MXPA01002896A - Gpr10 como un objetivo para identificar compuestos medeladores de peso - Google Patents

Abstract

La invención propone ensayos para la identificación de los compuestosútiles para la modulación del peso corporal. Estos compuestos sonútiles para el tratamiento de obesidad y caquexia. Los métodos de la invención incluyen ensayos sin células y basados en células que identifican los compuestos que se unen a y/o activan o inhiben la actividad de GPR10, un receptor acoplado a la proteína G, seguido por un ensayo in vivo del efecto del compuesto sobre el comportamiento en la alimentación, el peso corporal o la tasa metabólica. La invención también propone los compuestos que se unen a y/o activan o inhiben la actividad de GPR10 asícomo las composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos. Además, la invención incluyen moléculas deácido nucléico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican todo o una parte de GPR10 de murino, los polipéptidos que contienen todo o una porción de GPR10 de murino, los anticuerpos dirigidos contra GPR10 de murino y los animales que albergan un transgen GPR10 de murino (por ejemplo ratones que sobre expresión GPR10 de murino).

Description

GPR10 COMO UN OBJETIVO PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS MODULADORES DE PESO Antecedentes de la Invención Los receptores acoplados a proteína G (GPCR = G-Protein-Coupled Receptors) forman una clase importante de receptores de unión de péptido. Los diversos miembros de la familia GPCR median una amplia variedad de señales intercelulares . Miembros de las familias GPCR tienen siete dominios helicoidales que se extienden por la membrana celular y están enlazados por tres bucles extra celulares y tres bucles intra celulares. Los receptores también poseen una cola amino terminal extra celular y una cola carboxi terminal intra celular. Los bucles intra celulares interactúan con una proteína G que puede conmutar de una forma de unión GDP a una forma de unión GTP . La unión de un ligando apropiado a un GPCR inicia la conversión de la proteína G acoplada de su forma de unión GDP a su forma de unión GTP. Esta conversión a su vez inicia una cascada de transducción de señal que genera una respuesta biológica. Dependiendo de la naturaleza del GPCR, la actividad de transducción de señal puede medirse al medir el nivel de Ca2+ intracelular, activación de fosfolifasa C, el nivel de trifosfato de inositol (IT3, el nivel de diacil glicerol, o el nivel de 3 ' , 5 ' -monofosfato cíclico de adenosina (ANP) . Márchese y colaboradores ( Genomics 29:335, 1995) describe el mapeo de clonación y cromosomal de GPR10, un GPCR humano. Márchese y colaboradores, analiza la expresión GPR10 en el cerebro y reporta que no se observó expresión GPR10 humano en hipotálamo, putamen, pons, hipocampo, corteza frontal, tálamo y cerebelo. Welch y colaboradores (Biochem. Biophys Res .

Comm. 209:606, 1995), describe la clonación de UHR-1, un GPCR de rata a partir del núcleo supra quiasmático hipotalámico, el marca pasos circadiano del cerebro humano. De acuerdo con Welch y colaboradores, UHR-1 tiene similaridad de secuencia a nivel amino ácido con los receptores para las taquicininas, substancia P y substancia K; los receptores de somatostatina SSTR5 y SSTR3 , el receptor neuropépticlo Yl; los receptores delta, kappa y mu opioides, y el receptor gastrina-CCK-B . De acuerdo con Welch y colaboradores, UHR-1 de rata se expresa en la pititaria, cerebelo, hipotálamo, pons e hipocampo de ratas. No hay expresión presente en cerebro neonatal de rata, hígado de rata adulta, pulmón, páncreas, riñon, bazo, intestino delgado, glándula adrenal, testículos, timo, aorta, corazón, músculo esquelético o diafragma. Duhl (publicación PCT No. WO 97/0837) describe una proteína referida como un "receptor hipotalámico humano" o "hHR = "human Hypothalamic Receptor" . De acuerdo con Duhl, hHR es un receptor de 7 trans-membranas . Duhl sugiere que hHR puede emplearse para identificar agonistas y antagonistas de actividad hHR. Hinuma y colaboradores (EP 0 845 529 A2) describe dos formas de una proteína receptora acoplada a proteína G. Hinuma y colaboradores reportan que una de las dos formas del receptor acoplado a proteína G descrito se expresa en el cerebro. Hinuma y colaboradores (Nature 393:272, 1998) describe "péptido de liberación de prolactina" (PrRP) un péptido que liga a hGR3. Un receptor que se expresa en la pituitaria humana y de acuerdo con Hinuma y colaboradores, casi idéntico tanto a GPR10 y el homologo humano de UHR-1 de rata. Hinuma y colaboradores reportan que PrRP estimula la liberación de prolactina de células pituitarias anteriores de ratas lactantes in vi tro . Hinuma y colaboradores también reportan la expresión de PrRP y su receptor parece fluctuar en la medulla oblongata y pituitaria durante embarazo y lactancia, respectivamente en ratas. Con base en estos resultados, Hinuma y colaboradores sugieren que los niveles de PrRP y su receptor se relacionen cercanamente a la regulación de procesos reproductores . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención caracteriza ensayos para la identificación de compuestos útiles para la modulación de peso corporal . Estos compuestos son útiles para el tratamiento de obesidad y caquexia. Los métodos de la invención involucran ensayos libres de células y basados en células que identifican compuestos (moduladores) que ligan a y/o activan o inhiben la actividad de GPR10, un receptor acoplado a proteína G, seguido por un ensayo in vi tro del efecto del compuesto en el comportamiento de alimentación, peso corporal o velocidad metabólica. La invención también caracteriza compuestos que se ligan a y/o activan o inhiben la cantidad del GPR10 así como composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos . Además, la invención incluye moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleótido que codifica todo o una porción de GPR10 murino, polipéptidos que comprenden todo o una porción de GPR10 murino, anticuerpos dirigidos contra GPR10 murino y animales que alojan un transgen GPR10 murino (por ejemplo ratones que sobre expresan GPR10 murino) . La invención también caracteriza composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto indentificado utilizando los métodos de clasificación de la invención así como a métodos para preparar estas composiciones al combinar tal compuesto y un portador farmacéuticamente aceptable. También, dentro de la invención están composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto identificado utilizando los ensayos de clasificación de la invención empacados con instrucciones para uso. Para moduladores que son antagonistas de actividad o expresión GPR10, las instrucciones especifican uso de la composición farmacéutica para el tratamiento de alto peso corporal (por ejemplo para reducción del peso corporal) . Para moduladores que son agonistas de actividad o expresión GPR10, las instrucciones especificarán el uso de una composición farmacéutica para el tratamiento de bajo peso corporal (es decir para incrementar el peso corporal) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra la secuencia de ácido nucleico de un ADNc que codifica GPR10 murino. La Figura 2 ilustra la secuencia de amino ácido pronosticada de GPR10 murino. La Figura 3 es una gráfica que ilustra los resultados de un experimento que examina el efecto de PrRP en el comportamiento de alimentación de ratones machos delgados . La Figura 4 es una gráfica que ilustra los resultados de un experimento que examina el efecto de PrRP en el comportamiento de alimentación de ratones hembra delgados.

