MXPA01005243A

MXPA01005243A - Colorantes fluorescentes solubles en agua libres de enlaces de agregacion y suero y metodos y productos relacionados.

Info

Publication number: MXPA01005243A
Application number: MXPA01005243A
Authority: MX
Inventors: Walter B Dandliker
Original assignee: Hyperion Inc
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2002-06-04
Also published as: AU1914000A; WO2000031187A9; WO2000031187A1; CA2350608A1; JP2002530662A; CN1344293A; EP1133531A1; BR9915677A

Abstract

La presente invencion entonces relaciona a los componentes marcadores, pruebas fluorescentes, oligonucleotidos, ensayos de hibridacion, y tales productos que usan inmunoensayos y metodos para hacer tales productos. De acuerdo a la presente invencion, los componentes marcadores etiquetados detectables son proporcionadas porque comprenden una porcion de fluoraforo acoplada a dos o mas ligandos axiales pequenos que se solubilizan, (define) el cual preferiblemente reduce o quita los problemas de la sensibilidad del solvente y enlace no especifico.

Description

COLORANTES FLUORESCENTES SOLUBLES EN AGUA LIBRES DE ENLACES DE AGREGACIÓN Y SUERO Y MÉTODOS Y PRODUCTOS RELACIONADOS INTRODUCCIÓN 5 La presente invención se relaciona generalmente a colorantes fluorescentes solubles en agua libres de enlaces de agregación y suero y métodos y productos relacionados. Los colorantes preferidos incluyen un fluoróforo luminiscente substancialmente plano enlazado a dos o más ligandos que se solubilizan. 10 SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama la prioridad provisional de los Estados Unidos No. 60/109,969 de Dandliker, et al., titulada "Water Soluble Fluorescent Dyes Free of 15 Aggregation And Serum Binding And Related Products and Methods", presentada el 25 de Noviembre de 1998, la cual es incorporada adjunto como referencia en su totalidad incluyendo los dibujos.

ANTEDEDENTES DE LA INVENCIÓN 20 Las publicaciones y otros materiales de referencia referidos aquí son incorporados adjunto por medio de esta referencia. La siguiente descripción de los antecedentes de la invención está dirigida para ayudar en el entendimiento de la invención, pero no es admitido que describa o constituya la técnica anterior de la 25 invención. "*fa*"*'>-'''- ! . ..

