MXPA01001426A - Factor gama de necrosis de tumor - Google Patents

Factor gama de necrosis de tumor

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MXPA01001426A
MXPA01001426A MXPA/A/2001/001426A MXPA01001426A MXPA01001426A MX PA01001426 A MXPA01001426 A MX PA01001426A MX PA01001426 A MXPA01001426 A MX PA01001426A MX PA01001426 A MXPA01001426 A MX PA01001426A
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tnf
gamma
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seq
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MXPA/A/2001/001426A
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Craig A Rosen
Guoliang Yu
Jian Ni
Jun Zhang
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Human Genome Sciences Inc
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Abstract

Se describe a los polipéptidos TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta y DNA (RNA) que codifica a tales polipéptidos y un procedimiento para producirlos por técnicas recombinantes. También se describe métodos para utilizar tales polipéptidos para inhibir el crecimiento celular, por ejemplo en un tumorócáncer, para facilitar la cicatrización de heridas, para proporcionar resistencia contra la infección, inducir actividades inflamatorias, y estimular el crecimiento de ciertos tipos celulares para tratar enfermedades, por ejemplo restenosis. También se describe métodos de diagnostico para detectar una mutación en las secuencias deácidos nucleicos de TNF-gama-alfa y TNF- gama-betaósobre-expresión de los polipéptidos TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta. Se describe también antagonistas contra tales polipéptidos y su uso terapéutico para tratar caquexia, choque séptico, malaria cerebral, inflamación artritis, y rechazo de injertos.

Description

FACTOR GAMA DE NECROSIS DE TUMOR Campo de la Invención La invención concierne a polinucleótidos, identificados recientemente, polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como también a la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. Más particularmente, el polipéptido de la presente invención se ha identificado como un nuevo miembro de la familia del factor de necrosis de tumor y en lo sucesivo se mencionara como ""TNF-gama-alfa11. La invención también concierne a una proteína codificada por una variante de unión del gen que codifica a la TNF-gama-alfa la cual será en lo sucesivo mencionada como "TNF-gama-beta " . La invención también concierne a la inhibición de la acción de tales polipéptidos.
Antecedentes de la Invención Los factores de necrosis de tumor humano-a (T?F-a) y (T?F-b ó linfotoxina) son miembros relativos de una amplia clase de mediadores de polipéptidos, los cuales incluyen los interferones, interleucinas y factores de crecimiento, REF.126809 colectivamente llamados citocinas (Beutler, B. Y Cerami, A., Annu . Rev. Immunol . , 7:625-655 (1989)).
Los factores de necrosis de tumor (TNF-a y TNF-b) , fueron originalmente descubiertos como un resultado de su actividad anti-tumor, sin embargo, ahora se reconocen como una citosina pleiotrópica que desempeña un papel importante en la regulación e inflamación inmune. Como dato, hay ocho miembros conocidos de la familia de las citocinas relacionadas con TNF, TNF-a, TNF-b (linfotocina (LT)-a), LT-b, y ligandos para los receptores de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-1BB. Estas proteínas han conservado las secuencias C-terminales y las secuencias N- terminales variables que son a menudo usadas como fijadoras de membrana, con la excepción de TNF-b . Ambas TNF-a y TNF-b funcionan como homotrímeros cuando enlazan a los receptores de TNF.
El TNF es producido por un número de tipos de células, que incluyen monocitos, fibroblastos, células T, células destructoras (NK) y predominantemente por macrofagos activados. Se ha reportado que TNF-a desempeña un papel en la necrosis rápida de tumores, inmunoestimulación, enfermedad autoinmune, rechazo de injerto, resistencia a parásitos, que produce una respuesta antiviral, choque séptico, regulación de crecimiento, efectos vasculares sobre el endotelio y efectos metabólicos. El TNF-a también provoca a las células endoteliales para secretar varios factores, que incluyen PAI-1, IL-1, GM-CSF e IL-6 para promover la proliferación celular. Además, el TNF-a sobre-regula varias moléculas de adhesión celular tales como E-Selectina, ICAM-1 y VCAM-1, TNF-a y el ligando de Fas se ha demostrado también que induce a la muerte celular programada .
La primera etapa en la inducción de las varias respuestas celulares mediadas por TNF ó LT es su enlace a los receptores de superficie celular específica. Se han identificado dos distintos receptores de TNF de aproximadamente 55-KDa (TNF-R1) y 75-Kda (TNF-R2) (Omán, H.P. y colaboradores, J. Biol.. Chem., 264:14927-14934 (1989), y cDNAs humano y de ratón que corresponden a ambos tipos de receptores se han aislado y caracterizado (Lotscher, H. Y colaboradores, Cell , 61:351 (1990)). Ambas sTNF-R comparten la estructura típica de los receptores de superficie celular que incluyen las regiones extracelular, transmembrana e intracelular.
El endotelio, que en condiciones fisiológicas es mayormente tejido quiescente (Denekamp, J. Cáncer Metas . Rev. 9:267-282 (1990)), desempeña un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis y permeabilidad vascular. Las células endoteliales están activamente involucradas en la inflamación, adhesión celular, coagulación, trombosis, fibrinolisis, y angiogénesis. Durante la angiogénesis, las células endoteliales proliferan, invaden el estroma, migran hacia la fuente de un estímulo de la angiogénesis, tal como células cancerosas, interactúan con células perivasculares y células estromales, y eventualmente forman vasos capilares que enlazan al tejido tumoral al sistema circulatorio (Folkman, J. Na ture Med. 1:27-31 (1995)). Aunque el mecanismo complejo que regula la angiogénesis es todavía ligeramente comprendido, se pone en evidencia que la iniciación o terminación del proceso es un resultado de un equilibrio entre factores positivos y negativos.
Un número de factores angiogénicos, a menudo marcadamente sobreregulados en tejidos tumorales, se han descrito. Estos incluyen varios miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), tales como FGF-1, FGF-2, y los de la familia del factor de crecimiento de las células endoteliales vasculares (V?GF) y los receptores para todas estas moléculas (Jiménez-Gallego, G. y colaboradores, Science 230:1385-1388 (1985); Schweigerer, J. Y colaboradores, Nature 325:257-259 (1987); Leung, D. W. y colaboradores, Science 246: 1306-1309 (1989); Burrus, L.
W. y Ol in, B. B. J. Biol . Chem. 264:18647-18653 (1989); Wennstrom, S. y colaboradores, Growth Factors 4: 197-208 (1991); Terman, B. I. Y colaboradores Biochem. Biophys .
Res . Comm. 187:1579-1586 (1992): de Vries, C. y colaboradores, Science 255:989-991 (1992)). Similarmente varios inhibidores de la angiogénesis han sido también publicados, que incluyen trombospondina, angiostatina, endostatina, y el factor-4 de plaquetas (Good, D. J. Y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 87:6623-6628 (1990); O'Reilly, M. S., y colaboradores Cell 79:315-328 (1994); O'Reilly, M.S. y colaboradores Cell : 277-285 (1997); Maione, T. E. y colaboradores, Science 247:77-79 (1990)). Es obvio que la angiogénesis normal es puntualmente activada cuando es necesario, y repentinamente terminada cuando no se requiere prolongarla más. Sin embargo, la angiogénesis patológica, una vez iniciada, es a a menudo prolongada y a menudo difícil de detener. Esto puede indicar que un mecanismo regulador negativo que funciona normalmente está ausente ó es suprimido en un proceso angiogénico patológico. Es concebible que células endoteliales pueden producir factores autocrinos para suprimir un proceso angiogénico ó mantener la quiescencia de una vascularidad madura.
El polipéptido de la presente invención se ha identificado como un nuevo miembro de la familia de TNF basada en estructura, homología de la secuencia de aminoácidos, y similitudes funcionales, por ejemplo, TNF-gama es una proteína pro-inflamatoria. Adicionalmente, el polipéptido TNF-gama de la presente invención es un regulador negativo de angiogénesis y del crecimiento celular endotelial. Hay necesidad de polipéptidos que funcionen de esta manera, puesto que disturbios de tales regulaciones pueden estar involucrados en transtornos relacionados con la angiogénesis, hemostasis, metástasis tumoral, migración celular y cánceres de muchos sistemas. Por consiguiente, hay necesidad de identificación y de caracterización de tales polipéptidos humanos los cuales pueden desempeñar un papel en la detección, prevención, mejora ó corrección de tales transtornos.
Breve Descripción de la Invención De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un nuevo polipéptido maduro que es TNF-gama-beta, así como también fragmentos activos biológicamente y diagnóstica ó terapéuticamente útiles, análogos y derivados de los mismos.
De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican al TNF-gama-alfa ó TNF-gama-beta humanos, que incluyen mRNAs , D?As, D?As, cD?As, D?As genómico así como también análogos y fragmentos biológicamente activos y diagnóstica y terapéuticamente útiles y derivados de los mismos.
La presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden un polinucleótido que codifica al menos una porción del polipéptido T?F-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidas completa que se expone en SEC ID ?O: 2 ó la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon e cD?A HUVE091 depositada como D?A de plásmido como Número de Depósito en ATCC 75927 en la american Type culture Collection ("ATCC") en octubre 26 de 1994. La ATCC está localizada en 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110-2209, USA. La secuencia de nucleótidos determinada por la formación de secuencias del clon de TNF-gama-alfa depositado, el cual se expone en las figuras ÍA y IB (SEC ID NO:l), contiene un sistema de lectura abierto que codifica a un polipéptido completo de 174 residuos de aminoácidos, que incluyen un codón de iniciación que codifica a una metionina N- terminal en las posiciones de los nucleótidos 783-785, y un peso molecular estimado de aproximadamente 20,132 Da.
La presente invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos aislados que comprenden un polinucleótido que codifica al menos una porción del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEC ID NO: 20 ó la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA HEMCZ51 depositado como DNA de plásmido como Número de Depósito en ATCC 203055 en Julio 9 de 1998. La secuencia de nucleótidos determinada por la formación de secuencias del clon de TNF-gama. beta depositado, el cual se expone en las figuras 20A y B (SEC ID NO: 20) , contiene un sistema de lectura abierto que codifica a un polipéptido completo de 251 residuos de aminoácidos, que incluyen un codón de iniciación que codifica a una metionina N-terminal en las posiciones de los nucleótidos 1-3, y un peso molecular estimado de aproximadamente 28,089 Da.
De ese modo, en una modalidad la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama -alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 2 (por ejemplo, posiciones -27 a 147 de la SEC ID NO: 2, (b) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencias de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 2 exceptuando la metionina N-terminal (por ejemplo posiciones -26 a 147 de la SEC ID N0:2); (c) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa maduro que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2 expuesta como posiciones 1 a 147 de la SEC ID NO: 2; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenido en el Número de Depósito en ATCC: 75927; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenido en el Número de Depósito en ATCC: 75927; y (g) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) , anteriores .
En otra modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 20 (por ejemplo posiciones 1 a 251 de la SEC ID NO: 20) ; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 20 exceptuando la metionina N-terminal (por ejemplo posiciones 2 a 251 de la SEC ID NO:20); (c) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa maduro que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 20 expuesta como posiciones 62 a 251 de la SEC ID NO: 20; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenido en el No. de Depósito en ATCC 203055; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenido en el No. de depósito en ATCC 203055; (f) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenida en el No. de Depósito en ATCC 203055; y (g) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b) , (c) , (d) , (e) ó (f), anteriores .
Modalidades adicionales de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90 % idéntica, y más preferiblemente al menos 95 % , 96 %, 98 % '99 % idéntica a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b) , (c, (d) , (e) , (f), ó (g) , anteriores, ó un polinucleótido que hibridiza en condiciones de hibridización severas a un polinucleótido en (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f) ó (g) anteriores, un fragmento de éste (tal como, por ejemplo, fragmentos descritos en la presente), ó las cadenas complementarias del mismo. Este polinucleótido que hibridiza no hibridiza en condiciones de hibridización severas a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste de solamente residuos A ó de solamente residuos T. Una modalidad adicional de ácido nucleico de la invención concierne a una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica a la secuencia de aminoácidos de una porción de apoyo epítope (por ejemplo, un fragmento) de un polipéptido TNF-gama que tiene una secuencia de aminoácidos en (a) , (b) , (c) , (d) , (e) ó (f), anteriores. Una modalidad adicional de la invención concierne a una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una substitución de aminoácido, pero no más de 50 substituciones de aminoácidos, igualmente más preferiblemente, no más de 40 substituciones de aminoácidos, aún más preferiblemente, no más de 30 substituciones de aminoácidos, y aún igualmente más preferiblemente, no más de 20 substituciones de aminoácidos. Por supuesto, a fin de que la preferencia aumente siempre, es altamente preferible para un polinucleótido que codifique a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TNF-gama para tener una secuencia de aminoácidos que contenga no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 substitución de aminoácidos- Las substituciones conservadoras son preferibles.
La presente invención también concierne a vectores recombinantes, los cuales incluyen las moléculas de ácidos nucleicos aisladas de la presente invención, y a células huéspedes que contienen los vectores recombinantes, así como también a métodos de elaborar tales vectores y células huéspedes y para usarlos para la producción de polipéptidos TNF-gama ó péptidos por técnicas recombinantes.
De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para producir un polipéptido tal por técnicas recombinantes que comprenden cultivar células huéspedes procarióticas y/ó eucarióticas recombinantes, que contienen una secuencia de ácido nucleico de TNF-gama humano, en condiciones que promueven la expresión de dicha proteína y subsecuente recuperación de dicha proteína.
La invención proporciona adicionalmente un polipéptido TNF-gama aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEC ID NO: 2 (de las posiciones -27 a 147 de la SEC ID NO: 2) ; (b) la secuencia de aminoácidos completa del polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEC ID NO: 2 exceptuando la metionina N-terminal (ver las posiciones -26 a 147 de la SEC ID NO: 2); (c)la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-alfa maduro que tiene la secuencia de aminoácidos en posiciones 1-147 en la SEC ID NO: 2; (d) la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenido en el Número de Depósito ATCC: 75927; (e) la secuencia de aminoácidos completa exceptuando la metionina N- terminal codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenida en el Número de Depósito: 75027; (f)la secuencia de aminoácidos completa del polipéptido TNF-gama maduro codificado por el clon de cDNA HUVE091 contenido en el Número de Depósito en ATCC: 75927; y (g) fragmentos del polipéptido de (a), (b) , (c) , (d) , (e) , ó (f) . Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica, más preferiblemente al menos 90 % idéntica, y aún más preferiblemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % idéntica a las descritas en (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f), ó (g) anteriores, así como también polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de similitud, y más preferiblemente al menos 95 % de similitud, a las anteriores. Modalidades adicionales de la invención conciernen a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una porción de apoyo epítope de un polipéptido TNF-gama que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f), ó (g) anteriores. Péptidos ó polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de una porción de apoyo epítope de un polipéptido TNF-gama de la invención incluye porciones de tales polipéptidos con al menos seis ó siete, preferiblemente al menos nueve, y más preferiblemente al menos aproximadamente 30 aminoácidos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, aunque los polipéptidos de apoyo epítopes de cualquier extensión hasta y que incluyen a la secuencia de aminoácidos entera de un polipéptido de la invención descrito anteriormente también se incluyen en la invención.
La invención proporciona adicionalmente un polipéptido TNF-gama aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEC ID NO: 20 (ver las posiciones 1 a 251 de la SEC ID NO: 20) ; (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEC ID NO: 20 exceptuando la metionina N-terminal (ver posiciones 2 a 251 de la SEC ID NO: 20) ; (c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-alfa madura predicha que tiene la secuencia de aminoácidos en posiciones 62-251 en la SEC ID NO: 20; (d) la secuencia de aminoácidoscompleta codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el No. de Depósito en ATCC 203055; (e) la secuencia de aminoácidos completa exceptuando la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el No. de Depósito en ATCC 203055; (f)la secuencia de aminoácidos completa del polipéptido TNF-gama maduro predicho codificado por el clon de cDNA contenido en el No. de Depósito en ATCC 203055; y (g) fragmentos del polipéptido de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , ó (f) .Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica, más preferiblemente al menos 90 %, idéntica, y aún más preferiblemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % idénticas a las descritas en (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , ó (g) anteriores, así como también polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de similitud, y más preferiblemente al menos 95 % de similitud a las anteriores. Modalidades adicionales de la invención conciernen a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una porción de apoyo epítope de un polipéptido TNF-gama que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , ó (g) anteriores. Péptidos y polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de una porción de apoyo epítope de un polipéptido TNF-gama de la invención incluye porciones de tales polipéptidos con al menos seis ó siete, preferiblemente al menos nueve, y más preferiblemente al menos aproximadamente 30 aminoácidos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, aunque polipéptidos de apoyo epítopes de cualquier extensión hasta y que incluyen la secuencia de aminoácidos entera de un polipéptido de la invención descritos anteriormente también se incluyen en la invención.
Una modalidad adicional de la invención concierne a un polipéptido que comprende a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TNF-gama que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una substitución de aminoácido, pero no más de 50 substituciones de aminoácidos, igualmente más preferiblemente, no más de 40 substituciones de aminoácidos, aún más preferiblemente, no más de 30 substituciones de aminoácidos, y aún igualmente más preferiblemente, no más de 20 substituciones de aminoácidos. Por supuesto, a fin de que la preferencia aumente siempre, es altamente preferible para un péptido ó polipéptido tener una secuencia de aminoácidos que comprenda la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TNF-gama, que contenga al menos una, pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 substitución de aminoácido. En modalidades específicas, el número de adiciones, substituciones, y/ó eliminaciones en la secuencia de aminoácidos de las figuras ÍA y IB, figuras 20 A y B, ó fragmentos de ésta (por ejemplo, la región extracelular y/ó otros fragmentos descritos en la presente) , es 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 ó 50-150, substituciones de aminoácidos conservadoras, son preferibles.