La Figura 5 es una gráfica que ilustra los resultados de un experimento que examina el efecto de PrRP en el comportamiento de alimentación de ratones macho ob/ob . La Figura 6 es una gráfica que ilustra los resultados de un experimento que examina el efecto de PrRP en la velocidad metabólica de ratones macho delgados a los que se les niega acceso a alimento. La Figura 7 es una gráfica que ilustra los resultados de un experimento que examina el efecto de PrRP en la velocidad metabólica de ratones macho delgados que se les permite acceso a alimento. La Figura 8 ilustra un alineamiento de GRP humano con hGR3 (humano) , UHR1 (rata) GPR10 murino (también referido como 101) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Ensayos de clasificación La invención proporciona métodos (también referidos aquí como "ensayos de clasificación" (para identificar compuestos que pueden utilizarse para la modulación de peso corporal, por ejemplo para el tratamiento de un desorden de peso corporal. Los métodos involucran identificar compuestos o agentes candidato o de prueba (por ejemplo péptidos, péptido miméticos, pequeñas moléculas u otras drogas) que ligan GPR10 y/o tienen el efecto estimulador o inhibitorio en la actividad de expresión de GPR10 y luego determinar cual de los compuestos que liga GPR10 obtiene un efecto estimulador o inhibitorio en la actividad o la expresión de GPR10 o tienen un efecto en el comportamiento de alimentación, peso corporal o velocidad metabólica de un mamífero (por ejemplo un ratón o una rata) en un ensayo in vivo . Compuestos o agentes candidato o de prueba que ligan GPR10 y/o tienen un efecto estimulador o inhibitorio en la actividad de la expresión de GPR10 se identifican en ensayos que emplean ya sea células que expresan una forma de GPR10 (ensayos basados en célula) o GPR10 aislado (ensayos libres de célula) . Los diversos ensayos pueden emplear una variedad de formas de GPR10 (por ejemplo GPR10 de toda su longitud, un fragmento biológicamente activo de GPR10, o una proteína de fusión que incluye todo o una porción de GPR10) . Aún más, el GPR10 puede ser derivado de cualesquiera especies mamíferas convenientes (por ejemplo GPR10 humano, GPR10 de rata) (también referido como UHR-1) o GPR10 murino. El ensayo puede ser un ensayo de unión que involucra medida directa o indirecta de la unión de un compuesto de prueba o ligando GPR10 conocido, a GPR10. El ensayo también puede ser un ensayo de actividad que involucra medida directa o indirecta de la actividad de GPR10. El ensayo también puede ser un ensayo de expresión que involucra medida directa o indirecta de la expresión de GPR10 (por ejemplo ARNm que codifica GPR10 o proteína GPR10) . Los diversos ensayos de clasificación se combinan con un ensayo in vivo que involucra medir el efecto del compuesto de prueba en el comportamiento de alimentación, peso corporal o velocidad metabólica de un mamífero (por ejemplo una rata o ratón) . En una modalidad, la invención proporciona ensayos para clasificar compuestos candidato o de prueba que ligan o modulan la actividad de una forma ligada a membrana (expresada en la superficie de la célula) de GPR10. Estos ensayos pueden emplear GPR10 de completa longitud, un fragmento biológicamente activo de GPR10, o una proteína de fusión que incluye todo o una porción de GPR10. Como se describe con mayor detalle a continuación, el compuesto de prueba puede obtenerse por cualquier medio conveniente, por ejemplo a partir de bibliotecas de compuestos convencionales. El determinar la capacidad del compuesto de prueba para ligar una forma ligada a membrana de GPR10, puede lograrse por ejemplo al acoplar el compuesto de prueba con un radioisótopo o etiqueta enzimática, de manera tal que la unión del compuesto de prueba a la célula que expresa GPR10 puede medirse al detectar el compuesto etiquetado en un complejo. Por ejemplo, el compuesto de prueba puede etiquetarse con 125I, 35S, 1 C, o 3H, ya sea directa o indirectamente y el radioisótopo detectarse por conteo directo de radio emisión o por conteo de destelleo. En forma alterna, el compuesto de prueba puede etiquetarse enzimáticamente por ejemplo con peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y la etiqueta enzimática detectarse por determinación de conversión de un substrato apropiado al producto. En un formato de unión competitivo, el ensayo comprende contactar una célula que expresa GPR10 con un compuesto conocido que liga GPR10 (por ejemplo PrRP) para formar una mezcla de ensayo, contactar la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con la célula que expresa GPR10, en donde el determinar la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con la célula que expresa GPR10, comprende determinar la capacidad del compuesto de prueba para ligar preferencialmente la célula que expresan el GPR10 en comparación con el compuesto conocido . En otra modalidad, el ensayo es un ensayo basado en células que comprende contactar una célula que expresa una forma ligada a membrana de un GPR10 (por ejemplo un GPR10 de toda su longitud, un fragmento biológicamente activo de GPR10, o una proteína de fusión que incluye todo o una porción de GPR10) expresado en la superficie de la célula con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular (por ejemplo estimular o inhibir) la actividad de la forma ligada a membrana del GPR10. El determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de la forma ligada a membrana de GPR10 puede lograrse por cualquier método conveniente para medir la actividad de GPR10, por ejemplo cualquier método conveniente para medir la actividad de un receptor acoplado a proteína G u otro receptor de siete trans-membranas (descrito con más detalle a continuación) . La actividad de un receptor de siete trans-membranas puede medirse en una cantidad de formas no todas las cuales son adecuadas para cualquier receptor determinado . Entre las medidas de actividad están: alteración en concentración intracelular de Ca2+, activación de fosfolipasa C, alteración en concentración intra celular de trifosfato de inositol (IP3) alteración en concentración intra celular de diacil glicerol (DAG) y alteración en concentración de 3 ' , 5 ' -monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) . El determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de GPR10 puede lograrse, por ejemplo al determinar la capacidad de GPR10 para ligar o interactuar con una molécula objetivo. La molécula objetivo puede ser una molécula con la cual GPR10 se liga o interactúa en naturaleza por ejemplo una molécula en la superficie de una célula que expresa GPR10, una molécula en la superficie de una segunda célula, una molécula en el medio extra celular, una molécula asociada con la superficie interna de una membrana celular o una molécula citoplásmica. La molécula objetivo puede ser un componente de una ruta de transducción de señal que facilita la transducción de una señal extra celular (por ejemplo una señal generada al unir un ligando GPR10, por ejemplo PrRP, a GPR10) a través de la membrana celular y dentro de la célula. La molécula objetivo por ejemplo puede ser una segunda proteína intra celular que tiene actividad catalítica o una proteína que facilita la asociación de moléculas de señalización corriente abajo con GPR10. Un ligando GPR10 tal como PrRP es un ejemplo de una molécula objetivo GPR10. El determinar la capacidad de un polipéptido GPR10 para ligar a o interactuar con una molécula objetivo puede lograrse por uno de los métodos descritos anteriormente para determinar unión directa. En una modalidad, el determinar la capacidad de un polipéptido de la invención para ligar con o interactuar con una molécula objetivo puede lograrse al determinar la actividad de la molécula objetivo. Por ejemplo, la actividad de la molécula objetivo puede determinarse al detectar inducción de un segundo mensajero celular del objetivo (por ejemplo Ca2+ intracelular, diacilglicerol, IP3, etc.), detectar actividad catalítica/enzimática del objetivo en un substrato apropiado, detectar la inducción de un gen reportero (por ejemplo un elemento regulatorio que responde a un polipéptido de la invención enlazado operativamente con un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo luciferasa) o detectar una respuesta celular. La presente invención también incluye ensayos libres de células. Estos ensayos involucran contactar una forma de GPR10 (por ejemplo GPR10 de toda longitud, un fragmento biológicamente activo de GPR10, o una proteína de fusión que comprende todo o una porción de GPR10 (con un compuesto de prueba y determinar la capacidad de compuesto de prueba para ligar al polipéptido GPR10. La unión del compuesto de prueba con el polipéptido GPR10 puede determinarse ya sea directa o indirectamente como se describió anteriormente. En una modalidad, el ensayo incluye contactar el polipéptido GPR10 con un compuesto conocido que liga el polipéptido GPR10 para formar una mezcla de ensayo, contactar la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con el polipéptido GPR10, en donde la determinación de la habilidad del compuesto de prueba para interactuar con el polipéptido GPR10 comprende determinar la capacidad de compuesto de prueba para ligar preferencialmente con el polipéptido GPR10 en comparación con el compuesto conocido. Los ensayos libres de células de la presente invención son susceptibles a utilizar ya sea en una forma ligada a membrana o un polipéptido GPR10 o su fragmento soluble. En el caso de ensayos libres de células que comprenden la forma ligada a membrana del polipéptido, puede ser conveniente el utilizar un agente de solubilización tal que la forma ligada a membrana del polipéptido se mantenga en solución. Ejemplos de estos agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Tritón X-100, Tritón X-114, Thesit, Isotridecipoli ( etilen glicol éter)n, 3-[(3-colamidopropil) dimetilaminio] -1-propan sulfonato (CHAPS), 3 - [ (3 -colamidopropil) dimetilaminio] -2 -hidroxi- 1 -propan sulfonato (CHAPSO) , o N-dodecil=N, N-dimetil-3 -amonio-1-propan sulfonato. En diversas modalidades de los métodos de ensayo anteriores de la presente invención, puede ser conveniente el inmovilizar el polipéptido GPR10 (o una molécula objetivo GPR10) para facilitar la separación de formas complejadas de las no complejadas de una o ambas de las proteínas, así como permitir automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba al polipéptido GPR10, o la interacción del polipéptido GPR10 con una molécula objetivo en la presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede lograrse en cualquier receptáculo adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de otros recipientes incluyen placas de micro titulación, tubos de ensayo y tubos de micro centrífuga. En una modalidad, puede proporcionarse una proteína de fusión que agrega un dominio que permite que una o ambas de las proteínas se liguen a una matriz . Por ejemplo, proteínas de fusión glutationa-S-transferasa o proteínas de fusión glutationa-S-transferasa pueden ser adsorbidas en perlas de glutationa sefarosa (Sigma Chemical; St . Louis, MO) o placas de micro titulación de derivatizadas de glutationa, que luego se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo ya sea una proteína objetivo no adsorbida o polipéptido GPR10, y la mezcla se incuba bajo condiciones que conducen a formación de complejo (por ejemplo a condiciones fisiológicas para sal y pH) . Después de incubación, las perlas o pozos de placa de micro titulación se lavan para retirar cualesquiera componentes no ligados y la formación de complejo se mide ya sea directa o indirectamente, por ejemplo como se describió con anterioridad. En forma alterna, los complejos pueden ser disociados de la matriz, y el nivel de unión o actividad de polipéptido GPR10 puede determinarse usando técnicas standard. Otras técnicas para inmovilizar proteínas en matriz también pueden ser utilizadas en los ensayos de clasificación de la invención. Por ejemplo, ya sea el polipéptido GPR10 o su molécula objetivo puede inmovilizarse utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. El polipéptido biotinilinado de la invención o moléculas objetivo pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-Hidroxi-Succinimida) utilizando técnicas bien conocidas en la especialidad (por ejemplo equipos de biotinilización, Pierce Chemicals; Rockford, IL) , e inmovilizados en los pozos de placas de 96 pozos revestidos con estreptavidina (Pierce Chemicals) . En forma alterna, anticuerpos reactivos con GPR10 o moléculas objetivo pero que no interfieren con la unión del polipéptido de la invención con su molécula objetivo, pueden derivatizarse a los pozos de la placa, y polipéptido u objetivo no ligado de la invención atraparse en los pozos por conjugación de anticuerpo. Métodos para detectar estos complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados GST, incluyen inmunodetección de los complejos utilizando anticuerpos reactivos con GPR10 o molécula objetivo, así como ensayos enlazados por enzima que se basan en detectar una actividad enzimática asociada con GPR o molécula objetivo.

El ensayo de clasificación también puede involucrar el verificar la expresión de GPR10. Por ejemplo, moduladores de la expresión de GPR10 pueden identificarse en un método en donde una célula se contacta con un compuesto candidato y la expresión de proteína GPR10 o ARNm en la célula, se determina. El nivel de expresión de proteína GPR10 o ARNm la presencia del compuesto candidato se compara al nivel de expresión de proteína GPR10 o ARNm en la ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato luego puede identificarse como un modulador de expresión de GPR10, con base en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de proteína GPR10 o proteína ARNm es mayor (estadísticamente más significante) en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de expresión de ARNm o proteína GPR10. En forma alterna, cuando la expresión de proteína GPR10 o ARNm es menos (estadísticamente menos significante) en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de expresión de ARNm o proteína GPR10. El nivel de expresión de ARNm o proteína GPR10 en las células puede determinarse por los métodos descritos a continuación. II . Compuestos de Prueba Adecuados compuestos de prueba para utilizar en los ensayos de clasificación de la invención, pueden ser obtenidos de cualquier fuente conveniente, por ejemplo bibliotecas de compuestos convencionales. Los compuestos de prueba también pueden obtenerse utilizando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de bibliotecas de combinación conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas, bibliotecas de fase en solución o fase sólida paralelas direccionables espacialmente, métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de biblioteca de "una-perla un-compuesto" ; y métodos de biblioteca sintéticas que utilizan selección de cromatografía por afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se limita a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos péptido, no péptido, oligómero o de pequeña molécula (Lam (1997) Anticancer Drug Des . 12:145) . Ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en: DeWitt y colaboradores (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:6909; Erb y colaboradores (1994) Proc.

Nati . Acad. Sci . USA 91:11422; Zuckermann y colaboradores (1994). J. Med. Chem . 37:2678; Cho y colaboradores (1993) Science 261:1303; Carrell y colaboradores (1994) Angew.

Chem . Int . Ed. Engl . 33 2059; Carell y colaboradores (1994) Angew. Chem . Int . Ed. Engl . 33:2061; y Gallop y colaboradores (1994) J. Med. Chem . 37:1233. Bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (por ejemplo Bio/Techniques 13:412-421 . o en perlas (Lam (1991) Na ture 354 : 82-84) , chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Patente de los E.U.A. No. ,223,409), esporas (Patentes de los E.IT.A. Nos. 5,571,698; 5,403,484; y 5,223,409), plásmidos (Culi y colaboradores (1992) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:1865-1869) o fago (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla y colaboradores (1990) Proc.

Nati . Acad. Sci . USA 87:6378-6382; y Felici (1991) J. Mol .

Biol . 222:301-310) . III . Modelado de moduladores las tecnologías de búsqueda y modelado por computadora permiten la identificación de compuestos, o la mejora de compuestos ya identificados, que pueden modular la expresión o actividad de GPR10. Habiendo identificado este compuesto o composición, las regiones o sitios activos se identifican. Estos sitios activos típicamente pueden ser sitios de unión de ligando, tales como el dominio de interacción de PrRP con GPR10. El sitio activo puede identificarse utilizando métodos conocidos en la especialidad incluyendo por ejemplo a partir de las secuencias de amino ácidos de péptidos, a partir de las secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos o del estudio de complejos del compuesto o composición relevante con su ligando natural . En este último caso, métodos cristalográficos químicos o de rayos X pueden emplearse para encontrar el sitio activo al hallar en donde se encuentra en el factor el compuesto ligando. A continuación, la estructura geométrica tridimensional del sitio activo se determina. Esto puede realizarse por métodos conocidos incluyendo cristalografía de rayos X, que pueden determinar una estructura molecular completa. Por otra parte, puede utilizarse RMN de fase sólida o líquida para determinar ciertas distancias intramoleculares . Cualquier otro método experimental para determinación de estructura puede emplearse para obtener estructuras geométricas parciales o completas. Las estructuras geométricas pueden medirse con un ligando complejo, natural o artificial, que puede incrementar la precisión de la estructura de sitio activo determinada. Si se determina una estructura incompleta o insuficientemente precisa, los métodos de modelado numérico basado en computadora pueden emplearse para completar la estructura o mejorar su precisión. Cualquier método de modelado reconocido puede ser empleado, incluyendo modelos parametrizados específicos para biopolímeros particulares tales como proteínas o ácidos nucleicos, modelos dinámicos moleculares con base en cómputo de movimientos moleculares, modelos mecánicos estadísticos con base en estructuras térmicas o modelos combinados. Para la mayoría de los tipos de modelos, campos de fuerza molecular standard, que representan las fuerzas entre átomos y grupos constituyentes, son necesarios y pueden elegirse de campos de fuerza conocidos en físico química. Las estructuras experimentales incompletas o menos precisas pueden servir como restricciones en las estructuras completas y más precisas calculadas por estos métodos de modelado. Finalmente, habiendo el terminado de estructuras del sitio activo, ya sea experimentalmente, por modelado o por una combinación, pueden identificarse compuestos de modulado candidato, al buscar bases de datos que contienen compuestos junto con información de su estructura molecular. Esta búsqueda es para compuestos que tienen estructuras que corresponden a la estructura de sitio activo determinado y que interactúan con los grupos que definen el sitio activo. Esta búsqueda puede ser manual, pero de preferencia es asistida por computadora. Estos compuestos que se encuentran de esta búsqueda son compuestos de modulación GPR potenciales.

