MXPA01005858A - Metodo de eficiencia mejorada para transformacion de planta mediada por agrobacterium - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un sistema rápido de transformación y regeneración para plantas;en particular, la invención se refiere a un sistema de preparación de tejido vegetal;el método de transformación es eficiente y confiable para [a producción de plantas fértiles con cualidades agronómicas mejoradas.

Description

MÉTODO DE EFICIENCIA MEJORADA PARA TRANSFORMACIÓN DE PLANTA MEDIADA POR AGROBACTERIUM ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de biotecnología de plantas. De manera más específica, se refiere a métodos para incorporar componentes genéticos en el genoma de plantas monocotiledoneas o dicotiledóneas. En particular, se proveen en la presente sistemas reproducibles para transformar genéticamente maíz, soya, arroz y trigo. Más en particular, es un sistema para transformar trigo. El método comprende nuevas condiciones durante el co-cultivo de Agrobacterium con una célula o tejido vegetal regenerable. Los métodos ilustrativos incluyen un método mejorado que utiliza transformación mediada por Agrobacterium para introducir ácidos nucleicos en tejidos regenerables diferentes utilizando una variedad de sistemas marcadores seleccionables o evaluables, y con un número de especies vegetales diferentes. La presente invención también provee plantas transgénicas fértiles, particularmente trigo. En otros aspectos, la invención se refiere a la producción de plantas transformadas de manera estable y fértiles, gametos, y retoños de estas plantas. Durante la década pasada se ha vuelto posible transferir genes desde una amplia variedad de organismos a plantas de cultivo mediante tecnología de ADN recombinante. Este avance ha provisto enormes oportunidades para mejorar la resistencia de plantas a pestes, enfermedades y herbicidas, y para modificar procedimientos biosintéticos para cambiar la calidad de productos vegetales (Knutson et al, 1992; Piorer et al, 1992; Vasil et al, 1992). Sin embargo, la disponibilidad de métodos de transformación mediados por Agrobacterium eficientes adecuados para alta capacidad de producción de plantas económicamente importantes es limitada. Se han intentado muchos métodos para transformación vegetal, pero solamente unos cuantos métodos son altamente eficientes. Los métodos para transformación de ADN de células vegetales incluyen transformación de plantas mediada por Agrobacterium (consultar, por ejemplo, las patentes de E.U.A. No. 5,416,011 y 5,569,834 y WO 97/48814). Además, la transformación de protoplastos, la transformación de genes en polen, la inyección en órganos reproductivos, la inyección en embriones inmaduros, y el bombardeo de partículas se han utilizado para transformación vegetal. A pesar clel número de métodos de transformación disponibles para sistemas vegetales específicos, sería ventajoso tener un método para introducir genes en plantas que es aplicable a varios cultivos diferentes y a una variedad de tejidos regenerables. Son bien conocidas varias tecnologías para la introducción de ADN en células para los expertos en la técnica y se pueden dividir en categorías que incluyen: (1 ) métodos químicos (Graham y van der Eb, 1973); Zatloukal et al, 1992); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, 1980), electroforación (Wong y Neuman, 1982; Fromm et al, 1985; Patente de E.U.A. No. 5,384,253), y la pistola de genes (Johnston y Tang, 1994; Fynan et al, 1993); (3) vectores vírales (Clapp, 1993; Lu et al, 1993; Eglitis y Anderson, 1988); y (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel et al, 1992; Wagner et al, 1992). Solo de manera reciente, los métodos utilizados para algunas especies monocotiledoneas incluyen transferencia directa de ADN en protoplastos aislados y suministro de ADN mediado por microproyectiles (Shimamoto et al, 1989; Fromm et al, 1990). Los métodos de protoplasto han sido utilizados ampliamente en arroz, en donde el ADN se suministra a los protoplastos a través de liposomas, PEG, y electroforación. Aunque un gran número de plantas transgénicas se ha recuperado en varios laboratorios (Shimamoto et al, 1989; Datta et al, 1990), los métodos de protoplasto requieren el establecimiento de cultivos de suspensión embriogénicos de largo plazo. Algunos regenerantes de protoplastos son infértiles y científicamente anormeiles debido al cultivo de suspensión a largo plazo (Davey et al, 1991 ; Rhode et al, 1988). La patente de E.U.A. No. 5,631 ,152 describe un método de bombardeo de microproyectiles rápido y eficiente para la transformación y regeneración de monocotiledoneas y dicotiledóneas. De manera más reciente, las especies de monocotiledoneas han sido treinsformadas de manera exitosa por medio de transformación mediada por Agrobacterium. WO 97/48814 describe procedimientos para producir trigo fértil treinsformado de manera estable. El método describe la recuperación de plantas de trigo transgénicas, dentro de un período de tiempo corto utilizando una variedad de explantes. La transformación mediada por Agrobacterium provee una alternativa viable a los métodos de bombardeo, y el método también permite el análisis molecular rápido de líneas transgénicas. Las principales deficiencias en los sistemas de transformación vegetal actuales que utilizan métodos mediados por Agrobacterium incluyen la eficiencia de producción del sistema y las dificultades de transformación debido a genotipo o diversidad de especies y limitaciones de explanta. WO 94/00977 describe un método para transformar monocotiledoneas que depende del uso de embriones inmaduros recién cultivados para una monocotiledonea y embriones o callos inmaduros cultivados para una monocotiledonea diferente. En cualquier sistema, los explantes deben estar recién aislados y el método es de labor intensiva, limitada por genotipo y explante. Otros reportes se apoyan en el uso de cepas especificas o vectores para lograr una transformación de alta eficiencia. En un reporte, se debe utilizar un vector superbinario específico con el fin de lograr una alta eficiencia de transformación (Ishida et al, 1996). A pesar del número de métodos de transformación en la técnica, se han desarrollado pocos métodos que son aplicables a monocotiledoneas y dicotiledóneas. La presente invención provee una mejora de un método de transformación mediada por Agrobacterium. El método es más eficiente para suministrar ADN objetivo a la planta según se prueba mediante eficiencias de transformación más altas y provee una reducción en labor y ventaja de costo en comparación con métodos convencionales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para producir una planta transgénica fértil el genoma de la cual ha sido modificado a través de la introducción de uno o más componentes genéticos, que comprende los pasos de: (a) introducir un componente genético que comprende una composición de ADN que se desea introducir en el genoma de dicha planta; (b) cultivar una célula o tejido regenerable con Agrobacterium bajo condiciones que disminuyen el peso de la explanta; (c) identificar o seleccionar una línea celular transformada; y (d) regenerar una planta transgénica fértil a partir de la misma.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una representación de pMON15715. La figura 2 es una representación de pMON 18365. La figura 3 es una representación de PMON25457.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se puede utilizar con cualquier especie vegetal Es particularmente útil para especies monocotiledoneas. Las especies que se prefieren en particular para la practica de la presente invención incluyen trigo, maíz, arroz y soya. La presente invención provee una planta transgénica fértil y un método para transformación de células o tejidos vegetales y regeneración de las células o tejidos transformados en una planta transformada diferenciada. Para iniciar un procedimiento de transformación de acuerdo con la presente invención, primero es necesario seleccionar componentes genéticos que se insertaran en las células o tejidos vegetales. Los componentes genéticos pueden incluir cualquier ácido nucleico que se introduce en una célula o tejido vegetal utilizando el método de acuerdo con la invención. Los componentes genéticos pueden incluir ADN no vegetal, ADN vegetal, o ADN sintético. En una modalidad preferida, los componentes genéticos se incorporan en una composición de ADN tal como una molécula de plásmido o vector recombinante, de doble cadena, que comprende al menos uno o más de los siguientes tipos de componentes genéticos: (a) un promotor que funciona en células vegetales para provocar la producción de una secuencia de ARN, (b) una secuencia de ADN estructural que provoca la producción de una secuencia de ARN que codifica un producto de utilidad agronómica, (c) una secuencia de ADN 3' no traducida que funciona en células vegetales para provocar la adhesión de nucleótidos poliadenilatados al extremo 3' de la secuencia de ARN. El vector puede contener un número de componentes genéticos para facilitar la transformación de la célula o tejido vegetal y regular la expresión del gen(es) deseado. En una modalidad preferida, ios componentes genéticos están orientados como para expresar un ARNm, el cual en una modalidad se puede traducir en una proteína. La expresión de una secuencia de codificación estructural vegetal (un gen, ADNc, ADN sintético, u otro ADN) que existe en forma de doble cadena involucra la transcripción del ARN mensajero (ARNm) desde una cadena del ADN mediante enzima de ARN polimerasa y el proceseimiento subsecuente del transcripto primario de ARNm dentro del núcleo. Este procesamiento involucra una región 3' no traducida que añade nucleótidos poliadenilatados a los extremos 3' del ARNm. Los medios para preparar plásmidos o vectores que contienen los componentes genéticos deseados son bien conocidos en la técnica. Los vectores que se utilizan para transformar plantas y los métodos para elaborar esos vectores se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,971 ,908, 4,940,835, 4,769,061 y 4,757,011 , la totalidad de las cuales está incorporada a la presente por referencia. Los vectores consisten típicamente de un número de componentes genéticos, que incluyen pero que no están limitados a, elementos reguladores tales como promotores, líderes, intrones, y secuencias de terminador. Los elementos reguladores también son referidos como elementos reguladores cis- o trans-, dependiendo de la proximidad del elemento a las secuencias o genes que controlan. La transcripción de ADN en ARNm está regulada por una región de ADN a la que se hacer referencia regularmente como el "promotor". La región de promotor contiene una secuencia de bases que envía señales a ARN polimerasa para asociarse con ADN y para iniciar la transcripción en ARNm utilizando una de las cadenas de ADN como patrón para hacer una cadena complementaria correspondiente de ARN. Un número de promotores que están activos en células vegetales han sido descritos en la literatura. Dichos promotores incluirían, pero no están limitados a, los promotores de nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS), los cuales se llevan sobre plásmidos que inducen tumores de Agrobacterium tumefaciens; los promotores de caulimovirus tales como los promotores de virus de mosaico de coliflor (CaMV) 19S y 35S y el promotor del virus de mosaico de figwort (FMV) 35S; el promotor CaMV35S mejorado (e35S) y el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de ribulosa disfosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido vegetal muy abundante). Todos esos promotores han sido utilizados para crear varios tipos de constructor de ADN que han sido expresados en vegetales. Consultar, por ejemplo la publicación de PCT WO 84/02913. Los promotores híbridos también se pueden construir para mejorar la actividad transcripcional (patente de E.U.A. 5,106,739) o para combinar actividad transcripcional deseada, inducibilidad, y especificidad de tejido o de desarrollo. Los promotores que funcionan en plantas son promotores que son inducibles, vírales, sintéticos, constitutivos como se describe (Poszkowski ef al., 1989; Odell et al, 1985) y regulados de manera temporeil, regulados de manera espacial, y regulados de espacio-tiempo (Chau et al., 1989). Otros promotores que son de mejoradores de tejido, específicos de tejido, o regulados de manera de desarrollo también son conocidos en la técnica y están contemplados por tener utilidad en la práctica de esta invención. Los promotores se pueden obtener a partir de una variedad de fuentes tales como vegetales y virus de ADN de vegetales e incluyen pero no están limitados a, los promotores CaMV35S y FMV35S y los promotores aislados a partir de genes de vegetales tales como los genes ssRUBISCO. Como se describe enseguida, se prefiere que el promotor particular seleccionado sea capaz de provocar una expresión suficiente para resultar en la producción efectiva del producto genético de interés. Los promotores que se utilizan en los constructos de ADN (es decir, cienes de planta quimérica/recombinante) de la presente invención se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características de control. Los promotores se pueden derivar por medio de ligación con regiones de operador, mutagénesis aleatoria o controlada, etc. Adicionalmente, los promotores se pueden alterar para contener múltiples "secuencias mejoradoras" para auxiliar a elevar la expresión del gen. Ejemplos de dichas secuencias mejoradoras han sido reportados por Kay et al. (1987). El ARNm producido mediante un constructo de ADN de la presentes invención también puede contener una secuencia líder 5' no traducida. Esta secuencia se puede derivar del promotor seleccionado para expresar el gen y se puede modificar de manera específica como para incrementar la traducción del ARNm. Las regiones 5' no traducidas también se pueden obtener a partir de ARNs vírales, a partir de genes eurocarióticos adecuados, o a partir de secuencia de gen sintética. Dichas secuencias "mejoradoras" también pueden ser deseables para incrementar o alterar la eficiencia de translación del ARNm resultante. La presente invención no está limitada a constructos en los cuales la región no traducida se deriva de la secuencia 5' no traducida que acompaña a la secuencia de promotor. Más bien, la secuencia líder no traducida se puede derivar a partir de promotores o genes no relacionados (consultar, por ejemplo la patente de E.U.A: 5,362,855). Otros componentes genéticos que sirven para mejorar la expresión o afectar la transcripción o traducción de un gen también están contemplados como componentes genéticos. La región 3' no traducida de los constructos quiméricos debe contener un terminador transcripcional, o un elemento que tiene una función equivalente, y una señal de poliadenilación, que funciona en plantas para provocar la adición de nucleótidos poliadenilatados al extremo 3' del ARN. Ejemplos de regiones 3' adecuadas son (1) las regiones 3' transcritas, no traducidas que contienen la señal de poliadenilación de genes de plásmido (Ti) que inducen tumor de Agrobacterium, tales como genes de nopanila sintasa (NOS), y (2) genes vegetales tales como los genes de proteína de almacenamiento de soya y la subunidad pequeña del gen de ribulose-1 ,5-bisfosfalo carboxilasa (ssRUBISCO). Un ejemplo de una región 3' preferida es la del gen ssRUBISCO de chícharo (solicitud de patente europea 385,962, incorporada a la presente por referencia en su totalidad). De manera típica, las secuencias de ADN localizadas a unos cuantos cientos de pares de bases corriente abajo del sitio de poliadenilación sirven para terminar la transcripción. Las secuencias de ADN son referidas en la presente como regiones de terminación de transcripción. Las regiones se requieren para poliadenilación eficiente de ARN mensajero transcrito (ARNm) y son conocidos como las regiones 3' no traducidas. La ARN polimerasa transcribe una secuencia de codificación de ADN a través de un sitio en donde ocurre la poliadenilación. En una modalidad preferida, el vector contiene un gen marcador seleccionable, evaluable o calificable. Esos componentes genéticos también son referidos en la presente como componentes genéticos funcionales, ya que producem un producto que sirve una función en la identificación de una planta transformada, o un producto de utilidad deseada. El ADN que sirve como un dispositivo de selección funciona en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que conferiría al tejido vegetal resistencia a un compuesto de otra manera tóxico. Los genes de interés para utilizarse como un marcador seleccionable, evaluable, o calificable incluirían, pero no están limitados a, ß-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa (LUX), genes de tolerancia a antibióticos o herbicidas. Ejemplos de transpos;ones y genes de resistencia antibiótica asociados incluyen los transposiones Tns (bla), Tn5 (npti\), Tn7 (dhf?; penicilinas, canamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprima); cloramfenicol; y tetraciclina. Las características útiles para marcadores seleccionables en vegetales han sido delineadas en un reporte sobre el uso de microorganismos (Advisory Committee on novel Foods and Processes, Julio 1994). Estos incluyen: i) selección estricta con un número mínimo de tejidos no transformados; ii) grandes números de eventos de transformación independientes sin interferencia significante con la regeneración; iii) aplicación a un gran número de especies; y iv) disponibilidad de una prueba para calificar los tejidos para presencia del marcador.

