MXPA01005907A - Union con patron de microesferas funcionalizadas para biosensores a base de difraccion optica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un sistema barato y sensible y un método para detectar no analitos presentes en un medio. El sistema comprende un elemento mejorador de difracción, tal como las microesferas funcionalizadas, las cuales son modificadas de manera que estas sean capaces de aglutinarse con un analito de objetivo. Adicionalmente, el sistema comprende una película de polímero, la cual puede incluir un recubrimiento de metal sobre el cual estáimpreso un patrón predeterminado y especifico de receptores específicos de analito. Con la sujeción del analito de objetivo a lasáreas seleccionadas de la película de polímero, ya sea directamente o con el elemento incrementador de difracción, la difracción de la luz transmitida y/o reflejada ocurre a través de las dimensiones físicas y definidas, la colocación precisa del analito. Una imagen de difracción es producida la cual puede ser vista fácilmente con el ojo u opcionalmente con un dispositivo sensor.

Description

UNION CON PATRÓN DE MICROESFERAS FUNCIONALIZAPAS PARA BIOSENSORES A BASE DE DIFRACCIÓN ÓPTICA CAME'O TÉCNICO La presente invención está generalmente en e campo de la detección de analitos en un medio y, má particularmente, la presente invención se refiere al uso d microesferas funcionalizadas para incrementar la difracció óptica con el uso sencillo, de sensores desechables para indica la presencia del analito en un medio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Hay muchos sistemas y dispositivos disponibles para detectar una amplia variedad de analitos en varios medios. La mayoría de estos sistemas y dispositivos son relativamente cares y requieren de un técnico entrenado para efectuar la prueba. Hay muchos casos donde podrá ser ventajoso para ser capaces de rápidamente y de manera barata determinar si un analito está presente. Lo que se necesita es un sistema biosensor que sea fácil y barato de fabricar y que sea capaz de manera sensible y confiable detectar analitos, incluyendo los analitos más pequeños .

En Sandstrom y otros, 24 Óptica Aplicada 472, 1985, se describe el uso de un substrato óptico de sílice con un capa de monóxido de sílice y una capa de sílice formada com películas dieléctricas. Estas indican que un cambio en el espeso de la película cambia las propiedades del substrato óptico par producir diferentes colores relacionados con el espesor de l película. El espesor de la película está relacionado con el colo observado y una película proporcionada encima de un substrat óptico puede producir un cambio de color visible. Los autore indican que un modelo matemático puede ser usado para cuantifica el cambio de color, y que "los (c)álculos efectuados usando u modelo de computadora muestran que se puede ganar muy poco en el rendimiento óptico del uso de una estructura de capas múltiples... pero una biocapa en la superficie cambia muy poco la reflsxión de tales estructuras ya que las propiedades ópticas son determinadas principalmente mediante las interfases dentro de la estructura de capas múltiples. El sistema más sensible para detectar las biocapas es un revestimiento de capa sencillo, mientras que en la mayoría de otras aplicaciones el rendimiento puede ser mediante capas dieléctricas adicionales" .

Sandstrom y otros, siguen indicando que los deslizamientos formados de los óxidos de metal en el metal tienen ciertos inconvenientes, y que la presencia de iones de metal pueden también ser dañinos en muchas aplicaciones bioquímicas.

Ellos se indican que la película dieléctrica superior es una de 2 a 3 nanómetros de espesor de dióxido de sílice el cual es formada espontáneamente cuando la capa de monóxido de sílice depositada en la atmósfera a temperatura ambiente, y que una ca de 70 a 95 nanómetros de dióxido de sílice en una capa de 40 a nanómetros de monóxido de sílice pueden ser usadas en un sustra de plástico o de vidrio. Ellos también describe en la formaci de una cuña de monóxido de sílice mediante el grabado selecti de] monóxido de sílice, el tratamiento de la superficie dióxido de sílice con diclorodimetilsilano, y la aplicación uncí biocapa de antígeno y de anticuerpo. De esta construcción cufia ellos fueron capaces de determinar el espesor de la pelícu con un elipsómetro, y notar que el "contraste máximo f encontrado en la región de alrededor de 65 nanómetros donde int.erferencia de color cambió de morado a azul". Ellos se indic que la sensibilidad de tal sistema es lo suficientemente al paira la detección de antígeno de proteína mediante l anticuerpos inmovilizados. Ellos concluyen que "los diseños dad son suficientemente sensibles para un rango amplio aplicaciones . Estos materiales, por ejemplo, el vidrio, sí?ice, y los óxidos de sílice, son químicamente inertes y afectan la reacción bioquímica estudiada. Usando l computaciones anteriores es posible el diseñar deslizamientos q sean optimizados para diferentes aplicaciones. Los deslizamient pueden ser fabricados y su calidad asegurada mediante métod industriales, y dos diseños están ahora comercialment disponibles .

La patente de los Estados Unidos de América No 5,512,131 otorgada a Kumar y otros describe un dispositivo qu incluye un substrato de polímero que tiene un revestimiento d metal. Una capa receptora específica de analito está estampada e el substrato revestido. El dispositivo es usado en un proces parót estampar o como un interruptor. Un patrón de difracción e generado cuando una analito se une a un dispositivo. U dispositivo de visualización, tal como un espectómetro, e entonces usado para determinar la presencia del patrón d difracción.

Sin embargo, el dispositivo descrito por Kumar otros tiene varias desventajas. Una desventaja es que se necesit un dispositivo de visualización extra para observar cualquie patrón de difracción. Al requerir un dispositivo d visualización, el dispositivo de Kumar y otros no permite a u número grande de muestras ser probadas ya que no es posible e determinar la presencia de una analito mediante el uso del oj sin ayuda. Adicionalmente, este dispositivo no es capaz d detectar a analitos pequeños ya que éstos han hálitos no produce un patrón de difracción perceptible.

La patente de los Estados Unidos de América No. 5,432,830 otorgada a Bogart y otros, describe un dispositivo qu inc Luye un substrato el cual tiene una superficie ópticament activa que exhibe un primer color en respuesta al golpe de la lu en el mismo. Este primer color es definido como una distribució espectral de la luz que emana. El substrato también exhibe u segundo color el cual es diferente del primer color (al tener un combinación de ondas de longitud de luz las cuales difieren d esa combinación presenté en el primer color, o que tienen un distribución es pectoral diferente, o porque tienen un intensidad de uno o de más longitudes de onda diferentes d aquellas presentes en el primer color) . El segundo color e exhibido en respuesta a la misma luz cuando el analito est presente en la superficie. El cambio de un color a otro puede se medido ya sea mediante el uso de un instrumento, o mediante l vista. Tal detección sensible es un avance sobre los dispositivo descritos por Sandstrom y Nygren, mencionado anteriormente, permiten el uso de dispositivos en una manera competitivas disponibles comercialmente.

Sin embargo, el método y el dispositivo descrito en La patente de Bogart y otros, tiene varias desventajas. Un desventaja es el alto costo del dispositivo. Otro problema con e dispositivo es la dificultad de controlar las varias capas qu son colocadas sobre el disco para que uno obtenga una lectur confiable .

Adicionalmente, los biosensores que tienen un monocapa de autoensamble han sido usados para detectar a analito y están descritos en las solicitudes de patente de los Estados Unidos de América Nos. 08/768,449 y 08/991,844, ambas de las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad. Sin embargo, estos biosensores actualmente no tienen el requisito de sc sibilidad requerido para detectar los analitos más pequeños ya que éstos analitos más pequeños no producen un patrón de difracción suficiente para ser visibles.

Algunas tecnologías de flujo lateral comerciales han sido usadas las cuales se emplean tecnología de glóbulo de látex. Estas tecnologías son empleadas actualmente en la mayoría de los juegos de diagnosticó caseros disponibles comercialmente (por ejemplo los juegos de ovulación y de embarazo) . Estos juegos usan glóbulos coloreados los cuales acumulan en una "zona capt rada" definida hasta aquel la cantidad de glóbulos se vuelvan visibles a la vista sin ayuda. Sin embargo, el estos sistemas no tienen el requisito de sensibilidad para probar muchos analitos, ya que un número más grande de glóbulos de látex deben unirse en la zona capturada para ser visibles a simple vista que esa requerida para hacer la difracción en el mismo tamaño de zona. Generalmente, el número de robos y necesarios es de alrededor de 2 a 3 órdenes de magnitud más altas que los sensores de la presente invención.

Lo que se necesita es un sistema de biosensor que sea fácil y barato de fabricar y que sea capaz de sensiblemente y confiablemente detectar los analitos, incluyendo los analito más pequeños .

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un sistema y u método sensible y barato para detectar analitos presentes en u medio. El sistema comprende un dispositivo biosensor que tien una película de polímero sobre la cual está impreso un patró pre eterminado, específico de receptores específicos de analito. La película de polímero puede estar revestida con una capa de metal. Adicionalmente, el sistema utiliza "elementos que incrementa la difracción" los cuales son capaces de unirse al analito objetivo y al biosensor y son capaces de producir un cambio substancial en la altura y/o en el índice refractivo, por lo que incrementa la eficiencia de difracción del biosensor y que peririten la detección de analitos más pequeños. En uso, una analito objetivo se acopla ya sea al elemento que incrementa la difracción, el cual entonces se acopla al biosensor, o directamente a las áreas seleccionadas de la película de polímero sobre la cual el receptor está impreso. Entonces la difracción de luz transmitida y/o reflejada ocurre por medio de las dimensiones físicas y la colocación precisa, definida del analito. Una imagen de difracción es producida la cual puede ser fácilmente vista por el ojo o, opcionalmente, con el dispositivo sensor.