En forma alterna, pueden emplearse estos métodos para identificar compuestos de modulación mejorada a partir de un compuesto o ligando de modulación ya conocido. La composición del compuesto conocido puede ser modificada y los efectos estructurales de modificación, pueden ser determinados usando los métodos de modelado por computadora y experimentales descritos anteriormente aplicados a la nueva composición. La estructura alterada luego se compara con la estructura de sitio activo del compuesto para determinar si resulta una interacción o ajuste mejorado. De esta manera, variaciones sistemáticas en composición, tales como al variar grupos laterales, pueden evaluarse rápidamente para obtener compuestos o ligandos modulados modificados de actividad o especificidad mejorada. Kaul (1998) Prog. Drug Res . 50:9-105 proporciona una revisión de técnicas de modelado para el diseño de ligandos, receptores y drogas. Programas de computadora que clasifican e ilustran gráficamente productos químicos están disponibles de compañías tales como BioDesign, Inc. (Pasadena, CA. ) , Oxford Molecular Design (Oxford, UK) , y Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario). Aunque se describió anteriormente con referencia al diseño y generación de compuestos que pueden alterar la unión, también se pueden clasificar bibliotecas de compuestos conocidos, incluyendo productos naturales o productos químicos sintéticos, y materiales biológicamente activos, incluyendo proteínas, para compuestos que son inhibidores o activadores. IV. Moléculas de Ácido Nucleico Aisladas Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican GPR10 murino o una porción biológicamente activa del mismo, así como moléculas de ácido nucleico, suficientes para utilizar como sondas de hibridización para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican GPR10 murino y fragmentos de estas moléculas de ácido nucleico, adecuados para utilizar como cebadores PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico. Como se emplea aquí, el término "molécula de ácido nucleico" se pretende que incluya moléculas de ADN (por ejemplo ADNc o ADN genómico) moléculas de ARN (por ejemplo ARNm) y análogos del ADN o ARN generado, utilizando análogos nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero de preferencia es ADN de doble hebra. Esta sección describe ácidos nucleicos GPR10 murinos y métodos para producir y emplear estos ácidos nucleicos. Sin embargo, las mismas técnicas pueden emplearse para producir y utilizar ácidos nucleicos GPR humanos . Una molécula de ácido nucleico "aislada" es aquella que se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. De preferencia, una molécula de ácido nucleico "aisladas" está libre de secuencias (de preferencia secuencias de codificación de proteína) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir secuencias localizadas en los extremos 5 ' y 3 ' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias nucleótido que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Aún más, una molécula de ácido nucleico "aislada" tal como una molécula de ADNc, puede estar substancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo, cuando se produce por técnicas recombinantes, o substancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótido de ID de SEC. NO.:l o 2, puede aislearse utilizando técnicas de biología molecular standard y la información de secuencia que aquí se proporciona. Utilizando todo o una porción de las secuencias de ácido nucleico de ID de SEC. NO. : 1 o 2 como una sonda de hibridización, moléculas de ácido nucleico de la invención pueden aislarse utilizando técnicas de hibridízación y clonación standard (por ejemplo como se describe por Sambrook y colaboradores, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio) , segunda edición: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Una molécula de ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando ADNc, ARNm o ADN genómico como una plantilla y cebadores oligo nucleótido apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación PCR standard. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencia de ADN. Además, oligo nucleótidos que corresponden a toda o una porción de la molécula de ácido nucleico de la invención pueden prepararse por técnicas sintéticas standard, por ejemplo utilizando un sintetizador de ADN automatizado. Aún más, una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solo una porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica GPR murino, por ejemplo un fragmento que puede emplearse como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de GPR10 murino. La secuencia de nucleótido determinada a partir de la clonación de un gen permite la generación de sondas y cebadores diseñados para utilizar en identificar y/o clonar variantes alélicas y otras variantes del GPR10. La Sonda/cebador típicamente comprende oligonucleótidos substancialmente purificados . El oligonucleótido típicamente comprende una región de secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones estrictas cuando menos aproximadamente 12, de preferencia aproximadamente 25, más preferible aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia sentido o antisentido de ID de SEC. NO. : 1 o 2 de un mutante de origen natural o variante alélica de ID de SEC. NO. : 1 o 2. Sondas basadas en la secuencia de una molécula de ácido nucleico de la invención pueden emplearse para detectar transcripciones o secuencias genómicas que codifican la misma molécula de proteína codificada por una molécula de ácido nucleico selecta. La sonda comprende un grupo de etiqueta conectado, por ejemplo un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima. Estas sondas pueden emplearse como parte del equipo de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que mal expresan la proteína, tal como al medir niveles de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo detectar niveles de ARNm o determinar si un gen que codifica la proteína se ha mutado o eliminado. Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa" de GPR10 murino puede prepararse al aislar una porción de ID de SEC. NO. : 2 que codifica un polipéptido que tiene actividad biológica, expresar la porción codificada de la proteína de polipéptido (por ejemplo por expresión recombinante in vi tro) y estimar la actividad de la porción codificada del polipéptido. La invención además abarca moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótido de ID de SEC. NO. : 1 o 2 debido a la degeneración del código genético y de esta manera codifican la misma proteína que la codificada por la secuencia de nucleótido mostrada en ID de SEC. NO. : 2. Además de la secuencia de nucleótido mostrada en ID de SEC. NO.: 1, se apreciará por aquellos con destreza en la especialidad que polimorfismo de secuencia de ADN que lleva a cambios en la secuencia de amino ácidos puede existir dentro de una población. Estos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a variación alélica natural. Un alelo es uno de un grupo de genes que ocurre en forma alterna en un sitio genético determinado. Como se emplea aquí, la frase "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que ocurre en un sitio determinado o a un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos. Estas variaciones alélicas naturales típicamente pueden resultar en 1 a 5% de variancia en la secuencia de nucleótido de un gen determinado. Alelos alternos pueden identificarse al secuenciar el gen de interés en una cantidad de diferentes individuos. Esto puede llevarse a cabo fácilmente al utilizar sondas de hibridización para identificar el mismo sitio genético en una variedad de individuos . Cualquier y todas estas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de amino ácidos resultantes o variaciones que son el resultado de variación alélica natural y que no alteran la acción funcional, se pretenden dentro del alcance de la invención. De acuerdo con esto, en otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención es de al menos 300 (325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, o 1290) nucleótidos de longitud e hibridiza bajo condiciones estrictas a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido, de preferencia la secuencia de codificación de ID de SEC. NO. : 1 o 2 y codifica una variante alélica o mutante de GPR10 murino.

Como se emplea aquí, el término "hibridiza bajo condiciones estrictas" se pretende que describa condiciones para hibridización y lavado bajo las cuales secuencias de nucleótido al menos 60% (75%, 70%, de preferencia 75%) son idénticas entre sí, típicamente permanecen hibridizadas entre sí. Estas condiciones estrictas se conocen por aquellos con destreza en la especialidad y pueden encontrarse en Current Protocols Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biología Molecular) , John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitante preferido de condiciones de hibridización estrictas son hibridización en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida por uno o más lavado en 0.2 X SSC, 0.1% SDS a 50-65°C. De preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que hibridiza bajo condiciones estrictas a la secuencia cualquiera de ID de SEC. NO. : 1 o 2, corresponden a una molécula de ácido nucleico de origen natural . Como se emplea aquí, una molécula de ácido nucleico de "origen natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótido que ocurre en la naturaleza (por ejemplo codifica una proteína natural) . Además de variantes alélicas de origen natural de GPR10, la persona con destreza en la especialidad apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación, de esta manera llevando a cambios en la secuencia de amino ácidos de la proteína codificada, sin alterar la actividad biológica de la proteína. Por ejemplo, pueden hacerse substituciones de nucleótido que lleva las substituciones de amino ácido en residuos de amino ácido "no esenciales" . Un residuo de amino ácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo silvestre sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo amino ácido "esencial" se requiere para actividad biológica. Por ejemplo residuos amino ácido que no se conservan o solo son semi conservados entre homólogos de diversas especies, pueden ser no esenciales para actividad y de esta manera serían probablemente objetivos para alteración. En forma alterna, residuos de amino ácido que se conservan entre los homólogos de diversas especies (por ejemplo murino y humano) pueden ser esenciales para actividad y de esta manera no serían probablemente objetivos para alteración. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican GPR10 murino que contiene cambios en residuos de amino ácidos que no son esenciales para actividad. Estos polipéptidos difieren en secuencia de amino ácidos de ID de SEC. NO.: 3, sin embargo retienen actividad biológica. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada incluye una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que incluye una secuencia de amino ácido que es al menos aproximadamente 85%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de amino ácido de ID de SEC. NO. : 3. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína variante, puede crearse al introducir una o más substituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótido en la secuencia de nucleótido de ID de SEC NOS. : 1 o 2, de manera tal que una o más substituciones, adiciones o eliminaciones de amino ácido se introducen en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones por técnicas standard, tales como mutagénesis dirigida por sitio y mutagénesis mediada por PCR. De preferencia, substituciones de amino ácidos conservadoras se fabrican en uno o más residuos amino ácidos no esenciales pronosticados. Una "substitución de amino ácido conservadora" es aquella en la cual el residuo amino ácido se reemplaza con un residuo amino ácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de los residuos amino ácido que tienen cadenas secundarias similares, se han definido en la técnica. Estas familias incluyen amino ácidos con cadenas secundarias básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas secundarias acídicas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas secundarias polares sin carga (por ejemplo, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas secundarias no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas secundarias de ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas secundarias aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . En forma alterna, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente sobre todo o parte de la secuencia de codificación, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden clasificarse por actividad biológica para identificar mutantes que retienen actividad. Siguiendo la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse en forma recombinante y la actividad de la proteína puede ser determinada. En una modalidad, un polipéptido mutante que es una variante de GPR10 murino puede ser ensayado para: (1) la capacidad por formar interacciones proteína: proteína con proteínas en una ruta de señalización de GPR10 murino; (2) la capacidad de unir un ligando de GPR10 (por ejemplo, PrRP) ; o (3) la capacidad de ligar a una proteína objetivo intra celular de GPR10. En otra modalidad, el polipéptido mutante puede ensayarse por la capacidad por mediar cambios en el comportamiento de alimentación, peso corporal o metabolismo . La presente invención abarca moléculas de ácido nucleico antisentido, es decir moléculas que son complementarias a un ácido nucleico sentido que codifica GPR10 murino, por ejemplo complementario a la hebra de codificación de una molécula de ADNc de doble hebra o complementario a una secuencia de ARNm. De acuerdo con esto, un ácido nucleico antisentido puede ser ligado por hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a toda una hebra de codificación o solo a una porción de la misma, por ejemplo todo o parte de una región de codificación de proteína (o marco de lectura abierto) . Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a todo o parte de una región de no codificación de la hebra de codificación de una secuencia de nucleótido que codifica GPR10 murino. Las regiones de no codificación ("regiones sin traducir 51 y 3'") son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región de codificación y no se traducen en amino ácidos. Un oligonucleótido anti sentido por ejemplo puede ser aproximadamente de 5, 10. 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse utilizando reacciones de ligación enzimática o síntesis química empleando procedimientos conocidos en la especialidad. Por ejemplo. un ácido nucleico antisentido (por ejemplo un oligonucleótido antisentido, puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados en forma diversa diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos anti sentido y sentido, por ejemplo derivados fosforotioato y nucleótidos substituidos acridina pueden ser empleados. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5 -carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2- tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2- metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido 5-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3 -amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2 , 6-diaminopurina. En forma alterna, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual se ha sub-clonado un ácido nucleico en una orientación anti sentido (es decir ARN transcrito del ácido nucleico insertado será de una orientación anti sentido a un ácido nucleico objetivo de interés, descrito más adelante en la siguiente sub-sección) . Las moléculas de ácido nucleico anti sentido de la invención, típicamente se administran a un sujeto o generan in si tu de manera tal que hibridizan con o ligan a ARNm celular y/o ADN genómico que codifica GPR10 para de esta manera inhibir la expresión, por ejemplo al inhibir transcripción y/o traducción. La hibridización puede ser por complementariedad de nucleótido convencional para formar un dúplex estable, o por ejemplo en el caso de una molécula de ácido nucleico anti sentido que liga a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en la ranura principal de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de administración de las moléculas de ácido nucleico anti sentido de la invención incluyen inyección directa en un sitio de tejido. En forma alterna, moléculas de ácido nucleico antisentido pueden modificarse para hacer objetivo en células selectas y luego administrarse sistémicamente. Por ejemplo, para administración sistémica, pueden modificarse moléculas anti sentido de manera tal que liguen específicamente a receptores o antígenos expresados en una superficie celular selecta, por ejemplo al enlazar las moléculas de ácido nucleico anti sentido con péptidos o anticuerpos que ligan a receptores o antígenos de superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico anti sentido también pueden suministrarse a células utilizando los vectores aquí descritos. Para lograr suficientes concentraciones intra celulares de las moléculas anti sentido, se prefieren construcciones de vector en donde la molécula de ácido nucleico anti sentido se coloca bajo el control de un fuerte promotor pol II o pol III. Una molécula de ácido nucleico anti sentido de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico a-anomérica. Una molécula de ácido nucleico -anomérica forma híbridos de doble hebra específicos con ARN complementario en donde contrario a las ß-unidades usuales, las hebras corren paralelas entre sí (Gaultier y colaboradores, (1987) Nucleic Acids Res . 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico anti sentido también puede comprender un 2 ' -o-metilribonucleótido (Inoue y colabor-adores (1987) Nucleic Acids Res . , 15:6131-6148) oun análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y colaboradores (1987) FEBS Lett. 215:327-330). La invención también abarca ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico de hebra sencilla tal como ARNm al cual tienen una región complementaria. De esta manera, ribozimas (por ejemplo ribozimas de cabeza de martillo (descritas por Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) pueden utilizarse para escindir catalíticamente transcripciones ARNm para de esta manera inhibir la traducción de la proteína codificada por ARNm. Una ribozima que tiene una especificidad para una molécula de ácido nucleico que codifica GPR10 murino puede diseñarse con base en la secuencia de nucleótido de un ADNc aquí descrito. Por ejemplo, un derivado de un ARN IVS L19 Tetrahymena puede construirse, en donde la secuencia de nucleótido del sitio activo es complementaria con la secuencia de nucleótido a extinguir en la Patente de los E.U.A. No. 4,987,071; de Cech y colaboradores; y de Cech y colaboradores la Patente de los E.U.A. No. 5,116,742. En forma alterna, un ARNm que codifica GPR10 murino puede utilizarse para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad de ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de ARN. Ver por ejemplo, Bartel y Szostak (1993) Science 261:1411-1418. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico que forman estructuras triples helicoidales. Por ejemplo, la expresión de GPR10 murino puede inhibirse al hacer objetivo secuencias nucleótido complementarias a la región reguladora del gen que codifica el polipéptido (por ejemplo el promotor y/o mejorador) para formar estructuras triples helicoidales que evitan la transcripción del gen en células objetivo. Ver en general Helene (1991) Anticancer Drug Des . 6 (6) : 569-84 ; Helene (1992) Ann . N. Y. Acad. Sci . 660:27-36; and Maher (1992) Bioassays 14 (12) : 807-15. En ciertas modualidades, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden modificarse en la porción base, porción azúcar o estructura principal fosfato para mejorar-, por ejemplo la estabilidad, hibridización o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la estructura principal de oxiribosa fosfato de los ácidos nucleicos puede modificarse para generar ácidos péptido nucleicos (ver Hyrup y colaboradores (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1) : 5-23) . Como se emplea aquí, los términos "ácidos péptido nucleicos" o "APNs" se refieren a mímicos de ácido nucleico, por ejemplo mímicos de ADN, en donde la estructura principal de oxiribosa fosfato se reemplaza por una estructura principal pseudo-péptido y solo las cuatro núcleo bases naturales se retienen. La estructura principal neutra de APNs se ha mostrado que permite hibridización específica a ADN y ARN bajo condiciones de baja concentración iónica. La síntesis de oligómeros APN puede realizarse utilizando protocolos de síntesis de péptido en fase sólida standard como se describe en Hyrup y colaboradores (1996), arriba; Perry-0 ' Keefe y colaboradores (1996) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 93: 14670- 675. APNs pueden emplearse en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, APNs puede emplearse como un agente anti sentido o antígeno para modulación específica de secuencia de expresión de gen, por ejemplo por inducir frenado de traducción o transcripción o inhibir replicación. APNs también pueden emplearse, por ejemplo en el análisis de mutaciones de par base simple en un gen por ejemplo por sujeción PCR dirigida por APN como enzimas de restricción artificiales cuando se utilizan en combinación con otras enzimas, por ejemplo Sl nucleasas (Hyrup (1996) , arriba; o como sondas o cebadores para secuencia e hibridización de ADN (Hyrup (1996) , arriba; Perry-O' Keefe y colaboradores. (1996) Proc . Nati . Acad.

