MXPA01012093A

MXPA01012093A - Proteina homologa zacrp7 relacionada al complemento de adipocitos.

Info

Publication number: MXPA01012093A
Application number: MXPA01012093A
Authority: MX
Inventors: Christopher S Piddington
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-05-27
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2002-07-30
Also published as: EP1185645A1; US20030129698A1; WO2000073448A1; AU5159500A; JP2003501028A; CA2374387A1; US20060040360A1

Abstract

La presente invencion se refiere a las moleculas polinucleotidicas y polipeptidicas para zacrp7, un nuevo miembro de la familia de proteinas que poseen un dominio similar al colageno y un dominio Clq. Los polipeptidos y polinucleotidos que los codifican estan involucrados en la homo- y heterotrimerizacion u oligomerizacion, y pueden ser utilizados en el estudio de los mismos. La presente invencion tambien incluye los anticuerpos para los polipeptidos zacrp7.

Description

PROTEÍNA HOMOLOGA ZACRP7 RELACIONADA AL COMPLEMENTO DE ADIPOCITOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular permiten el intercambio de información entre, y la coordinación entre, diversas células de un organismo multicelular y son fundamentales para la mayoría de los procesos biológicos. Estas interacciones juegan un papel en todo desde la fertilización hasta la muerte. Tales interacciones son esenciales durante el desarrollo y diferenciación y son críticas para la función y protección del organismo. Por ejemplo, la interacción entre la célula y su ambiente es necesaria para iniciar y mediar la remodelación de los tejidos. La remodelación de tejidos puede ser reiniciada, por ejemplo, en respuesta a muchos factores que incluyen el daño físico, el daño citotóxico, la tensión metabólica o los estímulos del desarrollo. La modulación entre la patología y el sanado (u optimización metabólica) puede ser realizada, en parte, por la interacción de las células estimuladas con la matriz extracelular así como el solvente local . Una familia de proteínas que juega un papel en la interacción de las células con su ambiente, y parece actuar REF 134385 en la interfaz de la matriz extracelular y la célula, son las proteínas relacionadas al complemento de adipocitos. Estas proteínas incluyen Acrp30, un polipéptido de 247 aminoácidos que es expresado exclusivamente por adipocitos. El polipéptido Acrp30 está compuesto de una secuencia de señal amino-terminal, un tramo de 27 aminoácidos de homología no conocida, 22 repeticiones de colágeno perfectas Gly-Xaa-Pro o imperfectas Gly-Xaa-Xaa y un dominio globular carboxilo-terminal . Ver, Scherer et al., J. Biol. Chem. 270 (45): 26746-9, 1995 y la Solicitud de Patente Internacional No. W096/39429. Acrp30, una proteína abundante en el suero humano regulada por la insulina, comparte similitud estructural, particularmente en el dominio globular carboxilo-terminal, al factor del complemento Clq y a una proteína de suero del verano de las ardillas Siberianas que hibernan (Hib27) . La expresión de Acrp30 es inducida más de 100 veces durante la diferenciación de los adipocitos. Acrp30 es sugerida para el uso en la modulación del balance de energía y en la identificación de adipocitos en muestras de prueba. Los miembros adicionales incluyen zsig37 ( O99/04000) , una proteína de 281 residuos de aminoácidos expresada predominantemente en el corazón, en la aorta y en la placenta, que tiene 14 repeticiones de colágeno y un dominio globular Clq similar a ACRP30. Zsig37 ha mostrado - i que inhibe la actividad del complemento, se enlaza a los fibroblastos SK5 y estimula la proliferación a concentraciones que se sabe inician las respuestas Clq-célula. Zsig37 también inhibe específicamente la activación del colágeno de las plaquetas en sangre completa humana y en el plasma rico en plaquetas de una manera dependiente de la dosis (Solicitud de Patente de los Estados Unidos copendiente 09/253,604). También se incluye zsig39 (WO99/10492) , una proteína de 243 residuos de aminoácidos expresada predominantemente en el corazón y en el intestino delgado, que tiene 22 ó 23 repeticiones de colágeno y un dominio Clq similar a ACRP30 y zsig37. Estas proteínas comparten todas un dominio Clq. El factor del complemento Clq consiste de seis copias de tres polipéptidos relacionados (cadenas A, B y C) , con cada polipéptido que es de aproximadamente 225 aminoácidos de longitud con un dominio de colágeno amino-terminal cercano y una región globular carboxilo-terminal . Se forman seis regiones de triple hélice por los dominios de colágeno de las cadenas seis A, seis B y seis C, formando una región central y seis troncos. Una porción de cabeza globular es formada mediante la asociación del dominio carboxilo-terminal globular de una cadena A, una B y una C. Clq está por lo tanto compuesta de seis cabezas globulares enlazadas por medio de seis troncos similar al colágeno, a una región de fibrilo central. Sellar y colaboradores, Biochem. J. 274: 481-90, 1991. Esta configuración es a menudo denominada como un ramo de flores. Acrp30 tiene una estructura similar a un ramo, formada a partir de un tipo simple de cadena polipeptídica. El dominio globular Clq de ACRP30 ha sido determinado que tiene una topología de 10 hebras beta "rollo de jalea" (Shapiro y Scherer, Curr. Bio. 8: 335-8, 1998) . Los elementos estructurales tales como las topologías de plegamiento, los residuos conservados y las interconexiones de trímero similares y las posiciones de intrones son homologas a la familia del factor de necrosis tumoral, sugiriendo una conexión entre las familias TNF y Clq. Zsig39 y zsig37 comparten esta estructura y homología también. Las proteínas que juegan un papel en la interacción celular, tal como los factores de transcripción y las hormonas son agentes diagnósticos y terapéuticos útiles. Las proteínas que son mediadoras de las interacciones específicas, tales como una remodelación, podrían ser particularmente útiles. La presente invención proporciona tales polipéptidos para estos y otros usos que deben ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Dentro de un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 80% idéntica en secuencia de aminoácidos a los residuos 52-303 de la SEQ ID No. 2, en donde dicha secuencia comprende: las repeticiones Gly-Xaa-Xaa y Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal. Dentro de una modalidad el polipéptido es al menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a los residuos 31-303 de la SEQ ID NO. 2. Dentro de una modalidad relacionada cualesquiera diferencias entre el polipéptido y la SEQ ID NO. 2 son debidas a las sustituciones conservadoras de aminoácidos. Dentro de otra modalidad más el dominio similar al colágeno consiste de 26 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones Gly-Xaa-Pro. Dentro de otra modalidad más, el polipéptido comprende: una región amino-terminal; 26 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácidos 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231-238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2. Dentro de una modalidad adicional, el polipéptido se enlaza específicamente con un anticuerpo que se enlaza específicamente con un anticuerpo de la SEQ ID NO. 2. Dentro de otra modalidad más, el dominio similar al colágeno comprende los residuos de aminoácidos 52-153 de la SEQ ID NO. 2. Dentro de otra modalidad más el dominio Clq comprende los residuos de aminoácidos 154-303 de la SEQ ID NO. 2. Dentro de otras modalidades el polipéptido comprende los residuos 52-303 de la SEQ ID NO. 2, los residuos 31-303 de la SEQ ID NO. 2 o 1-303 de la SEQ ID NO. 2. Dentro de otra modalidad más, el polipéptido es formado en complejo por enlaces disulfuro intermoleculares para formar un homotrímero. Dentro de otra modalidad más, el polipéptido es formado en complejo por los enlaces disulfuro intermoleculares, a uno o más polipéptidos que tienen un dominio similar al colágeno, para formar un heterotrímero. Dentro de una modalidad adicional, el polipéptido está covalentemente enlazado en el extremo amino o carboxilo a una porción seleccionada del grupo que consiste de marcadores de afinidad, toxinas, radionucleótidos, enzimas y fluoróforos. La invención también proporciona un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido que consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos a partir del residuo 52 hasta el residuo 153 de la SEQ ID NO. 2; y b) un polipéptido que consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos desde el residuo 154 hasta el residuo 303 de la SEQ ID NO. 2. Dentro de otro aspecto más la invención proporciona una proteína de fusión que consiste esencialmente de una primera porción y de una segunda porción unidas por un enlace peptídico, la primera porción consiste de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 80% idéntica en secuencia de aminoácidos a los residuos 52-303 de la SEQ ID NO. 2, en donde la secuencia comprende: las repeticiones Gly-Xaa-Xaa y Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal; b) un polipéptido que comprende: una región amino-terminal; 26 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácidos números 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231-238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2; c) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar al colágeno capaz de realizar la trimerización o la oligomerización; d) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio Clq o una porción activa del dominio Clq; o e) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2 que comprende el dominio similar al colágeno y el dominio Clq; y la segunda porción que comprende otro polipéptido. Dentro de una modalidad relacionada la primera porción se selecciona del grupo que consiste de: a) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácidos 52 hasta el residuo de aminoácidos 153 de la SEQ ID NO. 2; b) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácidos 154 hasta el residuo de aminoácidos 303 de la SEQ ID NO. 2; c) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácidos 52 a 303 de la SEQ ID NO. 2; d) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácidos 31 a 303 de la SEQ ID NO. 2; y e) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácidos 1 a 303 de la SEQ ID NO. 2. La invención también proporciona un polipéptido como se describe anteriormente; en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dentro de otro aspecto más la invención proporciona un método para la producción de un anticuerpo para un polipéptido, que comprende: la inoculación de un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 80% idéntica en secuencia de aminoácidos a los residuos 52-303 de la SEQ ID NO. 2, en donde dicha secuencia comprende: las repeticiones Gly-Xaa-Xaa y Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácidos; y un dominio Clq carboxilo-terminal; b) el polipéptido que comprende: una región amino-terminal; 26 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácidos; y un dominio Clq carboxilo-terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácidos números 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231-238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2; c) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar al colágeno capaz de realizar la trimerización o la oligomerización; d) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio Clq o una porción activa del dominio Clq; o e) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2 que comprende el dominio similar al colágeno y el dominio Clq; y en donde dicho polipéptido promueve una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y el aislamiento del anticuerpo a partir del animal.

También se proporcionan los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo que se enlazan específicamente a un polipéptido como se describe anteriormente. Dentro de una modalidad el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: a) un anticuerpo policlonal; b) un anticuerpo monoclonal murino; c) un anticuerpo humanizado derivado de (b) ; y d) un anticuerpo monoclonal humano. Dentro de otra modalidad más, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de F(ab'), F(ab), Fab1, Fab, Fv, scFv y la unidad de reconocimiento mínima. Dentro de otra modalidad más se proporciona un anticuerpo anti-idiotipo que se enlaza específicamente al anticuerpo descrito anteriormente. También es proporcionada por la invención una proteína de enlace que se enlaza específicamente a un epítope de un polipéptido como se describe anteriormente. Dentro de otro aspecto más, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido como se describe anteriormente. También se proporciona en la presente un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos del nucleótido 1 al nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 1; b) una secuencia de nucleótidos del nucleótido 91 al nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 1; c) una secuencia de nucleótidos del nucleótido 91 al nucleótido 459 de la SEQ ID NO. 1; d) una secuencia de nucleótidos del nucleótido 154 al nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 1; e) una secuencia de nucleótidos del nucleótido 154 al nucleótido 459 de la SEQ ID NO. 1; f) una secuencia de nucleótidos del nucleótido 460 al nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 1; g) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de los residuos 52 a 153 de la SEQ ID NO. 2; h) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de los residuos 154 a 303 de la SEQ ID NO. 2; i) un polinucleótido que permanece hibridado, después de las condiciones de lavado estrictas, a un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1, o el complemento de la SEQ ID NO. 1; j) la secuencia nucleotídica complementaria a (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) , (h) o (i) y k) las secuencias nucleotídicas degeneradas de (g) o (h) . También se proporciona un polinucleótido aislado que codifica para una proteína de fusión como se describe anteriormente . La invención también proporciona un polipéptido aislado que consiste de la secuencia del nucleótido 1 al nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 11. Dentro de otro aspecto más la invención proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos operablemente enlazados: un promotor de la transcripción; un segmento de ADN que codifica para un polipéptido como se describe anteriormente; y un terminador de la transcripción. Dentro de una modalidad el segmento de ADN codifica además para una secuencia de señal secretora operablemente enlazada al polipéptido. Dentro de una modalidad relacionada la secuencia de señal secretora comprende los residuos 1-30 de la SEQ ID NO. 2. La invención también proporciona una célula cultivada dentro de la cual ha sido introducido un vector de expresión como se describe anteriormente, en donde dicha célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN. Dentro de una modalidad la célula cultivada incluye además uno o más vectores de expresión que comprenden segmentos de ADN que codifican para los polipéptidos que tienen dominios similares al colágeno. Dentro de otro aspecto más, la invención proporciona un método de producción de una proteína que comprende: el cultivo de una célula dentro de la cual ha sido introducido un vector de expresión como se describe anteriormente; mediante lo cual dicha célula expresa la proteína codificada por el segmento de ADN; y la recuperación de la proteína expresada. Dentro de una modalidad la proteína expresada es un homotrímero. Dentro de otra modalidad, la proteína expresada es un heterotrímero. Dentro de otro aspecto, la invención proporciona un método de detección la presencia de la expresión del gen zacrp7 en una muestra biológica, que comprende: a) el poner en contacto una sonda de ácido nucleico zacrp7 bajo condiciones de hibridación ya sea con (i) las moléculas de ARN de prueba aisladas de la muestra biológica, o (ii) las moléculas de ácido nucleico sintetizadas a partir de las moléculas de ARN aisladas, en donde la sonda consiste de una secuencia nucleotídica que comprende una porción de la secuencia nucleotídica de la molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente, o los complementos de la misma, y b) la detección de la formación de híbridos de la sonda de ácido nucleico y cualquiera de las moléculas de ARN de prueba o las moléculas de ácido nucleico sintetizadas, en donde la presencia de los híbridos indica la presencia del ARN de zacrp7 en la muestra biológica. Dentro de otro aspecto más, se proporciona un método de detección de la presencia de zacrp7 en una muestra biológica, que comprende: a) el poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, como se describe anteriormente, en donde la puesta en contacto es realizada bajo condiciones que permiten el enlace del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo a la muestra biológica; y b) la detección de cualquier anticuerpo enlazado o del fragmento de anticuerpo enlazado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra un alineamiento múltiple del polipéptido zacrp7 de la presente invención y el ACRP30 humano (ACR3_HUMAN0) (SEQ ID NO. 4, Maeda y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 221: 286-9, 1996), la proteína homologa zsig39 relacionada al complemento de adipocitos (SEQ ID NO. 3, WO99/10492) y la proteína homologa zacrp2 relacionada al complemento de adipocitos humana (SEQ ID NO. 5, Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Copendiente No. 60/130,207). El alineamiento múltiple realizado utilizando una herramienta de alineamiento múltiple Clustalx con los ajustes por omisión: Matrices de Peso en Series Blosum, penalidad por Abertura de Espacio Vacío: 10.0, penalidad por extensión de Espacio Vacío: 0.05. Los alineamientos múltiples fueron sintonizados manualmente antes de computar la identidad porcentual.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la invención con detalle, puede ser de auxilio el entendimiento para definir los siguientes términos . El término "marcador de afinidad" se utiliza en la presente para denotar un segmento peptídico que puede ser enlazado a un polipéptido para proporcionar la purificación o detección del polipéptido o proporcionar sitios para el acoplamiento del polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para el cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico esté disponible, puede ser utilizado como un marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen un tramo de polihistidina, proteína A (Nilsson y colaboradores, EMBO J. 4 : 1075, 1985; Nilsson y colaboradores, Methods Enzymol . 198: 3, 1991), la glutation-S-transferasa (Smith y Johnson, Gene 67 : 31, 1988) , la sustancia P, péptido FlagMR (Hopp y colaboradores, Biotechnology 6 : 1204-10, 1988; disponible de Eastman Kodak Co., New Haven, CT) , el péptido de enlace a la estreptavidina, u otro epítope antigénico o dominio de enlace. Ver, en general Ford y colaboradores, Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los ADNs que codifican para los marcadores de afinidad son disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . El término "variante alélica" denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen secuencia alterada de aminoácidos. El término variante alélica es también utilizado en la presente para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Los términos "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" son utilizados en la presente para denotar las posiciones dentro de los polipéptidos y las proteínas. Donde el contexto lo permite, estos términos son utilizados con referencia a una secuencia particular o porción de un polipéptido o proteína para denotar la proximidad o la posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada carboxilo-terminal a una secuencia de referencia dentro de una proteína está localizada próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero está necesariamente en el extremo carboxilo de la proteína completa. El término "muestra biológica" denota una muestra que es derivada de o contiene células, componentes celulares o productos celulares, incluyendo, pero no limitados a, sobrenadantes de cultivo celular, lisados celulares, lisados de células aclaradas, extractos celulares, extractos de tejido, plasma sanguíneo, suero, y fracciones del mismo, provenientes de un paciente.

El término "par complemento/anticomplemento" denota las porciones no idénticas que forman un par estable no covalentemente asociado, bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anticomplemento. Otros pares ejemplares complemento/anticomplemento incluyen pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítope) , pares de polinucleótidos en sentido/antisentido, y similares. Donde la disociación subsiguiente del par complemento/anticomplemento es deseable, el par complemento/anticomplemento tiene preferentemente una afinidad de enlace menor de 109 M"1. El término "complementos de una molécula polinucleotídica" es una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de bases complementarias y orientación inversa en comparación a una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5 'ATGCACGGG3 ' es complementaria a 5 ' CCCGTGCAT3 ' . El término "contiguo" denota un polinucleótido que tiene un tramo contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otro polinucleótido. Se dice que las secuencias contiguas se "traslapan" un tramo dado de la secuencia polinucleotídisa ya sea en su totalidad o a lo largo de un tramo parcial del polinucleótido. Por ejemplo, los contiguos representativos de la secuencia polinucleotídica 5 ' -ATGGCTTAGCTT-3 ' son 5 ' -TAGCTTgagtct-3 ' y 3 ' -gtcgacTACCGA-5 ' . El término "secuencia nucleotídica degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación a una molécula polinucleotídica de referencia que codifica para un polipéptido) . Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican para el mismo residuo de aminoácidos (por ejemplo, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno para Asp) . El término "vector de expresión" denota una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica para un polipéptido de interés, operablemente enlazado a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un aumentador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión son en general derivados de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos . El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido removido de su medio genético natural, y está de este modo libre de otras secuencias de codificación extrañas o no deseadas, y está en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de proteínas, manipulados mediante ingeniería genética. Tales moléculas aisladas son aquellas que son separadas de su ambiente natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales éstas están ordinariamente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5 ' y 3 ' de origen natural tales como los promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para una persona de experiencia ordinaria en la técnica (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316: 774-78, 1985) . Otro ejemplo de una molécula aislada de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula aislada de ácido nucleico que ha sido aislada de un cromosoma de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de ese cromosoma. Un polipéptido o proteína "aislado" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición diferente de su ambiente nativo, tal como aparte del tejido y la sangre del animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, por ejemplo mayor de 95% pura, más preferentemente más de 99% pura. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glucosiladas o derivatizadas. El término "operablemente enlazado", cuando se hace referencia a los segmentos de ADN, denota que los segmentos están acomodados de modo que éstos funcionan en concierto para sus fines pretendidos, por ejemplo la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento de codificación hacia el terminador. El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína obtenida de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o proteína de una diferente especie. Las diferencias secuenciales entre ortólogos son el resultado de la especiación. "Parálogos" son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas elaboradas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen a través de la duplicación de los genes. Por ejemplo, la a-globina, ß-globina y mioglobina son parálogos uno del otro. El término "polinucleótido" denota un polímero de hebra simple o doble de las bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas desde el extremo 5' hasta el extremo 3 ' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser &*.!-&. aislados de fuentes naturales, sintetizados in vi tro, o preparados a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos son expresados como pares de bases (abreviados "bp"), nucleótidos ("nt_") , o kilobases ("kb") . Donde el contexto lo permita, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son de una sola hebra o de doble hebra. Cuando el término es aplicado a las moléculas de doble hebra, éste es utilizado para denotar la longitud completa y se entenderá que es equivalente al término "pares de bases" . Será reconocido por aquellos expertos en la técnica que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud y los extremos de las mismas pueden estar escalonados como resultado de la escisión enzimática; de este modo todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica de doble hebra pueden no estar apareados. Tales extremos no apareados en general no excederán 20 nucleótidos de longitud. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea producido de manera natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos de longitud son comúnmente denominados como "péptidos". "Sondas y/o cebadores" como se utiliza en la presente pueden ser ARN o ADN. El ADN puede ser ya sea ADNc o ADN genómico. Las sondas polinucleotídicas y los cebadores son ADN o ARN de una sola hebra o de doble hebra, en general oligonucleótidos sintéticos, pero pueden ser generados a partir de ADNc clonado o de secuencias genómicas o sus 5 complementos. Las sondas analíticas serán en general de al menos 20 nucleótidos de longitud, aunque pueden ser utilizadas sondas algo más cortas (14-17 nucleótidos) . Los cebadores de PCR son al menos de 5 nucleótidos de longitud, preferentemente de 15 o más nucleótidos, más preferentemente 10 20-30 nucleótidos. Los polinucleótidos cortos pueden ser utilizados cuando una región pequeña del gen es marcada para el análisis. Para el análisis bruto de los genes, una sonda polinucleotídica puede comprender un exón completo o más. Las sondas pueden ser marcadas para proporcionar una señal 15 detectable, tal como con una enzima, biotina, un radionúclido, fluoróforo, quimioluminiscente, partícula paramagnética y similares, que son comercialmente disponibles de muchas fuentes, tales como Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, y Amersham Corp., Arlington Heights, IL, utilizando 20 técnicas que son bien conocidas en la materia. El término "promotor" denota una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de la ARN-polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, ^^-^jataa*-— encontradas en las regiones 5 ' de no codificación de los genes. El término "receptor" denota una proteína asociada a la célula que se enlaza a una molécula bioactiva (por ejemplo, un ligando) y es mediador del efecto del ligando sobre la célula. Los receptores enlazados a la membrana están caracterizados por una estructura de dominios múltiples que comprende un dominio extracelular de enlace al ligando y un dominio efector intracelular que está típicamente involucrado en la transducción de la señal. El enlace del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor, que provoca una interacción entre el dominio efector y otra u otras moléculas en la célula. Esta interacción a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están enlazados a las interacciones receptor-ligando incluyen la transcripción del gen, la fosforilación, la desfosforilación, incrementos en la producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos membranales, adhesión celular, hidrólisis de los lípidos de inositol e hidrólisis de los fosfolípidos. La mayoría de los receptores nucleares también muestran una estructura de dominios múltiples, incluyendo un dominio amino-terminal de transactivación, un dominio de enlace al ADN y un dominio de enlace al ligando. En general, los receptores pueden ser enlazados a la membrana, citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona estimuladora de la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, el receptor de PDGF, el receptor de la hormona del crecimiento, el receptor de IL-3, el receptor de GM-CSF, el receptor de G-CSF, el receptor de eritropoyetina y el receptor de IL-6) . El término "secuencia de señal secretora" denota una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido (un "péptido secretor") que, como un componente de un polipéptido más grande, dirige al polipéptido más grande a través de una vía secretora de una célula en la cual éste es sintetizado. El péptido más grande es comúnmente escindido para remover el péptido secretor durante el tránsito a través de la vía secretora. Un "receptor soluble" es un polipéptido receptor que no está enlazado a una membrana celular. Los receptores solubles son más comúnmente los polipéptidos receptores de enlace al ligando que carecen de los dominios transmembranal y citoplásmico. Los receptores solubles pueden comprender residuos de aminoácidos adicionales, tales como los marcadores de afinidad que proporcionan la purificación del polipéptido o proporcionan sitios para la unión del polipéptido a un sustrato, o las secuencias de la región constante de inmunoglobulina. Muchos receptores de la superficie celular tienen contrapartes solubles de origen natural, que son producidas por la proteólisis o traducidas a partir de los ARNms alternativamente empalmados. Los polinucleótidos del receptor se dice que están sustancialmente libres de segmentos polipeptídicos transmembranales e intracelulares cuando éstos carecen de suficientes porciones de estos segmentos para proporcionar anclaje a la membrana o transducción de la señal, respectivamente . El término "variante de empalme" es utilizado en la presente para denotar formas alternativas del AR? transcrito a partir de un gen. La variación de empalme surge de manera natural a través del uso de los sitios de empalme alternativos dentro de una molécula de AR? transcrita, o menos comúnmente entre moléculas de AR? separadamente transcritas, y puede dar como resultado varios AR?ms transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar para los polipéptidos que tienen secuencia alterada de aminoácidos. El término variante de empalme es utilizado en la presente para denotar una proteína codificada por una variante de empalme de un AR?m transcrito a partir de un gen. Los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel) se entenderá que son valores aproximados. Cuando tal valor es expresado como "aprox." X o "aproximadamente" X, el valor establecido de X se entenderá que es preciso a ±10%. La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de una nueva secuencia de ADN que tiene homología con la proteína homologa relacionada al complemento de adipocitos, zacrp2 (SEQ ID NO. 5) (Solicitud de Patente de los Estados Unidos Copendiente de pertenencia común No. 09/552,204). La secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de señal amino-terminal, una región N-terminal adyacente de no homología, un dominio de colágeno compuesto de 34 repeticiones de colágeno y un dominio Clq similar al globular, carboxilo-terminal. La estructura polipeptídica general descrita anteriormente es compartida por zsig39 y Acrp30 (ver Figura) . Otras regiones de homología, encontradas en el dominio Clq globular carboxilo-terminal en las proteínas alineadas, son identificadas en la presente como cebadores útiles para la búsqueda por otros miembros de la familia. El enlace disulfuro intracatenario puede involucrar las cisteínas en los residuos 48, 153, 155 y 201 de la SEQ ID NO. 2. El nuevo polinucleótido zacrp7 de la presente invención fue inicialmente identificado mediante la búsqueda de proteínas en la base de datos EST, caracterizadas por una secuencia de señal, un dominio similar al colágeno y un dominio Clq. Los polipéptidos correspondientes a ESTs que cumplen esos criterios de búsqueda fueron comparados a las secuencias conocidas para identificar las proteínas que tienen homología a zsig39. Un cúmulo EST ensamblado fue descubierto y se predijo que era una proteína secretada. Para identificar el ADNc correspondiente en diversos tejidos, las sondas y/o los cebadores son proporcionados en la presente y pueden ser diseñados a partir de secuencias descritas, tales como la SEQ ID NO. 1. Los tejidos que expresan zacrpd podrían ser identificados ya sea a través de hibridación (Manchados de Northern) o mediante PCR de transcriptasa inversa (RT) . Las genotecas son luego generadas a partir de los tejidos que parecen mostrar expresión de zacrp7. Los clones simples provenientes de tales genotecas son luego identificados a través de la hibridación con las sondas y/o por PCR con los cebadores como se describe en la presente. La conformación de la secuencia de ADNc de zacrp7 puede ser verificada utilizando las secuencias proporcionadas en la presente. La secuencia nucleotídica de 912 pares de bases es descrita en la SEQ ID NO. 1. La identidad porcentual al nivel de aminoácidos sobre la molécula completa entre zacrp7 y otros miembros de la familia se muestra en la Tabla ÍA. La identidad porcentual sobre el dominio Clq únicamente es mostrada en la Tabla IB. Los alineamientos fueron realizados utilizando una herramienta de alineamiento múltiple Clustalx con los ajustes por omisión: las Matrices de Peso en Serie Blosum, penalidad por Apertura de Espacios Vacíos: 10.0, penalidad por Extensión de Espacio Vacío: 0.05. Los alineamientos múltiples fueron sintonizados manualmente antes de computar la identidad porcentual. La identidad porcentual es el número total de residuos idénticos sobre la longitud del traslape .

