MXPA01006437A - Compuestos de triazinona para el tratamiento de enfermedades debidas a sarcosystis, neospora y toxoplasma - Google Patents

Abstract

Se revelan métodos para tratar terpéuticamente o metafilácticamente animales infectados susceptibles o que sufren de enfermedades parásitas neurológicas o abortígenas, tales como Sarcosistiditis o Toxoplasmosis que son tratables con compuestos de triazineona administrando una cantidad farmacéuticamente efectiva de ponazuril, incluyendo un solo tratamiento terapéutico de dosis altas.

Description

COMPUESTOS DE TRIAZINONA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DEBIDAS A SARCOSYSTIS, NEOSPORA Y TOXOPLASMA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención: La presente invención se refiere a compuestos de triazi-nona para el tratamiento de animales infectados con parásitos que provocan enfermedades abortivas o neurológicas . Más espe-cíficamente, la presente invención se refiere a compuestos de triazinona que son útiles en el tratamiento de protozoos parásitos tales como coccidios que provocan enfermedades abortivas o neurológicas . Breve Descripción de la Técnica anterior: Los compuestos de triazinona tales como triazindionas, por ejemplo, los compuestos de diclazuril, y triazintrionas, por ejemplo, compuestos de toltrazuril, se han utilizado en el tratamiento y protección de diversos mamíferos, insectos y peces de enfermedades provocadas por un amplio rango de pro-tozóos. Ver Patentes U.S.: 4.933.341; 4.935.423; 5.114.938; 5.141.938; 5.188.832; 5.196.562; 5.526.631 y 5.464.837. Los protozoos sensibles a estos compuestos incluyen parásitos, que infectan los intestinos de los pájaros, mamíferos e insectos y se manifiestan como diarrea, agotamiento, náuseas y vómitos. Generalmente, el modo de acción de las triazinonas es atacar las fases intermedias del parásito encontrado en las células del tubo digestivo y las paredes intestinales, haciendo que el retículo endoplásmico, el espacio perinuclear y la mitocondria del parásito se hinchen. Esto altera signi-ficativamente la capacidad para las divisiones nucleares haciendo que los sizontes ("shizonts") y los microgamontes ("microgamonts") queden escasos formando solamente unos pocos merozoitos y microgametos respectivamente. Se manifiesta que el resultado final es la pérdida de capacidad de estas últi- mas fases de los parásitos para atravesar nuevas células de mamíferos, deteniendo eficazmente la replicación del parásito en el huésped. Son de particular interés aquí ciertos protozoos sospe-chosos de provocar enfermedades neurológicas y/o abortivas de los animales desde los años 1970. Se ha experimentado que el aislamiento exitoso y el cultivo in vi tro de alguno de estos protozoos es dificultoso. Por ejemplo, el aislamiento exitoso a partir del cerebro o del fluido cerebro-espinal no se con-siguió hasta finales de 1980. Una vez que se determinó que las enfermedades neurológicas podían estar producidas por parásitos que infectaban el cerebro y que las enfermedades abortivas podían estar producidas por la infección de los fetos, se produjo la necesidad de fármacos anti-protozoarios eficaces que pudieran cruzar la barrera sangre-cerebro y la barrera placentaria sin producir efectos secundarios perjudiciales. Muy pocos fármacos son capaces de pasar la barrera sangre-cerebro o la barrera placentaria de los animales. Sin embargo, muchos de los fármacos conocidos en el campo que pueden atravesar la barrera sangre-cerebro y/o la barrera placentaria para tratar eficazmente las infecciones parasitarias del cerebro tienen efectos secundarios perjudiciales tales que no pueden utilizarse sin un gran riesgo. Por lo tanto, no han sido aprobados fármacos efectivos hasta la fecha que proporcionen un tratamiento efectivo para dichas enfermedades neurológicas o abortivas. Lo siguiente es una breve descripción de las enfermedades parasitarias. La Mieloencefalitis Protozoaria Equina (EPM) es una enfermedad neurológica de los caballos, con una predilección por los caballos jóvenes sometidos a esfuerzo (por ejemplo, caballos de carreras de pura raza y caballos amaestrados de pura sangre, y por ello es una enfermedad con un impacto monetario significativo para la industria equina. La EPM, primeramente reconocida como enfermedad en los años 1970, no fue cultivada a partir de un caballo con EPM y dado el nombre de Sarcocystis neurona hasta 1991. En 1997, se aisló una Neospo-ra spp., ahora denominada Neospora hugesi , a partir del cerebro de un caballo con EPM. Consecuentemente, ahora se ha pro-puesto que la EPM puede estar provocada por este organismo nuevamente reconocido sólo, por Sarcocystis neurona sólo o por la combinación de los dos. La EPM da lugar, lo más frecuentemente, a incoordinación asimétrica (ataxia) , debilidad y espasticidad. La enfermedad puede simular casi cualquier situación neurológica. Puede aparecer como una situación pe-raguda o crónica. La forma crónica es frecuentemente insidiosa al comienzo, difícil de diagnosticar hasta el final del curso de la enfermedad, y puede dar lugar a la muerte. En los casos más benignos, el único signo clínico puede ser débili-dad de los miembros pélvicos mal definida o un menor ruido respiratorio. En los casos más graves, los caballos son incapaces de tragar o mantenerse en pie. Ahora se ha sabido que en los casos más graves, el parásito, por ejemplo, S. neurona infecta el cerebro y produce un daño significativo en el mis-mo. Los signos clínicos de la EPM están producidos por el daño neuronal (cerebro y médula espinal) directo mediante parásitos así como por el daño cerebral resultante de la infiltración de células inflamadas, edema y muerte neuronal asociado con los merozoitos y merontes en el sistema nervioso central (CNS) . Actualmente, no hay aprobado ningún tratamiento o profilaxis efectivos para el control de la EPM. Se ha utilizado la combinación de fármacos para humanos trimetoprim-sulfonamida. Sin embargo, el tratamiento es caro y requiere un número extenso de dosis repetidas. Se conoce desde hace cierto tiempo otro parásito cocci-diano, Toxoplasma gondii , y se aisló primeramente de los intestinos y tejidos musculares de los gatos. El huésped definitivo para este parásito es el gato que puede hospedar el organismo durante largos períodos de tiempo dispersando oo- cistos a otros animales incluyendo bovinos, ovinos, cerdos y humanos. La infección de las ovejas, ganado vacuno y humanos ha sido asociada con el aborto y con trastornos adquiridos congénitamenté, los cuales afectan principalmente al sistema nervioso central . También se ha asociado recientemente con el aborto y las malformaciones en gatitos nacidos de hembras infectadas que habían sido seronegativas antes de la infección durante la gestación. Los huéspedes no felinos, tales como bovinos, ovinos, cerdos y humanos no producen oocistos pero desarrollan y pueden padecer la invasión del músculo y el cerebro por tachizoitos y bradizoitos que producen los signos clínicos de la enfermedad - síntomas neurológicos y aborto con defectos fetales. Se ha informado que el 60% de los gatos son serológicamente positivos a T. gondii . Una vez, de nuevo, no hay aprobado ningún tratamiento o profilaxis para la toxoplasmosis . Todavía otro parásito coccidiano, Neospora caninum, produce, ambas, enfermedad neurológica y abortiva en animales. Se aisló primeramente de perros en 1988. Inicialmente se con-fundió con Toxoplasma gondii . La enfermedad producida por este parásito se produce de forma más grave en cachorros infectados transplacentariamente y está caracterizada por la parálisis ascendente progresiva en los cachorros, particularmente en los miembros traseros; también puede producirse polimiosi-tis y hepatitis. Mas recientemente se ha reconocido esta enfermedad como una causa principal de aborto y defectos de los miembros neurológicamente asociados en terneros recién nacidos. Pueden apreciarse lesiones microscópicas de encefalitis no supurativa y miocarditis en los fetos abortados, en el ce-rebro, médula espinal y corazón. Recientemente se ha identificado que un huésped definitivo para Neospora caninum es el perro. Hasta la fecha no se ha aprobado ningún tratamiento o profilaxis ni para Neospora caninum de perros o bovinos ni para Neospora hugesi de caballos.