En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que enlaza específicamente a un polipéptido TNF-gama que tiene una secuencia de aminoácidos descrita anteriormente. La invención proporciona adicionalmente métodos para aislar anticuerpos que enlazan específicamente a un polipéptido TNF-gama que tiene una secuencia de aminoácidos que se describe en la presente. Tales anticuerpos son útiles diagnóstica ó terapéuticamente como se describe a continuación.
De conformidad con aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar polinucleótidos y/ó polipéptidos de la invención para selección de agonistas y antagonistas, y para propósitos terapéuticos, lo cual incluye, pero no se limita a, cicatrización de heridas, inhibición de la proliferación de tumores, proporcionar resistencia a parásitos, bacterias y virus, inducir actividades inflamatorias, inducir la proliferación de células endoteliales y ciertas células hematopoyéticas, tratar restenosis y prevenir ciertas enfermedades inmunes.
De conformidad con aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona también sondas de ácidos nucleicos que comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente extensión para hibridizar específicamente a secuencias de TNF-gama humano.
De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan agonistas de TNF-gama que imitan a TNF-gama y enlazan a los receptores de TNF-gama para provocar respuestas tipo TNF-gama.
De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona antagonistas de tales polipéptidos, los cuales pueden utilizarse para inhibir la acción de tales polipéptidos, por ejemplo, prevenir choque séptico, inflamación, malaria cerebral, activación del virus HIV, rechazo de injerto, resorpción ósea y caquexia.
De conformidad con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades relacionadas con la sub-expresión y sobre-expresión del polipéptido TNF-gama y secuencias de ácidos nucleicos que codifican a tal polipéptido.
En un aspecto adicional de la invención, TNF-gama puede usarse para tratar artritis reumatoide (RA) por inhibición del incremento en agiogénesis ó el incremento en la proliferación de células endoteliales requerido para sostener una invasión de quratitis vascular en hueso y cartílago como se observa a menudo en RA.
En aún otro aspecto adicional, el TNF-gama puede enlazar a una proteína de superficie celular lo cual también funciona como un receptor ó co-receptor viral. De ese modo, TNF-gama, ó agonistas ó antagonistas del mismo, pueden ser usados para regular la infecciocidad viral al nivel de enlace ó interacción viral con el receptor ó co-receptor de TNF-gama ó durante el proceso de interiorización viral ó de entrada en la célula.
De conformidad con todos los aspectos de la invención, el término "TNF-gama" se refiere a TNF-gama-alfa y/ó TNF-sama-beta.
Estos y otros aspectos de la presente invención serán obvios para el experto en la materia de lo expuesto en la presente.
Breve Descripción de las figuras Los siguientes dibujos son ilustrativos de las modalidades de la invención y no limitativos del alcance de la invención abarcado por las reivindicaciones.
Las figuras ÍA y IB ilustran la secuencia de cDNA (SEC ID NO: 1) y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducidas del polipéptido de TNF-gama-alfa de la presente invención. Los 27 aminoácidos iniciales (subrayados) son la secuencia líder putativa. Se utilizan las abreviaciones estándares de una letra para aminoácidos. Los sitios de glicosilación con unión aspargina potenciales están marcados en las figuras ÍA y IB con símbolos aspargina en negrilla (N) en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa y un signo de libra en negrilla (#) encima del primer nucleótido que codifica al residuo de aspargina en la secuencia de nucleótidos de TNF-gama-alfa. Las secuencias de glicosilación potenciales unidas a N- se encuentran en las localizaciones siguientes en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa: N-29 hasta N-32 (N-29, Y-30, T-31, N-32) y N-125 hasta D-128 (N-125, V126, S-127, D-128). Los sitios de fosforilación de la Proteína Cinasa C potenciales (PKC) están también marcados en las figuras ÍA y IB con un símbolo de treonina en negrilla (T) en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa y un asterisco (*) encima del primer nucleótido que codifica al residuo treonina en la secuencia de nucleótidos de TNF-gama-alfa. Las secuencias de fosforilación de PKC potenciales se encuentran en las siguientes lugares en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa: T-32 hasta K-34 (T-32, N-33, K-34) y T-50 hasta R-52 (T-50, F-51, R-52) . Los sitios de fosforilación potenciales de la Caseína Cinasa II (CKII) están también marcados en las figuras ÍA y IB con un símbolo de serina ó treonina en negrilla (S ó T) en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa y un asterisco (*) en cima del primer nucleótido que codifica al residuo de serina ó de treonina apropiado en la secuencia de nucleótidos de TNF-gama-alfa. Las secuencias de fosforilación potencial de CK2 se encuentran en los siguientes lugares en la secuencia de aminoácidos de TNF-ga ma-alfa: S-83 hasta E-86 (S-83, Y-84, P-85, E-86) ; S-96 hasta E-99 (S-96, V-97, C-98, E-99) ; S-115 hasta E-118 (S-115, L-116, Q-117, E-118); S-130 hasta D-133 (S-130, L-131, V-132, D-133); y T-135 hasta D-138 (T-135, K-136, E-137, D-138). Los sitos de miristilación potenciales están también marcados en las figuras ÍA y IB con un doble subrayado en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa. Las secuencias de miristilación potencial se encuentran en los siguientes lugares en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa: G-20 hasta K-25 (G-20, L-21, a-22, F-23, T-24, K-25) y G-lll hasta L-116 (G-lll, A-112, M-113, F-114, S-115, L-116) .
Las figuras 2A-C ilustran una alineación de secuencia de aminoácidos entre TNF-gama-alfa (SEC ID NO: 2) y otros miembros de la familia TNF que incluyen TNF-alfa humano (GenBank No. Z15026; SEC ID N0:3), TNF-beta humano (GenBank No. Z15026; SEC ID NO: 4), linfotoxina-beta humana (Lbeta; GenBank No. L11016; SEC ID NO: 5), y Ligando de Fas humano (FASL; GenBank No. U11821; SEC ID NÓ:6). TNF-gama contiene los residuos de aminoácidos conservados de la familia TNF como se expone por las áreas sombradas encuadradas. Las moléculas alineadas se presentan en su integridad en las Figuras 2A, 2B, y 2C.
La figura 3A es un análisis de manchado de RNA que expone los tejidos humanos en donde se expresó T?F-gama. El R?A de los tejidos indicó que fueron sondeados con cD?A de T?F-gama marcado. El mR?A de T?F-gama-alfa existe predominantemente en el riñon puesto que la figura 3A, expone una banda distinta. Otras franjas parecen mostrar fuerte hibridización, no obstante, estas son actualmente manchas no específicas.
La figura 3B es un análisis de manchado de RNA que muestra que la TNF-gama es expresada predominantemente en células HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical; franja 9) . La franja 6 y la franja 8 son manchas no específicas. El RNA de las líneas celulares indicadas se sondearon con cDNA de TNF-gama-alfa marcado. La franja 1 es CAMA 1 (cáncer de seno) ; la franja 2 AN3CA (cáncer uterino); la franja 3, SK.UT.l (cáncer uterino); la franja 4, MG63 (osteoblastoma) ; la franja 5, HOS (osteoblastoma) ; la franja 6, MCF7 (cáncer de seno); la franja 7, OVCAR-3 (cáncer ovárico); la franja 8, CAOV-3 (cáncer ovárico); la franja 9, HUVEC; la franja 10, AOSMIC (músculo liso); la franja 11, fibroblasto de la piel exterior.
La figura 4 ilustra la expresión relativa de TNF-gama en células endoteliales quiescentes ó proliferantes. Los niveles de mRNA de TNF-gama en células HUVEC cultivadas se determinó por análisis por manchado Northern. Cantidades idénticas de RNA total (15 µg) se cargaron en cada franja, como se indica por la intensidad de b-actina. La señal que corresponde a TNF-gama se designa "VEGI". El RNA total se preparó en los intervalos indicados (días post-siembra) . El número de células en cada frasco de cultivo se determinó simultáneamente. El experimento se llevó a cabo por duplicado. Las células se sembraron a 125.00 células por frasco (T-25) .
La figura 5 es una fotografía de un análisis por electroforesis sobre gel de poliacrilamida de la proteína TNF-gama. TNF-gama se produjo por expresión bacteriana y se purificó como se describe en el Ejemplo 1.
La figura 6 es una fotografía de un gel que exhibe la pureza y movilidad relativas de TNF-gama expresado en baculovirus. La expresión y purificación de TNF-gama que utiliza el sistema de baculovirus se describe en el Ejemplo 2.