Tabla ÍA Tabla IB La secuencia nucleotídica de zacrp7 es descrita en la SEQ ID NO. 1, y su secuencia deducida de aminoácidos es descrita en la SEQ ID NO. 2. Como se describió en general anteriormente, el polipéptido zacrp7 incluye una secuencia de señal, en el intervalo del aminoácido 1 (Met) al residuo de aminoácido 30 (Gly) de la SEQ ID NO. 2, los nucleótidos 1-30 de la SEQ ID NO. 1. El polipéptido maduro por lo tanto está en el intervalo del aminoácido 31 (Gln) hasta el aminoácido 303 (Leu) de la SEQ ID NO. 2, los nucleótidos 91 a 909 de la SEQ ID NO. 1. Dentro del polipéptido maduro, una región N-terminal de homología no conocida es encontrado, en el intervalo entre el residuo de aminoácidos 31 (Gln) y 50 (Pro) de la SEQ ID NO. 2, los nucleótidos 91-153 de la SEQ ID NO. 1. Además, un dominio similar al colágeno se encuentra entre el aminoácido 51 (Gly) y 153 (Cys) de la SEQ ID NO. 2, los nucleótidos 154 a 459 de la SEQ ID NO. 1. En el dominio similar al colágeno, se observan 8 repeticiones perfectas Gly-Xaa-Pro y 26 imperfectas Gly-Xaa-Xaa. Acrp30 contiene 22 repeticiones perfectas o imperfectas, zsig39 tiene 22 ó 23 repeticiones y zacrp2 tiene 34. Los residuos de prolina encontrados en este dominio en los residuos de aminoácidos 54, 57, 66, 75, 135, 147 y 150 de la SEQ ID NO. 2 pueden ser hidroxilados. El polipéptido zacrp7 incluye también un dominio Clq carboxilo-terminal, en el intervalo de aproximadamente el aminoácido 154 (Arg) al 303 (Leu) de la SEQ ID NO. 2, los nucleótidos 460 a 909 de la SEQ ID NO. 1. Existe una cantidad clara de estructura conservada dentro del dominio Clq para hacer posible el plegamiento adecuado. Una porción aromática Clq imperfecta (F-X (5) - [ND] -X (4) - [FYWL] - 5 X(6) -F-X(5) -G-X-Y-X-F-X- [FY] (SEQ ID NO. 6) es encontrada entre los residuos 181 (Phe) y 211 (Tyr) de la SEQ ID NO. 2. X representa cualquier residuo de aminoácido y el número en el paréntesis () indica el número de aminoácidos de los residuos. Los residuos de aminoácidos contenidos dentro del 10 corchete [] restringen la elección de los residuos de aminoácidos en esa posición particular. El polipéptido zacrp7, zsig39 humano, zacrp2 humano y Acrp30 parecen ser homólogos dentro del dominio de colágeno y en el dominio Clq, pero no en la porción N-terminal del polipéptido maduro (ver 15 Figura) . Otro aspecto más de la presente invención incluye los fragmentos polipeptídicos zacrp7. Los fragmentos preferidos incluyen aquellos que contienen el dominio similar al colágeno de los polipéptidos zacrp7, en el intervalo del 20 aminoácido 1 (Met) , 31 (Gln) o 51 (Gly) al aminoácido 153 (Cys) de la SEQ ID NO. 2, una porción del polipéptido zacrp7 que contiene el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar al colágeno capaz de realizar la dimerización u oligomerización. Como se utiliza en la presente, el 25 término "colágeno o "dominio similar al colágeno" se refiere i . ¿ L S.¿ ^ ..... a una serie de secuencias de aminoácidos de tripletes repetidos, "repeticiones" o "repeticiones de colágeno" representadas por las porciones Gly-Xaa-Pro o Gly-Xaa-Xaa, donde Xaa es cualquier residuo de aminoácidos. Tales dominios pueden contener tantas como 34 repeticiones de colágeno o más. Además, tales fragmentos o proteínas que contiene tales dominios similares al colágeno pueden formar construcciones heteroméricas, usualmente trímeros. El análisis estructural y la homología a otras proteínas que contienen el dominio similar al colágeno, indica que los polipéptidos zacrp7, fragmentos o fusiones que comprenden el dominio similar al colágeno, pueden formar complejos con otros polipéptidos que contienen el dominio de colágeno, para formar homotrímeros y heterotrímeros. Estos fragmentos que contiene el dominio similar al colágeno son particularmente útiles en el estudio de la trimerización u oligomerización del colágeno o en la formación de las proteínas de fusión como se describe más completamente más adelante. Los polinucleótidos que codifican para tales fragmentos son también abarcados por la presente invención, incluyendo el grupo que consiste de: (a) la molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO. 1 desde el nucleótido 1, 91 ó 154 hasta el nucleótido 459; (b) las moléculas polinucleotídicas que codifican para un fragmento polipeptídico zacrp7 que es al menos 80% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el residuo de aminoácidos 51 (Gly) hasta el residuo de aminoácidos 153 (Cys) ; (c) las moléculas complementarias a (a) o (b) ; y (d) las secuencias nucleotídicas degeneradas que codifican para un fragmento del dominio similar al colágeno, del polipéptido zacrp7. Otros polipéptidos que contienen el dominio similar al colágeno incluyen miembros de la familia de proteínas relacionadas al complemento de adipocitos, tales como zsig37, zsig39 y ACRP30, por ejemplo. Las proteínas triméricas de la presente invención son formadas mediante enlaces disulfuro intermoleculares formados entre los residuos de cisteína conservados dentro de los polipéptidos. La presente invención proporciona por lo tanto los polipéptidos zacrp6 formados en complejo por enlaces disulfuro intermoleculares para formar homotrímeros. La invención proporciona además los polipéptidos zacrpd formados en complejo por enlaces disulfuro intermoleculares a otros polipéptidos que tienen un dominio similar al colágeno, para formar heterotrímeros. Otros fragmentos preferidos incluyen el dominio Clq globular de los polipéptidos zacrp7, en el intervalo del aminoácido 154 (Arg) a 303 (Leu) de la SEQ ID NO. 2, los nucleótidos 460 a 909 de la SEQ ID NO. 1, una porción del polipéptido zacrp7 que contiene el dominio Clq o una porción activa del dominio Clq. Otras proteínas que contienen el dominio Clq incluyen zsig37 (WO 99/04000) , zsig39 (WO 99/10492), Clq A, B y C (Sellar et al., ibid. , Reid, ibid. , y Reid et al., Biochem. J. 203: 559-69, 1982), las proteínas plasmáticas HP-20, HP-25 y HP-27 asociadas a la hibernación de la ardilla listada (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 y Kondo y Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, 1992), la precerebelina humana (Urade et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 88: 1069-73, 1991), la multimerina de células endoteliales humanas (Hayward et al., J. Biol. Chem. 270: 18246-51, 1995) y los colágenos de vertebrados tipos VIII y X (Muragaki et al., Eur. J. Biochem. 197: 615-22, 1991). Se ha determinado que el dominio Clq globular de ACRP30 tiene una topología de 10 hebras beta de "rollos de jalea" (Shapiro y Scherer, Curr. Biol. 8: 335-8, 1998) que muestra homología estructural significativa a la familia TNF y la secuencia zacrp7 como se representa por la SEQ ID NO. 2 contiene 10 hebras beta de esta estructura (residuos de aminoácidos 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231-238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2). Estas hebras han sido designadas "A", "A'", "B", "B1", "C", "D", "E", "F", "G" y "H" respectivamente. Zacrp7 tiene dos rizos de enlace al receptor, en los residuos de aminoácidos 168-194 y 225-238. Los residuos de aminoácidos 205 (Gly) , 207 (Tyr) , 253 (Leu) y 283 (Gly) ,^aA^: parecen estar conservados a través de la superfamilia que incluye CD40, TNFa, TNFß, ACRP30 y zacrp7. Estos fragmentos son particularmente útiles en el estudio o modulación de las interacciones de la matriz celular y extracelular. La actividad antimicrobiana puede también estar presente en tales fragmentos. La homología a las proteínas TNF sugiere que tales fragmentos podrían ser útiles en la resistencia a la insulina relacionada a la obesidad, regulación de la respuesta inmune, respuesta inflamatoria, apoptosis y maduración de osteoclastos. Los polinucleótidos que codifican para tales fragmentos son también abarcados por la presente invención, incluyendo el grupo que consiste de: (a) las moléculas polinucleotídicas que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestran en la SEQ ID NO. 1 desde el nucleótido 460 hasta el nucleótido 909; (b) las moléculas polinucleotídicas que codifican para un fragmento polipeptídico zacrp7 que es al menos 80% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el residuo de aminoácidos 154 (Arg) hasta el residuo de aminoácidos 303 (Leu) ; (c) las moléculas complementarias a (a) o (b) ; y (d) las secuencias nucleotídicas degeneradas que codifican para un fragmento del dominio Clq del polipéptido zacrp7. Otros fragmentos del polipéptido zacrp7 de la presente invención incluyen el dominio similar al colágeno y el dominio Clq en el intervalo del residuo de aminoácido 51 (Gly) a 303 (Leu) de la SEQ ID NO. 2. Los polinucleótidos que codifican para tales fragmentos son también abarcados por la presente invención, incluyendo el grupo que consiste de (a) las moléculas polinucleotídicas que comprenden una secuencia de los nucleótidos como se muestran en la SEQ ID NO. 1 desde el nucleótido 154 al nucleótido 909; (b) las moléculas polinucleotídicas que codifican para un fragmento del polipéptido zacrp7 que es al menos 80% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el residuo de aminoácido 51 (Gly) hasta el residuo de aminoácido 303 Leu; (c) las moléculas complementarias a (a) o (b) ; y (d) las secuencias nucleotídicas degeneradas que codifican para un fragmento del dominio Clq del dominio similar al colágeno del polipéptido zacrp7. Los aminoácidos altamente conservados, particularmente aquellos en el dominio Clq carboxilo-terminal del polipéptido zacrp7, pueden ser utilizados como una herramienta para identificar nuevos miembros de la familia. Por ejemplo, la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) puede ser utilizada para amplificar las secuencias que codifican para las porciones conservadas a partir del ARN obtenido de una variedad de fuentes de tejido. En particular, los cebadores altamente degenerados y sus complementos diseñados a partir de ^^^^ secuencias conservadas son útiles para este propósito. En particular, los siguientes cebadores son útiles para este propósito: La secuencia cebadora degenerada que codifica para los residuos de aminoácidos 257-262 de la SEQ ID NO. 2 GAY SAR GTN TGG BTN SAR (SEQ ID NO. 7) La secuencia cebadora degenerada que codifica para los residuos de aminoácidos 204-209 de la SEQ ID NO. 2 CNN GGN NTN TAY TAY TTY (SEQ ID NO. 8) La secuencia cebadora degenerada que codifica para los residuos de aminoácidos 187-192 de la SEQ ID NO. 2 AAY SAR SRN RRN CAY TAY (SEQ ID NO. 9) La secuencia cebadora degenerada que codifica para los residuos de aminoácidos 196-201 de la SEQ ID NO. 2 WSN GGN AAR TTY VHN TGY (SEQ ID NO. 10) Las sondas correspondientes a los complementos de los polinucleótidos descritos anteriormente son también abarcadas . La presente invención también proporciona un ortólogo murino zacrp7 (SEQ ID NO. 15) y el polinucleótido que lo codifica (SEQ ID NO. 14) . El homólogo murino comparte 96.5% de identidad al nivel de aminoácidos. La presente invención también proporciona las moléculas polinucleotídicas que incluyen las moléculas de ADN 5 y ARN, que codifican para los polipéptidos zacrp7 descritos en la presente. Aquellos expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, la variación secuencial considerable es posible entre estas moléculas polinucleotídicas. La SEQ ID NO. 11 es 10 una secuencia de ADN degenerado que abarca todos los ADNs que codifican para el polipéptido zacrp7 de la SEQ ID NO. 2. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de la SEQ ID NO. 11 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican para la SEQ ID NO. 2 mediante 15 la sustitución de U por T. De este modo, los polinucleótidos que codifican para el polipéptido zacrp7 que comprenden el nucleótido 1 al nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 11 y sus equivalentes de ARN, son contemplados por la presente invención. La Tabla 2 describe los códigos de una sola letra 20 utilizados dentro de la SEQ ID ?O. 11 para denotar las posiciones de los nucleótido degenerados. "Resoluciones" son los nucleótidos denotados por el código de una sola letra. "Complemento" indica el código para el o los nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y denota ya sea C o ___ .^'~_ i_________i___«**___M T, y su complemento R denota A o G, siendo A complementaria a T y siendo G complementaria a C.

Tabla 2 Nucleótido Resolución Complemento Resolución A A T T C C G G G G C C T T A A R A|G Y C|T Y C|T R A|G M A|C K G|T K G|T M A|C S C|G S C|G W A|T W A|T H A|C|T D A|G|T B C|G|T V A|C|G V A|C|G B C|G|T D A|G|T H A|C|T N A|C|G|T N A|C|G|T Los codones degenerados utilizados en la SEQ ID NO. 11, que abarcan todos los posibles codones para un aminoácido dado, se describen en la Tabla 3. -tit». ., i 3 «. ?»?_.t., »A.< Tabla 3 Aminoácido Código de Codonee ! Codón Una Letra Degenerado Cys C • TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T ACÁ ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gln Q CAÁ CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG He I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Val V GTA GTC GTG GTT GTN PhE F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp W TGG TGG Ter . TAA TAG TGA TRR Asn|As B RAY Glu/Gln Z SAR Cualquiera X NNN Una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que es introducida cierta ambigüedad en la determinación de un codón degenerado, representativa de todos los posibles codones que codifican para cada aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar para la arginina (AGR) , y el codón degenerado para la arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar para la serina (AGY) . Existe una relación similar entre los codones que codifican para la fenilalanina y la leucina. De este modo, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar para secuencias de aminoácidos variantes, pero una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede identificar fácilmente tales secuencias variantes por referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. Las secuencias variantes pueden ser fácilmente probadas para la funcionalidad como se describe en la presente. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que diferentes especies pueden mostrar "uso de codón preferencial". En general, ver, Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas et al. Curr. Biol. 6: 315- - .Hj .. ..M -? t. *~?*á ^ 24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13 : 355-65, 1981; Grosjean y Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc . Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. Como se utiliza en la presente, el término "uso de codón preferencial" o "codones preferenciales" es un término de la técnica que se refiere a los codones de traducción de proteínas que son más frecuentemente utilizados en células de una cierta especie, favoreciendo de este modo uno o unos pocos representantes de los posibles codones que codifican para cada aminoácido (ver Tabla 3) . Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede ser codificado por ACÁ, ACC, ACG, o ACT, pero en células de mamífero ACC es el codón más comúnmente utilizado; en otras especies, por ejemplo, células de insecto, levadura, virus o bacterias, diferentes codones de Thr pueden ser preferenciales. Los codones preferenciales para una especie particular pueden ser introducidos dentro de los polinucleótidos de la presente invención mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codón preferencial dentro del ADN recombinante puede, por ejemplo, aumentar la producción de la proteína al hacer la traducción de la proteína más eficiente dentro de un tipo celular o especie particular. Por lo tanto, la secuencia del codón degenerado descrito en la SEQ ID NO. 11 sirve como una plantilla para la optimización de la expresión de los polinucleótidos en varios tipos celulares y especies comúnmente utilizados en la técnica y descritos en la presente. Las secuencias que contienen codones preferenciales pueden ser probadas y optimizadas para la expresión en varias especies, y probadas para la funcionalidad como se describe en la presente. La presente invención proporciona además los polipéptidos variantes y las moléculas de ácido nucleico que representan contrapartes de otras especies (ortólogos) . Estas especies incluyen, pero no están limitadas a mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otros vertebrados y especies de invertebrados. De interés particular son los polipéptidos zacrp7 de otras especies de mamífero, incluyendo murino, porcino, ovino, bovino, canino, felino, equino, y otros polipéptidos de primates. La invención proporciona un ortólogo murino (SEQ ID NO. 15) para zacrp7 humano (SEQ ID NO. 2) . Los ortólogos de zacrp7 humano pueden ser clonados utilizando la información y las composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc puede ser clonado utilizando el ARNm obtenido de un tejido o tipo celular que expresa zacrp7 como se describe en la presente. Las fuentes adecuadas de ARNm pueden ser identificadas mediante el sondeo de los manchados de northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas en la presente. Una genoteca es luego preparada a partir de ARNm de un tejido positivo o de una línea celular positiva. Un ADNc que codifica para zacrp7 puede ser luego aislado mediante una variedad de métodos, tales como mediante el sondeo con un ADNc humano completo o parcial, o con uno o más grupos de sondas degeneradas, con base en las secuencias descritas. Un ADNc puede también ser clonado utilizando la reacción en cadena de polimerasa con cebadores diseñados a partir de las secuencias zacrp7 humanas, representativas descritas en la presente. Dentro de un método adicional, la genoteca de ADNc puede ser utilizada para transformar o transfectar células huésped, y la expresión del ADNc de interés puede ser detectada por un anticuerpo para el polipéptido zacrp7. Pueden también ser aplicadas técnicas similares al aislamiento de los clones genómicos. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEQ ID NO. 1 representa un alelo simple de zacrp7 humano, y que la variación alélica y el empalme alternativo se espera que ocurran. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden ser clonadas mediante el sondeo del ADNc o las bibliotecas genómicas provenientes de diferentes individuos de acuerdo a procedimientos estándares. Las variantes alélicas de la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID NO. 1, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las cuales las mutaciones dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, como lo son las proteínas que son variantes alélicas de la SEQ ID NO. 2. Las moléculas de ADNc generadas a partir de los ARNms alternativamente empalmados, que conservan las propiedades del polipéptido zacrp7 son incluidas dentro del alcance de la presente invención, como lo son los polipéptidos codificados por tales AD?cs y AR?ms. Las variantes alélicas y las variantes de empalme de estas secuencias pueden ser clonadas mediante el sondeo del AD?c o de las bibliotecas genómicas provenientes de diferentes individuos o tej idos de acuerdo a procedimientos estándares conocidos en la técnica. Dentro de las modalidades preferidas de la invención, las moléculas aisladas de ácido nucleico pueden hibridarse bajo condiciones estrictas a las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia nucleotídica de la SEQ ID ?O. l o a las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia nucleotídica complementaria a la SEQ ID ?O. 1. En general, las condiciones estrictas son seleccionadas para ser de aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida y pH definido) a la cual 50% de la secuencia objetivo se hibrida a una sonda de concordancia perfecta.

Un par de moléculas de ácido nucleico, tales como ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN puede hibridarse si las secuencias nucleotídicas tienen algún grado de complementariedad. Los híbridos pueden tolerar pares de bases mal acoplados en la doble hélice, pero la estabilidad del híbrido es influenciada por el grado de mal acoplamiento. La Tm del híbrido mal acoplado disminuyó por 1°C por cada 1-1.5% de mal acoplamiento de pares de bases . Variando la exigencia de las condiciones de hibridación, se permite el control sobre el grado de mal acoplamiento que estará presente en el híbrido. El grado de exigencia se incrementa conforme se incrementa la temperatura de hibridación y la fuerza iónica del amortiguador de hibridación disminuye. Las condiciones de hibridación estrictas abarcan temperaturas de aproximadamente 5-25°C por debajo de la Tm del híbrido y un amortiguador de hibridación que tiene hasta 1 M de Na+. Más altos grados de exigencia a menores temperaturas pueden ser logrados con la adición de formamida, que reduce la Tm del híbrido aproximadamente 1°C por cada 1% de formamída en la solución amortiguadora. En general, tales condiciones estrictas incluyen temperaturas de 20-70°C y un amortiguador de hibridación que contiene hasta 6x de SSC y 0-50% de formamida. Un más alto grado de exigencia puede ser logrado a temperaturas de 40-70°C con un amortiguador de hibridación que tiene hasta 4x de SSC y de 0-50% de formamida.