Como se mencionó, varios marcadores de resistencia a antibióticos satisfacen esos criterios incluyendo aquellos resistentes a canamicina (nptll), higromicina B (aph IV), y gentamicina (aac3 y aacC4). Un número de genes marcadores seleccionables son conocidos en la técnica. Los genes marcadores seleccionables que se prefieren en particular para usarse en la presente invención incluirían genes que confieren resistencia a compuestos tales como antibióticos como canamicina (Dekeyser et al., 1989), y herbicidas como glifosato (Della-Cioppa et al., 1987) otros dispositivos de selección también se pueden implementar y aún caerían dentro del alcance de la presente invención. La presente invención se puede utilizar con cualquier plásmido o vector de transformación vegetal adecuado que contiene un marcador seleccionable o evaluable y elementos reguladores asociados como se describe, junto con uno o más ácidos nucleicos expresados en una manera suficiente para conferir una característica deseable particular. Ejemplos de genes estructurables adecuados de interés contemplados por la presente invención incluirían, pero no están limitados a, genes para tolerancia a insecto» o pestes, tolerancia a herbicida, genes para mejoras en calidad tales como producción, mejoras nutricionales, tolerancias al entorno o a la tensión, o cualquier cambio deseable en fisiología, crecimiento, desarrollo, morfología de planta o de productos de plantas. De manera alternativa, las secuencias que codifican ADN pueden afectar esos fenotipos codificando una molécula de ARN no traducible que provoca la inhibición objetivo de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo por medio de mecanismos mediados por antisentido o co-supresión (consultar, por ejemplo, Bird et al., 1991). El ARN también podría ser una molécula de ARN catalítico (es decir una ribosima) manipulada genéticamente para cortar un producto de ARNm endógeno deseado (consultar, por ejemplo, Gibson y Shillitoe, 1997). De esta manera, cualquier gen que produce una proteína o ARNm que expresa un cambio de fenotipo o de morfología de interés es útil para la práctica de la presente invención. Los ácidos nucleicos ilustrativos que se pueden introducir mediante los métodos abarcados por la presente invención incluyen, por ejemplo, secuencias o genes de ADN de otras especies, o incluso genes o secuencias que se originan con, o están presentes en la misma especie pero están incorporados en células recipientes por métodos de ingeniería genética en vez de las técnicas clásicas de reproducción o cultivo. Sin embargo, el término exógeno también está diseñado para referirse a genes que no están presentes normalmente en la célula que se está transformando o a genes que no están presentes en la forma, estructura, etc., como se encuentran en el segmento de ADN transformante o a los genes que están normalmente presentes pero que es deseable una expresión diferente. Por lo tanto, el término gen o ADN "exógeno" está diseñado para referirse a cualquier gen o segmento de ADN que está introducido en una célula recipiente, sin considerar si es que un gen similar puede ya estar presente en dicha célula. El tipo de ADN incluido en el ADN exógeno puede incluir ADN que ya está presente en la célula vegetal, ADN de otra planta, ADN de un organismo diferente, o un ADN generado de manera externa, tal como una secuencia de ADN que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una secuencia de ADN quei codifica una versión sintética o modificada de un gen. A la luz de esta descripción, serán evidentes muchos otros genes marcadores seleccionables o evaluables posibles, elementos reguladores, y otras secuencias de interés para los expertos en la técnica. Por lo tanto, la discusión mencionada anteriormente está diseñada para ser ilustrativa en vez de exhaustiva. Después de la construcción del vector o constructo de transformación vegetal, dicha molécula de ácido nucleico, preparada como una composición de ADN in vitro, se introduce en un hospedero adecuado tal como E. coli y se hace coincidir en otro hospedero adecuado tal como Agrobacterium, o se transforma directamente en Agrobacteria competente. Esas técnicas son bien conocidas para los expertos en la técnica y han sido descritas para un número de sistemas vegetales incluyendo soya, algodón, y trigo (consultar, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,569,834 y 5,159,135 y WO 97/48814 incorporadas a la presente por referencia en su totalidad. La presente invención abarca el uso de cepas bacterianas para introducir uno o más componentes genéticos en plantas. Aquellos de habilidad en la técnica reconocerían la utilidad de métodos de transformación mediados por Agrobacterium. Las cepas preferidas incluirían, pero no están limitadas a, cepa C58 Agrobacterium tumefaciens, una cepa nopalina que se utiliza para mediar la transferencia de ADN en una célula vegetal; cepas octopina, tales como L3A4404; o cepas de agropina, por ejemplo, EHA101 , EHA105, o EHA109. El uso de esas cepas para transformación vegetal ha sido reportado, y los métodos son familiares para los expertos en la técnica. La presente invención se puede utilizar con cualquier célula o tejido regenerable. Aquellos de habilidad en la técnica reconocerán que tejido vegetal regenerable se refiere en general a tejido que después de la inserción de ADN exógeno y condiciones de cultivo adecuadas puede formarse en un planta diferenciada. Dicho tejido puede incluir, pero no está limitado a, tejido de callo, tejido de hipocotilo, cotiledóneas, raíces, y hojas. Por ejemplo los tejidos regenerables pueden incluir callos o embriones de anteros (Zhou y Zonzak, 1989), microesporas (Ziauddin et al, 1992), inflorescencias (Barcelo et al, 1 94), y tejidos de hoja (Conger et al, 1987). En trigo por ejemplo, los embriones inmaduros se pueden aislar a partir de espigas de trigo. Otros tejidos también están contemplados por tener utilidad en la práctica de la presente invención. En una modalidad de la presente invención, se utiliza el tejido calloso embriogénico como el material de explanta de partida. El callo embriogénico se produce a partir de embriones inmaduros. Esos callos se pueden producir aislado y cultivando embriones inmaduros sobre un medio nutriente que contiene carbohidratos y reguladores de crecimiento vegetal.

