MXPA02002301A - Proteina de asociacion de la apoptina - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al campo de la apoptosis. La invención proporciona posibilidades terapéuticas novedosas, por ejemplo, terapias de combinación novedosas o compuestos terapéuticos novedosos que pueden trabajar solos, secuencialmente a, o conjuntamente con apoptina, especialmente aquellos casos en donde p53 es (parcialmente) no funcional.

Description

PROTEINA DE ASOCIACIÓN DE LA APOPTINA. Antecedentes de la Invención. La invención de se re::iere al campo de la apoptosis. La apoptosis es un proceso activo y programado para eliminar células malignas o alteradas, excedentes (Earnshaw, 1995, Duke y colaboradores, 1996) . La apoptosis se caracteriza por el encogimiento de células, segmentación del núcleo, condensación y desdoblamiento del ADN dentro de fragmentos dimensionados por el dominio, seguido en la mayoría de las células por una degradación internucleosomal . Las células apoptóticas se fragmentan dentro de cuerpos apoptóticos cerrados por membrana. Finalmente, las células vecinas y/o macrófagos formarán fagocitos rápidamente en estas células que mueren (Wyllie y colaboradores, 1980, White, 1996) . Las células que crecen bajo condiciones de cultivo de tejidos y las células de material da tejido se pueden analizar para ser apoptóticas con 1os agentes de tinción del ADN, como por ejemplo el DAjPI, que tiñe el ADN normal fuertemente y regularmente, mientras que el ADN apoptótico se tiñe débilmente y/o irregularmente (Noteborn y colaboradores, 1994, Telford y colaboradores, 1992) El proceso apoptótic o se puede iniciar por una diversidad de estímulos re ulatorios (Wyllie, 1995, White Ref: 136670 1996, Levine, 1997) . Lps cambios en la tasa de supervivencia de las células juegan un papel importante en la patogénesis humana db las enfermedades, por ejemplo en el desarrollo del cá. cer y de enfermedades auto-inmunes, en donde se observa la proliferación creciente o muerte celular disminuida (Kerr y colaboradores, 1994, Paulovich, 1997). Diversos compuestos quimioterapéuticos y la radiación, han demostrado inducir la apoptosis en células de tumor, en michos casos por medio de la proteína p53 de tipo silvestre (Thompson, 1995, Bellamy y colaboradores, Steller, 1995, McDonell y colaboradores, 1995) . Muchos tumores sin embargo, adquieren una mutación en el p53 durante su desarrollo, que se correlaciona a menudo con una respuesta ?obre a la terapia del cáncer, Ciertos genes transformadores de los virus tumorigénicos del ADN pueden inactivar a p53 al enlazarse directamente a él (Teodoro, 1997). Un ejemplo de tal agente es el antígeno T mayor del virus SV40 del ADN de tumor. Para diversos tumores (leucémico), un alto nivel de expresión del proto-oncogen Bcl-2 5 Bcr-abl se asocia con una fuerte resistencia a divensos agentes quimioterapéuticos que inducen al apoptosis (Hockenberry 1994, Sachs y Lotem, 1997) Para tales tumores que carecen del p53 funcional (que representan más de la mitad de los tumores) están bajo desarrollo terapias alternativas anti-tumor basadas en la inducción de la apoptosis independiente del p53 (Thompson 1995, Paulovich y colaboradores, 1997). Se deben buscar los factores involucrados en la inducción de la apoptosis, que no necesita el p53 y/o no se pueden bloquear por actividades a:ti-apoptóticas, tales como los Bcl-2 ó similares al Bcr-abl. Estos factores pueden ser parte de una trayectoria diferente de la apoptosis o podrían estar (más lejanc) en la dirección 3' de los compuestos inhibidores de a apoptosis. La apoptina es una proteína pequeña derivada del virus de la anemia de lqs pollos (CAV, Noteborn y De Boer, 1995, Noteborn y colaboradores, 1991, Noteborn, 1994; 1998a), que pueden inducir la apoptosis en líneas celulares transformadas y malignas humanas, pero no en cultivos celulares humanos no transformados. In vitro, la apoptina falla para induci[r la muerte celular programada en células del músculo lisO y endoteliales, epidermales, dermales, linfoides normales. Sin embargo, cuando las células normales se transforman, se hacen susceptibles a la apoptosis por la apoptina. La expresión de largo plazo de la apoptina en fibroblastos normales humanos, revela que la apoptina no tiene una actividad tóxica o transformadora en estas células (Danen-van Oorschot, 1997 y Noteborn, 1996) . En células normales, , la apoptina se encuentra predominantemente en el citoplasma, mientras que en células malignas o transfo :madas, esto es, caracterizadas por hiperplasia, metaplas ia, diaplasia ó aplasia, se localizan en el núcleo, su firiendo que la localización de la apoptina se relaciona con su actividad (Danen-van Oorschot y colaboradores, 1997). La apoptosis inducida por la apoptina sucede en ausencia del p53 funcional (Zhuang y colaboradores, ] 995a) , y no se puede bloquear por Bcl-2, Bcr-abl (Zhuanc y colaboradores, 1995), o la proteína BAG-1 de asocia* :ión con el Bcl-2 (Danen-van Oorschot, 1997a, Noteborn, 1996) . Por lo tanto, la apoptina es un compuesto terapéutico para la destp cción selectiva de células de tumor u otra hiperplasia, metaplasia, a- ó displasia, especialmente para aquellas células de tumor que se han vuelto resistentes a la indlucción quimioterapéutica de la apoptosis, debido a la car encia de un p53 funcional y a la (sobre) -expresión del Bcl-2 y otros agentes inhibidores de la apoptosi (Noteborn y Pietersen, 1998) . Parece que aún la células iínimamente transformadas, pre-malignas, son sensibles al efecto inductor de la muerte de la apoptina. Además, Moterborn y Zhang (1998), han demostrado que la apoptos s inducida por la apoptina se puede usar como diagnós' ico de células propensas al cáncer y el tratamiento de células propensas al cáncer. El hecho de que la apoptina no induzca la apoptosis en células humanas norme les, al menos no in vitro, muestra que el efecto tóxi :o del tratamiento con apoptina in vivo será muy bajo Noteborn y Pietersen (1998) y Pietersen y colaboradores, (1998), han suministrado evidencia de que la apopt. na expresada por el adenovirus no tiene un efecto agud * tóxico in vivo. Además, en ratones descubiertos, se demuestra que la apoptina tiene una fuerte actividad anti-tumor, Sin embargo, para extender además el arreglo de los compuestos terapéuticos anti-cáncer o anti-enfermedad auto-inmune disponibles en el arte, se desean compuestos terapéuticos adicionales que estén diseñados para trabajar solos, secuencialmente, unidos con la apoptina, especialmente en aquellos casos en donde el p53 no es (parcialmente) funcional La invención proporciona posibilidades terapéuticas novedosas, por ejemplo terapias combinatorias novedosas o compuestos terapéuticos rovedosos que pueden trabajar solos, secuencialmente a, o unidos con la apoptina, especialmente en aquellos casos en donde el p53 no es (parcialmente) funcional.

