MXPA01005448A

MXPA01005448A - Composiciones y metodos para regular la patogenesis bacterial

Info

Publication number: MXPA01005448A
Application number: MXPA/A/2001/005448A
Authority: MX
Inventors: Bonnie Bassler; Michael G Surette
Original assignee: Bonnie Bassler; Princeton University; Michael G Surette
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 2001-05-31
Publication date: 2003-11-07

Abstract

Esta invención proporciona una molécula deseñalización autoinducida-2 bacterial extracelular purificada, la producción de la cual se regula por cambios en condiciones ambientales asociadas con un cambio desde una existencia de vida libre hacia una existencia de colonización o patogénica en un organismo huésped. La molécula de señalización estimula genes de luminiscencia LuxQ y se cree que también estimula una variedad de genes relacionados con la patogénesis en las especies bacteriales que la produce. Esta invención también proporciona una nueva clase de genes bacteriales comprendidos en la biosíntesis de la molécula de señalización.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA REGULAR LA PATOGÉNESIS BACTERIAL REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de los E.U. Serie No. 60/110,570, presentada el 2 de Diciembre de 1998, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia. DECLARACIÓN EN CUANTO A LA INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE AUSPICIADA De acuerdo con el 35 U.S.C. §202 (c) , se reconoce que e?~ gobierno de los E.U. tiene ciertos derechos en la invención descrita en la presente, la cual se hizo en parte con fondos de la National Science Fundation (Fundación Nacional de Ciencias), Concesión No. MCB-9506033. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de las enfermedades bacterianas de humanos y otros mamíferos. En particular, la invención proporciona genes novedosos y factores de señalización incluidos en la patogénesis de inducción en ciertas bacterias, y métodos para controlar tal patogénesis a través de la manipulación de esos factores y genes . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones para describir completamente el estado de la - técnica a la cual pertenece esta invención. La exposición de cada una de tales publicaciones se incorpora en la presente para referencia. El control de la expresión de los genes en respuesta a la densidad celular, o detección de quorum, se describió primero en la bacteria luminosa marina ViJbrio fischeri y Vibrio harveyi . Este fenómeno se reconoció recientemente como un mecanismo general para la regulación genética en muchas bacterias Gram negativas. Las bacterias de detección de quorum sintetizan, liberan y responden a las moléculas de señalización de acil-homoserina lactona específica llamadas autoinductoras para controlar la expresión genética como una función de la densidad celular. En todos los sistemas de detección de quorum de acil-homoserina lactona descritos hasta la fecha, a excepción de V. harveyi , la sintasa autoinductora se codifican por un gen homólogo a luxl de V. fischeri , y la respuesta a la autoinductora se media por una proteína activadora transcripcional codificada por un gen homólogo a luxR de V. fischeri (Bassler y Silverman, en Two component Signal Transduction (Transducción de Señal de Dos Componentes) , Hoch et al . , eds Am. Soc. Microbiol. Washington D.C., pp 431-435, 1995) . En contraste. V. harveyi tiene dos sistemas de detección de densidad independientes (llamados Sistemas de Señalización 1 y 2) , y cada uno se compone de un par detector-autoinductora. El Sistema de Señalización 1 del V. harveyi se compone del Detector 1 y la autoinductora 1 (Allí , y esta autoinductora es N- (3-hidroxibutanoil) -L-homoserina lactona (ver Bassler et al . , Mol. Microbiol. 9 : 773-786, 1993) . El Sistema de Señalización 2 del V. harveyi se compone del Detector 2 y la autoinductora 2 (AI-2) , (Bassler et al . , Mol. Microbiol. 13: 273-286, 1994). Hasta ahora no se ha determinado la estructura del AI -2, ni se ha(n) identificado el (los) gen (es) involucrados en la biosíntesis de AI-2. El Sistema de Señalización 1 es un sistema altamente específico propuesto para utilizarse en la comunicación intra-especies y el Sistema de Señalización 2 parece ser menos selectivo de especies, y se hipotesiza que es para la comunicación inter-especies (Bassler et al . , J. Bacteriol. 179: 4043-4045, 1997). Las cepas informadoras de V. hirveyi se han construido para ser capaces de producir luz exclusivamente en respuesta a AI-1 o AI-2 (Bassler et al . , 1993, supra; Bassler et al . , 1994 supra) . Las cepas informadoras de V. harveyi se han utilizado para demostrar que unas cuantas especies de la bacteria producen sustancias estimuladoras que imitan la acción de AI-2 (Bassler et al . , 1997, supra) . La detección de quorum en V. harveyi , mediada por los Sistemas de Señalización 1 y 2, activa los organismos para la bioluminiscencia a una cierta densidad celular.

- Estos mismos sistemas de señalización, particularmente el Sistema de Señalización 2 se considera que activa otros cambios fisiológicos en V. herveyi y otras bacterias que poseen el mismo sistema de señalización. Así, sería un avance en la técnica identificar y caracterizar el factor de señalización de la autoinductora -2 y los genes que codifican las proteínas requeridas para su producción. Tal avance proporcionaría un medio para identificar una nueva clase de compuestos útiles para controlar las bacterias entéricas o patogénicas del mamífero. SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, ahora se ha descubierto que una variedad de especies bacterianas, algunas de ellas patógenas de mamífero, secretan una molécula de señalización orgánica que estimula la expresión de luminiscencia en el bioensayo del Sistema de Señalización 2 del V. harveyi . La molécula secretada por estos organismos imita al AI -2 del V. harveyi en sus características físicas y funcionales. La producción en bacterias de esta nueva molécula de señalización se regula por los cambios en las condiciones ambientales asociadas con un cambio desde una existencia de vida libre hacia una existencia de colonización o patogénica en un organismo huésped. De esta manera, además de estimular los genes de luminiscenia (específicamente luxCDABE) en V. harveyi, la molécula de señalización se espera que estimule una variedad de patogénesis relacionadas a los genes en las especies bacterianas que la producen. Se proporciona en la presente invención, una forma altamente purificada de la molécula de señalización. También se proporciona una nueva clase de genes bacterianos involucrados en la biosíntesis de la molécula de señalización. De acuerdo a un aspecto, la presente invención proporciona un factor de señalización extracelular bacteriano aislado que comprende al menos una molécula que es polar y sin cambio y que tiene un peso molecular aproximado de menos de 1,000 kDa, en donde este factor interactúa con la proteína LuxQ introduciendo mediante esto la expresión de un operón de Vibrio Harveyi que comprende genes de luminiscencia LuxCDABE . En una modalidad preferida, el factor posee una actividad específica en donde aproximadamente 0.1 hasta 1.0 mg de una preparación del factor estimula aproximadamente un incremento de 1,000 veces en luminiscencia, como se midió en un bioensayo utilizando una cepa informadora del Detector 2+ del V harveyi . En una modalidad particularmente preferida, el factor se purifica de tal manera que posea una actividad específica en donde aproximadamente de 1 a 10 µg de una preparación del factor estimula aproximadamente un incremento de 1,000 veces en luminiscencia, como se midió en un bioensayo utilizando una cepa informadora del Detector 2+ de V. harveyi .

- El factor de señalización de la invención se produce por una variedad de bacterias, incluyendo pero sin limitarse a: ViJbrio harveyi , Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocoli tica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori , Bacilus subtilis, Borrelia burgfdorferi , Neisseria meningi tidis, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni , Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus . En otro aspecto, la invención proporciona un factor de señalización bacterial aislado que tiene la fórmula: En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que regula la actividad del factor de señalización al poner en contacto el factor de señalización con el compuesto, midiendo la actividad del factor de señalización en la presencia de un compuesto y que comprende la actividad del factor de señalización obtenida en la presencia del compuesto para la actividad del factor de señalización obtenida en la ausencia del compuesto y que identifica un compuesto que regula la actividad del factor de señalización. En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar una molécula autoinductora en una muestra al poner en contacto la muestra con una célula bacterial, o extracto de esta, que comprende las trayectorias biosintéticas que producen una cantidad detectable de luz en respuesta a una autoinductora exógena, teniendo la célula bacterial al menos dos alteraciones distintas en el loci del gen que participa en las trayectorias de la autoinductora, en donde una primera alteración en el loci del gen comprende una alteración que inhibe la detección de una primera autoinductora y en donde una segunda alteración en el loci del gen comprende una alteración que inhibe la producción de una segunda autoinductora y mide la luz producida por la célula bacterial, o extracto de la misma. En otro aspecto, la invención proporciona una célula bacterial que tiene al menos dos alteraciones distintas en el loci del gen que participa en la trayectoria de la autoinductora, en donde una primera alteración en el locus del gen comprende una alteración que inhibe la detección de una primera autoinductora y en donde una segunda alteración en el locus del gen comprende una alteración que inhibe la producción de una segunda autoinductora y en donde la célula es bioluminiscente cuando se pone en contacto con - una autoinductora. En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar una autoinductora análoga que regula la actividad de una autoinductora al poner en contacto una célula bacterial, o extracto de la misma, que comprende las trayectorias biosintéticas que producirán una cantidad de luz detectable en respuesta a una autoinductora análoga con un análogo de la autoinductora y que comprende la cantidad de luz producida por la célula bacterial, o extracto de la misma, en la presencia de una autoinductora con la cantidad producidaen la presencia de la análoga de la autoinductora, en donde un cambio en la producción de luz es indicativo de una análoga de la autoinductora que regula la actividad de una autoinductora . En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir la autoinductora-2 al poner en contacto S-adenosilhomo-cisteína (SAH) con una proteína LuxS bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la conversión de la S-adenosilhomo-cisteína hacia la autoinductora-2. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir la autoinductora-2 al poner en contacto la S-ribosilhomo-cisteína (SRH) con la proteína LuxS bajo condicuiones durante tal tiempo como para promover la conversión de la S-ribosilhomocisteína hacia la autoinductora-2. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir a la autoinductora -2 al poner en contacto la S-adenosilhomo-cisteína (SAH) con una proteína 5'-metiltioadenosina/S-adenosilhomo-cisteína nucleasa bajo condiciones ydurante tal tiempo como para promover la conversión de la S-adenosilhomocisteína a S-ribosilhomocisteína; poner en contacto la S-ribosilhomocisteína arriba descrita con una proteína LuxS bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la conversión de la S-ribosilhomocisteína hacia la autoinductora-2. En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar un biomarcador bacterial asociado a la autoinductora al poner en contacto al menos una célula bacterial con una molécula autoinductora bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la inducción de un biomarcador bacterial y detectar el biomarcador bacterial . En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar un compuesto objetivo que se une a una proteína LuxP al poner en contacto la proteína LuxP con el compuesto objetivo y detectar la unión del compuesto a la LuxP. En otro aspecto, la invención proporciona un método para regular la formación de biopelícula bacterial que comprende poner en contacto una bacteria capaz de la - - formación de biopelícula con un compuesto capaz de regular la formación de la biopelícula, en donde el compuesto regula la actividad de la autoinductora-2. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar el factor de señalización extracelular bacterial antes mencionado. El método comprende las etapas de: (a) desarrollar, en un medio de cultivo, células bacterianas que producen la molécula de señalización; (b) separar las células bacteriales del medio de cultivo; (c) incubar las células bacteriales en una solución que tiene osmolaridad elevada, bajo condiciones que permiten la producción y secreción de la molécula de señalización a partir de las células bacteriales; (d) separar las células bacteriales de la solución de osmolaridad elevada; y (e) purificar el factor a partir de la solución de osmolaridad elevada. El método puede comprender además: (f) separar los factores polares de los factores no polares en una muestra evaporada de la solución de osmolaridad elevada; y (g) someter los factores polares a Cromatografía Líquida de Alta Resolución en fase inversa. En una modalidad preferida, la solución de osmolaridad elevada comprende al menos sal monovalente 0.4 M, más preferentemente NaCl 0.4 - 0.5 M. En otra modalidad preferida, el método comprende además desarrollar las células bacteriales en un medio de cultivo que contiene un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste de glucosa, fructosa, mañosa, glucitol, glucosamina, galactosa y arabinosa. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica una proteína necesaria para la biosíntesis de un factor de señalización extracelular bacterial que induce la expresión de un gen luminiscente LuxQ de Vibrio harveyi . La molécula de ácido nucleico puede aislarse a partir de una amplia variedad de bacterias, incluyendo pero sin limitarse a: Vibrio harveyi , Vibrio colera, Salmonella typhomurium, Escherichia coli , Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori , Bacillus subtilis y Borrelia burdorferi . La molécula de ácido nucleico referida codifica una proteína que tiene entre aproximadamente 150 y 200 residuos de aminoácido. Preferentemente, la proteína codificada comprende una secuencia de aminoácido substancialmente la misma que una secuencia seleccionada del grupo que consiste de cualquiera de las SEQ ID NOS: 10-17 o una secuencia de consenso derivado de una comparación de dos o más de las SEQ ID NOS: 10-17. La molécula de ácido nucleico preferentemente tiene una secuencia substancialmente igual a la secuencia seleccionada del grupo que consiste de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-9 o una secuencia de consenso derivada de una comparación de dos o más de las SEQ ID NOS: 1-9. Las moléculas de ADN recombinante comprenden las - moléculas de ácido nucleico antes menicionadas que también se proporcionan de acuerdo con la presente invención, así como las proteínas producidas mediante la expresión de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico. Se entenderán mejor características y ventajas adicionales de la presente invención, por referencia a los dibujos, descripción detallada y ejemplos que siguen. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Substancia de señalización a partir de E. coli AB1157 y fluidos de cultivo libres de células S. typhimurium LT2 que inducen la luminiscencia en V. harveyi . Se muestran las respuestas de las cepas informadoras BB170 V. harveyi (Detector 1" , Detector 2+) (Figura ÍA) y BB886 (Detector 1+, Detector 2' ) (Figura IB) a substancias de señalización presentes en fluidos de cultivo libres de células a partir de cepas E. coli , S. typhimurium y V. harveyi . Se diluyó un cultivo brillante de cada cepa informadora 1:5000 en un medio fresco y se midió entonces la producción de luz por célula durante el crecimiento del cultivo diluido. Se agregaron fluidos de cultivo libre de células o medio estéril de crecimiento hasta una concentración final del 10% (v/v) al inicio del experimento. Los datos para las 5 horas de punto de tiempo se mostraron y se presentaron como el por ciento de la actividad obtenida cuando se agregaron los fluidos de cultivo empleados libres - - de célula V. harveyi . Las abreviaturas utilizadas para las diferentes cepas son: V.h; ViJbrio harveyi , S.t; Salmonella typhimurium, y E.c; Escherichia coli . Figura 2. Secreción activa de la molécula de señalización mediante la E. coli y la S. typhimurium viables. Se muestra la respuesta de la cepa informadora BB170 de V. harveyi (Detector 1' , Detector 2+) para una substancia de señalización producida y secretada por la E. coli AB1157 y la S. typhimurium LT2 pero no por la E. coli DH5. La cepa informadora BB170 de V. harveyi se diluyó 1:5000 en un medio AB y la producción de luz por célula se monitoreó durante el crecimiento. Al inicio del experimento, se agregaron células viables lavadas y resuspendidas 1 X 106 ya sea de E. coli AB1157, S. typhimurium LT2 o E. coli DH5 (al lado izquierdo, barras blancas) o células destruidas por UV (al lado derecho, barras negras) . Los datos se presentaron como las veces de activación por arriba del nivel endógeno de luminiscencia expresado por V. harveyi BB170 al punto de tiempo de 5 horas. Las abreviaturas utilizadas para las diferentes cepas son: S.t; Salmonella typhimurium y E.c; Escherichia coli . Figura 3. Efecto del agotamiento de la glucosa en la producción y degradación de la actividad de señalización por S. typhimurium LT2. La S . typhimurium LT2 creció en el medio LB que contiene ya sea 0.1% de glucosa (Figura 3A) o 0.5% de glucosa (Figura 3B) . Se prepararon y analizaron a tiempos específicos los fluidos de cultivo libres de células para la actividad de señalización en el análisis de estimulación de luminiscencia (Barras) y la concentración del remanente de la glucosa (círculos) . El número de células se determinó a cada momento al diluir y cultivar en placas la S. typhimurium LT2 en un medio LB y contar las colonias al siguiente día (cuadros) . La actividad de señalización se presenta como el porcentaje de la actividad obtenida cuando se agregaron los fluido de cultivo empleados libres de célula V. harveyi. Estos datos corresponden al punto de tiempo de 5 horas en el análisis de estimulación de luminiscencia. La concentración de glucosa se muestra como un % de remanente de glucosa. El número de células es células/ml x 10~9.' El símbolo \\ indica que el eje de tiempo no se dibujó a escala después de 8 h. Figura 4. Curva de respuesta de V. harveyi a AI-2 producida por V. harveyi y S. typhimurium. La cepa informadora BB170 de V. harveyi (Detector 1", Detector 2+) se probó por su respuesta a la adición de exógenos AI -2 elaborados por la cepa BB152 de V. harveyi (AI - 1J AI-2+) y para que se elaborara por S. typhimurium LT2. Se diluyó un cultivo brillante de la cepa informadora 1:5000 y se agregó al inicio del experimento ya sea 10% (v/v) de medio de crecimiento (círculos cerrados) , fluido de cultivo libre de células proveniente de V. harveyi BB152 crecido durante la - noche en AB (círculos abiertos) o fluido de cultivo libre de células proveniente de S. typhimurium LT2 crecido durante 6 horas en LB + 0.5% de glucosa (cuadros cerrados) . RLU denota unidades de luz relativa y se define como (conteos min"1 x 103)/(ml_1 de unidades de formación de colonia). Figura 5. Condiciones que afectan la producción de la autoinductora en S. typhimurium. S . typhimurium se sometió a una variedad de tratamientos después de lo cual se prepararon los fluidos de cultivo libre de células o los fluidos de choque osmótico. Estas preparaciones se agregaron a un cultivo diluido de la cepa informadora BB170 de V. harveyi AI -2 a 10% (v/v) y después de esto se midió la producción de luz. Las veces activación es el nivel de luz producida por la informadora después de la adición de la preparación de S. typhimurium especificada dividida por la producción de luz de la informadora cuando se agregó el medio de crecimiento sólo. Las barras en la Figura 5A representan fluidos libres de célula preparados a partir de la S. typhimurium después de los siguientes tratamientos : LB 6h; 6 h de crecimiento en LB a 30°C, LB+Glc 6h; 6 h de crecimiento en LB + 0.5% de glucosa a 30 °C, LB+Glc 24h; 24 h de crecimiento en LB + 0.5% de glucosa a 30°C. En todos los experimentos presentados en la Figura 5B, la S . typhimurium se pre-desarrolló a 30 °C durante 6 h en LB conteniendo 0.5% de glucosa, entonces se nodulizó y se suspendió durante 2 h - bajo las siguientes condiciones: LB; en LB a 30°C, LB+Glc; en LB + 0.5% de glucosa a 30°C, LB pH 5; en LB a pH 5.0 a 30 °C, 0.4M NaCl; en 0.4M NaCl a 30°C, 0. ÍM NaCl; en 0. ÍM NaCl a 30 °C y Choque Térmico a 43°; en LB + 5% de glucosa a 43 °C. Después de estas dos horas de tratamiento, se prepararon fluidos libres de célula para cada muestra y análisis. Figura 6. Actividad de señalización de S . typhimurium en concentraciones de limitación y no limitación de glucosa. La S. typhimurium LT2 se desarrolló en LB en la presencia de concentraciones de limitación (0.1%) y no limitación (1.0%) de glucosa. Se analizó la actividad presente en los fluidos de cultivo libre de células (barras negras) a los tiempos indicados y se normalizaó para que se produjera mediante células de 1 X 109. El incremento en la actividad de señalización medido en los fluidos de choque osmótico de 0.4M NaCl preparados a partir de las mismas células se muestra como las barras blancas arriba de las barras negras. Estos datos también se normalizaron para las células de 1 X 109. La actividad de señalización para la glucosa de limitación se muestra en las Figuras 6A, 6C y 6E y para la glucosa de no limitación se muestra en las Figuras 6B, 6D y 6F. Las Figuras 6A y 6B también muestran el porcentaje de remanente de glucosa (triángulos) , las Figuras 6A y 6D muestran el número de células (cuadros) y los Paneles E y F muestran el pH (cículos) en cada punto de tiempo.