Sci . USA 93 : 14670-675). En otra modalidad, APNs pueden modificarse, por ejemplo para mejorar su estabilidad o la absorción celular, al conectar grupos lipofílicos u otros auxiliares a APN, por la formación de quimeras APN-ADN o por el uso de liposomas u otras técnicas de suministro de droga conocidas en la especialidad. Por ejemplo, quimeras APN-ADN pueden generarse que pueden combinar las propiedades ventajosas de APN y ADN. Estas quimeras permiten enzimas de reconocimiento ADN, por ejemplo ARNsa H y ADN polimerasas, para interactuar con la porción ADN mientras que la porción APN proporcionará alta afinidad de unión y especificidad. Quimeras APN-ADN pueden ligarse empleando enlazadores de longitudes apropiadas seleccionados en términos de apilamiento de base, número de uniones entre las núcleo bases y orientación (Hyrup (1996) , arriba) . La síntesis de quimeras APN-ADN puede realizarse como se describe (Hyrup (1996) , arriba) y Finn y colaboradores (1996) Nucleic Acids Res . 24(17) : 3357-63. Por ejemplo, una cadena ADN puede sintetizarse en un soporte sólido utilizando química de acoplamiento fosforamidita standard y análogos nucleósido modificados. Compuestos tales como 5 '-4-metoxitritil) amino-5 ' -deoxi-timidina fosforamidita pueden emplearse como un enlace entre APN y el extremo 5', del ADN (Mag y colaboradores (1989) Nucleic Acids Res . 17:5973-88) .

Monómeros APN luego se acoplan en una forma escalonada para producir una molécula quimérica con segmento APN 5 ' y un segmento ADN 3' (Finn y colaboradores (1996) Nucleic Acids Res . 24(17) :3357-63) . En forma alterna, moléculas quiméricas pueden sintetizarse con un segmento ADN 5 ' y un segmento APN 3 ' (Peterser y colaboradores (1975) Bioorganic Med. Chem . Let t . 5:1119-11124). En otras modalidades, el oligonucleótido puede incluir otros grupos agregados tales como péptidos (por ejemplo para ser objetivo a receptores de célula huésped in vivo) o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (ver por ejemplo Letsinger y colaboradores (1989) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86:6553- 6556; Lemaitre y colaboradores (1987) Proc. Nati . Acad.

Sci . USA 84:648-652; Publicación PCT No. WO 88/09810) o la barrera sangre-cerebro (ver por ejemplo publicación PCT No ." WO 89/10134) . Además, oligonucleótidos pueden modificarse con agentes de escisión disparados por hibridización (ver por ejemplo Krol y colaboradores (1988) Bio/Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (ver por ejemplo Zon (1988) Pharm . Res . 5:539-549). Para este objetivo, el oligonucleótido puede conjugarse en otra molécula, por ejemplo un péptido, agente de entrelazamiento disparado por hibridización, agente de transporte, agente de escisión disparado por hibridización, etc. V. Proteínas Aisladas y Anticuerpos Un aspecto de la invención se refiere a proteínas aisladas y sus porciones biológicamente activas, así como fragmentos polipéptido adecuados para utilizar como inmunógeno para desarrollar anticuerpos dirigidos contra GPR10 murino. En una modalidad, GPR10 nativo puede aislarse de células o fuentes de tejido por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteína standard. En otra modalidad, polipéptidos de la invención se producen por técnicas de ADN recombinante. E forma alterna a expresión recombinante, GPR10 murino puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptido standard. Esta sección describe polipéptidos GPR10 murinos, anticuerpos dirigidos contra GPR10 murino y métodos para producir y utilizar estos polipéptidos y anticuerpos. Sin embargo, pueden emplearse las mismas técnicas para producir y utilizar polipéptidos GPR10 humanos y anticuerpos GPR10 antihumanos. Una proteína o su porción biológicamente activa "aislada" o "purificada" está substancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o fuente de tejido de la cual se deriva la proteína o substancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. La expresión "substancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína, en donde la proteína se separa de componentes celulares de las células de las cuales se aisla o produce de manera recombinante. De esta manera, proteína que está substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también referida aquí como "proteína contaminante") . Cuando la proteína o su porción biológicamente activa se produce de manera recombinante, también de preferencia está substancialmente libre del medio de cultivo, es decir el medio de cultivo representa menos que aproximadamente 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteínas . Cuando la proteína se produce por síntesis química, de preferencia está substancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir se separa de precursores químicos u otros productos químicos que se involucran en la síntesis de la proteína. De acuerdo con esto, estas preparaciones de la proteína tienen menos que aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no-GPRIO. Porciones biológicamente activas de GPR10 murino incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de amino ácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de amino ácidos de la proteína (por ejemplo, la secuencia de amino ácidos mostrada en ID de SEC NO. : 3, que incluye menos amino ácidos que la proteína de longitud íntegra, y exhiben al menos una actividad de la proteína correspondiente de longitud íntegra. Típicamente, porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína correspondiente. Una porción biológicamente activa de una proteína de la invención puede ser un polipéptido que por ejemplo tiene de longitud, 10, 25, 50, 100 o más amino ácidos. Aún más, otras porciones biológicamente activas, en donde otras regiones de la proteína se eliminan, pueden ser preparadas por técnicas recombinantes y evalúan por una o más de las actividades funcionales de la forma nativa de GPR10 murino. Entre los polipéptidos útiles están aquellos que tienen la secuencia de amino ácidos de ID de SEC NO.: 3. Otras proteínas útiles son substancialmente idénticas (por ejemplo al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o 99.5%) a cualquier ID de SEC NO. : 3 y retienen la actividad funcional de la proteína de origen natural correspondiente sin embargo difiere en secuencia de amino ácidos debido a la variación alélica natural o mutagénesis. Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de amino ácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para propósitos de óptima comparación (por ejemplo pueden introducirse espacios en la secuencia de una primer secuencia de ácido nucleico o amino ácido para óptimo alineamiento con una segunda secuencia de ácido nucleico o amino ácido) . Los nucleótidos o residuos amino ácido en correspondientes posiciones amino ácido o posiciones nucleótido luego se comparan. Cuando una posición en la primer secuencia se ocupa por el mismo residuo amino ácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas/# total de posiciones (de nuevo por ejemplo posiciones superpuestas) X100) . De preferencia, las dos secuencias son de la misma longitud. La determinación de % de homología entre dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Na ti .

Acad. Sci . USA 87 2264-2268, modificado por Karlin y Altschul (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:5873-5877.

Este algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST programas de Altschul y colaboradores. (1990) J.

