MXPA01007521A - Polipeptido humano provisto de multiples dominios similares al factor de crecimiento epidermico(egf), zntr2 - Google Patents

Abstract

Los dominios similares al factor de crecimiento epidérmico aparecen en una amplia variedad de proteínas que llevan a cabo funciones biológicas críticas, tales como la regulación de la diferenciación celular. El ZNTR2 es un nuevo miembro de este grupo de proteínas.

Description

PO IPEPTIDO HUMANO PROVISTO DE MÚLTIPLES DOMINIOS SIMILARES AL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGF) , ZNTR2 Campo técnico de la invención La presente invención se relaciona generalmente a los polipéptidos que tienen usos terapéuticos y de diagnóstico. En particular, la presente invención se relaciona a un polipéptido novedoso, designado ?Zntr2", y a moléculas de ácidos nucleicos que se codifican para Zntr2.

Antecedentes de la invención La diferenciación celular de organismos multicelulares se controlan mediante hormonas y factores polipeptídicos de crecimiento. Estas moléculas diseminables permiten que las células se comuniquen entre sí y actúan en concierto para formar tejidos y órganos, para reparar y regenerar tejidos dañados. Ejemplos de hormonas y de factor de cretcimiento incluyen las hormonas de esteroides, hormona paratiroidea, hormona folículo estimulante, los interferones, las interleucinas, el factor de REF: 131993 crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, y el factor estimulante de colonias de macrófagos-granulocitos . Las hormonas y los factores " de crecimiento influyen en el metabolismo celular al aglutinarse a las proteínas receptoras . Ciertos receptores son proteínas integrales de la membrana que se aglutinan con la hormona o el factor de crecimiento fuera de la célula, y se ligan a sendas de señalización dentro de la célula, tales como los segundos sistemas mensajeros. Otras clases de receptores son las moléculas solubles intracelulares . El factor de crecimiento epidérmico, uno de los primeros factores de crecimiento que se descubrieron, ejerce un efecto mitogénico potencial en células epiteliales, células endoteliales, y los fibroblastos. A la luz de su amplia actividad farmacológica, el factor de crecimiento epidérmico se ha utilizado como un auxiliar para la cicatrización de heridas, y para tratar pacientes afectados por condiciones tales como enterocolitis necrotizante, síndrome de Zollinger-Ellison, ulceración gastrointestinal, y atrofia congenital de las microvellosidades (Gucjlietta y Sullivan, Eur. J. Gas troenterol . Hepatol . 7:945 (1995); Rosenthal y colaboradores, Jn Vi vo 11 : 201 (1997); Gónül y colaboradores, J. Pharm . Pharmacol . 50:641 (1998) ) . Un dominio de péptido que caracteriza el factor de crecimiento epidérmico consiste de aproximadamente 30 a 50 residuos amino e incluye tres enlaces disulfuro (ver, por ejemplo, Na ayama y colaboradores, Genomi cs 51 : 21 (1998)). Esta región del factor de crecimiento epidérmico se cree que juega un papel en las funciones extracelulares críticas, incluyendo la adhesión celular y las interacciones de receptor-ligando. Los dominios similares a factor de crecimiento epidérmico se hayan en una dirección de proteínas que son ya sea proteínas secretadas o proteínas unidas a la membrana que contienen los dominios dentro de la región extracelular. Las proteínas que contienen los dominios similares a factor de crecimiento epidérmico incluyen los inhibidores de la diferenciación, estimuladores de la diferenciación, factores de coagulación, y activadores del factor de crecimiento, entre otros. En vista de los papeles significativos que juegan estas proteínas, existe una necesidad para la identificación de nuevos polipéptidos caracterizados por un motivo similar al factor de crecimiento epidérmico, que puede proporcionar nuevas herramientas para detectar y tratar las alteraciones en estas funciones biológicas básicas, tales como la diferenciación celular.

Breve resumen de la invención La presente invención proporciona un polipéptido novedoso, designado ""*Zntr2" . La presente invención también proporciona polipéptidos variantes de Zntr2, proteínas de fusión de Zntr2, moléculas de ácidos nucleicos se codifican para estos polipéptidos y proteínas, y métodos para utilizar estos nucleótidos y secuencias de aminoácidos.

Breve descripción de la invención 1. Resumen La presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que se codifican para un nuevo polipéptido en humano, designadas como *Zntr2", en que se caracterizan mediante múltiples dominios similares al factor de crecimiento epidérmico. Una molécula ilustrativa de ácidos nucleicos que contiene la secuencia que codifica para el polipéptido Zntr2 contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0:1.

El polipéptido codificado tiene la siguiente secuencia de aminoácido: MNGGAERAMR SLPSLGGLAL LCCAAAAAAA AVASAASAGN VTGGGGAAGQ VDASPGPGLR GEPSHPFPRA TAPTAQAPRT GPPRATVHRP LAATSPAQSP ETTPLWATAG PSSTTFQAPL " GPSPTTPPAA ERTSTTSQAP TRPAPTTLST TTGPAPTTPV ATTVPAPTTP RTPTPDLPSS SNSSVLPTPP ATEAPSSPPP EYVCNCSWG SLNVNRCNQT TGQCECRPGY QGLHCETCKE GFYLNYTSGL CQPCDCSPHG ALSIPCNSSG KCQCKVGVIG SICDRCQDGY YGFSFNGCLP CQCNNRSASC DALTGACLNC QENSKGNHCE ECKEGFYOSP DATKECLRCP CSAVTSTGSC SIKSSELEPE CDQCKDGYIPG PNCNKCENGY YNFDSICRKC QCHGHVDPVK TPKICKPESG ECINCLHNTT GFWCENCLEG YVHDLEGNCI KKEVILPTPE GSTILVSNAS LTTSVPTPVI NSTFTPTTLQ TIFSVSTSEN STSALADVSW TQFNIIILTV IIIVWLLMG FVGAVYMYRE YQNRKLNAPF TIELKEDNI SFSSYHDSIP NADVSGLLED DGNEVAPNGQ LTLTTPIHNY KA (SEQ ID N0:2) . Por lo tanto, el gen Zntr2 descrito en la presente codifica para un polipéptido de 602 aminoácidos . El análisis del polipéptido Zntr2 revela una variedad de dominios funcionales. La secuencia de señal Zntr2 incluye residuos de aminoácidos 1 a 30 de SEQ ID NO: 2, aunque, los residuos 9 a 30 de los aminoácidos también proporcionan una secuencia útil de señal. El dominio extracelular Zntr2 incluye los residuos 31 al 507 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, el dominio transmembranal incluye los residuos 508 al 533 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y un dominio intracelular incluye los residuos 534 al 602 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La" secuencia de aminoácidos Zntr2 también contienen múltiples repeticiones de dos motivos relacionados al factor de crecimiento epidérmico. Una sintonía similar al factor de crecimiento epidérmico tiene la siguiente estructura: x ( ) -C-x (0.48) -C-x(3, 12) -C-x (1.70) -C-x (1.6) -C-x (2) -G-a-x(0.21) -G-x(2) -C-x, en donde "'x" es un aminoácido, ""a" normalmente es un aminoácido aromático, y una gama entre paréntesis indica la ocurrencia de 'x" (secuencia PROSITE número PDOC00021 de Liberación 15.0; Bairoch y colaboradores, Nucl eic Acids Res, 24:217 (199.7)). Este motivo se encuentra presente en SEQ ID NO: 2 en los residuos 200 al 236 de los aminoácidos, y 250 al 284. En el último caso, el aminoácido representado por *a" en la sintonía es valina, más que un aminoácido aromático. La región entre la cuarta y la sexta sisteína, incluye dos residuos conservados de glicina, puede exhibir el siguiente patrón: C-x-C-x (5) -G-x (2) -C. Este patrón puede hallarse en . los residuos 224 al 235 de aminoácidos y 272 al 283 de SEQ ID NO: 2. Una sintonía de dominio similar al factor de crecimiento epidérmico tipo laminina, que sigue el patrón: C-x (1,2) -C-x (5) -G-x (2) -C-x (2) -C-x (3,4)- [FYW] -x(3,15)-C, en donde ^x" es un aminoácido, los valores en paréntesis indican ya sea el número o la gama de ocurrencia de *x", y los aminoácidos aceptables indicados en corchetes (secuencia PROSITE número PS01248 de Liberación 15.0). Ocurren cinco repeticiones de este motivo dentro de SEQ ID NO: 2: residuos 224 al 256 de aminoácidos (alternativamente: residuos 224 al 254 de aminoácidos, o residuos 224 al 251 de aminoácidos) , residuos 272 al 303 de aminoácidos (alternativamente: residuos 272 al 301 de aminoácidos, o residuos de 272 al 298 de aminoácidos), residuos 317 al 351 de aminoácidos (alternativamente: residuos 317 al 349 de aminoácidos, o residuos 317 al 346 de aminoácidos) , residuos 371 al 402 de aminoácidos (alternativamente: residuos 371 al 400 de aminoácidos, o residuos 371 al 397 de aminoácidos) , y residuos 422 al 449 de aminoácidos. Un estudio de localización cromosómica revela que el gen Zntr2 reside en el cromosoma 9 humano en 9q33. Esta región está asociada al síndrome congénito letal, como se describe a continuación. Los análisis de transferencia Northern ponen de manifiesto dos tamaños de transcripción de Zntr2, de aproximadamente 3.4 kilobases y 6.5 kilobases de longitud. Una fuerte expresión de transcripto de 3.4 kilobase se observa en los leucocitos de la sangre periférica, mientras una expresión más débil se observa en la médula espinal, en la médula ósea, en el bazo, en los testículos, en el ovario y el colon. Cada tejido que se examina muestra la expresión de un transcripto mayor excepto el timo. La expresión más fuerte del transcripto más grande se observa en el cerebro, el bazo, los leucocitos de sangre periférica y en la médula espinal. También se descubre un alto nivel de expresión en el tejido cerebral de fetos. Estos resultados muestran que las secuencias de Zntr2 se pueden utilizar para diferenciarse entre diversos tej idos.— ~ Como se describe en la presente, la presente invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden un dominio extracelular, en donde el dominio extracelular comprende residuos 31 al 507 de aminoácidos de la secuencia aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Estos polipéptidos pueden además comprender un dominio transmembranal que reside la posición carboxil-ter inal en relación al dominio extracelular, en donde los dominios transmembranales comprenden los residuos 508 al 533 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Estos polipéptidos ~ también pueden comprender un dominio intracelular que reside en la posición carboxil-terminal en relación al dominio transmembranal, en donde el dominio intracelular comprende los residuos 534 al 602 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y opcionalmente, una secuencia de señal secretoria que reside en una posición amino-terminal en relación al dominio extracelular, en donde la secuencia de señal secretoria comprende ya sea los residuos 1 al 30 ó 9 al 30 de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La presente invención también contempla los polipéptidos aislados que contienen una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 70 por ciento, por lo menos un 80 por ciento, o por lo menos un 90 por ciento, idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos dé los residuos 31 al 224 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o la secuencia de aminoácidos de los residuos 31 al 507 de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en donde estos polipéptidos aislados pueden aglutinarse de manera específica con un anticuerpo que se aglutina específicamente como un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2. Un polipéptido ilustrativo es un polipéptido que comprende los residuos 31 al 602 de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos ejemplificantes adicionales incluyen los polipéptidos que comprenden por lo menos una sintonía similar al factor de crecimiento epidérmico que tiene uno de los siguientes motivos: x(4) -C-x-C-x (10) -C-x (6) -C-x-C-x(2) -G-x (2) -G-x (2) -C-x, o x(4)-C-x-C-x(9)-C-x(5) -C-x-C-x (2) -G-x (2) -G-x (2) -C-x, en donde x,x" es un aminoácido, y en donde los valores en paréntesis indican el número de ocurrencias de ^x" . Por ejemplo, estos polipéptidos pueden comprender cuando menos una secuencia de aminoácidos de los residuos 200 al 236 de los aminoácidos de. SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos de los residuos 250 al 284 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Más aún, estos polipéptidos pueden comprender ambas secuencias de aminoácidos. Otros polipéptidos ilustrativos incluyen los polipéptidos que además comprenden por lo menos una sintonía de dominio similar al factor de crecimiento epidérmico ~ tipo laminina que tiene uno de los siguientes motivos: C-x-C-x (5) -G-x (2) -C-x (2) -C-x (3) -F-x(8)-C, C-x-C-x (5) -G-x (2) -C-x (2) -C-x (3) -Y-x (7) -C, C-x (2) -C-x (5) -G- (2) -C-x (2) -C-x (3) -F-x (9) -C, C-x(2)-C-x(5) -G-x (2) - (c-x- (2) -C-x(3)-Y-x(6) -C, y C-x (2) -C-x (5) -G-x (2) -C-x (2) -C-x (3) -Y-x (7) -C, en donde *x" es cualquier aminoácido, y en donde los valores en paréntesis indican el número de ocurrencia de *x" . Estos polipéptidos pueden comprender cuando menos una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de (a) residuos 224 al 251 de aminoácidos de SEQ TD NO: 2, (b) secuencia de aminoácidos de los residuos 272 al Z98 de aminoácidos de SEQ ID NO:2, (c) residuos 317 al 346 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, (d) secuencia de aminoácidos de los residuos 371 al 397 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y (e) residuos 422 al 449 de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Además, estos polipéptidos pueden comprender todas las secuencias de aminoácidos (a) al (e) . La presente invención también contempla los polipéptidos que comprenden cuando menos 15 residuos contiguos de aminoácidos de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2: (a) residuos 1 al 220 de aminoácidos, (b) residuos 31 al 220 de aminoácidos, (c) residuos 1 al 2.41 de aminoácidos, (d) residuos 31 al 241 de aminoácidos, (e) residuos 1 al 507 de aminoácidos, (f) residuos 9 al 507 de aminoácidos, (g) residuos 508 al 533 de aminoácidos, y (h) residuos 534 al 602 de aminoácidos, o por lo menos 30 residuos contiguos de aminoácidos de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2: (i) residuos 1 al 235 de aminoácidos, (j) residuos 31 al 235 de aminoácidos, (k) residuos 1 al 256 de aminoácidos, (1) residuos 31 ai 256 de aminoácidos, (m) residuos 1 al 507 _de aminoácidos, (n) residuos 9 al 507 de aminoácidos, (o) residuos 508 al 533 de aminoácidos, y (p) residuos 534 al 602 de aminoácidos. La presente invención también incluye los polipéptidos que comprenden, o que consisten de residuos de aminoácidos (a) al (p) . Los polipéptidos adicionales ilustrativos descritos en la presente incluyen los polipéptidos que comprende, o que consisten de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2: residuos 1 al 206 de aminoácidos, 31 al 206, 1 al 227, y 31 al 207. La presente invención además proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se aglutinan de manera específica con estos polipéptidos. Los anticuerpos ejemplificantes incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos murinos monoclonales, anticuerpos humanizados derivados de anticuerpos monoclonales de murino, y anticuerpos monoclonales de humano. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen F(ab')., F(ab)_, Fab', Fab, Fv, scFv, y unidades mínimas de reconocimiento. La presente invención además contempla los anticuerpos anti-idiotipo que se aglutinan con estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. La presente invención también incluye las composiciones que comprenden un vehículo y un péptido, pslipéptido, anticuerpo, o anticuerpo anti-idiotipo descrito en la presente.

La presente invención también proporciona moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido Zntr2, en donde la molécula de ácido nucleico se selecciona a partir del grupo que consiste de (a) una molécula de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, (b) una molécula de ácidos nucleicos que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y (c) una molécula de ácidos nucleicos que permanece hibridizada luego de condiciones rigurosas de lavado hacia una molécula de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 193-1908 de SEQ ID N0:1, o el complemento de nucleótidos 193-1908 de SEQ ID NO: 1. Las moléculas ilustrativas de ácidos nucleicos incluyen aquellos en donde cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos que modifica para la molécula de ácidos nucleicos y la secuencia correspondiente a aminoácidos de SEQ ID NO: 2 es debida a una sustitución conservativa de aminoácidos. La presente invención además contempla las moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 193-1908 de SEQ ID N0:1. Por ejemplo, una molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 103-1908 de SEQ ID NO:l.

La presente invención también incluye vectores y vectores de expresión que comprenden estas moléculas de ácidos nucleicos. Estos vectores de expresión pueden comprender un promotor de la transcripción, y un terminador de la transcripción, en donde el promotor está ligado de manera operable a la molécula de ácidos nucleicos, en donde la molécula de ácidos nucleicos está ligada de manera operable con el terminador de la transcripción. La presente invención además incluye células hospederas recombinantes que comprenden estos vectores y vectores de expresión. Las células hospederas ilustrativas incluyen células bacterias, de levaduras, fúngales, de insecto, de mamífero, y vegetales. Las células hospederas recombinantes que comprenden -estos vectores de expresión pueden utilizarse para producir polipéptidos Zntr2 mediante el cultivo de estas células hospederas recombinantes que comprenden vector de expresión y que producen la proteína Zntr2 y, opcionalmente, aislar la proteína Zntr2 de las células hospederas recombinantes cultivadas . La presente invención también contempla los métodos para detectar la presencia del Zntr2 ARN en una muestra biológica, que comprende los pasos de (a) poner en contacto una sonda Zntr2 de ácidos nucleicos bajo condiciones hibridizantes ya sea con (i) moléculas de análisis ARN aisladas en una muestra biológica, o (ii) moléculas de ácidos nucleicos sintetizadas a partir de moléculas aisladas de ARN, en donde la sonda tiene una secuencia de nucleótidos que comprenden una porción de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 193-1908 de SEQ ID NO : 1 , o su complemento, y (b) detectar la formación de híbridos de la sonda de estos nucleótidos ya sea las moléculas de análisis de ARN o las moléculas sintetizadas de ácidos nucleicos, en donde la presencia de los híbridos indica la presencia del Zntr2 ARN en la muestra biológica. Como ilustración, la muestra biológica puede ser una muestra biológica de humano. La presente invención además proporciona métodos para detectar la presencia de polipéptidos Zntr2 en una muestra biológica, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto -la muestra biológica con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se aglutina de manera específica con un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en donde el contacto se dá bajo condiciones que permiten la aglutinación del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la muestra biológica, y (b) detectar cualquier anticuerpo aglutinado o fragmento aglutinado de anticuerpo. Este anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede además comprender un marcador detectable seleccionado a partir del grupo que consiste de un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente, y oro coloidal. Una muestra biológica ejemplificante es una muestra biológic -de humano. La presente invención también proporciona juegos de reactivos para llevar a cabo estos métodos de detección. Por ejemplo, un juego de reactivos para la detección de la expresión del gen Zntr2 puede comprender un contenedor que comprende una molécula de ácidos nucleicos, en donde la molécula de ácidos nucleicos se selecciona a partir del grupo que consiste de (a) una molécula de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 193-1908 de SEQ ID N0:1, (b) una molécula de ácidos nucleicos que comprende el complemento de los nucleótidos 193- 1908 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:l, (c) una molécula de ácidos nucleicos que es un fragmento de (a) que consiste de cuando menos ocho nucleótidos, y (d) una molécula de ácidos nucleicos que es un fragmento de (b) que consiste de por lo menos ocho nucleótidos. Este juego de reactivos puede comprender un segundo contenedor que comprende uno o- más reactivos capaces de indicar la presencia de la molécula de ácidos nucleicos. Por otra parte, un juego de reactivos para la detección de la proteína Zntr2 puede comprender ' un contenedor que comprende un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpos, que se aglutina de manera específicaa un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO : 2. La presente, invención también contempla las moléculas aisladas de ácidos nucleicos y comprende una 'secuencia de nucleótidos que codifica para la -secuencia de señal de secreción .de Zntr2 y una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido biológicamente activo, en donde la secuencia de señal de secreción para Zntr2 comprendé una secuencia de aminoácidos ya sea de los residuos 1 a 30 de SEQ ID NO : 2 o residuos 9 al 30 de SEQ ID NO: 2. El polipéptido activo biológicamente ejemplificado incluye el Factor Vlla, proinsulina, insulina, hormona folículo estimulante, activador de tipo tejido del plasminógeno, factor de necrosis tumoral, interleucina, factor estimulante de colonias, interferón, eritropohetina, y tro bopoyetina . La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden una secuencia de señal de secreción de Zntr2 y un polipéptido, en donde la secuencia de señal de secreción de Zntr2 comprende una secuencia de aminoácidos ya sea de los residuos 1 al 30 de SEQ ID NO: 2 o residuos 9 al 30 de SEQ ID NO: 2. La presente invención además incluye moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican para un dominio extracelular de Zntr2, en donde el dominio extracelular tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 31 al 507 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y polipéptidos aislados que consisten de la secuencia de aminoácidos de los residuos 31 al 507 de aminoácidos de SEQ ID NO : 2. La presente invención también contempla los anticuerpos que se aglutinan específicamente con los polipéptidos aislados, y anticuerpos anti-idiotipo que se aglutinan específicamente con estos anticuerpos.

Estos anticuerpos anti-idiotipo pueden utilizarse, por ejemplo, para imitar el dominio extracelular de Zntr2. Además, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden una porción de un polipéptido Zntr2, y una porción de inmunoglobulina, tal como una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina . Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes mediante las referencias a la siguiente descripción detallada. 2. Definiciones En la descripción que sigue, se usan de manera extensiva una variedad de términos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la invención. Como se utiliza en la presente, los términos "'ácido nucleico" o "molécula de ácidos nucleicos" se refiere a polinucleótidos, tal como el ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) , oligonucleótidos, fragmentos generados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , y fragmentos generados mediante cualquier acción de ligación, escissión, y endonucleasa, y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden componerse de monómeros que son nucleótidos que ocurren naturalmente (tales como el ADN y el ARN) , o análogos de nucleótidos que ocurren naturalmente (por ejemplo, formas alfa-enantloméricas de nucleótidos que ocurren naturalmente), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados tienen alteraciones en sus porciones de azúcar y/o en las porciones de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de los azúcares incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilos con halógenos, grupos alquilo, aminas, y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse a manera de éteres o esteres. Más aún, la porción completa del azúcar puede reemplazarse con estructuras estéricamente y electrónicamente similares, tales como los aza-azúcares y análogos carbocíclicos del azúcar. Los ejemplos de las modificaciones en una porción de base incluyen las purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros substitutos heterocíclicos que se conocen bien. Los monómeros de ácidos nucleicos pueden ligarse a enlaces fosfodiéster o análogos de estos enlaces. Los análogos de los enlaces fosfodiéster incluyen el fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforamidato, y similares. El término ^molécula de ácidos nucleicos" también incluye los llamados "ácidos nucleicos peptídicos", que comprenden bases de ácidos nucleicos modificados o que ocurren naturalmente a una estructura principal de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ya sea ser monocatenarios ~o bicatenarios. El término * complemento de una molécula de ácidos nucleicos" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos que tiene una secuencia complementaria de nucleótidos y una orientación inversa en comparación a una secuencia de nucleótidos de referencia. Por ejemplo., la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3' . El término * contiguo" denota una molécula de ácidos nucleicos que tiene un tramo contiguo de una secuencia idéntica o complementaria a otra molécula de ácidos nucleicos. Las secuencias contiguas se dice que se ^superponen" a un tramo dado de una molécula de ácidos nucleicos ya sea en su totalidad o a lo largo de un tramo parcial de la molécula de ácidos nucleicos. El término "secuencia degenerada de nucleótidos" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados en comparación a una molécula de referencia de ácidos nucleicos que codifica para un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican para el mismo residuo de aminoácidos (es decir, tripletes GAU y GAC que codifican cada uno para Asp) . El término "gen estructural" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos que se transcribe en el ARN mensajero (ARNm), que luego se traduce en una secuencia de aminoácidos de característica para un polipéptido específico. Una "'molécula aislada de ácidos nucleicos" es una molécula de ácidos nucleicos que no se integra en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, la molécula de ADN que codifica para un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula aislada de ADN. Otro ejemplo de una molécula aislada de ácidos nucleicos es una molécula de ácidos nucleicos químicamente sintetizada que no se integra en el genoma de un organismo. Una molécula de ácidos nucleicos que se ha aislado de una especie en particular es menor que la molécula completa de ADN de un cromosoma de esa especie. Una "estructura de una molécula de ácidos nucleicos" es una molécula de ácidos nucleicos, ya sea mono o bicatenaria que se ha modificado mediante la intervención humana para contener segmentos de ácidos nucleicos combinados y yuxtapuestos en una configuración que no existe en la naturaleza. El "ADN lineal" denota moléculas de ADN que no son circulares y que tienen un extremo 5' libre y extremos 3' libres. El ADN lineal se puede preparar de moléculas de ADN circulares y cerradas, tales como plásmidos, mediante digestión enzimática o interrupción física. El "ADN complementario (ADNc)" es una molécula de ADN onocatenaria que se forma a partir de 'molde de ARNm mediante transcriptasa inversa enzimática. Típicamente, un cebador complementario a prociones de ARNm se emplea para la iniciación de la transcripción inversa. Aquellos diestros en la técnica también utilizan el término "ADNc" para referirse a una molécula de ADN bicatenaria que consiste de esta molécula de ADN monocatenaria y su cadena complementaria de ADN. El término "ADNc" también se refiere a un clon de . una molécula de ADNc sintetizada a partir de un molde de ARN. Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente, el promotor se localiza en la región 5' no codi-ficadora de un gen, próxima a la secuencia de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción normalmente se caracterizan por secuencias de nucleótidos de concenso. Estos elementos promotores incluyen los sitios de aglutinación del ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de la diferenciación (DSEs; McGehee y colaboradores, Mol . Endocrinol . 7:551 (1993)), elementos de respuesta del AMP cíclico (CREs), elementos séricos de respuesta (SREs; Treis an, Seminars in Cáncer Bi ol . 1:47 (1990)), elementos de respuesta de glucocorticoides (GREs), y sitios de aglutinación para otros factores de la transcripción, tales como CRE/ATF (O'Reilly y colaboradores, J. Bi ol . Chem . 267 : 1993 % (1992)), AP2 (Ye y colaboradores, J. Bi ol . Chem . 269 : 25128 (1994)), SPI, proteína aglutinadora del elemento de respuesta de /AMPc (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) y factores de octámeros (ver, en general, Watson y colaboradores, eds., Mol ecular Bi ol ogy of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), y Lemaigre and Rousseau, Bi ochem . J. 303 : 1 (1994)) . Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de la transcripción se incrementa en respuesta a un agente inductor. En contraste, la velocidad de la transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. Los promotores reprimibles también se conocen. Un "promotor nuclear" contiene secuencias esenciales de nucleótidos para la función promotora, que incluye la secuencia TATA y el inicio de la transcripción. Mediante esta definición, un promotor nuclear puede o no tener una actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que puedan intensificar la actividad o conferir una actividad específica de tejido.

Un "elemento regulatorio" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor nuclear. Por ejemplo, un elemento regulatorio puede contener una secuencia de nucleótidos que se aglutina a factores celulares que permiten la transcripción exclusivamente o preferiblemente en células particulares, tejidos particulares u organelos particulares. Estos tipos de elementos regulatorios normalmente están asociados a los genes que se expresan de una forma "específica de célula", "específica de tejido" o "específica de organelos". Un "intensificador" es un tipo de elemento regulatorio que puede intensificar la eficiencia de la transcripción, sin importar la distancia u orientación del intensificador en relación a la secuencia de inicio de la transcripción. Un "ADN heterólogo" se refiere a una molécula de ADN, o a una población de moléculas de ADN, que no existen de manera natural dentro de una célula hospedera dada. Las moléculas de ADN heterólogas para una célula hospedera en particular pueden contener ADN derivado de especies -de células hospederas (es decir, ADN endógeno) siempre y cuando el ADN hospedero se combine con un ADN no hospedero (es decir, ADN hexógeno) . Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento no hospedero de ADN que codifica para un polipéptido ligado de manera operable a un segmento de ADN hospedero que comprende un promotor de la transcripción, se considera que es una molécula de ADN heterólogo. De manera inversa, una molécula heteróloga de ADN puede comprender un gen endógeno ligado de manera operable con un promotor hexógeno. De manera diferente, una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula tipo silvestre se considera como un ADN heterólogo si la molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen tipo silvestre. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, ya sea que se produzcan de manera natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos se refieren comúnmente como "péptidos" . Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína puede también comprender componentes no peptídicos, tales como grupos de carbohidratos. Los carbohidratos y otros substitutos no peptídicos pueden agregarse a una proteína por la célula en la cual la proteína se produce, y pueden variar con el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente en términos de sus estructuras principales de aminoácidos; substitutos tales como los grupos carbohidratos normalmente no se especifican, pero sin embargo pueden estar presentes. Un péptido o polipéptido codificado para una molécula de ADN no hospedero es un péptido o polipéptido- .'"-heterólogo" . Un "elemento genético integrado" es un segmento de ADN que se ha incorporado en un cromosoma de una célula hospedera después de que el elemento se introduce en la célula mediante la manipulación humana. Dentro de la presente invención, los elementos genéticos integrados se derivan normalmente de plásmidos linearizados que se introducen en las células mediante electroporación u otras técnicas. Los elementos genéticos integrados se hacen pasar de la célula hospedera original a su descendencia. Un "vector de clonación" es una molécula de ácidos nucleicos, tales como un plásmido, cósmido, o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse de manera autónoma en una célula hospedera. Los vectores de clonación contienen típicamente una o una pequeña cantidad de secuencias de reconocimiento de la restricción de la endonucleasa que permite la inserción de una molécula de ácidos nucleicos de una manera determinable sin la pérdida de una función biológica esencial del vector, así como secuencias de nucleótidos que codifican para un gen marcador que es adecuado para utilizarse en la identificación _ y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores típicamente incluyen genes que proporcionan resistencia a la tetraciclína o resistencia a la ampicilina. Un "vector de expresión" es una molécula de ácidos nucleicos que codifica para un gen que se expresa en una célula hospedera. Típicamente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La 'expresión génica normalmente se coloca bajo el control de un promotor, y este gen se dice que está "ligado de manera operable" al promotor. De manera similar, un elemento regulatorio y un promotor - nuclear están ligados de manera operable si el elemento regulatorio modula la actividad del promotor nuclear. Un "hospedero recombinante" es una célula que contiene una molécula heteróloga de ácidos nucleicos, tales como un vector de clonación o un vector de expresión. En el contexto actual, un ejemplo de una célula hospedera recombinante es una célula que produce Zntr2 a partir de un vector de expresión. En contraste, el Zntr2 se pueden producir mediante una célula que es una "fuente natural" de Zntr2, y que carece de un vector de expresión. Los "transformantes integrantes" son células hospederas recombinantes, en las cuales el ADN heterólogo se ha integrado en el ADN genómico de las células. Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácidos nucleicos que comprende secuencias de nucleótidos de por lo menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender por lo menos una parte de un polipéptido Zntr2 fusionado con un polipéptido que se aglutina a una matriz de afinidad. Esta proteína de fusión proporciona un medio para aislar grandes cantidades de Zntr2 al utilizar la cromatografía de afinidad.

