veces y almacenándolo a -70°C.

La estimulación de las células por el humo de cigarrillos se realiza a través de un medio enriquecido de humo. 100 mi de medio RPMI sin suplementos se asperjan con el humo de 2 cigarrillos. El humo de los cigarrillos se introduce dentro de una jeringa de 50 mi (cerca de 20 volúmenes de un volumen de 50 mi por cigarrillo) y se asperja en el medio. Después se ajusta el pH del medio a 7.4, y el medio es filtroesterilizado a través de un filtro de 0.2 um. Las células se resuspenden en un medio enriquecido de humo y se incuban por 10 minutos a 37 °C a una densidad de lxlO6 células/ml. Luego, las células se lavan dos veces con RPMI 1640 y se siembran en frascos o platinas 24 (MonoMac6) durante los tiempos indicados arriba.

Los ARNs totales se aislan con el Equipo de Aislamiento Total de AR Qiagen RNeasy (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN purificado se usa para el análisis de Taqman. Se miden los niveles de expresión de las citocinas TNFa, IL-?ß, IL-8, E IL-6.

Detección de las citocinas secretadas Las proteínas en los flotantes de las células cultivadas y estimuladas se precipitan por adición de TCA a una concentración final del 10%. Los precipitados se lavan dos veces con etanol al 80% y las pelotillas se resuspenden en 50 mM de Tris/HCl, pH 7.4, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA. La concentración de proteina se determina a través del método Bradford y 50 Dg de cada muestra se cargan en geles de poliacrilamida SDS al 12%. Los geles se untan sobre membranas PVDF, se bloquean por 1 hora en 5% de BSA en TBST, y se incuban por 1 hora con anticuerpos contra los TNFa, IL-?ß, IL-8 E IL-6 humanos, disponibles comercialmente . Después de lavarlas con TBST, las manchas de gel se incuban con IgG anti-humanos conjugados a peroxidasa de rábano picante, se lavan de nuevo y se desarrollan con equipo de quimioluminiscencia ECL (Amersham) . La intensidad de las bandas se visualiza con películas de rayos X BioMax (Kodak) y se cuantifican por densitometria .

Las células CD44 purificadas (como se describió en 2.0) se siembran en platinas 96 (5xl04 células/200 µ?) en RPMI 1640, 10% de FCS, y se incuban con dexametasona (10 nM) en presencia o ausencia de 10 ng/ml de MIF. Después de 24 horas de incubación a 37 "C en una atmósfera humidificada con 5% de C02, se determina por ELISA la liberación de citocina (p. ej . IL-2 ó IFN-? ( ínterferón-gamma) ) . La MIF sobrepara el efcto inhibidor de la dexametasona y causa la liberación de las citocinas . El efecto contrarrestante de la MIF en la dexametasona se regula añadiendo sustancias de acuerdo con la invención (0.1-100 ng/ml) a la mezcla reacción y se calcula el efecto como porcentaje de inhibición del efecto mediado de la MIF.

Para determinar la liberación de citocina (IL-?ß, IL-6, IL-8, TNF-a) en los monocitos, las células requieren ser tratadas con 1 g/ml de LPS, después de 1 hora de preincubación con dexametasona y MIF (de acuerdo con el párrafo anterior) .

Detección de metaloproteasas de matriz y otras proteasas^ secretadas El procedimiento es idéntico al usado para las citocinas. Los anticuerpos usados para el manchado de Western son contra los humanos MMP-1, MMP-7, MMP-9, Y MMP-12.

Actividad de las metaloproteasas de matriz secretadas La actividad de la proteasa se determina con un substrato fluorescente. Los flotantes aislados a partir de las células estimuladas y no estimuladas (descritos arriba) se incuban en un volumen total de 50 µ? con 1 µ? del substrato (Dabcil-Gaba-Pro-Gln-Gli-Leu-Glu (EDANS) -Ala-Lis-NH2 (Novabiochem) ) por 5 minutos a temperatura ambiente. Los controles positivos se realizan con 125 ng de MMP-12 purificado por reacción. La actividad de proteasa se determina por fluorometria con una excitación a 320 mi y una emisión a 405 nm.

En un ensayo alternativo para determinar la actividad proteolitica y la migración celular se usa una cámara de quimiotaxis (Boyden) . En las paredes de la parte superior de la cámara las células se colocan en platinas (105 células por platina) en filtros cubiertos con una capa de 8 um de Matrigel (Becton Dickinson) . En el compartimiento inferior, se añaden al medio quimioatrayentes como MIF (1 g/Ir?l) , leucotriena B4 (10 ng/ml) , y MCP-1 (10 ng/ml). Después de cinco dias se remueven los filtros, las células de la superficie de abajo que han atravesado el Matrigel se fijan con metanol, se tintan con el equipo de entintado Diff-Quik (Dade Behring) y se cuentan en tres campos de alto poder (400x) , por microscopía de luz.

Ensayo de quimiotaxis Para determinar la quimiotaxis, se usa una cámara de quimiotaxis de 48 platinas (Boyden) . Las células se privan de alimento durante 24 horas en un medio RPMI sin FCS. Se estimula la quimiotaxis con 100 ng/ml de leucotriena B , o MCP-1. Se usa la adición de MIF (1 µg/ml) para bloquear la quimiotaxis. Se diluyen las sustancias de acuerdo con la invención en el medio RPMI sin FCS y se colocan 30 µ? en las platinas del compartimento inferior, para contrarrestar la actividad MIF. El compartimento superior se separa del compartimento inferior con un filtro de policarbonato (tamaño de poro 8 um) . Una suspensión de células de 50 µ? (5xl04) se coloca en la platina del compartimento superior. La cámara se incuba por 5 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de C02. Luego se remueve el filtro, se raspan las células de la parte superior, las células del lado de abajo se fijan durante 5 minutos en metanol y se tintan con el conjunto de entintado Diff-Quik (Dade Behring) . Las células migradas se cuentan en tres campos de alto poder (400x) por microscopía de luz.

Ensayo de adherencia Se cultivan las células, se lavan en PBS y se resuependen (4xl06/ml) en PBS y 1 µ? de éster de BCECF ( (2' -7' -bis- (carboxietil ) -5 (6' ) -carboxifluoroesceina acetoximetilo) , Calbiochem) y se incuban por 20 minutos a 37°c. las células se lavan en PBS y se resuspenden (3.3x loVml) en PBS conteniendo 0.1% de BSA. Se añaden 3xl0 células (90 µ?) a cada platina 96 de fondo plano cubierta con laminina (Becton Dickinson) y se permite que se asiente por 10 minutos. Se añaden las sustancias de acuerdo con la invención en presencia y en ausencia de MIF (1 µg/ml) , y las platinas se incuban por 20 minutos a 37 °C. Se lavan las células con PBS conteniendo 0.1% de BSA y las células adherentes se solubilizan con 100 µ? de 0.025 M NaOH y 0.1% de SDS. Se realiza la cuantificación por medida de fluorescencia .

Fagocitosis Las suspensiones de células (2.5x10" células/ml) se siembran en platinas 6 con 5 mi de U937 o de THP-1, o en platinas 24 con 2 mi de MonoMac6 y se incuban por 1 hora a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de C02. En presencia de MIF, se añaden las sustancias de acuerdo con la invención para contrarrestar la actividad de la MIF. A cada platina se añaden 40 µ? de una suspensión dispersa de boulardii Sacaromicas desactivadas por calor (20 levaduras/célula) . Las células se incuban por tres horas más, se lavan dos veces con PBS y se citocentrifugan. Las preparaciones de citospina se tintan con May~Grünwald-Giemsa y las partículas fagocitosadas se cuentan por microscopía de luz .

Ejemplo 3: DAD1 Un gen identificado como regulado a la baja en los fumadores EPOC, comparados con los fumadores saludables, es el DAD1 (defensor contra la muerte celular apoptótica 1, siglas en inglés) . Originalmente, el DAD1 se descubrió como un regulador negativo de la apoptosis (Nakashima et al. 1993) . Por homología con la proteina 0st2 en la pomba Esquizosacaromicas, se identificó como la subunidad 16 kDa del complejo oligosacariltransferasa que cataliza la transferencia de los oligosacáridos altos en mannosa en residuos de asparagina en los polipéptidos nacientes. La DAD1 es una proteina de membrana integral y se expresa ubicuamente (Kelleher y Gilmore, 1997) .

La DAD1 se encuentra consistentemente sobrerregulada (42%) en comparaciones entre fumadores EPOC y fumadores sanos. Esto se muestra a través de los "valores de doblez" (Tab. 2) .