Las referencias de la técnica conocida, incluyendo las referencias citadas anteriormente no sugieren ni enseñan el uso de compuestos de triazinona tales como toltrazuril o toltrazuril sulfona (recientemente renombrado "ponazuril") para el tratamiento de animales infectados con coccidios o, más específicamente, de la familia Sarcocystidae que provocan enfermedades abortivas o neurológicas sin producir efectos secundarios intolerables. Existe, por lo tanto, la necesidad de un tratamiento mejorado y seguro para los animales afectados con enfermedades parasitarias que se manifiesten como enfermedades neurológicas y abortivas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con lo anterior, la presente invención abarca un método mejorado de tratamiento terapéutico de un animal enfermo que padece una enfermedad parasitaria neurológica o abortiva que es susceptible de ser tratado con un compuesto de triazinona, que comprende administrar al animal una cantidad farmacéuticamente efectiva del compuesto, comprendiendo la mejora el compuesto de triazinona que es ponazuril. El término "cantidad farmacéuticamente efectiva" como se utiliza aquí significa que la cantidad de triazinona a administrar es bastante elevada para inhibir el crecimiento in vivo o in vi tro de los protozoos parásitos, típicamente coc-cidios los cuales producen enfermedades neurológicas y/o abortos. La cantidad farmacéuticamente efectiva controla los parásitos en los tejidos infectados; consecuentemente, la salud del animal mejora. Además, la presente invención abarca un método para tra-tar metafilácticamente un animal infectado con un parásito que puede producir una enfermedad neurológica o abortiva, que es susceptible de ser tratado con ponazuril. El tratamiento metafiláctico comprende administrar al animal el ponazuril utilizando un régimen metafilácticamente efectivo. Por el término "régimen metafilácticamente efectivo" se da a entender la administración de dosis intermitentes pautadas del compuesto de triazinona durante un período prolongado de tiempo hasta que dicho animal supere la invasión de parásitos mediante, por ejemplo, el desarrollo de una respuesta inmune protectora u otro modo de liberarse del parásito. Típicamente, el régimen es tal que pueda controlar eficazmente los parásitos y evitar los signos clínicos de la enfermedad. Las dosis metafilácticamente efectivas también pueden adminis-trarse durante un período de tiempo prolongado de hasta cinco años o el tiempo de vida del animal, especialmente en el caso en que el parásito sea difícil de controlar. También, la presente invención abarca un tratamiento de los animales con una dosis única elevada. Este método com-prende la administración al animal de una única dosis elevada de una cantidad farmacéuticamente efectiva de ponazuril al animal enfermo que padece una enfermedad neurológica o abortiva parasitaria que es susceptible de ser tratado con una triazinona. Por el término "única dosis elevada" se da a en-tender una cantidad que se administra solamente una vez. Esta cantidad es significativamente mas alta que la cantidad de la dosis empleada en el tratamiento terapéutico o metafiláctico; es efectiva para controlar los parásitos causantes de la enfermedad, y como tal no dará lugar a efectos perjudiciales tales como toxicidad. La dosis elevada única de ponazuril es consecuentemente mayor de 10 mg/kg. Éste y otros aspectos de la invención se describen de forma más completa en adelante .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de un animal infectado o enfermo que padece una enfermedad parasitaria que se manifiesta como una enfermedad neurológica o abortiva que es susceptible de ser tratada con un compuesto de triazinona, que comprende la administración al mismo de una cantidad farmacéuticamente efectiva de ponazuril. Ejemplos ilustrativos, pero no limitativos, de los animales pueden ser equinos, bovinos, felinos, caninos, porcinos, ovinos, pájaros, insectos y humanos. Los parásitos que infectan o provocan la enfermedad son coccidios de la familia Sarcocystidae, que puede manifestarse como una enfermedad neurológica o abortiva. Pueden seleccionarse ejemplos ilustrativos, pero no limitativos, de los mismos del grupo formado por Sarcocystis spp., Neospora spp, y Toxoplasma spp. Los Sarcocystidae se seleccionan típicamente del grupo formado por S. neurona, N. hugesi , N. cani num y T. gondii . Las infecciones o enfermedades protozoarias incluyen, pero no están limitadas a, EPM, Neosporosis, y Toxoplasmosis . En la práctica de la invención, el tratamiento de las infecciones o enfermedades parasitarias provocadas por los protozoos aquí descritos da lugar al alivio de los síntomas de las enfermedades neurológicas y abortivas. Generalmente, los síntomas incluyen debilidad, ataxia, parálisis, aborto, recién nacidos débiles y otros trastornos relacionados. Para el tratamiento terapéutico, los animales que ya padecen los signos anteriores de la enfermedad son tratados con el compuesto de triazinona. Típicamente, la duración del tratamiento es de aproximadamente 28 días hasta 90 días y preferible-mente desde aproximadamente 28 hasta 60 días. Se entiende que para el tratamiento terapéutico, el régimen de tratamiento puede ser de una vez al día, dos o más veces al día, una vez en días alternos o incluso una vez por semana, dependiendo de los factores tales como la gravedad de la enfermedad y el ti-po de parásito productor de la enfermedad. En algunos casos, sin embargo, el régimen de tratamiento puede durar indefinidamente, a veces durante el resto de la vida del animal. El último tratamiento podría requerirse en el caso de infección de un animal con una cepa del parásito más resistente. Sin embargo, el tratamiento puede extenderse durante períodos de tiempo más largos cuando sea necesario hasta que los signos de la enfermedad se hayan eliminado. El tratamiento preferido es una vez al día durante aproximadamente 28 días. Para el tratamiento metafiláctico, se tratan los animales que están infectados para protegerlos frente a las manifestaciones clínicas de las enfermedades. Este tratamiento da lugar eventualmente a la adquisición del animal de la capacidad para controlar el parásito, por ejemplo, mediante el es-tablecimiento de una respuesta inmune efectiva para impartir protección frente a futuras infecciones, sin necesidad de una administración adicional de ponazuril. La actividad metafi-láctica, de acuerdo con la invención, se refiere al uso de los compuestos de triazinona en un régimen de tratamiento in-termitente pautado (régimen metafilácticamente efectivo) para controlar los protozoos, que puedan haber infectado al animal, desde el tratamiento anterior. Consecuentemente, el régimen metafilácticamente efectivo se administra para reducir su capacidad de provocar la enfermedad