Mol . Biol . 215:403-410. Búsquedas de nucleótido BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, calificación (score) = 100, longitud de palabra (wordlength) = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico GPR10 murino de la invención. Búsquedas de proteína BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, calificación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de amino ácido homologas a moléculas de proteína GPR10 murina de la invención. Para obtener alineamientos espaciados para propósitos de comparación, Gapped BLAST puede utilizarse como se describe en Altschul y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389-3402. En forma alterna, PSI-Blast puede emplearse para realizar una búsqueda iterada que detecta las relaciones distantes entre moléculas. Id. Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST con espacio y PSI-Blast, los parámetros predefinidos de los programas respectivos (por ejemplo XBLAST y NBLAST) pueden ser utilizados. Ver http//www.ncbi .nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, (1988) CABIOS 4:11-17. Este algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de soporte lógico de alineamiento de secuencia GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de amino ácidos, una tabla de residuo de peso PAM 120, una penalidad de longitud de espacio de 12, y una penalidad de espacio 4 pueden ser empleadas . La identidad porcentual entre dos secuencias puede determinarse utilizando técnicas similares a aquellas descritas anteriormente, con o sin permitir espacios. En el cálculo de identidad porcentual, solo se cuentan correspondencias exactas. La invención también proporciona proteínas de fusión o quiméricas. Como se emplea aquí, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende todo o parte (por ejemplo un fragmento biológicamente activo) de GPR10 murino enlazado operativamente con un polipéptido heterólogo (es decir un polipéptido diferente al mismo polipéptido de la invención) . Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado operativamente" se pretende que indique que el polipéptido de la invención y el polipéptido heterólogo se fusionan dentro del cuadro entre sí. El polipéptido heterólogo puede fusionarse al extremo o extremo C del polipéptido GPR10. Una proteína de fusión útil es una proteína de fusión GST en donde todo o una porción de GPR10 se fusiona al extremo C de las secuencias GST. Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de un polipéptido recombinante. Otras proteínas de fusión útiles incluyen fusiones a FLAGMR, una porción lacZ, GST, péptido que liga calmodulina, His6, o HA. Vectores para preparar estas proteínas de fusión están disponibles de Clontech, Inc. (Palo Alto, CA) y Stratagene, Inc. (La Jolla, CA) . En otra modalidad, la proteína de fusión contiene una secuencia de señales heterólogas en su extremo N. Por ejemplo, la secuencia de señal nativa de GPR10 murino puede retirarse y reemplazarse con una secuencia de señal de otra proteína. Por ejemplo, la secuencia secretoria gp67 de la porteína envolvente de baculovirus puede emplearse como una secuencia de señal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en Biología Molecular), Ausubel y colaboradores eds., John Wiley & Sons, 1992) . Otros ejemplos de secuencia de señal heterólogas eucarioticas incluyen las secuencias decretorias de melitina y fosfatasa alcalina de placenta humana (Stratagene; La Jolla, California) . Todavía en otro ejemplo, secuencias de señales heterólogas procarióticas útiles incluyen la señal secretoria phoA (Sambrook y colaboradores arriba) y la señal secretoria proteína A (Pharmacia Biotech; Piscata ay, New Jersey) . Todavía en otra modalidad, la proteína de fusión ee una proteína de fusión de inmunoglobulina en donde todo o parte de GPR10 se fusiona a secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas inmunoglobulina. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto para inhibir una interacción entre un ligando (soluble o ligado a membrana) y una proteína en la superficie de una célula) receptor) , para de esta manera suprimir transducción de señal in vivo . La proteína de fusión de inmunoglobulina puede emplearse para afectar la biodisponibilidad de un ligando connato de GPR10. La inhibición de interacción de receptor/ligando puede ser útil terapéuticamente para modular el comportamiento de alimentación, peso corporal y/o velocidad metabólica. Aún más, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden emplearse como inmunógeno para producir anticuerpos dirigidos contra PGR10 en un sujeto, para purificar ligandos y ensayos de clasificación para identificar moléculas que inhiben la interacción de receptores con ligandos. Proteínas de fusión y quimérica de la invención pueden producirse por técnicas de ADN recombinantes standard. En otra modalidad, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. En forma alterna, amplificación PCR de fragmentos de gen puede llevarse a cabo utilizando cebadores ancla que dan lugar a extensiones o ramificaciones complementarias entre dos fragmentos de gen consecutivos que subsecuentemente pueden ser sometidos a recocido y reamplificarse para generar una secuencia de gen quimérica (ver por ejemplo a Ausubel y colaboradores, arriba) . Aún más, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles que ya codifican una porción de fusión (por ejemplo un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica GPR10 puede clonarse en este vector de expresión, de manera tal la porción de fusión se enlaza encuadro al polipéptido de la invención. La presente invención también se refiere a variantes de GPR10. Estas variantes tienen una secuencia de amino ácidos alterada que puede funcionar ya sea como agonistas (miméticos) o como antagonistas. Pueden generarse variantes por mutagénesis, por ejemplo mutación o truncado de punto discreto. Un agonista puede retener substancialmente las mismas o un sub-conjunto de las actividades biológicas de la forma de origen natural de la proteína. Un antagonista de una proteína puede inhibir una o más de las actividades de la forma de origen natural de la proteína, por ejemplo al ligar en forma competitiva a un miembro corriente abajo o corriente arriba de una cascada de señalización celular que incluye la proteína de interés. De esta manera, efectos biológicos específicos pueden producirse por tratamiento con una variante de función limitada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un sub-conjunto de las actividades biológicas de la forma de origen natural de la proteína puede tener menos efectos secundarios en un sujeto respecto al tratamiento con la forma de origen natural de la proteína. Variantes de una proteína de la invención que funcionan ya sea como agonistas (miméticos) o como antagonistas, pueden identificarse al clasificar bibliotecas de mutantes combinatorias, por ejemplo mutantes de truncado, de la proteína de la invención para actividad agonista o antagonista. En una modalidad, una biblioteca diversi icada de variantes se genera por mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico y se codifica por una biblioteca de gen diversa. Una biblioteca de variantes diversificada puede producirse por ejemplo al ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes, de manera un conjunto degenerado de secuencias de proteínas potenciales sea expresable como polipéptidos individuales o en forma alterna como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo para exhibición de fago) . Hay una variedad de métodos que pueden emplearse para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la invención a partir de una secuencia oligonucleótido degenerada. Métodos para sintetizar oligonucleótido degenerado se conocen en la especialidad (ver, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron especialidad { ver, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y colaboradores, (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y colaboradores (1984) Science 198:1056; Ike y colaboradores (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477) . Además, bibliotecas de fragmentos de la secuencia de codificación de GPR10 pueden utilizarse para generar una población diversificada de polipéptidos para clasificación y subsecuente selección de variantes. Por ejemplo, una biblioteca de fragmentos de secuencia de codificación puede generarse al tratar un fragmento PCR de doble hebra de la secuencia de codificación de interés con una nucleasa bajo condiciones en donde ocurre muescamiento solo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizar el ADN de doble hebra, renaturalizar el ADN DNA para formar ADN de doble hebra, lo que puede incluir pares sentido/antisentido a partir de diferentes productos de muescado, retirar porciones de hebra sencilla de dúplex reformados por tratamiento con Sl nucleasa, y ligar la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método, pueden derivarse una biblioteca de expresión que codifica fragmentos internos y N-terminales de diversos tamaños de la proteína de interés . En la especialidad se conocen varias técnicas para clasificar productos de genes de bibliotecas combinatorias, elaborados por mutaciones punto o truncado, y para clasificar bibliotecas ADNc para productos de gen que tienen una propiedad selecta. Las técnicas más ampliamente empleadas que son susceptibles a un análisis de alto rendimiento, para clasificar grandes bibliotecas de genes, típicamente incluyen clonar la biblioteca de gen en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios bajo condiciones en donde la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detecta. Mutagénesis de totalidad recursiva (REM Recursíve Ensemble Mutagenesis) , una técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de clasificación para identificar variantes de una proteína de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc . Nati . Acad. Sci .

USA 89:7811-7815; Delgrave y colaboradores, (1993) Protein Engineering 6(3) :327-331) . Puede emplearse un polipéptido GPR10 aislado como un inmunógeno para generar anticuerpos utilizando técnicas standard para preparación de anticuerpo monoclonal y policlonal. La proteína o polipéptido de toda la longitud puede emplearse o en forma alterna, la invención proporciona fragmentos de péptido antigénico para utilizar como inmunógeno. El péptido antigénico de una proteína de la invención comprende al menos 8 (de preferencia 10, 15, 20, o 30) residuos amino ácido de la secuencia de amino ácidos de ID de SEC. NO. :3 y abarca un epítope de la proteína de manera tal que un anticuerpo desarrollado contra el péptido forma un complejo inmune específico con la proteína. Epítopes útiles abarcados por el péptido antigénico, a menudo, pero no en forma exclusiva son regiones que se localizan en la superficie de la proteína, por ejemplo regiones hidrofílicas. Un inmunógeno típicamente se emplea para preparar anticuerpos al inmunizar un sujeto conveniente (por ejemplo conejo, cabra, ratón u otro mamífero) . Una preparación inmunogénica apropiada puede contener . por ejemplo polipéptido sintetizado químicamente, expresado en forma recombinante . La preparación además puede incluir un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund o agente inmunoestimulatorio semejante. De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra GPR10. El término "anticuerpo" como se emplea aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir moléculas que contienen un sitio de unión de antígeno que liga específicamente un antígeno tal como GPR10 murino. Una molécula que liga específicamente a un polipéptido determinado de la invención, es una molécula que liga en polipéptido, pero no liga substancialmente otras moléculas en una muestra, por ejemplo una muestra biológica, que contiene naturalmente el polipéptido. Ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden generarse al tratar el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se emplea aquí, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene solo una especie de un sitio de unión de antígeno, capaz de inmunoreacción con un epítope particular. Anticuerpos policlonales pueden prepararse como se describe anteriormente al inmunizar un sujeto conveniente con GPR10 murino como inmunógeno. El título de anticuerpo en el sujeto inmunizado puede verificarse con el tiempo por técnicas standard, tal como con un ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA = Enzime Linked Immuñosorbent Assay) utilizando polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo pueden aislarse del mamífero (por ejemplo de la sangre) y purificarse adicionalmente por técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. En un tiempo apropiado después de inmunización, por ejemplo cuando los títulos de anticuerpo específicos son los más altos, pueden obtenerse células productoras de anticuerpos a partir del sujeto y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas standard, tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica de hibridoma de célula humana (Kozbor y colaboradores, (1983) Immunol . Today 4:72), EBV- la técnica hibridoma EBV (Colé y colaboradores, (1985) , Monoclonal Antibodies & Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp . 77-96) o técnicas trioma.

La tecnología para producir hibridoma es bien conocida (ver en general Current Protocols in Immunology (Protocolos Actuales en Inmunología) (1994) Coligan y colaboradores, (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY) . Células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan al clasificar los sobrenadantes del cultivo de hibridoma para anticuerpos que ligan el polipéptido de interés, por ejemplo utilizando un ensayo ELISA standard. En forma alterna para preparar los hibridomas que secretan anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal dirigido contra GPR10 murino puede identificarse y aislarse al clasificar una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo una biblioteca de exhibición de fago anticuerpo) con el polipéptido de interés. Equipos para generar y clasificar bibliotecas de exhibición de fago, están comercialmente disponible (por ejemplo Pharmacia Recombinant Phage Antibody System (Sistema Anticuerpo de Fago Recombinante Pharmacia) , No. de Catálogo 27-9400-01; y el Equipo de Exhibición de Fago SurfZAP1™ de Stratagene, No. de Catálogo 240612) . Adicionalmente, ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles para utilizar en generar y clasificar biblioteca de exhibición de anticuerpo pueden encontrarse por ejemplo en la patente de los E.U.A. No. 5,223,409; la Publicación del PCT No. WO 92/18619; Publicación PCT No. WO 91/17271; Publicación PCT No. W0 92/20791; Publicación PCT No. WO 92/15679; Publicación PCT No. WO 93/01288; Publicación PCT No. WO 92/01047; Publicación PCT No. WO 92/09690; Publicación PCT No. WO 90/02809; Fuchs y colaboradores, (1991) Bio/Technology (Bio/ Tecnología) 9:1370-1372; Hay y colaboradores, (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse y colaboradores, (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths y colaboradores, (1993) EMBO J. 12:725-734. Adicionalmente, anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, comprenden tanto porciones humanas como no humanas, pueden hacerse utilizando técnicas de ADN recombinante standard, están dentro del alcance de la invención. Estos anticuerpo monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la especialidad, por ejemplo utilizando los métodos descritos en la Publicación del PCT No. WO 87/02671; Solicitud de Patente Europea 184,187; Solicitud de Patente Europea 171,496; Solicitud de Patente Europea 173,494; Publicación PCT No. WO 86/01533; Patente de los E.U.A. No. 4,816,567; Solicitud de Patente Europea 125,023; Better y colaboradores, (1988) Science 240:1041-1043; Liu y colaboradores, (1987) Proc.