Tab. 2: Valores de cambio de doblez (FC, siglas en inglés) para comparaciones entre fumadores obstruidos y fumadores sanos. En promedio, la DAD1 está sobrerregulada por doblez de 1.6, la media es doblez de 1.5. comp FC comp FC comp FC comp FC 1 vs 2 -1.1 5 vs 43 2.3 39 a 57 4.8 68 vs 66 1.4 1 vs 37 2.5 5 vs 56 3.9 39 vs 58 2.5 68 vs 69 1. 1 vs 43 1.5 5 vs 57 4.0 39 vs 62 6.6 68 vs 76 2.2 1 vs 56 2.4 5 vs 58 2.0 44 va 2 -2.9 68 vs 78 2.1 1 vs 57 2.5 5 vs 62 5.5 44 vs 37 1.1 70 vs 65 -1.3 1 vs 58 1.3 6 vs 2 1.0 44 vs 43 -1.7 70 vs 66 -1.4 1 vs 62 3.4 6 vs 37 2.7 44 vs 56 1.0 70 vs 69 -1.3 3 vs 2 -1.2 6 s 43 1.6 44 vs 57 1.0 70 vs 76 1.1 3 V3 37 2.3 6 vs 56 2.7 44 vs 58 -1.9 70 vs 78 1.1 3 vs 43 1.4 6 va 57 2.7 44 vs 62 1.4 71 vs 65 1.1 3 vs 56 2.3 6 vs 58 1.4 64 V3 65 -1.1 71 vs 66 1.0 3 vs 57 2.3 6 vs 62 3.7 64 vs 66 -1.1 71 vs 69 1.2 3 vs 58 1.2 39 vs 2 1.7 64 vs 69 -1.1 71 vs 76 1.6 3 vs 62 3.2 39 vs 37 4.8 64 vs 76 1.3 71 vs 78 1.6 5 vs 2 1.4 39 vs 43 2.8 64 vs 78 1.3 5 vs 37 3.9 39 vs 56 4.7 68 vs 65 1.4 La proteina es clonada y los ensayos se designan y se realizan de una manera análoga a las clonaciones y ensayos aqui antes descritos.

Ejemplo 4: 7ARL4 Un gen identificado como ssiendo sobrerregulado en los fumadores EPOC comparados con los fumadores sanos es el ARL4 (factor ADP de ribosilación como la protelna 4) . Los ARLs pertenecen a la familia de los factores de ribosilación ADP (ARFs, siglas en inglés) . Los ARFs están involucrados en el tráfico vesicular y de membranas. El ARL4 está detectado tanto en interior como en el exterior del núcleo y se especula que está involucrado en la diferenciación celular (Jacobs et al. 1999).

El ARL4 se encuentra consistentemente sobrerregulado (45%) en comparaciones entre fumadores EPOC y fumadores sanos. Esto se muestra a través de los valores de "cambio de doblez" (Tab. 3: los valores de p para dos grupos separados que comparan fumadores EPOC y fumadores sanos son de 0.10 y 0.06).

Tab. 3: Valores de cambio de doblez (FC, siglas en inglés) para comparaciones entre fumadores obstruidos y fumadores sanos. En promedio, el ARL4 está sobrerregulado por doblez de 1.6, la media es doblez de 1.9. comp FC comp FC comp FC comp FC 1 vs 2 -1.1 5 vs 43 1.9 39 vs 57 2.5 68 vs 66 2.4 1 vs 37 2.7 5 vs 56 2.2 39 vs 5B 1.2 68 vs 69 4.5 1 vs 43 3.2 5 vs 57 1.6 39 vs 62 1.5 68 vs 76 7.8 vs 56 4.3 5 vs 58 -1.2 44 vs 2 -3.7 68 vs 78 3.3 vs 57 2.0 5 vs 62 1.0 44 vs 37 -1.3 70 vs 65 1.2 vs 58 -1.1 6 vs 2 1.2 44 vs 43 -1.1 70 vs 66 1.5 vs 62 1.2 6 vs 37 3.4 44 vs 56 1.5 70 vs 69 2.7 vs 2 -1.8 6 vs 43 3.6 44 vs 57 -1.7 70 vs 76 4.7 vs 37 2.0 6 vs 56 4.1 44 V3 58 -3.5 70 vs 78 1.9 vs 43 2.4 6 vs 57 2.7 44 vs 62 -2.7 71 vs 65 1.7 vs 56 3.2 6 vs 58 1.3 64 vs 65 -1.1 71 vs 66 2.0 vs 57 1.5 6 vs 62 1.6 64 vs 66 1.2 71 va 69 3.9 vs 5B -1.4 39 vs 2 1.1 64 vs 69 2.2 71 vs 76 6.7 vs 62 1.0 39 vs 37 3.3 64 vs 76 3.8 71 vs 78 2.8 vs 2 -1.3 39 vs 43 4.0 64 vs 78 1.6 vs 37 1.8 39 vs 56 4.7 68 vs 65 1.9 4.1. Clonación de ARL4 El ARL4 es clonado a partir de un ARN total extractado del 3T3-L1 humano. 5 µg de ARN se transcriben inversamente dentro de un cADN con 5 ng de primer oligo(dt)ig, regulador lx de primer cordón, 10 mM de DTT, 0.5 mM de dNTPs y 2 U de Superscript II (Gibco BRL) a 42 °C por 50 minutos. Luego se termina la reacción a 70°C por 15 minutos y se determina la concentración de cADN por espectrofotometria UV. Por amplificación de ARL4, 100 ng del cADN y 10 pmoles de los primers especificos de secuencia para ARL4 (primer delantero, SEQ ID NO. 19 y primer inverso, SEQ ID NO. 20) se usan para el PCR. Las condiciones de reacción son: 2 minutos de 9 °C, 35 ciclos con 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 53°C, 90 segundos a 72°C, seguidos por 7 minutos a 72°C con polimerasa Taq de ADN. El producto PCR se separa en un gel de agarosa al 2%, se corta una banda de cerca de 600bp 'y se purifica con el equipo de extracción QIAEX II (qiagen) . Este producto se digiere con BamHl y HindIII y se clona dentro del pQE-30 (Qiagen) que es digerido con BamHI y HindIII. Un clon, designado como pQE/ARL4, con secuencia idéntica a la entrada de la base de datos (acc.U73960) , se usa para experimentos posteriores. 4.2. Expresión de ARL4 1 1 de caldo LB, incluyendo 100 g/ml de ampicilina, se inocula con 0.5 mi de un cultivo de toda la noche de E. coli M15(pREP4) que porta pQE/ARL . El cultivo se incuba a 37 °C con agitación vigorosa hasta que se induce la Expresión ODGoo al añadir 1 mM de IPTG y el cultivo se crece más durante 4 horas. Las células se cosechan por centrifugación a 4000xg por 20 minutos a 4°C. La pelotilla se congela a -20°C. Las células se descongelan en hielo y se resuspenden en 2 ml/g de pelotilla de células de regulador de lisis (50 mM de NaH2P04/ pH 8.0, 300 mM de NaCl, 10 nM de imidazola) . Luego, se añade lisozima a 1 mg/ml y se incuba en hielo por 30 minutos. Luego las células se someten a sonicación (seis estallidos de 10 segundos a 300 W) . Se añaden 10 g/ml de RNase y 5 µ?/ l de DNase I y se incuba en hielo durante 10 minutos. Luego, los lisatos se aclaran por giro de sedimentos a lOOOOxg por 20 minutos a 4°C. Luego se añaden los inhibidores de proteasa (40 de bacitracina, 4 µg/ml de leupeptina, 4 g/ml de quimostatina, 10 µg ml de pefabloc, 100 µ? de PMSF) . Se añaden al lisato 3 mi de resina Ni-NTA (Qiagen) y se coloca dentro de una columna. Se deja aglutinar con la resina durante 60 minutos a 4°C durante agitación suave. Después se abre el desagüe de la columna, se lava dos veces la resina con 12 mi de regulador de lavado (50 mM de NaH2P04, pH 8.0, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazola) y se eluye con cuatro veces 3 mi de regulador de elusión (50 mM de NaH2P04, pH 8.0, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazola). La fracción de elusión que contiene la proteina recombinante se determina a través de SDS-PAGE y, la concentración de proteina de la proteina purificada se determina a través del método de Bradford. 4.3. Ensayo de aglomeración GTPys Se incuba ARL4 recombinante (1 µ?) a 37 °C con [5S]GTPS o [3H]GDP (10 µ?, -1000 cpm/pmol) en 50 mM de hepes ( H 7.5), 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de MgC12 con o sin (como se indica en los letreros de la figura) 2 mM de EDTA (1 µ? ó 1 mM de Mg2+ libre), 100 mM de KC1. Las sustancias de acuerdo on la invención se preincuban con ARL4 por 5 minutos a 4°C, en un rango de concentración desde 0.5 hasta 300 nM antes de iniciar la reacción de aglutinamiento GTPyS. En varios puntos de tiempo (de 10 segundos a 30 minutos), se remueven muestras de 25 µ? (25 pmoles de ARF) , se diluyen en 2 mi de heper 20 mM a temperatura de hielo (pH 7.5), 100 mM de NaCL, y 10 mM de MgCl2/ y se filtran en filtros de nitrocelulosa BA 85 de 25 mm (Schleicher & Schüll) . Los filtros se lavan dos veces con 2 mi del mismo regulador, se secan, y se cuantifican por conteo de centelleo .