mediante, por ejemplo, matándolos o reduciéndolos en número. En esencia, el régimen metafilácticamente efectivo puede administrarse aproximadamente una vez al mes, durante la vida del animal o hasta un mecanismo de eliminación inherente, por ejemplo, una respuesta inmune eficaz, que se desarrolle dentro del animal para protegerlo de futuras infecciones. Lo último puede ocurrir al cabo de 5 años o menos. Como puede apreciarse, el tratamiento metafiláctico está basado en el reconocimiento de que cuando los animales sean infectados con los protozoos aquí descritos, no muestren signos clínicos tales como signos neurológi-cos o aborto hasta que haya pasado un tiempo significativo (por ejemplo, 2-6 meses después de la infección). En contraste, las infecciones protozoarias entéricas se manifiestan por si mismas en breve tras la infección. De acuerdo con esta invención, el tratamiento metafiláctico evita que el parásito se establezca por si mismo y provoque una enfermedad clínica. El régimen de tratamiento se efectúa sobre una pauta intermitente de aproximadamente una vez al mes, una vez cada dos meses, o una vez cada dos semanas a una dosis equivalente de aproximadamente entre 1,0 y 100 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 1,0 a 25 mg/kg y más preferiblemente aproximadamente 2,5 a 10 mg/Kg. Se precisará la parte alta del intervalo en casos particularmente resistentes (por ejemplo, cuando un animal esté infectado con una cepa resistente) . El nivel de dosificación requerido y la duración del tratamiento están dentro del punto de vista de un experto común en el campo. Un régimen de tratamiento preferido para caballos con EPM o bovinos con Neosporosis es de aproximadamente 1,0 a 25 mg/Kg, y un rango más preferido es de aproximadamente 2,5 a 10 mg/kg de triazintriona cada 28 días. Para el tratamiento de única dosis elevada, se administra ponazuril en cantidades farmacéuticamente efectivas que sean mayores de 10 mg/Kg y de hasta aproximadamente 100 mg/Kg. Es una característica distintiva de la invención que los compuestos de esta invención pueden ser no-tóxicos, así pueden administrarse a niveles de dosificación elevados. La ventaja de la administración a la dosis elevada reside en el hecho de que no se precisan dosis repetidas y de que algunos compuestos de triazinona pueden producir efectos secundarios perjudiciales si se administran a niveles de dosificación muy elevados . Sin estar enlazados a ninguna teoría particular de la invención, se cree que el éxito inesperado de los tratamientos descritos aquí resulta de la capacidad del ponazuril a cruzar la barrera sangre-cerebro o la barrera placentaria. Se cree que los compuestos de esta invención cruzan fácilmente la barrera sangre-cerebro y, también, son capaces de atravesar la placenta y matar los protozoos in si tu en el cerebro y en el fluido cerebro-espinal/médula espinal. Se ha encontra- do, además, que los compuestos de esta clase son no-tóxicos y no-mutagénicos incluso a las elevadas dosis necesarias para el régimen de tratamiento de única dosis elevada aquí descrito. Hasta ahora, no había disponibles fármacos de coste efectivo, fácilmente administrables para tratar y proteger eficazmente frente a estas enfermedades sin producir efectos secundarios inaceptables tales como toxicidad o mutagenicidad en animales . En la práctica de la invención, el ponazuril puede ser formulado de cualquier forma conveniente para la administración a los animales . Las formulaciones adecuadas para la administración oral, que es aquí preferida, pueden ser suspensiones, tabletas, cápsulas, geles, pastas, pildoras, o prepa-raciones en forma de polvos, granulos o pelets. La formulación preferida para administrar oralmente está en forma de pasta o de un aditivo alimentario. Otros modos de administración que pueden emplearse incluyen el parenteral, tópico, intramuscular, e intramucosal u otras vías conocidas por los expertos en el campo. La administración tópica en forma de un rociado es también preferida. Típicamente, se emplean en las formulaciones portadores y auxiliares farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de los mismos pueden ser agentes espesantes seleccionados del grupo formado por: Carbopol, espesantes inorgánicos tales como silicatos, bentonitas o sílice coloidal y espesantes orgánicos tales como alcoholes grasos o esteres de ácidos grasos, y los agentes humectantes están seleccionados del grupo formado por polietilén glicol y lauril sulfato de sodio siendo los Carbo-poles, más específicamente, el Carbopol 974P, el agente espesante más preferido aquí para la formulación de la pasta. También pueden emplearse aquí los conservantes seleccionados del grupo formado por parabenes, alcoholes y aldehidos. Éstos pueden ser materiales líquidos, sólidos o gaseosos, los cua- les por otra parte son inertes o médicamente aceptables y son compatibles con los ingredientes activos. Sorprendentemente, las pastas, de acuerdo con la invención, son efectivas cuando se utilizan en el tratamiento de los parásitos. Más específicamente, es sorprendente que las pastas de la presente invención sean efectivas en la liberación de las triazinonas, particularmente toltrazuril, y ponazuril para que crucen la barrera sangre-cerebro o la barrera placentaria y ataquen los parásitos que ya han invadido el cerebro o infectado el feto de los animales preñados. A nivel de conveniencia, se proporciona aquí una descripción de una realización específica de las pastas preferidas aquí y cómo se preparan. Una pasta preferida, de acuerdo con la presente invención contiene una suspensión micronizada de la triazino-na (por ejemplo, ponazuril), propilén glicol, un agente espesante tal como Carbopol, conservantes tales como metilparaben y propilparaben, y agua. Puede hacerse por combinación de agua, típicamente, agua purificada y propilén glicol, calentando la combinación hasta aproximadamente 70 °C, y añadiendo los conservantes a esta temperatura. La mezcla resultante se enfría hasta la temperatura ambiente después de lo cual se añade el Carbopol, preferiblemente en forma de Carbopol 974P. Finalmente, se añade la triazintriona. Después de completar el mezclado, se ajusta el pH hasta aproximadamente 6,0 con hidróxido de sodio. La pasta más preferible incluye 15% p/p de ponazuril, 20% p/p de propilén glicol, 0,5% p/p de Carbopol 974P, 0,14% p/p de metilparaben, 0,02% p/p de propilparaben, 0,1% p/p de hidróxido de sodio siendo el resto agua purificada. Pueden añadirse edulcorantes incluyendo dextrosa, sacarosa, lactosa, fructosa, sorbitol, xilitol, edulcorantes artificiales y melazas para mejorar el sabor. Adicionalmente, puede añadirse levadura o sabor de hígado para la misma finalidad. La invención se describe adicionalmente mediante los si- guientes ejemplos ilustrativos pero no limitativos.

