MXPA02008641A - Genes de plantas monocotiledoneas novedosas y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Homologos del gen NIMl Arabidopsis, los cuales son implicados en la cascada de transduccion de se+- ales que conduce a la resistencia adquirida sistemica (RAS), son aislados de cultivos monocotiledoneos tales como Triticum aestivum (trigo) y Oryza sativa (arroz). La invencion se relaciona ademas con vectores de transformacion y procesos para expresar los homologos de NIMI de monocotiledoneas en plantas transgenicas para incrementar la expresion del gen de la RAS y mejorar la resistencia a enfermedades de amplio espectro.

Description

GENES DE PLANTAS MONOCOTILEDONEAS NOVEDOSAS Y USO DE LOS MISMOS Descripción de la investigación La presente invención se relaciona con la resistencia a enfermedades de amplio espectro en plantas, incluyendo el fenómeno de resistencia adquirida sistémica (RAS) . De manera más particular, la presente invención se relaciona con la identificación, aislamiento y caracterización de homólogos monocotiledóneos del gen NIM1 implicados en la cascada de transducción de señales que conducen a la resistencia adquirida sistémica en plantas. Las plantas son constantemente desafiadas por una amplia variedad de organismos patógenos incluyendo virus, bacterias, hongos y nemátodos. Las plantas de cultivo son particularmente vulnerables debido a que usualmente crecen como monocultivos genéticamente uniformes; cuando ataca una enfermedad, las pérdidas pueden ser severas. Sin embargo, la mayoría de las plantas tienen sus propios mecanismos de defensa innatos contra organismos patógenos. La variación natural de la resistencia a patógenos de plantas ha sido identificada por productores de plantas y patólogos y se producen en esas plantas de cultivo. Esos genes de resistencia a enfermedades naturales con frecuencia proporcionan altos niveles de resistencia a o inmunidad contra patógenos. Ref : 141313 La resistencia adquirida sistémica (RAS) es un componente del sistema complejo que utiliza las plantas para defenderse por sí mismas contra patógenos (Hunt y Ryals, 1996; Ryals et al . , 1996). Véase también, la Patente Estadounidense No. 5, 614, 395. La RAS es un aspecto particularmente importante de las respuestas de patógenos de plantas debido a que es una resistencia sistémica, inducible por patógenos, contra un amplio espectro de agentes infecciosos, incluyendo virus, bacterias y hongos. Cuando la vía de transducción de señales de la RAS es bloqueada, las plantas se vuelven más susceptibles a patógenos que normalmente causan enfermedades, y también se vuelven susceptibles a patógenos infecciosos que normalmente no causarían enfermedades (Gaffney et al . , 1993; Delaney et al ,-1994; Delaney et al . , 1995; Delaney, 1997; Bi et al . , 1995; Mauch-Mani y Slusarenko, 1996) . Esas observaciones indican que la vía de transducción de señales de RAS es crítica para mantener la salud de la planta. Conceptualmente, la respuesta de la RAS puede ser dividida en dos fases. La fase inicial, es reconocida la infección por un patógeno, y es liberada una señal que se desplaza a través del floema a tejidos distantes. Esta señal sistémica es percibida por células objetivo, las cuales reaccionan mediante la expresión de genes de RAS y resistencia a la enfermedad. La fase de mantenimiento de la RAS se refiere al periodo de tiempo, de semanas hasta toda la vida de la planta, durante el cual la planta está en un estado casi estacionario, y la resistencia a la enfermedad se mantiene (Ryals et al . , 1996). Parece requerirse la acumulación de ácido salicílico (AS) para la transducción de señales de la RAS. Las plantas que no pueden acumular AS debido al tratamiento con inhibidores específicos, represión epigenética de fenilalanina amoniaco liasa, o expresión transgénica de salícilato hidroxilasa, la cual degrada específicamente al AS, tampoco pueden inducir al gen de expresión de la RAS o resistencia a la enfermedad (Gaffney et al . , 1993; Delaney et al . , 1994; Mauch-Mani y Slusarenko, 1996; Maher et al . , 1994; Pallas et al . , 1996) . Aunque se ha sugerido que el AS puede servir como la señal sistémica, esto actualmente es controversial , y a la fecha, todo lo que se sabe con certeza es que el AS no se puede acumular, entonces la transducción de señales de la RAS es bloqueada (Pallaws et al . , 1996; Shulaev et al . , 1995; Vernooij et al . , 1994). Recientemente, la Arabidopsis ha emergido como un sistema modelo para estudiar la RAS (Uknes et al . , 1992; Uknes et al . , 1993; Cameron et al . , 1994; Mauch-Mani y Slusarenko, 1994; Dempsey y Klessig, 1995). Se ha demostrado que la RAS puede ser activada en Arabidopsis por patógenos y productos químicos, tales como el AS, ácido 2,6- dicloroisonicotínico (AIN) y ácido S-metil éster del ácido benzo (1, 2 , 3) tiadiazol- 7 -carbotiónico (BTH) (Uknes et al . , 1992; Vernooij et al . , 1995; Lawton et al . , 1996). Después del tratamiento con AIN o BTH o infección por patógenos, al menos tres genes de proteína relacionada con la patogénesis (ER) , a saber, PR-1, PR-2 y PR-5 son inducidos de manera combinada concomitantemente con la aparición de la resistencia (Uknes et al . , 1992, 1993). En el tabaco, la mejor especie caracterizada, el tratamiento con un patógeno o un compuesto inmunizante induce la expresión de al menos nueve conjuntos de genes (Ward et al . , 1991). Han sido creadas plantas resistentes a enfermedades, transgénicas, transformando plantas con varios genes de ARS (Patente Estadounidense No .5 / d14 395' • Aunque la mayoría de los estudios sobre la RAS han sido producidos en plantas dicotiledóneas, la RAS ha sido demostrada en plantas monocotiledóneas también. Por ejemplo, la RAS ha sido demostrada en arroz, donde una infección inducida por P.s. pv syringae condujo a protección sistémica contra Pyricularia oryzae (Smith y Metraux, 1991) , el agente causal del marchitamiento de las hojas, y en la cebada y el trigo, donde, una infección previa por Erysiphe graminis condujo a un ambiente de protección contra E. graminis, el agente causal del moho polvoriento (Schweizer et al . , 1989; Hwang y Heitefuss, 1992) . La resistencia inducida químicamente por AIN ha sido descrita en la cebada (Kogel et al . , 1994; Wasternack et al . , 1994) . Más recientemente, el BTH ha mostrado induciendo resistencia adquirida en trigo contra E. graminis, Puccinia recóndi ta, y Septoria spp . , e inducir la acumulación de transcriptos de un número de genes de plantas novedosos que también demostraron ser inducidos durante la infección por patógenos (Górlach et al . , 1996). Ha sido aislado un número de mutantes de Arabidopsis que tienen transducción de señales de RAS modificada (Delaney, 1997) . Los primeros de esos mutantes son los llamados mutantes Jsd (enfermedad estimulante de lesiones) y acd2 (muerte celular acelerada) (Dietrich et al . , 1994; Greenberg et al . , 1994). Esos mutantes tienen todos algún grado de formación de lesiones necróticas espontáneas sobre sus hojas, niveles elevados de AS, acumulación de ARNm por los genes de la RAS, y un aumento significativo de resistencia a la enfermedad. Han sido caracterizados al menos siete mutantes Jsd diferentes (Dietrich et al . , 1994; Weymann et al . , 1995) . Otra clase interesante de mutantes son los mutantes cim (inmunidad constitutiva) (Lawton et al . , 1993) . Véase tambi én, la Patente Estadounidense No. 5,792,904 y la Solicitud PCT Internacional WO 94/16077. Al igual que los mutantes Isd y acd2 , los mutantes cim tienen AS y expresión del gen de la RAS y resistencia elevados, pero en contraste con la Jsd o acd2, no presentan lesiones detectables en sus hojas. El cprl (expresor constitutivo de los genes de PR) puede ser un tipo de mutante cim; sin embargo, debido a que la presencia de lesiones sobre las hojas de cprl no ha sido excluida, el cprl puede ser un tipo de mutante Jsd (Bowling et al . , 1994) . También han sido aislado mutantes que están bloqueados en la señalización de la RAS. El ndrl (resistencia a enfermedades no específicas de la raza) es un mutante que permite el crecimiento de Pseudomonas syringae que contienen varios genes avirulentos y también aislados normalmente avirulentos de Peronospora parasítica (Century et al . , 1995). Aparentemente este mutante está bloqueado en principio en la señalización de la RAS. El nprl (no expresante de los genes de PR) es un mutante que no puede inducir la expresión de la vía de señalización de la RAS después del tratamiento con AIN (Cao et al . , 1994). Los mutantes eds (susceptibilidad a enfermedades aumentada) ha sido aislado sobre la base de su capacidad para soportar infecciones bacterianas después de la inoculación de una baja concentración bacteriana (Glazebrook et al . , 1996; Parker et al . , 1996) . Ciertos mutantes eds son genotípicamente muy similares al nprl , y, recientemente, se ha demostrado que el eds5y el eds53 son alélicos al nprl (Glazebrook et al . , 1996). El ninl (inmunidad no inducible) es un mutante que soporta el crecimiento de P. parasí tica (es decir, el agente causal de la enfermedad del moho difuso) después del tratamiento con AIN (Delaney et al . , 1995; Patente Estadounidense No. 5,792,904). Aunque el niml puede acumular AS después de la infección por patógenos, no puede inducir la expresión del gen de la RAS o resistencia a la enfermedad, sugiriendo que la enfermedad bloquea la vía corriente abajo de AS. El niml también está dañado en su capacidad para responder al INA o BTH, sugiriendo que el bloqueo existe corriente abajo de la acción de esos compuestos químicos (Delaney et al . , 1995; Lawton et al . , 1996) . Han sido aislados y caracterizados genes alélicos de Arabidopsi s, mutantes de los cuales son responsables de los fenotipos niml y nprl , respectivamente (Ryals et al . , 1997; Cao et al , 1997) . El producto del gen NIM1 natural está implicado en la cascada de traducción de señales que conduce a la SAR y resistencia a la enfermedad gen por gen en Arabidopsis (Ryals et al . , 1997). Ryals et al . , 1997, también reporta el aislamiento de cinco alelos adicionales de ni l que muestran una gama de fenotipos débilmente deteriorados en la expresión del gen PR-1 inducida químicamente y resistencia fungal a los muy fuertemente bloqueados. La transformación del gen NRP1 natural en los mutantes nrpl no únicamente completó las mutaciones, restableciendo las respuestas de la inducción de la RAS con respecto a la expresión del gen PR y resistencia a la enfermedad, sino que también volvió las plantas transgénicas más resistentes a la infección por P. syringae en ausencia de inducción de RAS (Cao et al . , 1997).

La WO 98/06748 describe el aislamiento de NPRl de Arabidopsis y un homólogo de Nicotiana glutinosa . Véase también, la WO 97/49822, la WO 98/26082, y la WO 98/29537. Además, la Solicitud de Patente Estadounidense No. 09/265,149 de Salmerón et al . , describe el aislamiento de Nicotiana tabacum (tabaco) , Lycopersicon esculentum (tomate) , Brassica napus (colza de semilla oleaginosa) , y homólogos de Arabidopsis thaliana del gen NIM1 . Por lo tanto, aunque han sido aislados homólogos de NJM1 de un número de especies de plantas dicotiledóneas, hasta ahora no han sido aislados homólogos de NJM2 de ninguna especie de planta monocotiledónea . A pesar de la mucha investigación y el uso de medidas de protección de cultivo sofisticadas e intensivas, incluyendo la transformación genética de plantas, las pérdidas debidas a enfermedades siguen siendo de billones de dólares anualmente. Por lo tanto, existe la necesidad continua de desarrollar nuevas medidas de protección de cultivos basadas en la comprensión cada vez mayor de las bases genéticas para la resistencia a la enfermedad en plantas. En particular, existe la necesidad de la identificación, aislamiento y caracterización de homólogos de NIM1 de especies adicionales de plantas, particularmente plantas monocotiledóneas. La presente invención resuelve las necesidades mencionadas anteriormente, proporcionando homólogos del gen NIM1 de Arabidopsis de especies de plantas monocotiledóneas. En particular, la presente invención se relaciona con el aislamiento de homólogos del gen NIM1 de Tri ticum aestivum (trigo) o Oryza sativa (arroz) , que codifica para proteínas que se cree están implicadas en la cascada de transducción de señales que responde a inductores biológicos y químicos que conducen a la resistencia adquirida sistémica en plantas. En consecuencia, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica de una planta monocotiledónea que es un homólogo del gen NIM1 . En una modalidad particular, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la SEQ ID ?O: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID ?O: 1, 7, 9 , 11, 13, 15, 17 ó 19. En una modalidad más, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 (de manera preferible 20) porciones de pares de bases consecutivas idénticas en secuencia a, al menos una porción de 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 (de manera preferible 20) pares de bases consecutivos de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19. En otra modalidad más, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de planta monocotiledónea utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6. En otra modalidad más, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de Orryza sativa utilizando la región en cadena de la polimerasa con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6. En otra modalidad más, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de .ADN de Tri ticum aestivum utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con el par atfaasa-8 aatete de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6. En una modalidad más, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de una planta monocotiledónea utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con un par de cebadores, que comprende los primeros 20 nucleótidos y el complemento inverso de los últimos 20 nucleótidos de la secuencia codificadora (SCD) de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19. En una modalidad adicional, la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica de una planta monocotiledónea que se hibrida al complemento de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13/ 15, 17 ó 19 bajo condiciones de hibridación y condiciones de lavado estrictas. La presente invención también abarca un gen quimérico que comprende un promotor activo en plantas ligado operativamente a la secuencia codificadora del homólogo de NIM1 de la presente invención, un vector recombinante que comprende tal gen quimérico, donde el vector es capaz de ser transformado de manera estable en un huésped, así como un huésped transformado de manera estable con tal vector. De manera preferible, el huésped es una planta tal como una de los siguientes cultivos agronómicamente importantes: arroz, trigo, cebada, cañóla, caña de azúcar, maíz, papa, zanahoria, camote, remolacha azucarera, frijol, guisantes, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, berenjena, pepino, apio, calabaza, calabaza anaranjada, pepino, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, durazno, nectarina, chabacano, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, pina, aguacate, papaya, mango, banana, soya, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar. De manera más preferible, el huésped es una planta monocotiledónea. La presente invención también abarca semillas de una planta de la invención. Además, la presente invención está dirigida a un método para incrementar la expresión del gen de la RAS en una planta mediante la expresión en la planta de un gen quimérico que comprenda en sí un ' promotor activo en plantas ligadas operativamente a una secuencia codificadora homologa de NJM2 de la presente invención, donde la proteína codificada es expresada en la planta transformada a niveles mayores que en una planta natural. De manera preferible, el huésped es una planta monocotiledónea. Además, la presente invención está dirigida a un método para aumentar la resistencia a enfermedades en una planta mediante la expresión en la planta de un gen quimérico que en sí comprende un promotor activo en plantas ligadas operativamente a una secuencia codificadora homologa de NJMI de la presente invención, donde la proteína codifica es expresada en la planta, y transformada en niveles mayores que en una planta natural. De manera preferible, el huésped es una planta monocotiledónea. Además, la presente invención está dirigida a un cebador de PCR que es la SEQ ID ?O: 3 ó 4. La presente invención también abarca un método para aislar un homólogo del NJ 1 implicado en la cascada de transducción de señales que conduce a la resistencia adquirida sistémica en plantas, que comprende amplificar una molécula de AD? de una biblioteca de AD? de planta monocotiledónea utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con un par de cebadores correspondientes a los primeros 20 nucleótidos y el complemento inverso de los últimos 20 nucleótidos dé la secuencia codificadora (SCD) de la SEQ ID ?O : 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19 o con el par de cebadores expuestos como SEQ ID ?O: 3 y 4 o SEQ ID ?O: 5 y 6.

En una modalidad preferida, la biblioteca de AD? de planta monocotiledónea es una biblioteca de AD? de Oryza sativa (arroz) o Tri ticum aestivum (trigo) . SEQ ID ?O: 1- Secuencia de .AD? genómico de un homólogo de NJM 1 (pHWOl) de trigo. SEQ ID ?O : 2- Secuencia de proteína del homólogo de ?IM 1 de trigo codificado por la SEQ ID ?O: 1.

SEQ ID NO: 3- Cebador oligonucleotídico KL1. SEQ ID NO: 4- Cebador oligonucleotídico KL2. SEQ ID NO: 5- Cebador de PCR NIM 2B. SEQ ID NO: 6- Cebador de PCR NIM 2D. SEQ ID NO: 7- Fragmento de ADN similar al NJM de 498 pb amplificado de Oryza sativa (Arroz A) , que es una de las 13 secuencias de consenso y tiene una identidad de secuencia del 59% con la secuencia del gen NJ?f 1 de Arabidopsis thaliana . SEQ ID ?O: 8- Secuencia de la proteína codificada por la SEQ ID ?O: 7. SEQ ID ?O: 9- Fragmento de AD? similar al ?IM de 498 pb amplificado de Oryza sativa (Arroz B) , que tiene una identidad de secuencia de 62% con la secuencia del gen ?IM 1 de Arabidopsis thaliana . SEQ ID ?O: 10- Secuencia de la proteína codificada por la SEQ ID ?O: 9. SEQ ID ?O: 11- Fragmento de AD? similar al ?IM de 498 pb amplificado de Tri ticum aestivum (Trigo) , la cual es una de las 3 secuencias de consenso y tiene una identidad de secuencia de 55% con la secuencia del gen ?IM 1 de Arabidopsis thaliana . SEQ ID ?O: 12- Secuencia de la proteína codificada por la SEQ ID ?O : 11.

SEQ ID NO: 13- Secuencia de ADNc de longitud completa de un homólogo de NIM 1 de Oryza sativa (Arroz A) , que corresponde al fragmento de la PCR de la SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 14- Secuencia de la proteína en el homólogo NIM 1 de arroz codificada por las SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 15- Secuencia de ADNc parcial del un homólogo de NIM 1 de Oryza sativa (Arroz B) , que corresponde al fragmento de PCR de la SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 16- Secuencia de la proteína del homólogo de NIM 1 de arroz codificada por la SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 17- Secuencia de ADNc de longitud completa de un homólogo de NIM 1 de Tri ticum aestivum (Trigo) , que corresponde a fragmento de PCR de la SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 18- Secuencia de la proteína del homólogo de NIM 1 de trigo codificada por la SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 19- Secuencia de ADNc de longitud completa correspondiente a la secuencia genómica similar a la de NIM de Tri ticum aestivum (Trigo) pHWOl (SEQ ID NO: 1) . SEQ ID NO: 20- Secuencia de la proteína codificada por la SEQ ID NO: 19. En la descripción de la presente invención, pueden ser empleados los siguientes términos, y se pretende que sean definidos como se indica más adelante.