El término "receptor" denota una proteína asociada a una célula que se aglutina a una molécula bioactiva llamada un "ligando". Esta interacción interviene en el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores pueden estar unidos a la membrana, pueden ser citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, el receptor de la hormona estimulante de la tiroides, el receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor PDGF, receptor de la hormona de crecimiento, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor de la eritropoyetina y receptor IL-6) . Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura de dominios múltiples que comprende un dominio extracelular aglutinador de ligandos y un dominio efector intracelular que típicamente está involucrado en la transducción de señal. Ciertos receptores unidos a la membrana, el dominio extracelular de aglutinación de ligando y el dominio efector intracelular se localizan en polipéptido separados que comprenden al receptor funcional completo . En general, la aglutinación del ligando al receptor resulta un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio efector y otras moléculas en la célula, que a su vez conlleva a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que normalmente están asociados a las interacciones ligando-receptor incluyen la transcripción génica, fosforilación, defosforilación, incrementos en la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de lípidos membranales, adhesión celular, hidrólisis de los lípidos de inositol e hidrólisis de los fosfolípidos . El término "secuencia de señal secretoria" describe una secuencia de nucleótidos que codifica por un péptido (un "péptido secretorio" que, como un componente de un polipéptido más grande, dirige al polipéptido mayor mediante una guía secretoria de una célula en la cual se sintetiza. El polipéptido más grande normalmente se escinde para retirar el péptido secretorio durante el tránsito a través de la vía secretoria. Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como los carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteináceas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Típicamente, la preparación del polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, es decir, por lo menos aproximadamente un 80 por ciento puro, por lo menos aproximadamente 90 por ciento puro, por lo menos aproximadamente 95 por ciento puro, más del 95 por ciento puro, o mayor al 99 por ciento puro. Una forma de mostrar que una preparación particular de proteína contiene un polipéptido aislado es mediante la aparición de una sola banda después de una electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico (SDS)-poliacrilamida de la preparación proteica y una tinción de azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas, derivadas o fosforiladas. Los términos " amino-terminal" y "carboxilo-terminal" se utiliza en la presente para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. En donde lo permite el contexto, estos términos se utilizan con referencia a una secuencia particular o porción particular de un polipéptido para denotar la proximidad o una posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada en forma caboxilo-terminal a una secuencia de referencia de que un polipéptido se localiza en posición próxima al términus carboxilo de la secuencia de referencia, pero no necesariamente se encuentra "" en el términus carboxilo del polipéptido completo. El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un. producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión involucra la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos. El término "variante de eliminación de intrones" se utiliza en la presente para denotar formas alternativas de ARN transcrito a partir de un gen. La variación de eliminación de intrones aparece naturalmente mediante el uso de secuencias alternativas de unión exón - intrón dentro de una molécula transcrita de ARN, o menos comúnmente entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede resultar en diversos ARNm transcritos del mismo gen. Las variantes de eliminación de intrones pueden codificar para polipéptidos que tienen una secuencia alterada de aminoácidos. El término variante de eliminación de intrones también se utiliza en la presente para denotar un polipéptido codificado por una variante de eliminación de intrones de ARNm transcrito de un gen. Como se utiliza en la presente, el término " inmunoregulador" incluye las citocinas, factor de crecimiento de células germinales, linfotoxinas, moléculas co-estimulatorias, factores hematopoyéticos, y análogos sintéticos de estas moléculas. El término "par de complemento/anti-complemento" denota porciones no idénticas que forman un par estable y asociado de manera no covalente bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anti-complemento. Otros pares ejemplificantes de complemento/anti-complemento incluyen los pares de receptor/ligando, pares de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo) , pares de polinucleótidos sentido/antisentido, y similares. En donde se desea una disociación subsecuente del par complemento/antí-complemento, el par comple ento/anti- complemento tiene una afinidad de aglutinación de menos de 10" M"X Un "anticuerpo anti-idiotipo" es un anticuerpo que se aglutina con el dominio de región variable de una inmunoglobulina. En el contexto actual, un anticuerpo anti-idiotipo se aglutina con una región variable de un anticuerpo anti-Zntr2, y por lo tanto, un anticuerpo anti-idiotipo imita un epítopo para Zntr2. Un "fragmento de anticuerpo" es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')_, F(ab)_, Fab', Fab, y similares. Sin importar la estructura, un fragmento de anticuerpo se aglutina con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-Zntr2 se aglutina como un epítopo para Zntr2. El término "fragmento de anticuerpo" incluye un polipéptido sintética s genéticamente manipulado que se glutina a un antígeno específico, estos polipéptidos consisten de una región variable de cadena ligera, fragmentos " Fv" que consisten de regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, moléculas recombinantes de un polipéptido monocatenario en donde las regiones variables ligeras y pesadas se conectan mediante un ligador -péptido ("proteínas scFv" ) , y unidades mínimas de reconocimiento que consisten de residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable. Un "anticuerpo quimérico" es una proteína recombinante que contiene dominios variables y las regiones complementarias determinantes derivadas de un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de, la molécula del anticuerpo se deriva de un anticuerpo de humano . Los "anticuerpos humanizados" son proteínas recombinantes en las cuales las regiones determinantes complementarias de murino de un anticuerpo monoclonal se han transferido a las cadenas variables ligeras y pesadas de una inmunoglobulina de murino en un dominio variable de humano. Como se utiliza en la presente, el término "agente terapéutico" es una molécula o un átomo el cual se conjuga a una porción de anticuerpos para producir un conjugado que es útil para la terapia. Los ejemplos de los agentes terapéuticos incluyen los fármacos, toxinas, inmunorreguladores, agentes quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o tintes fotoactivos, y radioisótopos.

Un "marcador detectable" es una molécula o átomo que puede conjugarse a una porción de anticuerpo para producir una molécula útil para el diagnóstico. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen los agentes quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otras porciones marcadoras . El término "indicador de afinidad" se utiliza en la presente para denotar un segmento de polipéptido que puede unirse a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección de un segundo polipéptido o proporcionar secuencias para unión de un segundo polipéptido a el sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para la cual un anticuerpo u otro agente específico de aglutinación está disponible puede utilizarse como un indicador de afinidad. Los indicadores de afinidad incluyen un segmento de poli-histidina, proteína A (Nilsson y colaboradores, EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson y colaboradores, Methods Enzymol . 198 : 3 (1991)), glutatión S transferasa (Smith and Johnson, Gene 67: 31 (1988)), indicador de afinidad Glu-Glu (Grussen eyer y colaboradores, Proc, Na tl . Acad. Sci . USA 82 : 1952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp y colaboradores, Bi otechnol ogy 6: 1204 (1988)), péptído de aglutinación de la estreptavidina, u otros epítopos antigénicos o dominios de aglutinación. Ver, en general, Ford y colaboradores, Protein Expressi on and Purifi ca tion 2 : 95 (1991). Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para indicadores de afinidad se encuentran disponibles de abastecedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo completo, en oposición a un fragmento de anticuerpo, el cual no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales, así como ciertos anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos quiméricos y humanizados. Como se utiliza en la presente, el término "componente de anticuerpo" incluye tanto un anticuerpo completo como un fragmento de anticuerpo. Un " inmunoconjugado" es un conjugado o un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o un marcador detectable.

Como se utiliza en la presente, el término "proteína de fusión de anticuerpos" se refiere a una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un agente terapéutico. Los ejemplos de estos agentes terapéuticos adecuados para estas proteínas de fusión incluyen los inmunorreguladores ("proteína de fusión de anticuerpo-inmunorregulador" ) y toxinas ("proteína de fusión de anticuerpo-toxina" ) . Un "antígeno asociado a un tumor" es una proteína que normalmente no se expresa, s que se expresa a niveles menores, por una contraparte celular normal. Los ejemplos de los antígenos as'ociados con tumores incluyen la alfa-fetoproteína, el antígeno carcinoembriónico, y Her-2/neu. Se conoce por aquellos diestros en la técnica diversas ilustraciones más de antígenos asociados a tumores. Ver, por ejemplo, Urban y colaboradores, Ann . Rev. Immunol . 1 0 : 611 (1992). Un "polipéotido objetivo" o un "péptido objetivo" es una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos un epítopo, y que se expresa en una célula objetivo, tales como células tumorales, o una célula que transporta un antígeno de un agente infeccioso. Las células T reconocen los epítopos de péptidos presentados por la molécula del complejo principal de histocompatibilidad a un polipéptido objetivo o a un péptido objetivo y típicamente lisan la célula objetivo o recrutan otras células inmunes a el sitio de la célula objetivo, y de esta manera aniquilan la célula objetivo. Un "péptido antigénico" es un péptido que se aglutina a la molécula de complejo principal de histocompatibilidad para formar un complejo MHC-péptido que es reconocido por una célula T, y de esta manera induce una respuesta citotóxica de linfocitos al momento de la presentación a la célula T. Por lo tanto, los péptidos antigénicos son capaces de aglutinarse a una molécula apropiada del complejo principal de histocompatibilidad e inducir una respuesta citotóxica. de células T, tal como la lisis celular o una vibración específica de citocina en contra de la célula objetivo que se aglutina o expresa el antígeno. El péptido antigénico puede aglutinarse en el contexto de una molécula del complejo principal de histocompatibilidad tipo I o tipo II, en un antígeno presentador de células o en una célula objetivo.

En los eucariontes, el ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir AKNm. La molécula de ácido nucleico se puede diseñar para que contenga el molde del ARN polimerasa II en la cual el transcrito de ARN tiene la secuencia que es complementaria a la del ARNm específico. El transcrito ARN se llama un "AR? anti-sentido" y una molécula de ácido nucleico que codifica para el AR? anti-sentido se llama un "gen anti-sentido". Las moléculas de AR? anti-sentido son capaces de aglutinarse a las moléculas de ARNm, lo que resulta en una inhibición de la traducción del AR?m. Un "oligonucleótido anti-sentido específico para Zntr2" o un "oligonucleótido anti-sentido de Zntr2" es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) capaz de formar un triplete estable con una porción del gen Zntr2, o (b) capaz de formar un dual estable con una porción del transcripto de AR?m del gen Zntr2. Una "ribozima" es una molécula de ácidos nucleicos que contiene un centro catalítico. El término incluye las enzimas de AR?, los AR? que eliminan los intrones por sí mismos, los AR? auto-desdoblantes, y las moléculas de ácidos nucleicos que llevan a cabo estas funciones catalíticas. Una molécula de ácidos nucleicos que codifican para una ribozima se llama un "gen ribozima" . Una "secuencia guía exterior" es una molécula de ácidos nucleicos que dirige al ribozima endógeno, ARNasa P, o una especie en particular de ARNm intracelular, lo que resulta en el desdoblamiento del ARNm por el ARNasa P. una molécula de ácidos nucleicos que codifican para una secuencia guía exterior se llama un "gen_de secuencia guía exterior". El término "variante del gen Zntr2" se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican para un polipétido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación del SEQ ID ?O: 2. Estas variantes incluyen los polimorfismos que ocurren naturalmente de los genes Zntr2, así como genes sintéticos que contienen sustituciones conservativas de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos del SEQ ID ?O: 2. Las formas adicionales de variantes de los genes Zntr2 son las moléculas de ácidos nucleicos que contienen inserciones o supresiones de las secuencias de nucleótídos descritas en la presente. Un gen variante de _ Zntr2 se puede identificar al determinar si el gen se hibridiza con una molécula de ácidos nucleicos que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o su complemento, bajo condiciones rigurosas. Alternativamente, los genes variantes Zntr2 se pueden identificar mediante una comparación de secuencias. Dos secuencias de aminoácidos tienen "1001 de identidad de secuencia de aminoácidos" si los residuos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son los mismos cuando se comparan para una correspondencia máxima. De manera similar, dos secuencias de nucleótidos tienen un "100"- de identidad de secuencia de nucleótidos" si los residuos de nucleótidos de las dos secuencias de nucleótidos son los mismos cuando se alinean para su correspondencia máxima. Las comparaciones de secuencias se pueden llevar a cabo al utilizar programas convencionales de computación tales como aquellos que se incluyen en la suite LASERGENE de computación de bioinformática, que se produce por DNASTAR (madison, Wisconsin) . Otros métodos para comparar dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos al determinar una alineación óptima se conocen bien por aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Bi ol ogy: Tools for Genomi c and Mol ecular Research (ASM Press, Inc. 1-997), Wu et al. (editores), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," en Methods in Gene Biotechnol ogy, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), y Bishop (editor), Guide to Human Genome Computing, 2a edición (Academic Press, Inc. 1998)). Los métodos particulares para determinar la identidad de secuencias se describen a continuación. Sin importar el método particular que se utiliza para identificar un gen variante de Zntr2 o un polipéptido variante de Zntr2, un gen variante o polipéptido variante codificado por un gen variante pueden caracterizarse por su habilidad de aglutinarse de manera específica a un anticuerpo anti-Zntr2. El término "variante alélica" se utiliza en la presente para denotar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico-. La variación alélica se manifiesta naturalmente mediante mutación, y puede resultar en un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia alterada de aminoácidos. El término variante alélica también se utiliza en la presente para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. El término "ortolog" denota un polipéptido o proteína que se obtiene a partir de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencias ente los ortologs son el resultado de la evolución de las especies. Los "paralogs" son distintos pero proteínas estructuralmente relacionadas que -se hacen por un organismo. Se cree que los paralogs se manifiestan durante la duplicación de genes. Por ejemplo, a-globina, ß-globina, y la mioglobina son paralogs entre sí. La presente invención incluye los fragmentos funcionales de los genes Zntr2. Dentro del contexto de esta invención, un "fragmento funcional" de un gen de Zn.tr? .se refiere a una molécula de ácidos nucleicos que codifica para una porción del polipéptido de Zntr2 que se aglutina específicamente por un anticuerpo anti- Zntr2.

Debido a la imprecisión de los métodos analíticos convencionales, los pesos moleculares y longitudes moleculares de los polímeros se entiende que son valores que son aproximados. Cuando se expresa para un valor de esto como "aproximadamente" X o "casi" aproximadamente X, el valor indicado de X se entiende que es exacto en un ± 101.. 3. Producción del Gen Humano Zntr2 Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para un gen Zntr2 de humano se pueden obtener al detectar un ADNc genómico de humano o una genoteca al utilizar sondas de polinucleótidos basadas en SEQ ID NO: 1. Estas técnicas son convencionales y bien establecidas . A manera de ilustración, una molécula de ácido nucleico que codifica para el gen Zntr2 humano se puede aislar a partir de una genoteca de ADNc. En este caso, el primer paso es preparar la genoteca de ADNc al aislar un ARN de los leucocitos de la sangre periférica, el cerebro, el bazo, o el tejido de la médula espinal, al utilizar los métodos que se conocen bien por aquellos diestros en la técnica. En general, las técnicas de aislamiento de ARN deben de proporcionar un método para romper las células, un medio para inhibir la degradación del ARN dirigida por la ARNasa, y un método para separar al ARN del ADN, de los contaminantes proteicos y polisacáridos. Por ejemplo, el ARN total se puede aislar al congelar el tejido en nitrógeno líquido, al triturar el tejido congelado con un mortero y una masa de mortero para lisar "las células, extraer el tejido molido con una solución de fenol/cloroformo para retirar las proteínas, separar al ARN de las impurezas restantes mediante una precipitación selectiva con cloruro de litio (ver, por ejemplo, Ausubel et al . (editores), Short Protocols in Mol ecul ar Bi ology, 3a edi ci ón, páginas .4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu et al . , Methods in Gene Bi otechnol ogy, páginas 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ["Wu (1997)"]. Alternativamente, el ARN total se puede aislar del tejidos al extraer el tejido molido con isotiocianato de guanidinio, extraer con solventes orgánicos, y separar al ARN de los contaminantes al utilizar una centrifugación diferencial (ver, por ejemplo, Chirgwin et al . , Bi ochemi stry 18 : 52 (1979); Ausubel (1995) en las páginas 4-1 a 4-6; Wu (1997) en las páginas 33-41) .

A fin de estructurar una genoteca de ADNc, el ARN poli (A)* debe aislarse de una preparación total de ARN. El ARN poli (A)"" se puede aislar del ARN total utilizando la técnica convencional de cromatografía de oligo (dT)-celulosa (ver, por ejemplo, Aviv y Leder, Proc Na t ' l Acad. Sci . USA 69 : 1408 (1972); Ausubel (1995) en las páginas 4-11 a 4-12) . Las moléculas de ADNc bicatenarias se sintetizan del ARN poli (A) " utilizando técnicas que se conocen bien por aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Wu (1997) en las páginas 41-46) . Más aún, los juegos de reactivos comercialmente disponibles se pueden utilizar para sintetizar moléculas de AD?c bicatenarias. Por ejemplo, estos juegos de reactivos se encuentran disponibles de Life Technologies, Inc.

(Gaithersburg, MD) , CLO?TECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) , Promega Corporation (Madison, Wl) y STRATAGE?E (La Jolla, CA) . Diversos vectores de clonación son apropiados para la estructuración de una genoteca de AD?c. Por ejemplo, la genoteca de AD?c se puede preparar en un vector derivado de un bacteriófago, tal como el vector ?gtlO.

Ver, por ejemplo, Huynh et al . , "Constructing and Screening cDNA Libraries in ?gtlO y ?gtll," en DNA Cl oning: a Practi cal Approach Vol . I, Glover (editor), página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en las páginas 47-52. Alternativamente, las moléculas de AD?c bicatenarias se pueden insertar en un vector plásmido tal como el vector PBLUESCRIPT (STRATAGE?E; La Jolla, CA) , un LAMDAGEM-4 (Promega Corp.) u otros vectores comercialmente disponibles. Los vectores de clonación adecuados también pueden obtenerse de la Colección Americana de Tipos de Cultivo (Manassas, VA) . Para amplificar las moléculas clonadas de AD?c, la genoteca de AD?c se inserta en un hospedero procariótico, al utilizar técnicas convencionales. Por ejemplo, una genoteca de AD?c puede introducirse en células DH5 competentes de E . coli , que se pueden obtener, por ejemplo, a partir de Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD) . Una genoteca humana se puede preparar por medios que se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327) . El ADN genómico puede aislarse al usar el tejido con el detergente Sarkosyl, digerir el producto lisado con proteinasa K, depurar los restos insolubles del producto lisado mediante centrifugación, y precipitar los ácidos nucleicos del producto lisado al utilizar isopropanol, y purificar el ADN vuelto a suspender en un gradiente de densidad de cloruro de cesio . Los fragmentos de ADN que son adecuados para la producción de una genoteca pueden obtenerse mediante una corte aleatoria de ADN genómico mediante una digestión parcial de ADN genómico con Bndonucleasas de restricción. Los fragmentos del ADN genómico se pueden insertar en un vector, tal como en un bacteriófago o en un vector cósmido, en conformidad con las técnicas convencionales, tales como el uso de una digestión con enzimas de restricción para proporcionar un término apropiado, el uso del tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseada de las moléculas de ADN, y una ligación con las ligasas apropiadas.- Las técnicas para esta manipulación se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las pá-ginas 307-327) . Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para el gen humano de Zntr2 también pueden obtenerse al utilizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) teniendo los cebadores_ oligonucleótidos y secuencias de nucleótidos que están basadas en las secuencias de nucleótidos del gen humano de Zntr2, como se describe en la presente. Los métodos generales para detectar las genotecas con PCR se proporcionan mediante, por ejemplo, Yu et al . , "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage' Libraries", en Methods in Molecular Bi ology, Vol . 15 : PCR Protocols : Current Methods and Appli ca ti ons, White (editor), páginas 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Más aún, las técnicas para utilizar PCR para aislar los genes relacionados se describen por, por ejemplo, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and . the _ Polymerase Chain Reactíon to Clone Gene Family Members", en Methods in Mol ecular Bi ol ogy, Vol . 15 : PCR Protocols : Current Methods and Appl i ca ti ons, White (editor) , páginas 317-337 (Humana Press, Inc. 1993) .

Alternativamente, las librerías genómicas de humano pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales tales como Research Genetics (Huntsville, AL) y la Colección Americana de Tipos de Cultivo (Manassas, VA) . Una genoteca que contiene el ADDNc o clones genómicos se pueden detectar con una o más sondas de polinucleótidos basándose en la SEQ ID NO: 1, al utilizar métodos convencionales (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-1 a 6-11) . Los anticuerpos anti-Zntr2, que se producen como se describe a continuación, también pueden utilizarse para aislar las secuencias de ADN que codifican para los genes humanos de Zntr2 a partir de genotecas de ADNc. Por ejemplo, los anticuerpos que se pueden utilizar para detectar las librerías de expresión ?gtll, o los anticuerpos que se pueden utilizar para una inmunodetección luego de una selección híbrida y una traducción híbrida (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-12 a 6-16; Margolis et al . , "Screening ? expression libraries with antibody and protein probes" en DNA Cl oning 2 : Expressi on Systems , 2* edici ón, Glover et al . (editores), páginas 1-14 (Oxford University Press 1995) ) .

Como una alternativa, el gen Zntr2 se puede obtener al sintetizar las moléculas de ácidos nucleicos al utilizar oligonucleótidos de cadena larga que se ceban mutuamente y- las secuencias de nucleótidos descritas en la presente, (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 8-8 a 8-9) . Las técnicas establecidas al utilizar la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la habilidad de sintetizar las moléculas de ADN de por lo menos dos kilobases de longitud (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993), Dilon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," en Methods in Molecular Biolog7y , Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (editor)*, páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), y Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)). Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención también pueden sintetizarse con "maquinarias génicas" al utilizar los protocolos tales como el método _ de la fosforamídita . Si se sintetiza químicamé-nte, el ADN bicatenario se le requiere para una aplicación tal como la síntesis de un gen o un fragmento génico, entonces cada cadena complementaria se hace por separado. La producción de los genes cortos (de 60 a 80 pares de bases) es técnicamente directa y se puede lograr al sintetizar las cadenas complementarias y luego fijándolas. Para la producción de genes más largos (> 300 pares de bases), sin embargo, se requieren estrategias especiales, debido a que la eficiencia de la copulación de cada ciclo durante- la síntesis química del ADN es apenas del 1001,. Para sobrellevar este problema, los genes sintéticos (bicatenarios) se ensamblan en forma modular a partir de fragmentos monocatenarios que son de 20 a 100 nucleótidos de longitud. Para los repasos en la síntesis de polinucleótidos, ver, por eiemplo, Glick y Pasternak, Mol ecular Bi otechnol ogy, Principies and Appli ca ti ons of Recombinan t DNA ASM Press 1994). Itakura et al . , Annu . Rev. Bi ochem . 53 : 323 (1984), y Cumie et al . , Proc . Na t 'l Acad. Sci . USA 87 : 633 (1990) . La secuencia de un ADNc de Zntr2 o un fragmento genómico de Zntr2 se puede determinar al utilizar métodos convencionales. Las secuencias de polinucleótidos de Zntr2 descritas en la presente también pueden utilizarse como sondas o cebadores para clonar regiones no codificadoras 5' del gen Zntr2. Los elementos promotores del gen Zntr2 se pueden utilizar para dirigir la expresión de los genes heterólogos en, por ej-emplo, los leucocitos de sangre periférica, de animales transgénicos o de pacientes que sufren una terapia génica. La identificación de los fragmentos genómicos que contienen el promotor Zntr2 o el elemento regulador se pueden lograr utilizando técnicas que se conocen bien, tal como el análisis de supresión (ver, por ejemplo, generalmente a Ausubel (1995) ) . La clonación de las secuencias fianqueadoras 5' también facilita la producción de la proteína Zntr2 mediante una "activación génica" según los métodos generales descritos en la Patente de E. U. A. No. ,641,670. En breve, la expresión de un gen endógeno de - Zntr2 en una célula al introducir en el locus de Zntr2 una estructura de ADN que comprende por lo menos una secuencia dirigida al objetivo, o una secuencia regulatoria, un exón, y una secuencia donadora impar de eliminación de intrones. La secuencia dirigida al objetivo es la secuencia no codificadora 5' de Zntr2 que permite la recombinación homologa de la estructura con el locus endógeno de Zntr2, mientras que la secuencia dentro de la estructura se vuelve ligada de manera operable con la secuencia codificadora de Zntr2 endógeno. De esta manera, el promotor endógeno de Zntr2 se puede reemplazar o suplementar con otras secuencias regulatorias para proporcionar una expresión intensificada, específica del tejido, o de otra manera regulada.

Producción de Variantes del Gen Zntr2 La presente invención proporciona una diversidad de moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo las moléculas de ADN y ARN, que codifican para los polipéptidos Zntr2 descritos en la presente. Aquellos diestros en la técnica reconocen fácilmente que, en vista de la degenerabilidad del código genético, una variación considerable en la secuencia es posible entre estas moléculas de polinucleótidos. La SEQ ID NO: 3 es una secuencia degenerada de nucleótidos que abarca todas las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos Zntr2 de SEQ ID NO: 2. Aquellos diestros en la técnica reconocen que la secuencia degenerada de SEQ ID NO: 3 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican para SEQ ID NO: 2, al sustituir U por T. Por lo tanto, la presente invención contempla las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido Zntr2 que comprenden del nucleótido 103 hasta 1908 de la SEQ ID NO: 1, y sus equivalentes de ARN. La Tabla 1 expone los códigos de una sola letra que se utilizan dentro de la SEQ ID NO: 3 para denotar las posiciones de nucleótidos degenerados. Las "resoluciones" son los nucleótidos denotados por un código de letra. El "complemento" indica el código para los nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y denota ya sea C ó T, y su complemento R denota A ó G, A es complementaria a T, y G es complementaria a C.

Tabla 1 Los codones degenerados utilizados en SEQ ID NO: 3, que abarcan todos los codones posibles para un aminoácido dado, se exponen en la Tabla 2.

Tabla 2 Alguien de destreza ordinaria en la técnica aprecia que se introduce algo de ambigüedad para determinar un codón degenerado, representativo de todos los codones posibles que codifican para un aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar para la arginina (AGR) , y el codón degenerado para la arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar para la serina (AGY) . Una relación similar existe entre los codones que codifican, para la fenilalanina y la leucina. Por lo tanto, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar para una variante de secuencias de aminoácidos, que alguien de destreza ordinaria en la técnica puede identificar fácilmente estas secuencias variantes mediante la referencia .a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Las secuencias variantes pueden analizarse fácilmente para su funcionalidad como se describe en la presente. Las diferentes especies pueden exhibir una "utilización preferencial de codones". En general, ver, Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893 (1980), Haas et al. Curr. Biol. 6: 315 (1996), Wain-Hobson et al. Gene 13: 355 (1981), Grosjean y Fiers, Gene 18: 199 (1982), Holm, Nuc. Acids. Res. 14: 3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573 (1982), Sharp y Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494 (1995), y Makrides, Microhial . Rev. 60: 512 (1996) . Como se utiliza en la presente, el término "utilización preferencial de un codón" o "codones preferenciales" es un término de la técnica que se refiere a codones para la traducción de proteínas que se utilizan más frecuentemente en células de ciertas especies, que por lo tanto favorece uno o unos cuantos representantes de los codones posibles que codifican para cada aminoácidos (ver Tabla 2) . Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede codificarse por AC , ACC, ACG, ó ACT, pero en células de mamífero, el ACC es el codón más ampliamente utilizado; en otras especies, por ejemplo, en las células de insecto, levaduras, virus o bacterias, diferentes codones Thr pueden ser preferenciales . Los codones preferenciales para una especie en particular pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente invención mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferenciales en ADN recombinante puede, por ejemplo, intensificar la producción de la proteína al hacer la traducción de proteínas más eficiente dentro de un tipo celular en particular o especie en particular. Por lo tanto, una secuencia de un codón degenerado descrita en SEQ ID NO: 3 sirve como un molde para optimizar la expresión de los polinucleótidos en diversos tipos celulares y especies comúnmente utilizados en la técnica y descritas en la presente. Las secuencias que contienen codones preferenciales se pueden analizar y optimizar para la expresión en diversas especies, y analizarse para su funcionalidad como se describe en la presente. La presente invención además proporciona polipéptidos variantes y moléculas de ácidos nucleicos que representan las contrapartes para otras especies (ortologs) . Estas especies incluyen, pero no se limitan a especies de mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otros vertebrados e invertebrados. De interés son los polipéptidos Zntr2 de otras especies de mamíferos,- incluyendo los polipéptidos de murino, porcino, ovino, bovino, canino, felino, equino, y otros primates. Los ortologs del Zntr2 de humano pueden clonarse . utilizando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas convencionales de clonación. Por ejemplo, el ADNc puede clonarse utilizando el ARNm que se obtiene de_ un tejido o tipo celular que expresa para el Zntr2 como se describe en la presente. Las fuentes adecuadas de ARNm pueden identificarse al sondear las transferencias Northern con sondas diseñadas de las secuencias descritas en la presente. Luego se prepara una genoteca a partir del ARNm de un tejido o línea celular positiva. Una molécula de ADNc que codifica para el Zntr2 luego puede aislarse mediante una diversidad de métodos, tales como el sondeo con un ADNc parcial o completo de humano o con uno o más juegos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Un ADNc también puede clonarse utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores designados a partir de las secuencias representativas de Zntr2 de humano descritas en la presente. En un método adicional, la genoteca de ADNc puede utilizarse para transformar o transfectar células hospederas, y la expresión del ADNc de interés puede detectarse con un 'anticuerpo dirigido en contra del polipéptido Zntr2.