La figura 7A consiste de fotografías de células WEHI 164 las cuales no son tratadas (Figura 7Aa) y después de exposición a TNF-a (figura 7Ab) , TNF-gama (Figura 7Ac) , y TNF-b (Figura Ad) . Se lisaron las células que tienen una morfología no redonda alargada. Se añadieron las diferentes moléculas de TNF a una concentración de aproximadamente 0.5 µg/ml. Se tomaron fotografías cada 72 horas después de adición de las diferentes moléculas de TNF.
La figura 7B ilustra la capacidad de TNF-gama (Figura 7Bc) en comparación a TNF-a (Figura 7Ba) y TNF-b (Figura 7Bb) para inhibir el crecimiento de células WEHI 164.
La figura 8 ilustra la capacidad de TNF-a (Figura 8B) , TNF-b (Figura 8D) , y TNF-gama (Figura 8C) recombinantes para inducir cambios morfológicos en células L929 con respecto a células L929 no tratadas (Figura 8A) .Los cambios en la morfología se indican por células redondas obscuras. Las células se trataron con las diferentes moléculas de TNF recombinantes (producidas en E. coli) a aproximadamente 0.5 µg/ml. se tomaron fotografías 72 horas después de la adición de las diferentes moléculas de TNF. Los cambios en la morfolosía indican sue las células han sido destruidas.
La figura 9 es una ilustración gráfica del efecto de TNF-gama (Figura 9C) , TNF-a (Figura 9A) , y TNF-b (Figura 9B) sobre células endoteliales venosas. La proliferación célula después de que las células endoteliales venosas se trataron con TNF-a y TNF-b disponibles comercialmente y TNF-gama producida por E. coli se cuantificó utilizando un ensayo MTS.
La figura 10 exhibe el efecto de TNF-gama sobre la proliferación celular de células endoteliales y células cancerosas de seno. El número de células se gráfico contra la concentración de TNF-gama como se indica (TNF-gama se designa "VEGI" en esta figura) . Se exhibe la inhibición del crecimiento de células endoteliales aórticas de bovino adulto (ABAE) (círculos obscuros) , pero no de células MDA-MB-231 (triángulos obscuros) ó MDA-MB-435 (círculos abiertos) . Las células se sembraron a 2 x 103 células/pocilio en placas de 24 pocilios por triplicado. El medio de cultivo de células ABAE contuvo IMEM (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) suplementado con FCS al 10 % y FGF-2 (1 ng/ml) . Los cultivos se mantuvieron a 37 °c, 5 % de C02, por 6 días. Las células se triptinizaron luego, y el número de células se determinó utilizando un contador Coulter. Un quinto del número total de células ABAE recuperadas se muestran a fin de normalizar la comparación con células MDA-MB-231 y MDA-MB-435.
La figura 11 es una fotografía de células HL60, con control (Figura HA) que exhibe células HL60 que están diseminadas aparte; TNF-a (Figura 11B) y TNF-gama (Figura 11C) inducen la adhesión celular y el contacto célula-célula como se ilustra por la adherencia de las células juntas en el lado inferior izquierdo.
La figura 12 ilustra la capacidad de TNF-gama, representada por cuadros) , TNF-a (representada por círculos) , y TNF-b (representada por triángulos) recombinantes para inducir la muerte de células WEHI 164. La muerte celular es inversamente proporcional a la proporción de absorbancia a 405 nm hasta la de 490 nm.
La figura 13 ilustra que TNF-gama no enlaza significativamente a dos receptores de TNF solubles conocidos, es decir sTNF Rl (p55: barras llenas) y sTNF RII (p75; barras hachuradas) .
La figura 14 demuestra el efecto de TNF-gama sobre la capacidad de células ABAE para formar tubos similares a capilares sobre geles de colágeno. Se muestra la capacidad de TNF-gama recombinante (residuos 12-147 que se expone en la SEC ID NO: 2 y designada "VEGI" en esta figura) para inhibir la formación de los tubos similares a capilares po células ABAE. Los valores-p (t-prueba) dados anteriormente las columnas se obtuvieron por comparación de la extensión de la formación de los tubos similares a capilares por células ABAE. en presencia de varias concentraciones de TNF-gama, como se indica, a la de cuando TNF-gama está ausente del medio de cultivo.
La figura 15 muestra la inhibición de angiogénesis en geles de colágeno colocados sobre membrana corioalantoica embrionaria de pollo (CAM) por TNF-gama. El crecimiento de los nuevos vasos capilares en comprimidos de gel de colágeno colocados sobre CAM fue inducido ya sea por FGF-2 (100 ng) ó V?GF (250 ng) . La extensión de la angiogénesis en los geles se determinó por evaluación de la intensidad de la fluorescencia de FITC-dextrano inyectado en la circulación de CAM. Se muestra la inhibición del crecimiento de los vasos capilares por la TNF-gama recombinante (designado "VEGI" en esta figura) , que se indica por un valor inferior a 100. El experimento se llevó a cabo por triplicado.
La figura 16 ilustra la inhibición del crecimiento de tumores xenoinjertados de cáncer de seno humano en ratones desnudos atímicos por TNF-gama. Mezclas de células CHO que sobre-expresan a TNF-gama ó transfectadas en vector (5 x 10° células por inyección) y células cancerosas de seno humano (1 x 106 células por inyección) se inyectaron en la capa grasa mamaria de ratones desnudos. Las tallas de los tumores (área) se monitorearon después de la inyección. Las tallas de los tumores xenoinjertados MDA-MB-231 (mm2) se graficaron como una función de los días post-inoculación (Figura 16A) . Las talla de los tumores xenoinjertados MDA-MB-435 (mm2) se graficaron como una función de los días post-inoculación (Figura 16B) . Los círculos abiertos representan valores de tumores co-inoculados con células CHO transfectadas con vector, mientras que los círculos cerrados representan valores de tumores co-inoculados con células CHO transfectadas con TNF-gama La figura 17 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa (SEC ID NO: 2) . Se muestran las regiones alfa, beta, en giro y en espiral; hidrofilicidad e hidrofobicidad; regiones antipáticas; regiones flexibles; índice antigénico y probabilidad superficial, como se predijo utilizando los parámetros faltantes de los programas de cómputo citados. En la gráfica "Antigenic Index or Jameson-Wolf", los picos positivos indican la ubicación de las regiones altamente antigénicas de la proteína de TNF-gama, por ejemplo regiones de las cuales puede obtenerse péptidos de apoyo epítopes de la invención.
Las figuras 18A-D muestran una alineación de las secuencias de nucleótidos de TNF-gama-alfa (SEC ID NO: 1) y de TNF-gama-beta (SEC ID NO: 19) construidas por utilización del programa de cómputo BESTFIT para colocar los parámetros faltantes.
La figura 19 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de TNF-gama-alfa (SEC ID NO: 2) y TNF-gama-beta (SEC ID NO: 20) construida utilizando los parámetros faltantes del programa de cómputo BESTFIT.
Las figuras 20A y B ilustran las secuencias de cDNA (SEC ID NO: 19) y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente (SEC ID NO: 20) del polipéptido del TNF-gama-beta de la presente invención. Se utilizaron las abreviaciones de una letra estándares. Los aminoácidos metionina-1 a triptofano-35 están en la región intracelular predicha. Los residuos de aminoácidos alanina-36 hasta alanina-61 (subrayados) están en la secuencia transmembrana putativa. Los residuos de aminoácidos glutamina 62- hasta leucina-251 (subrayados) están en la secuencia transmembrana putativa. Los sitios de glicosilación potenciales enlazados a aspargina están marcados en las figuras 20a y B con un símbolo aspargina en negrilla (N) en la secuencia de aminoáidos de TNF-gama-beta y un signo de libra en negrilla (#) encima del primer nucleótido que codifica al residuo aspargina en la secuencia de nucleótidos de TNF-gama-alfa. Las secuencias de glicosilación unidas a N potenciales se encuentran en los siguientes ubicaciones en la se cuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta: N-133 hasta N-136 (N-133, , Y-134, T-135, N- 136) y N-229 hasta D-232 (N-229, V-230, S-231, D-232) . Los sitios de fosforilación potenciales de la Proteína Cinasa C están también marcados en las figuras 20A y B con símbolos de serina ó treonina en negrillas (S ó T) en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta y un asterisco encima del primer nucleótido que codifica al residuo de treonina en la secuencia de nucléotidos de TNF-gama-beta. Las secuencias de fosforilación de PKC potenciales se encuentran en las siguientes ubicaciones en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta: S23 hasta R-25 (S-23, hasta C-24, R-25) ; S-32 hasta R-34 (S-32, A-33, R-34); T-135 hasta K-137 (T-135, N-136, K-137) y T-154 hasta R-156 (T-154, F-155, R-156) . Los sitios de fosforilación potenciales de la Caseína Cinasa II (CKII) están también marcados en las figuras 20A y B con un símbolo serina ó treonina en negrilla (S ó T) en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta y un asterisco (*) encima del primer nucleótido que codifica al residuo de serina ó treonina apropiado en la secuencia de nucleótidos de TNF-gama-beta. Las secuencias de fosforilación potenciales de CK2 se encuentran en las siguientes ubicaciones en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta: S-8 hasta E-ll (S-8, F-9, G-10, E-ll); S-187 hasta E-190 (S-187, Y-188, P-189, E-190); S-200 hasta E-203 (S-200, V-201, C-202, E-203); S-219 hasta E-222 (S-219, L-220, Q-221, E-222); S-234 hasta D-237 (S-234, L-235, V-236, D-237); y T-239 hasta D-242 (T-239, K-240, E-241, D-242). Los sitios de miristilación potenciales están marcados en las figuras 20A y B con doble un subrayado en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta. Las secuencias de miristilación potenciales se encuentran en las siguientes ubicaciones en la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta: G-6 hasta E-ll (G-6, L-7, F-9, G-10, E-ll); G-124 hasta G-129 (G-124, L-125, A-126, F-127, T-128, K-129) ; y G-215 hasta L-220 (G-215, A-216, M-217, F-218, S-219, L-220) .