Asociada con/ligada operativamente: se refiere a dos secuencias de ADN que están relacionadas física o funcionalmente. Por ejemplo, se dice que una secuencia de ADN promotora o reguladora está "asociada con" una secuencia de ADN que codifica para una ARN o una proteína si las dos secuencias están ligadas operativamente, o siutadas de modo que la secuencia de ADN reguladora afctará el nivel de expresión de la secuencia de ADN codificadora o estructural . Gen Quimérico: una secuencia de ADN recombinante en la cual una secuencia de .ADN promotora o reguladora está ligada operativamente a, o asociada con, una secuencia de ADN que codifica para un ARNm o que está apresada como una proteína, de modo que la secuencia de ADN reguladora es capaz de regular la transcripción a expresión de la secuencia se ADN asociada. La secuencia de ADN reguladora del gen quimérico normalmente no está ligada operativamente a la secuencia de ADN asociada como se encuentra en la naturaleza. Secuencia Codificadora: una secuencia de ácido nucleico que es transcrita en ARN tal como ARNm ARNr, ARNt, ARNsn, ARN sentido o ARN antisentido. De manera preferible el AR? es traducido entonces en un organismo para producir la proteína. Complementarias: se refiere a dos secuencias nucleotídicas que comprenden secuencias nucleotídicas antiparalelas capaces de aparearse entre sí tras la formación de enlaces de hidrógeno y entre los residuos de las bases complementarias de las secuencias nucleotídicas antiparalelas . Expresión: se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno o un transgen en plantas. En el caso de constructos antisentido, por ejemplo, la expresión puede referirse a la transcripción del ADN antisentido únicamente . Cásete de Expresión: una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia nucleotídica particular en una célula huésped apropiada, que comprende un promotor ligado operativamente a la secuencia nucleotídica de interés que está ligada operativamente a señales de terminación. También típicamente comprende secuencias requeridas para la transmisión apropiada de la secuencia nucleotídica. El cásete de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El cásete de expresión también puede ser uno que se encuentre en la naturaleza pero qué haya sido obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Típicamente, sin embargo, el cásete de expresión es heterólogo con respecto al huésped, es decir, que la secuencia de ácido nucleico particular del cásete de expresión no se encuentra en la naturaleza en las células huésped y debió haber sido introducida en las células huésped o un ancestro entre las células huésped por un evento de transformación. La expresión de la secuencia nucleotídica en el cásete de expresión puede ser bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicie las transcripción únicamente cuando la célula huésped sea expuesta al mismo estimulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, tal como la planta, el promotor también puede ser específico para un tejido, u órgano o etapa de desarrollo particular. Gen: una región definida que se localiza dentro de un genoma y que, además de la secuencia de ácido nucleico codificadora mencionada anteriormente, comprende otras secuencias de ácido nucleico, principalmente reguladoras, responsables del control de la expresión, es decir, la transcripción y traducción de la porción codificadora. Un gen también puede comprender otras secuencias no traducidas 5' y 3' y secuencias de terminación. Los elementos adicionales que pueden estar presentes son, por ejemplo, intrones. Secuencia de ADN Heteróloga: el término "secuencia de ADN heteróloga" , "segmento de ADN exógeno" o "ácido nucleico heterólogo", como se utilizan aquí, se refieren cada uno a una secuencia que se origina en una fuente diferente a la célula huésped particular, o, si es de la misma fuente, se modificó a partir de su forma original. De este modo, el gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno a la célula huésped particular pero que ha sido modificado a través, por ejemplo, del uso de .ADN. Los términos también incluyen copias múltiples que no se encuentran en la naturaleza de una secuencia de ADN natural. De este modo, los términos se refieren a un segmento de ADN que es externo o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la cual el elemento no se encuentra comúnmente . Los segmentos de ADN exógenos son expresados para producir polipéptidos exógenos. Secuencia de ADN Homologa: la secuencia de ADN asociada naturalmente con una célula huésped en la cual es introducida. Isocodificac ón: una secuencia de ácido nucleico es isocodificadora con una secuencia de ácido nucleico de referencia cuando la secuencia de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de referencia. Aislado: en el contexto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada o una enzima aislada es una molécula de ácido nucleico o enzima que, por la mano del hombre, existe separada de su ambiente nativo y por lo tanto no es un producto de la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico o enzima aislada puede existir en forma purificada o puede existir en ambiente no nativo tal como por ejemplo, una célula huésped recombinante. Promotor Mínimo: un elemento promotor, particularmente un elemento TATA que está inactivo o tiene una actividad promotora reducida en gran medida en ausencia de activación corriente arriba. En presencia de un factor de transcripción adecuado, un promotor mínimo funciona para permitir la transcripción. Nativo: se refiere a un gen que esté presente en el genoma de una célula no transformada. Que se encuentra en la naturaleza: el término "que se encuentra en la naturaleza" se utiliza para definir un objeto que puede ser encontrado en la naturaleza como distinto de lo producido artificialmente por el hombre. Por ejemplo, una proteína o secuencia nucleotídica presente en un organismo (incluyendo un virus) , la cual puede ser aislada de una fuente natural y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio, se encuentra en la naturaleza. NIM1 : Gen descrito en Ryals et al . , 1997, el cual está implicado en la cascada de transducción de señales de la RAS. NIM1 : Proteína codificada por el gen NIM1.

Acido Nucleico: El término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de una sola hebra o doble hebra. A menos que se límite específicamente, el término abarca ácidos que contiene anólogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión muy similares a las del ácido nucleico de referencia y son metabolizados en una forma similar en los nucleótidos que se encuentran en la naturaleza. A menos que se indique otra cosa, una frecuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservativa de las mismas (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas) y secuencias complementarias así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, la sustituciones de codón degeneradas pueden ser logradas generando secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones (o todos) seleccionados que estén sustituidos con residuos de bases mezcladas y/o desoxiinosina (Batzer et al . , Nucleic Acid Res . 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al . , J. Biol . Chem . 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al . , Mol . Cell Probes 8:91-98 (1994)). El término "ácido nucleico" o secuencia de ácido nucleico" también puede ser utilizada de manera intercambiable con gen, .ADNc y ARNm codificado por un gen. En el contexto de la presente invención, la molécula de ácido nucleico es preferiblemente un segmento de ADN. Los nucleótidos son indicados por sus pares de bases por las siguientes abreviaturas estándar: adenina (A), citosina (C) , timina (T) , y guanina (G) . ORF: Marco de Lectura Abierta. Planta: Cualquier Planta Completa. Célula de Planta: Una unidad estructural y fisiológica de una plante, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula de planta puede estar en forma de una sola célula aislada o una célula cultivada, o como una parte de una unidad organizada superior tal como, por ejemplo, un tejido de planta, un órgano de planta o una planta completa. Cultivo de Células de Planta: Cultivos de unidades de planta tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células de tejido de plantas, polen, tubos de polen, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en varias etapas de desarrollo. Material de Planta: Se refiere a las hojas, tallo, raíces, flores o partes de flores, frutos, polen, células huevo, cigotos, semillas, cortes, cultivos celulares o tisulares, o cualquier otra parte o pr ducto de una planta. Órgano de Planta: Una parte distinta y visiblemente estructurada diferenciada de una planta tal como una raíz, tallo, hoja, brote de flor o embrión.

Tejido de Planta: Un grupo de células de planta organizadas en una unidad estructural y funcional. Cualquier tejido de una planta in planta o en cultivo está incluido. Este término incluye, pero no se limita a, plantas completas, órganos de plantas, semillas de plantas, cultivos tisulares y cualesquier grupos de células de plantas organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de este término en conjunto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido de planta como se lista anteriormente o abarcado de otro modo por esta definición no pretende ser exclusivo de ningún otro tipo de tejido de planta. Promotor: Una secuencia de ADN no traducida corriente arriba de la región codificadora que contiene el sitio de unión de la ARN polimerasa II e inicia la transcripción del ADN. La región promotora también puede incluir otros elementos' que actúan como reguladores de la expresión genética. Protoplasto: Una célula de planta aislada sin una pared celular o sólo con parte de la pared celular. Purificado: el término "purificado" cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, denota que el ácido nucleico o proteína está esencialmente libre de otros componentes celulares con los cuales está asociada en el estado natural . Este es preferiblemente un estado homogéneo aunque puede estar seca o en solución acuosa. La pureza y homogeneidad son determinadas típicamente utilizando técnicas de química analítica tales como la electroforesis sobre el gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto desempeño. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación es purificada de manera sustancial. El término "purificada" denota que un ácido nucleico o proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforático. Particularmente significa que el ácido nucleico o proteína está al menos aproximadamente 50% pura, de manera más preferible al menos 85% pura, y de manera más preferible al menos aproximadamente 99% pura. Molécula de ADN recombinante : una combinación de moléculas de ADN que son unidas utilizando la tecnología del ADN recombinante. Elementos reguladores: Secuencias implicadas en el control de la expresión "de una secuencia nucleotídica. Los elementos reguladores comprenden un promotor ligado operativamente a la secuencia nucleotídica de interés y las señales de terminación. Ellos también típicamente abarcan las secuencias requeridas para la traducción apropiada de la secuencia nucleotídica. Gen marcador seleccionable: un gen cuya expresión en una célula de planta da a la célula una ventaja selectiva. La ventaja selectiva poseída con las células transformadas con el gen marcador seleccionable puede deberse a su capacidad para crecer en presencia de un agente selectivo negativo, tal como un antibiótico o un herbicida, en comparación con el crecimiento de células no transformadas. Las ventajas selectivas poseídas por las células transformadas, comparadas con las células no transformadas, también pueden deberse a su capacidad mejorada o novedosa de utilizar los compuestos agregados como nutrientes, factor de crecimiento o fuente de energía. El gen marcador seleccionable también se refiere a un gen o una combinación de genes cuya expresión en una célula de planta da a la célula una ventaja selectiva negativa y positiva. Incremento significativo: un incremento en la actividad enzimática que es mayor que el margen de error inherente a la técnica de medición, de manera preferible en un incremento aproximadamente 2 veces mayor que la actividad de la enzima natural en" presencia del inhibidor, de manera más preferible un incremento de aproximadamente 5 veces o mayor, y de manera preferible un incremento de aproximadamente 10 veces o mayor. Los términos "idéntica" o por ciento de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o proteína, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos cuando se comparan y alinean para determinar la correspondencia máxima de acuerdo a lo medido utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual . Sustancialmente idéntica: la frase "sustancialmente idéntica", en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o proteína, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos 60%, de manera preferible 80%, de manera más preferible 90-95%, y de manera más preferible al menos 99% de identidad de nucleótidos o residuos de aminoácidos, cuando se comparan y alinean para determinar la correspondencia máxima, de acuerdo a lo medido utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual. De manera preferible, la identidad sustancial existe sobre una región de secuencias que es de al menos aproximadamente 50 residuos de longitud, de manera más preferible sobre una reg"ión de al menos aproximadamente 100 residuos, y de manera más preferible las secuencias son sustancialmente idénticas a al menos aproximadamente 150 residuos. En una modalidad más preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas sobre toda la longitud de las regiones codificadoras. Además, las secuencias de ácido nucleico o proteínas sustancialmente idénticas efectúan sustancialmente la misma función. Para la comparación de la secuencia, típicamente una secuencia actúa como la secuencia de referencia con la cual las secuencias de prueba son comparadas. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia son alimentadas a una computadora, son diseñadas las coordenadas de la subsecuencia si es necesario, y son designados los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces el por ciento de identidad de secuencia para las secuencias de prueba con relación a las secuencias de referencia, sobre la base de los parámetros del programa designados. La alineación óptima de las secuencias por comparación puede conducirse, por ejemplo, por medio del algoritmo de analogía local de Smith y Waterman, Adv. Appl . Math . 2:482(1981), por el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch, J". Mol . Biol . 48:443(1970), por el método de investigación de similitud de Pearson y Lipman, Proc . Na t ' l . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wl) , o por inspección visual ( véase de manera general , Ausubel et al . , infra) . Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, el cual es descrito en Altschul et al . , J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990) . Los programas y sistemas de programación para efectuar análisis BLAST se encuentran públicamente disponibles a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http: //www. ncbi .nlm.nih.gov/) . Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alto puntaje (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia interrogada, la cual es idéntica o satisface algún puntaje umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es referida como el umbral de puntaje de la palabra vecino (Altschul et al . , 1990). Esa palabra vecina inicial actúa como acierto como semilla para iniciar búsquedas para encontrar HSP más grandes que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia" tanto como puede incrementarse el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos son calculados utilizando, por ejemplo, secuencias nucleotídicas, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos similares; siempre >0) y N (puntaje penalizado por residuos no similares; siempre <0) . Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección es resaltada cuando el puntaje de alineación acumulativo cae fuera de la cantidad X de su valor máximo alcanzado, el puntaje acumulativo se dirige a cero o debajo de cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo, o si se alcanza el fin de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de alineación. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) utiliza como predeterminados la longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, como un corte de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminados una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntaje BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 89:10915 (1989) ) . Además de calcular el por ciento de identidad de secuencia, el algoritmo "BLAST también efectúa un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la suma de probabilidad más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la cual ocurrirá, por probabilidad, una similitud entre dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de prueba es considerada similar a una secuencia de referencia, si la suma de probabilidad más pequeña en una comparación de la secuencia del ácido nucleico de referencia a la secuencia de ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.1, de manera más preferible menor de aproximadamente 0.01, y de manera más preferible menor de aproximadamente 0.001. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibriden entre sí bajo condiciones estrictas. La frase "que se hibride específicamente a", se refiere a la unión, duplexión o hibridación de una molécula únicamente a una secuencia nucleotídica particular bajo condiciones estrictas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja de ADN o ARN (por ejemplo, celular total) . "Que se une sustancialmente" se refiere a la hibridación complementaria entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico objetivo y abarraca desajustes menores que pueden ser acomodados mediante la reducción de la astringencia de los medios de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico objetivo. "Condiciones de hibridación estrictas" y "condiciones de lavado de hibridación estrictas" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tales como las hibridaciones Southern y Northern son dependientes de la secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas mayores. Una guía exhaustiva de la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization wi th Nucleic Acid Probes, parte 1, capítulo 2, "Vista general de los principios de hibridación y estrategia de ensayos de sondas de ácido nucleico", Elsevier, New York. De manera general, las condiciones de hibridación y condiciones de lavado altamente estrictas son seleccionadas de modo que sean 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Típicamente, bajo "condiciones estrictas" una sonda se hibridará a su secuencia objetivo, pero no a otras secuencias. La Tm da temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual es 50% de la secuencia objetivo se hibrida a una sonda perfectamente apareada. Las condiciones muy exigentes son seleccionadas de modo que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación estrictas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una mancha Southern o Northern es formaldehído al 50% con 1 mg de heparina a 42°C, con la hibridación siendo llevada a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente estrictas es NaCl 0.15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado estrictas es un lavado de SSC 0.2x a 65 °C durante 15 minutos (véase, Sambrook, para una descripción del amortiguador de SSC) . Con frecuencia, un lavado altamente estricto es precedido por un lavado poco estricto para remover la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado semiestricto para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos es SSC lx a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado por estricto para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos es SSC 4-6x a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos) las condiciones estrictas típicamente implican concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1.0 M de ion de Na, de manera típica, de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion de Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es de manera típica de al~ menos aproximadamente 30°C. Las condiciones estrictas también pueden ser logradas con la adición de agentes estabilizantes tales como la formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o mayor) a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones estrictas son aún sustancialmente idénticos, si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando es creada una copia de ácido ^KiÉ^dWüt nucleico utilizando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético. Los siguientes son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridación/lavado que pueden ser utilizadas para clonar secuencias nucleotídicas homologas que sean sustancialmente idénticas a las secuencias nucleotídicas de referencia de la presente invención: una secuencia nucleotídica de referencia preferiblemente se híbrida a la secuencia nucleotídica de referencia en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7%, NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con un lavado en SSC 2X, SDS al 0.1% a 50°C, de manera más deseable en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7%, NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC IX, SDS al 0.1% a 50°C, de manera más deseable aún, en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7%, NaP04 0.5 M, EDTA 1 M a 50 °C con lavado en SSC 0.5X, SDS al 0.1% a 50°C, de manera preferible en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7%, NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0.1X, SDS al 0.1% a 50°C, de manera más preferible en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7%, NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0.1X, SDS al 0.1% a 65°C. Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o proteína son sustancialmente idénticas, es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico reaccione inmunológicamente de manera cruzada con, o se una específicamente a la proteína codificada por el segundo ácido nucleico. De este modo, una proteína es, de manera típica, sustancialmente idéntica a una segunda proteína, por ejemplo, donde las dos proteínas difieren únicamente por sustituciones conservadoras . La frase "que se une específicamente (o selectivamente) a un anticuerpo", o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactiva con" , cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión, la cual es determinante de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. De este modo, bajo las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos específicos se unen a una proteína particular, y no se unen a una cantidad significativa de otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo tales condiciones, puede requerir un anticuerpo que sea seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos a la proteína con la secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de aminoácido de la invención, pueden ser seleccionadas para obtener anticuerpos específicamente ir?munorreactivos con esa proteína y no con otras proteínas excepto por variantes polimórficas. Puede ser utilizada una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA en fase sólida, manchas Western o inmunohistoquímica, son utilizados de manera rutinaria para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lañe (1998) Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Publications, New York "Harlow y Lañe"), para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden ser utilizados para determinar la inmunorreactividad específica. Típicamente, una reacción específica o selectiva será al menos una señal del doble del fondo o ruido de manera más específica de más de 10 a 100 veces el fondo. "Variaciones modificadas de manera conservadora" de una secuencia de ácido nucleico particular se refiere a aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican para secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde la secuencia de ácido nucleico no codifica para una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos, codifican para cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones CGT, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG codifican todos para el aminoácido arginina. De este modo, en cada posición en donde es especificada una arginina por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes sin alterar la proteína codificada. Tales variaciones de ácido y ^g g nucleico son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de "variaciones modificadas de manera conservadora" . Cada secuencia de ácido nucleico descrita aquí que codifique para una proteína también describe todas las variaciones silenciosas posibles, excepto donde se haga notar otra cosa. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto ATG, el cual es comúnmente el único codón para la metionina) , es modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica por técnicas estándar. En consecuencia cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica para una proteína, está implícita en cada secuencia descrita. Además, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales que alteran, agregan o suprimen un solo aminoácido o un solo porcentaje de aminoácidos (típicamente menos del 5%, de manera más típica menos del 1%) , en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de manera conservadora" , donde las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los siguientes cinco grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: Alifáticos: Glicina >^ttÉÍjito|^gflti É^jj_ ¿ (G) , Alanina (A) , Valina (V) , Leucina (L) , Isoleucina (I) ; Aromáticos: Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptófano (W) ; que contienen Azufre: Metionina (M) , Cisteína (C) , Básicos: Arginina (R) , Lisina (K) , Histidina (H) ; Ácidos: Acido aspártico (D) , Acido glutámico (E) , Asparagina (N) , Glutamina (Q) . Véase también, Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman y Company. Además, las sustituciones, supresiones o adiciones individuales que alteran, agregan o suprimen un solo ácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada, también son "variaciones modificadas de manera conservadora" . Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprende una parte de la secuencia más larga de ácidos nucleicos o aminoácidos (por ejemplo proteína) respectivamente. Los ácidos nucleicos son "alargados" cuando son incorporados nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas)) en el ácido nucleico. De manera más común, esto se efectúa con una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa) , por ejemplo una polimerasa la cual agrega secuencias al término 3' del ácido nucleico. Dos ácidos nucleicos son "recombinados" cuando las secuencias de cada uno de los dos ácidos nucleicos son combinadas en un ácido nucleico progenitor. Dos secuencias son recombinadas "directamente" cuando ambos ácidos nucleicos son sustratos para la recombinación. Dos secuencias son "recombinadas" indirectamente cuando las secuencias son recombinadas utilizando un intermediario tal como un oligonucleótido usado. Para la recombinación indirecta, no más de una de las secuencias es un sustrato real para la recombinación, y en algunos casos ninguna secuencia es un , sustrato para la recombinación. Una "afinidad de unión específica" entre dos moléculas, por ejemplo, un ligando y un receptor, significa una unión preferente de una o más moléculas a otras en una mezcla de moléculas. La unión de las moléculas puede ser considerada específica si la afinidad de unión es de aproximadamente lxlO4 M"1 hasta aproximadamente lxlO6 M"1 o mayor . Transformación: un proceso para introducir ADN heterólogo en una célula "huésped u organismo. "Transformado", "transgénico" y "recombinante" se refiere a un organismo huésped tal como una bacteria o una planta en la cual ha sido introducida una molécula de ácido nucleico heteróloga. La molécula de ácido nucleico puede ser integrada de manera estable en el genoma del huésped o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosomal . Tal molécula extracromosomal puede ser autorreplicante. Debe comprenderse que células, tejidos o plantas transformadas abarcan no únicamente al producto final de un proceso de transformación, sino también a la progenie transgénica del mismo. Un huésped "no transformado" , "no transgénico" o "no recombinante" se refiere a un organismo natural, por ejemplo, una bacteria o planta que no contiene la molécula de ácido nucleico heteróloga. El siguiente material ha sido depositado con el Servicio de Investigación Agrícola, Colección de Cultivos de Patentes (NRRL) , 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, EUA, bajo los términos del tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimientos de Patentes. Todas las restricciones sobre la disponibilidad del material depositado serán removidas irrevocablemente tras el otorgamiento de una patente.