Los callos embriogénicos u otros tejidos objetivo para transformación de un cultivo particular se pueden aislar mediante un número de métodos conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, WO 97/48814, incorporada a la presente por referencia en su totalidad, describe el aislamiento de embriones inmaduros de trigo y callos embriogénicos. El aislamiento de embriones inmaduros de trigo también se describe por Weeks et al (1993) y Vasil et al (1993). De manera similar, los embriones inmaduros de maíz se pueden precultivar sobre un medio de cultivo adecuado y utilizarse para inoculación de Agrobacterium. En soya, por ejemplo, los cultivos de suspensión celular se pueden desarrollar a partir de tejido de hoja y mantenerse durante un período extendido antes de inoculación de Agrobacterium. Las secciones de hipocotilo también están contempladas como explantes para soya y se pueden preparar a partir de retoños germinados, como es sabido para los expertos en la técnica. Otra modalidad de la presente invención es utilizar células o tejidos pre-cultivados como el material de partida. Pre-cultivado, como se utiliza en la presente, significa el cultivo de células o tejidos en un medio adecuado para soportar el crecimiento de tejido vegetal antes de la inoculación con Agrobacterium. El pre-cultivo de las células o tejidos regene ables antes de inoculación con Agrobacterium puede ocurrir durante un período de tiempo extendido, por ejemplo siete días o más. De manera más preferible, el período de pre-cultivo es de seis días o menos. De manera un más preferible, el período de pre-cultivo es un período más corto de tiempo tal como aproximadamente de una hora a cuatro días. De manera más preferible, el período de pre-cultivo es de uno a tres días. Ejemplos de medios para pre-cultivo adecuados incluirían, pero no están limitados a, medio basado en MS (Murashige y Skoog, 1962) o medio basado en N6 (Chu et al., 1978) suplementado con nutrientes adicionales y/o reguladores de crecimiento vegetal incluyendo, pero no limitado a, piclorama y 2,4-D (consultar cuadro 2). Aquellos de habilidad en la técnica son familiares con la variedad de medios de cultivo de tejido que, cuando se suplementan de manera adecuada, soportan el crecimiento de tejido vegetal y el desarrollo. Esos medios de cultivo de tejido se pueden adquirir como una preparación comercial o prepararse a la medida y modificarse por los expertos en la técnica. Ejemplos de dichos medios incluirían, pero no están limitados a, medio de Gamborg (Gamborg et al., 1968), medio para planta leñosa de McCown (McCown y Loyd, 1981 ), medio de Nitsch y Nitsch (Nitsch y Nitsch, 1969), y medio de Schenk y Hildebrandt (Schenk y Hildebrandt, 1972) suplementados de manera adecuada. Aquellos de habilidad en la técnica están consientes de que los medios y los suplementos de medios tales como nutrientes y reguladores de crecimiento para utilizarse en la transformación y regeneración se optimizan normalmente para el cultivo objetivo particular de interés. Una vez que el tejido vegetal regenerable está aislado, el siguiente paso del método es introducir los componentes genéticos en el tejido vegetal. Este procedimiento también es referido en la presente como "transformación". Las células vegetales se transforman y se selecciona cada célula vegetal transformada de manera independiente. Los transformantes independientes son referidos como líneas de células vegetales. Se han reportado un número de métodos y se pueden utilizar para insertar componentes genéticos en tejido vegetal regenerable. Los métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens, y para obtener plantas transgénicas han sido publicados para un número de cultivos incluyendo algodón (patente de E.U.A. No. 5,004,863; patente de E.U.A. No. 5,159,135; patente de E.U.A. No. 5,518,908; WO 97/43430), soya (patente de E.U.A. No. 5,569,834; patente de E.U.A. No. 4,416,011 ; McCabe et al, 1988; Christou et al, 1986!), Brassica (patente de E.U.A. No. 5,463,174), y cacahuate (Cheng et al, 1996; De Kathen y Jacobsen, 1990). La transformación de monocotiledones utilizando electroforación, bombardeo de partículas, y Agrobacterium también ha sido reportada. La transformación y regeneración vegetal se ha logrado en espárrago (Bytebier et al, 1987), cebada (Wan y Lemaux, 1994), maíz (Rhodes et al., 1988; Ishida et al., 1996; Gordon-Kamm et al., 1990; Fromm et al., 1990; Koziel et al., 1993; Armstrong et al., 1995), avena (Somers et al., 1992), arroz (Toriyama et al, 1988); Zhang y Wu, 1988; Zhang et al., 1988; Battraw y Hall, 1992; Christou et al., 1991 ; Park et al., 1996), remolacha de azúcar (Bower y Birch, 1992), cañuela alta (Wang et al., 1992), y trigo (Vasil et al., 1992; Weeks et al., 1993).