En una primera modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico recombinante o aislado, ó un equivalente funcional ó fragmento del mismo, que codifica una sustancia proteinácea de asociación con la apoptina, capaz de proporcionar la a optosis, sola o en combinación con otras sustancias inductoras de la apoptosis tal como la apoptina. La sustancia proteinácea aquí, se define como una sustancia que comprende un péptido, polipéptido ó proteína, que ha sido opcionalmente modificada, por ejemplo, por gliqosiliación, miristilación, fosforilación, la adici 5n de lípidos, por di o multimerización homólo a ó heteróloga o cualesquiera otras modificaciones (post-traduccionales) conocidas en el arte La asociación de la apoptina en la presente, se define como perteneciente a la cascada de sustancias involucradas específicamente en la cascada de eventos qae se encuentran en la trayectoria de la apoptosis como inducibles por la apoptina, preferiblemente aquellas sustancias que se involucran específicamente en la trayectoria de la apoptosis independiente del p53. En una modalidad preferida, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante o equivalente funcional o fragmento del mismo, que codifica una sustancia proteinácea de asociación con la apoptina capaz de provocar la apoptos Ls. Más preferiblemente, la sustancia proteinácea de asociación con la apoptina codificada, co-localiza ot::as sustancias inductoras de la apoptosis, por ejemplo La apoptina, cuando las dos sustancias inductoras de 1a apoptosis están presentes en la misma célula. En células normales no transformadas, las dos proteínas inductoras de la apoptosis se colocalizan en el citoplasma mientras que en las células transformadas o malignas, .as dos proteínas inductoras de la apoptosis se co-local izan en el núcleo. En otra modalidad, la sustancia que asocia la apoptina, es capaz de enlazar al factor de t transcripción de ratón YY1, que se demostró previamente que enlaza al RYBP homólogo de ratón a AAP-1 (García y colaboradores, 1999). En una modalidad más preferida, e.'. ácido nucleico recombinante o aislado o el equivalente funcional o fragmento del mismo que codifica una sustancia prcteinácea de asociación de la apoptina capaz de provocar apoptosis, se deriva de una colección de cADN, preferiblemente una colección de cADN de vertebrados, tal como derivada de aves, pero preferiblemente de una co Lección de cADN de mamíferos, preferiblemente en donde . ''.a colección de cADN comprende cADN humano . En otra modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico recombinante o aislado o un equivalente funcional o fragmento del mismo, que codifica una sustancia proteinácea de asociación con la apoptina, capaz de provocar apoptosis, que puede hibridizar a una molécula de ácido nucleico que codifica una sustancia proteinácea de asociación con la apoptina, capaz de provocar apoptosis como se muestra en la figura 1 ó 2, en particular, que codifica una proteína novedosa capaz de provocar apoptosis o un equivalente funcional o un fragmento funcional de la misma denominado proteína 1, de asociación de la apoptina L, abreviada aquí también como AAP-1. Por supuesto, tambi_én se suministra aquí un ácido nucleico recombinante o aislado o equivalente funcional o fragmento del mismo, que codifica una sustancia proteinácea de asociación de la apoptina adicional, capaz de asociarse con la proteína AAP-1, los medios y métodos para llegar a tal proteína adicional localizada en la cascada de la apoptina, siguen aquellos de la descripción detallada que se da en la presente. En particular, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante o un fragmento o equivalente funcional del mismo que codifica una sustancia proteinácea de asociación de la apoptina, capaz de provocar la apoptosis, que es al menos 70% homologa, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% homologa con una molécula de ácido nucleico, o con un equivalente funcional o fragmento func onal de la misma, que codifica una sustancia proteinácea de asociación de la apoptina como se muestra en la figura 1 ó 2. Adicionalmente, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la invención. Ejemplos de tal vector se dan en la descripción detallada que se da en la presente, tal como el vector pMT2SM-AAP-l-a ó b, el vector pMT2SM que expresa los cADN AAP-l-b ó AAP-l-a etiquetados con Myc, un plásmido que expresa un fragmento de proteína de asociación de la apoptina, vectores de sobreexpresión E.coli tales como pMAL y pET22b que comprenden un ácido nucleico de conformidad con la invención y asi sucesivamente. Estos y otros vectores son, por ejemplo, útiles en encontrar substancias proteináceas adicionales de asociación con la apo tina de la cascada, como se define arriba, o para la (sobre) expresión de una proteína codificada por un ácido nucleico de conformidad con la invención. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un vector que comprende- un ácido nucleico de conformidad con la invención, el vector comprende un vehículo de entrega de genes, haciendo a la invención muy útil en la terapia de genes. Al equi -par un vehículo de entrega de genes con un ácido nucleico de conformidad con la invención, y al dirigir el vehículo a la célula o células que son sobre-proliferati-v as y/o han demostrado tasas de muertes disminuidas, el vehículo de entrega de genes suministra la célula o células con los medios necesarios para la apoptosis, proporcionando posibilidades terapéuticas de largo alcance. Adicionalmente, la irvención proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico o un vector de ccoonnffoorrmmiiddaadd ccoonn llaa iinnvveennción. Los ejemplos comprenden células de levadura o bacterianas transformadas o transfectadas como se describen en la descripción detallada en la presente. Se prefiere una célula huésped de conformidad con la invención, que es una célula eucariótica transformada, tal como una célula de levadura o una célula de vertebrados, tal como células de mamíferos o Cos transforeadas o transfectadas con un ácido nucleico o un ve ctor de conformidad con la invención. Las células son en general capaces de expresar oo pprroodduucciirr uunnaa ssuubbssttaanncciiaa proteinácea capaz de provocar la apoptosis con la capacidad de asociarse con la apoptina . La invención adidionalmente proporciona una substancia proteinácea dej asociación con la apoptina recombinante o aislada, capaz de provocar la apoptosis.

Como en el ejemplo que se muestra aquí en la figura 4, la expresión de tal substancia proteinácea de asociación con la apoptina en células, ta 1 como células de tumor u otras células sobre-proliferativas, inducen el proceso apoptótico. Se puede ser así solamente, o en presencia de otras substancias inductoras de la apoptosis tales como la apoptina, y especialme te así independiente del p53, mostrando que también en aquellos casos en donde el p53 (funcional) está ausente, se puede inducir la apoptosis por una sustancia de confo trinidad con la invención. Cuando la substancia proteinácea asociada con la apoptina capaz de provocar la apoptos:.s se usa junto con otras substancias inductoras de la apoptosis, por ejemplo la apoptina, las dos subs :ancias proteináceas se co-localizan en el citoplasma de la células normales y no resultan en apoptosis Mientras que en células transformadas o malignas 1.as dos proteínas inductoras de la apoptosis se co-localizan en el núcleo e inducen la apoptosis. La invención también proporciona una substancia proteinácea de conformidad con la invención que se enlaza al factor dé la transcripción YY1, que ya se demostró que se enlaza al homólogo de ratón AAP1 RYBP. En particular, la invención proporciona una substancia proteinácea de conformidad con la invención, codificada por un ácido nucleico de conformidad con la invención, por ejemplo, que comprende al menos una parte de una secuencia de aminoácidos :omo se muestra en la figura 3 ó un fragmento funcional o equivalente funcional del mismo capaz de proporcionar Lia apoptosis solamente, o en combinación con otras substancias inductoras de la apoptosis tales como la apoptina La invención también proporciona un anticuerpo aislado o sintético que, reconoce específicamente una substancia proteinácea o equivalente funcional o fragmento funcional de la misma de conformidad con la invención. Tal anticuerpo se obtiene por ejemplo al inmunizar un animal experimental con una substancia proteinácea de asociación con la apoptina o un fragmento o equivalente inmunogénico del mismo, y cosechar los anticuerpos policlonales del animal inmunizado (como se muestra aquí en la descripción detallada) u obtener por otros métodos conocidos en el arte tales como por la producción de anticuerpos monoclonales, o anticuerpos (de cadena simple) o enlazar proteínas expresadas del ácido nucleico recombinante der ivado de una colección de ácido nucleico, por ejemplo, que se obtiene por medio de técnicas de despliegue de fagos . Con tal anticuerpo, .a invención también proporciona una substancia prot<?inácea que se reconoce específicamente por tal anticuerpo de conformidad con la invención, por ejemplo, 3ue se obtiene por medio de inmunoprecipitación, manchado Western u otras técnicas inmunológicas conocidas en el arte. Adicionalmente, la injvención proporciona el uso de un ácido nucleico, vector célula huésped o substancia proteinácea de conformidad con la invención, para la inducción de la apoptosis, como por ejemplo se muestra en la figura 4. En partícula r, tal uso se proporciona en donde la apoptosis es independiente del p53. En particular, tal uso se proporciona también, además, comprendiendo el uso de un ácido nucleico que codifica la apoptina o un equivalente p un fragmento funcional de la misma o el uso de la apoptina o un equivalente o fragmento funcional de la misma. Como se puede ver en la figura 4, al combinar est as substancias que inducen la apoptina se incrementa e.' porcentaje de apoptosis de células tratadas de tumor. Tal uso como se proporciona por la invención, es particularmente útil desde un punto de vista terapéutico. La invención proporciona aqui una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico, vector, célula huésped o substancia proteinácea de conformidad con la invención. Además, tal composición farmacéutica de conformidad con la invención, se suministra que comprende además un ácido nucleico que codifica la apoptina o un equivalente o fragmento funcional de la misma, o apoptina o un equivalente funcional o fragmento de la misma, Tal composición farmacéutica se proporciona en particular para la inducción de la apoptosis, por ejemplo en donde la apoptosis es independiente del p53, para el tratamiento de una enfermedad en donde la proliferación de células enriquecidas , o la muerte celular disminuida se observa, como es en general el caso cuando la enfermedad comprende ccáaneer o una enfermedad autoinmune. Anexo con la invención, se proporciona un método para tratar a un individuo ue porta una enfermedad en donde se observa una prolife ación creciente de células o una muerte celular disminuída, que comprende el tratamiento del individuo con u a composición farmacéutica de conformidad con la ¡nvención. En particular, estas composiciones comprendem un factor de una trayectoria de la apoptosis que es específico para células transformadas. Por lo tanto, estas composiciones son esenciales para tratamientos nuevos, pero también para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con aberraciones en el proceso apoptótico tal como el cáncer y enfermedades autoinmunee En el campo del diagnóstico, la invención proporciona un método para detectar la presencia de células de cáncer o células que son propensas al cáncer, en una muestra de células que comprende la transfección de las células en la mué stra con un ácido nucleico de conformidad o un vector de la invención, cultivar la células y determinar el porcentaje de apoptosis de las células en la muestra. Por ejemplo, se puede concluir que la localización celular de la AAP-1 es diferente en células transformadas/tumorigénicas en comparación con células normales no transfprmadas . Además, la acumulación de la AAP-1 en el núcleo s correlaciona con la inducción de la apoptosis, mientras que la localización citoplásmica se correlaciona con la viabilidad celular y la capacidad proliferaziva normal. La invención proporciona así, un métc do para la detección de la presencia de las células de cáncer o células que son propensas al cáncer en una muestra de células que comprende la transfección de células en la muestra con un ácido nucleico un vector de conformidad con la invención, y determinar la localización intracelular de una substancia proteinácea derivada del ácido nucleico o del vector en las células en la muestra. En particular, la invención proporciona en donde la presencia de la substancia proteinácea en las células se detecta por inmunotinción de las células con un anticuerpo, tal como un ensayo por inmunofluorescencia u otro inmunoensayo conocido en el arte. Preferiblemente, el anticuerpo comprende un anticuerpo de conformidad con la invención, También, la invención proporciona un método para la identificación de un agente supuesto inductor del cáncer, tal como genes transformanjtes o fragmentos funcionales de los mismos, que comprende remitir una muestra de células al agente, por ejemplo, por transfección o al suministrar meramente el agente al medio que rodea las células, y detectar la presencia de qélulas de cáncer o células que son propensas al cáncer en una muestra de células con un método de conformidad con la invención. Además, la invenciór. proporciona un método para detectar la propensión £.1 cáncer de una muestra de células, por lo cual se detecta la propensión al cáncer de un individuo de quien se han tomado muestras de las células, que comprende remitir las células a un agente inductor del cáncer tal como la luz UV, y detectar lu presencia de células de cáncer o células que son propensas al cáncer en una muestra de células con un método de conformidad con . '.a invención. La invención se explicará en mayor detalle en la siguiente descripción deta .lada que no es limitante de la invención. muy abundantes presentes en líneas celulares inmortalizadas. Por lo tanto, un nivel elevado aberrante de proteínas similares a la AAP-1 resultará en la inducción del proceso opuíesto de transformación celular, nominalmente la apoptosis. La invención proporciona además al mediador de La apoptosis inducida por la apoptina, que es especí frico del tumor. La invención proporciona una terapia para el cáncer, enfermedades auto-inmunes o enfermedadess relacionadas que se basan en proteínas similares a la AAP-1, solas o en combinación con la apoptina y/o compue stos similares a la apoptina, Construcción del pGBT 9-VP3 Para la construcción del plásmido de carnada, que permite la identificación de las proteínas de asociación con la apoptina por medio de un sistema de dos híbridos-levadura, el plásmido, pET-16b-VP3 (Noteborn, resultados no publicados) se trató con Ndel y BamHI . El fragmento de ADN de 0.4 kb de Ndel-BanHI se aisla de la agarosa de bajo punto de fusión. El plásmido pGBT9 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, EUA) se trata con las enzimas de restricción EcoRi y BamHI . El fragmento de ADN de alrededor de 5.4 kb se aisla y se liga a un ligador EcoRI-Ndel y el fragmento de ADN de 0.4 kb contiene las secuencias codificadoras dé la apoptina que parten desde su propio codón de iniciapión ATG. El constructo final que contiene un gen de fusión de la secuencia de dominio de enlace GAL4 y la apoptina bajo la regulación del promotor de levadura ADH, se denominan pGBT-VP3 y se ha probado que es correcto por el análisis de enzima de restricción y la formacion de secuencias de ADN de conformidad con el método de Sanger (1977) . Todas las etapas de clonación, se llevaron a cabo esencialmente como se describe por Maniatis y colaboradores, (1992) . El plásmido pGBT-VP3 se purificó por centrifugación en un gradiente de CsCl y cromatografía en columna e Sefacril S500 (Pharmacia) . Colección de cADN etiquetada en el dominio de activación GAL4 El vector de expresión pACT, que contiene los cADN de células B humanas transformadas con el virus de Epstein-Barr, que se fund Leron al dominio de activación transcripcional GAL4, se asaron para detectar proteínas de asociación con la apop ina. La colección de cADN del pACT, se deriva de la colacción de cADN lambda-ACT como se describe por Durfee y colaboradores, 1993 Cepas de levadura y bacterianas La cepa E.coli JMl09 fue el receptor de la transformación para el plásmido pGBT9 y pGBT-VP3. La cepa bacteriana electromax/DHIOB se usó para la transformación requerida para la recuperación de los cADN pACT asociados con la apoptina y se obtuvo de GIBCO-BRL, EUA. La cepa de levadura Y190 se usó para la separación por exclusión de una colección de cADN, y todas las otras transformaciones que son parte del sistema de dos híbridos-levadura . Medios Para las selecciones de fármacos, se complementaron placas de caldo Luria (LB por E.coli con ampiciJ ina (50 microgramos por ml) . Se prepararon los medios SC y YPD de levadura como se descri e por Rose y colaboradores, 1990' Transformación de la cepa de levadura competente Y190 con los plásmidos pGBT-VP3 y pACT-cADN y la separación por exclusión de la actividad de la beta-galactosidasa . La cepa de levadura Y190 se hizo competente y se transformó según los métodos descritos por Klebe y colaboradores, (1983). Las células de levadura se transformaron primero con pGBT-VP3 y se transformaron posteriormente con pACT-cADN, y estas células de levadura transformadas se hicieron crecer en placas reducidas en histidina, que también carecían de leucina y triptofano.