La absorción en el infrarrojo cercano y la emisión de porfinas, ftalocianinas y otras azaporfirinas y otros ciertos nitrógenos aromáticos que contienen macrociclos por algún tiempo estos compuestos se han hecho candidatos atractivos para el uso de etiquetas de fluorescencia. Las ftalocianinas, particularmente porque su fuerte absorción en el infrarrojo cercano (el coeficiente de extinción molar de aproximadamente 200,000), su alta producción cuántica en solventes orgánicos y la bien conocida resistencia a decolorarse de los colorantes comunes metaloftalocianina han dado origen a muchos esfuerzos para utilizarlos como etiquetas de fluorescencia. Sin embargo, los esfuerzos anteriores a lo largo de estas líneas no redituaron productos largamente y enteramente satisfactorios por la fuerte tendencia inusual de las ftalocianinas para asociarse, particularmente por medio del apilamiento en agregados cara a cara y también para enlazarse fuertemente a una variedad de otras moléculas superficiales (enlace no específico). Como resultado del apilamiento intramolecular las ftalocianinas insubstituidas tienen muy baja solubilidad en ambos solventes orgánicos y acuosos. Como es bien conocido, la tendencia para apilarse puede ser decrecida dramáticamente por medio de la introducción de uno o más grupos cargados, tal como sulfanato. Mientras que las ftalocianinas con tales substituciones pueden poseer una alta solubilidad en agua y en soluciones acuosas de electrolitos, la tendencia para enlazar no especificamente persiste largamente. Comúnmente, mucho del interés científico en el etiquetado de fluorescencia está enfocado en las aplicaciones que involucran materiales biológicos tales como secciones de tejidos, células, fragmentos de células, proteínas, incluyendo glicoproteínas y lipoproteínas, péptidos oligo-sacaridos y poli-sacaridos, oligo-nucleotidos y poli-nucleotidos y lípidos. Una tendencia para enlazar no específicamente en los ensayos de fluorescencia que involucran estos materiales puede interferir enmascarando particularmente la interacción específica de más interés. El enlace no específico así como la tendencia para apilarse puede ser reducido a niveles despreciables en los ensayos para las drogas terapéuticas por el acoplamiento de colorantes ftalocianinas a uno o más grupos polioxihídrocarbil, típicamente metoxi-interrumpido poli (etileno glicol) (PEG). Al mismo tiempo la adherencia de tales grupos preserva la absorción deseada y las características de emisión. La misma tecnología también es efectiva para una amplia variedad de otros colorantes en el infrarrojo cercano. Ver, la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 08/476,544, presentada el 7 de Junio de 1995, titulada POLYOXYHYDROCARBYL RELATED PRODUCTS AND METHODS FOR FLUORESCENT ASSAY por Dandliker et al, Lyon & Lyon sumario No. 211/167 (y las solicitudes de prioridad referidas adjunto), las cuales son incorporadas adjunto como referencia en su totalidad, incluyendo algunas dibujos. Recientemente, los avances significativos han sido hecho en el área de los colorantes de fluorescencia. En un aspecto, los colorantes siendo excitables por medio de radiación de longitud de onda más grande, tal como en longitudes de onda de rojo e infrarrojo, están ahora disponibles. Estos colorantes están descritos en dos solicitudes de patente asignadas comúnmente a: Arrhenius, solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. de Serie 701 ,449, presentada el 15 de Mayo de 1991 , titulada "Fluorescent Marker Components and Fluorescent Probes", (la cual es una continuación en parte de la solicitud de patente No. 523,601 presentada el 15 de Mayo de 1990), y Dandliker y Hsu, solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. de Serie 701 ,465, presentada el 15 de Mayo de 1991 , titulada "Fluorescent Dyes Free of Aggregation and Serum Binding" (la cual es una continuación en parte de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. de Serie 524,212, presentada el 15 de _^^_^^^^^^* Mayo de 1990). Estas solicitudes son incorporadas adjunto como referencia, en su totalidad, incluyendo algunos dibujos. Además los avances significantes que han sido hechos en incrementar la comprensión a través de la recopilación de datos y técnicas de análisis. Como esta descrito en Dandliker et al., patente de los Estados Unidos de América No. 4,877,965, titulada "Fluorometer", la cual es incorporada adjunto como referencia, en su totalidad, incluyendo algunos dibujos, las técnicas de tiempo de recorte son usadas en combinación con la recopilación de datos y técnicas de análisis para obtener una señal mejorada relativa a los antecedentes. Generalmente, la patente '965 considera la intensidad detectada como una función del tiempo para estar compuesta de señales de varias fuentes, incluyendo la fuente de señal deseada, y varias fuentes de antecedentes no deseados. La optimización de la señal deseada es alcanzada a través de la recolección de datos y técnicas de análisis. Además los avances significativos que han sido hecho en la capacidad de medir materiales relevantes en inmunoensayos. Por ejemplo, usando la técnica descrita en Dandliker, et al, solicitud de patente No. de Serie 490,770 presentada el 6 de Marzo de 1990, titulada "Transient State Luminescence Assays", (la cual es una continuación en parte de la solicitud de patente No. de Serie 365,420, presentada el 13 de Junio de 1989) incorporada adjunto como referencia, en su totalidad, incluyendo algunos dibujos, permite la unión y la forma libre de los materiales en un ensayo homogéneo para ser determinados. Generalmente, la técnica requiere medidas de decaimiento de dependencia del tiempo de la intensidad de los componentes de polarización paralela y perpendicular. Por la medida de la dependencia del tiempo de decaimiento de varios estados de polarización es posible determinar el enlace y la forma libre de los materiales tales como haptenos, péptidos, o pequeñas proteínas en un formato de análisis homogéneo. Significativamente, se requiere la no separación de los materiales libres y de unión. No obstante la mejora promisoria y significativa hecha en el campo de los colorantes fluorescentes, y los aspectos de análisis de datos, mantienen una necesidad en la técnica por colorantes adicionales con esas y/o otras ventajas y los cuales pueden también favorecer la reactividad química.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención explota un resultado no esperado que aún muy pequeños grupos tales como los -OH pueden producir protección efectiva contra los enlaces no específicos y el apilamiento en una molécula plana si dos de tales grupos están presentes, uno sobre ambos lados de la molécula plana. Incrementando la carga negativa neta y acentúa el efecto favorable de esos ligandos para muchos sistemas biológicos en los cuales la mayoría de "las biomoléculas" ellas mismas portan una carga negativa neta. Entonces, un aspecto de esta invención es que los efectos deseables de la ingeniería de las ftalocianinas y otros colorantes fluorescentes por el acoplamiento a los grupos polioxihidrocarbil pueden ser conseguidos en su lugar por medio de dos ligandos axiales muy pequeños (tales como -OH) que proporcionan la carga neta en los colorantes y es suficientemente grande. Para la mayoría de circunstancias esta carga neta preferiblemente es negativa, entonces en el intervalo de pH fisiológico la mayoría de materiales biológicos incluyen proteínas y ADN el cual también portará una carga neta negativa. Entonces, nosotros hemos encontrado que las dihidroxi-silicio-discarboxi-ftalocianinas altamente sulfonatadas tienen un enlace no -específico casi tan bajo como el de las proteínas de suero como las PEG-conjugadas, colorante no sulfunatado. i Att,4»y> En adición, surge una ventaja en que la formación de micelos por medio del PEG esta ausente. La ingeniería de colorante PEG en la concentración de colorante de 10'4 M y mayores se comportan en gran parte parecida a una macromolécula en su paso a través de las membranas designadas para prevenir el paso de las moléculas de 5 aproximadamente 30K daltones o mayores es muy difícil. También, los colorantes se mueven en la falta de volumen en la cromatografía de permeación de gel diseñada para separar macromoléculas de las moléculas pequeñas. En contraste, la sulfonatada, dihidroxi, discarboxi-silicio-ftalocianina (SDDSiPc) se comporta como es esperado para una molécula de su formula y peso. 10 Con respecto a el enlace no específico como se midió por medio de los cambios en fluorescencia polarización e intensidad, cuando los colorantes son expuestos, por ejemplo, para ser diluidos en suero humano, SDDSiPc se comporta aproximadamente como el mismo PEG acoplado al colorante (ver el ejemplo 6). En esta conexión es importante notar que la carga negativa por sí misma tiene una marcada influencia en el 15 decrecimiento del enlace no específico considerando que la no sulfonatada dihidroxi- discarboxi-silicio-ftalocianina (DDSiPc) muestra un enlace no específico apreciable. La hidroxi-aluminio-ftalo-cianina-trisulfonatada muestra en ambas sensibilidad fuerte a la magnitud iónica y también tiene un enlace fuerte no específico. De ello parece que la molécula de ftalociamina debe tener un ligando axial en ambos lados de la molécula 20 plana, pero que el grupo OH es suficientemente grande para eliminar virtualmente el enlace no específico si la carga neta es suficientemente alta. Otra ventaja de la presente invención es que la ingeniería de colorantes por medio de -OH u otros ligandos axiales pequeños que se solubilizan junto con la carga alta parece ser mucho más reactivo químicamente (en las reacciones de etiquetado) aún a 25 través de las moléculas que están siendo etiquetadas, es decir, proteínas y oligonucleótidos, ellas mismas están negativamente cargadas. Esto sugiere que los g^gg^|jíj g¡| ligandos PEG interfieren en el etiquetado de las macromoléculas, además de etiquetar los haptenos y otras moléculas pequeñas que usualmente se benefician fácilmente. Esta invención es muy inesperada en vista del enlace no específico fuerte de hidroxi-aluminio-ftalocianina-trisulfonato, de la cual uno podría presumir que la dehidroxi-dicarboxi-silicio-ftalocianina con una carga negativa neta más pequeña podría mostrar aún enlace no específico más fuerte que el de colorante de aluminio. Esta invención esta basada en parte en los resultados los cuales muestran completamente la marcha atrás (ver figuras 1 y 2 ). Los efectos de los otros ligandos axiales pequeños tales como: -OCH3, -O-CH2OH, Cl, -Br y -F también se espera que trabajen basados en los resultados reportados adjunto. Muchas otros macrociclos que contienen nitrógeno pueden ser metalizadas con átomos del grupo 14 con resultados similares. Tales macrociclos incluyen derivados y variantes estructurales de porfirinas, azaporfirinas, corroles, sapfirinas, pentafirinas, porficenos y otros macrociclos similares las cuales tienen extensivamente deshubicado un sistema de electrón pi. En vista de el hecho de que a ellas se incorporan muchas características deseables, una clase preferida especialmente de macrociclos comprende azarporfirinas derivadas y variantes estructurales. Las azarporfirinas derivadas incluyen derivados de mono-, di- y triazaporfirinas y porfiracinas. Ninguno de estos macrociclos puede opcionalmente tener anillos de fusión aromática. Tales azarporfirinas derivadas y variantes incluyen ftalocianina, benzotriazaporfirina y naftalocianina y sus derivados así como sus oxa-tia-o aza- variantes estructurales. La presente invención se relaciona entonces a componentes marcadores, pruebas fluorescentes, oligonucleótidos, ensayos de hibridación, e inmunoensayos que usan tales productos y métodos para hacer tales productos. De acuerdo a la presente invención, los componentes marcadores de etiquetado detectables son proporcionados que comprenden una porción de fluoróforo acoplados a dos o más ligandos pequeños que ^^^^.^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ s jü se solubilizan usualmente axiales, el eje estando definido por la geometría octahedral de los complejos formados por medio del átomo de metal central, el cual preferiblemente reduce o quita los problemas de sensibilidad del solvente y del enlace no específico. El uso de tales etiquetas detectables o componentes marcadores en inmunoensayos es ventajoso en que esas etiquetas tienen substancialmente las mismas intensidades de las componentes paralela y perpendicular de la emisión del estado de fluorescencia transitorio en la presencia o ausencia de fluidos biológicos tales como el suero. Entonces, los métodos de ensayo que usan estas etiquetas son capaces de detectar bajas concentraciones de un analito, un analito objetivo o análogo de él mismo en un fluido biológico. El término "analito" se refiere al compuesto o compuestos que van a ser medidos en un ensayo el cual puede reunir algún compuesto para el cual un receptor existe naturalmente o puede ser preparado el cual es mono o poliepitópico, antigénico o hapténico, un individual o pluralidad de compuestos los cuales comparten al menos un sitio epitópico común o un receptor. El término "analito objetivo" se refiere al compuesto o compuestos que van a ser medidos en un ensayo el cual puede tener algún compuesto para el cual existe naturalmente un receptor o que puede ser preparado el cual es mono o poliepitópico, antihigénico o hapténico, un individual o pluralidad de compuestos lo cuales pueden compartir al menos un sitio epitópico común o un receptor. Por "análogo" de un analito objetivo se entiende un compuesto o compuestos capaces de competir con el analito objetivo por el enlace a un receptor. El término "receptor" se refiere a una molécula o complejo molecular la cual es capaz de reconocer específicamente o creer haber reconocido por medio de un analito objetivo o análogo de él mismo. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser un receptor para un antígeno. Estos componentes marcadores pueden ser usados como etiquetas para etiquetar un analito, antígeno, anticuerpo u otra molécula. Estos componentes marcadores pueden opcionalmente funcionalizar de tal modo que incluyan un brazo enlazador el cual permite al componente marcador estar enlazado al analito, antígeno, anticuerpo u otra molécula. Una variedad de brazos enlazadores los cuales están ubicados para este propósito han sido descritos. Kricka, J.J.; Ligand-Binder Assays; Labels and Analytical Strategies; páginas 15-51 ; Marcel Dekker, Inc., New York, NY 5 (1985). Los componentes marcadores están enlazados al analito, antígeno, anticuerpo u otras moléculas usando técnicas convencionales. En un aspecto de la presente invención se proporciona un componente marcador de etiquetado detectable el cual comprende: (1) una porción de fluoróforo que comprende una estructura molecular plana substancialmente luminiscente, que tiene ío preferiblemente longitudes de onda de excitación de al menos aproximadamente 500 nm y (2) acoplada a ella dos o más ligandos axiales pequeños que se solubilizan. Ejemplos de fluoróforos preferidos, ligandos axiales pequeños que se solubilizan, y conexiones de los dos como están descritos en detalle adjunto. En adición, la evidencia es proporcionada para demostrar la efectividad de los componentes marcadores y reducir la sensitividad del 15 solvente y el enlace no específico. En modalidades preferidas especialmente, los componentes marcadores de la presente invención se pueden usar para hacer pruebas como se describió generalmente en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. de Serie 08/051 ,446, de propiedad común, presentada el 21 de Abril de 1993, usada en 20 inmunoensayos como se describió generalmente en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. de Serie 08/035,633, de propiedad común, presentada el 23 de Marzo de 1993, la descripción de ambas la cual es incorporada adjunto como referencia en su totalidad, incluyendo algunos dibujos. Los componentes marcadores de la presente invención son útiles como 25 etiquetas detectables, por ejemplo como etiquetas detectables en reactivos de diagnóstico y en ensayos tales como ensayos de enlace de fluorescencia y otros inmunoensayos. De Má¿________¿__i acuerdo a la presente invención, los componentes marcadores de etiquetado detectable son proporcionados para que tengan una porción de fluoróforo acoplado a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan los cuales en la presencia de componentes de suero en soluciones acuosas están caracterizados por medio de la emisión de fluorescencia en estado transitorio que tienen componentes paralela y perpendicular de la misma intensidad substancialmente como lo es sin el suero. El término "ligando axial" se refiere a un substituyente el cual, junto con un ligando macrocíclico, forma un complejo en coordinación con un átomo central. El ligando axial se encuentra normal al plano descrito por el ligando macrocíclico. Tales componentes moleculares se cree que también son útiles en el método tal como aquellos descrito en Walker et al, Clinical Chemistry 42:1 (1996) Clinical Chemistry 39:9 (1993); la patente de los Estados Unidos de América No. 5,593,867; y la solicitud de patente Europea No. 93117909.7, las cuales se incorporan adjunto como referencia en su totalidad, incluyendo algunos dibujos. Sorpresivamente, se ha encontrado que los componentes marcadores de la presente invención los cuales tienen un ligando multidentado macrocíclico con dos ligando axiales pequeños que se solubilizan, cada uno ubicado en ambos lados del plano del ligando multidentado, exhiben un enlace no específico disminuido dramáticamente a los componentes de suero, y exhiben sensibilidad despreciable al solvente. El término "sensibilidad al solvente" se refiere a cambios en el comportamiento de fluorescencia de una molécula que depende del sistema de solvente en uso, la mayoría se refiere notablemente a las diferencias en el comportamiento de fluorescencia en soluciones acuosas en comparación con solvente orgánicos (tal como DMF). Muchos fluoróforos los cuales exhiben alta intensidad de fluorescencia en solventes orgánicos tales como DMF muestran intensidad de fluorescencia disminuida substancialmente en soluciones acuosas. La intensidad de fluorescencia está relacionada a la concentración de la muestra y a la intensidad de la radiación de excitación. La intensidad de fluorescencia de un colorante particular se puede correlacionar a sus características de ligera absortividad (el coeficiente de extinción) y la eficiencia cuántica de fluorescencia, así como los factores del medio ambiente. Estos componentes marcadores también exhiben tiempos de decaimiento mejorados los cuales se aproximan a sus vidas medias radiactivas no apagadas. Nosotros usamos el término "tiempo de decaimiento" genéricamente para indicar el tiempo al cual debe transcurrir la concentración de la molécula excitada con el fin que disminuya de su concentración inicial hasta 1/e de aquel valor. El uso de términos estimando que varias medias vidas, de, por ejemplo, Demos, J.N., Exíted State Lifetime Measurement, Academic Press, New York, NY (1983), páginas 10, 35, 44 y 158. Estos componentes marcadores son útiles como etiquetas fluorescentes para la incorporación en pruebas fluorescentes. El término "prueba fluorescente" se refiere a un componente marcador que comprende una porción de fluoróforo el cual unido para o coordinar directamente a ambos o vía un brazo de enlace a un analito, antígeno, hapteno, anticuerpo u otra molécula la cual se usa en el ensayo, tal como un fluoroinmunoensayo para determinar la presencia de y/o cuantificar una substancia de interés. Algunos de estos componentes marcadores son útiles como etiquetas fosforescentes. Los componentes de la presente invención son útiles también como etiquetas para agentes de expresión in vivo y también como etiquetas para agentes usados en la terapia de tumores in vivo. Como corresponde, en general, los preferidos son los fluoróforos los cuales producen fluorescencia eficientemente tras la excitación con luz cuyas longitudes de onda caen en el intervalo de aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 nanómetros, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 600 a 800 nanómetros. Los fluoróforos adecuados incluyen aquellos los cuales absorben y/o emiten a longitudes de onda las cuales son distinguibles de la excitación y emisión máxima de las otras 1 soluciones componente (tales como proteínas presentes en una muestra) para minimizar la fluorescencia de fondo. Entonces estos componentes marcadores son particularmente útiles en ensayos usando muestras de fluidos biológicos, preferidos para estos usos son los fluoróforos que tienen excitación y/o emisión de longitudes de onda de al menos aproximadamente 500 nanómetros los cuales reducen la interferencia de la fluorescencia del ambiente de otros componentes de la muestra. Algunas muestras, tales como suero, pueden exhibir interferencia de fluorescencia de fondo considerable de las flavinas, flavoproteínas, NADH, etc., cuando son usadas las longitudes de onda de excitación de menos de 500 nm. Para ciertas aplicaciones, tales como los inmunoensayos de polarización de fluorescencia, los fluoróforos preferidos pueden también exhibir un alto grado de polarización de la fluorescencia cuando están en la forma unida, preferiblemente más grande que aproximadamente el 10% del valor teórico máximo para una polarización observable. El término "unido" se refiere a la condición en la cual una interacción de enlace ha sido formada entre una molécula y su pareja de enlace específico. Para ciertas aplicaciones tales como los ensayos de estado de transición de fluorescencia, los fluoróforos son preferidos y son también caracterizados por la medida de los tiempos de decaimiento de fluorescencia en el intervalo de aproximadamente 1 nanosegundo hasta aproximadamente 50 nanosegundos, preferiblemente en el ¡ntervalo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 nanosegundos. Para otras aplicaciones, tal como las etiquetas fosforecentes, los fluoróforos que tienen aún tiempos de decaimiento mayor pueden ser usados. Entonces, los fluoróforos preferidos los cuales producen eficientemente luz fluorescente, es decir, los cuales están caracterizados por su alta absortividad de la longitud de onda apropiada en alta producción cuántica de fluorescencia. Para ciertas aplicaciones, los fluoróforos preferidos han medido los tiempos de decaimiento de fluorescencia del orden de al menos 2 nanosegundos y exhiben un alto grado de polarización de la fluorescencia. Los ligandos axiales pequeños que se solubilizan preferidos incluyen -OH, -O-t-butil, -OCH2OH, -OCH2CH2OH, -OCH2CHOHCH2OH, -OCH2CH2-O-CH2CH2OH, -OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH, Cl, Br y F. Para alguno de estos ligandos axiales alineados por -O- al átomo central la estabilidad hacia la hidrólisis probablemente podría ser mejorada por medio de reemplazar el -O- enlace por un carbón directo a la conexión con el metal, es decir, carbón a silicio. En las modalidades preferidas, la porción de fluoróforo tiene un ligando macrocíclico multidentado substancialmente plano, coordinado al átomo central capaz de una coordinación con los ligando axiales pequeños que se solubilizan. Para usarse como un componente marcador en ensayos de enlace de fluorescencia, el átomo central adecuado a aquellos al cual puede ser coordinado a los dos ligandos axiales y los cuales no tienen un número atómico suficientemente alto para ocasionar una fluorescencia extensiva de apagamiento por medio de la transición a un estado de triplete. Los elementos preferidos para el átomo central incluyen el silicio, germanio y estaño, especialmente preferidos son el silicio y el germanio. La presente invención está también dirigida a métodos para determinar la presencia o cantidad de un analito objetivo en una muestra por medio del uso, como una etiqueta para el analito objetivo como un receptor el cual es capaz de reconocer específicamente el analito objetivo, una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada uno ubicado en ambos lados de la estructura molecular plana. El uso de tales componentes marcadores o etiquetas detectables en inmunoensayos es ventajoso en que esas etiquetas tienen substancialmente las mismas . 8A V^SáÍÁ, intensidades de las componentes paralela y perpendicular de la emisión de fluorescencia en la presencia y ausencia de fluidos biológicos tales como el suero. Entonces, los métodos de ensayo que usan esas etiquetas son capaces de detectar las bajas concentraciones del analito objetivo en fluidos biológicos. Los métodos de la presente invención son particularmente adecuados para usarse con el sistema de detección de fluorescencia mejorado descrito en la comúnmente asignada solicitud de patente de los Estados Unidos de América titulada "Fluorometer Detection System", Lyon & Lyon Docket No. 195/129, con No. de Serie 07/855,238, presentada el 23 de Marzo de 1992. Los componentes marcadores y etiquetas se cree que también son útiles en los métodos descritos en Walker, et al, Clinical Chemistry 42:1 (1996); Clinical Chemistry 39:9 (1993); patente de los Estados Unidos de América No. 5,593,867; y solicitud de patente Europea No. 93117909.7, todas las cuales son incorporadas adjunto como referencia en su totalidad, incluyendo algunos dibujos. En un aspecto, la presente invención está dirigida hacia los procedimientos de ensayo de inhibición competitiva que utilizan etiquetas particulares. En este aspecto, la presente invención está dirigida a un método de determinar la presencia o cantidad de un analito objetivo por medio del contacto de la muestra que se sospecha que contiene el analito objetivo con una cantidad conocida de un analito objetivo agregado o análogo del mismo enlazado a una prueba fluorescente la cual incluye un componente marcador de etiquetado detectable hecho de una porción de fluoróforo el cual incluye una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada uno ubicado sobre ambos lados de la estructura molecular plana; que contiene la muestra con un receptor capaz de reconocer específicamente el ligando objetivo; y que determina junto con la cantidad de prueba fluorescente la unión al receptor de la prueba fluorescente libre. La cantidad de unión de la prueba fluorescente libre en las muestras desconocidas puede ser comparado con las muestras en blanco y las muestras que contienen cantidades desconocidas de analito objetivo. En una modalidad preferida, la mezcla resultante de la muestra, la prueba fluorescente y el receptor son diluidos inmediatamente antes de la medida de la cantidad de unión y/o prueba de fluorescencia libre. El paso de dilución permite una sensibilidad mayor del ensayo. Particularmente preferidas son las diluciones de 2 veces a 100 veces, preferiblemente aproximadamente 7 veces hasta aproximadamente 50 veces, y más preferiblemente aproximadamente 35 veces. En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de inmunoensayo mejorado el cual utiliza una etiqueta para que junto con el analito objetivo (o análogo a él) o el receptor. La mejora es el uso de una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular plana. Los ensayos que usan este tipo de etiqueta son ventajosos en que ellos están libres de enlace de suero y agregación y de lo anterior, específicamente adecuada para probar muestras biológicas tales como el suero, plasma, sangre entera y orina. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de mejorar un "sandwich" o "dos sitios" de inmunoensayo que tienen los pasos de: (a) una muestra que se contacta que se sospecha contiene un analito objetivo con un primer receptor capaz de reconocer específicamente el analito objetivo para forma un complejo del analito objetivo y del primer receptor, el primer receptor siendo etiquetado con una prueba fluorescente la cual tiene una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos pequeños ligandos axiales que se solubilizan, cada cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular; (b) el complejo de contacto con un segundo receptor capaz de reconocer específicamente el ^^^^fe^^^^tí^ analito objetivo del primer receptor, el segundo receptor estando unido a un portador sólido, para formar un complejo del primer receptor etiquetado, el analito objetivo y el segundo receptor unido al portador sólido; (c) que se mide junto con la cantidad del primer receptor etiquetado asociado con el portador sólido o la cantidad del primer receptor etiquetado que no reacciona. Un ensayo tipo sandwich puede estar junto a un ensayo heterogéneo de un ensayo homogéneo. Si este es heterogéneo, puede incorporar el paso adicional de separar el portador sólido del primer receptor etiquetado que no reacciona. Los ensayos homogéneos son generalmente preferidos porque ellos son más rápidos. En otra modalidad, el ensayo puede incorporar el paso adicional de relacionar la cantidad del primer receptor etiquetado medido en la muestra desconocida a la cantidad del primer receptor etiquetado medido en la muestra de control libre del analito objetivo, o la cantidad del primer receptor etiquetado medido en muestras que contienen cantidades conocidas de analito objetivo. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para ensayo tipo sandwich simultaneo para determinar la presencia o cantidad de un analito objetivo en una muestra que tiene los pasos de: (a) contacto simultaneo de una muestra que se presume contiene un analito objetivo con primer y segundo receptores capaces de reconocer específicamente el analito objetivo, el primer receptor siendo etiquetado con una prueba fluorescente la cual tiene una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada uno está ubicado en ambos lados de la estructura molecular plana, y el segundo receptor estando unido a un portador sólido, para formar un complejo del primer receptor, el analito objetivo y el segundo receptor; y (b) la medición de ambas cantidades del primer receptor etiquetado asociada con el portador sólido o la cantidad del primer receptor etiquetado que no reacciona.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para un ensayo tipo sandwich simultaneo que tiene además el paso de relacionar la cantidad del primer receptor etiquetado medido a la cantidad del primer receptor etiquetado medido por una muestra control libre de dicho analito objetivo, o relacionar la cantidad del primer receptor etiquetado medida con la cantidad medida del primer receptor etiquetado en muestras que contienen cantidades conocida de analito objetivo. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de inmunoensayo de fluorescencia tipo sandwich para la medida de un analito objetivo el cual es capaz de reconocer dos receptores diferentes independientemente sin interferencia mutua. El método utiliza dos receptores, cada uno de los cuales está etiquetado con un colorante diferente. Por ejemplo, un receptor está etiquetado con un primer colorante que tiene absorción y emisión máxima de 680 nm y 690 nm, respectivamente, y el otro receptor está etiquetado con un segundo colorante que tiene absorción y emisión máxima de 695 y 705 nm, respectivamente. La detección y cuantización del analito puede hacerse usando ambas medidas en estado estable o en estado de transición. En ambos casos, para el ejemplo dado, la excitación podría ser a 680 nm y la detección podría ser a 705 nm. Este tipo de ensayo está basado en la transferencia de energía y es ventajoso en que es homogéneo. En modalidades preferidas la presente invención está dirigida a inmunoensayos de fluidos biológicos, que incluyen suero, plasma, sangre entera y orina. Preferiblemente, células de sangre roja en sangre entera son disueltas antes de ensayarse en muestras de sangre entera. Los métodos preferidos de disolución de células de sangre roja incluyen la adición de estearoil-lisolecitina, palmitoil-lisolecitina y miristoil lisolecitina. Dependiendo del tipo de inmunoensayo usado, el analito objetivo puede ser un antígeno, un hapteno o un anticuerpo; y el receptor puede ser un antígeno o anticuerpo. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclona. Los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención se pueden obtener por medio del método de Kohier & Milstein reportado en Nature 256:495-497 (1975). Alternativamente, ellos se pueden producir por medio de métodos recombinantes. Science 246:1275-1281 (1989). En una modalidad, el analito objetivo es una droga o una droga metabólica. La droga puede ser un estero.de, hormona, antibiótico, inmunodepresivo, antiasmático, antineoplastico, antiaritmico, anticonvulsivo, anti artrítico, antidepresivo, o glucosado cardiaco. Ejemplos de tales drogas ¡ncluyen digoxina, digitoxina, teofilina, fenobarbital. Tiroxina, N-acetilprocaenamida, primidona, amicacin, gentamicina, netilmicina, tobramicina, carbamazepina, etosuximida, ácido valproico, disopiramida, lidocaina, procainamida, quinidina, metotrexato, amitritilina, mortriptilina, imipramina, desipramina, vancomicina, y ciclosporina. En una modalidad preferida, la droga es digoxina. En otra modalidad, el analito objetivo es un péptido, por ejemplo, una hormona péptido tal como la hormona leutinizante, una hormona que estimula el folículo, coriogonatotropin humano, hormona que estimula la tiroides, angiotensina I, angiotensina II, prolactina o insulina. El péptido puede también ser un marcador de tumor tal como el antígeno carcinoembriónico. O, el péptido puede ser un virus o porción del mismo, por ejemplo, el virus rubela o una porción de él. Los métodos de la presente invención proporcionan maneras de medir analitos objetivos en concentraciones desde aproximadamente 1 x 10"5 M/L hasta aproximadamente 1 x 10.13 M, y particularmente en el intervalo de concentración de aproximadamente 1 x 10"9 M/L a aproximadamente 1 x 10"12 M/L. Para la medida de las drogas y sus metabolismos, los métodos presentes permiten la medida en el intervalo de aproximadamente 5 x10"9 M/L a aproximadamente 5 x 10"12 M/L, y particularmente, concentraciones desde aproximadamente 1 x 10"10 M/L a aproximadamente 5 x 10"10 M/L.