Clona Número de Acceso Fecha de Depósito pHWOl NRRL B-30152 Julio 1, 1999 La presente invención se relaciona con homólogos del NIM1 monocotiledóneos, tales como aquéllos aislados de Tri ticum aestivum (trigo) y Oryza sativa (arroz) . Como se describe de manera más completa más adelante en los ejemplos, los homólogos de NIM1 monocotiledóneos de acuerdo a la invención pueden ser aislados de ADNc y/o bibliotecas de ADN »f & ^M genómico sondeando con fragmentos de ADNc del NJ?íl del tabaco descritos en la WO 00/53762, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Además, los homólogos de NIM1 de acuerdo a la invención pueden ser aislados de AD?c y/o bibliotecas de AD? genómico de plantas monocotiledóneas por amplificación PCR utilizando cebadores construidos basados en las secuencias de NJM2 de Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum y Lycopersicon esculentum, así como las secuencias de NJ?íl de Arabidopsis thaliana (véase, Ejemplo 5: "Diseño de Cebadores Degenerados" en la WO 00/53762) . Además, los homólogos de NJM1 monocotiledóneos de acuerdo a la invención pueden ser aislados por PCR utilizando las secuencias de arroz y trigo expuestas en el listado de secuencia anexo como base para construir cebadores de PCR. Por ejemplo, los primeros y últimos 20-25 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID ?O: 19 (por ejemplo, los nucleótidos 1-20 y 1649-1668 de la SEQ ID ?O : 19) pueden ser utilizados como base para construir cebadores de PCR para amplificar la secuencia de AD?c (SEQ ID ?O: 19) directamente de una biblioteca de AD?c de la planta de origen (trigo) . Otras secuencias de AD? de la invención pueden de igual modo ser amplificadas por PCR a partir del AD?c o bibliotecas de AD? genómico de plantas monocotiledóneas utilizando los extremos de las secuencias de ADN expuestos en el listado de secuencia como base para cebadores de PCR. Se predijo que los homólogos de NJ 1 monocotiledóneos, tales como los homólogos de NIM1 de trigo y arroz descritos aquí, codifican para proteínas implicadas en la cascada de transducción de señales en respuesta a inductores biológicos y químicos, lo cual conduce a la resistencia adquirida sistémica en plantas. La presente invención también se relaciona con la expresión transgénica de un homólogo de NIM1 monocotiledóneo en plantas para incrementar la expresión del gen de la RAS y mejorar la resistencia a enfermedades. Se predijo que la expresión transgénica de un homólogo de NJM1 monocotiledóneo de la invención en plantas da como resultado la inmunidad a un amplio arreglo de patógenos de plantas, los cuales incluyen, pero no se limitan a virus o viroides, por ejemplo virus del mosaico de tabaco o el pepino, virus de manchas anulares o virus de la necrosis, virus rizador de las hojas de pelargonio, virus moteador del trébol rojo, virus atrofiante del arbusto del tomate y virus similares; hongos, por ejemplo oomicetos tales como Phythophtora parasí tica y Peronospora tabacina; bacterias, por ejemplo Pseudomonas syringae y Pseudomonas tabaci ; insectos tales como áfidos, por ejemplo, Myzus persicae; y lepidópteros, Heliothus spp. ; y nemátodos, por ejemplo, Meloidogyne incógni ta . Los vectores y métodos de la invención son útiles contra un número de organismos de enfermedades del maíz incluyendo pero sin limitarse a mohos vellosos tales como Scleropthora macrospora, Sclerophthora rayissiae, Sclerospora graminicola, Peronosclerospora sorghi , Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora sacchari y Peronosclerospora ayáis ; mohos tales como Puccinia sorphi , Puccinia polysora y Physopella zeae,- otros hongos tales como Cercospora zeae-maydis, Colletotrichum graminicola, Fusarium monoliforme, Gibberella zeae, Exserohilum turcicum, Kabatiellu zeae, Erysiphe graminis, Septoria y Bipolaris mayáis,- y bacterias tales como Erwinia stewartii . Los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para conferir resistencia a enfermedades a una amplia variedad de plantas, incluyendo gimnospermas , monocotiledóneas y dicotiledóneas. Aunque la resistencia a enfermedades puede ser conferida a cualesquier plantas que caigan dentro de esas amplias clases, es particularmente útil en plantas de cultivos argonómicamente importantes, tales como el arroz, trigo, cebada, centeno, colza, maíz, papa, zanahoria, camote, remolacha azucarera, frijol, guisantes, achicoria, lechuga, calabaza, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, berenjena, chile, apio, zanahoria, calabaza, calabaza anaranjada, calabacín, pepino, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, durazno, nectarina, chabacano, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, pina, aguacate, papaya, mango, banana, soya, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar. Una secuencia que codifica para un homólogo de NJAfl monocotiledóneo en la presente invención puede ser insertada en un cásete de expresión diseñado para plantas para construir un gen quimérico de acuerdo a la invención utilizando técnicas de ingeniería genética estándar. La elección de secuencias reguladoras específicas tales como un promotor, una secuencia señal, secuencias no traducidas 5' y 3', y un amplificador o mejorador apropiado para lograr el patrón y nivel de expresión deseados en la planta huésped elegida está dentro del nivel de destreza de rutina en la técnica. La molécula resultante, que contiene los elementos individuales ligados en el marco de lectura apropiado, puede ser insertada en un vector capaz de ser transformado en una célula de planta huésped. Los ejemplos de promotores capaces de funcionar en plantas o células de planta (es decir, aquéllos capaces de dirigir la expresión de secuencias codificadoras asociadas tales como aquéllas que codifican para homólogos de NJM2 en células de plantas) incluyen a los promotores de ubiquitina de Arabidopsis y maíz; promotores 19A o 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y promotores dobles de CaMV; promotores de actina de arroz; promotores PR-1 del tabaco, Arabidopsis, o maíz; promotores de la nopalina sintasa; promotores de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato de carboxilasa (ssuRUBISCO) , y similares. Especialmente preferido es el promotor de ubiquitina de Arabidopsis . Los 5 promotores en sí pueden ser modificados para manipular la fuerza del promotor para incrementar la expresión de la secuencia codificadora asociada de acuerdo con procedimientos reconocidos en la técnica. Los promotores preferidos para utilizarse con la presente invención son aquéllos que 10 confieren un alto nivel de expresión constitutiva. Los péptidos señal o de tránsito pueden ser fusionados a la secuencia codificadora del homólogo de NJ?fl monocotiledóneo en los constructos de AD? quiméricos de la invención para dirigir el transporte de la proteína expresada 15 al sitio de acción deseado. Los ejemplos de péptidos señal incluyen aquéllos ligados de manera nativa a las proteínas relacionadas con la patogénesis de la planta, por ejemplo, PR-1, PR-2 y similares. Véase, por ejemplo Payne et al . , 1988. Los ejemplos de péptidos de tránsito incluyen los 20 péptidos de tránsito de cloroplasto tales como aquéllos descritos en Von Heijne et al . , (1991), Mazur et al . (1987), y Vorst et al . (1988); y péptidos de tránsito mitocondriales tales como aquellos descritos en Boutry et al . (1987). También están incluidas secuencias que dan como resultado la 5 localización de la proteína localizada en varios compartimientos celulares tales como las vacuolas. Véase, por ejemplo, Neuhaus et al . (1991) y Chrispeels (1991). Los constructos de .ADN quiméricos de la invención pueden contener copias múltiples de un promotor de copias múltiples de una secuencia codificadora de homólogo de NJ?íl monocotiledóneo de la presente invención. Además, los constructos pueden incluir secuencias codificadoras para marcadores y secuencias codificadoras para otros péptidos tales como péptidos señal o de tránsito, cada uno en el marco de lectura apropiado con los otros elementos funcionales en la molécula de AD?. La preparación de tales constructos está dentro del nivel común de destreza en la técnica. Los marcadores útiles incluyen péptidos que proporcionan resistencia a herbicidas, antibióticos o fármacos, tales como, por ejemplo, resistencia a inhibidores de la protoporfirinógerio oxidasa, higromicina, kanamicina, G418, gentamicina, lincomicina, metotrexato, glifosato, fosfinotricina o similares. Esos marcadores pueden ser utilizados para seleccionar células transformadas con los constructos de AD? quiméricos de la invención de células no transformadas. Otros marcadores útiles son enzimas peptídicas las cuales pueden ser fácilmente detectadas por una reacción visible, por ejemplo una reacción de color, por ejemplo luciferasa, ß-glucuronidasa o ß-galactosidasa.

Los genes quiméricos designados para la expresión en plantas tales como aquéllos descritos aquí pueden ser introducidos en células de plantas en un número de formas reconocidas en la técnica. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la elección del método puede depender del tipo de planta (es decir, monocotiledónea o dicotiledónea) y/o el organelo (es decir el núcleo, cloroplasto, mitocondria) elegido para la transformación. Los métodos adecuados para transformar células de plantas incluyen la microinyección (Crossway et al . , 1986), electroporación (Riggs et al . , 1986) , transformación mediada por Agrojbacterium (Hinchee et al . , 1988; Ishida et al . , 1996), transferencia genética directa (Paszkowski et al . , 1984; Hayashimoto et al . , 1990) y aceleración balísitica de partículas utilizando los dispositivos disponibles de Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin y Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense 4,945,050; y McCabe et al . , 1988). Véase también, Weissinger et al . (1988); Sanford et al . (1987) (cebolla); Christou et al . (1988) (soya) ; McCabe et al . (1988) (soya); Datta et al . (1990) (arroz); Klein et al . (1988) (maíz); Klein et al . (1988) (maíz); Klein et al . (1988) (maíz); Fromm et al . (1990); y Gordon-Kamm et al . (1990) (maíz); Svab et al . (1990) (cloroplastos de tabaco); Gordon-Kamm et al . (1993) (maíz); Shimamoto et al . (1989) (arroz); Christou et al . (1991) (arroz); Datta et al . (1990) (arroz) ; Solicitud de Patente Europea EP 0 332 581 (maleza de hortaliza y otras Pooiáeae) ; Vasil et al . (1993) (trigo); Weeks et al . (1993) (trigo); Wan et al . (1994) (cebada); Jahne et al . (1994) (cebada); Umbeck et al . (1987) (algodón); Casas et al . (1993) (sorgo) ; So ers et al . (1992) (avenas); Torbert et al . (1995) (avenas); Weeks et al . (1993) (trigo); WO 94/13822 (trigo); y Nehra et al . (1994) (trigo). Un conjunto particularmente preferido de modalidades para la introducción de moléculas de .ADN recombinante en el maíz por bombardeo de microproyectiles puede encontrarse en Koziel et al . (1993); Hill et al . (1995) y Koziel et al . (1996). Una modalidad preferida adicional es el método de transformación de protoplastos para el maíz como se describe en la EP 0 292 435. Una vez que un gen quimérico que comprende una secuencia codificadora de homólogo de NJ 1 monocotiledóneo ha sido transformado en una especie de planta particular, puede ser propagado en esa especie o movido a otras variedades de la misma especie, incluyendo particularmente variedades comerciales, utilizando técnicas de reproducción tradicionales. Las plantas particularmente preferidas de la invención incluyen los cultivos argonómicamente importantes listados anteriormente. Las propiedades genéticas diseñadas en las semillas y plantas transgénicas descritas anteriormente son pasadas por reproducción sexual y de este modo pueden ser mantenidas y propagadas en las plantas en la progenie.

EJEMPLOS La invención es ilustrada con mayor detalle por los siguientes procedimientos, preparaciones y ejemplos detallados. Los ejemplos son para ilustración únicamente, y no deben constituirse en limitantes del alcance de la presente invención. Las técnicas de ADN recombinante y clonación molecular estándar utilizados aquí son bien conocidos en la técnica, y son descritos por Sambrook, et al . , 1989; por T. J. Silhavy, M. L. Berman, y L. W. Enquist, 1984; y por Ausubel, F. M. et al . , 1987.

I. Aislamiento de Homólogos del Gen NJAfl de Arabidopsis de Plantas Monocotiledóneas Ejemplo 1: Aislamiento de un Homólogo de NIM1 de Triticum aestivum (Trigo) Se construyó una biblioteca de .ADN genómico de costumbre de Tri ticum aestivum (cv UC703) en vectores EMBL3 SP6/T7 (Clontech) . La biblioteca (1 x 106 ufp) se separó siguiendo el protocolo de Clontech Laboratories. Se utilizaron dos fragmentos diferentes del ADNc del NJ?íl de tabaco (p?OV1206 - SEQ ID ?O:l de la WO 00/53762) como sondas: el fragmento 5' -NIM1 (secuencia nucleotídica 1-790; fragmento de AccI /EcoRI de 0.8 kb aislado de pNOV1206) y el fragmento 3' -NIM1 (secuencia nucleotídica 1176-1770; fragmento de Kpnl/HindIII de 0.6 kb aislado de pNOV1206) . Se produjeron levantamientos de placa, cada uno conteniendo 50,000 clonas, un total de 1 x 106 clonas (membranas de nitrocelulosa, NEN) por duplicado de 10 placas de fago, y cada sonda de híbrido a 10 membranas. La sonda se marcó con P32-dCTP utilizando el método de Mareaje de Cebador Aleatorio Prime-ItR II (Stratagene) . La hibridación se llevó a cabo preferiblemente a 58°C en amortiguador de hibridación (SSPE 6x, Denhards 5x, SDS al 0.5%, 100 µg de ADNst/ml), y los lavados se condujeron preferiblemente en (I) : SSPE 2x, SDS al 0.1%, temperatura ambiente, 10 minutos, (II): SSPE 2x, SDS al 0.1% a 55°C, 15 minutos, y (III) SSPE lx, SDS al 0.1% a 55°C, 15 minutos, dos veces por cada lavado. Se aislaron un total de nueve clonas positivas por dos rondas adicionales de purificación de placa. El ADN del fago lambda se aisló del lisado de K802 de acuerdo a Zabarovsky y Turina, 1988. Entre los nueve candidatos positivos, seis se hibridaron a sondas de 3' -NIM1 y 5' -NIM1 por manchado o electroinmunotransferencia Southern del ADN lambda digerido por restricción. Los fragmentos de ADN hidridantes son entonces clonados en el vector pUC19 (NEB) .

La secuencia de ADN de la clona HWOl es determinada por desplazamiento del cebador utilizando 18-méricos diseñados sobre el Sintetizador de ADN ABI 3948. El Patrón de HWOl es secuenciado con Reacciones de Secuenciamiento de Terminados con Tinte Grande, utilizando 400 ng de patrón por reacción. Las condiciones del ciclo son de acuerdo al Programa DT 50-30: 95°C - 10 seg., 50°C - 5 seg., 60°C - 4 minutos durante 29 ciclos. Después del programa de acondicionamiento del ciclo térmico, las reacciones son precipitadas con isopropanol. Las muestras son cargadas sobre un gel de poliacrilamida y analizadas en el Secuenciador Automatizado ABI 377. El patrón de HWOl también es sometido al protocolo Primer Island, por lo que el patrón es preparado sobre el Qiagen Robot y secuenciado en un formato de bloque de placas de Marsh de 96 pozos." Los cebadores utilizados para el secuenciamiento en placa son los cebadores de ida y regreso del Equipo Primer Island. Los datos del secuenciamiento son analizados y montados utilizando los Programas Phred/Phrap y Consed. Una de las secuencias de ADN subclonadas de una parte de la clona lambda #8, llamada pHWOl, contiene un inserto de Sa cl de 4270 pb, y es identificada como un homólogo del trigo del gen NIM1 de Arabidopsis (Ryals et al . , 1997). La secuencia de aminoácido traducida del homólogo de NJ?fl de trigo se basó en la secuencia invertida del HWOl (i- HW01), en la cual la orientación del homólogo de NIM1 es la misma que la secuencia de NIM1 de Arabidopsis . La secuencia de aminoácidos de ?IM1 de trigo tiene una similitud/identidad de aminoácidos del 77/68% con la del homólogo de ?IM1 de tabaco mostrado como SEQ ID ?O:l de la WO 00/53762, 78/68% del homólogo de ?IM1 del tomate mostrada como SEQ ID ?O:3 de la WO 00/53762, 65/51% con el ?IM1 de Arabidopsis (Ryals et al . , 1997), y 69% 69% y 59% de similitud nucleotídica con los genes de NIM de tabaco, tomate y Arabidopsis, respectivamente (véanse, la Tabla 1, y la Tabla 2, más adelante) .

Tabla 1. Comparación de .Aminoácidos (Similitud/Identidad) de Homólogos de ?IM1 Tabla 2. Comparación Nucleotidica (identidad) de Homólogos de NIM1 La secuencia genómica de los homólogos de NIM1 se muestra en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de la proteína codificada se muestra en la SEQ ID NO: 2. El homólogo de NIM1 de trigo que comprende la SEQ ID NO: 1 fue depositado en E . coli DH5a como pHWOl con el NRRL (Servicio de Investigación Agrícola, Colección de Cultivos de Patente, Centro de Investigación Regional del Norte, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, E.U.A) en Julio 1, 1999, y se le asignó el acceso no. NRRL B-30152.

Ejemplo 2: Amplificación por PCR del Homólogo de NJAtt de Trigo Se utilizó PCR para confirmar que el homólogo de NIM1 de trigo se origina del genoma del trigo. Se utilizaron los cebadores KL1 (19avo, 5' -CCATTGCTACTCTTGCCTC-3' (SEQ ID NO: 3)) y KL2 (21avo, 5 ' -ATCGTTGTCTCCCTTTTAACC-3' (SEQ ID NO:4)) correspondientes a los nucleótidos 1871-1890 y los nucleótidos 2360-2340, respectivamente, de la secuencia de la subclona de pHWOl para reacciones de PCR utilizando ADN genómico de trigo UC703 como patrón. Las condiciones del ciclo son 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos, para un total de 35 ciclos. Se obtuvo y clonó una banda de -500 pb . El secuenciamiento de clonas múltiples con el inserto del tamaño correcto, reveló que se amplificaron tres secuencias diferentes del genoma del trigo. Las tres secuencias son altamente similares entre sí, y una de las secuencias se alinea precisamente con la región correspondiente de HWOl, indicando que el HWOl en efecto se origina del genoma del trigo. Un homólogo de NIM1 del trigo, de acuerdo a la invención, puede por lo tanto ser aislado por PCR de una biblioteca genómica de trigo utilizando los cebadores de PCR descritos anteriormente KL1 y KL2.