Descripción detallada La presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden un polinucleótido que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en las Figuras 1A y B (SEC ID NO: 2), la cual se determinó por formación de secuencias de un cDNA clonado (HUVE091) . Como se muestra en la figura 2A-2C, el polipéptido TNF-gama-alfa de la presente invención participa de la homología de secuencia conTNF-alfa humano (SEC ID NO: 3), TNF-beta (SEC ID NO: 4), linfotoxina-beta humana (SEC ID NO: 5) y ligando de FAS (SEC ID NO: 6). La TNF-gama-alfa funciona al menos en la inhibición de la angiogénesis, como una molécula similar a citosina anti-tumor, como un tratamiento para artritis por la inhibición de angiogénesis y/ó proliferación celular endotelial asociada con invasión de queratitis vascular en hueso y cartílago, como un inductor de NF-kB y cinasa c-Jun (JNK), un inductor de adhesión celular, y como un inductor de apoptosis (ver Ejemplos, particularmente Ejemplos 12-15). La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID N0:1 se obtuvo por formación de secuencias de un cDNA clonado (HUVE091), que fue depositado en octubre 16 de 1994 en la American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, y se le dio el No. de acceso 75927. El plásmido depositado está contenido en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) . La caracterización adicional de la proteína codificada por el clon HUVE091 se presentó con la solicitud co-dependiente Solicitud provisional U.S.A. con Nó . De serie 60/074,047, registrada en febrero 9, de 1998; cuya descripción completa se incorpora a la presente como referencia.
La presente invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden un polinucleótido (SEC ID NO: 19) que codifica a un polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 20a y B (SEC ID NO: 20), la cual se determinó por formación de secuencias de un cDNA clonado (HEMCZ56) . El polipéptido TNF-gama-beta es una variante de unión del polipéptido TNF-gama-alfa descrito en la presente. La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID NO: 19 se obtuvo por formación de secuencias de un clon de cDNA (HEMCZ56) , el cual se depositó en Julio 9 de 1998 en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, y se le dio el no. de acceso 203055. El plásmido depositado está contenido en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) .
Moléculas de ácido nucleico A menos que se indique de otro modo, todas las secuencias de nucleótidos determinada por la formación de secuencias de una molécula de DNA en la presente se determinaron utilizando un formador de secuencias de DNA automático (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) , y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos codificados por moléculas de DNA determinadas en la presente se predijeron por traslación de una secuencia de DNA determinada anteriormente. Por consiguiente, como es sabido en la especialidad para cualquier secuencia de DNA determinada por esta aproximación automática, cualquier secuencia de nucleótido determinada en la presente puede contener algunos errores. Secuencias de nucleótidos determinadas automáticamente son típicamente al menos aproximadamente 90 % idénticas, más típicamente al menos aproximadamente 95 % hasta al menos 97 % idénticas a la secuencia de nucleótidos actual de la molécula de DNA secuenciada. La secuencia actual puede determinarse precisamente por otras aproximaciones que incluyen métodos de formación de secuencias de DNA manuales conocidos en la materia. Como se sabe también en la especialidad, una sola inserción ó eliminación en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia actual ocasionará un cambio en el sistema de traslación de la secuencia de nucleótidos de modo que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos actualmente codificada pot la molécula de DNA secuenciada, que comienza en el punto de una inserción ó eliminación tal.
Por "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico ó polinucleótido se pretende, para una molécula de DNA ó polinucleótido, una secuencia de desoxiribonucleótidos, y para una molécula de RNA ó polinucleótido, la secuencia correspondiente de ribonucleótidos (A, G, C, y U) , en donde cada timidina desoxiribonucleótida (T) en la secuencia de desoxiribonucleótidos especificada es reemplazada por la uridina ribonucleótida (U) .
Utilizando la información proporcionada en la presente, así como la secuencia de nucleótidos en las figuras ÍA y B (SEC ID N0:1), ó la secuencia de nucleótidos en las figuras 20A y B (SEC ID NO: 19) una molécula de ácido nucleico (por ejemplo polinucleótida) de la presente invención que codifica a un polipéptido TNF-gama-alfa ó TNF-gama-beta puede obtenerse utilizando los procedimientos de clonación y de selección estándares, tales como por e emplo, aquellos para clonar cDNAs que utilizan mRNA como material inicial. Por ejemplo, polinucleótidos que codifican a polipéptidos T?F-gama-alfa pueden obtenerse rutinariamente de cualquier fuente de célula ó tejido que exprese a T?F-gama-alfa, tal como, por ejemplo células de riñon y endoteliales de la vena umbilical humana. Ilustrativas de la invención, las moléculas de ácido nucleico descritas en las figuras 1A y B (SEC ID ?O: 1) se descubrieron en un acervo de cD?A derivado de células endoteliales de la vena umbilical humanas. El clon de cD?A que corresponde a T?F-gama-alfa (clon HUVE091) contiene un sistema de lectura abierto que codifica a una proteína de 174 residuos de aminoácidos de los cuales aproximadamente los primeros 27 residuos de aminoácidos son la secuencia líder putativa de modo que la proteína madura comprende 147 aminoácidos. La proteína exhibe el mayor grado de homología al C-terminus de TNF-a de Conejo (Ito, H. Y colaboradores, DNA 5:157-165 (1986); No. de Acceso GenBank: M12846; SEC ID NO: 7) con 38 % de identidad y 58 % de similitud sobre una extensión de 111 aminoácidos. Las secuencias conservadas por todos los miembros de la familia de TNF son también conservadas en TNF-gama (ver las figuras 2A-2C) . Las letras sombreadas indican los residuos de aminoácidos conservados. El mRNA de TNF-gama específicamente expresado en células endoteliales de la vena umbilical humana se expone en el análisis por manchado de RNA de la figura 3B.
Adicionalmente polinucleótidos que codifican al polipéptido TNF-gama-beta pueden rutinariamente obtenerse de células endoteliales inducidas ó en reposo, vena umbilical, amígdalas, y otros diversos tipos de células y tejidos. Ilustrativas de la invención las moléculas de ácido nucleico descritas en las figuras 20A y B (SEC ID NO: 19) se descubrieron en un acervo de cDNA derivado de células endoteliales inducidas. El clon de cDNA correspondiente a TNF-gama-alfa (HEMCZ56) contiene un sistema de lectura abierto que codifica a una proteína de 251 residuos de aminoácidos de los cuales los primeros 35 residuos de aminoácidos son la región intracelular putativa y los aminoácidos 36-61 son la región transmembrana putativa y los residuos de aminoácidos 62-251 son una región extracelular putativa.
Los residuos de aminoácidos que constituyen las regiones extracelular, transmembrana, e intracelular se predijeron por análisis computacional. De ese modo, como lo podría apreciar un experto en la materia, los residuos de aminoácidos que constituyen estas regiones pueden variar ligeramente (por ejemplo, por aproximadamente 1 hasta 15 residuos de aminoácidos) dependiendo del criterio usado para definir cada región.
De conformidad con un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado (polinucleótido) que codifica para el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras Ia y B (SEC ID NO: 2) , ó para el polipéptido maduro codificado por el cDNA del clon designado HUVE091 depositado con No. de Depósito en ATCC: 75927 el 26 de Octubre de 1994.
Además de conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado (polinucleótido) que codifica para el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras 20A y B (SEC ID NO: 20), ó para el polipéptido maduro codificado por el cDNA del clon designado HEMCZ56 depositado con el No. de Depósito en ATCC 203055 el 9 de Julio de 1998.