Los filtros N Hybond se colocaron sobre colonias de levaduras, que eran positi /as a la histidina y se dejaron humedecer completament e. Los filtros se levantaron y sumergieron en nitróge no líquido para permeabilizar las células de levadura, Los filtros se derritieron y se colocaron con la co onia hacia arriba en un papel Whattman 3MM en una ca a petri con solución amortiguadora (por litro: 16.1 g c Na2HP04»7H20, 5.5 gr Na2HP04»H20, 0.75 gr KCl y 0.246 gr MgS0»7H20, pH 7.0), que contenían beta mercapto-etanol ¿ 1 0.27% y 1 mg/ml de X-gal. Se incubaron los filtros durante al menos 15 minutos o durante la noche. Recuperación de lo )s plásmidos de la levadura. El ADN total de 1.as células de levadura, que fueron positivas a la histidina y a la beta-galactosidasa, se prepararon al usar un método de lisis alcalina de glusulasa como se describe por Hoffman y Winston (1987) y se usaron para transfoimar las bacterias electromax/DHIOB por medio de electroporación usando un pulsador de genes Bio-Rad de conformidad con las especificaciones del fabricante. Se colocaron en placas los transformantes sobre medios LB que contenían la ampicilina como agente antibiótico. Aislamiento de los clones pACT de asociación con la apoptina .