Para la medición de péptidos, los métodos presentes permiten la medición en el intervalo de aproximadamente 1 x 10"12 M/L. La medición de la cantidad de la prueba fluorescente unida o libre o ambas puede ser determinada por la medición de la fluorescencia en estado estable o por la 5 medición de la fluorescencia en estado de transición. En una modalidad preferida, la longitud de onda de la luz medida es mayor que aproximadamente 500 nm, preferiblemente mayor que aproximadamente 650 nm, y más preferiblemente mayor que aproximadamente 680 nm o 690 nm. Porque en el estado de transición el sistema de detección utiliza un diodo láser, es necesario para los colorantes tener una máxima ío excitación igualada a la longitud de onda de salida del diodo. Los colorantes se han hecho disponibles para igualar otros diodos láser disponibles comercialmente que tienen longitudes de onda de salida de 680, 690, 720, 750, ó 780 nm. Entonces, la longitud de onda de la luz medida puede ser mayor que aproximadamente 680 nm, 690 nm, 720 nm, 750 nm ó 780 nm. Más lejos en la región roja del espectro conforme uno se mueve, es 15 decir, la longitud de onda mayor, el enriquecimiento de la señal mayor es arriba de la de fondo. En una modalidad preferida, la detección y cuantización es ejecutada usando una medición en el estado de transición. La energía de transferencia en el estado de transición ofrece mediciones mejoradas debido a la optimización de las longitudes de 20 onda de absorción y emisión, así como debido a la optimización de los tiempos de decaimiento del primer y segundo colorantes. Tal optimización permite quitar la dispersión de Rayleigh y Raman, y maximizar eficientemente la transferencia y minimizar la excitación directa del segundo colorante por medio del primer colorante. En concordancia, ello es el objeto principal de esta invención para 25 proporcionar un mejorado FIAs con sensibilidad mejorada mayormente. Es aún otro objeto de esta invención proporcionar métodos FIA los cuales permiten la determinación precisa y rápida, algunas veces dentro de una situación de minutos. Es un objeto de esta invención proporcionar métodos FIA los cuales son capaces de medir concentraciones bajas en extremo de material fluorable. Es un objeto de esta invención proporcionar métodos FIA útiles para el establecimiento clínico en que ellos son rápidos y precisos, a un costo relativamente bajo y capaces de usarse con muestras biológicas no modificadas, tal como la sangre entera. Es además un objeto de esta invención proporcionar métodos FIA particularmente adaptados para explotar el sistema de detección de fluorescencia mejorado descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América titulada "Fluorometer Detection System", con No. de Serie 07/855, 238, presentada el 23 de Marzo de 1992, arriba referida. Es además un objeto de esta invención proporcionar métodos de ensayo para drogas terapéuticas homogéneas "mezclada y leídas" las cuales pueden ser usadas para determinar el nivel de digoxina en el suero, plasma o sangre entera. Es además un objeto de esta invención proporcionar un ensayo para péptidos, por ejemplo, para un virus rubela o porción de él. La presente invención también proporciona marcadores fluorescentes particulares y pruebas para usarse en inmunoensayos, como se describió adjunto. La presente invención también proporciona un método de sintetizar un componente marcador por la reacción de porciones de fluoróforo con una forma reactiva de los ligandos axiales que se solubilizan. La invención también caracteriza una prueba fluorescente que tiene un componente marcador de la invención, enlazado a un número de pares de enlace específicos o analito objetivo o un análogo. El termino "par de enlace específico" se refiere a dos moléculas diferentes (o composiciones) donde una de las moléculas tiene un área sobre la superficie o en una cavidad la cual específicamente reconoce y enlaza a una organización polar y espacial particular de las otras moléculas o complejo molecular que involucra otras moléculas.