El sistema de la presente invención es mucho má sensible que los sistemas baratos actuales. El sistema de l presente invención es capaz detectar analitos de peso molecula bajos a altos, microorganismos, y el especies de DNA y RNA e muestras de fluido. Más específicamente, el sistema es capaz d detectar hormonas, esteroides, anticuerpos, metabolitos de droga y aún ácidos nucleicos, entre otros. Esta vez una expansió significativa de la tecnología sensora de difracción óptica com est descrita en las solicitudes de patente de los Estados Unido de América Nos. 08/768,449 y 08/991,844.

La presente invención utiliza elementos qu incrementa la difracción, tales como las microesferas de látex los cuales asisten en la detección de analitos más pequeños Normalmente, después de que un analito se une a un recepto específico de analito en un biosensor, el analito podrá difracta o reflejar la luz transmitida para producir un patrón d difracción. Si el analito es más grande, el patrón de difracció es capaz de ser observado a simple vista. Sin embargo, alguno ana..itos son muy pequeños tal que el patrón de difracció producido no es capaz de ser visto. Mediante el uso de elemento que incrementa la difracción, el biosensor que tiene materia receptor específico de analito puede ser usado para detecta estos analitos más pequeños. Los elementos que incrementan l difracción usados son capaces de unirse al analito, entonces e elemento con el analito unido se une al biosensor. Entonces, mientras que la luz es transmitida a través o reflejada desde el biosensor, el elemento incrementa el patrón de difracción generado por el analito tal que el patrón de difracción que resulta puede ser observado a simple vista.

La presente invención también utiliza métodos de impresión de contacto de receptores específicos de analito, con patrón. Los receptores específicos de analito tienen materiales receptores unidos a los mismos. Los materiales receptores son específicos para una clase de analito o de analito en particular, dependiendo del receptor usado. Los métodos de impresión de contacto los cuales puedan ser útiles en generar los dispositivos sensores usados en el presente sistema son descritos completamente en las solicitudes de patente de los Estados Unidos de América Nos. 08/707,456 y 08/769,594, ambas de las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad. Sin embargo, ya que estos métodos ser relacionan con las monocapas de autoensamble, los métodos necesitan ser ligeramente alterados, como se describe abajo, para imprimir el material receptor de analito específico ya que este material no es de autoensamble.

Las capas receptoras de analito específico con patrón permiten la colocación controlada de analitos y/o de elementos que incrementan la de difracción de los mismos por medio de los patrones de receptores de analitos específicos. Los dispositivos biosensores producidos de la presente invención son usados mediante primero exponer el dispositivo biosensor a un medio que contiene el analito preferido mezclado con el elemento que incrementa la difracción. Entonces, después de un periodo de incubación apropiado, una luz, tal como un láser u otra fuente de luz <ie punto, es transmitido a través de o reflejado desde la película. Si el analito está presente en el medio y es unido, ya sea directamente o en conjunto con el elemento que incrementa la difracción, a los receptores en la capa receptora de analito específico con patrón, la luz es difractada en tal forma como para producir una imagen visible. En otras palabras, las capas receptoras de analito especifico con el analito y/o el elemento que incrementa la difracción unidos al mismo pueden producir patrones de difracción ópticos los cuales difieren dependiendo en la reacción de los receptores en la capa receptora de analito específico con el analito de interés. La luz puede estar en el espectro visible, y ser ya sea reflejada desde la película, o transmitida a través del mismo, y el analito puede ser cualquier compuesto o partícula que reacciona con la capa receptora de anal to específico. La los puede ser una luz blanca o una radiación electromagnética monocromática en la región visible. Mientras que la luz visible es la fuente de luz deseada, la presente invención puede también ser usada con fuentes de luz de punto no visibles, tal como la al luz cercanamente infrarroja, acoplada con un detector. El espesor de la película y el tamaño de la micropartícula puede ser ajustada para compensar por la fuent.e de luz no visible. Adicionalmente, la presente invención también proporciona un soporte flexible para una capa receptora de analito específico ya sea directamente en el substrato o sobre oro u otra aleación de metal o metal apropiado.

La presente invención proporciona una capa receptora de analito específico en oro u otro material el cual es apropiado para la producción en masa. Los biosensores usados en la presente invención pueden ser producidos como una prueba sencilla para detectar un analito o pueden ser formateados como un dispositivo de prueba múltiple. Los biosensores de la presente invención pueden ser usados para detectar (1) antígenos o anticuerpos asociados con las condiciones médicas, (2) La contaminación en las prendas, tales como los pañales, y (3) la contaminación mediante microorganismos.

En otra incorporación de la presente invención, los nutrientes para una clase específica de microorganismos pueden ser incorporados en la capa receptora de analito específico. En esta manera, concentraciones muy bajas de microorganismos pueden ser detectados mediante primero haciendo contacto con el biosensor de la presente invención con los nutrientes incorporados en el mismo y entonces incubados, si es necesario, el biosensor bajo condiciones apropiadas para el crecimiento del microorganismo unido. Al microorganismo se le permite crecer hasta que haya suficientes organismos para formar un patrón de difracción.

La presente invención también puede ser usada en lentes de contacto, lentes, hojas de vidrio, frascos farmacéuticos, contenedores de solvente, botellas para agua, vendajes adhesivos, y similares para detectar la contaminación.

Estas y otras características y ventajas de la presente invención podrán ser evidentes después de revisar la siguiente descripción detallada de las incorporaciones descritas.

BREV1S DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra un biosensor capaz de simulténeamente medir varios analitos diferentes en un medio.

La figura 2 es un esquemático de la impresión por contacto de las capas receptoras de analito específicos.

La figura 3 es una imagen microscópica de una fuerza atómica del oro evaporado en MYLAR®, ha adquirido de Courtaulds Performance Films ( Canoga Park, CA) . La aspereza promedio de la capa de oro es de 3 a 4 nanómetros, con asperezas máximas de 9 nanómetros .

La figura 4 es una fotomicrografía SEM que muestra una acoplamiento con patrón de elementos que incrementa la difracción en la presencia de un analito.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención muestra dispositivos biosensores mejorados, y los métodos para usar tales dispositivos biosensores, para detectar y cuantificar la presencia o la cantidad de un analito de interés dentro de un medio. La presente invención es mucho más sensible y puede ser usada para detectar analitos más pequeños los cuales, hasta ahora, no eran capaces de ser detectados sin el uso de instrumentos muy costosos. Los analitos que pueden ser detectados mediante la presente invención incluyen, pero no están limitados a, las hormonas, las proteínas tales como los anticuerpos, los esteroides, los metabolitos de droga, los ácidos nucleicos, los micro organismos tales como la bacteria, las levaduras, los hongos y los virus. En contraste con los dispositivos anteriores, aquellos de la presente invención permiten la detección de cantidades extremadamente pequeñas y tamaños de analitos en un medio en un ensayo y rápido que dura solamente unos pocos minutos. Adicionalmente, ninguna señal o componentes electrónicos asociados son requeridos en la presente invención. La presente invención comprende la impresión por micro contacto de receptores de analito específicos en la película de polímero, la cual pueden tener un revestimiento de metal en el mismo. La invención permite para el desarrollo de biosensore desechables, de uso único basados en la difracción de la luz par indicar la presencia del analito. Adicionalmente, la present invención incluye los elementos que incrementan la difracción lo cuales incrementan la eficiencia de la difracción del biosensor por lo que hace posible el detectar cualquier número de analito diferentes. Al acoplarse aún analito objetivo en área seleccionadas de la película de polímero los cuales contienen e receptor, ya sea directamente o en combinación con un element que incrementa la difracción, la difracción de luz reflejada y/ transmitida ocurre mediante las dimensiones físicas y l colocación precisa, definida del analito. Por ejemplo, l levadura, el hongo o la bacteria son los suficientemente larga paréL actuar como elementos de difracción para la luz visibl cuando son colocados en patrones organizados en una superficie. Sin embargo, los analitos más pequeños, tales como los virus, la proteínas, las moléculas, las hormonas, los esteroides, lo metabolitos de droga y los ácidos nucleicos, son solament capaces de actuar como elementos de difracción apropiados cuand son también unidos a un elemento que incrementa la difracción. Adicionalmente a producir una imagen de difracción simple, los patrones de analitos puede ser tal y como para permitir el desarrollo de una imagen sensible holográfica y/o un cambio en el color visible. Por lo tanto, la aparición de un holograma o un cambio en un holograma podrá indicar una respuesta positiva. El patrón hecho mediante la difracción de la luz transmitida puede ser de cualquier forma que incluye, pero no está limitada a, la transformación de un patrón de un patrón a otro a la unión del analito con el material receptivo. En las incorporaciones preferidas particulares, el patrón de difracción es discernible en menos de una hora después del contacto de la analito con el dispositivo biosensor de la presente invención.