Por medio de un ensaayo de filtro de colonias, se usaron e hibridizaron las colonias con un oligómero 17-mero etiquetado radioactivo, que es específico para el pACT (ver también la secc ion de análisis de secuencia) , El plásmido ADN se aisló de los clones pACT, y por medio de una digestión con Xhol analizada por la presencia de un inserto de cADN. Análisis de secuencias. Los subclones que contenían las secuencias que codifican a las proteínas de asociación con la apoptina, se formaron en secuencias usando dideoxi NTP según el método de Sanger, que se llevó a cabo por Eurogentec, Seraing, Bélgica). El cebador formador de secuencias usado fue un 17-mero específico de pACT que comprende la secuencia de ADN 5' -TACCACTACAATGGATG-3' . Las secuencias de los cADN de asociación con la apoptina se compararon cqn las secuencias conocidas de genes del EMBL/Genbank Construcción de pMAL-AAPl y pET22b-AAPl. Para la construcción de los plásmidos de sobre-expresión de proteínas, que permiten la producción y aislamiento de la proteína de asociación con la apoptina, se usaron los plásmidos pMALTB y pET22b. El plásmido pMALTB es un derivado del pMAL-C2 (New England Biolabs) en el cual el sitio del f actor Xa se ha reemplazado por un sitio de la trombina. El plásmido pMALTB se trató con BamHI y Salí y el fragmento de ADN de + 7.0 kb se aisló de un gel de agarosa/TBE (kit de extracción con gel QIAGEN) . La secuencia de AAP1 que codifica la estructura de lectura abierta completa se obtuvo por una reacción de PCR en pACT-AAP-lb con el cebador delantero: 5 ' AACGGGATCCGGCGGCATGGGCGACAAGAAGAGCCCGACC 3' y el cebador invertido: 5' AAAAGTCGACTCAGAAAGATTCATCATTGACTGCTGACAT 3'; el fragmento PCR de + 0.7 kb se digirió con BamHI y Salí y se aisló de un gel de agarosa/TBE (kit de extracción con gel QIAGEN) . El constructo final que contenía una fusión entre el gen MBP y el gen AAP1 bajo la regulación del promotor tac inducible por IPTG se denomina pMAL-AAPl . El plásmido pET22b Novagen) se trata con Ndel y Notl y el fragmento de ADN de + 5.5 kb se aisla de un gel de agarosa/TBE (kit de extracción con gel QIAGEN). La secuencia AAP1 que codifjica la estructura de lectura abierta se obtuvo por una reacción con PCR sobre pACT-AAP-lb con el cebador delantero: 5' GGGAATTCCATATGGGCGACAAOAAGAGCCCGACC 3' y el cebador invertido: 5' AAGGAAGTACGCGGCCGCGAAAGATTCATCATTGACTGCTGACATGT 3'; el producto de PCR se trató con Ndel y Notl y el fragmento de + 0. kb se aisló de un gel de agarosa/TBE (kit de extracción con gel QIAGÉN) . El constructo final que contiene una fusión entre el gen AAP1 y el extremo terminal (His) 6- bajo la regulación del promotor T71ac inducible por IPTG se denomina pET22b-AAPl. Ambos constructos denostraron ser correctos por el análisis de enzimas de restricción y una formación de secuencias de ADN según el método de Sanger (1977). Todas las etapas de clonación se llevaron a cabo esencialmente como se describe por Maniatis y colaboradores, (1992) . Cepas bacterianas para la sobreexpresión de MBP-AAP1 y AAPl-(His)6. ! Para la producción de proteínas con el plásmido pMAL-AAPl se usó la cepa ce E.coli B834(?DE3), y para el plásmido pET22b-AAPl, se usó la cepa de E.coli BL21(DE3) Ambas cepas se obtuvieron de Novagen. Resultados y discusión. La apoptina induce e?pecíficamente la apoptosis en células transformadas, tales como líneas celulares derivadas de tumores humanos. Para identificar los compuestos esenciales en esta trayectoria de la apoptosis específica del tumor y/o específica de la transformación de células se llevó a cabo! una separación por exclusión genética de levadura. Se ha usado una colección humana de cADN, que se basa en el vector plásmido pACT que contiene las copias completas de cADN hechas de células B humanas transformadas del virus de Epstein-Barr (Durfee y colaboradores, 1993) Construcción de un plásmido de carnada que expresa un producto de genes de fusión de un domino de enlace de ADN-GAL4 y apoptina. Para examinar la existencia de proteínas de asociación con la apoptina en la colección de cADN tumorigénico/transformado humano, un p.i ásmido denominado de carnada ha tenido que construirse. Hasta ese punto, la región codificadora de apoptina completa, flanqueada por alrededor de 40 pares base en la dirección 3' del gen de la apoptina, se clonó en el sitio de clonación múltiple del plásmido pGB9. El constructo final, denominado pGBT-VP3, se analizó por un análisis de enzimas de restricción y formación de secuencias del área de ilusión entre la apoptina y el domino de enlace de ADN-GAL4. Un gen (fragmento) que codifica una proteína de asociación de la apoptina se determina por la transactivación de un promotor de respuesta GAL4 en levadura . El gen de apoptina se funde al domino de enlace de ADN-GAL4 del plásmido pGBI-VP3, mientras que todos los cADN derivados de las células B humanas transformadas se funden al dominio de activación GAL-4 del plásmido pACT, Si una de las sustancias proteináceas codificadas por los cADN se enlaza a la apoptina, el dominio de enlaces de ADN-GAL4 estará en la vecindad del dominio de activación GAL-4 resultando en la activación del promotor de respuesta GAL-4 que regula los genes reporteros HIS3 y LacZ. Los clones de levadura que contienen la apoptina que expresa el plásmido, y un plásmido que expresa un fragmento de proteína de asociación con la apoptina, pueden crecer en un medio reducido de histidina y tendrán un teñido azul en un ensayo de beta-galactosidasa. Posteriormente, el plásm: .do con el inserto de cADN que codifica la proteína de asociación con la apoptina, se puede aislar y caracterizar. Antes de que se pueda hacer así sin embargo, se ha determinado que la transformación de células de levadura con el plásmido pGBT-VP3 solamente, o en combinación con un vector vacío pACT, no resulta en la activación del promotor de respuesta GAL 4. Identificación de las proteínas de asociación de la apoptina codificadas por cADN derivadas de una línea celular B transformada hunana . Se han encontrado dos colonias de levaduras, que con la transformación con pGBT-VP3 y pACT-cADN, pudieron crecer en un medio reducido con histidina (también que carece de leucina y triptofano) y tiñen en azul en un ensayo de beta-galactosidasa . Estos resultados indican que las colonias de levadura observadas contienen, además del plásmido de carnada pGBT-VP3, también un plásmido pACT que codifica una proteína de asociación con la apoptina potencial. El plásmido de ADN sé aisla de la colonia positiva de levaduras, que se transforma en bacterias. Por medio de un ensayo de hibridación de filtros usando una sonda de ADN etiquetada especí :ica de pACT, los clones que contienen el plásmido pACT se pueden determinar. Posteriormente, se aisla e . ADN del pACT y se digiere con la enzima de restricción ¡Xhol, que es indicadora de la presencia de un insert de cADN. Finalmente, los plásmidos de pACT que co: tienen un inserto de cADN se forman en secuencias por e. uso del método Sanger (Sanger y colaboradores, 1977). Descripción de las proteinas de asociación con la apoptina. La separación por exclusión genética de la levadura para las proteínas de asociación con apoptina, resulta en la detección de dos clones de cADN A y B, que comprenden un tipo simple de proteína, nominalmente una proteína • novedosa denominada proteína 1 de asociación con la apoptina, abreviada como AAP-1. El cADN de la AAP-l-b aloja la estructura completa de lectura abierta con un codón de iniciación ATG, mientras que la secuencia de cADN de AAP-l-a contien : una estructura de lectura abierta AAP-1 parcial, que es completamente homologa a la secuencia de ADN de AAP-1-) La secuencia de ADN determinada de los clones de cADN de AAP-l-a y AAP-l-b, se muestra en las figuras 1 y 2, respectivamente. La secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de ADN detectada del clon AAP-l-b, que representa la secuencia copvpleta AAP-1 a. a., se da en la figura 3. Construcción de un ve tor de expresión para la identificación de la proteína AAP-1 en células de mamíferos Para estudiar si lo ,3 AAP-l-a y AAP-l-b de cADN clonado codifican de hecho los productos de proteína (de asociación con la apoptin; ) , se han llevado a cabo los siguientes experimentos. El plásmido de ADN pMT2SM contiene el promotor tardío principal del adenovirus 5 (MLP) y el ori SV40 permite altos niveles de < xpresión de genes externos en células de mamíferos transformadas, tales como las células Cos transformadas con SV40. Adicionalmente, el vector pMT2SM contiene una etiqueta Myc (aminoácido: EQKLISEEDL) que esta en a estructura como el producto externo del gen. Esta etiqueta Myc permite el reconocimiento de, por ej emplo, proteínas de asociación con la apoptina por medio del anticuerpo 9E10 específico de la etiqueta Myc. Los vectores pMT2SM que expresan los cADN de AAP-1-a ó AAP-l-b etiquetados con Myc se construyen como sigue. Los clones de cADN pACT -AAP-l-a y pACT-AAP-1-b, se digieren con la enzima de restricción Xhol y se aislan los insertos de cADN. El vector de expresión pMT2SM se digiere con Xhol y se trata con fosfatasa alcalina de intestino de becerro y se liga con los insertos de cADN de AAP-1 aislado. Por análisis de secuencia, se identifican los construct s de pMT2SM que contienen el cADN de AAP-l-a y AAP-l-b, en la orientación correcta. La síntesis de la prcteína AAP-1 etiquetada con Myc se analiza por transfec :ión de células Cos con el plásmido pMT2SM-AAP-l-a ó pMT2SM-AAP-l-b. Como control negativo, las células Cos se transfectan con imitación. Dos días después de la tra?sfección, se lisan las células y se lleva a cabo un análi sis de manchado Western usando un anticuerpo 9E10 específ co de la etiqueta Myc. Las células Cos tran ifectadas con pMT2SM-AAP-l-a y pMT2SM-AAP-l-b, se prueba i para sintetizar un producto AAP-1 etiquetado con My|c específico con un tamaño esperado de aproximadamente 33 kDa (AAP-l-a) ó 35 kDa (AAP-l-b) . Como se espera, los usados de las células Cos transfectadas con imitación, no contenían un producto de proteína que reaccionara con los anticuerpos específicos etiquetados con Myc. Estos resultados indican que se han podido aislar los cADN que pueden producir un producto de proteína con la capacidad de asociar la apoptina de la proteína inductora de la apoptosis. Co-inmunoprecipitación de la proteína AAP-1 etiquetada con Myc con apoptina en un sistema celular transformado de un mamífero. Después, se ha analizado la asociación de la apoptina y la proteína AAP-1 por medio de co-inmunoprecipitaciones usando el anticuerpo 9E10 específico de la etiqueta Myc. Los anticuerpos 9E10 no se mostró que se enlazaban cirectamente a la apoptina, lo que permite el uso del 9E10 para llevar a cabo co-inmunoprecipitaciones con proteínas de asociación de apoptina (etiquetadas con .jlyc) y apoptina. Hasta ese punto, las élulas Cos se co-transfectaron con el plásmido pCMV-VP3 ue codifica la apoptina y con el plásmido pMT2SM-AAP-l-a Como un control negativo, las células se transfectaron con pCMV-VP3 que expresa la apoptina y un plásmido cADN3.1. LacZ-myc/His-LacZ que codifica la beta-galactosi|dasa etiquetada con myc, que no se asocia con la apoptina. Dos días después de a transfección, se lisaron las células en una solución airortiguadora que consistía de 50 mM de Tris (7.5), 250 mM NaCl, 5 mM ECTA, 0.1% Tritón XlOO, 1 mg/ml Na4P207 e inhibidores de proteasa agregados recientemente tal como P SF, inhibidor de la tripsina, leupeptina y Na3V04. Las p oteínas específicas se inmuno- describe por Noteborn y colaboradores, (1998) usando los anticuerpos 9E10 específicos etiquetados en Myc, y se analizaron por manchado Western. La tinción del manchado Western con anticuerpo 9E10 y anticuerpo 111.3, que se dirigen específicamente contra la etiqueta Myc y apoptina , respectivamente, muestran que los usados "totales" de c élulas contenían apoptina y la proteína AAP-1 etiquetada con Myc o producto de beta-galactosidasa . La inmuno-precipitación del producto de AAP-1 etiquetado con Myc se acompaña por la inmunoprecipitación del pr 'ducto de apoptina de 16kDa. En contraste, la inmunop: ecipitación de la beta-galactosidasa etiquetada QOn Myc, no resultó en una coprecipitación importante d la proteína de apoptina.