Condiciones altamente estrictas abarcan típicamente temperaturas de 42-70°C con un amortiguador de hibridación que tiene hasta lx de SSC y 0-50% de formamida. Diferentes grados de exigencia pueden ser utilizados durante la hibridación y lavado para lograr enlace específico máximo a la secuencia objetivo. Típicamente, los lavados después de la hibridación son realizados a grados cada vez mayores de exigencia para remover las sondas polinucleotídicas no hibridadas de los complejos hibridados. Se entiende que las condiciones anteriores sirven como una guía y está muy por dentro de las habilidades de una persona experta en la técnica el adaptar estas condiciones para el uso con un híbrido polipeptídico particular. La Tm para una secuencia objetivo específica es la temperatura (bajo condiciones definidas) a la cual 50% de la secuencia objetivo se hibridará a una secuencia sonda con concordancia perfecta. Estas condiciones que influyen la Tm incluyen, el tamaño y el contenido de pares de bases de la sonda polinucleotídica, la fuerza iónica de la solución de hibridación, y la presencia de agentes desestabilizadores en la solución de hibridación. Son conocidas numerosas ecuaciones para el cálculo de Tm en la técnica, y son específicas para los híbridos de ADN, ARN y ADN-ARN y las secuencias sonda polinucleotídicas de longitud variante (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Press 1989) ; Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987) ; y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)). El programa de análisis secuencial tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) , así como los sitios en la Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y calcular la Tm con base en los criterios definidos por el usuario. Tales programas pueden también analizar una secuencia dada bajo condiciones definidas e identificar las secuencias sondas adecuadas. Típicamente, la hibridación de secuencias polinucleotídicas más largas, mayores de 50 pares de bases, es realizada a temperaturas de aproximadamente 20-25°C por debajo de la Tm calculada. Para sondas más pequeñas, menos de 50 pares de bases, la hibridación es típicamente llevada a cabo a la Tm o a 5-10°C por debajo. Esto permite la velocidad máxima de hibridación para los híbridos de ADN-ADN y ADN-ARN. La longitud de las secuencias polinucleotídicas influye la velocidad y la estabilidad de la formación del híbrido. Secuencias sonda más pequeñas, de menos de 50 pares de bases, alcanzan el equilibrio con secuencias complementarias rápidamente, pero pueden formar híbridos menos estables. Los tiempos de incubación desde minutos hasta horas pueden ser utilizados para lograr la formación del híbrido. Secuencias sonda más largas entran en equilibrio más lentamente, pero forman complejos más estables incluso a temperaturas menores. Las incubaciones son dejadas proceder toda la noche o por más tiempo. En general, las incubaciones son llevadas a cabo por un periodo igual a tres veces el tiempo Cot calculado. Tiempo Cot, el tiempo que le toma a las secuencias polinucleotídicas reasociarse, puede ser calculado para una secuencia particular mediante métodos conocidos en la técnica. La composición de los pares de bases de la secuencia polinucleotídica afectará la estabilidad térmica del complejo híbrido, con lo cual se influye la elección de la temperatura de hibridación y la fuerza iónica del amortiguador de hibridación. Los pares A-T son menos estables que los pares G-C en soluciones acuosas que contienen cloruro de sodio. Por lo tanto, entre más alto es el contenido de G-C, más estable es el híbrido. Incluso la distribución de residuos de G y C dentro de la secuencia contribuye también positivamente a la estabilidad del híbrido. Además, la composición de pares de bases puede ser manipulada para alterar la Tm de una secuencia dada. Por ejemplo, la 5-metildesoxicitidina puede ser sustituida por la desoxicitidina y la 5-bromodesoxiuridina puede ser sustituida por la timidina para incrementar la Tm, mientras que la 7- desaza-2 ' -desoxiguanosina puede ser sustituida por la guanosina para reducir la dependencia a la Tm. La concentración iónica del amortiguador de 5 hibridación también afecta la estabilidad del híbrido. Los amortiguadores de hibridación contienen en general agentes de bloqueo tales como solución de Denhardt (Sigma Chemical Co., Saint Louis Missouri) , ADN de esperma de salmón desnaturalizado, ARNt , leche en polvo (BLOTTO) , heparina o 10 SDS, y una fuente de ?a+, tal como SSC (lx SSC: cloruro de sodio 0.15 M, citrato de sodio 15 mM) o SSPE (lx SSPE: cloruro de sodio 1.8 M, ?aH2P04 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.7). Al disminuir la concentración iónica del amortiguador, se incrementa la exigencia de la hibridación. Típicamente, los 15 amortiguadores de hibridación contienen de entre 10 mM a 1 M de ?a+. La adición de agentes desestabilizadores o desnaturalizadores tales como formamida, sales de tetraalquilamonio, cationes guanidinio o cationes tiocianato a la solución de hibridación, alterará la Tm de un híbrido. 20 Típicamente, la formamida es utilizada a una concentración de hasta 50% para permitir que sean llevadas a cabo las incubaciones a temperaturas más convenientes y más bajas. La formamida también actúa para reducir el antecedente no específico cuando se utilizan sondas de AR?. ^.-i ¿&jsí.

Como una ilustración, una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido zacrp7 variante puede ser hibridada con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) a 42°C toda la noche en una solución que comprende 50% de formamida, 5x de SSC (lx de SSC: cloruro de sodio 0.15 M y citrato de sodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5x de solución de Denhardt (100 x de solución de Denhardt: 2% (p/v) de Ficoll 400, 2% (p/v) de polivinilpirrolidona, y 2% (p/v) de albúmina sérica bovina) , 10% de sulfato de dextrano, y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado, desnaturalizado. Una persona de experiencia en la técnica puede divisar variaciones de estas condiciones de hibridación. Por ejemplo, la mezcla de hibridación puede ser incubada a una temperatura mayor o menor, tal como aproximadamente 65°C, en una solución que no contiene formamida. Además, las soluciones de hibridación premezcladas son disponibles (por ejemplo, Solución de Hibridación EXPRESSHYB de CLONTECH Laboratories Inc.), y la hibridación puede ser realizada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después de la hibridación, las moléculas de ácido nucleico pueden ser lavadas para eliminar las moléculas de ácido nucleico no hibridadas, bajo condiciones estrictas, o bajo condiciones altamente estrictas. Las condiciones de lavado estrictas, típicas incluyen lavado en una solución de 0.5x-2x de SSC con 0.1% de dodeciisulfato de sodio (SDS) a 55-65°C. Esto es, las moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido zacrp7 variante se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado estrictas, en las cuales la exigencia de lavado es equivalente a 0.5x-2x SSC con 0.1% de SDS a 50-65°C, incluyendo 0.5x de SSC con 0.1% de SDS a 55°C, o 2x de SSC con 0.1% de SDS a 65°C. Una persona de experiencia en la técnica puede divisar fácilmente condiciones equivalentes, por ejemplo, mediante la sustitución de SSPE por SSC en la solución de lavado. Las condiciones de lavado altamente estrictas, típicas incluyen lavado en una solución de 0.1x-0.2x de SSC con 0.1% de dodeciisulfato de sodio (SDS) a 50-65°C. En otras palabras, las moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido zacrp7 variante se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado altamente estrictas, en las cuales la exigencia de lavado es equivalente a 0.1x-0.2x de SSC con 0.1% de SDS a 50-65°C, incluyendo 0. lx de SSC con 0.1% de SDS a 50°C, o 0.2x de SSC con 0.1% de SDS a 65°C.

- " AJBJM La presente invención también proporciona los polipéptidos zacrp7 aislados que tienen una identidad secuencial sustancialmente similar a los polipéptidos de la SEQ ID NO. 2, o sus ortólogos. El término "identidad de secuencia sustancialmente similar" es utilizado en la presente para denotar los polipéptidos que tienen al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de identidad secuencial a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO. 2, o sus ortólogos. La presente invención también incluye los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de identidad secuencial a la secuencia de residuos de aminoácidos 70-252 de la SEQ ID NO. 2. La presente invención incluye además las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales polipéptidos. Los métodos para determinar la identidad porcentual se describen más adelante. La presente invención también contempla las moléculas de ácido nucleico variantes de zacrp7 que pueden ser identificadas utilizando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2, y un ensayo de hibridación, como se describe anteriormente. Tales variantes de zacrp7 incluyen las moléculas de ácido nucleico: (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado estrictas, en las cuales la exigencia de lavado es equivalente a 0.5X-2X de SSC con 0.1% de SDS a 50-65°C, y (2) que codifica para un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. Alternativamente, las variantes de zacrp7 pueden ser caracterizadas como moléculas de ácido nucleico (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado altamente estrictas, en las cuales la exigencia de lavado es equivalente a 0.1x-0.2x de SSC con 0.1% de SDS a 50-65°C, y (2) que codifican para un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. La identidad secuencial porcentual es determinada mediante métodos convencionales. Ver, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603, 1986, y Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 89: 10915, 1992. En resumen, dos secuencias de aminoácido son alineadas para optimizar las calificaciones de alineamiento utilizando una penalidad por espacio vacío de 10, una penalidad por extensión de espacio vacío de 1 , y la matriz de calificación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra en la Tabla 4 (los aminoácidos son indicados por los códigos estándares de una sola letra) . La identidad porcentual es luego calculada como: ([Número total de concordancias idénticas] / [longitud de la secuencia más larga más el número de espacios vacíos introducidos en la secuencia más larga con el fin de alinear las dos secuencias] ) (100) .

Tabla 4 A R N D C Q E G H I L K M F P W Y V A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 ' - - ' -" aiiiiiTií.i -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 O -1 O O O -1 -2 -2 O -2 -1 4 T O -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 Aquellos expertos en la técnica apreciarán que existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineamiento de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente y la secuencia de aminoácidos de una variante putativa zacrp7. El algoritmo FASTA es descrito por Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 85: 2444, 1988, y por Pearson, Meth. Enzymol . 183: 63, 1990. En resumen, FASTA caracteriza primeramente la similitud secuencial mediante la identificación de las regiones compartidas por la secuencia de búsqueda (por ejemplo, SEQ ID NO. 2) y una secuencia de prueba que tienen ya sea la más alta densidad de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2) , sin considerar las sustituciones conservadoras de aminoácidos, inserciones o supresiones. Las diez regiones con la más alta densidad de identidades son luego recalificadas mediante la comparación de la similitud de todos los aminoácidos apareados utilizando una matriz de sustitución de aminoácido, y los extremos de las regiones son "recortados" para incluir únicamente aquellos residuos que contribuyen a la más alta calificación. Si existen varias regiones con calificaciones más altas que el valor de "corte" (calculado mediante una fórmula predeterminada con base en la longitud de la secuencia y el valor ktup) , entonces las regiones iniciales recortadas son examinadas para determinar si las regiones pueden ser unidas para formar un alineamiento aproximado con espacios vacíos. Finalmente, las regiones de más alta calificación de las dos secuencias de aminoácidos son alineadas utilizando una modificación del algoritmo de Neddleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974), que permite inserciones y supresiones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son: ktup=l, penalidad por apertura de espacio vacío=10, penalidad por extensión de espacio vacío=l y matriz de sustitución=BLOSUM62. Estos parámetros pueden ser introducidos dentro de un programa FASTA mediante la modificación del archivo de la matriz de calificación ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63, 1990. • » - " -1- FASTA puede también ser utilizado para determinar la identidad secuencial de las moléculas de ácido nucleico utilizando una proporción como se describe anteriormente. Para las comparaciones de la secuencia nucleotídica, el valor ktup puede estar en el intervalo de entre uno a seis, preferentemente de cuatro a seis. La presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido que tiene una o más "sustituciones conservadoras de aminoácidos", en comparación con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden estar basadas en las propiedades químicas de los aminoácidos. Es decir, pueden ser obtenidas las variantes que contienen una o más de las sustituciones de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2, en las cuales un alquilaminoácido está sustituido por un alquilaminoácido en una secuencia de aminoácidos de zacrp7, un aminoácido aromático está sustituido por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácidos de zacrp7, un aminoácido que contiene azufre está sustituido con un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácidos de zacrp7, un aminoácido que contiene hidroxilo está sustituido por un aminoácido que contiene hidroxilo en una secuencia de aminoácidos de zacrp7, un aminoácido ácido está sustituido por un aminoácido ácido en una secuencia de aminoácidos de zacrp7, un aminoácido básico está sustituido por un aminoácido básico en una secuencia de aminoácidos de zacrp7 o un aminoácido monocarboxílico dibásico está sustituido por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácidos de zacrp7. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" es ilustrada por una sustitución entre los aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptofano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2,000 alineamientos múltiples locales de los segmentos de la secuencia proteica, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 89: 10915, 1992). En consecuencia, las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 pueden ser utilizadas para definir sustituciones conservadoras de aminoácidos que pueden ser introducidas dentro de las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos con base únicamente en las propiedades químicas (como se discutió anteriormente) , el lenguaje "sustitución conservadora de aminoácidos" preferentemente se refiere a una sustitución representada por un valor BLOSUM62 mayor de -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácido es conservadora si la sustitución está caracterizada por un valor BLOSUM62 de 0 , 1, 2 ó 3. De acuerdo a este sistema, las sustituciones conservadoras de 5 aminoácidos, preferidas, están caracterizadas por un valor BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 ó 3) , mientras que las sustituciones de aminoácidos conservadoras más preferidas están caracterizadas por un valor BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 ó 3) . 10 Los cambios conservadores de aminoácidos en un gen zacrp7 pueden ser introducidos mediante la sustitución de nucleótidos por los nucleótidos indicados en la SEQ ID NO. 1. Tales variantes "de aminoácidos conservadores" pueden ser obtenidas, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al 15 oligonucleótido, mutagénesis de exploración del ligador, mutagénesis utilizando la reacción en cadena de polimerasa y similares (ver Ausubel (1995) en las páginas 8-10 a 8-22; y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991) ) . La habilidad de tales variantes para 20 modular las interacciones celulares y extracelulares u otras propiedades de la proteína de tipo silvestre como se describe en la presente, pueden ser determinadas utilizando métodos estándares, tales como los ensayos descritos en la presente. Alternativamente, un polipéptido zacrp7 variante puede ser A-g-J . TI tlimUrflI " ".-^tlt identificado por la habilidad para enlazarse específicamente a los anticuerpos anti-zacrp7. Las proteínas de la presente invención pueden también comprender residuos de aminoácidos de origen no natural . Los residuos de aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietil-cisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homo-glutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3 , 3-dimetilprolina, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina. Varios métodos son conocidos en la técnica para la incorporación de los residuos de aminoácidos de origen no natural en las proteínas. Por ejemplo, un sistema in vi tro puede ser empleado en donde las mutaciones no en sentido son suprimidas utilizando ARNt supresores químicamente aminoacilados . Los métodos para sintetizar los aminoácidos y aminoacilar el ARNt son conocidos en la técnica. La transcripción y la traducción de los plásmidos que contienen las mutaciones no en sentido se lleva a cabo típicamente en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas son purificadas mediante cromatografía. Ver, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991, Ellman et al., Methods Enzymol . 202: 301, 1991, Chung et al., Science 259: 806, 1993, y Chung et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 90: 10145, 1993. 5 En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y los ARNts supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991, 1996). Dentro de un tercer método, las células de E. coli son cultivadas en 10 ausencia de un aminoácido natural que va a ser reemplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del o de los aminoácidos de origen no natural, deseados (por ejemplo, 2- azafenilalanina, 3 -azafenilalanina, 4-azafenilalanina, o 4- fluorofenilalanina) . El aminoácido de origen no natural es 15 incorporado dentro de la proteína en lugar de su contraparte natural. Ver, Koide et al., Biochem. 33: 7470, 1994. Los residuos de aminoácido de origen no natural pueden ser convertidos a especies de origen no natural mediante modificación química in vi tro. La modificación química puede 20 ser combinada con mutagénesis dirigida al sitio para expandir adicionalmente la gama de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2: 395, 1993) . Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético, 25 aminoácidos de origen no natural, y aminoácidos no naturales MÍÉIMI^,. . „..» , ,„ >. .. M r ______ > ».-. * ___ * pueden ser sustituidos por los residuos de aminoácidos zacrp7. Sustituciones múltiples de aminoácidos pueden ser realizadas y probadas utilizando métodos conocidos de mutagénesis y selección, tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 86: 2152, 1989). En resumen, estos autores describen los métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional, y luego secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden ser utilizados incluyen la representación visual de fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832, 1991, Ladner et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409, Huse, publicación Internacional No. WO 92/06204, y mutagénesis dirigida al sitio (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986, y Ner et al., DNA 7: 127, 1988) . Las variantes de las secuencias nucleotídicas y polipeptídicas de zacrp7 descritas pueden también ser generadas a través de revoltura de ADN como se describe por Stemmer, Nature 370; 389, 1994, Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 91: 10747, 1994, y publicación internacional No. WO 97/20078. En resumen, las moléculas variantes de ADN son generadas mediante recombinación homologa in vi tro por medio de fragmentación aleatoria de un ADN progenitor, seguido por remontaje o reensamble utilizando PCR, dando como resultado mutaciones puntuales aleatoriamente introducidas. Esta técnica puede ser modificada mediante el uso de una familia de moléculas progenitoras de ADN, tales como variantes alélicas o moléculas de ADN de diferentes especies, para introducir variabilidad adicional al proceso. La selección para la actividad deseada, seguida por las iteraciones adicionales de mutagénesis y el ensayo, proporcionan la "evolución" rápida de las secuencias mediante la selección de mutaciones deseables mientras que se seleccionan simultáneamente contra cambios dañinos. Los métodos de mutagénesis como se describe en la presente pueden ser combinados con métodos de selección automatizada de alto rendimiento, para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados, clonados, en las células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican para los polipéptidos biológicamente activos, o los polipéptidos que se enlazan con los anticuerpos anti-zacrp7, pueden ser recuperados de las células huésped y rápidamente secuenciados utilizando el equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos individuales de aminoácidos en un polipéptido de interés, y pueden ser aplicados a los polipéptidos de estructura desconocida. *' hf *|?JWt^<fc; Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden ser identificados de acuerdo a los procedimientos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de selección de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081, 1989, Bass et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 88: 4498, 1991, Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En la última técnica, las mutaciones simples de alanina son introducidas en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para la actividad biológica como se describe más adelante para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699, 1996. Las identidades de los aminoácidos esenciales pueden también ser inferidas del análisis de las homologías con zacrp7. La localización de los dominios de enlace al receptor de zacrp7 puede identificarse mediante análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcación de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos et al., Science 255: 306, 1992, Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899, 1992, y Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59, 1992. Además, zacrp7 marcado con biotina o FITC puede ser utilizado para la expresión de clonación de los receptores de zacrp7. La presente invención también proporciona fragmentos polipeptídicos o los péptidos que comprenden una porción que posee epítope de un polipéptido zacrp7 descrito en la presente. Tales fragmentos o péptidos pueden comprender un "epítope inmunogénico", el cual es una parte de una proteína que promueve una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es utilizada como un inmunógeno. Los péptidos que poseen epítope inmunogénico, pueden ser identificados utilizando métodos estándares (ver, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 81: 3998, 1983) . En contraste, los fragmentos polipeptídicos o los péptidos pueden comprender un "epítope antigénico", el cual es una región de una molécula proteica a la cual puede enlazarse específicamente un anticuerpo. Ciertos epítopes consisten de un tramo lineal o contiguo de aminoácidos, y la antigenicidad de tal epítope no es perturbada por agentes desnaturalizadores. Se sabe en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden imitar a epítopes de una proteína, pueden ser utilizados para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (ver, por ejemplo, Sutcliffe et al., Science 219: 660, 1983). En *^»" »-• i ?..*. ^-*»-consecuencia, los péptidos que poseen epítope antigénico y los polipéptidos de la presente invención son útiles para producir anticuerpos que se enlazan con los polipéptidos descritos en la presente. Los péptidos y polipéptidos que poseen epítope antigénico contienen preferentemente al menos cuatro a diez aminoácidos, al menos diez a quince aminoácidos, o aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. Tales péptidos y polipéptidos que poseen epítope pueden ser producidos mediante la fragmentación de un polipéptido zacrp7, o mediante síntesis química de péptidos, como se describe en la presente. Además, los epítopes pueden ser seleccionados mediante representación visual del fago de las genotecas de péptidos aleatorios (ver, por ejemplo, Lañe y Stephen, Curr. Opin. Immunol . 5: 268, 1993, y Coirtese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616, 1996). Los métodos estándares para identificar epítopes y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítope son descritos, por ejemplo, por Mole, "Epitope Mapping", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-16 (The Humana Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies" en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan et al., (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1-9.3.5 y páginas 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997). No obstante de las secuencias nucleotídicas particulares de un gen zacrp7 variante, el gen codifica para un polipéptido que está caracterizado por su habilidad de modular las interacciones celulares o extracelulares, u otras actividades de la proteína de tipo silvestre como se describe en la presente, o por la habilidad para enlazarse específicamente a un anticuerpo anti-zacrp7. Más específicamente, los genes zacrp7 variantes codifican para los polipéptidos que muestran al menos 50%, y preferentemente, más de 70, 80 ó 90% de la actividad del polipéptido codificado por el gen zacrp7 humano descrito en la presente. Para cualquier polipéptido zacrp7, incluyendo las variantes y proteínas de fusión, una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede degenerar fácilmente una secuencia polinucleotídica completamente degenerada que codifica para esa variante, utilizando la información descrita en las Tablas 2 y 3 anteriores. Además, aquellos expertos en la técnica pueden utilizar programas estándares para divisar las variantes de zacrp7 con base en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos descritas en la presente. En consecuencia, la presente invención incluye un medio legible en computadora codificado con una estructura de datos que proporciona al menos una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO . 1, SEQ ID ?O. 2 y SEQ ID ?O. 11. Las formas adecuadas de medios legibles en computadora incluyen los medios magnéticos y medios ópticamente legibles. Los ejemplos de medios magnéticos incluyen una unidad de disco duro o fija, un microcircuito de memoria de acceso aleatorio (RAM) , un disco flexible, una cinta lineal digital (DLT) , una antememoria de disco, y un disco ZIP. Los medios ópticamente legibles son ejemplificados por discos compactos (por ejemplo memoria de solo lectura de CD (ROM) , CD-reescribible (RW) y CD-grabable) , y discos versátiles/vídeo digitales (DVD) (por ejemplo, DVD-ROM, DVD-RAM y DVD+RW) . La presente invención proporciona además una variedad de fusiones polipeptídicas y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones polipeptídicas. Por ejemplo, un polipéptido zacrp7 puede ser preparado como una fusión a una proteína de dimerización como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Las proteínas de dimerización preferidas a este respecto incluyen los dominios de región constante de inmunoglobulina. Las fusiones de inmunoglobulina-polipéptido zacrp7 pueden ser expresadas en células manipuladas mediante ingeniería genética para producir una variedad de análogos de zacrp7 multiméricos. Los dominios auxiliares pueden ser fusionados a los polipéptidos zacrp7 para dirigirlos a células, tejidos, o macromoléculas, específicos (por ejemplo, colágeno) . Por ejemplo, un polipéptido zacrp7 o una proteína podría ser dirigido a un tipo celular predeterminado mediante la fusión de un polipéptido zacrp7 a un ligando que se enlaza específicamente a un receptor sobre la superficie de la célula objetivo. De esta manera, los polipéptidos y proteínas pueden ser dirigidos para fines terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido zacrp7 puede ser fusionado a dos o más porciones, tales como un marcador de afinidad para la purificación y un dominio de dirección al objetivo. Las fusiones polipeptídicas pueden también comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Ver, Tuan et al., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996. Las proteínas de fusión zacrp7 de la presente invención abarcan (1) un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: (a) moléculas polipeptídicas que comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO. 2 del residuo de aminoácido 1 (Met), 31 (Gln) o 51 (Gly) hasta el residuo de aminoácido 303 (Leu) ; (b) las moléculas polipeptídicas en el intervalo del aminoácido 51 (Gly) hasta el aminoácido 153 (Cys) de la SEQ ID NO. 2, una porción del polipéptido zacrp7 que contiene el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar al colágeno capaz de realizar la dimerización u oligomerización; . . ^. (c) las moléculas polipeptídicas en el intervalo de aminoácido 154 (Arg) a 303 (Leu) de la SEQ ID NO. 2, una porción del polipéptido zacrp7 que contiene el dominio Clq o una porción activa del dominio Clq; o (d) las moléculas polipeptídicas en el intervalo del aminoácido 51 (Gly) al 303 (Leu) , una porción del polipéptido zacrp7 que incluye el dominio similar al colágeno y el dominio Clq; y (2) otro polipéptido. El otro polipéptido puede ser un dominio Clq alternativo o adicional, un dominio alternativo o adicional similar a colágeno, un péptido de señal para facilitar la secreción de la proteína de fusión o similar. Tales dominios pueden ser obtenidos a partir de otros miembros de la familia de proteínas relacionadas al complemento de adipocitos, otras proteínas que tienen dominios de colágeno y/o de Clq como se describe en la presente. El dominio globular del complemento se enlaza a IgG, de este modo, el dominio globular del polipéptido zacrp7, el fragmento o la fusión puede tener un papel similar. Los polipéptidos zacrp7, están en el intervalo del aminoácido 1 (Met) hasta el aminoácido 303 (Leu) ; los polipéptidos zacrp7 maduros están en el intervalo del aminoácido 31 (Gln) hasta el aminoácido 303 (Leu) ; o los fragmentos guía de secreción de los mismos, cuyos fragmentos están en el intervalo del aminoácido 1 (Met) hasta el aminoácido 30 (Gly) , pueden ser utilizados en el estudio de ...t..? 1 t .__!__£_____________ secreción de las proteínas a partir de las células. En modalidades preferidas de este aspecto de la invención, los polipéptidos maduros son formados como proteínas de fusión con secuencias de señal secretoras, putativas; los plásmidos que poseen regiones reguladoras capaces de dirigir la expresión de la proteína de fusión, son introducidos dentro de las células de prueba; y se verifica la secreción de la proteína madura. La verificación puede ser realizada mediante técnicas conocidas en la materia, tales como HPLC y similares. Los polipéptidos de la presente invención, incluyendo proteínas de longitud completa, fragmentos de las mismas y proteínas de fusión, pueden ser producidos en células huésped manipuladas mediante ingeniería genética de acuerdo a las técnicas convencionales. Las células huésped adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden ser transformados o transfectados con ADN exógeno y desarrollados en cultivo, e incluyen bacterias, células de hongos, y células eucarióticas superiores cultivadas. Las células eucarióticas, particularmente las células cultivadas de organismos multicelulares, son preferidas. Las técnicas para manipular las moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno dentro de una variedad de células huésped son descritas por Sambrook et al., ibid. , y Ausubel et al. ibid. ».. -.-»,..¿a^» En general, una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido zacrp7 de la presente invención está operablemente enlazada a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, que incluye en general un promotor de la 5 transcripción y el terminador dentro de un vector de expresión. El vector contendrá también comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que dentro de ciertos sistemas los marcadores 10 seleccionables pueden ser proporcionados sobre vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede ser proporcionada por la integración dentro del genoma de la célula huésped. La selección de los promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros 15 elementos es un asunto de diseño rutinario dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Muchos de tales elementos son descritos en la literatura y son disponibles a través de proveedores comerciales. Para dirigir un polipéptido zacrp7 hacia la vía 20 secretora de una célula huésped, una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia guía, secuencia de señal, secuencia prepro o presecuencia) es proporcionada en el vector de expresión. La secuencia de señal secretora puede ser aquella del polipéptido zacrp7, o 25 puede ser derivada de otra proteína secretada (por ejemplo, fiA1--"aa-^a*i"'- ' t-PA) o sintetizada de novo . La secuencia de señal secretora está unida a la secuencia del ADN del polipéptido zacrp7 en la estructura de lectura correcta. Las secuencias de señal secretoras son comúnmente colocadas 5 ' a la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de interés, aunque pueden ser colocadas ciertas secuencias de señal en otro sitio en la secuencia de ADN de interés (ver, por ejemplo Welch et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,037,743; Holland et al, Patente de los Estados Unidos No. 5,143,830). De manera contraria, la porción de la secuencia de señal del polipéptido zacrp7 (residuos de aminoácidos 1-30 de la SEQ ID NO. 2) pueden ser empleados para dirigir la secreción de una proteína alternativa mediante métodos análogos. La secuencia de señal secretora contenida en los polipéptidos de la presente invención puede ser utilizada para dirigir otros polipéptidos hacia la vía secretora. La presente invención proporciona tales polipéptidos de fusión. Un polipéptido de fusión de señal puede ser elaborado en donde una secuencia de señal secretora derivada de los residuos de aminoácidos 1-30 de la SEQ ID NO. 2 está operablemente enlazado a otro polipéptido utilizando los métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. La secuencia de señal secretora contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención está preferentemente fusionada amino-terminalmente a un péptido adicional para dirigir el péptido adicional hacia la vía secretora. Tales construcciones tienen numerosas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estas novedosas construcciones de fusión de la secuencia de señal secretora, pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína normalmente no secretada, tal como un receptor. Tales fusiones pueden ser utilizadas in vivo o in vi tro para dirigir los péptidos a través de la vía secretora. Las células de mamífero cultivadas son huéspedes adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir ADN exógeno dentro de las células huésped de mamífero incluyen transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52 : 456, 1973), electroporación (Neumman et al., EMBO J . 1 : 841-5, 1982), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid. ) y transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993, y vectores virales (Miller y Rosman, BioTechniques 7 : 980-90, 1989; Wang y Finer, Nature Med . 2 ; 714-6, 1996) . La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas se describe, por ejemplo, por Levinson et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,713,339; Hagen et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,784,950; Palmiter et al., Patente de los * *_« __ & * * - * a, ,^^^^^^-^^ Estados Unidos No. 4,579,821; y Ringold, Patente de los Estados Unidos No. 4,656,134. Las células de mamífero cultivadas, adecuadas incluyen las células COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) y ovario de hámster Chino (por ejemplo CHO-Kl; ATCC No. CCL 61, DG44 CHO, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-666, 1986). Las líneas celulares adecuadas adicionales son conocidas en la técnica y disponibles de depositarios públicos tales como la American Type Culture Collection, Manassas, VA. En general, los promotores fuertes de la transcripción son preferidos, tales como los promotores del SV-40 o del citomegalovirus. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de los genes de la metalotioneína (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor tardío mayor del adenovirus . La selección con fármaco es en general utilizada para seleccionar las células de mamífero cultivadas dentro de las cuales ha sido insertado el ADN extraño. Tales células son comúnmente denominadas como "transfectantes". las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie, son denominadas como "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica para la resistencia al antibiótico neomicina. La selección es llevada a cabo en presencia de un fármaco tipo neomicina, tal como G-418 o similar. Los sistemas de selección pueden también ser utilizados para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado como "amplificación" . La amplificación es llevada a cabo mediante el cultivo de los transfectantes en presencia de un bajo nivel del agente selectivo y luego incrementando la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable, amplificable, preferido, es la dihidrofolato-reductasa, la cual confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a fármacos múltiples, la puromicina-acetiltransferasa) pueden también ser utilizados. Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tales como la proteína fluorescente verde, o las proteínas de la superficie celular tales como CD4, CD8, MHC de la Clase I, fosfatasa alcalina placentaria, pueden también ser utilizados para clasificar las células transfectadas de las células no transfectadas mediante medios tales como clasificación por FACS o la tecnología de separación con esferas magnéticas.