Nati . Acad. Sci . USA 84:3439-3443; Liu y colaboradores, (1987) J. Immunol . 139:3521-3526; Sun y colaboradores, (1987) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 84:214-218; Nishimura y colaboradores, (1987) Canc . Res, 47:999-1005; Wood y colaboradores, (1985) Nature 314:446-449; y Shaw y colaboradores, (1988) J. Nati . Cáncer Inst . 80:1553-1559): Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi y colaboradores, (1986) Bio/Tecnigues 4:214; Patente de los E.U.A. 5,225,539; Jones y colaboradores, (1986) Na ture 321:552- 525; Verhoeyan y colaboradores, (1988) Science 239:1534; y Beidler y colaboradores, (1988) J. I munol . 141:4053-4060. Anticuerpos completemente humanos son particularmente convenientes para tratamientos terapéuticos de pacientes humanos. Estos anticuerpos pueden producirse utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar genes de cadenas pesada y ligera humana. Los ratones transgénicos se inmunizan en la forma normal con un antígeno selecto, por ejemplo todo o una porción de GPR10 murino. Anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse utilizando tecnología de hibridoma convencional. Los trangenes de inmunoglobulina humana contenidos por rearreglo de ratón transgénico durante diferenciación de célula B y subsecuentemente se someten a mutación somática y conmutación de clase. De esta manera, utilizando esta técnica, es posible el producir anticuerpos terapéuticamente útiles IgG, IgA e IgE . Para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar (1995, Int . Rev. Inmuno 1 . 13:65-93) . Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir estos anticuerpos, ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 5,625,126; patente de los E.U.A. No. 5,633,425; patente de los E.U.A. No. 5,569,825, patente de los E.U.A. No. 5,661,016; y patente de los E.U.A. No. 5,545,806. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) , pueden contactarse para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno selecto utilizando tecnología semejante a la anteriormente descrita. Anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope selecto pueden generarse utilizando una técnica referida como "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano, por ejemplo un anticuerpo murino, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítope. Un anticuerpo dirigido contra GPR10 murino (por ejemplo anticuerpo monoclonal) puede emplearse para aislar el polipéptido por técnicas standard, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Aún más, este anticuerpo puede emplearse para detectar la proteína (por ejemplo en un lisado celular o sobrenadante de células) a fin de evaluar la abundancia y patrón de expresión del polipéptido. Los anticuerpos también pueden emplearse a manera de diagnóstico para verificar niveles de proteína en tejidos como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado. La detección puede facilitarse al acoplar el anticuerpo a una substancia detectable. Ejemplos de substancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes, materiales bioluminescentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas convenientes incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos convenientes incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes convenientes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminescente incluye luminol ; ejemplos de materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y ejemplos de material radioactivo conveniente incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. VI . Vectores de Expresión Recombinante y Células Huésped Otro aspecto de la invención se refiere a vectores (por ejemplo vectores de expresión) que contienen un ácido nucleico que codifica GPR10 murino (o una porción del mismo) . Como aquí se emplea, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un bucle de ADN con doble hebra circular en el cual pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales puede ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo vectores bacteriales que tienen un origen bacterial de replicación y vectores de mamífero episomales) . Otros vectores (por ejemplo vectores de mamífero no episomales) , se integran en el genoma de una célula huésped ante introducción en la célula huésped, y de esta manera se replican junto con el genoma huésped. Aún más, ciertos vectores, vectores de expresión, son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se ligan en forma operativa. En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante, a menudo están en la forma de plásmidos (vectores) . Sin embargo, la invención se pretende que incluya entre otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados) , que sirven funciones equivalentes. Esta sección describe vectores y células huésped que contienen ácidos nucleicos GPR10 murinos y sus variantes y métodos para su producción y uso. Sin embargo, pueden emplearse las mismas técnicas para producir y utilizar vectores y células huésped que alojan ácidos nucleico GPR10 humanos. Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma conveniente para expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Esto significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias regulatorias, seleccionadas en base a las células huésped para utilizarse en expresión que se enlazan operativamente con la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "enlazado operativamente" se pretende que signifique que la secuencia nucleótido de interés se enlaza a la o las secuencias regulatorias en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótido (por ejemplo en un sistema de transcripción/traducción in vi tro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped) . El término "secuencia regulatoria" se pretende que incluye promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo señales de poliadenilación) . Estas secuencias regulatorias se describen por ejemplo en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology (Tecnología de Expresión de Gen : Métodos en Enzimología) 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Secuencias regulatorias incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula huésped y aquéllos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped (por ejemplo secuencias regulatorias específicas de tejido) . Se apreciará por aquéllos con destreza en la especialidad que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped para transformar, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células huésped para de esta manera producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe aquí . Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden diseñarse para expresión de GPR10 murino en células procarióticas o eucarióticas, por ejemplo células bacterianas tales como E. coli , células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus) , células de levadura o células de mamíferos. Células huésped convenientes se discuten además en Goeddel, arriba . En forma alterna, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vi tro, por ejemplo utilizando secuencias regulatorias de promotor T7 y polimerasa T7. La expresión de proteínas en procariotas más a menudo se lleva a cabo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión ya sea de proteínas de fusión o no fusión.

Vectores de fusión agregan una cantidad de amino ácidos a una proteína ahí codificada, usualmente al extremo amino de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión típicamente sirven a tres propósitos: 1) incrementar la expresión de la proteína recombinante: 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como ligando en la purificación de afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, un sitio de escisión proteolítica se introduce en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante, para permitir separación de la proteína recombinante a partir de la porción de fusión subsecuente a purificación de la proteína de fusión. Estas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento connato incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutationa S-transferasa (GST) , proteína de unión maltosa E, o proteína A, respectivamente a la proteína recombinante objetivo. Ejemplos de vectores de expresión de E. coli no fusión inducibles convenientes incluyen pTrc (Amann y colaboradores, (1988) Gene 69:301-315) y pET lid (Studier y colaboradores, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology (Tecnología de Expresión de Gen : Métodos en Enzimología) 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89) . La expresión de gen objetivo a partir del vector pTrc, se basa en transcripción en ARN polimerasa huésped a partir de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión de_ gen objetivo a partir del vector pET lid se basa en transcripción de un promotor de fusión T7 gnlO-lac mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gnl) .

Esta polimerasa viral se suministra por cepas huésped BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) de un profago residente ? que aloja un gen T7 gnl bajo el control de transcripción del promotor lacUV 5. Una estrategia para llevar al máximo la expresión de proteína recombinante en E. coli es expresar la proteína en una bacteria huésped con capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology (Tecnología de Expresión de Gen : Métodos en Enzimología) 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128) . Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a insertarse en un vector de expresión, de manera tal que los codones individuales por cada amino ácido son aquéllos empleados de preferencia en E. coli (Wada y colaboradores, (1992) Nucleic Acids Res . 20:2111-211! Esta alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas de síntesis de ADN standard. En otra modalidad, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerivisae incluyen pYepSecl (Baldari y colaboradores, (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz y colaboradores, (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) , y pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA) . En forma alterna, el vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith y colaboradores, (1983) Mol .

Cell Biol . 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39) . Todavía en otra modalidad, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero utilizando vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed (1987) Na ture 329:840) y pMT2PC (Kaufman y colaboradores, (1987) EMBO J. 6:187-195) . Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión a menudo se proporcionan por elementos regulatorios virales. Por ejemplo, promotores comúnmente empleados se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus Simio 40. Para otros sistemas de expresión convenientes tanto para células procarióticas .como eucarióticas ver los capítulos 16 y 17 de Sambrook y colaboradores, arriba .

En otra modalidad, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico de preferencia en un tipo de célula particular (por ejemplo elementos regulatorios específicos de tejido, se emplean para expresar el ácido nucleico) . Elementos regulatorios específicos de tejido se conocen en la especialidad. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido convenientes incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert y colaboradores, (1987) Genes Dev. 1:268-277) , promotores específicos de linfoide (Caíame y Eaton (1988) Adv. I munol . 43:235-275), en particular promotores de receptores de célula T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji y colaboradores, (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund y colaboradores, (1985) Science 230:912-916), y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotores de suero de leche; patente de los E.U.A. No. 4,873,316 y publicación de patente europea No. 264,166) . Los promotores regulados en forma de desarrollo también están abarcados ejemplo el promotor de hox murina (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor a-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546). La invención además proporciona un vector de expresión recombinante comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Esto es, la molécula de ADN se enlaza operativamente a una secuencia regulatoria, en una forma que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm que codifica GPR10 murino. Secuencias regulatorias enlazadas operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido pueden seleccionarse que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células, por ejemplo promotores y/o mejoradores virales, o secuencias regulatorias pueden seleccionarse que dirijan expresión constitutiva específica de tejido o específica de tipo de célula de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en donde ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región regulatoria de alta eficiencia, la actividad de la cual puede determinarse por el tipo de célula en la cual se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de expresión de gen utilizando genes antisentido ver Weintraub y colaboradores, (Reviews - Trends in Geneti cs, Vol. 1(1) 1986). Otro aspecto de la invención se refiere a células huésped en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se emplean aquí en forma intercambiable. Se entiende que estos términos no solo se refieren a las células sujeto particular, sino a la progenie o progenie potencial de esta célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en sucesivas generaciones por influencias ambientales o mutación, esta progenie puede de hecho no ser idéntica a la célula padre pero aún se incluye dentro del alcance del término como se emplea aquí . Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica (por ejemplo, E. coli , células de insecto, células de levadura o de mamífero) . ADN de vector puede introducirse en células procarióticas o eucarióticas mediante técnicas de transfección o transformación convencionales. Como se emplean aquí, los términos "transformación" y "transfección" se pretende que se refieran a una variedad de técnicas reconocidas en la especialidad, para introducir ácido nucleico extraño en una célula huésped, incluyendo co-precipitación de cloruro de calcio o fosfato de calcio, transfección mediada por dextrano-DEAE, lipofección o electroporación. Métodos convenientes para transformar o transfectar células huésped, pueden encontrarse en Sambrook, y colaboradores, (arriba) , y otros manuales de laboratorio. Para transfección estable de células de mamíferos se sabe que, dependiendo de la técnica de transfección y vector de expresión empleados, solo una pequeña fracción de células pueden integrar el DNA extraño en su genoma. A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para resistencia a antibióticos) se introduce en general en las células huésped junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables útiles incluyen aquéllos que confieren resistencia a drogas tales como G418, higromicina y metotrexato. Células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas por selección de droga (por ejemplo, células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que otras células mueren) .

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo, puede ser utilizada para producir GPR10. De acuerdo con esto, la invención además proporciona métodos para producir GPR10 utilizando las células huésped de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar las células huésped de la invención (en donde un vector de expresión recombinante que codifica GPR10 se ha introducido) en un medio conveniente tal que se produce el polipéptido. En otra modalidad, el método además comprende aislar el polipéptido del medio o célula huésped. Las células huésped de la invención también pueden emplearse para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una modalidad, una célula huésped de la invención es un oocito fertilizado o una célula basal embriónica en la cual se han introducido secuencias que codifican GPR10. Estas células huésped luego pueden emplearse para crear animales transgénicos no humanos, en donde secuencias exógenas que codifican GPR10 murino se han introducido en su genoma o animales recombinantes homólogos en donde se han alterado secuencias GPR10 que codifican endógeno. Estos animales son útiles para estudiar la función y/o actividad del polipéptido y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad de polipéptido. Como se emplea aquí, un "animal transgénico" es un animal no humano, por ejemplo un mamífero, particularmente un roedor tal como una rata o ratón, en donde una o más de las células del animal incluyen un transgen. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgen es ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, de esta manera dirigiendo la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal tz-ansgénico. Como se emplea aquí, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, por ejemplo un mamífero, particularmente un ratón, en donde se ha alterado un gen endógeno por recombinación homologa entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo una célula embriónica del animal, antes de desarrollo del animal . Un animal transgénico de la invención puede crearse al introducir un ácido nucleico que codifica GPR10 murino (o su homólogo) en los pronúcleos macho de un oocito fertilizado, por ejemplo por microinyección, infección retroviral, y permitir que el oocito se desarrolle en un animal hembra substituta pseudo-embarazada . Secuencias intrónicas y señales de poliadenilación también pueden emplearse en el transgen para incrementar la eficiencia de expresión del transgen. Una o varias secuencias reguladoras específicas de tejido pueden enlazarse operativamente al transgen para dirigir la expresión del polipéptido de la invención en células particulares. Métodos para generar animales transgénicos por manipulación y microinyección de embrión, particularmente animales tales como ratones, se han vuelto convencionales en la especialidad y se describen por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Nos. 4,736,866 y 4,870,009, en la patente de los E.U.A. No. 4,873,191 y en Hogan, Manipulating the Mouse Embryo (Manipulación del Embrión de Ra tón) , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) . Métodos similares se emplean para producción de otros animales transgénicos. Un animal fundador transgénico puede identificarse, con base en la presencia del transgen en su genoma y/o expresión de ARNm que codifica el transgen en tejidos o células de los animales. Un animal fundador transgénico luego puede emplearse para criar animales adicionales que transportan el transgen. Aún más, animales transgénicos que transportan el transgen además pueden criarse en otros animales transgénicos que transportan otros transgenes. Para crear un animal recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen que codifica GPR10 murino en la cual se ha introducido una eliminación, adición o substitución para de esta manera alterar, por ejemplo interrumpir funcionalmente el gen. En una modalidad, el vector se diseña de manera tal que ante recombinación homologa, el gen endógeno se interrumpe funcionalmente (es decir ya no codifica más una proteína funcional; también referido como un vector "de desprendimiento") . En forma alterna, el vector puede diseñarse de manera tal que ante recombinación homologa, el gen endógeno se muta o de otra forma se altera pero aún codifica proteína funcional (por ejemplo, la región regulatoria corriente arriba puede alterarse para de esta manera alterar la expresión de la proteína endógena) . En el vector recombinante homólogo, la porción alterada del gen esta flanqueda en sus extremos 5 ' y 3 ' por ácido nucleico adicional del gen, para permitir que ocurra recombinación homologa entre el gen exógeno que se transporta por el vector y un gen endógeno en una célula basal embriónica. Las secuencias de ácido nucleico de flanqueo adicional son de longitud suficiente para recombinación homologa exitosa con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen varios kilobases de ADN de flanqueo (en ambos extremos 5' y 31) en el vector ( Ver, por ejemplo Thomas y Capecchi (1987) Cell (Célula) 51:503 para una descripción de vectores recombinantes homólogos) . El vector se introduce en una línea de célula basal embriónica (por ejemplo, por electroporación) y se eligen células en donde el gen introducido se ha recombinado homólogamente con el gen endógeno (ver, por ejemplo Li y colaboradores. (1992) Cell 69:915). Las células selectas luego se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo un ratón) para formar quimeras de agregación ( ver, por ejemplo Bradley en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell : A Practical Approach (Teratocarcinomas y Células Básales Ei?briónicas) : Un Enfoque Práctico, Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) págs . 113-152). Un embrión quimérico luego puede implantarse en un animal hembra substituta pseudoembarazada conveniente y llevarse el embrión a término. Progenie que aloja el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales puede emplearse para criar animales en donde todas las células del animal contienen el ADN recombinante homólogamente por transmisión de línea germinal del transgen. Métodos para construir vectores recombinantes homólogos y animales recombinantes homólogos, se describen adicionalmente por Bradley (1991) Current Opinión in Bio/Technology (Opinión Actual en Bio/Tecnología) 2:823-829 y en las publicaciones de los PCT Nos. WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968 y WO 93/04169. En otra modalidad, animales no humanos transgénicos pueden producirse que contienen sistemas selectos, lo que permite expresión regulada del transgen. Un ejemplo de este sistema es el sistema cre/loxP de bacteriófago Pl . Para una descripción del sistema cre/loxP recombinasa, ver por ejemplo Lakso y colaboradores, (1992) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89:6232-6236. Otro ejemplo de un sistema de recombinasa es el sistema FLP recombinasa de Saccharomyces cerevisiae (O' Gorman y colaboradores, (1991) Science 251:1351-1355. Si se emplea un sistema cre/loxP recombinasa para regular la expresión del transgen, animales que contienen transgenes que codifican tanto la Cre recombinasa como una proteína selecta, se requieren.