El injertado de difracción el cual produce la difracción de la luz en la interacción con el analito y/o elemento deberá de tener una periodicidad mínima de la onda de longitud de la luz incidente. Los analitos muy pequeño pueden ser detectados indirectamente mediante el uso de partículas de elemento que incrementa la difracción que son específicos para el analito pequeño. Una incorporación en la cual el analito pequeño puede ser detectado comprende revestir la particular de elemento, tal como un glóbulo de látex, con un material receptor y específicamente se une al analito de interés.

Una variedad de métodos pueden ser usados para acoplar el material receptor en la partícula que incrementa la difracción. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, la fisisorpción sencilla a una partícula hidrofóbica (por ejemplo, unir una proteína en partículas de poliestireno) ,- que une usando un eslabonador de proteína A o de proteína G; que une usando un eslabonador de avidin-biotina o de estreptavidina; o que une usando un acoplador covalente. Una incorporación preferida de la presente invención es el usar una cooperador carbodiimida de u receptor proteinaceo a partículas carboxilatadas. Otros método de acoplamiento bien conocidos para aquellos con una habilidad e el arte pueden igualmente ser usados.

Las partículas de elemento que incrementan l difracción que pueden ser usadas en la presente invenció incluyen, pero no están limitadas a, el vidrio, la celulosa, lo plásticos o los polímeros sintéticos, el látex, el poliestireno, el policarbonato, las células fungosas o bacteriales y similares. Las partículas son preferiblemente en forma esférica, pero la configuración espacial y estructural de la partícula no es crítica en la presente invención. Por ejemplo, las partículas pueden ser astillas, elipsoides, cubos, y similares. Un tamaño de partícula al deseable está en el rango de diámetro de aproximadamente 0.1 µm a 100.0 µm, deseablemente entre aproximadamente 0.3 µm a 1 µm. La composición de la partícula elemento no es crítica en la presente invención. Preferiblemente, la diferencia en el índice refractivo entre el medio y el elemento que incrementa está entre de 0.1 y 1.0. Más preferiblemente, la deferencia a en el índice de refractivo entre el medio y el elemento que incrementa es entre 0.2 y 0.7.

La capa receptora de analito específico en la película de polímero contiene un material receptivo, tal como un anticuerpo, que podrá específicamente unir a un epítrope en un analito que es diferente del epítrope usado en la unión a l partícula. Por lo tanto, para decretar una analito pequeño, ta come» las partículas virales, el medio es primero expuesto a las partículas de elemento que incrementan la difracción, tal com las partículas de látex, a las cuales se unen las partículas vire.les. Entonces, las partículas de elemento que incrementa la difracción son opcionalmente lavadas y expuestas a la película de polímero con las capas receptoras de analito específicos que contienen los anticuerpos específicos del virus. Los anticuerpos entonces se unen a las partículas virales en la partícula de elemento por lo que inmovilizan las partículas de elemento en el mismo patrón como los receptores en la película. Debido a que las partículas de en el elemento unidas podrán hacer la difracción y de la luz visible, un patrón de difracción es formado, que indica la presencia de la partícula viral en el líquido. Adicionalmente, la película de polímero puede incluir un revestimiento de metal en La misma. La capa receptora de analito específico podrá entonces estar localizada en la superficie metalizada de la película.

Alternativamente, el analito puede ser detectado mediante primero de exponer el substrato al medio que contiene el analito y hace que el analito se una al material de capa receptora de analito específico. Luego, una solución que contiene partículas de elemento que incrementan la difracción hace contacto con el substrato que tiene el analito unido al mismo.

Las partículas entonces se unen con el analito. Debido a que la partículas de elemento unidos podrán hacer la difracción de la luz visible, un patrón de difracción es formado, que indica l presencia del analito en el líquido.

Finalmente, en una incorporación preferida, el bioeensor, las partículas de elemento que incrementa la difracción y el medio que contiene el analito pueden ser simultáneamente mezclados. Esto podrá resultar en una combinación de los procedimientos que unen descritos anteriormente. Algunos de los analitos primero se unirán con una partícula de elemento que incrementa la difracción antes de unirse con el substrato. Otros analitos podrán primero unirse con el substrato y entonces unirse con una particular de elemento. Cuando una fuente de punto de luz es mostrada a través del sensor, un patrón de difracción es formado, que indican la presencia del analito en el líquido.

Los analitos que son entonces contemplados que son detectados usando la presente invención incluyen, pero no están limitados a, la bacteria; las levaduras; el hongo; los virus; el factor reumatoide; los anticuerpos, que incluyen, pero no están limitados a los anticuerpos IgC, IgM, IgA e IgE; el antígeno carcinoembriónico; el antígeno estreptococo Grupo A; los antígenos virales; los antígenos asociados con la enfermedad autoinmune: los alérgenos; los antígenos de tumor; el antígeno el estreptococo Grupo B; el antígeno HIV I o HIV II; o respuesta anfitrión (anticuerpos) a estos y otros virus; los antígeno específicos a RSV o a la respuesta anfitrión (anticuerpos) al virus; un antígeno; una enzima; una hormona; un polisacárido; una proteína; un lípido; un carbihidrato; un ácido nucleico o droga; la Salmonella species; la Candida species, que incluye, pero no está limitada a la Candida albicans y a la Candida tropicalis; la Salrr.onella species; la Nei sseria meningi tides grupos A, B, C, Y y W sub 135, el Streptococcus pneumoniae, el E. coli Kl , la haemophilus influenza tipo B; un antígeno derivado de los microorganismos; un haptano, una droga de abuso; una droga terapéutica; un agente de medio ambiente; y los antígenos específicos al Hepatitis.

En otra incorporación de la presente invención, los nutrientes para una clase específica de microorganismos pueden ser incorporados en la capa receptora de analito específico. En esta manera, concentraciones muy bajas de microorganismos pueden ser detectados mediante primero contactar el biosensor de la presente invención con los nutrientes incorporados en el mismo y entonces incubando el biosensor bajo condiciones adecuadas para el crecimiento del microorganismo unido. Al microorganismo se le permite crecer hasta que haya suficientes organismos para formar un patrón de difracción. Por supuesto, en algunos casos, el microorganismo está presente o puede multiplicarse lo suficiente para formar un patrón de difracción sin la presencia de un nutriente en la monocapa con patrón. Una parte de la presente invención es el material receptor de analito específico que puede ser micro impreso en la película de polímero y que podrá específicamente unirse al analito de interés. Por lo tanto, el material receptor es definido como una parte de un par de unión específico e incluye, pero no está limitado a, el anticuerpo/antígeno, substrato/enzima , DNA/oligonucleotido, metal/quelator, inhibidor/enzima, receptor/bacterial, receptor/virus, receptor/hormona, DNA/RNA, o RNA/IINA, oligonucleótido/RNA, y la unión de estas especies a cualesquiera otras especies, así como la interacción de estas especies con especies inorgánicas. Adicionalmente, cuando una película de polímero metalizada es usada, el material receptor de analito de específico puede ser microimpreso en la superficie metalizada de la película.

El material receptor que está unido a la capa de acopiamiento es caracterizado mediante una habilidad de específicamente unir el analito o los analitos de interés. La variedad de materiales que pueden ser usados como material receptor están limitados solamente mediante los tipos de material los cuales podrán combinarse selectivamente (con respecto a cualquier muestra escogida) con el analito. Las subclases de materiales las cuales pueden ser incluidas en la clase total de materiales receptores incluye las toxinas, los anticuerpos, los antígenos, los receptores de hormona, los parásitos, las células los haptanos, los metabolitos, los alérgenos, los ácido nucleicos, los materiales nucleares, los autoanticuerpos, la proteínas de la sangre, los desperdicios celulares, las enzimas, las proteínas de tisú, los substratos de enzima, las coenzimas, los transmisores de neuronas, los virus, las partículas virales, los microorganismos, las proteínas, los polisacáridos, lo quelatores, las drogas, y cualquier otro miembro de un par unid específico. Esta lista solamente incorpora algunos de los mucho materiales diferentes que pueden ser revestidos en la capa d acoplamiento para producir un sistema de ensaye de películ delgada. Cualquiera que sea el analito seleccionado de interés es, el material receptor está diseñado para unirse con el analit de interés. Las incorporaciones preferidas, el dispositivo biosensor está configurado y arreglado para suministrar un patrón detectable mediante la vista en respuesta a la transmisión de una fuente de luz de punto cuando el analito de interés está emparedado entre el material receptor y un elemento que incrementa la difracción.