Ejemplo 5: GNS, Un gen que se identifica por ser regulado a la baja en los fumadores EPOC comparados con los fumadores sanos es el Glutamina-6-sulfatasa (GNS) . El GNS hidroliza el grupo 6-sulfato de las unidades 6-sulfato de N-acetil-d-glucosamina de heparan (Kresse et al. 1980). El GNS se encuentra consistentemente regulado a la baja (44%) en comparaciones entre fumadores EPOC y fumadores sanos. Esto se muestra a través de los valores de "cambio de doblez" (Tab. 4) . Los valores de p para dos grupos separados que comparan fumadores EPOC y fumadores sanos son de 0.05 y 0.006.

Tab. 4: Valores de cambio de doblez (FC) para comparaciones entre fumadores obstruidos y fumadores sanos. En promedio está regulado a la baja por doblez de -2.0, la media es doblez de -1.8. comp FC comp FC comp FC comp FC 1 vs 2 1.0 5 vs 43 -4.6 39 vs 57 -2.4 68 vs 66 -3.6 1 vs 37 1.0 5 vs 56 -1.7 39 vs 58 -3.3 68 vs 69 -2.3 1 vs 43 -3.7 5 vs 57 -3.1 39 vs 62 -1.1 68 vs 76 -2.6 1 vs 56 -1.1 5 vs 58 -4.0 vs 2 -1.2 68 vs 78 -2.6 1 va 57 -2.3 5 vs 62 1.0 44 vs 37 -1.2 70 vs 65 -1.4 1 vs 58 -3.0 6 vs 2 1.0 44 vs 43 -4.3 70 vs 66 -1.6 1 vs 62 1.0 6 vs 37 1.1 44 vs 56 -1.3 70 vs 69 1.0 3 vs 2 -1.5 6 vs 43 -3.5 44 vs 57 -2.6 70 vs 76 -1.1 3 vs 37 -1.4 6 vs 56 1.0 44 vs 58 -3.7 70 vs 78 -1.1 3 vs 43 -5.0 6 vs 57 -2.2 44 vs 62 -1.2 71 vs 65 -2.1 3 va 56 -1.8 6 vs 58 -3.0 64 vs 65 -2.3 71 vs 66 -2.5 3 vs 57 -3.1 6 vs 62 1.1 64 vs 66 -2.6 71 vs 69 -1.7 3 vs 58 -3.9 39 vs 2 1.0 64 vs 69 -1.7 71 vs 76 -1.8 3 vs 62 -1.3 39 vs 37 -1.1 64 vs 76 -1.9 71 vs 78 -1.8 5 vs 2 -1.7 39 vs 43 -3.8 64 vs 78 -1.9 5 vs 37 -1.7 39 vs 56 1.0 68 vs 65 -3.1 Se clona la proteína y los ensayos se diseñan y se realizan de una manera análoga a la clonación y a los ensayos aquí antes descritos.

Ejemplo 6: Transglutaminasa 2 Un gen que se identifica como regulado a la baja en fumadores EPOC comparados con fumadores sanos, es la transglutaminasa 2. Esta enzima pertenece a una familia de transglutaminasas dependientes del calcio, que catalizan los enlaces covalentes de las proteínas específicas a través de la formulación de enlaces (?-glutamil) lisina, y la conjugación de poliaminas a proteínas (Foli 1980) . Las transglutaminasas también pueden ser secretadas. Las funciones fisiológicas no se comprenden bien; pueden estar involucradas en el procesamiento especializado de la matriz que ocurre durante la formación del hueso, en la cicatrización de heridas, y en otros procesos de remodelación (Lu et al. 1995) .

La transglutaminasa 2 se encuentra consistentemente regulada a la baja (55%) en comparaciones entre fumadores EPOC y fumadores sanos. Esto se muestra a través de los valores de "cambio de doblez" (Tab. 5) . Los valores de p para dos grupos separados que comparan fumadores EPOC y fumadores sanos son de 0.04 y 0.16.

Tab. 5: valores de cambio de doblez (FC) para comparaciones entre fumadores obstruidos y fumadores sanos. En promedio es regulado a la baja por doblez de 2.3, la media es doblez de -2.35. comp FC comp FC comp FC comp FC 1 vs 2 1.0 5 vs 43 -5.6 39 vs 57 -2.3 68 vs 66 -2.8 1 vs 37 -3.6 5 vs 56 -1.4 39 vs 58 -3.9 68 vs 69 -7.4 1 vs 43 -6.9 5 vs 57 -3.7 39 vs 62 1.0 68 vs 76 -4-4 1 vs 56 -1.5 5 vs 58 -7.5 44 vs 2 1.0 68 vs 78 -3.4 1 vs 57 -3.6 5 vs 62 1.0 44 vs 37 -3.2 70 vs 65 1.5 1 vs 58 -8.9 6 vs 2 2.2 44 vs 43 -7.7 70 vs 66 1.2 1 vs 62 1.0 6 vs 37 -2.2 44 vs 56 -1.9 70 vs 69 -2.5 3 vs 2 1.0 6 vs 43 -3.6 44 vs 57 -3.8 70 vs 76 -1.4 3 vs 37 -2.5 6 vs 56 1.0 44 vs 58 -11.3 70 vs 78 1.0 3 vs 43 -4.5 6 vs 57 -2.5 44 vs 62 1.0 71 vs 65 -1.8 3 vs 56 -1.2 6 vs 58 -4.7 64 vg 65 1.4 71 vs 66 -2.4 3 vs 57 -2.8 6 vs 62 -1.2 64 vs 66 1.1 71 vs 69 -6.9 3 vs 58 -5.9 39 vs 2 1.0 64 vs 69 -2.7 71 vs 76 -3.9 3 vs 62 1.0 39 vs 37 -1.8 64 vs 76 -1.5 71 vs 78 -2.8 5 vs 2 1.0 39 vs 43 -2.9 64 vs 78 -1.1 5 vs 37 -3.3 39 vs 56 1.2 68 vs 65 -2.1 La proteina es clonada y los ensayos se diseñan y se realizan de una manera análoga a la clonación y a los ensayos aqui antes descritos.

Ejemplo 7: Estearil-CoA-Desaturasa Un gen identificado como regulado a la baja en fumadores EPOC comparados con fumadores sanos, es la Estearil-CoA-Desaturasa . La Estearil-CoA-Desaturasa cataliza la oxidación del palmitoil-CoA y del estearoil-CoA en la posición A para formar los ésteres acil-CoA de ácido graso monoinsaturado, palmitoleoil-CoA y aoleoil-CoA, respectivamente (Enoch et al. 1976).

La estearoil-CoA-desaturasa se encuentra consistentemente regulada a la baja (48%) en comparaciones entre fumadores EPOC y fumadores sanos.

Esto se muestra a través de los valores de "cambio de doblez" (Tab. 6) . Los valores de p para dos grupos separados que comparan fumadores EPOC y fumadores sanos son de 0.03 y 0.15.

Tab, 6: valores de cambio de doblez (FC) para comparaciones entre fumadores obstruidos y fumadores sanos . En promedio es regulado a la baja por doblez de 2.3, la media es doblez de -1.9.

La proteina es clonada y los ensayos se diseñan y se realizan de una manera análoga a la clonación y a los ensayos aquí antes descritos.

Ejemplo 8: Glicosiltransferasa de glucosa Ceramida UDP Un gen identificado como regulado a la baja en los fumadores EPOC comparados con los fumadores sanos, es la glucosiltransferasa de glucosa ceramida UDP. Esta enzima cataliza la transferencia de glucosa de la glucosa UDP a la ceramida. El producto glucosil-ceramida sirve como la estructura central de más de 300 glicoshingolipidos que están involucrados en procesos celulares múltiples, tales como diferenciación, adhesión, proliferación, y reconocimiento célula-célula (basu et al. 1968, Ichikawa et al. 1996) .

La glucosiltransferasa de ceramida se encuentra consistentemente regulada a la baja (48%) en comparaciones entre fumadores EPOC y fumadores sanos. Esto se muestra a través de los valores de "cambio de doblez" (Tab. 7).

Tab. 7: valores de cambio de doblez (FC) para comparaciones entre fumadores obstruidos y fumadores sanos. En promedio es regulado a la baja por doblez de 1.2, la media es doblez de -1.9.