EJEMPLOS E EMPLO 1 : Se llevó a cabo un estudio farmacocinético en caballos comparando los niveles sanguíneos de toltrazuril, ponazuril y toltrazuril sulfóxido a diferentes tiempos después de una dosis única de toltrazuril. Todos los caballos recibieron una dosis única de 10 mg/kg, la cual se administró oralmente como una suspensión. Se extrajeron muestras sanguíneas en el momento del tratamiento (0) y a 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 y 72 horas después del tratamiento. Los resultados del muestreo se enumeran en la Tabla 1. Fue sorprendente observar que los caballos que habían recibido toltrazuril mostraban niveles relativamente altos de ponazuril en su suero. Adicionalmente, se encontraron niveles significativos de toltrazuril sulfóxido en la corriente sanguínea. Esto era indicativo de que el ponazuril, sólo, podía producir niveles sanguíneos aceptables que se veía que pasaban la barrera sangre-cerebro, una característica requerida para tratar las enfermedades neurológicas tales como aquellas provocadas por Sarcocystis neurona, Toxoplasma gondii , Neospora caninum y Neospora heu-gesi .

TABLA 1 Farmacocinética de una dosis única de toltrazuril en caballos D Compuesto medido Concentración en m/1 de ; sangre 0 0,25 0,5 1 2 4 A toltrazuril 0,027 0,773 2,863 4,511 3,119 toltrazuril-sulfóxido <0,01 0,077 0,070 0,159 0,142 ponazuril 0,010 0,089 0,088 0,171 0,110 B toltrazuril 0,061 0,393 2,617 4,296 6,820 toltrazuril-sulfóxido <0,01 0,025 0,047 0,083 0,157 ponazuril <0,01 0,029 0,036 0,040 0,050 C toltrazuril 0,061 0,560 3,286 5,788 9,079 toltrazuril-sulfóxido <0,01 0,024 0,041 0,097 0,218 ponazuril <0,01 0,013 0,019 0,026 0,032 D toltrazuril 0,017 0,295 3,286 2,165 3,328 toltrazuril-sulfóxido <0,01 0,027 0,039 0,058 0,100 ponazuril <0,01 0,011 0,021 0,024 0,029 E toltrazuril <0,01 0,039 1,146 3,175 8,410 toltrazuril-sulfóxido <0,01 <0,01 0,021 0,064 0,194 ponazuril <0,01 <0,01 0,017 0,015 0,044 F toltrazuril 0,110 0,428 1,741 -- 8,144 toltrazuril-sulfóxido <0,01 0,026 0,044 -- 0,183 ponazuril <0,01 0,012 <0,01 -- 0,041 D Compuesto medido Concentración en m/1 de sangre 6 12 24 48 72 A toltrazuril 5,149 5,066 6,434 7,607 6,653 toltrazuril-sulfóxido 0,167 0,230 0,407 0,732 0,592 ponazuril 0,108 0,170 0,324 1,622 1,933 B toltrazuril 11,474 11,670 11,690 6,677 5,058 toltrazuril-sulfóxido 0,320 0,451 0,566 0,454 0,346 ponazuril 0,131 0,254 0,255 0,831 0,880 C toltrazuril 14,202 13,751 -- 9,758 7,633 toltrazuril-sulfóxido 0,280 0,436 -- 0,477 0,377 ponazuril 0,061 0,135 -- 0,540 0,642 D toltrazuril 3,816 10,544 7,236 8,234 -- toltrazuril-sulfóxido 0,133 0,668 0,461 0,749 -- ponazuril 0,030 1,651 0,315 0,986 -- E toltrazuril 11,335 12,032 8,694 6,869 -- toltrazuril-sulfóxido 0,259 0,430 0,481 0,741 -- ponazuril 0,074 0,268 0,231 0,501 -- F toltrazuril 10,966 6,660 10,224 7,096 -- toltrazuril-sulfóxido 0,245 0,453 0,633 0,642 -- ponazuril 0,061 0,725 0,192 0,532 -- EJEMPLO 2 : Se formuló ponazuril, l-metil-3- [4-p- [trifluormetil) sul-fonilfenoxi] m-tolil] -s-triazin-2, 4, 6 (1H, 3H, 5H) -triona, una triazintriona representativa, en pasta para administración a caballos. Los componentes enumerados en la Tabla 2 se utilizaron en la preparación de formulaciones como sigue . Tabla 2 Componentes de la pasta para caballo de ponazuril Ingrediente Cantidad Cantidad práctica teórica % p/p ponazuril - Micronizado 22,5 kg 15, 0 propilén glicol 30,0 kg 20,0 Carbopol 974P 0,750 kg 0,5 metilparaben, NF 0,210 kg 0,14 propilparaben, NF 0,030 kg 0, 02 Hidróxido de sodio, NF 0,150 kg 0,10 Agua purificada 96,365 kg 64,24 Se prepararon las formulaciones utilizando el proceso (A) y (B) como sigue. El primer proceso (A) comprendía: 1) Mezclar una porción del agua con el propilén glicol; 2) añadir los conservantes (metilparaben y propilparaben; 3) añadir lentamente el Carbopol 974P hasta que se preparó una suspensión uniforme; 4) añadir el ponazuril en forma micronizada; 5) añadir el hidróxido de sodio para llevar la suspensión hasta un pH de aproximadamente 6,0; y 6) añadir el resto del agua hasta CS para el volumen. La suspensión final estaba en forma de una pasta, que podía dispensarse oralmente a un caballo. El segundo proceso (B) comprendía: 1) Mezclar una porción del agua con el propilén glicol; 2) calentar hasta 70 °C; 3) añadir los conservantes (metilparaben y propilparaben mientras se mantiene la solución a 70 °C; 4) enfriar la solución hasta la temperatura ambiente; 5) añadir lentamente el Carbopol 974P hasta que se preparó una suspensión uniforme; 6) añadir el ponazuril en forma micronizada; 7) añadir el hidróxido de sodio y llevar la suspensión hasta un pH de aproximadamente 6,0; y añadir el resto del agua hasta CS para el volumen. La suspensión final estaba también en forma de una pasta, que podía dispensarse oralmente a un caballo. Se administraron las pastas resultantes a caballos y se encontró que eran aceptables al paladar y bien aceptadas . EJEMPLO 3 : Se ensayó el ponazuril, l-metil-3- [4-p- [trifluormetil) -sulfonilfenoxi] -m-tolil] -s-triazin-2 ,4,6 (1H, 3H, 5H) -triona, una triazintriona representativa, en cuanto a su capacidad para tratar caballos que mostraban ya signos de Mieloencefa-litis Protozoaria Equina (EPM) . El compuesto se formuló en forma de pasta utilizando ponazuril al 15% como ingrediente activo (i. a.) según se describió en el EJEMPLO 1. Se administró a caballos ya diagnosticados con EPM una vez al día durante 28 días a un ritmo de dosificación entre 2,5 mg/kg y 10 mg/kg . Los casos clínicos de EPM que surgieron de forma natural estaban bien caracterizados por los síntomas y el diagnóstico de laboratorio. El diagnóstico utilizado para la incorporación de caballos EPM-positivos en este ensayo fue como sigue: déficit neurológico asimétrico confirmado como se determina mediante un examen neurológico estándar, incluyendo radiogra-fía, indicativa de EPM; transferencia Western positiva para Sarcocystis neurona IgG; contenido de glóbulos rojos por debajo de 500 células/mL; índices CSF - proteína total < 90, índice de IgG > 0,3, cociente AQ < 2,2. Los requerimientos adicionales fueron que los caballos no padecieran otras enfermedades diferentes de la EPM. Por lo tanto, tenían que cumplir con los siguientes criterios: CSF negativo (<1:4) para EHV-1; valores de suero normales para vitamina E (.2.0 µg/mL); ausencia de trastornos de ataques; ausencia de trastornos de comportamiento .