Ejemplo 3: Aislamiento de Homólogos de NIM1 Monocotiledóneos por Hibridación Southern El ADN de una planta monocotiledónea es aislado utilizando el método miniprep de Dellaporta et a l . (1983). El manchado Southern se efectúa de acuerdo al protocolo estándar (Amersharm) . La secuencia de ADN del homólogo de NIM1 de trigo correspondiente al "anillo de NIM" específico de NJ?íl (nucleótidos 2180-3251 de i-HWOl, un fragmento de Ndel/Bg/II de 1.1 kb aislado de pHWOl) es hibridado al ADN genómico del trigo (cv. UC703) y otros cultivos monocotiledóneos (por ejemplo, arroz, cebada y maíz). La hibridación se efectúa preferiblemente a 65°C en SSPE 5x, Denhards 5x, SDS al 0.5%, 100 µg de ADNst/ l, y el lavado es preferiblemente (I): SSPE 2x, SDS al 0.1%, temperatura ambiente, 10 minutos, (II): SSPE 0.2x, SDS al 0.1% a 65°C, 15 minutos, y (III) SSPE O.lx, SDS al 0.1% a 65°C, 15 minutos, dos veces por cada lavado. Los cultivos monocotiledóneos probados mostraron fuertes señales de hibridación a la secuencia NIM1 del trigo, indicando la presencia de homólogos de NIM1 en esos cultivos. Las señales de hibridación en el ADN genómico del trigo indican que están presentes al menos cuatro homólogos de NIM1 en el genoma del trigo. El producto de la PCR del ADN genómico del trigo que es obtenido con los cebadores de PCR KL1 y KL2 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente), es utilizado para probar manchas de gel de ARN de trigo. La hibridación con ARN total revela un transcripto vago. Sin embargo, la hibridación con poliA+ ARN revela la presencia de dos transcriptos; un transcripto de ARNm más pequeño, más abundante, y un ARNm más grande, menos abundante. El transcripto más pequeño corresponde al tamaño detectado en el ARN total. Ambos transcriptos parecen estar presentes en abundancia igual en el ARN aislado de tejido de hojas de plantas de trigo jóvenes tratada o tratadas con BTH durante 24 h. El "anillo de NIM" del trigo descrito anteriormente, también es utilizado como sonda.

Ejemplo 4 : Aislamiento de Homólogos de NIM1 por PCR de Bibliotecas de ADN Genómico de Cultivos Monocotiledóneos Se utilizaron los cebadores KL1 y KL2 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente) para clonar homólogos de NIM1 de otros cultivos monocotiledóneos. Utilizando las mismas condiciones de ciclo utilizadas para la amplificación del ADN genómico del trigo (Ejemplo 2), se amplificaron bandas de aproximadamente 500 pb de tamaño de bibliotecas de ADN genómico de arroz, maíz y cebada. Los productos de la PCR del ADN del arroz se clonaron y secuenciaron. Se encontró que todas las clonas secuenciadas contenían el mismo inserto, y la secuencia del inserto muestra una fuerte similitud con el gen NIM1 de Arabidopsis y sus homólogos de cultivo, indicando que se ha clonado un homólogo de arroz del NIM1 .

Ejemplo 5: Aislamiento de homólogos de NIMl por PCR Bibliotecas de ADNc de cultivos monocotiledoneos . Se diseñaron cebadores de PCR degenerados sobre la base de regiones conservadas descubiertas utilizando el programa de alineación de secuencias múltiples GCG Seqweb (Pretty, Wisconsin Genetics Computer Group) para alinear el gen NIM1 de Arabidopsis (Rylas et al., 1997); las secuencias genómicas similares a la del NIM de Arabidopsis thaliana (NML) AtNMLc5f AtNMLc2, AtNMLc4-l , y AtNMLc4-2; y las secuencia de NIM1 de .Nicotiana tabacum y Lycopersicon esculentum (Véase la WO 00/53762) . Sobre la base de esta alineación, se diseñaron cebadores de PCR degenerados para la amplificación por PCR de homólogos de NIM1 de otras especies de cultivo incluyendo el arroz y el trigo. Dos de los cebadores diseñados de fracciones conservadas se listan más adelante en la Tabla 3. Los cebadores son sintetizados preferiblemente por Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, Texas) . Las posiciones de degeneración son indicadas en la Tabla 3 por la rotación de más de una base en un solo sitio en el oligonucleótido. La "orientación" designa si el cebador está dirigido hacia el extremo 3' (corriente abajo) o el extremo 5' (corriente arriba) del ADNc.

Tabla 3 : Cebadores Degenerados Los fragmentos de ADN homólogos de NIM1 son amplificados del trigo-arroz utilizando ADNc como patrón. La PCR con cebador degenerado es efectuada preferiblemente con perlas de PCR Ready-To-Go (Amersham, Piscataway, NJ) en un sistema de PCR GeneAmp 9700 (Patente Estadounidense No. Applied Biosystems, Foster City, CA) . Se utilizaron de 5 a 10 ng de ADNc en cada reacción, con cada cebador a una concentración final de 0.8µM. Los parámetros de ciclo preferidos son los siguientes: 9 °C durante 1 minuto, 3 ciclos de [94°C durante 30 segundos; 37°C durante 30 segundos; 72°C durante 2 minutos]; 35 ciclos de [94°C durante 30 segundos; 60°C durante 30 segundos; 72°C durante 2 minutos]; 72°C durante 7 minutos; calentando 4°C. Los productos de reacción son analizados sobre geles de agarosa en 2% y son cortados los fragmentos de ADN de tamaño apropiado. Los fragmentos de ADN son aislados de bandas de agarosa utilizando, por ejemplo el equipo Geneclean III (BIO 101, Inc., Carisbad, CA) y clonados utilizando, por ejemplo el equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen Corporation, Carlasnd, CA) . Los plásmidos son aislados utilizando, por ejemplo, el Sistema de Minipreparación de Plásmido Rápido CONCERT (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) y secuencias por protocolos estándar. Utilizando los cebadores 2B y 2D, son amplificados dos fragmentos de ADN de homólogo de NIM1 únicos de la biblioteca de ADNc del arroz (SEQ ID NO: 7 y 9) y un fragmento de ADN de homologo de NJ?íl único es amplificado de la biblioteca de AD? de trigo (SEQ ID ?O: 11) .

Ejemplo 6: AD?c de homólogo de NIM1 monocotiledóneo de longitud completa Las secuencias corriente arriba y corriente abajo de AD?c correspondientes de fragmentos de PCR de homólogos de NJM1 son obtenidas preferiblemente por base PCR utilizando el equipo de amplificación de AD?c SMART RACE (Clontech, Palo Alto, CA) . De manera preferible, son secuencias al menos tres productos de RACE independientes por cada extremo 5' ó 3' para eliminar errores de la PCR. Una secuencia de AD? es el homólogo de NJ 1 de arroz de longitud completa correspondiente al fragmento de PCR mostrado en la SEQ ID ?O: 7 es presentada como SEQ ID ?O: 13; una secuencia de AD?c de arroz de homólogo de NIM1 correspondiente al fragmento de PCR mostrado en la SEQ ID ?O: 9 es presentada como SEQ ID ?O: 15; y una secuencia de AD?c de homólogo de NJ?íl de arroz de longitud completa correspondiente al fragmento de PCR mostrado en la SEQ ID ?O: 11 se presenta como SEQ ID ?O: 17. Una secuencia de AD?c de homólogo de NJ 2 de trigo de longitud completa correspondiente a la secuencia genómica de NJ?fl de trigo pHWOl (SEQ ID ?O: 1) se obtiene preferiblemente por RACE PCR y se presenta como SEQ ID NO: 19. (El extremo 3' de la SEQ ID NO: 19 es de un programa de predicción de ADNc) .

II . Expresión de las Secuencias Genéticas de la Invención en Plantas . El homólogo de NJ 1 monocotiledoneo de la presente invención puede ser incorporado en células de plantas utilizando la tecnología del AD? recombinante convencional. De manera general, esto implica insertar la secuencia codificadora de la invención en un sistema de expresión al cual la secuencia codificadora sea heteróloga (es decir, normalmente no presente) utilizando procedimientos de clonación estándar conocidos en la técnica. El vector contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de las secuencias decodificadoras de proteína insertadas. Puede ser utilizado un gran número de sistemas de vector conocidos en la técnica, tales como plásmidos, virus de bacteriófago y otros virus modificados. Los vectores adecuados incluyen pero no se limitan a, vectores virales, tales como los sistemas de vector lamda ?gtll, ?btlO, y Charon 4; vectores plasmídicos tales como pBI121, pBR322, pACYC177, pACYC184, serie pAR, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUCld, pUC19, pLG339, pRK290, ?KC37, pKClOl, pCD?AII; y otros sistemas similares. Los componentes del sistema de expresión también pueden ser modificados para ^£^¿ incrementar la expresión. Por ejemplo, pueden ser empleadas secuencias truncadas, sustituciones nucleotídicas u otras modificaciones. Los sistemas de expresión descritos aquí pueden ser utilizados para transformar virtualmente cualquier 5 célula de planta de cultivo bajo condiciones adecuadas. Las células transformadas pueden ser regeneradas en plantas completas de modo que el homólogo de NJ?íl monocotiledoneo juega un papel en el incremento de la expresión del gen de la RAS y tiene una resistencia de enfermedades en las plantas 10 transgénicas.

Ejemplo 7 : Construcción de Casetes de Expresión de Planta Las secuencias codificadoras que se pretende sirvan 15 para la expresión en plantas transgénicas son primero montadas en casetes de expresión detrás de un promotor adecuado expresable en plantas. Los casetes de expresión también pueden comprender cualesquier secuencias adicionales requeridas o seleccionadas para la expresión del transgen. Tales secuencias 20 incluyen, pero no se restringen a, terminadores de transcripción, secuencias extrañas para mejorar la expresión tales como intrones, secuencias vitales, y secuencias que se pretende sirvan para dirigir el producto genético a organelos y compartimientos celulares específicos. Esos casetes de 25 expresión pueden entonces ser fácilmente transferidos a los "-"rrTr"*"^TfT • > - - vectores de transformación de plantas descritos más adelante. La siguiente es una descripción de varios componentes de casetes de expresión típicos. 1. Promotores La selección del promotor utilizado en los casetes de expresión determinará el patrón de expresión espacial y temporal del transgen en la planta transgénica. Los promotores seleccionados expresarán los trangenes en tipos de células específicos (tales como células epidérmicas de hoja, células mesófilas, células de la corteza de la raíz) o en tejidos u órganos específicos (raíces, hojas o flores, por ejemplo) y la selección reflejará el lugar de acumulación deseado del producto genético. De manera alternativa, el promotor seleccionado puede dirigir la expresión del gen bajo varias condiciones inductoras. Los promotores varían en su fuerza, es decir, la capacidad para promover la transcripción. Dependiendo del sistema de celular huésped utilizado, puede ser utilizado cualquiera de un número de promotores adecuados, incluyendo el promotor nativo del gen. Los siguientes son ejemplos no limitantes de promotores que pueden ser utilizados en casetes de expresión. a. Expresión Constitutiva, el Promotor de Ubiguitina: La ubiquitina es un producto genético que se sabe se acumula en muchos tipos de células y su promotor ha sido clonado de varias especies para utilizarse en plantas trangénicas (por ejemplo girasol-Binet et al., 1991; maiz-Christensen et al., 1989; y ?rabidopsis-Norris et al., 1993). El promotor de la ubiquitina del maíz ha sido desarrollado en sistemas monocotiledóneos transgénicos y su secuencia y vectores construidos para la transformación de monocotiledóneas se describe en la solicitud de patente EP 0 342 926 (de Lubrizol) . Taylor et al. (1993) describe un vector (pAHC25) que comprende el promotor de la ubiquitina del maíz y el primer intrón y su alta actividad en suspensiones celulares de numerosas monocotiledóneas cuando se introduce vía bombardeo con microproyectiles. El promotor de la ubiquitina de Arabidopsis es especialmente preferido para utilizarse con los homólogos de NIM1 de la presente invención. El promotor de la ubiquitina es adecuado para la expresión genética en plantas trangénicas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Los vectores adecuados son derivados del pAHC25 o cualquiera de los vectores de transformación descritos en esta solicitud, modificados por la introducción del promotor de la ubiquitina y/o secuencias intrónicas apropiadas. b. Expresión Constitutiva, el promotor 35S de CaMV La construcción del plásmido pCGN1761 es descrita en la solicitud de patente publicada EP 0 392 225 (Ejemplo 23) . El pCGN1761 contiene el "doble" promotor 35S de CaMV y el terminador transcripcional tml con un sitio EcoRI único entre el promotor y el terminador y tiene un esqueleto del tipo pUC . Es construido un derivado del pCGN1761 el cual tiene un polienlazante modificado que incluye sitios Notl y Xhol además del sitio de EcoRI existente. Este derivado es designado como pCGN1761ENX. El pCGNl761ENX es útil para la clonación de secuencia de ADNc o secuencias codificadoras (incluyendo secuencias de ORF microbianas) dentro de su polienlazante para el propósito de su expresión bajo el control de promotor 35S en plantas trangénicas. Todo el cásete de terminador tml de la secuencia codificadora del promotor 35S de tal construcción puede ser escindida por los sitios HindIII, Sphl, Salí, y Xbal 5' al promotor y los sitios Xbal, BamHl, y bgll 3' al terminador para tranferirse a los vectores de transformación tales como aquéllos descritos mas adelante. Además, el fragmento del doble promotor de 35S puede ser removido por escisión 5' con HindIII, Sphl, Salí, Xbal, o PstI, y la escisión 3' con cualquier sitio de restricción de polienlazante (EcoRI, Notl o Xhol) para el reemplazo con otro promotor. Si se desea, ? ^fc^^^J pueden hacerse modificaciones alrededor de los sitios de clonación mediante la introducción se secuencias que puedan mejorar la traducción. Esto es particularmente útil cuando se desea una sobreexpresión. Por ejemplo, el pCGN1761ENX puede ser modificado mediante la optimización del sitio de inicio de la traducción como se describe en el Ejemplo 37 de la Patente Estadounidense No. 5,639,949. c. Expresión Constitutiva, el Promotor de Actina: Se sabe que varios isoformos de la actina son expresados en la mayoría de tipos celulares y en consecuencia el promotor de la actina es una buena elección para un promotor constitutivo. En particular, el promotor del gen Acti del arroz ha sido clonado y caracterizado (McElroy et al . , 1990). Se encontró que un fragmento de 1.3 kb del promotor contenía todos los elementos reguladores requeridos para la expresión en protoplastos de arroz. Además, han sido construidos numerosos vectores de expresión basados en el promotor Acti específicamente para utilizarse en monocotiledóneas (McElroy et al . , 1991). Esos incorporan un intrón 1 de Acti, la secuencia flanqueante AdhJ5' y el intrón 1 Adhl (del gen del alcohol deshidrogenasa de maíz) y la secuencia del promotor 35S de CaMV. Los vectores que muestran mayor expresión fueron fusiones del 35S y el intrón de Acti o la secuencia flanqueante de ActJ y el intrón de Actl. La optimización de las secuencias alrededor del ATG de inicio (el gen reportero GUS) también mejoró la expresión. Los casetes de expresión promotores descritos por McElroy et al . (1991) pueden ser fácilmente modificados por expresión genética y son especialmente adecuados para utilizarse en huespedes monocotiledóneos. Por ejemplo, los fragmentos que contienen promotor son removidos de construcciones de McElroy y utilizados para reemplazar el doble promotor 35S en el pCGN1761ENX, el cual está entonces disponible para la inserción de secuencias genéticas específicas. Los genes de fusión así construidos pueden entonces ser transferidos a vectores de transformación apropiados. En un reporte separado, se ha encontrado que el promotor Acti del arroz con su primer intrón dirige una alta expresión de células de cebada cultivadas (Chibbar et al . 1993). d. Expresión inducible, el Promotor PR-1 El doble promotor 35S en el pCGN1761ENX puede ser reemplazado con cualquier otro promotor de elección lo que dará como resultado niveles de expresión altamente estables. A manera de ejemplo, uno de los promotores regulables químicamente descritos en la Patente Estadounidense No 5,614,395 pueda reemplazar el doble promotor 35S. El promotor de elección es preferiblemente escindido de su fuente por enzimas de restricción, pero puede, de manera alternativa, ser amplificado por PCR utilizando cebadores que contengan sitios de restricción terminales apropiados. Si es efectuada la amplificación por PCR, entonces el promotor deberá ser resecuenciado para verificar errores de amplificación después de clonar el promotor amplificado en el vector objetivo. El promotor PR-la de tabaco regulable químicamente/por patógenos es escindido del pCIBl004 plasmídico (para la construcción, véase el ejemplo 21 de la EP 0 332 104) y transferido al plásmido pCGN1761ENX (Uknes et al . , 1992) . El pCIB1004 es escindido con NcoJ y la parte sobresaliente 3' del fragmento linearizado es cortada de manera roma con AD? polimerasa T . El fragmento es entonces escindido con HindIII y el fragmento que contiene el promotor PR-la resultante es purificado en gel y clonado en el pCG?1761E?X del cual ha sido removido el doble promotor 35S. Esto se hace mediante la escisión con Xhol y cortando con polimerasa T4, seguido por la escisión con HindIII y aislamiento del fragmento que contiene el terminador del vector grande en el cual se clonó el fragmento del promotor de pCIBl004. Esto genera un derivado del pCG?l761E?X con el promotor PR-la y el terminador tml y un polienlazante interviniente con sitios EcoRI y No J únicos. La secuencia codificadora seleccionada puede ser insertada en este vector, y los productos de fusión (es decir el promotor-gen-terminador) , pueden ser transferidos posteriormente a cualquier vector de transformación seleccionado, incluyendo aquellos descritos infra . Pueden ser empleados varios reguladores químicos para inducir la expresión de la secuencia codificadora seleccionada en las plantas transformadas de acuerdo a la 5 presente invención, incluyendo el benzotiadiazol, ácido isonicotínico y compuestos de ácido salicílico descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,523,311 y 5,614,395. e. Expresión Inducible, un Promotor Inducible por 10 Etanol: También puede ser utilizado un promotor inducible por ciertos alcoholes o cetonas, tales como el etanol, para conferir expresión inducible de una secuencia codificadora de la presente invención. Tal promotor es por ejemplo el promotor del gen alcA 15 de Aspergill us nídulans (Caddick et al . , 1998). En A. nidulans, el gen alcA codifica para el alchol deshidrogenasa I, la expresión de la cual es regulada por los factores de transcripción AlcR en presencia del inductor químico. Para los propósitos de la presente invención, las secuencias 20 codificadoras CAT en el plásmido palcA':CAT que comprenden una secuencia promotora del gen alcA fusionada a un promotor 35S mínimo (Caddick et al . , 1998) son reemplazadas por una secuencia codificadora de la presente invención para formar un cásete de expresión que tiene la secuencia codificadora bajo el control ........ *am ti¡ak?ttA¿ekiái?¡ £t^t?^A.?~***-~.c ... del promotor del gen alcR . Esto se lleva a cabo utilizando métodos bien conocidos en la técnica. f . Expresión Inducible, un Promotor Inducible por Glucocorticoide También se contempló la inducción de expresión de un homólogo NIM1 de la presente invención utilizando sistemas basados en hormonas esteroideas. Por ejemplo, se utilizó un sistema de inducción mediado por glucocorticoide (Aoyama y Chua, 1997) y la expresión del gen se indujo mediante la aplicación de un glucocorticoide, por ejemplo, un glucocorticoide sintético, de manera preferible dexametasona, preferiblemente a una concentración que fluctúa de 0.1 mM a 1 mM, de manera más preferible de 10 mM a 100 mM. Para los propósitos de la presente invención, las secuencias del gen de la luciferasa son reemplazadas por una secuencia codificadora que codifica para un homólogo de NIM1 para formar un cásete de expresión que tiene la secuencia genética que codifica para un homólogo de NIM1 bajo el control de seis copias de las secuencias activadoras corriente arriba GAL4 fusionadas al promotor mínimo 35S. Esto se lleva a cabo utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El factor de transacción comprende el dominio de unión de ADN de GAL4 (Keegan et al . , 1986) fusionado al dominio de transactivación de la proteína viral de herpes VP16 (Triezenberg et al . , 1988) fusionado al dominio de unión de hormona del receptor de glucocorticoide de rata (Picard et al . , 1988). La expresión de la proteína de fusión es controlada por cualquier promotor adecuado para la expresión en plantas conocido en la 5 técnica o descrito aquí. Este cásete de expresión también está comprendido en la planta que comprende la secuencia genética que codifica para el homólogo de NIM1 fusionado al 6xGAL4 /promotor mínimo. De este modo, se logra la especificidad de tejidos u órganos de la proteína de fusión que conduce a la especificidad 10 de tejido u órgano mducible del homólogo de NIM1. g. Expresión Especifica de la Raiz : Otro patrón de expresión genética es la expresión en la raíz. Un promotor de raíz adecuado es descrito por 15 Framond (1991) y también^en la solicitud de patente publicada EP 0 452 269. Este promotor es transferido a un vector adecuado tal como el pCGN1761ENX para la inserción de un gen seleccionado y la transferencia posterior de todo el cásete de promotor-gen-terminador al vector de transformación de 20 interés. h . Promotores Inducibles por Heridas Los promotores inducibles por heridas también pueden ser adecuados para la expresión de un gen. Han sido ••*•• -"• — J-frflMfcMaggt.» ?.?.? mÍCmt . &mí .t..i descritos numerosos de tales promotores (por ejemplo Xu et al . , 1993); Logemann et al., 1989; Rohrmeier & Lehle, 1993; Firek et al . , 1993; Warner et al . , 1993) y todos son adecuados para utilizarse con la presente invención. Logemann et al . describe las secuencias corriente arriba 5' del gen wunl de papa dicotiledónea. Xu et al . muestra que el promotor inducible por heridas de la papa dicotiledónea (pin2 ) es acitvo en el arroz monocotiledóneo. Además, Rohrmeier & Lehle describe la clonación del ADNc del WipI del maíz que es inducido por heridas y que puede ser utilizado para aislar el promotor cognado utilizando técnicas estándar. De manera similar, Firek et al . , y Warner et al . han descrito un gen inducido por heridas de Asparagus offi cina l is monocotiledónea, el cual es expresado en sitios de heridas locales e invasión de patógenos. Utilizando métodos de clonación bien conocidos en la técnica, esos promotores pueden ser transferidos a vectores adecuados, fusionados a los genes pertenecientes a esta invención, y utilizados para expresar esos genes en los sitios de heridas de plantas. i . Expresión Preferida de Médula La Solicitud de Patente WO 93/07278 describe el aislamiento del gen trpA del maíz, el cual es preferiblemente expresado en células de médula. Se presenta la secuencia del gen y el promotor que se extiende hasta -1726 bp desde el inicio ele la transcripción. Utilizando técnicas de biología molecular estándar, este promotor, o partes del mismo, puede ser transferido a un vector tal como el pCGN1761 donde pueda reemplazar el promotor 35S y ser utilizado para dirigir la expresión de un gen extraño en una forma preferida de la médula.