Otras células eucarióticas superiores pueden también ser utilizadas como huéspedes, incluyendo células vegetales, células de insecto y células de ave. El uso de Agrobacterium rhizogenes como un vector para la expresión de los genes en células vegetales ha sido revisado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. La transformación de las células de insecto y la producción de polipéptido extraños en éstas se describe por Guarino et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,162,222 y publicación OMPI WO 94/06463. Las células de insecto pueden ser infectadas con baculovirus recombinantes, comúnmente derivados del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) . Ver, King y Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman y Hall; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual , Nueva York, Oxford University Press., 1994; y Richardson, C. D., Ed. , Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Un segundo método para la elaboración de zacrp7 recombinante en baculovirus utiliza un sistema basado en transposón descrito por Luckow (Luckow et al., J. Virol. 67: 4566-79, 1993) . Este sistema, el cual utiliza los vectores de transferencia, es vendido en el equipo Bac-to-BacMR (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBaclMR (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica para el polipéptido zacrp7 hacia un genoma baculoviral mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado "bácmido" . El vector de transferencia pFastBacl" utiliza el promotor de la polihedrina AcNPV para impulsar la expresión del gen de interés, en este caso zacrp7. No obstante, pFastBaclMR puede ser modificado a un grado considerable. El promotor de la polihedrina puede ser removido y sustituido con el promotor de la proteína básica del baculovirus (también conocido como Peor, p6.9 o promotor MP) el cual es expresado tempranamente en la infección baculoviral, y ha mostrado que es ventajoso para la expresión de la proteína secretada. Ver, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994; y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. En tales construcciones de vector de transferencia, puede ser utilizada una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, los vectores de transferencia pueden ser construidos, los cuales reemplazan las secuencias de señal secretoras zacrp7, nativas con secuencias de señal secretoras derivadas de proteínas de insectos. Por ejemplo, una secuencia de señal secretora de la eedisteroide-glucosiltransferasa (EGT) , la melitina de abeja mielera (Invitrogen, Carlsbad, CA) , o baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) pueden ser utilizados en las construcciones para reemplazar la secuencia de señal secretora zacrp7 nativa. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión intraestructural con el ADN que codifica para un marcador de epítope en el extremo C o N del polipéptido zacrp7 expresado, por ejemplo, un marcador del epítope Glu-Glu (Grussenmeyer et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 82 : 7952-4, 1985) . Utilizando una técnica conocida en la materia, un vector de transferencia que contiene zacrp7 es transformado en E. coli , y seleccionado para los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicador del baculovirus recombinante. El ADN bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante es aislado, utilizando técnicas comunes, y utilizado para transfectar células de Spodoptera frugiperda, por ejemplo células Sf9. El virus recombinante que expresa zacrp7 es subsecuentemente producido. Las reservas virales recombinantes son elaboradas mediante métodos comúnmente utilizados en la técnica. El virus recombinante es utilizado para infectar células huésped, típicamente una línea celular derivada del gusano devastador del otoño, Spodoptera frugiperda . Ver en general Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C. 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveOMR (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente de los Estados Unidos #5,300,435).

Los medios libres de suero comercialmente disponibles son utilizados para desarrollar y mantener las células. Los medios adecuados son Sf900 II"11 (Life Technologies) o ESF 921^ (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex- 5 cellO405MR (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO"11 (Life Technologies) para las células de T. ni . Las células son desarrolladas a partir de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células hasta una densidad de 1-2 x 106 células, tiempo en el cual se agrega una reserva viral 10 recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 a 10, más típicamente cercana a 3. Los procedimientos utilizados son en general descritos en los manuales de laboratorio disponibles (King and Possee, ibid; O'Reilly et al., ibid; Richardson, ibid) . La purificación subsecuente 15 del polipéptido zacrp7 a partir del sobrenadante puede ser lograda utilizando los métodos descritos en la presente. Las células fúngicas, incluyendo células de levadura, pueden también ser utilizadas dentro de la presente invención. Las especies de levadura de interés particular a 20 este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica . Los métodos para transformar células de S cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de éstas, son descritos por ejemplo por Kawasaki, Patente de los Estados Unidos No. 25 4,599,311; Kawasaki y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,931,373; Brake, Patente de los Estados Unidos No. 4,870,008; Welch y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,037,743; y Murray y colaboradores; Patente de los Estados Unidos No. 4,845,075. Las células transformadas son seleccionadas por fenotipo, determinado por marcador seleccionable, comúnmente la resistencia a fármacos o la habilidad para desarrollarse en ausencia de un nutriente particular (por ejemplo leucina) . Un sistema vector preferido para el uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vector POTl descrito por Kawasaki y colaboradores (Patente de los Estados Unidos No. 4,931,373), que permite que las células transformadas sean seleccionadas por desarrollo en medios que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para el uso en levaduras incluyen aquellos de los genes de enzimas glucolíticas (ver por ejemplo Kawasaki, Patente de los Estados Unidos No. 4,599,311; Kingsman y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,615,974; y Bitter, Patente de los Estados Unidos No. 4,977,092) y los genes de la deshidrogenasa alcohólica. Ver también las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Los sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida mal tosa son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo Gleeson y colaboradores, J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986 y Cregg, Patente de los Estados Unidos No. 4,882,279. Las células de Aspergillus pueden ser utilizadas de acuerdo a los métodos de McKnight y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,935,349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum son descritos por Sumino y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,162,228. Los métodos para transformar Neurospora son descritos por Lambowitz, Patente de los Estados Unidos No. 4,486,533. El uso de Pichia methanolica como huésped para la producción de proteínas recombinantes es descrito en las publicaciones de la OMPI WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para el uso en la transformación de P. methanolica serán comúnmente preparadas como plásmidos circulares, de doble hebra, los cuales son preferentemente linearizados antes de la transformación. Para la producción del polipéptido en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sea aquel de un gen de P. methanolica, tal como un gen de utilización del alcohol de P. methanolica {AUG1 o AUG2) . Otros promotores útiles incluyen aquellos de los genes de la dihidroxiacetona-sintasa (DHAS) , formiato-deshidrogenasa (FMD) , y catalasa (CAT) . Para facilitar la integración del ADN dentro del cromosoma del huésped, se prefiere tener el segmento de expresión completo del plásmido flanqueado en ambos extremos por las secuencias huésped de ADN. Un marcador seleccionable preferido para el uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, el cual codifica para la fosforribosil-5-aminoimidazol-carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite que las células huésped ade2 se desarrollen en ausencia de adenina. Para los procesos industriales a gran escala, donde es deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere utilizar las células huésped en las cuales ambos genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2) están suprimidos. Para la producción de proteínas secretadas, las células huésped deficientes en los genes de la proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1) son preferidas. La electroporación es utilizada para facilitar la introducción de un plásmido que contiene el ADN que codifica para un polipéptido de interés dentro de células de P. methanolica . Se prefiere transformar las células de P. methanolica mediante la electroporación utilizando un campo eléctrico pulsado de decaimiento exponencial, que tiene la fuerza de campo desde 2.5 hasta 4.5 kV/cm, preferentemente aproximadamente 3.75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, más preferentemente de aproximadamente 20 milisegundos. 'Í__tt _-. .l i ^. ? .¿ r r A.

Las células huésped procarióticas, incluyendo las cepas de las bacterias Escherichia coli , Bacillus y otros géneros, son también útiles como células huésped dentro de la presente invención. Las técnicas para la transformación de 5 estos huéspedes y la expresión de las secuencias de ADN extrañas clonadas en éstos son bien conocidas en la materia (ver por ejemplo Sambrook y colaboradores, ibid. ) . Cuando se expresa un polipéptido zacrp7 en bacterias tales como E. coli , el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, 10 típicamente corao granulos insolubles, o puede ser dirigido hacia el espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células son lisadas, y los granulos son recuperados y desnaturalizados utilizando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El 15 polipéptido desnaturalizado puede ser luego replegado y dimerizado mediante la dilución del desnaturalizante, tal como mediante la diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido por diálisis contra una solución salina amortiguada. En el 20 último caso, el polipéptido puede ser recuperado del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional mediante la desintegración de las células (por ejemplo mediante sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, con lo cual se í?f fflfti¡¡ iS • evita la necesidad para la desnaturalización y el replegamiento . Las células huésped transformadas o transfectadas son cultivadas de acuerdo a los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el desarrollo de las células huésped elegidas. Una variedad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, son conocidos en la técnica y en general incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios pueden también contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, como se requiera. El medio de crecimiento seleccionará en general las células que contienen el ADN exógenamente agregado, mediante por ejemplo la selección del fármaco o la deficiencia en un nutriente esencial el cual es complementado por el marcador seleccionable llevado sobre el vector de expresión o co-transfectado dentro de la célula huésped. Los polipéptidos zacrp7 recombinantes expresados (o los fragmentos zacrp7 o los polipéptidos de fusión) pueden ser purificados utilizando métodos y medios de purificación convencionales y/o de fraccionamiento. La precipitación con sulfato de amonio y la extracción con ácido o caótropo puede ser utilizada para el fraccionamiento de las muestras. Los pasos de purificación ejemplares pueden incluir la cromatografía con hidroxiapatita, por exclusión de tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad y similares. Los derivados de PEÍ y DEAE, QAE y Q son los preferidos. Los medios cromatográficos ejemplares incluyen aquellos medios derivatizados con los grupos fenilo, butilo, u octilo, tales como fenil-sefarosa FF (Pharmacia) , Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA) , Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen esferas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, esferas de agarosa, esferas de agarosa reticuladas, esferas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares, que son insolubles bajo las condiciones en las cuales éstas van a ser utilizadas. Estos soportes pueden ser modificados con los grupos reactivos que permiten el acoplamiento de las proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o porciones carbohidrato. Los ejemplos de las químicas de acoplamiento incluyen la activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidracida, y derivados carboxilo y amino para las químicas de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios son bien conocidos y ampliamente utilizados en la técnica, y son disponibles de proveedores comerciales. Los métodos para el enlace de los polipéptidos receptores a los medios de soporte son bien conocidos en la técnica. La selección de un método particular es un asunto de diseño rutinario y es determinada en parte por las propiedades del soporte elegido. Ver, por ejemplo, Affinity Chromatography; Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser aislados mediante explotación de sus propiedades estructurales o de enlace. Por ejemplo, la cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) puede ser utilizada para purificar las proteínas ricas en histidina o las proteínas que tienen marcador His. En resumen, un gel es primeramente cargado con los iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985) . Las proteínas ricas en histidina serán adsorbidas a esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ion metálico utilizado, y serán eluidas mediante elución competitiva, disminuyendo el pH, o el uso de agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de las proteína glucosiladas mediante cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol , Vol, 182, "Guide to *» ' «-• Protein Purification", Deutscher, (ed) , Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39) . Dentro de una modalidad adicional preferida de la invención, una fusión del polipéptido de interés y un marcador de afinidad (por ejemplo la proteína de enlace a la maltosa, FLAG, Glu-Glu, un dominio de inmunoglobulina) puede ser construida para facilitar la purificación como se discute con mayor detalle en las secciones de Ejemplo siguientes. Los procedimientos de replegamiento de proteínas (y opcionalmente, la reoxidación) pueden ser ventajosamente utilizados. Se prefiere purificar la proteína hasta una pureza mayor de >80%, más preferentemente >90% de pureza, aún más preferentemente >95% de pureza y particularmente se prefiere un estado farmacéuticamente puro, que es más de 99.9% puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferentemente, la proteína purificada está sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas de origen animal. Los polipéptidos o fragmentos de zacrp7 pueden también ser preparados a través de la síntesis química mediante métodos bien conocidos en la materia, tales como la síntesis en fase sólida exclusiva, los métodos en fase sólida parcial, la condensación de fragmentos o la síntesis en solución clásica, ver por ejemplo Merrifield, J. Am. Chem.

Soc. 85:2149, 1963. Tales polipéptidos zacrp7 pueden ser monómeros o multímeros; glucosilados o no glucosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo de aminoácido metionina inicial. Un polipéptido que se enlaza al ligando, tal como un polipéptido que es enlaza a zacrp7 puede también ser utilizado para la purificación del ligando. El polipéptido es inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como esferas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas de celulosa, resinas basadas en sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada, o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para enlazar los polipéptidos a los soportes sólidos son conocidos en la técnica, e incluyen la química de la amina, activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, y activación con hidrazida. El medio resultante estará en general configurado en la forma de una columna, y los fluidos que contienen el ligando se hacen pasar a través de la columna una o más veces para permitir que el ligando se enlace al polipéptido que se enlaza al ligando. El ligando es luego eluido utilizando cambios en la concentración salina, agentes caotrópicos (clorhidrato de guanidina) , o pH para desintegrar el enlace ligando-receptor.

Un sistema de ensayo que utiliza un ligando-receptor de enlace (o un anticuerpo, un miembro de un par complemento/anticomplemento) o un fragmento de enlace del mismo, y un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) puede ser ventajosamente empleado. Tal receptor, anticuerpo, miembro de un par complemento/anticomplemento o fragmento del mismo, es inmovilizado sobre la superficie de una microplaca receptora. El uso de este instrumento es descrito por Karlsson, J. Immunol . Methods 145:229-40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento del mismo es covalentemente enlazado, utilizando la química de la amina o del sulfhidrilo, a fibras de dextrano que son acopladas a la película de oro dentro de la celda de flujo. Una muestra de prueba se hace pasar a través de la celda. Si un ligando, epítope o miembro opuesto del par complemento/anticomplemento está presente en la muestra, éste se enlazará al receptor inmovilizado, al anticuerpo o al miembro, respectivamente, provocando un cambio en el índice de refracción del medio, que es detectado como un cambio en la resonancia de plasmón superficial de la película de oro. Este sistema permite la determinación de las velocidades de encendido y apagado a partir de las cuales puede ser calculada la afinidad de enlace, y la evaluación de la estequiometría del enlace.

Los polipéptidos que se enlazan al ligando pueden también ser utilizados dentro de otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Tales sistemas incluyen el análisis de Scatchard para la determinación de la afinidad de enlace (ver Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham y colaboradores, Science 253:545-48, 1991; Cunningham y colaboradores, Science 245:821-25 1991) . La invención también proporciona los anticuerpos anti-zacrp7. Los anticuerpos para zacrp7 pueden ser obtenidos, por ejemplo, utilizando como un antígeno el producto de un vector de expresión de zacrp7, o zacrp7 aislado de una fuente natural. Los anticuerpos anti-zacrp7 particularmente útiles "se enlazan específicamente" con zacrp7. Se considera que los anticuerpos se enlazan específicamente si los anticuerpos se enlazan a un polipéptido, péptido o epítope de zacrp7 con una afinidad de enlace (Ka) de 106 M"1 o mayor, preferentemente 107 M"1 o mayor, más preferentemente 108 M"1 o mayor, y lo más preferentemente de 109 M"1 o mayor. La afinidad de enlace de un anticuerpo puede ser fácilmente determinada por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949). Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos que se enlazan con zacrp7 en dominios particulares . Los anticuerpo anti-zacrp7 pueden ser producidos utilizando los péptidos y polipéptidos que llevan el epítope zacrp7 antigénico. Los péptidos y polipéptidos que llevan el epítope antigénico de la presente invención contienen una secuencia de al menos nueve, preferentemente entre 15 a aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la SEQ ID No. 2. No obstante, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción más grande de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contienen de 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia completa de aminoácidos de un polipéptido de la invención, son también útiles para inducir los anticuerpos que se enlazan con zacrp7. Es deseable que la secuencia de aminoácidos del péptido que posee el epítope, se seleccione para proporcionar solubilidad sustancial en solventes acuosos (por ejemplo, la secuencia incluye residuos relativamente hidrofílicos, mientras que los residuos hidrofóbicos son preferentemente evitados) . Los péptidos hidrofílicos pueden ser predichos por una persona de experiencia en la técnica a partir de una gráfica de hidrofobicidad, ver por ejemplo, Hopp y Woods (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:3824-8, 1981) y Kyte y Doolittle (J. Mol. Biol. 157:105-142, 1982). Además, las secuencias de aminoácidos que contienen los residuos de prolina pueden ser también deseables para la producción del anticuerpo. Los anticuerpos policlonales para la proteína zacrp7 recombinante o para zacrp7 aislada de fuentes 5 naturales, pueden ser preparados utilizando los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver por ejemplo Green y colaboradores, "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed) , páginas 1-5, (Humana Press 1992), y Williams y colaboradores, 10 "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2a. Edición, Glover y colaboradores, (eds) , página 15 (Oxford University Press 1995) . La inmunogenicidad de un polipéptido zacrp7 puede ser 15 incrementada a través del uso de un adyuvante, tal como alumbre (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen los polipéptidos de fusión, tales como las fusiones de zacrp7 o una porción de la misma 20 con un polipéptido de inmunoglobulina o con la proteína de enlace a la maltosa. El inmonógeno polipeptídico puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción polipeptídica es "similar a un hapteno", tal porción puede ser ventajosamente unida o ligada a un portador 25 macromolecular (tal como la hemocianina de lapa (KLH) , astas*-*"¿ --albúmina sérica bovina (BSA) o toxoide tetánico) para la inmunización. Aunque los anticuerpos policlonales son típicamente producidos en animales tales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, hámsteres, cobayos, cabras u ovejas, un anticuerpo anti-zacrp7 de la presente invención puede también ser derivado de un anticuerpo de primate subhumano. Las técnicas generales para producir anticuerpos diagnóstica y terapéuticamente útiles en babuinos pueden ser encontradas, por ejemplo, en Goldenberg y colaboradores, publicación de patente internacional No. WO 91/11465, y en Losman y colaboradores, Int. J. Cáncer 46:310, 1990. Los anticuerpos pueden también ser producidos en animales transgénicos tales como cabras, vacas, ovejas o cerdos transgénicos, y pueden también ser expresados en levaduras y en hongos en formas modificadas, así como en células de insecto y de mamífero. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales anti-zacrp7 pueden ser generados. Los anticuerpos monoclonales de roedor para los antígenos específicos pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver por ejemplo, Kohier y colaboradores, Nature 256:495 (1975), Coligan y colaboradores (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley y colaboradores, "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli " , en DNA Cloning 2 : Expression Systems 2a. edición, Glover y colaboradores (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). En resumen, los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos al inyectar a ratones con una composición que comprende un producto del gen zacrp7, verificando la presencia de la producción del anticuerpo mediante el retiro de una muestra de suero, retirando el bazo para obtener los linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma par producir hidridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos para el antígeno, y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. Además, un anticuerpo anti-zacrp7 de la presente invención puede ser derivado de un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos son obtenidos de ratones transgénicos que han sido manipulados mediante ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta al reto antigénico. En esta técnica, los elementos de los locus de la cadena pesada y ligera humanas, son introducidos dentro de las cepas de ratones derivados de líneas de células totipotenciales embrionarias que contienen desintegraciones dirigidas de los tuA^Aa^.^». . loci de las cadenas pesada y ligera endógenas. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para los antígenos humanos, y los ratones pueden ser utilizados para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos son descritos, por ejemplo, por Green y colaboradores, Nature Genet . 7:13, 1994, Lonberg y colaboradores, Nature 368 :856, 1994, y Taylor y colaboradores, Int. Immun. 6.579, 1994. Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados y purificados a partir de cultivos de hibridoma mediante una variedad de técnicas bien conocidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con proteína A Sepharose, cromatografía de exclusión de tamaño, y cromatografía de intercambio iónico (ver por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y páginas 2.9.1-2.9.3; Baines y colaboradores, "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Para usos particulares, puede ser deseable preparar los fragmentos de los anticuerpos anti-zacrp7. Tales fragmentos de anticuerpo pueden ser obtenidos, por ejemplo mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser obtenidos mediante digestión con pepsina o papaína de los anticuerpos completos ~ t * -mediante métodos convencionales. Como una ilustración, los fragmentos de anticuerpo pueden ser producidos mediante escisión enzimática de los anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento puede ser además escindido utilizando un agente de reducción de tilo para producir los fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de escisión puede ser realizada utilizando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de los enlaces disulfuro. Como una alternativa, una escisión enzimática utilizando pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fe directamente. Estos métodos son descritos por ejemplo por Goldenberg, patente de los Estados Unidos No. 4,331,647, Nisonoff y colaboradores, Arch Biochem. Biophys, 89:230, 1960, Porter, Biochem. J. 73_:H9, 1959, Edelman y colaboradores, en Methods in Enzymology Vol. 1, página 422 (Academic Press 1967) , y por Coligan, ibid. Otros métodos para escindir los anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, la escisión adicional de los fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, pueden también ser utilizados, siempre y cuando los fragmentos se enlacen al antígeno que se ha reconocido por el anticuerpo intacto. aaé 4 i *» * ' Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de las cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe por Inbar y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci, USA 6_9:2659, 1972. Alternativamente, 5 las cadenas variables pueden ser ligadas por un enlace disulfuro intermolecular o reticuladas por productos químicos tales como gluteraldehído (ver por ejemplo, Sandhu, Crit . Rev. Biotech. 12:437, 1992) . Los fragmentos Fv pueden comprender cadenas V y V 10 que están conectadas por un enlazador peptídico. Estas proteínas de enlace al antígeno de la cadena simple (scFv) son preparadas mediante la construcción de un gen estructural que comprende las secuencias de ADN que codifican para los dominios VH y VL que están conectados por un oligonucleótido. 15 El gen estructural es insertado dentro de un vector de expresión el cual es subsecuentemente introducido dentro de una célula huésped, tal como E. coli . Las células huésped recombinantes sintetizan una cadena polipeptídica simple con un péptido enlazador que une los dos dominios V. Los métodos 20 para producir los scFvs son descritos, por ejemplo, por Whitlow y colaboradores, Methods : A Companion to Methods in Enzimology 2:97, 1991, también ver Bird y colaboradores, Science 242:423, 1988, Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778, Pack y colaboradores, 25 Bio/Technology 11:1271, 1993, y Sandhu, ibid.