Los caballos diagnosticados se asignaron a grupos al azar. Los caballos del Grupo 1 recibieron la formulación en pasta diariamente a un valor de dosificación de 5 mg/Kg mientras que los caballos del Grupo 2 recibieron la formulación en pasta diariamente a un valor de dosificación de 10 mg/Kg. La dosis de tratamiento estuvo basada en el peso corporal . Los caballos se evaluaron durante un período de 90 días (aproximadamente 60 días después de la interrupción del tratamiento) con el fin de determinar que el tratamiento fuera de hecho efectivo. Se puntuó la respuesta al tratamiento utilizando el siguiente sistema: 1) 0 = éxito completo-clínicamente normal con un CSF negativo; 2) 1 = déficit apenas detectable en el modo de andar normal; 3) 2 = déficit fácilmente detectable y exagerado por el sostén, giro, desviación, presión de la ijada sobre la mandíbula y alargamiento del cuello; 4) 3 = déficit muy apreciable al andar, torcedura facial, presión de la ijada o alargamiento del cuello; 5) 4 = traspiés, tropiezos y caídas espontáneamente; 6) 5 = recostado, incapaz de levantarse. Una mejo-ría de una (1) unidad en la puntuación se consideraba como una mejoría significativa. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 3. La totalidad (100%) de los caballos en el grupo de 10 mg/K que fueron tratados durante 28 días mostraron una mejo-ría significativa en la puntuación clínica al día 90 después del comienzo del tratamiento con ponazuril (día 0) . Ocho de nueve (88,9%) caballos tratados con la dosis de 5 mg/Kg mostraron una mejoría aceptable. Cuando se suman todos los puntos para cada grupo, para cada día de tratamiento, se obtiene la puntuación total. La mejoría en las puntuaciones totales mostradas por, ambos, Grupo 1 y Grupo 2 de caballos es aproximadamente equivalente. Se concluye así que el ponazuril es eficaz para el tratamiento activo de la EPM en caballos, ya sea a dosis de 5 mg/Kg o de 10 mg/Kg.

