PROTKINAS DE REPRODUCCIÓN DE PLANTAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Esta invención está en el campo de la biolpgia molecular de plantas. Más específicamente, esta invención pertenece a los fragmentos de ácido nucleico que codifican las proteínas para la reproducción en plantas y semillas. Apomixis es la formación de semillas sin fertilización. La formación de semillas en su mayoría en las plantas implica el intercambio de gametos sexuales entre diferentes plantas o dentro de la misma planta, sin embargo, la apomixis ocurre naturalmente especialmente en variedades/especies vegetales poliploides. Se anticipa que el control de la formación de semillas a través de la apomixis tiene un enorme impacto en la agricultura. Generalmente no se ha explotado la apromixis en la agricultura, sin embargo, si la apsmixis pudiera ser controlada en varias siembras ésta puede revolucionar la agricultura ya que pueden ser producidas semillas genéticamente idénticas sin la necesidad de fertilización de gametos. Uno puede visualizar fácilmente la inmortalización de variedades vegetales de siembras de alto rendimiento y la apomixis puede ser explotada por la industria de semillas para reducir los costos de mantenimiento de líneas endogámicas puras. También, la formación de semilla sin la fertilización evita factores que pueden afectar la eficiencia
del grupo de semillas, tales como cuenta de polen y viabilidad del polen, y surgimiento o viabilidad del estigma o borla. La apomixis puede también permitir la incorporación estable media de transgenes sin la necesidad para por sí mismos producir los homocigotos . El uso del gen de endospermo independiente a la fertilización y otros genes relaciones puede ser para formar endospermos independientes a la fertilización sin formar necesariamente embriones viables. Tal semilla puede no germinar ya que no tiene un embrión. El endosperma, si está suficientemente formado, puede sin embargo ser usado para alimento humano y animal y para molido y extracción comercial. Tales semillas sin embrión pueden tener la ventaja agregada de permitir contener los organismos modificados genéticamente para satisfacer cuestiones ambientales y regulatorias. Tales semillas pueden también ser modificadas independientemente para producir productos novedosos en el endosperma tales como farmacéuticos, nutracéuticos y compuestos y polímeros industriales. La identificación de genes específicos implicados en la apomixis, tales como genes de endospermo independientes a la fertilización, puede ofrecer nuevas formas para producir plantas apomicticas. Tales procedimientos pueden implicar la mutagénesis selectiva de genes de endospermo independientes a fertilización y después rastrear los alelos
mutantes en un programa de reproducción (molecular) , o por métodos transgénicos. Por consiguiente, la disponibilidad de las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o una porción de una proteína del endosperma independiente a la fertilización puede facilitar los estudios para entender mejor la regulación de desarrollo en plantas, proporcionar herramientas genética para controlar la apomixis. La presente invención se relaciona a un polinucleótido aislado el cual comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de: (a) una primera secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de por lo menos 55 aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad a base del método Clustal de alineación cuando se compara con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las SED ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70, o (b) una segunda secuencia de nucleótido la cual comprende el complemento de la primera secuencia de nucleótido. En una segunda modalidad, se prefiere que el polinucleótido asilado de la invención reclamada comprende una primera secuencia de nucleótidos la cual comprende una secuencia de ácido nucleicos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49,
51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67 y 69 que codifica para el polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70. En una tercera modalidad, esta invención se relaciona a un polinucleótido aislado el cual comprende una secuencia de nucleótido de por lo menos uno de 60 (preferentemente por lo menos uno de 40, más preferentemente por lo menos uno de 30) nucleótidos contiguos derivados a partir de una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67 y 69 y el complemento de tales secuencias de nucleótido. En una cuarta modalidad, esta invención se relaciona a un gen quimérico el cual comprende un polinucleótido aislado de la presente invención enlazado operablemente a por lo menos una secuencia regulataria adecuada. En una quinta modalidad, la presente invención se relaciona a una célula huésped aislada la cual comprende un gen quimérico de la presente invención o un polinucleótido aislado de la presente invención. La célula huésped puede ser eucariótica, tal como una célula de levadura o vegetal, o
procariótica, tal como una célula bacteriana. La presente invención se relaciona también a un virus, preferentemente un baculovirus, el cual comprende un polinucleótido aisladq de la presente invención o un gen quimérico de la presente invención. En una sexta modalidad, la invención también se relaciona a un proceso para producir una célula huésped aislada la cual comprende un gen quimérico de la presente invención o un polinucleótido aislado de la presente invención, el proceso comprende tanto transformar o transfectar una célula huésped compatible aislada con un gen quimérico o un polinucleótido aislado de la presente invención . En una séptima modalidad, la invención se relaciona a un polipéptido de proteína de endospermo independiente a la fertilización de por lo menos 55 aminoácidos el cual comprende por lo menos 80% de identidad en base al método Clustal de alineación comparado con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70. En una octava modalidad, esta invención se relaciona a un método para seleccionar un polinucleótido aislado que afecta el nivel de expresión de un polipéptido de
proteína de endospermo independiente a la fertilización o una actividad enzimática en una célula huésped, preferentemente una célula vegetal, el método que comprende las etapas de: (a) construir un polihucleótido aislado de la presente invención o un gen quimérico aislado de la presente invención; (b) introducir el polinucleótido aislado o el gen quimérico aislado en una célula huésped; (c) medir el nivel del polipéptido de proteína de endospermo independiente a la fertilización o actividad enzimática en la célula huésped que contiene el polinucleótido aislado; y (d) comparar el nivel del polipéptido de proteína de endospermo independiente a la fertilización o actividad enzimática en la célula huésped que contiene el polinucleótido aislado con el nivel del polipéptido de proteína de endospermo independiente a la fertilización o actividad enzimática en la célula huésped que no contiene el polinucleótido aislado. En una novena modalidad, la invención se relaciona a un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción substancial de un polipéptido de endospermo independiente a la fertilización, preferentemente un polipéptido de endospermo independiente a la fertilización vegetal, el cual comprende las etapas de: sintetizar un cebador de oligonucleótido el cual comprende una secuencia de nucleótido de por lo menos uno de 60 (preferentemente por lo menos uno de 40, más preferentemente por lo menos uno de 30)
nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidoß seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67 y 69, y el complemento de tales secuencias de nucleótido; y amplificar un fragmento de ácido nucleico (preferentemente un ADNc insertado en un vector de clonación) usando el cebador de nucleótido. El fragmento del ácido nucleico amplificado preferentemente codificará una porción substancial de una secuencia de aminoácidos de proteína de endospermo independiente a la fertilización. En una décima modalidad, esta invención se relaciona a un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica toda o una porción substancial de la secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de endospermo independiente a la fertilización que comprende las etapas de: sondear un ADNc o una biblioteca genómica con un polinucleótido aislado de la presente invención; identificar un clon de ADN que se hibridiza con un polinucleótido aislado de la presente invención; aislar el clon de ADN identificado; y secuenciar el ADNc o fragmento genómico que comprende el clon de ADN aislado. En una decimoprimera modalidad, esta invención se relaciona a una composición, tal como una mezcla de hibridización, la cual comprende un polinucleótido aislado de
la presente invención. En una decimosegunda modalidad, esta invención se relaciona a un método para la selección positiva de una célula transformada que comprende: (a) transformar una célula huésped con el gen quimérico de la presente invención o un cásete de expresión de la presente invención; y (b) hacer crecer la célula huésped transformada, preferentemente una célula vegetal, tal como una monocotiledónea o dicotiledónea, bajo condiciones las cuales permiten la expresión del polinucleótido del endospermo independiente a la fertilización en una cantidad suficiente para complementar un mutante nulo para proporcionar un medio de selección positivo. En una decimotercera modalidad, esta invención se relaciona a un método para alterar el nivel de expresión de una proteína de reproducción en una célula huésped que comprende: (a) transformar una célula huésped con un gen quimérico de la presente invención; (b) hacer crecer la célula huésped transformada bajo condiciones las cuales son adecuadas para la expresión del gen quimérico en donde la expresión del gen quimérico resulta en la producción de niveles alterados de la proteína de reproducción en la célula huésped transformada. Una decimocuarta modalidad, se relaciona a un polinucleótido cromosomal aislado de la invención reclamada
la cual comprende: (a) una primera secuencia de nucleóeitod seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 71 y 72 ó (b) una segunda secuencia de nucleótido la cual comprende el complemento de la primera secuencia de nucleótido. BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIA La invención puede ser más totalmente entendida a partir de la siguiente descripción detallada y el Listado de Secuencia anexo la cual forma parte de esta solicitud. La Tabla 1 enlista los polipéptidos que se describen en la presente, la designación de los clones de
ADNc y las secuencias cromosomales que comprenden los fragmentos de ácido nucleico que codifican los polipéptidos que representan toda o una porción substancial de eptos polipéptidos, y el identificador correspondiente (SEQ ID fíO:) como se usa en el Listado de Secuencia anexo. Las descripciones de la secuencias y el listado de secuencia anexos a la presente cumplen con las reglas que gobiernan las descripciones de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos en las solicitudes de patente como se indica en 37 C.F.R. Se 1.821-1.825. TABLA 1 Proteínas de reproducción y polinucleótidos Proteína Designación del SEQ ID NO: clon (Nucleótido) (aminoácido)
Proteína de Ccase-b.pk0026.g4 1 2
endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de Cení .mnOOOl . glO endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de cen3n.pk0076. b8 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de cpblc.pkOOl . dlO endospermo (FIS) independiente a la fertilización Proteína de eeclc.pk003.e23 10 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de hlplc.pk003.38 11 12
endospermo (FIS) independiente a la fertilización Proteína de nes .pk0019. h3 (CGS) 13 14 endospermo independiente a la fertilización Proteína de p0003. cgpfn34f (EST) 15 16 endospermo independiente a la fertilización Proteína de p0003. cgped29rb 17 18 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de p0037. crwao47r 19 20 endospermo (FIS) independiente a la fertilización Proteína de p0041. crta 93r 21 22
endospermo (FIS) independiente a la fertilización Proteína de pOlOl . cgamg48r 23 24 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de p010 . cabbn62r 25 26 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de p0107. cbcai79r 27 28 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de p0119. cmtoh49r 29 30 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de p0120. cdebd48r 31 32
endospermo (FIS) independiente a la fertilización Proteína de rcallc.pkOOOl . d2 33 34 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de ses2w.pk0015.bl0 35 36 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de wkmlc.pk0003. f4 37 endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de ccase-b.pk0026. g4 39 40 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteina de cení .mnOOOl . glO 41 42
endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de cpblc-pkOOl . dlO 43 44 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de eeclc-pk003. e23 45 46 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de hlplc.pk003. e8 47 48 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de nes .pk0019. h3 (EST) 49 50 endospermo independiente a la fertilización Proteina de p0003. cgpfn34rb 51 52
endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de p0003. cgped29rb 53 54 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de p0037. crwao47r 55 56 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de p0041. crtaw93r 57 58 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de p0104. cabbn62r 59 60 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de p0107. cbcai79r 61 62
endospermo (CGS) independiente a la fertilización Proteína de p0120. cdebd48r 63 64 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de rcallc-pkOOOl . d2 65 66 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de ses2w.pk0015.bl0 67 68 endospermo independiente a la fertilización Proteína de wkmlc.pk0003. f 69 70 endospermo (EST) independiente a la fertilización Proteína de Secuencia genómica 71
endospermo para ZmFIE-B independiente a la fertilización Proteína de Secuencia genómica 72 endospermo para ZmFIE-A independiente a la fertilización Las SED ID NO: 71 y 72 representan dos genes diferentes . El Listado de Secuencia contiene el código de una letra para los caracteres de secuencia de nucleótidos y el código de tres letras para los aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de IUPAC-IÜBMB descritos en Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) y en el Biochemical J. 219 (No. 2) : 345-373 (1984) los cuales se incorporan en la presente para referencia. Los símbolos y el formato usados para los datos de secuencia de nucleótidos y aminoácidos cumplen con las reglas indicadas en 37 C.F.R. & 1.822. En el contexto de esta descripción, pueden ser utilizados una variedad de términos. Los términos "polinucleótido", "secuencia de polinucleótidos", "secuencia de ácido nucleico" y "fragmento de ácido nucleico"/"fragmento de ácido nucleico aislado" se usan intercambiablemente en la
presente. Estos términos comprenden las secuencias de nucleótidos y similares. Un polinucleótido puede ser un polímero del ARN o ADN que es una cadena sencilla o doble, que opcionalmente contiene bases de nucleótidos sintéticos, no naturales o alterados. Un polinucleótido en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético o mezclas de los mismos. Un polinucleótido aislado de la presente invención puede incluir por lo menos uno de los 60 nucleótidos contiguos, preferentemente por lo menos uno de los 40 nucleótidos contiguos, más preferentemente por lo menos uno de los 30 nucleótidos contiguos derivados de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 y 72 o el complemento de tales secuencias . El término polinucleótido "aislado" se refiere a un polinucleótido que está substancialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, tales como y no limitadas a otros ADN y ARN cromosomales y extracromosomales . Los polinucleótidos aislados pueden ser purificados a partir de una célula huésped en la cual se presentan naturalmente. Pueden ser usados los métodos de purificación de ácido nucleico convencionales conocidos para los técnicos expertos para obtener los polinucleótidos aislados. El término también
comprende los polinucleótidos recombinantes y los polinucleótidos sintetizados químicamente. El término "recombinante" significa, por ejemplo, que se hace una secuencia de ácidos nucleicos por una combinación artificial de dos segmentos separados de otra forma de la secuencia, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación de los ácidos nucleicos aislados por técnicas de modificación genética. Como se usa en la presente "contig" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se ensambla a partir de dos o más secuencias de nucleótido constituyentes que comparten regiones comunes o de traslape de la homología de secuencia. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de dos o más de los fragmentos de ácido nucleico pueden ser comparadas y alineadas con el fin de identificar secuencias comunes o de traslape. Donde existen secuencias comunes o de traslape entre dos o más fragmentos de ácido nucleico, las secuencias (y de esta forma sus fragmentos de ácido nucleico correspondientes) pueden ser ensambladas en una secuencia de nucleótidos contiguos simple. Como se usa en la presente, "substancialmente similar" se refiere a fragmentos de ácidos nucleicos en donde los cambios en una o más bases de nucleótidos resulta en la substitución de uno o más aminoácidos, pero no afecta las propiedades funcionales del polipéptido codificado por la
secuencia de nucleótidos. "Substancialmente similar" también se refiere a los fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases de nucleótidos no afecta la capacidad del fragmento del ácido nucleico para mediar la alteración de la expresión del gen por silenciar el gen a través de por ejemplo la tecnología de sin sentido o cosupresión. "Substancialmente similar" también se refiere a modificaciones de los fragmentos del ácido nucleico de la presente invención tal como eliminación o inserción de uno o más nucleótidos que no afectan substancialmente las propiedades funcionales de la transcripción resultante pon relación a la capacidad para mediar el silenciamiento o alteración del gen de las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante. Se entiende por lo tanto que la invención comprende más de las secuencias de nucleótido o aminoácidos de ejemplo específicas e incluye equivalentes funcionales de las mismas. Los términos "substancialmente similar" y "substancialmente correspondientes" son usados intercambiablemente en la presente. Los fragmentos de ácido nucleico substancialmente similares pueden ser seleccionados por tamizar los fragmentos de ácidos nucleicos que representan subfragmentos o modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, en donde uno o más nucleótidos se substituyen, eliminan y/o insertan, por su capacidad para
afectar el nivel del polipéptido codificado por el fragmento de ácido nucleico no modificado en una planta o una célula vegetal. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico substancialmente similar que representa por lo menos uno de los 30 nucleótidos contiguos derivados a partir del fragmento de ácido nucleico presente puede ser construido e introducido en una planta o una célula vegetal. El nivel del polipéptido codificado por el fragmento de ácido nucleico no modificado presente en una planta o una célula vegetal expuesto al fragmento de ácido nucleico substancialmente similar pupde entonces ser comparado con el nivel del polipéptido en µna planta o una célula vegetal que no se expone al fragmento de ácido nucleico substancialmente similar. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que la supresión y cosupresión antisentido de la expresión de genes puede ser realizada usando fragmentos de ácido nucleico que representan menos de la región de codificación completa de un gen, y por usar fragmentos de ácido nucleico que no comparten 100% de identidad de secuencia con el gen a ser suprimido. Por otra parte, las alteraciones en un fragmento de ácido nucleico las cuales resultan en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado, pero no afectan las propiedades funcionales del polipéptido codificado, son bien conocidas en la técnica. De esta forma, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido
hidrofóbico, puede ser substituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como la glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como valina, leucina, o isoleucina. Similarmente, los cambios los cuales resultan en la substitución de un residuo cargado negativamente a otro, tal como ácido aspártico por ácido- glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginipa, pueden también ser esperados para producir un producto funcionalmente equivalente. Los cambios de nucleótidos los cuales resultan en la alteración de las porciones N terminal y C terminal de la molécula del polipéptido puede también no ser esperados para alterar la actividad del polipéptido. Cada una de las modificaciones propuestas está bien dentro de la experiencia de rutina en la técnica, como es la determinación de retención de la actividad biológica de .os productos codificados. Consecuentemente, un polinucleótido aislado el cual comprende una secuencia de nucleótido de por lo menos uno de 60 (preferentemente por lo menos uno de ^0, más preferentemente por lo menos uno de 30) nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 1, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 y 72, y el complemento de tales secuencias de nucleótidos puede ser usado en los métodos para seleccionar
un polinucleótido aislado que afecta la expresión de un polipéptido de endosperma independiente a la fertilización, en una célula huésped. Un método para seleccionar un polinucleótido aislado que afecta el nivel de expresión de un polipéptido en un virus o en una célula huésped (eucaríótica, tal como una planta o levadura, procariótica tal como bacterias) puede comprender las etapas de: construir un polinucleótido aislado de la presente invención o un gen quimérico aislado de la presente invención; introducir el polinucleótido aislado o el gen quimérico aislado en una célula huésped; medir el nivel de un polipéptido o actividad enzimática en la célula huésped que contiene el polinucleótido aislado; y comparar el nivel de un polipéptido o actividad enzimática en la célula huésped que contiene el polinucleótido aislado con el nivel de un polipéptido o actividad enzimática en una célula huésped que no contiene el polinucleótido aislado. Por otra parte, los fragmentos de ácidos nucleicos substancialmente similares pueden ser caracterizados también por su capacidad para hibridizarse. Se proporcionan }os estimados de tal homología por tanto hibridización de ADN-ADN o ADN-ARN bajo condiciones de astringencia como es bien entendido por aquellos expertos en la técnica (Hames a¡nd Higgins, Eds. (1985) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Preqs, Oxford, U.K.). Las condiciones de astringencia pueden ger
ajustadas para tamizar a fragmentos moderadamente similares, tales como las secuencias homologas a partir de organismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares, tales como genes que duplican las enzimas funcionales, a partir de organismos cercanamente relacionados. Los lavados post-hibridización determinan las condiciones de astringencia. Un grupo de condiciones preferidas usa una serie de lavados que inician con 6X SSC, SDS al 0.5% en temperatura ambiente por 15 minutos, después se repite con 2X SSC, SDS al 0.5% en 45°C por 30 minutos, y después se repite dos veces con 0.2X SC, SDS al 0.5% en 50°C,por 30 minutos. Un grupo más preferido de condiciones de astringencia µsa temperaturas superiores en las cuales los lavados son idénticos a aquellos anteriores excepto que la temperatura de los dos lavados finales de 20 minutos en 0.2X SSC, SDS al 0.5% se incrementa a 60 °C. Otro grupo preferido de condiciones altamente astringentes usa dos lavados finales en 0.1X SSC, SDS al 0.1% en 65°c. Pueden ser caracterizados también los fragmentos de ácidos nucleicos substancialmente similares de la presente invención por el por ciento de identidad de las secuencias de aminoácidos que codifican a las secuencias de aminoácidos descritas en la presente, como se determina por los algoritmos empleados comúnmente por aquellos expertos en esta técnica. Los fragmentos de ácidos nucleicos adecuados
(polinucleótidos aislados de la presente invención) codifican polipéptidos que son por lo menos aproximadamente 70% idénticos, preferentemente por lo menos aproximadamente 80% idénticos a las secuencias de aminoácidos reportadas en la presente. Los fragmentos de ácidos nucleicos preferidos codifican secuencias de aminoácidos que son aproximadamente 85% idénticas a las secuencias de aminoácidos reportadas en la presente. Los fragmentos de ácidos nucleicos más preferidos codifican secuencias de aminoácidos que son por lo menos aproximadamente 90% idénticas a las secuencias de aminoácidos reportadas en la presente. Son más preferidos los fragmentos de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que son por lo menos aproximadamente 95% idénticas a las secuencias de aminoácidos reportadas en la presente. Los fragmentos de ácidos nucleicos adecuados no solamente tienen las identidades anteriores sino codifican típicamente un polipéptido que tiene por lo menos 50 aminoácidos, preferentemente por lo menos 100 aminoácidos, más preferentemente por lo menos 150 aminoácidos, todavía más preferentemente por lo menos 200 aminoácidos, y más preferentemente por lo menos 250 aminoácidos. Las alineaciones de secuencia y los cálculos de por ciento de identidad se realizan usando el programa Megalign del cuadro de cómputo de bioinformática LASERGEN (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Se realizan múltiples alineaciones de las secuencias