Las técnicas similares también pueden aplicarse para el aislamiento de los clones genómicos. Aquellos diestros en la técnica reconocen que la secuencia descrita en SEQ ID NO: 1 representa un solo alelo de Zntr2 de humano, y que la variación alélica y que la eliminación de intrones alternativa son algo que se espera que ocurra. Las variantes alélicas de esta secuencia se pueden clonar al sondear el ADNc o las genotecas de diferentes individuos según los procedimientos convencionales. Las variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 1, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silenciosas que aquellas en las cuales las mutaciones resultan en cambios en la secuencia de aminoácidos, se encuentran dentro del alcance de la presente invención, que son proteínas que son variantes alélicas de SEQ ID NO: 2. Las moléculas de ADNc generadas a partir de los ARNm, con sus intrones elimina'dos de manera alternativa, que retienen las .'propiedades del polipéptido Zntr2 que se incluyen dentro del alcance de la presente invención, así como los polipéptidos codificados por estos ADNc y ARNm. Las variantes alélicas y las variantes de eliminación de intrones de estas secuencias se pueden clonar al sondear el ADNc o las genotecas de diferentes individuos o tejidos según los procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Dentro de ciertas modalidades de la invención, las moléculas aisladas de ácidos nucleicos pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos descritas en la presente. Por ejemplo, estas moléculas de ácidos nucleicos pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, a moléculas de ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 103 al 1908 de SEQ ID NO: 1, o a moléculas de ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: l o a los nucleótidos 103 a 1908 de SEQ ID NO: 1. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean de aproximadamente 5°C menor que el punto térmico de fusión (T,.) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH 'definido. El T es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) en la cual el 50. de la secuencia objetivo se híbrida a una sonda perfectamente igualada. Un par de moléculas de ácidos nucleicos, tales como ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN, se pueden hibridar si las secuencias de nucleótidos tienen algún grado de complementariedad. Los híbridos pueden tolerar pares de bases no igualadas en la doble hélice, pero la estabilidad del híbrido está influenciada por el grado de incompatibilidad. El T del híbrido incompatible disminuye mediante 1°C para cada 1-1.5. de incompatibilidad de los pares de bases. Al variar la rigurosidad de las condiciones de hibridación, se permite el control sobre el grado de incompatibilidad que está presente en el híbrido. El grado de rigurosidad se incrementa mientras que la temperatura de hibridación se incrementa y mientras que la fuerza iónica del amortiguador de hibridación se disminuye. Las condiciones rigurosas de hibridación abarcan temperaturas de aproximadamente 5-25°C por debajo de T del híbrido y un amortiguador de hibridación tiene hasta 1 M Na". Los mayores grados de rigurosidad a menores temperaturas puede lograrse mediante la adición de formamida la cual reduce el T._ del híbrido en aproximadamente 1°C por cada 11- de formamida en la solución de amortiguación. Generalmente, estas condiciones rigurosas incluyen temperaturas de 20-70°C y un amortiguador de hibridación que tiene hasta 6x SSC y 0-50T de formamida. Un mayor grado de rigurosidad puede lograrse a temperaturas desde 40-70°C con un amortiguador de hibridación que tiene hasta 4x SSC y desde 0-50. de formamida. Las condiciones altamente rigurosas típicamente abarcan temperaturas de 42-70 °C teniendo el amortiguador de hibridación hasta lx SSC y 0-501. de formamida. Los diferentes grados de rigurosidad pueden usarse durante la hibridación y el lavado para lograr una máxima aglutinación específica a la secuencia objetivo. Típicamente, los lavados luego de la hibridación se llevan a cabo a grados incrementados de rigurosidad para retirar las sondas de polinucleótidos no hibridizados de los complejos hibridizados . Las condiciones anteriores sirven para ser una guía y está dentro de las habilidades de alguien diestro en la técnica para adaptar esas condiciones para utilizarse con un híbrido particular del polipéptido. El T. para una secuencia específica objetivo es la temperatura (bajo condiciones definidas) en la cual el 501 de la secuencia objetivo se híbrida a una secuencia de una sonda perfectamente igualada. Aquellas condiciones que influyen en el T. incluyen, el tamaño y el contenido de los pares de bases de la sonda de polinucleótido, la fuerza iónica de la solución de hibridización, y la presencia de agentes desestabilizantes en la solución de hibridación. Se conocen en la técnica diversas ecuaciones para calcular el T , y son específicas para el ADN, ARN y los híbridos ADN-ARN y la secuencia de sondas de polinucleótidos de diversa longitud (ver, por ejemplo, Sambrook et al . , Mol ecular Cl oning: A Labora tory Manual , Segunda Edición (Cold Spring Harbor Press 198_9) ; Ausubel et al . , (editores), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987) ; Berger y Kirpmel editores), Guide to Mol ecular Cl oning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. . ev. Bi ochem . Mol . Bi ol . 26: 227 (1990)). Los programas de computadora para el análisis de secuencias tales como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premi er 4. 0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) , así como páginas de Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y calcular el T basándose en el criterio _ definido del usuario. Estos programas también pueden analizar una secuencia dada bajo condiciones definidas e identificar secuencias de sondas adecuadas. De manera típica, una hibridación de las secuencias más largas de polinucleótidos, >50 pares de bases, se lleva a cabo a temperaturas de aproximadamente 20-25°C por debajo del T calculado. Para sondas más pequeñas, <50 pares de bases, la hibridación se lleva a cabo típicamente a un T„ de 5-10°C por debajo. Esto permite la máxima velocidad de hibridación de los híbridos de ADN-ADN y ARN-ADN. La longitud de la secuencia de polinucleótidos influye en la velocidad y la estabilidad de la formación del híbrido. Las secuencias de sondas más pequeñas, <50 pares de bases, alcanzan un equilibrio con secuencias complementarias de manera rápida, pero puede formar híbridos menos estables. Los tiempos de incubación de entre unos cuantos minutos a horas se puede utilizar para lograr la formación de híbridos. Las secuencias más largas de sondas llegan a un equilibrio más densamente, pero forman complejos más estables incluso a temperaturas menores. A las incubaciones se les permite proceder durante la noche o más. Generalmente, las incubaciones se llevan a cabo durante un período igual a tres veces el tiempo calculado Cot. El tiempo Cot, es el tiempo que toma a las secuencias de pslinucleótidos volverse a asociar, y puede calcularse para una secuencia en particular mediante métodos que se conocen en la técnica. La composición de pares de bases de la secuencia de polinucleótidos efectúa la estabilidad térmica del complejo híbrido, y por lo tanto influye en la selección de la temperatura de hibridación y la fuerza iónica del amortiguador de hibridación. Los pares A-T son menos estables que los pares G-C en soluciones acuosas que contienen cloruro den sodio. Por lo tanto, mientras mayor es el contenido de G-C, más estable es el híbrido. Una distribución homogénea de los residuos G y C dentro de la secuencia también contribuyen de manera positiva a la estabilidad del híbrido. Además, la composición de pares de bases se pueden manipular para alterar el T_ de una secuencia dada. Por ejemplo, el 5-metildeoxicitidina se puede sustituir por deoxicitidina y 5-bromodeoxuridina que se puede sustituir .por timidina para incrementar el T,„, mientras que 7-deazz-2' -deoxiguanosina se puede sustituir por guanosina para reducir la dependencia del T . La concentración iónica del amortiguador de hibridación también afecta la calidad del híbrido. Los amortiguadores de hibridación generalmente contienen agentes bloqueadores tales como solución de Denhardt (Sigma Chemical Co . , St Louís, Mo) , ADN de esperma de salmón desnaturalizado, ARNt, polvos de leche (BLOTTO) , heparina o SDS, y una fuente de Na*, tal como SSC (Ix SSC: 0.15 M de cloruro de sodio, 15 mM de citrato sódico)_ o SSPE (lx SSPE: 1.8 M NaCl, 10 mM de NaH_PO,, 1 mM EDTA, pH 7.7) . Al disminuir la concentración iónica del amortiguador, incrementa la estabilidad del híbrido. - Típicamente, los amortiguadores de hibridacióncontienen desde entre 10 mM - 1 M NaX La adición de agentes desestabilizantes o desnaturalizantes tales como la formamida, sales de tetralquilamonio, cationes de guanidinio o cationes de tiocianato a la solución de hibridación alteran el T de un híbrido. De manera típica, se utiliza la formamida a una concentración de hasta un 50" para permitir que las incubaciones se lleven a cabo a temperaturas menores y más conveniente. La formamida también actúa para reducir los restos no específicos cuando se utilizan sondas ARN. A manera de ilustración, una molécula de ácidos nucleicos que codifica para un polipéptido variante de Zntr2 se puede hibridizar con una molécula de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (o su complemento) a 42°C durante la noche en una solución que comprende el 50. de formamida, 5x SSC (IX SSC: 0.15 M de cloruro de sodio y 15 mM de citrato sódico), 50 mM de fosfato sódico (pH 7.6), 5x de solución de Denhardt (lOOx solución de Denhardt: 20 (p/v) de Ficoll 400, 2 (p/v) de polivinilpirrolidona, y 2:- (p/v) de albúmina de suero bovino) , 10" de sulfato de dextrán, y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado. Alguien de destreza en la técnica puede implementar variaciones de estas condiciones de hibridación. Por ejemplo, la mezcla de hibridación puede incubarse a una mayor temperatura, tal como en aproximadamente 65 °C, en una solución que no contenga formamida. Más aún, las soluciones premezcladas de hibridación que se encuentran disponibles (por ejemplo, EXPRESSHYB Solución de Hibridación de Laboratorios CLONTECH, Inc.), y la hibridación para llevarse a cabo según las instrucciones del fabricante. Después de la hibridación, las moléculas de ácidos nucleicos pueden lavarse para retirar la moléculas no hibridizadas de ácidos nucleicos bajo condiciones rigurosas, o bajo condiciones altamente rigurosas. Las condiciones de lavado típicamente rigurosas incluyen el lavado en una solución de 0.5x - 2x SSC con 0.1' de dodecil sulfato sódico (SDS) a 55-65°C- Esto es, que las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido variante de Zntr2 permanecen hibridizadas, luego de n lavado bajo condiciones de lavado rigurosas, con una molécula de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (o su complemento) , en la cual la rigurosidad de lavado es equivalente a 0.25x - 2x SSC con 0.1" de SDS a 5-65°C, incluyendo 0.5x SSC con 0.1" de SDS a 55°C, ó 2x SSC con 0.1" SDS a 65°C. Alguien diestro en la técnica puede implementar fácilmente las condiciones equivalentes, por ejemplo, al sustituir el SSPE por SSC en la solución de lavado. Las condiciones de lavado típicamente altamente rigurosas incluyen el lavado en una solución de O.lx -0.2x SSC con O.lt de dodecil sulfato sódico (SDS) a 50-65°C. en otras palabras, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido variante Zntr2 permanecen hibridizadas, luego de un lavado bajo condiciones de lavado altamente rigurosas, con una molécula de ácidos nucleicos teniendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ( o su complemento), en la cual la rigurosidad de lavado es equivalente a O.lx -0.2x SSC con 0.1 SDS a 50-65°C, incluyendo O.lx SSC con 0.1 SDS a 50°C, ó 0.2 x SSC con 0.1 SDS a 65°C. La presente invención también proporciona polipéptidos aislados Zntr2 que tienen una identidad de secuencia sustancialmente similar a los polipéptidos de SEQ ID NO: 2, o sus ortologs. El término "identidad de secuencia sustancialmente similar" se utiliza en la presente para denotar los polipéptidas que tienen 701. , 801., *9ul, 951 o más del 951. de identidad de secuencias a las secuencias que se muestran en SEQ ID NO: 2, o sus ortologs . La presente invención también contempla las moléculas variantes de ácidos nucleicos de Zntr2 que pueden identificarse al utilizar dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una valoración de hibridación, como se describe anteriormente. Estas variantes de Zntr2 incluyen las moléculas de ácidos nucleicos que (1) permanecen hibridizadas, luego de un lavado bajo condiciones rigurosas de lavado, con una molécula de ácidos nucleicos teniendo la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 (o su complemento), en la cual la rigurosidad de lavado es equivalente a 0.5x - 2x SSC con 0.1. SDS a 55-65°C, y (2) que codifica para un polipéptido que contiene un 70 , 80 , 90", 95 o más del 95" de identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2. Alternativamente, las variantes Zntr2 se pueden caracterizar como moléculas de ácidos nucleicos (1) que permanecen hibridizadas, luego de un lavado bajo condiciones de lavado altamente rigurosas, con una molécula de ácidos nucleicos que tienen una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (o su complemento) , en las cuales la rigurosidad de lavado es equivalente a 0.1 x - 0.2x SSC con 0.11 SDS a 50-65°C, y (2) que codifica para un polipéptido que tiene un 701., 80", 901, 95r o más del 951 de identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2. El porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante los métodos convencionales. Ver, por ejemplo, Altschul et al . , Bull . Ma th . Bi o . 48 : (603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 89 : 10915 (1992) . En breve, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de alineación utilizando una penalidad de abertura de espacio de 10, una penalidad de extensión de espacios de 1, y la matriz de puntuación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff { ibi d. ) como se muestra en la Tabla 3 (los aminoácidos se indican mediante códigos convencionales de una sola letra) . El porcentaje de identidad luego se calcula como: ([número total igualación de igualdades idénticas] / [longitud de la secuencia más larga más el número de aberturas que se introducen en la secuencia más larga a fin de alinear las dos secuencias]) (100) .

TABLA 3 A R N D C Q E K M S T Y A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 a 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 O 0 -3 O 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 O -1 -2 -2 O -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 "-1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 w -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 O -3 -1 4 Aquellos diestros en la técnica aprecian que existen varios algoritmos establecidos disponibles para alinear las dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método adecuado de alineación de proteínas para examinar el nivel de identidad combatido por una secuencia de aminoácidos descritos en la presente y la secuencia de aminoácidos de una variante putativa de Znrt2. El algoritmo FASTA se describe por Pearlson y Lipman, Proc . Na t ' l Acad. Sci . USA 85 : 2444 (1988), y por Pearson, Meth . Enzymol . 1 83 : 63 (1990) . En breve, FASTA primero caracteriza la similitud de secuencia al identificar regiones compartidas por la secuencia en cuestión (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) y una secuencia de análisis que tiene ya sea la mayor densidad de identidades (es decir si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup = 2) , sin considerar las sustituciones conservativas de aminoácidos, inserciones o sustituciones. Las diez regiones con la densidad más alta de identidades luego se vuelven a puntuar para comparar la similitud de todos los aminoácidos pareados al utilizar una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se "escinden" para incluir solamente aquellos residuos que contribuyen a la puntuación más alta. Si existen varias regiones con puntuaciones mayores al valor "de corte" (que se calcula mediante una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup) , y luego se cortan las regiones iniciales y se examinan para determinar si las regiones pueden unirse para formar una alineación aproximada con los espacios. Finalmente, las regiones con la puntuación más alta de las dos secuencias de aminoácidos se alinean al utilizar una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol . Bi ol . 48 : A A A (1970); Sellers, SIAM J. Appl . Ma th . 26: 787 (1974)), permite las supresiones e inserdiones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para los análisis FASTA son: ktup = 1, penalidad por espacio de abertura = 10, penalidad por extensión de espacios = 1, y matriz de sustitución = BLOSUM62. Estos parámetros se pueden introducir en un programa FASTA mediante la modificación de la matriz de puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth . Enzymol . 183 : 63 (1990). El FASTA también puede utilizarse para determinar la identidad de secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos utilizando una proporción como se describe anteriormente. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup que abarca entre uno a seis, preferiblemente desde tres a seis, más preferiblemente de tres, con otros parámetros dispuestos como se describe anteriormente. La presente invención incluye las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que tiene un cambio conservador de aminoácidos, comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Esto es, que las variantes que se pueden obtener contienen uno o más sustituciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en donde un alquil-aminoácido se sustituye por un alquil-aminoácido en la secuencia de aminoácidos de Zntr2, un aminoácido aromático se sustituye por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácidos de Zntr2, un aminoácido que contiene azufre se sustituye por un aminoácido que contiene azufre en la secuencia de aminoácidos de Zntr2, un aminoácido que' contiene hidroxilo se sustituye por un aminoácido que contiene hidroxilo en la secuencia de aminoácidos de Zntr2, un aminoácido acídico, que se sustituye por un aminoácido acídico en la secuencia de aminoácidos de Zntr2, un aminoácido básico que se sustituye por un aminoácido básico en la secuencia de aminoácidos Zntr2, o un aminoácido dibásico monocarboxílico que se sustituye por un aminoácido dibásico monocarboxílco en una secuencia de aminoácidos de Zntr2. Entre los amino cidos comunes, por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" se ilustra mediante la sustitución ente los aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2, 000 alineaciones múltiples locales de uno de los segmentos de secuencias de proteínas, que representan regiones muy conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc . Na t ' l Acad. Sci . USA 89 : 10915 (1992)). En consecuencia, las frecuencias de sustitución BLOSUM62 se pueden utilizar para definir sustituciones conservadoras de aminoácidos que pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos basadas únicamente en propiedades químicas (como se discute anteriormente), el lenguaje "sustitución conservadora de aminoácidos" se puede referir a una sustitución representada por el calor de BLOSUM62 de más de -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácido es conservadora si la sustitución se caracteriza por un valor BLOSUM62 de 0, 1, 2, ó 3. Según este sistema, ciertas sustituciones conservadoras de aminoácidos se caracterizan por un valor BVLOSUM62 de por lo menos 1 (por ejemplo, 1, 2, ó 3), mientras que otras sustituciones conservadoras de aminoácidos se caracterizan por un valor BLOSUM62 de por lo menos 2 (por ej.emplo, 2 ó 3) . Los cambios conservadores de aminoácidos en el gen Zntr2 se pueden introducir mediante nucleótidos de sustitución para los nucleótidos identificados en la SEQ ID NO:. 1. Estas variantes "de aminoácidos conservadores" se pueden obtener, por ejemplo, mediante una mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, una mutagénesis de detección del ligador, una mutagénesis implicando la reacción en cadena de la polimerasa, y similares (ver Ausubel (1995) en las páginas 8-12 a 8- 22; y McPherson (editor), Directed Mu tagenesi s : A Prctical Approach (IRL Press 1991)). Un polipéptido variante de Zntr2 se puede identificar mediante la habilidad de aglutinarse específicamente a anticuerpos anti-Zntr2. Las variantes particulares de Zntr2 se caracterizan por tener más del 801, por lo menos el 85*, por lo menos el 901, 95° por lo menos el 951 de identidad de secuencia a la secuencia correspondiente de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), en donde la variación en la secuencia de aminoácidos es debida a una o más -sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las proteínas de la presente invención también pueden - comprender residuos de aminoácidos que no ocurren naturalmente. Los aminoácidos que no ocurren naturalmente incluyen, sin limitación, trans- 3-metilprolina, 2, 4-metanoprolina, ci s-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alJo-treonina, metiltreonina, trans-4-hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteina, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, dehidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-di etilprolina, terc-leucina, norvalina, 2- azafenilalanina, 3-azafenílalanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina. Se conocen diversos métodos en la técnica para incorporar los residuos de aminoácidos que no ocurren naturalmente en las proteínas . Por ejemplo, un sistema in vitro se puede emplear en donde las mutaciones anti-sentido se suprimen al utilizar ARNt supresores químicamente aminoacilados. Los métodos para " sintetizar los aminoácidos y los AR?t aminoafcilantes se conocen en la técnica. La transcripción y la traducción de los plásmidos que contienen las mutaciones anti-sentido típicamente se llevan a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas de otros reactivos comercialmente disponibles. Las proteínas se purifican mediante cromatografía. Ver, por ejemplo, Robertson et al. J. Am. Chem. Soc. 113: 2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol, 202: 301 (1991), Chung et al., Science 259: 806 (1993), y Chung et al., Proc. Nat X Acad. Sci. USA 90: 10145 (1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus mediante la microinyección de AR?m mutado y AR?t supresor químicamente aminoacilado (Turcatti et al., J.Biol. Chem. 271: 19991 (1996) ) . En un tercer método, las células de E. coli se cultivan en ausencia de aminoácidos naturales que han de ser reemplazados (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia de los aminoácidos que no ocurren naturalmente y que son deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina ó 4-fluorofenilalanina) . Los aminoácidos que no ocurren naturalmente se incorporan en la proteína en lugar de su contraparte natural. Ver, Koide et al . , Bi ochem . 33 : 7470 (1994) . Los residuos de aminoácidos que ocurren naturalmente se pueden convertir a especies que no ocurren naturalmente mediante una modificación química ?r¡ vi tro . La modificación química puede combinarse con una mutagénesis dirifida por secuencia para expandir aún más la gama de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci , 2 : 395 (1993) ) . Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no se codifican por el código genético, aminoácidos que no ocurren naturalmente, y aminoácidos no naturales que se pueden sustituir por residuos de aminoácidos de Zntr2. Los aminoácidos esenciales en los polípéptidos de la presente invención se pueden identificar según los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida por secuencia o la mutagénesis de detección de la alanina (Cunningham y Wells, Sci ence 244 : 1081 (1989), Bass et al . , Proc . Na t ' l Acad. Sci . USA 88 : 498 (1991), Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", en Proteins : Analysis and Design, Angeletti (editor) , páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)) . En la última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula, y las moléculas resultantes se analizan para su actividad biológica, tales como la habilidad aglutinante de un anticuerpo, para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al . , J. Bi ol . Chem . 271 : 4699 (1996). La ubicación de los dominios aglutinadores del Zntr2 también puede determinarse desde un análisis físico de la estructura, como se determina por tales técnicas como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el marcado de fotoafinidad, en conjunción con la mutación de aminoácidos putativos de secuencia de contacto. Ver, por ejemplo, de Vos et al . , Science 255 : 306 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992), y Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59 (1992). Más aún, el Zntr2 marcado con biotina o 1FITC se puede utilizar para la clonación de expresión de los ligandos de Zntr2. Las sustituciones múltiples de aminoácidos se pueden hacer y analizar al utilizar métodos conocidos de mutagénesis y detección, tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer {Science 241: 53 (1988)) o Bowie y Sauer {Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 2152 (1989)). En breve, los autores describen métodos para aleatorizar dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar un polipéptido funcional, y luego secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen el despliegue de fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832 (1991), Ladner et al., Patente de E. U. A. No. 5,223,409, Huse, Publicación Internacional No. WO 92/06204, y muutagénesis dirigida por región (Derbyshire et 3.1., Gene 46: 145 (1986) y Ner et al., DNA 7: 127, (1988)). Las variantes del nucleótido Zntr2 descrito y las secuencias de polipéptidos también pueden generarse mediante el desordenamiento del ADN como se describe por Stemmer, Na ture 370 : 389 (1994), Stemmer, Proc . Na t ' l Acad. Sci . USA 91 : 10747 (1994), y Publicación Internacional No. WO 97/20078. En breve, las variantes de ADN se generan mediante la recombinación homologa i n vi tro mediante una fragmentación aleatoria del ADN progenitor seguido de una reagrupación al utilizar el PCR, lo que resulta en mutaciones puntuales aleatoriamente introducidas. Esta técnica puede modificarse al utilizar una familia de ADN progenitores tales como variantes alélicas o ADN de diferentes especies, para introducir una variabilidad adicional en el proceso. La selección o detección de la actividad deseada, luego de repeticiones adicionales de mutagénesis y valoración proporciona una rápida "evolución" de las secuencias al seleccionar mutaciones deseables mientras que se selecciona de manera simultánea en contra de cambios perjudiciales. Los métodos de mutagénesis como se describen en la presente se pueden combinar mediante métodos automatizados de detección y de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y mutagenizados en células hospederas. Las moléculas mutagenizadas de ADN que codifican para los polipéptidos biológicamente activos, o polipéptidos que se aglutinan con. los anticuerpos anti-Zntr2, pueden recuperarse de las células hospederas y secuenciarse rápidamente utilizando equipo moderno. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se puede aplicar a polipéptidos de una estructura desconocida. La presente invención también incluye " fragmentos funcionales" de los polipéptidos Zntr2 y las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para estos fragmentos funcionales. Los análisis rutinarios de supresión y las moléculas de ácidos nucleicos se pueden llevar a cabo para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácidos nucleicos que codifican para un -polipéptido Zntr2. Como ilustración, las moléculas de ADN que tienen una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 pueden digerirse con la nucleasa 23al31 para obtener una serie de supresiones ubicadas. Los fragmentos luego se ins'ertan en los vectores de expresión en un cuadro de lecturas apropiados, y los polipéptidos expresados se aislan y canalizan para su habilidad de aglutinarse a anticuerpos anti-Zntr2. Una alternativa para la digestión con exonucleasa es el uso de una mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para introducir supresiones o codones finalizadores para especificar la producción de un fragmento deseado. Alternativamente, los fragmentos particulares del gen Zntr2 se pueden sintetizar utilizando la reacción en cadena de la polimerasa . Los métodos para identificar los dominios funcionales se conocen bien por aquellos diestros en la técnica. Por ejemplo, los estudios sobre la truncación en alguno o " ambos términos de interferones se ha resumido por Di Marco, Pharmac . Ther. 66: 507 (1995) . Más aún, las técnicas convencionales para el análisis funcional de proteínas se describen por, por ejemplo, Treuter et al . , Mol ec . Gen . Genet . 240 : 113 (1993), Content et al . , "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon" en Biol ogical Interferon Sys tems , Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Sys tems, Cantell (editor), páginas 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Prolifera ti on, Vol . 1 , Boynton et al . , (editores) páginas 169-199 (Aademic Press 1985) , Coumailleau et al . , J. Bi ol . Chem . 270 : 29270 (1995); Fukunaga et al . , J. Biol . Chem . 270 : 25291 (1995); Yamaguchi et ai., Bi ochem. Pharmacol . 50 : 1295 (1995), y Meisel et al . , Plant Mol ec . Bi ol . 30 : 1 (1996). Los fragmentos funcionales ilustrativos del Zntr2 incluye una secuencia de señal (residuos de aminoácidos 1 al 30 o residuos de aminoácidos del 9 al 30 del SEQ ID NO: 2), un dominio extracelular (31 a 507 de SEQ ID NO: 2), un dominio transmembranal (residuos de aminoácidos 508 al 533 de SEQ ID NO: 2), y un dominio intracelular (residuos de aminoácidos 534 al 602 de SEQ ID NO: ) . Un polípéptido que comprende el dominio extracelular de Zntr2 pero que carece de un dominio transmembranal, se considera como un "receptor soluble de Zntr2" . Ejemplos de los receptores solubles de Zntr2 incluyen un dominio extracelular (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 31 al 507 de SEQ ID NO: 2), una secuencia de señal con un dominio extracelular (por ejemplo, residuos de aminoácidos 1 al 507 ó 9 al 507, de SEQ ID NO: 2), un dominio extracelular con un dominio intracelular (por ejemplo, residuos de aminoácidos 31-507 y los residuos de aminoácidos 534 al 602 de SEQ ID NO: 2) , una secuencia de señal con un dominio extracelular y un dominio intracelular (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 1 al 507 (ó 9 al 507) y os residuos de aminoácidos 534 al 602 de SEQ ID NO: 2), y similares. El dominio transmembranal puede utilizarse para estructurar proteínas de fusión unidas a la membrana.

Estas proteínas de fusión pueden comprender una porción soluble de. polipéptido y un dominio transmembranal del Zntr2. La presente invención también contempla los fragmentos funcionales de un gen Zntr2 que tiene los cambios de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Un gen variante de Zntr2 se puede identificar en base a su estructura mediante la determinación del nivel de identidad con un nucleótido y las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y2, como se discute anteriormente. Un método alternativo para identificar un gen variante en base a su estructura es determinar si la molécula de ácidos nucleicos que codifica para un gen variante potencial de Zntr2 puede hibridarse a una molécula de ácidos nucleicos que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, como se discute anteriormente. La presente invención también proporciona fragmentos de polipéptidos o péptidos que comprenden una porción que lleva un epítopo del polípéptido Zntr2 descrito en la presente. Estos fragmentos o péptidos pueden comprender un "epítopo inmunogénico", que es una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpos para la proteína completa se utiliza como un inmunógeno. Los péptidos inmunogénicos que llevan un epítopo pueden identificarse utilizando métodos convencionales (ver, por ejemplo, Geysen et al . , Na t ' l Acad. Sci . USA 81 : 3998 (1983)) . En contraste, los fragmentos de polipéptidos o péptidos pueden comprender un "epítopo antigénico", el cual es_una región de una molécula proteica a la cual se puede aglutinar de manera específica un anticuerpo, ciertos epítopos consisten de porciones lineales o contiguas de aminoácidos, y la antigenicidad de ese epítopo no se interrumpe por los agentes desnaturalizantes. Se sabe en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos pueden imitar los epítopos de una proteína que se puede utilizar para estimular la producción de anticuerpos en contra de una proteína (ver, por ejemplo, Sutcliffe et al . , Sci ence 219 : 660 (1983)). En consecuencia, los péptidos antigénicos que llevan un epítopo y los polipéptidos de la presente invención son útiles para provocar anticuerpos que se aglutinan con los polipéptidos descritos en la presente. Los péptidos y polipéptidos antigénicos qe llevan un epítopo pueden contener por lo menos de 4 a 10 aminoácidos, por lo menos de 10 a 15 aminoácidos, o aproximadamente de 15 hasta aproximadamente 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Estos péptidos y polipéptidos que llevan un epítopo pueden producirse mediante la fragmentación de un polipéptido de Zntr2, o mediante la síntesis química de un péptido, como se describe en la presente. Más aún, los epítopos pueden seleccionarse mediante un despliegue de fagos de genotecas aleatorias de péptidos (ver, por ejemplo, Lañe y Stephen, Curr. Opin . Immunol . 5: 268 (1993), y Córtese et al . , Curr. Opin . Biotechnol . 7: 61 6 (1996)). Los métodos convencionales para identificar los epítopos y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítopo se describen, por ejemplo, por Mole, "Epitope Mapping", en Methods in Molecular Bi ology, Vol . 1 0, Manson (editor), páginas 105-115 (The Humana Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", en Monocl onal Antibodi es : Producti on, Engineering, and Clini cal Appli ca ti on , Ritter y Ladyman (editores) , páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan et al . (editores), Current Protocols in Immunol ogy, páginas 9.3.1-9.3.5 y páginas 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997). Sin importar las secuencias de nucleótidos en particular de un gen variante de Zntr2, el gen que codifica para im polipéptido se puede caracterizar por su habilidad para aglutinarse de manera específica a un anticuerpo anti-Zntr2. Para cualquier polipéptido _Zntr2, incluyendo las variantes y las proteínas de fusión, alguien de destreza ordinaria en la técnica puede fácilmente generar un polinucleótido totalmente degenerado que codifica para una variante utilizando la información expuesta en las Tablas 1 y 2 anteriormente. Más aún, aquellos diestros en la técnica pueden utilizar programas de computadora convencionales para divisar las variantes de Zntr2 basándose en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos descritas en la presente. En consecuencia, la presente invención incluye un medio legible por computadora codificado con una estructura de datos que proporciona por lo menos una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3. Las formas adecuadas de los medios legibles por computadora incluyen los medios magnéticos y los medios legibles de manera óptica. Los ejemplos de los medios magnéticos incluyen un disco duro o fijo, un chip fijo de memoria de acceso aleatorio (RAM), un disco flexible, cinta digital lineal (DLT) , memoria caché de disco, y un disco ZIP. Los medios ópticamente legibles se ejemplifican mediante discos compactos (por ejemplo, discos compactos de memoria solamente legible (ROM) , discos compactos re-escribibles (RW) , y discos compactos grabables) , y discos digitales versátiles/de video .(DVD) (por ejemplo, DVD-ROM, DVD-RAM, y DVD+RW) .