En total, se llevaron a cabo 3 experimentos independientes de inmunoprecipitación, que demuestran todos la capacidad de asociación de la apoptina con la proteína AAP-1, Estos resultados indican que la proteína AAP-1 determinada novedosa, es capaz de asociarse específicamente con la apoptina no solamente en el medio de la levadura, sino también en un sistema celular mamífero transformado, Sobre expresión de la proteína novedosa AAP-1 en células transformadas humanas que inducen el proceso apoptótico . Además, se ha examinado si la AAP-1 tiene actividad apoptótica. Primero se ha analizado la localización celular de la proteína novedosa AAP-1 en células transformadas humanas. Hl sta ese punto, las células humanas Saos-2 derivai,das del osteosarcoma se transfectaron como se delscribe por Danen-Van Oorschot [1997), con el plásmido pMT2SM-AAP-l-a ó pMT2SM-AAP-l-b, que codifica la proteína AAP-l-a ó AAP-l-b etiquetada con Myc respectivamente. Por inmunofluorescepcia indirecta usando el anticuerpo 9E10 específico de la etiqueta Myc y DAPI, que tiñe el ADN nuclear, se dlemuestra que la proteína AAP-1 parcial y completa están presente en el núcleo de la célula. De hecho, se co-localiza con las estructuras de ADN/cromatina , Finalmente se examirió si la (sobre) -expresión de ambos cADN que codificaror. los resultados de la proteína AAP-1 completos o parciales, resulta en la inducción de la apoptosis. Cuatro días después de la transfección, la mayoría de la células positivas de AAP-1 se tiñeron de forma aberrante con DAPI , lo que es indicador de la inducción de la apoptosis (Telford, 1992, Danen-van Oorschot, 1997) . La co-expresión de la! apoptina y de ambas proteínas AAP-1 en células de tumor humanas, tales como las células Saos-2, resulta en un proceso apoptótico más rápido que la expresión de la appptma o la proteína AAP-1 solamente. Los resultados de la actividad apoptótica de la proteína completa AAP-1 se muestran en la figura 4. El hecho de que la proteína AAP-1 pueda inducir la apoptosis en células Saos-2 con menos p53 indica que la AAP-1 puede inducir la apoptosis independiente del p53. Estos resultados involucran que la AAP-1 puede usarse como un agente anti-tumor en casos en donde fallaran otros agentes (quimio) terapéuticos . Además, el hallazgo de que la apoptina y la AAP •1 inducen una trayectoria independiente del p53, indica que la AAP-1 se acopla en la trayectoria apoptótica inducida por la apoptina, Co-localización de la apóptina y la AAP-1 en células humanas de tumor. Para establecer la posible co-localización de la apoptina y la AAP-1 en cé .ulas humanas transformadas, se transfectaron los plásmidc:s que codifican la apoptina y la AAP-1 en células Saos-2. La expresión del AAP-1 y de la apoptina se observó po2 inmunofluorescencia indirecta por medio de un microscopio de barrido láser confocal con el uso de anticuerpos específicos 9E10 Myc mAb contra la etiqueta Myc en la AAP-L y el pAb VP3-C contra la terminación C de la apoptina. Las células co-transfrectadas con un plásmido que codifica la AAP-1 y un plásmido que codifica la apoptina expresan estas proteínas predominantemente en el núcleo. La apoptina y la AAP-1 tenían estructuras granulares y las estructuras características arriba descritas. Por medio de un microscopio de barrido láser confocal, la co-localización parcial del AAP-1 y la apoptina demuestra claramente que se presentan en estas estructuras nucleares . En conclusión, se ha identificado una proteína de asociación con la apopti.na, nominalmente la proteína novedosa AAP-1, que está presente en el núcleo y es capaz de inducir (independiente del p53) la apoptosis en células humanas de tumor. Adicionalmente, cuando se expresa la AAP-1 y la appptina en la misma célula, las dos proteínas que inducen la apoptosis se co-localizan en el núcleo en las células humanas de tumor, AAP-1 se localizad en las células diploides humanas normales en estructuras citoplásmicas , Después, se ha examinado si la AAP-1 se comporta similar en células no transformadas diploides humanas normales como se ha encontrado para la AAP-1 en células humanas de tumor. Hasta ese punto, se transfectaron fibroblastos de VH10 diploides humanos (Danen-Van Oorschot, 1997) usando Fugene según el protocolo del fabricante (Roche, Almere, Países Bajos), con el plás ido pMT2SM-AAP-lb que codifica la proteína AAP completa etiquetada con Myc. En paralelo, se transfectaron también células Saos-2 derivadas de tumor humano con el plásmido pMT2SM-AAP-lb. Por inmunofluorescencia indirecta usando ei anticuerpo 9E10 específico de la etiqueta Myc, se demostró que los fibroblastos normales diploides de VH10, la proteína AAP-1 se loca Liza en el citoplasma. Como se espera, en las células Saos-2 de tumor humanas se localiza la AAP-1 del núcleo. Adicionalmente, se ha examinado el efecto de la coexpresión de la AAP-1 y la apoptina en fibroblastos humanos VH10 en la localiz ación celular del AAP-1 como se describe por la célula qje expresa solamente el AAP-1. Los datos de inmunofluores cencía muestran que la apoptina y la AAP-1 se localizan en estructuras citoplásmicas . Estos hallazgos indican que la expresión de la AAP-1 y/o apoptina no resultan en la localización nuclear de una o la otra en células diploides (humanas) normales. Co-localización de la apoptina y AAP-1 en fibroblastos humanos. Para establecer la posible co-localización de la apoptina y la AAP-1 en células no transformadas, se transfectaron los plásmidos que codifican la apoptina y AAP-1 en células de VH10. Se observa la expresión de la AAP-1 y la apoptina por inmunofluorescencia indirecta por medio de un microscopio de barrido láser confocal con el uso de anticuerpos espec fieos 9E10 Myc mAb contra la etiqueta myc en la AAP-1 y VP3-c contra la terminación C de la apoptina. Se separa ron por exclusión las células para la (co-) localizació i de la apoptina y la AAP-1 y para la inducción del apoptosis por tinción nuclear con DAPI Las células co-trans fectadas con un plásmido que codificaba el AAP-1 y un plásmido que codificaba la apoptina, expresaron estas proteínas predominantemente en el citoplasma. La apopt ina y la AAP-1 tienen una estructura algunas veces granular y filamentosa. Por medio de un microscopio de barrido láser confocal, la co-localización de la AAP-1 y la apoptina se demostró claramente que se pres entaba en estas estructuras citoplásmicas . Estructuras citoplásmicas similares se observaron con la AAP-1, cuando se expresan solas o viceversa cuando se expresla solamente la apoptina. Así, en presencia o ausencia de la apoptina, la AAP-1 tiene una localizaciccn citoplásmica y estructuras agregadas filamentosas en fibroblastos humanos no transformados . En conclusión, se ha identificado una proteína de asociación con la apopti :?a, nominalmente AAP-1 que se localiza diferencialmente en células humanas diploides no transformadas contra células tumorigénicas humanas. Estos resultados muestran que la AAP-1 funciona de una manera diferente en células dipl .oides normales que en células tumorigénicas. Además, cua ndo la AAP-1 y la apoptina se expresan en la misma célula normal no transformada, las dos proteínas inductoras de la apoptosis se co-localizan en el citoplasma. El efecto en la inducción del enlace covalente de una señal de localizador nuclear de antígeno T mayor SV40 a la proteína de apoptina, En los siguientes experimentos, se ha examinado si la expresión ;de una protejína quimérica que consiste de apoptina y la señal de Idealización nuclear del antígeno SV40 LT (aminoácidos IHterminal-prolina-Prolina-Lisina- Lisina-Lisina-arginina-Lisina-Valina- terminal C del antígeno mayor T SV40 enlazado covalentemente con la terminación N de la apoptina) resulta en la inducción de la apoptosis en células humanas transformadas y no transformadas. La proteína quimérica se denomina NLS-apoptina. Hasta ese punto, los fibroblastos humanos VH10 no transformados y las pélulas Saos-2 derivadas de osteosarcoma humano transformadas (Danen-van Oorschot y colaboradores, 1997) se t ransfectaron con un plásmido que codifica la NLS-apoptina quimérica. En células humanas transformadas, la represión de la NLS-apoptina resulta en la localización nuclear de apoptina y la inducción de la apoptosis. La expresión de apoptina en fibroblastos humanos normales, sin embargo, resulta en la localización nuclear de la apoptina, pero no en la inducción de la apoptosis. Esto indica que "al forzarse" el transporte de la apoptina dentro del núeleo no resulta en su actividad apoptótica per se. La apoptina parece requerir un evento adicional relacionado con el tumor El efecto de la expresión de NLS-apoptina en AAP-1 en fibroblastos humanos norm, les .