usando el método Clustal de alineación (Higgins and Síjarp (1989) CABIOS: 5:151-153) con los parámetros iniciales (PENALIDAD DE ESPACIO= 10, PENALIDAD DE LONGITUD DE ESPACIO=10) . Los parámetros iniciales para las alineaciones de modo de par usando el método Clustal son KTUPLE 1, PENALIDAD DE ESPACIO=3, VENTANA=5 y DIAGONALS SAVED=5. Una "porción substancial" de una secuencia de aminoácidos o nucleótido comprende una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que es suficiente para producir la identificación putativa de la proteína o gen que comprende la secuencia de aminoácidos o nucleótidos . Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos pueden ser evaluadas tapto manualmente por un experto en la técnica, o por usar comparación de secuencia a base de computadora y herramientas de identificación que emplean algoritmos tales como BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol.. 215 : 403-4^0; véase también ww . ncbi . nlm. nih . gov/BLAST) . En general, es necesaria una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos contiguos con el fin de identificar putativamente un polipéptido o secuencia de ácidos nucleicos como homólogos para una proteína o gen conocidos. Por otra parte, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicos a genes que comprencen 30 ó más nucleótidos contiguos pueden ser usadas en los
métodos dependientes a secuencia para identificación (por ejemplo, hibridización Southern) y aislamiento de genes (por ejemplo, hibridización in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófagos) . Además, pueden ser usados oligonucleótidos cortos de 12 ó más nucleótidos como cebadores de amplificación en PCR con el fin de obtener un fragmento de ácido nucleico particular el cual comprende una secuencia de nucleótido que producirá una identificación y7o aislamiento específicos de un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente especificación enseña secuencias de aminoácidos y nucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden una o más proteínas vegetales particulares. El técnico experto, que tiene el beneficio de las secuencias como se reportan en la presente, puede usar ahora toda o una porción substancial de las secuencias descritas para propósitos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por consiguiente, la presente invención comprende las secuencias completas como se reporta en el Listado de Secuencia anexo, así como también las porciones substanciales de aquellas secuencias como se definen anteriormente. "Degeneración de codón" se refiere a la divergencia en el código genético la cual permite variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar .la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. Por consiguiente, la presente invención se relaciona a cualquier fragmento de
ácido nucleico el cual comprende una secuencia de nucleótido que codifica todas o una porción substancial de .as secuencias de aminoácidos indicadas en la presente. El técnico experto está bien consciente de la "desviación de dobles" exhibida por una célula huésped específica en uso de codones de nucleótido para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un fragmento de ácido nucleico para expresión mejorada en una célula huésped, es deseable diseñar el fragmento de ácido nucleico de tal forma que su frecuencia de uso de codón se aproxima a la frecuencia de uso de codón preferido de la célula huésped. Los "fragmentos de ácidos nucleicos sintéticos" pueden se ensamblados a partir de bloques de construcción de oligonucleótidos que son sintetizados químicamente usando procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos bloques de construcción son ligados y destemplados para formar fragmentos de ácidos nucleicos más largos los cuales pueden entonces ser ensamblados enzimáticamente para construir el fragmento de ácido nucleico deseado completo. "Sintetizado químicamente", como se relaciona a un fragmento de ácido nucleico, significa que los nucleótidos componentes son ensamblados in vitro. La síntesis química manual de fragmentos de ácidos nucleicos puede ser realizada usando procedimientos bien establecidos, o la síntesis química automatizada puede ser realizada usando una de una variedad
de máquinas comercialmente disponibles. Por consiguiente, los fragmentos de ácidos nucleicos pueden ser hechos a la medida para expresión óptima de genes en base a la optimización de la secuencia de nucleótidos para reflejar la desviación de codones de la célula huésped. El técnico experto aprecia la probabilidad de la expresión exitosa de genes si el uso de codones es desviado hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. La determinación de los codones preferidos puede ser basada en una sobrevivencia de genes derivados de la célula huésped donde está disponible la información de secuencia. "Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, lo cual incluye secuencias regulatorias ' que preceden (secuencias no codificantes 5') y siguen (secuencias no codificantes 3') a la secuencia de codificación. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias regulatorias. "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, el cual compre?de secuencias regulatorias y de codificación que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias regulatorias y secuencias de codificación que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias regulatorias y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero dispuestas en una forma diferente que la encontrada en la naturaleza. "Gen
endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un "gen extraño" se refiere, a un gen no encontrado normalmente en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo por transferencia de genes. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos un "transgen" es un gen que se ha introducido en el genoma por un procedimiento de transformación. "Secuencia de codificación" se refiere a una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias regulatorias" se refiere a las secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro, o corriente abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia de codificación, y las cuales influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias regulatorias pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, y secuencias de reconocimiento d poliadenilación. "Promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. En general, se ubica una secuencia de codificación 3' a una secuencia promotora. a secuencia promotora consiste de elementos corriente arriba
próximos y más distales, los últimos elementos con frecuencia referidos como incrementadores. Por consiguiente, un "incrementador" es una secuencia de nucleótidos la cual puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para incrementar el nivel o especificidad a tejido de un promotor. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad a partir de un gen nativo, o pueden estar compuestos de diferentes elementos derivados de promotores diferentes encontrados en la naturaleza, o pueden incluso comprender segmentos de nucleótido sintético. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores los cuales provocan que un fragmento de ácido nucleico sea expresado en la mayoría de los tipos celulares la mayoría de las veces son referidos comúnmente como "promotores constitutivos". Los nuevos promotores de varios tipos útiles en células vegetales son constantemente descubiertos; pueden ser encontrados numerosos ejemplos en la compilación de Okamuro y Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Se reconoce además que ya que en la mayoría de los casos no han sido completamente definidos los límites exactos de las secuencias regulatorias, pueden tener actividad de promotor idéntica los
fragmentos de ácidos nucleicos de diferentes longitudes. "Secuencia líder de traducción" se refiere a la secuencia de nucleótidos ubicada entre _la secuencia promotora de un gen y la secuencia de codificación. La secuencia líder de traducción está presente en el ARNm totalmente procesado corriente arriba de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar procesar la transcripción primaria para ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficiencia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias líder de traducción (Turner and Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236). Las "secuencias no codificantes 3'" se refieren a las secuencias de nucleótidos ubicadas corriente debajo de una secuencia de codificación e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales regulatorias capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión de genes. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente por afectar la adición de tractos del ácido poliadenílico al extremo 3 ' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias no codificantes 3' se ejemplifica por Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-680. "transcripción de ARN" se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada por la ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando la transcripción de ARN es
una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se refiere como la transcripción primaria o puede ser una secuencia de ARN derivada a partir del procesamiento post transcripción de la transcripción primaria y se refiere como el ARN maduro. "ARN mensajero" (ARNm) se refiere al ARN que no tiene intrones y que puede ser ' traducido en polipéptido por la célula. "ADNc" se refiere al ADN que es complementario a y derivado a partir de un templado de ARNm. El ADNc puede ser una cadena simple o convertido a la forma de doble cadena usando, por ejemplo, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. "ARN sentido" se refiere a una transcripción de ARN que incluye el ARNm y puede así ser traducido en un polipéptido por la célula. "ARN antisentido" se refiere a una transcripción de ARN que es complementaria a toda o parte de una transcripción primaria objetivo o ARNm y que bloquea la expresión de un gen objetivo (véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,107,065, incorporada en la presente para referencia) . La complementaridad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte de la secuencia de nucleótidos específica, es decir, en la secuencia no codificante 5', la secuencia no codificante 3", intrones, o la secuencia de codificación. "ARN funcional" se refiere a ARN sentido, ARN antisentido, ARN de ribozima, u otro ARN que puede no ser traducido pero aún tiene un efecto en los procesos celulares. El término "enlazado operablemente" se refiere a la
asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un polipéptido sencillo de tal forma que la función de uno se afecta por el otro. Por ejemplo, un promotor se enlaza operablemente con una secuencia de codificación cuando es capaz de afectar la expresión de aquella secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación pueden ser enlazadas operablemente a las secuencias regulatorias en la orientación con sentido o antisentido. El término "expresión", como se usa en la presente, se refiere a la transcripción y la acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivada del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión puede per referida también a la traducción de ARNm en un polipéptido. La "inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcripciones de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína objetivo. La "sobreexpresión" se refiere a la producción de un producto de gen en organismos transgénicos que excede los niveles de producción en organismos normales o no transformados. La "cosupresión" se refiere a la producción de transcripciones de ARN con sentido capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos substancialmente similares (Patente de los Estados Unidos No. 5,231,020, incorporada en la presente para
referencia) . Una "proteína" o "polipéptido" es una cadena de aminoácidos dispuestos en un orden específico determinado por la secuencia de codificación en un polinucleótido que codifica el polipéptido. Cada proteína o polipéptido tiene una función única. • "Niveles alterados" o "expresión alterada" se refiere a la producción del producto de gen en organismos transgénicos en cantidades o proporciones que difieren de aquellas de los organismos normales o no transformados. "mutante nulo" se refiere en la presente a una célula huésped la cual tanto carece de la expresión de un cierto polipéptido o expresa un polipéptido el cual es inactivo o no tiene ninguna función enzimática esperada detectable. "Proteína madura" o el término "maduro" cuando se usa para describir una proteína se refiere a un polipéptido procesado post traducción; es decir, una a partir de la cual se han eliminado cualesquiera pero o propéptidos presentes en el producto de traducción primaria. "Proteína precursora" o el término "precursor" cuando se usa para describir una proteína se refiere al producto primario de traducción de ARNm; es decir, con pre y propéptidos todavía presentes. Los pre y propéptidos pueden ser pero no se limitan a señales de ubicación intracelular.