Un método de sintetizar una prueba fluorescente es también proporcionado el cual incluye el paso de enlazar un componente marcador de la invención a dos o más ligandos axiales que se solubilizan. Un equipo útil para detectar un analito objetivo en una muestra que se sospecha que contiene el analito objetivo es también proporcionada, el equipo incluye un componente marcador o prueba de la invención. La presente invención está también dirigida a novedosos conjugados colorantes oligonucleótidos y métodos de sintetizarlos y métodos de usarlos. Los métodos de usar estos conjugados o pruebas involucran un ácido nucleico por medio de métodos de amplificación de ácido nucleico, o métodos de hibridación y métodos de secuenciación de ácido nucleico. La porción de colorante del conjugado colorante oligonucleotido es un componente marcador etiquetado detectable que tiene una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular plana. Entonces, en un aspecto, la presente invención está dirigida a una composición que tiene un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable el cual tiene una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular plana. Por "oligonucleotido" significa una cadena de residuos nucleotido.

Típicamente, un oligonucleotido útil en la presente invención tiene una longitud de 5 hasta 50 nucleotidos. Las pruebas oligonucleotido usados en el método de la presente invención incluyen polinucleotidos de ADN, ARN o alguna otra clase de secuencia hibridizable a secuencias de ácido nucleico. Se ha apreciado que tales secuencias de ácido nucleico puedan incluir bases análogas así como bases citosina que ocurren naturalmente, adenina, guanina, tiamina y uracil. Tales bases análogas incluyen hipoxantina, 2.6- . ¿ ? U diaminopurina y 8-azaguanina. Las pruebas pueden tener una forma doble trenzada o individualmente trenzada pero tienen preferiblemente una forma individual trenzada. Ellas se pueden preparar por síntesis directas, reacciones de extensión mediada polimerasa o por clonación o algún otro método conveniente. Por "enlazado" significa químicamente combinado por una molécula intermedia la cual está conectada a ambas porciones. En un aspecto preferido, la presente invención está dirigida a composiciones que tienen un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable que tiene una porción de fluoróforo el cual tiene un ligando macrocíclico multidentado substancialmente plano coordinado a un átomo central capaz de coordinar con los ligandos axiales los cuales están coordinados al átomo central o a ambos lados del ligando macrocíclico. Preferiblemente, el componente marcador etiquetado detectable tiene un tiempo de decaimiento en el intervalo de aproximadamente 1 nanosegundo a aproximadamente 50 nanosegundos, más preferiblemente, el tiempo de decaimiento está en el intervalo de aproximadamente 5 nanosegundos aproximadamente 20 nanosegundos. Particularmente preferida es una ftalocianina de silicio dicarboxi enjaulado. El colorante ftalocianina de silicio dicarboxi enjaulado tiene una variedad de grupos funcionales disponibles para el acoplamiento. Estos grupos incluyen carboxil libre, amino y N-hidroxisuciamida ester (NHS ester) libre. Preferiblemente, el oligonucleotido de la composición reclamada tendrá una longitud de 5 hasta aproximadamente 50 bases. La conexión del oligonucleotido o polinucleotido al marcador puede ser ejecutada usando una reacción de condensación que conduce, por ejemplo, a la formación de amida, ester, hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, urea, y uniones de tiourea. Por ejemplo, un enlace puede terminar en un grupo amino, preferiblemente primario. Otros enlaces pueden terminar en un grupo carboxyl. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para preparar ciertos colorantes conjugados oligonucleótidos. En una modalidad, tal método involucra los pasos de (a) la reacción de un oligonucleotido que tiene un enlace adherido y que termina en un grupo amina con una sucinimida N-hidroxi ester o un imidazolido de un componente marcador etiquetado detectable el cual comprende una porción de fluoróforo que comprende una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular, para formar un conjugado; y separar el conjugado formado en el paso (a) en el oligonucleotido o polinucleotido que no reacciona y del colorante que no reacciona. La adherencia de un ligando al oligonucleotido puede ser completada usando una diamina o un alcohol amino. Preferiblemente, el componente marcador etiquetado detectable comprende un colorante ftalocianina silicio discarboxi enjaulado. Alternativamente, la preparación de los oligonucleótidos colorantes conjugados puede ser conseguida: haciendo reaccionar un componente marcador etiquetado detectable el cual tiene una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular plana, con una carbodiimida en la presencia de hidroxi-benzotriazol y en la presencia de un oligonucleotido o polinucleotido para formar un conjugado; y que separa el conjugado resultante de otros componentes de la mezcla de reacción. Preferiblemente el componente marcador etiquetado detectable tiene un colorante ftalocianina silicio discarboxi enjaulado. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra que comprende los pasos de contactar la muestra de ácido nucleico con componente marcador etiquetado oligonucleotido, preferiblemente olígonucleotido conjugado colorante ftalocianina silicio discarboxi enjaulado capaz de hibridizar con dicha secuencia de ácido nucleico objetivo en una solución homogénea, y que detecta la presencia o cantidad de tal hibridación por medio de la fluorescencia polarizad a en el estado de transición. En aún otro aspecto , la presente invención está dirigida a un método para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra que tiene los pasos de contactar una muestra que se sospecha que contiene una secuencia de ácido nucleico objetivo con un oliconucleotido complementario capaz de hibridizar con dicha secuencia objetivo; que contacta dicha muestra con un componente marcador etiquetado oligonucleotido, preferibleme|nte un colorante ftalocianina silicio discarboxi enjaulado oligonucleotido conjugado capaz de hibridizar a dicho oligonucleotido complementario; y que detecta la presencia o cantidad de hibridación de dicho conjugado con dicho oligonucleotido complementario En además ot o aspecto, la presente invención está dirigida a métodos para la detección o cuantificación de un ácido nucleico objetivo en donde el ácido nucleico objetivo es un producto de amplificación de ácido nucleico. Los métodos de amplificación de ácido nucleico incluyen cadenas de reacción polimerasa (PCR), cadenas de reacción ligasa (LCR), secuencias autosustentadas de replicación (3SR) y sistemas de amplificación basados en tran|scripción (TAS), las cuales son discutidas adjunto. En otro aspect|o , la presente invención está dirigida a un mejoramiento en los métodos de hibridación de ácido nucleico o en el método de amplificación de ácido nucleico empleando como eettiiqueta una prueba fluorescente la cual tiene un componente marcador etiquetado detectable que tiene una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular plana. Los métodos de la presente invención son particularmente útiles cuando se usan con un sistema de detección en el estado de transición correlacionado en el tiempo, como se describió en la asignación generalmente Studholme, et al. Solicitud de patente de los Estados Unidos de América titulada "Fluorometer Detection Systema", con No. de Serie 07/855,238, presentada el 23 de Marzo de 1992. Aquellas características del sistema en la detección del estado de transición que permite la lectura directa de la polarización de la muestra dependiente del tiempo. El sistema usa un diodo láser el cual puede ser modulado a muy altas frecuencia, es decir, un intervalo de 10 MHz y exhibe una gran potencia de salida. Típicamente el tiempo de láser "en contacto" es aproximadamente 2-3 nanosegundos. Los fotones de la solución son detectados usando un tubo fotomultiplicador (PMT) que opera en un fonón individual en modo de conteo. El evento del fonón con el tiempo relativo del evento del fotón es comparado con el tiempo del pulso láser que está determinado. Almacenando los tiempo del evento del fotón individual en un histograma de frecuencia de fotones como una función de tiempo que es generada. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para monitorear la cinética de los procesos de amplificación de ácido nucleico, y/o la cuantificación de ácido nucleico en una muestra objetivo. Por ejemplo, durante la amplificación por medio de PCR, una prueba que consiste de un oligonucleotido el cual ha sido en ambas maneras "encapuchado" y etiquetado con una composición que tiene un oligonucleotido o polinucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable el cual tiene una porción de fluoróforo que tiene una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños se solubilizan, cada uno de ellos localizado en ambos lados de la estructura molecular plana, puede ser agregado directamente a la reacción PCR. Por medio del "encapuchado" se entiende que el extremo 3' ha estado reaccionando con dideoxinucleotido. A cada fase de enfriamiento, la hibridación con un producto amplificado puede ser seguido cinéticamente. Conforme la concentración del producto amplificado se incrementa, la velocidad de combinación de la prueba con el producto amplificado se incrementa y cuantifica la concentración del producto amplificado. Esta información junto con el número de ciclos cuantifica la cantidad de ADN original en la muestra antes de la amplificación. El uso de una secuenciación. Otros aspecto de esta invención es la aplicación de la secuenciación del ADN en el cual el componente marcador etiquetado detectable es incorporado en ambas formas químicamente o enzimáticamente en el ADN: el ADN es adherido en numerosos puntos y la colección resultante de los fragmentos es analizada por medio de electrofóresis de gel. Si se desea, el etiquetado puede ser hecho por diferentes componente marcadores, uno para cada una de las bases para facilitar el análisis. Otro aspecto de esta invención es el amplio alcance de aplicación para algunos diseños, variación o modificación de fluorómetros. Esta amplitud de aplicabilidad está ilustrada a los siguientes ejemplos de un tipo especializado de instrumento. En un medio no absorbente una onda de luz que atraviesa el medio A circundante por un segundo medio B de bajo índice de refacción que sufre la reflexión total interna en las fronteras del medio A si el ángulo de incidencia es mayor que el ángulo crítico. Sin embargo, el campo electromagnético de la totalidad reflejada de la luz penetra en las fronteras una distancia corta y allí puede producir un efecto físico tal como la excitación de las moléculas de fluoróforo localizadas cerca de la interface entre A y B. Este efecto capacita los ensayos homogéneos, basados en fluorescencia en los cuales la reacción específica ocurre con moléculas inmovilizadas sobre la superficie del medio A y entonces en la interface en la cual está solamente la ubicación donde la excitación de la fluorescencia puede ocurrir. Una muestra de vidrio o placa de plástico actúa en ambos como una guía de onda óptica para la luz incidente y como un portador para un receptor específico previamente depositado en una ubicación conocida sobre la superficie. Esta metodología ha sido nombrada "fluoroinmunoensayo de luz evanescente" (Herrón et al. Patente de los Estados Unidos de América No. 5,512,492). Ventajosamente, la presente invención incorpora las características de muy largos corrimientos de Stokes que utilizan colorantes fluorescentes basados en N- que contienen macrociclos (con las clases enlistadas abajo) las cuales comúnmente tienen una región de excitación cercana al ultravioleta con emisiones en la región del infrarrojo cercano del espectro. Tales colorantes son aplicables a ensayos inmunoreceptores en el estado estable o modos de estado de transición. Las fuentes de excitación incluyen arcos de mercurio, láseres de nitrógeno y láseres de nitrógeno bombeados por láseres de colorante. Alternativamente, estos mismos colorantes pueden ser excitados en el infrarrojo cercano con diodos láseres que permiten resultados excelentes con una excitación de pulso y una detección de estado de transición. La selección de la fuente depende de la posición de la banda de absorción del colorante particular en cuestión, el modo preferido de excitación y detección, si el estado estable o el estado de transición y los requerimientos de espacio. La inclusión de estas características en la química y en el diseño de instrumentos para "fluoroinmunoensayo de luz evanescente" conduciría a un muy bajo umbral junto con un nivel de señal alta y entonces en favor de la alta sensibilidad del ensayo. El breve resumen de la invención descrito arriba no es limitante de otras características y ventajas de la invención que serán aparentes de la siguiente descripción de las modalidades preferidas, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra efectos del enlace no específico y solvente en la intensidad de fluorescencia, que muestra un efecto de protección de silicio como es comparado al aluminio presumiblemente porque los dos Ngandos axiales de Si como son comprados a solamente uno para Al. Las abreviaciones: Al trisulf = hidroxialuminotrisulfonato; Si discarb = bis-hidroxi (2,3-discarboxiftalocianino) silicio IV; Si discarb sulf = sulfonatado Si discarb; BBKCI = borato neutralizado KCl (ver Materiales, ejemplo 6); NHS = suero humano normal estancado; Cts = cuentas obtenidas durante un ciclo de medida del fluorómetro del estado de transición FAST1. Cts es proporcional a la intensidad de fluorescencia. La figura dos muestra una comparación de derivados ftalocianina de aluminio y silicio con respecto a los efectos solventes y al enlace no específico. Los resultados indican que la presencia de Si (con dos ligandos axiales) produce dramáticamente una mejor realización que los que tienen Al como un átomo central. Esto está evidenciado por un cambio relativo mucho más pequeño en la polarización para dihidroxidiscarboxiciliconftalocianina (Si discarb) como es comparado al Al trisulfonato (Al trisulf). Una mejora más adelante es permitida por medio de la sulfonación como se muestra por dihidroxi discarboxi silicio ftalocianina sulfonatado (Si discarb, sulf) el cual tiene probablemente dos o tres grupo sulfonatados. Los valores para la polarización en glicerol que indican aproximadamente los límites potenciales podrían ser si el colorante fuera usado como una etiqueta. La polarización está en unidades de minipolarización (mP). Para más información sobre las abreviaciones ver la leyenda de la figura 1. Aquellos entendidos en la técnica reconocerán que los colorantes de la invención se pueden usar en una variedad de aplicaciones de fluorescencia sobre un amplio rango del espectro visible. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de la siguiente descripción de las modalidades preferidas de ella misma y de las reivindicaciones. Los dibujos son necesariamente a escala. Ciertas características de la invención pueden ser exageradas en la escala o mostradas en una forma esquemática en el interés de claridad y de ser concisos.