Por moléculas de ácido nucleico "aislado" ó polinucleótido se entiende una molécula, DNA ó RNA que tiene una forma diferente a la de su ambiente nativo. Por ejemplo moléculas de D?A recombinante (polinucleótidos) contenidas en un vector se consideran aisladas para el propósito de la presente invención. Ejemplos adicionales de moléculas de D?A aislado (polinucleótidos) incluyen moléculas de D?A recombinante conservadas en células huéspedes heterólogas ó moléculas de D?A purificadas (parcial ó substancialmente) en solución. Moléculas de RNA aisladas (polinucleótidos) incluyen transcritos de R?A in vivió ó in vitro de las moléculas de D?A (polinucleótidos) de la presente invención. Moléculas de ácido nucleico aisladas ó polinucleótidos conforme a la presente invención incluyen adicionalmente tales moléculas producidas sintéticamente.
El polinucleótido de la presente invención puede estar en la forma de RNA ó en la forma de DNA, dicho DNA incluye cDNA, DNA genómico, y DNA sintético. El DNA puede ser de doble cadena ó de una sola, y si es de una sola puede ser cadena codificante ó cadena no codificante (anti-sentido) .
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención incluyen la secuencia de polinucleótidos expuesta en las figuras ÍA y B (SEC ID NO: 1) que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa maduro, la secuencia de polinucleótidos expuesta en las figuras 20A y B (SEC ID NO: 19) que codifican al polipéptido TNF-gama-beta maduro, las secuencias de polinucleótidos contenidas en el clon depositado (HUVE091) depositado con No. de Depósito en ATCC 75927 que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa maduro, las secuencias de polinucleótidos contenidas en el clon depositado (HREMCZ56) depositadas con No. de Depósito 203055 que codifican al polipéptido TNF-gama-beta maduro, y las secuencias de polinucleótidos que comprenden una secuencia diferente de las descritas anteriormente, pero la cual debido a la degeneración del código genético codifican al mismo polipéptido maduro que el DNA de las figuras ÍA y B, figuras 20A y B, ó el cDNA depositado. Por supuesto, el código genético es conocido por los expertos en la materia.
Así, sería rutina para un experto en la materia generar tales variantes degeneradas.
La secuencia de aminoácidos de la proteína TNF-gama-alfa completa incluye una secuencia líder y una proteína madura, como se muestra en las figuras 1A y B (SEC ID NO: 2). Más en particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican a una forma madura de la proteína TNF-gama-alfa. Así, conforme a la hipótesis indicadora, una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de la proteína en desarrollo a través del rígido retículum endoplámico, las proteínas secretadas por células de mamíferos tienen una secuencia líder secretora ó indicadora la cual es fragmentada del polipéptido complejo para producir una forma "madura" secretada de la proteína. La mayoría de las células de mamíferos e igualmente células de insectos fragmentan las proteínas secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en algunos casos, la fragmentación de una proteína secretada no es totalmente uniforme, lo cual dá como resultado dos ó más especies maduras de la proteína. Adicionalmente, es extensamente sabido que la especificidad de f agmentación de una proteína secretada es finalmente determinada por la estructura primaria de la proteína completa, esto es, es inherente en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por consiguiente, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC con No.: 75927. "Polipéptido TNF-gama-alfa maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA en el Depósito ATCC No.: 75927", significa la(s) forma (s) madura (s) de la proteína TNF-gama-alfa producida por expresión en una célula de mamífero (por ejemplo células COS, que se describen a continuación) del sistema de lectura abierto completo codificado por la secuencia de DNA humano del clon depositado .
El polinucleótido codificante del polipéptido maduro de las figuras 20A y B ó del polipéptido maduro codificado por el cDNA depositado (HEMCZ56) puede incluir, pero no limitarse a: solamente la secuencia codificante del polipéptido maduro; la secuencia codificante del polipéptido maduro y una secuencia codificante adicional tal como una secuencia líder ó secretora ó una secuencia transmembrana ó una secuencia proproteína; la secuencia codificante del polipéptido maduro (y opcionalmente la secuencia codificante adicional) y la secuencia no-codificante, tal como intrones, ó secuencia no codificante 5' y/ó 3' de la secuencia que codificante del polipéptido maduro .
La presente invención también incluye polinucleótidos en los que la secuencia codificante del polipéptido maduro puede estar fusionada al mismo sistema de lectura abierto a una secuencia de polinucleótidos que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido desde una célula huésped, por ejemplo, una secuencia líder la cual funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder fragmentada por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden también codificar para una preproteína la cual es la proteína madura más residuos de aminoácidos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia es fragmentada una proteína madura activa permanece.
Así, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar a una proteína madura, ó a una proteína que tiene una prosecuencia ó a una proteína que tiene ambas una prosecuencia y una presecuencia (secuencia líder) .
Los polinucleótidos de la presente invención pueden también tener la secuencia codificante fusionada en estructura a una secuencia marcadora lo cual permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una hexa-histidina tag provista de un vector pQE-9 para purificar el polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano, ó por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una hemaglutinina (HA) tag cuando es un huésped mamífero, por ejemplo se usan células COS-7. La HA tag corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina influenza (Wilson, I. Y colaboradores, Cell , 37: 767 (1984) ) .
Así, el término "polinucleótido codificante de un polipéptido" abarca a un polinucleótido que incluye solamente la secuencia codificante del polipéptido así como también un polinucleótido que incluye la secuencia codificante y/ó no-codificante adicional.
La presente invención concierne adicionalmente a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente que codifican a fragmentos (por ejemplo porciones), análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras ÍA y B, figuras 20A y B, y el polipéptido codificado por el cDNA de los clones depositados. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica como se encuentra naturalmente del polinucleótido ó una variante del polinucleótido no como se encuentra naturalmente.
Así, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro que se muestra en las figuras 1A y B ó el polipéptido maduro codificado por el cDNA del clon depositado HUVE091 así como también variantes de tales polinucleótidos, dichas variantes codifican a un fragmento, derivado ó análogo del polipéptido de las figuras ÍA y B, ó al polipéptido codificado por el cDNA del clon depositado HUVE091. Tales variantes de nucleótidos incluyen variantes por eliminación, variantes por substitución y variantes por adición ó inserción.
Adicionalmente, la presente invención incluye polinucleótidos codificantes del polipéptido maduro que se muestra en las figuras 20A y B, ó al polipéptido maduro codificado por cDNA del clon depositado HEMCZ56 así como también variantes de tales polinucleótidos, dichas variantes codifican a un fragmento, derivado ó análogo del polipéptido de las figuras 20A y B, ó el polipéptido codificado por el cDNA del clon depositado HEMCZ56. Tales variantes de nucleótido incluyen variantes por eliminación, variantes por substitución y variantes por adición ó inserción.
Como se indicó anteriormente, el polinucleótido puede tener una secuencia codificante que se muestra en las figuras Ia y B ó de la secuencia codificante del clon depositado HUVE091. alternativamente, el polinucleótido puede tener una secuencia codificante la cual es una variante alélica natural de la secuencia codificante que se muestra en las figuras 20a y B ó de la secuencia codificante del clon depositado HEMCZ56. Como se sabe en la especialidad, una variante alélica es una forma alterna de una secuencia de polinucleótidos que puede tener una substitución, eliminación ó adición de uno ó más nucleótidos, las cuales no alteran substancialmente la función del polipéptido codificado.
La presente invención está adicionalmente dirigida a fragmentos de moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente. Por un fragmento de una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de nucleótidos de los cDNAs depositados (HUVE091 y HEMCZ56) , ó la secuencia de nucleótidos que se muestra en las figuras 1A y B (SEC ID N0:1), figuras 20A y B (SEC ID NO: 19), ó los filamentos complementarios de éstas, se entiende por fragmentos al menos 15 nt, y más preferiblemente al menos 20 nt, aún más preferiblemente al menos 30 nt e igualmente más preferiblemente, al menos 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, ó 500 nt de extensión. Estos fragmentos tienen numerosos usos que incluyen pero no se limitan a, sondas de diagnóstico e iniciadores que se discuten en la presente. Por supuesto fragmentos mayores de 50-1500 de extensión son también útiles conforme a la presente invención como son los fragmentos que corresponden a la mayoría, si no a todas, las secuencias de nucleótidos del clon de cDNA depositado HUVE091, el clon de cDNA depositado HEMCZ56, la secuencia de nucleótidos expuesta en las figuras Ia y B (SEC ID NO: 1), ó la secuencia de nucleótidos expuesta en las figuras 20A y B (SEC ID NO: 20) . Por un fragmento de al menos 20 nt de extensión, por ejemplo, se entiende fragmentos que incluyen 20 ó más bases contiguas de la secuencia de nucleótidos de los clones de cDNA depositados (HUVE091 y HEMCZ56),La secuencia de nucleótidos de las figuras ÍA y B (SEC ID NO: 1), ó la secuencia de nucleótidos de las figuras 20A y B.