Un "péptido de tránsito de cloroplasto" es una secuencia de aminoácidos la cual se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al cloroplasto u otros tipos de plástidos presentes en la célula en la cual se hace la proteína. "Secuencia de tránsito de cloroplasto" se refiere a una secuencia de nucleótido que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto. Un "péptido de señal" es una secuencia de aminoácidos la cual se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeeis (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53). Si la proteína se dirige a una vacuola, puede ser agregada además una señal de objetivación vacuolar (spra) , o si es para el retículo endoplasmático, puede ser agregada una señal de retención del retículo endoplasmático (supra) . Si la proteína es para ser dirigida al núcleo, cualquier péptido de señal presente puede ser eliminado y en su lugar se inclµye una señal de ubicación nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632) . "Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, lo cual resulta en una herencia estable genéticamente. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleicos transformados son referidos como organismos "transgénicos". Ejemplos de métodos de transformación de plantas incluyen transformación mediada por
Agrobacterium (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277) y tecnología de transformación acelerada por partículas o "de pistola de genes" (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73; Patente de los Estados Unidos JMo . 4,945,050, incorporada en la presente para referencia). De esta forma, los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden ser incorporados en construcciones recombinantes, típicamente construcciones de ADN, capaces de introducción dentro y replicación de una célula huésped. Tal construcción puede ser un vector que incluye un sistema de replicación y secuencias que son capaces de transcripción y traducción de una secuencia que codifica un polipéptido en una célula huésped dada. Un número de vectores adecuados para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas han sido descritos en, por ejemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; and Flevin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publisher, 1990. Típicamente, los vectores de expresión vegetal incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcio?al de las secuencias regulatorias 5' y 3' y un marcador dominante seleccionable. Tales vectores de expresión vegetales puede también contener una región regulatoria
promotora (por ejemplo, una región regulatoria que controla la expresión inducible o constitutiva, regulada ambiental o desarrolladamente, específica a célula o tejido), un sitio de inicio de transcripción, un sitio de enlace de riboso a, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de transcripción, y/o una señal de poliadenilación. Las técnicas de clonación molecular y ADN recombinante estándar usadas en la presente son bien conocidas en la técnica y se describen más totalmente en Sambrook et al. Moleclar Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (posteriormente en la presente "Maniatis") . "PCR" o "reacción de cadena polimerasa" es bien conocida por aquellos expertos en la técnica como una técnica usada para la amplificación de segmentos de ADN específicos (Patentes de los Estados Unidos No. 4,683,195 y 4,800,159). La presente invención se relaciona a un polinucleótido aislado el cual comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una primera secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de por lo menos 55 aminoácidos que tienen por lo menos 80% de identidad en base al método Clustal de alineamiento comparado con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2 , 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 6,
58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70, o (b) una segunda secuencia de nucleótidos que comprende el complemento de la primera secuencia de nucleótidos. La presente invención también se relaciona a un polinucleótido aislado el cual comprende una secuencia de nucleótido cromosomal seleccionada del grupo que consiste de:
(a) un primer nucleótido que tiene por lo menos 80% de identidad en base al método Clustal de alineación cuando se compara con una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 71 y/o (b) una segunda secuencia de nucleótidos que comprende el complemento de la primera secuencia de nucleótidos. Preferentemente, la primera secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 1 , 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67 y 69 que codifica para el polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70. Se han aislado e identificado los fragmentos de ácidos nucleicos que codifican por lo menos una porción de varias proteínas de reproducción para la comparación de secuencias de ADNc vegetal aleatorio a bases de datos
públicas las cuales contienen secuencias de nucleótidos, y proteínas que usan algoritmos BLAST bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser usados para aislar ADNc y genes que codifican proteínas homologas a partir de los mismos u otras especies vegetales. El aislamiento de los genes homólogos que usan protocolos dependientes a secuencia es bien conocido en la técnica. Ejemplos de protocolos dependientes a secuencia incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridización de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ADN y ARN como se ejemplifica por varios usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, reacción de cadena polimerasa, reacción de cadena ligasa) . Por ejemplo, los genes que codifican otras proteínas de endospermo independiente a la fertilización, tanto como ADNc o ADN genómico, pueden se aislados directamente por usar todos o una porción de los fragmentos de ácidos nucleicos presentes como sondas de hibridización de ADN para tamizar bibliotecas a partir de cualquier metodología la cual emplea plantas deseada bien conocida por aquellos expertos en la técnica. Las sondas de oligonucleótido específicas en base a las secuencias de ácidos nucleicos presentes pueden ser diseñadas y sintetizados por métodos conocidos en la técnica (Maniatis) .
Por otra parte, una secuencia completa puede ser usada directamente para sintetizar sondas de ADN por métodos conocidos por aquellos expertos tales como el etiquetado de ADN de cebador aleatorio, traducción de Nick, técnicas de etiquetado final, o sondas de ARN usando sistemas de transcripción in vitro disponibles. Además, los cebadores específicos pueden ser diseñados y usados para amplificar una parte o toda de las secuencias presentes. Los productos resultantes de la amplificación pueden ser etiquetados directamente durante las reacciones de amplificación o etiquetados después de las reacciones de amplificación, y usados como sondas para aislar ADNc de longitud completa o fragmentos genómicos bajo condiciones de astringencia apropiada. Además, dos segmentos cortos de los fragmentos de ácidos nucleicos presentes pueden ser usados en los protocolos de la reacción de cadena polimerasa para amplificar fragmentos de ácidos nucleicos más largos los cuales codifican genes homólogos a partir de ADN o ARN. La reacción de la cadena polimerasa puede también ser realizada en una biblioteca de fragmentos de ácidos nucleicos clonados en donde la secuencia de un cebador se deriva de los fragmentos de ácidos nucleicos presentes, y la secuencia del otro cebador toma ventaja de la presencia de los tractos de ácido poliadenílico para el extremo 3' del precursor de ARNm
que codifica genes de plantas. Alternativamente, la segunda secuencia de cebador puede ser basada en las secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, el técnico experto puede seguir el protocolo RACE (Forman et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8998-9002) para generar ApNc por usar PCR para amplificar copias de la región entre un solo punto en la transcripción y el extremo 3 ' o 5 ' . L°s cebadores orientados en las direcciones 3 ' y 5 ' pueden ser diseñados a partir de las secuencias presentes. Usando los sistemas RACE 3' o 5' RACE comercialmente disponibles (BR¡p) , pueden ser aislados fragmentos de ADNc 3' o 5' específicos
(Ohara et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5673-5677;
Loh et al. (1989) Science 243:217-220). Los productos generados por los procedimientos RACE 3 ' y 5 ' pueden ser combinados para generar ADNc de longitud completa (Forman a d Martín (1989) Techniques 1:165). Consecuentemente, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos uno de 60 (preferentemente uno de por lo menos 40, más preferentemente uno de por lo menos 30) nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 y 72 y el complemento de tales secuencias de nucleótidos pueden ser usados en tales métodos para obtener
un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción substancial de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido. La presente invención se relaciona a un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción substancial de un polipéptido de endospermo independiente a la fertilización, preferentemente una porción substancial de un polipéptido de endospermo independiente a la fertilización vegetal, el cual comprende las etapas de: sintetizar un cebador de oligonucleótido el cual comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos uno de 60
(preferentemente por lo menos uno de 40, más preferentemente por lo menos uno de 30) nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 1 , 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 70 y 71, y el complemento de tales secuencias de nucleótidos; y amplificar un fragmento de ácido nucleico (preferentemente un ADNc insertado en un vector de clonación) usando el cebador de oligonucleótido. El fragmento de ácido nucleico amplificado preferentemente codificará una porción del polipéptido de endospermo independiente a la fertilización. La disponibilidad de las secuenciad de nucleótidos presentes y aminoácidos deducidos facilita el tamizado