- Figura 7. Efectos de la glucosa y pH en la producción de señal por S. typhimurium . La señal de detección de quorum liberada por S. typhimurium LT2 se midió cuando las células se desarrolaron en el medio LB conteniendo 0.5% de glucosa a un pH de 7.2 (Figura 7A, barras) y cuando las células se desarrollaron en LB a un pH de 5.0 sin agregar una fuente de carbón (Figura 7B, barras) . Se midió a los puntos de tiempo indicados, el nivel de la señal presente en los fluidos de cultivo libres de células (barras negras) y en los fluidos de choque osmótico 0.4M NaCl (barras blancas arriba de las barras negras) . En cada panel, los círculos representan el pH del medio y los cuadros muestran el número de células en los diferentes puntos de tiempo. Figura 8. La alta osmolaridad induce la liberación de señal y la baja osmolaridad induce la degradación de la señal en S. typhimurium LT2. La señal de detección de quorum liberada por el S. typhimurium LT2 resuspendida en 0.4M NaCl y en 0. ÍM NaCl se midió en la presencia y ausencia de síntesis de proteína. S . typhimurium LT2 se pre-desarrolló en LB contiendo 0.5% de glucosa durante 6 h. Las células se cultivaron y resuspendieron en 0.4M NaCl (Figura 8A) o 0. ÍM NaCl (Figura 8B) en la presencia o ausencia de 30 g/ml Cm durante los periodos de tiempo indicados. En cada panel, los símbolos abiertos representan la actividad medida en la ausencia de Cm y los símbolos cerrados representan la - actividad medida en la presencia de Cm. Figura 9. Los genes luxS e ygaG del V. harveyi y E. coli . MG1655. La Figura 9A muestra un mapa de restricción de la región cromosomal del luxSy.h. de V. harveyi que se definió por la inserción de Tn5. Se muestran (triángulos) los sitios de inserciones de Tn5 que rompen la función de producción AI-2 y una inserción Tn5 de control fuera del locus luxSv.h. . La Figura 9B representa la región ygaG en el cromosoma de E. coli MG1655. Este ORF está flanqueado por los genes emrB y gshA . La dirección de transcripción de cada gen se indica por las flechas horizontales. La posición correspondiente de la inserción MudJ que elimina la producción AI -2 en S . typhimurium LT2 se muestra por una flecha vertical. H, R, P y B denotan los sitios de restricción HindlII, EcoRI , PstI y .Ba-7-HI respectivamente. Figura 10. Los Fenotipos de producción de la autoinductora de las cepas V. harveyi y S . typhimurium. Los fluidos del cultivo libre de células de las cepas V. harveyi y S . typhimurium se prepararon y se probaron para la actividad de AI-2 y el bioensayo de V. harveyi BB170. Figura 10A: los fenotipos de producción AI-2 de la cepa MM28 de V. harveyi tipo silvestre el cual contiene una inserción de Tn5 fuera del luxSv.h. (WT denotado) y la cepa MM30 de luxSv.h. : :Tn5 mutante {luxS' denotado). Figura 10B: fenotipos de producción AI -2 del S. typhimurium LT2 tipo silvestre (WT denotado) y la cepa mutante de inserción CS132 del ygaG: :MudJ {ygaG' denotado) . La actividad se reporta como las veces de inducción de la expresión de luminiscencia de la cepa informadora BB170 de V. harveyi sobre esa cuando se agrega medio estéril. Figura 11. Complementación de la producción AI -2 en S . typhimurium CS132 y E. coli DH5. Los fluidos de cultivo libres de células de las cepas de E. coli y S. typhimurium se probaron para la actividad AI -2 en el bioensayo. La actividad presente en estos fluidos se comparó a aquella producida por el V. harveyi BB120 tipo silvestre. En la figura, el nivel de actividad de BB120 se normalizó a 100%. Figura HA: actividad AI-2 en los fluidos libres de células del V. harveyi BB120, E. coli 0157 :H7, y S. typhimurium LT2 tipo silvestre. Figura 11B: complementación del S. typhimurium CS132 {ygaG: :MudJ) y Figura 11C: complementación de E. coli DH5. En los paneles B y C, los genes de producción AI-2 in trans son los siguientes: control de vector (denotado: ninguno), E. coli 0157:H7 ygaG; y V. harveyi BB120 luxSv.h. E. coli y V. harveyi se abrevian E. c. y V. h . respectivamente. Figura 12. Alineamiento de las secuencias de proteína LuxS y YgaG. Se muestran las secuencias de proteínas transladadas por la familia de producción AI -2 de las proteínas. Determinamos las secuencias para el gen luxSv.h. del V. harveyi BB120 y los genes ygaG (renombrados en la presente como luxSE.c. ) a partir de E. coli MG1655, E. coli 0157 :H7 y E. coli DH5. La secuencia parcial del ygaG del S . typhimurium LT2 (renombrado en la presente luxSs. t. ) viene de la base de datos del S. typhimurium. Los residuos de aminoácidos que no son idénticos a la proteína LuxSv.h. se encuentran subrayados y sin resalto. El sitio de la mutación del cambio de la estructura en la secuencia de ADN del E. coli DH5 se denota por un "*" . Los 20 residuos de aminoácidos alterados que se transladan siguiendo el cambio de estructura se encuentran encerrados por un cuadro. Figura 13. Se proporciona un diagrama del circuito de detección de quorum híbrido del Vibrio harveyi . Los circuitos AI-1 y AI-2 se estimulan independientemente pero integran sus señales para la expresión de luz. Sin embargo, cada trayectoria también es independientemente competente para generar luz. Esto permite utilizar las mutaciones recíprocas en los detecores LuxN o LuxQ para utilizarse para construir una informadora específica para AI -2 o AI-1 respectivamente. Figura 14. Fenotipos de respuesta del tipo silvestre de V. harveyi y los mutantes de regulación. Se agregaron en el primer punto de tiempo, fluidos de cultivo libres de células (10%) o nada (N.A.) . Los fluidos de cultivo libres de células tipo silvestre (AI-1 + AI-2) ; fluido de cultivo libre de células LuxS" (AI-1) ; fluido de cultivo libre de células LuxM" (AI -2) . Las unidades de luz relativas se definieron como cpm x 103/CFU/ml. Figura 15. Se muestra un diagrama de la trayectoria biosintética de la autoinductora-2 (AI-2) . Figura 16. Se muestra la estructura de la AI -2 y los precursores biosintéticos a partir de los cual se deriva AI-2. Descripción Detallada de la Invención De acuerdo con la presente invención hemos identificado, aislado y caracterizado un factor de señalización extracelular producido por varias cepas de bacterias patogénicas, incluyendo Salmonella typhimurium y Escherichia coli , que tienen un rol en la regulación de la patogénesis o virulencia de estas bacterias. También hemos identificado y clonado genes incluidos en la biosíntesis de este factor de señalización. La purificación y/o clonación de esta molécula de señalización y los genes que codifican las proteínas que catalizan sus biosíntesis abren un nuevo camino para el diseño de fármacos que se dirigen a ya sea la inhibición de la producción o la respuesta a esta molécula mediante bacterias. Los fármacos diseñados para interferir con la señalización mediante esta molécula constituirán una nueva clase de antibióticos. La invención proporciona además los métodos para detectar una autoinductora y métodos para la - - producción in vi tro de la autoinductora-2. I. Definiciones; Varios términos relacionados a las moléculas biológicas de la presente invención se utilizarán a través de las especificaciones y reivindicaciones. Los términos "substancialmente el mismo", "similaridad en porcentaje" e "identidad en porcentaje" se definen en detalle a continuación. Con referencia al nuevo factor de señalización de la presente invención, esta molécula se refiere alternativamente en la presente como "factor de señalización", "molécula de señalización", "autoinductora" y más específicamente "autoinductora-2" o "AI-2" . Los términos "autoinductora-2" y "AI -2" se refieren específicamente al factor de señalización según se produce por Vibrio harveyi . Los términos "factor de señalización" o "molécula de señalización", "autoinductora" o "molécula similar a AI-2" pretenden referirse en general a los factores de señalización de la presente invención, del cual AI -2 es un ejemplo. Con referencia a los ácidos nucleicos de la invención, el término "ácido nucleico aislado" se utiliza algunas veces. Este término, cuando se aplica al ADN, se refiere a una molécula de ADN que se encuentra separada de las secuencias con las cuales se encuentra inmediatamente contigua (en las direcciones 5' y 3') en el genoma que ocurre de manera natural del organismo del cual se derivó. Por ejemplo, el "ácido nucleico aislado" puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, tal como un vector de plásmido o de virus, o integrada en el ADN genómico de un procariote o eucariote . Una "molécula de ácido nucleico aislada" puede comprender también una molécula de ADNc. Con respecto a las moléculas de ARN de la invención, el término "ácido nucleico aislado" principalmente se refiere a una molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada como se definió arriba. De manera alternativa el término puede referirse a una molécula de ARN que se ha separado suficientemente de la molécula de ARN con la cual podría asociarse en su estado natural (i.e. en células o tejidos) de modo que existe en una forma "substancialmente pura" (el término "substancialmente puro" se define abajo) . Con respecto a la proteína, el término "proteína aislada" o "proteína aislada y purificada" algunas veces se utiliza en la presente. Este término se refiere principalmente a una proteína producida por la expresión de una molécula de ácido nucleico aislado de la invención. De manera alternativa, este término puede referirse a una proteína que se ha separado suficientemente de otra proteína con la cual puede asociarse de manera natural, a fin de que exista en forma "substancialmente pura" . El término "substancialmente puro" se refiere a una preparación que comprende al menos 50-60% por peso del factor de interés { e . g. factor de señalización de patogénesis, ácido nucleico, oligonucleótido, proteína, etc.). Más preferentemente, la preparación comprende al menos 75% por peso y más preferentemente 90-99% por peso, del factor de interés. La pureza se mide por métodos apropiados para el factor de interés (e.g. métodos cromatográficos, electroforésis de gel de agarosa o poliacrilamida, análisis HPLC y lo similar) . Con respecto a los anticuerpos de la invención, el término "inmunológicamente específico" se refiere a anticuerpos que se unen a uno o más epítopes de una proteína de interés, pero que no reconocen substancialmente y se unen a otras moléculas en una muestra que contiene una población mezclada de moléculas biológicas antigénicas. Con respecto a los oligonucleótidos, el término "hibridizar específicamente" se refiere a la sucesión entre dos moléculas de nucleótidos de una sola hebra de secuencias suficientemente complementarias para permitir tal hibridización bajo condiciones predeterminadas utilizadas generalmente en la técnica (algunas veces llamada "substancialmente complementaria") . En particular el término se refiere a la hibridización de un oligonucleótido con una secuencia substancialmente complementaria contenida dentro de una molécula de ADN o ARN de una sola hebra de la invención, - - para la substancial exclusión de la hibridización del oligonucleótido con ácidos nucleicos de una sola hebra de secuencias no complementarias. El término "región del promotor" se refiere a las regiones de regulación transcripcional de un gen, que pueden encontrarse en el lado 5' o 3' de la región de codificación o dentro de la región de codificación o dentro de los intrones. El término "gen marcador seleccionable" se refiere a un gen que codifica un producto que, cuando se expresa, confiere un fenotipo seleccionable tal como resistencia antibiótica en una célula transformada. El término "gen informador" se refiere a un gen que codifica un producto que es fácilmente detectable por métodos estándar, ya sea directa o indirectamente. El término "operablemente enlazado" significa que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia de codificación se colocan en la molécula de ADN en las posiciones apropiadas con relación a la secuencia de codificación a fin de permitir la expresión de la secuencia de codificación. Esta misma definición se aplica algunas veces a la instalación de las unidades de transcripción y a otros elementos reguladores { e . g. mejoradores o secuencias reguladoras de la translación) en un vector de expresión. II . Descripción del Factor de Señalización La invención proporciona un bio-ensayo heterólogo - que ha permitido la identificación de un factor de señalización extracelular producido por S . typhimurium y E. coli , entre otras bacterias patogénicas. Algunas veces el factor se refiere en la presente como un factor de "señalización de patogénesis" o molécula, aunque actúa como una señal para una variedad de cambios fisiológicos en la bacteria diferentes a la patogénesis. Este factor imita la acción de AI -2 (autoinductora-2) de la bacteria de señalización de quorum Vibrio harveyi y actúa específicamente a través del detector LuxQ del Sistema de Señalización 2 de Vibrio harveyi . El factor de señalización es una molécula orgánica pequeña, soluble, termo lábil que se incluye en la comunicación intracelular en las tres bacterias. En E. coli y Salmonella, la secreción máxima de la molécula ocurre en la fase media exponencial y la actividad extracelular se degrada a medida que la glucosa se agota del medio o por el inicio de la fase estacionaria. La destrucción de la molécula de señalización en la fase estacionaria indica que, en contraste a otros sistemas de señalización de quorum, la detección de quorum en la bacteria que utiliza la molécula de señalización es crítica para regular el comportamiento en la fase pre-estacionaria de crecimiento. Se requiere la síntesis de proteína para la degradación de la actividad, que indica que un circuito complejo de regulación controla la detección de - quorum en estas bacterias entéricas . La actividad de señalización incrementada se observa si, después del crecimiento en la presencia de glucosa, las bacterias se transfieren a un ambiente de alta osmolaridad { e . g. 0.4M NaCl) o a un pH bajo { e . g. pH 5.0) . Además, la degradación de la señal se induce por condiciones de baja osmolaridad (e.g. 0. ÍM NaCl) . La alta osmolaridad y bajo pH son dos condiciones encontradas por la bacteria entérica patogénica, tal como S . typhimurium y E. coli , cuando sufren la transición a una existencia patogénica dentro de un organismo huésped. De este modo, la detección de quorum en estas bacterias aparece para jugar un rol en la regulación de su virulencia al dirigir la bacteria para sufrir la transición entre un huésped asociado (i.e. patogénico) y una existencia de vida libre. Otros factores que regulan la actividad de la molécula de señalización se describen en mayor detalle en el Ejemplo 2. Particularmente ejemplificativa es la regulación de la molécula en S. typhimurium . La sincronización de la inducción lux en el bioensayo y la forma de la curva de respuesta de las señales de V. harveyi para la S . typhimurium y la E. coli son indistinguibles de la de V. harveyi que responde a su propio inductor del Sistema de Señalización 2, AI -2. Además, cada una de las moléculas de señalización del S . typhimurium, E. - coli y V. harveyi pueden purificarse parcialmente de acuerdo al mismo protocolo. Estos resultados indican que las moléculas de señalización de cada uno de los organismos antes mencionados son idénticos o relacionados muy cercanamente. De acuerdo con lo anterior, el AI -2 del V. harveyi es una molécula de señalización de la invención, pero parece jugar un rol diferente en ese organismo del que hace en la bacteria entérica patogénica tal como Salmonella y Escherichia . A. Estructura del Factor de Señalización AI-2 Así, en otro aspecto, la invención proporciona el factor de señalización de la autoinductora-2 (AI -2) y derivados del mismo. La AI -2 de la nvención puede utilizarse para regular el crecimiento bacterial en una variedad de aplicaciones. La presente invención proporciona moléculas de la autoinductora-2 que tiene la estructura: en donde Rl, R2 , R3 y R4 se seleccionan independientemente de hidruro, halo, alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocíclilo, metilo, ciano, alcoxicarbonilo, amino, carboxilo, hidroxilo, formilo, nitro, fluoro, cloro, bromo, metilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroarilalquilo, alquilsulfonilo, haloalquilsulfonilo, - - ariisulfonilo, heteroariisulfonilo, hidroxialquilo, mercaptoalquilo, alcoxialquilo, ariloxialquilo, heteroariloxialquilo, aralquiloxialquilO, heteroarilalquiloxialquilo, alquiltioalquilo, ariltioalquilo, heteroariltioalquilo, aralquiltioalquilo, heteroarilalquiltioalquilo, haloalquilcarbonilo, haloalquil (hidroxi) alquilo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroarilalquilcarbonilo, carboxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilcarboniloxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, arilaminoalquilo, aralquilaminoalquilo, heteroarilaminoalquilo, heteroarilalquilaminoalquilo, alcoxi, y ariloxi; fenilo, ciciohexilo, ciclohexenilo, benzofurilo, benzodioxolilo, furilo, imidazolilo, tienilo, tiazolilo, pirrolilo, oxazolilo, izoxazolilo, triazolilo, pirimidilo, izoquinolilo, quinolinilo, bezimidazolilo, indolilo, pirazolilo y piridilo, aminosulfonilo, flúor, cloro, bromo, metiltio, metilo, etilo, izopropilo, ter-butilo, izobutilo, pentilo, hexilo, ciano, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, propoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, pentoxicarbonilo, metilcarbonilo fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, heptafluoropropilo, difluoroclorometilo, diclorofluorometilo, difluoroetilo, difluoropropilo, dicloroetilo, dicloropropilo, metoxi, metilenodioxi, etoxi, propoxi, n. butoxi, hidroximetilo, hidroxietilo, metoximetilo, etoximetilo, trifluorometoxi, metilamino, N, N-dimetilamino, fenilamino, etoxicarboniletilo y metoxicarbonilmetilo, metilo, etilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, ciano, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, benzilo, feniletilo, fenilpropilo, metiisulfonilo, felilsulfonilo, trifluorometilsulfonilo, hidroximetilo, hidroxietilo, metoximetilo, etoximetilo, metilcarbonilo, etilcarbonilo, trifluorometilcarbonilo, trifluoro (hidroxi) etilo, fenilcarbonilo, benzilcarbonilo, metoxicarbonilmetilo, etoxicarboniletilo, carboximetilo, carboxipropilo, metilcarboniloximetilo, feniloxi, feniloximetilo, trienilo, furilo y piridilo, en donde el tienilo, furilo, piridilo, metiltio, metiisulfonilo, metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, ciano, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, heptafluoropropilo, difloroclorometilo, diclorofluorometilo, difluoroetilo, difluoropropilo, dicloroetilo, dicloropropilo, metoxi, metilenodioxi, etoxi, propoxi, n-butoxi, hidroximetilo, hidroxietilo y trifluorometoxi. Los grupos químicos descritos en la presente son conocidos por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, - como se utiliza en la presente, el término "hídrido" denota un solo átomo de hidrógeno (H) . Este radical hídrido puede unirse, por ejemplo, a una átomo de oxígeno para formar un radical hidroxilo o dos radicales hídridos pueden unirse a un átomo de carbono para formar un radical metileno (-CH2-) . Además, los radicales alquilo son radicales "alquilos inferiores" que tienen de uno a aproximadamente diez átomos de carbono. Se prefieren más los radicales alquilos inferiores que tienen de uno a aproximadamente seis átomos de carbono. Ejemplos de tales radicales incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, tert-butilo, pentilo, iso-amilo, hexilo y lo similar. El término "halo" significa halógenos tales como flúor, cloro, bromo o yodo. Los términos "carboxi" o "carbixilo" denotan -C02H. El término "carboxilo" , si se utiliza solo o con otros términos denota -(S=0)-. Preferentemente, la molélula de la autoinductora-2 de la invención es 4 , 5-Dihidroxi-2 , 3-pentanediona que tiene la estructura Como se utiliza en la presente, una molécula de la "autoinductora-2 (AI-2)" de la invención incluye una molécula que actúa como un sensor difundible para el Sistema de Señalización 2 de detección de quorum. Por ejemplo, AI -2 puede regular la expresión del gen al incrementar o disminuir la expresión de los genes asociados con la patogénesis de un microorganismo. Típicamente las moléculas de la autoinductora se producen por microorganismos, tales como bacterias durante el metabolismo. Por ejemplo, la molécula autoinductora-2 (AI -2) de la invención puede interactuar con LuxP que es la proteína codificada por el homólogo del gen luxP de las bacterias patogénicas tal como V. cholerae, S. typimurium y E. coli . A su vez, el complejo AI -2 -LuxP puede interactuar con LuxQ que es el producto de proteína codificado por el gen luxQ. La interacción de AI -2 -LuxP-LuxQ puede promover la luminiscencia en bacteriaa tales como Vi-brio spp. La interacción de AI-2-LuxP-LuxQ se ha enlazado a la activación de las trayectorias bioquímicas requeridas para la patogenicidad bacterial. Así, la invención proporciona un método para controlar la expresión del gen bacterial y para regular la patogenicidad bacterial al modular las interacciones de AI-2 -LuxP-LuxQ. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para utilizar homocisteína como la molécula autoinductora. La estructura de la homocisteína es como sigue: La homocisteína se produce por la actividad de la proteína LuxS en S-ribosilhomocisteína (Figura 16) . Así la invención proporciona métodos para utilizar la homocisteína como una autoinductora . La presente invención también comprende isómeros ópticamente activos de una molécula autoinductora-2. Como se utiliza en la presente, un "isómero" se pretende que incluya moléculas que tengan la misma fórmula que la molécula autoinductora-2 de la invención pero que posean diferentes propiedades físicas y químicas debido a un diferente arreglo de los átomos en la molécula. Los isómeros incluyen tanto isómeros ópticos como isómeros estructurales. Como se utiliza en la presente, "ópticamente activo" se pretende que incluya moléculas que tengan la capacidad para girar a un plano de luz polarizada. Un isómero ópticamente activo incluye el isómero-L y el isómero-D de la molécula autoinductora-2 de la invención. Además de los isómeros ópticamente activos se incluyen los análogos de la molécula autoinductora-2. Como se utiliza en la presente un "análogo" de AI -2 se pretende que incluya moléculas que son estructuralmente similares pero no idénticas a las moléculas autoinductora reivindicadas 4,5- Dihidroxi-2, 3 -pentanediona. Los análogos de AI -2 pueden incluir moléculas que inhiban en lugar de estimular la actividad de la proteína LuxP. Por ejemplo, puede producirse un análogo de AI -2 que es capaz de una interacción no productiva con LuxP. Tal molécula puede retener la capacidad de unirse a LuxP, pero el complejo análogo AI -2 -LuxP no será capaz de interactuar productivamente con LuxQ dando como resultado una inhibición de la patogenicidad bacterial. Así, un análogo de AI -2 de la invención puede actuar como un inhibidor de la patogénesis bacterial al competir con el AI -2 endógeno por la unión a LuxP. Además, una análogo de AI -2 puede construirse de manera que el complejo análogo AI -2 -LuxP sea capaz de interactuar no productivamente con LuzQ. En este caso el complejo análogo AI-2-LuxQ se vuelve no funcional por procesos bioquímicos subsecuentes, tales como por ejemplo, activación transcripcional de genes requeridos para la patogenicidad. La invención también incluye análogos de AI -2 que actúan sinergísticamente para mejorar la capacidad de AI -2 para incrementar la actividad de la proteína LuxP. B. Preparación del factor de señalización Las estrategias iniciales para purificar la molécula de señalización de la invención que resultan de una preparación parcialmente purificada que comprende la molécula con una actividad de señalización específica estimada en - - aproximadamente 0.1 - 1.0 mg del material parcialmente purificado que estimula un incremento de 1,000 veces en luminiscencia, se midió en el bioensayo de V. harveyi . La actividad de señalización no se extrae cuantitativamente en solventes orgánicos y no se une a una columna de intercambio ya sea cationico o aniónico. La molécula es un factor orgánico pequeño (menos de 1,000 kDa) polar pero sin cambio. La actividad es estable en ácido y lábil en base, y es resistente al calor hasta 80°C pero no a 100°C. Estas características de la molécula de señalización hacen claro que la molécula es diferente de cualquier autoinductora previamente descrita. El factor de señalización de la presente invención puede purificarse de sus fuentes naturales, i.e. la bacteria que lo produce. Con respecto a la purificación de AI -2 a partir de fuentes naturales, alterando el medio de cultivo, e . g. , al agregar glucosa u otro azúcar, incrementando la osmolaridad y/o disminuyendo el pH, que puede incrementar la producción de la molécula de señalización en Salmonella y otras bacterias entéricas, también ha permitido la purificación de la molécula de señalización para la homogeneidad más cercana. Así, la molécula ahora ha sido altamente purificada a partir de fluidos de cultivo de bacteria entérica (e.g., E. coli , S . typimurium) utilizando el siguiente protocolo: 1. Desarrollar un cultivo de la señal que produce bacteria entérica durante la noche en LB que contiene 0.5% de glucosa u otro azúcar (37°C con ventilación) . Inocular el LB fresco que contiene glucosa u otro azúcar a 0.5% con el cultivo de la noche a una dilución 1:100. Desarrollar el cultivo diluido hasta ellla fase exponencial media (3.5 h, 37°C con ventilación) . 2. Aglomerar las células (10,000 rpm, 10 min, 4°C) . Descartar el medio de cultivo. Resuspender las células y lavarlas en 1/10 del volumen original de la solución de NaCl de baja osmolaridad (0.1M NaCl en agua) . 3. De nuevo aglomerar las células (10,000 rpm, 10 min, 4°C) . Descartar el fluido de cultivo de baja osmolaridad. Resuspender la células en 1/10 del volumen original de la solución de NaCl de alta osmolaridad (0.4M NaCl en agua) . Incubar la suspensión a 37°C durante dos horas con ventilación. Durante este tiempo, ocurre la producción y secreción incrementada de la molécula de señalización. 4. Aglomerar las células (10,000 rpm, 10 min, 4°C). Recolectar el sobrenadante que contiene las moléculas de señalización incrementada, filtrar el sobrenadante a través de un filtro bacterial de 0.2M para retirar cualquier célula remanente. 5. Evaporar el filtrado acuoso utilizando un evaporador giratorio a 30°C. Extraer el filtrado seco en 1/10 del volumen original de cloroformo:metanol (70:30) 6. Evaporar el extracto orgánico utilizando un evaporador giratorio a temperatura ambiente. Redisolver el extracto seco en metanol a 1/100 del volumen original. 7. Someter la señal parcialmente purificada a Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) , usando una columna C18 de fase inversa preparatoria. Eluir la molécula con un gradiente lineal de o-100% de acrilonitrilo en agua a 5 ml por minuto. Recolectar 30 fracciones, de 5 ml cada una. 8. Analizar las fracciones por HPLC en el análisis de AI -2 de V. Harveyi BB170, y agrupar las fracciones activas. El producto de la columna C18 contiene la molécula de señalización y un pequeño número de otras moléculas orgánicas. Esta preparación altamente purificada de la molécula de señalización tiene actividad 50-100 veces mayor que el material parcialmente purificado anteriormente descrito (la preparación de la cual no incluye la etapa altamente osmótica o la etapa final de HPLC), i.e., 1-10 µg del material estimula un incremento de 1,000 veces en luminiscencia en el bioensayo de V. harveyi . Las estrategias subsecuentes para purificar la molécula de señalización AI-2 tiene un led para la identificación de un nuevo sistema in vitro para producir AI- - 2. Así, además de proporcionar una proteína LuxS de S. typhimurium clonada, sobre-expresada y purificada, la presente invención también proporciona un método para producir AI -2 in vi tro . La presente invención proporciona un mecanismo para generar grandes cantidades de AI -2 pura útil por la masa espectral y análisis MNR y para clasificar los compuestos que regulan la actividad de AI-2. Además, la presente invención proporciona un método para determinar la trayectoria biosintética in vivo para la síntesis de AI-2. El método in vi tro para la producción de AI -2 se describe a continuación en el Ejemplo 5 y la Figura 15. El método proporciona un nuevo medio para producir moléculas autoinductoras para su estudio adicional . El método también proporciona un medio para producir cantidades sustanciales de AI-2 para utilizarse en aplicaciones comerciales. Tales aplicaciones incluyen pero no se limitan a, agregar AI-2 de la invención a un medio de crecimiento para incrementar el crecimiento bacterial. Tal método es particularmente útil en la producción de antibióticos provenientes de bacterias cultivadas. La adición de AI -2 puede incrementar la producción de antibióticos de tales organismos al promover el crecimiento celular. Preferentemente, el factor de señalización AI -2 se produce por el método in vi tro establecido en el Ejemplo 5 de la exposición.

- C. Usos del Factor de Señalización Las moléculas de señalización aisladas y purificadas de la presente invención se utilizan como objetivos para el diseño de compuestos que regulan la actividad de AI-2. Como se utiliza en la presente "regular" incluye incrementar o disminuir la actividad de AI-2. Como se utiliza en la presente, la "actividad" de AI -2 comprende cualquier aspecto de la capacidad de las moléculas para actuar como factor de señalización en la detección de quorum bacterial . Un "compuesto" puede ser cualquier agente o composición que efectúe la actividad de AI-2. Por ejemplo un compuesto de la invención puede ser un ácido nucleico, una proteína o molécula pequeña. Así, la invención proporciona un medio para identificar una nueva clase de antibióticos que inhiban la actividad de la molécula AI -2 o de otra manera bloqueen la trayectoria de señalización en la que participa la molécula. Tales inhibidores pueden identificarse mediante clasificación a gran escala de una variedad de compuestos de prueba, utilizando el bioensayo de V. harveyi en la presencia de la molécula de señalización purificada. Una reducción en la actividad de señalización en presencia de un compuesto de prueba indicaría la capacidad de ese compuesto para inhibir la actividad de la molécula de señalización o bloquear alguna otra parte de la trayectoria de señalización de patogénesis. Además, la invención proporciona una base para el - diseño racional de inhibidores específicos o análogos no funcionales de AI-2. Tales inhibidores o análogos de estructura específica pueden probarse en el bioensayo de V. harveyi por su capacidad para inhibir la molécula de señalización o para bloquear la trayectoria de señalización de patogénesis. La invención también comprende métodos para identificar los compuestos producidos de manera natural que inhiben la actividad de una molécula de señalización tal como la autoinductora-2. Por ejemplo, una estrategia defensiva empleada por organismos eucarióticos para evitar la colonización bacterial es dirigirse específicamente e inhibir las funciones controladas de detección de quorum. Tal mecanismo se ha identificado en D. pulchra . Estuduios recientes indican que las furanonas alogenadas producidas por D. pulchra inhiben la detección de quorum al competir por el sitio de unión de la autoinductora de la homoserina-lactona (HSL) en LuxR. Así al proporcionar una nueva autoinductora y los componentes celulares que interactúan con la autoinductora, la presente invención también proporciona un método para clasificar los compuestos producidos de manera natural por sus efectos en el sistema-2 de detección de quorum. Por ejemplo, los compuestos producidos de manera natural pueden clasificarse por sus efectos en la interacción de la autoinductora-2LuxP. Alternativamente, tales compuesto pueden clasificarse por su efecto en las interacciones de la autoinductora-2 -LuxP-LuxQ . Se apreciará por las personas expertas en la materia que, ahora los objetivos para la molécula de señalización se han identificado en E. coli , la inhibición del objetivo E. coli también puede utilizarse para clasificar los inhibidores o análogos de la molécula de señalización potencial . Los inventores han preparado una construcción de fusión de la informadora ler-lacZ para utilizarse en la prueba para la reducción de expresión del gen de secreción Tipo III directamente en E. coli 0157 :H7 (cepa patogénica). Además existe un locus similar en S . typhimurium . Así, la invención proporciona un método para seleccionar inhibidores o sinergistas de la molécula autoinductora-2 , 4 , 5-Dihidroxi -2 , 3-pentanediona. Como se utiliza en la presente, un "inhibidor" de AI -2 se pretende que incluya moléculas que interfieren con la capacidad de la molécula autoinductora para actuar como una señal para la luminiscencia o patogénesis. Los inhibidores incluyen moléculas que degradan o se unen a AI -2. El método comprende poner en contacto la molécula autoinductora con un presunto inhibidor o sinergista, que mide la capacidad de la molécula autoinductora tratada para estimular la actividad de un gen seleccionado, que determina entonces sí el presunto inhibidor o sinergista reprime o mejora la actividad de la molécula - autoinductora. Se seleccionan entonces los actuales inhibidores y sinergistas de la molécula autoinductora. Por ejemplo un presunto inhibidor puede mezclarse con 4,5-Dihidroxi -2, 3 -pentanediona y la mezcla se combina entonces con una cepa informadora de V. harvery descrita en la presente. La cantidad de luminiscencia en la presencia del presunto inhibidor puede compararse con una mezcla de control que no incluye al inhibidor. Una disminución en la luminiscencia es indicativa de la inhibición de AI-2. De esta manera, los compuestos que regulan la patogénesis bacterial pueden clasificarse rápidamente. En otro aspecto, la invención también proporciona métodos de selección de análogos inhibidores y sinergísticos de AI-2. El método comprende mezclar una cantidad conocida de la molécula autoinductora con una cantidad conocida del presunto análogo inhibidor o sinergístico, midiendo la habilidad de la molécula autoinducida tratada para estimular la actividad de un gen seleccionado que determina entonces sí el presunto análogo inhibidor o sinergético reprime o mejora la actividad de la molécula autoinducida. Se seleccionan entonces, los análogos inhibidores o sinergísticos actuales de la molécula autoinducida. La molécula autoinductora-2 puede purificarse a partir de la fuente nativa utilizando técnicas de purificación convencionales, sintéticamente derivada por medios químicos o preferentemente producida por el método in vi tro de la invención descrito abajo. Como se utiliza en la presente, "purificación a partir de una fuente nativa" intenta incluir una molécula autoinductora-2 de la fórmula de anterior que se ha elaborado mediante un organismo. La "purificación a partir de una fuente nativa" incluye aislar la molécula autoinductora del medio de cultivo o citoplasma de la bacteria tal como la S. typhimurium utilizando técnicas de purificación convencionales. Como se utiliza en la presente "sintetizado por medios químicos" intenta incluir moléculas autoinductoras de la fórmula reivindicada que se ha producido artificialmente fuera de un organismo. La invención incluye una autoinductora de la invención elaborada por una persona experta en la materia a partir de precursores químicos utilizando técnicas de síntesis química estándar. La invención proporciona además métodos de inhibir la inefectividad de un organismo patogénico así como composiciones terapéuticas que contienen un análogo de AI -2 o inhibidor AI -2 de la invención. Los métodos comprenden administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que es capaz de inhibir la actividad de AI-2. Como se utiliza en la presente "infectividad de inhibición" incluye métodos para afectar la habilidad de un organismo patogénico para infectar inicialmente o infectar de manera adicional a un sujeto que puede beneficiarse a partir del tratamiento. Una composición farmacéutica de la invención puede incluir, pero no restringirse a, un agente que evita la activación transcripcional de los factores de virulencia extracelular tales como exotoxina A y proteasas elastolíticas . Como se utiliza en la presente, un "agente" incluye moléculas que inhiben la habilidad de la proteína LuxP y la proteína LuxQ para activar la transcripción de los factores de virulencia extracelular. Los agentes incluyen inhibidores que interactúan directamente con AI-2 de tal forma que AI-2 se evita para actuar como un detector para un Sistema de Señalización-2 de detección de quorum. Preferentemente, el agente interactúa con 4 , 5-Dihidroxi-2 , 3 -pentanediona. Los agentes también incluyen análogos de AI -2 que pueden competir con 4, 5-Dihidroxi-2 , 3 -pentanediona para unirse a LuxP o LuxQ. La invención además proporciona composiciones farmacéuticas para evitar o tratar enfermedades asociadas a patógenos mediante factores propuestos comprendidos en la trayectoria del Sistema de Señalización tipo-2. Por ejemplo, LuxP o LuxQ u homólogos de las mismas proporcionan una propuesta común para el desarrollo de una vacuna. Los anticuerpos producidos para LuxP o LuxQ u homólogos de los mismos, pueden inhibir la activación de las trayectorias bacteriales asociadas con la virulencia. Así, LuxP y LuxQ proporcionan determinantes antigénicos comunes que pueden utilizarse para inmunizar un sujeto contra múltiples estados de enfermedades patogénicas asociadas. Por ejmeplo, el Sistema de Señalización tipo-2 de la autoinductora se cree que existe en un amplio rango de especies bacteriales que incluyen patógenos bacteriales. Como se trató arriba, el factor de señalización de la autoinductora-2 se considera que está comprendido en la comunicación inter-especies así como en la intra-especies . A fin de que el Sistema de Señalización tipo-2 de detección de quorum sea efectivo para la comunicación de inter-especies, es probable que se conserve de manera elevada entre varias especies bacteriales. Así, provocar a un sujeto con el polipéptido LuxP o LuxQ o un fragmento antigénico del mismo, aislado a partir de un organismo particular puede conferir inmunidad protectora hacia otros estados de enfermedad asociados con un organismo diferente. Por ejemplo, una vacuna desarrollada para la proteína LuxP aislada a partir de V. cholerae puede ser capaz de reaccionar en forma cruzada con un homólogo de LuxP, expresado mediante un organismo diferente. Así, es de imaginarse que los métodos de la presente invención pueden utilizarse para tratamientos con estados de enfermedades patogénicas asociadas. Generalmente, los términos "tratar", "tratamiento" y lo similar se utilizan en la presente para referirse a obtener un efecto farmacológico y/o psicológico deseado. El - efecto puede ser profiláctico en términos de evitar completa o parcialmente una infección de espiroqueta o enfermedad o signos o síntomas del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una infección o enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la infección o enfermedad. "Tratar" se utiliza en la presente para cubrir cualquier tratamiento de (e.g. completo o parcial) o evitar, una infección o enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) evitar la enfermedad a partir de que ocurra en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que no aún no ha sido diagnosticado como que la tenga; (b) inhibir la infección o enfermedad, i.e. impidiendo su desarrollo; o (c) remediar o mejorar la infección o enfermedad, i.e. causar la regresión de la infección o enfermedad. Así, la invención incluye varias composiciones farmacéuticas útiles para mejorar los síntomas atribuibles a una infección bacterial o, alternativamente para inducir una respuesta inmune protectora para evitar una infección. Por ejemplo, puede prepararse una composición farmacéutica de acuerdo a la invención que incluye un anticuerpo contra, por ejemplo, LuxP o LuxQ, un péptido o péptido derivado de LuxP o LuxQ, un LuxP o LuxQ mimético o un agente de unión LuxP o LuxQ de acuerdo a la presente invención en una forma adecuada - para administración a un sujeto utilizando vehículos, excipientes y aditivos o auxiliares. Frecuentemente se utilizan vehículos o auxiliares que incluyen carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, proteína lechosa, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales, polietilen glicoles y solventes, tales como agua estéril, alcoholes, glicerol y alcoholes polihídricos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluido y nutrientes. Los conservadores incluyen agentes antimicrobiales, anti-oxidantes, agentes quelantes y gases inertes. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas, excipientes no-tóxicos, incluyendo sales, conservadores, reguladores y lo similar, como se describe por ejemplo, en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 15va ed. Easton: Mack Publishing Co. , 1405-1412, 1461-1487 (1975) y The National Formulary XIV., 14va ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975) , el contenido de los cuales se incorpora en la presente para referencia. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo a las experiencias de rutina en la técnica. Ver la Pharmacological Basis for Therapeeeutics de Goodman y Gilman (7a ed.) . Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención pueden administrarse local o sistemáticamente. Por "dosis terapéuticamente efectiva" se entiende la cantidad de un compuesto de acuerdo a la invención necesario para evitar, curar o al menos impedir parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Cantidades efectivas de este uso, dependerán, por supuesto de la gravedad de la enfermedad y el peso y estado general del paciente. Típicamente, dosis utilizadas in vi tro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para la administración in si tu de la composición farmacéutica y pueden utilizarse modelos animales para determinar la dosis efectiva para el tratamiento de desórdenes particulares. Se describen varias consideraciones, e.g. en Langer, Science, 249 : 1527, (1990) ; Gilman et al . (eds.) (1990), cada uno de los cuales se incorpora en la presente para referencia. Como se utiliza en la presente "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva" se intenta incluir métodos de dar o aplicar una composición farmacéutica de la invención a un sujeto que le permita a la composición realizar su función terapéutica propuesta. Las cantidades terapéuticamente efectivas variarán de acuerdo a los factores tales como el grado de la infección en un sujeto, la edad, sexo y peso del individuo. El régimen de dosis puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas pueden administrarse diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. La composición farmacéutica puede administrarse de una manera conveniente, tal como mediante una inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. Dependiendo de la ruta de administración, la composición farmacéutica puede cubrirse con un material para proteger la composición farmacéutica de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar la composición farmacéutica. La composición farmacéutica también puede administrarse parenteralmente o intraperitonealmente. Las dispersiones pueden también preparase en glicerol, polietilen glicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (agua soluble) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe de ser estéril y debe ser un fluido hasta el grado de que exista fácil inyectabilidad . Debe de ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y debe ser - - protegido contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. Los vehículos pueden ser un solvente o medio de dispersión que contenga por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y propilen glicol líquido y lo similar) , mezclas adecuables de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, al mantener el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y al utilizarse surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacteriales y antifungales, por ejemplo, parabens, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y lo similar. En muchos casos, será preferible incluir en la composición, agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede originarse al incluir en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones estériles inyectables pueden prepararse mediante la incorporación de la composición farmacéutica en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes de los arriba enumerados, según se requiera, seguida por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar la composición farmacéutica en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos provenientes de aquellos anteriormente enumerados . La composición farmacéutica puede administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inherte o un vehículo comestible asimilable. La composición farmacéutica y otros ingredientes también pueden incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o suave, comprimida en tabletas o directamente incorporada en la dieta del individuo. Para la administración oral terapéutica, la composición farmacéutica puede incorporarse con excipientes y utilizarse en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y los similar. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 1% por peso del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse y puede convenientemente estar entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de composición farmacéutica en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosis adecuada. Las tabletas, pastillas, pildoras, cápsulas y lo similar también pueden contener lo siguiente: un aglutinante tal como goma tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; - - excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente de desintegración tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y lo similar; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente endulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente saborizante tal como menta, aceite de gaulteria o saborizante de cereza. Cuando la forma de la unidad de dosis es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como revestimientos o modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosis. Por ejemplo, las tabletas, pildoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambas. Un jarabe o elixir puede contener el agente, la sacarosa como un agente edulcorante, metilo y propilparabens como conservadores, un colorante y saborizante tal como sabor de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado para preparar cualquier forma de unidad de dosis debe ser farmacéuticamente pura y substancialmente no-tóxica en las cantidades empleadas. Además, la composición farmacéutica puede incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida. Como se utiliza en la presente, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir solventes, medio de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y antifungales, agentes isotónicos y de absorción retardada, - y lo similar. El uso de tales medios y agentes para las substancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en lo que respecta a cualquier medio o agente convencional se contempla que es incompatible con la composición farmacéutica, uso de la misma en las composiciones terapéuticas y métodos de tratamiento. Los compuestos activos suplementarios también pueden incorporarse en las composiciones. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en dosis en forma unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. Forma unitaria de dosis como se utiliza en la presente se refiere a las unidades físicamente separadas adecuadas como dosis unitarias para el individuo a ser tratado; se calcula cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de composición farmacéutica para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las nuevas formas unitarias de dosis de la invención se dicta por y directamente dependen de (a) las características únicas de la composición farmacéutica y el efecto terapéutico particular a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de componer una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección patogénica en un sujeto. La composición farmacéutica principal se compone por la administración conveniente y efectiva en cantidades efectivas con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado en una unidad de dosis aceptable. En el caso de las composiciones que contienen ingredientes activos suplementarios, las dosis se determinan por la referencia a la dosis y la manera de administración usual de los ingredientes . Además de generar anticuerpos que se unen a epítopes antigénicos de las proteínas de la invención, se prevé además que el método de la invención pueda utilizarse para inducir respuestas celulares, particularmente linfocitos-T citotóxicos (CTLs) , para epítopes atigénicos de, por ejemplo, LuxP o LuxQ. Típicamente las proteínas solubles no modificadas fallan al preparar las respuestas de CTL restringidas clase I del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) condiderando que las proteínas particuladas son extremadamente inmunogénicas y se han mostrado para preparar las respuestas de CTL in vivo. Los epítopes de CTL y los epítopes auxiliares se han identificado en las proteínas a partir de muchos patógenos infecciosos. Además, estos epítopes pueden producirse concurrentemente de tal manera que los epítopes múltiples pueden suministrarse en una forma que puedan prepar las respuestas de CTL restringidas clase I de MHC. Un ejemplo de un sistema que puede producir partículas de proteínas recombinantes portando uno o más epítopes ocasiona el uso de la proteína pl del retrotransposón Tyl de Saccharomyces cerevisiae (Adams, et al . Nature, 329:68, 1987). Las secuencias que codifican epítopes CTL pueden, por ejemplo, fusionarse a la C-terminal de pl y las partículas similares al virus Ty resultantes (Ty-VLPs) pueden ser capaces de generar una respuesta a CTL. Así, las regiones conservadas de los antígenos patogénicos, tales como aquellas que están involucradas o resultan de la activación del sistema de señalización tipo-2, pueden identificarse e incorporarse juntas en una partícula que permite al sistema inmune huésped instalar una respuesta inmune efectiva contra los organismos espiroquetales múltiples. Además, el método de la invención puede utilizarse para generar partículas con epítopes múltiples para una sola proteína, tal como LuxP o epítopes múltiples de varias proteínas. El método de la invención también incluye sistemas de suministro de antígeno de liberación lenta tal como microencapsulación de antígenos en liposomas. Tales sistemas se han utilizado como un planteamiento para mejorar la inmunogenicidad de las proteínas sin el uso de los adyuvantes tradicionales. Los liposomas en la corriente sanguínea se absorben generalmente por el hígado y el bazo y son fácilmente fagocitados por los macrófagos. Los liposomas también permiten el co-entrampamiento de las moléculas - inmunomodulatorias junto con los antígenos, de modo que las moléculas pueden suministrarse en el sitio de encuentro del antígeno, permitiendo la modulación del sistema inmune hacia las respuestas protectoras. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que se une a una proteína de la invención, tal como LuxP o LuxQ. El método incluye incubar los componentes que comprenden el compuesto y a LuxP o LuxQ bajo condiciones suficientes para permitir que los componentes interactúen y medir la unión de los compuestos a LuxP o LuxQ. Como se describió anteriormente, los compuestos que se unen a LuxP o LuxQ incluyen péptidos, peptidomiméticos, polipéptidos, compuestos químicos y agentes biológicos. La incubación incluye condiciones que permiten el contacto entre el compuesto de prueba y LuxP o LuxQ. El contacto incluye en solución y en fase sólida. El (los) ligando (s) /compuesto de prueba pueden opcionalmente ser un archivo combinatorio para clasificar una pluralidad de compuestos. Los compuestos identificados en el método de la invención pueden adicionalmente evaluarse, detectarse, clonarse, secuenciarse y lo similar, ya sea en solución o después de la unión a un soporte sólido, mediante cualquier método usualmente aplicado a la detección de una secuencia de ADN específica tal como PCR, restricción de oligómero (Saiki, et al . Bio/Technology, 3_: 1008-1012 , 1985), análisis de prueba de oligonucleótido de alelo específico (ASO) (Conner, et al . Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 80:278, 1983), análisis de ligadura de oligonucleótido (OLAs) (Landegren, et al . , Science, 241:1077, 1988) y lo similar. Las técnicas moleculares para el análisis de ADN se han revisado (Landegren, et al . , Science, 242:229-237, 1988). También se incluyen en el método de clasificación de la invención los métodos químicos combinatorios para identificar los compuestos químicos que se unen a LuxP o LuxQ. Ver por ejemplo, Plunkett y Ellman, "Combinatorial Chemistry and New Drugs" ("Química Combinatoria y Nuevos Fármacos"), Scientific American, Abril, p.69, (1997). La invención proporciona además un método para promover la producción de un producto bacterial, tal como por ejemplo, un antibiótico, al poner en contacto un cultivo de bacteria con una AI -2 de la invención a una concentración efectiva para estimular o promover el metabolismo, el crecimiento o la recuperación celular. Por ejemplo, se conoce que la bacteria que produce antibiótico solo produce un antibiótico en o cerca del pico del crecimiento de fase log. Al poner en contacto un medio de cultivo que contiene tal bacteria que produce antibiótico con AI -2 de la invención, la producción del antibiótico puede inducirse en una fase anterior de crecimiento. Así, AI -2 de la invención proporciona un método para incrementar la cantidad de antibiótico producido por un cultivo. "Medio de cultivo", como se utiliza en la presente, se propone para incluir una sustancia sobre la cual o en la cual crecen las células. La molécula autoinductora puede incluirse en medios de cultivo celulares comercialmente disponibles que incluyen caldos, agar y gelatina. La invención proporciona además un método para identificar factores que degradan o inhiben la síntesis autoinductora-2. Por ejemplo, se sabe que la concentración de la autoinductora- 1 lleva a tope la fase log media a tardía de un cultivo celular bacterial. En contratse, la concentración de la autoinductora-2 incrementa la fase inicial en log del crecimiento del cultivo celular bacterial y se encuentra presente en cantidades inferiores en la fase log tardía y la fase estacionaria. Estos datos indican que existe un mecanismo para la degradación de la autoinductora-2 en un punto específico en el crecimiento bacterial. Al proporcionar la autoinductora-2 aislada y purificada, la invención permite la identificación del mecanismo mediante el cual se controlan los niveles de la autoinductora-2. Por ejemplo, los extractos bacteriales parcialmente purificados pueden analizarse contra la autoinductora-2 aislada para identificar aquellas fracciones que degradan a la autoinductora-2. Las fracciones que degradan a la autoinductora-2 pueden fraccionarse adicionalmente mediante técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica hasta que aquellos componentes celulares involucrados en la degradación de la autoinductora se aislan. La presente invención también proporciona un método de regular la expresión de un gen. El método comprende insertar un gen en la bacteria seleccionada para mejorar la expresión del gen mediante un agente capaz de estimular la actividad de la proteína LuxQ e incubar la bacteria con un agente capaz de estimular la actividad de la bacteria LuxP. Así, la molécula de señalización de la invención también puede utilizarse en clasificaciones para otros objetivos que se regulan por la molécula. Los archivos de fusión de promotor clonado pueden prepararse a partir de cualquier especie de bacteria y estos archivos pueden utilizarse para identificar genes que se inducen o reprimen por el factor de señalización, simplemente al clasificar las diferencias en la actividad del informador en las placas de petri o de microtitulación que contienen la molécula de señalización comparadas a las placas que no contienen la molécula. Además, la detección de quorum es un regulador principal del control de biopelícula y bloqueadores de detección de quorum por lo tanto pueden utilizarse para evitar y/o inhibir la formación de biopelícula. También, los bloqueadores de detección de quorum son efectivos para - - retirar o disminuir substancialmente la cantidad de biopelículas que ya se han formado sobre una superficie. Así, al proporcionar la estructura de la autoinductora-2 (AI-2) , la presente invención proporciona un nuevo planteamiento para identificar compuestos que inhiben las infecciones bacteriales al regular la formación de biopelícula. Se sabe que los bloqueadores de detección de quorum pueden reducir la producción de proteasa por un 50% en algunas cepas de bacteria pero el descubrimiento de que ciertos compuestos pueden eliminar substancialmente la producción de proteasa imparte claras ventajas clínicas significativas. Además, el hallazgo inesperado de que la formación de biopelícula puede inhibirse o evitarse por los bloqueadores de deteción de quorum conduce a la conclusión razonable de que otros bloqueadores de detección de quorum que son conocidos para exhibir bloqueo de detección de quorum en otros sistemas, tal como la producción de proteasa, también serán efectivos contra la formación de biopelícula. Los compuestos de la invención se utilizan ventajosamente para tratar y/o evitar infecciones, tal como aquellas causadas por V. angufflarum o Aeromonas spp . Ejemplos de este tipo de infección son las enfermedades de vibriosis y furunculosis en el pez. La inhibición de la formación de biopelícula por la bacteria, opcionalmente junto con una reducción o eliminación de la producción de la proteasa - extracelular, hace a la bacteria substancialmente no-patogénica. Los compuestos de la invención pueden formularse por métodos convencionales para utilizarse en el tratamiento y/o prevención de infección bacterial. Por ejemplo, los compuestos pueden utilizarse como preparaciones sólidas o líquidas (tales como tabletas, suspensiones o soluciones para administración oral o composiciones estériles inyectables) , opcionalmente junto con diluyentes farmacéuticamente aceptables, vehículos u otros aditivos. Para el tratamiento de las enfermedades de vibriosis o furunculosis en el pez, los compuestos o composiciones que los contienen pueden aplicarse directamente al pez o pueden agregarse al alimento o agua del pez. En otra modalidad, la invención proporciona un método para retirar una biopelícula de una superficie que comprende tratar la superficie con un compuesto de la invención. La superficie es preferentemente el interior de un sistema acuoso de distribución de líquido, tal como un sistema de distribución de agua para beber o una línea de suministro conectada a un sistema dental de aire-agua. El retiro de las biopelículas de este tipo de superficies puede ser particularmente difícil de lograr. El compuesto se aplica preferentemente a la superficie como una solución del compuesto ya sea sola o junto con otros materiales tales como detergentes o surfactantes convencionales.