Como una ilustración, un scFV puede ser obtenido mediante la exposición de los linfocitos al polipéptido zacrp7 in vitro, y seleccionando las genotecas de representación visual del anticuerpo en vectores fago o similares (por ejemplo, a través del uso de la proteína o el péptido zacrp7 inmovilizado o marcado) . Los genes que codifican para los polipéptidos que tienen dominios potenciales de enlace al polipéptido zacrp7, pueden ser obtenidos mediante la selección de las genotecas de péptidos aleatorios mostradas sobre el fago (representación visual del fago) o sobre bacterias, tales como E. coli . Las secuencias nucleotídicas que codifican para los polipéptidos pueden ser obtenidas en un número de formas, tales como a través de la mutagénesis aleatoria y síntesis de polinucleótido aleatoria. Estas genotecas de representación visual de péptidos aleatorios pueden ser utilizadas para seleccionar los péptidos que interactúan con un objetivo conocido, que puede ser una proteína o un polipéptido, tal como un ligando receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para la creación y selección de tales genotecas de representación visual de péptidos aleatorios son conocidas en la materia (Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409, Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778, Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,403,484, Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,571,698, y Kay y colaboradores, Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) y las genotecas de representación visual de péptidos aleatorios y los equipos para la selección de tales genotecas son disponibles comercialmente, por ejemplo de Clontech (Palo Alto, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego, CA) , New England Biolabs, Inc.

(Beverly, MA) ; y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . Las genotecas de representación visual de péptidos aleatorios pueden ser seleccionadas utilizando las secuencias de zacrp7 descritas en la presente para identificar las proteínas que se enlazan a zacrp7. Otra forma más de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica para una región simple de determinación de la complementariedad (CDR). Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimas") pueden ser obtenidos mediante construcción de los genes que codifican para CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes son preparados, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de las células productoras de anticuerpo (ver por ejemplo, Larrick y colaboradores, Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y colaboradores, (eds.), página 166 (Cambridge University Press, 1995), y Ward y colaboradores, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principies and Application, Birch y colaboradores, (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). Alternativamente, un anticuerpo anti-zacrp7 puede ser derivado de un anticuerpo monoclonal "humanizado". Los anticuerpos monoclonales humanizados son producidos mediante la transferencia de las regiones de determinación de la complementariedad de ratón, a partir de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón dentro de un dominio variable humano. Los residuos típicos de los anticuerpos humanos son luego sustituidos en las regiones estructurales de las contrapartes murinas . El uso de los componentes de anticuerpo derivados de anticuerpos monoclonales humanizados evita los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas. Las técnicas generales para la clonación de los dominios variables de inmunoglobulina murinos se describen, por ejemplo por Orlandi y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:3833, 1989. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen por ejemplo por Jones y colaboradores, Nature 321:522, 1986, Cárter y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992, Singer y colaboradores, J. Immun. 150:2844, 1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", en Protein Engineering : Principies and Practice, Cleland y colaboradores (eds.), páginas 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), y por Queen y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,693,762 (1997). Los anticuerpos anti-idiotipo policlonales pueden ser preparados mediante la inmunización de animales con anticuepos anti-zacrp7 o fragmentos de anticuerpo, utilizando técnicas estándares. Ver por ejemplo, Green, y colaboradores, "Production of Polyclonal Antisera", en Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), páginas 1-12 (Humana Press 1992). También, ver Coligan, ibid. en las páginas 2.4.1-2.4.7. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales anti-idiotipo puede ser preparados utilizando los anticuerpos anti-zacrp7 o los fragmentos de anticuerpo como inmunógenos con las técnicas descritas anteriormente. Como otra alternativa, los anticuerpos anti-idiotipo humanizados o los anticuerpos anti-idiotipo de primate subhumano pueden ser preparados utilizando las técnicas anteriormente descritas. Los métodos para producir los anticuerpos anti-idiotipo son descritos, por ejemplo por Irie, Patente de los Estados tsi-^t Unidos No. 5,208,146, Greene, y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,637,677, y Varthakavi y Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875, 1996. Los genes que codifican para los polipéptidos que tienen dominios potenciales de enlace al polipéptido zacrp7, "proteínas de enlace", pueden ser obtenidos mediante la selección de las genotecas de péptidos aleatorios o dirigidos, mostradas sobre el fago (representación visual del fago) o sobre bacterias, tales como E. coli . Las secuencias nucleotídicas que codifican para los polipéptidos pueden ser obtenidas en un número de formas, tales como a través de mutagénesis aleatoria y síntesis aleatoria de polinucleótidos. Alternativamente, pueden también ser producidas las genotecas de representación visual de fagos constreñidos. Estas genotecas de representación visual de péptidos pueden ser utilizadas para seleccionar los péptidos que interactúan con un objetivo conocido que puede ser una proteína o un polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y seleccionar tales genotecas de representación de péptidos son conocidas en la técnica (Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409; Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778; Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No, 5,403,484 y Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,571,698) y las genotecas de representación visual de péptidos y los equipos para seleccionar tales genotecas son disponibles comercialmente, por ejemplo de Clontech (Palo Alto, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego, CA) , New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . Las genotecas de representación visual de péptidos pueden ser seleccionadas utilizando las secuencias zacrp7 descritas en la presente para identificar las proteínas que se enlazan a zacrp7. Estas "proteínas de enlace" que interactúan con los polipéptidos zacrp7 pueden ser utilizadas esencialmente como un anticuerpo. Una variedad de ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden ser utilizados para detectar los anticuerpos y/o las proteínas de enlace que se enlazan específicamente a las proteínas o péptidos zacrp7. Los ensayos ejemplares se describen, con detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) , manchado por puntos o ensayo de manchado de Western, ensayo de inhibición o competencia, y ensayo de emparedado. Además, los anticuerpos pueden ser seleccionados para el enlace a la proteína o polipéptido zacrp7 tipo silvestre versus mutante. Los anticuerpos y las proteínas de enlace a zacrp7 pueden ser utilizados para marcar células que expresan zacrp7; para aislar zacrp7 mediante purificación por afinidad; para ensayos de diagnóstico para la determinación de los niveles en circulación de los polipéptidos zacrp7; para la detección o cuantificación de zacrp7 soluble como marcador de la patología o enfermedad subyacente; en métodos analíticos que emplean FACS; para la selección de genotecas de expresión; para la generación de anticuerpos anti-idiotipo; y como anticuerpos neutralizadores o como antagonistas para bloquear la modulación del polipéptido zacrp7 de la espermatogénesis o actividad similar in vi tro o in vivo . Los marcadores directos adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; los marcadores indirectos pueden caracterizar el uso de biotina-avidina u otros pares complemento/anticomplemento como intermediarios. Además, los anticuerpos para zacrp7 o fragmentos del mismo, pueden ser utilizados in vi tro para detectar zacrp7 desnaturalizado o fragmentos del mismo en ensayos, por ejemplo, Manchados de Western u otros ensayos conocidos en la técnica.

Los anticuerpos o polipéptidos en la presente pueden también ser directa o indirectamente conjugados a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados utilizados para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vivo. Por ejemplo, los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anticomplementaria correspondiente (receptor o antígeno, respectivamente, por ejemplo) . Más específicamente, los polipéptidos zacrp7 o los anticuerpos anti-zacrp7 o fragmentos o porciones bioactivas de los mismos, pueden ser acoplados a moléculas detectables o citotóxicas y distribuidos a un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan la molécula anticomplementaria. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona los métodos para identificar los agonistas o antagonistas de los polipéptidos zacrp7 descritos anteriormente, cuyos agonistas o antagonistas pueden tener propiedades valiosas como se discute posteriormente en la presente. En una modalidad, se proporciona un método para identificar los agonistas del polipéptido zacrp7, que comprende la provisión de las células que responden a ésta, el cultivo de las células en presencia de un compuesto de prueba y la comparación de la respuesta celular con la célula i.í ¿ ?. cultivada en presencia del polipéptido zacrp7, y seleccionando los compuestos de prueba para los cuales la respuesta celular es del mismo tipo. Dentro de otra modalidad más, se proporciona un método de identificación de los antagonistas del polipéptido zacrp7, que comprende la provisión de las células que responden a un polipéptido zacrp7, el cultivo de una primera porción de las células en presencia del polipéptido zacrp7, el cultivo de una segunda porción de las células en presencia del polipéptido zacrp7 y un compuesto de prueba, y la detección de una disminución en una respuesta celular de la segunda porción de las células, en comparación a la primera porción de las células. Además de aquellos ensayos descritos en la presente, las muestras pueden ser probadas para la inhibición de la actividad de zacrp7 dentro de una variedad de ensayos diseñados para medir el enlace del receptor o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes de zacrp7. Por ejemplo, las líneas celulares que responden a zacrp7 pueden ser transfectadas con una construcción de gen reportero que responde a una vía celular estimulada por zacrp7. Las construcciones del gen reportero de este tipo son conocidas en la técnica, y comprenderán en general un elemento de respuesta al ADN de zacrp7 operablemente enlazado a un gen que codifica para una proteína evaluable, tal como la luciferasa. Los elementos de respuesta al ADN pueden incluir, pero no están limitados a, los elementos de respuesta al AMP cíclico (CRE) , los elementos de respuesta a hormonas (HRE) , elementos de respuesta a insulina (IRÉ) (Nasrin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci, USA 87:5273-7, 1990) y elementos de respuesta al suero (SRE) (Shaw y colaboradores, Cell 56: 563-72, 1989). Los elementos de respuesta al AMP cíclico son revisados en Roestler y colaboradores, J. Biol. Chem. 263 (19) :9063-6, 1988 y Habener, Molec. Endocrinol . 4 (8) :1087-94, 1990. Los elementos de respuesta a hormona son revisados en Beato, Cell 56:335-44; 1989. Los compuestos, soluciones, mezclas o extractos candidatos son probados para la habilidad de inhibir la actividad de zacrp7 sobre las células objetivo como se pone en evidencia por una disminución en la estimulación de zacrp7 de la expresión del gen reportero. Los ensayos de este tipo detectarán los compuestos que bloquean directamente el enlace de zacrp7 a los receptores de la superficie celular, así como los compuestos que bloquean los procesos en la vía celular subsiguientes al enlace receptor-ligando. En una alternativa, los compuestos u otras muestras pueden ser probados para el bloqueo directo del enlace de zacrp7 al receptor, utilizando zacrp7 marcado con un marcador detectable (por ejemplo 125I, biotina, peroxidasa de rábano, FITC y similares) . Dentro de los ensayos de este tipo, la habilidad de una muestra de prueba para inhibir el enlace de zacrp7 marcado al receptor, es indicadora de la actividad inhibitoria, que puede ser confirmada a través de ensayos secundarios. Los receptores utilizados dentro de los ensayos de enlace pueden ser receptores celulares o receptores inmovilizados, aislados. Las proteínas relacionadas al complemento de adipocitos están involucradas en las interacciones célula-célula o célula-matriz extracelular, particularmente aquellas que involucran la modulación de la remodelación del tejido. La manifestación fenotípica de muchas enfermedades autoinmunes y relacionadas a la remodelación es la activación extensiva de los procesos de remodelación inflamatoria y/o de tejidos. El resultado es frecuentemente que el órgano funcional o el tejido suborgánico es reemplazado por una variedad de componentes de matriz extracelular (ECM) incapaces de realizar la función de la estructura biológica reemplazada. Existe un entendimiento incompleto de los eventos de iniciación en estas enfermedades, y la deposición de la matriz extracelular excesiva, resultante. Se ha lanzado la hipótesis de que los eventos de iniciación involucran un daño o perturbación inicial de la regulación óptima de la estructura biológica. De manera interesante, algunas veces los componentes intracelulares son encontrados como autoantígenos, indicadores de las enfermedades particulares. Podría ser que la producción de anticuerpos »..<t«-l»U por el sistema inmune, después de la exposición excesiva a estas proteínas intracelulares, sea un resultado de la remodelación excesiva o inadecuada. Mediante la dirección del proceso de remodelación puede ser posible disminuir el efecto de los autoantígenos. Por lo tanto, los polipéptidos zacrp7, los fragmentos, fusiones, agonistas, antagonistas y similares del mismo, podrían ser benéficos en la mediación de una variedad de enfermedades autoinmunes y de remodelación. Es posible que una respuesta de remodelación inadecuada al tejido conectivo o al daño muscular en las coyunturas dé como resultado sensibilidad para la liberación excesiva de componentes celulares en el sitio del daño. Los polipéptidos zacrp7, fragmentos, fusiones y similares podrían ser útiles en la determinación si una asociación existe entre tal respuesta y la inflamación asociada con la artritis. Tales indicadores incluyen una reducción en la inflamación y alivio del dolor o rigidez. En modelos animales, las indicaciones podrían ser derivadas de la inspección macroscópica de las coyunturas y cambio en la hinchazón de los cuartos posteriores. Los polipéptidos zacrp6, fragmentos, fusiones y similares pueden ser administrados a modelos animales de osteoartritis (Kikuchi y colaboradores, Osteorarthritis Cartilage 6:177-86, 1998 y Lomhander y colaboradores, Artritis Rheum. 42:534-44, 1999) para buscar la inhibición de la destrucción del tejido que resulta de la inflamación estimulada por la acción de la colagenasa. Hallazgos recientes han mostrado que el diagnóstico de autoantígeno del escleroderma son lo que se podría considerar como proteínas citoplásmicas. Un animal suprimido en un gen para Zacrp6, como se describe en la presente, podría ser útil en la determinación de si los anticuerpos para las proteínas zacrp7, fragmentos, fusiones y similares son producidos como una respuesta a la inflamación debida a la reparación inadecuada o incompleta del tejido local en la respuesta al estrés. Los polipéptidos zacrp7, fragmentos, fusiones y similares, como se proporciona en la presente, podrían ser útiles en la determinación de si la remodelación arterial excesiva y/o inapropiada juega un papel en la formación de placas en la esclerosis arterial y en el daño arterial, tal como la oclusión arterial, utilizando los métodos proporcionados en la presente. El tratamiento de un daño vascular (y la matriz extracelular subyacente) con la proteína de complemento de adipocitos, zsig37 parece alterar el proceso de remodelación vascular en una etapa muy temprana (Patente de los Estados Unidos co-pendiente 09/253,604). El tratamiento con una proteína del complemento de adipocitos puede actuar para mantener las plaquetas relativamente quietas después del daño, eliminando el reclutamiento excesivo de las proteínas y células de prorremodelación y proinflamatorias . Otros miembros de la familia pueden modular la remodelación inducida por la presencia de grasa, o colesterol por ejemplo. Cantidades excesivas de colesterol y grasa en la sangre pueden activar la remodelación, en ausencia del miembro de la familia de proteína del complemento, de adipocitos, correcto. ACRP30 es expresado únicamente en tejido adiposo que prolifera activamente. La remodelación del tejido conectivo está estrechamente ligada a esta activación de las células adiposas. Existe claramente una conexión entre la ganancia excesiva de peso (grasa) y la diabetes. Es por lo tanto probable que ACRP30 esté involucrado en la remodelación de la grasa y este proceso es exacerbado en individuos obesos. Como resultado, los efectos del almacenamiento inapropiado e inadecuado de la grasa contribuyen al inicio de la diabetes tipo II. El balance de la energía (que involucra el metabolismo de energía, el estado nutricional, el almacenamiento de lípidos y similares) es un criterio importante para la salud. Esta homeostasis de la energía involucra la ingestión de alimento y el metabolismo de los carbohidratos y los lípidos para generar la energía necesaria para las funciones voluntarias e involuntarias. El metabolismo de las proteínas puede conducir a la generación de energía, pero preferentemente conduce a la formación o reparación del músculo. Entre otras consecuencias, una falta de la homeostasis de la energía conduce a formación excesiva o disminuida del tejido adiposo. La formación y almacenamiento de grasa es modulada por la insulina. Por ejemplo, la insulina estimula el transporte de la glucosa hacia las células, donde ésta es inmovilizada en a-glicerofosfato que es utilizado en la esterificación de los ácidos grasos para permitir el almacenamiento de los mismos como triglicéridos. Además, los adipocitos (células grasas) expresan una proteína de transporte específica que aumenta la transferencia de los ácidos grasos libres hacia los adipocitos . Los adipocitos también secretan varias proteínas que se cree modulan el control homeostático del metabolismo de la glucosa y de los lípidos. Estas proteínas secretadas por los adipocitos, adicionales incluyen adipsina, factores del complemento C3 y B, el factor a de necrosis tumoral, el producto del gen ob y Acrp30. Existe también evidencia de que sugiere la existencia de una vía secretora regulada por la insulina en adipocitos. Scherer y colaboradores, J. Biol. Chem. 270 (45) : 26746-9, 1995. La sobresecreción o la subsecreción de estas porciones, impactada en parte por la sobreformación o la subformación de tejido adiposo, puede conducir a condiciones patológicas asociadas directa o indirectamente con la obesidad o la anorexia. Con base en la homología a otras proteínas relacionadas al complemento de adipocitos, tales como ACRP30, los polipéptidos zacrp7, los fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas, pueden ser utilizados para modular el balance de la energía en mamíferos o para proteger las células endoteliales del daño. Con respecto a la modulación del balance de energía, los polipéptidos zacrp7 modulan las reacciones metabólicas celulares. Tales reacciones metabólicas incluyen la adipogénesis, gluconeogénesis, glucogenólisis, lipogénesis, captación de glucosa, síntesis de proteína, termogénesis, utilización de oxígeno y similares. Los polipéptidos zacrp7 pueden también encontrar uso como neurotransmisores o como moduladores de la neurotransmisión, como es indicado por la expresión del polipéptido en tejidos asociados con el sistema nervioso simpático o parasimpático. A este respecto, los polipéptidos zacrp7 pueden encontrar utilidad en la modulación de la captación de nutrientes, como se demostró, por ejemplo, por la captación de la 2-desoxiglucosa en el cerebro o similares. Entre otros métodos conocidos en la técnica o descritos en la presente, el balance de energía del mamífero puede ser evaluado por la verificación periódica de una o más de las siguientes funciones metabólicas: adipogénesis, gluconeogénesis, glucogenólisis, lipogénesis, captación de glucosa, síntesis de proteínas, termogénesis, utilización de oxígeno o similares. Estas funciones metabólicas son verificadas periódicamente por técnicas (ensayos o modelos animales) conocidos por una persona de experiencia en la técnica, como es más completamente descrito más adelante. Por ejemplo, los efectos glucorreguladores de la insulina son predominantemente ejercidos en el hígado, el músculo esquelético y el tejido adiposo. La insulina se enlaza a su receptor celular en estos tres tejidos e inicia las acciones específicas del tejido que dan como resultado, por ejemplo, la inhibición de la producción de glucosa y la estimulación de la utilización de la glucosa. En el hígado, la insulina estimula la captación de glucosa e inhibe la gluconeogénesis y la glucogenólisis. En el músculo esquelético y en el tejido adiposo, la insulina actúa para estimular la captación, el almacenamiento y la utilización de la glucosa. Existen métodos reconocidos en la técnica para verificar periódicamente todas las funciones metabólicas anteriormente citadas. De este modo, una persona de experiencia ordinaria en la técnica es capaz de evaluar los polipéptidos zacrp7, los fragmentos, las proteínas de fusión, los anticuerpos, los agonistas y los antagonistas del mismo, para las funciones de modulación metabólica. Las técnicas de modulación ejemplares son descritas más adelante.

La adipogénesis, la gluconeogénesis y la glucogenólisis son componentes interrelacionados del balance de energía de los mamíferos, que pueden ser evaluados por técnicas conocidas utilizando, por ejemplo, ratones ob/ob o ratones db/db. Los ratones ob/ob son ratones endogámicos que son homocigotos para una mutación de inactivación del locus ob (obeso) . Tales ratones ob/ob son hiperfágicos e hipometabólicos, y se cree que son deficientes en la producción a la proteína OB en circulación. Los ratones db/db son ratones endogámicos que son homocigotos para una mutación de inactivación en el locus db (diabetes) . Los ratones db/db muestran un fenotipo similar a aquel de los ratones ob/ob, excepto que los ratones db/db también muestran un fenotipo diabético. Tales ratones db/db se cree que son resistentes a los efectos de la proteína OB en circulación. También, son conocidos en la técnica diversos métodos in vi tro para evaluar estos parámetros. La lipogénesis estimulada con la insulina, por ejemplo, puede ser verificada periódicamente mediante la medición de la incorporación del 1C-acetato en triglicérido (Mackall y colaboradores, J. Biol .. Chem. 251 : 6462-4, 1976) o la acumulación de triglicérido (Kletzien y colaboradores, Mol. Pharmacol. 41: 393-8, 1992). La captación de la glucosa puede ser evaluada, por ejemplo, en un ensayo para el transporte de la glucosa i.? IJ estimulado por insulina. Los miotubos L6 diferenciados, no transfectados (mantenidos en ausencia de G418) son colocados en DMEM que contiene 1 g/l de glucosa, 0.5 o 1.0% de BSA, Hepes 20 mM, y glutamina 2 mM. Después de dos a cinco horas 5 de cultivo, el medio es reemplazado con DMEM fresco, libre de glucosa que contiene 0.5 o 1.0% de BSA, Hepes 20 mM, piruvato de 1 mM, y glutamina 2 mM. Son agregadas concentraciones apropiadas de insulina o IGF-1, o una serie de diluciones de la sustancia de prueba, y las células son incubadas por 20-30 10 minutos. Se agregan desoxiglucosa marcada con 3H o 14C a una concentración final de aproximadamente 50 µM, y las células son incubadas por aproximadamente 10-30 minutos. Las células son luego rápidamente enjuagadas con amortiguador frío (por ejemplo, PBS) , luego lisadas con un agente de lisis adecuado 15 (por ejemplo, 1% de SDS o NaOH 1 N) . El lisado celular es luego evaluado mediante el conteo en un contador de cintilación. La radioactividad asociada a las células es tomada como una medición del transporte de la glucosa después de sustraer el enlace no específico como se determina por la 20 incubación de las células en presencia de citocolasina b, un inhibidor del transporte de la glucosa. Otros métodos incluyen aquellos descritos por, por ejemplo, Manchester y colaboradores, Am. J. Physiol. 266 (Endocrinol. Metab. 29) : E326-E333, 1994 (transporte de glucosa estimulado por 25 insulina) . • *11 ñ imátf?*?- _- - _. -.¿^_^r_. _iik La síntesis de la proteína puede ser evaluada por ejemplo, mediante la comparación de la precipitación de las proteínas marcadas con 35S-metionina después de la incubación de las células de prueba con 35S-metionina y 35S-metionina y un modulador putativo de la síntesis de la proteína. La termogénesis puede ser evaluada como se describe por B. Stanley en The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides, W. Colmers y C. Wahlestedt (eds.), Humana Press, Ottawa, 1993, pp. 457-509; C. Billington y colaboradores, Am. J. Physiol. 260:R321, 1991; N. Zarjevski y colaboradores, Endocrinology 133:1753, 1993; C. Billington y colaboradores, Am. J. Physiol. 266:R1765, 1994; Heller y colaboradores, Am. J. Physiol. 252 (4 pt 2) : R661-7, 1987; y Heller y colaboradores, Am. J. Physiol. 245: R321-8, 1983. También, la velocidad metabólica, la cual puede ser medida por una variedad de técnicas, es una medición indirecta de la termogénesis. La utilización del oxígeno puede ser evaluada como se describe por Héller y colaboradores, Pflugers Arch 369: 55-9, 1977. Este método también involucró un análisis de la temperatura hipotalámica y de la producción de calor metabólico. La utilización del oxígeno y la termorregulación han sido también evaluadas en humanos como se describe por Haskell y colaboradores, J. Appl. Physiol. 51: 948-54, 1981.