inmunológico de las bibliotecas de expresión de ADNc. Los péptidos sintéticos los cuales representan porciones de las secuencias de aminoácidos presentes pueden ser sintetizados. Estos péptidos pueden ser usados para inmunizar animales para producir anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad para péptidos o proteínas los cuales comprenden las secuencias de aminoácidos. Estos anticuerpos pueden ser usados entonces para tamizar las bibliotecas de expresión de ADNc para aislar clones de ADNc de longitud completa de interés (Lerner (1984) Adv. Immunol. 36:1-34; Maniatis). En otra modalidad, esta invención se relaciona a los virus y células huésped las cuales comprenden tanto los genes quiméricos de la invención como se describe en la presente o un polinucleótido aislado de la invención como se describe en la presente. Ejemplos de células huésped los cuales pueden ser usados para practicar la invención incluyen, pero no se limitan a, levaduras, bacterias y plantas . Como se indicó anteriormente, los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser usados para crear plantas transgénicas en las cuales los polipéptido descritos están presentes en niveles superiores o inferiores que lo normal o en tipos celulares o etapas de desarrollo en los cuales no se encuentran normalmente. Esto puede tener el efecto de alterar la formación de endospermo en aquellas
células . La sobreexpresión de las proteínas de la presente invención puede ser realizada por construir primero un gen quimérico en el cual la región de codificación se enlaza operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en los tejidos deseados en la etapa deseada del desarrollo. El gen quimérico puede comprender secuencias promotoras y secuencias líder de traducción derivadas de los mismos genes. Las secuencias no codificantes 3' que codifican señales de terminación de transcripción pueden también ser proporcionadas. El gen quimérico presente puede comprender también uno o más intrones con el fin de facilitar la expresión de los genes. Pueden ser construidos los vectores de plásmidos los cuales comprenden el polinucleótido aislado presente (o gen quimérico) . La elección del vector de plásmido es dependiente del método que será usado para transformar plantas huésped. El técnico experto está bien consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector de plásmido con el fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped las cuales contienen el gen quimérico. El técnico experto también reconocerá que los diferentes eventos de transformación independientes resultarán en niveles y patrones diferentes de expresión (Jones et al. (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De
Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), y de esta forma que los eventos múltiples deben se tamizados con el fin de obtener líneas que exhiben el nivel y patrón deseado de expresión. Tal tamizado puede ser realizado por análisis Southern de ADN, análisis Northern de expresión de ARNm, análisis Western de expresión de proteínas o análisis fenotípico. Para algunas aplicaciones puede ser útil dirigir los polipéptidos presentes para diferentes comportamientos celulares, o facilitar su secreción a partir de la célula. De esta forma se preveé que el gen quimérico descrito anteriormente puede además ser complementado por dirigir la secuencia de codificación para codificar los polipéptidos presentes con secuencias de objetivación intracelular apropiadas tales como secuencias de tránsito (Keegstra (1989) Cell 56:247-253), secuencias de señal o secuencias que codifican la ubicación del retículo endoplasmático (Chrispeeis (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53), o señales de ubicación nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632) con o sin eliminar secuencias de objetivación que ya están presentes. Mientras que las referencias citadas dan ejemplos de cada una de estas, la lista no es exhaustiva y más señales de objetivación de uso pueden ser descubiertas en el futuro. Puede también ser deseable reducir o eliminar la
expresión de genes que codifican los polipéptidos presentes en plantas para algunas aplicaciones. Con el fin de realizar esto, puede ser construido un gen quimérico diseñado para la cosupresión del polipéptido presente por enlazar un gen o fragmento de gen que codifica aquel polipéptido a lasa secuencias promotoras vegetales. Alternativamente, puede ser construido un gen quimérico diseñado para expresar ARN antisentido para todo o parte del fragmento de ácido nucleico presente por enlazar el gen o fragmento de gen en orientación inversa a las secuencias promotoras vegetales. Tanto los genes quiméricos de cosupresión o antisentido pueden ser introducidos en las plantas por medio de la transformación en donde la expresión de los genes endógenos correspondientes se reduce o elimina. Las soluciones genéticas moleculares para la generación de plantas con expresión alterada de genes tiene una ventaja decidida sobre los procedimientos de reproducción vegetal más tradicionales. Los cambios en los fenotipos vegetales pueden ser producidos por inhibir específicamente la expresión de uno o más genes por inhibición o cosupresión antisentido (Patentes de los Estados Unidos No. 5,190,931, 5,107,065 y 5,283,323). Una construcción antisentido o de cosupresión puede actuar como un regulador negativo dominante de actividad del gen. Mientras que las mutaciones convencionales pueden producir regulación negativa de la
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actividad del gen estos efectos son más probablemente recesivos. La regulación negativa dominante disponible con un procedimiento transgénico puede ser ventajosa a partir de una perspectiva de reproducción. Además, la capacidad para restringir la expresión de un fenotipo específico a los tejidos reproductivos de la planta por el uso de promotores específicos a tejido puede conferir ventajas agronómicas con relación a las mutaciones convencionales las cuales pueden tener un efecto en todos los tejidos en los cuales se expresa ordinariamente el gen mutante. La persona experta en la técnica conocerá que están asociadas consideraciones especiales con el uso de tecnologías antisentido o cosupresión con el fin de reducir la expresión de genes particulares. Por ejemplo, el nivel apropiado de expresión de genes con sentido o antisentido puede requerir el uso de genes quiméricos diferentes los cuales utilizan elementos regulatorios diferentes conocidos para el técnico experto. Una vez que se obtienen las plantas transgénicas por uno de los métodos descritos anteriormente, será necesario tamizar los transgénicos individuales por aquellos que exhiben más efectivamente el fenotipo deseado. Por consiguiente, el técnico experto desarrollará métodos para tamizar grandes números de transformantes. La naturaleza de estas tamizaciones serán generalmente elegidas en bases prácticas. Por ejemplo, se puede tamizar por observar
cambios en la expresión de los genes por usar anticuerpos específicos para la proteína codificada por el gen que se suprime, o se pueden establecer ensayos que miden específicamente la actividad enzimática. Un método preferido será uno el cual permite que sean procesados un gran número de muestras rápidamente, ya que se esperará que un gran número de transformante serán negativos para el fenotipo deseado. En otra modalidad, la presente invención se relaciona a un polipéptido de por lo menos 55 aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad en base al método Clustal de alineación cuando se compara con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste ' de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70. Los polipéptidos presentes (o porciones de los mismos) pueden ser producidos en células huésped heterólogas, particularmente en las células de huéspedes microbianos, y pueden ser usados para preparar anticuerpos para estas proteínas por métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los anticuerpos son útiles para detectar los polipéptidos de la presente invención in situ en células o in vitro en extractos celulares. Las células huésped heterólogas preferidas para la producción de los polipéptidos
presentes son huéspedes microbianos. Los sistemas de expresión microbianos y vectores de expresión que contienen las secuencias regulatorias que dirigen la expresión de alto nivel de proteínas extrañas son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Cualquiera de estos pueden ser usados para construir un gen quimérico para la producción de los presentes polipéptidos. Este gen quimérico puede entonces ser introducido en microorganismos apropiados por medio de la transformación para proporcionar una expresión de alto nivel de las proteínas de reproducción codificadas. Se proporciona un ejemplo de un vector para la expresión de alto nivel de los presentes polipéptidos en un huésped bacteriano (Ejemplo 6) . Todos o una porción substancial de los polinucleótidos de la presente invención pueden también ser usados como sondas para mapear genética y físicamente los genes de los que son parte, y usados como marcadores para rasgos enlazados a estos genes. Tal información puede ser útil en reproducir plantas con el fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Por ejemplo, los fragmentos de ácidos nucleicos presentes pueden ser usados como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) . Las manchas Southern (Maniatis) de ADN genómico vegetal digerido con restricción pueden ser sondeadas con los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención. Los
patrones de bandas resultantes pueden entonces ser sometidos a análisis genéticos usando programas de computación tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1:174-181) con el fin de construir un mapa genético. Además los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser usados para sondear manchas Southern las cuales contienen ADN genómico tratado con endonucleasas de restricción de un grupo de individuales los cuales representan el progenitor y progenie de una cruza genética definida. Se nota la segregación de los polimorfismos de ADN y se usa para calcular la posición de la secuencia de ácidos nucleicos presente en el mapa genético obtenido previamente usando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331) . Se describe la producción y el uso de las sondas derivadas de genes vegetales para uso en mapeo genético en Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol.. Repórter 4:37-41. Publicaciones numerosas describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos usando la metodología indicada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, las poblaciones de intercruza F2, poblaciones de retrocruza, poblaciones reproducidas aleatoriamente, líneas isogénicas cercanas y otros grupos de individuales pueden ser usadas para mapeo. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.