. Producción de Proteínas de Fusión de Zntr2 las proteínas de fusión del Zntr2 se pueden utilizar para expresar el Zntr2 en un hospedero recombinante, y para aislar el Zntr2 expresado. Como se describe a continuación, las proteínas de fusión particulares de Zntr2 también tienen un uso en la terapia y el diagnóstico. Un tipo de proteína de fusión comprende un péptido que guía al polipéptido Zntr2 de una célula hospedera recombinante. Para dirigir el polipéptido Zntr2 en una vía secretoria de una célula hospedera eucariótica, una secuencia de señal secretoria (también conocida como un péptido de señal, una secuencia líder, o pre-pro-secuencia o pre-secuencia) se proporciona en el vector de expresión Zntr2. Mientras que la secuencia de señal secretoria se puede llevar del Zntr2, una secuencia de señal adecuada también puede derivarse de otra proteína secretada o sintetizada de novo . La secuencia secretoria de señal se liga de manera operable a la secuencia codificadora Zntr2 de manera tal que las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se coloca para dirigir el polipéptido recientemente sintetizado en la vía secretoria de la célula hospedera. Las secuencias secretoras de señal se colocan comúnmente en dirección 5' a la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias secretoras de señal se pueden colocar en cualquier otro lado en la secuencia de nucleótidos de interés (ver, por ejemplo, Welch et al . , Patente de E. U. A. No. 5,037,743; Holland et al . , Patente de E. U. A. No. 5,143,830). Aunque la" secuencia secretora de señal del Zntr2 u otras proteínas que se producen por células de mamífero (por ejemplo, secuencia de señal del activador del plasminógeno tipo tejido, como se describe, por ejemplo, en la Patente de E. U. A. No. 5,641,655) que es útil para la expresión del Zntr2 en hospederos recombinantes de mamífero, una secuencia de señal de levadura se prefiere para la expresión en células de levadura. Los ejemplos de las secuencias de señal de levadura adecuada son aquellas que se derivan del factor-<x de la ferormona del apareamiento de levaduras (codificada por el gen MFal ) , invertasa (codificada por el gen SUC2) , fosfatasa acida (codificada por el gen PH05) . Ver, por ejemplo, Romanos et al . , "Expression of Cloned Genes in Yeast", en DNA Cl oning 2 : A Practi cal Approach , 2a edición, Glover y Hames (editores), páginas 123-167 (Oxford University Press 1995) .

En células bacterianas, es normalmente deseable expresar una proteína heteróloga como una proteína de fusión para disminuir la toxicidad, incrementar la estabilidad, y para intensificar la recuperación de la proteína expresada. Por ejemplo, el Nntr2 se puede expresar a manera de una proteína de fusión que comprende el polipéptido de S-transferasa de glutatión. Las proteínas de fusión de la S-transferasa de glutatión son típicamente solubles, y fácilmente purificables a partir de productos usados de E. coli en columnas inmóviles de glutatión. En métodos similares, una proteína de' fusión de Zntr2 comprende un polipéptido de proteína aglutinadora de la maltosa se puede aislar con una columna de resina de amilosa, mientras que una proteína de fusión que comprende el extremo C-terminal de un gen truncado de Proteína A se puede purificar utilizando IgG-Sefarosa . Las técnicas establecidas para expresar un polipéptido heterólogo a manera de una proteína de fusión en una célula bacteriana se describen, por ejemplo, por Williams et al . , "Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies" en DNA Cl oning 2 : A Practi cal Approach , 2a edición, Glover y Hames (editores), páginas 15-58 (Oxford University Press 1995) . Además, los sistemas de expresión comercialmente disponibles se encuentran disponibles. Por ejemplo, el sistema de purificación de proteína PINPOINT Xa (Promega Corporation; Madison, Wl) proporciona un método para aislar una proteína de fusión que comprende un polipéptido que se vuelve biotinilado durante la expresión con una resina que comprende avidina. Los indicadores de péptidos que son útiles para aislar polipéptidos heterólogos expresados ya sea por células procarióticas o eucarióticas incluyen los indicadores poliHistidina (que tienen una afinidad para la resina quelante de níquel), indicadores c-myc, proteína aglutinadora de la calmodulina (aislada con una cromatografía de afinidad para la calmodulina) , sustancia P, el indicador RYIRS (que se aglutina con los anticuerpos anti-RYIRS) , el indicador Glu-Glu, y el indicador FLAG (que se aglutina con los anticuerpos anti-FLAG) , ver, por ejemplo, Luo et al . , Arch . Bi ochem . Bi ophys . 329 : 215 (1996), Morganti et al . , Bictechnol . Appl . Bi ochem . 23 : 67 (1996), y Zheng et al . , Gene 186: 55 (1997). Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para estos indicadores de péptidos se encuentran disponibles, por ejemplo, de Sigma-Aldrich Corporation (St Louis, MO) . La presente invención también contempla que el uso de secuencias secretoras de señal que están contenidas en los polipéptidos Zntr2 de la presente invención para dirigir otros polipéptidos en la vía secretoria. Un polipéptido de señal y polipéptidos de la fusión se puede hacer en donde una secuencia secretoria de señal derivada de los residuos de aminoácidos 1 al 30, ó 9 al 30, de SEQ ID NO. 2 se liga de manera operable a otro polipéptido utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. La secuencia secretoria de señal contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención preferiblemente se fusionan de manera amino-terminal a un péptido adicional para dirigir el péptido adicional en la vía secretoria. Estas estructuras tienen diversas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estas estructuras de fusión novedosas de secuencias secretoras de señal pueden dirigir la secreción de un componente activo y de una proteína normalmente no secretada, tal como un receptor. Estas fusiones pueden utilizarse en un animal transgénico o un hospedero recombinante cultivado para dirigir los péptidos mediante la vía secretoria. Con respecto a lo último, los polipéptidos ejemplificantes que incluyen las moléculas farmacéuticamente activas tales como el Factor Vlla, proinsulina, insulina, hormona folículo-estimulante, activador del plasminógeno tipo tejido, factor de necrosis tumoral, interleucinas (por ejemplo, interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-il, IL-12, IL-13, IL-14, e IL-15), factores estimulantes de colonias (por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , y factor .estimulante de colonia de granulocitos macrófagos (GM-CSF)), interferones (por ejemplo, interferones-a, -ß, -?, -?, -d, y -t) , y el factor de crecimiento de células germinales designado "factor SI", eritropoyetina, y trombopoyetina . La secuencia secretoria de señal del Zntr2 contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención se fusiona preferiblemente de manera amino-terminal a un péptido adicional para dirigir el péptido adicional de manera secretoria. Las proteínas de fusión que comprenden la secuencia secretoria de señal Zntr2 se pueden estructurar utilizando técnicas convencionales.

Otra forma de proteína de fusión que comprende un polipéptido Zntr2 y una región constante de cadena pesada de una inmunogobulina, típicamente un fragmento F , que contiene dos dominios constantes de región y una región de visagra pero que carece de una región variable. A manera de ilustración, Chang et al . , Patente de E. U. A. No. 5,723,125, describen una proteína de fusión que comprende un interferón de humano y un fragmento F de inmunoglobulina humana. El C-terminal del interferón está ligado al N-terminal del fragmento F- mediante una porción ligadora de péptidos. Un ejemplo de un ligador de péptidos es un péptido que contiene principalmente una secuencia inerte de células T, las cuales son inmunológicamente inertes. Un ligador peptídico ejemplificante tiene la secuencia de aminoácidos: GGSGG SGGG SGGG S (SEQ ID NO: 10). En esta proteína de fusión, una porción F preferida es la cadena ?4 humana, la cual es estable en solución y tiene poca o ninguna actividad de activación del complemento. En consecuencia, la presente invención contempla la proteína de fusión Zntr2 que comprende un dominio extracelular de Zntr2 y un fragmento F- en donde el C-término en la porción del dominio extracelular de la porción Zntr2 se une al C-término del fragmento F por medio de un ligador péptido, tal como un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. La porción de dominio extracelular de Zntr2 puede ser un receptor Zntr2 soluble, como se describe anteriormente. En otra variación, una proteína de fusión de Zntr2 comprende una secuencia de IgG, una porción soluble del receptor de Zntr2 unida de manera covalente al extremo amino-terminal de ia secuencia IgG, un péptido de señal que se une de manera covalente al amino-terminal de la porción soluble del receptor Zntr2, en donde la secuencia IgG consiste de los siguientes elementos en el siguiente orden: la región de v sagra, el dominio CH , y el dominio CH . En consecuencia, la secuencia IgG carece del dominio CH . El receptor soluble Zntr2 despliega actividad de Zntr2, tal como la habilidad de aglutinarse al ligando Zntr2. Este procedimiento general para producir las proteínas de fusión puede comprender tanto al anticuerpo como las porciones que no son anticuerpos que se han descrito por LaRochelle et al . , EP 742830 (WO 95/21258). Las proteínas de fusión que comprenden las porciones solubles del receptor Zntr2 y una porción de F se pueden utilizar, por ejemplo, a manera de una herramienta de valoración in vi trc . Por ejemplo, la presencia del ligando Zntr2 e una muestra biológica puede detectarse utilizando estas proteínas de fusión de Zntr2-anticuerpo, en donde la porción de Zntr2 se utiliza para poner como objetivo al ligando cognado, y una macromolécula, tal como la Proteína A o al anticuerpo anti-F , se 'utiliza para detectar el complejo de proteína de fusión aglutinada-ligando . Además, las proteínas de fusión de anticuerpos-Zntr2, que comprenden los dominios variables del anticuerpo, son útiles como proteínas terapéuticas, en donde las porciones de anticuerpos de aglutinan con un antígeno objetivo, tales como un antígeno asociado a un tumor. Las proteínas de fusión se pueden preparar mediante métodos conocidos por aquellos diestros en la técnica al preparar cada componente ríe la proteína de fusión y conjugar químicamente estos. Relativamente, un polinucleótido que codifica ambos componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura adecuado se puede generar al utilizar las técnicas conocidas y expresarse mediante métodos descritos en la presente. Por ejemplo, una parte o la totalidad de los dominios que confiere una función biológica pueden intercambiarse entre el Zntr2 de la presente invención con los dominios funcionales equivalentes de otras proteínas transmerabranales . Estos dominios incluyen, pero no se limitan a, las secuencias secretorias de señal, el dominio extracelular, el dominio transmembranal, y el dominio intracelular. Los métodos generales para el desdoblamiento enzimático y químico de las proteínas de fusión se describen, por ejemplo, por Ausubel (1995) en las páginas 16-25. 6. Producción de Polipéptidos Zntr2 en Células Cultivadas Los polipéptidos de la presente invención, incluyendo los polipéptidos de cadena completa, los fragmentos funcionales, y las proteínas de fusión, se pueden producir en células hospederas recombinantes siguiendo las técnicas convencionales. Para expresar un gen Zntr2, una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido_ deben de ligarse de manera operable a las secuencias regulatorias que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión y luego, introducirse en una célula hospedera. Además de las secuencias regulatorias transcripcionales, tales como promotores e intensificadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras traductoriales y un gen marcador que es adecuado para la selección de células que transportan el vector de expresión. Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína externa en células eucarióticas contiene típicamente (1) elementos de ADN procarióticos que codifican para un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para proporcionar el crecimiento y selección" di vector de expresión en un hospedero bacteriano; (2) elementos de ADN eucarióticos que controlan el inicio de la transcripción, tales como un promotor; y (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de los transcriptos, tales como la secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación. Como se describe con anterioridad, los vectores de expresión pueden también incluir secuencias de nucleótidos que codifican para secuencias secretorias que dirigen al polipéptido heterólogo en la vía secretoria de una célula hospedera. Por ejemplo, un vector de expresión de Zntr2 puede comprender un gen Zntr2 y una secuencia secretoria derivada del gen Zntr2 u otro gen secretado.

Las proteínas Zntr2 de la presente invención pueden expresarse en células de mamífero. Los ejemplos de células adecuadas de un mamífero incluyen las células de riñon de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de riñon de embrión humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñon de hámster bebe (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células caninas de riñon (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovarios de hámster chino (CHO-Kl; ATCC CCL61; CHO DG44 [Chasin et al . , Som . Cel . Mol ec . Genet . 12 : 555 1986]), células pituitarias de rata (GH1; ATC CCL82) , células HeLa S3 (ATCC CCL2.2 ) , células de hepatoma de rata (H-4 Il-E; ATCC CRL 1548), células de riñon de mono SV-40-transformadas (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embriónicas de murino (NIH-33; ATCC CRL 1658).

II." Para un hospedero mamífero, la señales regulatorias transcripcionales y traductoriales se pueden derivar de fuente víricas, tales como el adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del simio, o similares, en las cuales las señales regulatorias que están asociadas con un gen en particular que tiene un alto nivel de expresión. Las secuencias regulatorias adecuadas de la transcripción y traducción también pueden obtenerse a partir de genes de mamífero, tales como la actina, el colágeno, miosina, y genes de la metalotioneí a. Las secuencias regulatorias de la transcripción incluyen una región promotora para dirigir la iniciación de síntesis del ARN. Los promotores eucariótícos adecuados incluyen el promotor del gen de la metalotioneína I de ratón (Hamer et al., Molec. Appl. Genet. i: 273 (1982)), el promotor TK del Herpes virus (McKnight, Cell 31: 355 (1982)), el promotor temprano SV40 (Benoist et al., Nature 290: 304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)), el promotor del citomegalovirus (Foecking et al., Gene 45: 101 (1980) ) , y el promotor del virus del tumor mamario de ratón (ver, por ejemplo, generalmente, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", en Protein Engineering: Principi es and Practi ce, Cleland et al . (editores), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). Alternativamente, un promotor procariótico, tal como el promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T3, puede utilizarse para controlar la expresión del gen Zntr2 en las células de mamífero si es que el promotor procariótico se regula por un promotor eucariótico (Zhou et al . , Mol . Cell . Bi ol . 1 0 : 4529 (1990), y Kaufman et al . , Nucí . Acids Res . 19: 4485 (1991) ) , Un vector de expresión puede introducirse en células hospederas utilizando una diversidad de técnicas convencionales que incluyen la transfección por fosfato de calcio, la transfección mediada por ribosomas, el suministro mediado por microproyectiles, electroporación y similares. Las células transfectadas se pueden seleccionar y propagar para - proporcionar células hospederas recombinantes que comprenden al vector de expresión de manera establemente integrada en el genoma de la célula hospedera. Las células para introducir los vectores en células eucarióticas y las técnicas para seleccionar estos transformantes estables utilizando un marcador seleccionable dominante se describen, por ejemplo, por Ausubel (1995) y por Murray (editor), Gene Transfer and Expressi on Protocols (Humana Press 1991) . Por ejemplo, un marcador seleccionable adecuado es , un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, la selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco tipo neomicina, tal como el G-418 o similares. Los sistemas de selección también pueden utilizarse para ' incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso referido como "amplificación". La amplificación se lleva a cabo al cultivar los transfectantes en presencia de un bajo nivel del agente selectivo y luego incrementar la cantidad del agente selectivo para seleccionar las células que producen altos niveles de productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable adecuado es la dihdrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a fármacos múltiples, puromicinacetiltransferasa) también se pueden utilizar. Alternativamente, los marcadores que introducen un fenotipo alterado, tal como la proteína verde fluorescente, o proteínas de superficie celular tales como la CD4, CD8, y complejo principal de histocompatibilidad Tipo I MHC, fosfatasa alcalina de placenta se pueden utilizar para sortear las células transfectadas de células no transfectadas mediante esos métodos tales como la clasificación FACS o la tecnología de separación por avalorios magnéticos. Los polipéptidos Zntr2 también se pueden producir mediante células cultivadas de mamíferos utilizando un sistema de administración vírico. Los virus ejemplificantes para este propósito incluyen los adenovirus, herpesvirus, virus de la vacuna y virus adeno-asociados (AAV) . El adenovirus, un virus ADN bicatenario, es actualmente el vector de transferencia de genes mejor estudiados para la administración de ácido nucleico heterólogo (para un repaso, ver Becker et al . , Meth . Cell. Bi ol . 43 : 161 (1994), y Douglas y Curiel, Sci ence & Medi cine 4 : A A (1997) ) . Las ventajas del sistema adenovirus incluyen la acomodación de insertos de ADN relativamente grandes, la habilidad de cultivar a una alta titulación, la habilidad de infectar una amplia gama de tipos de células de mamíferos, y la selectividad que permite utilizar una amplia variedad de vectores disponibles que contienen diferentes promotores. Al suprimir porciones del genoma del adenovirus, se pueden acomodar mayores insertos (de hasta 1 kb) de ADN heterólogo. Estos insertos se pueden incorporar e el ADN vírico mediante una ligación directa o mediante una recombinación homologa con un plásmido cotransfectado. Una opción es suprimir el gen esencial El del vector vírico, lo *que resulta en la inhabilidad de replicarse a menos que el gen El se proporcione por la célula hospedera. La célula 293 de humano infectada por vector de adenovirus (ATCC Nos. CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, se puede cultivar como células adherentes o en un cultivo de suspensión a una densidad celular relativamente alta para producir cantidades significativas de proteína (ver Garnier et al . , Cytotechnol . 15 : 145 (1994)). Las genes Zntr2 también pueden expresarse en otras células eucarióticas más evolucionadas, tales como las células aviares, fúngales, de insecto, levadura o vegetales. El sistema de baculovirus proporciona un medio efectivo para introducir los genes clonados de Zntr? en células de insectos. Los vectores de expresión adecuados están basados en el virus de la polihedrosis múltiple nuclear de Autographa californi ca (AcMNPV) y contiene promotores bien conocidos tales como eí promotor 70 de la proteína de choque térmico de la Drosophila {hsp) , el promotor del gen temprano inmediato del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica ( i e-1 ) y el promotor 39K temprano retardado, promotor pl O de baculovirus, y el promotor de la metal oti oneina de Drosophila . Un segundo método para hacer baculovirus recombinante utiliza un sistema basado en transposón descrito por (Luckow et al . , J. Virol . 67 : 4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se vende en un juego de reactivos BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technolgies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica para el polipéptido Zntr2 en un genoma de baculovirus que se mantiene en E. coli como un gran plásmido llamado "bacmid" . Ver, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen . Virol . 71 : 971 (1990), Bonning, et al . , J. Gen . Virol . 75 : 1551 (1994), y Chazenbalk, y Rapoport, J. Bi ol . Chem . 270 : 1543 (1995) . Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en marco o el ADN que codifica para un indicador de epítopo en el C- ó N-término del polipéptido expresado para el Zntr2, por ejemplo, un indicador de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer e£ al . , Proc . Na t 'l Acad. Sci . 82 : 7952 (1985)). Al utilizar un método que se conoce en la técnica, un vector de transferencia que contiene el gen Zntr2 se transforma en E. coli se detecta por bacmids que contienen un gen interrumpido lac? de baculovirus recombinante. El ADN bacmid que contiene el genoma recombinante de baculovirus luego se aisla utilizando técnicas comunes. El vector ilustrativo PFASTBAC puede modificarse a un grado considerable. Por ejemplo, el promotor de la polihedrina puede retirarse y sustituirse con el promotor de la proteína básica del baculovirus (también conocida como Peor, p6.9 o promotor MP) que se expresa antes en la infección por baculovirus, y que ha mostrado ser ventajoso para expresar proteínas expresadas (ver, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J.

Gen . Virol . 71 : 971 (1990), Bonning, et al . , J. Gen . Virol . 75: 1551 (1994), y Chazenbalk, y Rapoport, J. Bi ol . Chem . 270 : 1543 (1995) . En estas estructuras de vectores de transferencia, una versión corta o larga del promotor básico de proteínas se puede utilizar. Más aún, los vectores de transferencia pueden estructurarse los cuales reemplazan a las secuencias naturales secretorias de señal Zntr2 con secuencias secretorias de señal derivadas de proteínas de insectos. Por ejemplo, una secuencia secretoria de señal para el Ecdysteroide Glucosiltransferasa (EGT), miel de abeja Melittin (Invitrogen Corporation; Carisbad, CA) , o el baculovirus gp67 (PharMingen; San Diego, CA) , o gp67 (PharMingen; San Diego, CA) se pueden utilizar estructuras para reemplazar a la secuencia secretoria de señal natural de Zntr2. El virus recombinante o bac id se utiliza para transfectar las células hospederas. Las células de insecto hospederas adecuadas incluyen líneas celulares que se derivan de IPLB-S/-21, una línea celular de ovarios de crisálida Spodoptera frugiperda, tales como S/9 (ATCC CRL 1711), S 21AE, y S/21 (Invitrogen Corporation; Carisbad, CA) , así como células Schneider- 2 de Drosophila y la línea celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivadas de Tri chopl usi a ni (Patente de E. U. A. No. 5,300,435). El medio libre de suero comercialmente disponible puede utilizarse para cultivar y para mantener las células. El medio adecuado es Sf900 II7" (Life Technologies) ó ESF 9217" (Sistemas de Expresión) para células Sf9; y ExcellO405 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO" para células T. ni . Cuando se utiliza un virus recombinante, las células se cultivan típicamente a una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10 células a una densidad de 1-2 x 10 células en cuyo momento se agrega una variedad recombinante de virus a una multiplicidad de infecciones (MOI) de 0.1 a 10, mas típicamente cerca de 3. Las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en los sistemas de baculovirus se proporcionan por Bailey et al . , "Manipulation of Baculovirus Vectors", en Meth ods in Mol ecul ar Bi ol ogy, Vol umen 7. Gene Transfer and Expressi on Protocols, Murray (editor), páginas 147-168 (The Human Press, Inc. 1991), por Patel et al.,"The baculovirus expression system" en DNA Cl oning 2 : Expressi on Systems, 2a edi ción, Glover et al . , (editores), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (editor), Bacul ovirus Expressi on Protocols (The Human Press, Inc. 1995), y por Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", en Protein Engineering : Principi es and Practi ce, Cleland et al . , (editores), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) . Las células de hongos, incluyendo las células de levaduras, también pueden utilizarse para expresar los genes descritos en la presente. Las especies de levaduras de interés particular en este aspecto incluyen Saccharomyces cerevi siae, Pi chi a pastori s , y Pi chia methanoli ca . Los promotores adecuados para la expresión en levaduras incluye los promotores GAL1 (galactosa), PGK ( fosfoglicerato cinasa), ADH (alcohol dehidrogenasa) , AOXl (alcohol oxidasa) , HIS4 (histidinol dehidrogenasa), y similares. Diversos vectores de clonación de levaduras se han designado y se encuentran fácilmente disponibles. Estos vectores incluyen los vectores basados en Yip, tales como los vectores YIp5, YRp, tales como los vectores YRpl7, YEp tales como los vectores YEpl3 y YCp, tales como YCpl9.

Los métodos para transformar las células de 5. cérevisiae con ADN exógeno y producir el polipéptido recombinante de estos se describe por, por ejemplo, Kawasaki, Patente de E. U. A. No. 4,599,311, Kawasaki et al . , Patente de E. U. A. No. 4,931,373, Brake, Patente de E. U. A. No. 4,870,008, Welch et al . , Patente de E. U. A. No. 5,037,743 Murray et al . , Patente de E. U. A. No. 4,845,075. Las células transformadas se seleccionan mediante el fenotipo determinado con un marcador seleccionable, comúnmente resistencia a fármacos o la habilidad para crecer en ausencia de un nutriente en particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema adecuado de vectores para utilizarse en Saccharomyces cerevi siae es el sistema de vector PÜT1 descrito por Kawasaki et al . , (Patente de E. U. A. No. 4,931,373), que permite a las células "transformadas seleccionarse mediante el crecimiento de un medio que contiene glucosa. Los promotores adecuados adicionales terminadores par-a utilizarse en levaduras incluyen aquellos de genes de la enzima glicolítica (ver, por ejemplo, Kawasaki, Patente de E. U. A. No. 4,599,311, Kings an et al . , Patente de E. U. A: No. 4,615,974, y Bitter, Patente de E. U. A. No. 4,977,092) y los genes' del alcohol dehidrogenasa. Ver también las Patentes de E. U. A. Nos. 4,990,446, 5,063,154, 5, 139, 936 y 4, 661, 454. Los sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha , Schi?osacharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica , Pichia guillermondii y Candida maltosa se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 459 (1986), y Cregg, Patente de E. U. A. No. 4,882,279. Las células de Aspergillus se pueden utilizar según los métodos de McKnight et ai., Patente de E. U. A. No. 4,935,349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum se describen por Sumino et al., Patente de E. U. A. No. 5,162,228. Los métodos para transformar Neurospora se describen por Lambowit?, Patente de E. U.