En muchas instancias, un "blanqueador" puede ser necesario para evitar la unión no específica. El término "blanqueador" como es usado aquí significa un reactivo que se adhiere a la superficie del sensor para que "bloquee" o evita que se unan los materiales no analitos a la superficie (ya sea en las áreas sin patrón o con patrón) . El paso de bloqueo puede ser hecho como un paso de postratamiento a una superficie la cual y está impresa por contacto ( "postbloqueo" ) , y es la técnic anormal para rellenar la regiones impresas no contactadas co otro tiol. Sin embargo, los inventores han descubierto que un técnica de "prebloqueo" es preferido sobre la técnica de post bloqueo. En la técnica de prebloqueo, la superficie del substrat es pretratada con un no tiol que contiene bloqueador y entonces impreso por contacto. No deseando que sean unidos en cualquie teoría, se teoriza que el material impreso por contacto (usualmente contenido de sulfuro) desplaza el bloqueador fisisorbido, por lo que permite al material receptor de analito específico a unirse directamente a la superficie del substrato. Un postbloqueo subsiguiente puede también ser efectuado, si se desea. Los blanqueadores pueden incluir, pero no están limitados a, la á-caseína, las albíminas tales como la albúmina de suero bovino, de plurónico u otros surfactantes, de polietileno de glicol, de polivinilo de alcohol, o los derivados de sulfuro de los compuestos anteriores, y de cualquier otro material de bloqueo conocido por aquellos con una habilidad ordinaria en el arte.

El aglomerante que contiene el analito de interés puede ser un fluido intersticial, un sólido, un gas, o un fluido corporal tal como el moco, la saliva, la orina, el material fecal, el tisú, la médula, el fluido espinal cerebral, el suero, la plasma, la sangre completa, el esputo, las soluciones tampón, las soluciones de extracto, el semen, las secreciones vaginales, las pericardíales, las gástricas, las peritoneales, las pleuras, un algodón de garganta u otros lavados y similares. El analito d interés puede ser un antígeno, un anticuerpo, una enzima, u fragmento de DNA, un gen intacto, un fragmento de RNA, un molécula pequeña, un metal, una toxina, un agente del medio ambiente, una ácido nucleico, un componente de citoplasma, un componente de flagela o pili, una proteína, un polisacárido, una droga, o cualquier otro material. Por ejemplo, el material receptor para la bacteria puede específicamente unirse al componente de membrana de superficie, una proteína o lípido, un polisacárido, una ácido nucleico, o una enzima. El analito el cual es indicativo de la bacteria puede ser un polisacárido o sacárido, una enzima, un ácido nucleico, un componente de membrana, una gangliosida o un anticuerpo producido por el anfitrión en respuesta a la bacteria. La presencia del analito puede indicar una enfermedad infecciosa (bacterial o viral) , cáncer, una alergia, u otro desorden médico o condición. La presencia del analito puede ser una indicación de agua o contaminación de alimento u otros materiales dañinos. El analito puede indicar abuso de droga o puede vigilar los niveles de los agentes terapéuticos.

Uno de los protocolos de ensaye encontrados más comúnmente para los cuales esta tecnología puede ser usada es un inmunoensaye . Sin embargo, las consideraciones generales aplican a las investigaciones de ácido nucleico, enzima/sustrato, y otro formatos de ensaye de 1iga/receptor . Para los inmunoensayes, u antj.cuerpo puede servir como el material receptor y/o puede se el analito de interés. El material receptor, por ejemplo u anticuerpo o un antígeno, debe de formar una capa reactiva, estc.ble en la capa de acoplamiento para el dispositivo de prueba. Si un anticuerpo es el material receptor, el anticuerpo debe d ser específico a la antígenos de interés; y el anticuerpo (material receptor) debe de unirse al antígeno (analito) co suficiente avidez que el antígeno el retenido en la superficie de prueba. En algunos casos, el analito puede no simplemente unir al material receptor, pero puede hacer que ocurra una modificación detectable del material receptor. En esta interacción puede causar un incremento en masa en la superficie de prueba o una disminución en la cantidad de material receptor en la superficie de prueba. Un ejemplo de lo anterior es la interacción de una enzitia degradativa o material con un substrato inmovilizado, específico. En este caso, uno podrá observar un patrón de difracción antes de la interacción con el analito de interés, pero el patrón de difracción podrá desaparecer si el analito estuviera presente. El mecanismo específico a través de la cual la unión, la hibridización, o la interacción del analito con el mate ial receptor ocurre no es importante para esta invención, pero pueden pactar las condiciones de reacción usadas en el protocolo de ensaye final. a las investigaciones de ácido nucleico, enzima/sustrato, y otros formatos de ensaye de liga/receptor. Para los inmunoensayes, un anticuerpo puede servir como el material receptor y/o puede ser el analito de interés. El material receptor, por ejemplo un anticuerpo o un antígeno, debe de formar una capa reactiva, estable en la capa de acoplamiento para el dispositivo de prueba. Si un anticuerpo es el material receptor, el anticuerpo debe de ser específico a la antígenos de interés; y el anticuerpo (material receptor) debe de unirse al antígeno (analito) con suficiente avidez que el antígeno el retenido en la superficie de prueba . En algunos casos, el analito puede no simplemente unir al material receptor, pero puede hacer que ocurra una modificación detectable del material receptor. En esta interacción puede causar un incremento en masa en la superficie de prueba o una disminución en la cantidad de material receptor en la superficie de prueba. Un ejemplo de lo anterior es la interacción de una enzima degradativa o material con un substrato inmovilizado, específico. En este caso, uno podrá observar un patrón de difracción antes de la interacción con el analito de interés, pero el patrón de difracción podrá desaparecer si el analito estuviera presente. El mecanismo específico a través de la cual la unión, la hibridización, o la interacción del analito con el material receptor ocurre no es importante para esta invención, pero pueden pactar las condiciones de reacción usadas en el protocolo de ensaye final.

En general, el material receptor puede se pasivamente aplicado a la capa del substrato. Si se requiere, lo grupos funcionales libres introducidos en la superficie de prueb mediante la capa de acoplamiento puede ser usada para e acoplamiento covalente del material receptor a la superficie d prueba .

Un amplio rango de técnicas pueden ser usadas par aplicar el material receptor a la capa de substrato. La superficies de prueba pueden ser revestidas de con el materia receptor mediante la aplicación de una solución en patrones o e arreglos discretos; el rociado, el chorro de tinta, la impresió por contacto u otros métodos de impresión; o imprimiendo u material bloqueador en un patrón seguido por la inmersión tota o eL revestido centrífugo con el material receptor. La técnic seleccionada deberá de minimizar la cantidad de material recepto requerida para revestir un número grande de superficies de prueb y mantener la estabilidad/funcionalidad del material recepto durante la aplicación. La técnica deberá también aplicar adherir el material receptor a la capa de acoplamiento en un manera controlada y muy uniforme.

El dispositivo biosensor de la presente invención utiliza los métodos de impresión por contacto de capas receptoras de analito específico, con patrón en películas de polímero metalizadas o de polímero, deseablemente transparentes o semitransparentes, las composiciones producidas de ese modo, y e uso de estas composiciones. Las capas receptoras de analit específico con patrón permiten para la colocación de acoplamient (o unión) controlada del receptor de analito. El término "capa receptoras de analito específico con patrón en el mismo" como e usado aquí significa que las capas receptoras de analit específico en cualquier patrón en las películas de polímer metalizadas o de polímero, que incluyen un patrón sólido.

Cuando la película con las capas receptoras d analito específico con patrón en el mismo es expuesta a u analito que es capaz de reaccionar con la capa receptora de analito específico, la película podrá producir patrones de difracción óptica la cual difiere dependiendo de la reacción en la capa receptora de analito específico y con patrón con el analito de interés. El medio podrá contener las partículas de elemento que incrementan la difracción. El medio puede ser un fluido de tensión de superficie superior tal como el agua. La luz puede estar en el espectro visible, y puede ser ya sea reflejada desde la película, y o transmitida a través de ella, y en la analito puede ser cualquier compuesto que reacciona con la capa receptora de analito específico.

En las incorporaciones preferidas, el método involucra hacer contacto con el dispositivo sensible con una muestra de prueba que contiene las partículas de elemento que incrementar la difracción y potencialmente contiene el analito. Si el analito está presente en la prueba, entonces cuando la luz es t.ransmitida a través de una película de polímero metalizada con la capa receptora de analito específico, una imagen de difracción visible es formada.

El medio en el cual el analito puede residir puede ser sólido, similar al gel, líquido o gaseoso. Para propósitos de detectar un analito en un fluido corporal, el fluido es seleccionado de, pero no está limitado a, la orina, el suero, la plasma, el fluido espinal, el esputo, la sangre completa, la saliva, las secreciones urogenitales, los extractos de tales, los pericardio, el gástrico, el peritoneal, los lavados pleurales, las secreciones vaginales, o una algodoncillo de garganta. El gas más común que se contempla como siendo usado con el dispositivo biosensor de la presente invención es el aire.

En una incorporación, la presente invención se contempla en una varilla para medir la profundidad en la cual una película metalizada impresa de micro contacto está montada en un extremo de la varilla para medir la profundidad. En uso, la varilla para medir la profundidad es sumergida en el líquido en el cual el analito sospechoso puede estar presente. El líquido puede también contener partículas de elemento que incrementa la difracción. La varilla para medir la profundidad se le permite el permanecer por varios minutos. La varilla para medir la profundidad es entonces removida y luego, ya sea una luz e proyectada a través de la película metalizada o la película es observada con una luz atrás de la película. Si una imagen de difracción es observada, entonces el analito está presente en el líquido.