- Una modalidad adicional de la invención es una composición antibacterial que comprende un compuesto de la invención junto con un agente bactericida. En las composiciones antibacteriales, el compuesto de la invención ayuda a retirar la biopelícula mientras el agente bactericida elimina a las bacterias. La composición antibacterial se encuentra preferentemente en la forma de una solución o suspensión para rociar y/o frotar sobre una superficie. En aún otro aspecto, la invención proporciona un artículo recubierto y/o impregnado con un compuesto de la invención a fin de inhibir y/o evitar la formación de biopelícula en el mismo. El artículo es preferentemente de material plástico con el compuesto de la invención distribuido a través de todo el material . III. Descripción de Ácidos Nucleicos que Codifican Proteínas Involucradas en la Biosíntesis del Factor de Señalización De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, hemos clonado y caracterizado los genes responsables de la producción de la molécula de señalización de la invención en V. harveyi , S . typhimurium y E. coli . Estos genes codifican una nueva familia de proteínas responsables de la producción de la autoinductora. Hemos diseñado los miembros de esta familia de genes de producción de la autoinductora como luxS, específicamente luxSE. - , luxSs - t - , y luxSv. h - para E. coli , S . typhimurium y V. harveyi respectivamente . La mutagénesis de luxS en V. harveyi , S. typhimurium y E. coli elimina la producción de la molécula de señalización en las tres especies de bacterias. La S. typhimurium puede complementarse para la producción total de la molécula mediante la introducción de ya sea el gen de E. coli 0157 :H7 luxSE. c. o del gen V. harveyi BB120 luxSv. h . Estos resultados indican que tanto las proteínas luxS de E. coli y V. harveyi pueden funcionar con los componentes celulares de S. typhimurium para producir la molécula de señalización. La E. coli DH5 se complementó solo parcialmente para la producción de la molécula de señalización mediante la introducción de ya sea el gen de E. coli 0157 :H7 luxSE. c. o el V. harveyi BB120 luxSv. h . Debido a que la expresión in trans de los genes luxS en E. coli DH5 no regeneró completamente la producción de la molécula de señalización, otros factores bioquímicos o fisiológicos pueden contribuir a la producción de señal . La regulación de la producción de la molécula de señalización difiere entre las cepas patogénicas y no patogénicas. Por ejemplo las cepas 0157 :H7 de E. coli producen AI-2 a 30° y 37°C con o sin glucosa mientras que las cepas K-12 de E. coli no producen la molécula en ausencia de una fuente de carbono preferida. Y, todas las cepas 0157 de E. coli probadas producen mayor actividad de señalización que las cepas E. coli no patogénicas. De igual modo, la S . typhimurium 14028 patogénica produce significativamente mayor actividad de señalización que la S . typhimurium LT2. Los análisis de secuencia muestran que las proteínas LuxS son altamaente homologas y los datos de complementación sugieren que las proteínas pueden funcionar a través de las especies. Estos resultados indican que la actividad enzimática llevada a cabo por las proteínas LuxS y cualquier otra maquinaria celular que contribuya a la síntesis de la molécula de señalización se conserven. No hemos identificado ningún motif de secuencia de aminoácido en las proteínas LuxS que es indicativo de una función particular. Por lo tanto, la mayoría de las proteínas LuxS probablemente catalizan una etapa enzimática específica en la biosíntesis de la molécula de señalización. El resto de las etapas involucradas en la biosíntesis de la molécula de señalización podria ser una consecuencia de un proceso metabólico normal intermedio. Los genes luxS identificados en la presente no producen homología hacia otros genes conocidos a involucrarse en la producción de autoinductoras de acil-homocerina lactona (como luxl (Fuqua et al . , J. Bacteriol, 176, 269-275, 1994) , como luxLM-ainS (Bassler et al . , 1993, supra ; Wilson et al . , J. Bacteriol. 177, 6946-6951, 1995), además indican que son novedosas las moléculas de señalización de la presente invención. Los análisis de base de datos de los genomas bacteriales terminados y no terminados revelan que muchas otras especies de bacterias poseen un gen homologo a luxS de V. harveyi , S. typhimurium y E. coli . Las especies de bacteria identificadas y el porcentaje de homología/identidad (H/I) hacia la proteína LuxS de V. harveyi son como sigue: Haemophilus influenzae (88/72) , Helicobacter pylori (62/40) , Bacilus subtilis (58/38) , Borrelia burgfdorferi (52/32) , Neisseria meningi tidis (89/80) , Neisseria gonorrhoeae (89/80) , Yersinia pestis (85/77) , Campylobacter jejuni (85/74), Vibrio cholerae (95/90), Deinococcus radiodurans (65/45) , Mycobacterium tuberculosis (59/41) , Enterococcus faecalis (60/44) , Streptococcus pneumoniae (57/36) y Streptococcus pyogenes (57/36) . Como se reportó anteriormente (Bassleer et al . 1997 supra) , unas cuantas de estas especies se probaron para la producción de la molécula de señalización. Hemos mostrado que la V. cholerae y la Y. enterocoli tica pero no la B . subtilis produjeron actividad de señalización. Creemos que la B . subtilis produce la molécula pero no se han determinado aún las condiciones ambientales que inducen su síntesis. Además creemos que todas las especies identificadas en el análisis de base de datos producen una molécula similar a AI-2. Las secuencias de nucleótidos de los genes l uxS de V. harveyi , E. coli y S. typhimurium se establecen al final de la especificación como SEQ ID N0:1, SEQ ID NO : 2 y SEQ ID NOS: 3 y 4 respectivamente (las secuencias leídas en la dirección 5' a 3') estos genes se refieren algunas veces en la presente como "LuxSv. h . ", "LuxSE. c . " y "LuxSs . t - " rspectivamente . Las secuencias de aminoácidos deducidas de SEQ ID NOS: 1-4 se establecen al final de la especificación (y en la Figura 11) como SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 respectivamente. Se cree que la SEQ ID NOS: 1 y 2 constituyen ciónos de longitud total mientras que la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO : 4 no. Los genes LuxS de V. harveyi , E. coli y S. typhimurium se describen en mayor detalle en el Ejemplo 3. Aunque estos genes LuxS particulares y sus proteínas codificadas son ejemplificativas en la presente, esta invención abarca los genes LuxS y sus enzimas codificadas provenientes de cualquier especie bacterial, que tengan la secuencia, las propiedades estructurales y funcionales de las proteínas LuxS codificadas descritas en la presente. Como se mencionó en el Ejemplo 3, las secuencias de ácido nucleico homologas se han identificado en una variedad de especies bacteriales, pero la identidad de esas secuencias como los genes LuxS hasta ahora no se habían apreciado. Los nucleótidos de LuxS y las secuencias de aminoácidos deducidas de otras especies bacteriles se establecen al final de la especificación como SEQ ID NOS: 5-9 y 13-17, respectivamente e incluyen secuencias de las siguientes especies Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori , Bacilus subtilis, Borrelia burgdorferi , y Vibrio cholerae. Además de los homólogos de LuxS de las especies diferentes a V. harveyi , E. coli o S. typhimurium, las variantes y los mutantes naturales de SEQ ID NOS: 1-9 es probable que existan dentro de diferentes especies o cepas de Vibrio, Escherichia y Salmonela (verdaderamente la cepa DH5 de E. coli posee una forma mutante no funcional del gen) . Debido a que se espera que tales variantes posean ciertas diferencias en la secuencia de nucleótidos y aminoácidos, esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico LuxS aislada y la proteína codificada que tiene al menos aproximadamente 50-60% (preferentemente 60-80%, más preferentemente más de 80%) de homología de secuencia en la región de codificación con las secuencias de nucleótidos establecidas como SEQ ID NOS: 1-9, respectivamente (y preferentemente que comprenda específicamente las regiones de codificación de SEQ ID NOS: 1-9), y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 10-17. Debido a la variación natural de secuencia que probablemente existen entre estas proteínas y los ácidos nucleicos que las codifican, alguien de experiencia en la técnica esperaría encontrar hasta aproximadamente 40-50% de variación de secuencia, mientras se - mantiene aún las propiedades únicas de las proteínas LuxS codificadas de la presente invención. Tal expectativa se debe en parte a la degeneración del código genético, así como a los resultados positivos evolucionarlos conocidos de las variaciones de secuencia de aminoácidos conservadoras, que no alteran apreciablemente la naturaleza de la proteína. De acuerdo con lo anterior tales variantes se consideran substancialmente las mismas que otras y se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Para propósitos de esta invención, el término "substancialmente la misma" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos que tienen variaciones de secuencia que no afectan materialmente la naturaleza de la proteína (i.e. la actividad de las características estructurales y/o biológicas de la proteína) . Con referencia particular a secuencias de ácidos nucleicos el término "substancialmente la misma" pretende referirse a la región de codificación y a la expresión que gobierna las secuencias conservadas, y se refiere principalmente a codones de degradación que codifican al mismo aminoácido, o alteran los codones que codifican a los aminoácidos substitutos conservadores en el polipéptido codificado. Con referencia a las secuencias de aminoácidos, el término "substancialmente la misma" se refiere en general a substituciones y/o variaciones conservadoras en regiones de los polipéptidos no incluidos en la determinación de la estructura o función. El término "porcentaje de identidad" y "porcentaje de similitud" también se utilizan en la presente en comparaciones entre las secuencias de amonoácidos. Estos términos se pretende se definan como se encuentran en el programa de análisis de secuencia UWGCG (Devereaux et al . , Nucí. Acids Res. 12: 387-397, 1984), disponible en la Universidad de Wisconsin, y los parámetros utilizados por este programa son los parámetros propuestos para utilizarse en la presente para comparar la identidad y similitud de las secuencias. A. Preparación de las Moléculas del Ácido Nucleico LuxS, Proteínas Codificadas y Anticuerpos Inmunológicamente Específicos 1. Moléculas de Ácido Nucleico Las moléculas del ácido nucleico LuxS de la invención pueden prepararse por dos métodos generales: (1) pueden sintetizarse de trifosfatos de nucleótido apropiados, o (2) pueden aislarse de fuentes biológicas. Ambos métodos utilizan protocolos bien conocidos en la materia. La disponibilidad de la información de la secuencia del nucleótido, tal como los ADNs que tienen SEQ ID NOS: 1-9, permiten la preparación de una molécula de ácido nucleico aislado de la invención mediante síntesis de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos sintéticos pueden prepararse mediante el método de fosforamadita empleado en Sintetizador de ADN 38A de los Biosistemas Aplicados o dispositivos similares. La construcción resultante puede purificarse de acuerdo a métodos conocidos en la materia, tal como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) . Los grandes polinucleótidos de doble trenzado, tal como una molécula de ADN de la presente invención, deben sintetizarse en etapas, debido a las limitaciones de tamaño inherentes en los actuales métodos sintéticos de oligonucleótidos. Tales grandes moléculas de doble trenzado pueden sintetizarse como varios pequeños segmentos de complementariedad apropiada. Los segmentos de complementariedad así producidos pueden fortalecerse de manera que cada segmento posea terminales cohesivas apropiadas para unirse a un segmento adyacente. Los segmentos adyacentes pueden ligarse al fortalecer las terminales cohesivas en presencia de la ligasa de ADN para construir una molécula completa de doble trenzado de 1.8 kb. Una molécula de ADN sintético así construida puede clonarse y amplificarse en un vector apropiado. Los ácidos nucleicos LuxS pueden aislarse de fuentes biológicas apropiadas utilizando métodos conocidos en la materia. En una modalidad preferida, un clon genómico se aisla de un archivo de expresión cósmido de un genoma de S . typhimurium o E. coli . En otra modalidad, se aisla un clon genómico a partir de un archivo cósmido de otro genoma bacterial .