A. No. ,486,533. Por -ejemplo, el uso de Pichia methanolica como un hospedero para la producción de proteínas recombínantes se describe por Raymond, Patente de E. U. A. No. ,716,808, Raymond, Patente de E. U. A. No. 5,736,383, Raymond et al., Yeast 14: 11-23 (1998), y en las Publicaciones Internacionales Nos. WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para utilizarse en P. methanoli ca transformante comúnmente se preparan como plásmidos circulares bicatenarios, que preferiblemente se linearizan antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanoli ca, se prefiere que el promotor y terminador en el plásmido sea del gen de P. methanolica, tal como un gen de la utilización del gen de la utilización del alcohol de P. methanoli ca { AUG I o AUG2) . Otros promotores útiles incluyen aquellos de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS), formato dehidrogenasa (FMD) y catalasa (CAT) . Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma hospedero, se prefiere tener el segmento completo de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por las secuencias hospederas de ADN. Un marcador seleccionable adecuado para utilizarse en P. methanoli ca es un gen ADE2, de P. me thanoli ca , que codifica _ , para la fosforibosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21) y que permite que las células hospederas ade2 se cultiven en ausencia de adenina. Para procesos industriales a gran escala en donde es deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere utilizar células hospederas en las cuales ambos genes de la utilización del metanol [AUGI o AUG2) se suprimen. Para la producción de proteínas secretadas, las células hospederas deficientes en los genes de la proteasa vacuolar { PEP4 o PRB1 ) se prefieren. La electroporación se utili-za para facilitar la introducción de un plásmido que contiene el ADN que codifica para ün polipéptido de interés en las células de P. methanolica . Las células de P. methanoli ca se pueden transformar mediante electroporación utilizando un campo eléctrico pulsado decadente de manera exponencial que tiene una fuerza de campo desde 2.5 a 4.5 kV/cm, preferiblemente de aproximadamente 3.75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, más preferiblemente de aproximadamente 20 milise.gundos . Los vectores de expresión también pueden introducirse en protoplastos vegetales, tejidos intactos de vegetales c células vegetales aisladas. Los métodos para introducir los vectores de expresión en el tejido vegetal, incluyen la infección directa o el cocultivo- de tejido vegetal con Agrobacteri um tumefaci ens, administración mediada por microproyecriles, inyección de ADN, electroporación, y similares. Ver, por ejemplo, Horsch et al., Science 227: 1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10: 265 (1992), y Miki et al., "Procedures for Introducting Foreign DNA into Plants", en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et ai., (editores), páginas 67-88 (CRC Press,. 1993) . Alternativamente, los genes Zntr2 se pueden expresar en células hospederas procarióticas . Los promotores adecuados que se pueden utilizar para expresar los polipéptidos de Zntr2 en un hospedero procariótico se conocen bien por aquellos diestros en la técnica e incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores P. y P_. del bacteriófago lambda, el trp, recA, choque térmico, y promotores lacUVS, tac, Ipp-lacSpr, phoA, y lac? de E. coli, promotores de B. subtilis, los promotores de bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322, y el promotor CAT del gen de cloramfenicol de acetil transferasa. Los promotores procarióticos han sido repasados por Glick, J. Jnd. Micrcbiol. 1: 277 (1987), Watson et al., Molecular Bi ol ogy of the Gene, 4a edi ci ón (Benjamín Cummins 1987), y por Ausubel et al . (1995). Los hospederos procarióticos adecuados incluyen __". coli y Bacill us subtil us . Las cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21 (DE3), BL21 (DE3 ) pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DHl, DH41, DH5, DH51, DH51F" DH51MCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM1O9, JMl 10. K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, y ER1647 (ver, por ejemplo, Brown (editor), Mol ecular Bicl ogy Labfax (Academic Press 1991)). Las cepas adecuadas de Bacill us subtil us incluyen BR151, YB886, MI119, MI120, y B170 (ver, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", en DNA Cl oni ng: A Practi cal Approach, Glover (editor) (IRL Press 1985) ) . Cuando se expresa un polipéptido Zntr2 alrededor de una bacteria tal como E. coli , el polipéptido puede retenerse en el citoplasma, típicamente a manera de granulos insolubles, o se puede dirigir al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el último caso,, las células se lisan, y los granulos se recuperan y se desnaturalizan al utilizar, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado luego puede volverse a naturalizar y dimerizar al diluir el desnaturalizante, tal como mediante diálisis en contra de una solución de urea y una combinación de glutationa oxidada y reducida, .seguido de una diálisis en contra de una solución salina amortiguada. En el último caso, el polipéptido puede recuperarse del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional al interrumpir las células (ver, por ejemplo, tratamiento por sonido o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, y de esta manera hacer obvia la necesidad para la desnaturalización y naturalización. Los métodos para expresar las proteínas en hospederos procarióticos se conocen bien por aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Williams et al . , "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodie-s" , en DNA Cl oni ng 2 : Expressi on Systems , 2a edi ci ón, Glover et al . (editores), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al . , "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monocl onal Antbodi es : Principies and Appli ca tions, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), y Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," en Protein Engineering: Principi es and Practi ce, Cleland et al . (editores), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). Los métodos convencionales para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levadura, de insecto y de vegetales se proporcionan, por ejemplo, por Ausubel (1995) . Los métodos generales para expresar y recuperar la proteína foránea producida por un sistema celular de mamífero se proporciona mediante, por ejemplo, Etcheverry, "Expression of Engineering Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principi es and Practi ce, Cleland et al . (editores), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996) . Las técnicas convencionales para recuperar la proteína producida por un sistema bacteriano se proporcionan por, por ejemplo, Grisshammer et al . , "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," en DNA Cl oning 2 : Expressi on Systems , 2a edi ci ón, Glover et al . (editores), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995) . Los métodos establecidos para aislar las proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus se describe por Richardson (editor) , Baculovirus Expression Protocols (The Human Press, Inc. 1995) . Como una alternativa, los polipéptidos de la presente invención .se pueden sintetizar mediante una síntesis exclusiva de fase sólida, métodos parciales de fase sólida, condensación de fragmentos o una síntesis clásica de soluciones. Estos métodos de síntesis se conocen bien por aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2a edición), (Pierce Chemical Co . 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields y Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volumen 289 (Academic Press 1997), y Lloyd-Wí lliams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press Inc. 1997)). Las variaciones en la totalidad de las estrategias de síntesis químicas, tales como "ligación química natural" y "ligación proteica expresada" también son convencionales (ver, por ejemplo, Dawson et al., Science 266: 776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat X Acad. Sci. USA 94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol . 28 "' ' : 34 (1997), Muir et al , Proc . Na t 'l Acad. Scil . USA 95 : 6705 (1998), y Severinov y Muir, J. Bi ol . Chem . 273 : 16205 (1998)). Los péptidos y polipéptidos de _ la presente invención comprenden por lo menos seis, y por lo menos nueve, o por lo menos 15 residuos contiguos de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. A manera de ilustración, los polipéptidos pueden comprender por lo menos 15 residuos contiguos de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2: residuos 1 al 220 de aminoácidos, residuos de aminoácidos 31 al 220, residuos de aminoácidos 1 al 241, residuos de aminoácidos 31 al 241, residuos de aminoácidos 1 al 507, residuos de aminoácidos 9 al 507, residuos de aminoácidos 508 al 533, y residuos de aminoácidos 534 al 602. Dentro de ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos comprenden 20, 30, 40, 50, o más residuos contiguos de estas secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos pueden comprender por lo menos 30 residuos contiguos de aminoácidos de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2: residuos de aminoácidos 1 al 256, residuos de aminoácidos 31 al 256, residuos de aminoácidos 1 al 507, residuos de aminoácidos 9 al 507, residuos de aminoácidos 508 al 533, y residuos de aminoácidos 534 al 602. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para estos péptidos y polipéptidos son útiles como cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa y sondas. 7. Aislamiento de los Polipéptidos Zntr2 Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por lo menos en aproximadamente un 80 de pureza, por lo menos' en aproximadamente 90. de pureza, por lo menos aproximadamente en 95 de pureza, e incluso mayor al 95 de pureza con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes infecciosos y pirogénicos. Los polipéptidos de la presente invención también pueden purificarse mediante un estado farmacéuticamente puro, el cual es mayor a 99.9 puro. Ciertas preparaciones comprenden polipéptidos purificados que son sustancialmente libres de otros polipéptidos, particularmente de otros polipéptidos de origen animal.

La fraccionación y/o los métodos convencionales de purificación se pueden utilizar para obtener preparaciones de Zntr2 purificado de fuentes naturales (por ejemplo, leucocitos de sangre periférica), y polipéptidos recombinantes del Zntr2 y polipéptidos de fusión de Zntr2 purificados a partir de células hospederas recombinantes. En general, la precipitación por sulfato de amonio y la extracción por ácido o extracción caotropa se puede utilizar para la fraccionación de las muestras. Los pasos ejemplificantes de purificación pueden incluir hidroxiapatita, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa. El medio cromatográfico adecuado incluye dextranos derivados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad, y similares, o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados' incluyen abalorios de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, abalorios de agarosa, abalorios de agarosa entrecruzada, abalorios de poliestireno, resinas de poliacrilamida entrecruzada y similares que son insolubles bajo condiciones en las cuales han de utilizarse. Estos soportes se pueden modificar mediante grupos reactivos que permiten unión de proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfidrilo, grupos hidroxilo y/o porciones de carbohidratos . Los ejemplos de los productos químicos de copulación incluyen la activación del bromuro de cianógeno, activación de la N-hidroxisuccinimida, activación epoxídica, activación de sulfidrilo, activación de hidrazida, y derivados carboxilo y amino para los productos químicos de copulación de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos se conocen bien y se usan ampliamente en la técnica, y se encuentran disponibles de proveedores comerciales. La selección de un método en particular para el aislamiento de polipéptidos y purificación es un caso de diseño de rutina y se determina en parte con las propiedades del soporte seleccionado. Ver, por ejemplo, Affini ty Chroma tography: Pri ncipi es & Metnods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), y Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996) . Las variaciones adicionales en el aislamiento de Zntr2 y su purificación pueden ingeniarse por aquellos diestros en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Zntr2, que se obtienen como se describe a continuación, pueden utilizarse para aislar grandes cantidades de proteína mediante la purificación por inmunoafinidad. Más aún, los métodos para aglutinar receptores, tales como Zntr2, a los polipéptidos de ligandos aglutinados son medios de soporte conocidos en la técnica. Los polipéptidos de la presente invención también pueden aislarse mediante la explotación de propiedades particulares. Por ejemplo, la cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) se pueden utilizar para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden indicadores de polihistidina . En breve, primero se carga un gel con los iones metálicos divalentes para formar un producto quelado (Sulkowski, Trends in Bi ochem . 3 : 1 (1985)). Las proteínas ricas en histidina se absorben a esta matriz con afinidades diferentes, dependiendo del ion metálico que se utiliza, y se eluyen mediante una elución competitiva, disminuyendo el pH, o mediante el uso de fuertes agentes quelantes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas mediante la cromatografía de la afinidad de la lectina y la cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed. ) , Meth . Enzymol . 182 : 529 (1990)). Dentro de modalidades adicionales de la invención, un polipéptido de fusión de interés y un indicador de afinidad (por ejemplo, proteína aglutinadora de la maltosa, un dominio de inmunoglobulina) se puede estructurar para facilitar la purificación. Los polipéptidos o fragmentos Zntr2 de esto se puede preparar mediante una síntesis química, como se describe a continuación. Los polipéptidos Zntr2 pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; fosforilados o no fosforilados; pegiládos o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo inicial del aminoácido metionina. 8. Valoraciones para los polipéptidos Zntr2, y moléculas que se aglutinan con los polipéptidos Zntr? Co o se describe anteriormente, los polipéptidos descritos se pueden utilizar para estructurar variantes de Zntr2. Estos polipéptidos se pueden utilizar para identificar ligandos naturales del polipéptido receptor Zntr2, y análogos de ligando natural (un "ligando Zntr2" ) . Un tipo de análogo del ligando Zntr2 imita al ligando natural de ZntrZ al aglutinarse con un polipéptido de Zntr2, tal como un receptor soluble de Zntr2. Un análogo así se considera como un agonista de ligando Zntr2 y la aglutinación del análogo con el polipéptido Zntr2 produce una respuesta mediante una célula que expresa para el receptor. Por otra parte, el análogo del ligando Zntr2 que se aglutina con un polipéptido Zntr2, pero que no estimula una respuesta celular, puede ser un antagonista de ligando Zntr2. Este antagonista puede disminuir la actividad del agonista o el ligando, por ejemplo, mediante una aglutinación competitiva o no competitiva del antagonista al polipéptido Zntr2. Un método para producir el. análogo del ligando Zntr2 es generar un anticuerpo que se aglutine al dominio - extracelular de Zntr2. Los estudios muestran que un anticuerpo que se aglutina en el dominio extracelular puede actuar como un agonista o un antagonista de ligando natural (ver, por ejemplo, Kita y colaboradores, Bi ochem . Biphys . Res , Commun . 226: 59 (1996), y Alia y colaboradores, J. Bi ol . Chem . 271 : 1148 (1996) ) . Otro método para obtener los análogos de ligando Zntr2 se proporciona mediante el uso de genotecas combinantes. Los métodos para estructurar y detectar las genotecas de despliegue de fagos, y las genotecas peptídicas o peptidomiméticas producidas mediante métodos químicos se describen por ejemplo, por Kay y colaboradores, Phage Di splay of Peptides and Proteins (Academic Press _ 1996) , Al-Obeidi y colaboradores, Mol ec Bi otechnol . 9 : 205 (1998), Verdine, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,783,384, Kay y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,747,334, y Kaufrman y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,723,323. El ligando Zntr2, sus agonistas y antagonistas son valiosos tanto para los usos in vi tro como in vi vo . Por ejemplo, un ligando Zntr2 o un agonista se puede utilizar a manera de un componente de un medio de cultivo de células definidas, solo o en combinación con otros agentes bioactivos, para reemplazar el suero que se utiliza comúnmente en el cultivo celular. Los antagonistas también son útiles como reactivos de investigación para caracterizar las secuencias de interacción entre ligandos Zntr2 y su receptor. En un marco terapéutico, las composiciones farmacéuticas que comprenden los antagonistas del ligando Zntr2 se pueden utilizar para inhibir la actividad de ligando Zntr2. Los polipéptidos de receptor Zntr2 se pueden Utilizar para identificar y para aislar los ligandos Zntr2. Los fragmentos de Zntr2, tales como un dominio extracelular de Zntr2 (por ejemplo, los aminoácidos 31 al 507 de SEQ ID NO: 2) y otras formas de receptor solubles Zntr2, son particularmente útiles para estos métodos. Por ejemplo, las proteínas y péptidos de la presente invención se pueden inmovilizar en una columna y utilizarse para aglutinar los ligandos a partir de una muestra biológica que se hace correr sobre la columna (Hermanson y colaboradores, (eds.), Immobili zed Affini ty Ligand Techniques, páginas 195-202 (Academic Press 1992) ) . La actividad del polipéptido Zntr2 se puede observar mediante un microfisiómetro con biosensor basado en silicio, que cuantifica la velocidad extracelular de acidificación o la excreción de protones asociados con una aglutinación de receptores y respuestas celulares fisiológicas subsecuentes. Un dispositivo ejemplificante es el micro isiómetro CYTOSENSOR fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Una diversidad de respuestas celulares, tales como la proliferación celular, transporte iónico, producción de energía, respuesta inflamatoria, activación de receptor y regulatoria, y similares, se pueden cuantificar mediante este método (ver, por ejemplo, McConnell y colaboradores, Sci ence 257: 1906 (1992), Pitchford y colaboradores, Meth . Enzymol . 228 : 84 (1997), Arimilli y colaboradores, J. Immunol . Meth 212 : 49 (1998), Van Liefde y colaboradores, Eur. J. Pharmacol . 346: 81 (1998)).' El microfisiómetro se puede utilizar para valorar células eucarióticas, procarióticas, adherentes y no adherentes. Al cuantificar los cambios extracelulares de acidificación en un medio celular durante un periodo de tiempo, el microfisiómetro cuantifica directamente las respuestas celulares a diversos estímulos, incluyendo los agonistas, ligandos, o antagonistas del receptor Zntr2. El microfisiómetro se puede utilizar para cuantificar las respuestas de una célula eucariótica que expresa para el Zntr2, en comparación a una célula eucariótica testigo que expresa para el polipéptido Zntr2. Las células adecuadas que responden al estímulo modulador del Zntr2 incluyen las células hospederas recombinantes que comprenden un vector de expresión Zntr2, y células que expresan naturalmente para Zntr2, tales como los linfocitos de sangre periférica o las células del bazo. La acidificación extracelular proporciona una cuantificación para la respuesta celular modulada por Zntr2. Además, se puede utilizar un método para identificar los ligandos, agonistas y antagonistas del polipéptido receptor Zntr2. Por ejemplo, un compuesto puede identificarse con un agonista del polipéptido Zntr2 para proporcionar células que expresan a un polipéptido Zntr2, cultivar una primera porción de las células en ausencia de un compuesto de análisis, cultivar una segunda porción de las células en presencia del compuesto del análisis, y determinar si la segunda porción exhibe una respuesta celular, en comparación con la primera porción. Alternativamente, un sistema de fase sólida puede utilizarse para identificar un ligando, agonista, o antagonista del polipéptido receptor Zntr2. Por ejemplo, un polipéptido Zntr2 o una proteína de fusión Zntr2 se puede inmovilizar sobre la superficie de un circuito receptor de un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIACORE, Biacore AB; Uppsala, Suecia) . El uso de instrumento se describe, por ejemplo, por arlsson, Immunol . Methods 1 45 : 229 (1991), y Cunningham and Wells, J. Mol . Bi ol . 234:554 (1993) . En breve, el polipéptido Zntr2 o las proteínas de fusión se unen de manera covalente, utilizando la química de_ aminas o' sulfidrilo, a fibras de dextrano que se unen a una película de oro en una celda de flujo. Luego se hace pasar una muestra de análisis a través de la celda. Si el ligando está presente en la muestra, éste se aglutina a polipéptido o proteína de fusión inmovilizada, causando un cambio en el índice refractario del medio, el cual se detecta como un cambio de resonancia superficial del plasma de la película de oro. Este sistema permite la determinación de los que están dentro y fuera de alcance, de donde se puede .calcular la afinidad de aglutinación, y la evaluación de la estequiometría de aglutinación. Este sistema también se puede utilizar para examinar las interacciones anticuerpo-antígeno, y las interacciones de otros pares de complemento/anti-complemento .

Los dominios receptores de aglutinación de Zntr2 se puede además caracterizar mediante un análisis físico o estructura, como se determina por estas técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcado de fotoafinídad, en conjunción con una mutación de aminoáci'dos putativos de secuencias de contacto de los agonistas de ligando Zntr2. Ver, por ejemplo, de Vos y colaboradores, Sci ence 255 : 306 (1992), Smith y colaboradores, J. Mol . Bi ol . 224 : 899 (1992), y Wlodaverr y colaboradores, FEBS Lett . 309 : 59 (1992). La presente invención contempla las composiciones que comprenden un polipéptido o péptido descrito en la presente. Estas composiciones pueden además comprender un portador. El portador puede ser un portador orgánico o inorgánico convencional. Los ejemplos de los portadores incluyen el agua, la solución amortiguadora, alcchol, propilenglicol, macrogol, aceite de ajonjolí, aceite de maíz, y similares. 9. Producción de anticuerpos para proteínas Zntr2 Los anticuerpos para Zntr2 se pueden obtener, por ejemplo, en utilizar el producto de un vector de expresión de Zntr2 o el Zntr2 aisladc a partir de una fuente natural como un antígeno. Particularmente, los anticuerpos útiles anti-Zntr2 se "aglutinan específicamente" con el Zntr2. Se considera que los anticuerpos se aglutinan de manera específica si los anticuerpos exhiben por lo menos una de las siguientes dos propiedades: (1) los anticuerpos se aglutinan a Zntr2 con un nivel de umbral de actividad de aglutinación, y (2) que los anticuerpos no reaccionan en forma cruzada de manera significativa con los polipéptidos relacionados al Zntr2. Los anticuerpos incluyen anticuerpos que se aglutinan con Zntr2 en dominios particulares, tales como las secuencias secretarias de señal Zntr2, el dominio extracelular de Zntr2, el dominio transmembranal de Zntr2, y el dominio intraceluiar de Zntr2. Con respecto a la primera característica, los anticuerpos se mantienen específicamente si se aglutinan al polipéptido Zntr2, el péptido o el epítopo con una afinidad de aglutinación de (KJ de 10 M"" o más, preferiblemente 10 M" o más, más preferiblemente 10" M" o más, y más preferiblemente 10 M" o más. La afinidad de aglutinación de un anticuerpo puede determinarse fácilmente por alguien ordinariamente diestro en la técnica, por ejemplo, por el análisis de Scatchard (Scatchard, Ann . NY Acad. Sci . 51 : 660 (1949)). Con respecto a la segunda característica, los anticuerpos no reaccionan en forma cruzada de manera significativa con las moléculas relacionadas de polipéptidos,. por ejemplo, si detectan el Zntr2, pero sin los polipéptidos relacionados son utilizar un análisis convencional de transferencia Western. Los ejemplos de los polipéptidos relacionados son los ortólogos y las proteínas de los mismos tipos que los miembros de una familia proteica. A manera de ilustración, los anticuerpos anti-Zntr2 que se aglutinan _de manera específica, se "aglutinan con el Zntr2, pero no con otros polipéptidos que tienen un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico, tal como el factor de crecimiento epidérmico, factores de la coagulación VII, IX, X, y XII, fibul'ina-1, y similares . Los anticuerpos anti-Zntr2 se pueden producir utilizando péptidos y polipéptidos que llevan un epítopo antigénico de Zntr2. Los péptidos y polipéptidos que llevan un epítopo antigénico de la presente invención contienen una secuencia de por lo menos cuatro, o entre 15 hasta aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de SEQ ID NO: 2. Sin embargo, loe péptidos o polipéptidos que comprenden una mayor porción una secuencia de aminoácidos de la invención, que contienen de 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud de hasta incluyendo la secuencia completa de aminoácidos del polipéptido de la invención, también son útiles para inducir anticuerpos que se aglutinan con el Zntr . Es deseable que la secuencia de aminoácidos del péptido que lleva el epítops se seleccione para 'proporcionar una solubilidad sustancial en solventes acuosos (es decir, la secuencia incluye residuos relativamente hidrofílicos, mientras que los residuos hidrofóbicos preferiblemente se eviten) . Más aún, las secuencias de aminoácidos que tienen residuos de prolina también pueden ser deseables para la producción de anticuerpos. A manera de ilustración, las secuencias potenciales antigénicas en el Zntr2 se identifical al utilizar el método de Jameson-Wolf, Jameson y Wolf, CABIOS 4 : 181 , (1988), como se implementa por el programa PROTEAN (versión 3.14) de LASERGENE (DNASTAR; Madison, Wl) . Los parámetros por omisión se utilizan en este análisis. El método Jameson-Wolf predice las determinales antigénicas potenciales mediante la combinación de seis subrutinas principales para la predicción de la estructura proteica. En breve, el método Hpp-Woods, Hopp y colaboradores, Proc, Na t ' l Acad. Sci . USA 78:3824 (1981), se utiliza primero para identificar las secuencias de aminoácidos que representan las áreas de una mayor hidrofilicidad local (parámetro: siete residuos en promedio) . En la segunda etapa, el método de Emini, Emini y colaboradores, J. Vi rol ogy 55:836 (1985), se utiliza para calcular las probabilidades de superficie (parámetro: umbral de decisión de superficie ?C.6) = 1). Tercero, el método Karplus-Schultz, Karplus y Schultz, Na t urwissenschaften 72:212 (1985), se utiliza para predecir la flexibilidad de la cadena principal (parámetro: umbral de flexibilidad (0.2) = I X En el cuarto y quinto paso del análisis, las predicciones de la estructura secundaria se aplican a los datos utilizando los métodos de Chou-Fasman, Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", in Predi cti on of Protein Structure and the Principies of Protein Conformation, Fasman (ed.), páginas 549-586 (Plenum Press 1990), y Garnier- Robson, Garnier y colaboradores, J. Mol . Bi cl . 120 : 91 (1978) (Chou-Fasman parámetros: tabla de conformación = 64 proteínas; umbral de la región alfa = 103; umbral de región .beta = 105; parámetros Garnier-Robson : constantes de decisión alfa y beta = 0) . En la sexta subrutina, los parámetros de flexibilidad y los factores de accesibilidad de la hidropatía/solvente se combina para determinar un valor de contorno de superficie, designado como el "índice antigénico".

Finalmente, una función de ampliación de pico se establece para el índice antigénico, que amplía los principales picos de superficie al agregar 20, 40, 60, u 80 peor "ciento del valor respectivo del pico para dar cuenta por energía libre adicional derivada de la movilidad de las regiones de superficie en relación a las regiones internas: Este cálculo no se aplica, sin embargo, a cualquier pico principal que reside en la región de la hélice, ya que las regiones de la hélice tienden a ser menos flexibles. Los resultados de este análisis indican que un péptido que consiste de los aminoácidos 57 al 67 de SEQ ID NO: 2 ("péptido antigénico 1"), y sus seis fragmentos de aminoácidos (aminoácidos 57 al 62 de SEQ ID NO: 2 ("péptido antigénico 2" ) , aminoácidos 58 a 63 de SEQ ID NO: 2 ("péptido antigénico 3"), aminoácidos 59 ai 64 ("péptido antigénico A" ) , aminoácidos 60 al 65 ("péptido antigénico 5"), aminoácidos 61 al 66 ("péptido antigénico 6" ) , y aminoácidos 62 al 67 ("péptido antigénico 1" ) ) proporcionan péptidos antigénicos adecuados. El análisis también indica que los péptidos que consisten de los siguientes residuos de aminoácidos-" de SEQ ID NO : 2 proporcionan péptidos antigénicos adecuados: aminoácidos 78 a 86 ("péptido antigénico 8" ) , aminoácidos 78 al 83 ("péptido antigénico 9"), aminoácidos 79 al 84 ("péptido antigénico 10"), aminoácidos 80 al -85 ("péptido antigénico 11"), aminoácidos 81 al .86 ("péptido antigénico 12"), aminoácidos 98 al 103 ("péptido antigénico 13"), aminoácidos 131 al 138 ("péptido antigénico 14"), aminoácidos 131 al 136 ("péptido antigénico 15"), aminoácidos 132 al 137 ("péptido antigénico 16"), aminoácidos 133 - al 138 ("péptido antigénico 17"), aminoácidos 171 al 182 ("péptido antigénico 18" ) , aminoácidos 171 al 176 ("péptido antigénico 19"), aminoácidos 172 al 177 ("péptido antigénico 20"), aminoácidos 173 al 178 ("péptido antigénico 21"), aminoácidos 174 al 179 ("péptido antigénico 22"), a. a. 175 al 180 (*péptido antigénico 23"), aminoácidos 176 al 131 ("péptido antigéníco 24"), aminoácidos 177 al 182 ("péptido antigénico 25"), aminoácidos 192 al 198 ("péptido antigénico 26"), aminoácidos 192 al 197 ("péptido antigénico 27") aminoácidos 193 al 198 ("péptido antigénico 28") aminoácidos 268 al 273 ("péptido antigénico 29" aminoácidos 304 al 310 ("péptido antigénico 30" aminoácidos 304 al 30_9 ("péptido antigénico 31" aminoácidos 305 al 310 ("péptido antigénico 32" aminoácidos 321 al 327 ("péptido antigénico 33"), a. a 321 al 326 ("péptido antigénico 34"), aminoácidos 322 al 327 ("péptido antigénico 35"), aminoácidos 331 al 337 ("péptido antigénico 36"), aminoácidos 331 al 336 ("péptido antigénico 37") aminoácidos 332 al 337 ("péptido antigénico 38") aminoácidos 339 al 345 ("péptido antigénico 39") aminoácidos 339 al 344 ("péptido antigénico 40") aminoácidos 340 al 345 ("péptido antigénico 41") aminoácidos 384 al 390 ("péptido antigénico 42") aminoácidos 384 al 389 ("péptido antigénico 43" ) , aminoácidos 385 al 390 ("péptido antigénico 44"), aminoácidos 395 al 401 "péptido antigénico 45"), aminoácidos 395 al 400 "péptido antigénico 46"), aminoácidos 396 al 401 "péptido antigénico 47" ) , aminoácidos 407 al 412 *péptido antigénico 48" ) , aminoácidos 416 al 422 "péptido antigénico 49" ) , aminoácidos 416 al 421 "péptido antigénico 50" ) , aminoácidos 417 al 422 "péptido antigénico . 51" ) , aminoácidos 446 al 452 "péptido antigénico 52" ) , aminoácidos 446 al 451 "péptido antigénico 53" ) , aminoácidos 447 al 452 "péptido antigénico 54" ) , aminoácidos 497 al 503 "péptido antigénico 55"), aminoácidos 541 al 547 "péptido antigénico 56" ) , aminoácidos 541 al 546 "péptido antigénico 57"), aminoácidos 542 al 547 "péptido antigénico 58"), aminoácidos 578 al 588 "péptido antigénico 59" ) , aminoácidos 578 al 583 "péptido antigénico 60" ) , aminoácidos 579 al 584 "péptido antigénico 61" ) , aminoácidos 580 al 585 "péptido antigénico 62"), aminoácidos 581 al 586 "péptido antigénico 63" ) , aminoácidos 582 al 587 "péptido antigénico 64"), aminoácidos 583 al 588 "péptido antigénico 65" ) . Más aún, los siguientes también son fragmentos adecuados de péptidos antigénicos: aminoácidos 330 al 335 ("péptido antigénics 66"), aminoácidos 554 al 559 ("péptido antigénico 67"), aminoácidos 329 al 334 ("péptido antigénico 68"), y aminoácidos 539 al 544 ("péptido antigénico 69" ) . Los fragmentos particularmente adecuados incluyen los péptidos antigénicos 61, 66, 67, 68, y 6*9. La presente invención contempla el uso de cualquiera de los péptidos antigénicos 1 al 69 para generar anticuerpos para Zntr2. La presente invención también contempla los polipéptidos que comprenden cuando menos uno de los péptidos antigénicos 1 al 69. Los anticuerpos policlonales para la proteína recombinante Zntr2 o el aislado Zntr2 de fuentes naturales se puede tratar utilizando métodos que se conocen por los diestros en la técnica. Ver, por ejemplo, Green y colaboradores, "Production of Pólyclonal Antisera", en Immunochemi cal Protoccl s (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992), y Williams y colaboradores, "expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA - Cl oning 2 : X.xpressi on Sys tems , 2nd Edi ti cn, Glover y colaboradores, (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995) . La inmunogenicidad del polipéptido Zntr2 se puede incrementar mediante el uso adyuvante, tal como el alumbre (hidróxido de aluminio) o el adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen los polipéptidos de fusión, tales como las fusiones del Zntr2 o porciones de estas con un péptido de inmunoglobulina o con una proteína que se aglutina a la maltosa. El inmunógeno de polipéptido también puede ser una molécula de cadena completa o una porción de ésta. Si la porción del polipéptido es "similar a un hapteno" , esta porción puede universe de manera ventajosa o ligarse a un portador macromolecular (tal como una hemocianina de lapa (KLH) , albúmina sérica de bovino (BSA) o toxoide titánico) para su inmunización. Aunque los anticuerpos policlonales típicamente se manifiestan en animales tales como caballos,' vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, coballos, cabras u ovejas, un anticuerpo anti-Zntr2 de la presente invención también pueden derivarse de un anticuerpo de un primate subhumano. Las técnicas generales "para poner de manifiesto los anticuerpos diagnósticamente y terapéuticamente útiles en los babuinos se pueden hayar, por ejemplo., en Goldenberg y colaboradores, publicación internacional de patente número WO 91/11465, y . en Loman y colaboradores, Int, J. Cáncer 46: 310 (1990). Alternativamente, los anticuerpos monoclonales anti-Zntr2 se pueden generar. Los anticuerpos monoclonales de roedores para antígenos específicos se pueden obtener mediante métodos conocidos por los diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Kohler y colaboradores, Na ture 256: 495 (1975), Coligan y colaboradores, (eds.), Current Protocols in Immunol ogy, Vol . 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley y colaboradores, "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli" , in DNA Cl oning 2 : Expressi on Systems , 2nd Edi ticn, Gl over y colaboradores, (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995) ) . En breve, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener al inyectar ratones con una composición que comprende el producto génico de Zntr2, verificar la presencia de la producción de anticuerpos al retirar una muestra sérica, retirar el bazo para obtener los linfacitos B, fusionar los linfocitos B con las células del mieloma para producir hibridomas, clonando las hibridomas, seleccionar clonas positivas que producen anticuerpos par el antígeno, cultivar las clonas para producir anticuerpos para el antígeno, y aislar los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. Además, el anticuerpo anti-Zntr2 de la presente invención puede derivarse de un anticuerpo monoclonal de humano. Los anticuerpos monoclonales de humano se obtienen a partir de ratones transgénicos que se han manipulado genéticamente para producir los anticuerpos humanos específicos en respuesta a un desafío antigénico. En esta técnica, los elementos del locus humano de cadena ligera y pesada se introducen en las cepas de ratones derivados de líneas de células germinales embriónicas que contienen interrupciones marcadas como objetivo de el loci endógeno de la cadena pesada y ligera. El ratón transgénico puede sintetizar anticuerpos de humano específicos para antígenos de humano, y el ratón puede utilizarse para producir hibridomas de humano secretoras de anticuerpos.