La presente invención utiliza transformación mediada por Agrobacterium. Una ventaja de la presente invención es que los vectores binarios regulares se pueden utilizar con los experimentos en esta invención. La transformación se logró en todos los sistemas de plantas probados. El hecho de que un vector super binario puede no ser necesario, provee utilidad adicional, debido a que los vectores super binarios han mostrado que son esenciales para lograr alta transformación en otro sistema de maíz reportado (Ishida et al., 1996). El tejido regenerable se inocula con Agrobacterium, y la explanta inoculada fue tratada de manera que el peso de la explanta se redujo durante el período de co-cultivo. El tratamiento de células o tejidos regenerables después de inoculación de Agrobacterium comprende cualquier método que reduce el peso de la explanta inoculada y facilita el procedimiento de transferencia de ADN. Una modalidad de la invención que se prefiere en particular utiliza condiciones de humedad limitadas o reducidas para reducir el peso de la explanta después de inoculación con Agrobacterium. Los métodos posibles para reducir el peso de la explanta durante el co-cultivo podrían incluir, pero no están limitados a, restringir humedad exógena a la explanta ante el co-cultivo; reducir el peso de la explanta aplicando un vacío durante el co-cultivo, ¡ncrementar el potencial osmótico del medio, por ejemplo, mediante el uso de manitol, sorbitol, rafinosa, o polietilenglicol o combinaciones de los mismos; secar al aire la explanta para reducir el peso de la explanta mediante evaporación o aire aplicado; o medios químicos para extraer humedad de la explanta durante el co-cultivo, por ejemplo, colocando la planta en un entorno desecante. Ejemplos de desecantes adecuados incluirían, pero no están limitados a, óxido de calcio o ácido sulfúrico. Un método preferido para disminuir el peso de la explanta inoculada con Agroacterium es limitar el suministro de humedad a dicha explanta durante el co-cultivo. El co-cultivo, como se utiliza en la presente, significa el tiempo a partir de cuando la explanta es inoculada con el cultivo de Agroactsríum hasta el tiempo en el cual el crecimiento de Agroacterium se suprime mediante la adición de compuestos o a través del procedimiento que inhibe el crecimiento de Agroacterium. La explanta inoculada con Agroacterium se coloca en un recipiente de cultivo de tejido tal como un plato de petri que no contiene medio que contiene un agente gelificador. En una modalidad, la explanta se coloca sobre un medio absorbente adecuado, incluyendo, pero no limitado a, papel filtro que se coloca en el plato de petri. La cepa de Agroacterium que alberga el plásmido o vector de interés se cultiva en un medio de cultivo adecuado, tal como Luria Burtani (LB) suplementado con antibióticos selectivos para la cepa y el vector. Aquellos de habilidad en la técnica son familiares con procedimientos para crecimiento y condiciones de cultivo adecuadas para Agroacterium así como procedimientos de inoculación subsecuentes. La densidad del cultivo de Agroacterium utilizadei para inoculación y la relación de células de Agroacterium a explanta puede variar desde un sistema al siguiente, y por lo tanto se espera la optimización de esos parámetros para cualquier método de transformación. Típicamente, un cultivo de Agroacterium es inoculado a partir de una placa sembrada o material de abastecimiento de glicerol y se cultiva durante la noche y las células bacterianas se lavan y se resuspenden en un medio de cultivo adecuado para inoculación de la explanta. El medio de inoculación adecuado para la presente invención incluye, pero no está limitado a, 1/10 de sales MS en medio de CM4C (cuadro 2) o un medio de cultivo CM4C modificado con una concentración de sal reducida. En algunos casos, también se puede añadir un agente tensioactivo incluyendo, pero no limitado a Silwet (L77) (Wites, Hudson, Ohio) o pluronic F68 (Sigma, St. Louis, MO) al medio de inoculación a una concentración baja. Los explantes se incuban con la suspensión de célula de Agroacterium lavada y resuspendida. La inoculación se realiza generalmente a una temperatura de 20°C-28°C, preferiblemente de 23°C-28°C desde 1 minuto a 3 horas. La cantidad de líquido añadido incubado con la explanta durante el período de co-cultivo varía dependiendo del tamaño del recipiente de cultivo, el tamaño/peso de los explantes de partida y el número de explantes/placa. La cantidad de líquido añadido puede estar en la escala de 0 µL a 1 CíOO µL, preferiblemente de 0 µL a 500 µL para una placa de cultivo de 60 x 20 mm. El período de co-cultivo puede estar en la escala desde una hora a una semana, preferiblemente de un día a cuatro días, más preferiblemente de un día a tres días. Después del período de co-cultivo, el peso de la explanta inoculada con Agroacterium se reduce por no más de 50%. Más preferiblemente, el peso de la explanta inoculada con Agroacterium se reduce hasta 40%. Aun más preferiblemente, el peso de la explanta inoculada con Agroacierium se reduce hasta 30%. Después del período de co-cultivo, los explantes inoculados con Agroacterium se cultivan en un medio adecuado que contiene un agente para inhibir crecimiento de Agroacterium. Los explantes inoculados con Agroacierium se cultivan en dicho medio generalmente desde uno a catorce días, preferiblemente desde dos a siete días. Aquellos de habilidad en la técnica están consientes de los componentes de medio adecuados para inhibir el crecimiento de Agroacterium. Dichos componentes de medio incluirían, pero no están limitados a, antibióticos tales como carbenicilina o cefotaxima. Después del paso de cultivo para inhibir el crecimiento de Agroacterium, y preferiblemente antes de que los explantes se coloquen sobre medio selectivo, se analizan para eficiencia de suministro de ADN mediante una prueba transitoria que detecta la presencia de un gen contenido en el vector de transformación, incluyendo, pero no limitado a, un gen marcador seleccionable tal como el gen que codifica para ß-glucuronidasa (GUS). El número total de puntos azules (que indican expresión de GUS) para un número seleccionado de explantes se utiliza como una correlación positiva de eficiencia de transferencia de ADN. La cantidad óptima de reducción de peso durantes el co-cultivo y la eficiencia de transformación se predicen de manera transitoria y se confirman de manera subsecuente con alta eficiencia de producción de transformantes estables. En la modalidad preferida, después de la incubación sobre medio no selectivo que contiene los antibióticos para inhibir crecimiento de Agroacierium sin agentes selectivos, los explantes se cultivan sobre medio de cultivo selectivo incluyendo, pero no limitado a, medio de inducción de callos que contiene un agente selectivo. Los agentes selectivos típicos incluyen, pero no están limitados a, antibióticos tales como geneticina (G418) paromomicina, u otros químicos tales como glifosato. Los cultivos se transfieren de manera subsecuente a un medio de regeneración adecuado para la producción de plántulas transformadas. Aquellos de habilidad en la técnica están consientes de los numerosos tipos de medios y requerimientos de transferencia que se pueden implementar y optimizar para cada sistema de plantas para transformación y regeneración de plantas. En consecuencia, dichos medios y condiciones de cultivo descritos en la presente invención se puede modificar o sustituirse con componentes equivalentes de manera nutricional, o procedimientos similares para selección y regeneración, y aun caer dentro del alcance de la presente invención. Los transformantes producidos se analizan de manera subsecuente para determinar la presencia o ausencia de un ácido nucleico particular de interés contenido en el vector de . transformación. Los análisis moleculares pueden incluir, pero no están limitados a, análisis de Southern blots (Southern, 1975) o PCR (reacción en cadena de polimerasa). Esos y otros métodos bien conocidos se pueden realizar para confirmar la estabilidad de las plantas transformadas producidas mediante los métodos descritos. Esos métodos son bien conocidos para los expertos en la técnica y se han reportado (consultar, por ejemplo, Sambrook et al, 1989). Aquellos de habilidad en técnica apreciaran las muchas ventajas de los métodos y composiciones provistas mediante la presente invención. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la invención y por lo tanto se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos de habilidad en técnica deberán apreciar, a ia luz de la presente descripción, que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y aun obtener un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de vector plásmido Los vectores plásmidos se construyeron utilizando técnicas biológicas moleculares estándar conocidas para los expertos en la técnica. Un número de vectores de transformación de planta mediados por Agrobacterium han siclo descritos (Klee y Rogers, 1989). Brevemente, los vectores de transformación de plantas descritos en la presente comprenden una o más secuencias de ácido nucleico que incluyen pero no están limitados a, una o más secuencias de borde de ADN-T para promover la transferencia de moléculas de ácido nucleico en el genoma de la planta, los elementos de replicación, un marcador seleccionable y uno o más genes de interés. pMON25457 (figura 3) también contiene un intrón de proteína de choque de calor des maíz (hsp 70) localizado corriente arriba de la región de codificación. pMON15715 (figura 1 ) y pMON18365 (figura 2) contienen un intron de Solanun tuberosum (ST-LS1*INT). Las características básicas de los vectores que se utilizan en los ejemplos están resumidas en el cuadro 1 y están listadas como sigue: promotor/secuencia de codificación/región 3' no traducica. Las abreviaciones en el cuadro se describen como sigue: FMV es el promotor del virus de mosaico de Figwort (patente de E.U.A. No. 5,378,619); El promotor e35S es una modificación del promotor 35S derivado del ARN 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV) que contiene una duplicación de la región -90 a -300; el promotor nos es de Agrobacterium tumefaciens pTiT37. El gen GUS es la secuencia de codificación de ß-glucuronidasa de E. coli; el gen nptll codifica para neomicin fosfotransferasa; la región nos 3' contiene secuencia no traducida corriente abajo y la señal poli A para el gen NOS de Agrobacterium tumefaciens pTiT37. Varios constructos de tolerancia a glifosato también se probaron utilizando el gen CP4 como el gen de interés junto con elementos reguladores asociados.