Las funciones de neurotransmisión pueden ser evaluadas mediante la verificación periódica de la captación de 2-desoxi-glucosa en el cerebro. Este parámetro es verificado mediante las técnicas (ensayos o modelos animales) conocidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, la autorradiografía. Las técnicas de verificación periódica útiles se describen, por ejemplo, por Kilduff y colaboradores, J. Neurosci . 10 2463-75, 1990, con las técnicas relacionadas utilizadas para evaluar el "corazón en hiberna" como se describe en Gerber y colaboradores Circulation 94: 651-8, 1996, y Fallavollita y colaboradores, Circulation 95: 1900-9, 1997. Además, los polipéptidos zacrp7, los fragmentos, los agonistas o antagonistas de fusión de los mismos, pueden ser terapéuticamente útiles para aplicaciones antimicrobianas. Por ejemplo, el componente Clq del complemento juega un papel en la defensa del huésped contra los agentes infecciosos, tales como bacterias y virus. Se sabe que Clq muestra diversas funciones especializadas. Por ejemplo, Clq dispara la cascada del complemento vía la interacción con el anticuerpo enlazado o la proteína C reactiva (CRP) . También, Clq interactúa directamente con ciertas bacterias, virus de ARN, micoplasma, cristales de ácido úrico, los componentes de lípidos A de la endotoxina bacteriana y membranas de ciertos organismos intracelulares. El enlace de Clq al receptor de . A . . .

Clq se cree que promueve la fagocitosis. Clq también parece mejorar la formación del aspecto de formación del anticuerpo del sistema de defensa del huésped. Ver por ejemplo, Johnston, Pediatr. Infect . Dis. J. 12(11): 933-41, 1993. De este modo, las moléculas similares a Clq solubles pueden ser útiles como agentes anti-microbianos, promotores de la lisis o la fagocitosis de los agentes infecciosos. Los fragmentos de zacrp7 así como los polipéptidos zacrp7, las proteínas de fusión, los agonistas, los antagonistas o anticuerpos pueden ser evaluados con respecto a sus propiedades anti-microbianas de acuerdo a los procedimientos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Barsum y colaboradores, Eur. Respir. J. 8(5): 709-14, 1995; Sandovsky-Losica y colaboradores, J. Med. Vet. Mycol (Inglaterra) 28 (4) : 279-87, 1990; Mehentee y colaboradores, J. Gen. Microbiol. (Inglaterra) 135 (Pt. 8): 2181-8, 1989; Segal y Savage, J. Med. Vet. Mycol. 24: 477-9, 1986 y similares. Si se desea, el funcionamiento de zacrp7 a este respecto puede ser comparado a las proteínas que se sabe son funcionales a este respecto, tales como las proteínas ricas en prolina, lisozima, histatinas, lactoperoxidasa o similares. Además, los fragmentos de zacrp7, los polipéptidos, proteínas de fusión, agonistas, antagonistas o anticuerpos pueden ser evaluados en combinación con uno o más agentes anti-microbianos para identificar los efectos sinérgicos . Una persona de experiencia en la técnica reconocerá que las propiedades anti-microbianas de los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, agonistas, antagonistas y anticuerpos de los mismos, pueden ser similarmente evaluadas. Como neurotransmisores o moduladores de la neurotransmisión, los fragmentos del polipéptido zacrp7 así como los polipéptidos zacrp7, las proteínas de fusión, los agonistas, los antagonistas o anticuerpos de la presente invención pueden también modular la concentración de iones calcio, la contracción muscular, la secreción de hormonas, la síntesis de ADN o el desarrollo celular, la conversión de fosfato de inositol, la liberación de araquidonato, la activación de la fosfolipasa-C, el vaciado gástrico, la activación de neutrófilos humanos, o la capacidad de ADCC, la producción del anión superóxido y similares. La evaluación de estas propiedades puede ser conducida por métodos conocidos, tales como aquellos descritos en la presente. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el anticuerpo, el agonista o el antagonista sobre el nivel de calcio intracelular puede ser evaluado por los métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Dobrzanski y colaboradores, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista del mismo sobre la contracción muscular puede ser evaluada mediante los métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Smits y Lebebvre, J. Auton. Pharmacol . 14 : 383-92, 1994, Belloli y colaboradores, J. Vet. Pharmacol. 5 Therap. 17: 279-83, 1994, Maggi y colaboradores, Regulatory Peptides 53 : 259-74, 1994 y similares. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo sobre la secreción de hormonas puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica, 10 tales como aquellos para la liberación de prolactina descrita por Henriksen y colaboradores, J. Recep. Sig. Transd. Res. 15 (1-4) : 529-41, 1995, y similares. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista sobre la síntesis de ADN o el desarrollo celular, 15 puede ser evaluado mediante métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Dobrzanski y colaboradores, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista sobre la conversión del fosfato de 20 inositol puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Dobrzanski y colaboradores, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares . También, el impacto del polipéptido zacrp7, el 25 fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo, ¿ia*?t__ l_- .¿tn?~ . „ „ , , , „ ?_^, , _.. i ' S. _mxísMl sobre la liberación del araquidonato puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Dobrzanski y colaboradores, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo, sobre la activación de la fosfolipasa-C puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Dobrzanski y colaboradores, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo sobre el vaciado gástrico puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Varga y colaboradores, Eur. J. Pharmacol. 286: 109-112, 1995, y similares. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo sobre la activación de los neutrófilos humanos y la capacidad de ADCC puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Wozniak y colaboradores, Immunology 78 : 629-34, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo sobre la producción del anión superóxido puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Wozniak y colaboradores, Immunology 78: 629-34, 1993, y similares . El colágeno es un potente inductor de la agregación plaquetaria. Este impone riesgos a los pacientes que se 5 recuperan de los daños vasculares. Los inhibidores de la agregación plaquetaria inducida por el colágeno podrían ser útiles para el bloqueo del enlace de las plaquetas a las superficies recubiertas con colágeno y la reducción de la agregación plaquetaria inducida por el colágeno asociado. 10 Clq es un componente de la vía del complemento y se ha encontrado que estimula los mecanismos de defensa así como también dispara la generación de especies de oxígeno tóxicas que pueden provocar daño tisular (Tenner, Behring Inst. Mitt. 93:241-53, 1993). Los sitios de enlace a Clq son encontrados 15 sobre las plaquetas. Clq, independientemente de un socio de enlace inmune, se ha encontrado que inhibe la agregación plaquetaria pero no la adhesión de las plaquetas o el cambio de forma. La región amino-terminal de Clq comparte homología con el colágeno (Peerschke y Ghebrehiwet, J. Immunol . 145: 20 2984-88, 1990) . La inhibición de Clq y la vía del complemento puede ser determinado utilizando los métodos descritos en la presente o conocidos en la técnica, tales como los que se describen en Suba y Csako, J. Immunol . 117:304-9, 1976. i i ir ffJE«aMBife-..aaig El impacto de los polipéptidos zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo sobre la inhibición del complemento, puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo sobre la actividad en enlace a Clq puede ser evaluado mediante los métodos conocidos en la técnica. El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo sobre la adhesión plaquetaria mediada por el colágeno, la activación y la agregación plaquetaria puede ser evaluado utilizando los métodos descritos en la presente o conocidos en la técnica, tales como el ensayo de agregación plaquetaria (Chiang y colaboradores, Trombosis Res. 37:605-12, 1985) y los ensayos de adhesión plaquetaria (Peerschke y Ghebrehiwet, J . Immunol . 144 :221-25, 1990) . Los ensayos para la adhesión plaquetaria al colágeno y la inhibición de la agregación plaquetaria inducida por colágeno pueden ser medidos utilizando los métodos descritos en Keller y colaboradores, J. Biol. Chem. 268:5450-6, 1993; Waxman y Connolly, J. Biol. Chem. 268:5445-9, 1993; Noeske-Jungblut y colaboradores, J. Biol. Chem. 269:5050-3 ó 1994 Deckmyn y colaboradores, Blood 85:712-9, 1995.

El impacto del polipéptido zacrp7, el fragmento, la fusión, el agonista o antagonista del mismo sobre la vasodilatación de los anillos aórticos, puede ser medido de acuerdo a los métodos de Dainty y colaboradores, J^ Pharmacol. 100:767, 1990 y Rhee y colaboradores, Neurotox. 16:179, 1995. Diversos modelos in vi tro e in vivo son disponibles para la evaluación de los efectos de los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas y antagonistas sobre la isquemia y el daño por reperfusión. Ver por ejemplo, Shandelya y colaboradores, Circulation 88:2812-26, 1993; Weisman y colaboradores, Science 249:146-151, 1991; Buerke y colaboradores, Circulation 91:393-402, 1995; Horstick y colaboradores, Circulation 95:701-8, 1997 y Burke y colaboradores, J. Phar. Exp. Therp. 286:429-38, 1998. Un ensayo de agregación plaquetaria de hámster ex vivo es descrito por Deckmyn y colaboradores, ibid. Los tiempos de sangrado en los hámsters y babuinos pueden ser medidos después de la inyección de los polipéptidos zacrp7 utilizando el modelo descrito por Deckmyn y colaboradores, ibid. La formación de trombos en respuesta a la administración de proteínas de la presente invención puede ser medido utilizando el modelo de trombosis de vena femoral de hámster que es proporcionado por Deckmyn y colaboradores, ibid. Los cambios en la adhesión plaquetaria bajo condiciones de flujo i > ^..-Mte^iafc-=aá después de la administración de zacrp7 pueden ser medidos utilizando el método descrito en Harsfalvi y colaboradores, Blood 85:705-11, 1995. La inhibición del complemento y el sanado de heridas por los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas del mismo, pueden ser evaluados solos o en combinación con otros inhibidores conocidos de la activación y agregación plaquetaria inducida por el colágeno, tales como la paldipina, moubatina o calina, por ejemplo. Los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas del mismo, pueden ser evaluados utilizando los métodos descritos en la presente o conocidos en la técnica, tales como el sanado de capas dérmicas en cerdos (Lynch y colaboradores, Proc. Nati.

Acad. Sci. EUA 84: 7696-700, 1987) y heridas de piel de espesor completo en ratones genéticamente diabéticos (Greenhalgh y colaboradores, Am. J. Pathol. 136: 1235-46, 1990) , por ejemplo. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser evaluados solos o en combinación con otros inhibidores del complemento conocidos, como se describe anteriormente . El trazado del mapa híbrido de radiación es una técnica genética de células somáticas desarrollada para la construcción de alta resolución, de mapas contiguos de cromosomas de mamífero (Cox y colaboradores, Science 250:245-50, 1990). El conocimiento parcial completo de una secuencia génica permiten el diseño de los cebadores de PCR adecuados para el uso con los paneles de trazado de mapa híbrido de radiación, cromosómicos. Los paneles de trazado de mapa híbrido de radiación, comercialmente disponibles, los cuales cubren el genoma humano completo, tales como el panel Stanford G3 RH y el panel GeneBridge 4 RH (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), son disponibles. Estos paneles hacen posible las localizaciones cromosómicas basadas en PCR, rápidas, y el ordenamiento de los genes, los sitios marcados con la secuencia (STSs) , y otros marcadores polimórficos y no polimórficos dentro de una región de interés. Esto incluye el establecimiento de las distancias físicas directamente proporcionales entre los genes recién descubiertos de interés y los marcadores previamente trazados en mapa. El conocimiento preciso de la posición de un gen puede ser útil en un número de formas incluyendo: 1) la determinación de si una secuencia es parte de un contiguo existente y obteniendo secuencias genéticas circunvecinas adicionales en diversas formas tales como los clones de YAC-, BAC- o ADNc, 2) la provisión de un posible gen candidato para una enfermedad heredable que muestra conexión a la misma región cromosómica, y 3) para referencia cruzada de los organismos modelo tales como ratones que pueden ser benéficos en ayudar a determinar qué función puede tener un gen particular. El trazado del mapa híbrido por radiación fue utilizado para confirmar la localización de zacrp7 sobre el cromosoma 4pl5 humano. Los resultados mostraron conexión de zacrp7 al marcador SHGC- 5 35585 del cromosoma 4 con una calificación LOD >16 y a una distancia de cR_10000 desde el marcador. El uso de genes/marcadores circunvecinos coloca a zacrp7 en la región cromosómica 4pl5. El receptor de la colecistocinina A (CCKAR) traza 10 el mapa a 4pl5.2-pl5.1. Una variante en mal sentido, gly21- arg, fue encontrada en un afroamericano con obesidad y diabetes no dependiente de insulina (Inoue y colaboradores, Genomics 42:331-5, 1997) . CD8, una ecto-nicotinamida-adenina-dinucleótido- 15 glucohidrolasa, expresadas sobre células hematopoyéticas traza el mapa a 4pl5. Los estudios con ratones CD8 suprimidos en algún gen indican que CD8 juega un papel en la regulación in vivo de la respuesta inmune humoral (Cockanye y colaboradores, Blood 92:1324-33, 1998). CD8 juega también un 20 papel en la síntesis e hidrólisis de la ADP-ribosa cíclica en el proceso de secreción de insulina en células ß pancreáticas (Takasawa y colaboradores, J. Biol. Chem. 268:26052-4, 1993) . CD38 fue también identificado como un antígeno sobre la superficie celular de células de leucemia linfoblástica aguda (ALL) (Katz y colaboradores, Europ. J. Immun. 13:1008-13, 1983) . La presente invención también proporciona reactivos que encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el gen zacrp7, una sonda que comprende el ADN de zacrp7 o el ARN del mismo, o una subsecuencia del mismo puede ser utilizado para determinar si el gen zacrp7 está presente sobre el cromosoma 4 o si ha ocurrido una mutación. Las aberraciones cromosómicas detectables en el locus del gen zacrp7 incluyen, pero no están limitadas a, aneuploidía, cambios en el número de copias de gen, inserciones, supresiones, cambios en sitio de restricción y reacomodos. Estas aberraciones pueden ocurrir dentro de la secuencia de codificación, dentro de los intrones, o dentro de las secuencias flanqueantes, incluyendo el promotor con dirección de arriba (5') y las regiones reguladoras, y pueden ser manifestadas como alteraciones físicas dentro de una secuencia de codificación o cambios en el nivel de expresión del gen. En general, estos métodos de diagnóstico comprenden los pasos de (a) obtener una muestra genética de un paciente; (b) incubar la muestra genética con una sonda polinucleotídica o cebador como se describe anteriormente, bajo condiciones en donde el polinucleótido se hibridará a la secuencia polinucleotídica complementaria, para producir un primer producto de reacción; y (iii) comparar el primer producto de reacción a un producto de reacción control. Una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción control es indicadora de una anormalidad genética en el paciente. Las muestras genéticas para el uso dentro de la presente invención incluyen el ADN genómico, el ADNc y el ARN. La sonda o cebador polinucleotídico puede ser ARN o ADN, y comprenderá una porción de la SEQ ID NO. 1, el complemento de la SEQ ID N0.1, o un equivalente de ARN del mismo. Los métodos de ensayo adecuados a este respecto incluyen las técnicas genéticas moleculares conocidas por aquellos expertos en la técnica, tales como el análisis de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) , el análisis de repetición en tándem corto (STR) que emplea técnicas de PCR, la reacción de cadena de ligadura (Barany, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991) , los ensayos de protección de ribonucleasa y otras técnicas de análisis de enlace genético conocidas en la materia (Sambrook y colaboradores, ibid; Ausubel y colaboradores, ibid; Marian Chest 108:255-65, 1995) . Los ensayos de protección de ribonucleasa (ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, ibid, ch. 4) comprenden la hibridación de una sonda de ARN a una muestra de ARN del paciente, después de lo cual el producto de reacción (híbrido de ARN-ARN) es expuesto a la ARNasa. Las regiones hibridadas del ARN son protegidas de la digestión. Dentro del los ensayos de PCR, se incuba la muestra genética de un paciente con un par de cebadores polinucleotídicos, y la región entre los cebadores es amplificada y recuperada. Los cambios en el tamaño o en la cantidad de producto recuperado son indicadores de las mutaciones en el paciente. Otra técnica más basada en PCR que puede ser empleada es el análisis de polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP) (Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34-8, 1991). La presente invención también contempla los equipos para la realización de un ensayo de diagnóstico para la expresión del gen zacrp7 o para examinar el locus de zacrp7. Tales equipos comprenden las sondas de ácido nucleico, tales como las moléculas de ácido nucleico de doble hebra que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO.l, o una porción de la misma, así como las moléculas de ácido nucleico de una sola hebra que tienen el complemento de la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO.l, o una porción de la misma. Las moléculas de sonda pueden ser ADN, ARN, oligonucleótidos, y similares. Los equipos pueden comprender cebadores de ácidos nucleicos para la realización de la PCR. Tal equipo puede contener todos los elementos necesarios para realizar un ensayo de diagnóstico de ácido nucleico descrito anteriormente. Un equipo comprenderá al menos un recipiente que comprende una sonda de zacrp7 o un cebador. El equipo puede también comprender un segundo recipiente que contiene uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de las secuencias de zacrp7. Los ejemplos de tales indicadores reactivos incluye marcadores detectables tales como marcadores radioactivos, fluorocromos, agentes quimioluminiscentes y similares. El equipo puede también comprender para indicarle al usuario que las sondas de zacrp7 y los cebadores son utilizados para detectar la expresión del gen zacrp7. Por ejemplo, las instrucciones escritas pueden establecer que las moléculas de ácido nucleico incluidas pueden ser utilizadas para detectar ya sea una molécula de ácido nucleico que codifica para zacrp7, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia nucleotídica que codifica para zacrp7. El material escrito puede ser aplicado directamente a un recipiente, o el material escrito puede ser proporcionado en la forma de un inserto de envasado. También se contempla un método de detección de la presencia de la expresión del gen zacrp7 en una muestra biológica, que comprende: (a) el poner en contacto una sonda de ácido nucleico de zacrp7 bajo condiciones de hibridación ya sea con (i) las moléculas de ARN de prueba aisladas de la muestra biológica, o (ii) las moléculas de ácido nucleico sintetizadas a partir de las moléculas de ARN aisladas, en donde la sonda consiste de una secuencia nucleotídica que comprende una porción de la secuencia nucleotídica de la molécula de ácido nucleico como se describe en la presente, o los complementos de la misma, y (b) la detección de la formación de híbridos de la sonda de ácido nucleico y las moléculas de ARN de prueba o las moléculas de ácido nucleico sintetizadas, en donde la presencia de los híbridos indica la presencia del ARN de zacrp7 en la muestra biológica. Se proporciona adicionalmente un método para la detección de la presencia de zacrp7 en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo como se describe en la presente, en donde la puesta en contacto realizada bajo condiciones que permiten el enlace del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo a la muestra biológica, y (b) la detección de cualquiera del anticuerpo enlazado o de fragmento de anticuerpo enlazado. Los polipéptidos zacrp7 pueden ser utilizados en el análisis de la eficiencia de la energía de un mamífero. Los polipéptidos zacrp7 encontrados en muestras de suero o de tejido pueden ser indicadores de una habilidad de los mamíferos para almacenar alimento, con mamíferos más altamente eficientes que tienden hacia la obesidad. Más específicamente, la presente invención contempla los métodos para detectar el polipéptido zacrp7 que comprende: la exposición de una muestra que contiene posiblemente el polipéptido zacrp7 para un anticuerpo adherido a un soporte sólido, en donde el anticuerpo se enlaza a un epítope de un polipéptido zacrp7; 5 el lavado del anticuerpo-polipéptido inmovilizado para remover los contaminantes no enlazados; la exposición del anticuerpo-polipéptido inmovilizado a un segundo anticuerpo dirigido a un segundo epítope de un polipéptido zacrp7, en donde el segundo 10 anticuerpo está asociado con un marcador detectable; y la detección de un marcador detectable. La concentración del polipéptido zacrp7 en la muestra de prueba parece ser indicadora de la eficiencia de energía de un mamífero. Esta información puede ayudar al análisis 15 nutricional de un mamífero. Potencialmente, esta información puede ser útil en la identificación y/o en la dirección al tejido deficiente en energía. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para estudiar la insulina. Tales métodos de la 20 presente invención comprenden la incubación de los adipocitos en un medio de cultivo que comprende polipéptido zacrp7, anticuerpo monoclonal, el agonista o antagonista del mismo ± insulina, y observando los cambios en la secreción o diferenciación de la proteína de adipocito. •^*^te.-i^ . i^, . i ., . -*— .. --_£. ' t A&Ba^aa Los agentes protectores anti-microbianos pueden estar actuando directamente o actuando indirectamente. Tales agentes que operan vía la asociación de la membrana o los mecanismos de acción formadores de poros directamente se enlazan al microbio ofensor. Los agentes anti-microbianos pueden también actuar vía un mecanismo enzimático que rompe las sustancias protectoras microbianas o la pared celular/membrana de los mismos. Los agentes anti-microbianos, capaces de inhibir la proliferación de los microorganismos o la acción de los mismos o la desintegración de la integridad del microorganismo por cualquier mecanismo escrito anteriormente, son útiles en los métodos para prevenir la integración en el cultivo celular por microbios susceptibles a esa actividad anti-microbiana. Tales técnicas involucran el cultivo de las células en presencia de una cantidad efectiva del polipéptido zacrp7 o un agonista o antagonista del mismo. También, los polipéptidos zacrp7 o agonistas del mismo pueden ser utilizados como reactivos de cultivos celular en estudios in vi tro de la infección por microorganismos exógenos, tales como la infección bacteriana, viral o fúngica. Tales porciones pueden también ser utilizadas en modelos de infección animal in vivo. La presente invención también proporciona los métodos para estudiar el metabolismo celular de los mamíferos. Tales métodos de la presente invención comprenden la incubación de la células que van a ser estudiadas, por ejemplo, las células endoteliales vasculares humanas, ± el polipéptido zacrp7, anticuerpo monoclonal, el agonista o antagonista del mismo y la observación del cambio en la adipogénesis, gluconeogénesis, glucogenólisis, lipogénesis, captación de glucosa o similares. Los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la presente invención pueden ser utilizados en los métodos para promover el flujo sanguíneo dentro de la vasculatura de un mamífero, mediante la reducción del número de plaquetas que se adhieren y que son activadas, y el tamaño de los agregados plaquetarios . Utilizado para tal fin, zacrp7 puede ser administrado antes de, durante o después de un daño vascular agudo en el mamífero. El daño vascular puede ser debido a la reconstrucción vascular, incluyendo pero no limitada a, angioplastía, injerto de desviación de arterias coronarias, reparación microvascular o anastomosis de un injerto vascular. También son contemplados los daños vasculares debidos a trauma, apoplejía o aneurisma. En otros métodos preferidos el daño vascular es debido a la ruptura de las placas, degradación de la vasculatura, complicaciones asociadas con la diabetes y la ateroesclerosis. La ruptura de la placa en la arteria coronaria induce el ataque cardiaco y en la arteria cerebral induce la apoplejía. El uso de los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas del mismo, en tales métodos, podrían también ser útiles para mejorar las enfermedades del sistema completo de la vasculatura asociada con el sistema inmune, tales como la coagulación intravascular diseminada (DIC) y SIDs. Adicionalmente, la actividad de inhibición del complemento podría ser útil para tratar enfermedades inmunes no de la vasculatura, tales como la arterioloesclerosis. Si se desea, el funcionamiento del polipéptido zacr?7, el fragmento, la proteína de fusión, el agonista, antagonista o el anticuerpo del mismo, a este respecto, puede ser comparado a las proteínas que se sabe son funcionales a este respecto, tales como zsig37 o similares. Además, los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas del mismo, pueden ser evaluados en combinación con uno o más agentes inhibidores de la agregación o la activación plaquetaria para identificar los agentes sinérgicos. Los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, agonistas, antagonistas o anticuerpos pueden también ser útiles en los tratamientos para el daño vascular agudo. Los daños vasculares agudos son aquellos que ocurren rápidamente (por ejemplo, en días a meses) , en contraste a los daños vasculares crónicos (por ejemplo, ateroesclerosis) que se desarrollan en toda una vida. Los daños vasculares agudos frecuentemente resultan de los procedimientos quirúrgicos tales como la reconstrucción vascular, en donde las técnicas de angioplastia, endarterectomia, aterectomia de reducción, implantación de stend endovascular, ablación endovascular con láser, anastomosis de un injerto vascular o similares, son empleados. La hiperplasia puede también ocurrir como una respuesta retardada en respuesta a, por ejemplo, la colocación de un injerto vascular o transplante de órganos. Se ha encontrado una correlación entre la presencia de Clq en el miocardio isquémico localizado y la acumulación de leucocitos después de la oclusión y reperfusión coronarias. La liberación de los componentes celulares después del daño al tejido dispara la activación del complemento que da como resultado productos de oxígeno tóxico que pueden ser la causa principal del daño miocardiaco (Rossen y colaboradores, Circ. Res. 62:572-84, 1998 y Tenner, ibid) . Se encontró que el bloqueo de la vía del complemento protege al miocardio isquémico del daño por reperfusión (Buerke y colaboradores, J. Pharm. Exp. Therp. 286:429-38, 1998) . Las proteínas que tienen inhibición del complemento y actividad de enlace a Clq podrían ser útiles para tales propósitos.