A continuación, se examina si la expresión de NLS- apoptina puede influenciar la localización celular del APP-1 y/o su actividad apoptótica en fibroblastos normales de humano. Hasta este punto, se co-transfectaron células VH10 con plásmidos que codifican la NLS-apoptina o AAP-1. Por medio de nmunofluorescencia indirecta y tinción DAPI usando un microscopio fluorescente, se estableció claramente que tanto la NLS-apoptina y la AAP- 1 se localizan en el núcleo sin inducir la apoptosis. Esto indica que el "for :zar" la AAP-1 transportada a través de la NLS-apoptina en los núcleos, no resulta en la actividad apoptótica dá AAP-1 per se. La AAP-1 similar a la apoptina parece que requiere un evento adicional relacionado al tumor para volverse apoptótica en los núcleos de las células transformadas. La AAP-1 no induce la apoptosis en células humanas diploides no transformadas. En los siguientes experimentos, se examina si la AAP-1 sola, o en combinación con apoptina, también es capaz de inducir la apoptosis en fibroblastos humanos diploides no transformados como se ha observado para células humanas tumorigénicas/transformadas . Hasta este punto, se transfectan células VH10 con plásmido pMT2SM-AAP-lb como se describe arriba. Las - células transfectadas se analizan por inmunofluorescencia indirecta usando los anticuerpos específicos de etiqueta myc y/o específicos de apc :ptina y tinción DAPI . El teñido DAPI deja intacto el ADN de una manera diferente al ADN apoptótico (Telford y colaboradores, 1992) . El análisis muestra claramente que los fibroblastos VH10 que contienen la proteína AAP sola o ambas AAP-1 y apoptina, no experimentan apoptosis. Los resultados obtenidos muestran que las proteínas relacionadas con la apoptosís, tales como la AAP-1, pueden comportarse de diferente manera en células "saludables" en comparación a las células de tumor. Ensayo de diagnóstico para células cancerígenas. Con base en el presente informe, puede concluirse que la localización celular de la AAP-1 es diferente en células humanas tumprigénicas/transformadas, en comparación con células humanas normales no transformadas. Adicionalmente, la acumulación de AAP-1 en los núcleos, está correlacionada con la inducción de la apoptosis, mientras que la localización citoplásmica está correlacionada con la viabilidad celular y capacidad proliferativa normal. Por lo tanto, el solicitante ha sido capaz de desarrollar un ensayo de diagnóstico para la identificación de células (humanas) cancerígenas contra células normales "saludables" no transformadas.

El ensayo consiste en transfectar células (humanas) 'sospechosas", por ejempl.o de origen humano, con un plásmido que codifica la AAP-1, o infectar las células con vectores virales que expresan la AAP-1. Posteriormente, las células podrán examinarse, 1) para la capacidad de experimentar la apoptosis por el gen AAP-1 sobre-expresado y 2) para cambiar en la localización de la AAP-1 del citoplasma al núcleo. La localización intbacelular de la AAP-1 puede determinarse, usando un ensayo de inmunofluorescente con anticuerpos monoclonales específicos para AAP-1 y/o específicos para una etiqueta enlazada a la AAP-1 tal como la etiqueta myc descrita en la presente. Si el porcentaje de apoptosis y/o la localización nuclear de AAP-1 en las células analizadas que expresan la AAP-1 es significativamente mayor qie en las células "saludables" de control positivo AAP-1, puede concluirse que las células analizadas se han vuelto tumorigénicas/transformadas . Como un control positivo, podrán usarse para expresar la AAP-1, células tumorigénicas humanas conocidas. La co-expresión del a:ntígeno SV40 T mayor y la AAP-1 resulta en la translocalización de la AAP-1 y la inducción de la apoptosis.

Se ha examinado el efecto de la expresión de los genes transformados en la apoptosis inducida por AAP-1 en células humanas normales derivadas de individuos saludables. Hasta este punto, los fibroblastos humanos diploides VH10 se co-transfectan transitoriamente con el plásmido pMT2SM-AAP-lb que codifica la proteína AAP-1 completa y tanto el plásmido pR-s884 que codifica el antígeno SV40 T mayor, o el plásmido de control negativo pCMV-neo (Noteborn y Zhang, 1998) Por inmunofluorescenfia indirecta, las células se analizan para la apoptos s inducida por la AAP-1. Las células VH10 normales no experimentan apoptosis cuando la AAP-1 se transfecta con e.' plásmido de control negativo, Los resultados muestran, como se esperaba, que la expresión de la AAP-1 no e ? capaz de inducir la apoptosis en células humanas diploides normales, conforme los datos arriba mencionados. Sin embargo, los fibroblastos humanos normales diploides que expresan tanto la AAP-1 y el antígeno SV40 T mayor experimentan la apoptosis inducida por la AAP-1. La transición de las ¡células humanas normales, de la resistencia a la AAP-1 a la susceptibilidad a la AAP-1, puede explicarse probablemente por el hecho de que la proteína AAP-1 se desplaza de una localización citoplásmica a una localización nuclear. Esta transición La localización in racelular de la AAP-1 puede determinarse, usando un e nsayo de inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos para la AAP-1 y/o específicos para una etiqueta enlazada a la AAP-1 tal como la etiqueta myc descrita en la presente. Si el porcentaje de apoptosis y/o la localización nuclear de AAP-1 en las células normales que co-expresan la AAP-1 y el gen supuesto transformante/que induce el cáncer, es significativamente mayor que en las células de control positivo AAP-1 que expresan un plásmido de control, puede concluirse que el gen analizado efectivamente tiene actividad transformante/que induce el cáncer. Un segundo ejemplo de una prueba de diagnóstico se basa en el tratamiento de células cultivadas diploides normales con un agente c¿ rcinogénico supuesto. El agente puede agregarse, por ejemplo, al medio de cultivo en varios periodos de tiempo >. Posteriormente, las células se transfectan con un plásm do que codifica la AAP-1. Este enfoque también puede llevarse a cabo transfectando/infectando primero las células diploides normales, y después tratando las células con el agente a probarse . Las etapas posteriores del ensayo son las mismas como se describe para éste en esta sección, que describe primero el tipo de ensayo de diagnóstico. Si el porcentaje de apoptosis y/'o la localización nuclear de la AAP-1 en células normales que expresan la AAP-1 y el agente carcinógeno supuesto, es significativamente mayor que las células de control positivo AAP-1 que expresan un agente de control, puede concluirse que el agente analizado efectivamente tiene actividad transformante/que induce el cáncer. Un tercer ejemplo de una prueba de diagnóstico se basa en el tratamiento de células diploides normales cultivadas, derivadas de una biopsia en la piel del individuo potencial propenso al cáncer para probarse y cultivarse en un medio apropiado. A continuación, las células se irradian con luz UV y posteriormente se transfectan con un plásmido que codifica la AAP-1, o se infectan con un vector viral que expresa la AAP-1, o las células se transfectan/infectan primero y después se irradian. En paralelo, se usarán como control células diploides de un individuo saludable normal. Las etapas posteriores del ensayo son las mismas como se describe para éste en esta sección, que describé primero el tipo de ensayo de diagnóstico. Si después del tratamiento con luz UV el porcentaje de apoptosis y/o la localización nuclear de la AAP-1 en las células diploides derivadas del individuo potencial propenso al cáncer es significativamente mayor que en las células de control positivo AAP-1 tratadas con luz UV, puede concluirse que el individuo analizado es propenso al cáncer, AAP-1 e YYl asociad s una con la otra en células transformadas . El homólogo de rat :pn de AAP-1, RYBP (García y colaboradores, 1999) puede interactuar con la YYl. La YYl puede activar o reprimir la trascripción de proteínas celulares y virales. Las interacciones proteína-proteína puede influenciar la actividad de la YYl. La AAP-1 puede interactuar con la YYl. La interacción entre la AAP-1 y la YYl podría influenci .ar la actividad de la YYl, resultando en la represión o activación transcripcional. La transcripción de los genes podría ser importante para la actividad apoptótica de la Apoptina y/o la AAP-1. Para establecer si la AAP-1 forma un complejo con la YYl in vitro, los plásmidIbs que codifican la AAP-1 y la YYl (pCMV-HAVY-1; atenta donación del Dr . Yang Shi, Harvard Medical School, B >ston, EUA) se co-transfectaron en células Cos. Como control negativo, se co-expresaron la YY-1 con LacZ. Las cél .las se usaron y se realizó un ensayo de inmunoprecipita :ión con el uso de anticuerpos específicos contra la etiqueta myc de la AAP-1 (o LacZ), 9E10 anti myc, y contra 1a YYl, anti-YYl. Los complejos resultantes se analizan po¡r técnicas de manchado Western.