Métodos para obtener los anticuerpos de humano para ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green y colaboradores, Na t ure Genet . 7 : 13 (1994), Lonberg y colaboradores, Na ture 368 : 856 (1994), y Taylor y colaboradores, Jnt, Immun . 6: 519 (1994) . Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar a partir de cultivos de hibridoma mediante una diversidad de técnicas bien establecidas. Estas técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con la sefarosa de proteína A, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico (ver, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1.-2.7.12 y en las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines y colaboradores, "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol . 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Para los usos particulares, puede ser deseable preparar fragmentos de anticuerpos anti-Zntr2. Estos fragmentos de anticuerpos se pueden obtener, por ejemplo, mediante la hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse mediante la digestión por pepsina o papaína de los anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Como una ilustración, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir mediante un desdoblamiento enzimático en los anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S llamado F(ab')_. Este fragmento puede desdoblarse aún más al utilizar un agente reductor de tiol para producir los fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Qpcionalmente, la reacción de desdoblamiento puede llevarse a cabo al utilizar un grupo bloqueador para los grupos sulfidrilo que resultan del desdoblamiento de los enlaces disulfuro. Como una alternativa, un desdoblamiento enzimático al utilizar pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fe directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenbert, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,331,647, Nisonoff y colaboradores, Arch Bi ochem . Biphys . 89 : 230 (1960), Porter, Bi ochem . J. 73 : 119 (1959) Edelman y colaboradores, en Methods in Enzymol ogy Vol . I, página 422 (Academic Press 1967), y por Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 ' y 2.10-2.10.4.

Otros métodos para desdoblar los anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadenas ligeras-pesadas, desdoblaron más los fragmentos, otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas también se pueden utilizar, mientras que los fragmentos que contienen antígeno es reconocido por el anticuerpo completo. Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas V. y V_. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe por Inbar y colaboradores, Proc, Na t ' l Acad. Sci . USA 69 : 2 659 (1972) . Alternativamente, las cadenas variables se pueden enlazar mediante un enlace disulfuro intermolecular o entrecruzarse mediante químicos tales como el glutaraldehído (ver, por ejemplo, Sandhu, Cri t .

Rev. Biotech . 12 : 431 (1992)). Los fragmentos Fv pueden comprender cadenas V. y V_ que se conectan mediante un ligador péptido. Estas proteínas de una sola cadena aglutinadoras de antígenos (scFv) se preparan para estructurar un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican para los dominios V, y V_ se conectan por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión que se introduce subsecuentemente en una célula hospedera, tal como la E. coli . Las células hospederas recombinantes sintetizan una sola cadena polipeptida con un péptido ligador que une los dos dominios V. Los-métodos para producir scFvs se describen, por ejemplo, por Whitlow y colaboradores, Methods : A Compani on to Methods in Enzymol ogy 2 : 91 (1991) (también ver, Bird y colaboradores, Sci ence 242:423 (1988), Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,946,778, Pack y colaboradores, Bi o/Technol ogy 11 : 1211 (1993), y Sandhu, supra ) . Como una ilustración, el scFV puede obtenerse mediante la exposición de los linfocitos al polipéptido Zntr2 ín vi tro, y seleccionar las genotecas de despliegue de anticuerpos en un fago o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de péptido o proteína Zntr2 marcada o inmovilizada) . Los genes que codifican polipéptidos que tienen dominios de aglutinación de polipéptido Zntr2 potenciales se pueden obtener mediante la detección aleatoria de genotecas peptíricas desplegadas en fagos (despliegue de fagos) o en bacterias, tales como el E. coli . Secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos se pueden obtener de una variedad de formas, tales como mediante una mutagénesis aleatoria y una síntesis aleatoria de poinucleótidos . Estas genotecas de despliegue aleatorias de péptidos se pueden utilizar para detectar los péptidos que interactúan con un objetivo conocido que puede ser una proteína o un polipéptido, tal como un ligando o receptor, o una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y detectar estas genotecas de despliegue aleatorio de péptidos se conocen en la técnica (Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,223,409, Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,946,778, Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,403,484, Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,571,698, y Kay y colaboradores, Phage Displ ay of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) y las genotecas aleatorias de despliegue de péptidos y juegos de reactivos para estas genotecas se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego, CA) , New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) , y Pharmacia LKB Biotechnology Inc.

(Piscataway, NJ) . Las genotecas aleatorias de despliegue de péptidos se pueden detectar o utilizar las secuencias de Zntr2 descritas en la presente para identificar proteínas que se aglutinan en el Zntr2. Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica para la región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos CDR ("unidades mínimas de reconocimiento" ) se pueden obtener para estructurar genes que codifican para el CDR o un anticuerpo de interés. Estos genes se preparan, por ejemplo, al utilizar la reacción de cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable del ARN de una célula productora de anticuerpo (ver, por ejemplo, Larrick y colaboradores, Methods : A Compani on to Methods in Enzymol ogy 2:106 (1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monocl onal Antibodi es : Producticn , Engineering and Clini cal Appli ca ti on, Ritter y colaboradores, (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995), y Ward y colaboradores, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antlbodi es : Principi es and Appli ca ti ons, Birch y colaboradores, (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). Alternativamente, un anticuerpo anti-Zntr2 se puede derivar de un anticuerpo monoclonal "humanizado" .

Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen al transferir las regiones determinantes de complementariedad de un ratón de las cadenas ligeras y pesadas variables de la inmunoglobulina de ratón en un dominio variable de humano. Los residuos típicos de los anticuerpos humanos luego se sustituyen en las regiones de la estructura de las contrapartes de murino. El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados hacen obvio los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes de murino. Las técnicas generales para clonar los dominios variables de inmunoglobulina de murino se describen, por ejemplo, por Orlandi y colaboradores, Proc, Na t ' l Acad. Sci . USA 86: 3833 (1989)". Técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen, por ejemplo, por Jones y colaboradores, Na ture 321 : 522 (1986), Cárter y colaboradores, Proc, Na t ' l Acad. Sci USA 85:4285 (1992), Sandhu, Cri t . Rev. Bi otech . 12:437 (1992), Singer y colaboradores, J. Immun . 150 -. 28 A A (1993), Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", en Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland y colaboradores, (eds.), páginas 399- 434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), y por Queen y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,693,762 (1997). Los anticuerpos policlonales anti-idiotipo se pueden preparar al inmunizar animales con anticuerpos antí-Zntr2 o fragmentos de anticuerpos, utilizando técnicas convencionales. Ver, por ejemplo, Green y colaboradores, "Production of Polyclonal Antisera", en Methods In Mol ecul ar Bi ol ogy: Immunochemi cal Protocol s, Manson (ed.), páginas 1-12 (Humana Press 1992). También, ver Coligan en las páginas 2.4.1-2.4.7. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales anti-idiotipo se pueden preparar utilizando anticuerpos anti-Zntr2 o fragmentos de anticuerpos inmunógenos con las técnicas descritas anteriormente. Como otra alternativa, los anticuerpos humanizados anti-idiotipo o los anticuerpos anti-idiotipo de primate subhumano puede prepararse utilizando las técnicas anteriormente descritas. Los métodos para producir anticuerpos anti-idiotipo se describen, por ejemplo, por Irie, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,208,146, Greene, y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,637,677, y Varthakavi y Minocha, J. Gen . Vi rol . 77:1875 (1996).

. Uso de secuencias de nucleótidos Zntr2 para detectar la expresión del gen Zntr2 y para examinar el locus cromosómico de Zntr2 Las moléculas de ácidos nucleicos pueden utilizarse para detectar la expresión de un gen Zntr2 en una muestra biológica. Estas moléculas de prueba incluyen las moléculas de ácidos nucleicos bicatenarias y comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:l, o un fragmento de esta, así como las moléculas de ácidos nucleicos de una sola cadena que tienen el complemento de la secuencia de nucleótido SEQ ID NO:l, o un fragmento de éste. Las moléculas de sondas pueden ser de ADN, ARN, oligonucleótidos, y similares. Las sondas adecuadas comprenden una porción de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 103 al 1908 de SEQ ID N0:1, o el complemento de éste. Como se utiliza en la presente, el término "porción" se refiere a cuando menos ocho nucleótidos y hasta cuando menos 20 o más nucleótidos. Por ejemplo, las sondas adecuadas' pueden comprender una porción de secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 103 al 720, o los nucleótidos 103 hasta el 783, de SEQ ID NO:l. Las sondas adicionales ilustrativas se aglutinan a ciertos dominios funcionales de Zntr2. Estas sondas tienen una secuencia de nucleótidos, o su complemento, que codifica para una porción de una secuencia de señal, un dominio extracelular, un dominio transmembranal, o un dominio intracelular. En una valoración básica, una molécula de una sonda monocatenaria se incuba al ARN, se aisla de una muestra biológica, bajo condiciones de temperatura y fuerza iónica que promueve el pareo de bases entre la sonda y las especies objetivo del ARN de Zntr2. Después de separar la sonda no aglutinada de las moléculas hibridizadas, la cantidad de híbridos se detecta . Los métodos de hibridización bien establecidos de la detección de ARN incluyen los análisis de transferencia northern y la hibridización de transferencia en mancha (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 4-1 a 4-27, y Wu y colaboradores, (eds.), "Analysis of Gene Expression at the ARN Level", en Me thods in Gene Bi o technol ogy, páginas 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)) . Las sondas de ácidos nucleicos se pueden manchar de manera detectable con radioisótopos tales como '"P ó S. Alternativamente, el ARN de Zntr2 se puede detectar con un método no radioactivo de hibridización (ver, por ejemplo, Isaac (ed.), Protccols for Nucl ei c Acid Analysis by Nonradi oacti ve Probes (Humana Press, Inc. 1993)). Típicamente, la detección no radioactiva se lleva a cabo mediante una conversión enzimática de los sustratos cromogénicos o quimioluminescentes . Las porciones no radioactivas ilustrativas incluyen la biotina, fluoresceína, y digoxigenina . Las sondas de los oligonucleótidos Zntr2 también son útiles para el diagnóstico in vivo. A manera de ilustración, los oligonucleótidos marcados con ""F se puede administrar a un sujeto y visualizar mediante una tomografía de emisión de positrones (Tavitian y colaboradores, Na t ure Medi ci ne 4:467 (1998)). Los diversos procedimientos diagnósticos tienen la ventaja de la reacción en cadena de poli eraca (PCR) para incrementar la sensibilidad de los métodos de detección. Las técnicas convencionales para llevar a cabo el PCR se conocen bien (ver, generalmente, Mathew (ed.j, Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols : Curren t Methcds and Appli ca ti ons (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Mol ecul ar Diagnosis of Cáncer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protoccls (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clini cal Appli ca ti ons of PCR (Humana Press, Inc. 1998), y Meltzer (ed.), PCR in Bi oanalysis (Humana Press, Inc. 1998) ) . Una variación del PCR para las valuaciones de diagnóstico es la transcriptasa inversa 'PCR (RT-PCR) . En la técnica de RT-PCR, el ARN se aisla a partir de una muestra biológica, se transcribe inversamente al ADNc, y el ADNc se incuba como cebador Zntr2 (ver, por ejemplo, Wu y colaboradores, (eds.), "Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR", en Methods in Gene Bi otechnol ogy, páginas 15-28 (CRC Press, Inc. 1997)). Luego el PCR se lleva a cabo y los productos se analizan utilizando técnicas convencionales. A manera de ilustración, el ARN se aisla a partir de las muestras biológicas utilizand, por ejemplo, el procedimiento de lisis celular de guanidinio-tiocianato descrito anteriormente. Alternativamente, una técnica en fase sólida se puede utilizar para aislar el ARNm de un lisado celular. Una reacción inversa de la transcripción puede cebarse con el ARN aislado utilizando oligonucleótidos aleatorios, homopolímeros cortos de dT, u oligómeros antise.ntido de Zntr2. Los cebadores Olig-dT ofrecen la ventaja que diversas secuencias de nucleótidos de ARNm se amplifican y puede proporcionar secuencias de control de objetivos. Las secuencias Zntr2 se amplifican mediante la reacción de cadena en polimerasa utilizando dos cebadores franqueadores de oligonucleótidos que son típicamente de veinte bases de longitud. Los productos de la amplificación PCR pueden detectarse utilizando una diversidad de métodos. Por ejemplo, los productos PCR pueden fraccionarse mediante una electroforesis en gel, visualizarse mediante una tinción por bromurl de etidio. Alternativamente, los productos fraccionados de PCR pueden transferirse a una membrana, hibridarse con una sonda Zntr2 detectablemente marcada, y examinarse mediante una auto-radiografía. Los métodos adicionales alternativos incluyen el uso de trifosfatos de ácido deoxirribonucleico marcados con digoxigenina para proporcionar una detección quimioluminiscente, y la valoración colorimétrica C-TRAK. Otro método para la detección de la expresión Zntr2 es la tecnología de ciclización de sondas, en donde un objetivo de ADN es monocatenario se aglutina a un exceso de una sonda quimérica ADN-ARN-ADN para formar un complejo, la porción ARN se desdobla con ARNasa H, y la presencia de una sonda quimérica es doblarse (ver, por ejemplo, Beggs y colaboradores, J. Clin . Mi crobi ol . 34 : 2 985 (1996), Bekkaoui y colaboradores, Bi otechni ques 20 : 240 (1996)). Métodos alternativos para la detección de las secuencias Zntr2 pueden utilizar métodos tales como amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos, la amplificación cooperativa de moldes mediante una hibridización cruzada, y la reacción en cadena de la ligasa (ver, por ejemplo, Márshall y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,686,272 (1997), Dyer y colaboradores, J. Vi rol . Methods 60 : 161 (1996), Ehricht y colaboradores, Eur. J. Bi ochem . 243 : 358 (199"7), y Chadwick y colaboradores, J. Virol . Methods 70 : 59 (1998)). Se conocen otros métodos convencionales por aquellos diestros en la técnica.

La sonda Zntr2 y los cebadores también pueden utilizarse para detectar y localizar la expresión del gen Sntr2 y las muestras de tejidos. Los métodos tales como la hibridización in si tu se conoce bien por aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Choo (ed.), In Si tu Hybridi za ti on Protocols (Humana Press, Inc. 1994), Wu y colaboradores, (eds.), "Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive Jn Situ Hybridization (RISH)", en Methods i n Gene Biotechnol ogy, páginas 259-278 (CRC Press, Inc. 1997), y Wu y colaboradores, (eds.), "Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Sí t u Hybridization (RISH)", en Methods in Gene Bi otechnol ogy, páginas 279-289 (CRC Press, Inc. 1997) ) . Diversos métodos adicionales de diagnóstico se conocen bien para aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Mathew (ed. ) , Protocols in Human Mol ecul ar Geneti cs (Humana Press, Inc. 1991), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnosti cs (Humana • Press, Inc. 1996), y Elles, Mol ecular Diagnosis of Geneti c Diseases (Humana Press, Inc., 1996) ) . Como se describe en el Ejemplo 3, el gen Zntr2 se ha localizado en el cromosoma humano 9q33. Esta región también está asociada con los genes ligados a una disautonomía doméstica, distrofia muscular de los miembros 2H, y el síndrome de la contractura congenital (Blumenfeld y colaboradores, Na ture Genet . 4:160 (1993); Makela-Bengs y colaboradores, Am . J. Hum . Genet . 61 (Suppl.): A30 (1997); Makela-Bengs y colaboradores, .Am . J. Hum . Gene t . 63 : 506 (1998); Weiler _ y colaboradores, Am . J. Hum . Genet . 63:140 (1998) ) . Las moléculas de ácidos nucleicos comprenden las secuencias de nucleótidos Zntr2 se pueden utilizar para determinar si los cromosomas del sujeto contienen una mutación en el gen Zntr2. Las aberraciones cromosómicas detectables en el locus del gen Zntr2 incluyen, pero no se limitan a, una aneuploidía, cambios en el número de copias de genes, inserciones, supresiones, cambios y reconfiguraciones en las secuencias de restricción. De un interés en particular son las alteraciones genéticas que inactivan el gen Zntr . Las aberraciones asociadas con el locus Zntr2 se pueden detectar utilizando las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención para emplear técnicas de genética molecular, tales como el análisis de longitud de fragmento por polimorfismo, análisis de repeticiones por tándem empleando técnicas PCR, análisis por un sistema de mutación de amplificación refractario, detección de polimorfismo de conformación monocatenaria, métodos de desdoblamiento por ARasa, electroforesis en gel por gradiente desnaturalizante, análisis de incompatibilidad y asistido por fluorescencia, y otras técnicas de análisis genéticos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Mol ecular Geneti cs (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Ches t 1 08 : 255 (1995), Coleman y Tsongalis, Mol ecular Diagnos ti cs (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Mol ecular Diagnosi s of Geneti c Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Labora tory Protocols for Muta ti on Detection (Oxford University Press 1996) , Birren y colaboradores, (eds.), Genome Analysi s , Vol . 2 : Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli y colaboradores, (eds.), Current Protocols in Human Geneti cs (John Wiley & Sons 1998), y Richards y Ward, "Molecular Diagncstic Testing", en Principi es of Molecul ar Medi cine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998) ) . El análisis de truncación de proteínas también es útil para detectar la inactivación de un gen en el cual las mutaciones terminadoras de la traducción producen solamente porciones de la proteína codificada (ver, por ejemplo, Stoppa-Lyonnet et al . , Bl ood 91 : 3920 (1998)). Según este método, el ARN es aislado a partir de una muestra biológica, y se utiliza para sintetizar ADNc. Después se utiliza el PCR para amplificar la secuencia objetivo del Zntr2 y para introducir un promotor de ARN polimerasa, una secuencia de inicio de la traducción, y un triplete de ATG dentro del cuadro de lectura. Los productos PCr se transfieren utilizando el ARN polimerasa, y los transcriptos que traducen in vi tro con un sistema de un lisado de reticulocitos copulados con T7. Los productos de la traducción luego se fraccionan mediante SDS-PAGE para determinar las longitudes de los productos de la traducción. El análisis de truncación de proteínas se describe, por ejemplo, por Dracopoli et al . (editores), Current Prctocols in Human Geneti cs, páginas 9.11.1-9.11.18 (John Wiley & Sons 1998) .

La presente invención también contempla los juegos de reactivos para llevar a cabo una valoración diagnóstica para la expresión génica de Zntr2 o para examinar el locus de Zntr2. Estos juegos de reactivos comprenden sondas de ácidos nucleicos, tales como las moléculas de ácidos nucleicos bicatenarias que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o fragmentos de estas, y como moléculas de ácidos nucleicos de una sola cadena que tienen el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de estas. Las sondas moleculares pueden ser de ADN, ARN, oligonucleótidss, y similares. Los juegos de reactivos pueden comprender cebadores de ácidos nucleicos para llevar a cabo el PCR. Este juego de reactivos puede contener todos los elementos necesarios para llevar a cabo una valoración diagnóstica de ácidos nucleicos descrita anteriormente. El juego de reactivos Zntr2. El juego de reactivos puede también comprender un segundo contenedor que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de las secuencias de Zntr2. Los ejemplos de estos reactivos indicadores incluyen los marcadores detectables tales co o- los marcadores radioactivos, fluorocromos, agentes quimioluminiscentes, y similares.

El juego de reactivos también puede comprender un medio para indicarle al usuario que las sondas y cebadores Zntr2 se utilizan para detectar la expresión del gen Zn tr2. Por ejemplo, las instrucciones escritas pueden indicar que las moléculas adjuntas de ácidos nucleicos pueden utilizarse para detectar ya sea una molécula de ácidos nucleicos que codifica para el Zntr2, o una molécula de ácidos nucleicos que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria que codifica a la secuencia de nucleótidos que codifica para el Zntr2. El material escrito puede aplicarse directamente al contenedor o el material escrito se puede proporcionar en forma de un inserto err-el empaque. 11. Uso de Anticuerpos Anti-Zntr2 para Detectar Polipéptidos Zntr2 la presente invención contempla el uso de los anticuerpos anti-Zntr2 para detectar muestras biológicas in vi tro para la presencia de Zntr2. En un tipo de valoración in vi tro, los anticuerpos anti-Zntr2 se utilizan en fase líquida. Por ejemplo, la presencia del Zntr2 en una muestra biológica puede analizarse al mezclar una muestra biológica con una cantidad traza del Zntr2 marcado y un anticuerpo anti-Zntr2 bajo condiciones que promueven la aglutinación entre el Zntr2 y su anticuerpo. Los complejos del Zntr2 y el anti-Zntr2 en la muestra pueden separarse de la mezcla de reacción al poner en contacto el complejo con una proteína inmovilizada que se aglutina con el anticuerpo, tal como un anticuerpo Fe o una Proteína A de Staphyl ococcus . La concentración del Zntr2 en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de Zntr2 marcado que se aglutina al anticuerpo y que se relaciona directamente a la cantidad del Zntr2 marcado y en forma libre. Alternativamente, las valoraciones in vi tre pueden llevarse a cabo en donde el anticuerpo anti-Zntr2 se aglutina a un portador de fase sólida. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a un polímero, tal como el amino'dextrano, a fin de ligar el anticuerpo a un soporte insoluble tal como un avalorio recubierto por polímero, una placa o un tubo. Otras valoraciones adecuadas in vi tro son fácilmente aparentes para-aquellos diestres en la técnica.

En otra modalidad, los anticuerpos anti-Zntr2 se pueden utilizar para detectar el Zntr2 en secciones de tejidos preparadas para un espécimen de biopsia. Esta detección in unoquímica puede utilizarse para determinar la abundancia relativa del Zntr2 y para determinar la distribución del Zntr2 en el tejido examinado. Las técnicas generales de inmunoquímica se encuentran bien establecidas (ver, por ejemplo, Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application", en Mammalian Devel opment : A Practi cal Approach , Monk (editor) páginas 115-138 (IRL Press 1987), Coligan en las páginas 5.7.1-5.8.8, Ausubel (1995) en las páginas 14.6.1 a 14.6.13 (Wiley Interscience 1990), y Manson (editor), Methods in Mol ecular Bi ology, Vol . 1 0 : Immunc chemi cal Prctcccls (The Humana Press, Inc. 1992) ) . La detección inmunoquímica puede llevarse a cabo al poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-Zntr2, y luego poner en contacto la muestra biológica con una molécula de un marcador detectable que se aglutina al anticuerpo, por ejemplo, la molécula marcada detectable puede comprender una porción de anticuerpo que se aglutina al anticuerpo anti-Zntr2 . Alternativamente, el anticuerpo anti-Zntr2 puede conjugarse con avidina/estreptavidina (o biotina) y la molécula marcada detectable puede comprender biotina (avidina/estreptavidina) . Diversas variaciones de esta técnica básica se conocen bien por aquellos diestros en la técnica. Alternativamente, el anticuerpo anti-Zntr2 puede conjugarse con un marcador detectable para formar el inmunoconj ugado anti-Zntr2. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente u oro coloidal. Los métodos para hacer y detectar estos inmunoconjugados marcados de forma detectable se conocen bien por aquellos de destreza ordinaria en la técnica, y se describen a mayor detalle a continuación.

El marcador detectable puede ser un radioisótopo que se detecta mediante una autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención son H, "" I, S, y '"C. Los inmunoconjugados anti-Zntr2 también pueden marcarse con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo fluorescentemente marcado se determina al exponer el inmunoconj ugado a una luz de la longitud de onda apropiada y detectar la fluorescencia resultante. Los compuestos marcadores fluorescentes incluyen el isotiocianato de fluoresceína, rhida ina, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o- ftaldehído y fluorescamina . Alternativamente, los inmunocanjugados anti-Zntr2 pueden marcarse de manera detectable al copular un componente de anticuerpo a un compuesto quimiouminiscente. La presencia del inmunoconjugado indicado por quimioluminiscencia se determina al detectar la presencia de la luminiscencia que se manifiesta durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de los compuestos marcadores quimioluminiscentes incluyen el luminol, isoluminol, éster aromático de acridinio, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato. De manera similar, un compuesto bioluminiscente puede utilizarse para marcar los inmunoconjugados anti- Zntr2 de la presente invención. La bioluniniscencia es un tipo de quimioluminiscencia hallada en los sistemas biológicos en donde la proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina al detectar la presencia de luminiscencia. Los compuestos biolu iniscentes que son útiles para marcar incluyen la luciferina, la luciferasa y la aqueorina. Alternativamente, los inmunoconjugados anti-Zntr2 pueden marcarse de manera detectable al ligar un componente de un anticuerpo anti-Zntr2 a una enzima. Cuando el conjugado enzima- anti-Zntr2 se incuba en presencia de un sustrato apropiado, la porción en?imática reacciona con el sustrato para producir una porción química que luego puede detectarse, por ejemplo, mediante medios especfrofotométricos, fluoro étricos o visuales. Los ejemplos de las enzimas que se pueden utilizar para marcar de manera detectable los inmunoconjugados poliespecíficos incluyen la ß-galactosidasa, la oxidasa de la glucosa, peroxidasa y fosfátasa alcalina. Aquellos de destreza en la técnica saben de otros marcadores adecuados que pueden emplearse de conformidad con la presente invención. La aglutinación de las porciones marcadas para los anticuerpos anti- Zntr2 puede lograrse _ al utilizar los métodos convencionales conocidos en la técnica. La metodología típica a este respecto se describe por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schurs et al., Clin.

Chim. Acta 81: 1 (1977, Shih et al., Int'l J. Cáncer 46: 1101 (1990), Stein et al., Cáncer Res. 50: 1330 (1990), y Coligan, supra. Más aún, la conveniencia y versatilidad de la detección inmunoquímica puede intensificarse al utilizar los anticuerpos anti-Zntr2 ue se han conjugado con avidina, estreptavidina, y biotina (ver, por ejemplo, Wilchek et al. (editores), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, vol. 184 (Academic Press 1990), y Bayer et al., " Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", en Methods Jn Molecular Biology, Vol. 10, Manson (editor), páginas 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992) . Los métodos para llevar a cabo los inmunoensayos se encuentran bien establecidos. Ver, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays" , en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering , and Clinical Application, Ritter y Ladyman (editcresX páginas 180-208, (Cambridge University ress, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology" , en Monoclonal Antibodies : Principi es and Applica ti ons, Birch y Lennox (editores) , páginas 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995) , y Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996) . En un método relacionado, el Zntr2 marcado con biotina o FITC, puede utilizarse para identificar células que se aglutinan al Zntr2. Esta aglutinación se puede detectar, por ejemplo, al utilizar una citometría de flujo. La presente invención también contempla los juegos de reactivos para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico inmunológico para la expresión del gen Zntr? . Estos juegos de reactivos comprenden por lo menos un contenedor que comprende un anticuerpo anti-Zntr2, o un fragmento del anticuerpo. Un juego de reactivas puede también comprender un segundo contenedor que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de del anticuerpo Zntr2 o fragmentos de anticuerpos. Los ejemplos de estos reactivos indicadores incluyen los marcadores detectables tales como un marcador -radioactivo, un • marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente, oro coloidal, y similares. El juego de reactivos también puede comprender un medio para indicarle al usuario que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de Zntr2 que se utilizan para detectar la proteína de Zntr2. Por ejemplo, las instrucciones escritas pueden indicar -que el anticuerpo adjunto o el fragmento de anticuerpo adjunto pueden utilizarse para detectar el Zntr2. El material escrito puede aplicarse directamente a un contenedor, o el material escrito puede proporcionarse en forma de un inserto en el empaque. 12. Usos Terapéuticos de los Polipéptidos que Tienen la Actividad de Zntr2 La presente invención incluye el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen una actividad de Zntr2 (tales como los polipéptidos Zntr2, anticuerpos anti-Zntr2 anti-idiotipo, y proteínas de fusión Zntr2) . La actividad del ligando endógeno Zntr2 puede inhibirse mediante la administración de polipéptidos que se aglutinan al ligando, tal como los polipéptidos del receptor soluble de Zntr2 o los anticuerpos anti- idiotipo Zntr2, o mediante la administración de polipéptidos que inhiben la aglutinación efectiva del ligado Zntr2 con el receptor cognado de Zntr2, tal como un anticuerpo que . se aglutina con el dominio extracelular de Zntr2. . A manera de ilustración, un polipéptido Zntr2 (por ejemplo, un receptor soluble de Zntr2) se usa para regular la proliferación celular del músculo liso vascular, para restaurar el funcionamiento normal neurológico después de un trauma, para tratar los desórdenes oculares, para tratar desórdenes hepáticos y renales, para promover el desarrollo de. los folículos pilosos, para estimular el crecimiento y diferenciación de diversas células epiteliales y epidérmicas in vi vo e i n vi tro, para el tratamiento de quemaduras, úlceras e incisiones en la córnea, para estimular la embriogénesis in vi tro . Los polipéptidos Zntr2 también pueden utilizarse para estimular la cicatrización de heridas ípor ejemplo, heridas cutáneas, heridas de la córnea, heridas a los órganos huecos recubiertss por epitelio en el cuerpo, etc.), que, por ejemplo, resultan de un trauma tal como heridas, abrasiones y cortaduras, o por procedimientos quirúrgicos, tales como incisiones quirúrgicas e injertos de piel, y similares . Generalmente, la dosis del polipéptido administrado, proteína o el péptido administrado varía dependiendo de factores tales como la edad del sujeto, peso, altura, sexo, condición médica general e historial médico previo. Típicamente, es deseable proporcionarle al receptor con una dosis de una molécula que tiene actividad de Zntr2 que se encuentra en la gama desde aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad el agente activo/peso corporal del sujeto), aunque también se puede administrar una dosis mayor o menor como vayan dictando las circunstancias. Los sujetos adecuados incluyen lo sujetos mamíferos, tales como los humanos. La administración de una molécula que tiene una actividad de Zntr2 a un sujeto puede ser intravenosa, intra-arterial, " intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, mediante perfusión a través de un catéter regional, o mediante una inyección directa intralesional . Cuando se administran las proteínas terapéuticas de la invención , la administración puede ser mediante una infusión continua o mediantes bolos únicos o múltiples. Una composición farmacéutica que comprende una proteína, polipéptido, o péptido que tiene actividad de Zntr2 se puede formular según los métodos conocidos para preparar las composiciones f rmacéuticamente útiles, mientras que las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "portador farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por el paciente receptor. La solución salina estéril amortiguada con fosfato es un ejemplo de un portador farmacéuticamente aceptable. Otros portadores adecuados se conocen bien por aquellos diestros en la técnica. Ver, por ejemplo, Gennaro (editor), Remington ' s Pharmaceu ti cal Sci ences , 19a edición (Mark Publishing Company 1995) . Para los propósitos de terapia, las moléculas que tienen actividad de Zntr. y un portador farmacéuticamente aceptable se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva. Una combinación de una proteína, polipéptido, o péptido que tiene actividad de Zntr2 y un portador farmacéuticamente aceptable se dice que se administra en una "cantidad terapéuticamente efectiva" si es que la cantidad que se administra es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia resulta en un cambio detectable en la fisiología del paciente receptor. Una composición farmacéutica que comprende moléculas que tienen actividad de Zntr2 se puede hacer en forma líquida, o en forma sólida. Las formas líquidas, incluyendo las formulaciones encapsuladas por liposo as, se ilustran mediante soluciones inyectables y de suspensiones orales. Las formas sólidas ejemplificantes incluyen cápsulas, tabletas, y formas de liberación controlada, tales como un implante o una bomba miniosmótica. Otras formas de dosificación pueden ingeniarse por aquellos diestros en la técnica, como se muestran, por ejemplo, por Ansel y Popovich, Pharmaceuti cal Dosage Forms and Drug Deli very Systems, 5a edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (editor), Remingtcn ' s Pharmaceuti cal Sci ences, 19a edición (Mack Publishing Company 1995), y por Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) .