COItlp FC comp FC comp FC comp FC 1 vs 2 1.3 5 vs 43 -2.4 39 vs 57 -1.6 68 vs 66 -4.0 1 vs 37 -2.4 5 vs 56 -2.0 39 vs 58 -2.6 68 vs 69 -1.1 vs 43 -1.9 5 vs 57 -1.6 39 vs 62 -2.3 68 vs 76 -2.9 vs 56 -1.5 5 vs 58 -2.6 44 vs 2 7.2 68 vs 78 -3.4 vs 57 -1.3 5 vs 62 -2.0 44 vs 37 1.9 70 vs 65 1.0 vs 58 -2.1 6 vs 2 1.0 44 vs 43 2.7 70 vs 66 -2.0 vs 62 -1.5 6 vs 37 -4.2 44 vs 56 3.5 70 vs 69 1.5 vs 2 1.3 6 vs 43 -2.8 44 vs 57 4.6 70 vs 76 -1.4 vs 37 -2.6 6 vs 56 -2.3 44 vs 58 2.7 70 vs 78 -1.8 vs 43 -1.9 6 vs 57 -1.8 44 vs 62 3.4 71 vs 65 -2.0 vs 56 -1.6 6 vs 58 -3.0 64 vs 65 -1.7 71 vs 66 -4.3 vs 57 -1.3 6 vs 62 -2.4 64 vs 66 -3.2 71 vs 69 1.0 vs 58 -2.1 39 vs 2 1.0 64 vs 69 -1.1 71 vs 76 -2.5 vs 62 -1.7 39 vs 37 -3.5 64 vs 76 -2.5 71 vs 78 -3.7 vs 2 1.0 39 vs 43 -2.4 64 vs 78 -2.9 vs 37 -3.1 39 vs 56 -2.2 68 vs 65 -1.9 La proteína es clonada y los ensayos se diseñan y se realizan de una manera análoga a la clonación y a los ensayos aquí antes descritos.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> Boehringer Ingelheim Pharma KG <120> Método para identificar sustancias que influencian positivamente las condiciones inflamatorias de las enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias . <130> COPDrestlicheP <140> <141> <150> US 60/257, 878 <151> 2000-12-22 <160> 20 <170> Patent n Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2167 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctgcaggaac caatacccdt aggctatttg tataaatggg ccatgggg c tcccagctgg 60 aggctggctg gtgccacgag ggt cccacag gcatgggtgt ccttcctata tcacatggcc 120 ttcactgaga ctggtata g gattgcacct atcagagacc aaggacagga cctccctgga 180 aatctctgag gacctggcct g gatccagt tgctgccttg tcctcttcct gctatgtcat 240 ggcttatctt ctttcaccca ttcatt.catt cattcattca ttcagcagta ttagtcaatg 300 tctcttgata tgcctggcac ctgctagatg gyccccgagt ttaccattag tggaaaagac 360 atttaagaaa ttcaccaagg gctc atgag aggccataca cggtggacct gactagqgtg 420 tggcttccct gaggagctga agttg ccag aggcccagag aaggggagct gagcacgttt 480 gaaccactga acctgctc g gacctcg ;ct ccttccttcg gtgcctccca qcatcctatc 540 ctctttaaag agcaggggtt cagggaagtt ccctgga gg tgattcgcag gggcagctcc. 600 cctctcacct gccgcatgac taccccgccc catctcaaac acacaagctc ' acgcatgcgg 660 gactggagcc cttgaggaca tgtggcccaa agacaggagg tacaggggct cagtgcgtgc 720 agtggaatga actgggcttc atctctggaa gggtaagggg ccatcttccg ggttcaccgc 780 cgcatcccca cccccggcac agcgcctcct ggcgactaac atcggtgact taggtaaagg 840 actaagaaag acccgaggcg aggccggaac aggccgattt ctagccgcca agtggagaac 900 aggttggagc ggtgcgccgg gcttagcggc ggt gctgga ggaacgggcg gagtcgccca 960 gggtcctgcc ctgcgggggt cgagccgagg caggcggtga cttccccact cggggcggag 1020 ccgcagcctc gcgggggcgg ggcctggcgc cggcggtggc gtcacaaaag gcgggaccac 1080 agtggtgtcc gagaagtcag gcacgtagct. cagcggcggc cgcggcgcgt gcgtctgtgc 1140 ctctgcgcgg gtctc tggt ccttctgcca tcatgccgat gttcatcgta aacaccaacg 1200 tgccccgcgc ctccgtgccg gacggqttcc tctccgagct. cacccagcag ctqqcgcagg 1260 ccaccggcaa gcccccccag gtttgccggg aggggacagg a gagggggg tgcccaccgg 1320 acgaggggtt ccgcgctggg agctggggag gcgactcctg aacqqagctg gggggcgggg 1380 cggggggagg acggtggctc gggcccgaag tggacgttcg gggcccgacg aggtcgctgg 1440 ggcgggctga ccgcgccctt tcctcgcagt acatcgcggt gcacgtggtc ccggaccagc 1500 tcatggcctt cggcggctcc agcgagccgt gcgcgctctg cagcctgcac agcatcggca 1560 agatcggcgg cgcgcagaac cgctcctaca gcaagctgct gtgcggcctg ctggccgagc 1620 gcc gcgcat cagcccggac aggtacgcgg agtcgcggag gggcggggga ggggcggcgg 1680 cgcgcggcca ggcccgggac tgagccaccc gctgagtccg gcctcctccc cccgcagggt 1740 ctacatcaac tattacgaca tgaacgcggc caatgtgggc tggaacaact ccaccttcgc 1800 ctaagagcgg cagggaccca cgctgtctgc gctggctcca cccgggaacc cgccgcacgc 1860 tgtgttctag gcccgcccac cccaaccttc tggtggggag aaataaacgg ttagagact 1920 aggagtgcct cggqgttc t tggcttgcgg gaggaattgg tgcagagccg ggaeattggg 1980 gagcgaggtc gggaaacggt gttgggggcg ggggtcaggg ccgggttgct ctcctcgaac 2040 ctgctgttcg ggagcccttt tgtccag ct gtccctccta cgctcctaac agaggagccc 2100 cagtgtcttt ccattctatg gcgtacgaag ggatgaggag aagttggcac tctgccctgg 2160 gctgcag 2167 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Met Phe He Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro 1 5 10 15 Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly 20 25 30 Lys Pro Pro Gln Tyr lie Ala Val His Val Val Pro Asp Gla Leu Met 35 40 45 Ala Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser 50 55 60 lie Gly Lys lie Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu 65 70 75 80 Cys Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg lie Ser Pro Asp Axg Val Tyr 85 90 95 Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser 100 105 110 Thr Phe Ala 115 <210> 3 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 catccggtgt ggtcgacggg tcctccaaga gtttggggcg cggaccggag taccttgcgt 6 gcagttatgt cggcgtcggt agtgtctgtc atttcgcggt tcttagaaga gtacttgagc 120 tccactccgc agcgtctgaa gttgctggac gcgtacctgc tgtatatact g tgaccggg 180 gcgctgcagt tcggttactg tctcctcgtg gggaccttcc ccttcaactc ttttctctcg 240 ggcttcatct cttgtgtggg gagtttcatc ctagcggtt gcctgagaat acagatcaac 300 ccacagaaca aagcggattt ccaaggcatc tccccagagc gagcctttgc tgattttctc 360 tttgccagca ccatcctgca ccttgttgtc atgaactttg tt.ggctgaat cattctcatt 420 tacttaat g aggagtagga gactaaaaga atgttcactc tttgaatttc ctggataaga 480 gttctggaga tggcagctta ttggacacat ggattttctt cagatttgac acttactgct 540 agctctgctt tttatgacag gagaaaagcc cagagttcac tgtgtgtcag aacaactttc 600 taacaaacat ttattaatcc agcctctgcc tttcattaaa tgtaaccttt tgctttccaa 660 attaaagaac tccatgccac tcctcaaaaa aaaaaaaaa 699 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Ala Ser Val Leu Ser Val He Ser Arg Phe Leu Glu Glu Tyr 1 5 10 15 Leu Ser Ser Thr Pro Gln Arg Leu Lys Leu Leu Asp Ala Tyr Leu Leu 20 25 30 Tyr lie Leu Leu Thr Gly Ala Leu Gln Phe Gly Tyr Cys Leu Leu Val 35 40 45 Gly Thr Phe Pro Phe Asn Ser Phe Leu Ser Gly Phe He Ser Cys Val 50 55 60 Gly Ser Phe He Leu Ala Val Cys Leu Arg He Gln He Aan Pro Gln 65 70 75 80 Aan Lya Ala Asp Phe Gln Gly He Ser Pro Glu Arg Ala Phe Ala Asp 85 90 95 Phe Leu Phe Ala Thr He Leu His Leu Val Val Met A3n Phe Val 100 105 110 Gly <210> 5 <211> 1077 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 cttatccctg cgtagaaacg cctgccaatg ctttctcatt tggacccaga ctccagatcg 60 ggagcagtct ta agctgga tcagctacca agagaagttg taaaccaaga agagaaaagc 120 atttcaattt gggacattta tttgcacctg gaaatgggga atgggctgtc aga ccagact 180 tctatcctgt ccaacctgcc ttcatttcag tctttccaca ttgttattct gggtttggac 240 tgtgctggaa agacaacagt t atacagg ctgcagttca atgaatttgt aaataccgta 300 cctaccaaag gatttaacac tgagaaaatt aaggtaacct tgggaaattc taaaacagtc 360 acttttcact tctgggatgt aggtggtcag gagaaattaa ggccactgtg gaagtcatat 420 accagatgca cagatggcat tgta ttgtt gtggactctg ttgatgtcga aaggatggaa 480 gaagccaaaa ctgaacttca caaaataact aggatatcag aaaatcaggg agtccctgta 540 cttatagttg ctaacaaaca agatttgagg aactcattgt cactttcaga aattgagaaa 600 ttgttagcaa tgggtgaact gagctcatca actccttggc atttgcagcc tacctgtgca 660 a cataggag atggcctaaa ggaaggactt gagaaactac atgatatgat catt aaaaga 720 agaaaaatgt tgcggcaaca gaaaaagaaa agatgaatat