Las capacidades de enlace al colágeno y al Clq de los homólogos de las proteínas relacionadas al complemento de adipositos, tales como zacrp7 podrían ser útiles para apaciguar los tejidos colagenosos dañados previniendo la adhesión, la activación o la agregación plaquetaria, y la activación de los procesos inflamatorios que conducen a la liberación de los productos de oxígeno tóxico. Al hacer al tejido expuesto inerte hacia tales procesos como la actividad del complemento, la actividad trombótica y la activación inmune, se reducen los efectos dañinos de la isquemia y la reperfusión. En particular, tales daños podrían incluir la isquemia por daño traumático, estrangulación intestinal, y daño asociado con pre- y post-establecimiento del flujo sanguíneo. Tales polipéptidos podrían ser útiles en el tratamiento de la isquemia por derivación cardiopulmonar y resucitación, infarto del miocardio y vasoespasmo post-traumático, tal como apoplejía o angioplastia transluminal cutánea así como traumovascular por accidente o inducido quirúrgicamente . Además, tales polipéptidos de enlace al colágeno y al Clq podrían ser útiles para pacificar los biomateriales prostéticos y el equipo quirúrgico para hacer a la superficie de los materiales inerte hacia la activación del complemento, la activación trombótica o la activación inmune. Tales materiales incluyen, pero no están limitados a, colágeno o biomateriales recubiertos con fragmentos de colágeno, biomateriales recubiertos con gelatina, biomateriales recubiertos con fibrina, biomateriales recubiertos con fibronec ina, biomateriales recubiertos con heparina, stents de colágeno y recubiertos con gel, injertos arteriales, válvulas cardiacas sintéticas, órganos artificiales o cualquier aplicación prostética expuesta a la sangre que se enlazará a zacrp7 a más de 1 x 108. El recubrimiento de tales materiales puede ser realizado utilizando métodos conocidos en la técnica, ver por ejemplo, Rubens, Patente de los Estados Unidos No. 5,272,074. El complemento y Clq juegan un papel en la inflamación. La activación del complemento es iniciada por el enlace de Clq a las inmunoglobulinas (Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12:933-41, 1993; Ward y Ghetie, Therap. Immunol. 2:77-94, 1995). Los inhibidores de Clq y el complemento podrían ser útiles como agentes anti-inflamatorios . Tal aplicación puede ser realizada para prevenir la infección. Además, tales inhibidores pueden ser administrados a un individuo que sufre de inflamación mediada por la activación del complemento y el enlace de los complejos inmunes a Clq. Los inhibidores de Clq y el complemento podrían ser útiles en los métodos mediadores de la reparación de heridas, mejoramiento de la progresión en el sanado de heridas al superar el sanado deteriorado de la *. ...... „ , , - .. ^ s.. , 1 ' ' é «t^-»* herida. La progresión en el sanado de la herida podría incluir, por ejemplo, elementos tales como una reducción en la inflamación, reclutamiento de fibroblastos, retracción de la herida y reducción en la infección. 5 La habilidad de las células tumorales para enlazarse al colágeno puede contribuir a la metástasis de los tumores. Los inhibidores del enlace al colágeno son también útiles como mediadores de las interacciones adhesivas y de la dispersión metastática de los tumores (Noeske-Jungbult y 10 colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,723,312). Además, los polipéptidos zacrp7, fragmentos, proteínas de fusión, agonistas o antagonistas del mismo, pueden ser terapéuticamente útiles para aplicaciones antimicrobianas. Por ejemplo, el componente Clq del componente 15 juega un papel en la defensa del huésped contra agentes infecciosos, tales como bacterias y virus. Se sabe que Clq muestra varias funciones especializadas. Por ejemplo, Clq dispara la cascada del complemento vía la interacción con el anticuerpo enlazado o la proteína Clq reactiva (CRP) . 20 También, Clq interactúa directamente con ciertas bacterias, virus de ARN, micoplasma, cristales de ácido úrico, el componente del lípido A de la endotoxina bacteriana y membranas de ciertos organelos intracelulares. Clq que se enlaza al receptor de Clq se cree que promueve la 25 fagocitosis. Clq parece también mejorar el aspecto de l^^^g¡¡ formación del anticuerpo del sistema de defensa del huésped. Ver, por ejemplo, Johnston, Pedriatr. Infect. Dis. J. 12(11): 933-41, 1993. De este modo, las moléculas similares a Clq solubles pueden ser útiles como agentes antimicrobianos, 5 promotores de la lisis o la fagocitosis de los agentes infecciosos. El dominio de colágeno de triple hélice, extracelulares, positivamente cargados de Clq y el receptor del podador de macrófagos fueron determinados como poseedores 10 de un papel en enlace al ligando, y se mostró que tienen una amplia especificidad de enlace para los polianiones (Acton y colaboradores, J. Biol. Chem. 268:3530-37, 1993) . El factor de crecimiento del lisofosfolípido (ácido lisofosfatídico, LPA) y otros aniones mitogénicos se localizan en el sitio de 15 los tejidos dañados y ayudan en la reparación de las heridas. LPA ejerce muchos efectos biológicos incluyendo la activación de las plaquetas y la sobrerregulación del montaje de la matriz. Se piensa que LPA sinergiza con otros factores de la coagulación sanguínea y es mediador del sanado de heridas. 20 Los dominios de colágeno de las proteínas tales como Clq y el receptor de podador de macrófagos se saben que se enlazan a los fosfolípidos ácidos tales como el LPA. La interacción de los polipéptidos zacrp7, fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas del mismo, con aniones mitogénicos 25 tales como LPA puede ser determinada utilizando ensayos -— *'-A* HBl-1Mtfffrft.J- ...Ji conocidos en la técnica, ver por ejemplo, Acton y colaboradores, ibid. La inhibición de los procesos inflamatorios por los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención podrían también ser útiles en la prevención de la infección en el sitio de la herida. Para el uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención pueden ser formuladas con portadores farmacéuticamente aceptables para la administración parenteral, oral, nasal, rectal, tópica, transdérmica o similares, de acuerdo a los métodos convencionales. En una modalidad preferida, se realiza la administración en o cerca del sitio de daño vascular. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína zacrp7 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina amortiguada, 5% de dextrosa en agua o similares. Las formulaciones pueden además incluir uno o más excipientes, conservadores, solubilizantes, agentes amortiguadores, albúmina para prevenir la pérdida de la proteína sobre las superficies del frasco, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed. , Mack Publishing Co., Easton PA, 19. ed. 1995. Las dosis terapéuticas serán en general determinadas por el médico de acuerdo a los estándares aceptados, tomando en cuenta la naturaleza y la severidad de la condición que va a ser tratada, los rasgos del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Como se utiliza en la presente una "cantidad 5 terapéuticamente efectiva" de un polipéptido zacrp7, fragmento, proteína de fusión, agonista o antagonista del mismo, es una cantidad suficiente para inducir un resultado biológico deseado. El resultado puede ser el alivio de los signos, los síntomas, o las causas de una enfermedad, o 10 cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un polipéptido zacrp7 es aquella que proporciona ya sea el alivio subjetivo de los síntomas o un mejoramiento objetivamente identificable como es notado por el médico u otro observador calificado. Tal 15 cantidad efectiva de un polipéptido zacrp7 podría proporcionar, por ejemplo, inhibición de la actividad plaquetaria activada por el colágeno y la vía del complemento, incluyendo Clq, incremento localizado del flujo sanguíneo dentro de la vasculatura de un paciente y/o 20 reducción en los efectos nocivos de la isquemia y la reperfusión. La modulación de la información asociada con la artritis podría incluir la reducción en la inflamación y el alivio del dolor o la rigidez, en modelos animales, las indicaciones serían derivadas de las inspección macroscópica 25 de las coyunturas y cambio en la hinchazón de las patas -,*''J*1JÍf1ih*' posteriores. Las cantidades efectivas de los polipéptidos zacrp7 pueden variar ampliamente dependiendo de la enfermedad o el síntoma que va a ser tratado. La cantidad del polipéptido que va a ser administrado y su concentración en las formulaciones, depende del vehículo seleccionado, de la ruta de administración, de la potencia del polipéptido particular, de la condición clínica del paciente, de los efectos colaterales y de la estabilidad del compuesto en la formulación. De este modo, el médico empleará la preparación apropiada que contiene la concentración apropiada en la formulación, así como la cantidad de la formulación administrada dependiendo de la experiencia clínica con el paciente, en cuestión, o con pacientes similares. Tales cantidades dependerán en parte, de la condición particular que se trate, de la edad, el peso, y la salud general del paciente, y otros factores evidentes para aquellos expertos en la técnica. Típicamente, una dosis estará en el intervalo de 0.01-100 mg/kg del sujeto. En aplicaciones tales como catéteres de globo el intervalo de dosis típico sería de 0.05-5 mg/kg del sujeto. Las dosis para compuestos específicos pueden ser determinados a partir de estudios in vi tro o ex vivo en combinación con estudios sobre animales experimentales. Las concentraciones de los compuestos que son encontrados como efectivos in vi tro o ex vivo proporcionan la guía para los estudios animales, en donde las dosis son calculadas para proporcionar concentraciones similares en el sitio de acción. Los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos zacrp7 son útiles dentro de las aplicaciones en terapia génica donde se desea incrementar o inhibir la actividad de zacrp7. Si un mamífero tiene un gen zacrp7 mutado o ausente, el gen zacrp7 puede ser introducido dentro de las células del mamífero. En una modalidad, un gen que codifica para un polipéptido zacrp7 es introducido in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tal como, pero no limitado a, virus de la herpes simple (HSV) , papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), y similares. Los virus defectuosos, los cuales completamente o casi completamente carecen de genes virales, son los preferidos. Un virus defectuoso no es infeccioso después de la introducción a una célula. El uso de vectores virales infecciosos permite la administración a las células en un área localizada, específica, sin importar que el vector pueda infectar a otras células. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no están limitados a, un vector del virus del herpes simples defectuoso 1 (HSV1) (Kaplitt y colaboradores, Molec. Cell. Neurosci . 2:320-30, 1991) ; un vector de adenoviral atenuado tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y colaboradores, J. Clin. Invest. fc 9_0: 626-30, 1992; y un vector viral adeno-asociado defectuoso (Samulski y colaboradores, J. Virol. 61:3096-101, 1987; Samulski y colaboradores, J. Virol. 63:3822-8, 1989) . En otra modalidad más, un gen zacrp7 puede ser introducido en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,399,346; Mann y colaboradores, Cell 33:153, 1983; Temin y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,650,764; Temin y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 4,980,289; Markowitz y colaboradores, J. Virol. 2:1120, 1988; Temin y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,124,263; Publicación WIPO WO 95/07358; y Kuo y colaboradores, Blood 82:845, 1993. Alternativamente, el vector puede ser introducido mediante lipofección in vivo utilizando liposomas. Los lípidos catiónicos sintéticos pueden ser utilizados para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica para un marcador (Felgner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:7413- 7, 1987; Mackey y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 8J5: 8027-31, 1988) . El uso de la lipofección para introducir genes exógenos dentro de órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La dirección molecular de los liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Más particularmente, la dirección de transfección a células particulares representa un área de beneficio. Por --JtiS^e ejemplo, la dirección de transfección a tipos particulares celulares podría ser particularmente ventajosa en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el hígado, el riñon y el cerebro. Los lípidos pueden ser químicamente acoplados a otras moléculas para fines de dirección al objetivo. Los péptidos dirigidos (por ejemplo, hormonas o neurotransmisores) , proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas pueden ser acoplados a liposomas químicamente . Es posible remover las células objetivo del cuerpo; introducir el vector como un plásmido de ADN desnudo; y luego reimplantar las células transformadas dentro del cuerpo. Los vectores de ADN desnudos para la terapia con genes pueden ser introducidos dentro de las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, uso de una pistola de genes o el uso de un transportador vector de ADN. Ver por ejemplo, Wu y colaboradores, J. Biol. Chem. 267:963-7, 1992; Wu y colaboradores, J. Biol.. Chem. 263:14621-4, 1988. La metodología antisentido puede ser utilizada para inhibir la transcripción del gen zacrp7, tal como para inhibir la proliferación celular in vivo. Los polinucleótidos que son complementarios a un segmento de un polinucleótido que codifica para zacrp7 (por ejemplo, un polinucleótido como se describe en la SEQ ID NO.l) son diseñados para enlazarse al ARNm que codifica para zacrp7 y para inhibir la traducción de tal ARNm. Tales polinucleótidos antisentido son utilizados para inhibir la expresión de los genes que codifican para el polipéptido zacrp7 en cultivo celular o en un sujeto. Los ratones transgénicos, manipulados mediante ingeniería genética para expresar el gen zacrp7, y los ratones que muestran una ausencia completa de la función del gen zacrp7, denominados como "ratones suprimidos en algún gen" (Snouwaert y colaboradores, Science 257:1083, 1992), pueden también ser generados (Lowell y colaboradores, Nature 366:740-42 1993). Estos ratones pueden ser empleados para estudiar el gen zacrp7 y la proteína codificada por éste, en un sistema in vivo. La invención es además ilustrada por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Identificación de una Secuencia de zacrp7 El nuevo polinucleótido que codifica para el polipéptido zacrp7 de la presente invención, fue inicialmente identificado mediante la búsqueda de una base de datos EST A. ?? #? ..r__, para homólogos de las proteínas relacionadas al complemento de adipocitos, caracterizado por una secuencia de señal, un dominio similar al colágeno, y un dominio Clq. Los polipéptidos correspondientes a los ESTs que cumplen esos criterios de búsqueda fueron comparados a las secuencias conocidas para identificar las nuevas proteínas que tienen homología a esta familia. Un cúmulo EST ensamblado fue generado y se predijo que era una proteína secretada. La secuencia resultante de 912 pares de bases es descrita en la SEQ ID NO.l. Con el fin de aislar el polinucleótido de la SEQ ID NO.l de diversos tejidos, son diseñadas las sondas y/o los cebadores a partir de las secuencias descritas en la presente tales como la SEQ ID NO.l. Los tejidos que expresan zacrp7 podrían ser identificados ya sea a través de hibridación (Manchados de Northern) o mediante PCR de transcriptasa inversa (RT) . Las genotecas son luego generadas a partir de tejidos que parecen mostrar expresión de zacrp7. Los clones simples provenientes de tales genotecas son luego identificadas a través de la hibridación con las sondas y/o por PCR con los cebadores como se describe en la presente. La conformación de la secuencia del ADNc de zacrp7 puede ser verificada utilizando las secuencias proporcionadas en la presente .

Ejemplo 2 Asignación Cromosómica y Colocación de Zacrp7 Zacrp7 fue trazada en mapa al cromosoma 4 utilizando la versión comercialmente disponible del panel de trazado de mapa híbrido por Radiación Stanford G3 (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). El panel Stanford G3 RH contiene los ADNs susceptibles de ser sometidos a PCR provenientes de cada uno de los 83 clones híbridos de clonación del genoma humano completo, más dos ADNs control (el donador RM y el recipiente A3) . Un servidor WWW públicamente disponible (http: //shgc-www. stanford.edu) permite la localización cromosómica de los marcadores. Para el trazado del mapa de zacrp7 con el panel Stanford G3 RH, se establecieron reacciones de 20 µl en una placa de microtitulación de 96 pozos (Strategene, la Jolla, CA) y se utilizó en un ciclador térmico RoboCycler Gradient 96 (Stratagene) . Cada una de los 85 reacciones de PCR consistió de 2 µl de amortiguador de reacción PCR KlenTaq 10X (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , 1.6 µl de mezcla de dNTPs (2.5 mM de cada uno, Perkin-Elmer, Foster City, CA) , 1 µl de cebador en sentido, ZC 23,631 (SEQ ID NO.12), 1 µl de cebador antisentido ZC 23,632 (SEQ ID NO.13), 2 µl de RediLoad (Research Genetics), 0.4 µl de Mezcla de Polimerasa Advantage KlenTaq 50X (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng del ADN proveniente de un clon híbrido individual o el control y agua bidestilada para un volumen total de 20 µl . Las reacciones fueron cubiertas con una cantidad igual de aceite mineral y selladas. Las condiciones del ciclador de PCR fueron como sigue: 1 ciclo inicial de 5 minutos de desnaturalización a 94°C, 35 ciclos de una desnaturalización de 45 segundos a 94°C, recocido de 45 segundos a 64 °C y 1 minuto 15 segundos de extensión a 72°C, seguido por un ciclo final de extensión de 7 minutos a 72°C. Las reacciones fueron separadas mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 2% (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Los resultados mostraron la conexión de zacrp7 al marcador SHGC-35585 del cromosoma 4 con una calificación LOD >16 y a una distancia de 0 cR_10000 desde el marcador. El uso de los genes/marcadores circunvecinos coloca a zacrp7 en la región cromosómica 4pl5. De lo anterior, se apreciará que, aunque las modalidades específicas de la invención han sido descritas en la presente para fines de ilustración, pueden ser realizadas diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Zyn-ioGenetics. Inc. <120> PROTEINA HOMOLOGA ZACRP7 RELACIONADA AL COMPLEMENTO DE ADIPOCITOS <130> 99-31 <150> 60/136,289 <151> 1999-05-27 <150> 60/145 ,589 <151> 1999-07-22 <150> 60/158.448 <151> 1999-10-07 <160> 15 <170> FastSEQP913 Wi ndows Versión 3.0 <210> 1 <211> 912 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> Cl) . . . (912) <400> 1 atg ggg aag gag gac act caá gaa act cgc acá gag cca aag atg ttt 48 Met Gly Lys Gl u Asp Thr Gl n Glu Thr Arg Thr Glu Pro Lys Met Phe 1 5 10 15 gtc ttg ctc tat gtt acá agt ttt gcc att tgt gcc agt gga caá ecc 96 Val Leu Leu Tyr Val Thr Ser Phe Ala He Cys Ala Ser Gly Gln Pro 20 25 30 cgg ggt aat cag ttg aaa gga gag aac tac tcc ecc agg tat ate tgc 144 Arg Gly Asn Glp Leu Lys Gly Glu Asn Tyr Ser Pro Arg Tyr He Cys 35 40 45 age att cct ggc ttg cct gga cct cca ggg ecc cct gga gca aat ggt 192 Ser He Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Asn Gly 50 55 60 tcc cct ggg ecc cat ggt cgc ate ggc ctt cca gga aga gat ggt aga 240 Ser Pro Gly Pro His Gly Arg He Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Arg 65 70 75 80 gac ggc agg aaa gga gag aaa ggt gaa aag gga act gca ggt ttg aga 288 Asp Gly Arg Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Thr Ala Gly Leu Arg 85 90 95 ggt aag act gga ceg cta ggt ctt gcc ggt gag aaa ggg gac caá gga 336 Gly Lys Thr Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly 100 105 110 gag act ggg aag aaa gga ecc ata gga cca gag gga gag aaa gga gaa 384 Glu Thr Gly Lys Lys Gly Pro He Gly Pro Glu Gly Glu Lys Gly Glu 115 120 125 gta ggt cca att ggt cct cct gga cca aag gga gac aga gga gaa caá 432 Val Gly Pro He Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Glu Gln 130 135 140 ggg gac .ccg ggg ctg cct gga gtt tgc aga tgt gga age ate gtg ctc 480 Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Val Cys Arg Cys Gly Ser He Val Leu 145 150 155 160 aaa tcc gcc ttt tet gtt ggc ate acá acc age tac cca gaa gaa aga 528 L?s Ser Ala Phe Ser Val Gly He Thr Thr Ser Tyr Pro Glu Glu Arg 165 170, 175 cta cct att ata ttt aac aag gtc ctc ttc aac gag gga gag cac tac 576 Leu Pro He He Phe Asn Lys Val Leu Phe Asn Glu Gly Glu His Tyr 180 185 190, aac cct^gcc acá ggg aag ttc ate tgt gct ttc cca ggg ate tat tac 624 Asn Pro Ala Thr Gly Lys Phe He Cys Ala Phe Pro Gly He Tyr Tyr 195 200 205 ttt tet tat gat ate acá ttg gct aat aag cat ctg gca ate gga ctg 672 Phe Ser Tyr Asp He Thr Leu Ala Asn Lys His Leu Ala He Gly Leu 210 215 220 gta cac aat ggg caá tac cgg ata aag acc ttc gac gcc aac acá gga 720 Val His Asn Gly Gln Tyr Arg He L?s Thr Phe Asp Ala Asn Thr Gly 225 230 235 240 aac cat gat gtg gct teg ggg tcc acá gtc ate tat ctg cag cca gaa 768 Asn His Asp Val Ala Ser Gly Ser Thr Val He Tyr Leu Gln Pro Glu 245 250 255 gat gaa gtc tgg ctg gag att ttc ttc acá gac cag aat ggc ctc ttc 816 Asp Glu Val Trp Leu Glu He Phe Phe Thr Asp Gln Asn Gly Leu Phe 260 - > 265 270 tea gac cca ggt tgg gca gac age tta ttc tcc ggg ttt ctc tta tac 864 Ser Asp Pro Gly Trp Ala Asp Ser Leu Phe Ser Gly Phe Leu Leu Tyr 275 280 285 gtt gac acá gat tac cta gat tcc ata tea gaa gat gat gaa ttg tga 912 Val Asp Thr'Asp Tyr Leu Asp Ser He Ser Glu Asp Asp Glu Leu * 290 295 300 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Lys Glu Asp Thr Gln Glu Thr Arg Thr Glu Pro Lys Met Phe 1 5 10 15 Val Leu Leu Tyr Val Thr Ser Phe Ala He Cys Ala Ser Gly Gln Pro 20 25 30 Arg Gly Asn Gln Leu Lys Gly Glu Asn Tyr Ser Pro Arg Tyr He Cys 35 40 45 Ser He Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Asn Gly 50 55 60 Ser Pro Gly Pro His Gly Arg He Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Arg 65 70 75 80 Asp Gly^rg Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Thr Ala Gly Leu Arg 85 90 95 Gly Lys Thr Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly 100 105 110 Glu Thr Gly Lys Lys Gly Pro He Gly Pro Glu Gly Glu Lys Gly Glu 115 120 125 Val Gly Pro He Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Glu Gln 130 135 140 Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Val Cys Arg Cys Gly Ser He Val Leu 145 150 155 160 ^¿ggg j Lys Ser Ala Phe Ser Val Gly He Thr Thr Ser Tyr Pro Glu Glu Arg 165 170 175 Leu Pro He He Phe Asn Lys Val Leu Phe Asn Glu Gly Glu His Tyr 180 185 190 Asn Pro Ala Thr Gly Lys Phe He Cys Ala Phe Pro Gly He Tyr Tyr 195 200 205 Phe Ser Tyr Asp He Thr Leu Ala Asn Lys His Leu Ala He Gly Leu 210 215 220 Val His Asn Gly Gln Tyr Arg He Lys Thr Phe Asp Ala Asn Thr Gly 225 230 235 240 Asn His Asp Val Ala Ser Gly Ser Thr Val He Tyr Leu Gln Pro Glu 245 250 255 Asp Glu Val Trp Leu Glu He Phe Phe Thr Asp Gln Asn Gly Leu Phe 260 265 270 Ser Asp Pro Gly Trp Ala Asp Ser Leu Phe Ser Gly Phe Leu Leu Tyr 275 280 • 285 Val Asp Thr Asp Tyr Leu Asp Ser He Ser Glu Asp Asp Glu Leu 290 295 300 <210> 3 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Ser Arg Gly Gln Gly Leu Leu Leu Ala Tyr Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ser Gly Leu Val Leu Ser Arg Val Pro His Val Gln Gly 20 25 30 Glu Gln Gln Glu Trp Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Ser Pro Pro Asp 35 40 45 His Ala Glu Arg Ala Glu Glu Gln His Glu Lys Tyr Arg Pro Ser Gln 50 55 60 Asp Gln Gly Leu Pro Ala Ser Arg Cys Leu Arg Cys Cys Asp Pro Gly 65 70 75 80 Thr Ser 1et Tyr Pro Ala Thr Ala Val Pro Gln He Asn He Thr He 85 90 95 Leu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Leu Gln Gly Lys 100 105 110 Tyr Gly Lys Thr Gly Ser Ala Gly Ala Arg Gly His Thr Gly Pro Lys 115 120 125 Gly Gln Lys Gly Ser Met Gly Ala Pro Gly Glu Arg Cys Lys Ser His 130 135 140 Tyr Ala Ala Phe Ser Val Gly Arg Lys Lys Pro Met His Ser Asn His 145 150 155 160 Tyr Tyr Gln Thr Val He Phe Asp Thr Glu Phe Val Asn Leu Tyr Asp 165 170 175 His Phe Asn Met Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Tyr Val Pro Gly Leu 180 185 190 5 Tyr Phe Phe Ser Leu Asn Val His Thr Trp Asn Gln Lys Glu Thr Tyr 195 200 205 Leu His He Met Lys Asn Glu Glu Glu Val Val He Leu Phe Ala Gln 210 215 220 Val Gly Asp Arg Ser He Met Gln Ser Gln Ser Leu Met Leu Glu Leu 10 225 230 235 240 Arg Glu Gln Asp Gln Val Trp Val Arg Leu Tyr Lys Gly Glu Arg Glu 245 250 255 Asn Ala He Phe Ser Glu Glu Leu Asp Thr Tyr He Thr Phe Ser Gly 260 265 270 15 Tyr Leu Val Lys His Ala Thr Glu Pro 275 280 <210> 4 <211> 244 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 25 Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gly His 1 5 10 15 Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro Leu Pro 20 25 30 Lys Gly Ala Cys Thr Gly Trp Met Ala Gly He Pro Gly His Pro Gly 30 35 40 45 His Asn Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro Gly Glu 50 55 60 Lys Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Leu He Gly Pro Lys Gly Asp He 65 ' 70 75 80 35 Gly Glu Thr Gly Val Pro Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly 85 90 95 He GlnlGly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg 100 105 110 ?f) Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val Thr He Pro Asn Met 115 120 125 Pro He Arg Phe Thr Lys He Phe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp 130 135 140 Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn He Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe 145 150 155 160 5 Ala Tyr His He Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val Ser Leu Phe 165 170 175 Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr Gln Glu Asn 180 185 190 Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu Glu Val Gly 195 200 205 Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly Glu Arg Asn Gly Leu 210 215 220 Tyr Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr 225 230 235 240 His Asp Thr Asn 10 <210> 5 <211> 285 <212> PRT 15 <213> Homo sapiens <400> 5 Met He Pro Trp Val Leu Leu Ala Cys Ala Leu Pro Cys Ala Ala Asp 1 5 10 15 20 Pro Leu Leu Gly Ala Phe Ala Arg Arg Asp Phe Arg Lys Gly Ser Pro 20 25 30 Gln Leu Val Cys Ser Leu Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro 35 40 45 Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Met Met Gly Arg Met Gly Phe Pro Gly 25 50 55 60 Lys Asp Gly Gln Asp Gly His Asp Gly Asp Arg Gly Asp Ser Gly Glu 65 70 75 80 Glu Gly Pro Pro Gly Arg Thr Gly Asn Arg Gly Lys Pro Gly Pro Lys 85 90 95 30 Gly Lys Ala Gly Ala He Gly Arg Ala Gly Pro Arg Gly Pro Lys Gly 100 105 110 Val Asn Gly Thr Pro Gly Lys His Gly Thr Pro Gly Lys Lys Gly Pro 115 120 125 Lys Gly Lys Lys Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Pro Cys Ser Cys Gly 35 130 135 140 Ser Gly^is Thr Lys Ser Ala Phe Ser Val Ala Val Thr Lys Ser Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Arg Leu Pro He Lys Phe Asp Lys He Leu Met Asn Glu 165 170 175 40 Gly Gly His Tyr Asn Ala Ser Ser Gly Lys Phe Val Cys Gly Val Pro 180 185 190 Gly He Tyr Tyr Phe Thr Tyr Asp He Thr Leu Ala Asn Lys His Leu 195 200 205 Ala He Gly Leu Val His Asn Gly Gln Tyr Arg He Arg Thr Phe Asp 45 210 215 220 / .' Ala Asn Thr Gly Asn His Asp Val Ala Ser Gly Ser Thr He Leu Ala 225 230 235 240 Leu Lys Gln Gly Asp Glu Val Trp Leu Gln He Phe Tyr Ser Glu Gln 245 250 255 5 Asn Gly Leu Phe Tyr Asp Pro Tyr Trp Thr Asp Ser Leu Phe Thr Gly 260 265 270 Phe Leu He Tyr Ala Asp Gln Asp Asp Pro Asn Glu Val 275 280 285 10 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Secuencia Artificial 15 <220> <223> Porción Aromática Clq <221> VARIANTE <222> (2) . . . (6) 20 <223> Cada Xaa es independientemente cualquier residuo de aminoácidos <221> VARIANTE <222> (7) . . . (7) <223> Cada Xaa es asparagina o ácido aspártico 25 <221> VARIANTE <222> (8)... (11) <223> Cada Xaa es independientemente cualquier residuo de aminoácidos 30 <221> VARIANTE <222> (12)... (12) <223> Xaa es fenilalanina, tirosina, triptofano o leucina 35 <221> VARIANTE <222> (13)... (13) <223> Cada Xaa es independientemente cualquier residuo de aminoácidos <221> VARIANTE 0 <222> (20)... (24) <223> Cada Xaa es independientemente cualquier residuo de aminoácidos <221> VARIANTE <222> (26)... (26) 45 <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácidos / ,• ,_______.-& ___. <221> VARIANTE <222> (28)... (28) <23>Xaa es cualquier residuo de aminoácidos <221> VARIANTE <222> (30)... (30) <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácidos <221> VARIANTE 10 <222> (31)... (31) <223> Xaa es fenilalanina o tirosina <400> 6 Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 1 5 10 15 Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Tyr Xaa Phe Xaa Xaa 20 25 30 <210> 7 20 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 25 <223> Cebador nucleotídico degenerado <221> variación <222> (D...Ü8) <223>Cada N es ya sea A, T, C o G 30 <400> 7 gaysargtnt ggbtnsar 18 <210> 8 35 <3ll> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 40 <223> Cebador nucleotíd±co degenerado <221> varáación <222> (1)...(18) <223> Cada N es A, T, C o G 45 / . <400> 8 cnnggnntnt aytaytty 18 <210> 9 <211> 18 <212>ADN <213>Secuencia Artificial <220> <223>Cebador nucleotídico degenerado <221> variación <222> (1) . . . (18) <223> Cada N es A , T, G o C <400> 9 aaysarsrnr rncaytay 18 <210> 10 <2ll> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 Cebador nucleotídico degenerado <221> variación <222> (1) . . . (18) <223> Cada N es A , T, G o C <400> 10 wsnggnaart tyvhntgy 18 <210> 11 <5ll> 909 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Nucleótido degenerado que codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 <400> 11 atgggnaarg argayacnca rgaraenmgn aengarecna aratgttygt nytnytntay 60 gtnacnwsnt tygcnathtg ygcnwsnggn carccngng gnaayearyt naarggngar 120 aaytaywsnc cnmgntayat htgywsnath ccnggnytnc cnggnccncc nggnccnccn 180 ggngcnaayg gnwsnccngg nccncayggn gnathggny tnccnggnmg ngayggnmgn 240 gayggnmgna arggngaraa rggngaraar ggnaengeng gnytnmgngg naaracnggn 300 ccnytnggny tngcnggnga raarggngay carggngara cnggnaaraa rggnccnath 360 ggnccngarg gngaraargg ngargtnggn ccnathggnc cnccnggncc naarggngay 420 mgnggngarc arggngaycc nggnytnccn ggngtntgy gntgyggnws nathgtnytn 480 aarwsngcnt tywsngtngg nathacnacn wsntayccng argarmgnyt necnathath 540 ttyaayaarg tnytnttyaa ygarggngar caytayaayc engenaengg naarttyath 600 tgygenttye enggnathta ytayttywsn taygayatha enytngenaa yaarcayytn 660 gcnathggny tngtncayaa yggncartay mgnathaara cnttygaygc naayacnggn 720 aaycaygayg tngcnwsngg nwsnacngtn athtayytnc arcengarga ygargtntgg 780 ytngaratht tyttyacnga ycaraayggn ytnttywsng ayccnggntg ggcngaywsn 840 ytnttywsng gnttyytnyt ntaygtngay acngaytayy tngaywsnat hwsngargay 900 gaygarytn 909 <210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido 23, 631 <400> 12 cgagggagag cactacaa 18 <210> 13 <211> 18 < 12> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido 23 , 632 < )0> 13 ttgccagatg cttattag 18 <210> 14 <211> 1282 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (79)... (945) <400> 14 ggcacgagga ggaaagatcc tgacttttgt acactgggaa tcctgcagca acctaccctc 60 ccagaacacg agcccaag atg att gtc ctg ctc tac gtg acg agt ctt gcc 111 Met He Val Leu Leu Tyr Val Thr Ser Leu Ala 1 5 10 ate tgt gca agt gga caá cct cgg gcc aat cag gct aag gga gag age 159 He Cys Ala Ser Gly Gln Pro Arg Ala Asn Gln Ala Lys Gly Glu Ser 15 20 25 tac tet cca agg tac ate tgc age ate cct gga tta cct ggg ecc cca 207 Tyr Ser Pro Arg Tyr He Cys Ser He Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro 30 35 40 ggt cct cct gga gca aat ggc tcc cct ggg ecc cat ggt cgc att ggc 255 Gly Pro Pro Gly Ala Asn Gly Ser Pro Gly Pro His Gly Arg He Gly 45 50 55 ctt cct gga agg gat ggt aga gat ggc aga aaa gga gag aag ggg gaa 303 Leu Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Lys Gly Glu Lys Gly Glu 60 65 70 75 aag ggc act gca ggt cta aaa ggt aaa act gga ecc ctg ggc ctt gct 351 Lys Gly Thr Ala Gly Leu Lys Gly Lys Thr Gly Pro Leu Gly Leu Ala 80 85 90 ggt gag aaa gga gac caá gga gaa act ggg aag aaa gga ecc ata gga 399 Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly Glu Thr Gly Lys Lys Gly Pro He Gly 95 100 105 cca gag ggt gag aaa gga gaa gtc ggt cca gct ggg cct cct ggg cca 447 Pro Glu Gly Glu Lys Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro 110 115 120 aag gga gac aga gga gat caá ggg gac cca ggg ctg cct gga gtg tgc 495 Lys Gly Asp Arg Gly Asp Gln Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Val Cys 125 130 135 agg tgt gga age att gtg ctc aaa tet gcc ttt tea gtt ggc ate acá 543 Arg Cys Gly Ser He Val Leu Lys Ser Ala Phe Ser Val Gly He Thr 140 145 150 155 acc age tac cca gaa gaa aga cta ecc ate ata ttt aac aaa gtc ctc 591 ., .? _í, -.__.,-ri¡ i- ~'~~...