En las células usadas, 1.a AAP-1 y/o la YYl y/o la LacZ se detectan, como se esperaba. En las células transfectadas con AAP-1 e YYl, es claramente visible qué cuando se realiza una inmunoprecipitación con ar :ticuerpos específicos para AAP-1 etiquetado con myc, son detectables tanto la AAP-1 como la YYl. El manchado muest:ra una banda a 32 kD (AAP-1) y una banda a 67 kD (YYl Adicionalmente, se realiza una inmunoprecipitación usando anticuerpos específicos para YYl. Nuevamente, son detectables tanto la YYl como la AAP-1 en el manchado Western. En las células tran sfectadas con un plásmido que sólo expresa la AAP-1, sójlo podría detectarse la AAP-1. Las células transfectadas con un plásmido que codifica la YYl que <muestra la expresi LÓn de YYl, no detecta la AAP-1.

Para una regla de enlace específico de la AAP-1 con YYl, las células transfectadas con AAP-1 y LacZ y las inmunoprecipitaciones, se llevan a cabo con anticuerpos específicos para LacZ. No obstante que la proteína LacZ es claramente visible en el Manchado Western, no es visible la proteína AAP-1 Por lo tanto, los resultados obtenidos muestran que la AAP-1 enlaza específicamente a la YYl de factor relacionado a la transcripción. Producción y aislado de MBP-AAP1 y AAPl-(His)6 Para examinar la posibilidad de producción de proteína de fusión MBP-AAP1 y AAPl-(His)6, el ácido nucleico de la AAP1 que codifica para la estructura de lectura abierta, se clona en los casetes de sobreexpresión de proteína pMALTB y pET22b. La inducción de las células E.coli de conformidad con las instrucciones de los fabricantes (Novagen) lleva a la producción de proteína de fusión soluble, El aislamiento de la proteína de fusión MBP-AAP1 por medio de la cromatografía de afinidad (resina amilosa, New England Biolabs) y la cromatografía de intercambio de iones (Hig-S, Biorad) conduce a una proteína de longitud completa, del 90 hasta 95% de pureza. La cromatografía de exclusión de tamaño (Phartmacia Superosa 6 HR 10/30) de esta proteína, muestra q e una parte sustancial de la preparación MBP-AAP1 aparpece para comportarse como una especie distinta, un homotri- o tetrámero. Este descubrimiento podría sugerir que la AAP1 recombinante (en la forma de una proteína de fusión MBP) es capaz de un pliegue correcto y probablemente es biológicamente activa. El aislamiento de l proteína AAPl-(His)6 con la cromatografía de afinidaid metálica (Ni2+-NTA, QIAGEN) conduce a un lote de proteiUna de ± 80% de pureza.

En conclusión, la fusión de AAP1 a MBP resulta en AAP soluble de pliegues apropiados, que es probable que sea biológicamente activa Producción de anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína AAP-1. Para la producción de anticuerpos policlonales contra proteínas AAP-1, se sintetiza un péptido inmunogénico supuesto (péptido AAP-1 que consiste de los aminoácidos N terminales -CRKTSETNHTSRPRLK-C terminales; EuroGentec SA, Bélgica) . Posteriormente, se inyectan conejos con los péptidos específicos de conformidad con los procedimientos estándar del fabricante El suero derivado de los conejos inyectados con el péptido AAP-1, se muestra que es específico para los productos AAP-1 arriba descritos, por medio de ensayos ELISA y de manchado Western. Estos resultados implican que se han generado anticuerpos específicos, que pueden usarse para detectar la proteína AAP-1 asociada con la Apoptina . En conclusión, se ha proporcionado evidencia de que la interferencia de factores específicos con la función de las proteínas AAP-1 resulta en la inducción de la apoptosis. Las terapias basadas en la inducción de la apoptosis (independiente de p53) , son posibles utilizando la interferencia con la función de las proteínas AAP-1.

Un ejemplo de tal factor de interferencia es la apoptina. Otra proteína derivada de CAV, que se conoce que induce la apoptosis y también que se conoce que potencia la actividad de la apopti na, es la VP2 (Noteborn y colaboradores, 1997) . Descripción de las figuras La Figura 1 muestra . ' a secuencia parcial del vector pMT2SM-AAP-l-a. La secuenci.a de ADN del cADN de la AAP-1-a- se da en letras negrita La Figura 2 muestra . ' a secuencia parcial del vector pMT2SM-AAP-l-b. La secuencia de ADN del cADN de AAP-l-b se da en letras negritas. La Figura 3 muestra La secuencia de aminoácidos de la región analizada de clon AAP-l-b asociado con la apoptina (letras negritas) . Además, los tres aminoácidos C terminales, H-E-G del i itio de clonación múltiple de pACT, se dan para ilustrar que la secuencia de aminoácido AAP-1 está en estructura con el dominio de activación GAL4. Esta característica proporciona que la región AAP-1 sea efectivamente sintetizada en las células de levadura, Notar que en la Figura 3, si aminoácido en la posición 23 es correspondiente con el primer aminoácido de la proteína similar a la AAP- 1. Los dominios funcionales en la presente pueden, por ;jemplo, identificarse como un factor de transcripción que enlaza el dominio corrido desde el aminoácido en la posición 1 (=23 en la Figura 3) hasta alrededor del 54; una porción marcada con zinc, interacción proteína-proteína y/o dominio de interacción proteína-ácido nucleico corrida desde alrededor del aminoácido en la posición 25 (= 47 en la Figura 3) hasta alrededor de 42; una región asociada con la apoptosis corrida desde alrededor del aminoácido en la posición 32 hasta 226; una señal qe localización nuclear desde alrededor del aminoácido en la posición 74 hasta la 81; y una señal de localización nuclear corrida desde alrededor del aminoácido en la pos ición 102 hasta la 108, o en posiciones equivalente en otra proteína similar a la AAP-1. La Figura 4 muestra la actividad apoptótica de la proteína AAP-l-b en célu as Saos-2, cuando se expresan solas (cuadro relleno) o en combinación con apoptina (cuadro abierto) . El porcentaje de apoptosis inducida por la apoptina también se indiica (triángulo relleno) . REFERENCIAS 1. Bellamy, C.O.C., Maleomson, R.D.G., Harrison, D.J., and Wyllie, H. 1995. Cell death and disease: The biology and regulation of apoptos is. Seminars in Cáncer Biology 6, 3-12. 2. Danen-Van Oorschot ,A.A.A.M., Fischer, D.F., Grimbergen, J.M., Klein, B., Zhuang, S.-M., Falkenburg, |¡¿»A, J.H.F., Backendorf, C, Quax, P.H.A., Van der Eb, J.A. and Noteborn, M.H.M. (1997 . Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells. Proceedings National Academy Sciences, USA: 94, 5843-5847. 3. Danen-Van Oorschot, A. A. A.M, Den Hollander, A., Takayama, S., Reed, J. , Van der Eb, A.J. and Noteborn, M.H.M. (1997a). BAG-1 :.nhibits p53-induced but not apoptin-induced apoptosis. Apoptosis 2, 395-402. 4. Duke, R.C., Ocjius, D.M., Young, J, D-E. (1996). Cell suicide in health and disease. Scientific American December 1996, 48-55. 5. Durfee, T., Becherer, K., Chen, P.-L., Yeh, S.-H., Yang, Y., Kilburn, A.E., Lee, W.-H., and Elledge, S.J. (1993) . The retinoblastoma protein associates with the protein phosphate type I catalytic subunit. Genes and Development 7, 555-569. 6. Earnshaw, W.C., 1995. Nuclear changes in apoptosis, Current Opinión in Cell Biflogy 7, 337-343. 7. Fields, S. and Song, O.K. (1989). A novel genetic system to detect proteiri-protein interactions . Nature 340, 245-246. 8. García, E., Marcos-Gutierrez, C, Del Mar Lorente, M., Moreno, J.C., and Vidal, M , RYBP, a new repressor protein that interacts with compo ents of the mammalian polycomb complex, and with the transcription factor YYl. (1999; EMBO Journal 18, 3404-3418. 9. Hockenberry, D.M. (1T94). Bcl-2 in cáncer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 51-55. 10. Hoffman, C.S. and Winston, F. (1987) . A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coili. Gene 57, 267-272 11. Kerr, J.F.R., Winiterford, C.M., and Harmon, B.V. (1994). Apoptosis: Its significance in cáncer and cáncer therapy. Cáncer 73, 2013-2026, 12. Klebe, R.J., Harriss, J.V., Sharp, Z.D., and Douglas, M.G. (1983) . A general method for polyethylene-glycol-induced genetic transfjprmation of bacteria and yeast, Gene 25, 333-341. 13. Levine, A.J. (1997 / ) p53, the cellular gatekeeper for growth and división. Cell 88, 323-331, 14. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press, New York, USA, 15. McDonell T.J., Meyn, R.E., Robertson, L.E. (1995; Implications of apoptotic cell death regulation in cáncer therapy. Seminars in Cáncer Biology 6, 53-60. a j--bA- . 16. Noteborn, M.H.M. (1996). PCT application WO 96/41191. Apoptin induces apoptos is in human transformed and malignant cells but not in normal cells as essential characteristic for the development of an anti-tumor therapy. 17. Noteborn, M.H.M., anti De Boer, G.F. (1996). Patent USA/no. 030, 335. 18. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Van Roozelaar, D., Karreman, C, Kranenburg , 0., Vos, J. , Jeurissen, S., Zantema, A., Hoeben, R. , Koch, G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (199l|). Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle. Journal of Virology 65, 3131-3139. 19. Noteborn, M.H.M., anti Pietersen, A. (1998). A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin. PCT Application no. PCT/NL98/00213 20. Noteborn, M.H.M., Todd, D., Verschueren, C.A.J., De Gauw, H.W.F.M., Curran, W.L., Veldkamp, S., Douglas, A.J., McNulty, M.S., Va der Eb, A.J., and Koch, G. (1994). A single chicker anemia virus protein induces apoptosis. Journal of Vire logy 68, 346-351. 21. Noteborn, M.H.M., Verschueren, C.A.J., Koch, G., and Van der Eb, A.J. (199 Simultaneous expression of recombinant baculovirus-éncoded chicken anemia virus (CAV) proteins VP1 and VP¡2 is required for formation of the CAV-specific neutrali zing epitope. Journal General Virology, 79, 3073-3077. 22. Noteborn, M.H.M., and Zhang, Y. (1998) . Methods and means for determining the transforming capability of agents, for determining the predisposition of cells to become transformed and prophylactic treatment of cáncer using apoptin-like activity. PCT Application no, PCT/NL98/00457 23. Noteborn, M.H.M., Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Van der Eb, A.J. (1998a). Chicken anemia virus: Induction of apoptosis by a single protein of a single-stranded DNA virus. Seminars in Virology 8, 497-504 24. Paulovich, A.G., Toczyski, D. , Hartwell, H. (1997) When checkpoints fail. Cel 8, 315-321. 25. Pietersen, A.M., Van der Eb, M.M., Rademaker, H.J., Van den Wollenberg, D.J.M , Rabelink, M.J.W.E., Kuppen, P.J.K., Van Dierendonck, J.H., Van Ormondt, H., Masman, Van de Velde, C.J.H. Van der Eb, Hoeben, R.C, and Noteborn, M.H.M. (1998). Specific tumor-cell killing with adenovirus vectors contai ning the apoptin gene. Gene Therapy 6, 882-892. 26. Rose, M.D., Winston, F. , and Hieter, P. (1990) . Methods in yeast genetics . A laboratory course manual.