En otra incorporación de la presente invención, una prueba de analito múltiple es construida en el mismo soporte. Como se muestra en la figura 1, una tira 10 es suministrada con varias películas impresas de micro contacto 20, 25, 30 y 35, cada película tiene un patrón 40 impreso en la misma. Cada una de las películas impresas de micro contacto 15, 20, 25, y 30 tienen un material receptor diferente que es específico para analitos diferentes. Se puede observar que la presente invención puede ser formateada en cualquier arreglo con una variedad de películas impresas de micro contacto por lo que le permiten al usuario del dispositivo biosensor de la presente invención para detectar la presencia de analitos múltiples en un medio que usa una prueba sencilla.

Hay muchos soportes posibles para las capas receptoras de analito específico. La fisisorpción simple puede ocurrir en muchos materiales, tales como el vidrio de poliestireno, el nailon, y otros muy conocidos por aquellos con una habilidad ordinaria en el arte. Las incorporaciones preferidas para inmovilizar las capa receptoras de analito específico tiene en involucrado el acoplamiento covalente, ta como es posible entre los compuestos que contienen disulfido tiol y oro. Típicamente, un revestimiento de oro, de 5 a 200 nanómetros de espesor, es soportado en un disco de Si/Si02, e vidrio, o una película de polímero. Opcionalmente, el titani puede ser usado para servir como un promotor de adhesión entre e oro y el soporte. El receptor de analito específico sea copla la superficie de oro durante la impresión de contacto o inversió de una solución. Preferiblemente, el soporte comprende u revestimiento de oro en una película MYLAR®.

La figura 2 esboza el procedimiento usado para l impresión de micro contacto. Un estampado elastomérico es usad para transferir "tinta" del receptor de analito específico a un superficie de oro por contacto; si el estampado tiene patrón, s forma una capa receptora de analito específico con patrón. E estampado es fabricado mediante el polidimetilsolixano (PDMS) fundido que en un maestro que tiene el inverso del patró deseado. Los maestros son preparados usando técnica fotolitográficas normales, o construidos de materiales existente que tienen características de superficie de microescala.

En una incorporación preferida de un procedimiento experimental típico, un maestro producido fotolitográficamente es colocado en un plato Petri plástico o de vidrio, y una porción de mezcla (w:w) de elastómero de silicona SYLGARD® 184 y un agente de curado 184 de elastómero de silicona SYLGARD® (Dow Cornon Corporation) es vertido sobre el mismo. Al elastómero se l permite reposar por aproximadamente 30 minutos a temperatur ambiente y presión reducida para desgasar, entonces curado por l menos 4 horas a 60°C y gentilmente mondado del maestro. E "entintado" del estampado elastomérico es logrado mediante l exposición del estampado en una solución acuosa de 0.1 a lOµM d anticuerpo derivatizado de disulfido típicamente mediante coloca el estampado hacia abajo en la solución por 10 segundos a 1 minutos. Al estampado se le permite secarse, ya sea baj condiciones de medio ambiente, o típicamente mediante l exposición de una corriente de aire o gas nitrógeno. Seguido de entintado, al estampado se le aplica una superficie de oro. Un presión ligera es usada para asegurar el contacto completo entr el estampado y la superficie. Después de 1 segundo a 5 minutos, el estampado es entonces gentilmente mondado de la superficie Seguido de la remoción del estampado, la superficie es enjuagad y secada. Alternativamente, una derivatización adicional de área sin estampar pueden lograrse, ya sea mediante usar un segund estampado o mediante la exposición de la superficie completa co un reactivo diferente. Subsecuentemente, la exposición a u agente bloqueador de proteína, tal como el BSA o la á-caseína, cualquier otro agente muy conocido en el arte, puede también se hecho .

El carácter elastomérico del estampado e importante para el logro del proceso. El polidimetilsiloxan (PDMS) , cuando es curado, es suficientemente elastomérico par permitir un buen contacto conformal del estampado y l superficie, aun para las superficies con liberació significativa; este contacto es esencial para transferir contact eficiente del receptor a una película de oro. Las propiedades elastoméricas del polidimetilsiloxano son también importantes cuando el estampado removido del maestro: si el estampado fuera rígido (como es el maestro) podrá ser difícil el separar el estampado y el maestro después del curado sin dañar uno de los dos substratos. El polidimetilsiloxano es también lo suficientemente rígido para retener su forma, aún para características con dimensión de submicrón. El estampado es durable en que el mismo estampado puede ser usado por más de 200 veces sobre un periodo de 1 año sin una degradación significativa en su rendimiento. Usando un rodillo de impresión para el estampado podrá permitir para una operación de impresión continua, alternativamente, la impresión por chorro de tinta del patrón deseado puede también ser hecho si el capaz de producir tamaños característicos necesarias para la difracción, por ejemplo =100µm.

Sigue una descripción más detallada y de los métodos y de las composiciones de la presente invención. Todas las ¡publicaciones citadas aquí están incorporadas por referenci en su totalidad. Cualquier película plástica es apropiada para l presente invención. Preferiblemente, la película plástica e también capaz de tener un revestimiento de metal depositado en l misma. Estas incluyen, pero no están limitadas a los polímeros tales como: el polietileno-tereftalato (por ejemplo, MYLAR®, el acrilonitrilo-butadieno-estireno, el copolímero de acrilato de acrilonitrilo-metilo, el celofán, los polímeros celulósicos tales como la celulosa de etilo, el acetato de celulosa, el butirato de acetato de celulosa, el propionato de celulosa, el triacetato de celulosa, el triacetato de celulosa, el polietileno, los copolímeros de acetato de vinilo de polietileno, los copolímeros de polietileno de nailon (polímeros de etileno) de ionómeros, el polipropileno, los polímeros de penteno de metilo, el fluoruro de polivinilo, y los polisulfones aromáticos. Preferiblemente, la película plástica tiene una transparencia óptica mayor de 80%. Otros plásticos apropiados y y proveedores pueden ser encontrados, por ejemplo, en trabajos de referencia tales como la Enciclopedia de Plásticos Modernos (McGraw-Hill Publishing Co . , New York 1923-1996) .

En una incorporación de la invención, la película de polímero tiene un revestimiento de metal en la misma y tiene una transparencia óptica de entre aproximadamente 5% y 95%. Una transparencia óptica más deseable para la película plástica la acusada en la presente invención es de entre aproximadamente 20 y 80%. En una incorporación deseada de la presente invención, l película de polímero tiene por lo menos aproximadamente un transparencia óptica de 80%, y el espesor de revestimiento d metal es tal como para mantener una transparencia óptica mayor d alre:dedor de 60%, para que las imágenes de difracción puedan se producidas mediante la luz transmitida. Esto corresponde a u espesor de revestimiento de metal de alrededor de 10 nanómetros Sin embargo, en otras incorporaciones de la invención, el espeso del oro puede ser de entre aproximadamente 1 nanómetro a 100 nanómetros; por ejemplo, los revestimientos de oro más grueso (>20 nanómetros) pueden todavía ser apropiados para produci imágenes de difracción mediante la luz reflejada.

El metal preferido para la deposición en l película es el oro. Sin embargo, la plata, el aluminio, el cromo, el cobre, el hierro, el circonio, el platino y el níquel, así como los óxidos de estos metales, pueden ser usados.

En principio, cualquier superficie con corrugados de tamaño apropiado pueden ser usados como maestros. El proceso de impresión de microcontacto comienza con una estructura de libe:ración apropiada, desde la cual cualquier estampado elastomérico es fundido. Esta plantilla "maestra" pueden ser fotolitográficamente generada, o mediante otros procedimientos, tale:s como los emparrillados de difracción disponibles comercialmente. En una incorporación, el estampado puede s hecho de polidimetilsiloxano.

El estampado puede ser aplicado en aire, o bajo fluido capaz de evitar la difusión excesiva del materi receptor. Para los procesos de impresión continuos o de gr escala, es más deseable el imprimir por aire.

En una incorporación de la presente invención, patrón está formado en un polímero plástico metalizado con u capa receptora de analito específico. Después del proceso estampado, las áreas metalizadas en el plástico opcionalment pueden ser bloqueadas, por ejemplo, con un agente repelente d proteína tal como la á-caseína.

Esta invención está adicionalmente ilustrad mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben de se interpretados en cualquier forma como que imponen limitacione sobre el alcance del mismo. Por el contrario, es de se claramente entendido como último recurso puede obtenerse de otra varias incorporaciones, modificaciones, y equivalentes del mismo los cuales, después de leer la descripción de aquí, puede sugerirse así mismos por aquellos con una habilidad en el art sin apartarse del espíritu de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Las partículas de poliestireno de anticuerp con ugado fueron producidas por acoplamiento con carbodiimida co etildimetilaminodicarbodiimida (EDAC, botella #3 de Poliscience kit, catálogo #19539) . Para este ejemplo, 0.125 mililitros de un suspensión al 10% de 0.5 micrones de diámetro de partícula carboxilatadas azul (Bangs Laboratories, Fishers, Indiana, Cat #D0005070CB) fueron activadas con una solución acuosa del EDA por 1 a 4 horas, enjuagadas, entonces expuestas a 300 microgramo de un anticuerpo monoclonal de hormona luteinización, subunida alfa, (Fritzgerald Industries, Concord, Massachusetts, Cat# 10 LIO, Clone # M94136) . Las partículas fueron una vez má enjaguadas, bloqueadas con albúmina de suero bovino, almacenadas en una concentración de 2.5% en salina y amortiguad de fosfato.