Estos animales pueden proporcionarse a través de la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo al aparear dos animales transgénicos, uno que contiene un transgen que codifica una proteína selecta y el otro que contiene un transgen que codifica una recombinasa. Clones de los animales transgénicos no humanos descritos aquí también pueden producirse de acuerdo con los métodos descritos por Wilmut y colaboradores, (1997) Nature 355:810-813 y en las publicación de PCT Nos. WO 97/07668 y WO 97/07669. VII . Métodos de Tratamiento La presente invención proporciona tanto métodos profilácticos como terapéuticos para modular el peso corporal, por ejemplo alterando el comportamiento de alimentación o la velocidad o tasa metabólica. En un aspecto, la invención proporciona un método para modular el peso corporal administrando un agente que modula una actividad de GPR10. Estos métodos son útiles para modular peso corporal tanto en pacientes que tienen • expresión o actividad aberrante de GPR10 u otros pacientes que se beneficiarían de la administración de un agente que modula la actividad de GPR10. Dependiendo de las necesidades del paciente, puede emplearse un agonista o antagonista GPR10 para tratar al sujeto. Antagonistas de actividad de GPR10 o compuestos que reducen expresión de GPR10, son útiles para tratar alto peso corporal, por ejemplo obesidad, debido a que pueden emplearse para reducir el peso corporal. Similarmente, compuestos que disminuyen la actividad o expresión de una proteína en la ruta de señalización GPR10, son útiles para tratamiento de alto peso corporal. Por el contrario, agonistas de actividad de GPR10 o compuestos que incrementan la expresión de GPR10 son útiles para el tratamiento de bajo peso corporal, por ejemplo caquexia, debido a que pueden emplearse para incrementar el peso corporal. Compuestos que aumentan la actividad o expresión de una proteína en la ruta de señalización GPR10 son útiles para el tratamiento de bajo peso corporal.

El método modulatorio de la invención involucra contactar una célula con un agente que modula una o más de las actividades de GPR10. Un agente que modula actividad puede ser un agente como se describe aquí, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando connato de origen natural del polipéptido, un péptido, un péptido-mimético, u otra pequeña molécula. En una modalidad, el agente estimula una o más de las actividades biológicas de GPR10. Ejemplos de estos agentes estimulatorios incluyen polipéptidos GPR10 activos y moléculas de ácido nucleico que codifican una porción de GPR10. En otra modalidad, el agente inhibe una o más de las actividades biológicas de GPR10. Ejemplos de estos agentes inhibitorios incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido y anticuerpos. Estos métodos modulatorios pueden realizarse in vi tro (por ejemplo, al cultivar la célula con el agente) o en forma alterna in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto) . Como tal, la presente invención proporciona métodos para tratar a un individuo afectado con una enfermedad o desorden, caracterizados por expresión o actividad indeseada de GPR10 o una proteína en la ruta de señalización de GPR10. En una modalidad, el método involucra administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado por un ensayo de clasificación aquí descrito) o combinación de agentes que modula (por ejemplo regula en forma ascendente o descendente) la expresión o actividad de GPR10 o una proteína de la ruta de señalización GPR10. En otra modalidad, el método involucra administrar un modulador de GPR10 como terapia para compensar una baja expresión o actividad reducida o indeseable de GPR10 o una proteíha en la ruta de señalización de GPR10. El estímulo de la actividad o expresión es conveniente en situaciones en donde la actividad o expresión es anormalmente regular en forma descendente baja y/o en donde es probable que la actividad incrementada tenga un efecto benéfico. Por el contrario, la inhibición de actividad o expresión es conveniente en situaciones en donde la actividad o expresión es anormalmente elevada o regulada ascendente y/o en donde la actividad disminuida probablemente tenga un efecto benéfico. Esta invención- además se ilustra por los siguientes ejemplos que no habrán de considerarse como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a través de esta solicitud, aquí se incorporan por referencia. VIII. Composiciones Farmacéuticas Esta invención además se refiere a agentes novedosos identificados por los ensayos de clasificación anteriormente descritos y sus usos para tratamientos como se describe aquí . Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos (también referidos aquí como "compuestos activos") de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Estas composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, proteína o anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se emplea aquí, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" se pretende que incluya cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retardo de absorción e isotónicos y semejantes, compatibles con administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para substancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la especialidad. Excepto en cuanto a que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, su uso en las composiciones se contempla. Compuestos activos suplementarios también pueden incorporarse en las composiciones. La invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un modulador de expresión o actividad GPR10 (y/o un modulador de la actividad o expresión de una proteína en la ruta de señalización GPR10) así como métodos para preparar estas composiciones al combinar uno o más de estos moduladores y un portador farmacéuticamente aceptable . También dentro de la invención están composiciones farmacéuticas que comprenden un modulador identificado utilizando los ensayos de clasificación de la invención, empacado con instrucciones para uso. Para moduladores que son antagonistas de actividad GPR10 o que reducen la expresión GPR10, las instrucciones especificarán el uso de la composición farmacéutica para tratamiento de alto peso corporal (por ejemplo, reducción de peso corporal) . Para moduladores que son agonistas de actividad GPR10 o que incrementan la expresión GPR10, las instrucciones especificarán el uso de la composición farmacéutica para el tratamiento de bajo peso corporal (es decir reducción de peso corporal) . Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su ruta pretendida de administración. Ejemplos de rutas de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo inhalación), transdérmica (tópica)) transmucosal y rectal. Soluciones o suspensiones empleadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución de salino, aceites fijos, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol benzílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiamintetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Puede ajustarse pH con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede circunscribirse o encerrarse en ampolletas, jeringas desechables o ampolletas de múltiples dosis elaboradas de vidrio ,o plástico. Composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (ya sea solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, portadores convenientes incluyen salino fisiológico, agua bacterioestática, Cremophor ELMR (BASF; Parsippany, NJ) o salino amortiguado con fosfato (PBS) . En todos los casos, la composición debe ser estéril y deberá ser fluida en la proporción de que exista fácil aplicación por jeringa. Deber ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminantes de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un medio de dispersión o solvente que contiene por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido y semejantes) y sus mezclas convenientes. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y por el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse por diversos agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y semejantes. En muchos casos, será preferible el incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden prepararse al incorporar el compuesto activo (por ejemplo, un polipéptido o anticuerpo) en la cantidad requerida, en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes anteriormente enumerados, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquéllos anteriormente citados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelamiento, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada estéril previamente del mismo . Composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden circunscribirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y emplearse en la forma de tabletas, trociscos, o cápsulas. Composiciones orales también pueden prepararse utilizando un portador fluido para utilizar como enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica oralmente y hacer gárgaras y expectorar o tragar. Agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y semejantes pueden contener cualquiera de los ingredientes siguientes o compuestos de una naturaleza semejante: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínics, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente endulzante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, metil salicilato o sabor naranja. Para administración por inhalación, los compuestos se suministran en la forma de un rocío en aerosol de un recipiente a presión o surtidor que contiene un propulsor conveniente, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizante. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para administración transmucosal o transdérmica, en la formulación se emplean penetrantes apropiados para que la barrera sea permeada . Estos penetrantes en general se conocen en la especialidad e incluyen por ejemplo para administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse a través del uso de supositorios o rocíos nasales. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, bálsamos o emplastos, geles o cremas como se conoce generalmente en la especialidad. Los compuestos también pueden prepararse en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal . En una modalidad, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán los compuestos contra rápida eliminación del cuerpo, tales como formulación de liberación controlada incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Polímeros biodegradables, biocompatibles pueden emplearse, tales como etilen vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Métodos para la preparación de estas formulaciones serán aparentes para aquéllos con destreza en la especialidad. Los materiales también pueden ser obtenidos comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) , también pueden emplearse como portadores farmacéuticamente aceptable. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por aquéllos con destreza en la especialidad, por ejemplo como se describe en la patente de los E.U.A. No. 4,522,811. Es especialmente ventajoso el formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitarias para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de la unidad de dosis como se emplea aquí, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo que se calcula para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención se dicta por y es dependiente directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de formulación de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos . Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden insertarse en vectores y utilizarse como vectores de terapia de gen. Vectores de terapia de gen pueden suministrarse a un sujeto por ejemplo por inyección intravenosa, administración local (patente de los E.U.A. 5,328,470) o por inyección estereotáctica ( ver, por ejemplo, Chen y colaboradores. (1994) Proc. Nati . Acad.