En modalidades específicas, los fragmentos de polinucleótido de la invención codifican a un polipéptido que demuestra una actividad funcional. Un polipéptido que demuestra "actividad funcional", significa, un polipéptido capaz de desplegar una ó más actividades funcionales asociadas con un polipéptido TNF-gama completo ó maduro. Tales actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica ( (por ejemplo, inhibición de angiogénesis, inhibición de la proliferación de células endoteliales, inducción de la NF-kB y cinasa c-Jun (JNK) .
Inducción de la adhesión celular, e inducción de apoptosis (Ver ejemplos, particularmente los Ejemplos 12-15)), antigenicidad [capacidad para enlazar (ó competir con un polpéptido TNF-gama para enlazar) a un anticuerpo anti—TNF-gama], inmunogenicidad (capacidad para generar anticuerpos que enlazan a un polipéptido TNF-gama) , la capacidad para formar polímeros con otros polipéptidos TNF-gama, y la capacidad para enlazar a un receptor ó ligando para un polipéptido TNF-gama (por ejemplo DR3) .
La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos relacionados a los fragmentos extensos de SEC ID NO: que se han determinado de la siguiente relación de clones de cDNA: HUVE091 (SEC ID NO: 8), HMPAP05 (SEC ID NO: 9), HSXCA44 (SEC ID NO: 10), HEMFG66 (SEC ID NO: 11), y HELAM93 (?EC ID NO: 12) .
La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos relacionadas con los fragmentos extensos de la SEC ID NO: 19 que se han determinado de la siguiente relación de clones de cDNA: HUVEO91P01 (SEC ID NO: 21), HMPTI24R (SEC ID NO: 22), HELAM93R (SEC ID NO: 23), y HEMFG66R (SEC ID NO: 24).
En modalidades específicas, los fragmentos de polinucleótidos de la invención comprenden, ó alternativamente, consisten de, un polinucleótido que comprende cualquier porción de al menos 30 nucleótidos, preferiblemente de al menos 50 nucleótidos, de la SEC ID NO: 1 desde el residuo de nucleótido 1 al 2442, preferiblemente que exlcuye las secuencias de nucleótidos determinada de los clones anteriormente enlistados. Ejemplos representativos de los fragmentos de polinucleótido TNF-gama-alfa de la invención incluyen fragmentos que comprenden, ó alternativamente, consisten de, nucleótidos: 783-1304, 800-1300, 850-1300, 900-1300, 950-1300, 1050-1300, 1100-1300, 1150-1300, 1200-1300,1250-1300, 783-1250, 800-1250, 850-1250, 900-1250, 950-1250, 1000-1250, 1050-1250, 1100-1250, 1150-1250, 1200-1250, 783- 1200, 800-1200, 850-1200, 900-1200, 950-1200, 1000-1200, 1050-1200 1100-1200, 1150-1200, 783-1150, 800-1150, 850- 1150, 900-1150, 950-1150, ' 1000-1150, 1050-1150, 1100-1150,. 783-1100, 800-1100, 850-1100, 900-1100, 950-1100, 1000-1100, 1050-1100, 783-1050, 800-1050, 850-1050, 900-1050, 950-1050, 1000-1050, 783-1000, 800-1000, 850-1000, 900-1000, 950-1000, 783-950, 800-950, 850-950, 900-950, 783-900, 800-900, y 850-900 de la SEC ID NO: 1, ó el filameno de polinucleótido complementario de los mismos, ó el cDNA contenido en el clon depositado HUVE091.
En modalidades específicas adicionales, los fragmentos de polinucleótido de la invención comprenden, ó alternativamente, consisten de, un polinucleótido que comprende cualquier porción de al menos 30 nucleótidos, preferiblemente al menos 50 nucleótidos de la SEC ID NO: 19 desde el residuo de nucleótido 1 hasta el 1116, preferiblemente excluyendo las secuencias de nucleótidos de los clones de cDNA enlistados anteriormente (por ejemplo, la lista de la página 25) .
Modalidades preferidas de la invención abarcan polinucleótidos que codifican a polipéptidos que comprenden, ó alternativamente consisten de, la secuencia de aminoácidos de los residuos -1-147 (ver -1 a 147), 1-147 (ver +1 a 147), 2-147, 3-147, 4-147, 5-147, 6-147, 7-147, 8-147, 9-147, 10-147, 11-147, 12-147, y 13-147 de la SEC ID NO: 2. Se proporcionan también polinucleótidos que codifican a estos polipéptidos.
Ejemplos representativos de los fragmentos de polinucleótido TNF-gama-beta de la invención incluyen fragmentos que comprenden, ó alternativamente consisten de, nucleótidos 1-1116, 50-1116, 100-1116, 150-1116, 200-1116, 250-1116, 300-1116, 350-1116, 400-1116, 450-1116, 500-1116, 550-1116, 600-1116, 650-1116, 700-1116, 750-1116, 800-1116, 850-1116, 900-1116, 950-1116, 1000-1116, 1050-1116, 1-1100, 50-1100, 100-1100, 150-1100, 200-1100, 250-1100, 300-1100, 350-1100, 400-1100, 450-1100, 500-1100, 550-1100, 600-1100, 650-1100, 700-1100, 750-1100, 800-1100, 850-1100, 900-1100, 950-1100, 1000-1100, 1050-1100, 1-1050, 50-1050, 100-1050, 150-1050, 200-1050, 250-1050, 300-1050, 350-1050, 400-1050, 450-1050, 500-1050, 550-1050, 600-1050, 650-1050, 700-1050, 750-1050, 800-1050, 850-1050, 900-1050, 950-1050, 1000-1050, 1-1000, 50-1000, 100-1000, 150-1000, 200-1000, 250-1000, 300-1000, 350-1000, 400-1000, 450-1000, 500-1000, 550-1000, 600-1000, 650-1000, 700-1000, 750-1000, 800-1000, 850-1000, 900-1000, 950-1000, 1-950, 50-950, 100-950, 150-950, 200-950, 250-950, 300-950, 350-950, 400-950, 450-950, 500-950, 550-950, 600-950, 650-950, 700-950, 750-950, 800-950, 850-950, 900-950, 1-900, 50-900, 100-900, 150-900, 200-900, 250-900, 300-900, 350-900, 400-900, 450-900, 500-900, 550-900, 600-900, 650-900, 700-900, 750-900, 800-900, 850-900, 1-850-50-850, 100-850, k 150-850, 200-850, 250-850, 300-850, 350, 850, 400-850, 450-850, 500-850, 550-850, 600- 850, 650-850, 700-850, 750-850, 800-850, 1-800, 50-800, 100-800, 150-800, 200-800, 250-800, 300-800, 350-800, 400-800, 450-800, 500-800, 550-800, 600-800, 650-800, 700-800, 750-800, 1-750, 50-750, 100-750, 150-750, 200-750, 250-750, 300-750, 350-750, 400-750, 450-750, 500-750, 550-750, 600- 750, 650-750, 700-750, 1-700, 50-700, 100-700, 150-700, 200-700, 250-700, 300-700, 350-700, 400-700, 450-700, 500-700, 550-700, 600-700, 650-700, 1-650, 50-650, 100-650, 150-650, 200-650, 250-650, 300-650, 350-650, 400-650, 450-650, 500-650, 550-650, 600-650, 1-600, 50-600, 100-600, 150-600, 200-600, 250-600, 300-600, 350-600, 400-600, 450-600, 500-600, 550-600, 1-550, 50-550, 100-550, 150-550, 200-550, 250-550, 300-550, 350-550, 400-550, 450-550, 500-550, 1-500, 50-500, 100-500, 150-500, 200-500, 250-500, 300-500, 350-500, 400-500, 450-500, 1-450, 50-450, 100-450, 150-450, 200-450, 250-450, 300-450, 350-450, 400-450, 1-400, 50-400, 100-400, 150-400, 200-400, 250-400, 300-400, 350-400, 1-30, 50-350, 100-350, 150-350, 200-350, 250-350, 300-350, 1-300, 50-300, 100-300, 150-300, 200-350, 250-300, 1-250, 50-250, 100-250, 150-250, 200-250, 1-200, 50-200, 100-200, 150-200, 1-150, 50-150, 100-150, 1-100, 50-100, y 1-50 de la SEC ID NO: 19 ó la cadena del polinucleótido complemetario del mismo, ó el cDNA contenido en el clon depositado HEMCZ56.
Fragmentos de ácido nucleico preferidos de esta invención también incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican a una ó más de las siguientes regiones de TNF-gama-alfa (por ejemplo, como se describe también en los subtítulos de las figuras ÍA y B) : sitios de glicosilación potenciales de enlace aspargina N-29 hasta N-32 (N-29, Y-30, T-31, N-32) y N-125 hasta D-128 (N-125, V-126, S-127, D-128); sitios de fosforilación potenciales de la Proteína Cinasa C (PKC) T-32 hasta K-34 (T-32, N-33, K-34) y T-50 hasta R-52 (T-50, F-51, R-52); sitios de fosforilación potenciales de la Caseína Cinasa II (CK2) S-83 hasta E-86 (S-83, Y-84, P-85, E-86) ; S-96 hasta E-99 (S-96, V-97, C-98, E-99) ; S-115 hasta E-118 (S-115, L-116, Q-117, E-118); S-130 hasta D-133 (S-130, L-131, V-132, D-133); y T-135 hasta D-138 (T-135, K-a36, E-137, D-138); y sisitos de miristilación potenciales G-20 hasta K-25 (G-20, L-21, A-22, F-23, T-24, K-25) y G-lll hasta L-116 (G-lll, A-112, M-113, F-114, S-115, L-116) de la SEC ID NO: 2.