A manera de ilustración, las composiciones farmacéuticas de Zntr2 pueden abastecerse a manera de un juego de reactivos que comprende un contenedor que comprende el Zntr2. El Zntr2 puede proporcionarse en forma de una solución inyectable para dosis únicas o múltiples, o a manera de un polvo estéril que se reconstituye antes de la inyección. Este juego de reactivos puede además comprender información escrita en las indicaciones de uso de la composición farmacéutica. Más aún, esta información puede incluir una indicación de que la composición de Zntr2 está contraindicada - en pacientes con hipersensibilidad conocida al Zntr2. 13. Usos Terapéuticos de las Secuencias de Nucleótidos del Zntr2 La presente invención incluye el uso de las secuencias de nucleótidos de Zntr2 para proporcionar pclipéptidos de Zntr2 a un sujeto en necesidad de este tratamiento. Además, un vector de expresión terapéutico puede proporcionarse el cual inhibe la expresión del- gen Zntr 2, tales como una molécula anti-sentido, un ribozima, o una molécula externa de secuencia guía. Existen diversos métodos para introducir el gen Zntr2 en el sujeto, incluyendo el uso de células hospederas recombinantes que expresan para el Zntr2, la administración de un ácido nucleico definido que codifica para el Zntr2 , el uso de un portador lipídico catiónico con una molécula de pacidos nucleicos que codifica para el Zntr2, y el uso de virus que expresan para el Zntr2, tales como los retrovirus recombinantes, virus adeno-asociados recombinantes, adenovirus recombinantes, y virus recombinantes del Herpes simplex [HSV] (ver, por ejemplo, Mulligan, Sci ence 260 : 926 (1993), Rosenberg et al . , Sci ence 242 : 1575 (1988), LaSalle et al . , Sci ence 259. 988 (1993), Wolff et al . , Science 247: 1465 (1990), Breakfield y Deluca, The New Bi ol ogi st 3 : 203 (1991) . En un método ex vivo, por ejemplo, las células se aislan de un sujeto, se transfectan con un vector que expresa para el gen de Jntr , y luego se trasplantan de nuevo en el sujeto. A fin de efectuar la expresión del gen Zn tr2, un vector de expresión se construye en el cual las secuencias de nucleótidos que codifican para el gen de Zntr2 se ligan de manera operable a un promotor nuclear, y un elemento regulatorio opcional, para controlar la transcripción génica. Los requerimientos generales para un vector de expresión se describen anteriormente. Alternativamente, el gen Zntr puede administrarse utilizando vectores virales recombinantes, incluyendo, por ejemplo, los vectores adenovíricos (por ejemplo, Kass-Eisler et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11498 (1993), Kolls et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91: 215 (1994), Li et al., Hum. Gene Ther. 4: 403 (1993), Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130 (1993), y Zabner et al., Cell 75: 207 (1993)), vectores víricos asociados a adenovirus (Flotte et al., Proc. Nat'l lcad. Sci. USA 90: 10613 (1993)), alfavirus tales como el Virus de Semliki Forest y Virus de Sindbis (Hertz y Huang, J. Vir. 66: 857 (1992), Raju y Huang, J. Vir. 65: 2501 (1991), y Xiong et al., Science 243: 1188 (1989)), vectores víricos de herpes (por ejemplo, iasPatentes de E. U. A. Nos. 4,769,331, 4,859,587 y 5,328,688), vectores de parvovirus (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5: 457 (1994)), vectores de virus de viruela (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193: 653 (1993), Panicali y Paoletti, Proc. Nat'l Acad.

Sci. USA 79: 4927 (1982)), virus de viruela tal como el virus de la viruela del canario o virus de vacuna (Fisher-Hoch et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 317 (1989), y Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86 (1989)), y retrovirus (por ejemplo, Baba et ai . , J.

Neurcsurg. 79: 729 (1993), Ram et al., Cáncer Res. 53: 83 (1993), Táka iya et ai., J. Neurosci. Res. 33: 493 (1992), Vile y Hart, Cáncer Res. 53: 962 (1993), Vile y Hart, Cáncer Res. 53: 3860 (1993), y Anderson et al. , con Patente de E. U. A. No. 5,399,346) . Dentro de diversas modalidades, ya sea el vector vírico en sí, o una partícula vírica que contiene el vector viral pueden utilizarse en los métodos y composiciones descritos a continuación. A manera de ilustración de un sistema, el adenovirus, un virus de ADN de cadena doble, es un vector de transferencia génica bien caracterizado para la ilustración de una molécula heteróloga de ácidos nucleicos (para un repaso, ver Becker et al., Meth. Ceil Bicl.. 43: 161 (1994); Douglas y Curiel, Science & Medicine 4: AA (1997)). El sistema adenovirus .ofrece varias ventajas que incluyen: (i) la habilidad de acomodar insertos de ADN relativamente grandes, (ii) la habilidad de cultivar a una alta circulación, (ii) la habilidad de infectar una amplia gama de tipos celulares de mamíferos, e incluso (iv) la habilidad de ser utilizado por varios promotores diferentes incluyendo los promotores regulares específicos de tejido y ubicuos. Además, los adenovirus se pueden administrar mediante una inyección intravenosa, debido a que los virus son estables en el flujo sanguíneo. Al utilizar los vectores de adenovirus en donde las porciones del genoma del adenovirus se suprimen, se incorporan los insertos en el ADN vírico mediante una ligación directa o mediante una recombinación homologa con un plásmido co-transfectado . En un sistema ejemplificante, el gen El esencial se suprime del vector vírico, y el virus no se replica a menos que el gen El sea proporcionado por la célula hospedera. Cuando se administra intravenosamente a animales intactos, los objetivos principales de adenovirus es el hígado. Aunque la administración adenovírica con una supresión del gen El no puede replicarse en las células hospederas, el tejido del hospedero expresa y procesa la proteína heteróloga codificada. Las células hospederas también secretan la proteína heteróloga y el gen correspondiente incluye una secuencia de señal secretoria. Las proteínas secretadas entran a la circulación del tejido que expresa para el gen heterólogo (por ejemplo, el hígado altamente vascuíarizado) . Más aún, los vectores adenovíricos contienen diversas supresiones de genes virales pueden utilizarse para reducir o eliminar las respuestas inmunes del vector. Estos adenovirus tienen El suprimido, y además, contienen supresiones de E2A ó E4 (Lusky et al . , J. Virol . 72 : 2022 (1998); Raper et al . , Human Gene Therapy 9 : 671 (1998)) . La supresión del E2b también se ha reportado que reduce las respuestas inmunes (A alfitano et al . , J. Virol . 72 : 926 (1998)). Al suprimir el genoma completo de adenovirus, se pueden acomodar .-insertos muy grandes de ADN heterólogo. La generación de los llamados "adenovirus cobardes", en donde todos los genes víricos que se suprimen, son particularmente ventajosos para la incersión de grandes insertos de AD? heterólogo (para un repaso, ver Yeh y Perricaudet, FASEB J. 11 : 615 (1997)).

Las Altas titulaciones de las variedades de virus recombinantes capaces de expresar para un gen terapéutico que pueden obtenerse de células infectadas de mamíferos utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, el HSV recombinante puede prepararse en células Vero, como se describe por Brandt et al., J. Gen. Virol. ~?2: 2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Virol. 75: 1211 (1994), Visalli y Brandt, Virology 185: 419 (1991), Grau et ~al . , Invest. Ophthalmol . Vis. Sci. 30: 2474 (1989), Brandt et al., J. Virol. Meth. 36: 209 (1992), y por Brown y MacLean (editores), HSV Virus Protccols (Humana Press. 1997). Alternativamente, un vector de expresión que comprende el gen Zntr2 se puede introducir en las células de un sujeto mediante lipofección in vivo utilizando liposomas. Los lípidos catiónicos sintéticos pueden utilizarse para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica para un marcador (Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 413 (1987); Mackey et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 8027 (1988)). El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tienen ciertas ventajas prácticas. Los liposomas pueden utilizarse para dirigir la transfección a tipos celulares en particular, lo cal es particularmente ventajoso en un tejido con la heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el "hígado, el riñon, y el cerebro. Los lípidos pueden copularse químicamente a otras moléculas para el propósito de la especificidad de objetivo. Los péptidos marcados como objetivo (por ejemplo, hormonas o neurotransmisores)., proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas se pueden copular a los liposomas de manera química. La electroporación es otro modo alternativo para la administración de las moléculas de ácidos nucleicos de Zntr2. Por ejemplo, Aihara y Miyazaki, Na t ure Bi ctechnol ogy 1 6: 867 (1998), han demostrado el uso de la electroporación in vi vo de la transferencia génica en el músculo. En un método alternativo para la terapia génica, un gen terapéutico puede codificar para un ARN antisentido de Zntr2 que inhibe la expresión de Zntr2. Las secuencias adecuadas para las moléculas anti-sentido de Zntr2 pueden derivarse de las secuencias de nucleótidos de Zntr2 descritas en la presente.

Alternativamente, un vector de expresión puede estructurarse en el cual un elemento regulatorio se liga de manera operable a una secuencia de nucleótidos que codifica para una ribozima. Las ribozimas pueden diseñarse para expresar una actividad de endonucleasa que se dirige a ciertas secuencias objetivo en una molécula de ARNm (ver, por ejemplo, Draper y Macejak, Patente de E. U. A. No. 5,496,698, McSwiggen, Patente de E. U. A. No. 5,525,468, Chowira y McSwiggen, Patente de E. U. A. No. 5,631,359, y Robertson y Goldberg, Patente de E. U. A. No. 5,225,337). En el contexto de la actual invención, las ribozimas que incluyen las secuencias de nucleótidos que se aglutinan con el ARNm del Zntr2. En otro método, los vectores de expresión pueden estructurarse en los cuales los elementos regulatorios dirigen la producción de la producción de los transcriptos de ARN capaces de promover el desdoblamiento mediado por ARNasa P que codifica para el gen Zntr2. Según este método, una secuencia guía exterior puede estructurarse para dirigir a la ribozima endógena, ARNasa P, a una especie particular de ARNm intracelular, que se desdobla subsecuentemente por la ribozima celular (ver, por ejemplo, Altman et al . , Patente de E. U. A. No. 5,168,053, Yuan et al . , Sci ence 263 : 1269 (1994), Pace et al . , Publicación Internacional No. WO 96/18*733, George et al . , Publicación Internacional No. WO 96/21731, y Werner et al . , Publicación Internacional No. WO 97/33991).

Preferiblemente, la secuencia guía exterior comprende una secuencia de diez a quince nucleótidos complementaria al ARNm de Zntr2, y una secuencia de nucleótidos 3'-NCCA, en donde N es de preferencia una purina. Los transcriptos de la secuencia guía exterior se aglutinan a las especies específicas como objetivo del ARNm para la formación de pares de bases entre el ARNm y las secuencias guía exteriores complementarias, y de esta forma se promueve el desdoblamiento del ARNm mediante la ARNasa P en el nucleótido localizado en el extremo 5' de la región de pares de bases. En general, la dosis de una composición que comprende un vector terapéutico que tiene una secuencia de ácidos nucleicos de Zntr2, tal como un virus recombinante, varía dependiendo de tales factores como la edad del sujeto, peso, altura, sexo, condición médica general e historial médico previo. Las rutas adecuadas de administración de los vectores terapéuticos incluyen la inyección intravenosa, inyección intraarterial, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección intratu oral, e inyección dentro de una cavidad que contiene un tumor.

La composición que comprende vectores víricos, vectores no víricos, o la composición de vectores víricos y no víricos de la presente invención se puede formular de acuerdo a los métodos ya conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en donde los vectores o virus se combinan en una mezcla común preparada farmacéuticamente aceptable. Como se indica anteriormente, una composición, tales como una solución salina amortiguada por fosfatos se dice que es un "portador farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un sujeto receptor. Otros portadores adecuados se conocen bien por aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Remington ' s Pharmaceuti cal Sci ences, 19th Ed. (Mack Publishing Co . 1995), y Gliman ' s the Pharmacol ogical Basis of Therapeuti cs, 7" Ed. (MacMillan Publishing Co .

Para los propósitos de terapia, un vector de expresión de un gen terapéutico, o un virus recombinante que comprende este vector, y un vector farmacéuticamente aceptable es administrado a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva. Una combinación de un vector de expresión (o virus) y un portador farmacéuticamente aceptable se dice que se administra en una "cantidad terapéuticamente efectiva" si esta cantidad que se administrado es fisiológicamente significativa. Una agente es fisiológicamente significativo si su presencia resulta de un cambio detectable en la fisiología del sujeto receptor. Cuando el sujeto se mantiene en tratamiento con un vector de expresión un gen terapéutico o un virus recombinante es un humano, entonces la terapia preferiblemente es una terapia génica o células somáticas. Esto es, el tratamiento preferido de un humano con un vector de expresión de un gen terapéutico o un virus recombinante no incluye introducir a las células una molécula de ácidos nucleicos que pueda formar parte de la línea germinal de un humano y ser pasadas en generaciones sucesivas (es decir, una terapia génica de la línea terminal germinal de humano) . 14. Producción de Ratones Transgénicos Los ratones transgénicos pueden manipularse genéticamente para que sobre-exprese el gen Zntr2 en todos los tejidos o bajo el control de un elemento regulatorio específico de tejido o preferido por el tejido. Estos sobreproductores en Zntr2 puede utilizarse para caracterizar al genotipo que resulta de la sobre-expresión, los animales transgénicos pueden servir como modelos para las enfermedades humanas causadas por un exceso de Zntr2. Los ratones transgénicos que sobre-expresan el. Zntr2 también proporcionan bio-reactores modelo para la producción del Zntr2, tales como el Zntr2 soluble, en la leche o en la sangre de animales más grandes. Los métodos para producir ratones transgénicos conocidos por aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", en Overexpressi on and Knockout of Cytokines in Transgeni c Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky y Robl (eds.), Strategi es in Transgeni c Animal Science (ASM Press 1995) , y Abbud y Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", en Gene Expressi on Systems : Using Nature for the Art of Expression, Fernández y Hoeffler (eds.), páginas 367-397 (Academic Press, Inc. 1999) ) . Por ejemplo, un método para producir un ratón transgénico que expresa para el gen Zntr2 puede comenzar con machos adultos y fértiles (sementales) (B6C3fl, de 2- meses de edad (Taconic Farms, Germantown, NY) ) , machos vasectomizados (inservibles) (B6D2fl, de 2-8 meses, (Taconic Farms)), hembras fértiles prepubescentes (donantes) (B6C3fl, de 4-5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras adultas fértiles (receptores) (B6D2fl, de 2-4 meses, (Taconic Farms)). Los donantes, se aclimatan durante una semana y luego se inyectan aproximadamente 8 IU/ratón de gonadotropina Sérica de Yegua Preñada (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) I.P., y 46-47 horas después, 8 IU/ratón de Gonadotropina Corónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para inducir la superovulación. Los donantes se cruzan con los sementales subsecuente a las inyecciones de hormonas. La ovulación generalmente ocurre dentro de 13 horas de una inyección hCG. La copulación se confirma mediante la presencia de un tapón vaginal a la mañana siguiente de la copulación. Los huevos fertilizados se colectan bajo un ámbito quirúrgico. Los oviductos se recolectan y los huevos se liberan en portaobjetos de urinanálisis que contienen hialuronidasa (Sigma) . Los huevos se lavan una vez en hialuronidasa, y dos veces en un medio Whitten' s W640 (descrito, por ejemplo, Menino y O' Clay, Biol . Repord. 77 : 159 (1986), y Dienhart y Downs, Zygote 4 : 129 (1996)) que han sido incubados con 51 CO, 51 o , y 901 N, a 37°C. Luego los huevos se almacenan en una incubadora a 37°C/5* CO, hasta el momento de la microinyección. Se linearizan de diez a veinte microgramos de ADN plásmido que contiene una secuencia purificadora para Zntr2, se purifican en gel, y se vuelven a suspender en 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.25 mM EDTA (pH 8.0), a una concentración final de 5-10 nanogramos o icrolitro para la microinyección. Por ejemplo, las secuencias purificadoras para el Zntr2 pueden codificar por un polipéptido que comprende los residuos 31 a 507 de los mino ácidos de SEQ ID NO: 2.

El ADN plásmido se microinyecta en los huevos cultivados contenidos en una gota de medio W640 sobrepuestos en aceite mineral tibio, equilibrado con CO.. El ADN se extrae en una aguja de inyección (que se jala de un capilar de vidrio de borosilicato 0.75mm ID, lmm OD) , y se inyectan en los huevos individuales. Cada huevo se penetra con la aguja de inyección, en uno o ambos de los pronúcleos haploides. Los picolitros de ADN se inyectan en el pronúcleo, y la aguja de inyección se extrae sin ponerse en contacto con los nucléolos. El procedimiento se repite hasta que todos los huevos se inyectan. Los huevos exitosamente microinyectados se transfieren en una caja de petri para el cultivo de tejidos de órganos por un medio W640 pregasificado para su almacenamiento durante la noche en una incubadora a 37°C/5., C0_. Al día siguiente, se transfieren los embriones de dos células en receptoras pseudopreñadas . Las receptoras se identifican por la presencia de tapones de copulación, después de copular con machos vasectomizados . Las receptoras se anestesian y se rasuran en el lado izquierdo dorsal y se transfieren al microscopio quirúrgico. Se hace una pequeña incisión en la piel y atrás de la pared del músculo de la parte media del área abdominal, indicada por la caja torácica, el punto de ensilladura y la pierna posterior, a la mitad entre la rodilla y el bazo. Los órganos reproductores se exteriorizan en un pequeño campo quirúrgico. La almohadilla de grasa se estira sobre .el campo quirúrgico, y la serrefina de bebé (Roboz, Rockville, MD) se adhiere a la almohadilla de grasa y se deja colgando en la parte posterior del botón, el que previene que los órganos se regresan hacia adentro . Con una pipeta de transferencia fina que contiene aceite mineral seguido de una alternación con W640 y burbujas de aire, 12-17 embriones sanos de dos células de la elección previa del día anterior se transfieren en las receptoras. El ámpula hinchada se localiza y se sostiene el oviducto entre el ámpula y la bursa, una mezcla en el oviducto se hace con una aguja de calibre 28 g cerca de la bursa, asegurándose de no rasgar el ámpula o la bursa. La pipeta se transfiere en la muesca dentro del oviducto, y los embriones s soplan hacia adentro, permitiendo que la primera burbuja de aire se escape de la pipeta. La almohadilla de grasa se empuja gentilmente en el peritoneo, y los órganos reproductores se les permite deslizarse hacia adentro. La pared peritoneal se cierra con una sutura y la piel se cierra con un sujetador de heridas. Los ratones se recuperan en un calefactor deslizable hacia 37°C durante un mínimo de cuatro horas . Las receptoras se regresan a sus jaulas por pares, se les permite una gestación de. 19-21 días. Después del nacimiento, 19-21 días postparto se permite antes de el destete. Los ratones destetados se sexan y se colocan en jaulas sexadas por separado, y una biopsia de 0.5 cm (utilizada para la genotipificación) se recorta de la cola con tijeras limpias. El ADN genómico se prepara de los recortes de colas utilizando, por ejemplo, un juego de reactivos QIAGEN DINEASY siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico se analiza mediante PCR utilizando sedadores designados para amplificar el gen Zntr2 o un gel con marcador seleccionable que se introduce en el mismo plásmido. Después de que se confirma que los animales son transgénicos, se entrecruzan en una ceta consanguínea al colocar una hembra transgénica con un ratón tipo silvestre, o un ratón transgénico con una o dos hembras tipo silvestre.