TABLA 3 : Respuesta de caballos infectados con EPM al tratamiento con toltrazuril sulfona EJEMPLO 4 : Con el fin de determinar el alcance de protección proporcionado por el ponazuril, se llevó a cabo un ensayo in vi tro. Se evaluaron las siguientes cepas de parásitos en cuanto a su sensibilidad para este compuesto: Cepa SN3 de Sarcocys- tis neurona; cepa SFl de Sarcocystis falcatula; cepa RH de Toxoplasma gondii ; y la cepa NC-1 de Neospora caninum. El ponazuril fue ensayado a 2 concentraciones (1 µg/mL y 10 µg/mL) . Se utilizaron células de turbinado bovino (BT) para to- dos los estudios in vi tro. Las células se hicieron crecer hasta confluencia en matraces de 25 cm2 en medio RMPI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% v/v (FBS) , 100 unidades de penicilina (G/mL) , 100 mg de estreptomicina/mL y 5x 10"2 mM de 2 -mercaptoetanol . Después de conseguirse la con-fluencia de las células, se mantuvieron las células en el mismo medio con FBS reducido (2% v/v) . Los cultivos celulares se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada conteniendo 5% de dióxido de carbono y 95% de aire. Para el crecimiento de los parásitos, se infectaron monocapas de células BT con parásitos y se examinaron con un microscopio invertido en cuanto al desarrollo de lesiones (efecto citopático, "CPE") o la presencia de muchos merozoi-tos extracelulares. Una vez que se observaron las lesiones, o que hubo presentes muchos parásitos extracelulares, la mono-capa fue raspada con la punta de una pipeta de 5 mL y se transfirieron 1 a 3 gotas de fluido conteniendo los merozoi-tos a dos matraces de células BT frescas. Los merozoitos de S. neurona y S. falcatula fueron transferidos de este modo cada 5 a 10 días mientras que los tachizoitos de T. gondii y N. caninum se transfirieron cada 3 a 4 días. El ensayo utilizado para determinar la efectividad del ponazuril fue el "Microtiter Monolayer Disruption Assay" (MMDA) . Este ensayo se utilizó para determinar si los parásitos o el compuesto eran tóxico para las células BT. Se inocu-laron placas de microvaloración de 96 pocilios de fondo plano con células BT y se utilizaron las monocapas resultantes para determinar los efectos del toltrazuril y ponazuril sobre la producción de merozoitos como se midió por CPE (formación de placas) . Se inocularon las monocapas con parásitos (S. neuro-na o S. falcatula hasta un contaje de 50.000/pocillo, T. gondii hasta un nivel de 10.000/pocillo, y N. caninum a 20.000/pocillo. Todos los pocilios se inocularon con el compuesto de ensayo 2 horas después de la infección. Los pocilios con la monocapa sin tratar ni infectar sirvieron como controles para el parásito y las células BT tratadas con el agente sin infectar sirvieron como controles de toxicidad. Cada tratamiento fue examinado en replicados de 6. Cada pocilio fue monitorizado visualmente a diario y el ensayo se de-tuvo cuando el 90-100% de las células infectadas de merozoitos sin tratar se hubieron lisado (90-100% CPE) . Todos los pocilios de las placas se enjuagaron con suero salino tampo-nado con fosfato (PBS) y se fijaron en metanol al 100% durante 5 minutos después de lo cual se tiñeron con solución de violeta cristal. Las áreas de destrucción inducida de los merozoitos o las células BT muertas a causa de la toxicidad no captaron el violeta cristal. Se utilizó un lector de placa ELISA para cuantificar la incorporación de violeta cristal y estos datos se utilizaron para determinar la concentración de ponazuril que inhibe la destrucción al 50% (Concentración In-hibitoria50 o CI50) - Los datos mostrando la inhibición se presentan en la Tabla 4. Se observa que una cantidad tan pequeña como 1 µg/mL de ponazuril proporciona el 100% de inhibición de la destrucción celular producida por N. caninum, T. gondii y S. falcatula mientras que se precisaban 10 µg/mL de ponazuril para producir el 100% de inhibición de la destrucción celular por S. neurona . Esto indica que las triazinonas tales como toltrazuril y ponazuril serían eficaces para el tratamiento de enfermedades provocadas por coccidios que es sabido que están asociados a los síndromes de enfermedades neurológicas y abortivas incluyendo enfermedades producidas por S. neurona, N. caninum, N. hugesi y T. gondii . Adicionalmente, el ponazuril no fue tóxico para las células BT.