- De acuerdo con la presente invención, los ácidos nucleicos que tienen la homología de secuencia de nivel apropiado con la región de codificación de la proteína de cualquier SEQ ID NOS: 1-9 puede identificarse al utilizar condiciones de hibridización y lavado de restricción apropiadas. Por ejemplo, las hibridizaciones pueden realizarse, de acuerdo a los métodos de Sambrook et al . , utilizando una solución de hibridización que comprende: reactivo de Denhardt 5X SSC, 5X, 1.0% SDS, 100 g/ml desnaturalizado, ADN de esperma de salmón fragmentado, 0.05% de pirofosfato de sodio y hasta 50% de formamida. La hibridización se lleva a cabo a 37-42°C por al menos seis horas. Después de la hibridización, los filtros se lavan como sigue: (1) 5 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC y 1% SDS; (2) 15 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC y 0.1% SDS; (3) de 30 minutos a 1 hora a 37 °C en IX SSC y 1% SDS; (4) 2 horas a 42-65° en IX SSC y 1% SDS, cambiando la solución cada 30 minutos. Una fórmula común para calcular las condiciones de restricción requeridas para lograr la hibridización entre las moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia específica (Sambrook et al . , 1989) : Tm=81.5C+16.6Log[Na+] +0.41 (%G+C) -0.63 (%formamida) -600/#bp al doble Como una ilustración de la fórmula anterior, utilizando [N+] = [0.368] y 50% de formamida, con contenido GC de 42% y un tamaño de prueba promedio de 200 bases, el Tra es 57C. El Tm de un ADN duplicado disminuye de 1 - 1.5C con cada 1% que disminuye en homología. Así, los abjetivos mayores que aproximadamente 75% de identidad de secuencia se observarían utilizando una temperatura de hibridización de 42°C. Otra forma de aislar los ácidos nucleicos luxS es buscar las bases de datos públicamente disponibles para la secuencia de luxS en el genoma bacterial de interés, diseñar los iniciadores PCR a partir de la secuencia y amplificar el gen directamente del cromosoma. Entonces puede clonarse el producto de PCR. Alternativamente, si la secuencia completa de un genoma bacterial específico no se encuentra disponible, la secuencia establecida en la presente invención, o cualquier otra secuencia de luxS, puede utilizarse para diseñar oligonucleótidos degenerados por la amplificación de PCR y clonar luxS a partir del cromosoma. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden mantenerse como ADN en cualquier vector de clonación conveniente. En una modalidad preferida, los clones se mantienen en vectores de clonación/expresión del plásmido, tal como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) , que se propaga en una célula huésped de E. coli adecuada. Las moléculas de ácido nucleico luxS de la invención incluyen ADN, ARN, y fragmentos de los mismos que pueden ser de trenzado doble o sencillo. Así, esta invención proporciona oligonucleótidos (hebras de detección o antidetección de ADN o ARN) que tienen secuencias capaces de hibridizarse con al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tales como segmentos seleccionados del ADN que tiene las SEQ ID NOS: 1, 2 o 3. Tales oligonucleótidos son útiles como prueba para detectar los genes LuxS o las transcripciones. 2. Proteínas y Anticuerpos Un producto de gen LuxS de longitud total de la presente invención puede prepararse en una variedad de formas, de acuerdo a métodos conocidos. La proteína puede purificarse de fuentes apropiadas, e.g., bacterias cultivadas tales como S. typhimurium, E. coli o V. harveyi . La disponibilidad de las moléculas de ácido nucleico LuxS de longitud completa permite la producción de la proteína purificada utilizando métodos de expresión in vi tro conocidos en la materia. De acuerdo a una modalidad preferida, la enzima puede producirse por expresión en un sistema de expresión adecuado. Por ejemplo, parte o toda una molécula de ADN, tal como el ADN que tiene la SEQ ID NO: l o 2, puede insertarse en un vector de plásmido adaptado para la expresión en una célula bacterial tal como E. coli , o una célula eucariótica, tal como Saccharomyces cerevisiae u otra levadura. Tales vectores comprenden los elementos de regulación necesarios para la expresión del ADN en la célula huésped colocados de tal manera como para permitir la expresión del ADN en la célula huésped. Tales elementos de regulación requeridos para la expresión incluyen secuencias promotoras, secuencias de iniciación de la transcripción, y opcionalmente secuencias mej oradoras. La proteína producida por el gen de expresión LuxS en un sistema procariótico o eucariótico recombinante puede purificarse de acuerdo a métodos conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, puede utilizarse un sistema de expesión/secreción, comercialmente disponible, mediante el cual la proteína recombinante se expresa y de ahí en adelante se secreta desde la célula huésped, para purificarse fácilmente a partir del medio circundante. Si los vectores de expresión/secreción no se utilizan, un enfoque alternativo incluye purificar la proteína recombinante mediante separación por afinidad, tal como mediante la interacción inmunológica con anticuerpos que se unen específicamente a la proteína recombinante. Tales métodos se utilizan cumunmente por los practicantes experimentados. La proteína codificada por el gen LuxS de la invención, preparada por uno de los métodos antes mencionados puede analizarse de acuerdo a procedimientos estándar. Por ejemplo, la proteína puede someterse a análisis de secuencia - de aminoácidos, de acuerdo a métodos conocidos. La estabilidad y actividad biológica de la enzima puede determinarse de acuerdo a métodos estándar, tal como mediante la capacidad de la proteína para catalizar la producción de la molécula de señalización bajo diferentes condiciones. La presente invención también proporciona anticuerpos capaces de unirse inmunoespecíficamente a la proteína de la invención codificada por LuxS . Los anticuerpos policlonales pueden prepararse de acuerdo a métodos estándar. En una modalidad preferida, se preparan los anticuerpos monoclonales, los cuales reaccionan inmunoespecíficamente con varios epítopes de la proteína. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse de acuerdo a los métodos generales de Kóhler y Milstein, siguiendo los protocolos estándar. Los anticuerpos policlonales o monoclolales que interactúan inmunoespecíficamente con las proteínas que codifican LuxS, pueden utilizarse para identificar y purificar tales proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse por separación de afinidad de las proteínas con las cuales interactúan inmunoespecíficamente . Los anticuerpos también pueden usarse para inmunoprecipitar proteínas a partir de una muestra que contenga una mezcla de proteínas y otras moléculas biológicas . B. Usos de las Moléculas de Ácido Nucleico LuxS , - Proteínas Codificadas y Anticuerpos Inmunológicamente Específicos Los ácidos nucleicos LuxS pueden utilizarse para una variedad de propósitos de acuerdo con la presente invención. El ADN, ARN, o fragmentos de los mismos pueden utilizarse como pruebas para detectar la presencia y/o expresión de los genes LuxS. Los métodos en los cuales pueden utilizarse los ácidos nucleicos LuxS como pruebas para tales ensayos incluyen, pero no se limitan a: (1) hibridización in si tu; (2) Hibridización Southern (3) Hibridización Northern y (4) reacciones de amplificación clasificadas tales como reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) . El ácido nucleico LuxS de la invención también puede utilizarse como prueba para identificar genes relacionados a partir de otra bacteria. Como se conoce bien en la técnica, las restricciones de hibridización pueden ajustarse a la hibridización permitida de las pruebas de ácido nucleico con secuencias complementarias de variedad de grados de homología . Como se describió anteriormente, los ácidos nucleicos LuxS también se utilizan ventajosamente para producir grandes cantidades de proteína codificada sustancialmente pura, o proteínas seleccionadas de las mismas. Debe notarse a este respecto que los genes clonados en lugar de vectores de expresión pueden utilizarse para hacer grandes cantidades de la molécula de señalización por si misma, a partir de cualquier especie bacterial seleccionada, en un huésped recombinante tal como E. coli DH5. Los genes LuxS específicos se clonan, se produce una gran cantidad de la proteína codificada, produciendo mediante esto una gran cantidad de la molécula de señalización específica. Esto será particularmente útil al determinar las diferencias en las estructuras de las moléculas de señalización a partir de diferentes especies, si se encuentra que existen tales diferencias. Alternativamente, una gran cantidad de moléculas de señalización a partir de las especies de interés, pueden hacerse utilizando el gen clonado en un vector de expresión, y a partir de ahí se utiliza en selecciones de archivos para objetivos potenciales en análisis de placa de petri, como se describió anteriormente. Los productos del gen LuxS purificados, o los fragmentos del mismo, pueden utilizarse para producir anticuerpos monoclonales o policlonales que también pueden servir como reactivos de detección sensitiva para la presencia y acumulación de esas proteínas en las células cultivadas. Las técnicas recombinantes permiten la expresión de las proteínas de fusión que contienen parte o todo de una proteína seleccionada codificada por LuxS. La proteína de longitud total o fragmentos de la proteína pueden utilizarse ventajosamente para generar un arreglo de anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para varios epítopes de la proteína, proporcionando mediante esto aun mayor sensibilidad de la proteína en células o tejido. Otros usos de las proteínas LuxS incluyen la sobre producción para hacer una cantidad de las proteínas LuxS suficiente para la cristalización. Resolver la estructura del cristal de la proteína LuxS permitiría la determinación exacta del sitio activo LuxS para la catálisis de producción de la molécula de señalización. Por lo tanto, la estructura del cristal LuxS puede utilizarse para modelado en computadora lo que facilitaría grandemente el diseño de análogos de la molécula de señalización, inhibidores LuxS, y diseño de fármacos racionales en general . Los anticuerpos monoclonales o policlonales inmunológicamente específicos para una proteína codificada por LuxS pueden utilizarse en una variedad de ensayos diseñados para detectar y cuantificar la proteína. Tales ensayos incluyen pero no se limitan a: (1) análisis citométrico de flujo, (2) localización inmunoquímica de una proteína LuxS en células o tejidos; y (3) análisis de inmunoblot (e.g.,dot blot, Western blot) de extractos de varias células y tejidos. Adicionalmente, como se describió arriba los anticuerpos pueden utilizarse para la purificación de las proteínas (e.g., purificación de la columna de - afinidad, inmunoprecipitación) . IV. Cepa de Clasificación de Vibrio harveyi En otro aspecto, la invención proporciona una nueva cepa de Vibrio harveyi que tiene un genotipo que es luxNJ luxSJ La bacteria Gram negativa Vibrio harveyi contiene dos circuitos de detección de quorum paralelos que sintetizan y detectan dos diferentes moléculas autoinductoras (Figura 13) . El circuito 1 sintetiza AI-1 una autoinductora HSL similar en estructura a las autoinductoras sintetizadas por la trayectoria Luxl/R encontrada en otras bacterias Gram negativas. El circuito 2 sintetiza AI-2, la estructura de la cual no ha sido determinada. La síntesis de AI-1 y AI-2 depende de LuxLM y LuxS respectivamente. Después de la acumulación de una concentración externa crítica de las autoinductoras, ocurre la señalización a través de una serie de reacciones de forsforilación/defosforilación. Las detectoras de AI-1 y AI -2, LuxN y LuxQ respectivamente, contienen tanto un dominio quinasa detector con una histidina conservada (Hl) y un dominio regulador de respuesta anexa con un aspartato conservado (DI) las señales de ambos detectores se canalizan hacia la proteína integradora dividida LuxU, que se fosforila en un residuo de histidina (H2) . Subsecuentemente, la señal se traduce a un residuo de aspartato conservado (D2) en la proteína reguladora de respuesta LuxO. El fosfato de LuxO controla la expresión del operon estructural de la luciferasa luxCDABE, que da como resultado la emisión de luz. La presencia de cualquier AI-1 o AI -2 es suficiente para iniciar la producción de luz en V. harveyi tipo silvestr (cepa BB120) . Por esta razón, tenemos cepas V. harveyi que contienen mutaciones separadas en los genes Lux L, M, S o Q que son defectuosos en su capacidad para sintetizar o detectar AI-1 o AI -2, respectivamente. AI-2 es detectable utilizando cepa BB170 la cual es el detector 1", detector 2+ (LuxNJ LuxQ+) . Esta cepa se utilizó para detectar AI-2 en diversas bacterias. La respuesta de emisión de luz de los fenotipos LuxN- y LuxQ- tipo silvestre para incrementar la densidad celular se muestra en la Figura 14. La BB170 es una informadora sensitiva para AI -2, sin embargo, la cepa BB170 no es óptima para utilizarse como una informadora para los inhibidores de la trayectoria de quorum en un análisis en base a microtitulación. La cepa deseada es defectuosa en su capacidad para detectar AI-1 (detector 1") y defectuosa en su capacidad para sintetizar la AI-2. De este modo, la invención proporciona una cepa de V. harveyi que es genotípicamente luxN y LuxS. La nueva cepa, designada MM32, es útil para identificar inhibidores de la trayectoria de detcción de quorum. Por ejemplo, ya que la nueva cepa es el detector 1", su crecimiento o capacidad de luminiscencia no se afectará por esos organismos que producen AI-1. Además, ya que MM32 es defectuosa para la producción de AI-2, la adición de AI-2 exógena o análogos de la misma, permite la rápida identificación de inhibidores de AI-2. Además, los materiales descritos anteriormente son idealmente adecuados para la preparación de un equipo. Tal equipo puede comprender medios de vehículo que están divididos en compartimientos para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios contenedores tales como viales, tubos y lo similar, cada uno de los medios contenedores comprende uno de los elementos separados para utilizarse en el método. El medio contenedor puede comprender una cepa de bacteria capaz de detectar la presencia de una autoinductora. Preferentemente la cepa bacterial será capaz de proporcionar una señal fácilmente detectable en la presencia de una autoinductora-2. Más preferentemente, la cepa deseada es defectuosa en su capacidad para detectar AI-1 (detector 1") y defectuosa en su capacidad para sintetizar AI-2. Así, el equipo puede proporcionar una cepa de V. harveyi que genotípicamente es luxN" y LuxS" designada MM32. La cepa bacterial es útil para identificar la autoinductora-2 así como los inhibidores de la autoinductora-2 y la trayectoria de detección de quorum. V. Métodos para Detectar un Biomarcador Bacterial Muchas bacterias actualmente conocidas por utilizar el factor de señalización de la autoinductora- 1 se asocian - - con organismos superiores, i.e. plantas y animales, en algún punto durante su ciclo de vida. Por ejemplo, la Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista en humanos con fibrósis quística. La P. aeruginosa regula diversos determinantes de virulencia con AI. Otros ejemplos de bacteria que producen AI incluyen Erwinia carotovora, Pseudomonas aureofaciens, Yersinia enterocolítica, Vibiro harveyi y Agrobacterium tumefaciens . La E. carotovora infecta ciertas plantas y crea enzimas que degradan las paredes celulares de la planta, dando como resultado lo que se llama "enfermedad de pudrición suave" . La Yersinia enterocolítica es una bacteria que causa enfermedad gastrointestinal en humanos y se ha reportado que produce una autoinductora. La P. aureofaciens se asocia con las raíces de las plantas y producen antibióticos que bloquean el crecimiento de los hongos en las raíces. La síntesis antibiótica se encuentra bajo control de la autoinductora. La presente invención proporciona nuevas autoinductoras-2 y métodos de uso de la autoinductora-2. En contraste, a la autoinductora-1, se cree que la autoinductora-2 es una intra-especie así como el factor de señalización inter-especies. Se cree además que la autoinductora-2 regula la expresión de los factores patogénicos y de virulencia no regulados por la autoinductora-1. Así, la presente invención proporciona un método para identificar y regular la expresión de los biomarcadores bacteriales en por ejemplo, la bacteria patogénica. Los métodos de la invención pueden utilizarse para regular la actividad de los patógenos bacteriales que se encuentran presentes tanto en plantas como en animales. La invención proporciona además un método para detectar un biomarcador bacterial asociado a la autoinductora al poner en contacto al menos una célula bacterial con una molécula de la autinductora bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la inducción de un biomarcador bacterial. Como se utiliza en la presente, un "biomarcador bacterial asociado a la autoinductora" es cualquier componente celular bacterial que se regula, modifica, mejora, inhibide o induce en respuesta a una autoinductora . Un biomarcador puede ser cualquier componente celular bacterial que es identificable mediante técnicas biológicas, microscópicas, histológicas o moleculares conocidas. Tales biomarcadores pueden utilizarse, por ejemplo, para distinguir patogénicos de bacterias no patogénicas. Tal biomarcador puede ser por ejemplo, una molécula presente en una superficie celular, una proteína, un ácido nucleico, un evento de fosforilación o cualquier característica molecular o morfológica de una célula bacterial que se modifica como un resultado de la bacteria contactada con una autoinductora. Preferentemente la autoinductora es la autoinducotra-2. El método de la invención es particularmente útil para - identificar un biomarcador que es indicativo de patogenicidad bacterial. Como se anotó previamnete, las autoinductoras son factores de señalización extracelular utilizados por una variedad de bacterias para regular funciones celulares en respuesta a varios estímulos ambientales, incluyendo la alta densidad de población. Se cree que la bacteria patogénica expresa un biomarcador, tal como un determinante antigénico, como resultado de la concentración incrementada de la autoinductora en el ambiente que la rodea. Así, la presente invención proporciona un método para identificar un biomarcador al poner en contacto una bacteria con una autoinductora-2 y analizar la presencia del biomarcador. El método de la invención contempla el uso de una prueba para identificar un biomarcador presente en una célula bacterial. Como se utiliza en la presente, una "prueba" puede ser un ácido nucleico, proteína, molécula pequeña o anticuerpo útil para detectar un biomarcador bacterial presente en una muestra. La prueba puede utilizarse en un análisis de clasificación para identificar un biomarcador presente en una muestra después de que la muestra se ha puesto en contacto con por ejemplo, una autoinductora. Por ejemplo, un biomarcador bacterial producido por una bateria después del contacto con una autoinductora puede identificarse al poner en contacto una muestra que contiene la bacteria con una prueba que se une al biomarcador. Tal - análisis puede utilizarse para detectar, pronosticar, diagnosticar o monitorear varias condiciones, enfermedades y desórdenes o monitorear el tratamiento de los mismos. Una prueba puede ser detectablemente etiquetada de tal manera que la prueba sea detectable cuando se une a su marcador objetivo. Tal medio para etiquetar de manera detectable una prueba incluye una proteína que se une a la biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula informadora. Tal como una etiqueta enzimática, fluorescente o radionúclida . Se conocen bien en la técnica, otros medios y etiquetas informadoras. Además, el método de la invención puede utilizarse para analizar la expresión del gen diferencial en una célula bacterial después del contacto con una autoinductora. Por ejemplo, cuando la expresión de genes en células diferentes, normalmente una célula de interés y un control, se comparan y cualquier discrepancia en la expresión se identifica. En tales análisis, la presencia de discrepancias indica una diferencia en la clase de genes expresados en la célula que se compara. Los métodos que pueden utilizarse para llevar a cabo lo anterior son comúnmente conocidos en la técnica. La presente invención proporciona un método para identificar un biomarcador que puede ser una proteína. Por ejemplo, puede detectarse, una proteína bacterial expresada en respuesta a una molécula autoinductora utilizando el - anticuerpo apropiado. La proteína expresada puede ser por ejemplo, un determinante antigénico indicativo de una bacteria patogénica. Los anticuerpos utilizados en el método de la invención son adecuados para utilizarse por ejemplo, en inmunoanálisis para la detección de tal determinante. El término "anticuerpo" como se utiliza en la presente, significa que incluye moléculas intactas de anticuerpos policlonales o monoclonales, así como fragmentos del mismo, tal como Fab y F(ab') '- Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se elaboran de fragmentos que contienen antígeno de una proteína mediante métodos muy conocidos para aquellos de experiencia en la técnica (Kohler, et al . , Nature, 256:495, 1975) . Además, los anticuerpos monoclonales en estos inmunoensayos pueden etiquetarse de manera detectable en varias formas. Por ejemplo, los radioisótopos pueden unirse a una inmunoglobulina ya sea directamente o indirectamente al utilizar un grupo funcional intermediario. Los grupos funcionales intermediarios, que con frecuencia se utilizan para unirse a radioisótopos que existen como iones metálicos para las inmunoglobulinas son los agentes de quelación bifuncionales tales como el ácido dietilentriamina-pentacético (DTPA) y el ácido etilendiaminatetracético (EDTA) y moléculas similares. Ejemplos típicos de iones metálicos que pueden unirse a anticuerpos monoclonales son 1:L1In, 97Ru, - 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr y 201T1. Una prueba útil en el método de la invención puede también ser una prueba de ácido nucleico. Por ejemplo, las técnicas de hibridización de ácido nucleico son muy conocidas en la técnica y pueden utilizarse para identificar un biomarcador de ARN o ADN presente en una muestra que contiene una bacteria puesta en contacto con una autoinductora. Los procedimientos de clasificación que dependen de la hibridización de ácido nucleico hacen posible identificar un biomarcador a partir de cualquier muestra, siempre que se encuentre disponible la prueba apropiada. Por ejemplo, las pruebas de oligonucleótido, que pueden corresponder a una parte de la secuencia que codifica una proteína objetivo, pueden sintetizarse químicamente. La secuencia de ADN que codifica la proteína puede deducirse a partir del código genético, sin embargo, debe tomarse en cuenta la degeneración del código. Para tal clasificación, se utiliza preferentemente la hibridización realizada bajo condiciones in vi tro o in vivo conocidas para aquellos expertos en la técnica. Además, los materiales anteriormente descritos son idealmente adecuados para la preparación de un equipo. Tal equipo puede comprender un medio de vehículo que se divide en compartimientos para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios contenedores tal como viales, tubos y lo similar, comprendiendo cada uno de los medios contenedores uno de los elementos separados a utilizarse en el método. Un equipo de la invención puede contener un primer medio contenedor que comprende a la autoinductora-2 aislada. La autoinductora-2 aislada puede utilizarse para regular la expresión de un biomarcador en una bacteria objetivo. Por ejemplo, la autoinductora-2 puede utilizarse para inducir la expresión de un biomarcador particular que puede entonces identificarse mediante una prueba. Así, el equipo puede contener un segundo medio contenedor comprendiendo una prueba que pueda etiquetarse de manera detectable. El equipo también puede tener un tercer contenedor que comprende un medio informador, tal como una proteína que se una a la biotina, tal como una avidina o estreptavidina que se una a una molécula informadora, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente o radionúclida . También se conocen en la técnica, otros medios y etiquetas informadoras. Por ejemplo, el equipo de la invención puede proporcionar los reactivos necesarios para realizar los análisis de hibridización de ácido nucleico como se describe en la presente o los reactivos necesarios para detectar anticuerpos unidos a un objetivo. La siguiente descripción establece los procedimientos generales involucrados en la práctica de este aspecto de la presente invención. El grado en el que los materiales específicos se encuentran mencionados, es solamente para propósitos de ilustración y no intenta limitar la invención. A menos que se especifique de otra manera, se utilzan procedimientos de clonación generales, tales como los establecidos en Sambrook et al . , Molecular Cloning, (Clonación Molecular) Cold Spring Harbor Laboratory (1989) (de aquí en adelante "Sambrook et al . " ) o Ausubel et al . (eds) Current Protocols in Molecular Biology, (Protocolos Actuales en Biología Molecular) John Wiley & Sons (1998) (de aquí en adelante "Ausubel et al . " ) . EJEMPLO 1 Detección de Quorum en Escherichia coli y Salmonella typhimuri um Han existido indicaciones preliminares de que E. coli detecta la densidad celular (Huisman et al . , Science 265:537-539, 1994; Sitnikov et al . , Proc. Nati. Acad. ci . USA 93:336-341, 1996; García-Lara et al . , J. Bacteriol. 178:2742-2748, 1996) . Tomamos ventaja de la selectividad reducida del detector del Sistema de Señalización 2 en V. harveyi para desarrollar un análisis sensitivo para la detección de moléculas de señal extracelular producidas por E. coli y S . typhimurium. Utilizando este análisis pudimos determinar las condiciones bajo las cuales muchas cepas de E. coli y S . typhimurium, sintetizan, secretan y degradan una substancia de señalización que interactuará con el detector del Sistema 2 de V. harveyi .

MATERIALES Y MÉTODOS Preparación de los fluidos de cultivo libres de células. Las cepas AB1157 y DH5 de E. coli y la cepa LT2 de S . typhimurium se desarrollaron a 30°C durante la noche con ventilación en caldos LB que contienen glucosa a las concentraciones especificadas en el texto. A la mañana siguiente el medios LB fresco que contenía la misma concentración de glucosa utilizada para el crecimiento durante la noche se inaculó a una dilución de 1:100 con los cultivos que crecieron de durente la noche. Los cultivos frescos se desarrolaron varias veces a 30°C con ventilación. Los fluidos de cultivo libres de células se prepararon mediante la remoción de células del medio de crecimiento mediante centrifugación a 15,000 rpm durante 5 min en una microcentrífuga. Los fluidos de cultivo depurados se pasaron a través de filtros de 0.2 m HT Tuffryn (Gelman) y se almacenaron a -20°C. Los fluidos de cultivo libres de células que contenían la Autinductora-2 de V. harveyi se prepararon de la cepa BB152 de V. harveyi (Auntoinductora 1", / Autoinductora 2+) . La BB120 de V. harveyi (Autoinductora 1+, Autoinductora 2+) se utilizó para preparar fluidos de cultivo conteniendo la Autoinductora- 1. En ambos casos, las cepas V. harveyi se desarrollaron durante la noche a 30°C con ventilación en un medio AB (Bioanálisis de la Autoinductora) (Bassler et al . , 1993, supra) . Los fluidos de cultivo libres - de células de V. harveyi se prepararon del cultivo de durante la noche exactamente como se describió arriba para E. coli y S. typhimurium. Análisis para la producción de moléculas de señalización Los fluidos de cultivo libre de células provenientes de las cepas E. coli , S. typhimurium y V. harveyi se probaron para la presencia de substancias de señalización que pudieran inducir luminiscencia en la cepa informadora BB170 o BB886 de V. harveyi . En los análisis 10 L de fluidos de cultivo libre de células de las cepas E. coli AB1157, E. coli DH5 y S . typhimurium LT2 desarrolladas y cosechadas como se describió anteriormente se agregaron a platos de microtitulación de 96 cavidades. La cepa informadora BB170 o BB886 de V. harveyi se desarrolló durante 16 horas a 30°C con ventilación en un medio AB, se diluyó 1:5000 en un medio AB fresco y se agregaron 90 1 de las células diluidas a los pozos que contenían los fluidos de cultivo libres de células de E. coli y S. typhimurium. Los pozos de control positivo contenían 10 1 de fluido de cultivo libre de células proveniente de la cepa BB152 de V. harveyi (Autoinductora- 1", Autoinductora-2+) o la BB120 de V. harveyi (Autinductora-l+, Autoinductora-2+) . Los pozos de control negativos contenían 10 1 de medio de crecimiento estéril.

Los platos de microtitulación se agitaron en un agitador giratorio a 175 rpm a 30°C. Cada hora, se midió la producción de luz utilizando un contador de centelleo líquido Microbeta Plus 1450 Modelo Wallac en el modo de quemiluminiscencia. La densidad celular de V. harveyi se midió al diluir las mismas alícuotas de células utilizadas para medir la luminiscencia, separando las diluciones en el medio sólido LM (Bassler et al . , 1993, supra) , incubando las placas durante la noche a 30°C y contando las colonias resultantes el día siguiente. Preparación de E. coli y S . typhimurium viables y células eliminadas por UV para el análisis de actividad. Los cultivos de E. coli AB1157, E. coli DH5 y S. typhimurium LT2 se desarrollaron durante 8 horas en LB conteniendo 0.5% de glucosa a 30°C con ventilación. Los cultivos se sometieron a centrifugación durante 5 minutos a 15,000 rpm en una microcentrífuga y el medio de desarrolló se removió de las pellets de células mediante aspiración. Las pellets de células se resuspendieron en un medio AB y se lavaron mediante vigoroso mezclado. Las células se sometieron de nuevo a centrifugación durante 5 min a 15,000 rpm. El medio de lavado AB se retiró y se deshecho y las células se resuspendierone en un medio AB fresco. Cada suspensión celular se diluyó para dar 1 X 106 células/10 1 y se agregaron múltiples alícuotas 10 1 a los pozos de los platos de microtitulación. La mitad de las alícuotas de células se trataron con luz ultravioleta de longitud de onda corta - durante 15 min a una distancia de 10 cm. Este tratamiento fue suficiente para eliminar todas las células según se juzgó al emplacar e incubar las células tatadas con UV y que asegura que no ocurrió crecimiento durante el siguiente día. Se agregó después 90 1 de la cepa informadora BB170 de V. harveyi diluida a los pozos que contenían ya sea células de E. coli y S. typhimurium viables o muertas y la actividad del análisis se llevó a cabo exactamente como se describió en la sección previa. Análisis de glucosa en los fluidos de cultivo de S. typhimurium LT2. Se determinaron las concentraciones de glucosa en los fluidos de cultivo libre de células preparados a partir de S . typhimurium utilizando un análisis Trinder (Diagnostic Chemicals Ltd.) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, excepto que los estándares de glucosa se prepararon en el medio LB. El análisis fue sensible a menos de 0.002% de glucosa. No estuvieron presentes substancias de interferencia en el medio LB o se emplearon fluidos de cultivo LB. RESULTADOS Y EXPOSICIÓN E. coli AB1157 y S. typhimurium LT2 producen una substancia de señalización que induce específicamente uno de los dos sistemas de detección de quorum de V. harveyi . La cepa informadora BB170 de V. harveyi tiene el fenotipo de detección de quorum Detector 1", Detector 2+. Este induce la - expresión lux en respuesta a las señales extracelulares que actúan exclusivamente a través del detector del Sistema de Señalización 2. La adición del 10% de fluido de cultivo utilizado libre de células preparado a partir de la ceppa BB152 de V. harveyi (que contiene a la autoinductora del Sistema 2) estimula a la cepa informadora aproximadamente 1000 veces más que el nivel endógeno de la expresión de luminiscencia. En la Figura 1, la producción de luz por la BB170 de V. harveyi inducida por la adición de 10% de fluidos de cultivo utilizados libres de células se normalizó al 100% de actividad. La cepa AB1157 de E. coli y la cepa LT2 de S. typhimurium se desarrollaron durante ocho horas en caldo LB o caldo LB conteniendo 5% de glucosa. Las células de E. coli y S . typhimurium se retiraron del medio de crecimiento y los fluidos de cultivo libre de células se prepararon y analizaron para una actividad que pudiera inducir la expresión de luminiscencia en V. harveyi . La adición del 10% de fluido de cultivo libre de células proveniente de S . t phi-7iuriu-7? LT2 o E. coli AB1157 desarrollado en glucosa que contenía LB indujo luminiscencia de manera máxima en la cepa informadora BB170, similar a los fluidos de cultivo provenientes de V. harveyi BB152 (Figura ÍA) .

Específicamente E. coli AB1157 produjo 106% y S . typhimurium produjo 237% de la actividad de V. harveyi BB152. Cuando E. - coli y S . typhimurium se desarrollaron en LB sin agregar glucosa no orodujeron el factor de señalización. La sustitución de 10% (v/v) del medio LB que contenía 0.5% de glucosa no estimuló la luminiscencia en la cepa informadora, indicando que no existía sustancia en el medio de crecimiento de glucosa-LB que indujera la expresión de luminiscenia en V. harveyi . Probamos candidatos obvios para la señal incluyendo glucosa, aminoácidos, cAMP, acetato, homoserina lactona, cetoglutarato y otros cetoácidos que se sabe se excretan. Ninguno de estos compuestos tiene actividad. Estos resultados sugieren que V. harveyi BB170 puede responder a alguna sustancia secretada por E. coli AB1157 y S . typhimurium LT2 cuando se desarrollan en LB que contiene glucosa. Se realizaron experimentos análogos con la cepa informadora BB886 de V. harveyi (Detector 1+, Detector 2") . V. harveyi BB886 es defectuosa en su respuesta a las moléculas de señalización que actúan a través del detector del Sistema de Señalización 2, pero es de otra manera una cepa tipo silvestre (Bassler et al . , Mol. Microbiol 3^: 273-286, 1994) . La Figura IB muestra la activación 100% normalizada de V. harveyi BB886 mediante los fluidos de cultivo utilizados libres de células preparados a partir de V. harveyi BB120. V. harveyi BB120 produce la autoinductora del Sistema 1, N- (3-hidroxibutanoilo) -L-homoserina lactona - (Bassler et al . , 1993, supra) . La adición de fluidos de cultivo libre de células de S. typhimurium LT2 y E. coli AB1157 a la cepa BB886 de V. harveyi causó un 5% y un 1% de incremento por arriba del nivel del control (Figura IB) . Juntos los resultados de la Figura ÍA y IB mostraron que la molécula de señalización producida por E. coli y S. typhimurium debe actuar específicamente a través del Sistema de Señalización 2 de V. harveyi y no alguna otra trayectoria no identificada. Se requiere E. coli AB1157 y S . typhimurium para la secreción de la molécula de señalización. Consideramos la posibilidad de que el crecimiento de E. coli AB1157 y S . typhimurium LT2 en el medio LB que contiene glucosa simplemente les permita utilizar y por lo tanto retirar algo del inhibidor de inducción de luminiscencia pre-existente . Para demostrar que las células por sí mismas producen el factor de señalización soluble, agregamos células de E. coli y S. typhimurium lavadas directamente al análisis de luminiscencia. Estos resultados se presentan el la Figura 2. En este experimento E. coli AB1157 y S. typhimurium LT2 se desarrollaron durante 8 horas en LB que contenía glucosa al 0.5%; las condiciones para la producción máxima del factor de señalización. Las células se retiraron del medio de desarrollo LB-glucosa mediante centrifugación y se utilizó un medio de análisis de luminiscencia de V. harveyi estéril para lavar y resuspender los pellets de células. Las células de E. coli AB1157 o S. typhimurium LT2 1 X 106 se agregaron al cultivo de V. harveyi BB170 diluido al inicio del experimento. En la Figura 2, la barra del lado izquierdo en cada serie muestra que la presencia de las células E. coli AB1157 o S. typhimurium LT2 lavadas es suficiente para inducir completamente la luminiscenia en V. harveyi BB170. E. coli AB1157 y S . typhimurium LT2 estimularon la expresión lux en V. harveyi BB170, 821 veces y 766 veces respectivamente. Las alícuotas idénticas de las células E. coli o S. typhimurium lavadas se eliminaron con luz ultravioleta de onda corta antes de su adición al análisis. Cuando las células muertas se incluyeron en el análisis no ocurrió la estimulación de luminiscencia. En la Figura 2 se muestran estos resultados en la barra del lado derecho para cada cepa. Tomados en conjunto los resultados muestran que se produjo el factor estimulatorio mediante las células de E. coli AB1157 y S. typhimurium LT2 por sí mismas durante el curso del tiempo del experimento; el factor no pudo haber venido desde el medio en el cual las células se habían desarrollado. Este factor se libera activamente en el medio por E. coli y S . typhimurium debido a que las células muertas no tienen actividad. E. coli DH5 no produce la actividad de señalización. Los aislamientos clínicos de E. coli y - Salmonella también producen el compuesto de señalización. Se analizaron diez aislamientos clínicos de Salmonella y cinco aislamientos patogénicos de E. coli 0157 y todos produjeron la actividad. Fue concebible que la señal fuera algo de subproducto normal del metabolismo de la glucosa que se difunde simplemente de las células. Este no es el caso, sin embargo, debido a que demostramos que E. coli DH5 la cual es capaz igualmente de utilizar la glucosa como E. coli AB1157 y S . typhimurium LT2 , no produce la actividad de señalización. La Figura ÍA demuestra que a diferencia de E. coli AB1157 y S . typhimurium LT2 , la adición de 10% de fluido de cultivo libre de células preparado a partir de E. coli DH5 desarrollada 8 horas en LB conteniendo 0.5% de glucosa no estimula la producción de luz en V. harveyi BB170. De manera similar, la inclusión de células de E. coli DH5 lavadas viables o eliminadas en el análisis de luminiscencia no estimulan a V. harveyi BB170 para producir luz (Figura 2) . La incapacidad de E. coli DH5 para producir la actividad indica que esta cepa altamente domesticada carece del gen o genes necesarios para ya sea la producción o la exportación de la actividad de señalización. Analizamos otras cepas de laboratorio de E. coli para la actividad de señalización (Tabla 1) . Sólo E. coli DH5 fue completamente defectuosa para producir la señal extracelular.

Tabla 1. Se muestra la inducción de luminiscencia en la cepa informadora BB170 de V. harveyi mediante los fluidos de cultivo libre de células provenientes de V. harveyi , S. typhimurium y E. coli . Los fluidos de cultivo libres de células se prepararon a partir de varias cepas de V. harveyi S. typhimurium y E. coli como se describió y probó para la producción de una sustancia de señalización que pudo estimular la producción de luz en la cepa informadora de V. harveyi BB170. El nivel de stimulación de V. harveyi se normalizó a 100%. Se muestran los datos para el punto de tiempo de 5 horas.