Cold Spring Harbor Labora ory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. 27. Sachs, L. and Lotem, . (1993) . Control of programmed cell death in normal and 1 eukemia cells: New implications for therapy. Blood 82, 15 21. 28. Sanger, F. , Nickien, S., and Coulsen, A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings National Academic Sciences USA 74, 5463-5467. 29. Steller, H. (1995). Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267, 1445 -1449. 30. Telford, W.G., King L.E. , Fraker, P. J. (1992) . Comparativo evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometry. Cytomet y 13, 137-143. 31. Teodoro, J.G. and Branton, P.E. (1997). Regulation of apoptosis by viral gene prpducts. Journal of Virology 71, 1739-1746. 32. Thompson, C.B. (1995) Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267, 1456-1462. 33. White, E. (1996) . Li::e, death, and the pursuit of apoptosis. Genes and development 10, 1-15. 34. Wyllie, A.H. (1995) The genetic regulation of apoptosis. Current Opinión in Genetics and Development 5, 97-104. Éikí. ? . Wyllie, A.H., Kerr, J F.R., Currie, A.R. (1980). Cell death: The significance of apoptosis. International Review of Cytology 68, 25 -306. 36. Yang, X., Hubbard, E J.A., and Carison, M. (1992). A protein kinase substrato identified by the two-hybrid system. Science 257, 680-682. 37. Zhuang, S.-M., Landegent, J.E., Verschueren, C.A.J., Falkenburg, J.H.F., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995; Apoptin, a protein encoded by chicken anemia virus, induces cell death in various human hematologic malignant cells in vitro. Leukemia 9 SI, 118-120. 38. Zhuang, S.-M., Shvarts, A-, Van Ormondt, H., Jochemsen, A.-G., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995). Apoptin, a protein derived from chicken anemia virus, induces a p53-irdependent apoptosis in human osteosarcoma cells. Cáncer Research 55, 486-489. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un ácido nucíeico o equivalente funcional aislado o recombinante, c fragmento funcional del mismo, caracterizado porque cod fica una sustancia proteinácea asociada a la apoptina capaz de provocar apoptosis. El ácido nucíeico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia proteinácea asociada a la apoptina está co-localizada con apoptina . 3. El ácido nucí .eico de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, ca racterizado porque la sustancia proteinácea asociada con la apoptina enlaza el factor de transcripción de ratón YYl . 4. El ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizado porque se de :riva de una colección de cADN. El ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque la colección de cADN comprende cADN humano . 6. El ácido nui leico de conformidad con cualesquiera de las neivindicaciones 1 hasta 5, - **-.. caracterizado porque es capaz de hibridizarse a una molécula de ácido nucleico que codifica una substancia proteinácea asociada con la apoptina como se muestra en la Figura 1 ó 2. 7. El ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado porque es al menos 70% homólogo a una molécula de ácido nucleico, o a un equivalente funcional o fragmento funcional del mismo, que codifica una sustancia proteinácea asociada con la apoptina como se muestra en la Figura 1 ó 2 8. Un vector, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7 9. El vector de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque comprende un vehículo de entrega de gen. 10. Una célula huesped, caracterizada porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivündicaciones 1 hasta 7, o un vector de conformidad con Jja reivindicación 8 ó 9 11. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque es una célula eucariótica tal como una célula de levadura o una célula de vertebrado. 12. Una sustancia proteinácea asociada con la apoptina, aislada o recombinante, capaz de provocar apoptosis . 13. La sustancia prcjteinácea de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque es capaz de estar co-localizada con la apoptina. 14. La sustancia pro )teinácea de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, cairacterizada porque se enlaza al factor de transcripción de ratón YYl. 15. La sustancia prjoteinácea de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 14, caracterizada porque se codifica por un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7. 16. La sustancia prloteinácea de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 15, caracterizada porque comprende al menos una parte de una secuencia de aminoácido cono se muestra en la Figura 3 o un equivalente funcional o fragmento funcional del mismo. 17. Un anticuerpo aislado o sintético que reconoce específicamente una sustancia proteinácea o un equivalente funcional < fragmento funcional de conformidad con cualesquie tra de las reivindicaciones 12 hasta 16. 18 Una sustancia protemacea que se reconoce específicamente por un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17 19. El uso de un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, el vector de conformidad con las reivindicaciones 8 ó 9, la célula huésped de conformidad cor las reivindicaciones 10 ó 11, la sustancia proteinácea ?le conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 16 ó 18, para la inducción de la apoptosis. 20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde la apoptosis es independiente de p53. 21. El uso de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, que comprende además el uso del ácido nucleico que codifica la apoptina o un equivalente funcional o fragmento del mismo, o el uso de la apoptina o un equivalente funcional o frag ento del mismo. 22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivinc icaciones 1 hasta 7, el vector de conformidad con las reivindicaciones 8 ó 9, la célula huésped de conformidad con la reivindicación 10 ó 11, ma sustancia proteinácea de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 hasta 16 ó 18. 23. La composición £armacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque comprende, además, un ácido nucleico que codifica la apoptina o un equivalente funcional o fragmento del mismo o apoptina o un equivalente o fragmento funcional del mismo. 24. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22 ó 23 caracterizada porque es para la inducción de la apoptosis. 25. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la apoptosis es independiente de p53. 26. La composición farmacéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 22 hasta 25, caracterizada porque es para el tratamiento de una enfermedad donde se opserva el aumento de la proliferación celular o reducción de muerte celular. 27. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la enfermedad comprende el cáncer o enfermedad autoinmune. 28. Un método para tratar un individuo que porta una enfermedad donde se observa un aumento en la proliferación celular o una reducción de la muerte celular, caracterizado porque comprende tratar al individuo con una composición farmacéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 22 hasta 27 33. Un método para identificar un agente supuesto que induce el cáncer, aracterizado porque comprende exponer una muestra de céfulas al agente, y detectar la presencia de células car cerígenas o células que son propensas al cáncer en una muestra de células con un. método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 29 hasta 2 2. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el agente supuesto que induce el cáncer comprende un gen o un fragmento funcional del mismo .