DETALLADA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente a componentes marcadores fluorescentes mejorados que tienen una porción substancialmente plana luminiscente ligada a dos o más ligandos axiales pequeños, y productos relacionados y métodos. El fluoróforo preferido involucra ligandos axiales pequeños que se solubilizan, propiedades de fluorescencia y métodos de síntesis y usos que son descritos abajo. La siguiente descripción incluye modos preferidos de llevar a cabo la invención y se hace con el propósito general de ilustrar los principios generales de la invención además de que limitan la invención de alguna manera.

COMPONENTES MARCADORES PREFERIDOS Lo siguiente es una breve descripción de los componentes marcadores preferidos que van a ser usados en inmunoensayos de fluorescencia de la presente invención. Una discusión más completa se encuentra en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América generalmente asignada al No. de Serie 701 ,449 y 201 ,465, las cuales, como se hizo notar arriba, han sido incorporadas adjunto como referencia.

A. PORCIONES DE FLUOROFORO PREFERIDAS.

Las porciones adecuadas de fluoróforo comprenden una estructura molecular luminiscente substancialmente plana. Las porciones de fluoróforo preferidas son aquellas a las cuales la estructura molecular luminiscente substancialmente plana tiene un ligando multidentado macrocíclico substancialmente plano el cual coordina un átomo central el cual puede coordinar con dos ligandos axiales, en uno o ambos lados del ligando macrocíclico (es decir, que tiene una trans orientación). Los átomos centrales preferidos los cuales pueden formar complejos de coordinación octahedral que contienen dos ligandos con una orientación transversal o axial, en ambos lados y perpendiculares al ligando macrocíclico plano. Para usarse como componentes marcadores fluorescentes en ciertas aplicaciones el átomo central no tendría un número atómico tan alto (aproximadamente 30 o menor) de tal modo que la fluorescencia no es disminuida a través de la interacción de acoplamiento con los orbitales del átomo central. Los ligandos multidentados preferidos incluyen macrociclos que contienen nitrógeno los cuales tienen sistemas de anillos conjugados con electrones pi. Estos macrociclos pueden ser sustituidos opcionalmente, la substitución que incluye unos carbones que puentean sobre los nitrógenos. Los macrociclos adecuados incluyen variantes estructurales derivados de porfirinas, azaporfirinas, corrinas, safirinas, pentafirinas y porficenas y otros macrociclos parecidos los cuales contienen electrones los cuales están desubicados extensivamente. Estos macrociclos pueden opcionalmente tener anillos aromáticos fusionados con o sin átomos heterogéneos tales como N, O o S.

En vista del hecho de que ellos incorporan muchas de las características arriba notadas, una clase preferida especialmente de macrociclos comprenden los derivados de porfirinas, y los derivados de azaporfirinas (derivados porfirinas de donde al menos uno de los carbones que puentean es reemplazado por medio de un átomo de nitrógeno). Los derivados de azaporfirinas incluyen derivados de mono-, di- y triazaporfirinas y porfirazina. Estos macrocilcos pueden opcionalmente tener anillos aromáticos fusionados con o sin átomos heterogéneos tales como O, N o S. Estos derivados azaporfirinas incluyen ftalocianina, benzotriazaporfirina y naftalocianina y sus derivados. La preparación y cualidades de fluorescencia de muchos de estos compuestos es conocida y algunos están disponibles comercialmente. Ver la solicitud de patente de los Estados Unidos de América con No. de Serie 201 ,465 que está referenciada y citada adjunto, particularmente, las referencias 2 - 5 en aquella solicitud. Para ciertas aplicaciones, tales como los ensayos de fluorescencia de polarización, los derivados de azaporfirina que son preferidos los cuales exhiben un alto grado de polarización en la forma unida, que son, aquellos los cuales emiten luz polarizada fuertemente. Para estas aplicaciones, los macrociclos preferidos que tienen un menor grado de simetría, preferiblemente tiene simetrías menores que D4n. Un grupo preferido incluye macrociclos que tienen al menos un anillo aromático fusionado. Entonces, los macrociclos preferidos incluyen derivados de azaporfirinas que tienen anillos aromáticos fusionados en las posiciones en las cuales resulta el decrecimiento de la simetría. Las clases preferidas de derivados de azaporfirinas incluyen derivados de monoazaporfirina, diazaporfirina, y triazaporfirina que tienen menor simetría que D4n. Otros colorantes fluorescentes preferidos son descritos en "Polyoxydydrocarbyl Related Products and Methods for Fluorescence Assay", solicitud de los Estados Unidos de América No. 08/476,544, presentada el 6 de Junio de 1995, Lyon & Lyon sumario No. 211/167, la cual se incorpora adjunto como referencia en su totalidad, incluyendo algunos dibujos.

B. LIGANDOS PREFERIDOS AXIALES PEQUEÑOS QUE SE SOLUBILIZAN Los ligandos preferidos axiales pequeños que se solubilizan preferidos incluyen -OH, -O-t-butil, -OCH2OH, -OCH2CH2OH, -OCH2CHOHCH2OH, -OCH2CH2-O-CH2CH2OH, -OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH, Cl, Br y F.

C. COMPORTAMIENTO DE LA ABSORBENCIA Y POLARIZACIÓN DE LOS COMPONENTES MARCADORES PREFERIDOS Estos componentes marcadores los cuales comprenden un átomo central (por ejemplo, el silicio) acoplados a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan pueden ser caracterizados por las medidas de su fluorescencia en estado de transición. En tales mediciones la intensidad de los dos componentes de polarización ambas paralelas o perpendiculares a la dirección de polarización del pulso de excitación es monitoreado sobre un periodo de tiempo igual a aproximadamente 3 veces el tiempo de decaimiento del componente marcador. Tales curvas reflejan el coeficiente de extinción, la producción cuántica, el tiempo de decaimiento y el estado de polarización y suministro sensitivo indicaciones de las condiciones físicas y químicas del componente marcador. Por ejemplo, si el estado excitado esta siendo desactivado o convertido al estado de triplete de todas las intensidades es disminuido y los tiempos de decaimiento acortados. Si el movimiento brawniano giratorio de las moléculas está siendo alterado por medio de un incremento en la viscosidad o está siendo unido a una molécula larga, la proporción de la intensidad de las componentes paralela a la perpendicular se incrementa.

Algunos componentes marcadores de acuerdo a la presente invención se muestran, dentro del error experimental de aproximadamente 5%, algunas intensidades, el tiempo de decaimiento y la polarización en DMF (un solvente orgánico) como en SAP (salina acida fosfato, un neutralizador neutro acuoso). Para alguna extensión de estas propiedades que son compartidas por otras preparaciones de componente marcador. Una propiedad distintiva e importantes de los componentes marcadores de la presente invención es una intensitividad a los componentes (y falta de enlace a) en el suero el cual es evidenciado por medio de una falta de cualquier efecto medido significativo del suero sobre las intensidades, el tiempo de decaimiento o magnitudes relativas de las componentes polarizadas de la fluorescencia. Esta propiedad es crucial para los componentes marcadores que van a ser usados para las aplicaciones tales como los ensayos que usan materiales biológicos.

II. PEPARACION DE LOS COMPONENTES MARCADORES PREFERIDOS De acuerdo a un método de preparación de los componentes marcadores preferidos de la presente invención, la porción de fluoróforo apropiada que tiene hidroxi o grupos halida como ligandos axiales es reaccionada con un reactivo para formar la proporción que se solubiliza en una reacción de intercambio de ligandos de acuerdo al esquema de reacción general: Mcl-CA-(X)2 + 2(SM) ? Mcl-CA-(SM)2 + 2X de donde Mcl denota el ligando macrocíclico, CA el átomo central, X el ligando desplazado y SM la porción que se solubiliza. Esta reacción puede ser llevada a cabo en forma pulcra o, si se desea, en solvente. El solvente adecuado incluye, quinolina, THF, DMF, imidazol cuando ella misma se ha disuelto en uno de los otros solventes enlistados y los similares. Las temperaturas de reacción adecuadas pueden variar, dependiendo de la naturaleza del material de inicio macrocíclico y el grupo que solubiliza. La reacción está generalmente completa en aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 24 horas. La mezcla de reacción puede ser convenientemente calentada bajo reflujo o por medio de así como un baño de arena. Por conveniencia, la reacción se puede llevar a cabo a presión ambiente.

Como se cree que esta reacción toma lugar en dos pasos, con un grupo polioxihidrocarbil que coordina como un ligando axial en el tiempo.

Cuando es usado como etiquetas fluorescentes en inmunoensayos de fluorescencia, estos componentes marcadores pueden ser enlazados a un miembro de un par de enlace específico ("compañero de enlace etiquetado") o en un análogo de un tal miembro. El término "compañero de enlace" se refiere a una molécula o complejo molecular el cual es capaz de reconocer específicamente o ser reconocido por una molécula particular o complejo molecular. El componente marcador puede ser directamente adherido o conjugado a él o adherido a un conjugado vía un brazo de enlace. lll. UTILIDAD Los componentes marcadores de la presente invención son útiles como etiquetas fluorescentes para pruebas fluorescentes y en ensayos de enlace de fluorescencia y también como etiquetas para crear imágenes in vivo y terapia de tumores in vivo.