Mientras que los ratoncitos nacen y se destetan, los sexos se separan, y sus colas se recortan para la genotipificación. Para verificar la expresión de un transgén en un animal vivo, se lleva a cabo una hepatocto ía parcial. Una preparación quirúrgica se hace en el abdomen superior directamente por debajo del proceso zipoideo. Al utilizar la técnica estéril, se hace una incisión pequeña de 1.5-2 cm por debajo del esternón y en lóbulo lateral izquierdo del hígado exteriorizado. Al utilizar un hilo de seda 4-0, se hace un nudo alrededor del lóbulo inferior asegurándose fuera de la cavidad corporal. Se utiliza una abrazadera atraumática para sostener el nudo mientras que un segundo lazo de Dexon absorbible (American Cyanamid; Wayne, N.J.) se coloca próximo al primer nudo. Se hace un corte distal del nudo con Dexon y aproximadamente 100 mg del tejido extirpado de vida se coloca en una caja de petri. La sección extirpada del hígado se transfiere a un tubo de polipropileno de 14 ml de forma redonda y se congela rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacena en hielo seco. El sitio quirúrgico se cierra con una sutura y abrazaderas para heridas, y la jaula del animal se coloca en una almohadilla calefactora a 37 °C durante 24 horas después de la operación. El animal se verifica diario después de la operación y se retiran las abrazaderas de heridas 7-10 días después de la cirugía. El nivel de expresión de ARNm del Zntr2 se examina para cada ratón transgénico utilizando una valoración de solución para la hibridación de ARN o una reacción en cadena para la poligrasa. Además de producir ratones _ transgénicos que sobre-expresan al Zntr2, es útil manipular ratones transgénicos ya sean con una expresión anormalmente baja o sin expresión del gen. Estos ratones transgénicos proporcionan modelos útiles para enfermedades asociadas con la carencia del Zntr2. Como se discute anteriormente, la expresión del gen Zntr2 puede inhibirse utilizando genes anti-sentido, genes de ribozimas, o genes de secuencia guía exterior. Para producir ratones transgénicos que sub-expresan al gen Zntr2, al como las secuencias inhibitorias se dirigen hacia el AR?m del Zntr2. Los métodos para producir ratones transgénicos que tienen una expresión anormalmente baja de un gen en particular se conoce por aquellos diestros en la técnica (ver, por ejemplo, Wu et al, "Gene Underexpression in Cultured Cells and Animáis by Antisense DNA and RNA Strategies", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 205-224 (CRC Press 1997) ) . Un método alternativo para producir ratones transgénicos que tienen poca o ninguna expresión del gen Zntr2 es generar ratones que tienen por lo menos un alelo normal del Zntr2 reemplazado por un gen Zntr2 no funcional. Un método para diseñar un gen Zntr2 no funcional es insertar otro gen, tal como un gen de un marcador seleccionado, dentro de una molécula de ácido nucleico que codifica. al Zntr2. Los métodos convencionales ara producir s llamados "ratones desprovistos de una cualidad" se conoce por aquellos diestros en la técnica (ver, como por ejemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgeni c Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), y Wu et al-, "New Strategies for Gene Knockout", en Methods in Gene Biotechnol ogy, páginas 339-365 (CRC Press 1997)). La presente invención, que se describe generalmente así, se ha de entender más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, como se proporcionan a manera de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención. EJEMPLO 1 Estructuración de Una Molécula de Ácidos Nucleicos que Codifica para Zntr2 Un "clon de longitud completa de Zntr2 se obtiene al detectar una gensteca homogénea en cerebro fetal, que contiene 80 grupos de 12,000 colonias cada uno, como un indicador expresa la secuencia (EST) . Veinte picomoles de cada uno de los sedadores de oligonucleótidos ZC18, 638* (5' CTC TGT GGT TGG AAG CCT GAA TGT G3'; SEQ ID NO : 4 ) y ZC18,639 (5' AGC CCT CTT TGC AGG TTT CAC AGT G 3'; SEQ ID NO: 5) y 5 µls de cada grupo se utilizan en cada reacción. Las condiciones que se utilizan son como siguen: 94 °C durante 1 minuto, luego se hace correr por 30 ciclos de 94°C, durante 20 segundos; 68°C, durante 1 minuto; y terminan con una incubación de 7 minutos a 72 °C. Hubieron tres fuertes positivos y cuatro débiles positivos. Los tres positivos fuertes siguieron al siguiente nivel (nivel de transferencia en plata) . Doce grupos que contienen 1,000 clones cada unp se coloca una placa de trabajo y se detectan mediante PCR como antes. Cada uno de los tres positivos que trabajan en plata tienen un positivo en el nivel correspondiente de la placa de transferencia. El grupo Hll se analiza aún más. El grupo Hll se colocan placas y se obtienen los activados por filtro con filtros HYBOND-N (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Inc, ; Piscataway, NJ) . Los filtros se marcan para su orientación con uno caliente, se desnaturaliza en 0.5 M NaOH y 1.5 M Tris-HCL (pH 7.2) durante 10 minutos y luego se neutralizan en 1^5 M NaCl y 0.5 M Tris-HCL (pH 7.2) durante 10 minutos. El ADN se fija al filtro utilizando un agente de entrecruzamiento STRATALINKER UV (STRATAGENE, La Jolla, CA) a 1200 joules y _ se prelavan a 65°C en un amortiguador prelavado que consiste de 0.25 X SSC, 0.251 SDS y 1 mM EDTA, se cambia la solución tres veces durante un total de 45 minutos para retirar todos los restos celulares. Los activados se prehibridizan durante la noche a 65°C en lOmls en una Solución de Hibridación EXPRESSHY (Clontech, Palo Alto, CA) se mezcla con un mg de ADN de esperma de salmón, que se ha hervido durante 5 minutos, y luego se almacenan sobre hielo durante un minuto. Las sondas se generan mediante una reamplificación del fragmenteo PCR subclonado como se describe a continuación con los sedadores ZC14,064 (5' CTC CAG AGT ATG TAT GTA ACT GC 3': SEQ ID NO: 69 y ZC14,065 (5' CAC ATG GCT GAC AGA CCC ACÁ 3'; SEQ ID NO : 7 ) . El producto PCR se fracciona mediante electroforesis en gel 1.51 TBE, el fragmento se extirpa con una navaja de rasurar, y el ADN se extrae de la agarosa con un Juego de Reactivos del Gel de Extracción. QIAquick (QIAGEN, Chatsworth, CA) . Quince nanogramos del fragmento Zntr2 se marcan con 32p utilizando el juego de reactivos de marcado REDIPRIMEII (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Inc.). La radioactividad no incorporada se retira mediante una cromotografía por columna utilizando una columna de empuje comercialmente disponible (columna NUCTRAP; STRATAGENE, La Jolla, CA) . La sonda radiomarcada (8 x 10' cpms) y 1 mg de ADN de esperma de salmón se hierven durante 5 minutos, se enfrían en nielo durante 1 minuto, se mezclan con 8 mis de una solución de hibridación EXPRESSHYB y se agregan a los activados del filtro. La hibridación se llevó a cabo toda la noche a 65°C. Los activados en la solución de prelavado hasta que la radioactividad sea por debajo de 200 cpm. Las transferencias en manchas se exponen en película durante la noche a -80°C. Uno de los productos positivos se somete a una secuencia, y se hallará que contiene una cadena de secuencia completa con 1,805 pares de bases de un marco de lectura abierto. EJEMPLO 2 Expresión del Gen Zntr2 Los análisis de transferencia Northern se llevan a cabo al utilizar las Transferencias en Mancha I, II y III, de Tejido Múltiple de Humano y una Transferencia en Mancha Maestra de ARN Humano (CLONTECH Laboratories, Inc.; Palo Alto, CA) para determinar la distribución del tejido del Zntr2. Un fragmento PCR subclonado de 187 pares de bases que se ha subclonado en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carisbad, CA) fue utilizado como la sonda. El fragmento PCR se ha generado utilizado 20 pms en cada uno de los sedadores ZG14, 064 y ZG14,065 y 5 µls de la genoteca maratón de DNAc del útero que se prepara del ARN de útero utilizando el Juego de Reactivos de Amplificación de ADNc Marathón (CLONTECH) . Las condiciones de reacción son como siguen: la desnaturalización inicial a 94°C durante 1 minuto, seguido por 5 ciclos de 94°C, durante 20 segundos; 59°C, 30 segundos, 72°C, 30 segundos, seguido por 30 ciclos de 94°C, 20 segundos; 55°C, 30 segundos; 72°C, segundos y luego una extensión final durante 7 minutos a 72°C. Debido al bajo nivel del material, la reamplíficación fue efectuada para subclonar en las siguientes condiciones con 2 µls de la primera reacción: denaturalización inicial de 94°C seguido por 25 ciclos de 94°C, 20 segundos; 59°C, 30 segundos; 72°C, 30 segundos y luego una extensión final a 72°C durante 7 minutos. Cien nanogramos de este framento subclonado se marca con 32p utilizando el Sistema de Mareaje de ADN MULTIPRIME (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Inc.). La radioactividad no incorporada se retira mediante una cromatografía utilizando una columna de empuje comercialmente disponible con (columna NUCTRAP; STRATAGENE) . Las transferencias en manchas de prehibridizan durante tres horas a 65°C en una solución de hibridación (Solución de Hibridación EXPRESSHYB; CLONTECH) que contiene 1 mg de ADN del esperma de salmón que se ha hervido durante 5 minutos, luego se almacena en hielo durante un minuto. La sonda radiomarcada (7 x 10' cpm) y 1 mg de AD? de esperma de salmón se hirvió durante 1 minuto, se almacenan en hielo durante 1 minuto, se mezcla con 7 mis de la misma solución de EXPRESSHYB, y luego se agregan a las manchas mencionadas anteriormente. La hibridación se lleva a cabo durante la noche a 65°C. Las transferencias de manchas se lavan en 2 x SSC, 0.11- SDS a temperatura ambiente durante 40 minutos con varios cambios en la solución, seguida por 40 minutos de lavado a 50 °C en 0.1 x SSC, 0.11 SDS con un cambio de solución. Después de una exposición durante la noche a -80°C, las transferencias de manchas se lavan adicionalmente en 0.1 x SSC, 0.11 SDS a 60°C para retirar los restos generales, y la exposición durante la noche se repite. Hubieron dos tamaños de transcriptos de aproximadamente 3.4 kilobases y 6.5 kilobases. Hubo una fuerte expresión del transcripto de 3.4 kilobases en los leucocitos de sangre periférica y una expresión más débil en la médula espinal, la médula ósea, el bazo, los testículos, el ovario y el colon. Cada tejido muestra una expresión del transcripto mayor igual excepto el timo con la expresión más fuerte en el cerebro, bazo, leucocitos de sangre periférica y médula espinal. La Transferencia en Mancha Maestra del ARN en el muestra la fuerte expresión en el cerebro de fetos . EJEMPLO 3 Localización Cromosómica del Gen Zntr2 El Zntr2 se cartografía al cromosoma 9 utilizando la versión. comercialmente disponible del "Standford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel" (Research Genetics, Inc. Huntsville, AL) . Standford G3 RH Panel contiene moléculas amplificables de AD? de cada uno de los 83 clones híbridos de radiación del genoma humano completo, más dos AD?s testigos (el donante RM y el receptor A3) . Un servidor de WWW (http: //shgc-www.stanford.edu) permite la localización cromosómica de los marcadores. El cartografeo del Zntr2 con el Stanford G3 RH Panel, fracciones de 20 µl se ponen en una placa de microtitulación de 96 pocilios en donde puede hacerse un PCR (STRATAGE?E, La Jolla, CA) se utilizan en un ciclizador térmico "RoboCycler Gradiente96" (STRATAGENE) . Cada una de las 85 reacciones PCR consisten de 2 µl lOx KlanTaq de amortiguador de reacción PCR (CLONTECH Laboratories, le, Palo Alto, CA) , 1.6 µl dNTPs una mezcla (2.5 mM cada una, PERKIN- ELMER, Forest City, CA) , 1 µl de cebador homosentido, ZC 21,097 (5' CCC GAG AGT GGT GAG TGC 3'; SEQ ID NO : 8 ) , Iµ de cebador antisentido, ZC 21,098 (5' CTC GAG GTC AAC ATA 3'; SEQ ID NO : 9 ) , 2 µl "RediLoad" (Research Genetics, Inc. Huntsville, AL), 0.4 µl 50x Advantage KlenTaq de Mezcla de Polimerasa (CLONTECH) , 25 ng de ADN a partir de un híbrido individual o un testigo ddH20 con un volumen total de 20 µl . Las reacciones pueden cubrirse con una cantidad igual de aceite mineral y sellado. Las condiciones del ciclo PCR fueron las siguientes: un ciclo inicial de 5 minutos de desnaturalización a 94°C, 35 ciclos de 45 segundos de desnaturalización a 94 °C, 45 segundos de fijación a 64 °C y 1 minuto, y 15 segundos de extensión a 72 °C, luego de una extensión final de 1 ciclo de 7 minutos a 72°C. Las reacciones se separan de la electroforesis en un gel agarosa al 21 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Los resultados mostraron un enlace con el Zntr2 al marcador del marco de lectura SHGC-52622 con una puntuación LOD de >10 y a una distancia de 12 cR_10000 desde el marcador. El uso de los marcadores circundantes y las posiciones Zntr2 en la región 9q33-q34en el mapa 9 del cromosoma LDB integrado (The Genetic Location Datábase, University of Southhampton, servidor WWW: hctp: //ced r .genecics . sce on.ac.uk/pubiic html/) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para la solicitante, para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> ZymoGenetics. Inc. y, r POLIPEPTIDO DE HUMANO PROVISTO DE MÚLTIPLES DOMINIOS SIMILARES AL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGF), ZNTR2 <130> 98-63PC <160> 10 <170> FastSEQ para Windows versión 3.o <210> 1 <211> 2687 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (103)... (1908) <400> 1 ggcgatggtg cgcccggtgg cggtggcggc ggcggttgcg gaggcttcct tggtcggatt 60 gcaacgagga gaagatgact gaccaaccga ctggctgaat ga atg aat ggc gga 114 Met Asn Gly Gly 1 gcc gag cgc gcc atg agg age ctg ccg age ctg ggc ggc etc gcc ctg 162 Ala Glu Arg Ala Met Apg Ser Leu Pro Ser Leu Gly Gly Leu Ala Leu 5 10 15 20 ttg tgc tgc gcc gcc gcc gcc gcc gcc gcc gcc gtc gcc tea gcc gcc 210 Leu Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Ala Ala 25 . 30 35 teg gcg ggg aat gtc acc ggt ggc ggc ggg gcc gcg ggg cag gtg gac 258 Ser Ala Gly Asn Val Thr Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gln Val Asp 40 45 50 gcg teg ccg ggc ecc ggg ttg cgg ggc gag ecc age cae ecc ttc ect 306 Ala Ser Pro Gly Pro Gly Leu Arg Gly Glu Pro Ser His Pro Phe Pro 55 60 65 agg gcg acg gct ecc acg gcc cag gcc ccg agg acc ggg ecc ccg cgc 354 Arg Ala Thr Ala Pro Thr Ala Gln Ala Pro Arg Thr Gly Pro Pro Arg 70 75 80 gcc acc gtc cae cga ecc ctg gct gcg act tet cca gcc cag tec ccg 402 Ala Thr Val His Arg Pro Leu Ala Ala Thr Ser Pro Ala Gln Ser Pro 85 ' 90 95 100 gag acc acc ect ctt tgg gcg act gct gga ecc tet tec acc acc ttt 450 Glu Thr Thr Pro Leu Trp Ala Thr Ala Gly Pro Ser Ser Thr Thr Phe 105 110 115 cag gcg ccg etc ggc ecc teg ccg acc acc ect ccg gcg gcg gaa cgc 498 Gln Ala Pro Leu Gly Pro Ser Pro Thr Thr Pro Pro Ala Ala Glu Arg 120 125 130 act teg acc acc tet cag gcg ccg acc aga ecc gcg ccg acc acc ctt 546 Thr Ser Thr Thr Ser Gln Ala Pro Thr Arg Pro Ala Pro Thr Thr Leu 135 140 145 teg acg acc act ggc ccg gcg ccg acc acc ect gta gcg acc acc gta 594 Ser Thr Thr Thr Gly Pro Ala Pro Thr Thr Pro Val Ala Thr Thr Val 150 155 160 ccg gcg ecc acg act ecc cgg acc ccg acc ecc gat etc ecc age age 642 Pro Ala Pro Thr Thr Pro Arg Thr Pro T r Pro Asp Leu Pro Ser Ser 165 170 175 180 15 age aac age age gtc etc ecc acc cca ect gcc acc gag gcc ecc tet 690 Ser Asn Ser Ser Val Leu Pro Thr Pro Pro Ala Thr Glu Ala Pro Ser 185 190 195 teg ect ect cca gag tat gta tgt aac tgc tet gtg gtt gga age ctg 738 Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Val Cys Asn Cys Ser Val Val Gly Ser Leu 200 205 210 aat gtg aat cgc tgc aac cag acc acá ggg cag tgt gag tgt cgg cca 786 Asn Val Asn Arg Cys Asn Gln Thr Thr Gly Gln Cys Glu Cys Arg Pro 215 220 225 ggt tat cag ggg ctt cae tgt gaa acc tgc aaa gag ggc ttt tac cta 834 Gly Tyr Gln Gly Leu His Cys Glu Thr Cys Lys Glu Gly Phe Tyr Leu 230 235 240 aat tac act tet ggg etc tgt cag cca tgt gac tgt agt cca cat gga 882 Asn Tyr Thr Ser 61y Leu Cys 61n Pro Cys Asp Cys Ser Pro His 61y 245 250 255 260 gct etc age ata ccg tgc aac agt tet ggg aaa tgc cag tgc aaa gtg 930 Ala Leu Ser He Pro Cys Asn Ser Ser Gly Lys Cys Gln Cys Lys Val 265 270 275 ggt gtc att ggc tet ata tgt gac cga tgc caá gat gga tat tat ggc 978 Gly Val He Gly Ser He Cys Asp Arg Cys Gln Asp Gly Tyr Tyr Gly 280 285 290 ttt agt aag aat ggc tgc ttg ecc tgc caá tgc aat aat cgg tet gcc 1026 Phe Ser Lys Asn Gly Cys Leu Pro Cys Gln Cys Asn Asn Arg Ser Ala 295 300 305 agt tgc gat gcc etc acá ggt gct tgt tta aac tgc cag gaa aat age 1074 Ser Cys Asp Ala Leu Thr Gly Ala Cys Leu Asn Cys Gln Glu Asn Ser 310 315 320 aaa gga aat cae tgt gaa gaa tgt aaa gaa gga ttt tat cag agt ect 1122 Lys Gly Asn His Cys Glu Glu Cys Lys Glu Gly Phe Tyr Gln Ser Pro 325 330 335 340 gat gcc act aaa gaa tgt ctt cgc tgc ect tgt tea gca gtg acá tet 1170 Asp Ala Thr Lys Glu Cys Leu Arg Cys Pro Cys Ser Ala Val Thr Ser 345 350 355 acá ggc age tgc tet ata aaa teg agt gaa ttg gaa ect gaa tgt gac 1218 Thr Gly Ser Cys Ser He Lys Ser Ser Glu Leu Glu Pro Glu Cys Asp 360 365 370 cag tgt aaa gat ggt tac ata ggc ccg aac tgc aat aaa tgt gaa aat 1266 Gln Cys Lys Asp Gly Tyr lie Gly Pro Asn Cys Asn Lys Cys Glu Asn 375 380 385 ggc tat tac aat ttt gac age ate tgt aga aag tgc caá tgt cae ggc 1314 Gly Tyr Tyr Asn Phe Asp Ser He Cys Arg Lys Cys Gln Cys His Gly 390 395 400 cat gtg gac cca gtt aaa act cca aag att tgt aag ecc gag agt ggt 1362 His Val Asp Pro Val Lys Thr Pro Lys He Cys Lys Pro Glu Ser Gly 405 410 415 420 gag tgc ate aac tgc etc cat aac acc act ggg ttt tgg tgt gag aac 1410 Glu Cys lie Asn Cys Leu His Asn Thr Thr Gly Phe Trp Cys Glu Asn 425 430 435 tgc cta gaa ggt tat gtt cae gac etc gag gga aat tgc ate aag aaa 1458 Cys Leu Glu Gly Tyr Val His Asp Leu Glu Gly Asn Cys He Lys Lys 440 445 450 gaa gtt att ctt cca acá ect gaa ggt tet acc att ttg gtt tec aat 1506 Glu Val He Leu Pro Thr Pro Glu Gly Ser Thr He Leu Val Ser Asn 455 460 465 gcc tet ttg acc acá tea gtg ecc acc ect gtt ata aat agt act ttt 1554 Ala Ser Leu Thr Thr Ser Val Pro Thr Pro Val He Asn Ser Thr Phe 470 475 480 acc ect acá acc ctg cag act ate ttt tea gta age act tet gaa aac 1602 Thr Pro Thr Thr Leu Gln Thr He Phe Ser Val Ser Thr Ser Glu Asn 485 490 495 500 age act tea gct tta gct gat gta tea tgg acc caá ttt aac ate ate 1650 Ser Thr Ser Ala Leu Ala Asp Val Ser Trp Thr Gln Phe Asn He He 505 510 515 att ttg acá gtc ate ate att gtt gtg gtg ctg cta atg gga ttt gtg 1698 He Leu Thr Val He He He Val Val Val Leu Leu Met Gly Phe Val 520 525 530 ggg gct gta tat atg tac cgc gag tac caá aac cgg aaa etc aat gcc 1746 Gly Ala Val Tyr Met Tyr Arg Glu Tyr Gln Asn Arg Lys Leu Asn Ala 535 - 540 545 ecc ttt tgg acc ate gag ctg aaa gaa gac aat ate agt ttc age age 1794 Pro Phe Trp Thr He Glu Leu Lys Glu Asp Asn He Ser Phe Ser Ser 550 555 560 tac cat gac age att ecc aat gca gat gtt teg gga ttg ttg gaa gat 1842 Tyr His Asp Ser He Pro Asn Ala Asp Val Ser Gly Leu Leu Glu Asp 565 570 575 580 gat ggc aat gaa gtg gct ecc aat ggg cag ctg acc ctg acg acg ecc 1890 Asp Gly Asn Glu Val Ala Pro Asn Gly Gln Leu Thr Leu Thr Thr Pro 585 590 595 ata cat aac tac aaa gcc taaggagcta gaactgttct gaattgttaa 1938 lie His Asn Tyr Lys Ala 600 accacagtgc ttgctaagac agagtcagcc cctgggccag acaaagcctg gctagagttt 1998 gctgagaaag caaaggcaaa tagtgcatct gaaattttca ggtacaaatt tgtaatgcgc 2058 ttagectate tattgctctt agttttccca tgaagatctg aagcgttcac tgtcattagg 2118 acttgaagta aagtatattt ttgtaccaaa ccacatggga gtatggaaag gctgaacccc 2178 atagtgeage ccaaaaccac tttgacctcc agatagaetc ctggggaagc attcaccaag 2238 ccagtggtaa caagatgatg aatgtggagg gggaaaagac tgctggaaga cttcatctcc 2298 attcctgaaa catttttttt aaaacagtgt cagggattat attcgtttta ctatacaaaa 2358 ggacatcatt gaggaaaagc ttgtttcagg ctgtatcaca gtaaataatc ttgattgttt 2418 ctagaacagg ggtagaaaag tcccaagatc ttcagaaggg cttggttttt tcctcccagg 2478 attcttgctc agtgatgagt tgaaagcaca ggataagctt ctaagggagg aaggcagcat 2538 tggggageag gaggetgatg gtcctcctca gggtctcagt gtaaatgata aattgtetaa 2598 aaataaggaa tattcctgcc tet gagaaa taaggtgtac atagttaatg tageatatet 2658 ggtcgacgtt gtatttgtat ctatttgta 2687 <210> 2 <211> 602 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Gly Gly Ala Glu Arg Ala Met Arg Ser Leu Pro Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Ala Leu Leu Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val 20 25 30 Ala Ser Ala Ala Ser Ala Gly Asn Val Thr Gly Gly Gly Gly Ala Ala 35 " 40 45 Gly Gln Val Asp Ala Ser Pro Gly Pro Gly Leu Arg Gly Glu Pro Ser 50 55 60 His Pro Phe Pro Arg Ala Thr Ala Pro Thr Ala Gln Ala Pro Arg Thr 65 70 75 80 Gly Pro Pro Arg Ala Thr Val His Arg Pro Leu Ala Ala Thr Ser Pro 85 90 95 Ala Gln Ser Pro Glu Thr Thr Pro Leu Trp Ala Thr Ala Gly Pro Ser 100 105 110 ' Ser Thr Thr Phe Gln Ala Pro Leu Gly Pro Ser Pro Thr Thr Pro Pro 115 120 125 Ala Ala Glu Arg Thr Ser Thr Thr Ser Gln Ala Pro Thr Arg Pro Ala 130 135 140 Pro Thr Thr Leu Ser Thr Thr Thr Gly Pro Ala Pro Thr Thr Pro Val 145 150 155 160 Ala Thr Thr Val Pro Ala Pro Thr Thr Pro Arg Thr Pro Thr Pro Asp 165 170 175 Leu Pro Ser Ser Ser Asn Ser Ser Val Leu Pro Thr Pro Pro Ala Thr 180 185 190 Glu Ala Pro Ser Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Val Cys Asn Cys Ser Val 195 200 205 Val Gly Ser Leu Asn Val Asn Arg Cys Asn Gln Thr Thr Gly Gln Cys 210 215 220 Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Gln Gly Leu His Cys Glu Thr Cys Lys Glu 225 230 235 240 Gly Phe Tyr Leu Asn Tyr Thr Ser Gly Leu Cys Gln Pro Cys Asp Cys 245 250 255 Ser Pro His Gly Ala Leu Ser He Pro Cys Asn Ser Ser Gly Lys Cys 260 265 270 Gln Cys Lys Val Gly Val He Gly Ser He Cys Asp Arg Cys Gln Asp 275 280 285 Gly Tyr Tyr Gly Phe Ser Lys Asn Gly Cys Leu Pro Cys Gln Cys Asn 290 295 300 Asn Arg Ser Ala Ser Cys Asp Ala Leu Thr Gly Ala Cys Leu Asn Cys 305 310 315 320 Gln Glu Asn Ser Lys Gly Asn His Cys Glu Glu Cys Lys Glu Gly Phe 325 330 335 Tyr Gln Ser Pro Asp Ala Thr Lys Glu Cys Leu Arg Cys Pro Cys Ser 340 345 350 Ala Val Thr Ser Thr Gly Ser Cys Ser He Lys Ser Ser Glu Leu Glu 355 360 365 Pro Glu Cys Asp Gln Cys Lys Asp Gly Tyr He Gly Pro Asn Cys Asn 370 375 380 Lys Cys Glu Asn Gly Tyr Tyr Asn Phe Asp Ser He Cys Arg Lys Cys 385 390 395 400 Gln Cys His Gly HisXal Asp Pro Val Lys Thr Pro Lys He Cys Lys 405 410 415 Pro Glu Ser Gly Glu Cys He Asn Cys Leu His Asn Thr Thr Gly Phe 420 425 430 Trp Cys Glu Asn Cys Leu Glu Gly Tyr Val His Asp Leu Glu Gly Asn 435 440 445 Cys He Lys Lys Glu Val He Leu Pro Thr Pro Glu Gly Ser Thr He 450 455 460 Leu Val Ser Asn Ala Ser Leu Thr Thr Ser Val Pro Thr Pro Val He 465 470 475 480 Asn Ser Thr Phe Thr Pro Thr Thr Leu Gln Thr He Phe Ser Val Ser 485 490 495 Thr Ser Glu Asn Ser Thr Ser Ala Leu Ala Asp Val Ser Trp Thr Gln 500 505 510 Phe Asn He He He Leu Thr Val He He He Val Val Val Leu Leu 515 520 525 Met Gly Phe Val Gly Ala Val Tyr Met Tyr Arg Glu Tyr Gln Asn Arg 530 535 540 Lys Leu Asn Ala Pro Phe Trp Thr He Glu Leu Lys Glu Asp Asn He 545 550 555 560 Ser Phe Ser Ser Tyr His Asp Ser He Pro Asn Ala Asp Val Ser Gly 565 ' 570 575 Leu Leu Glu Asp Asp Gly Asn Glu Val Ala Pro Asn Gly Gln Leu Thr 580 585 590 Leu Thr Thr Pro He His Asn Tyr Lys Ala • 595 600 <210> 3 <211> 1806 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Esta secuencia degenerada codifica para ia secuencia de Aminoácidos de SEQ ID NO:2. <221> variation <222> Cl)...(1806) <223> N es cualquier pucleótido <400> 3 atgaayggng gngcngarmg ngcnatgmgn wsnytnccn snytnggngg nytngcnytn 60 ytntgytgyg cngcngcngc ngcngcngcn gcngtngcnw sngcngcnws ngcnggnaay 120 gtnacnggng gnggnggngc ngcnggncar gtngaygcnw snccnggncc nggnytnmgn 180 ggngarccnw sncayccntt yccnmgngcn acngcnccna cngcncargc nccnmgnacn 240 ggnccnccnm gngcnacngt ncaymgnccn ytngcngcna cnwsnccngc ncarwsnccn 300 garacnacnc cnytntgggc nacngcnggn ccnwsnwsna cnacnttyca rgcnccnytn 360 ggnccnwsnc cnacnacncc nccngcngcn garmgnacnw snacnacnws ncargcnccn 420 acnmgnccng cnccnacnac nytnwsnacn acnacnggnc cngcnccnac nacnccngtn 480 gcnacnacng tnccngcncc nacnacnccn mgnacnccna cnccngayyt nccnwsnwsn 540 wsnaaywsnw sngtnytncc nacnccnccn genaengarg cnccnwsnws nccnccnccn 600 gartaygtnt gyaaytgyws ngtngtnggn wsnytnaayg tnaaymgntg yaaycaracn 660 acñggncart gygartgymg nccnggntay carggnytnc aytgygarac ntgyaargar 720 ggnttytayy tnaaytayac nwsnggnytn tgycarccnt gygaytgyws nccncayggn 780 gcnytnwsna thccntgyaa ywsnwsnggn aartgycart gyaargtngg ngtnathggn 840 wsnathtgyg aymgntgyca rgayggntay tayggnttyw snaaraaygg ntgyytnccn 900 tgycartgya ayaaymgnws ngcnwsntgy gaygcnytna cnggngcntg yytnaaytgy 960 cargaraayw snaarggnaa ycaytgygar gartgyaarg arggnttyta ycarwsnccn 1020 gaygcnacna argartgyyt nmgntgyccn tgywsngcng tnacnwsnac nggnwsntgy 1080 '•>c-n--H.asrw ?nwcnaarvt nparrmpai" -t- »-.-... — --«- ..«~ ^+ ,v,_+hr,nn 1 140 ccnaaytgya ayaartgyga raayggntay tayaayttyg aywsnathtg ygnaartgy 1200 cartgycayg gncaygtnga yccngtnaar acnccnaara thtgyaarcc ngarwsnggn 1260 gartgyatha aytgyytnca yaayacnacn ggnttytggt gygaraaytg yytngarggn 1320 taygtncayg ayytngargg naaytgyath aaraargarg tnathytnce nacncengar 1380 ggnwsnacna thytngtnws naaygcnwsn ytnacnacnw sngtnccnac nccngtnath 1440 aaywsnacnt tyacnccnac nacnytncar acnathttyw sngtnwsnac nwsngaraay 1500 wsnacnwsng cnytngcnga ygtnwsntgg acncarttya ayathathat hytnacngtn 1560 athathathg tngtngtnyt nytnatgggn ttygtnggng cngtntayat gtaymgngar 1620 taycaraaym gnaarytnaa ygcnccntty tggacnathg arytnaarga rgayaayath 1680 wsnttywsnw sntaycayga ywsnathccn aaygcngayg tnwsnggnyt nytngargay 1740 gayggnaayg argtngcncc naayggncar ytnacnytna cnacnccnat hcayaaytay 1800 aargcn 1806 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 ctctgtggtt ggaagcctga atgtg 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> . secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 agccctcttt gcaggtttca cagtg 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 etecagagta tgtatgtaac tgc 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotide . 400> 7 cacatggctg acagacccac a 21 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> '.Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 cccgagagtg gtgagtgc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 ctcgaggtcg tgaacata 18 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia Artificial <400> 10 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1.- Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende un dominio extracelular, en donde el dominio extracelular comprende los residuos de 31 a 507 de los aminoácidos SEQ ID NO: 2.

2.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido además comprende un dominio transmembranal que reside en la posición carboxilo-terminal en relación al dominio extracelular, en donde el dominio transmembranal comprende los residuos 508 al 533 de SEQ ID NO : 2.

3.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido además comprende un dominio intracelular que reside en la posición carboxilo-terminal en relación al dominio transmembranal, en donde el dominio intracelular comprende los residuos 534 al 602 de SEQ ID NO: 2.

4.- El polipéptido. aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido además comprende una secuencia de señal secretora que reside en la posición amino-terminal en relación al dominio extracelular, en donde la secuencia de señal secretora comprende ya sea los residuos de 1 al 30 de los aminoácidos de SEQ ID NO : 2 o los residuos 9 al 30 de los aminoácidos de SEQ ID ?O:2.

5.- El polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 70 _ idéntico a cualquier secuencia de aminoácidos de SEQ ID ?O: o una secuencia de aminoácidos de los residuos 31 al 507 de los aminoácidos de SEQ ID ?O:2, en donde el polipéptido aislado se aglutina de manera esp-ecífica con un anticuerpo que se aglutina de manera específicamente con un polipéptido que consiste de la secuencia de los aminoácidos de SEQ ID ?O:2.

6.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende una secuencia aminoácidos que es por lo menos un 801 idéntico ya sea a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o a la secuencia de aminoácidos de los residuos 31 al 507 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

1 . - El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende una secuencia aminoácidos que es por lo menas un 901 idéntico ya sea a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o a la secuencia de aminoácidos de los residuos 31 al 507 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

8.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende por lo menos un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico que tiene uno de los siguientes motivos: x (4 ) -C-x-C-x (10) -C-x ( 6) -C-x-C-x (2 ) -G-x(2)-G-x(2)-C-x. o x(4) -C-x-C-x(9) -C-?(5) -C-x-C-x(2) -G-x (2) -G-x (2) -C-x, en donde "x" es cualquier aminoácido, y en donde los valores de los paréntesis indican el número de ocurrencias de "x" .

9.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende por lo menos una asignatura de un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico tipo laminina que tiene un motivo seleccionado a partir de: (a) C-x-C-x (5) -G-x (2 ) -C-x (2) -C-x (3) -F-x ( 8) -C, (b) C-x-C-x (5) -G-x (2) -C-x (3) -Y-x (7) -C, (c) C-x (2) -C-x (5) -G-x(2) -C-x(2) -C-x(3) -F-x(9) -C, (d) C-x (2) -C-x (5) -G-x (2) -C-x(2) -C-x(3) -Y-x (6) -C, y (e) C-x (2) -C-x (5) -G-x (2 ) -C- (2) -C-x (3) -Y-x (7) -C, en donde "x" es cualquier aminoácido, y en donde los valores de los paréntesis indican el número de ocurrencias de "x" .

10.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 31 al 507 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

11.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 31 al 602 de los aminoácidos de SEQ ID NO : 2.

12.- Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque la molécula de ácidos nucleicos es seleccionada del grupo que consiste de (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleótidos de SEQ ID NO: 3, y (b) una molécula de ácido nucleico que permanece hibridizada luego de unas comisiones rigurosas de lavado a una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia nucleótida de nucleótidos 193-1908 de SEQ ID NO:l, o el complemento de nucleótidos 193-1908 de SEQ ID NO : 1.

13. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico y la secuencia correspondiente a aminoácidos de SEQ ID NO : 2 es debida a una substitución conservadora de aminoácidos.

14. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 193-1908 de SEQ ID NO:l.

15.- Un vector, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los residuos de aminoácidos 31 al 507 de SEQ ID NO: 2.

16.- Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica residuos de aminoácidos 31 a 507 de SEQ ID NO: 2, un promotor en la transcripción, y un terminador de transcripción, en donde el promotor se enlaza de manera operable con la secuencia de nucleótidos, y en donde la secuencia de nucleótidos se enlaza de manera operable con el terminador de transcripción.

17.- Una célula huésped recombinante la cual comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende que la célula huésped es seleccionada del grupo que consiste de una bacteria, una célula de levadura, una célula de hongo, una célula de un insecto, una célula de un mamífero, y una célula vegetal.

18.- Un método para utilizar el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 16, para producir un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos 31 a 507 de SEQ ID NO : 2 , que comprende el cultivar una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión y que produce el polipéptido.

19.- Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se aglutina específicamente con un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos 31 a 507 de SEQ ID NO: 2.

20.- Un método para detectar en una muestra biológica la presencia de 7?RN que codifica las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2, el cual comprende:' (a) poner en contacto una sonda de ácido nucleica bajo condiciones de hibridación con cualquier (i) prueba de las moléculas de ARN aisladas de la muestra biológica, o (ii) las moléculas de ácido nucleico sintetizadas desde las moléculas de ARN aisladas, en donde la sonda tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera una porción de la secuencia de nucleótidos 193-19DS de SEQ ID NO:l, o su complemento, y (b) detectar la formación de híbridos de la sonda de ácido nucleico en cualquier prueba de las moléculas dé ARN o las moléculas sintetizadas de ácido nucleico, en donde la presencia de los híbridos indican la presencia de AR? que codifica la secuencia de aminoácido de SEQ ID ?O:2 en muestras biológicas.

21.- Un método para detectar en una muestra biológica la presencia de un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de residuos de aminoácido 31 a 507 de SEQ ID ?O:2, el cual comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo; o un fragmento de anticuerpo, de conformidad con la reivindicación 19, en donde el contacto se lleva a cabo bajo condiciones que permite la aglutinación del anticuerpo o fragmento del anticuerpo a la muestra biológica, y (b) detectar cualquier anticuerpo aglutinado o fragmento del anticuerpo aglutinado.

POLIPEPTIDO HUMANO PROVISTO DE MÚLTIPLES

DOMINIOS SIMILARES AL FACTOR DE CRECIMIENTO

EPIDÉRMICO (EGF) , ZNTR2

RESUMEN DE LA INVENCIÓN Los dominios similares al factor de crecimiento epidérmico aparecen en una amplia variedad de proteínas que llevan a cabo funciones biológicas críticas, tales como la regulación de la diferenciación celular . El ZNTR2 es un nuevo miembro de este grupo de proteínas .