Especies de Cepas Inducción de luminiscencia (%) V. harveyi V. harveyi BB152 100 Salmonella S . typhimurium LT2 237 E. coli E. coli AB1157 106 E. coli DH5 5 E. coli JM109 76 E. coli MG1655 100 E. coli MC4100 93 La glucosa regula la producción y degradación del factor de señalización mediante S . typhimurium LT2. Los fluidos de cultivo libre de células provenientes de células de S. typhimurium LT2 y E. coli AB1157 desarrolladas en LB sin agregar glucosano no estimularon la exprsión de luminiscencia en la cepa informadora, indicando que el metabolismo de la glucosa es necesario para la producción de la señal. Probamos otros carbohidratos y en general, el desarrollo en la presencia de azúcares PTS (ver Postma et al . , en Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, (Biología celular y molecular de la Escherichia coli y Salmonella) (Ed. F. C. Niehardt) , Am. Soc. Microbiol. Washington D.C., pp. 1149-1174, 1996) permitió que E. coli AB1157 y S . typhimurium LT2 produjeran la señal. De los azúcares probados, el crecimiento en glucosa indujo la síntesis del nivel más elevado de actividad. El crecimiento en otras fuentes de carbono, por ejemplo intermediarios de ciclo TCA y el glicerol, no inducen la producción significativa de la actividad de señalización. Probamos sí la presencia de glucosa se requería para que las células continuaran produciendo la señal . La Figura 3 muestra los resultados con S . typhimuri um LT2 desarrollada en LB conteniendo concentraciones de glucosa limitadas a (0.1%) y no limitadas (0.5%) . La Figura 3A muestra que cuando se limita la glucosa S . typhimuri um LT2 produce la señal en la fase media exponencial (después de 4 horas de desarrollo) , pero deja de producir la actividad de señalización una vez que la glucosa se agota del medio. La Figura 3B muestra que cuando la glucosa no se limita, S. typhimurium LT2 produce mayor actividad total y continua produciendo la actividad de señalización a través de toda la fase experimental, con actividad máxima a las 6 horas de desarrollo. Además, la Figura también muestra que la actividad de señalización sintetizada por las células de fase media exponencial se degrada por el tiempo que las células alcanzan la fase estacionaria. En condiciones de limitación de glucosa, ninguna actividad permanece en la fase estacionaria y cuando la glucosa fue abundante, sólo permaneció el 24% de la actividad. Al incrementar las concentraciones de la glucosa en el medio de desarrollo estos resultados no cambiaron, i.e. la actividad se secretó durante el desarrollo medio exponencial y se redujo severamente la actividad restante en los fluidos de cultivo empleados mediante la fase estacionaria. En suma, los resultados presentados en este ejemplo muestran que E. coli y S . typhimurium producen una sustancia de señalización que estimula un sistema de señalización de quorum específico en V. harveyi . Muchas otras bacterias han sido previamente analizadas para tal actividad y sólo raramente se identificaron especies que son positivas para la - producción de este factor (Bassler et al . , 1997 supra) . Además, como se muestra en la presente, la señal de E. coli y S. typhimurium es potente, estas bacterias hacen actividad igual a la de V. harveyi . La degradación de la señal de E. coli y S. typhimurium antes de la fase estacionaria indica que la detección de quorum en estas bacterias se adapta a densidades celulares bajas, sugiriendo que la detección de quorum en E. coli y S. typhimurium se modula de manera que la respuesta para la señal no persiste en la fase estacionaria. Adicionalmente la detección de quorum en E. coli y S. typhimurium se influencia por varios factores ambientales. La producción y la degradación de la señal son sensibles no solo a la fase de desarrollo sino también a la actividad metabólica de las células. Estos resultados indican que la señal de detección de quorum en E. coli y S. typhimurium tiene dos funciones; permite que las células se comuniquen entre sí su fase de crecimiento y también el potencial metabólico del ambiente. Entender la regulación de la detección de quorum en E. coli y S . typhimurium es importante para entender la estructura común y las interacciones cúlula-célula en la patogénesis. En la E. coli y S . typhimurium patogénicas silvestres puede nunca alcanzarse la fase estacionaria debido a que la dispersión es crítica. Es por lo tanto apropiado que la detección de quorum en E. coli y S . typhimurium deba - - estar funcionando a baja densidad celular. Esta situación se encuentra en contraste a la de V. fischeri , el simbionte marino luminiscente, en donde el sistema de detección de quorum es sólo operacional a altas densidades celulares; densidades celulares indicativas de la existencia dentro del órgano de luz especializado del huésped. Los sistemas de detección de quorum específico de V. fischeri y E. coli y S . typhimurium parecen apropiadamente regulados para el nicho en el cual existe cada organismo. En ambos casos, la detección de quorum puede ser útil para comunicar que la bacteria reside en el huésped, no viviendo libre en el ambiente. Existe complejidad adicional en los sistemas de E. coli y S. typhimurium debido a que esta bacteria canaliza tanto la información de densidad celular como las señales metabólicas hacia el circuito de señalización de quorum. De nuevo, las señales que dependen de la información respecto de la abundancia de la glucosa u otros metabolitos podría comunicar a la bacteria que deben sufrir la transición desde un modo de vida libre hacia el modo de existencia dentro del huésped. Bajo todas las condiciones hemos probado, que la actividad de señalización descrita en este ejemplo no se extracta cuantitativamente en los solventes orgánicos y no se une ya sea a una columna de intercambio de catión o de anión. La caracterización preliminar indica que la señal es una polar pequeña (menos de 1,000 MW) pero aparentemente un compuesto orgánico sin cambio. La actividad es estable en ácido y lábil en base, es resistente al calor hasta 80 pero no a 100°C. La purificación de la señal de E. coli , S. typhimurium y V. harveyi se describe en mayor detalle en los siguientes ejemplos. EJEMPLO 2 Regulación de la Producción de la Autoinductora en Salmonella typhimurium En este ejemplo, se aclaran las condiciones bajo las cuales S. typhimurium LT2 produce AI -2, el factor extracelular que estimula la expresión de lux en la cepa informadora del Detector 1", Detector 2+ de V. harveyi . La producción de la molécula de señalización mediante S. typhimurium ocurre durante el desarrollo en los carbohidratos preferidos que, al utilizarse por la bacteria, dando como resultado una disminución en el pH del medio. Disminuyendo el pH del medio de crecimiento en ausencia de una fuente de carbono preferida se induce la producción limitada del factor indicando que las células se encuentran influenciadas tanto por el pH cambiante como por la utilización de la fuente de carbono. La actividad de señalización se degrada por el tiempo que las células alcanzan la fase estacionaria y se requiere la síntesis de la proteína para la degradación de la actividad. El choque osmótico que sigue al desarrollo en una fuente de carbono apropiada incrementa grandemente la - cantidad de actividad presente en los fluidos de cultivo de S . typhimurium. Esta actividad incrementada se debe aparentemente a la inducción de la síntesis de la autoinductora y a la represión de la degradación de la actividad. E. coli y S . typhimurium poseen una proteína llamada SdiA la cual es homologa a LuxR de V. fischeri (Wang et al . , EMBO J. 10: 3363-3372, 1991; Ahmer et al . , J. Bacteriol. 180 : 1185-1193, 1998) . SdiA se propone para responder a un factor extracelular (Sitnikov et al . , Proc. Nati. Acad. Sci USA 93: 336-341, 1996; García-Lara et al . , J. Bacteriol. 178 : 2742-2748, 1996), y se ha demostrado que controla la producción del factor de virulencia en S. typhimurium (Ahmer et al . , 1998, supra) . El análisis establecido más adente muestra que la actividad de señalización de la autoinductora AI -2 no funciona a través de la trayectoria de SdiA. MATERIALES Y MÉTODOS Cepas y Medio. Las cepas bacteriales utilizadas en este estudio y sus genotipos y fenotipos se listan en la Tabla 2.

Tabla 2. Cepas bacteriales; sus genotipos y fenotipos relevantes .

Cepa Genotipo Fenotipo Relevante S. typhimurium LT2 Tipo silvestre E. coli 0157 Tipo silvestre E. coli MG1655 F", ilvG, rfb- 50 Tipo silvestre E. coli C4100 (lac)U169, araD139, rpsL, thi LacZ" E. coli DH5 supE44, hsdRll , recAl, endAl , AI-2" gyrA96 , thi- 1 , elAl V. harveyi BB170 luxN: :Tn5 Detector 1", Detector 2+ V. harveyi BB152 luxL: :Tn5 AI-1", AI-2+ V. harveyi JAF305 luxiV: :Cmr Detector 1", Detector 2+ El caldo luria (LB) contuvo 10 g de Bacto Tryptone (Difco) , 5 g de Extracto de Levadura (Difco) y 10 g de NaCl por litro (Sambrook et al . , 1989) . La receta para el medio del Bioensayo de la Autoinductora (AB) se reportó previamente por (Greenberg et al . , Arch Microbiol. 120 : 87-91, 1979). El medio LM (L-Marina) contiene 20 g de NaCl , 10 g de Bacto Tryptone, 5 g de Extracto de Levadura Bacto y 15 g de Agar por litro (Bassler et al . , 1994, supra). La regulación de la producción de AI -2 similar a la reportada en la presente se observó también con la cepa ATCC del Serovar Typhimurium 14028 de Salmonella entérica, un clínico independiente aislado del Serovar Typhimurium de la Salmonella entérica, y otros nueve serovares de Salmonella entérica (diferente a Typhimurium) . Condiciones de Crecimiento para S . typhimurium LT2 y la preparación de fluidos de cultivo libre de células. Se desarrolló durante la noche S . typhimurium LT2 en caldo LB con agitación a 30°C. Al día siguiente se utilizaron 30 1 del cultivo de la noche para inocular 3 ml del caldo LB fresco. En cultivos que contienen fuentes de carbono adicional en el momento de la inoculación, se agregó 20% de soluciones de las cepas estériles para dar las concentraciones finales especificadas. Después del subcultivo de las células, los tubos se agitaron a 200 rpm a 30°C durante los periodos de tiempo indicados en el texto. Los fluidos del cultivo libre de células se prepararon al retirar las células del medio de cultivo por centrifugación durante 5 minutos a 15,000 rpm en una microcentrífuga. Los sobrenadantes clarificados se pasaron a través de filtros Spinx de acetato de celulosa de 0.2 m (CoStar, Cambridge, MA) mediante centrifugación durante 1 minuto a 8000 X g. Las muestras se almacenaron a -20°C. Los resultados similares a - los reportados en la presente se obtuvieron cuando desarrollamos el S. typhimurium a 37°C. La preparación de los fluidos de cultivo libre de células a partir de las cepas de V. harveyi ya se habían reportado (Bassler et al . , 1993, supra ; Bassler et al . , 1991 , supra) . Análisis de bioluminiscencia dependiente de la densidad. La cepa informadora BB170 de V. harveyi (Detector 1", Detector 2+) , (Bassler et al . , 1993, supra) se desarrolló durante 12 horas a 30°C en el medio AB y se diluyó 1:500 en medio AB fresco. La luminiscencia se midió como una función de la densidad celular al cuantificar la producción de luz en diferentes tiempos durante el desarrollo con un contador de centelleo líquido 1409 Modelo Wallac (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) . La densidad celular se midió al diluir las mismas alícuotas de células utilizadas para medir la luminiscencia, rociando las diluciones sobre el medio LM sólido, incubando las placas durante la noche a 30°C y contando las colonias resultantes al día siguiente. Las unidades de luz relativas son (conteos min"1 ml"1 X 103)/(ml"1 de unidades que forman colonias) . Los sobrenadantes de cultivo libre de células provenientes de las cepas de V. harveyi o S . typhimurium se agregaron hasta una concentración final de 10% (v/v) en el momento de la primer medición. En los experimentos de control, 10% v/v del medio AB, el medio LB o el medio LB que contenía glucosa al 0.5% se agregó en lugar de los fluidos de cultivo libre de células. Análisis de actividad de la autoinductora de S . typhimurium . La actividad de señalización que detecta el quorum liberada por S. typhimurium LT2 se analizó después del desarrollo bajo diversas condiciones. Como se describió anteriormente se agregaron 10 1 de fluidos de cultivo libre de células de S. typhimurium LT2 desarrollado y cosechado a platos de microtitulación de 96 cavidades. La cepa informadora BB170 de V. harveyi se desarrollo durante la noche y se diluyó como se describió anteriormente. Se agregaron 90 1 de las células de V. harveyi diluidas a los pozos que contenían los fluidos de cultivo libre de células de S . typhimurium. Los pozos del control positivo contuvieron 10 1 de fluido de cultivo libre de células de V. harveyi BB152 (AI-1", AI-2+) (Bassler et al . , 1993, supra) . Los platos de microtitulación se agitaron en un agitador giratorio a 200 rpm a 30°C. se midió la producción de luz cada hora utilizando un contador de centelleo líquido Microbeta Plus 1450 Modelo Wallac diseñado para platos de microtitulación (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) . En estos experimentos, la densidad celular no se midió en cada punto de tiempo. Más bien para asegurar que la producción de luz incrementada se debió a una actividad de señalización y no a un componente del medio de desarrollo, la producción de luminiscencia por V. harveyi en pozos que contenían fluidos de cultivo libre de células se comparó a la producida por V. harveyi en los pozos que contenían 10 1 del medio de crecimiento idéntico sólo. Los datos se reportan como veces de estimulación sobre los obtenidos por el medio de crecimiento solo. Factores que controlan la producción de señal en S . typhimurium . S. typhimurium LT2 se desarrolló durante 6 horas en LB que contenía 0.5% de glucosa como se describió anteriormente. Los cultivos de la fase media exponencial se dividieron en varias alícuotas idénticas. Una alícuota de células se desarrolló hasta la fase estacionaria (24 horas a 30°C con agitación) . En las alícuotas restantes, las células se retiraron del medio de crecimiento de LB-glucosa mediante centrifugación durante 5 minutos a 15,000 rpm en una microcentrífuga. Los pellets de células resultantes se resuspendieron a un OD6oo de 2.0 en ya sea LB, LB + 0.5% de glucosa, LB a pH 5.0 o en 0. ÍM NaCl o 0.4M NaCl (en agua). Las células resuspendidas se agitaron a 30°C o 43 °C durante 2 horas. Los fluidos libres de células se prepararon a partir del cultivo de fase estacionaria y de las células que se habían resuspendido e incubado en los diversos medios o las soluciones de choque osmótico. Los fluidos libres de células se probaron para la actividad de señalización en el análisis de actividad de S. typhimurium como se describió anteriormente .

Efectos de la fase de crecimiento, pH, concentración de glucosa y osmolaridad en la producción de la autoinductora por S. typhimurium. S. typhimurium LT2 se desarrolló a 30°C por varias veces en LB conteniendo concentraciones de glucosa limitantes (0.1%) y de no limitación (1.0%). En los tiempos especificados en el texto, el número de células se determinó al cultivar en placas las diluciones de cultivos de S. typhimurium en el medio LB y contar las colonias al día siguiente. El pH de los dos cultivos se midió y se determinó el porcentaje de glucosa remanente en cada cultivo utilizando el análisis Trinder como se describió en el Ejemplo 1. Los fluidos de cultivo libres de células se prepararon a partir de los cultivos de LB-glucosa como se describió arriba. Las mismas células a partir de las cuales se prepararon los fluidos de cultivo libres de células, se resuspendieron en 0.4M NaCl solución de choque osmótico y se agitaron a 200 rpm, a 30 °C durante 2 horas. Se determinó que esta sincronización fue óptima para la producción de la autoinductora. Las células se retiraron de la solución de choque osmótico por centrifugación a 15,000 rpm durante 5 minutos en una microcentrífuga. Los fluidos de choque osmótico libre de células se prepararon a partir de las células resuspendidas exactamente como se describió para los fluidos de cultivo libre de células. La actividad de señalización tanto para los fluidos libres de células como para los fluidos de choque osmótico libre de células se analizó como se describió anteriormente. En los experimentos en los cuales se mantiene el pH a 7.2, las células se desarrollaron en LB + 0.5% de glucosa que contenía 50 nM MOPS a pH 7.2. El pH se ajustó cada 15-30 minutos utilizando ÍM MOPS pH 7.2. En los experimentos realizados en caldo LB a pH 5.0 se mantuvieron entre pH 5.0 y 5.2 con ÍM NaOH. Requerimiento para la síntesis de proteína en producción de señal, liberación y desintegración por S . typ-fiimu iu-p LT2. S . typhimurium LT2 se predesarrolló en Lb conteniendo 0.5% de glucosa a 30 °C a un OD6oo de 2.5 (aproximadamente 6-8 horas) . El cultivo se dividió en cuatro alícuotas idénticas. Dos alícuotas se trataron con 100 g/ml Cm durante 5 minutos a temperatura ambiente después de lo cual las células se cosecharon por centrifugación a 15,000 rpm durante 5 minutos. Un pellet de células tratadas con Cm se resuspendió en 0. ÍM NaCl que contenía 30 g/ml de Cm y el segundo pellet se resuspendió en 0.4M NaCl que contenía 30 g/ml de Cm. Cada uno de estas pellets se resuspendieron hasta un OD6oo final de 2.0. Las dos alícuotas de cultivos restantes no se trataron con Cm. En su lugar las células de estas dos alícuotas se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron en 0. ÍM y 0.4M NaCl exactamente como se describió para las células tratadas con Cm. Las suspensiones de células se incubaron a 30 °C con agitación. En los tiempos - indicados en el texto, se retiraron 1.5 ml de alícuotas de las suspensiones de células y se prepararon los fluidos de choque osmótico libres de células por el procedimiento anteriormente descrito. Análisis del efecto de la autoinductora en la expresión del gen regulado por SdiA. Se amplificó una secuencia que incluye los promotores ftsQlp y ftsQ2p (Wang et al . , 1991, supra) a partir de ADN cromosomal de E. coli MG1655 utilizando los siguientes iniciadores; ftsQlp, 5'-CGGAGATCTGCGCTTTCAATGGATAAACTACG-3' ; ftsQ2p, 5 ' - CGCGGATCCTCTTCTTCGCTGTTTCGCGTG-3' . El producto amplificado contenía tanto los promotores fts como los primeros 14 codones del gen ftsQ flanqueado por los sitios Ba-t-HI y BglII. El producto de PCR ftsQlp2p se clonó en el sitio Ba-nHI del vector pMLB1034 (Silhavy et al., Experimentos con Fusiones de Genes, Cold Spring Harbor Press, 1984) para generar la fusión lacZ que contiene los promotores, sitio de unión de ribosomas y codón de iniciación de ftsQ . Se seleccionaron para análisis adicional, un clon correctamente orientado pMS207 y un clon que contenía el inserto ftsQlp2p en la orientación opuesta, pMS209. Ambos insertos se secuenciaron para asegurarse que no se introdujera ningún error durante la reacción de PCR. Para la regulación de ftsQ en E. coli , se transformaron los plásmidos pMS207 y pMS209 en cepas de E. - coli MC4100 (Silhavy et al., 1984, supra) y los transformantes se desarrollaron durante la noche en LB conteniendo 100 mg/L de ampicilina a 30°C con ventilación. Para la regulación de rck, las cepas de S . typhimurium BA1105 {rck: :MudJ) y BA1305 {rck : :MudJ sdiA) se desarrollaron durante la noche en LB que contenía 100 mg/L de kanamicina a 30°C con ventilación. Durante la noche los cultivos se diluyeron 20 veces en medio fresco y se desarrollaron por 4.5 horas adicionales. En ese tiempo, cada cultivo se dividió en cinco alícuotas idénticas y se agregó a cada alícuota 10% (v/v) de uno de los siguientes: LB, 0.4M NaCl , 0.4M fluidos de choque osmótico del S . typhimurium LT2 , E. coli 0157 o cepa DH5 de E. coli (control negativo) . Los fluidos de choque osmótico se prepararon como se describió anteriormente, seguidos por el pre-crecimiento de S. typhimurium LT2 y E. coli en LB que contenía 0.5% de glucosa durante 6 horas. Las suspensiones de células se incubaron a 30°C durante 2 horas, después de los cual se realizaron las reacciones de -galactosidasa estándar en las muestras (Miller, Un Pequeño Curso en Genéticas Bacteriales, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) . RESULTADOS S. typhimurium LT2 produce una actividad similar a la de la autoinductora. En el Ejemplo 1 se demostró que las cepas de S. typhimurium y E. coli producen una actividad de señalización que estimula la expresión de lux en V. harveyi y la molécula de señalización actúa exclusivamente a través del Sistema 2 de detección de quorum de V. harveyi . La Figura 4 muestra la inducción de luminiscencia en la cepa informadora BB170 del Sistema 2 de V. harveyi (detector 1", Detector 2+) . Las características del comportamiento de detección de quorum de V. harveyi se muestran en el experimento de control (círculos cerrados) . Inmediatamente después de la dilución en medio fresco, la luz emitida por las células de V. harveyi cae rápidamente más de 1,000 veces. A una densidad celular crítica, que corresponde a la acumulación de una concentración crítica de la autoinductora (AI -2) producida endógenamente en el medio, la luminiscencia por las células se incrementa exponencialmente, aproximadamente 3 órdenes de magnitud, para alcanzar de nuevo el nivel de pre-dilución. Además del 10% de fluido de cultivo libre de células preparado a partir de V. harveyi BB152 (AI - 1JAI-2+) causa que la cepa informadora mantenga un nivel elevado de producción de luz seguida de la dilución (círculos abiertos) . La producción de luz incrementada se debe a las células de V. harveyi BB170 que responden a la presencia de AI-2 en los fluidos de cultivo libres de células preparados de la cepa V. harveyi BB152 (Bassler et al . , 1993, supra) . De manera similar, la adición de fluido de cultivo libre de células de S . typhimurium LT2 desarrollada en LB + 0.5% de glucosa - - indujo luminiscencia en la cepa informadora aproximadamente 800 veces más que el nivel del control (cuadrados sólidos) . Ninguna actividad similar a V. harveyi AI-1 se produjo por S . typhimurium LT2 bajo estas condiciones y no existe actividad de AI-1 o AI -2 en LB + 0.5% de glucosa (ver Ejemplo 1) . Factores ambientales que influencian la producción y degradación de la autoinductora en S . typhimurium. El control de producción de la autoinductora en S . typhimurium es diferente de otros sistemas de detección de quorum descritos. La Figura 5A demuestra tres importantes aspectos de la regulación de la producción de la autoinductora en S . typhimurium. Primero, ninguna actividad de la autoinductora se observa cuando S. typhimurium se desarrolla durante 6 horas en LB en la ausencia de glucosa. Segundo, el crecimiento en la presencia de glucosa durante 6 horas da como resultado la producción substancial de la autoinductora (activación de 760 veces de la cepa informadora) . Tercero, la actividad, mientras es detectable, se reduce severamente cuando el cultivo de S. typhimurium se le permite crecer hasta la fase estacionaria (activación de 33 veces de la cepa informadora) . Sometimos a S . typhimurium LT2 a varios tratamientos diferentes incluyendo algunos estreses ambientales a fin de iniciar el entendimiento de qué condiciones favorecen la producción de la autoinductora - versus aquellas que favorecen la degradación de la autoinductora. En el experimento presentado en la Figura 5B, las células de S. typhimurium se indujeron para la producción de señal mediante el pre-crecimiento en LB que contenía 0.5% de glucosa durante 6 horas. Hemos mostrado que bajo estas condiciones, la glucosa no se agota (Surette y Bassler, 1998) . Después de la fase de inducción de crecimiento, el fluido de cultivo se retiró y las alícuotas de las células se resupendieron e incubaron durante 2 horas bajo una variedad de condiciones que se describen en la descripción de la Figura 2. A continuación se prepararon cada uno de estos tres tratamientos de fluidos libres de células y se probaron para la actividad en BB170. Es importante notar que en los resultados presentados en la Figura 5B, el S. typhimurium se pre-indujo para la producción de la autoinductora al inicio del experimento, i.e. su fluido de cultivo libre de células activó a la cepa informadora 760 veces. La Figura 5B muestra que el retiro del fluido de cultivo de pre-crecimiento de estas células y la resuspensión de las células LB sin glucosa, en 0. ÍM NaCl (condiciones hipotónicas) o el choque térmico a 43 °C durante 2 horas, da como resultado ninguna o muy baja producción de la autoinductora. Estos resultados indican que los tratamientos anteriores dan como resultado la terminación de la producción de la autoinductora o degradación de la autoinductora nuevamente liberada o ambos. En contraste a los resultados anteriores, la resuspensión de células pre-inducidas en LB fresco + glucosa da como resultado la producción continua de alto nivel de la autoinductora (activación de 735 veces de la informadora) . De manera similar el pH acídico promueve la producción continua de la autoinductora (activación de 600 veces) y el choque osmótico hipertónico (0.4M NaCl) da como resultado 1,300 veces la inducción de la informadora. Se observó únicamente la actividad de AI -2 incrementada en los fluidos de pH 5.0 o fluidos de choque osmótico de 0.4M NaCl de las células que ya habían producido activamente AI-2, i.e., si la glucosa no se incluyó durante el pre-crecimiento no se produjo actividad medible siguiendo los tratamientos idénticos de 2 horas. Desplazando las células S. typhimurium del LB + glucosa hasta 0.4M NaCl da como resultado una acumulación de actividad de AI -2 hasta un nivel mucho mayor que el observado bajo cualquier otra condición probada. A continuación se muestra que las células de S . typhimurium resuspendidas en 0.4M NaCl incrementan la biosíntesis y/o liberación de la autoinductora y además aparentemente no degradan cantidades significativas de la actividad liberada. Un incremento similar en la producción de AI -2 ocurre cuando las células de S . typhimurium se resuspenden en 0.4M NaCl, 0.4M KCl o 0.8M 1 sucrosa, indicando que el efecto del NaCl en la producción de AI -2, es osmótico no iónico. Este efecto de choque osmótico aparente en las células de S . typhimurium fue extremadamente útil debido a que nos permiten medir la máxima liberación de la actividad de la autoinductora en ausencia o pérdida debido a la degradación. El efecto de la glucosa en la producción de señal en S. t phiipu iu-n. En el Ejemplo 1 mostramos que la presencia continua de glucosa fue requerida por S. typhimurium para producir el factor de señalización que detecta el quorum. Debido a la utilización del azúcar que tanto se incrementa la tasa de crecimiento aunque disminuye el pH del cultivo, analizamos el efecto del metabolismo de la glucosa, disminuyendo el pH e incrementando el número de células en la producción de señal por -3. typhimurium. En el experimento presentado en la Figura 6, medimos la producción de señal, la tasa de crecimiento y el pH en el crecimiento de los cultivos de -3. typhi-t.uriu-t. LT2 que contienen concentraciones de glucosa limitantes (0.1%) y no limitantes (1.0%) . En los datos presentados en la Figura 6, en varios momentos, el nivel de la autoinductora producido tanto en los fluidos de cultivo libres de células como en los fluidos de choque osmótico libres de células 0.4M NaCl correspondientes se midieron y normalizaron por células 1 x 109. Debe notarse que a diferencia de la Figura 5, las células en este - experimento no se pre-indujeron para la producción de señal. La Figura 6 muestra que el modelo de producción y desaparición de la autoinductora observado en los fluidos de choque osmótico 0.4M NaCl imitan al observado en los fluidos de cultivo libres de células. Sin embargo, en cada punto de tiempo en que se produce la inductora, se detecta mucho mayor actividad en los fluidos de choque osmótico que en los fluidos de cultivo libres de célula correspondientes. Bajo condiciones de limitación (0.1%) de glucosa (Figuras 6A, 6C y 6E) , S. typhimurium produce la actividad de señalización entre 2-4 horas (Barras) . Sin embargo, la glucosa se agota completamente a las 4 horas y en ese momento cesa la producción del factor (Figura 6A) . En contraste, cuando las células se desarrollan en 1.0 de glucosa (Figuras 6B, 6D, y 6F) , la glucosa se presenta en el medio a través del experimento completo (Figura 6B) . Bajo estas condiciones, las células continúan la actividad de síntesis durante 12 horas. Similar a los resultados mostrados en la Figura 5 y aquellos reportados en el Ejemplo 1, casi no se observó actividad en los fluidos de cultivo libre de células o en los fluidos de choque osmótico a partir de las células en fase estacionaria a las 24 horas independientemente de la concentración de glucosa. S. typhimurium creció en aproximadamente la misma tasa en ambos medios de alta y baja glucosa durante la fase exponencial. De hecho, el cultivo de S. typhimurium desarrollado en el medio de glucosa alta no alcanzó la densidad celular lograda por el S. typhimurium que creció en el medio de glucosa baja (Figuras 6C y 6D) . El crecimiento celular probablemente se inhibió en este cultivo por el pH drásticamente reducido que ocurrió a partir de la utilización de glucosa incrementada. Estos resultados muestran que el nivel más alto de la actividad producida por S. typhimurium en el LB que contenía 1% de glucosa no se debe al mayor número de células, sino se debe a la inducción de la producción de señal causada por el metabolismo de la glucosa. Las Figuras 6E y 6F muestran el pH de los cultivos de baja y alta glucosa en cada punto de tiempo. Bajo condiciones de baja glucosa (Figura 6E) , el pH del cultivo disminuye inicialmente a medida que las células utilizan la glucosa. Sin embargo, simultáneamente al agotamiento completo de la glucosa, el pH comienza a elevarse. En contraste, bajo condiciones de alta glucosa, el pH del medio disminuye hasta por abajo de pH 5 (Figura 6F) . En los experimentos presentados en la Figura 6, tanto el catabolismo de la glucosa como la disminución del pH ocurren simultáneamente sugiriendo que cualquiera o ambos de estos factores podrían ser responsables de la producción de señal por S. typhimurium. Tanto el metabolismo de la glucosa como el pH bajo controlan independientemente la producción de señal en «S. typhimurium . Para distinguir entre la contribución del metabolismo de la glucosa y la del pH bajo en la producción de señal por S . typhimurium, comparamos la actividad producida por el crecimiento de S. typhimurium en LB que contenía 0.5% de glucosa en un cultivo en el cual el pH se mantuvo en 7.2 (Figura 7A) , para la producida por el crecimiento de S. typhimurium en LB sin glucosa en donde el pH se mantuvo a 5.0 (Figura 7B) .. De nuevo, medimos la señal presente en los fluidos de cultivo libre de células y en los fluidos de choque osmótico 0.4M NaCl. Similar a los datos presentados en la Figura 3, el nivel de señal observado en los fluidos de cultivo libre de células fue inferior al observado en los fluidos de choque osmótico de 0.4M. Cuando S . typhimurium creció en LB + 0.5% de glucosa a pH 7.2 se detectaron cantidades incrementadas de señal de detección de quorum durante 6 horas. A las 6 horas, en los fluidos de choque osmótico 0.4M NaCl , existió una estimulación de producción de luz aproximadamente 550 veces de la cepa informadora BB170 de V. harveyi . Ninguna actividad se produjo después del punto de tiempo de 6 horas. La Figura 7A muestra que el pH se mantuvo entre 7.15 y 7.25 durante 8 horas, después de este tiempo, el pH de los cultivos ya no disminuyó, pero empezó incrementándose presumiblemente debido a que las células agotaron la glucosa.