En efecto, los fragmentos que contienen el promotor preferido de la médula o partes del mismo pueden ser transferidos a cualquier vector y modificados para utilizarse en plantas transgénicas. j. Expresión Especifica de la Hoja: Ha sido descrito un gen de maíz que codifica para la fosfoenol carboxilasa (PEPC) por Hudspeth y Gruía (1989). Utilizando técnicas de biología molecular estándar el promotor para este gen puede ser utilizado para dirigir la expresión de cualquier gen en una forma específica de las hojas en formas transgénicas. k . Expresión Especifica del Polen : La WO 93/07278 describe el aislamiento del gen de la proteína cinasa dependiente del calcio (CDPK) del maíz que es expresado en células de polen. La secuencia del gen y promotor se extiende hasta 1400 bp desde el inicio de la transcripción. Utilizando técnicas de biología molecular estándar, este promotor o partes del mismo, puede ser transferido a un vector tal como el pCGN1761 donde puede reemplazar al promotor 35S y ser utilizado para dirigir la expresión de un homólogo de NIM1 de la presente invención en una forma específica del polen. 2. Terminadores Transcripcionales Está disponible una variedad de terminadores transcripcionales para utilizarse en casetes de expresión. Esos son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgen y su poliadenilación correcta. Los terminadores transcripcionales apropiados son aquéllos que se saben funcionan en plantas e incluyen al terminador 35S de CaMV, el terminador tml, el terminador de la nopalina sintasa y el terminador rbcS E9 de los guisantes. Esos pueden ser utilizados en monocotiledóneas y „ dicotiledóneas. Además, puede ser utilizado el terminador de transcripción activo del gen. 3. Secuencias para el Mejoramiento o Regulación de la Expresión . Se ha encontrado que numerosas secuencias mejoran la expresión del gen desde dentro de la unidad transcripcional y esas secuencias pueden ser utilizadas en conjunto con los genes de esta invención para incrementar su expresión en plantas transgénicas.

Se ha demostrado que varias secuencias intrónicas mejoran la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen Ad l del maíz mejoran significativamente la expresión del gen natural bajo su promotor cognado cuando se introducen en células de maíz. Se encontró que el intrón 1 es particularmente efectivo y mejora la expresión de constructos de fusión con el gen de la cloramfenicol acetil transferasa (Callis et al . , 1987). En el mismo sistema experimental, el intrón del gen bronce 1 del maíz tuvo un efecto similar en el mejoramiento de la expresión. Las secuencias intrónicas han sido incorporadas de manera rutinaria en vectores de transformación de plantas, típicamente dentro del líder no traducido. También se conoce un número de secuencias líder no traducidas derivadas de ^virus para mejorar la expresión, y esas son particularmente efectivas en células dicotiledóneas. Específicamente, las secuencias líder del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV la "secuencia W" ) , el Virus del Moteado Clorótico del Maíz (MCMV) , y el Virus del Mosaico de la Alfalfa (AMV) han demostrado ser efectivas para mejorar la expresión (por ejemplo Gallie et a l . , 1987; Skuzeki et al . , 1990) . 4. Dirección del Producto Genético Dentro de la Célula Se sabe que existen varios mecanismos para dirigir productos de genes en plantas y las secuencias que controlan 5 el funcionamiento de esos mecanismos han sido caracterizadas con algún detalle. Por ejemplo, la dirección de productos genéticos a los cloroplastos es controlada por una secuencia señal encontrada en el extremo amino terminal de varias proteínas que es escindida durante la importación de 10 cloroplastos para producir la proteína madura (por ejemplo, Comai et al . , 1988). Esas secuencias señal pueden ser fusionadas a productos de genes heterólogos para efectuar la importación de productos hacia los cloroplastos (van den Broeck, et al . , 1985). El ADN que codifica para las 15 secuencias señal apropiadas puede ser aislado del extremo 5' de los ADNc que codifican para proteína RUBISCO, la proteína CAB, la enzima EPSP sintasa, la proteína GS2 y muchas otras proteínas que se sabe se localizan en los cloroplastos. Véase también, la sección titulada "Expresión con Dirección 20 de Cloroplastos" en el Ejemplo 37 de la Patente Estadounidense No. 5,639,949. Otros productos genéticos se localizan en otros organelos tales como las mitocondrias y peroxisoma (por ejemplo, Unger et al . , 1989). Los ADNc que codifican para 25 esos productos también pueden ser manipulados para efectuar la dirección de los productos de genes heterólogos a esos organelos. Los ejemplos de tales secuencias son las ATPasas codificadas nucleares e isoformos de aspartato aminotransferasa específicos para las mitocondrias . La 5 dirección de cuerpos de proteínas celulares ha sido descrita por Rogers et al . (1985). Además, han sido caracterizadas secuencias que pueden producir la dirección de productos genéticos a otros compartimentos celulares. Las secuencias aminoterminales son 10 responsables de la dirección al ER, el apoplasto, y la secreción extracelular de células de aleurona (Koehler & Ho, 1990). Adicionalmente, las secuencias aminoterminales, en conjunto con las secuencias carboxiterminales son responsables de la dirección vacuolar de productos genéticos 15 (Shinshi et al . , 1990) . Mediante la fusión de las secuencias de dirección apropiadas descritas anteriormente a secuencias transgenéticas de interés, es posible dirigir el producto transgénico a cualquier organelo o compartimiento celular. 20 Para dirigir al cloroplasto, por ejemplo, la secuencia señal del cloroplasto del gen RUBISCO, el gen CAB, el gen de la EPSP sintasa, o el gen GS2 es fusionado en cuadro con el ATG aminoterminal del transgen. La secuencia señal seleccionada deberá incluir el sitio de escisión conocido, 25 y la fusión construida deberá tomar en cuenta cualesquier j^c^gg^gj^ aminoácidos después del sitio de escisión que sean requeridos para la escisión. En algunos casos, este requerimiento puede ser satisfecho por la adición de un pequeño número de aminoácidos entre el sitio de escisión y el ATN del transgen o, de manera alternativa, el reemplazo de algunos aminoácidos dentro de la secuencia del transgen. Las fusiones construidas para importar cloroplastos, pueden ser probadas para determinar su eficacia de absorción de cloroplastos por traducción in vi tro de construcciones transcritas ín vi tro seguido por la absorción de cloroplastos in vi tro utilizando técnicas descritas por Bartlett et a l . (1982) y Wasmann et a l . (1986) . Esas técnicas de construcción son bien conocidas en la técnica, y son igualmente aplicables a mitocondrias y peroxisomas. Los mecanismos descritos anteriormente para la dirección celular, pueden ser utilizados no únicamente en conjunto con sus promotores cognados, sino también en conjunto con promotores heterólogos para efectuar una meta de dirección celular específica bajo la regulación transcripcional de un promotor que tiene un patrón de expresión diferente al del promotor del cual se deriva la señal directora.

Ejemplo 8: Construcción de Vectores de Transformación de Planta Numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de planta, son conocidos por aquellos expertos en la técnica de la transformación de plantas, y los genes pertenecientes a esta invención, pueden ser utilizados en conjunto con cualesquiera de tales vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y las especies objetivo para la transformación. Para ciertas especies objetivo, pueden ser preferidos diferentes marcadores de selección de antibiótico o herbicida. Los marcadores de selección utilizados rutinariamente en la transformación incluyen el gen npt ll, el cual confiere resistencia a la kanamicina y antibióticos relacionados (Messing & Vierra, 1982; Bevan et a l . , 1983), el gen ba r, el cual confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White et a l . , 1990; Spencer et a l . , 1990), el gen hph , el cual confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann) , y el gen dhfr, el cual confiere resistencia al metotrexato (Bourouis et a l . , 1983), y el gen EPSPS, el cual confiere resistencia al glifosato (Patentes Estadounidenses Nos. 4,940,935 y 5,188,642). 1. Vectores Adecuados para la Transformación de Agroba c t eri van Están disponibles muchos vectores para la transformación utilizando Agroba cteri um tumefa ci ens . Esos típicamente contienen al menos una secuencia limítrofe de T-ADN, e incluyen vectores tales como el pBIN19 (Bevan, Nucí. Acids. Res. (1984)) y pXYZ . Más adelante, se describe la construcción de dos vectores típicos útiles para la transformación de Agrobacterium . a. pCIB200 y ?CIB2001: Los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001, son utilizados para la construcción de vectores de recombinación para utilizarse con Agroba cteri um, y son construidos de la siguiente manera. El pTJS75kan es creado por digestión con NarI de pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, 1985), permitiendo la escisión del gen de resistencia a la tetraciclina, seguido por la inserción de un fragmento Accl pUC4K que contiene un NPTII (Messing & Vierra, 1982; Bevan et al . , 1983; McBride et al . , 1990). Los enlazantes de Xhol son ligados al fragmento de EcoRV del PCIB7, el cual contiene los límites de T-ADN izquierdo y derecho, un gen quimérico nos/nptll seleccionable de planta, y el polienlazante de pUC (Rothstein et al . , y el fragmento digerido con Xhol son clonados en pTJS75kan digerido con Sal í para crear el pCIB200 (véase también la EP O 332 104, ejemplo 19) . El pCIB200 contiene los siguientes sitios de restricción de polienlazante únicos: EcoRI, Ss tl, Kpnl, Bglll, Xbal, y Sal í . El pCIB2001 es un derivado del pCIB200 creado mediante la inserción en el polienlazante de sitios de restricción adicionales. Los sitios de restricción únicos en el polienlazante del pCIB2001 son EcoRI, Sstl, Kpnl, Bglll, Xba l, Sal í, Ml ul, Bcl l, Avrll, Apa l, Hpa l y Stul . El pCIB2001, además de contener esos sitios de restricción únicos, también tiene la selección de kanamicina de plantas y bacterias, los límites de T-ADN izquierdo y derecho para la transformación mediada por Agrobacteri um, la función trfA derivada de RK2 para la inmovilización entre E . coli y otros huéspedes, y las funciones Ori T y OriV también de RK2. El polienlazante de pCIB2001 es adecuado para la clonación de casetes de expresión de planta que contienen sus propias señales reguladoras. b. pCIBlO y Derivados de Selección de Higromicina del mismo: El vector binario pCIBlO contiene un gen que codifica para la resistencia a la kanamicina para la selección en plantas y en las secuencias limítrofes derecha e izquierda de T-ADN, e incorpora secuencias de la amplia gama de huéspedes del plásmido pRK252 que le permiten reproducirse en E . col i y Agroba cteri um . Su construcción es descrita por Rothstein et al . (1987). Son construidos varios derivados del pCIBlO que incorporan el gen para la higromicina B fosfotransferasa descrita por Gritz et al . , 1983) . Esos derivados permiten la selección de células de plantas transgénicas sobre higromicina únicamente (pCIB743) , o higromicina y kanamicina (pCIB715, pCIB717) . 2. Vectores Adecuados para la Transformación sin Agrobacterivaa La transformación sin el uso de Agroba cteri um t umefa ci ens evita el requerimiento de las secuencias de T-ADN en el vector de transformación elegido, y en consecuencia, pueden ser utilizados vectores que carezcan de esas secuencias, además de vectores tales como los descritos anteriormente que contengan secuencias de T-ADN. Las técnicas de transformación que no dependen de Agroba cteri um incluyen la transformación vía el bombardeo de partículas, absorción de protoplastos (por ejemplo, PEG, y electroporación) y microinyección. La elección del vector depende en gran medida de la selección preferida de las especies que estén siendo transformadas. Más adelante, se describe la construcción de vectores típicos adecuados para la transformación sin Agroba cteri um . a. pCIB3064: El pClB3064 es un vector derivado del pUC adecuado para dirigir técnicas de transferencia de genes en combinación con la selección por el herbicida basta (o fosfinotricina). El plásmido pCIB246 comprende el promotor 35S de CaMV en fusión operacional al gen GUS de E . col i y el terminador transcripcional 35S de CaMV, y se describe la solicitud PCT publicada WO 93/07278. El promotor 35S de este vector contiene dos secuencias de ATG 5' del sitio de inicio. Esos sitios se hacen mutar utilizando técnicas de PCR estándar de tal manera para remover los ATG y generar los sitios de restricción de SspI y Pvull . Los nuevos sitios de restricción están 96 y 37 pb lejos del sitio Sal í único y 101 y 42 pb lejos del sitio inicial real. El derivado resultante del pCIB246 es designado como pCIB3025. El gen GUS es entonces escindido del pCIB3025 por digestión con Sa l í y Sa cl, los términos son cortados de manera roma, y religados para generar el plásmido pCIB3060. El plásmido pJIT82 se obtuvo del John Innes Centre, Norwich y el fragmento Sma l de 400 pb que contiene el gen bar de Streptomyces viridochromogenes es escindido e insertado en el sitio Hpa l del pCIB3060 (Thompson et al . , 1987). El pCIB3064 generado, el cual comprende el gen bar bajo el control del promotor 35S de CaMV y el terminador para la selección de herbicida, un gen para la resistencia a la ampicilina (para la selección en E . coli ) y un polienlazante con los sitios únicos Sphl, Ps tI, HindIII y BamHl . Este vector es adecuado para la clonación de casetes de expresión en plantas que contienen sus propias señales reguladoras. b. pSOGl9 y pSOG35 : El pSOG35 es un vector de transformación que utiliza el gen de la deshidrofolato reductasa (DFR) de E. coli como un marcador seleccionable que confiere resistencia al metotrexato. Es utilizada PCR para amplificar el promotor 35S (-800 pb) , intrón 6 del gen Adhl del maíz (-550 pb) y 18 pb de la secuencia líder no traducida GUS del pSOGlO. Un fragmento de 250 pb que codifica para el gen de la hidrofolato reductasa del tipo II de E . col i es también amplificado por PCR y esos dos fragmentos de PCR son amplificados con un fragmento SacI-PstI del pB1221 (Clontech) el cual comprende el esqueleto del vector pUC19 y un terminador de nopalina sintasa. El montaje de esos fragmentos genera el pSOG19 el cual contiene el promotor 35S en fusión con la secuencia intrónica 6, el líder GUS, el gen de DHFR y el terminador de la nopalina sintasa. El reemplazo del GUS en el gen pSOG19 con la secuencia líder del Virus del Moteado Clorótico del Maíz (MCMV) genera el vector pSOG35. El pSOG19 y el pSOG35 contienen el gen pUC a la resistencia a la ampicilina y tienen los sitios HindIII, Sphl, PstI y EcoRI disponibles para la clonación de sustancias extrañas.