TABLA 4 : Datos in vitro de ponazuril Organismo Porcentaje de inhibición de destrucción celular 0 , lµg/ml Iµg/ml 5,0µg/ml lOµg/ml Sarcocystis 0 40 90 100 neurona Sarcocystis 61 100 100 100 falcatula Organismo Porcentaje de inhibición de destrucción celular 0, 00lµg/ml 0,0lµg/ml 0,lµg/ml l,0µg/ml Neospora 3 13 100 100 caninum NC-1 Toxoplasma 11 16 100 100 gondii EJEMPLO 5: Este experimento se llevó a cabo con el fin de determinar si las triazinonas tales como el toltrazuril podían pasar la barrera sangre-cerebro. Se dividieron caballos normales en tres grupos de tres caballos por grupo. Los caballos del Gru-po 1 recibieron toltrazuril administrado oralmente como una suspensión al 5% a un nivel de dosificación de 2,5 mg/Kg. Los caballos del Grupo 2 recibieron toltrazuril administrado oralmente como una suspensión al 5% a un nivel de dosificación de 5,0 mg/Kg. Los caballos del Grupo 3 recibieron tol-trazuril administrado oralmente como una suspensión al 5% a un nivel de dosificación de 7,5 mg/Kg. Las dosis se repitieron diariamente durante 10 días. Se extrajeron muestras de sangre a las 48, 96 y 240 horas y se midió la concentración de toltrazuril, toltrazuril sulfóxido y ponazuril en el suero. Diez días después del comienzo del tratamiento (día 10), se extrajo una muestra de fluido cerebro-espinal de cada caballo y, de nuevo, se midieron las concentraciones de toltrazuril, toltrazuril sulfóxido y ponazuril en estas muestras. Las concentraciones de toltrazuril, toltrazuril sulfóxido y ponazuril en el suero y el fluido cerebro-espinal se proporcionan en las TABLAS 5a y 5b. La concentración de ponazuril en la sangre y fluido cerebro-espinal después del tratamiento de los caballos con toltrazuril fue significativa, mientras que la concentración de ponazuril en el fluido cerebroespinal después del tratamiento de los caballos con toltrazuril fue esencialmente equivalente a la concentración del propio toltrazuril. Esto es una evidencia de que, ambos, toltrazuril y ponazuril cruzan eficazmente la barrera sangre-cerebro y de que el ponazuril cruza esta barrera más eficazmente que el toltrazuril . Los datos sugieren para un experto en el campo que las triazinonas pueden también cruzar eficazmente la barrera placentaria.