Permitimos que el pH continuara para incrementar la duración del experimento. También se muestra en la Figura el número de células en cada punto de tiempo. A pH 7.2 las células crecieron rápidamente y alcanzaron una elevada densidad celular. El análisis de los cursos de tiempo similares a aquellos presentados aquí, han mostrado que S . typhimurium no produce ninguna señal cuando crece en LB sin glucosa a pH neutro (ver Ejemplo 1) . Sin embargo, S . typhimurium produjo temporalmente el factor de detección de quorum en ausencia de glucosa cuando creció a pH 5.0 (Figura 7B) . La señal se produjo durante 4 horas y aproximadamente 450 veces la estimulación de la informadora fue la actividad máxima lograda en fluidos de choque osmótico 0.4M NaCl. Se produjo una señal muy pequeña durante 5 horas y la señal se ausentó completamente después de 6 horas de incubación. La Figura 7B muestra que el pH se mantuvo entre 5.0 y 5.2 en este experimento. Obsérvese que las células crecieron mucho más lentamente a pH 5.0 que en pH 7.2. Caracterización preliminar del aparato degradativo de la autoinductora de S . typhimurium . La actividad de detección de quorum producida por S . typhimurium LT2 se degrada por el inicio de la fase estacionaria. Hemos determinado que la actividad contenida en el sobrenadante del cultivo libre de células y de los fluidos de choque osmótico 0.4M NaCl de las células desarrolladas durante 6 horas en Lb + glucosa es estable por al menos 24 horas a 30 °C, indicando que no se presentó actividad degaradativa en estos fluidos libres de células. Además, la mezcla de los fluidos de cultivo libres de células preparados a partir de producir activamente S . typhimurium { i . e . , de los cultivos que crecieron durante 6 horas en LB + glucosa) con fluidos de cultivo libre de células preparados a partir de S. typhimurium que han degradado el factor (í.e. de los cultivos que crecieron durante 12 o 24 horas en LB + glucosa) no dan como resultado la degradación de la actividad. Este resultado indica que la actividad degradativa no se libera, pero en su lugar, se asocia con las células. Mostramos en la Figura 5 que ninguna autoinductora adicional se produce si las células de S. typhimurium que son autoinductoras activamente liberadas se cambian en 0. ÍM NaCl. Sin embargo, cuando estas mismas células se cambian en 0.4M NaCl observamos aún mayor producción de autoinductora. Este resultado implica que la baja osmolaridad podría ser una señal que induce el mecanismo degradativo de la autoinductora. Para iniciar el análisis del mecanismo por el cual la osmolaridad afecta la producción y la degradación de la autoinductora en S. .typhimurium investigamos los requerimientos para la síntesis de proteína en la producción y degradación de señal por S. typhimurium en la alta y baja osmolaridad. Como se describió en la leyenda de la Figura 5, S. typhimurium LT2 creció en LB que contenía 0.5% de glucosa para lograr la inducción máxima de producción de señal después se trató con zO.lM o 0.4M NaCl en la presencia y ausencia de síntesis de proteína. Los fluidos libres de células se prepararon y se probaron para la actividad de señalización. Debido a que la mitad de los fluidos de choque osmótico libre de células contenían cloranfenicol (Cm) , se utilizó V. harveyi JAF350 como la cepa informadora en el análisis de actividad. Esta cepa de V. harveyi contiene un caset Cmr en el gen luxN y su fenotipo es Detector 1", Detector 2+, un fenotipo idéntico al de V. harveyi BB170. Cuando las células se resuspendieron en 0.4M NaCl , el S. typhimurium produjo y liberó cantidades incrementadas de la señal durante 200 minutos (Figura 8A cuadros abiertos) . Después de este tiempo, el nivel de actividad de señalización presente en el fluido de choque osmótico libre de células disminuyó un poco, sugiriendo que se degradó algo de la señal liberada. Se obtuvieron resultados bastante diferentes cuando las células de S. typhimurium se resuspendieron en 0. ÍM NaCl (Figura 8B, cuadros abiertos) . En este caso, en los puntos de los primeros tiempos, el S. typhimurium produjo una cantidad de actividad equivalente a la producida por las células resuspendidas en 0.4M NaCl. Sin embargo, por 120 minutos permaneció sin actividad en el fluido de baja - osmolaridad libre de células. Este resultado indica que bajo condiciones de baja osmolaridad, la actividad liberada se degrada rápidamente. No observamos degradación de la actividad en los fluidos de cultivo libre de células, indicando que la desaparición de la actividad de los fluidos libre de células de baja osmolaridad no se debe a la inestabilidad química de la molécula de señalización. Bajo condiciones de elevada osmolaridad, cuando las células se tratan con Cm para inhibir la síntesis de proteína, solo aproximadamente un cuarto de la actividad se produjo comparado con las células no tratadas. Los cuadros cerrados en la Figura 8A muestran que la inducción de 300 veces de la cepa informadora ocurre en presencia de Cm según se comparó a la inducción de 1,200 veces con las células no tratadas (Figura 8A, cuadros abiertos) . Cuando la S. typhimurium se resuspendió en baja osmolaridad (Figura 8B) aproximadamente tres cuartos de la actividad producida en ausencia de Cm (cuadros abiertos) se produjo en la presencia de Cm (cuadros cerrados) . En la presencia de Cm, la actividad liberada no se degradó durante 30 minutos en alta osmolaridad y solo se degradó parcialmente en baja osmolaridad. Para mostrar que la alta osmolaridad no inhibe la degradación de señal de AI -2, agregamos la actividad contenida en los fluidos de choque osmótico libre de células 0.4M NaCl a las células de S. typhimurium que se habían resuspendido en 0. ÍM NaCl durante 2 horas. Como se muestra en la Figura 8, existen células que pueden degradar el factor. La Tabla 3 muestra que estas células de S. typhi-t.uriu-7? degradaron más del 98% de la actividad de señalización mientras se incubaron a alta osmolaridad. La tabla también muestra que las células de S . typhimurium que se habían incubado en 0.4M NaCl (existen células que producen activamente la señal) no liberaron actividad adicional cuando se resuspendieron en el fluido de incubación de 0. ÍM NaCl obtenido de las células activamente degradadas. Además, la mezcla activa y no activa de los fluidos osmóticos libre de células de 0.4M y 0. ÍM no dieron como resultado la degradación de la actividad en los fluidos 0.4M. Tabla 2. La alta osmolaridad induce la liberación y la baja osmolaridad induce la degradación del factor de señalización de S. typhimurium Tratamiento Veces de inducción de luminiscencia actividad en 0.1M NaCla 4 actividad en 0.4M NaCla 944 células en 0 ÍM + actividad en 17 0.4M NaClb células en 0 4M + actividad en 6 0.1M NaClc a S . typhimurium creció durante 6 horas en LB que contenía 0.5% de glucosa. Las células se formaron en pellets y se resupendieron en ya sea 0. ÍM o 0.4M NaCl durante 2 horas . Los fluidos libres de células se prepararon y se probaron para la actividad. b Las células de S. typhimurium que se habían incubado en 0. ÍM NaCl durante dos horas se formaron en pellets y se resuspendieron en la actividad contenida en los fluidos de choque osmótico clarificados obtenidos de las células suspendidas en 0.4M NaCl durante 2 horas. Los fluidos libres de células se prepararon después de 2 horas de incubación y se analizaron para la actividad de señalización. c Las células de S. typhimurium que se habían suspendido en 0.4M NaCl se formaron en pellets y se incubaron durante 2 horas en los fluidos de choque osmótico clarificados obtenidos de las células suspendidas durante 2 horas en 0. ÍM NaCl. Los fluidos libres de células se prepararon después de 2 horas de incubación y se analizaron para la actividad de señalización.

La homología de LuxR a SdiA no se incluye en la respuesta para la autoinductora AI-2. Un gen homólogo a luxR de V. fischeri se ha identificado en E. coli y S . typhimurium y se llama sdiA . Dos reportes sugieren que en sdiA de E. coli regula modestamente la expresión del locus de división celular ftsQAZ en respuesta a un factor presente en los fluidos de cultivo libre de células (García-Lara et al . , 1996, supra, y en respuesta a unas cuantas autoinductoras de homoserina lactona (Sitnikow, et al . , 1996 supra). La terminación de la secuencia del genoma de E. coli muestra que no existe homólogo de Luxl en E. coli de tal manera que el locus responsable de la biosíntesis del factor (es) soluble (s) hipotetizado (s) no se ha (n) determinado. La sobreexpresión de SdiA en S . typhimurium ha mostrado recientemente que influencia la expresión de varios ORFs localizados en el plásmido de virulencia S. typhimurium (Ahmer, et al . , 1998, supra) . Al igual que en los estudios de E. coli , la actividad SdiA en S. typhimurium se propone para modularse por un factor extracelular. Fue posible que la autoinductora AI -2 que habíamos caracterizado en S . typhimurium y E. coli actuara a través de SdiA. Probamos si AI -2 tuvo un efecto en los genes regulados por SdiA en E. coli y S. typhimurium. En E. coli , analizamos un informador ftsQlp2p-lacZ y en S . typhimurium analizamos una fusión rck: :MudJ tanto en un ambiente sdiA+ como un sdiA" Probamos los efectos de la adición de LB, 0.4M NaCl, fluidos de choque osmótico en 0.4M NaCl que contenían actividad de AI-2 a partir de S. typhimurium LT2 , E. coli 0157 y fluidos de choque osmótico en 0.4M NaCl a partir de E. coli DH5. Hemos mostrado previamente en el Ejemplo 1 que DH5 no produce actividad AI -2 bajo nuestras condiciones de crecimiento. Para los experimentos de E. coli determinamos que MC4100 y MC4100/pMS209 (que contiene ftsQlp2p en la orientación correcta) no tuvo actividad de la -galactocidasa medible. El nivel de la -galactocidasa producido por MC4100/pMS207 (que contiene la fusión ftsQlp2p-lacZ) fue aproximadamente de 20-30 unidades Miller y su nivel de actividad no varió bajo ninguna de las condiciones aquí probadas. Este nivel de actividad de la fusión fue comparable a la reportada previamente (Sitnikow et al . , 1996, supra; García-Lara et al . , 1996, supra) . En los estudios de Sdia de S . typhimurium, similares a los de Ahmer et al . , (1998, supra) , obtuvimos ~30 unidades Miller de actividad de rck: :MudJ en el ambiente sdiA+ y este nivel se redujo a 10 unidades en el ambiente sdiA". No ocurrió cambio en la producción de -galactocidasa seguido por la adición de AI -2 de E. coli o S . typhimurium. Estos resultados indican que, si existe un factor extracelular que module la actividad de SdiA, bajo las condiciones que hemos probado no es AI-2. EXPOSICIÓN Detección del Quorum en E. coli y S. typhimurium . Hemos desarrollado un bio-ensayo heterólogo que nos permite detectar un factor de señalización extracelular producido por S . typhimurium. El factor imita la acción de AI-2 de la bacteria de detección de quorum V. harveyi y actúa específicamente a través del detector LuxQ del sistema de señalización 2 de V. harveyi . Los resultados que utilizan las fusiones lacZ para los promotores ftsQ y rck indican que, bajo nuestras condiciones de análisis, el factor de detección de quorum AI-2 no señala a SdiA, al menos con respecto a la regulación de estos genes. El sistema de detección de quorum AI -2 se involucra por lo tanto en una trayectoria de transducción de señal de S. typhimurium y E. coli diferente de la(s) previamente investigada (s) . S. typhimurium LT2 produce una cantidad de actividad aproximadamente equivalente a la producida por V. harveyi . Observamos aproximadamente estimulación de 800 veces de la cepa informadora de BB170 de V. harveyi después de la adición de 10% de fluidos de cultivo libre de células de S . typhimurium. La sincronización de la inducción de lux y la forma de la curva de respuesta de V. harveyi a la señal de S. typhimurium son indistinguibles de aquella de V. harveyi que responde a su propia AI -2. Además hemos purificado exitosamente de manera parcial tanto la molécula de señal de V. harveyi AI-2 como la de S . typhimurium, utilizando procedimientos de purificación idénticos. Estos dos resultados nos conducen a creer que la molécula de señalización de S. typhimurium es idéntica o relacionada muy cercanamente a la de AI -2 de V. harveyi .

- Las condiciones de Crecimiento Regulan la Producción de Señal y la Degradación en S. typhimurium . En este ejemplo caracterizamos adicionalmente la regulación de la actividad de señalización en S. typhimurium LT2. La acumulación de actividad de señalización en los sobrenadantes del cultivo de S. typhimurium es máxima durante la fase media exponencial cuando las células se encuentran utilizando activamente la glucosa en un medio rico. Bajo estas condiciones de desarrollo, la utilización de glucosa se acompaña por una caída rápida en el pH del cultivo. Los resultados demuestran que ya sea el metabolismo de la glucosa o el pH bajo es suficiente para inducir a S . typhimurium LT2 a producir el factor de detección de quorum indicando que tanto la glucosa como la acidez generan señales independientes para la producción de la autoinductora. En la presencia de glucosa, cuando el pH no se mantiene, probablemente tanto la disminución de pH como la presencia de una fuente de carbono apropiada contribuyen a la regulación de detección de quorum en S. typhimurium. Los resultados también muestran que la producción de la autoinductora cesa antes de la fase estacionaria en la presencia de glucosa a pH natural y en la ausencia de glucosa a pH bajo. Por lo tanto, una combinación de condiciones acídicas y la ausencia de glucosa no se requiere para insertar S . typhimurium en la producción terminada de la autoinductora.

Además de la glucosa, el desarrollo en varios otros carbohidratos también induce la producción de la actividad de señalización. Estos incluyen tanto azúcares PTS (fructosa, mañosa, glucitol y glucosamina) como sin PTS (galactosa y arabinosa) . Estos hallazgos eliminan un rol exclusivo para los PTS en la regulación de la biosíntesis de la autoinductora. Cuando S . typhimurium LT2 se desarrolló en varias otras fuentes de carbono (acetato, glicerol, citrato y serina) no se observó significativa acumulación de actividad de señalización. Hemos demostrado en el Ejemplo 1 que la señal no es cualquiera de un número de sustancias conocidas a secretarse por S . typhimurium incluyendo los principales productos de la fermentación acida mezclada. Claramente, la producción de la molécula de señalización se regula de manera precisa por las células y se favorece bajo condiciones de desarrollo en los carbohidratos preferidos por razones que aún no entendemos. La identificación de la molécula de señalización y la clonación del gen (es) biosintético (s) ayudará a un entendimiento más completo del proceso de regulación. Los resultados presentados en este ejemplo muestran que, en contraste a otros sistemas de señalización de quorum, la señal de -5. typhimurium no se acumula en la fase estacionaria. Al menos dos procesos competidores contribuyen a esta regulación; la producción de la autoinductora y la degradación de la autoinductora. En este ejemplo definimos la producción de la autoinductora como un incremento en la actividad de señalización presente en los fluidos libres de células. Reconocemos que un incremento en la actividad podría resultar de la liberación de la autoinductora nuevamente biosintetizada, de la liberación de la autoinductora almacenada, de la represión de la degradación de la autoinductora o alguna combinación de estas actividades. Definimos la degradación de la autoinductora como la desaparición de la actividad de señalización proveniente de los fluidos libres de células. Esta desaparición puede deberse a la destrucción de la autoinductora, a la re-absorción de la autoinductora o una combinación de estas actividades. Es posible que bajo alguna de estas condiciones utilizadas en nuestros estudios, la producción de la autoinductora y la degradación de la autoinductora ocurran simultáneamente. Sí es este el caso, la actividad detectada en los fluidos de cultivo libre de célula es una medida de cuál de estos procesos, producción o degradación, predomina. Estos hallazgos indican que la detección de quorum en S . typhimurium se regula de tal manera que la señal y presumiblemente la respuesta a la señal no persisten en la fase estacionaria. Debido a la utilización de un carbohidrato preferido que también se requiere para la producción de señal, la detección de quorum en S. typhimurium - puede utilizarse tanto para medir la densidad celular como para medir el potencial del ambiente para el desarrollo. Producción de Señal de Influencias de Osmolaridad y Degradación en S. typhimurium . Las células de S. typhimurium que se encuentran produciendo activamente señal pueden estimularse adicionalmente para producir señal mediante tratamientos ambientales específicos, indicando que varias trayectorias reguladoras independientes canalizan información hacia la síntesis de la autoinductora. Uno de estos tratamientos es el choque osmótico de 0.4M NaCl. Cuando la autoinductora que produce células S . typhimurium se encuentra resuspendida en 0.4M NaCl , las células liberan significativamente mayor actividad cuando tienen la capacidad de sintetizar proteínas que cuando la síntesis de proteína se encuentra bloqueada. Además, la degradación de la señal también requiere la síntesis de proteínas. Estos resultados tienen varias implicaciones. Primero, en la presencia de Cm, S. typhimurium resuspendida tanto a alta como baja osmolaridad produce una cantidad similar de actividad. Este resultado indica que, después del desarrollo en la presencia de glucosa, las células de S. typhimurium tienen una capacidad predefinida para producir actividad de señalización (y/o liberar actividad ya sintetizada a partir de las células) . Segundo, cuando las células se encuentran resuspendidas a alta osmolaridad, la producción de señal se incrementa bastante más allá de este nivel. Este incremento en la producción de señal requiere la síntesis de proteínas e interpretamos que esto significa que la alta osmolaridad es una señal ambiental que induce a S. typhimurium a sintetizar más de los aparatos biosintéticos necesarios para la producción y/o liberación de la señal. Tercero, bajo condiciones de baja osmolaridad observamos una liberación inicial de la actividad seguida por una rápida degradación de la actividad. Y, la degradación de señal requiere de la síntesis de proteínas debido a que no se observa en la presencia de Cm. Estos resultados implican que el ambiente ha cambiado de condiciones que favorecen la producción de la autoinductora (LB + un carbohidrato preferido o alta osmolaridad) a condiciones en donde la producción de la autoinductora no se favorecen (baja osmolaridad o ausencia de una fuente de carbono preferida) . Este cambio ambiental induce a S . typhimurium a sintetizar la(s) proteína (s) requerida (s) para la degradación de la actividad de señalización. Cuando las células de S . typhimurium se incubaron en 0.4M NaCl no ocurrió degradación significativa de la actividad durante 200 minutos. Este resultado indica que cualquiera de las proteina (s) degradada (s) necesaria (s) no se sintetizaron bajo estas condiciones o alternativamente se instala el aparato de degradación, pero su actividad se inhibe por la alta osmolaridad. Los resultados demuestran que la alta osmolaridad no inhibe la degradación de señal, debido a que las células inducidas para degradar la actividad no lo pueden hacer en alta osmolaridad. Por lo tanto, ocurre la persistencia de la actividad en las muestras de alto NaCl debido a que la maquinaria de degradación no se sintetiza, no se debe a que se inhibe su actividad. Es difícil determinar de manera precisa cuando las células de S . typhimurium son productoras de autoinductora y cuando son degradadoras de la autoinductora debido a que ambos procesos pueden ocurrir simultáneamente. Sin embargo, parece que no ocurre degradación o es muy baja en la osmolaridad alta y la conversión de las células provenientes de las productoras de señal total a degradadoras de señal total ocurre en baja osmolaridad y requiere la síntesis de proteínas. Nuestra caracterización preliminar del proceso degradativo indica que es célula asociada, debido a que la actividad de la autoinductora es estable en sobrenadantes de cultivo libre de células durante periodos de tiempo prolongados y que combinando los fluidos de cultivo libre de células activo con inactivo o los fluidos libres de células de alta y baja osmolaridad activos e inactivos no se promueve la degradación de la autoinductora. Hemos aislado recientemente un mutante de S. typhimurium que no produce la actividad AI -2. Sí este mutante retiene la capacidad para - degradar a la autoinductora, su análisis será informativo para entender la sincronización de la degradación y para identificar las señales que inducen la maquinaria degradativa. Actualmente intentamos aislar mutantes de S. typhimurium capaces de la producción de la autoinductora pero incapaces de la degradación de la autoinductora. El rol para la detección de quorum en la patogénesis de la Salmonella . Las observaciones aquí presentadas sobre la regulación de la producción y degradación de señal por S . typhimurium LT2 implican un rol para la detección de quorum en la patogénesis de la Salmonella . Las condiciones que favorecen la producción de señal (nutrientes ricos, alta osmolaridad y bajo pH) son aquellas que probablemente se encuentran en la primera interacción de un patógeno entérico con su huésped. Las condiciones que favorecen la degradación de la señal (nutrientes pobres, baja osmolaridad) son aquellas más probablemente encontradas a medida que los patógenos salen del huésped. La colonización inicial del huésped puede ser un esfuerzo concertado entre una población de células coordinadas a través de este sistema de señalización célula a célula. Otras señales que aún no hemos probado, pudieran también regular la señalización de quorum en S. typhimurium. Estas pueden representar trayectorias de señalización independientes o sobrepuestas involucradas en la patogénesis.

Hemos aislado mutantes de S. typhimurium para probar estas hipótesis. Finalmente, las patogénesis de la Salmonella es un proceso dinámico de interacción entre el huésped y la bacteria metabólicamente activa. Consistente con el rol para la detección de quorum en la patogénesis, nuestra evidencia sugiere que este sistema de detección de quorum no funciona durante la fase estacionaria. Hemos mostrado que la molécula de señalización no se produce durante la fase estacionaria y además, que las señales salientes se degradan. Quizá la detección de quorum es crítica para que S . typhimurium sufra la transición entre un huésped asociado y una existencia de vida libre. EJEMPLO 3 Detección de Quorum en Escherichia coli , Salmonella Tphi-7-u iupz y Vibrio harveyi : Una Nueva Familia de Genes Resposables de la Producción de la Autoinductora En este ejemplo reportamos el análisis de un gen responsable de la producción de AI -2 en V. harveyi , E. coli y S . typhimurium. El gen identificado en las tres especies de bacteria es altamente homólogo y proponemos que estos genes definan una nueva familia de proteínas involucradas en la producción de la autoinductora. Los genes, que nombramos luxSv.h. , luxSE.c. y l xSs. t. se han identificado en muchas especies de bacteria mediante los proyectos de secuenciación de genoma, pero hasta ahora no se ha ascrito ninguna función - a este gen en ningún organismo. Los genes luxS no portan homología para ningún otro gen conocido a involucrarse en la producción de la autoinductora. MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacteriales, medio y técnicas de ADN recombinante . V. harveyi BB120 es la cepa tipo silvestre (Bassler et al . , 1997, supra) . La cepa LT2 de S. typhimurium se obtuvo por el Dr. K. Hughes (Universidad de Washington) , S . typhimurium 14028 es el Organismo 14028 de la cepa ATCC: Salmonella choleraesuis. E. coli 0157 :H7 es un aislado clínico suministrado por el Dr. Paddy Gibb (Universidad de Calgary) . El caldo Luria (LB) contuvo 10 g de Bacto Tryptone (Difco) , 5 g de Extracto de Levadura (Difco) y 10 g de NaCl por litro. La receta para el medio del Bioensayo (AB) de la Autoinductora se ha reportado previamente (Greenberg, E.P. Hastings, J.W. y Ulitzur, S. (1979) Arch. Microbiol. 120, 87-91) . Cuando se especificó, la glucosa se agregó de una cepa estéril al 20% hasta una concentración final de 0.5%. Los antibióticos se utilizaron a las siguientes concentraciones (mg/L) : Ampicilina (Amp) 100, Cloranfenicol (Cm) 10, Gentamicina (Gn) 100, Kanamicina (Kn) 100 y Tetraciclina (Tet) 10. El aislamiento de ADN, el análisis de restricción y la transformación de E. coli se realizaron como se describe por Sambrook et al . Las pruebas para el análisis de Southern Blot se etiquetaron utilizando el sistema de etiquetación de ADN Multiprime de Amersham. La secuenciación se llevó a cabo utilizando un aparato de secuenciación de Applied Biosystems. El archivo genómico de V. harveyi BB120 se construyó en el cósmido pLAFR2 como se describió por (Bassler et al . , 1993, supra) . Se ha reportado el método para la mutagénesis de Tn5 de los genes de V. harveyi clonados y la técnica de reemplazo alélico para insertar genes mutados de Tn5 en el cromosoma de V. harveyi (Bassler et al . , 1993, supra) . Análisis de Bioluminiscencia. El bioensayo de AI -2 utilizando la cepa informadora BB170 de V. harveyi (Detector 1", Detector 2+) se han tratado en los ejemplos previos. Los fluidos de cultivo libre de células de las cepas de V. harveyi , E. coli o S. typhimurium a probarse para la actividad de AI -2 se prepararon como se describió anteriormente y se analizaron a 10% (v/v) . La actividad AI -2 se reportó como las veces de inducción de la cepa informadora a través del ambiente o como el porcentaje de la actividad obtenida a partir del fluido de cultivo libre de células de V. harveyi BB120 (tipo silvestre) . Mutagénesis y análisis del gen de producción de AI- 2 en S. typhimurium LT2. Los mutantes de inserción MudJ de S . typhimurium LT2 se generaron utilizando un sistema de suministro de fago P22 como se describió (Maloy, S. R. , Steward, V. J. y Taylor R. K. (1996) Análisis genético de la bacteria patogénica: un manual de laboratorio. Cold Sring - - Harbor Laboratory Press, Cold Sring Harbor, N.Y.). Después del crecimiento hasta la fase exponencial media en LB conteniendo 0.5% de glucosa, los mutantes de inserción de S . typhimurium se probaron para la producción de AI -2 utilizando el bioensayo de V. harveyi BB170. El sitio de la inserción de MudJ que inactivo la función de producción de AI-2 en S . typhimurium se identificó por amplificación y secuenciación de PCR del ADN cromosamal en la unión de inserción. Se utilizó un procedimiento de amplificación de dos etapas (Caetano-Annoles, G. (1993) Meth. Appl. 3, 85-92). En la primera reacción de PCR, se utilizó el iniciador arbitrario 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNACGCCC-3' , y el iniciador específico de MudJ 5' -GCACTACAGGCTTGCAAGCCC-3 ' . A continuación, se utilizó 1 1 de esta reacción de PCR como el modelo en una segunda amplificación de PCR empleando un segundo iniciador arbitrario (5' -GGCCACGCGTCGACTAGTCA-3 ' ) y otro iniciador específico MudJ (5' -TCTAATCCCATCAGATCCCG-3 ' ) . El producto de PCR de la segunda reacción se purificó y secuenció. Clonación y secuenciación de los genes de producción de AI-2 de E. coli MG1655, E. coli 0157:137, y E. coli DH5. La secuencia de ADN obtenida de la clasificación de S . typhimurium LT2 MudJ se utilizó para investigar las secuencias del genoma de E . coli MG1655 para identificar la región E. coli correspondiente (Blattner et al . , Science 277, - - 1453-1462, 1997). El gen identificado del proyecto de secuenciación tuvo la designación ygaG. Los iniciadores que flanquearon el gen ygaG y los sitios de restricción incorporados se diseñaron y utilizaron para amplificar los genes de E. coli MB1655, E. coli 0157 :H7 y E. coli DH5. Los iniciadores utilizados son : 5' -GTGAAGCTTGTTTACTGACTAGATC-3 ' y 5' -GTGTCTAGAAAAACACGCCTGACAG-3' . Los productos de PCR se purificaron, digirieron y clonaron en pUC19. En cada caso, los productos de PCR de las tres reacciones independientes se clonaron y secuenciaron. RESULTADOS Identificación y clonación de los genes responsables de la producción de AI-2 en V. harveyi . Hemos tratado en ejemplos previos que, a diferencia de muchas otras cepas de E. coli , la cepa de E. coli DH5 no produce una molécula de señal de AI-2 que pueda detectarse por V. harveyi . Por lo tanto, razonamos que podríamos utilizar E coli DH5 como un mutante para clonar los genes de producción de AI -2 de V. harveyi . Un archivo de ADN genómico de V. harveyi BB120 tipo silvestre se transformó en cepa DH5 de E. coli y las transformaciones se clasificaron para la producción de AI -2 en el bioensayo de detección de AI -2 de V. harveyi BB170. El archivo consistió de 2,500 ciónos conteniendo cada uno aproximadamente 25 kb de ADN genómico de V. harveyi . Se identificaron cinco ciónos DH5 que dieron como resultado más de 300 veces de estimulación de la cepa informadora en el bioensayo. El ADN cósmido recombinante de los cinco ciónos de JE?, coli DH5 que producen AI-2 se analizaron mediante análisis de restricción y Southern Blotting. Los cinco cósmidos contuvieron un subconjunto de sobreposición de fragmentos de restricción genómicos de V. harveyi idénticos, indicando que habíamos clonado al mismo varios locus varias veces. Un cósmido, llamado pBB2929 se seleccionó para análisis adicional. Se llevó a cabo mutagénesis aleatoria utilizando transposón Tn5 en el cósmido pBB2929 y se transformaron subsecuentemente grupos de cósmidos que albergan inserciones Tn5 en E. coli DH5. Probamos 962 cepas de E. coli DH5/pBB2929 : :Tns individuales para la pérdida de la capacidad de producir AI-2. Se identificaron cuatro cepas de E. coli DH5 que albergaban inserciones Tn5 en pBB2929 que fallaron para producir AI-2. Representamos las ubicaciones de estas inserciones Tn5 en pBB2929 y encontramos que las cuatro inserciones del transposón residieron en el mismo fragmento 2.6 kb Hindlll de ADN genómico de V. harveyi (Figura 9A) . Se digirió el cósmido pBB2929 con Hindlll y se subclonaron los 8 fragmentos resultantes en ambas orientaciones en pALTER (Promega) . Los subclonos pALTER se transformaron en E. coli DH5 y subsecuentemente se probaron para la producción de AI-2. Las únicas cepas capaces de - producir AI-2 contuvieron el fragmento 2.6 kb fíindlll identificado en la mutagénesis de Tn5. Este fragmento se secuenció y solo pudo identificarse una estructura de lectura abierta (ORF) y su ubicación correspondió a las posiciones del mapa de las cuatro inserciones de Tn5 que eliminaron la producción de AI-2. Nombramos la ORF luxSv.h. (Figura 9A) . Mutagénesis de luxSv.h. en V. harveyi . Analizamos los efectos de las mutaciones nulas de luxSv.h. en la producción de AI-2 en V. harveyi . Las cuatro inserciones de Tn5 que se representaron para el gen luxS?.h. y el control de inserción Tn5 adyacente al locus luxSv.h. se transfirieron a las ubicaciones correspondientes en el cromosoma de V. harveyi BB120 para hacer las cepas MM37, MM30, MM36, MM38 y MM28 respectivamente (Figura 9A) . Se utilizó Southern Blotting para confirmar la colocación correcta de las cinco inserciones de Tn5 en el cromosoma de V. harveyi . Las cuatro cepas de inserción luxSv.h. '• :Tn5 de V. harveyi se probaron para su capacidad de producir AI -2 y las cuatro cepas dieron resultados idénticos. En la Figura 10A, mostramos los fenotipos de la producción de AI -2 de las cepas de inserción Tn5 de control tipo silvestre MM28 y una cepa de inserción luxSv.h. • :Tn5 representativa MM30. V. harveyi MM28 y MM30 se desarrollaron a elevada densidad celular, después de lo cual se prepararon los fluidos de cultivo libre de células. Los fluidos de - cultivo se analizaron para la actividad de AI -2 para la capacidad de inducir luminiscencia en la cepa detectora BB170 de AI-2. La Figura 10A muestra que la adición de los fluidos de cultivo a partir de la cepa de inserción Tn5 de control MM28 induce la luminiscencia en la informadora 780 veces, aunque los fluidos de cultivo de la cepa de inserción luxSv.h. : :Tn5 MM30 no inducen la expresión de luminiscencia en Ja informadora. Por lo tanto, una mutación nula en luxSv.h. en V. harveyi elimina la producción de AI-2. Identificación y análisis de los mutantes de producción de la autoinductora de S . typhimurium . A fin de identificar el gen responsable para la producción de AI-2 en S . typhimurium, analizamos S . typhimurium LT2 aleatoriamente mutagenizada utilizando el transposon MudJ (Maloy et al . , 1996, supra) . Diez mil mutantes de inserción de S. typhimurium LT2 se analizaron para la producción de AI -2 en el bioensayo de V. harveyi BB170. Un mutante de inserción MudJ de S . typhimurium (cepa CS132) se identificó que carecía de AI -2 detectable en fluidos de cultivo en la fase exponencial media. La Figura 10B muestra los fenotipos de producción de AI -2 de la cepa LT2 de S . typhimurium y la cepa CS132 de inserción de MudJ correspondiente. Las cepas se desarrollaron hasta la fase exponencial media en LB que contenía glucosa, y los fluidos de cultivo libre de células se prepararon y analizaron para AI-2. Los fluidos de cultivo de S. typhimurium LT2 indujeron 500 veces la cepa informadora, mientras los fluidos de cultivo de la cepa CS132 no contenían actividad de AI-2. Además, la cepa CS132 no produce AI -2 bajo ninguna de las condiciones de crecimiento que nosotros reportamos previamente que induce la producción de AI-2 en S . typhimurium (no mostrada) . El sitio de la inserción MudJ en S. typhimurium CS132 se determinó por la amplificación de PCR seguida por la secuenciación de la 110 bp del ADN cromosomal adyacente al transposon. Esta secuencia se utilizó para buscar las bases de datos para la homología de ADN. La secuencia se comparó a un sitio (89/105bp de identidad) en el genoma de E. coli MG1655 que corresponde a un ORF de función desconocida denotado ygaG (Blattner et al . , 1997, supra) . En el cromosoma, el gen ygaG de E. coli está flanqueado por los genes gshA y emrB (Figura 9B) el gen ygaG se transcribe desde su propio promotor que se localiza corriente arriba del gen, indicando que no es un operón con gshA . El gen e-7.rB se transcribe en la dirección opuesta. Amplificamos PCR en la región ygaG del cromosoma de E. coli 0157 :H7 y --.. coli MG1655 y los dos genes ygaG de E. coli se clonaron en pUC19. Complementación de los mutantes de AI-2" de S. typhimurium y E. coli . Probamos si el gen ygaG de E. coli 0157 :H7 y el gen luxSv.h de V. harveyi podrían restaurar la - - producción de AI-2 en las cepas de AI-2" de S. typhimurium CS132 y E. coli DH5. En la Figura HA, demostramos la actividad de AI -2 producida por V. harveyi BB120, E. coli 0157 :H7 y S. typhimurium LT2 tipo silvestre. En esta figura, el nivel de actividad de AI -2 presente en los fluidos de cultivo libre de células de V. harveyi BB120 se normalizó a 100% y las actividades de los fluidos de cultivo libre de células de E. coli y S. typhimurium se compararon a esta. En este experimento, E. coli 0157 :H7 produjo 1.5 veces y S . typ i-77uriu-77 LT2 produjo 1.4 veces más actividad de AI-2 que V. harveyi BB120 (i.e. 150% y 141% respectivamente). Las Figuras 11B y 11C muestran que la complementación de AI -2 resulta de la S. typhimurium CS132 y E. coli DH5. La Figura 11B demuestra que la inducción del gen ygaG de E. coli 0157 :H7 en S . typhimurium CS132 restaura la producción de AI -2 más allá del nivel de producción de S . typhimurium tipo silvestre (i.e., 209% de actividad). La comparación de los datos en las figuras HA y 11B muestran que el gen ygaG de E. coli en S. typhimurium da como resultado en la producción de AI -2 que excede la producida por E. coli 0157 :H7 in vivo . La inducción del gen luxSv.h. de V. harveyi en S. typhimurium da como resultado la producción de AI -2 ligeramente menor que el nivel producido por V. harveyi BB120 tipo silvestre (i.e., 73% del nivel de V. harveyi BB120) . La Figura 11C muestra que E. coli DH5 - también se complementó para la producción de AI -2 tanto por los genes de producción de AI-2 de E. coli 0157 :H7 clonado como de V. harveyi BB120. Sin embargo, la inducción del ygaG de E. coli 0157 :H7 y de luxSv.h de V. harveyi . en E. coli DH5 dio como resultado únicamente 31% y 43% de la actividad de AI-2 de V. harveyi BB120 respectivamente. Las Figuras 11B y 11C muestran que los vectores de control producidos no tienen actividad en los experimentos de complementación. Análisis de los genes de producción de AI-2 a partir de V. harveyi , E. coli y S. typhimurium . Secuenciamos luxSv.h. del gen de producción de AI -2 a partir de los loci V. harveyi BB120 y ygaG de E. coli 0157 :H7, E. coli MG1655 y E. coli DH5. Las secuencias de proteína transladadas codificadas por los ORF de ygaG se muestran en la Figura 12 y se alinean con la secuencia de proteína LuxS transladada a partir de V. harveyi . Los aminoácidos subrayados sin resaltar indican los residuos en las proteínas de E. coli que difieren de la proteína LuxS de V. harveyi . Los loci ygaG provenientes de E. coli codifican las proteínas que son altamente homologas entre sí y también al LuxS de V. harveyi . Las proteínas ygaG de E. coli MG1655 y E. coli 0157 :H7 son idénticas 77% y 66% al LuxS del V. harveyi BB120. La secuencia de ADN que determinamos por ygaG de E. coli 0157 :H7 difiere en cinco sitios de las secuencias reportadas (y las nuestras) para el gen ygaG de E. coli MG1655. Cuatro de los cambios son silenciosos, el quinto da como resultado una alteración conservadora de Ala a Val en el residuo de aminoácidos 103 en la proteína de E. coli 0157 :H7. La identificación del locus ygaG en E. coli MG1655 y E. coli 0157 : H7 nos permiten investigar el defecto de producción de AI-2 en E. coli DH5. E. coli DH5 posee el gen ygaG porque pudimos amplificar PCR en esta región a partir del cromosoma utilizando los mismos iniciadores que nosotros empleamos para amplificarlo a partir de E. coli MG1655 y E. coli 0157 :H7. El examen del promotor ygaG del E. coli DH5 muestra que es idéntico al de E. coli MG1655, indicando que el defecto de AI -2 en E. coli DH5 no se debe simplemente a la transcripción disminuida de ygaG. Sin embargo el análisis de secuencia de la región que codifica ygaG de E. coli DH5 muestra que existe una cancelación del par de bases G-C y una transversión de T a A en el bp 222 y 224 respectivamente. La mutación del cambio de estructura que resulta de la cancelación G/C causa truncación prematura en la proteína E. coli DH5. La Figura 12 muestra que la proteína de E. coli DH5 truncada es de 111 aminoácidos, mientras que las proteínas de E. coli MG1655 y E. coli 0157 :H7 son de 117 residuos. Veinte aminoácidos alterados se trasladan después del cambio de estructura y antes de la terminación de la proteína. Nuestros resultados de complementación (Figura 11) demuestran que el defecto de producción de AI -2 en E. coli - DH5 es recesivo en la expresión trans de ygaG, que es consistente con que el defecto se debe a una mutación nula causada por el cambio de estructura en el gen ygaG de E. coli DH5. Investigamos la base de datos de S. typhimurium utilizando la secuencia que obtuvimos adyacente ala MudJ que inactiva la función de producción de AI -2 en S. typhimurium CS132. Se identificó una comparación perfecta (110/110 bp) para los fragmentos B_TR7095.85-T7 en las bases de datos de secuenciación de genoma de S. typhimurium LT2 (Centro de Secuenciación de Genoma Universidad de Washington St . Louis) . Sin embargo, la secuencia de la base de datos de S . typhimurium LT2-ygaG se encuentra incompleta (Figura 12) . La secuencia trasladada se compara a las secuencias de E. coli y V. harveyi iniciando en el residuo 8 de los aminoácidos. La secuencia trasladada muestra que la proteína de S. typhimurium es 75% idéntica al LuxS de V. harveyi . Con objeto de alinear la secuencia de S. typhimurium con la proteína LuxS de V. harveyi , corregimos tres errores aparentes de cambio de estructuras en la secuencia de base de datos. Considerando que sólo los datos de secuencia al natural y sin anotación, se encuentran actualmente disponibles para S. typhimurium, predecimos que la proteína de S . typhimurium contiene 7 aminoácidos más y que las mutaciones de cambio de estructura son errores de - secuenciación. No tuvimos éxito en la amplificación de PCR ya sea del gen ygaG de S . typhimurium 14028 o S . typhimurium LT2 utilizando los iniciadores diseñados para E. coli , así que aún no tenemos la secuencia completa del gen de S . typhimurium. Los resultados establecidos anteriormente indican que el gen que identificamos y analizamos codifica una nueva familia de proteínas responsable de la producción de la autoinductora. Los miembros de esta nueva familia de genes, referidos en la presente como LuxS, son altamente homólogos entre sí pero no para cualquier otro gen identificado. El producto codificado de los genes LuxS cataliza una etapa esencial en la síntesis de la molécula de señalización de la presente invención. EJEMPL04 Construcción de una Cepa Informadora de V. harveyi de AI-2" del Detector 1" Se han construido mutantes nulos de V. harveyi en cada uno de los genes lux, luxL, luxM, luxN, LuxS y luxQ. Estos mutantes fallan para ya sea marcar o responder a una autoinductora específica, pero todavía producen luz debido a que en cada caso, permanece operacional un sistema de detección de quorum. Un mutante doble de V. harveyi luxN, LuxS no emitirá luz sin la adición de AI -2 exógeno debido a que este mutante no responderá a AI-1 y no producirá AI-2.