Ejemplo 9: Transformación 5 Una vez que la secuencia de interés ha sido clonada en un sistema de expresión, es transformada en una célula de planta. Los métodos para la transformación y regeneración de planta son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, han sido utilizados vectores plasmídicos Ti para la liberación 10 del ADN extraño, así como para dirigir la absorción de ADN, liposomas, electroporación, microinyección y microproyectiles. Además, pueden ser utilizas bacterias del genero Agrobacteri um para transformar células de plantas. Más adelante se harán descripciones de las técnicas 15 representativas para transformar plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. 1. Transformación de dicotiledóneas Los métodos de transformación de dicotiledó'neas son bien conocidos en la técnica e incluyen técnicas basadas en 20 Agroba cteri um y métodos que no requieren Agroba cteri um . Los métodos sin Agrobacterium implican absorción de material genético exógeno directamente por protoplastos o células. Esto puede lograrse por absorción mediada por PEG o electroporación, liberación mediada por bombardeo de 25 partículas o microinyección. Los ejemplos de esas técnicas i^ga son descritos por Paszkowski et al., 1984; Potrykus et al., 1985; Reich et al., 1986; y Klein et al., 1987. En cada caso las células transformadas son generadas para plantas completas utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. La transformación mediada por Agroba cteri um es un método preferido para la transformación de dicotiledóneas debido a que es altamente eficiente para la transformación y es de amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación con Agroba cteri um típicamente implica la transferencia del vector binario que contiene el ADN extraño de interés (por ejemplo el pCIB200 o pCIB2001) para una cepa de Agrobacterium apropiada que pueda depender del complemento de los genes de vir contenidos por la cepa de Agroba cteri um huésped ya sea en un plásmido Ti corresidente o cromosomalmente (por ejemplo la cepa CIB542 para el pCIB200 y el pCIB2001 (Uknes et al., 1993)). La transferencia del vector binario recombinante a Agroba cteri um es lograda por un procedimiento de acoplamiento triparental utilizando E. coli que contiene el vector binario recombinante, una cepa de E. coli auxiliar que contiene un plásmido tal como el pRK2013 y que es capaz de movilizar el vector binario recombinante a las cepas de Agroba cteri um objetivo. De manera alternativa, el vector binario recombinante puede ser transferido a Agroba cteri um por transformación de ADN (Hófgen y Willimitzer 1988) . La transformación de las espacies de planta objetivo por Agroba cteri um recombinante usualmente implica el cocultivo de Agroba cteri um con explantes de la planta y sigue protocolos bien conocidos en la técnica. El tejido transformado es regenerado sobre un medio seleccionable que contiene el marcador de resistencia a antibiótico o herbicida presente entre los límites de T-ADN del plásmido binario. Otro método para transformar células de planta con un gen implica impulsar partículas biológicamente activas o inertes en tejidos de plantas y células. Esta técnica es descrita en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,945,050, 5,036,006, y 5,100,792. De manera general, este procedimiento implica impulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células bajo condiciones efectivas para penetrar la superficie externa de la célula y proporcionar la incorporación dentro del interior de la misma. Cuando son utilizadas partículas inertes, el vector puede ser introducido en la célula recubriendo las partículas con el vector que contenga el gen deseado. De manera alternativa, la célula objetivo puede ser rodeada por el vector, de modo que el vector contenido en la célula pueda despertar la partícula. También pueden ser impulsadas partículas biológicamente activas (por ejemplo, células de levadura secas, bacterias secas o un bacterió'fago, cada uno conteniendo el ADN que se busque introducir) en tejido de células de planta. 2. Transformación de Monocotiledoneas La transformación de la mayoría de las especies de monocotiledóneas se ha vuelto ahora rutina. Las técnicas preferidas incluyen la transferencia genética directa en protoplastos utilizando técnicas con PEG o electroporación, y bombardeo de partículas en tejido de callo. Las transformaciones pueden efectuarse con una sola especie de ADN o múltiples especies de ADN (es decir, cotransformacón ) y ambas técnicas son adecuadas para utilizarse con esta invención. La cotransformación puede tener la ventaja de evitar la construcción completa del vector y de generar plantas transgénicas con' sitios no ligados para el gen de interés y el marcador seleccionable, permitiendo la remoción del marcador seleccionable en generaciones posteriores, si esto se considera deseable. Sin embargo, una desventaja del uso de la cotransformación es la frecuencia menor del 100% con la cual especies de ADN separadas se integran en el genoma (Schocher et al., 1986). Las solicitudes de patente EP 0 392 225, y WO 93/07278 describen técnicas para la preparación de callos y protoplastos de una línea élite engendrada de maíz, jJ u¡¡A¿tLJ , .. *..! .*... i ... , transformación de cloroplastos utilizando PEG o electroporación, en la regeneración de plantas de maíz de protoplastos transformados. Gordon-Kamm et al., (1990) y Fromm et al., (1990) han publicado técnicas para la transformación de una línea de maíz derivada de A188 utilizando el bombardeo con partículas. Además, la WO 93/07278 y Koziel et al. (1993) describen técnicas para la transformación de líneas élite engendradas de maíz por bombardeo de partículas. Esta técnica utiliza embriones de maíz inmaduros de 1.5-2.5 mm de longitud escindidos de una mazorca de maíz de 14-15 días después de la polinización y un dispositivo PDS-lOOOHe Biolistics para el bombardeo. La transformación de arroz también puede ser efectuada por técnicas de transferencia genética directa utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. También ha sido descrita la transformación mediada por protoplastos para tipos de Japóni ca y Indi ca (Zhang et al., 1988; Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990). Ambos tipos también son transformables de manera rutinario utilizando bombardeo de partículas (Christou et al., 1991). Además, la WO 93/21335 describe técnicas para la transformación de arroz vía electroporación . La solicitud de patente EP 0 332 581 describe técnicas para la generación, transformación y regeneración de protoplastos de Pooideae. Esas técnicas permiten la transformación de Dactylis y trigo. Además, ha sido descrita la transformación de trigo por Vasil et al. (1992) utilizando el bombardeo de partículas de células de tallo regenerable a largo plazo del tipo C, y también por Vasil et al. (1993) y Weeks et al. (1993) utilizando bombardeo de partículas de embriones inmaduros y callo derivado de embrión inmaduro. Una técnica preferida para la transformación del trigo, sin embargo, implica la transformación del trigo por una red de partículas de embriones inmaduros e incluye un paso alto en sucrosa o alto en maltosa antes de la liberación del gen. Antes del bombardeo, es sembrado cualquier número de embriones (0.75-1 mm de longitud) sobre el medio MS con 3% de sucrosa (Murashiga & Skoog, 1962) y 3mg/l de 2,4-D para la introducción de embriones somáticos, el cual se permite uqe proceda en la obscuridad. El día elegido para el bombardeo, los embriones son removidos del medio ¿e inyección y colocados en el osmótico (es decir medio de inducción con sucrosa a maltosa agregada a la concentración deseada, típicamente 15%). Los embriones se dejan plasmolizar durante 2-3h y a continuación se bombardean. Veinte embriones por placa objetivo es típico, aunque no crítico. Un plásmido que contiene el gen apropiado (tal como pCIB3064 o pSG35) es precipitado sobre partículas de oro de tamaño micrométrico utilizando procedimientos estándar. Cada placa de embriones es baleada con un dispositivo de helio DuPont Biolistics® . t;á i ifta.'n utilizando una presión de ráfaga de -703.1 kgf/m2 (1000 psi) utilizando un tamiz de malla 80 estándar. Después del bombardeo, los embriones son colocados nuevamente en la oscuridad para recuperarlos en 24h (aún sobre osmótico) . 24 horas después, los embriones son removidos del osmótico y colocados nuevamente en el medio de inducción donde permanecen durante aproximadamente 1 mes antes de la regeneración. Aproximadamente 1 mes más tarde los explanes de embrión con el cayo embriónico en desarrollo son transferidos al medio de regeneración (MS+1 mg/litro NAA, 5mg/litro de GA) , que contiene además un agente de selección apropiado (10 mg/l basta en el caso de pCIB3064 y 2 mg/l metotrexato en el caso de pSOG35) . Después de aproximadamente 1 mes, los brotes desarrollados son transferidos a recipientes estériles más grandes conocidos como "GA7" los cuales contienen MS de fuerza media, sucrosa al 2%, y la misma concentración de agente de selección. Ha sido descrita la transformación de monocotiledóneas utilizando Agroba cteri um . Véase, la WO 94/00977 y la Patente Estadounidense No .5 , 591 , 616.

III. Crecimiento y Producción de Semillas Ejemplo 10: Crecimiento Las plantas obtenidas de la transformación con el gen de la presente invención pueden ser cualquiera de una amplia variedad de especies de plantas, incluyendo aquellas monocotiledóneas y dicotiledóneas; sin embargo, las plantas utilizadas en el método de la invención son seleccionadas preferiblemente de la lista de cultivos objetivo agronómicamente importantes expuestos in supra . Puede incorporarse la situación de un gen de la presente invención en combinación con otras características importantes para la producción y calidad en líneas de plantas a través del crecimiento. Los métodos y técnicas de crecimiento y producción son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Welsh J. R. (1981); Wood D. R. (Ed.) (1983); Mayo O. (1987); Singh, D.P. (1986); y Wricke y Weber (1986). Las propiedades genéticas diseñadas en las semillas y plantas transgénicas descritas anteriormente son pasadas por reproducción sexual o crecimiento vegetativo y pueden de este modo ser mantenidas'' y propagadas en las plantas de la progenie. De manera general el mantenimiento y propagación hace uso de métodos agrícolas conocidos desarrollados para ajustarse a propósitos específicos tales como el cultivo, siembra o cosecha. También pueden ser aplicados procesos especializados tales como tecnologías hidropónicas y de invernadero. Puesto que el cultivo en crecimiento es vulnerable a ataques y daños causados por insectos e infecciones así como a la competencia de hierbas o malezas, se toman medidas para controlar hierbas o malezas, enfermedades de plantas, insectos,- nemátodos y otras condiciones adversas para mejorar el rendimiento. Esas incluyen medidas mecánicas tales como el cultivo del suelo o remoción de hierbas o malezas y plantas infectadas, así como la aplicación de productos agroquímicos tales como herbicidas, fungicidas, gametocidas, nematocidas, reguladores del crecimiento, agentes madurantes e insecticidas. Puede hacerse uso adicional de las propiedades genéticas ventajosas de las plantas y semillas transgénicas de acuerdo a la invención en la producción de plantas, lo cual ayuda al desarrollo de plantas con propiedades mejoradas tales como tolerancia a plagas, herbicidas, o esfuerzo, valor nutricional mejorado, mayor rendimiento o estructura mejorada causando menos pérdidas por alojamiento o destrozos. Los varios pasos de crecimiento o producción se caracterizan por una intervención humana Bien definida tales como la selección de las líneas a ser cruzadas, dirección de la polinización de las líneas padres o selección apropiada de las plantas de la progenie. Dependiendo de las propiedades deseadas, se toman diferentes medidas de crecimiento o producción. Las técnicas relevantes son bien conocidas en la técnica e incluyen pero no se limitan a la hibridación, procreación, reproducción por retrocruce, reproducción de líneas múltiples, mezcla de variedades, hibridación interespecífica, técnicas aneuploides, etc. Las técnicas de hibridación también ?MÜt"l i -t-a- * .---»»»,.*. — .¿¡.«.^ - . **•**... incluyen la esterilización de plantas para producir plantas estériles macho y hembra por medios mecánicos, químicos o bioquímicos. La polinización cruzada de una planta estéril macho con polen de una línea diferente asegura que el genoma del macho estéril pero no de la planta fértil hembra obtendrá propiedades uniformes de ambas líneas padres. De este modo, las semillas y plantas transgénicas de acuerdo a la invención pueden ser utilizadas para la reproducción de líneas de plantas mejoradas, que por ejemplo, incrementan la efectividad de los métodos convencionales tales como el tratamiento con herbicidas o plaguicidas o le permiten a uno abastecerse con tales métodos debido a sus propiedades genéticas modificadas. De manera alternativa pueden obtenerse nuevos cultivos con tolerancia al esfuerzo mejorada, lo cual, debido a su "equipo" genético optimizado, producen productos cosechados de mejor calidad que los productos que no eran capaces de tolerar condiciones de desarrollo adversas comparables .

Ejemplo 11: Producción de Semillas En la producción de semillas, la calidad de la germinación y uniformidad de las semillas son características esenciales del producto, por lo tanto la calidad de germinación y uniformidad de las semillas cosechadas y vendidas por el granjero no es importante. Puesto que es difícil mantener un cultivo libre de otro cultivo y malezas o hierbas, para controlar las enfermedades portadas por las semillas, y producir semillas con buena germinación, han sido desarrolladas prácticas de producción de semillas muy exhaustivas y bien definidas por los productores de semillas, que están experimentando en la técnica del crecimiento, acondicionamiento y comercialización de semillas puras. De este modo, es una práctica común para el granjero comprar semillas certificadas que reúnan estándares de calidad específicos en lugar de utilizar las semillas cosechadas de su propio cultivo. El material de propagación a ser utilizado como semillas es comúnmente tratado con un recubrimiento protector que contiene herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusticidas, o mezclas de los mismos. Los recubrimientos protectores utilizados comúnmente comprenden compuestos tales como el captan, carboxin, thiram (TMTD®) , metalaxil (Apron®) , y pirimifos-metil (Actellic®) .

Si se desea, esos compuestos son formulados junto con portadores, tensoactivos o adyuvantes que promuevan la aplicación adicionales comúnmente empleados en la técnica de formulación para proporcionar protección contra el daño causado por bacterias, hongos o plagas animales. Los recubrimientos protectores pueden ser aplicados impregnando material de propagación con una formulación líquida o recubriendo con una formulación húmeda o seca combinada.

También son posibles otros métodos de aplicación tales como el tratamiento directo en los brotes o los frutos. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar nuevos métodos agrícolas, tales como los métodos 5 ejemplificados anteriormente, los cuales se caracterizan por el uso de plantas transgénicas, material de plantas transgénicas o semillas transgénicas de acuerdo a la presente invención . Las semillas pueden ser proporcionadas en una 10 bolsa, contenedor o recipiente comprimido de un material para empaquetar adecuado, la bolsa o contenedor puede ser cerrado para contener las semillas. La bolsa, contenedor o recipiente puede ser diseñado para el almacenamiento a corto plazo o largo plazo, o ambos, de las semillas;. Los 15 ejemplos de material para empaquetar adecuado incluyen papel, tal como el papel kraft, plástico rígido o plegable u otro material polimérico, vidrio o metal. De manera deseable la bolsa, contenedor, o recipiente está comprendido de una pluralidad de capas de materiales para empacar, del mismo o 20 diferente tipo. En una modalidad la bolsa, contenedor o recipiente es proporcionado para excluir o limitar el contacto del agua o la humedad con las semillas. En un ejemplo, la bolsa, contenedor o recipiente es sellado, por ejemplo, sellado térmicamente, para evitar que el agua o 25 humedad entren. En otra modalidad son colocados materiales que absorben agua entre o adyacentes a las capas del material para empaquetar. En otra modalidad más la bolsa, contenedor o recipiente, o material para empaquetar del cual está comprendida está tratado para limitar, suprimir o 5 evitar enfermedades, contaminación u otros efectos adversos de almacenamiento o transporte de la semilla. Un ejemplo de tal tratamiento es la esterilización, por ejemplo por medios químicos por exposición a la radiación. Comprendida por la presente invención está una bolsa comercial que 10 comprende semillas de una planta transgénica que comprende un gen de la presente invención es expresado en la planta transformada a niveles superiores que en una planta natural, junto con un portador adecuado, junto con las instrucciones de la etiqueta para el uso de la misma para 15 conferir una resistencia a enfermedades de espectro amplio a las plantas.

IV. Evaluación de la Resistencia a Enfermedades La evaluación de la resistencia a las enfermedades 20 es efectuada por métodos conocidos en la técnica, véase, Uknes et al . (1993); Górlach et al . (1996); Alexander et al . (1993). Por ejemplo, más adelante se describen varios ensayos de resistencia a enfermedades representativos.

Ejemplo 12 : Ensayo de Resistencia a Phytophthora parasítica (Tallo Negro) Los ensayos de resistencia a Phytoph thora pa ra sí ti ca , el organismo causante de tallo negro, son efectuados en plantas con un crecimiento de seis semanas, de acuerdo a lo descrito en Alexander et a l . (1993) . Las plantas fueron humedecidas, se dejaron drenar bien, y a continuación se inocularon aplicando 10 ml de una suspensión de sporangium (300 esporangios/ml ) al suelo. Las plantas inoculadas se mantuvieron en un invernadero a 23-25°C de temperatura de día, y 20-22°C de temperatura de noche. Se utilizó el índice de marchitamiento para el ensayo como sigue: 0 = sin síntomas; 1 = sin síntomas; 1 = con algún signo de marchitamiento, con turgencia reducida; 2 = síntomas claros de marchitamiento, pero sin putrefacción o atrofia; 3 = síntomas claros de marchitamiento con atrofia, pero sin putrefacción evidente del tallo; 4 = marchitamiento severo, con putrefacción visible del tallo y algún daño del sistema de raíces; 5 = como 4, pero para plantas cerca de la muerte o muertas, y con reducción severa del sistema de raíces. Todos los ensayos son puntajes ciegos sobre plantas arregladas en diseños aleatorios.

Ejemplo 13 : Ensayo de Resistencia a Pseudomonas syringae Se inyectó Pseudomonas syringae pv. de tabaco, cepa #551 en las dos hojas inferiores de varias plantas de 6-7 semanas de edad a una concentración de 106 ó 3 x 106 por ml en H20. Se evaluaron seis plantas individuales en cada punto temporal. Las plantas infectadas con Pseudomonas taba ci son calificadas en una escala de severidad de enfermedad de 5 puntos, 5 = 100% de tejido muerto, 0 = sin síntomas. Se condujo una prueba T (LSD) tras la evaluación diaria y los agrupamientos se indican después del valor nominal Promedio de la enfermedad. Los valores seguidos por la misma letra el día de la evaluación no son en un sentido estadístico significativamente diferentes.

Ejemplo 14: Ensayo de Resistencia contra Cercospora nicotianae Se roció una suspensión de esporas de Cercospora ni cotianae (ATCC #18366) (100,000-150,000 esporas por ml ) para que corrieran inminentemente sobre la superficie de las hojas. Las plantas son mantenidas a un 100% de humedad durante 5 días. Posteriormente, las plantas son tratadas con una niebla de agua 5-10 veces por día. Se evaluaron seis plantas individuales en cada punto temporal. La Cercospora ni cotianae se calificó como un por ciento del área de la hoja que mostró síntomas básico de la enfermedad. Se condujo una prueba T (LSD) tras la evaluación diaria y los agrupamientos se indicaron después del valor nominal Promedio de la enfermedad. Los valores seguidos por la misma letra el día de la evaluación no son en un sentido estadístico significativamente diferentes.