Pueden ser usadas también las sondas de ácidos nucleicos derivadas a partir de las secuencias de ácidos nucleicos por mapeo físico (es decir, colocación de las secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel et al., In: Nonmammalian Genomic Análisis: A Practical Guide, Academic press 1996, pág. 319-346, y referencias citadas en la misma) . En otra modalidad, las sondas de ácidos nucleicos derivadas de las secuencias de ácidos nucleicos presentes pueden ser usadas en mapeo de hibridización in situó con fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de grandes clones (varios a varios miles de KB; véase Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir el comportamiento de mapeo FISH usando sondas más cortas. Una variedad de métodos a base de amplificaciones de ácidos nucleicos de mapeo genético y físico pueden ser realizados usando las secuencias de ácidos nucleicos presentes. Los ejemplos incluyen amplificación específicos a alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados con PCR (CAPS; Sheffield et al., (1993) Genomics 16:325-332), ligamiento específico a alelo (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080) , reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), mapeo híbrido de radiación
(Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y mapeo de Happy (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res: 17:6795-6807). Para estos métodos, se usa la secuencia de un fragmento de ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para uso en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores es bien conocido por aquellos expertos en la técnica. En los métodos que emplean el mapeo genético a base de PCR, puede ser necesario identificar diferencias de secuencia de ADN entre los progenitores de la cruza de mapeo en la región que corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos presentes. Esto, sin embargo, es generalmente no necesario para métodos de mapeo. La pérdida de función de fenotipos de mutantes puede ser identificada por los clones de ADNc presentes tanto por protocolos de alteración de gen objetivado o por identificar mutantes específicos para estos genes contenidos en una población de maíz que porta mutaciones en todos los posibles genes (Ballinger and Benzer (1989) Proc. Nati. Acad. Sci USA 86:9402-9406; Koes et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci USA 92:8149-8153; Bensen et al. (1995) Plant Cell 7:75-84) . El último procedimiento puede ser realizado en dos formas. Primero, pueden ser usados segmentos cortos de los fragmentos de ácidos nucleicos presentes en los procotolos de reacción de cadena polimerasa junto con un cebador de
secuencia tag de mutación en ADN preparados a partir de una población de plantas en las cuales se han introducido transposones de mutantes o algún otro elemento de ADN que provoca una mutación (véase Bensen, supra) . La amplificación de un fragmento de ADN específico con estos cebadores indica la inserción del elemento tag de mutación en o cerca al gen vegetal que codifica los polipéptidos presentes. Alternativamente, el fragmento de ácido nucleico presente puede ser usado como una sonda de hibridización contra los productos de amplificación de PCR generados a partir de la población de mutación usando el cebador de secuencia tag de mutación junto con un cebador de sitio genómico arbitrario, tal como aquel para un adaptador sintético anclado a un sitio de la enzima de restricción. Con cualquier método, una planta que contiene una mutación en el gen endógeno el cual codifica los polipéptidos presentes puede ser identificada y obtenida. Esta planta mutante puede ser usada entonces para determinar o confirmar la función natural de los polipéptidos presentes descritos en la presente. EJEMPLOS La presente invención se define además en los siguientes ejemplos, en los cuales las partes y porcentajes son en peso y los grados con Celsius, a menos que se establezca otra cosa. Debe ser entendido que estos ejemplos, mientras que indican modalidades preferidas de la invención,
se dan para forma de ilustración solamente. A partir de la discusión anterior y estos ejemplos, un experto en la técnica puede establecer las características esenciales de esta invención, y sin alejarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. De esta forma, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción mencionada anteriormente. Tales modificaciones son propuestas también para caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . La descripción de cada referencia indicada en la presente se incorpora para referencia en su totalidad. EJEMPLO 1 Composición de bibliotecas de ADNc; Aislamiento y secuenciación de clones de ADNc Se preparan las bibliotecas de ADNc las cuales representan los ARNm a partir de varios tejidos de catalpa, eucalipto, maíz, arroz, fríjol de soya, girasol y trigo. Se describen a continuación las características de las bibliotecas. TABLA 2 Bibliotecas de ADNc a partir de catalpa, maiz, eucalipto, arroz, frijol de soya, girasol y trigo
Biblioteca Tejido Clon ccase-b Callo de maíz, embrión ccase-b. pk0026. g4 somático formado, cení Endospermo de maíz 10 a 11 cení .mnOOOl . glO días después de la polinización* cen3n Endospermo de maíz 20 días cen3n.pk0076.b8 después de la polinización* cpblc BMS agrupado de maíz tratado cpblc.pkOOl . dlO con químicos relacionados al canal de Ca++** eeclc Cápsulas de Eucalyptus eeclc. pk003. e23 tereticornis (flores más viejas, pierden estambres, posiblemente fertilizados) a partir de árboles adultos hlplc Hoja de Helianthus sp. hlplc.pk003. e8 Infectada con fomopsis nes Semilla desarrollada de nes .pk0019.h3 Catalpa speciosa p0003 Raíz de espiga premeiótica de p0003. cgped29rb maíz, 0.2-4 cm p0037 Etapa V5 de maíz***raíces p0037. crwao47r infestadas con gusano de raíz de maíz
p0041 Puntas de raíz de maíz más p0041. crtaw93r pequeñas de 5 mm en longitud cuatro días después de la inhibición pOlOl Sacos de embrión de maíz 4 p0101.cgam.g48r días después de la polinización* p0104 Raíces de maíz V5, infestadas p0104.cabbn62r con gusano de raíz de maíz* p0107 Granos enteros de maíz 7 días p0107. cbcai79r después de la polinización* p0119 Etapa V12 de maíz***raíz de p0119. cmtoh49r espiga con cascara, cosechado de noche* p0120 Endospermo agrupado: 18, 21, p0120. cdebd48r 24, 27 y 29 días después de la polinización* rcallc Callo de la corteza raspada rcallc.pkOOOl .d2 de raíz ses2w Suspensión embriogénica de ses2w.pk0015.bl0 fríjol de soya 2 semanas después del subcultivo wkmlc Grano de trigo malteado 55 wkmlc.pk0003. f4 horas en 22 °C *Estas bibliotecas están normalizadas esencialmente como
se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,482,845, incorporada en la presente para referencia. ** Químicos usados incluyen cafeína, BHQ, ácido ciclopiazónico, nifedipina, verapamil, flufenizina-N-2- cloroetano, cloruro de calmidazoilo *** Se explican las etapas de desarrollo en la publicación "How a corn plant develps" de Iowa State
University Coop. Ext. Service Special Report No. 48 reimpreso en Junio de 1993. Pueden ser preparadas las bibliotecas de ADNc por cualquiera de muchos métodos disponibles. Por ejemplo, los
ADNc pueden ser introducidos en vectores de plásmidos por preparar primero las bibliotecas de ADNc en vectores Uni-ZAP™
XR de acuerdo al protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . Las bibliotecas Uni-ZAP™ XR son convertidas en bibliotecas de plásmidos de acuerdo al protocolo proporcionado por Sratagene. Después de la conversión, los insertos de ADNc estarán contenidos en el vector de plásmido pBluescript. Además, los ADNc pueden ser introducidos directamente en los vectores Bluescript II SK
(+) precortados (Stratagene) usando la T4 ADN ligasa (New
England Biolabs) , seguido por transfección en células DH10B de acuerdo al protocolo del fabricante (GIBCO BRL Products) .
Una vez que los insertos del ADN están en los vectores de plásmidos, se preparan los ADN de plásmido a partir de
colonias bacterianas recogidas aleatoriamente que contienen los plásmidos pBluescript recombinantes, o las secuencias de ADN de insertos se amplifican por medio de la reacción de cadena polimerasa usando cebadores específicos para secuencias de vectores que flanquean las secuencias de ADNc insertadas. Los ADN de inserto o ADN de plásmido amplificados son secuenciados en reacciones de secuenciación de cebador de tinte para generar secuencias de ADNc parciales (tags de secuencias expresadas o "EST", véase Adams et al., (1991) Science (252:1651-1656). Las EST se analizan usando un secuenciador fluorescente de Perkin Elmer Modelo 377. EJEMPLO 2 Identificación de clones de ADNc Se identifican los clones de ADNc que codifican las proteínas de reproducción por realizar búsquedas BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol.. 215:403-410; véase también www. ncbi . nlm. nih. gov/BLAST) para similitud a secuencias contenidas en la base de datos "nr" BLAST (la cual comprende todas las traducciones GenBank CDS no redundantes, secuencias derivadas de la estructura tridimensional Brookhaven Protein Data Bank, la última liberación principal de la base de datos de la secuencia de proteínas SWISS-PROT, bases de datos EMBL, y DDBJ) . Se analizan las secuencias de ADNc obtenidas en el Ejemplo I por similitud a todas las secuencias de ADN
disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Se traducen las secuencias de ADN en todos los cuadros de lectura y se comparan para similitud con todas las secuencias de proteínas públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTX (Gish and States (1993) Nat. Genet. 3:266-272) proporcionado por NCBI . Para conveniencia, se reporta en la presente como los valores "pLog" el valor P (probabilidad) de observar un acoplamiento de una secuencia de ADNc a una secuencia contenida en las bases de datos buscadas simplemente por oportunidad como se calcula por BLAST, los cuales representan el negativo del logaritmo del valor P reportado. Por consiguiente, a mayor valor pLog, mayor la probabilidad de que la secuencia de ADNc y el "hit" BLAST representen las proteínas homologas. EJEMPLO 3 Caracterización de los clones de ADNc que codifican la proteina de endospermo independiente a la fertilización La búsqueda de BLASTX usando las secuencias EST a partir de clones listados en la Tabla 3 revela similitud de los polipéptidos codificados por los ADNc para proteína de endospermo independiente a la fertilización a partir del identificador No. gi 4567095 de NCBI Arabidopsis thaliana) . Están mostrados en la Tabla 3 los resultados BLAST para EST