CUADRO 1 Vectores de plásmido Plásmido Elementos genéticos pMON15715 PFMV-GUS-E937 pnos-nptll-nos3' PMON18365 pe35S-nptll-nos37pe35S-GUS-nos3' pMON25457 pE35S-GUS-nos37pe35S-nptll-nos3" EJEMPLO 2 Transformación utilizando embriones inmaduros precultivados (PCIEs) de trigo 1. Preparación de explante Se aislaron embriones inmaduros de trigo (Triticum aestivum L) cv Bobwhite a partir de cariopsis inmaduros (espigas de trigo) 13-15 días después de polinación, y se cultivaron en CM4C (cuadro 2) durante 1-6 días. Los embriones sin callos embriogénicos se seleccionaron para inoculación de Agrobacterium.

CUADRO 2 Componentes suplementales en medio basal1 1Todos los medios contienen sales básales (sales básales MS) y vitaminas (vitaminas MS) de Murashige y Skoog (1962). El pH en cada medio se ajusló a 5.8. 2 Esterilizado por filtro y añadido al medio después de auto clave. 3 PHYTAGEL (P) (PHYTAGEL es una marca registrada de Sigma Chemical Co., St Louis, MO) o GELRITE (G) (GELRITE está disponible de Schweizerhall, Inc., South Plainfield NJ) (GELRITE es una marca registrada de Monsanto Company, St Louis, MO). 2. Cultivo e inoculación de Agrobacterium Una cepa de Agrobacterium desarmada C58 (ABl) que alberga un vector binario se utilizó para todos los experimentos. Los cultivos de Agrobacterium se iniciaron a partir de material de abastecimiento de glicerol o a partir de una placa recién sembrada y cultivada durante la noche a 26°C-28°C con agitación (aproximadamente 150 rpm) a fase mid-log (aproximadamente OD66o=1-1 -5) en medio LB líquido, pH 7.0 (Miller, 1972) que contiene 50 mg/L canamicina, 50 mg/L espectromicina y espectinomicina, y 25 mg/L cloramfenicol con 200 µM acetosiringona (AS). Las células de Agrobacterium se resuspendieron en el medio de inoculación y la densidad se ajustó a un ODßßo de 1. Los embriones inmaduros cultivados en medio de CM4C se transfirieron a cajas de petri estériles (16 x 20 mm) o pozos de una placa de cultivo celular de 6 pozos (Costar Corporation, Cambridge, MA) que contiene 10 mL de medio de inoculación por caja de petri o 5 mL por placa de agrupación de cultivo celular. Una cantidad igual de la suspención celular de Agrobacterium se añadió de manera que la concentración final de células de Agrobacteríum fue de un OD6oo de 0.5. En la mayoría de los experimentos, se añadió pluronic F68 a la mezcla de inoculación a una concentración final de 0.01 %. La relación entre el Agrobacterium y los embriones inmaduros (lEs) fue de eiproximadamente 10 mL: 20-200 I Es. Las condiciones para inoculación fueron temperaturas de 23°C-26°C con una duración de 5-60 minutos. 3. Co-cultivo Después del periodo de inoculación, las células de Agrobacterium restantes se removieron de los explantes utilizando el equipo de instalación al vacío. Se colocó una pieza de papel filtro Whatman No. 1 (para ajustar al tamaño de la caja de petri) en cada caja de petri de 60 x 15 o 60 x 20 mm sin líquido o medio suplementado con agar adicional. Se colocaron 200 microlitros de agua estéril en la parte media del papel filtro. Después de 2-3 minutos, los embriones inmaduros inoculados se colocaron en las cajas. Normalmente se agruparon 20-50 explantes como una pila (de aproximadamente 1 cm de tamaño y 60-80 mg/pila) con 4-5 pilas en cada caja. Las cajas se cubrieron con película de parafina inmediatamente y después se cultivaron en la obscuridad a 24°C-26°C durante 2-3 días. 4.- Efecto de la humedad durante el co-cultivo sobre el suminis ro de ADN. crecimiento de Agrobacterium y peso de explanta La eficiencia de suministro de ADN se midió mediante expresión transitoria de GUS después de un retraso de 2-3 días de selección. El efecto de la humedad durante el co-cultivo sobre el suministro de ADN se probó utilizando los explantes precultivados. Como se muestra en el cuadro 3, cuando se añaden 300 µL o menos de agua a las cajas de co-cultivo, el peso de los explantes se reduce por aproximadamente 20%-35%. De manera significemte se observó también más expresión de GUS transitoria. Cuando se añadieron 400 µL o más de agua, el peso de los explantes se incrementó y se observaron menos puntos de GUS sobre los explantes. La expresión de GUS transitorio se redujo de manera significante cuando se utilizó un tiempo corto de inoculación (5-30 minutos) acoplado con 500 µL o más de agua en las cajas de co-cultivo. Cuando se utilizó 300 µL o menos de agua para el cocultivo, los puntos azules, que indican expresión de GUS, se dispersaron de manera uniforme sobre la superficie del tejido escutelar de todos lo embriones inmaduros, especialmente en el área que muestra división celular activa. En contraste, solamente 30%-50% de los embriones inmaduros mostraron expresión de GUS cuando se añadió 500 µL o más de agua durante el cocultivo.

CUADRO 3 Efecto de humedad durante co-cultivo sobre el crecimiento de Agrobacterium, el peso de PCIE inoculado, y el suministro de ADN1 H2O/caja Peso Peso Ganancia % No. de No. de (µD antes de después +/pérdida- (ganancia/ Agro puntos cocultivo2 de co(C=B-A) pérdida) colonias 3 GUS/IE4 (gramos) cultivo (gramos) (C/A)x100 (A) (gramos) (B) 0 0.24351 0.15864 -0.08487 -34.8 251 105 100 0.27871 0.21456 -0.06415 -23.0 274 208 200 0.32957 0.25648 -0.07309 -22.2 279 219 300 0.35865 0.28576 -0.07289 -20.3 372 213 400 0.21412 0.22171 +0.00759 +3.5 672 93 500 0.33199 0.39501 +0.06302 + 19.0 842 84 1Se utilizó pMON 18365. 2 Cada caja (tratamiento) contiene 100 PCI Es. 3 Noventa y cinco PCI Es inoculados después de co-cultivo de 3 días con Agrobacterium se enjuagaron con 10 mL de H20 suplementada con 0.01% L77 durante 5 minutos, entonces se recogieron 100 µL y se diluyeron a mL de H20. Un microlitro del tratamiento 400 y 500 (H20/caja) y 10µL de los tratamientos restantes se formaron en placas sobre LB más fármacos adecuados, y las placas se incubaron a 28°C durante 3 días. Las colonias individuales se contaron, y el número se ajustó basado en la solución de 10 µL diluida. Cinco explantes se analizaron mediante una prueba de GUS y los pun ios azules se contaron.