Ejemplo 15 : Ensayo de Resistencia a Peronospora parasítica Se efectuaron ensayos de resistencia par Peronospora parasí tica en plantas como se describe en Uknes et al . (1993). Las plantas se inocularon con un aislado compatible de p . parasí tica rociando con suspensión conidia (aproximadamente 5 x 104 esporas por mililitro) . Las plantas inoculadas son incubadas bajo condiciones húmedas a 17°C en una cámara de crecimiento con un ciclo de 14 horas de día/10 horas de noche. Las plantas se examinaron a los 3-14 días, preferiblemente a los 7-12 días, después de la inoculación para determinar la presencia de conidióforos . Además, se seleccionaron aleatoriamente varias plantas de cada tratamiento, y se tiñeron con azul de lactofenol-tripan (Keogh et al . , 1980) para su examen microscópico. Las modalidades descritas anteriormente son ilustrativas. Esta descripción de la invención colocará a un experto en la técnica en posesión de muchas variaciones de la invención. Se pretende que todas aquellas variaciones obvias contemplables sean abarcadas por las reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIA <110> Syngenta Participations AG <120> GENES DE PLANTAS MONOCOTILEDONEAS NOVEDOSAS Y USOS DE LOS MISMOS <130> A-31281A <140> <141> <150> US 09/519233 <151> 2000-03-06 <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.2 <210> 1 <211> 4270 <212> ADN <213> Triticum aestivum <220> <221> exón <222>(1396) .. (2163) <220> <221> intrón <222> (2164) .. (2337) <220> <221> exón <222> (2338) .. (2532) <220> <221> intrón <222>(2533) .. (2933) <220> <221> exón <222>(2934) .. (3188) <400> 1 gagctcgcca acctcttcca ggtccgcctc tccctctccc cttctcctcc atgatgcttt 60 cttggtttca gacatttatt gtgcttgctg ggaatgcata tttgcgcgca cgttcttgtg 120 3 ctcagacage aaggtttaat gctgtctttt ctttctgcac gcggggacgt tttctgtatg 180 cggcaaaatg ggettagate cccttaccat ttctgctaaa tttaatcaat ttcagtactt 240 ctgaaaaata gcgttaaaca ttggttagta ctagtacgtt ttgtcggtag caatgaggag 300 cttgtgctta tcatgtggtg atcttgaaat tggtgaagtt gtcaatggaa attgtacagt 360 tgggaccttg aggtgccgtg tcattttgat getatetcaa ggattcttgt tctgatgttt 420 tttttttctt ggggaaaaat ggtaattgtt cattgetcaa agaatgagtg gtgtcaatat 480 ggtacatgcc ectaettata tttttcatca atgaaatgca gttcttatga aactgtacaa 540 atctaggttg cattaatgea gacgtttggt acatatacaa tacaaaggaa agcatgtaca 600 gcacctttcc cccggataca ataggaaagc atgtgcacca cctttcccca gacaatteac 660 aacaccggga gtctgcgaca gtattatatc gtctgttttc teaettaata aagtttcggg 720 tgtcagtgtg taaagcgcct aatattecta atgttcataa acatatttgc tccacaactc 780 cttaatttcc attaggatca tetattaatg ttattctgag caggagtgtt ttgatagtga 840 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Secuencia Artificial: cebador PCR NIM 15 2D <400> 6 agttkagcma gdccaactck attttcaarr t 31 <210> 7 20 <211> 498 <212> ADN <213> Oryza sativa ^^Mta^ >AJ^¿.Jl.^^?;i^-3*^^^i 12 <220> <221> CDS <222> (2) .. (496) 5 <400> 7 g gca ytg gat tet gat gat gtt gag ctt gtg aag ttg ctt ctt aac gaa 49 Ala Xaa Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu 1 5 10 15 10 tet gag ate aca ttg gat gat gcc aat gca ttg cae tat gct gct gct 97 Ser Glu He Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala 20 25 30 tac tgt gat tcg aaa gtt gtt tcg gag ttg tta gac ttg aga ctt gcc 145 15 Tyr Cys Asp Ser Lys Val Val1 Ser Glu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Ala 35 40 45 aac ttg aat ttg aag aat tcg cgt gga tac acg gca ctc cat ctg gct 193 20 Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala 50 55 60 13 gct atg agg aga gag cea gct att ate atg tgt ctc cta aac aaa gga 241 Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala He He Met Cys Leu Leu Asn Lys Gly 65 70 75 80 gca gct gta tca caa ttg act gct gat ggc cag agt gca atg agt ate 289 Ala Ala Val Ser Gln Leu Thr Ala Asp Gly Gln Ser Ala Met Ser He 85 90 95 tgc cgg agg tta aca agg atg aaa gac tac aat aca aag atg gag caa 337 Cys Arg Arg Leu Thr Arg Met Lys Asp Tyr Asn Thr Lys Met Glu Gln 100 105 110 ggc caa gag tca aac aaa gac aga tta tgt att gat ata tta gat agg 385 Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Leu Cys He Asp He Leu Asp Arg 115 1-20 125 gag atg ata agg aaa cct atg gca gtg gaa gat tet gtc acc tcg cct 433 Glu Met He Arg Lys Pro Met Ala Val Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro 130 135 140 ttg ttg gct gac gat ctt cae atg aag ctt ctc tac ctt gaa aat cga 481 Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg 145 150 155 160 14 gtt ggc ctt gct aaa ct Val Gly Leu Ala Lys 165 5 <210> 8 <211> 165 <212> PRT <213> Oryza sativa 0 <400> 8 Ala Xaa Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu 1 5 10 15 Ser Glu He Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala 20 - 25 30 Tyr Cys Asp Ser Lys Val Val Ser Glu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Ala 35 40 45 Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala 50 55 60 15 Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala He He Met Cys Leu Leu Asn Lys Gly 65 70 75 80 Ala Ala Val Ser Gln Leu Thr Ala Asp Gly Gln Ser Ala Met Ser He 85 90 95 Cys Arg Arg Leu Thr Arg Met Lys Asp Tyr Asn Thr Lys Net Glu Gln 100 105 110 Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Leu Cys He Asp He Leu Asp Arg 115 120 125 Glu Met He Arg Lys Pro Met Ala Val Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro 130 135 140 Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg 145 150 155 160 Val Gly Leu Ala Lys 165 <210> 9 <211> 498 16 <212> ADN <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (2) .. (496) <400> 9 g gca ttg gat tca gat gat gtt gag tta gtc agg atg ctg ctc act gaa 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Arg Met Leu Leu Thr Glu 1 5 10 15 gga cag aca aat ctt gat gat gcg ttt gca ctg cae tac gcc gtc gaa 97 Gly Gln Thr Asn Leu Asp Asp Ala Phe Ala Leu His Tyr Ala Val Glu 20 • 25 30 cat tgt gac tec aaa att aca acc gag ctt ttg gat ctc gca ctt gca 145 His Cys Asp Ser Lys He Thr Thr Glu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Ala 35 40 45 gat gtt aat cat aga aac cea aga ggt tat acc gtt ctt cae att gct 193 Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His He Ala 50 55 60 .^Maj 17 gcg agg cga aga gag cct aaa ate att gtc tec ctt tta acc aag ggg 241 Ala Arg Arg Arg Glu Pro Lys He He Val Ser Leu Leu Thr Lys Gly 65 70 75 80 gct cgg cea gca gat gtt aca ttc gat ggg aga aaa gcg gtt caa ate 289 Ala Arg Pro Ala Asp Val Thr Phe Asp Gly Arg Lys Ala Val Gln He 85 90 95 tca aaa aga cta aca aaa caa ggg gat tac ttt ggg gtt acc gaa gaa 337 Ser Lys Arg Leu Thr Lys Gln Gly Asp Tyr Phe Gly Val Thr Glu Glu 100 105 110 gga aaa cct tet cea aaa gat agg tta tgt att gaa ata ctg gag caa 385 Gly Lys Pro Ser Pro Lys Asp Arg Leu Cys He Glu He Leu Glu Gln 115 120 125 gct gaa aga agg gac cea caa ctc gga gaa gca tca gtt tet ctt gca 433 Ala Glu Arg Arg Asp Pro Gln Leu Gly Glu Ala Ser Val Ser Leu Ala 130 135 140 atg gca ggt gag agt cta cga gga agg ttg ctg tac ctt gaa aat cga 481 Met Ala Gly Glu Ser Leu Arg Gly Arg Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg 145 150 155 160 ?^?i^t^í^ tiiá i^^? gtt ggc ctg gct caa ct 498 Val Gly Leu Ala Gln 165 <210> 10 <211> 165 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 10 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Arg Met Leu Leu Thr Glu 1 5 10 15 Gly Gln Tyr Asn Leu Asp Asp- Ala Phe Ala Leu His Tyr Ala Val Glu 20 25 30 His Cys Asp Ser Lys He Thr Thr Glu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Ala 35 40 45 sp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His He Ala 50 55 60 19 Ala Arg Arg Arg Glu Pro Lys He He Val Ser Leu Leu Thr Lys Gly 65 70 75 80 Ala Arg Pro Ala Asp Val Thr Phe Asp Gly Arg Lys Ala Val Gln He 85 90 95 Ser Lys Arg Leu Thr Lys Gln Gly Asp Tyr Phe Gly Val Thr Glu Glu 100 105 110 Gly Lys Pro Ser Pro Lys Asp Arg Leu Cys He Glu He Leu Glu Gln 115 120 125 Ala Glu Arg Arg Asp Pro Gln Leu Gly Glu Ala Ser Val Ser Leu Ala 130 135 140 Met Ala Gly Glu Ser Leu Arg Gly Arg Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg 145 150 155 160 Val Gly Leu Ala Gln 165 <210> 11 <211> 498 <212> ADN 20 <213> Triticum aestivum <220> <221> CDS <222> (2) .. (496) <400> 11 g gca ctg gat tca gat gat gtt gag ctt gtg aag ttg ctt ctt aat gag 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu 1 5 10 15 tet gaa ate acc cta gac gac gcc aac gca ttg cat tat gct gca gct 97 Ser Glu He Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala 20 25 30 tac tgc gat tet aaa gtt ctt aca gag ttg tta ggc ctg gaa ctt gcc 145 Tyr Cys Asp Ser Lys Val Leu Thr Glu Leu Leu Gly Leu Glu Leu Ala 35 40 45 aac ttg aat ttg aag aac agt cgt ggg tac aca gca ctc cae cta gct 193 Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala 50 55 60 21 gct atg agg aga gaa cea gct att att atg tgt ctc tta age aaa gga 241 Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala He He Met Cys Leu Leu Ser Lys Gly 65 70 75 80 gca gtg gcg tcg caa ttg aca gat gat ggc cgc ctt gca agt aat att 289 Ala Val Ala Ser Gln Leu Tyr Asp Asp Gly Arg Leu Ala Ser Asn He 85 90 95 tgt cga aga tta aca aga cta aaa gat tac aat gca aag atg gag cag 337 Cys Arg Arg Leu Thr Arg Leu Lys Asp Tyr Asn Ala Lys Met Glu Gln 100 105 110 ggc caa gag tca aat aaa gat agg atg tgc att gac ate cta gag agg 385 Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Met Cys He Asp He Leu Glu Arg 115 120 125 gag atg atg agg aat cct atg aca gcg gaa gat tca gtc acc tca cct 433 Glu Met Met Arg Asn Pro Met Thr Ala Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro 130 135 140 tta ttg gct gat gat ctt cae atg aaa cta age tac ctt gaa aat cga 481 Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Ser Tyr Leu Glu Asn Arg 145 150 155 160 |^^^^^^^^^^^^^g^^^^^^^^^^gg^^^^^&^^^2s^^^^^^Sási&^^^ jjgjg£ ¡¡ ¡ 22 gtt ggc ctt gct caa ct Val Gly Leu Ala Gln 165 <210> 12 <211> 165 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 12 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu 1 5 10 15 Ser Glu He Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala 20 - 25 30 Tyr Cys Asp Ser Lys Val Leu Thr Glu Leu Leu Gly Leu Glu Leu Ala 35 40 45 sn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala 50 55 60 23 Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala He He Met Cys Leu Leu Ser Lys Gly 65 70 75 80 Ala Val Ala Ser Gln Leu Thr Asp Asp Gly Arg Leu Ala Ser Asn He 5 85 90 95 Cys Arg Arg Leu Thr Arg Leu Lys Asp Tyr Asn Ala Lys Met Glu Gln 100 105 110 10 Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Met Cys He Asp He Leu Glu Arg 115 120 125 Glu Met Met Arg Asn Pro Met Thr Ala Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro 130 135 140 15 Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Ser Tyr Leu Glu Asn Arg 145 150 155 160 Val Gly Leu Ala Gln 20 165 <210> 13 <211> 2326 <212> ADN -'TirtfpffUtfii 24 <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (419) .. (1954) <400> 13 ggccgcgagc caaagcccct ggtttcctcg caactgcctc cccgcgattc cgtttgaccc 60 ccactgttct tctcccctac caccaccagg tcgccgtcgc ttccaatttc caaataatte 120 cctccactcc ggccgctcgc gaggatagaa aaggatttet ttttctctct ctctctctcc 180 ccctctctcc gagatccgtt tcccaaacag gcggggggtc gaaagtgttt ggtactttgg 240 tttggggagc ttgtttgccg acgcggatct gcgtggagac gagcagaggg gggagcgccg 300 gaattgggtg gtttggcccg ggaggcgccg gaaagtgggg gagcctttgg attccccgaa 360 cccgccatgg tgatccggca cgagtagtag tggtggtggt ggtattagta gcagtgag 418 atg ccg gcg cgt age gcg gtg gtg gta ata gcc atg gag ccc tcg tcg 466 Met Pro Ala Arg Ser Ala Val Val Val He Ala Met Glu Pro Ser Ser 1 5 10 15 tec ate acc ate gcg tcg tcg tec tcg tac ctc tcg aac ggg tet age 514 Ser He Thr He Ala Ser Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Asn Gly Ser Ser 20 25 30 *?.?.? ^^jjja.L 25 ccg cgg tac aag atg gag gag ctc gtg ccg gga ggc cgc gtg ggg cgc 562 Pro Arg Tyr Lys Met Glu Glu Leu Val Pro Gly Gly Arg Val Gly Arg 35 40 45 gac gcc ttc ctg tcg ctg ctg ggt tac ctg tac acg ggc aag 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Ala He 260 265 270 ate atg tgt ctc cta aac aaa gga gca gct gta tca caa ttg act gct 1282 He Met Cys Leu Leu Asn Lys Gly Ala Ala Val Ser Gln Leu Thr Ala 275 280 285 gat ggc cag agt gca atg agt ate tgc cgg agg tta aca agg atg aaa 1330 Asp Gly Gln Ser Ala Met Ser He Cys Arg Arg Leu Thr Arg Met Lys 290 295 300 28 gac tac aat aca aag atg gag caa ggc caa gag tca aac aaa gac aga 1378 Asp Tyr Asn Thr Lys Met Glu Gln Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg 305 310 315 320 5 tta tgt att gat ata tta gat agg gag atg ata agg aaa cct atg gca 1426 Leu Cys He Asp He Leu Asp Arg Glu Met He Arg Lys Pro Met Ala 325 330 335 gtg gaa gat tet gtc acc tcg cct ttg ttg gct gac gat ctt cae atg 1474 10 Val Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met 340 345 350 aag ctt ctc tac ctt gaa aac aga gtt gca ttt gca aga tta ttt ttt 1522 Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg Val Ala Phe Ala Arg Leu Phe Phe 15 355 3-60 365 cct gca gaa gca aag gtt gca atg caa att gca caa gca gac acc aca 1570 Pro Ala Glu Ala Lys Val Ala Met Gln He Ala Gln Ala Asp Thr Thr 370 375 380 20 cea gaa ttt ggc att gtt cct gca gct age act tet gga aaa ttg aag 1618 Pro Glu Phe Gly He Val Pro Ala Ala Ser Thr Ser Gly Lys Leu Lys 385 390 395 400 29 gaa gtc gat ctg aac gag aca cea gta aca caa aac aaa agg ctc cgt 1666 Glu Val Asp Leu Asn Glu Thr Pro Val Thr Gln Asn Lys Arg Leu Arg 405 410 415 tca agg gtg gat gca ctc atg aaa aca gtt gag ctg gga cgt cgc tac 1714 Ser Arg Val Asp Ala Leu Met Lys Thr Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr 420 425 430 ttc cct aac tgc tcg cag gtg ctc gac aaa ttt ctg gag gat gat ttg 1762 Phe Pro Asn Cys Ser Gln Val Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Asp Leu 435 440 445 ccc gat agt cct gat gca ctc gac ctc caa aat ggc act tet gat gag 1810 Pro Asp Ser Pro Asp Ala Leu Asp Leu Gln Asn Gly Thr Ser Asp Glu 450 455 « 460 caa aat gtt aaa agg atg cgg ttc tgt gag tta aag gag gat gtg cgc 1858 Gln Asn Val Lys Arg Met Arg Phe Cys Glu Leu Lys Glu Asp Val Arg 465 470 475 480 aag gca ttc age aaa gac aga gct gat aat age atg ttt tet ate ttg 1906 Lys Ala Phe Ser Lys Asp Arg Ala Asp Asn Ser Met Phe Ser He Leu 485 490 495 .. , *?t,zc^ 30 tca tet tca tcg tca tet tcg cea cct ccc aag gtt gca aag aaa tga 1954 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Lys Val Ala Lys Lys 500 505 510 cagaagtttt gtaacaaatt tccgctcgtg atgttactgg gacaagagat ategatcaat 2014 agacctgtat agtcttacag tggtataaca attagatatc gaagcttctt cgaatattag 2074 aaagtgctgt tctgggctgc actcagctgg tttatgggac ccatgcggtg aaactggcaa 2134 aagaaaacca getgattaga gtctccaaag cagtgtctct cgtgaatatg tttgtageat 2194 tctgttttgt tcaggatggc tataatgata aaatcttttc aatagatata tagetaattg 2254 tetegtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2314 aaaaaaaaaa aa 2326 <210> 14 <211> 511 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 14 Met Pro Ala Arg Ser Ala Val Val Val He Ala Met Glu Pro Ser Ser 1 5 10 15 Ser He Thr He Ala Ser Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Asn Gly Ser Ser 20 25 30 31 Pro Arg Tyr Lys Met Glu Glu Leu Val Pro Gly Gly Arg Val Gly Arg 35 40 45 Asp Ala Phe Leu Ser Leu Leu Gly Tyr Leu Tyr Thr Gly Lys Leu Arg 50 55 60 5 Pro Ala Pro Asp Asp Val Val Ser Cys Ala Asp Pro Met Cys Pro His 65 70 75 80 Asp Ser Cys Pro Pro Ala He Arg Phe Asn Val Glu Gln Met Tyr Ala 85 90 95 Ala Trp Ala Phe Lys He Thr Glu Leu He Ser Leu Phe Gln Arg Arg 10 100 105 110 Leu Leu Asn Phe Val Asp Lys Thr Leu Val Glu Asp Val Leu Pro He 115 120 125 Leu Gln Val Ala Phe His Ser Glu Leu Thr Pro Val Leu Glu Lys Cys 130 135 140 15 He Arg Arg He Ala Arg Ser Asn Leu Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys 145 150 155 160 Glu Leu Pro Pro Glu Val Ala Val Gln He Lys Glu He Arg Gln Lys 165 170 175 Ser Gln Pro Asn Glu Gly Asp Thr Val He Ser Asp Pro Val His Glu 20 180 185 190 Lys Arg Val Arg Arg He His Arg Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu 195 200 205 32 Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu Ser Glu He Thr Leu Asp Asp Ala 210 215 220 Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala Tyr Gys Asp Ser Lys Val Val Ser 225 230 235 240 Glu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Ala Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg 245 250 255 Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala He 260 265 270 He Met Gys Leu Leu Asn Lys Gly Ala Ala Val Ser Gln Leu Thr Ala 275 280 285 Asp Gly Gln Ser Ala Met Ser He Gys Arg Arg Leu Thr Arg Met Lys 290 295 300 Asp Tyr Asn Thr Lys Met Glu Gln Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg 305 310 315 320 Leu Cys He Asp He Leu Asp Arg Glu Met He Arg Lys Pro Met Ala 325 330 335 Val Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met 340 345 350 Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg Val Ala Phe Ala Arg Leu Phe Phe 355 360 365 Pro Ala Glu Ala Lys Val Ala Met Gln He Ala Gln Ala Asp Thr Thr 370 375 380 .........,., i. -mil-AiM.iii 1... - ...Im .CJMáÁí ?M^mí.MÍ, 33 Pro Glu Phe Gly He Val Pro Ala Ala Ser Thr Ser Gly Lys Leu Lys 385 390 395 400 Glu Val Asp Leu Asn Glu Thr Pro Val Thr Gln Asn Lys Arg Leu Arg 405 410 415 Ser Arg Val Asp Ala Leu Met Lys Thr Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr 420 425 430 Phe Pro Asn Gys Ser Gln Val Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Asp Leu 435 440 445 Pro Asp Ser Pro Asp Ala Leu Asp Leu Gln Asn Gly Thr Ser Asp Glu 10 450 455 460 Gln Asn Val Lys Arg Met Arg Phe Gys Glu Leu Lys Glu Asp Val Arg 465 470 475 480 Lys Ala Phe Ser Lys Asp Arg Ala Asp Asn Ser Met Phe Ser He Leu 485 490 495 15 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Lys Val Ala Lys Lys 500 505 510 <210> 15 <211> 1565 20 <212> ADN <213> Oryza sativa 34 <220> <221> GDS <222> 1) • • (1263! <400> 15 ggc gcc ttc cea cea gct cgg gcg gga ggc ctc ctc ctc ctc ctc ctc 48 Gly Ala Phe Pro Pro Ala Arg Ala Gly Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 ctc gcc gag ctc acc aac ctc ttc cag cgg cgt ctc ctt gat gtc ctt 96 Leu Ala Glu Leu Thr Asn Leu Phe Gln Arg Arg Leu Leu Asp Val Leu 20 25 30 gat aag gtt gaa gta gat aac ctt cta ttg ate tta tet gtt gcc aac 144 Asp Lys Val Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu He Leu Ser Val Ala Asn 35 40 45 tta tgc aac aaa tet tgc atg aaa ctg ctt gaa aga tgc ctt gat atg 192 Leu Gys Asn Lys Ser Gys Met Lys Leu Leu Glu Arg Gys Leu Asp Met 50 55 60 35 gta gtc cgg tca aac ctt gac atg att act ctt gag aag tca ttg cct 240 Val Val Arg Ser Asn Leu Asp Met He Thr Leu Glu Lys Ser Leu Pro 65 70 75 80 cea gat gtt ate aag cag att att gat gca cgc cta age ctc gga tta 288 Pro Asp Val He Lys Gln He He Asp Ala Arg Leu Ser Leu Gly Leu 85 90 95 att tca cea gaa aac aag gga ttt cct aac aaa cat gtg agg agg ata 336 He Ser Pro Glu Asn Lys Gly Phe Pro Asn Lys His Val Arg Arg He 100 105 110 cae aga gcc ctt gac tet gac gat gta gag cta gtc agg atg ctg ctc 384 His Arg Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Arg Met Leu Leu 115 -120 125 act gaa gga cag aca aat ctt gat gat gcg ttt gca ctg cae tac gcc 432 Thr Glu Gly Gln Thr Asn Leu Asp Asp Ala Phe Ala Leu His Tyr Ala 130 135 140 gtc gaa cat tgt gac tec aaa att aca acc gag ctt ttg gat ctc gca 480 Val Glu His Gys Asp Ser Lys He Thr Thr Glu Leu Leu Asp Leu Ala 145 150 155 160 JÉ». áa»»t* 36 ctt gca gat gtt aat cat aga aac cea aga ggt tat act gtt ctt cae 528 Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His 165 170 175 att gct gcg agg cga aga gag cct aaa ate att gtc tec ctt tta acc 576 He Ala Ala Arg 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Met Asp He Ala Gln Val Asp Gly Thr Leu Glu Phe Asn Leu Gly 290 295 300 tet ggt gca aat cea cct cct gaa aga caa cgg aca act gtt gat cta 960 Ser Gly Ala Asn Pro Pro Pro Glu Arg Gln Arg Thr Thr Val Asp Leu 305 310 -. 315 320 aat gaa agt cct ttc ata atg aaa gaa gaa cae tta gct cgg atg acg 1008 Asn Glu Ser Pro Phe He Met Lys Glu Glu His Leu Ala Arg Met Thr 325 330 335 gca ctc tec aaa aca gtg gag ctc ggg aaa cgc ttt ttc ccg cga tgt 1056 Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Gys 340 345 350 38 tcg aac gtg ctc gac aag ate atg gat gat gaa act gat ccg gtt tec 1104 Ser Asn Val Leu Asp Lys He Met Asp Asp Glu Thr Asp Pro Val Ser 355 360 365 ctc gga aga gac acg tec gcg gag aag agg aag agg ttt cat gac ctg 1152 Leu Gly Arg Asp Thr Ser Ala Glu Lys Arg Lys Arg Phe His Asp Leu 370 375 380 cag gat gtt ctt cag aag gca ttc cae gag gac aag gag gag aat gac 1200 Gln Asp Val Leu Gln Lys Ala Phe His Glu Asp Lys Glu Glu Asn Asp 385 390 395 400 agg tcg ggg ctc tcg tcg tcg tcg tca tcg aca tcg 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Gly Ala Asn Pro Pro Pro Glu Arg Gln Arg Thr Thr Val Asp Leu 305 310 315 320 Asn Glu Ser Pro Phe He Met Lys Glu Glu His Leu Ala Arg Met Thr 325 330 335 Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Gys 340 345 350 Ser Asn Val Leu Asp Lys He Met Asp Asp Glu Thr Asp Pro Val Ser 355 360 365 Leu Gly Arg Asp Thr Ser Ala Glu Lys Arg Lys Arg Phe His Asp Leu 370 375 380 Gln Asp Val Leu Gln Lys Ala Phe His Glu Asp Lys Glu Glu Asn Asp 385 390 395 400 Arg Ser Gly Leu Ser Ser- Ser Ser Ser Ser Thr Ser He Gly Ala He 405 410 415 Arg Pro Arg Arg 420 <210> 17 <211> 2446 <212> ADN <213> Triticum aestivum 42 <220> <221> CDS <222> ;148) .. 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(1668) <400> 19 tgtacttgcg agcatttgaa acacataaaa ttacttttga taggttactt aaatatatgc 60 aacttcgatg cagaggctgg ggtaataaaa tcttccattt tctatttttt gaaatacttg 120 ttgacagggc tgtaatcaaa ttgggttaat caatgtatgt gtttgtattc ttaaaatatt 180 acttatcaga ttagaccgtt tatgcgtcta tattcttatc aatccgtatg getgtgtega 240 gacttcggat ttttatgtat tttttagtga tgatatgett tteettetta gctttgtcat 300 actgagattt gtgttttaat aattctgact tegetgeaga tgatttgccc gtgtatcgtt 360 tgatgetaac tctcgtcgac ttgctacttg taacagttct ctattgttct attgtttcat 420 gtttttgaga agcgagtact aacccatgtt atg ccc ttc ttt tec atg cag cgg 474 54 Met Pro Phe Phe Ser Met Gln Arg 1 5 cat ctc ctt gat ttc ctt gat aaa gtt gaa gtg gat aac ctt ccg ttg 522 His Leu Leu Asp Phe Leu Asp Lys Val Glu Val Asp Asn Leu Pro Leu 10 15 20 ate tta tet gtt gca aac tta tgc aac aaa tet tgc gtg aaa ctg ttc 570 He Leu Ser Val Ala Asn Leu Cys Asn Lys Ser Cys Val Lys Leu Phe 25 30 35 40 gag aga tgc atg gag atg gta gtc cgg tca aat ctt gac atg att act 618 Glu Arg Cys Met Glu Met Val Val Arg Ser Asn Leu Asp Met He Thr 45 50 55 cta gag aaa gca ttg cct caa gat gtc ate aag caa att act gat tta 666 Leu Glu Lys Ala Leu Pro Gln Asp Val He Lys Gln He Thr Asp Leu 60 65 70 cgg ata act ctt gga tta gct tca ccc gaa gac aat ggc ttt cct aac 714 Arg He Thr Leu Gly Leu Ala Ser Pro Glu Asp Asn Gly Phe Pro Asn 75 80 85 ^^U|k 55 aaa cae gta aga agg ata ctc aga gca ctt gat tet gat gat gtg gag 762 Lys His Val Arg Arg He Leu Arg Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu 90 95 100 ctt gtc agg atg ctg ctc aca gaa ggg cag act aac ctt gat gat gca 810 Leu Val Arg Met Leu Leu Thr Glu Gly Gln Thr Asn Leu Asp Asp Ala 105 110 115 120 ttt gca ttg cae tat gct gta gaa cae tgt gac tca aaa att aca aca 858 Phe Ala Leu His Tyr Ala Val Glu His Cys Asp Ser Lys He Thr Thr 125 130 135 gaa ctt ctg gac ate gca ctt gcg gat gtt aat ctc aga aac cea aga 906 Glu Leu Leu Asp He Ala Leu Ala Asp Val Asn Leu Arg Asn Pro Arg 140 - 145 150 ggt tat act gtt ctt cae ate gcc gct aag cgg aga gat cct aaa ate 954 Gly Tyr Thr Val Leu His He Ala Ala Lys Arg Arg Asp Pro Lys He 155 160 165 gtt gtc tec ctt tta acc aaa ggt gcc cgg cct tca gat ttt aca ttt 1002 Val Val Ser Leu Leu Thr Lys Gly Ala Arg Pro Ser Asp Phe Thr Phe 170 175 180 56 gat gga aga aaa gca gtt caa ate tca aag aga ctc aca aaa cat ggt 1050 Asp Gly Arg Lys Ala Val Gln He Ser Lys Arg Leu Thr Lys His Gly 185 190 195 200 gat tat ttt ggg aat act gaa gaa gga aag ccg tet ccc aat gat aaa 1098 Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Glu Glu Gly Lys Pro Ser Pro Asn Asp Lys 205 210 215 tta tgc att gag ata ttg gag caa gct gaa aga agg gat cea caa ctt 1146 Leu Cys He Glu He Leu Glu Gln Ala Glu Arg Arg Asp Pro Gln Leu 220 225 230 gga gaa gca tca ctt tet ctt gca ttg gct ggt gac tgt ctt cgt gga 1194 Gly Glu Ala Ser Leu Ser Leu Ala Leu Ala Gly Asp Cys Leu Arg Gly 235 240 245 aag tta ctg tac ctt gaa aac cga gtt gct ttg gca agg ata atg ttt 1242 Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Arg He Met Phe 250 255 260 Í?*ik.?i* i .*..?M.?.c]t. .< ...-». ,*rr- ~*A .--fchl......-.,. „ui.«^ .-titoA-i 57 cea att gag gca aga gta gca atg gac att gct caa gtg gat ggt act 1290 Pro He Glu Ala Arg Val Ala Met Asp He Ala Gln Val Asp Gly Thr 265 270 275 280 ttg gaa ttt acc ctt ggt tet agt aca aat cea cct ctg gag ata aca 1338 Leu Glu Phe Thr Leu Gly Ser Ser Thr Asn Pro Pro Leu Glu He Thr 285 290 295 acc gtt gat ctg aat gat act tet ttc aaa atg aag gag gaa cae tta 1386 Thr Val Asp Leu Asn Asp Thr Ser Phe Lys Met Lys Glu Glu His Leu 300 305 310 gct cgg atg aga gcc ctc tec aaa aca gtt gaa ctc ggc aaa cgt ttc 1434 Ala Arg Met Arg Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe 315 320 325 ttc cea cgc tgt tca aat gtg ctg gac aag ate atg gac gat gaa cct 1482 Phe Pro Arg Cys Ser Asn Val Leu Asp Lys He Met Asp Asp Glu Pro 330 335 340 gag ctg gct tec ctc gga aga gat gca tec tec gag agg aag agg agg 1530 Glu Leu Ala Ser Leu Gly Arg Asp Ala Ser Ser Glu Arg Lys Arg Arg 345 350 355 360 Í^ii.Mi. ..?M? ¡liáMiciííáí¿ M^ -, íitJÉÜt•• -i- j^j-^jtjJt^jjfaj^IBlá ti-J- 58 ttt cae gac ctg caa gat acg ctt ctg aag gcg ttc age gag gac aag 1578 Phe His Asp Leu Gln Asp Thr Leu Leu Lys Ala Phe Ser Glu Asp Lys 365 370 375 gag gag ttt aac aga acg aca acc ctt tca tet tcg tca tcg tcg acg 1626 Glu Glu Phe Asn Arg Thr Thr Thr Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr 380 385 390 tec act gta gca agg aac ttg gca ggt cga act agg aga tga 1668 Ser Thr Val Ala Arg Asn Leu Ala Gly Arg Thr Arg Arg 395 400 405 <210> 20 <211> 405 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 20 Met Pro Phe Phe Ser Met Gln Arg His Leu Leu Asp Phe Leu Asp Lys 1 5 10 15 Val Glu Val Asp Asn Leu Pro Leu He Leu Ser Val Ala Asn Leu Cys 20 25 30 g j^£¿£jdMg gg||^^» 59 Asn Lys Ser Cys Val Lys Leu Phe Glu Arg Cys Met Glu Met Val Val 35 40 45 Arg Ser Asn Leu Asp Met He Thr Leu Glu Lys Ala Leu Pro Gln Asp 50 55 60 Val He Lys Gln He Thr Asp Leu Arg He Thr Leu Gly Leu Ala Ser 65 70 75 80 Pro Glu Asp Asn Gly Phe Pro Asn Lys His Val Arg Arg He Leu Arg 85 90 95 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Arg Met Leu Leu Thr Glu 100 105 110 Gly Gln Thr Asn Leu Asp Asp Ala Phe Ala Leu His Tyr Ala Val Glu 115 120 125 His Cys Asp Ser Lys He Thr Thr Glu Leu Leu Asp He Ala Leu Ala 130 135 140 Asp Val Asn Leu Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His He Ala 145 150 155 160 Ala Lys Arg Arg Asp Pro Lys He Val Val Ser Leu Leu Thr Lys Gly 165 170 175 Ala Arg Pro Ser Asp Phe Thr Phe Asp Gly Arg Lys Ala Val Gln He 180 185 190 Ser Lys Arg Leu Thr Lys His Gly Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Glu Glu 195 200 205 60 Gly Lys Pro Ser Pro Asn Asp Lys Leu Cys He Glu He Leu Glu Gln 210 215 220 Ala Glu Arg Arg Asp Pro Gln Leu Gly Glu Ala Ser Leu Ser Leu Ala 225 230 235 240 Leu Ala Gly Asp Cys Leu Arg Gly Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg 245 250 255 Val Ala Leu Ala Arg He Met Phe Pro He Glu Ala Arg Val Ala Met 260 265 270 Asp He Ala Gln Val Asp Gly Thr Leu Glu Phe Thr Leu Gly Ser Ser 275 280 285 Thr Asn Pro Pro Leu Glu He Thr Thr Val Asp Leu Asn Asp Thr Ser 290 295 300 Phe Lys Met Lys Glu Glu His Leu Ala Arg Met Arg Ala Leu Ser Lys 305 310 315 320 Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Asn Val Leu 325 330 335 Asp Lys He Met Asp Asp Glu Pro Glu Leu Ala Ser Leu Gly Arg Asp 340 345 350 Ala Ser Ser Glu Arg Lys Arg Arg Phe His Asp Leu Gln Asp Thr Leu 355 360 365 Leu Lys Ala Phe Ser Glu Asp Lys Glu Glu Phe Asn Arg Thr Thr Thr 370 375 380 61 Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Val Ala Arg Asn Leu Ala 385 390 395 400 Gly Arg Thr Arg Arg 405