El gen LuxS de V. harveyi se ha clonado en E. coli DH5 en un cósmido movilizable de amplio rango de huéspedes llamado pLAFR2. Esta construcción restaura la producción de AI -2 para E. coli DH5a. Se diseñó una mutación nula marcada en el gen LuxS al introducir un cásete de resistencia al cloranfenicol (Cmr) en sitio de restricción interna. La colocación del caset Cmr en este sitio en LuxS eliminó subsecuentemente la producción de AI -2 en E. coli DH5a. El alelo nulo luxS : : Cmr se transfirió en el cromosoma de la cepa BB170 de V. harveyi . La cepa BB170 contiene un Tn5Kanr en luxN y no responde a AI-1. Para construir el doble mutante, se llevaron a cabo las conjugaciones triparentales al mezclar los cultivos de fase estacionaria de E. coli DH5a portando la construcción V. harveyi luxS: :Cmr en pLAFR2 (pLAFR2 porta la resistencia a la tetraciclina) , E. coli DH5a porta el plásmido pRK2013 donador de tra y el V. harveyi receptor de la cepa BB170. El intercambio del alelo del mutante luxS::Cmr para el alelo LuxS tipo silvestre en el cromosoma ocurre mediante recombinación homologa. El cósmido exogenoto en V. harveyi se eliminó por la inducción de un segundo plásmido incompatible pPHlJl . Esto se llevó a cabo al comparar E. coli DH5a que contenía pPHIJI con el V. harveyi BB170 receptor que contenía el cósmido luxS : :Cmr y al seleccionarlo para exconjugados en placas que contenían ampicilina (para la - selección de conteo del donador de E. coli) cloranfenicol (para herencia del alelo mutante luxS : :Cmr) y gentamicina (para mantenimiento del plásmido pPHIJI) . Se utilizó el análisis Southern blot para verificar que el cósmido pLAFR2 exogenoto se hubiera eliminado y que la construcción luxS: :Cmr se había transferido a la posición correspondiente en el genoma de V. harveyi . El cósmido pPHIJI se eliminó subsecuentemente mediante crecimiento en ausencia de la selección de gentamicina. Verificación de que el Doble Mutante luxN, LuxS responde a AI-2. La cepa V. harveyi que es mutante en luxN y luxS se estimuló para producir luz en respuesta a la adición exógena de AI-2 pero no de AI-1. Esto se verificó en un análisis de luminiscencia para responder a AI-1 y AI-2 de V. harveyi . La cepa MM30 de V. harveyi (luxS::Tn5) que es fonotípicamente AI-1+, AI-2", y la cepa BB152 de V. harveyi (luxM: :Tn5) que es fonotípicamente AI-1", AI-2+, se utilizaron como las fuentes de AI-1 y AI-2, respectivamente. La AI-1 y AI -2 presentes en los fluidos de cultivo de estas cepas se trataron para la estimulación de la producción de luz de la cepa informadora doble mutante luxN, LuxS de V. harveyi . En este análisis, las preparaciones de la autoinductora a partir de MM30, BB152 o controles en medio estéril se agregaron a los pozos de las placas de microtitulación seguidas por la adición de la cepa informadora V. harveyi . La producción de - luz resultante se monitoreo utilizando un contador de centelleo líquido en el modo de quimioluminiscencia. La estimulación máxima de la producción de luz en la cepa informadora luxN, luxS de V. harveyi se comparó a la producida por la cepa BB886 de V. harveyi , Detector 1+, Detector 2". Estas dos cepas de V. harveyi se utilizan rutinariamente en este análisis como informadoras de la actividad de AI-1 y AI -2, respectivamente. Determinación de la concentración óptima de AI-2 en los análisiss de microtitulación. La clasificación antes mencionada se optimizará para utilizarse en los análisis de microtitulación de 96 pozos. Esta clasificación se utilizará en análisis del inhibidor para identificar los inhibidores de AI-2. Se agregará AI-2 purificado o sintético a los pozos de microtitulación que contienen la cepa informadora recientemente construida y se medirá la inhibición mediante una disminución en la emisión de luz a partir de los pozos que contienen un inhibidor. El análisis se optimizará al determinar la concentración de células y AI -2 en los pozos de microtitulación que permitirán la sensibilidad máxima. La concentración óptima de AI-2 será la que estimulará la mitad de la producción de luz máxima para una concentración de células dada por unidad de tiempo. Los experimentos iniciales se conducirán en este rango de concentración para determinar el rango de concentración de AI -2 que produce el mayor cambio en la producción de luz. Los experimentos similares que utilizan AI-1 y no los mutantes de auto-estimulación detector-l+, detector-2" (BB886) mostraron que el análisis fue sensible a las concentraciones tan bajas como lOOnM en AI-1 y que la emisión de luz fue lineal a través de 6 órdenes de magnitud (la emisión de luz a partir de una cepa de auto-estimulación fue lineal a través de tres órdenes) . Se predicen resultados similares para AI -2 utilizando la nueva cepa informadora que no será auto-estimulante y por lo tanto tendrá cero emisión de luz ambiental. La emisión de luz proveniente de los pozos de microtitulación se medirán con un contador de centelleo líquido Wallac TriLux modelo 1450-021 en el modo de quimioluminiscencia. Esta máquina adaptará 16 placas y por lo tanto permitirá 1536 experimentos de concentración por separado por corrida. EJEMPLO 5 Método In Vitro para Sintetizar AI-2 Purificación e Identificación de AI-2. La clase de molécula de AI -2 es refractaria para purificación por técnicas convencionales utilizadas para el aislamiento de las autoinductoras de acil-homoserina lactona (HSL) tal como AI-1 de V. harveyi . A diferencia de otras autoinductoras HSL, bajo las condiciones tratadas, la actividad de AI -2 no se extracta cuantitativamente en solventes orgánicos. Además, falla en la unión a cualquier columna de intercambio catiónico o aniónico. La presente caracterización de AI -2 indica que tiene un peso molecular inferior a 1000 kDa, y es un compuesto orgánico polar pero aparentemente sin cambio. La actividad de AI -2 es estable en ácido y lábil en base y resistente al calor a aproximadamente 80 pero no a 100 °C. Estos resultados indican que las AI -2 no son acil -homoserina lactonas. Los genes luxS identificados en el presente estudio no portan homología para otros genes conocidos para incluirse en la producción de las autoinductoras de HSL indicando además que la presente clase de autoinductoras AI -2 es nueva. Así, además de proporcionar una proteína luxS de S . typhimurium clonada, sobre-expresada y purificada, la presente invención también proporciona un método para producir AI -2 in vi tro . La presente invención proporciona un mecanismo para generar grandes cantidades de AI -2 pura útil por masa espectral y el análisis NMR, y para clasificar compuestos que modulan la actividad de AI-2. Además, la presente invención proporciona un método para determinar la trayectoria biosintética in vivo para la síntesis de AI-2. El análisis de las ubicaciones genómicas de varios genes luxS identificados en la presente invención indican que los genes luxS no residen consistentemente en ninguna de las ubicaciones en el cromosoma, ni se les encuentra típicamente en proximidad cercana a ningún gen (es) específico (s) . Sin embargo, en un caso, el gen luxS es el tercer gen en un operon de tres genes con dos genes (-netf y pfs) . En E. coli , Salmonella y muchas otras bacterias, MetK y Pfs se incluyen en la conversión de la S-adenosil metionina (SAM) a homocisteína y 4 , 5-dihidroxi-2 , 3 pentanediona (Figura 15). La función de MetK es convertir la metionina a SAM que es un cofactor importante en el metabolismo de un carbono. SAM se utiliza para metilar ADN, ARN y una variedad de proteínas celulares, y varias SAM dependen de la metil transferasa que actúa en esta etapa. S-adenosil homocisteína (SAH) se produce cuando el grupo metilo se transfiere de SAM a sus subtratos. SAH funciona como un potente inhibidor de SAM dependiente de las metiltransferasas . Por lo tanto, la bacteria rápidamente degrada SAH a través de la enzima Pfs. La designación "pfs" se refiere a una estructura de lectura abierta en el genoma de E. coli que se ha determinado recientemente que codifica la enzima 5' -metiltioadenosina/S-adenosilhomocisteina nucleosidasa, también conocida como MTA/SAH nucleosidasa. En el presente sistema, la enzima divide el enlace glicosídico en S-adenosilhomocisteina (SAH) . Así, la función de Pfs es convertir SAH a adenina y S-ribosil homocisteína. En una etapa final, S-ribosil homocisteína se convierte a homocisteína y 4 , 5-dihidroxi-2 , 3 -pentanediona . La homocisteína puede re-emprender esta trayectoria; se metila para generar metionina que puede convertirse a SAM - - mediante MetK. El catabolismo de SAH se considera una trayectoria de salvamento para reciclar los intermediarios metabólicos (adenina y homocisteína) . Sin embargo, algunas especies de bacterias eliminan SAH por una trayectoria diferente. En esta trayectoria alternativa, la adenosina se retira directamente de SAH que genera homocisteína. Por lo tanto, las células que utilizan este segundo mecanismo no producen 4 , 5-dihidroxi-2 , 3 -pentanediona . En la trayectoria mostrada en la Figura 15, la enzima responsable de la conversión de S-ribosil homocisteína a 4 , 5-dihidro-2 , 3 -pentanediona nunca se ha identificado, clonado o purificado. Además, no se conoce ningún rol para 4 , 5-dihidroxi-2 , 3 -pentanediona . LuxS se incluye en la trayectoria mostrada en la Figura 15, y SAM y SAH se incluyen en la producción de AI-2. La estructura de AI-2 puede ser 4 , 5-dihidroxi-2 , 3-pentanediona en cuyo caso LuxS es la enzima no caracterizada que actúa en S-ribosil homocisteína. Segundo, LuxS puede actuar en uno de los intermediarios para hacer AI-2. LuxS podría representar un punto divergente fuera de la trayectoria conocida. Para confirmar que LuxS se incluye en la conversión de SAM a AI-2, el gen que codifica la proteína LuxS de S . typhimurium se clonó, sobre-expresó y la proteína LuxS de S . typhimurium se purificó. Esta proteína se utilizó en combinación con extractos libres de células dializados preparados a partir de un mutante nulo de luxS de S. typhimurium para mostrar que la adición de SAM y proteína LuxS puede restaurar la producción de AI -2 a los extractos célula-LuxS dializados. Las mezclas de reacción se prepararon conteniendo 10 nM del regulador Fosfato de Sodio pH7.0, extracto célula-LuxS de V. harveyi y SAM. Se agregó proteína LuxS purificada a algo de estas mezclas. Las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min, seguida por la centrifugación en un centricon 5000 MWCO. El material con MW < 5000 se agregó al bioensayo estándar de V. harveyi como se describió previamente . Los extractos LuxS-células dializados a los que se agregó SAM o extractos que contenían proteína LuxS sin la adición de SAM no produjeron actividad de AI-2. Sin embargo, los extractos idénticos a los que se les había agregado proteína LuxS y SAM produjeron AI-2 que dio como resultado la estimulación de más de 500 veces en producción de luz en el bioensayo. Investigaciones adicionales muestran que SAM no es el substrato directo para LuxS, y que LuxS debe actuar en una etapa subsecuente a la conversión de SAM a SAH (Figura 15) . Se determinó que AI -2 no se produjo sí se agregó SAM directamente a la proteína LuxS, sin embargo se produjo actividad mediante la pre-incubación de SAM con los extractos -LuxS, filtración y la adición subsecuente de la proteína LuxS al filtrado. De manera importante, estos estudios indican que SAM puede reaccionar con un elemento en el extracto celular antes de que se pueda utilizar por LuxS para hacer AI-2. Presumiblemente, la SAM dependiente de la metiltransferasa presente en el extracto celular utiliza SAM como un donador de metilo y lo convierte a SAH en el proceso. Para verificar esto, SAH se sustituyó por SAM en un análisis in vi tro. La adición de SAH a un análisis in vi tro dio como resultado una mucho mayor producción de AI -2 que cuando se agregó SAM. Este resultado indica que LuxS funciona en la trayectoria subsecuente a la conversión de SAM a SAH. De nuevo, la adición de SAH directamente a la proteína LuxS no es suficiente para la producción de la actividad de AI -2, aunque la pre-incubación de SAH con los extractos -LuxS dializados seguidos por la filtración y la adición subsecuente de la proteína LuxS a los filtrados dio como resultado la producción de AI-2. Presumiblemente, SAH se convierte a S-ribosil homocisteína y después LuxS actúa para producir AI -2. La trayectoria propuesta mostrada en la Figura 15 no es una trayectoria de salvamento para reciclar los metabolitos secundarios, pero preferentemente es la trayectoria para producir AI-2. La presente invención ha reducido las posibilidades para los puntos de la actividad de LuxS en la biosíntesis de AI-2. Las posibilidades que - permanecen se muestran en la Figura 15 (designadas ¿LuxS?) . De acuerdo a la invención, AI -2 es un derivado de la ribosa. Es notable que, en V. harveyi , LuxP, el detector primario para AI -2, es un homólogo de la proteína que se une a la ribosa de E. coli y S. typhimurium. Caracterización y Biosíntesis de AI-2. La invención proporciona además un método para un procedimiento in vi tro para la producción a gran escala de AI -2 puro. Como se indica en la Figura 15, SAH es un precursor en la biosíntesis dependiente de LuxS de AI-2. Además LuxS no actúa directamente en SAH. Antes de la reacción de LuxS, SAH debe ser atacada primero por algo de la enzima en los extractos celulares dializados. Presumiblemente esta etapa es la conversión de SAH a S-ribosil homocisteína por Pfs. Por lo tanto el sustrato para LuxS es S-ribosil homociteína. Para confirmar que LuxS act a en S-ribosil homocisteína, la enzima Pfs puede purificarse y utilizarse para convertir SAH a S-ribosil homocisteína. Para este fin, el gen pfs se ha clonado a partir de S. typhimurium 14028 colocado en el vector de sobre-exoresión pLM-1. Esta enzima Pfs se sobre-expresará y SAH se agregará a la Psf purificada para producir S-ribosil homocisteína. La conversión de SAH a S-ribosil homocisteína se confirmará mediante el análisis de HPLC de fase inversa (SAH se activa por UV mientras S-ribosil homocisteína no) . Subsecuentemente, la S-ribosil - - homocisteína producida por Pfs se agrgará a la LuxS purificada. Después de la incubación, la mezcla se filtrará en un centricón 5000 MWCO. El filtrado se probará para la actividad de AI -2 en el bioensayo de V. harveyi descrito previamente. La identificación de la actividad confirmará que 4 , 5-dihidroxi-2 , 3 -pentanediona es AI -2. Además, de la estructura de AI -2 obtenida de E. coli y V. harveyi , se determinará AI-2. Los genes luxS de E. coli y V. harveyi se han clonado para los vectores de sóbreexpresión. La identidad/biosíntesis de la AI-2 de S . typhimurium proporcionada por la presente invención debe facilitar grandemente este análisis. En el caso de que las AI -2 de S . typhimurium, E. coli y V. harveyi sean idénticas, estos datos indicarán que las AI-2's son la misma. La presente invención no se limita a las modalidades descritas y ejemplificadas arriba, sino es capaz de variación y modificación dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Lista de secuencias <110> Bonnie . Bassler Michael Surette <120> ^Composiciones y métodos para regular la patogénesis bacterial <130> 99-1545-1 <160> 17 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> l <211> 519 <212> DNA <213> Vibrio harveyi <400> 1 atgcctttat tagacagctt taccgtagac cacacgcgta tgaatgcacc agcggttcgt 60 gtggctaaaa cgatgcaaac tccaaaagga gacaccatca cggtattcga cctacgtttc 120 actgctccaa acaaagacat cctttctgag aaaggaattc atacattaga gcatttgtac 180 gcaggcttta tgcgtaatca cctaaatggt gatagcgttg agatcattga tatctcacca 240 atggggtgcc gtactggttt ctacatgagc ttgattggta cgccttcaga gcagcaagtg 300 gctgacgctt ggattgccgc gatggaagac gtactaaaag tagaaaacca aaacaagatc 360 cctgagttga acgaatacca atgtggtaca gcagcgatgc actctctgga tgaagcgaag 420 caaatcgcga agaacattct agaagtgggt gtggcggtga ataagaatga tgaattggca 480 ctgccagagt caatgctgag agagctacgc atcgactaa 519 <210> 2 <211> 516 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgccgttgt tagatagctt cacagtcgat catacccgga tggaagcgcc tgcagttcgg 60 gtggcgaaaa caatgaacac cccgcatggc gacgcaatca ccgtgttcga tctgcgcttc 120 tgcgtgccga acaaagaagt gatgccagaa agagggatcc ataccctgga gcacctgttt 180 gctggtttta tgcgtaacca tcttaacggt aatggtgtag agattatcga tatctcgcca 240 atgggctgcc gcaccggttt ttatatgagt ctgattggta cgccagatga gcagcgtgtt 300 gctgatgcct ggaaagcggc aatggaagac gtgctgaaag^ tgcaggatca gaatcagatc 360 ccggaactga acgtctacca gtgtggcact taccagatgc actcgttgca ggaagcgcag 420 gatattgcgc gtagcattct ggaacgtgac gtacgcatca acagcaacga agaactggca— 480 ctgccgaaag agaagttgca ggaactgcac atctag 516 <210> 3 <:211> 110 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <220> <221> mise-característica <222> (0) ... (0) <:223> secuencia de MudJ <400> 3 gatgtgctga aagtgcagga tcaaaaccag atcccggagc tgaacgttta ccagtgcggt 60 acgtatcaga tgcactcgct cagtgaagcg caggacattg cccgtcatat no <210> 4 <211> 492 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <22220l>> mi.sc-caracter*l•s t-i,ca <222> (0) ... (0) <223> secuencia de la alineación; comienza con el codon 8 y reaudere i-res -ca-bios de estructura <400> 4 aattcggatc ataccggatg caagcgccgg cggtccgggt tgcaaaaacg atgaacaccc 60 cgcatggcga cgcaatcacg tgtttgatct gcgtttttgc attccgaaca aagaagtgat 120 gccggaaaaa gggattcata cgcttgagca tctgtttgct ggctttatgc gcgaccacct 180 caacggtaac ggcgttgaga ttategatat ctcgccgatg ggctgccgca ccggctttta 240 catgagcctg attggcacgc cggacgagca gcgtgttgcc gacgcctgga aagcggcgat 300 ggcggatgtg ctgaaagtgc aggatcaaaa ccagatcccg gagctgaacg tttaccagtg 360 cggtacgtat cagatgeact cgctcagtga agcgcaggac attgcccgtc atattctgga 420 gcgtgatgtg cgcgtgaaca gcaataaaga gctggcgctg ccgaaagaaa aactgcagga 480 actgatattt ag 492 <:210> 5 ' <211> 504 <212> DNA <213> Haemophilus influenzae <400> 5 atgecattac ttgatagttt taaagtggat cacacaaaaa tgaacgcacc tgcagtacgc 60 attgcaaaaa cgatgctcac gccaaaaggc gataatatta ctgtttttga tttacgtttt_. — 120 tgtattccaa acaaagaaat tctttcccca aaaggcattc atacacttga acatttat-tt 180 gctggattta tgcgcgatca 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Bacillus subtilis <400> 7 atgccttcag tagaaagttt tgagcttgat cataatgcgg ttgttgctcc atatgtaaga 60 cattgcggcg tgcataaagt gggaacagac ggcgttgtaa ataaatttga cattcgtttt 120 tgccagccaa ataaacaggc gatgaagcct gacaccattc acacactcga gcatttgctc 180 gcgtttacga ttcgttctca cgctgagaaa tacgatcatt ttgatatcat tgatatttct 240 ccaatgggct gccagacagg ctattatcta gttgtgagcg gagagccgac atcagcggaa 300 atcgttgatc tgcttgaaga cacaatgaag gaagcggtag agattacaga aatacctgct 360 gcgaatgaaa agcagtgcgg ccaagcgaag cttcatgatc tggaaggcgc taaacgttta 420 atgcgtttct ggctttcaca ggataaagaa gaattgctaa aagtatttgg ctaaaataga 480 aa 482 <210> 8 <211> 537 <212> DNA <213> Borrelia burdorferi <400> 8 atgaatttga atgggaaaaa ttagattttg taaaaaaaat acaaacagcg ctaaaaaaat 60 gaaaaaaata acaagcttta caatagatca tacaaaactc aaccctggca tatatgtctc_ — 120 aagaaaagat acctttgaaa atgtaatatt tactacaata gacattagaa tcaaagctcc 180 caacatcgaa ccaataattg aaaacgcagc aatacataca atagagcaca taggagctac 240 tttacttaga aataatgaag tttggaccga aaaaatagta tattttggcc ctatgggatg 300 cagaactggt ttttacttaa taatttttgg agactatgaa agtaaagatc ttgttgactt 360 agtctcatgg cttttttccg aaatcgtaaa tttttcagaa cctatcccag gcgcaagtga 420 taaggaatgc ggaaattaca aagaacataa ccttgatatg gctaaatatg aatcttctaa 480 atacttacaa atattaaaca atattaaaga agaaaattta aaatatcctt agctcat 53*7 <210> 9 <211> 519 <212> DNA <213> Vibrio cholerae <400> 9 atgccattat tagacagttt taccgtcgat catactcgta tgaatgcacc ggcggtgcgt 60 gttgccaaaa ccatgcaaac cccaaaaggg gatacgatta ccgtatttga tttgcgtttt 120 actatgccaa acaaagatat cttgtctgag cgcggtatcc atactctaga gcatctctac 180 gcgggcttta tgcgcaatca ccttaacggc agccaagtgg agatcatcga tatttcacca 240 atgggttgcc gtacaggttt ctacatgagc ttgattggtg cgccgacaga acagcaagtg 300 gcacaagcat ggctagccgc aatgcaagat gtgttgaaag ttgaaagcca agagcaaatt 360 cctgagctga atgagtacca gtgcggcact gcggcgatgc actcgctcga agaagccaaa 420 gcgattgcga aaaacgtgat tgcggcaggc atctcggtta accgtaacga tgagttggcg 480 ctgcccgaat ctatgctcaa tgagctgaag gttcactaa 519 <210> 10 <211> 172 <212> PRT <213> Vibrio harveyi <400> 10 Met Pro Leu Leu Asp Ser Phe Thr Val Asp His Thr Arg Met Asn Ala 1 5 10 15 Pro Ala Val Arg Val Ala Lys Thr Met Gln Thr Pro Lys Gly Asp Thr 20 25 30 lie Thr Val Phe Asp Leu Arg Phe Thr Ala Pro Asn Lys Asp lie Leu 35 40 45 Ser Glu Lys Gly lie His Thr Leu Glu His Leu Tyr Ala Gly Phe Met 50 55 60 Arg Asn His Leu Asn Gly Asp Ser Val Glu lie lie Asp lie Ser Pro 65 70 75 80 Met Gly Cys Arg Thr Gly Phe Tyr Met Ser Leu lie Gly Thr Pro Ser 85 90 95 Glu Gln Gln Val Ala Asp Ala Trp He Ala Ala Met Glu Asp Val Leu 100 105 110 Lys Val Glu Asn Gln Asn Lys lie Pro Glu Leu Asn Glu Tyr Gln Cys 115 120 125 Gly Thr Ala Ala Met His Ser Leu Asp Glu Ala Lys Gln He Ala Lys 130 135 140 , Asn He Leu Glu Val Gly Val Ala Val Asn Lys Asn Asp Glu Leu Ala 145 150 155 160 Leu Pro Glu Ser Met Leu Arg Glu Leu Arg He Asp 165 170 <210> 11 <211> 171 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 11 Met Pro Leu Leu Asp Ser Phe Thr Val Asp His Thr Arg Met Glu Ala 1 5 10 15 Pro Ala Val Arg Val Ala Lys Thr Met Asn Thr Pro His Gly Asp Ala 25 30 He Thr Val Phe Asp Leu Arg Phe Cys Val Pro Asn Lys Glu Val Met 40 45 Pro Glu Arg Gly He His Thr Leu Glu His Leu Phe Ala Gly Phe Met 50 55 60 Arg Asn His Leu Asn Gly Asn Gly Val Glu He He Asp He Ser Pro 65 70 75 80 Met Gly Cys Arg Thr Gly Phe Tyr Met Ser Leu He Gly Thr Pro Asp 85 90 95 Glu Gln Arg Val Ala Asp Ala Trp Lys Ala Ala Met Glu Asp Val Leu 100 105 110 Lys Val Gln Asp Gln Asn Gln He Pro Glu Leu Asn Val Tyr Gln Cys 115 120 125 Gly Thr Tyr Gln Met His Ser Leu Gln Glu Ala Gln Asp He Ala Arg 130 135 140 Ser He Leu Glu Arg Asp Val Arg He Asn Ser Asn Glu Glu Leu Ala 145 150 155 160 Leu Pro Lys Glu Lys Leu Gln Glu Leu His He 165 170 <210> 12 <211> 164 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <220> <22l> Variante <222> (0) ... (0) <223> starts with residue 8 and has 3 frameshifts <400> 12 sn Ser Asp His Thr Arg Met Gln Ala Pro Ala Val Arg Val Ala Lys 1 5 10 15 Thr Mett Asn Thr Pro His Gly Asp Ala He Thr Val Phe Asp Leu Arg 25 30 Phe Cys He Pro Asn Lys Glu Val Met Pro Glu Lys Gly He His Thr 40 45 Leu Glu His Leu Phe Ala Gly Phe Met Arg Asp His Leu Asn Gly Asn 50 55 60 Gly Val Glu He He Asp He Ser Pro Met Gly Cys Arg Thr Gly Phe 65 70 75 80 Tyr Met Ser Leu He Gly Thr Pro Asp Glu Gln Arg Val Ala Asp Ala 85 90 95 Trp Lys Ala Ala Met Ala Asp Val Leu Lys Val Gln Asp Gln Asn Gln 100 105 110 He Pro Glu Leu Asn Val Tyr Gln Cys Gly Thr Tyr Gln Met His Ser 115 120 125 Leu Ser Glu Ala Gln Asp He Ala Arg His He Leu Glu Arg Asp Val 130 135 140 Arg Val Asn Ser Asn Lys Glu Leu Ala Leu Pro Lys Glu Lys Leu Gln 145 150 155 160 Glu Thr Asp He <210> 13 <211> 167 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 13 Met Pro Leu Leu Asp Ser Phe Lys Val Asp His Thr Lys Met Asn Ala 1 5 10 15 Pro Ala Val Arg He Ala Lys Thr Met Leu Thr Pro Lys Gly Asp Asn 25 30 He Thr Val Phe Asp Leu Arg Phe Cys He Pro Asn Lys Glu He Leu 40 45 Ser Pro Lys Gly He His Thr Leu Glu His Leu Phe Ala Gly Phe Met 50 55 60 Arg Asp His Leu Asn Gly Asp Ser He Glu He He Asp He Ser Pro 65 70 75 80 Met Gly Cys Arg Thr Gly Phe Tyr Met Ser Leu He Gly Thr Pro Asn 85 90 95 Glu Gln Lys Val Ser Glu Ala Trp Leu Ala Ser Met Gln Asp Val Leu 100 105 110 Gly Val Gln Asp Gln Ala Ser He Pro Glu Leu Asn He Tyr Gln Cys 115 120 125 Gly Ser Tyr Thr Glu His Ser Leu Glu Asp Ala His Glu He Ala Lys 130 135 140 Asn Val He Ala Arg Gly He Gly Val Asn Lys Asn Glu Asp Leu Ser 145 150 155 160, Leu Asp Asn Ser Leu Leu Lys 165 <210> 14 <211> 155 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 14 Met Lys Thr Pro Lys Met Asn Val Glu Ser Phe Asn Leu Asp His Thr 1 5 10 15 Lyg Val Lys Ala Pro Tyr Val Arg Val Ala Asp Arg Lys Lys Gly Val 25 30 Asn Gly Asp Leu He Val Lys Tyr Asp Val Arg Phe Lys Gln Pro Asn 40 45 Gln Asp His Met Asp Met Pro Ser Leu His Ser Leu Glu His Leu Val 50 55 60 Ala Glu He He Arg Asn His Ala Ser Tyr Val Val Asp Trp Ser Pro 65 70 75 80 Met Gly Cys sln Thr Gly Phe Tyr Leu Thr Val Leu Asn His Asp Asn 85 90 95 Tyr Thr Glu He Leu Glu Val Leu Glu Lys Thr Met Gln Asp Val Leu 100 105 110 Lys Ala Thr Glu Val Pro Ala Ser Asn Glu Lys Gln Cys Gly Trp Ala 115 120 125 Ala Asn His Thr Leu Glu Gly Ala Lys Asp Leu Ala Arg Ala Phe Leu 130 135 140 Asp Lys Arg Ala Glu Trp Ser Glu Val Gly Val 145 150 155 <210> 15 <211> 157 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 15 Met Pro Ser Val Glu Ser Phe Glu Leu Asp His Asn Ala Val Val Ala 1 5 10 15 Pro Tyr Val Arg His Cys Gly Val His Lys Val Gly Thr Asp Gly Val 25 30 Val Asn Lys Phe Asp He Arg Phe Cys Gln Pro Asn Lys Gln Ala Met 40 45 Lys Pro Asp Thr He His Thr Leu Glu His Leu Leu Ala Phe Thr He 50 55 60 Arg Ser His Ala Glu Lys Tyr Asp His Phe Asp He He Asp He Ser 65 70 75 80 Pro Met Gly Cys Gln Thr Gly Tyr Tyr Leu Val Val Ser Gly Glu Pro, 85 90 95 Thr Ser Ala Glu He Val Asp Leu Leu Glu Asp Thr Met Lys Glu Ala 100 105 110 Val Glu He Thr Glu He Pro Ala Ala Asn Glu Lys Gln Cys Gly Gln 115 120 125 Ala Lys Leu His Asp Leu Glu Gly Ala Lys Arg Leu Met Arg Phe Trp 130 135 140 Leu Ser Gln Asp Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Phe Gly 145 150 155 <210> 16 <211> 173 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 16 Met Gly Lys He Arg Phe Cys Lys Lys Asn Thr Asn Ser Ala Lys Lys 1 5 10 15 Met Lys Lys He Thr Ser Phe Thr He Asp His Thr Lys Leu Asn Pro 25 30 Gly He Tyr Val Ser Arg Lys Asp Thr Phe Glu Asn Val He Phe Thr 40 45 Thr He Asp He Arg He Lys Ala Pro Asn He Glu Pro He He Glu 50 55 60 Asn Ala Ala He His Thr He Glu His He Gly Ala Thr Leu Leu Arg 65 70 75 80 Asn Asn Glu Val Trp Thr Glu Lys He Val Tyr Phe Gly Pro Met Gly 85 90 95 Cys Arg Thr Gly Phe Tyr Leu He He Phe Gly Asp Tyr Glu Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Val Asp Leu Val Ser Trp Leu Phe Ser Glu He Val Asn Phe 115 120 125 Ser Glu Pro He Pro Gly Ala Ser Asp Lys Glu Cys Gly Asn Tyr Lys 130 135 140 Glu His Asn Leu Asp Met Ala Lys Tyr Glu Ser Ser Lys Tyr Leu Gln 145 150 155 160 He Leu Asn Asn He Lys Glu Glu Asn Leu Lys Tyr Pro 165 170 <210> 17 <211> 172 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 17 Met Pro Leu Leu Asp Ser Phe Thr Val Asp His Thr Arg Met Asn Ala 1 5 10 15 - - Pro Ala Val Arg Val Ala Lys Thr Met Gln Thr Pro Lys Gly Asp Thr 25 30 He Thr Val Phe Asp Leu Arg Phe Thr Met Pro Asn Lys Asp He Leu 40 45 Ser Glu Arg Gly He His Thr Leu Glu His Leu Tyr Ala Gly Phe Met 50 55 60 Arg Asn His Leu Asn Gly Ser Gln Val Glu He He Asp He Ser Pro 65 70 75 80 Met Gly Cys Arg Thr Gly Phe Tyr Met Ser Leu He Gly Ala Pro Thr 85 90 95 Glu Gln Gln Val Ala Gln Ala Trp Leu Ala Ala Met Gln Asp Val Leu 100 105 110 Lys Val Glu Ser Gln Glu Gln He Pro Glu Leu Asn Glu Tyr Gln Cys 115 120 125 Gl,y Thr Ala Ala Met His Ser Leu Glu Glu Ala Lys Ala He Ala Lys 130 135 140 Asn Val He Ala Ala Gly He Ser Val Asn Arg Asn Asp Glu Leu Ala 145 150 155 160 Leu Pro Glu Ser Met Leu Asn Glu Leu Lys Val His 165 170