individuales ("EST") , las secuencias de los insertos de ADNc completos que comprenden los clones de ADNc indicados ("FIS") , las secuencias de contigs ensambladas a partir de dos o más EST ("Contig") , secuencias de contigs ensamblados de un FIS y uno o más EST ("Contig"*), o secuencias que codifican una proteína completa derivada de un FIS, un contig, o un Fis y PCR ("CGS") . TABLA 3 Resultados BLAST para secuencias que codifican homólogos de polipéptidos para proteina de endospermo independiente a la fertilización de Arabidopsis thaliana Clon Estado Clasificación pLog BLAST para gi4567095 ccase-b. pk0026.g4 EST 23.40 cení.mnOOOl. glO EST 33.60 cpblc.pkOOl.dlO EST 60.15 eeclc. pk003.e23 EST 25.10 hlplc.pk003.e8 EST 54.00 ncs.pk0019.h3 EST 50.40 p0003.cgpfn34rb EST 50.52 p0003.cgped29rb EST 88.70 p0037.crwao47r EST 82.00 p0041.crtaw93r EST 18.00 p0104.cabbn62r EST 20.70 p0107.cbcai79r CGS 133.00
p0101.cgamg48r EST 41.40 rcallc.pkOOOl. d2 EST 80.00 ses2w.pk0015.bl0 EST 89.71 wkmlc. pk0003.f4 EST 33.00 Se determina la secuencia del inserto de ADNc completo en los clones listados en la Tabla 3. Además la secuenciación y búsqueda de la base de datos patentada por
DuPont permite la identificación de otros clones de maíz, arroz, fríjol de soya y/o trigo que codifican proteínas de endosperma independiente a la fertilización. La búsqueda
BLASTX que usa las secuencias EST a partir de los clones enlistados en la Tabla 4 revela similitud de los polipéptidos codificados por los ADNc a la proteína de endospermo independiente a la fertilización a partir del identificador
No. gi4567095 NCBI de Arabidopsis thaliana ) . Están mostrados en la Tabla 4 los resultados de BLAST para EST individuales
("EST") , las secuencias de los insertos de ADNc completos las cuales comprenden los clones de ADNc indicados ("FIS") , las secuencias de contigs ensambladas a partir de dos o más EST
("Contig") , las secuencias de contigs ensambladas a partir de FIS y una o más EST ("Contig"'), o las secuencias que codifican la proteína completa derivada de FIS, un contig, o una FIS y PCR ("CGS") . TABLA 4 Resultados BLAST para secuencias que codifican homólogos de
polipéptidos para la proteina de endospermo independiente a fertilización Clon Estado Clasificación pLog BLAST para gi4567095 ccase-b. pk0026.g4 CGS 155.00 cení.mnOOOl. glO CGS 134.00 cen3n.pk0076.b8 CGS 134.00 cpblc.pk001.dl0 FIS 60.40 eeclc.pk003.e23 CGS 177.00 hlplc.pk003.e8 FIS 49.70 ncs.pk0019.h3 CGS 176.00 p0003.cgpfn34rb EST 54.00 p0003.cgped29rb CGS 148.00 p0037.crwao47r FIS 121.00 p0041.crtaw93r FIS 15.10 p0101.cgamg48r CGS 112.00 p0104.cabbn62r CGS 155.00 p0107.cbcai79r CGS 134.00 p0119.cmtoh49r CGS 155.00 p0120.cdebd48r FIS 40.70 rcallc.pkOOOl. d2 CGS 154.00 sés2w.pk0015.bl0 CGS 167.00 wkmic.pk0003.f4 CGS 155.00 Los datos en la Tabla 5 representan un cálculo del por ciento de identidad de las secuencias de aminoácidos
indicadas en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44,. 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 4 , 66, 68 y 70 y la secuencia de Arabidopsis thaliana . TABLA 5 Por ciento de identidad de secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias de nucleótidos de clones de ADNc que codifican homólogos de polipéptidos para proteina de endosplermo independiente a la fertilización de Arab±dops±s thaliana SEQ ID NO Por ciento de identidad a gi4567095 2 66% 4 57% 6 57% 66% 10 75% 12 70% 14 74% 16 68% 18 64% 20 72% 22 55% 24 62% 26 57% 28 57%
68% 32 49% 34 67% 36 71% 38 67% 40 55% 42 53% 44 70% 46 66% 48 70% 50 65% 52 68% 54 80% 56 79% 58 66% 60 66% 62 58% 64 66% 66 80% 68 79% 70 49% Se realizan las alineaciones de secuencia y cálculos de por ciento de identidad usando el programa
Megalign del cuadro de cómputo de bioinformática LASERGEN
(DNASTAR Inc., Madison, Wl) . Se realizan múltiples
alineaciones de las secuencias usando el método Clustal de alineación (Higgins and Sharp (1989) CABIOS: 5:151-153) con los parámetros iniciales (PENALIDAD DE ESPACIO= 10, PENALIDAD DE LONGITUD DE ESPACIO=10) . Los parámetros iniciales para las alineaciones de modo de par usando el método Clustal son KTUPLE 1, PENALIDAD DE ESPACIO=3, VENTANA=5 y DIAGONALS SAVED=5. Las alineaciones de secuencia y las clasificaciones BLAST y las probabilidad indican que los fragmentos de ácidos nucleicos que comprenden los clones ADNc presentes codifican una porción substancial de una proteína de endosperma independiente a la fertilización. Estas secuencias representan las primeras secuencias de Catalpa, eucalipto, maíz, arroz, fríjol de soya, girasol y trigo que codifican proteínas de endospermo independiente a la fertilización conocidos para el Solicitante. EJEMPLO 4 Expresión de genes quiméricos en células monocotiledóneas Puede ser construido un gen quimérico el cual comprende un ADNc que codifica los polipéptidos presentes en orientación con sentido con respecto al promotor zein de 27 kD de maíz que se ubica 5' al fragmento de ADNc, y el extremo 3' zein de 10 kD el cual se ubica 3' al fragmento de ADNc. El fragmento de ADNc de este gen puede ser generado por la reacción de la cadena polimerasa (PC) del clon de ADNc usando los cebadores de oligonucleótído apropiados. Pueden ser
incorporados los sitios de clonación (Ncol o Smal) en los oligonucleótidos para proporcionar orientación apropiada del fragmento de ADN cuando se inserta en el vector digerido pML103 como se describe posteriormente. Se realiza entonces la amplificación en una PCR estándar. EL ADN amplificado es entonces digerido con las enzimas de restricción Ncol y Smal y se fracciona en un gel de agarosa. Puede ser aislada la banda apropiada a partir del gel y se combina con un fragmento Ncol-Smal de 4.0 kb del plásmido pML103. Se ha depositado el plásmido pML103 bajo los términos del Tratado de Budapest en ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209) , y porta el número de acceso ATCC 97366. El segmento de ADN a partir de pML103 contiene un fragmento de promotor Sall-Ncol de 1.05 kb del gen zein de 27 kD de maíz y un fragmento Smal-Sall de 0.96 kb a partir del extremo 3' del gen zein de 10 kD de maíz en el vector pGem9Z (+) (Promega). Pueden ser ligados el vector y el ADN de inserto en 15°C durante la noche, esencialmente como se describe (Maniatis) . El ADN ligado puede entonces ser usado para transformar E. coli XLl-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue™, Stratagene) . Los transformantes bacterianos pueden ser tamizados por digestión de enzima de restricción del ADN de plásmido y el análisis de secuencia de nuclóeitods limitada usando el método de terminación de cadena dideoxi (Sequenase™ DNA Sequencing Kit; U.S. Biochemical). La construcción de
plásmido resultante puede comprender un gen quimérico el cual codifica, en la dirección 5' a 3', el promotor zein de 27 kD de maíz, un fragmento de ADNc que codifica los polipéptidos presentes, y la región 3' de zein de 10 kD. El gen quimérico descrito anteriormente puede entonces ser introducido en las células de maíz por el siguiente procedimiento. Los embriones de maíz inmaduros pueden ser diseccionados a partir de cariopsis en desarrollo derivadas le las cruzas de las líneas de maíz endogámica H99 y LH132. Se aislan los embriones 10 a 11 días después de la polinización cuando tienen 1.0 a 1.5 mm de longitud. Se colocan entonces los embriones con la cara del lado del eje hacia abajo y en contacto con el medio N6 solidificado de agarosa (Chu et al. (1975) Sci. Sin . Peking 18:659-668). Se mantienen los embriones en la oscuridad en 27 °C. El callo embriogénico friable el cual consiste de masas indiferenciadas de células con proembrioides o embrioides somáticos portados en estructuras suspensoras prolifera a partir del escutelo de estos embriones inmaduros. El callo embriogénico aislado a partir de la explanta primaria puede ser cultivado en medio N6 y subcultivado en este medio cada 2 a 3 semanas. El plásmido p35S/Ac (obtenido a partir del Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) puede ser usado en los experimentos de transformación con el fin de
proporcionar un marcador seleccionable. Este plásmido contiene el gen Pat (véase la Publicación de Patente Europea 0 242236) el cual codifica la fosfinotricin acetil transferasa (PAT) . La enzima PAT confiere resistencia a los inhibidores de la glutamina sintetasa herbicida tales como la fosfinotricina. El gen pat en p35S/Ac está bajo el control del promotor 35S a partir del Virus del Mosaico de Coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812) y la región 3' del gen nopalina cintaza a partir de T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . Puede ser usado el método de bombardeo de partículas (Klein et al. (1987) Nature 327:70-73) para transferir genes a las células de cultivo de callo. De acuerdo a este método, se recubren las partículas de oro (1 µm en diámetro) con ADN usando la siguiente técnica. Después se agregan diez µg de ADN de plásmido a 50 µL de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mL) . Se agregan a las partículas cloruro de calcio (50 µL de una slución 2.5 M) y base libre de espermidina (20 µL de una solución 1.0 M) . Se lleva aun vórtex la suspensión durante la adición de estas soluciones. Después de 10 minutos, se centrifugan brevemente los tubos (5 segundos en 15,000 rpm) y se elimina el sobrenadante. Se vuelven a suspender las partículas en 200 µL de etanol absoluto, se centrífuga otra vez y se elimina el sobrenadante. Se realiza el enjuague de etanol, otra vez y se
vuelven a suspender las partículas en un volumen final de 30 µL de etanol. Una alícuota (5 µL) de las partículas de oro recubiertas con ADN puede ser colocada en el centro de un disco de vuelo Kapton™ (Bio-Rad Labs) . Se aceleran entonces las partículas en el tejido de maíz con un Biolistic™ PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) , usando una presión de helio de 1000 psi, una distancia de espacio de 0.5 cm y una distancia de vuelo de 1.0 cm. Para el bombardeo, se coloca el tejido embriogénico en el papel filtro sobre medio N6 solidificado con agarosa. El tejido está dispuesto como un césped delgado y cubre un área circular de aproximadamente 5 cm en diámetro. La caja de petri la cual contiene el tejido puede ser colocada en la cámara de PDS-1000/He aproximadamente 8 cm a partir del tamiz de detención. El aire en la cámara es entonces evacuado a un vacío de 28 pulgadas de Hg. El macriportador es acelerado con una onda de choque de helio usando una membrana de ruptura que se revienta cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 1000 psi. Siete días después del bombardeo el tejido puede ser transferido a medio Nc6 que contiene glufosinato (2 mg por litro) y carece de caseína o prolina. El tejido continua creciendo lentamente en este medio. Después de una 2 semanas adicionales el tejido puede ser transferido a medio N6 fresco que contiene glufosinato. Después de 6 semanas, las áreas de