caatacctat tatatctgtg 780 tggagtaggt tttctctggt ctgattttga 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Asp Leu Arg Asn Ser Leu Ser Leu 130 135 140 Ser Glu lie Glu Lys Leu Leu Ala Met Gly Glu Leu Ser Ser Ser Thr 145 150 155 160 Pro Trp His Leu Gln Pro Thr Cys Ala lie lie Gly Asp Gly Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Leu Glu Lys Leu His Asp Met lie lie Lys Arg Arg Lys Met 180 185 190 Leu Arg Gln Gln Lys Lys Lys Arg 195 200 <210> 7 <211> 2379 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 ggaattccgg tcggcctctc gcccttcagc tacctgtgcg tccctccqtc ccgtcccgtc 60 ccggggtcac cccggagcct gtccgctatg cggctcctge ctctagcccc aggtcggctc 120 cggcggggca gcccccgcca cctgccctcc tgcagcccag cgctgctact gctggtgctg 180 ggcggctgcc tgggggtctt cggggtggct gcgggaaccc ggaggcccaa cgtggtgctg 240 ctcctcacgg acgaccagga cgaagtgctg ggcggcatga caccactaaa gaaaaccaaa 300 gctctcatcg gagagatggg gatgacttt tc agtgctt atgtgccaag tgctctctgc 360 tgccccagca gagccagtat cctgacagga aagtacccac ataatcatca cgttgtgaac 420 aacactctgg aggggaactg cagtagtaag tcctggcaga agatccaaga accaaatact 480 ttcccagcaa ttctcagatc aatgtgtggt. tatcagacct tttttgcagg gaaatattta 540 aatgagtacg gagccccaga tgcaggtgga ctagaacacg ttcctctggg ttggagttac 600 tggtatgcct tggaaaagaa ttctaagtat tataatt acá ccctgtctat caatgggaag 660 gcacggaagc atggtgaaaa ctatagtgtg gactacctga cagatgtttt ggctaatgtc 720 tccttggact ttctggac a caagtccaac tttgagccct tcttcatgat gatcgccact 760 ccagcgcctc attcgccttg gacagctgca cctcagtacc agaaggcttt ccagaatgtc 840 tttgcaccaa gaaacaagaa cttcaacatc catggaacga acaagcactg gttaatt agg 900 caagccaaga ctccaatgac taattcttca atacagtttt tagataatgc atttaggaaa 960 aggtggcaaa ctctcctctc agttgatgac cttgtggaga aactggtcaa gaggctggag 1020 ttcactgggg agctcaacaa cacttacatc ttctatacct cagacaatgg ctatcacaca 1080 ggacagtttt ccttgccaat agacaagaga cagctgtatg agtttgatat caa agttcca 1140 ctgttggttc gaggacctgg gatcaaacca aatcagacaa gcaagatgct ggttgeeaac 1200 attgacttgg gtcctactat tttggacatt gctggctacg acctaaataa gacacagatg 1260 gatgggatgt ccttattgcc cat t gaga ggtgccagta acttgacctg gcgatcaga 1320 gtcctggtgg aataccaagg agaaggccgt aacgtcactg acccaacatg cccttccctg 1380 agtcctggcg tatctcaatg ttcccagac t gtgtatgtg aagatgctta taacaatacc 1440 tatgcctgtg tgaggacaat gtcagcattg tggaatttgc agtattgcga gtttgatgac 1500 caggaggtgt. ttgtagaagt ctataatctq actgcagacc cagaccagat. cactaacatt. 1560 gctaaaacca t agacccag a gcttttagga aagatgaact atcggttaat gatgttacag 1620 tcctgttctg ggccaacctg tcgcactcca ggggtttttg accccggata caggtttgac 1680 ccccgtctca tgttcagcaa tcgcggcagt gtcaggactc gaagattttc ca.aacatc.tt 1740 ctgtagcgac ctcacacaq c ctctgcagat ggatccctgc acgcctcttt ctgatgaagt 1800 gattgtagta ggtgtctgta gctagtcttc aagaccacac ctggaagagt ttctgggctg 1860 gctttaagtc ctgtttgaaa aagcaaccca gtcagctgac ttcctcgtgc aatgtgttaa 1920 actgtgaact ctgcccatgt gtcaggagtg gctgtctctg gtctcttcct ttagctgaca 1980 aggacactcc tgaggtcttt gttctcactg tatttttttt atcctgggge cacagttctt 2040 gattattcct cttgtggtta aagact aat ttgtaaaccc attcagataa atggcagtac 2100 tttaggacac acacaaacac acagatacac cttttgatat gtaagcttga cctaaagtca 2160 aaggacctgt gtagcatttc agattgagca cttcactatc aa aaat acta acatcacatg 2220 gcttgaagag taaccatcag agctgaatca tccaagtaag aacaagtacc attgttgatt 2280 gataagtaga gatacatttt ttatgatgtt catcacagtg tggtaaggtt gcaaattcaa 2340 aacatgtcac ccaagctctg ttcatgtttt tgtgaattc 2379 <210> 8 <211> 552 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg leu Leu Pro leu Ala Pro Gly Arg Leu Arg Arg Gly Ser Pro 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Ser Cys Ser Pro Ala Leu Leu Leu Leu Val Leu Gly 20 25 30 Gly Cys Leu Gly Val Phe Gly Val Ala Ala Gly Thr Arg Arg Pro Asn 35 40 45 Val Val Leu Leu Leu Thr Asp Asp Gln Asp Glu Val Leu Gly Gly Met 50 55 60 Thr Pro Leu Lys Lys Thr Lys Ala Leu lie Gly Glu Met Gly Met Thr 65 70 75 80 Phe Ser Ser Ala Tyr Val Pro Ser Ala Leu Cys Cys Pro Ser Arg Ala 85 90 95 Ser lie Leu Thr Gly Lys Tyr Pro His Asn His His Val Val Asn Asn 100 105 110 Thr Leu Glu Gly Asn Cys Ser Ser Lys Ser Trp Gln Lys lie Gln Glu 115 120 125 Pro Asn Thr Phe Pro Ala lie Leu Arg Ser Met Cys Gly Tyr Gln Thr 130 135 140 Phe Phe Ala Gly Lys Tyr Leu Asn Glu Tyr Gly Ala Pro Asp Ala Gly 145 150 155 160 Gly Leu Glu His Val Pro Leu Gly Trp Ser Tyr Trp Tyr Ala Leu Glu 165 170 175 Lys Asn Ser Lys Tyr Tyr Asn Tyr Thr Leu Ser lie Asn Gly Lys Ala 180 185 190 Arg Lys His Gly Glu Asn Tyr Ser Val Asp Tyr Leu Thr Asp Val Leu 195 200 205 Ala Asn Val Ser Leu Asp Phe Leu Asp Tyr Lys Ser Asn Phe Glu Pro 210 215 220 Phe Phe Met Met lie Ala Thr Pro Ala Pro His Ser Pro Trp Thr Ala 225 230 235 240 Ala Pro Gln Tyr Gln Lys Ala Phe Gln Asn Val Phe Ala Pro Arg Asn 245 250 255 Lys Asn Phe Asn His Gly Thr Asn Lys His Trp Leu lie Arg Gln 260 265 270 Ala Lys Thr Pro Met Thr Asn Ser Ser lie Gln Phe Leu Asp Asn Ala 275 280 285 Phe Arg Lys Arg Trp Gln Thr Leu Leu Ser Val Asp Asp Leu Val Glu 290 295 300 Lys Leu Val Lys Arg Leu Glu Phe Thr Gly Glu Leu Asn Asn Thr Tyr 305 310 315 320 Ile Phe Tyr Thr Ser Asp Asn Gly Tyr His Thr Gly Gln Phe Ser Leu 325 330 335 Pro lie Asp Lys Arg Gln Leu Tyr Glu Phe Asp lie Lys Val Pro Leu 340 345 350 Leu Val Arg Gly Pro Gly lie Lys Pro Asn Gln Thr Ser Lys Met Leu 355 360 365 Val Ala Asn lie Asp Leu Gly Pro Thr lie Leu Asp lie Ala Gly Tyr 370 375 380 Asp Leu Asn Lys Thr Gln Met Asp Gly Met Ser Leu Leu Pro lie Leu 385 390 395 400 Arg Gly Ala Ser Asn Leu Thr Trp Arg Ser Asp Val Leu Val Glu Tyr 405 410 415 Gln Gly Glu Gly Arg Asn Val Thr Asp Pro Thr Cys Pro Ser Leu Ser 420 425 430 Pro Gly Val Ser Gln Cys Phe Pro Asp Cys Val Cys Glu Asp Ala Tyr 435 440 445 Asn Asn Thr Tyr Ala Cys Val Arg Thr Met Ser Ala Leu Trp Asn Leu 450 455 460 Gln Tyr Cys Glu Phe Asp Asp Gln Glu Val Phe Val Glu Val Tyr Asn 465 470 475 4T0 Leu Thr Ala Asp Pro Asp Gln lie Thr Asn lie Ala Lys Thr lie Asp 485 490 495 Pro Glu Leu Leu Gly Lys Met Asn Tyr Arg Leu Met Met Leu Gln Ser 500 505 510 Cys Ser Gly Pro Thr Cys Arg Thr Pro Gly Val Phe Asp Pro Gly Tyr 515 520 525 Arg Phe Asp Pro Arg Leu Met Phe Ser Asn Arg Gly Ser Val Arg Thr 530 535 540 Arg Arg Phe Ser Lys His Leu Leu 545 550 <210> 9 <211> 3257 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 aacaggcgtg acgccagttc taaacttgaa acaaaacaaa acttcaaagt acaccaaaat 60 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acatcctgcg gcgctggaag aaccacggct gccagcgcgt caagtatgg 960 cagtgctggg tc tcgccgc cgtggcctgc acagtgctga ggtgcctagg catccctacc 1020 cgcgtcgtga c aactacaa ctcggcc at gaccagaaca gcaaccttct catcgagtac 1080 ttccgcaatg agt tgggga gatccagggt gacaagagcg agatgatctg gaacttccac 1140 tgctgggtgg agtcgtggat gaccaggccg gacctgcagc cggggtacga gggctggcag 1200 gccctggacc caacgcccca ggagaagagc gaaggaacgt actgctgtgg cccagttcca 1260 gttcgtgcca tcaaggaggg cgacctgagc accaagtacg atgcgccctt tgtctttgcg 1320 gaggtcaatg ccgacgtggt agactggatc cagcaggacg atgggtctgt gcacaaatcc 1380 atcaaccgtt ccctgatcgt tgggctgaag atcagcacta agagcgtggg ccgagacgag 1440 cgggaggata tcacccacac ctacaaatac ccagaggggt cctcagagga gagggaggcc 1500 ttcacaaggg cgaaccacct