.- Selección y regeneración Después de 2-3 días sobre el medio de retraso, los embriones inmaduros se transfirieron a CM4C suplementado con 25 mg/L G418 y 500 mg/L carbenicilina. Después de 2-3 semanas, los embriones se fracturaron en piezas más pequeñas (~2mm) y se subcultivaron al primer medio de regeneración, MMS.2C (cuadro 2) con 25 mg/L G418 y 250 mg/L carbenicilina. Con la transferencia al medio de regeneración, cada pieza de callo se dividió de manera adicional en varias piezas pequeñas (~2 mm). Dos semanas después de la transferencia, retoños jóvenes y tejido calloso viable se transfirieron a un segundo medio de regeneración MMS0C (Cuadro 2) con las mismas concentraciones de G418 y carbenicilina. Se separaron piezas más grandes de tejidos en piezas más pequeñas como se describe anteriormente. Las plántulas, las cuales se confirmaron posteriormente que son transformantes verdaderos, crecieron vigorosamente y formaron sistemas de raices fuertes sobre este medio. Las plantas con raíces pilosas fuertes, con más de diez raíces cortas y fuertes, o raíces secundarias, se transfirieron a tazas de Sundae (Sweetheart Cup Company, Chicago, IL) que contienen el segundo medio de regeneración para crecimiento y selección adicional. Las muestreis de hojas se tomaron de algunas de las plántulas para la prueba histoquimica GUS en ese momento. Durante el periodo de crecimiento en las tazas de Sundae, la mayoría de las no transformantes murieron o mostraron signos de susceptibilidad a G418. Las plantas altamente resistentes a G418, que crecieron vigorosamente con sistemas de raíces fuertes, se transfirieron a tierra antes de que crecieran a la parte superior de las tazas de Sundae. Todas las plantas que se originaron del mismo embrión fueron consideradas que son retoños del mismo evento. 6. Eficiencia de transformación Las plantas regeneradas no mostraron anormalidades visibles y fueron fértiles. Todas las plantas se probaron mediante una prueba histoqu'mica GUS. Se produjeron muchos eventos transgénicos. Para un total de 151 explantes a partir de 12 experimentos separados, se produjeron 99 eventos; transgénicos, con una eficiencia de transformación promedio de 6.5%. La escala de eficiencia de transformación fue de 1.4% a 19% para los diferentes parámetros probados, que incluyeron duración de periodo de inoculación y la densidad de Agrobacterium utilizada para inoculación. 7. Detección y análisis de las plantas transgénicas Las plantas se cultivaron en una cámara de crecimiento de entorno controlado con un fotoperíodo de 16 horas a 800 molrtf2s"1 provisto mediante descarga de alta densidad (HD) de luces de Silvania (GTE Products Corp., Manchester, NH). Las temperaturas de día/noche fueron 18/16°C. Tomó eiproximadamente de 2.5 a 3 meses a partir de la inoculación para transferir la mayoría de las plantas a tierra, y no se observaron anormalidades visibles, Cada planta se examinó mediante uno o más de los siguientes métodos: 1) Prueba colorimétrica histoquímica GUS (Jefferson, 1987) utilizando diferentes partes de las plantas. 2) Una prueba de blanqueo de hoja como se describe en Cheng et al. (1997). 3) También se condujo análisis de hibridización Southern (Southern, 1975). El ADN genómico se aisla de tejido de planta o plantas de prueba utilizando métodos estándar conocidos para los expertos en la técnica (consultar, por ejemplo, el método descrito en Roger y Bendich, 1985). Una vez que el ADN se ha aislado, se pueden realizar los análisis Southern utilizando protocolos y métodos que son conocidos para los expertos en la técnica.

EJEMPLO 3 Transformación de callos embriogénicos de trigo utilizando selección de Nptll 1. Preparación de explanta Un retoño de trigo Triticum aestivum cv. Bobwhite se utilizó a través e este estudio. Las plantas de abastecimiento se cultivaron en una cámara de crecimiento de entorno controlado bajo las mismas condiciones de crecimiento como se describe anteriormente. Los cariopsos inmaduros (espigas) se recolectaron de las plantas 13-15 días después de la antesis. Los embriones inmaduros (lEs) se disecaron asépticamente y se cultivaron en medio de inducción de callo CM4 o CM4C (Cuadro 2) durante 10-30 días a 23-25°C en la oscuridad. 2. Cultivo de Agrobacterium El protocolo para cultivo y cosecha de Agrobacterium fue el mismo como se describe en el ejemplo 2, y se utilizó pMON 18365. 3. Inoculación Los embriones inmaduros cultivados en el medio de inducción de callo (CM4 o CM4C) durante 10-30 días se transfirieron en una suspensión de células de Agrobacterium en cajas de petri (25 x 100 mm). La relación entre Agrobacterium y tejido calloso embriogénico (EC) fue de aproximadamente 30 mL Agrobacterium: 30 EC. Se añadió un agente tensioactívo Silwet (L77) (Witco Corporation, Hudson, OH) o pluronic F68 (Sigma, St. Louis, MO), al medio e inoculación a una concentración de 0.01-0.02%. La inoculación se realizó a 23°C-25°C durante 2-3 horas en la oscuridad. 4. Co-cultivo Después de la inoculación, el Agrobactería extra en cultivo líquido se removió de los explantes utilizando el equipo de vacío de la instalación. Una pieza de papel filtro estéril Whatman No. 1 se colocó en cada una de las cajas de petri de 60 x 20 mm. Cincuenta microlitros de medio de inoculación o agua estéril se colocaron en la parte media del papel filtro. Después de uno o dos minutos, los callos embriogénicos inoculados (derivados de cada embrión inmaduro cultivado durante 10-30 días) se colocaron en la cresta del medio líquido o agua. Normalmente, aproximadamente 10-12 plantas se colocan en un círculo sobre el papel filtro de cada placa. Las cajas fueron cubiertas con película de parafina y la co-cultivación se permitió proceder en la oscuridad a 24°C a 25°C durante tres días.

. Eficiencia de suministro de ADN ' La eficiencia de suministro de ADN se midió mediante una prueba de expresión de GUS transitorio después de un retraso de 2-3 días de selección. Un nivel más alto de expresión de GUS se observó para todos los experimentos que limitan la humedad a la explanta inoculada con Agrobacterium. Como se muestra en el cuadro 4, cuando 200 µL o menos de medio liquido se añaden a las placas de co-cultivo, se observa una expresión GUS significativamente más transitoria. Cuando 400 µL o más de medio se añaden, menos de 40 GUS puntos fueron visibles en los explantes.

CUADRO 4 Efecto de humedad durante el co-cultivo sobre el suministro de ADN utilizando embriones inmaduros cultivados durante 14 días1.