aproximadamente 1 cm en diámetro de callo que crece activamente pueden ser identificadas. En algunas de las placas que contienen el medio complementado con glufosinato. Estos callos pueden continuar creciendo cuando se subcultivan en el medio selectivo. Las plantas pueden ser regeneradas a partir del callo transgénico por primero transferir los coágulos de tejido a medio N6 complementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido puede ser transferido a medio de regeneración (Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839) . EJEMPLO 5 Expresión de clones quiméricos en células dicotiledóneas Puede ser usado un cásete de expresión específico a semilla del promotor y el terminador de transcripción del gen que codiica la subunidad de la faseolina proteína de almacenamiento de la semilla a partir del fríjol Phciseolus vulgar Ls (Doyle et al. (1986) J. Journal. Chem. 261:9228-9238), para la expresión de los presentes polipéptidos en el fríjol de soya transformado. El cásete de faseolina incluye aproximadamente 500 nucleótidos corriente arriba (5') del codón de iniciación de traducción y aproximadamente 1650 nucleótidos corriente abajo (3') a partir del codón de determinación de traducción de la faseolina. Entre las regiones 5' y 3' están los sitios de endonucleasa de
restricción únicos Neo I (los cuales incluyen el codón de inicición de traducción ATG), sma I, Kpn I y Xba I. El cásete completo está flanqueado por los sitios Hind III. El fragmento ADNc de este gen puede ser generado por la reacción de cadena polimerasa (PCR) del clon de ADNc usando los cebadores de oligonucleótido apropiados. La clonación siLCS puede ser incorporada en los oligonucleótidos para proporcionar orientación apropiada del fragmento de ADN cuando se inserta en el vector de expresión. Se realiza entonces la amplificación como se describe anteriormente, y el fragmento aislado se inserta en un vector pUC18 que porta el cásete de expresión de semilla. Los embriones del fríjol de soya pueden ser transformados entonces con el vector de expresión que comprende las secuencias que codifican los polipéptidos presentes. Para inducir los embriones somáticos, pueden ser cultivados los cotiledones, 3-5 mm en longitud diseccionados a partir de la superficie esterilizada, semillas inmaduras del cultivo de fríjol de soya A2872, en la luz u oscuridad en 25 °C en un medio de agar apropiado por 6-10 semanas. Algunos embriones los cuales producen embriones secundarios son entonces escindidos y colocados en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida para los glomérulos de embriones somáticos los cuales se multiplican como embriones tempranos, de etapa globular, se mantienen las suspensiones
como se describe a continuación. Los cultivos de suspensión embriogénica de fríjol de soya pueden ser mantenidos en 35 ml de medio líquido en un agitador giratorio, 150 rpm, en 26°C con luces fluorescentes en un programa de 16:8 horas días/noche. Se subcultivan los cultivos cada dos semanas por inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de medio líquido. Los cultivos de suspensión embriogénica de fríjol de soya pueden entonces ser transformados por el método de bombardeo de disparo de partículas (Klein et al. (1987) Nature (Londres) 327:70-73, Patente de los Estados Unidos No. 4,945,050). Puede ser usado un instrumento DuPont Biolistic™ PDS1000/HE (retrofijación de helio) para estas transformaciones . Un gen marcador seleccionable el cual puede ser usado para facilitar la transformación del fríjol de soya es un gen quimérico compuesto del promotor 35S a partir del virus del Mosaico de Coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), el gen de higromicin fosfotransferasa a partir del plásmido pJR225 (a partir de E. coli; T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . El cásete de expresión de semilla el cual comprende la región 5' de faseolin, el fragmento el cual codifica los presentes polipéptidos y la región 3' de faseolina puede ser aislado como un fragmento de restricción. Este fragmento puede entonces ser insertado en
un sitio de restricción único del vector que porta el gen marcador. Se agrega a 50 µL de una suspensión de partículas de 60 mg/ml 1 µm de suspensión de partículas (en orden) : 5 µL de ADN (1 µg/µL), 20 µl de espermidina (0.1 M) , y 50 µL de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partículas es entonces agitada por tres minutos, se agita en una microfuga por 10 segundos y se elimina el sobrenadante. Se lavan entonces las partículas recubiertas con ADN una vez en 400 µL de etanol al 70% y se vuelve a suspender en 40 µL de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas puede ser sonicada tres veces por un segundo cada una. Se cargan entonces cinco µL de las partículas de oro recubiertas con ADN en cada disco macro portador. Se colocan aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos semanas de edad en una caja petri de -60x15 mm vacía y se remueve el líquido residual a partir de este tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se bombardean normalmente aproximadamente 5-10 placas de tejido. Se fija la presión de ruptura de membrana en 1100 psi y se evacúa la cámara en vacio de 28 pulgadas de mercurio. Se coloca entonces tejido aproximadamente 3.5 pulgadas (8.89 cm) lejos de] tamiz de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido puede ser dividido en la mitad y colocado cié nuevo
en el líquido y cultivado como se describe anteriormente. Cinco a siete días post bombardeo, el medio de líquido puede ser intercambiado con medio fresco, y- once a doce días post bombardeo con medio fresco el cual contiene 50 mg/ml de higromicina. Este medio selectivo puede ser cambiado semanalmente. Siete a ocho días post bombardeo, puede ser observado un tejido verde, transformado, el cual crece a partir de glomérulos embriogénicos necróticos, no transformados. Se remueve el tejido verde aislado y se incoula en los matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, propagados clonalmente. Cada nueva línea puede ser tratada como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones pueden entonces ser subcultivadas y mantenidas como glomérulos de embriones inmaduros o regeneradas en plantas completas por maduración y germinación de los embriones somáticos individuales. EJEMPLO 6 Expresión de los genes quiméricos en células microbianas Los ADNc que codifican los polipéptidos presentes pueden ser insertados en el vector de expresión T7 de E. coli pBT430. Este vector es un derivado de pET-3a (Rosenberg et al. (1987) Gene 56:125-135) el cual emplea el sistema promotor T7 RNA polimerasa/T7 de bacteriófago. Se construye el plásmido pBT430 por destruir primero los sitios EcoR I y
Hind III en pET-3a en sus posiciones originales. Se inserta un adaptador de oligonucleótido el cual contiene EcoR I y Hind III en el sitio BamH I de pET-3a. Esto crea pET-3aM con sitios de clonación únicos adicionales para inserción de genes en el vector de expresión. Después, el sitio Nde I en la posición de inicio de traducción se convierte a un sitio Neo I usando la mutagénesis dirigida al oligonucleótido. La secuencia de ADN de pET-3aM en esta región, 5'-CATATGG, se convierte a 5'-CCCATGG en pBT430. El ADN de plásmido el cual contiene ADNc puede ser digerido apropiadamente para liberar un fragmento de ácido nucleico el cual codifica la proteína. Este fragmento puede entonces ser purificado en un gel de agarosa de baja fusión de 1%. El amortiguador y la agarosa contienen 10 µg/ml de bromuro de etidio para visualización. del fragmento de ADN. El fragmento puede entonces ser digerido a partir del gel de agarosa por digestión con GELase™. (Epicentre Technologies, Madison, Wl) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, se precipita con etanol, se seca y se vuelve a suspender en 20 µL de agua. Los adaptadores de oligonucleótido apropiados pueden ser ligados al fragmento usando T4 DNA ligasa (New England Biolabs (NEB) , Beverley, MA) . El fragmento el cual contiene los adaptadores ligados puede ser purificado a partir de adaptadores en exceso usando agarosa de baja fusión como se describe anteriormente. Se digiere el vector pBT430,
se desfosforila con fosfatasa alcalina (NEB) y se desproteiniza con fenol/cloroformo como se describe anteriormente. El vector preparado pBT430 y el fragmento pueden entonces ser ligados en 16°C por 15 horas seguido por transformación en células electrocompotentes DH5 (GIBCO BRL) . Las transformantes pueden ser seleccionadas en placas de agar las cuales contienen medio Lb y 100 µg/ml de ampicilina. Las transformantes las cuaies contienen el gen el cual codifica los polipéptidos presentes son entonces tamizadas para la orientación correcta con respecto al promotor T7 por análisis de restricción de enzimas. Para expresión de alto nivel, un clon de plásmido con el inserto de ADNc en la orientación correcta con relación al promotor T7 puede ser transformado en la cepa de E. coli BL21 (DE3) (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol.. 189:113-130). Se hacen crecer los cultivos en medio LB el cual contiene ampicilina (100 mg/L) en 25°C. En una densidad óptica en 600 nm de aproximadamente 1, puede ser agregado IPTG(isopropiltio-ß-galactosida, el inductor) para una concentración final de 0.4 mM y la incubación puede continuar por 3 horas en 25 °C. Las células son entonces cosechadas por centrifugación y se vuelven a suspender en 50 µL de Tris-HCl 50 mM en pH 8.0 la cual contiene DTT 0.1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0.2 mM. Puede ser agregada una cantidad pequeña de perlas de vidrio de 1 mm y se lleva a sonicación
la mezcla 3 veces por aproximadamente 5 segundos cada vez con un sonicador de microsonda. Se centrifuga la mezcla y se determina la concentración de la proteína del sobrenadante. Puede ser separado un µg de la proteína a partir de la fracción soluble del cultivo por electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida. Pueden ser observados los geles para bandas de proteínas que migran en el peso molecular esperado.