qaacaaactg gccgagaagg aggagacagg gatggccatg 1560 cggat ccgtg tgggccagag catgaacatg ggcagtgact ttgacgtctt tgcccacatc 1620 accaacaaca ccgctgagga gtacgtctgc cgcct cctgc tctgtgcccg caccgt agc 1680 tacaatggga tcttggggcc cgagtgtggc accaagtacc tgctcaacct aaccctggag 1740 cctttctctg agaagagcgt tcctctttgc atcctctatg agaaataccg tgactgcctt 1800 acggagtcca acctcatcaa ggtgcgggcc ctcctcgtgg agccagttat caacagctac 1860 ctgctggctg agagggacct ctacctggag aat ccagaaa tcaagatccg gatccttggg 1920 gagcccaagc agaaacgcaa gctggtggct gaggtgtccc tgcagaaccc gctccctgtg 1980 gccctggaag gctgcacctt cactgtggag ggggccggcc tgactgagga gcagaagacg 2040 g ggagatcc cagaccccgt ggaggcaggg gaggaagtta aggtgagaat ggacctcgtg 2100 ccgctccaca tgggcctcca caagctggtg gtgaacttcg agagcgacaa gctgaaggct 2160 gtgaagggct tccggaatgt catcattggc cccgcctaag ggacccctgc tcccagcctg 2220 ctgagagccc ccaccttgat cccaatcctt atcccaagct agtgagcaaa atatgcccct 2280 tattgggccc cagaccccag ggcagggtgg gcagcctatg ggggctctcg gaaatggaat 2340 gtgcccctgg cccatctcag cctcctgagc ctgtgggtcc ccactcaccc cctttgctgt 2400 gaggaatgct ctgtgccaga aacagtggga gccctgacct gtgctgactg gggctggggt 2460 gagagaggaa agacctacat tccctctcct gcccagatgc cctttggaaa gccattgacc 2520 acccaccata ttgtttgatc tacttcatag ctccttggag caggcaaaaa agggacagca 2580 tgcccttggc tggatcagga arccagctcc ctagactgca tcccgtacct cttcccatga 2640 ctgcacccag ctccaggggc c tgggaca cccagagctg ggtgggga a gtgataggcc 2700 caaggtcccc tccacatccc agcagcccaa gcttaatagc cctccccctc aacctcacca 2760 ttgtgaagca cctactatgt gctgggtgcc tcccacactt. gctggggctc acgggg ctc 2820 caacccattt aatcaccatg qgaaactgtt gtgggcgctg cttccaggat aaggagactg 2880 aggcttagag agaggaggca gc c ct cca caccagtggc ctcgtggtta taagcaaggc 2940 tgggtaatgt gaaggc caa gagcagagtc tgggcctctg actctgagtc cactgctcca 3000 tttataaccc cagcctgacc tgagactctc gcagaggctg tctggggcct ttatcaaaaa 3060 aagactcagc caagacaagg aggtagagag gggactgggg gactgggagt cag agccctg 3120 gctgggttca ggtcccacgt ctggccagcg actgccttct cctctctggg cctttgtttc 3180 cttgttggtc agaggagtga ttgaacctgc tcatctccaa ggatcctctc cactccatgt 3240 ttgcaataca caattcc 3257 <210> 10 <211> 687 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Glu Glu Leu Val Leu Glu Arg Cys Asp Leu Glu Leu Glu Thr 1 5 10 15 Asn Gly Arg Asp His His Thr Ala Asp Leu Cys Arg Glu Lys Leu Val 20 25 30 Val Arg Arg Gly Gln Pro Phe trp Leu Thr Leu His Phe Glu Gly Arg 35 40 45 Asn Tyr Gln Ala Ser Val Asp Ser Leu Thr Phe Ser Val Val Thr Gly 50 55 60 Pro Ala Pro Ser Gln Glu Ala Gly Thr Lys Ala Arg Phe Pro Leu Arg 65 70 75 T0 Asp Ala Val Glu Glu Gly Asp Trp Thr Ala Thr Val Val Asp Gln Gln 85 90 95 Asp Cys Thr Leu Ser Leu Gln Leu Thr Thr Pro Ala Asn Ala Pro lie 100 105 110 Gly Leu Tyr Arg leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Gly Tyr Gln Gly Ser 115 120 125 Ser Phe Val leu Gly His Phe lie Leu Leu Phe Asn Ala Trp Cys Pro 130 135 140 Ala Asp Ala Val Tyr Leu Asp Ser Glu Glu Glu Arg Gln Glu Tyr Val 145 150 155 160 Leu Thr Gln Gln Gly Phe lie Tyr Gln Gly Ser Ala Lys Phe lie Lys 165 170 175 Asn lie Pro trp Asn Phe Gly Gln Phe Gln Asp Gly lie Leu Asp lie 180 185 190 Cys Leu lie Leu Leu Asp Val Asn Pro Lys Phe Leu Lys s Ala Gly 200 205 Arg Asp Cys Ser Arg Arg Ser Ser Pro Val Tyr Val Gly Arg Val Gly 210 215 220 Ser Gly Met Val Asn Cys Asn Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gly Arg 225 230 235 240 Trp Asp Asn Asn Tyr Gly Asp Gly Val Ser Pro met Ser Trp lie Gly 245 250 255 Ser Val Asp lie Leu Arg Arg Trp Lys Asn His Gly Cys Gln Arg Val 260 265 270 Lys Tyr Gly Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Leu 275 280 285 Arg Cys Leu Gly lie Pro Thr Arg Val Val Thr Asn Tyr Asn Ser Ala 290 295 300 His Asp Gln Asn Ser Asn Leu Leu lie Glu Tyr Phe Arg Asn Glu Phe 305 310 315 320 Gly Glu lie Gln Gly Asp Lys Ser Glu Met lie trp Asn Phe His Cys 325 330 335 Trp Val Glu Ser Trp Met Thr Arg Pro Asp Leu Gln Pro Gly Tyr Glu 340 345 350 Gly Trp Gln Ala Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Lys Ser Glu Gly Thr 355 360 365 Tyr Cys Cys Gly Pro Val Pro Val Arg Ala lie Lys Glu Gly Asp Leu 370 375 380 Ser Thr Lys Tyr Asp Ala Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp 385 390 395 400 Val Val Asp Trp lie Gln Gln Asp Asp Gly Ser Val His Lys Ser lie 405 410 415 Asn A g Ser Leu lie Val Gly Leu Lys lie Ser Thr Lys Ser Val Gly 420 425 430 Arg Asp Glu Arg Glu Asp lie Thr HIs Thr Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly 435 440 445 Ser Ser Glu Glu Arg Glu Ala Phe Thr Arg Ala Asn His Leu Asn Lys 450 455 460 Leu Ala Glu Lys Glu Glu Thr Gly Met Ala Met Arg lie Arg Val Gly 465 470 475 480 Gln Ser Met Asn Met Gly Ser Asp Phe Asp Val Phe Ala His lie Thr 485 490 495 Asn Asn Thr Ala Glu Glu Tyr Val Cys Arg Leu Leu Leu Cys Ala Arg 500 505 510 Thr Val Ser Tyr Asn Gly lie Leu Gly Pro Glu Cys Gly Thr Lys Tyr 515 520 525 Leu Leu Asn Leu Thr Leu Glu Pro Phe Ser Glu Ser Val Pro Leu 530 535 Cys lie Leu Tyr Glu Lys Tyr Arg Asp Cys Leu Thr Glu Ser Asn Leu 550 555 560 Lys Val Arg Ala Leu Leu Val Glu Pro Val lie Asn Ser Tyr Leu 565 570 575 Leu Ala Glu Arg Asp Leu Tyr Leu Glu Asn Pro Glu lie Lys lie Arg 580 585 590 lie Leu Gly Glu Pro Lys Gln Lys Arg Lys Leu Val Ala Glu Val Ser 595 600 605 Leu Gln Asn Pro Leu Pro Val Ala Leu Glu Gly Cys Thr Phe Thr Val 610 615 620 Glu Gly Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Thr Val Glu lie Pro Asp 625 630 635 640 Pro Val Glu Ala Gly Glu Glu Val Lys Val Arg Met Asp Leu Val Pro 645 650 655 Leu His Met Gly Leu His Lys Val Val Asn Phe Glu Ser Asp Lys 660 665 670 Leu Lys Ala Val Lys Gly Phe Asn Val lie lie Gly Pro Ala 675 685 <210> 11 <211> 1470 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 gacggtcacc cgttgceagc tetageettt aaattcccgg ctcggggacc tccacgcacc 60 gcggctagcg ccgacaacca gct gcgtgc aa gcgccgc ggctcagcgc gtaccggcgg 1 0 gtttcgaaac cgcag cctc cggcgacccc gaactccgct ccggagcctc agccccctgg ieo a aagtgatce cggcatcgga gagecaagat gccggcccac ttgctgcagg aegatatetc 240 tagetectat accaccacca ccaccattac agcgcctcct ccaggggtcc tgcagaatgg 300 aggagataag ttggagacga tgcccctcta cttggaagac gacattcge.c ctgata aaa 360 agatgatata tatgacccca cctacaagga taaggaaggc ccaagcccca aggttgaata 420 tgtctggaga a acá t catee ttatgtctct gct.acacttg ggag cctgt atgggatcac 480 tttgattcct acctgcaagt tctacacctg gctttggggg gtattctact attttgtcag 540 tgccctgggc ataacageag gaget catcg tctgtggagc caccgctctt acaaagctcg 600 gctgccccta cggctctttc tgatcattgc caacaca tg gcatt ccaga atgatgtcta 660 tgaatgggct. cgtgaccacc gtgcccacca caagttttca gaaacacatg ctgatcctca 720 ¦ taattecega cgtggctttt tettetetca cgtgggttgg ctgcttgtcc gcaaacaccc 780 agctgtcaaa gagaagggga gtaegetaga cttgtct.gac etagaagetg agaaactggt S40 gatgtt ccag aggaggtact acaaacc gg cttgctgatg atgtgcttca tcctgcccac 900 gcttgtgccc tggtatttct ggggtgaaac ttttcaaaac agtgtgttcg ttgccacttt 960 cttgcgatat gctgtggtgc ttaatgecae ctggctggtg aacagtgctg cccacctctt 1020 cggatatcgt cettatgaca agaacat tag cccccgggag aatatcctgg tttcact.tgg 1080 agctgtgggt gagggct cc acaactacca ccactccttt ccctat.gact actctgccag 1140 tgagtaccqc tggcacatca acttcaacac