Luego, una película MYLAR®) de oro fue pretratad (o bloqueada) con una solución de beta caseína de miligramos/mililitros por 10 minutos, entonces enjuagada a fond y secada bajo una corriente de aire. Un estampado de polidimetilsiloxano de círculos de 10 micrones fue revestido co anticuerpo tiolatado mediante colocar la cara del estampado hacia abajo en una solución de anticuerpo tiolatado de 0.5 miligramos/mililitros y empaparlo por 10 minutos. Una corrient de aire fuerte fue usada para secar a fondo la superficie de estampado. El estampado revestido fue colocado en contacto co una película MYLAR® de oro por 5 minutos, luego removida. L película de MYLAR® de oro impresa que resulta puede enjuagada e agua destilada, y secada.

Una solución base de 10 mM del sulfo-LC-SPDP e preparada mediante disolver 1.3 miligramos de sulfo-LC-SPDP e 2.07 mililitros de agua deionizada. La reacción conjugada e transportada fuera en salina amortiguada de fosfato (PBS) que co tiene 20 mM de sodio de fosfato amortiguado, 150 mM NaCI , In EDTA y 0.02% de azida de sodio en un pH 7.5. Un miligramo de anticuerpo liofilizado está disuelto en 450 mililitros de salina amortiguada de fosfato, y 50 mililitros de solución base de sulfo-LC-SPDP es agregado a la solución de anticuerpo. A la mezcla se le permite el reaccionar a temperatura ambiente por 60 minutos. La muestra es aplicada a una columna de poliacrilamida desaliñada de 5 mililitros previamente equilibrada con cinco volúmenes de cama (25 mililitros) de salina amortiguada de fosfato. Las fracciones son eluídas usando salina amortiguada de fosfato como el amortiguador de elusión, y la proteína en las facciones son vigiladas usando ensaye de proteína COOMASSIE® (Pierce Chemical Co.). Típicamente, 50 ul del reactivo COOMASSIE® el mezclado con 50 ul de cada fracción en un plato de microtiter. El substrato de COOMASSIE® Azul reacciona con la proteína, produciendo un color azul de intensidad de la cual es dependien de la cantidad de proteína presente en la fracción. L fracciones las cuales producen el color azul más intenso s aquellas que contienen la mayoría de la proteína eluída. Est fracciones son jaladas juntas para producir la forma de disulfi del producto de derivatizado final. Esto es típicamente la for usada para la impresión de contacto.

Opcionalmente, el grupo de disulfido de piridil presente en la forma de disulfido del unidor tiolatado pueden se reducidas en un grupo de tiol en una reacción de reducción. E vez de desaliñar en una columna equilibrada con salin amortiguada de fosfato, la proteína derivatizada es desaliñada e una columna equilibrada con un amortiguador de acetato (100 mM d amortiguador de acetato de sodio, 100 mM NaCI , pH 4.5) . El p acídico de este amortiguador de acetato a actuar para protege cualquier unión de disulfido presente en la proteína nativa d una reducción no deseada. En la reacción de reducción, 1 miligramos de ditiotreitol (DTT) es disuelta en 500 mililitros d amortiguador de acetato y agregado a 1 mililitro de SPDP d proteína derivatizada. La mezcla de reacción es incubada por 3 minutos a temperatura ambiente, y desaliñada en una column equilibrada desaliñada de 5 mililitros, de 5 volúmenes de cam (25 mililitros) de amortiguador de acetato. El contenido d proteína de las fracciones eluídas es una vez más vigilad mediante el ensaye de proteína de COOMASSIE® como se describi anteriormente, y las fracciones que contienen la mayor cantidad de proteína son jaladas.

Ambas formas reducidas y del disulfido de los unidores tiolatados son almacenados en una solución acuosa a 4°C hasta que sean usadas para la impresión de contacto.

Los sensores fueron entonces usados para detectar un analíto. La solución de analito fue entonces mezclada con micropartículas (típicamente 50 a 70 micro litros de solución de analito en 1% de albúmina de suero bovino con 10 a 25 microlitros de 1.5 a 2.5% suspensión de partícula; preferiblemente, hay una proporción de 50:25 de solución de analito a la suspensión de partícula) , y colocada encima de 1 centímetro cuadrado de muestra de sensor. Después de 5 minutos, el disco de nitrocelulosa (5 o 8 micrones de tamaño de poro, Sigma #N3771 o N4146) con un orif cio pequeño (por ejemplo 3/16 pulgadas) perforadas fuera del centro fue colocada encima del sensor. El disco usado para transmitir lejos el exceso de fluido y las micro partículas sin unir. En este tiempo, una fuente de luz de punto fue transmitida a través de la muestra de sensor (usando el orificio pequeño en la n.Ltrocelulosa) . Una imagen de difracción puede ser observada en el otro lado del rayo de luz en la presencia del analito objetivo.

Como se observa en la figura 4, la fotosmicrografías de SEM mostradas en la colocación con patrón d micropartículas .

Ejemplo 2 Un estampado de polidimetilsiloxano de un arregl x, de círculos de 10 micrones fue "entintado" con oligonucleótid de 20 mer tiolatado el cual es complementado con la tira de DN objetivo ("30-mer"; secuencia base de tiol espaciador-5' -CAATCCACGTCACGGACAGGGTGAGGAAGA-3' hechas por Genosys, Inc., Th Woodlands, Texas) mediante colocar el estampado bocabajo un pes y la mezcla secada con horno (50°C , de vacío) de la 30-mer y el acetato de etilo en vidrio. Después de 10 minutos, el estampad entintado fue removido. Al mismo tiempo, una película MYLAR® de oro fue precalentada en un plato caliente a 60 °C por 5 minutos. La impresión que fue hecha mediante colocar el estampado de PDMS entintado encima de lado revestido de oro de MYLAR® a 60°C; el peso y el calor fueron mantenidos durante 5 minutos en tiempo de contacto. En este punto, el estampado fue removido y la película MYL^LR® de oro fue lavada con agua destilada, y secada por aire. La muestra de película MYLAR® de oro fue entonces bloqueada con una solución de beta caseína de 2.5 miligramos mL (en salina amortiguada de fosfato, con pH 7.2) por 10 minutos, y enjuagado con agua destilada y secado por aire.

Estos sensores fueron usados para probar el DN objetivo. La hibridización del DNA objetivo al DNA capturado co patrón en la superficie del sensor tuvo lugar como sigue: un solución del analito precalentado (60°C de baño de agua, 2 minutos) que contiene una tira de DNA de interés (u biot inilatado de 70 -mer de Genosys con secuencia base de biotin-5 ' -GGTAGACCGGAGAGCTGTGTCACCATGTGGGTCCCGGTTGTCTTCCTCACCCTGTCCGT ACGTGGATTG-3 ' fue agregado a un sensor precalentado (60°C de plato caliente, 5 minutos) y entonces 75 microlitors fueron agregados a un sensor de aproximadamente 1 centímetro cuadrado para, un calentado adicional de 10 minutos. Después de este tiempo, la muestra de sensor fue enjuagada con agua, y secada por aire' para su probado subsecuente con micropartículas. Una variación a éste método es que la solución de analito, por ejemplo, durante una amplificación PCR, y las micropartículas son expuestas al sensor al mismo tiempo.

Luego, las partículas de 1 micrón diámetro, revestidas de Streptavidin de Bangs Laboratories (Catálogo # CP01N) fueron agregados en cantidades de 20 a 30 micro litros, concentración de 2.4 x 1011 partículas y por mL, al sensor. El sensor y las partículas fueron calentadas en un plato caliente a 60 °C por 10 minutos (cubiertas, mientras se asegura que la completa evaporación no tuvo lugar) , y entonces gentilmente enjuagadas con agua destilada. Después de esto, una fuente de luz de punto fue transmitida a través de la muestra sensor. Una imagen de difracción puede ser observada en el otro lado del ray de luz en la presencia del analito de DNA.

La foto fotomicrografías SEM muestran l colocación con patrón de las micropartículas.

Ejemplo 3 Las partículas de poliestireno de anticuerp conjugadas fueron producidas mediante el acoplamiento d carbodiimida conetildimetilaminocarbodiimida ("EDAC", botella # de Polisciences kit, Catálogo #19539). Por ejemplo, 0.125 mL d una suspensión al 10% de partículas carboxilatadas azules de 0. micrones de diámetro (Bangs Laboratories, Cat #DC y de 02/1836) fueron activadas con una solución acuosa del EDAC por 1 a horas, enjuagadas, entonces expuestas a 300 microgramos de un ant cuerpo policlonal a IgE (Fitzgerald Industries, Cat #20-IR77) . Las partículas fueron otra ves enjuagada, bloqueadas co albúmina de suero bovino, y almacenadas en una concentración d 1.7% en salina amortiguada de fosfato.