Thr Ser Tyr Pro Glu Glu Arg Leu Pro He He Phe Asn Lys Val Leu 160 165 170 ttc aat gag ggg gag cat tac aac cct gca acg ggg aag ttc att tgc 639 Phe Asn Glu Gly Glu His Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Lys Phe He Cys 175 180 185 gct ttc cca ggg ate tat tac ttt tet tat gac ate acg ttg gcc aat 687 Ala Phe Pro Gly He Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp He Thr Leu Ala Asn 190 195 200 aag cac cta gca ate ggg ctg gtg cac aat ggg cag tac cgg ata agg 735 Lys His Leu Ala He Gly Leu Val His Asn Gly Gln Tyr Arg He Arg 205 210 215 acc ttt gat gcc aac acá ggg aac cat gat gtg gca teg ggg tcc acá 783 Thr Phe Asp Ala Asn Thr Gly Asn His Asp Val Ala Ser Gly Ser Thr 220 225 230 235 gtc ate tac ctg cag cca gaa gat gag gtc tgg ctg gag ate ttc ttc 831 Val He Tyr Leu Gln Pro Glu Asp Glu Val Trp Leu Glu He Phe Phe 240 245 250 aat gac cag aac ggc ctc ttc teg gat cca ggc tgg gca gac age ttg 879 Asn Asp Gln Asn Gly Leu Phe Ser Asp Pro Gly Trp Ala Asp Ser Leu 255 260 265 ttc tet ggg ttt ctc ctc tat gtc gat acá gat tac ctg gat tet ata 927 Phe Ser Gly Phe Leu Leu Tyr Val Asp Thr Asp Tyr Leu Asp Ser He 270 275 280 tea gag gat gat gag ctg tgatccagac cactacaggc ctgaatgttg 975 Ser Glu Asp Asp Glu Leu 285 caaacatgeg taccacagtg gctgacactc taatctggag tgctggaagg tggageaagt 1035 gataegggga ttcagaaaac gttttttaca gacgactcag gctgagttat caaaataaga 1095 caaaccacca actagctgaa atcacaacaa aacgaatggc atacaataac etcagacatg 1155 gaccccctaa agtaatgatc ctaaatattg aagcaaatta aagcaaatga tgttaacaaa 1215 tttgaatgcc cttggcaata caaccagctg gaaatgacac tgeetcatta aatatteata 1275 aaacccc 1282 <210> 15 <211> 289 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met He Val Leu Leu Tyr Val Thr Ser Leu Ala He Cys Ala Ser Gly 1 5 10 15 Gln Pro Arg Ala Asn Gln Ala Lys Gly Glu Ser Tyr Ser Pro Arg Tyr 20 25 30 He Cys Ser He Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala 35 40 45 Asn Gly Ser Pro Gly Pro His Gly Arg He Gly Leu Pro Gly Arg Asp 50 55 60 Gly Arg Asp Gly Arg Lys Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Thr Ala Gly 65 70 75 80 Leu Lys Gly Lys Thr Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Lys Gly Asp 85 90 95 Gln Gly Glu Thr Gly Lys Lys Gly Pro He Gly Pro Glu Gly Glu Lys 100 105 110 Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly 115 120 125 Asp Gln Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Val Cys Arg Cys Gly Ser He 130 135 140 Val Leu Lys Ser Ala Phe Ser Val Gly He Thr Thr Ser Tyr Pro Glu 145 150 155 160 Glu Arg Leu Pro He He Phe Asn Lys Val Leu Phe Asn Glu Gly Glu 165 170 175 His Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Lys Phe He Cys Ala Phe Pro Gly He 180 185 190 Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp He Thr Leu Ala Asn Lys His Leu Ala He 195 200 205 Gly Leu Val His Asn Gly Gln Tyr Arg He Arg Thr Phe Asp Ala Asn 210 215 220 Thr Gly Asn His Asp Val Ala Ser Gly Ser Thr Val He Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Pro Glu Asp Glu Val Trp Leu Glu He Phe Phe Asn Asp Gln Asn Gly 245 250 255 Leu Phel5er Asp Pro Gly Trp Ala Asp Ser Leu Phe Ser Gly Phe Leu 260 265 270 Leu Tyr Val Asp Thr Asp Tyr Leu Asp Ser He Ser Glu Asp Asp Glu 275 280 285 Leu

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 80% idéntica en secuencia de aminoácidos a los residuos 52-303 de la SEQ ID NO. 2, caracterizada la secuencia porque comprende: las repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal.

2. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es al menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a los residuos 31-303 de la SEQ ID NO. 2

3. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque cualesquiera diferencias entre el polipéptido y la SEQ ID NO. 2 son debidas a las substituciones conservadoras de aminoácidos.

4. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el dominio similar al colágeno consiste de 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro.

5. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido 5 comprende : una región amino-terminal; 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de 10 aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácidos 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231- 238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2. 15

6. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido se enlaza específicamente con un anticuerpo que se enlaza específicamente con un polipéptido de la SEQ ID NO. 2.

7. Un polipéptido aislado de conformidad con la 20 reivindicación 2, caracterizado porque el dominio similar al colágeno comprende los residuos de aminoácidos 52-153 de la SEQ ID NO. 2.

8. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el dominio Clq i?i ia'aftlMftÉíiiftiiili lu í i i i i i imi comprende los residuos de aminoácidos 154-303 de la SEQ ID NO. 2.

9. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 52-303 de la SEQ ID NO. 2.

10. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 31-303 de la SEQ ID NO. 2.

11. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 1-303 de la SEQ ID NO. 2.

12. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es formado en complejo por enlaces disulfuro intermoleculares para formar un homotrímero.

13. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es formado en complejo por enlaces disulfuro intermoleculares, a uno o más polipéptidos que tienen un dominio similar al colágeno, para formar un heterotrímero.

14. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque está covalentemente enlazado en el extremo amino o carboxilo a una porción seleccionada del grupo que consiste de marcadores de afinidad, toxinas, radionucleótidos, enzimas y fluoróforos.

15. Un polipéptido aislado, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a) un polipéptido que consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos desde el residuo 52 hasta el residuo 153 de la SEQ ID NO. 2; y b) un polipéptido que consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos desde el residuo 154 hasta el residuo 303 de la SEQ ID NO. 2.

16. Una proteína de fusión, caracterizada porque consiste esencialmente de una primera porción y una segunda porción, unidas por un enlace peptídico, la primera porción consiste de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1; b) el polipéptido que comprende: una región amino-terminal; 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácido 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231-238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2 ; c) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar al colágeno, capaz de realizar la trimeri zación u oligomerización; d) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio Clq o una porción activa del dominio Clq; o e) una porción del polipéptido zacrp2 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio similar al colágeno y el dominio Clq; y la segunda porción comprende otro polipéptido.

17. Una proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la primera porción se selecciona del grupo que consiste de: a) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácido 52 hasta el residuo de aminoácido 153 de la SEQ ID NO. 2; b) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácido 154 hasta el residuo de aminoácido 303 de la SEQ ID NO. 2; c) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácido 52 al 303 de la SEQ ID NO. 2; d) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácido 31 al 303 de la SEQ ID NO. 2; y e) un polipéptido que consiste de la secuencia del residuo de aminoácido 1 al 303 de la SEQ ID NO. 2. íií i .-> i ?.

18. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque está en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un método de producción de un anticuerpo para un polipéptido, caracterizado el método porque comprende: la inoculación de un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1; b) el polipéptido que comprende: una región amino-terminal; 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácido 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231-238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2; c) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar al colágeno, capaz de realizar la trimerización u oligomerización; d) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio Clq o una porción activa del dominio Clq; o iMiii e) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio similar al colágeno y el dominio Clq; y en donde el polipéptido promueve una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y el aislamiento del anticuerpo del animal .

20. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, caracterizado porque se enlaza específicamente a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

21. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: a) anticuerpo policlonal; b) anticuerpo monoclonal murino; c) anticuerpo humanizado derivado de b) ; y d) anticuerpo monoclonal humano.

22. Un fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv, y la unidad de reconocimiento mínima.

23. Un anticuerpo anti-idiotipo, caracterizado porque se enlaza específicamente al anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20. tt¿A&A.

24. Una proteína de enlace, caracterizada porque se enlaza específicamente a un epítope de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

25. Un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 80% idéntica en secuencias de aminoácidos a los residuos 52-153 de la SEQ ID NO. 2, caracterizada la secuencia porque comprende: repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; un dominio Clq carboxilo-terminal.

26. un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido es al menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a los residuos 31-303 de la SEQ ID NO. 2.

27. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el dominio es similar al colágeno consiste de 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro.

28. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido comprende : una región amino-terminal; 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácidos 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231-238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2.

29. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque cualesquiera diferencias entre el polipéptido y la SEQ ID NO. 2 son debidas a las sustituciones conservadoras de aminoácidos.

30. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido se enlaza específicamente con un anticuerpo que se enlaza específicamente con un polipéptido de la SEQ ID NO. 2.

31. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el dominio similar al colágeno comprende los residuos de aminoácidos 52-153 de la SEQ ID NO. 2.

32. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 52-303 de la SEQ ID NO. 2. __?¡ . . ^ ^ ^ __._. __.. _. , „__^___ . £ . , . ,*. . .. > ^^uMfJ J

33. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 31-303 de la SEQ ID NO. 2.

34. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 1-303 de la SEQ ID NO. 2.

35. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido está covalentemente enlazado en el extremo amino o carboxilo a una porción seleccionada del grupo que consiste de marcadores de afinidad, toxinas, radionucleótidos, enzimas y fluoróforos .

36. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 1 ; b) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 91 hasta el nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 1; c) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 91 hasta el nucleótido 459 de la SEQ ID NO. 1; d) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 154 hasta el nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 1; e) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 154 hasta el nucleótido 459 de la SEQ ID NO. 1; f) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 460 hasta el nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 1; g) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de los residuos 51 al 153 de la SEQ ID NO. 2 ; h) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de los residuos 154 al 303 de la SEQ ID NO. 2; i) un polinucleótido que permanece hebridado, después de las condiciones de lavado estrictas, a un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.l, o el complemento de la SEQ ID NO. 1; j) Las secuencias nucleotídicas complementarias a a) , b) , c) , d) , e) , f) , g) , h) o i) y k) Las secuencias nucleotídicas degeneradas de g) o h) .

37. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica para una proteína de fusión que consiste esencialmente de una primera porción y una segunda porción unidas por un enlace peptídico, la primera porción consiste de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1; b) el polipéptido que comprende: una región amino-terminal; 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido; y un dominio Clq carboxilo terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácidos 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231-238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2; c) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar al colágeno capaz de realizar la trimerización o la oligorimerización; d) una porción del polipéptido zacrp7 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio Clq o una porción activa del dominio Clq; o e) una porción del polipéptido zacrp2 como se muestra en la SEQ ID NO. 2, que comprende el dominio similar al colágeno y el dominio Clq; y la segunda porción comprende otro polipéptido.

38. un polinucleótido aislado, caracterizado porque consiste de la secuencia del nucleótido 1 al nucleótido 909 de la SEQ ID NO. 11.

39. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos operablemente enlazados: un promotor de la transcripción; un segmento de ADN que codifica para un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ; y un terminador de la transcripción.

40. Un vector de expresión de conformidad con la 5 reivindicación 39, caracterizado porque el segmento de ADN codifica para un polipéptido que es al menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a los residuos 31-303 de la SEQ ID NO. 2.

41. Un vector de expresión de conformidad con la 10 reivindicación 39, caracterizado porque el dominio similar al colágeno consiste de 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro.

42. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el segmento de ADN 15 codifica para un polipéptido que comprende: una región amino-terminal; 26 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Xaa y 8 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro que forman un dominio similar al colágeno, en donde Xaa es cualquier residuo de 20 aminoácido; y un dominio Clq carboxilo-terminal que comprende 10 hebras beta correspondientes a los residuos de aminoácidos 164-168, 184-186, 192-195, 199-201, 205-216, 220-226, 231- 238, 241-253, 258-263 y 281-285 de la SEQ ID NO. 2. , .--s-jssia

— -*-*«-»-«"-"•*"- •- 43. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el dominio similar al colágeno comprende los residuos de aminoácidos 52-153 de la SEQ ID NO. 2.

44. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque cualesquiera diferencias entre el polipéptido y la SEQ ID NO. 2 son debidas a sustituciones conservadoras de aminoácidos.

45. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el polipéptido se enlaza específicamente con un anticuerpo que se enlaza específicamente con un polipéptido de la SEQ ID NO. 2.

46. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el ADN codifica para un polipéptido que comprende los residuos 52-303 de la SEQ ID NO. 2.

47. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el segmento de ADN codifica para un polipéptido que comprende los residuos 31-303 de la SEQ ID NO. 2.

48. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el segmento de ADN codifica para un polipéptido que comprende los residuos 1-303 de la SEQ ID NO. 2. "*-• - ' i -* • -* í l

49. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el segmento de ADN codifica además para una secuencia de señal secretora operablemente enlazada al polipéptido.

50. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la secuencia de señal secretora comprende los residuos 1-30 de la SEQ ID NO. 2.

51. Una célula cultivada dentro de la cual ha sido introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada la célula porque expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.

52. Una célula cultivada de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque incluye además uno o más vectores de expresión que comprenden los segmentos de ADN que codifican para los polipéptidos que tienen dominios similares al colágeno.

53. Un método para la producción de una proteína, caracterizado el método porque comprende: el cultivo de una célula dentro de la cual ha sido introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 39; mediante lo cual la célula expresa la proteína codificada por el segmento de ADN; y la recuperación de la proteína expresada.

54. Un método para la producción de una proteína de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la proteína expresada es un homotrímero.

55. Un método para la producción de una proteína de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la proteína expresada es un heterotrímero.

56. Un método para detectar la presencia de la expresión del gen zacrp7 en una muestra biológica, caracterizado el método porque comprende: (a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico de zacrp7 bajo condiciones de hibridación ya sea con (i) las moléculas de ARN de prueba aisladas de la muestra biológica, o (ii) las moléculas de ácido nucleico sintetizadas a partir de las moléculas de ARN aisladas, en donde la sonda consiste de una secuencia nucleotídica que comprende una porción de la secuencia nucleotídica de la molécula de ácido nucleico de conformidad de conformidad con la reivindicación 25, o los complementos de la misma, y (b) la detección de la formación de los híbridos de la sonda de ácido nucleico y las moléculas de ARN de prueba o las moléculas de ácido nucleico sintetizadas, en donde la presencia de los híbridos indica la presencia del ARN de zacrp7 en la muestra biológica.

57. Un método para detectar la presencia de zacrp7 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: (a) el poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, de conformidad con la reivindicación 20, en donde la puesta en contacto es realizada bajo condiciones que permiten el enlace del anticuerpo o del fragmento del anticuerpo a la muestra biológica, y (b) la detección de cualquiera del anticuerpo enlazado o del fragmento del anticuerpo enlazado.