attetteatt. gattggatgg ccgccctcgg 1200 tctgacctat gaccggaaga aagtctccaa ggccgccatc ttggccagga ttaaaagaac 1260 cggagatgga aactacaaga gtggctgagt ttggggtccc tcaggttcct ttttcaaaaa 1320 ccagccaggc agaggtttta atgtctgttt attaactact gaataatget accaggatgc 1380 taaagatqat gatgttaacc cattecagta cagtattett. ttaaaatt a aaagtattga 1440 aagccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1470 <210> 12 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Pro Ala His Leu Leu Gln Asp Asp lie Ser Ser Ser Tyr Thr Thr 1 5 10 15 Thr Thr Thr lie Thr Ala Pro Pro Pro Gly Val Leu Gln Asn Gly Gly 20 25 30 Asp Lys Leu Glu Thr Met Pro Leu Tyr Leu Glu Asp Asp lie Arg Pro 35 40 45 Asp lie Lys Asp Asp lie Tyr Asp Pro Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Gly 50 55 60 Pro Ser Pro Lys Val Glu Tyr Val trp Arg Asn lie lie Leu Met Ser 65 70 75 80 Leu Leu His Leu Gly Ala Leu Tyr Gly lie Thr Leu lie Pro Thr Cys 85 90 95 Lys Phe Tyr Thr Trp Leu Trp Gly Val Phe Tyr Tyr Phe Val Ser Ala 100 105 110 Leu Gly lie Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu Phe Leu lie lie Ala Asn Thr Met 130 135 140 Ala Phe Gln Asn Asp Val Tyr Glu Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His 145 150 155 160 His Lys Phe Ser Glu Thr His Ala Asp Pro His Asn Ser Arg Arg Gly 165 170 175 Phe Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Ala 180 185 190 Val Lys Glu Lys Gly Ser Thr Leu Asp Leu Ser Asp Leu Glu Ala Glu 195 200 205 Lys Leu Val Met Phe Gln Arg Arg Tyr Tyr Lys Pro Gly Leu Leu Met 210 215 220 Met Cys Phe He Leu Pro Thr Leu Val Pro Trp Tyr Phe Trp Gly Glu 225 230 235 240 Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Val Ala Thr Phe Leu Arg Tyr Ala Val 245 250 255 Val Leu Asn Ala Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Phe Gly 260 265 270 Tyr Arg Pro Tyr Asp Lys Asn He Ser Pro Arg Glu Asn He Leu Val 275 280 285 Ser Leu Gly Ala Val Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Ser Phe 290 295 300 Pro Tyr Asp Tyr Ser Ala Ser Glu Tur Arg Trp His lie Asn Phe Asn 305 310 315 320 Thr Phe Phe lie Asp Trp Met Ala Ala Leu Gly Leu Thr Tyr Asp Arg 325 330 335 Lys Lys Val Ser Lys Ala Ala lie Leu Ala Arg lie Lys Arg Thr Gly 340 345 350 Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Gly 355 <210> 13 <211> 1637 <213> Homo sapiens <400> 13 gaggcgaacc ggagcgcggg gccgcggtcg ccccgaccag agccgggaga ccgcagcacc 60 cgcagccgcc cgcgagcgcg ccgaagacag cgcgcaggcg agagcgcgcg ggcgggggcg 120 cgcaggccct gcccgcccc tccgtcccca cccccctccg ccctttcctc tccccacctt 180 cctctcgcct cccgcgcccc cgcaccgggc gcccaccctg tcctcctcct gcgggagcgt 240 tgtccgtgtt ggcggccgca gcgggccggg ccggtccggc gggccggggg atggcgctgc 300 tggacctggc cttggaggga atggccgtct tcgggttcgt cctcttcttg gtgctgtggc 360 tgatgcattt catggctatc atctacaccc gattacacct caacaagaag gcaactgaca 420 aacagcctta tagcaagctc ccaggtgtct ctcttctgaa accactgaaa ggggtagatc 480 ctaacttaat caacaacctg gaaacattct ttgaattgga ttatcccaaa tatgaagtgc 540 tcctttgtgt acaagatcat gatgatccaq c attgatgt atgtaagaag cttcttggaa 600 aatatccaaa tgttgatgct agattgttta taggtggtaa aaaagttggc attaatccta 660 aaattaataa tttaatgcca ggatatgaag ttgcaaagta tgatcttata tggatttgtg 120 atagtggaat aagagtaatt ccagatacgc ttactgacat ggtgaatcaa atgacagaaa 780 aagtaggctt ggttcacggg ctgoctt acg tagcagacag acagggcttt gctgcca ct 840 tagagcaggt atattttgga acLtcacatc caagatacta tatctctgce aatgtaactg 900 gtttcaaatg tgtgacagga atgtcttgtt taatgagaaa agatgtgttg gatcaagcag 960 gaggacttat agcttttgct cagtacattg ccgaagatta ctttatggcc aaagcgatag 1020 ctgaccgagg ttggaggttt geaatgtcca ctcaagttgc aatgcaaaac tctggctcat 1080 attcaatttc tcagtttcaa tccagaatga tcaggtggac caaactacga attaacatgc 1140 ttcctgctac aataatttgt gaqccaattt cagaatgctt tgttgccagt ttaattattg 1200 gatgggcagc ccaccatgtg ttcagatggg atattatggt atttttcatg tgtcattgcc 1260 tggcatggtt tatatttgac tacattcaac tcaggggtgt ccagggtggc acactgtgtt 1320 tttcaaaact tgattatgca gtcgcctggt tcatccgcga atccatgaca atatacattt 1380 ttttgtctgc attatgggac ccaactataa gctggagaac tggtcgctac agattacgct 1440 gtgggggtac agcagaggaa atcctagatg tataact aca gctttgtgac tgtatataaa 1500 ggaaaaaaga gaagtattat aaattatgtt tatataaatg cttttaaaaa tctaccttct 1560 gtagttttat cacatgtatg ttttggtatc tgttcttt aa tttatttttg catgg actt 1620 gcatctgtga aaaaaaa 1637 <210> 14 <211> 394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Glu Gly Met Ala Val Phe Gly Phe 1 5 10 15 Val leu Phe Leu Val Leu Trp Leu Met His Phe Met Ala lie lie Tyr 20 25 30 Thr Arg leu His Leu Asn Lys Lys Ala Thr Asp Lys Gln Pro Tyr Ser 35 40 45 Lys Leu Pro Gly Val Ser Leu Leu Lys Pro Leu Lys Gly Val Asp Pro 50 55 60 Asn Leu lie Asn Asn Leu Glu Thr Phe Phe Glu Leu Asp Tyr Pro Lys 65 70 75 80 Tyr Glu Val Leu Leu Cys Val Gln Asp His Asp Asp Pro Ala lie Asp 85 90 95 Val Cys Lys Lys Leu Leu Gly Lys Tyr Pro Asn Val Asp Ala Arg Leu 100 105 110 Phe lie Gly Gly Lys Lys Val Gly lie Asn Pro Lys lie Asn Asn Leu 115 120 125 Met Pro Gly Tyr Glu Val Ala Lys Tyr Asp Leu lie Trp lie Cys Asp 130 135 140 Ser Gly lie Arg Val lie Pro Asp Thr Leu Thr Asp Met Val Asn Gln 145 150 155 160 Met Thr Glu Lys Val Gly Leu Val His Gly Leu Pro Tyr Val Ala Asp 165 170 175 Arg Gln Gly Phe Ala Ala Thr Leu Glu Gln Val Tyr Phe Gly Thr Ser 180 185 190 His Pro Arg Tyr Tyr lie Ser Asn Val Thr Gly Phe Lys Cys Val 195 205 Thr Gly Met Ser Cys Leu Met Arg Lys Asp Val Leu Asp Gln Ala Gly 210 215 220 Gly Leu lie Ala Phe Ala Gln Tyr lie Ala Glu Asp Tyr Phe Met Ala 225 230 235 240 Lys Ala lie Ala Asp Arg Gly Trp Arg Phe Ala Met Ser Thr Gln Val 245 250 255 Ala Met Gln Asn Ser Gly Ser Tyr Ser lie Ser Gln Phe Gln Ser Arg 260 265 270 Met lie Arg Trp Thr Lys Leu Arg lie Asn Met Leu Pro Ala Thr lie 275 280 285 lie Cys Glu Pro lie Ser Glu Cys Phe Val Ala Ser Leu lie lie Gly 290 2 5 300 Trp Ala Ala His His Val Phe Arg Trp Asp lie Met Val Phe Phe Met 305 310 315 320 Cys His Cys Leu Ala Trp Phe lie Phe Asp Tyr lie Gln Leu Arg Gly 325 330 335 Val Gln Gly Gly thx Leu Cys Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Ala Val Ala 340 345 350 Trp Phe lie Arg Glu Ser Met Thr lie Tyr lie Phe Leu Ser Ala Leu 355 360 365 Trp Asp Pro Thr lie Ser Trp Arg Thr Gly Arg Tyr Arg Leu Arg Cys 370 375 380 Gly Gly Thr Ala Glu Gl lie Leu Asp Val 385 390 <210> 15 <211> 63 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Primer <400> 15 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt ttttt tt t tttttttttt 60 ttt 63 <210> 16 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Primer <400> 16 gtcgtcaaga tgctaccgtt cagga <210> 17 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial <400> 17 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tgccgatgtt catcgtaaac a <210> 18 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial <400> 18 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt taggcgaagg tggagttgtt <210> 19 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Primer <400> 19 aaggattcgg gaatgggctg tcagaccaga ct 31 <210> 20 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción secuencia artificial <400> 20 ttaagctttc atcttttctt tttctgttgc c 31