Luego, la película MYLAR® de oro fue pretratada (o bloqueada) con una solución de beta caseína de 5 miligramos /mL por 10 minutos, entonces enjuagada fondo y secada bajo una corriente de aire. Una estampado PDMS en una arreglo x,y de círculos de 10 micrones diámetro fueron revestidos con anticuerpo tiolatado (el anticuerpo fue inicialmente Fitzgerald Catalog #10 110 entonces derivatizadas o "tiolatadas" usando Sulfo-LC-SPD por Pierce) mediante colocar el estampado bocabajo en un solución de anticuerpo tiolatado de 0.5 miligramos/mL y empapado por 10 minutos. Una corriente de aire fuerte fue usada para seca a fondo la superficie del estampado. El estampado revestido fu colocado en contacto con la película MYLAR® de oro por 5 minutos, entonces removida. La película MYLAR® de oro impresa que resulta puede enjuagada en agua destilada, y secada.

La solución de analito fue entonces mezclada con las micropartículas (típicamente 50 a 70 microlitros de solución de analito en albúmina de suero bovino al 1% con 10 a 25 micro litros de 1.5 a 2.5% de suspensión de partícula; preferiblemente, hay una proporción de 50:25 de solución de analito de suspensión de partícula) , y colocada encima de una muestra de 1 centímetro cuadrado. Después de 5 a 10 minutos, un disco de nitrocelulosa (de 5 u 8 micrones de tamaño de poro, Sigma #N3771 o N3771) con orificios pequeños (por ejemplo, 3/16 pulgadas) perforadas fuera del centro es colocado encima del sensor. El disco fue usado para transmitir el exceso de fluido y las micropartículas sin unir. En este tiempo, una fuente de luz de punto fue transmitida a través de la muestra sensor mediante tomando ventaja del orificio pequeño en la nitrocelulosa. Una imagen de difracción de orden superior de fue observada en el otro lado del rayo de luz, que significa la presencia del analito.

Ejemplo 4 Una película MYLAR® de oro fue pretratada bloqueada) con una solución de beta caseína a 5 miligramos/mL salina amortiguada de fosfato (pH ~7.2) por 10 minutos, entonc encuadrada fondo y secada bajo una corriente de aire. estampado polidimetilsiloxano de círculos de 10 micrones f revestido con anticuerpo tiolatado (por ejemplo, albinaco ant Candida de conejo, Cat #20-CR04 de Fitzgerald Industries, Inc. mediante colocar el estampado boca abajo en una solución anticuerpo tiolatado de 0.5 miligramos/mL y empapado por minutos . Una corriente de aire fuerte fue usada para secar fondo la superficie del estampado. El estampado revestido f colocado en contacto con la película MYLAR® de oro por 2 minutos entonces removida. La película MYLAR® de oro impresa que result fue enjuagada en agua destilada, y secada.

La muestra de sensor fue expuesta en una dilució al 10% en salina amortiguada de fosfato, pH 7.2 de 40 nanómetro de partículas de oro revestidas con IgC anti-conejo cabra ( e oro conjugado fue de Polisciences, Catálogo #22705) . Después d una hora, las muestras fueron enjuagadas a fondo con agu destilada y secadas bajo una corriente de aire o de nitrógeno. E este punto, las muestras no difractaron un rayo láser HeNe .

Las muestras fueron entonces expuestas a reactivos incrementadores de plata BBI (ya sea BBI International ' s kit #SEKL 15 (Batch #2575) o large kit #SEKB250 (Batch #2484) fueron usados) . Una proporción 1:1 v/v de los reactivos iniciadores e incrementadores en el juego fueron premezcladas y entonces inmediatamente colocadas encima de las muestras revestidas de partículas de oro. Después de 10 a 20 minutos de exposición (preferiblemente, 10 minutos) , las muestras fueron enjuagadas con agua, secadas, y examinadas. En este punto, las muestras difractaron luz (ya sea un rayo de láser o una fuente de luz blanca de punto) y probablemente debido al tamaño grande de la plata nucleatada alrededor de las nanopartículas de oro.

Ejemplo 5 Muestras preparadas como en los ejemplos 1 o 4 pueden también ser desarrolladas en una imagen de difracción mediante el exponerlas a un anticuerpo secundario de enzima conjugada en la presencia del analito, tal que si el analito está presente el anticuerpo secundario podrá unirse y hacer un desarrollo precipitados subsecuente con un substrato precipitador específico a la enzima.

Una película MYLAR® de oro fue pretratada (o bloqueada) con una solución de beta caseína a 5 miligramos/mL en salina amortiguada de fosfato (un pH -7.2) por 10 minutos, entonces enjuagada a fondo y secada bajo una corriente de air Un estampado polidimetilsiloxano de círculos de 10 micrones f revestido con anticuerpo tiolatado (por ejemplo, hormona bet ant:.-leutein?zada de ratón, Cat #10-L15 de Fitzgerald Industries Ine ) mediante colocar el estampado bocabajo en una solución d anticuerpo tiolatado de -0.3 miligramos/mL y empapada por 1 minutos. Una corriente de aire fuerte fue usada para secar fondo la superficie del estampado. El estampado revestido fu colocado en contacto con la película MYLAR® de oro por 5 minutos entonces removida. La película MYLAR® de oro impresa que result fue enjuagada en agua destilada, y secada.

La muestra sensor fue expuesta a una solución d analito de hormona luteinizada (CAT#30-AL15 de Fitzgeral Industries, Inc.) en albúmina de suero bovino al 1%, y salin amortiguador de fosfato. La concentración de antígeno fue variad de 0.1 a 1000 ng/mL. Después de una hora a temperatura ambiente la nuestra fue enjuagada con una solución de TWEEN 20 al 0.02% entonces destilada enagua. Una exposición subsecuente a un anticuerpos secundario (Fitzgerald Catalog #61-L05 diluida 1:100 en agua destilada) por una hora fue hecho, seguido mediant el enjuagado como se hizo anteriormente. Una solució incrementadora de membrana TMB ( por ejemplo, una mezcla a 10: v/v de reactivos Kirkegaard and Perry Laboratories CAT #50-76-1 y Cat#50-70-01) fue colocada en la muestra por 10 minutos par hacer el desarrollo de un precipitado azul en los círculos características. Este precipitado hizo una imagen de difracción para formarse a la irradiación con una fuente de luz de punto.

Claims (41)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un método para detectar un analito en un medi que comprende : agregar un elemento mejorador de difracción a medio sospechado de contener el analito, en donde el element incrementador de difracción tiene un material receptor ahí que e especifico para el analito; poner en contacto el medio con el dispositiv sensor, el dispositivo sensor comprende: una película de polímero; y una capa receptora especifica de analito impres en un patrón sobre la película de polímero en donde la cap receptora especifica de analito tiene un material receptor sobr la tiisma que es especifico para el analito; transmitir una luz a través de la película de polímero; y detectar la presencia del analito mediante e detectar un patrón formado por la difracción de la lu transmitida.

2. El método tal y como se reivindica en l cláusula 1 caracterizado porque la capa receptora de analito est impresa en un patrón que cuando el dispositivo sensor aglutina u analito, el dispositivo sensor difracciona la luz transmitid para formar un patrón de difracción.

3. El método tal y como se reivindica en l cláusula 1 caracterizado porque el patrón de difracción e visible al ojo sin ayuda.

4. El método tal y como se reivindica en l cláusula 1 caracterizado además porque comprende un recubrimient de metal sobre la película de polímero y en donde la cap receptora especifica de analito está impresa sobre e recubrimiento de metal.

5. El método tal y como se reivindica en l cláusula 4 caracterizado porque el metal es seleccionado de oro, plata, cromio, níquel, platino, aluminio, hierro, cobre oxido d oro, oxido de cromio o circonio.

6. El método tal y como se reivindica en l cláusula 5 caracterizado porque el metal es oro.

7. El método tal y como se reivindica en l cláusula 6 caracterizado porque el recubrimiento de oro es d entre aproximadamente 1 nanómetro y 1000 nanómetros de grosor.

8. El método tal y como se reivindica en l cláusula 1 caracterizado porque la película de polímero e seleccionada de polietileno-tereftalato, acrilomtplo-butadieno-estireno, copolímero de acrilonitrilo-metil acrilato, celofán, polímeros celulósicos tales como etil celulosa, acetato d celulosa, butirato de acetato de celulosa, propionato d celulosa, triacetato de celulosa, polietileno, copolímeros de polietileno-vinil acetato, copolímeros de ionómeros (polímeros de etileno) polietileno-nylon, polipropileno, polímeros de metil penteno, fluoruro de polivinilo o polisulfonas aromáticas.

9. El método tal y como se reivindica en la cláusula 8 caracterizado porque la película de polímero es tereftalato de polietileno.

10. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque la película de polímero es óptimamente transparente.

11. El método tal y como se reivindica en la cláusula 10 caracterizado porque la película de polímero tiene una transparencia óptica de entre 5 porciento y 95 porciento.

12. El método tal y como se reivindica en l cláu.sula 10 caracterizado porque la película de polímero tien una transparencia óptica de entre aproximadamente 20 porcient y 8C porciento.

13. El método tal y como se reivindica en l cláusula 1 caracterizado porque hay dos o más capas receptora especificas de analito con cada capa teniendo propiedade químicas diferentes.