Sci . USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector para terapia de gen puede incluir el vector para terapia de gen en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en donde el vehículo para suministro de gen se incrusta. En forma alterna, cuando el vector de suministro de gen completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro de gen. Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o surtidor junto con instrucciones para administración. Para composiciones farmacéuticas que incluyen un antagonista de actividad GPR10, un compuesto que reduce la expresión de GPR10, o un compuesto que reduce la expresión o actividad de una proteína en la ruta de señalización GPR10 (o alguna combinación de los mismos) , las instrucciones para administración especificarán el uso de la composición para disminuir el peso corporal. Para composiciones farmacéuticas que incluyen un agonista de actividad GPR10, un compuesto que incrementa la expresión de GPR10, o un compuesto que incrementa la expresión o actividad de una proteína en la ruta de señalización GPR10 (o alguna combinación de los mismos) , las instrucciones para administración especificarán el uso de la composición para incrementar el peso corporal. Ei emplos Ei emplo 1 GRP10 Expresión en Regiones de Hipotálamo que Regulan el Comportamiento de Alimentación La distribución del ARNm de GPR10 en el ratón de cerebro se examina como sigue. El cerebro de ratón se congela con hielo seco pulverulento y secciones criostáticas se cortaron a espesor de 10 µm a través de la región de hipotálamo montaron en placas superfrost plus (VWR) y almacenan a -80°, hasta que se requieran. Antes de análisis, secciones de cerebro de ratón se secaron al aire por 20 minutos y luego se incubaron con PFA (paraformaldehído) enfriado por hielo al 4% /lxPBS por 10 minutos. Las placas luego se lavaron con 1 x PBS dos veces (5 minutos cada vez) , incubaron con anhídrido acético 0.25% trietanolamina 1M por 10 minutos, lavaron con PBS por 5 minutos y deshidrataron con etanol al 70%, 80%, 95% y 100% (1 minuto cada vez) . Se incubaron secciones con cloroformo por 5 minutos, rehidrataron con etanol al 100% y 95% y luego secaron al aire. Se realizaron hibridizaciones con sondas ARNc radioetiquetado 35S (5 x 107 cpm/ml) en la presencia de formamida al 50%, dextran sulfato al 10%, solución de Denhardt lx, 600 mm NaCl, 10 mm DTT, 0.25% SDS y 100 µg/ml de RNasa A en TNE a 37°C por 30 minutos, lavaron en TNE por 10 minutos, incubaron una vez en 2x SSC a 60° por 1 hora, una vez en 0.2x SSC a 60° por 1 hora, 0.2x SSC a 65° por 1 hora y deshidrataron con etanol al 50%, 70%, 80%, 95% y 100%. La localización de transcripción de ARNm se detecta al sumergir las placas en fotoemulsión Kodak NBT-2 y exponer por 14 días a 4°C, seguido por revelador Kodak Dektol . Las placas se contra tiñeron con hematoxilina y eosina y fotografiaron. Los controles para los experimentos de hibridización in si tu incluyen el uso de una sonda de detección que no mostró señal de los niveles de fondo. Este análisis reveló que ARNm GPR10 se expresa dentro del núcleo arqueado y el hipotálamo ventral/medio, ambos de los cuales están implicados en el control del comportamiento de alimentación. Eiemplo 2 : PrRP Un Ligando GPR10, Estimula la Absorción de Alimentos Un péptido sintético amino amidado de 31 amino ácidos tienen la secuencia de PrRP (SRAHQHSMETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2; ID de Sec. NO.: 4; Hinuma y colaboradores, (1998) Nature 393:272-76) se emplea para examinar el efecto de moduladores GPR10 en la absorción de alimentos. Ratones macho y hembra y obesos macho delgados ob/ob C57BL/6J se alojaron individualmente en jaulas de macrolón (22 ± 2°C; 12:12 horas, ciclo de luz: oscuridad con las lámparas apagadas a las 6 pm) . Agua corriente y alimento de ratón se dieron ad libi tum . Los ratones se implantaron estereoaxial con una cánula de guía crónica dirigida al tercer ventrículo (intracerebroventricular) una semana antes del inicio del experimento. Se trataron ratones (15/grupo) con 0.1, 1, 5, 10 mg de PrRP péptido o salino (control) por inyecciones intracerebroventriculares a las 9:00 am. La absorción de alimento se mide por dos horas después de tratamiento. Estos experimentos demostraron que PrRP incrementó la absorción de alimento en ratones macho delgados (Figura 3), ratones hembra delgados (Figura 4) y ratones macho ob/ob (Figura 5) . Eiemplo 3 : PrRP Incrementa la Tasa metabólica El efecto de una dosis de 5 µg de PrRP en la tasa metabólica de ratones macho que niega o permite acceso de alimento, se investiga como sigue. Ratones macho C57BL/6J mantenidos como se describió anteriormente se colocaron en un calorímetro de circuito abierto acoplado a un monitor de alimentación. A los ratones se les administran 5 µg de PrRP o salino intra cerebroventricularmente a 1 hora y 45 minutos después el inicio del monitoreo metabólico. Un grupo (n = 6) de ratón se le permitió acceso a alimento y a un grupo de ratones (n = 6) no se les permitió acceso a alimento. El cociente respiratorio se calcula como la proporción de producción de C02/consumo de 02. La tasa metabólica (kcal/g/h) se calcula con base en el consumo de 0_ y el cociente de velocidad de respiración. Estos experimentos demuestran que PrRP incrementa la producción de tasa metabólica de ratones macho delgados que no tienen acceso a alimento (Figura 6; cuadrados cerrados = tratamiento PrRP; diamantes cerrados = control) . Este incremento en la tasa metabólica puede estar asociado con un incremento en comportamiento de búsqueda de alimento. Estos experimentos también demuestran que PrRP incrementa la tasa metabólica de ratones delgados que tienen acceso a alimento (Figura 7 cuadrados cerrados = tratamiento PrRP; diamantes cerrados = control) . Este incremento en tasa metabólica sugiere que PrRP incrementa la tasa metabólica independientemente de su efecto estimulatorio en el comportamiento de búsqueda de alimento. Eiemplo 4: Aislamiento de un ADNc que Codifica GPR10 Murino La secuencia ADNc de GPR10 murino (también referida como 101) se ilustra en la Figura 1. La secuencia de amino ácidos pronosticada de GPR10 murino se ilustra en la Figura 2. Un clon que codifica GPR10 humano se identifica como sigue. Un par de sondas degeneradas, diseñadas para reconocer regiones conservadas dentro de receptores acoplados a proteína G y RT-PCR, se emplea para amplificar secuencias que potencialmente codifican una proteína relacionada a un receptor de proteína acoplada G.

El secuenciado de los ciónos así identificados conduce a la identificación de un clon que codifica proteína, GPR10 murino (también referido como 101) con un alto grado de similaridad a GPR10 humano. La Figura 8 ilustra un alineamiento de GPR10 humano con hGR3 (humano) , UHR1 (rata) y GPR10 murino. Ejemplo 5: Ensayos de Transducción de Señal La actividad de GPR10 murino o su homólogo, por ejemplo GPR10 humano (No. de Acceso P49683) , UHR-1 de rata (No. de Acceso Q64121) , hGR3 humano, o GPR10 murino puede medirse utilizando cualquier ensayo adecuado para la medición de la actividad de un receptor acoplado a proteína G. La actividad de transducción de señal de un receptor acoplado a proteína G, puede verificarse al monitorear intracelularmente Ca2+, AMPc, 1, 4 , 5-trifosfato de inositol (IP3) , o 1, 2-diacilglicerol (DAG) . Ensayos para la medición Ca2+ intracelular, se describen por Sakurai y colaboradores.

(EP 480 381) . IP3 intracelular pueden medirse utilizando un equipo disponible de Amersham, Inc. (Arlington Heights, IL) . Un equipo para medir AMPc intracelular está disponible de Diagnostic Products, Inc. (Los Angeles, CA) . La activación de un receptor acoplado a proteína G dispara o activa la liberación de iones Ca2+ secuestrados en el mitocondrio, retículo endoplásmico y otras vesículas citoplásmicas en el citoplasma. Colorantes fluorescentes, por ejemplo, fura-2, pueden emplearse para medir la concentración de Ca2+ citoplásmico libre. El éster de fura-2, que es lipofílico y puede difundirse a través de la membrana celular, se agrega al medio de las células huésped que expresan GPR10. Una vez dentro de la célula, el fura-2 éster se hidroliza por esterasas citosólicas a su forma no lipofílica, y luego el colorante no puede difundirse de regreso a la célula. La forma no lipofílica de fura-2 fluorescerá cuando se liga a Ca2+ libre. La fluorescencia puede medirse sin lisar las células a un espectro de excitación de 340 nm o 380 nm y un espectro de fluorescencia de 500 nm (Sakurai y colaboradores, EP 480381) . Ante activación de un receptor acoplado a proteína G, el aumento de concentraciones Ca2+ citosólico libre se precede por la hidrólisis de fosfatidilinositol 4 , 5-bifosfato. La hidrólisis de este fosfolípido por la fosfolipasa C produce 1, 2-diacilglicerol (DAG), que permanece en la membrana e inositol 1, 4 , 5-trifofato soluble en agua (IP3) . La unión de ligando o agonistas incrementará la concentración de DAG e IP . De esta manera, puede medirse la actividad de transducción de señal al verificar la concentración de estos productos de hidrólisis . Para medir las concentraciones de IP3, se agrega 3H-inositol etiquetado por radioactividad al medio de células huésped que expresan GPR10. El 3H-inositol se absorbe por las células e incorpora en IP3. El inositol trifosfato resultante se separa de las formas mono y di-fosfato y mide (Sakurai y colaboradores, EP 480 381) . En forma alterna, Amersham proporciona un sistema de ensayo inositol 1,4,5- trifosfato. Con este sistema, Amersham proporciona inositol 1, 4.5-trifosfato tritilado y un receptor capaz de distinguir el inositol radioactivo de otros fosfatos de inositol. Con estos reactivos, puede realizarse un ensayo de competencia efectivo y preciso para determinar los niveles de trifosfato de inositol. Niveles de AMP cíclico pueden medirse de acuerdo con los métodos descritos por Gilman y colaboradores, Proc .

Na ti . Acad. Sci . 67:305-312 (1970) . Además, un equipo para ensayar niveles de AMPc está disponible de Diagnostic Products Corp. (Los Angeles, CA) .

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar compuestos útiles para modular el peso corporal, el método se caracteriza porque comprende: a) contactar un compuesto de prueba con un polipéptido de GPR10; b) determinar si el compuesto de prueba liga al polipéptido GPR10; c) administrar un compuesto identificado que liga al polipéptido GPR10 en la etapa (b) a un mamífero; d) determinar si el compuesto modula el peso corporal, el comportamiento de alimentación o tasa metabólica del mamífero; y e) identificar un compuesto que modula el peso corporal, el comportamiento de alimentación o tasa metabólica en la etapa (d) como un compuesto útil para modular el peso corporal .
2. 2. Un método para identificar compuestos útiles para modular el peso corporal, el método se caracteriza porque comprende: a) contactar un ligando GPR10 con un polipéptido GPR10 en la presencia y ausencia de un compuesto de prueba; b) determinar si el compuesto de ensayo altera la unión de ligando GPR10 al polipéptido GPR10; c) administrar un compuesto identificado que altera la unión de ligando GPR10 al polipéptido GPR10 en la etapa (b) a un mamífero; d) determinar si el compuesto modula el peso corporal, el comportamiento de alimentación o tasa metabólica del mamífero; y e) identificar un compuesto que modula el peso corporal, el comportamiento de alimentación o la tasa metabólica en la etapa (d) como un compuesto útil para modular el peso corporal.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido GPR10 se expresa en la superficie de una célula recombinante.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el GPR10 se expresa en la superficie de una célula recombinante.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la célula recombinante es una célula eucariótica.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la célula recombinante es una célula eucariótica.
7. 7. Un método para identificar compuestos útiles para modular el peso corporal, el método se caracteriza porque comprende: a) contactar un compuesto de prueba con una célula que expresa un polipéptido GPR10; b) determinar si el compuesto de prueba altera la actividad del polipéptido GPR10; c) administrar un compuesto identificado que altera la actividad del polipéptido GPR10 en la etapa (b) a un mamífero; d) determinar si el compuesto modula el peso corporal, el comportamiento de alimentación o tasa metabólica del mamífero; y e) identificar un compuesto que modula el peso corporal, el comportamiento de alimentación o tasa metabólica en la etapa (d) , como un compuesto útil para modular el peso corporal .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la actividad del polipéptido GPR10 se determina al medir el nivel de AMPc en la célula.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la actividad del polipéptido GPR10 se determina al medir el nivel de Ca2+ citoplásmico en la célula.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula que contiene adicionalmente un gen reportero asociado operativamente con un elemento de respuesta AMPc y el nivel de AMPc se mide al medir la expresión del gen reportero.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el gen reportero es fosfatasa alcalina, cloranfenicol acetiltransferasa, luciferasa, glucurónido sintetasa, hormona de crecimiento o fosfatasa alcalina de placenta.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la actividad del polipéptido GPR10 se mide al medir el inosital 1, 4 , 5-trifosfato (IP3) intracelular.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la actividad del GPR10 se mide al medir 1 , 2-diacilglicerol (DAG) intracelular.
14. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 7, caracterizado porque el mamífero es un ratón.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ratón es un ratón ob/ob.
16. 16. Una formulación farmacéutica para la modulación de peso corporal, que comprende un compuesto que modula la actividad de GPR10, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. ,
17. 17. Un paquete que comprende la formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16 e instrucciones para administrar la formulación farmacéutica para el propósito de modular el peso corporal .
18. 18. Un método para preparar una composición farmacéutica útil para modular el peso corporal, el método se caracteriza porque comprende: a) contactar un compuesto de ensayo o de prueba con un polipéptido GPR10; b) determinar si el compuesto de prueba liga el polipéptido GPR10; c) administrar un compuesto identificado que liga al polipéptido GPR10 en la etapa (b) a un mamífero; d) determinar si el compuesto modula el peso corporal; comportamiento de alimentación, o tasa metabólica del mamífero; e) identificar un compuesto que modula el peso corporal, el comportamiento de alimentación o tasa metabólica en la etapa (d) como un compuesto útil para modular el peso corporal; y f) combinar el compuesto identificado en la etapa e) con un portador farmacéuticamente aceptable para crear una composición farmacéutica útil para modular el peso corporal.
19. 19. Un método para preparar un composición farmacéutica útil para modular el peso corporal, el método se caracteriza porque comprende: a) contactar un ligando GPR10 con "un polipéptido GPR10 en la presencia y ausencia de un compuesto de ensayo; b) determinar si el compuesto de ensayo altera la unión de ligando GPR10 al polipéptido GPR10; c) administrar un compuesto identificado que altera la unión del ligando GPR10 al polipéptido GPR10 en la etapa (b) al mamífero; d) determinar si el compuesto modula el peso corporal , el comportamiento de alimentación o tasa metabólica del mamífero; e) identificar un compuesto que modula el peso corporal, el comportamiento de alimentación o tasa metabólica en la etapa (d) como un compuesto útil para modular el peso corporal; y f) combinar el compuesto identificado en la etapa e) con un portador farmacéuticamente aceptable para crear una composición farmacéutica útil para modular el peso corporal