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar si una sustancia inhibe o reduce una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias, en la que un macrofago está en un estado hiperactivado debido a una proteína sobrerregulada , caracterizado en desde la proteína se seleccionaentre el grupo consistente de DAD1 y ARL4; caracterizado en que comprende: (a) poner en contacto una proteína como se menciona o un equivalente funcional, variante, mutante o fragmento de la misma con una sustancia que será probada para ver si es un inhibidor o una función deseada de esta proteína, y (b) medir si la función deseada está inhibida.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la inhibición o activación de la función deseada se mide directamente .

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la inhibición o la activación de la función deseada se mide indirectamente .

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína mencionada es una proteína de mamífero.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la proteína es una proteína humana.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el análissis se realiza usando un sistema celular.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el análissis se realiza usando un sistema libre de células.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias se selecciona entre un grupo consistente de bronquitis crónica y EPOC.

9. Un método de diagnóstico o monitoreo de una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias que comprende el determinar el nivel de expresión de una proteina que se selecciona entre el grupo consistente de DAD1 y ARL4 expresado en un macrófago.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el macrófago es un macrófago de mamífero.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el macrófago es un macrófago humano.

12. Un método de acuerdo con la rivindicación 9 en el que la enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias se selecciona entre el grupo consistente de bronquitis crónica y EPOC.

13. Un sistema de prueba para realizar un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una proteína seleccionada entre el grupo consistente de DAD1 y ARL4 o un equivalente funcional, variante, mutante o fragmento de esta proteína.

14. Un sistema de prueba de acuerdo con la reivindicación 13, comprendiendo una célula que exprese una proteína seleccionada entre el grupo consistente de DADl y ARL4 o un equivalente funcional, mutante o fragmento de la proteína.

15. Una sustancia determinada para ser un inhibidor de una proteína seleccionada entre el grupo consistente de DADl y ARL4.

16. Una sustancia que es un inhibidor de una proteína seleccionada entre el grupo de DADl y ARL4, para el tratamiento de una enfermedad.

17. Una sustancia de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la mencionada enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias.

18. Una sustancia de acuerdo con la reivindicación 17, en la que la enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias se selecciona entre el grupo consistente de bronquitis crónica y EPOC.

19. Una composición farmacéutica que comprende al menos una sustancia determinada para ser un inhibidor de una proteína seleccionada entre el grupo consistente de DADl y ARL4.

20. El uso de una sustancia determinada para ser un inhibidor de una proteína seleccionada entre el grupo consistente de DADl y ARL4 para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad ínflamatoria crónica de las vias respiratorias.

21. El uso de una sustancia de acuerdo con la reivindicación 20 en la que la enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias se selcciona entre el grupo consistente de bronquitis crónica y EPOC.

22. Uso de una composición farmacéutica que comprende al menos una sustancia determinada para ser un inhibidor de una proteína seleccionada entre el grupo consistente de DAD1 y ARL4, para tratar una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, para el tratamiento de un mamífero.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, para el tratamiento de un ser humano.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, para tratar una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias, seleccionada entre el grupo consistente de bronquitis crónica y EPOC.

26. Un método para modular selectivamente una proteína seleccionada entre el grupo consistente de DAD1 y ARL4 en un macrófago, comprendiendo la administración de una sustancia determinada para ser un inhibidor de una proteína seleccionada entre el grupo consistente de DAD1 y ARL .

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el macrófago está involucrado en una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias es seleccionada entre el grupo consistente de bronquitis crónica y EPOC. RE SUMEN La presente invención se refiere a las proteínas involucradas en los procesos inflamatorios y a la modulación de la función de una proteína así para influenciar positivamente las enfermedades inflamatorias.