14. El método tal y como se reivindica en l cláusula 1 caracterizado porque el analito es seleccionado d bacterias, levadura, hongos, virus, factor reumatoide, anticuerpos IgG, IgM, IgA y IgE, antígeno carcinoembriónico, antigen grupo A estreptococo, antigenes virales, antigenes asociados con enfermedades autoinmunes, alérgenos, antígenos de tumcr, antígeno de grupo B estreptococo, antigen de virus de inmuno deficiencia humana I o virus de inmunodeficiencia humana II, virus de anticuerpos, antígenos específicos para RSV; un anticuerpo, antígeno, encima, hormona, polisacarido, proteína, lípido, carbohidrato, droga o ácido nucleico, grupos de Neisseria meningitdes A,B,C, Y y W sub 135, Streptococcus pneumeniae, E. coli Kl , Haempofilus influenza Tipo B, un antígeno derivado de microrganismos, un hapteno, una droga de abuso, una droga terapéutica, un agente ambiental o antígenos específicos para hepatitis .

15. El método tal y como se reivindica en la cláusula 14 caracterizado porque el analito es bacteria, levadura, hongos o virus.

16. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque el material receptor es seleccionado de antígenos, anticuerpos, oligonocleótidos, quelctores, enzimas, bacterias, levaduras, hongos, viruses, pili bacteriales, materiales flagelares bacteriales, ácidos nucleicos, polisacaridos, lípidos, proteínas, carbohidratos, metales, hormonas o receptores para dichos materiales .

17. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque el elemento mejorador de difracción es seleccionado de vidrio, celulosa, polímeros sintéticos o plásticos, látex, poliestireno, policarbonato, bacteria o células f ngales.

18. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque el elemento incrementador de difracción es microesferas de látex de poliestireno.

19. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado además porque comprende el paso de aplicar un material de bloqueo al áreas no impresas de la película de polímero.

20. El método tal y como se reivindica en l cláusula 19 caracterizado porque el material de bloqueo es seleccionado de /3-caseína, un albúmina, un surfactante, un polietilenglicol, un alcohol polivinilico, o derivados de sulfuro de los mismos.

21. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque el dispositivo sensor además comprende una capa de material de bloqueo sobre la película de poli -ñero a través de la cual el material receptor especifico de analito está impreso.

22. El método tal y como se reivindica en la cláusula 21 caracterizado porque el material de bloqueo es seleccionado de ß-caseína, una albúmina, un surfactante, polietilenglicol, alcohol de polivinilo o derivados de sulfuro de los mismos.

23. Un método para detectar un analito en un medio que comprende: agregar un elemento mejorador de difracción al medio sospechado de contener el analito, en donde el elemento mejorador de difracción tiene un material receptor sobre el mismo que es especifico para el analito; poner el contacto el medio con un dispositiv sensor, dispositivo el dispositivo sensor comprende: una película de polímero recubierta con metal; una capa receptora especifica de analito impres en u.n patrón sobre la película de polímero recubierta con metal en donde la capa receptora especifica de analito tiene u material receptor sobre la misma que es especifico para el analito; reflejar una fuente de luz fuera de una superficie de la película de polímero recubierta de metal; y detectar la presencia del analito mediante el detectar un patrón formado mediante difracción de luz reflejada.

24. El método tal y como se reivindica en la cláusula 23 caracterizado porque la capa receptora especifica de analito está impresa en un patrón de manera que cuando el dispositivo sensor aglutina un analito, el dispositivo sensor difracciona la luz reflejada para formar un patrón de difracción.

25. El método tal y como se reivindica en la cláusula 23 caracterizado porque el patrón de difracción es visible al ojo sin ayuda.

26. El método tal y como se reivindica en l cláusula 23 caracterizado porque el metal es seleccionado de oro plata, cromio, níquel, platino, aluminio, hierro, cobre, oxido d oro, oxido de cromio o circonio.

27. El método tal y como se reivindica en l cláusula 26 caracterizado porque el metal es oro.

28. El método tal y como se reivindica en l cláu.sula 27 caracterizado porque el recubrimiento de oro es d aproximadamente de entre 1 nanómetro y 1000 nanómetros de grosor.

29. El método tal y como se reivindica en l cláu.sula 23 caracterizado porque la película de polímero e seleccionada de tereftalato de polietileno, acrilonitrilo-butadieno-estireno, copolímero de acrilonitrilo-metil acrilato, celofán, polímeros celulósicos tales como etil celulosa, acetat de celulosa, butirato de acetato de celulosa, propionato d celulosa, triacetato de celulosa, polietileno, copolímeros de polietileno-vinil acetato, copolímeros de ionómeros (polímeros de etileno) polietileno-nylon, polipropileno, polímeros de metil penteno, fluoruro de polivinilo o polisulfonas aromáticas.

30. El método tal y como se reivindica en l cláu.sula 29 caracterizado porque la película de polímero e tereftalato de polietileno.

31. El método tal y como se reivindica en l cláusula 23 caracterizado porque hay dos o más capas receptora especificas de analito con cada capa teniendo propiedade químicas diferentes.

32. El método tal y como se reivindica en l cláusula 23 caracterizado porque el analito es seleccionado de bacterias, levadura, hongos, virus, factor reumatoide, anticuerpos IgG, IgM, IgA y IgE, antígeno carcinoembriónico, antigen grupo A estreptococo, antigenes virales, antigenes asociados con enfermedades autoinmunes, alérgenos, antígenos de tumor, antígeno de grupo B estreptococo, antigen de virus de inmuno deficiencia humana I o virus de inmunodeficiencia humana II, virus de anticuerpos, antígenos específicos para RSV; un anticuerpo, antígeno, encima, hormona, polisacarido, proteína, lípido, carbohidrato, droga o ácido nucleico, grupos de Neisseria meningitdes A,B,C, Y y W sub 135, Streptococcus pneumeniae, E. coli Kl , Haempofilus influenza Tipo B, un antígeno derivado de microrganismos, un hapteno, una droga de abuso, una droga terapéutica, un agente ambiental o antígenos específicos para hepatitis.

33. El método tal y como se reivindica en l cláusula 32 caracterizado porque el analito es bacteria levadura, hongos o virus.

34. El método tal y como se reivindica en l cláusula 23 caracterizado porque el material receptor e seleccionado de antígenos, anticuerpos, oligonocleótidos quelatores, encimas, bacterias, levaduras, hongos, viruses, pil bacteriales, materiales flagelares bacteriales, ácido nucleóicos, polisacaridos, lípidos, proteínas, carbohidratos metales, hormonas o receptores para dichos materiales.

35. El método tal y como se reivindica en l cláusula 23 caracterizado porque el elemento mejorador d difracción es seleccionado de vidrio, celulosa, polímero sintéticos o plásticos, látex, poliestireno, policarbonato, bacteria o células fúngales.

36. El método tal y como se reivindica en l cláusula 23, caracterizado porque el elemento incrementador d difracción es microesferas de látex de poliestireno.

37. El método tal y como se reivindica en la cláusula 23 caracterizado además porque comprende el paso de apli.car un material de bloqueo al áreas no impresas de la película de polímero.

38. El método tal y como se reivindica en l cláusula 37 caracterizado porque el material de bloqueo e seleccionado de -caseína, un albúmina, un surfactante, u polietilenglicol, un alcohol polivinilico, o derivados de sulfur de los mismos.

39. El método tal y como se reivindica en l cláusula 23 caracterizado porque el dispositivo sensor ademá comprende una capa de material de bloqueo sobre la película d polímero recubierta con metal a través de la cual es impreso e material receptor especifico de analito.

40. El método tal y como se reivindica en l cláusula 39 caracterizado porque el material de bloqueo es seleccionado de ß-caseína, una albúmina, un surfactante, polietilenglicol, alcohol de polivinilo o derivados de sulfuro de los mismos.

41. Un método para detectar un analito en un medio que comprende: agregar un elemento mejorador de difracción al medio sospechado de contener el analito, en donde el elemento mejcrador de difracción tiene un material receptor sobre el mismo que es especifico para el analito; poner el contacto el medio con un dispositiv sensor, dispositivo el dispositivo sensor comprende: una película de polímero recubierta con metal; una capa receptora especifica de analito impres en un patrón sobre la película de polímero recubierta con meta en donde la capa receptora especifica de analito tiene u material receptor sobre la misma que es especifico para e analito; transmitir de una luz fuera a través de l película del polímero; y detectar la presencia del analito mediante e detectar un patrón formado mediante difracción de luz reflejada R E S U M E N La presente invención proporciona un sistema barato y sensible y un método para detectar no analitos presentes en un medio. » El sistema comprende un elemento mejorador de difracción, tal como las microesferas funcionalizadas, las cuales son modificadas de manera que estas sean capaces de aglutinarse con un analito de objetivo. Adicionalmente, el sistema comprende una película de polímero, la cual puede incluir un recubrimiento de metal sobre el cual está impreso un patrón predeterminado y especifico de receptores específicos de analito. Con la sujeción del analito de objetivo a las áreas seleccionadas de la película de polímero, ya sea directamente o con el elemento incrementador de difracción, la difracción de la luz transmitida y/o reflejada ocurre a través de las dimensiones físicas y definidas, la colocación precisa del- analito. Una imagen de difracción es producida la cual puede ser vista fácilmente con el ojo u opcionalmente con un dispositivo sensor.