Claims (22)

100 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica de una planta monocotiledónea que es homologa del gen NIM1 .

2. Una molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende : (a) una secuencia nucleotídica que codifica para la SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20; (b) SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19; (c) una secuencia nucleotídica que comprende una porción de al menos 20 pares de bases consecutivos idéntica en secuencia a una porción de al menos una porción de 20 pares de bases consecutivos de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19; (d) una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de planta monocotiledónea utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6; 101 (e) una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de Oryza sa ti va utilizando la reacción en cadena de la polimerása con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6; (f) una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de Tri ti cum aes tivum utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6; (g) una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de una planta monocotiledónea utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con un par de cebadores, que comprenden los primeros 20 nucleótidos y el complemento inverso de los últimos 20 nucleótidos dé la secuencia codificadora (CDS) de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19; o (h) una secuencia nucleotídica que se hibrida al complemento de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19 bajo condiciones de hibridación y lavado estrictas.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20. i t ¡ jrf t.yjlf -||¡ I JJ g)j¡l,fa?lil-fa?k^..-J.~.^^ .-¡> -,a. .„..^...¡r;,,. t* k.íti i„ 102

4. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19.

5. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que comprende la porción de al menos 20 pares de bases consecutivos idéntica en secuencia a una porción de al menos 20 pares de bases consecutivos de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19.

6. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de planta monocotiledónea utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6."

7. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de Oryza sa tiva utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6.

8. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque 103 comprende una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de Tri ti cum aes tivum utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6.

9. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que puede ser amplificada de una biblioteca de ADN de planta monocotiledónea utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con un par de cebadores correspondientes a los primeros 20 nucleótidos y el complemento inverso de los últimos 20 nucleótidos de la secuencia codificadora (CDS) de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19.

10. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que se hibrida al complemento de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19 bajo condiciones de hibridación y lavado estrictas.

11. Un gen quimérico, caracterizado porque comprende un promotor activo en plantas ligado operativamente a la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. HjÉéÁí . . mJ?m JS> já*klíZ--¿& ., *tMát.J*. . SÍ.M.,1.... «...aaMa._ifaatt 104

12. Un vector recombinante, caracterizado porque comprende el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 11.

13. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 11.

14. Una planta, caracterizada porque comprende el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 13.

15. La planta de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es una planta monocotiledónea.

16. La planta de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es seleccionada de las siguientes: arroz, trigo, cebada, centeno, maíz, papa, cañóla, girasol, zanahoria, camote, remolacha azucarera, frijol, guisantes, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, berenjena, pimiento, apio, calabaza, calabaza anaranjada, pepino, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, durazno, nectarina, chabacano, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, piña, aguacate, papaya, mango, banana, soya, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar .

17. Una semilla, caracterizada porque es de una planta de conformidad con la reivindicación 14.

18. Un método para incrementar la expresión del gen de la RAS en una planta, caracterizado porque comprende íjfa_-.* .-j.k-Jt "-*»»-•-«« 105 expresar el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 11 en la planta.

19. Un método para mejorar la resistencia a enfermedades en una planta, caracterizado porque comprende expresar el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 11 en la planta.

20. Un cebador de PCR, caracterizado porque es la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.

21. Un método para aislar un homólogo de NIM1 implicado en la cascada de transducción de señales que conduce a la resistencia adquirida sistémica en plantas, caracterizado porque comprende amplificar una molécula de ADN de una biblioteca de ADN de planta utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con un par de cebadores correspondientes a los primeros 20 nucleótidos y el complemento inverso de " los últimos 20 nucleótidos de la secuencia codificadora (CDS) de la SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19 o con el par de cebadores expuestos como SEQ ID NO: 3 y 4 o SEQ ID NO: 5 y 6.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la biblioteca de ADN de planta es una biblioteca de ADN de Oryza sa tiva (arroz) o Tri ticum aestivum (trigo) . Homólogos del gen NIM1 Arabidopsis, los cuales son implicados en la cascada de transduccion de señales que conduce a la resistencia adquirida sistemica (RAS), son aislados de cultivos monocotiledoneos tales como Tri ti cum aestivum (trigo) y Oryza sa tiva (arroz). La invención se relaciona ademas con vectores de transformación y procesos para expresar los homólogos de NIM1 de monocotiledoneas en plantas transgenicas para incrementar la expresión del gen de la RAS y mejorar la resistencia a enfermedades de amplio espectro . PA/a/ 200 2 \ S > m