Estos componentes marcadores pueden ser ventajosamente usados como etiquetas de fluorescencia en ensayos de enlace de fluorescencia convencionales, que incluyen inmunoensayos de fluorescencia de polarización. Cuando así son usados, estos componentes marcadores pueden ser enlazados a un miembro de un par de enlace específico ("compañeros de enlace etiquetado") o un análogo de un tal miembro. El componente marcador puede ser directamente adherido o conjugado a él o unido o conjugado vía un brazo de enlace.

Estos compañeros de enlace etiquetado son útiles en ensayos que tiene una variedad de formatos, tal como el ensayo el cual involucra la competencia por analito o compañero de enlace analito (si un analito etiquetado o un analizo análogo se usan) y pueden ser usados en ambos ensayos homogéneos o heterogéneos.

En vista de su ventajosa libertad de soluciones acuosas en agregación y la falta de sensitivad del solvente (que indican una agregación no detectable) en combinación con su falta de enlace no específico a los componentes de suero y a otras macromoléculas biológicas, estos marcadores son especialmente adecuados para usarse en ensayos para detectar un analito en una muestra que contiene un fluido biológico tal como el suero. Entonces, estos componentes marcadores puede ser usados como etiquetas para pruebas fluorescentes para detectar analitos en soluciones en donde el enlace es no específico por medio de componentes de suero que podrían severamente comprometer la sensitividad de un ensayo, afectando en ambos casos su precisión y exactitud.

Alternativamente, estos componentes marcadores pueden ser usados como agentes para crear imágenes in vivo. Cuando son usados como agentes para crear imágenes, estos componentes marcadores son conjugados a otro miembro de un par de enlace específico para dar a un compañero de enlace etiquetado. El compañero de enlace etiquetado se introduce en el animal. Si el otro miembro del par de enlace especifico está presente, el compañero de enlace etiquetado se enlazará a él y la señal producida por el componente marcador se puede medir e identificar su localización.

Estos componentes marcadores pueden también ser usados en la terapia de tumores in vivo. Por ejemplo, la terapia fotodinámica involucra el uso de componentes marcadores como agentes fotosensitivos. El componente marcador (etiqueta fluorescente) es conjugado a un compañero de enlace el cual puede reconocer específicamente y enlazar a un componente de una célula tumoral.

La presente invención proporciona pruebas de ácido nucleico y métodos de hacer y usar las pruebas. Los métodos de usar las novedosas pruebas de ácido nucleico incluyen varias técnicas de secuenciación de hibridación de ácido nucleico ahora conocidas o desarrolladas después, y varias técnicas de amplificación de ácido nucleico ahora conocidas o después desarrolladas. Las pruebas (también referidas como conjugados adjunto) y métodos de la presente invención permiten el logro de la sensitividad de 1 fmole en los ensayos de hibridación homogénea. Como se demostró, adjunto, esta sensitividad es comparable a la sensitividad alcanzada por las técnicas de medición de hibridación heterogéneas comunes. Como se hizo notar arriba, sin embargo, los ensayos heterogéneos comunes tienen varias desventajas, los cuales resultas de la gran cantidad de pasos involucrados en los ensayos, que incluyen el riesgo incrementado de contaminación y el incremento del tiempo requerido para ejecutar el ensayo. Otras ventajas de las composiciones y métodos de la presente invención serán aparentes aquellas en el arte de una revisión de los ejemplos proporcionados adjunto.

EJEMPLOS Para asistir en el entendimiento de la presente invención los siguientes ejemplos se incluyen los cuales describen los resultados de una serie de experimentos.

Los siguientes ejemplos que se relacionan con esta invención no serán, desde luego, construidos con limitantes especificas de la invención y tales variaciones de la invención, ahora conocidas o después desarrolladas, los cuales podrían estar dentro de la visión de una persona hábil en la técnica que son consideradas para caer dentro del alcance de la invención como está descrita adjunto y de sus reivindicaciones posteriores adjuntas.

EJEMPLO 1 : SÍNTESIS DE DI I MIDA ACIDO TETRADIIMINOPIROMELITICA DE 1. 2. 4. 5-TETRACIANOBENZENO (TCNB).

Los 20.0 g (0.112 moles) de TCBN fueron secados al vacío por aproximadamente 1 hora en un matraz de 1 I de triple cuello. El matraz fue adaptado con un agitador lento de aspa de teflón de gran torque, el agitador de aspa de teflón y una boca para el burbujeo del amoniaco o líquido que se agrega, y un condensador enfriador de agua. Después de irrigar el aparato completo con hidrogeno, 400 ml de metanol se agregaron, el agitado empezó a la temperatura ambiente y el amoniaco burbujeó lentamente.

La absorción de amoniaco es muy eficiente y después de pocos minutos la suspención comienza a ser una solución de un verde pálido claro. Pocos minutos después (con la adición constante de amoniaco) la solución comienza a ser turbia y la temperatura se eleva ligeramente. Después de 40 minutos del comienzo de la adición del amoniaco la mezcla de reacción se hace difícil para agitar y se agregan 200 ml más de metanol los cuales se agitan con la adición del amoniaco que se continua. En este puente la absorción de amoniaco es aún muy eficiente como se evidencia por la falta de burbujeo que emerge de la superficie de la suspensión. Después de 100 minutos fue necesario agregar un adicional de 175 ml de metanol para habilitar el agitamiento. Después de 125 minutos grandes cantidades de amoniaco empezaron a aparecer en la salida del condensador y la mezcla de reacción se puso dentro de un baño de agua a 45°C con el mezclado continuado, calentando y agregando el amoniaco por un tiempo adicional de 240 minutos. Después del enfriado, la mezcla de reacción fue almacenada a +4°C por 24 horas. El sólido entonces se filtró por medio de succión en un papel Whatman del No 42 y secado al vacío. Produjo 23.2 g (0.109 moles).

EJEMPLO 2: SÍNTESIS DE BI-CLORO SILICIO (IV) (2.3 DICARBOXIFTALOCIANINO (30 g; 0.207 moles) de diiminoisoindolina y dimida acida tetraiminopiromelitica (10.5 g, 0.050 moles) fueron pulverizadas juntas y secadas al vacío durante toda la noche en un matraz de 3 cuellos de 1 I. El matraz fue adaptado con un mezclador de aspa de teflón, un septo, un termómetro y un condensador de reflujo con un tubo de secado de gel de silicio. El aparato con reactantes agitados fue irrigado con nitrógeno seco y bajo el nitrógeno, se agregaron 600 ml de quinolina y se mezclaron pr 30 minutos. Bajo el flujo de nitrógeno. Resultando en una suspensión fluida uniforme. De lo anterior, se agregaron 60 ml de tetracloruro de silicio sobre un periodo de 5 minutos lentamente a través del septo. Agitando la solución oscurecida y sin calentar se continuó por 15 minutos.

Entonces, con el agitado continuo, un baño de aceite precalentado a 195°C el matraz fue elevado en su posición para sumergirse un nivel arriba de su contenido. Después de 5 minutos la temperatura del baño había caído a 175°C y después de otros 15 minutos el baño se estabilizó a 185-190°C donde se mantuvo por 60 minutos adicionales. El baño fue entonces disminuido y a la mezcla de reacción se le permitió enfriarse por aproximadamente 15 minutos. El flujo de nitrógeno fue entonces iniciado para quitar el tetracloruro de silicio que no reaccionó el cual fue detectado por medio de un papel de pH en húmedo a la salida del condensador. Después de aproximadamente 45 minutos de ventilación el baño ahora a 100°C se reemplazo por un calentamiento continuo lento hasta aproximadamente 130°C para facilitar la separación del tetracloruro de silicio el cual se completo por medio de la prueba de arriba después de un período adiconal de 70 minutos solamente cuando los humos de quinolina fueron evidentes.

El baño entonces se quitó y cuando la mezcla de reacción se enfrió a una cantidad de 80°C una mezcla de agua de 424 ml y 424 ml de ácido clorhídrico concentrado se agregaron con el mezclador. El calor fue evolucionando y la mezcla final fue acida. Los productos de reacción puestos a la temperatura ambiente. El próximo día 424 ml de agua adicionales y 424 de ácido clorhídrico concentrado se agregaron con la mezcla y la mezcla se le permitió estabilizarse durante toda la noche a la temperatura ambiente.

La mezcla de reacción fue entonces filtrada en un embudo Buchner (papel de 24 cm), lavado con agua y aire seco en la campana durante toda la noche. El pastel del filtro húmedo fue entonces sacudido en un litro de acetona y filtrado. El material lavado fue secado en la campana por dos días, el material secado (50 g) fue pulverizado en un mortero con acetona y la mezcla fue agitada, filtrada y secada en el vacío saliendo 47.9 g de un sólido finamente dividido obscuro.

EJEMPLO 3: HIDRÓLISIS DE BI-CLORO (2.3-DICARBOXI FTALOCIANINO. SILICIO (IV) (COLORANTE DICARBOXIDICLORO). 98 ml de ácido sulfúrico concentrado se colocaron en un matraz de fondo redondo de 250 ml que usa un embudo de tubo largo para evitar que se moje el cuello del matraz. Con un magneto que remueve 16.3 g de colorante dicarboxidicloro que fue agregado en pequeñas porciones a través del embudo con un tubo más corto. La adición se extendió por un periodo de aproximadamente una hora hasta permitir que los grumos ___^yi¡íá^*^^j*^jj de colorante se dispersaran antes de agregar más sólido. Un tubo de secado fue adherido al matraz y la mezcla se calentó en un baño de aceite y se mantuvo a 50°C durante 24 horas.

El matraz de reacción se quito del baño de aceite y enfriado con hielo. 75 ml de agua se agregaron cuidadosamente en pequeñas porciones y sin enfriar, la mezcla se calentó con un agitador en un baño de aceite a 80°C por 20 horas. Después de enfriar, la mezcla fue vaciada en hielo en un vaso picudo de un litro y agitada.

La mezcla fue centrifugada a la temperatura ambiente a 2000 x g por 30 minutos. Los sedimentos fueron suspendidos en agua (con una capacidad de 250 ml) y otra vez centrifugados. Este lavado fue repetido una vez mas, los sedimentos se recolectaron y suspendidos en 300 ml de 1M K2CO3. La mezcla fue calentada con agitación en un vaso picudo cubierto con una ventana de vidrio. En 10 minutos la temperatura alcanzada de 90°C y el calentamiento se continuo hasta aproximadamente 93°C por 50 minutos o más. Mientras aún la mezcla estaba caliente fue acidificada con ácido clorhídrico concentrado y se le permitió enfriarse y se puso a una temperatura ambiente por 2 días.

El sólido fue entonces recolectado con un embudo Buchner de 11 cm de papel Whatman No. 42, la filtración se llevo a cabo durante una cantidad de 1 hora. El sólido fue lavado en el embudo con porciones de 3x100 ml de agua y aire seco en la campana El sólido fue entonces quebrado y secado al vacío sobre P2O5 y KOH. Produjo 13.3 g (87%).

EJEMPLO 4: PURIFICACIÓN DE BI-HIDROXI (2.3-DICARBOXI-FTALOCIANINO) SILICIO IV (COLORANTE DICARBOXI) POR MEDIO DE LA ABSORCIÓN CROMATOGRAFICA DE SILICIO El colorante dicarboxi crudo, 3 g, producido como en el ejemplo 3, fue colocado en una botella de 250 ml a la cual se le agregaron 100 ml de MeOh que contenía 2% (v/v) de amina etildiisopropil (DIEA) y la mezcla fue agitada durante 30 minutos. Después de este tiempo se agregaron 43 g de silicio (EM Science) y la mezcla fue sacudida con la mano para formar una pasta obscura. Después de 20 minutos y 100 ml de MeOH adicionales con 2% de DIEA que fueron agregados, la botella fue invertida varias veces y el contenido fue agitado durante 20 minutos. El ajuste de las características del solvente por agregarle el EtOH en adición al MeOH y DIEA alteraron la composición del colorante extraído y la extracción habilitó al componente individual. El sólido fue entonces filtrado sobre un embudo de vidrio sintetizado (de porosidad fina , de 6.5 cm de diámetro) bajo presión reducida. Para prevenir una gran perdida de MeOH la presión reducida se mantuvo por medio de la conexión a un tanque parcialmente evacuado. Después del filtrado de toda la noche, el residuo fue lavado por dos porciones de 50 ml de MeOH + DIEA la cual requirió alrededor de 30 horas. El filtrado (230 ml) fue concentrado en un evaporador rotatorio ya cercano a la resequedad. El residuo fue disuelto en 14 ml de MeOH + DIEA y la solución fue dividida igualmente y puesta en dos tubos de centrifugación cónicos de 40 ml.