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un factor de señalización extracelular bacterial aislado que comprende al menos una molécula que es polar y no cambia y que tiene un peso molecular aproximado de menos de 1,000 kDa en donde el factor interactúa con la proteína LuxQ por lo que induce la expresión de un operon Vibrio harveyi que comprende genes de luminiscencia luxCDABE.
2. El factor de la reivindicación 1, que tiene una actividad específica en donde aproximadamente de 0.1 a 1.0 mg de una preparación del factor estimula aproximadamente un incremento de 1,000 veces en luminiscencia, según se mide en un bioensayo utilizando una cepa informadora de Detector 2+ de V. harveyi .
3. El factor de la reivindicación 1, que tiene una actividad específica en donde aproximadamente de 1 a 10 µg de una preparación del factor estimula aproximadamente un incremento de 1,000 veces en luminiscencia, según se mide en un bioensayo utilizando una cepa informadora de Detector 2+ de V. harveyi .
4. El factor de la reivindicación 1, producido mediante una célula bacterial seleccionada del grupo que consiste de Vijbrio harveyi , Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus , Vibrio alginolyticus , Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocoli tica, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori , Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi , Neisseria meningi tidis, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni , Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus.
5. Un factor de señalización bacterial aislado que comprende un factor de la fórmula:
6. El factor de la reivindicación 5, en donde el factor se produce mediante una célula bacterial seleccionada del grupo que consiste de Vibrio harveyi , Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus , Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocoli tica, Escherichia coli , Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori , Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi , Neisseria meningi tidis, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus . 1 .
Un isómero ópticamente activo de un factor que tiene la fórmula como se definió en la reivindicación 5.
8. El isómero ópticamente activo de la reivindicación 7, en donde el isómero es el isómero L.
9. El isómero ópticamente activo de la reivindicación 7, en donde el isómero es el isómero D.
10. Un factor de señalización bacterial aislado que comprende un factor que tiene la fórmula: en donde Rl, R2 , R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hídrido, halo, alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclilo, metilo, ciano, alcoxicarbonilo, amino, carboxilo, hidroxilo, formilo, nitro, fluoro, cloro, bromo, metilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroarilalquilo, alquilsulfonilo, haloalquilsulfonilo, ariisulfonilo, heteroariisulfonilo, hidroxialquilo, mercaptoalquilo, alcoxialquilo, ariloxialquilo, heteroariloxialquilo, aralquiloxialquilO, heteroarilalquiloxialquilo, alquiltioalquilo, ariltioalquilo, heteroariltioalquilo, aralquiltioalquilo, heteroarilalquiltioalquilo, haloalquilcarbonilo, haloalquil (hidroxi) alquilo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroarilalquilcarbonilo, carboxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilcarboniloxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, arilaminoalquilo, aralquilaminoalquilo, heteroarilaminoalquilo, heteroarilalquilaminoalquilo, alcoxi y ariloxi; fenilo, ciciohexilo, ciclohexenilo, benzofurilo, benzodioxolilo, furilo, imidazolilo, tienilo, tiazolilo, pirrolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, pirimidinilo, isoquinolilo, quinolinilo, benzimidazolilo, indolilo, pirazolilo y piridilo, aminosulfonilo, fluoro, cloro, bromo, metiltio, metilo, etilo, isopropilo, tert-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, ciano, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, propoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbunilo, pentoxicarbonilo, metilcarbonilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, heptafluoropropilo, difluoroclorometilo, diclorofluorometilo, difluoroetilo, difluoropropilo, dicloroetilo, dicloropropilo, metoxi, metilenodioxi, etoxi, propoxi, n-butoxi, hidroximetilo, hidroxietilo, metoximetilo, etoximetilo, trifluorometoxi, metilamino, N, N-dimetilamino, fenilamino, etoxicarboniletilo y metoxicarbonilmetilo, metilo, etilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, ciano, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, tert-butoxicarbonilo, benzilo, feniletilo, fenilpropilo, metiisulfonilo, - fenilsulfonilo, trifluorometilsulfonilo, hidroximetilo, hidroxietilo, metoximetilo, etoximetilo, metilcarbonilo, etilcarbonilo, trifluorometilcarbonilo, trifluoro (hidroxi) etilo, fenilcarbonilo, benzilcarbonilo, metoxicarbonilmetilo, etoxicarboniletilo, carboximetilo, carboxipropilo, metilcarboniloximetilo, feniloxi, feniloximetilo, tienilo, furilo, y piridilo, en donde el tienilo, furilo, piridilo, metiltio, metilsulfinilo, metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, ciano, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, heptafluoropropilo, difluoroclorometilo, diclorofluorometilo, difluoroetilo, difluoropropilo, dicloroetilo, dicloropropilo, metoxi, metilenodioxi, etoxi, propoxi, n-butoxi, hidroximetilo, hidroxietilo y trifluorometoxi.
11. Un isómero ópticamente activo de un factor que tiene la fórmula como se define en la reivindicación 10.
12. El isómero ópticamente activo de la reivindicación 11, en donde el isómero es el isómero L.
13. El isómero ópticamente activo de la reivindicación 11, en donde el isómero es el isómero D.
14. Un método para identificar un compuesto que regula la actividad de un factor de señalización que comprende : a) poner en contacto el factor de señalización con - el compuesto; b) medir la actividad del factor de señalización en la presencia del compuesto y comparar la actividad del factor de señalización obtenida en la presencia del compuesto con la actividad del factor de señalización obtenida en la ausencia del compuesto; y c) identificar un compuesto que regula la actividad del factor de señalización.
15. El método de la reivindicación 14, en donde el factor de señalización es la autoinductora-2.
16. El método de la reivindicación 15, en donde la autoinductora-2 es , 5-dihidroxi-2 , 3 -pentadiona.
17. El método de la reivindicación 15, en donde la autoinductora-2 es homocisteína.
18. El método de la reivindicación 14, en donde el contacto es in vivo.
19. El método de la reivindicación 14, en donde el contacto es in vi tro .
20. El método de la reivindicación 14, en donde la regulación es mediante el incremento de la actividad del factor de señalización.
21. El método de la reivindicación 14, en donde la regulación es mediante el decremento de la actividad del factor de señalización.
22. El método de la reivindicación 14, en donde el compuesto es un polipéptido.
23. El método de la reivindicación 14, en donde el compuesto es una molécula pequeña.
24. Un método para detectar una molécula autoinductora en una muestra que comprende : a) poner en contacto la muestra con una célula bacterial o extracto de la misma, que comprende trayectorias biosintéticas que producen una cantidad detectable de luz en respuesta a una autoinductora exógena, teniendo la célula bacteria al menos dos alteraciones distintas en el loci del gen que participa en las trayectorias de la autoinductora, en donde una primera alteración en un locus del gen comprende una alteración que inhibe la detección de una primera autoinductora y en donde una segunda alteración en un locus del gen comprende una alteración que inhibe la producción de una segunda autoinductora; y b) medir la luz producida por la célula bacterial o extracto de la misma, de a) .
25. El método de la reivindicación 24, en donde la primera alteración en un locus de gen comprende una alteración en el gen LuxN.
26. El método de la reivindicación 24, en donde la primera alteración en un locus de gen inhibe la detección de la autoinductora-1.
27. El método de la reivindicación 24, en donde la segunda alteración en un locus de gen comprende una alteración en el gen LuxS.
28. El método de la reivindicación 24, en donde la segunda alteración en un locus de gen inhibe la producción de la autoinductora-2 endógena.
29. El método de la reivindicación 24, en donde la cantidad de luz medida en presencia de la muestra es mayor que la cantidad de luz medida en ausencia de la muestra que es indicativa de la presencia de una autoinductora en la muestra .
30. El método de la reivindicación 24, en donde la muestra se selecciona a partir de un fluido biológico, tejido homogenado o medio condicionado por el desarrollo de una prueba de célula bacterial sospechosa de producción de autoinductora .
31. El método de la reivindicación 24, en donde la autoinductora exógena se produce por una célula bacterial seleccionada del grupo que consiste de Vibrio harveyi , Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocoli tica, Escherichia coli , Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi , Neisseria meningi tidis, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis , Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus .
32. El método de la reivindicación 24, en donde la autoinductora exógena es la autoinductora-2.
33. El método de la reivindicación 24, en donde la célula bacterial es un mutante de una cepa original que es bioluminiscente y capaz de producir una autoinductora.
34. El método de la reivindicación 33, en donde la cepa original es V. harveyi .
35. El método de la reivindicación 34 en donde la célula bacterial es la cepa MM32 de V. harveyi .
36. Una célula bacterial que comprende al menos dos alteraciones distintas en los loci de gen que participa en las vías autoinductoras, en donde una primera alteración en un locus de gen comprende una alteración que inhibe la detección de una primera autoinducotra y en donde una segunda alteración en un locus de gen comprende una alteración que inhibe la producción de una segunda autoinductora y en donde la célula es bioluminiscente cuando se pone en contacto con una autoinductora .
37. La célula de la reivindicación 36, en donde la - primera alteración en un locus de gen comprende una alteración en el gen LuxN.
38. La célula de la reivindicación 36, en donde la primera alteración en un locus de gen inhibe la detección de la autoinductora-1.
39. La célula de la reivindicación 36, en donde la segunda alteración en un locus de gen comprende una alteración en el gen LuxS.
40. La célula de la reivindicación 36, en donde la segunda alteración en un locus de gen inhibe la producción de la autoinductora-2 endógena.
41. El método de la reivindicación 24, en donde la célula bacterial es un mutante de una V. harveyi que es bioluminiscente y capaz de producir una autoinductora.
42. La célula de la reivindicación 41, en donde la célula bacterial es la cepa MM32 de V. harveyi .
43. Un método para identificar un análogo de autoinductora que regula la actividad de una autoinductora, que comprende : a) poner en contacto una célula bacterial o extracto de la misma, que comprende trayectorias biosintéticas que producirán una cantidad detectable de luz en respuesta de una autoinductora con un análogo de autoinductora; b) comparar la cantidad de luz producida por la - célula bacterial o extracto de la misma, en presencia de una autoinductora con la cantidad producida en la presencia del análogo de autoinductora, en donde un cambio de la producción de luz es indicativo de un análogo de autoinductora que regula la actividad de una autoinductora .
44. El método de la reivindicación 43, en donde la autoinductora es una autoinductora endógena .
45. El método de la reivindicación 43, en donde la autoinductora es una autoinductora exógena.
46. El método de la reivindicación 43, en donde la autoinductora es la autoinductora-2.
47. El método de la reivindicación 43, en donde el contacto es in vi tro.
48. El método de la reivindicación 43, en donde el contacto es in vivo .
49. El método de la reivindicación 43, en donde la regulación es mediante la inhibición de la actividad autoinductora.
50. El método de la reivindicación 43, en donde la regulación es mediante el aumento de la actividad autoinductora .
51. El método de la reivindicación 43, en donde el análogo comprende un derivado de ribosa . -
52. El método de la reivindicación 43, en donde la célula bacterial comprende además al menos una alteración distinta en un locus de gen que participa en una trayectoria de autoinductora en donde la alteración inhibe la producción o detección de una autoinductora.
53. El método de la reivindicación 52, en donde la alteración en un locus de gen comprende una alteración en el gen LuxS .
54. El método de la reivindicación 52, en donde la alteración en un locus de gen inhibe la producción de la autoinductora-2 endógena.
55. El método de la reivindicación 52, en donde la alteración en un locus de gen comprende una alteración en el gen LuxN.
56. El método de la reivindicación 52, en donde la alteración en un locus de gen inhibe la detección de la autoinductotra-1.
57. El método de la reivindicación 49, en donde la alteración se encuentra en los loci LuxN y LuxS.
58. El método de la reivindicación 49, en donde la célula bacterial es una cepa M32 de V. harveyi .
59. Un método para producir la autoinductora-2 que comprende poner en contacto S-adenosilhomocisteína (SAH) con una proteína LuxS bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la conversión de la S-adenosilhomocisteína a la - autoinductora-2.
60. El método de la reivindicación 59, en donde la producción de la autoinductora-2 es in vi tro.
61. El método de la reivindicación 59, en donde la producción de la autoinductora-2 es in vivo.
62. El método de la reivindicación 59, que además comprende una proteína 5' -metiltioadenosina/S-adenosilhomocisteína nucleosidasa (pfs) .
63. El método de la reivindicación 62, en donde la autoinductora-2 es 4, 5 -dihidroxi-2 , 3 -pentanediona.
64. Un método para producir una autoinductora-2 que comprende poner en contacto S-ribosilhomocisteína (SRH) con un polipéptido LuxS bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la conversión de la S-ribosilhomocisteína a la autoinductora-2.
65. El método de la reivindicación 64, en donde la autoinducotra-2 es 4 , 5-dihidroxi-2 , 3 -pentanediona.
66. Un método para producir una autoinductora-2 que comprende : a) poner en contacto la S-adenosilhomocisteína (SAH) con una proteína 5' -metiltioadenosina/S- adenosilhomocisteína nucleosidasa (pfs) bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la conversión de S- adenosilhomocisteína a S-ribosilhomocisteína; - b) poner en contacto la S-ribosilhomocisteína de a) con una proteína LuxS bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la conversión de S-ribosilhomocisteína a la autoinductora-2.
67. El método de la reivindicación 66, en donde la autoinductora-2 es 4 , 5-dihidroxi-2 , 3 -pentanediona .
68. Un método para detectar un biomarcador bacterial asociado con la autoinductora que comprende: a) poner en contacto al menos una célula bacterial con una molécula autoinductora bajo condiciones y durante tal tiempo como para promover la inducción de un biomarcador bacterial; y b) detectar el biomarcador bacterial.
69. El método de la reivindicación 68, en donde la autoinductora es la autoinductora-2.
70. El método de la reivindicación 69, en donde la autoinductora-2 es 4 , 5-dihidroxi-2 , 3 -pentanediona .
71. El método de la reivindicación 68, en donde el biomarcador es un ácido nucleico.
72. El método de la reivindicación 68, en donde el biomarcador es una proteína.
73. El método de la reivindicación 68, en donde el biomarcador es un antígeno.
74. El método de la reivindicación 73, en donde el antígeno es indicativo de patogenicidad bacterial.
75. El método de la reivindicación 68, en donde el biomarcador es una proteína fosforilatada.
76. El método de la reivindicación 68, en donde la detección es mediante una prueba.
77. El método de la reivindicación 76, en donde la prueba es un ácido nucleico.
78. El método de la reivindicación 76, en donde la prueba es un anticuerpo.
79. El método de la reivindicación 78, en donde el anticuerpo es policlonal .
80. El método de la reivindicación 78, en donde el anticuerpo es monoclonal .
81. El método de la reivindicación 76, en donde la prueba se etiqueta de manera detectable.
82. El método de la reivindicación 68, en donde la célula bacterial se selecciona a partir del grupo que consiste de Vibrio harveyi , Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus , Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocoli tica, Escherichia coli , Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori , Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi , Neisseria meningi tidis, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni , Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus - - pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus .
83. Un método para detectar un compuesto objetivo que se une a una proteína LuxP que comprende poner en contacto la proteína LuxP con el compuesto objetivo y detectar la unión del compuesto a LuxP.
84. El método de la reivindicación 83, en donde el compuesto objetivo es la autoinductora-2.
85. El método de la reivindicación 83, en donde el compuesto objetivo es un análogo de la autoinductora-2.
86. El método de la reivindicación 83, en donde la detección es in vivo .
87. El método de la reivindicación 83, en donde la detección es in vi tro .
88. Un método para regular la formación de biopelícula bacterial que comprende poner en contacto una bacteria capaz de la formación de biopelícula con un compuesto capaz de regular la formación de biopelícula en donde el compuesto regula la actividad de la autoinductora-2.
89. El método de la reivindicación 88, en donde el compuesto es un análogo de la autoinductora-2.
90. El método de la reivindicación 88, en donde el compuesto es un polipéptido.
91. El método de la reivindicación 88, en donde el compuesto es una molécula pequeña.
92. El método de la reivindicación 88, en donde el - contacto es in vivo.
93. El método de la reivindicación 88, en donde el contacto es in vi tro.
94. El método de la reivindicación 88, en donde la regulación es por medio de inhibir la formación de biopelícula.
95. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína necesaria para la biosínteisis de un factor de señalización extracelular bacterial, en donde el factor interactúa con la proteína LuxQ induciendo así la expresión de un operón Vibrio harveyi que comprende genes de luminiscencia luxCDABE.
96. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 95, aislada a partir de una célula bacterial seleccionada del grupo que consiste de Vibrio harveyi , Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Pseudomonas phosphoreum, Yersinia enterocoli tica, Escherichia coli , Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori , Bacillus subtilis, Borrelia burgfdorferi, Neisseria meningi tidis, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni , Deinococcus radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus .
97. La molécula de ácido nucleico de la - reivindicación 95, que codifica un polipéptido que tiene entre aproximadamente 150 y 200 residuos de aminoácidos.
98. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 95, en donde el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos substancialmente igual la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, y una secuencia de consenso derivada de una comparación de dos o más de SEQ ID NOS: 10-17.
99. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 95, que tiene una secuencia substancialmente igual la secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , y una secuencia de consenso derivada de una comparación de dos o más de SEQ ID NOS: 1-9.
100. Una molécula de ADN recombinante, que comprende un vector que tiene un inserto que incluye la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 95.
101 Un polipéptido producido por la expresión de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 95.
102. Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de a) SEQ ID NO:l; b) una variante de la SEQ ID NO.-l; c) un mutante natural de la SEQ ID NO:l; d) una secuencia hibridizada con la SEQ ID NO:l o su complemento y que codifica un polipéptido substancialmente igual al polipéptido codificado por la SEQ ID N0:1; y e) una secuencia que codifica parte o todo un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 10 de aminoácidos.
103. Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de a) SEQ ID NO : 2 ; b) una variante de la SEQ ID NO: 2; c) un mutante natural de la SEQ ID NO: 2; d) una secuencia hibridizada con la SEQ ID NO: 2 o su complemento y que codifica un polipéptido substancialmente igual al polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 2; y e) una secuencia que codifica parte o todo un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 11 de aminoácidos.
104. Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de a) SEQ ID NO: 4; b) una variante de la SEQ ID N0:4; c) un mutante natural de la SEQ ID NO: 4; d) una secuencia hibridizada con la SEQ ID NO: 4 o su complemento y que codifica un polipéptido substancialmente igual al polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 4; y e) una secuencia que codifica parte o todo un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 12 de aminoácidos.
105. Una molécula de ADN recombinante que comprende un vector y un inserto que incluye la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 102, 103 o 104.
106. Un polipéptido producido por la expresión de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 102, 103 o 104.
107. Un método para purificar un factor de señalización extracelular bacterial en donde el factor interactúa con la proteína LuxQ induciendo mediante esto la expresión de un operón de Vibrio harveyi que comprende genes de luminiscencia luxCDABE, que comprenden: a) desarrollar, en un medio de cultivo, células bacteriales que producen la molécula de señalización; b) separar las células bacteriales del medio de cultivo; c) incubar las células bacteriales en una solución que tiene alta osmolaridad, bajo condiciones que permitan la producción y secreción de la molécula de señalización a partir de las células bacteriales; d) separar las células bacteriales de la solución de alta osmolaridad; y e) purificar el factor proveniente de la solución de alta osmolaridad.
108. El método de la reivindicación 107, que además comprende : a) separar los compuestos polares de los compuestos no polares en una muestra evaporada de la solución de alta osmolaridad; y b) someter los compuestos polares a la fase inversa de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución.
109. El método de la reivindicación 107, en donde la solución de alta osmolaridad comprende al menos sal monovalente 0.4M.
110. El método de la reivindicación 109, que comprende 0.4 - 0.5M NaCl .
111. El método de la reivindicación 107, que comprende además desarrollar células bacteriales en un medio de cultivo que contiene un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste de glucosa, fructosa, mañosa, glucitol, glucosamina, galactosa y arabinosa.
112. Una molécula de señalización purificada producida por el método de la reivindicación 107.
113. Un equipo que comprende un medio de vehículo que esta dividido en compartimientos para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios contenedores que contienen una cepa de bacteria, o extracto de la misma, comprendiendo trayectorias biosintéticas que producen una cantidad detectable de luz en respuesta a una autoinductora exógena, teniendo la célula bacterial al menos dos alteraciones distintas en los loci del gen que participan en las trayectorias de la autoinductora, en donde una primera alteración en un locus de gen comprende una alteración que inhibe la detección de una primera autoinductora y en donde una segunda alteración en un locus de gen comprende una alteración que inhibe la producción de una segunda autoinductora .
114. El equipo de la reivindicación 113, en donde la primera alteración en un locus de gen comprende una alteración en el gen LuxN.
115. El método de la reivindicación 113, en donde la primera alteración en un locus de gen inhibe la detección de la autoinductora-1.
116. El método de la reivindicación 113, en donde la segunda alteración en un locus de gen comprende una alteración en el gen LuxS.
117. El método de la reivindicación 113, en donde la segunda alteración en un locus de gen inhibe la producción de la autoinductora-2 endógena. fh l /? o \ /oo S lfí?i RESUMEN Esta invención proporciona una molécula de señalización autoinducida-2 bacterial extracelular purificada, la producción de la cual se regula por cambios en condiciones ambientales asociadas con un cambio desde una existencia de vida libre hacia una existencia de colonización o patogénica en un organismo huésped. La molécula de señalización estimula genes de luminiscencia LuxQ y se cree que también estimula una variedad de genes relacionados con la patogénesis en las especies bacteriales que la produce. Esta invención también proporciona una nueva clase de genes bacteriales comprendidos en la biosíntesis de la molécula de señalización.