Cantidad de líquido añadido a la Número de puntos azules caja (µL) /explante2 500 33.9 400 27.6 300 46.1 200 89.4 100 83.4 50 139.3 0 70.6 1Se utilizó pMON18365 2Diez explantes fueron probados en este experimento 6. Selección y regeneración de plantas Después de 2-5 días sobre el medio de CM4C (Cuadro 2), los callos embriogénicos inoculados con Agrobacterium se transfirieron a CM4 o CM4C (Cuadro 2) que contiene 25 mg/L G418 y 500 mg/L carbenicileno. Cada callo embriogénico se separó en 5 o 6 piezas, y cada pieza se trató como un sólo explante. Los callos embriogénicos se cultivaron durante 2-3 semanas para inducción de callos antes de transferencia al primer medio de regeneración y los métodos de cultivo subsecuentes son como se definen en el ejemplo 2. 7. Detección y análisis de las plantas transgénicas Las plantas T-i se analizaron como se describe en el ejemplo 2. 8. Eficiencia de transformación El número de eventos transgénicos en cada experimento se determinó después de que las plantas se probaron como se describe. A partir de 10 experimentos por separado, se obtuvieron 53 eventos transgénicos negativos a partir de un total de 515 explantes iniciales. La eficiencia de transformación estuvo en la escala de 3.6% a 37.7%, con un promedio de 10%. Los parámetros de tratamiento incluyeron el tipo de agente tensioactivo y la concentración y cantidad de agua en la caja durante el periodo de cocultivo. 9. Análisis de descendencia de las plantas transgénicas La segregación de los genes GUS y NPTII en la progenie T-i se analizó mediante una prueba histoquímica de GUS sobre el tejido de hoja, o una prueba de aspersión de paromomicina sobre los retoños de Ti. Las semillas; de T-i cosechadas a partir de cada planta de To se plantaron en macetas de 5 cm bajo las mismas condiciones que las plantas de abastecimiento descritas anteriormente. Las plantas en la etapa de tres hojas fueron asperjadas con 2% (p/v) de paromomicina que contiene 0.2% Tween 20 (ambos disponibles de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Una semana más tarde, las plantas se evaluaron para sensibilidad a paromomicina. Las plantas con un gen NPTII funcional no fueron blanqueadas, mientras que las plantas sin un gen NPTII funcional exhibieron puntos blanqueados. Los datos fueron analizados entonces mediante prueba de X2 para determinar el número de genes locos GUS o NPTII funcionales (Cuadro 5), Por ejemplo, si la relación de plantas resistentes a sensibles es de 3:1 , un solo gen loco funcional de nptll está presente en el evento transgénico. Si la relación es más grande de 3:1 , más de un evento funcional está presente.

CUADRO 5 Segregación de los genes NPTII y GUS en ia descendencia de Ti de trigo transgénico1 Planta T-, analizada mediante Plantas T-, analizadas para aspersión de Paromomicina actividad de GUS Eventcs Resistencia Sensible R/S Positivo Negativo +/- (R) (S) (+) (-) 19733 24 11 3:1 24 11 3:1 19347 32 4 3:1 32 4 3:1 19745 14 17 1:1 14 17 1:1 19751 21 11 2:1 21 11 2:1 19748 14 17 1:1 14 17 1:1 19752 28 6 3:1 28 6 3:1 19357 32 0 32:0 32 0 32:1 19741 11 23 1:2 11 23 1:2 19354 33 1 15:1 33 1 15:1 19735 32 0 32:0 32 0 32:0 1Todas las líneas derivadas a partir del constructo pMON 18365 EJEMPLO 4 Transformación de trigo utilizando selección de glifosato 1.- Preparación de explante Los procedimientos para el cultivo de plantas de abastecimiento, aislamiesnto de embriones inmaduros, e inducción de cultivo fueron iguales como se describe en el ejemplo 2. Los explantes fueron embriones inmaduros precultivados de 3-6 días (PCIE) sin tejido calloso embriogénico, o tejido calloso embriogénico cultivado durante 10-30 días. 2.- Preparación de Agrobacterium. inoculación, co-cultivo y suministro de ADN-T Los protocolos fueron los mismos como se describe en los ejemplcs 2 y 3. 3.- Selección y regeneración de plantas Después de un co-cultivo de 3 días, PCIE infectado con Agrobacterium y callos embriogénicos se transfirieron a medio de CM4C (cuadro 2) suplementado con 500 mg/L de carbenicilina y se cultivaron durante aproximadamente 7 días. Los explantes PCIE formaron callos embriogénicos en este medio. Los explantes fueron transferidas entonces a medio de selección de CM4C con 2 mM glifosato y 500 mg/L carbenicilina durante una semana en la obscuridad. Todos los callos fueron transferidos a MMS0.0C (cuadro 2) suplementado con 0.1 mM glifosato y 250 mg/L carbenicilina durante dos semanas adicionales de selección con condiciones de alumbrado de aproximadamente 80 µE. Se formaron puntos verdes o retoños al final de este periodo de cultivo. Todos los callos embriogénicos se transfirieron al segundo medio de regeneración MMS0C (cuadro 2) suplementado con 500 mg/L carbenicilina y 0.02 mM glifosato. Los aminoácidos aromáticos incluyendo L-triptofano y L-fenilalanina (10"7 mM/aminoácidos) se añadieron á este medio para facilitar la selección. Esos tejidos se transfirieron a medio fresco cada dos semanas. Las plántulas con meristemas alargados y raíces se podrían regenerar a partir de tejido calloso embriogénico en cualquier momento durante el período de cultivo. Una vez que se estableció el sistema de raíces, las plantas se transfirieron a tierra y se probaron de manera subsecuente. Todas las plantas que se originaron a partir del mismo PCIE o callo se consideraron como retoños del mismo evento transgénico. 4.- Confirmación de la naturaleza transgénica de las plantas Las plantas transgénicas sobrevivieron la selección de glifosato y se cultivaron en la cámara de cultivo con las mismas condiciones de entorno como se describe en el ejemplo 2. Las plantas transgénicas fueron examinadas normalmente mediante selección de glifosato (todas la plantas que sobrevivieron a la selección de glifosato se consideraron que son transformantes) o hibridización Southern (Southern, 1975).

.- Eficiencia de transformación Las plantas transgénicas tolerantes a glifosato también se produjeron utilizando el método de transformación de Agrobacterium de la presente invención. El tejido calloso de 10-14 días de edad y los embriones inmaduros precultivados de 3-6 días se utilizaron como explantes. Todas las plantas transgénicas putativas se confirmaron que son positivas mediante los métodos de prueba descritos. La eficiencia de transformación promedio de 12 experimentos fue de 4.6% (un total de 2844 explantes resultaron en 131 eventos transgénicos). La escala de eficiencia de transformación fue de 3.3% a 6.7%. 6.- Análisis de descendencia de las plantas transgénicas La segregación de genes CP4 y GUS en la generación de Ti se probó mediante una prueba istoquímica GUS sobre tejido de hoja y tejido de raíz o una prueba de aspersión de Roundup® de 71.7-143.4 kilos x hectárea en la etapa de 3-6 hojas. Los datos se analizaron mediante una prueba de ?2 para determinar el número de locos funcionales de genes CP4 y GUS. Se analizaron veintiuna líneas (17 CP4, 4GUS). De las líneas CP4, la descendencia de 11 líneas exhibió una relación de segregación de 3:1 (resistente:sensible), 5 líneas exhibieron una relación de 15:1 y 1 línea una relación de 1 :1. De las líneas GUS la descendencia de 4 líneas exhibió una relación de 3:1 (positivo:negativo), 2 líneas exhibieron una relación de 1 :1 y 1 línea una relación de 15:1. Se analizó una descendencia de más de 500.

EJEMPLO 5 Transformación de callo embriogénico de maíz 1.- Preparación de explante Los embriones inmaduros de maíz (Zea mays L.) de cruce de tres formas (Pa91 x H99) x A188 y línea de alimentación H99 (1 a 1.5 mm de longitud), se cultivaron en medio D (Duncan et al., 1985) suplementado con 1.5 mg/l 2,4-D (MediumD-1.5D) durante 14 días a 27°C en la obscuridad. 2.- Preparación de Agrobacterium. inoculación y co-cultivo La cepa de Agrobacterium desarmada EHA101 (Hood et al., 1986) que alberga al vector pMON25457 se utilizó para transformación de maíz. Los cultivos de Agrobacterium se iniciaron, crecieron y se cosecharon como se describe en el ejemplo 2; sin embargo, las células se seleccionaron con diferentes antibióticos (100 mg/L gentamicina y canamicina). La densidad celular se ajustó a un ODß6o de 0.5 a 1.0 para inoculación. Los callos embriociénicos (14 días, precultivados) se empaparon en la suspensión celular de Agrobacterium durante 3 horas de 23°C a 25°C en la obscuridad. Normalmente, se incluyó 0.01% Silwet (L77) en la mezcla de inoculación. Después de la inoculación, las células de Agrobacterium se removieron de las placas de inoculación como se describe, y los explantes fueron co-cultivados como se describe en los ejemplos 2 y 3. Normalmente se añaden 50-300 µL de agua a cada placa de co-cultivo. Los tratamientos con 500 µL o más de agua añadida a las placas de co-cultivo se utilizaron como controles. 3.- Regeneración de plantas e identificación de las plantas transgénicas Después de 3 días sobre el medio de retraso (MediumD-1.5D con 500 mg/L de carbenicilina), los embriones inmaduros precultivados o callos embriogénicos infectados con Agrobacterium se transfirieron al medio D modificado como se describe, con 500 mg/L carbenicilina y suplementado con paromomicina para una selección por pasos. Los explantes se seleccionaron con 25 mg/L de paromomicina durante una semana, después se fracturaron y se sub cultivaron a medio con paromomicina en concentraciones de 50 mg/L, 100 mg/L y 200 mg/L en intervalos de dos o tres semanas. Los tejidos viables se trarsfirieron a medio de pulso de BA, que consiste de medio D suplementado con 0.5 mg/L de benciladenina (BA). Después de 5 días, los callos embriogénicos se transfirieron a medio basal de MS para regeneración de planta. Las plantas transgénicas se identificaron mediante una prueba istoquímica de GUS. El cuadro 6 muestra los efectos de supresión de humedeid durante el co-cultivo sobre expresión de GUS.