El contenido de cada uno de los tubos fue acidificado con 200 unidades líquidas de HCl concentrado y el agua hasta casi llenar la tubería. El contenido fue mezclado invirtiendo y sacudiendo algunas veces y centrifugando alrededor de 650 x g durante 30 minutos. El líquido sobre nadante café fue descargado y el sedimento fue lavado 3 veces con 0.01 M HCl. El sedimento fue transferido a un matraz de fondo redondo de 100 ml y la mezcla fue secada por evaporación rotativa y entonces en le vacío sobre el H2SO4 y KOH. El peso seco fue entonces de 304 mg (colorante dicarboxi purificado).

EJEMPLO 5: SULFONACION DE COLORANTE DICARBOXI PURIFICADO POR MEDIO DE ACIDO CLOROSULFONICO.

El colorante dicarboxi purificado (ejemplo 4) 161 mg, fue pesado en un matraz de fondo redondo de cuello largo de 50 ml en un mezclador magnético. Se agregaron 3.4 ml de CISO3H a la temperatura ambiente bajo N2. Un pequeño condensador de aire con globos de N2 fueron adheridos y tanto el matraz y el contenido fueron calentados en un baño de aceite a 110°C por aproximadamente 3.7 horas a cuyo punto la muestra de 50 ml fue quitada para la prueba. El calentamiento entonces se continuo por 3.3 horas adicionales a 110°C con lo cual el calentamiento se detuvo para que fuera tomada una segunda muestra. Se agregó hielo para ambas muestras en cada una se diluyó con agua para un peso de 390 mg y 2 ml de 1 M NaHCO3 que se agregaron entonces para cada una de las pruebas y la absorbencia de cada una se midió por medio de diluir 10 unidades líquidas de mezcla diluida con 2 ml de un neutralizador neutral para hacer la medición.

Para ambas muestras la absorción máxima fue de 690 nm, la lectura de la muestra a las 3.7 horas de 0.650 y la lectura de la muestra a las 7 horas de 0.490 que indican aproximadamente 25% de destrucción del colorante en las últimas 3.3 horas del periodo del calentamiento.

La mezcla de la principal reacción fue agregada en pequeñas porciones al hielo en un vaso picudo, y la mezcla fría fue centrifugada a aproximadamente 7 x g durante 30 minutos. El líquido supernatante muy finamente coloreado fue descargado. El sedimento fue suspendido en 30 ml de agua fría con hielo, transferido con agua a un matraz Erlenmeyer de 250 ml, preparado básico con aproximadamente 40 ml 1 m KHCO3 y agitado a la temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción fue transferida a un envase picudo, acidificada con HCl concentrado y agitada a la temperatura ambiente durante 6 horas y almacenada a la temperatura ambiente durante 48 horas.

La mezcla fue centrifugada a una capacidad de 700 xg; el fluido super natante coloreado fue retenido y los sedimentos fueron disueltos en 1 M NaHCO3 y agitados por 2 horas. La solución verdosa obscura se pasó a través de un Sep Pak (de tamaño 2 g, Rainin) y el filtrado después de la acidificación se combinó con el fluido supernatante de la centrifugación. El volumen total fue de una cantidad de 400 ml. La solución acida azul oscura fue absorbida sobre un Sep Pak, lavada en la columna con 3 N HCl y eluido con MeOH. El Sep Pak después de lavado con MeOH y 3 N HCl se puede usar por siempre. El eluido MeOH que contiene el colorante fue secado por evaporación rotatoria y sobre H2SO y KOH en el vacío. Produjo 158 mg.

EJEMPLO 6: MEDICIÓN DEL ENLACE NO ESPECIFICO Y LA CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE SOLUCIÓN DE LAS FTALOCIANINAS DE ALUMINIO Y SILICIO Materiales: 1) Borato neutralizado KCl (BBKCI): Este neutralizador se hace por medio de la mezcla: 33.1 ml de 0.70 M de ácido bórico; 4.0 ml de 0.50 M K2B4O7; 75 ml de 4.0 M KCl; H2O para hacer un litro; pH con capacidad de 8.1. 2) Dicarboxisiliconftalocianina sulfonatada (Ejemplo 5), la dicarboxisiliconftalocianina (Ejemplo 4), y ácido trísulfonico de aluminio, sal de sodio (Productos de Porfirina) fueron disueltos en BBKCI. Las concentraciones de estas soluciones fueron determinadas por medio de mediciones de absorbencia en el infrarrojo cercano con un máximo (con la capacidad de 680 nm) de una dilusión de cada una de las muestras en metanol que contiene e 5% (v/v) de amina etildiisopropil y que considera el valor del coeficiente de extinción molar para ser de 2x105 litros mole"1 para todas las muestras. Las diluciones fueron entonces hechas en BBKCI para dar a las soluciones de cada uno de los colorantes de 5x10"8 M.

Las mediciones de fluorescencia. Las mediciones de la intensidad y polarización fueron hechas por medio de un fluorómetro de polarización en el estado de transición (FAST 1 , Hyperion, Inc. Miami, FL), en cada caso, la dilusión de 10 microlitros de una solución de 5x10"8M de los colorantes (inciso 2, Materiales) con 1ml de ambos BBCKI, BBKCI+ 1 % (v/v) suero humano normal estancado (L3833, 10/18/84) o glicerol.

Los resultados se muestran en las figuras 1 y 2 y caracterizan el enlace no específico y la sensibilidad al solvente de los tres colorantes como fueron evaluados por medio de la intensidad de la fluorescencia y las mediciones de polarización. Respecto a la intensidad, las propiedades deseadas son con independencia en la consistencia de los constituyentes del solvente junto con una alta salida de fluorescencia. Por el otro lado, la polarización idealmente se mantendría abajo en una media abajo de la viscosidad y es tan alta como sea posible en un solvente viscoso tal como el glicerol. "ß La figura 1 muestra que la intensidad de fluorescencia del aluminoftalocianinatrisulfonatada es muy sensible al solvente. En comparación, dihidroxi dicarboxi silicio ftalocianina sulfonatada muestra una realización mejorada dramáticamente que tiene al menos la misma salida de fluorescencia en el neutralizador , 5 el neutralizador más el suero o glicerol solamente. Algunos de estas mejoras se pueden ver que se deben a la sulfonación por medio de la comparación con dihydroxi-dicarboxi- silicio-ftalocianina (grupos no sulfonatados) los cuales por si mismos son menos sensitivos al suero y al solvente que con los compuestos Al.

La figura 2 indica a un más fuertemente que la sola presencia del átomo de ío silicio central resulta en una disminución de la sensibilidad al medio ambiente cuando es comparada con Al como átomo central. Esta diferencia es más probable debido al hecho que Si tiene dos ligandos axiales y que entonces "protege" la estructura plana del colorante de los efectos del solvente desde un "grupo protector" está entonces presente en cada lado del plano molecular. En el caso de Al solamente un ligando axial está 15 presente y entonces un lado de la molécula plana es libremente accesible a los efectos del solvente. En la figura 2 el resultado de esta interacción es claramente visto en el incremento muy grande en la polarización del colorante de Al cercanamente al máximo de atenuación por poner el colorante en glicerol (el cual indica el límite aproximado para la polarización si el movimiento es rotacional y es casi detenido). 20 CONCLUSIÓN Los ejemplos de aplicación de arriba, que se relacionan a la presente invención, no serán desde luego, como un alcance limitativo de la invención. Tales variaciones de la invención, ahora conocidas o desarrolladas después, las cuales podría ^tó^^^fc^^^ caer dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica son considerados como que caen dentro del alcance de la invención como en las posteriores reivindicaciones.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la descripción son indicativas de los niveles de aquellos expertos en la técnica para los cuales la invención es pertinente. Todas las patentes y publicaciones adjunto incorporadas como referencia se extienden a la misma como si cada publicación individual fuera específica e individualmente indicada para ser incorporada como referencia.

La invención ilustrativamente descrita adjunto adecuadamente puede ser practicada en la ausencia de algún elemento o elementos, limitación o limitaciones las cuales no están específicamente descritas adjunto. Entonces, por ejemplo, en cada caso adjunto algunos de los términos "que comprende" "que consiste esencialmente de" y "que consiste de" puede ser reemplazado por alguno de los otros dos términos. Los términos y expresiones los cuales han sido empleados y son usados como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en que el uso de tales términos y expresiones de excluir algunas características equivalentes mostradas y descritas en las porciones de ella misma, pero se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención reclamada. Entonces, se entenderá que además de la presente invención ha sido específicamente descrita por medio de las modalidades preferidas y características opcionales, la modificación y variación de los conceptos adjunto descritos pueden ser concurridos por aquellos expertos en la materia, y que tales modificaciones y variaciones son consideradas para estar dentro del alcance de la invención como se definió por las reivindicaciones agregadas.

Otras modalidades están dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un componente marcador etiquetado detectable el cual comprende una porción de fluoróforo luminiscente substancialmente plano acoplado a dos o más ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada cada uno localizado en ambos lados de la porción del fluoróforo.

2. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una porción de fluoróforo un ligando multidentado macrocíclico coordinado a un átomo central y ligandos axiales que se solubilizan que son seleccionados independientemente del grupo que consiste de hidroxil, cloro, bromo, fluoro, OCH3,y O-CH2OH.

3. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizado además porque el marcador comprende dos porciones de hidroxil que se solubilizan, una porción de hidroxil que solubiliza ligada sobre ambos lados del ligando monocíclico para el átomo central.

4. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizado además porque las dos porciones de hidroxil comprenden ligandos axiales los cuales coordinan al átomo central.

5. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho átomo central es capaz de formar complejos de coordinación octahedral.

6. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho ligando macrocíclico tiene un sistema de electrón pi conjugado.

7. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho ligando macrocíclico comprende un macrociclo que contiene nitrógeno.

8. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 7, caracterizado además porque ligando macrocíclico se selecciona de un derivado de porfirina, o de un derivado de profirina que tiene uno o más carbones que puentean reemplazados por medio del nitrógeno, un derivado corrina, un derivado safirina o un derivado porficena.

9. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho átomo central se selecciona del silicio, germanio, fósforo y estaño.

10. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho ligando macrocíclico tiene un bajo grado de simetría así como para mejorar la emisión de polarización paralela o para la absorción de polarización.

11. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho átomo central es silicio o germanio.

12. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho ligando macrocíclico tiene un menor grado de simetría respecto a la simetría de D4H.

13. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho ligando macrocíclico tiene al menos un anillo aromático fusionado.

14. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho macrociclo comprende un derivado de porfirina de donde 1 a 4 de los átomos de carbono que puentean son reemplazados por medio del nitrógeno.

15. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho macrociclo comprende un derivado de tetrabenzotriazaporfirina.

16. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho macrociclo se selecciona de tetrabenzotriazaporfirina, 27-feniltetrabenzotriazaporfirina, y 27-(p-metilfenil) tetrabenzotriazaporfirina.

17. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 16, caracterizado además porque el átomo central es silicio.

18. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho ligando macrocíclico comprende un derivado ftalocianina.

19. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción de fluoróforo es una naftalocianina o un derivado de naftalocíanina.

20. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha porción de fluoróforo acoplada a dos o más ligandos axiales que se solubilizan está caracterizado porque tienen en la presencia de componentes de suero en solución acuosa, emisiones de fluorescencia en estado de transición que tienen componentes perpendicular y paralela de las mismas intensidades como lo es substancialmente sin el suero.

21. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha estructura molecular luminiscente substancialmente plana tiene una longitud de onda de excitación de al menos aproximadamente 500 nanómetros y dicho componente marcador ha decrecido un enlace no específico para componentes de suero como es comparado en la porción de fluoróforo mínima cuando no está acoplado a dos o más porciones de hidroxil.

22. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho porción de fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación de aproximadamente 600 a 800 nanómetros.

23. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha porción de fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación de al menos 650 nanómetros.

24. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho componente marcador tiene intensidades substancialmente similares, tiempos de decaimiento y magnitudes relativas de las componentes polarizadas en la presencia y ausencia de suero.

25. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicha porción de fluoróforo sola tiene una constante de enlace que es al menos 60 veces más grande que la constate de enlace del componente marcador completo.

26. Un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho fluoróforo se selecciona del grupo que consiste de: (1) colorantes polimetina terminados aril; (2) colorantes quinoides; (3) colorantes indantreno; (4) 1 ,4- diaminoantraquinona-2,3-dicarboxamidas; (5) tetraaminoantraquinonas; (6) colorantes azina; (7) colorantes tiofirilium o firilium; y (8) metanuros naftoquinona.

27. Un método de sintetizar un componente marcador de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, que comprende del paso de reaccionar la porción de fluoróforo con una forma reactiva de dichos ligandos axiales que se solubilizan.

28. Un método de detectar un analito objetivo en una muestra que se sospecha que contiene dicho analito objetivo, el método comprende los pasos de: (a) Enlazar un componente marcador de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 a un analito objetivo o análogo de él mismo; (b) Contactar dicha muestra que se sospecha que contiene dicho analito objetivo con una cantidad conocida de un componente marcador enlazado al analito objetivo o análogo de él; (c) Contactar dicha muestra que se sospecha que contiene dicho analito objetivo con un receptor el cual específicamente une a dicho analito objetivo; (d) Determinar junto con la cantidad de dicho componente marcador enlazado al analito objetivo o análogo de él unido a dicho receptor o a la cantidad de analito objetivo no unido o análogo de él.

29. Una prueba fluorescente que comprende un componente marcador de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, enlazada a un miembro de un par de enlace no específico o a un analito objetivo o a un análogo.

30. Una prueba fluorescente de acuerdo a la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho analito objetivo receptor o análogo de él está adherido directamente a dicha porción de fluoróforo.

31. Una prueba fluorescente de acuerdo a la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho receptor de analito objetivo o análogo de él es conjugado vía un brazo enlazador para dicha porción de fluoróforo.

32. Una prueba fluorescente de acuerdo a la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho analito objetivo receptor o análogo de él se selecciona del grupo que consiste de digoxina, digitoxina, tiofilina, fenobarbital, acetilprocainamida, primidona, fenitoina, anticuerpo rubela, y derivados de cada uno.

33. Una prueba fluorescente de acuerdo a la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho miembro de un par de enlace específico tiene al menos un sitio de adhesión de componente marcador tolerante estéricamente capaz de permitir que dicha prueba forme un par de enlace específico.

34. Un método de sintetizar una prueba fluorescente el cual comprende el paso de enlazar un componente marcador de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 a uno o más ligandos axiales que se solubilizan.

35. Un método de detectar un analito objetivo en una muestra que se sospecha que contiene dicho analito objetivo, el método comprende los pasos de: (a) Contactar una muestra que se sospecha que contiene dicho analito objetivo con un primer receptor capaz de enlazar específicamente a dicho analito objetivo para forma un complejo de dicho analito objetivo y dicho primer receptor, dicho primer receptor siendo etiquetado con una prueba fluorescente que comprende un componente marcador de cualquiera de los de las reivindicaciones 1 a 26; (b) Contactar dicho complejo con un segundo receptor capaz de enlazar específicamente a dicho analíto objetivo, dicho segundo receptor estando unido a un portador sólido, para formar un complejo de dicho primer receptor etiquetado, dicho analito objetivo, y dicho segundo receptor unido a dicho portador sólido; y (c) Medir junto con la cantidad del primer receptor etiquetado unido a dicho portador sólido o la cantidad de el primer receptor etiquetado no unido.

36. Un método de detección de un analito objetivo de acuerdo a la reivindicación 35, caracterizado además porque comprende el paso de relacionar la cantidad de dicho primer receptor etiquetado con una medida de la prueba de fluorescencia en dicha muestra que se sospecha que contiene dicho analito objetivo para la cantidad de dicho primer receptor etiquetado con una medida de la prueba de fluorescencia en una muestra de control la cual no contiene analito objetivo, o la cantidad del primer receptor etiquetado con una medida de la prueba de fluorescencia en muestras que contienen cantidades medidas de dicho analito objetivo.

37. Un método de detección de un analito objetivo de acuerdo a la reivindicación 35, caracterizado además porque comprende le paso de separar el portador sólido de el primer receptor etiquetado no unido.

38. Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito objetivo en una muestra que se sospecha que contiene un analito objetivo que comprende los pasos de: (a) Contactar simultáneamente dicha muestra que se sospecha que contiene un analito objetivo con el primer y segundo receptores capaces de reconocer específicamente dicho analito objetivo, dicho primer receptor siendo etiquetado con una prueba de fluorescencia que comprende un componente marcador de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, y dicho segundo receptor siendo unido al portador sólido, para formar un complejo de dicho primer receptor, dicho analito objetivo, y dicho segundo receptor; y (b) Medir junto con la cantidad de dicho primer receptor etiquetado asociado con dicho portador sólido o la cantidad del primer receptor etiquetado que no reaccionó.

39. Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito objetivo de acuerdo a la reivindicación 38, caracterizado además porque comprende el paso de relacionar la cantidad medida del primer receptor etiquetado en la muestra que se sospecha que contiene el analito objetivo para la cantidad de medida del primer receptor etiquetado en una muestra de control la cual no contiene analito objetivo, o a la cantidad medida del primer receptor etiquetado en muestras que contienen cantidades conocidas de dicho analito objetivo.

40. Un método para medir un analito objetivo capaz de enlazar a dos receptores diferentes en una muestra que se sospecha que contiene dicho analito objetivo que comprende los pasos de: (a) Contactar dicha muestra que se sospecha que contiene dicho analito objetivo con un primer receptor capaz de enlazar específicamente a dicho analito objetivo para formar un complejo de dicho analito objetivo y dicho primer receptor, dicho primer receptor estando etiquetado con una prueba fluorescente que comprende un componente marcador de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26; y (b) Contactar dicho complejo con un segundo receptor capaz de enlazar específicamente a dicho analito objetivo, dicho segundo receptor teniendo una absorción y emisión máxima la cual no es idéntica a aquella de dicho primer receptor.

41. Un equipo útil para detectar un analito objetivo que se sospecha que contiene dicho analito objetivo, el equipo comprende un componente marcador de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

42. Un equipo útil para detectar un analito objetivo que se sospecha que contiene dicho analito objetivo, el equipo comprende una prueba de fluorescencia de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31.

43. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

44. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 43, caracterizado además porque dicho componente marcador etiquetado detectable tiene un tiempo de decaimiento en el intervalo de aproximadamente 1 nanosegundo hasta aproximadamente 50 nanosegundos.

45. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 44, caracterizado además porque dicho tiempo de decaimiento está en el intervalo de aproximadamente 5 nanosegundo a aproximadamente 20 nanosegundos.

46. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 43, caracterizado además porque dicho oligonucleotido tiene una longitud de entre 5 a 50 bases.

47. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 43, caracterizado además porque dicha conexión comprende (CH2)6O.

48. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 43, caracterizado además porque dicha conexión comprende (CH2)2NH.

49. Un método para preparar un componente marcador oligonucleotido conjugado que comprende los pasos de: (a) Hacer reaccionar un oligonucleotido que tiene una terminación de ligando adherida en un grupo amino con un ester N-hidroxi-succinimida o en un imidasólido de un componente marcador o composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable el cual comprende una porción de fluoróforo que comprende una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada uno ubicado sobre ambos lados de la estructura molecular plana, para formar un conjugado; y (b) Separar el conjugado formado en el paso (a) de un oligonucleotido que no reaccionó y de un componente marcador que no reaccionó.

50. Un método para preparar un componente marcador conjugado de acuerdo a la reivindicación 49, caracterizado además porque comprende realizar el paso anterior (a) el paso de; adherir a un oligonucleotido un ligando que termina en un grupo amino.

51. Un método para preparar un componente marcador conjugado oligonucleotido que comprende los pasos de: (a) Reaccionar un componente marcador a una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable el cual comprende una porción de fluoróforo que comprende una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligando axiales pequeños que se solubilizan, cada cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular plana, con un carbodiimida en la presencia de hidrobenzotriol y en la presencia de un oligonucloetido, para formar un conjugado; y (b) Separar el conjugado resultante formado en el paso (a) de otros componentes de la mezcla de reacción.

52. Un método para determinar la presencia o cantidad de una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra que comprende los pasos de: (a) Contactar la muestra de ácido nucleico con una composición de la reivindicación 43 de donde dicha composición es capaz de hibridizarse con dicha secuencia de ácido nucleico objetivo en una solución homogénea; y (b) Detectar la presencia o cantidad de tal hibridación por medio de la fluorescencia polarizada en el estado de transición.

53. Un método para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra que comprende los pasos de: (a) Contactar una muestra que se sospecha que contiene una secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleotido complementario capaz de hibridizarse con dicha secuencia objetivo; (b) Contactar dicha muestra con una composición de la reivindicación 1 de donde dicha composición es capaz de hibridizarse a dicho oligonucleotido complementario o polinucleotido; y (c) Detectar la presencia o medir la cantidad de hibridación de dicho conjugado con dicho oligonucleotido o polinucleotido complementario.

54. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 51 a 53, caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico objetivo se selecciona del grupo que consiste de un producto de amplificación de ácido nucleico, ADN, y ARN.

55. Un método de acuerdo a la reivindicación 54, caracterizado además porque dicha amplificación de ácido nucleico es realizada por un método seleccionado del grupo que consiste de cadena de reacción polimerasa (PCR), una cadena de reacción ligando(LCR), una replicación de secuencia autosostenida (3SR), y un sistema de amplificación basado en transcripción (TAS).

56. En un proceso de amplificación de ácido nucleico, la mejora comprende en que se emplea como una etiqueta una prueba de fluorescencia las cuales comprenden componentes marcadores etiquetados detectables los cuales comprenden una porción de fluoróforo que comprende una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular plana.

57. En una amplificación de ácido nucleico por el proceso de hibridación, la mejora comprende que se emplea como una etiqueta una prueba de fluorescencia la cual comprende un componente marcador etiquetado detectable el cual comprende una porción de fluoróforo que comprende una estructura molecular luminiscente substancialmente plana acoplada a dos ligandos axiales pequeños que se solubilizan, cada cada uno localizado en ambos lados de la estructura molecular plana.

58. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 43, caracterizada además porque su composición es termoestable.

59. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 58, caracterizada además porque dicha composición es estable después de la exposición a 90°C durante 1 hora.

60. Una composición que comprende un oligonucleotido enlazado a un componente marcador etiquetado detectable de acuerdo a la reivindicación 59, caracterizada además porque dicha composición es estable después de la exposición a 100°C durante 10 minutos.

61. Un equipo que comprende la composición de la reivindicación 43 y una etiqueta, y un paquete de instrucciones.

62. Un método para usar el equipo de la reivindicación 61 que comprende usar la composición de acuerdo con la etiqueta, o el paquete de instrucciones.

63. Un método de hacer el equipo de la reivindicación 61 que comprende el paso de combinar dicha composición y dicha etiqueta, o el paquete de instrucciones.