TABLA 5a Niveles de fármaco en caballos después de dosis repetidas de toltrazuril TABLA 5b Niveles de fármaco en caballos después de dosis repetidas de ponazuril Aunque la invención se ha descrito con detalle en lo que antecede con fines de ilustración, se entiende que tal detalle es solamente para ese propósito y que pueden hacerse variaciones en ella por los expertos en el campo sin apartarse del espíritu y alcance de la invención excepto en lo que pueda estar limitada por las reivindicaciones.

Claims (19)

Reivindicaciones

1. En un método mejorado de tratamiento terapéutico de un animal enfermo que padece una enfermedad abortiva o neurológica parasitaria que es susceptible de ser tratada con un compuesto de triazinona, que comprende la administración al animal de una cantidad farmacéuticamente efectiva del compuesto, la mejora que comprende el compuesto de triazinona que es ponazuril.

2. El método de la Reivindicación 1 donde la enfermedad parasitaria está causada por coccidios.

3. El método de la Reivindicación 2 donde el coccidios es un miembro de la familia Sarcocystidae.

4. El método de la Reivindicación 3 donde el miembro de la familia Sarcocystidae se selecciona del grupo formado por Sarcocystis, Neospora y Toxoplasma .

5. El método de la Reivindicación 4 donde el Sarcocystis se selecciona del grupo formado por Sarcocystis spp, el Neospora se selecciona del grupo formado por Neospora hugesi y el Toxoplasma se selecciona del grupo formado por Toxoplasma gondi i .

6. El método de la Reivindicación 5 donde el Sarcocystis spp es Sarcocystis neurona, el Neospora spp es Neospora caninum o Neospora hugesi y el Toxoplasma spp es Toxoplasma gondii .

1 . El método de la Reivindicación 4 donde el Sarcocystis es Sarcocystis neurona causante de Mielo encefalitis Protozoaria Equina.

8. El método de la Reivindicación 4 donde el Neospora es Neospora caninum causante de la Neosporosis bovina o canina.

9. El método de la Reivindicación 4 donde el Toxoplasma es Toxoplasma gondii .

10. Un método mejorado de tratamiento metafiláctico de animales infectados con un parásito que es un agente causante de una enfermedad abortiva o neurológica que es susceptible de ser tratada con un compuesto de triazinona, que comprende la administración al mismo de un régimen metafilácticamente efectivo del compuesto de triazinona, la mejora que comprende el compuesto que es ponazuril .

11. El método de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 10 donde se administra ponazuril en dos o más dosis intermitentes .

12. El método de la Reivindicación 11 donde la dosis intermitente se administra en una cantidad comprendida entre 1,0 y 100 mg/kg.

13. El método de la Reivindicación 10 donde el ponazuril se administra hasta que el animal ha desarrollado una inmunidad protectora .

14. El método de la Reivindicación 1 o Reivindicación 10 donde el ponazuril se administra en una cantidad entre 2,5 mg/kg y 10 mg/kg.

15. El método de la Reivindicación 1 donde el ponazuril se administra en una dosis única elevada de más de 10 mg/kg.

16. El método de la Reivindicación 1 donde el ponazuril se administra en un régimen de 2,5 mg/kg a 10 mg/kg diario durante un período de 28 días.

17. Una composición terapéutica que comprende (a) ponazuril en una cantidad farmacéuticamente efectiva para tratar una animal enfermo que es susceptible al mismo (b) un portador, y (c) opcionalmente, un agente auxiliar.

18. La composición de la Reivindicación 17 que está en forma de pasta.

19. Un método para tratar la mieloencefalitis protozoa-ria equina EPM que comprende administrar a un equino, que se sospecha que la sufre, una cantidad terapéuticamente efectiva de ponazuril.