CUADRO 6 Suministro de ADN y eficiencia de transformación Tratamientos1 Medio para Condiciones Expresión Número de inducción de de humedad de GUS eventos/explante callos (µL/caja3) transitoria s totales embriogénicos 1 CM4C 1 ,000 Poca 0/15 2 MedioD-1.5D 1 ,000 Poca 0/16 3 Cacahuate P4 1 ,000 Poca 1/7 4 MedioD-1.5D 1 ,000 Poca 0/20 5 CM4C 200 Mucha 0/5 6 MedioD-1.5D 200 Mucha 2/19 7 Cacahuate P 200 Mucha 0/24 8 MedioD-1.5D 200 Moderada 0/20 tratamientos 1-3, 5-7 utilizando genotipo (Pa91 x H99) A188; tratamiento 4 y 8 utilizando genotipo H99. 2Embriones inmaduros de (Pa91 x H99)A188 cultivados en varios medios durante 14 días antes de la inoculación. Los callos embriogénicos de H99 se iniciaron y mantuvieron sobre medio MediumD-1.5D durante 2 meses antes de la inoculación. 3Cajas de petri de 60 x 20 mm se utilizaron para co-cultivo; una pieza de papel filtro en el centro de la placa. 4Medio P de cacahuate consiste de medio basal MS más vitaminas suplementado con 3 mg/L de piclorama y solidificado con GELRITE.

EJEMPLO 6 Transformación de células en suspensión y explantes hipocotiledonarios de soya precultivados 1.- Preparación de explantes Una suspensión de cultivo celular se inició a partir de callos inducida a partir de tejido de hoja de soya cv. A3237 sobre medio basal de MS suplementado con 1 mg/L 2,4-D y 0.1 mg/L benciladenina (BA). Las células en suspensión se mantuvieron en este medio durante dos meses antes de la inoculación. Las células se cosecharon a partir del cultivo líquido y se inocularon con Agrobacterium. Las secciones de hipocotilo se prepararon a partir de retoños germinados de 5 días de edad de cv. A3237. Los hipocotilos se cortaron en secciones de 0.5 cm. Los explantes se precultivaron en varios medios durante 5 días antes de la inoculación. 2. Preparación de Agrobacterium. inoculación y co-cultivo La cepa de Agrobacterium desarmada ABl que alberga al vector binario pMON15715 se utilizó para todos los experimentos de soya. Los cultivos de Agrobacterium se iniciaron, crecieron y cosecharon como se describe anteriormente. La densidad celular se ajustó a un OD660 de 0.1 a 1.0 para inoculación. Los explantes se empaparon en la solución de Agrobacterium durante 15 a 30 minutos, y los explantes infectados se co-cultivaron en cajas de petri (100 x 20 mm, 100 x 15 mm, o 60 x 20 mm) con una pieza de papel filtro en la caja de petri. El agua u otro medio líquido se excluyó durante el periodo de co-cultivo para probar el efecto de humedad, y los controles se establecieron utilizando 500 µL o 1000 µL de agua o medio líquido durante el co-cultivo. El co-cultivo se realizó a 23°C-25°C durante 3 días en la obscuridad. 3. Eficiencia de suministro de ADN Después de 2 días de retraso de selección sobre un medio de MS modificado (designado como cacahuate P) con 500 mg/L de carbenicilina, los explantes se analizaron mediante una prueba de GUS. Se mostró significativamente más expresión de GUS transitoria (-50 veces) en el tratamiento de limitación de humedad utilizando suspensión celular comparado con los controles. Un efecto positivo de limitación de humedad a los explantes inoculados de Agrobacterium sobre suministro de ADN también se observó en los explantes de hipocotilo. El efecto fue más pronunciado bajo diferentes condiciones de medio de precultivo como se muestra en el cuadro 7.

CUADRO 7 Efecto de humedad y medio de precultivo sobre suministro de ADN a explantes de hipocotilo de soya1 Medio para precultivo Expresión de GUS transitoria bajo condiciones de supresión de humedad CM4C Mejora de ~10 veces sobre el control Cacahuate P2 Mejora de -100 veces Cacahuate TDZ3 igual que el control Medio D-1.5D -10 veces ^~Sin agua durante el cocultivo 2 Cacahuate P = medio basado en MS más vitaminas más 3 mg/L piclorama. Medio de cacahuate TDZ que consiste de sales básales MS más vitaminas suplementado con 2 mg/L TDZ; (TDZ = tidiazuran, Sigma, SI. Louis, MO).

REFERENCIAS Las referencias listadas enseguida y todas las referencias citadas en la presente están incorporadas a la presente por referencia al grado en que complementan, explican, proveen o respaldan, o enseñan metodología, técnicas y/o composiciones que se utilizan en la presente. Armstrong et al., Crop Science, 35:550-557, 1995. Barcelo et al., Plant J., 5:583-592, 1994. Battraw and Hall, Plant Sci. 86(2): 191 :202, 1992. Bird et al., Biotech Gen Engin. Rev., 9:207-227, 1991. Bower y Birch, Plant J., 2:409-416,1992. Bytebier et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345, 1987. Capecchi, Cell, 22(2):479-488, 1980. Chau et al., Science, 244:174-181 , 1989. Cheng et al., Plant Cell Rep., 15(9): 653-657, 1996. Cheng et al., Plant Physiol., 115(3): 971-980,1997. Christou et al., Plant Physiol., 87:671-674, 1988. Christou et al., Bio/Technology 9:957, 1991. Chu, Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Peking: Science Press. Pp. 43-50, 1978. Clapp. Clin. Perinatol., 20(1): 155-168, 1993. Conger et al., Plant Cell Rep., 6:345-347, 1987. Curiel et al., Hum. Gen. Ther., 3(2): 147-154, 1992.

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Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir una planta transgénica fértil, que comprende los pasos de: a) introducir uno o más componentes genéticos que se desea introducir en el genoma de una planta cocultivando una célula o tejido vegetal regenerable con Agrobacterium que contiene dichos componentes genéticos; b) co-cultivar dicho Agrobacterium y células o tejidos vegetales regenerables del paso a) bajo condiciones que disminuyen el peso de dicha explanta inoculada con Agrobacterium; c) identificar o seleccionar una línea celular transformada; y d) regenerar una planta transgénica fértil a partir de la misma.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula o tejido regenerable se precultiva antes del paso (a).

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las condiciones para co-cultivo comprenden limitación o remoción de humedad de la explanta inoculada con Agrobacterium en la cual el peso de la explanta se reduce por no más de 50%.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el peso de la explanta inoculada con Agrobacterium se reduce por hasta 40%.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el peso de la explanta inoculada con Agrobacterium se reduce por hasta 30%.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el periodo de limitación o remoción de humedad después de inoculación con Agrobacterium es más grande de 1 hora.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el periodo de limitación o remoción de humedad después de la inoculación con Agrobacterium es de 1 hora a 6 días.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el periodo de limitación o remoción de humedad después de la inoculación con Agrobacterium es de 1 día a 4 días.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el periodo de limitación o remoción de humedad después; de la inoculación con Agrobacterium es de 1 día a 3 días.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta transgénica es una monocotiledonea.

11.- El método de conformidad con' la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta transgénica es una dicotiledónea.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la monocotiledonea es trigo, maíz o arroz.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la monocotiledonea es trigo.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la monocotiledonea es maíz.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la monocotiledonea es arroz.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la dicotiledónea es soya.