Entre los polinucleótidos especialmente preferidos de la invención está aquellos caracterizados por los atributos estructurales ó funcionales de codificación a TNF-gama. Tales polinucleótidos codifican a residuos de aminoácidos que comprenden regiones alfa-helicoidal y formadoras de alfa-helicoidal ("regiones-alfa") , regiones beta-laminar y formadoras de beta-laminar ("regiones-beta") , regiones envolventes y formadoras de envolvente ("regiones-envolvente") , regiones espirales y formadoras de espirales ("regiones-espiral") , regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones antipáticas alfa, regiones antipáticas beta, regiones que forman superficie, regiones de índice antigénico alto, (por ejemplo, que tienen regiones antigénicas de tres ó más residuos de aminoácidos contiguos cada uno de los cuales que tiene un índice antigénico mayor ó igual a 1.5) de TNF-gama. Ciertas regiones preferidas son las que se expone en la figura 17, e incluyen, pero no se limitan a, regiones de los tipos anteriormente mencionados identificados por análisis de la secuencia de aminoácidos expuesta en la figura 1 (SEC ID NO: 2) utilizando los parámetros faltantes de los programas de cómputo identificados, tales regiones preferidas incluyen; las regiones- alfa, regiones-beta, regiones-envolventes, y regiones -espirales de Garnier-Robson, regiones-alfa, regiones-beta y regiones-espirales de Chou-Fasman, regiones hidrofílicas y regiones hidrofóbicas de Kyte-Doolittle, regiones antipáticas beta y alfa- de Einsenberg, regiones flexibles de Karplus-Schulz, regiones formadoras de superficie de Emini, y regiones de Jameson-Wolf de alto índice antigénico.
Los datos que representa TNF-gama-beta en el modo anteriormente descrito para TNF-gama-alfa (ver figura 17) pueden fácilmente prepararse utilizándola secuencia de aminoácidos expuesta en las figuras 20A y 20B y en la SEC ID NO: 20. De modo que, cada uno de los atributos estructurales y funcionales enlistados anteriormente de TNF gama de la lista anterior (por ejemplo las regiones- alfa, regiones-beta, regiones-envolventes y regiones -espirales de Garnier-Robson, regiones-alfa, regiones-beta, regiones-espirales de Chou-Fasman, regiones hidrofílicas y regiones hidrofóbicas de Kyte-Doolittle, regiones antipáticas beta y alfa- de Einsenberg, regiones flexibles de Karplus-Schulz, regiones formadoras de superficie de Emini, y regiones de Ja eson-Wolf de alto índice antigénico) se aplican igualmente bien a TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta.
Ciertas regiones preferidas a este respecto se exponen en la figura 17, pero pueden también representarse ó identificarse por utilización de yba representación tambular de los datos presentados en la figura 17. El algoritmo computacional DNA*STAR usado para generar la figura 17 (presenta en los parámetros faltantes originalmente) fácilmente se presentarán los datos de la figura 17 en un formato tabular tal. Un formato tabular de los datos de la figura 17 puede usarse para determinar fácilmente enlaces específicos de una región preferida.
Las regiones preferidas mencionadas anteriormente expuestas en la figura 17 incluyen, pero no se limitan a, regiones de los tipos anteriormente mencionados identificados por análisis de la secuencia de aminoácidos expuesta en las figuras 1A y B. Como se presenta en la figura 17, tales regiones preferidas incluyen las regiones-alfa, regiones-beta, regiones-envolventes y regiones -espirales de Garnier-Robson, regiones-alfa, regiones-beta, regiones-espirales de Chou-Fasman, regiones hidrofílicas y regiones hidrofóbicas de Kyte-Doolittle, regiones antipáticas beta y alfa- de Einsenberg, regiones flexibles de Karplus-Schulz, regiones formadoras de superficie de Emini, y regiones de Jameson-Wolf de alto índice antigénico Entre los fagmentos latamente preferidos a este respecto están los que comprenden las regiones de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta que combinan varias características estructurales, tales como varias (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) de las características expuestas anteriormente.
Fragmentos der ácidos nucleicos adicionalmente preferidos de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican a uno ó más porciones con orientación de epítope del polipéptido TNF-gama. En particular, tales fragmentos de ácido nucleico de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican a: un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos de aproximadamente Thr-24 hasta aproximadamente Asn-32 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácido de aproximadamente Ile-37 hasta Ile-45 en la SEC ID NO: 2; ; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Met-54 hasta aproximadamente Arg-62 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Gln-63 hasta aproximadamente Asp-7 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Glu-57 hasta aproximadamente Gly-65 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Val-80 hasta aproximadamente Thr-88 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Leu-116 hasta aproximadamente Va-124 en la SEC ID NO: 2; y un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Asp-133 hasta aproximadamente Phe-141 en la SEC ID NO: 2. estos fragmentos de polipéptidos se ha determinado que soportan a los epítopes antigénicos de la proteína TNF-gama por el análisis de del índice antigénico de Jameson-Wolf, como se muestra en la figura 17, anterior. Métodos para determinar otras porciones de apoyo epitopes de TNF-gama se describen en detalle a continuación.
Los fragmentos de polipéptidos que apoyan como epítopes antigénicos a la proteína TNF-gama-alfa pueden determinarse fácilmente por un experto en la materia utilizando el análisis anteriormente descrito del índice antigénico de Jameson-Wolf, que se muestra en la figura 17. Métodos para determinar otras porciones de apoyo epítopes tales de TNF-gama-alfa se describen en detalle a continuación.
Otra modalidad de la invención está dirigida hacia polinucleótidos que hibridizan, preferiblemente en condiciones de hibridización severas, a una porción de la secuencia de polinucleótidos de un polinucleótido de la invención tal como, por ejemplo, el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927, el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055 ó un fragmento de polinucleótido TNF-gama como se describe en la presente. Por "condiciones severas de hibridización" se entiende incubación toda la noche a 42 °C en una solución que comprende: 50 % de formamida, 5 x SCC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico) , 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 µg/ml de DNA de esperma de salmón separado, desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 0.1 x SCC hasta aproximadamente 65 °C. Por un polinucleótido que hibridiza a una "porción" de un polinucleótido se pretende un polinucleótido (ya sea DNA ó RNA que hibridiza a al menos 15 nucleótidos (nt) , y más preferiblemente al menos 20 nt, aún más preferiblemente al menos 30 nt, e igualmente más preferiblemente 30-70, ó 80-150 nt, ó la longitud completa del polinucleótido de referencia. Estos son útiles como sondas de diagnóstico e iniciadores como se discutió anteriormente y más en detalle a continuación. Por supuesto, un polinucleótido que hibridiza solamente a una secuencia poli A (tal como la vía poli 3' terminal del cD?A de T?F-gama de la SEC ID ?O: 1 ó SEC ID ?O: 19), ó a una extensión complementaria del residuo T (ó U) , no se incluiría en un polinucleótido de la invención usado para hibridizar a una porción de un ácido nucleico de la invención, puesto que un polinucleótido tal hibridizaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga una extensión poli (A) ó el complemento de la misma (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de cDNA de doble cadena generada utilizando oligo dT como iniciador) .
En modalidades preferidas, los polinucleótidos que hibridizan a los polinucleótidos de referencia descritos en la presente, codifican a polipéptidos los cuales ya sea que conserven substancialmente la misma función ó actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por las secuencias polinucleótidas expuestas en las figuras Ia y B (SEC ID NO: 1) y/ó las figuras 20a y B (SEC ID NO: 19), ó los cDNAs contenidos en el depósito.
Modalidades alternativas están dirigidas a polinucleótidos que hibridizan al polinucleótido de referencia (ver, una secuencia polinucleótida descrita en la presente), pero no conserva su actividad biológica. Mientras que estos polinucleótidos no conservan actividad biológica tienen usos tales como, por ejemplo, como sondas para el polinucleótido de la SEC ID NO:l, para recuperación del polinucleótido, como sondas de diagnóstico, y como iniciadores de PCR.
La presente invención concierne adicionalmente a variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, las cuales codifican porciones, análogos ó derivados de la proteína TNF-gama. Las variantes encontrarse naturalmente, tal como una variante alélica natural. Por una "variante alélica" se pretende una de varias formas alternas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B. Y colaboradores, ed. John Wiley & Sons, New York (1985) ) . Las variantes que no tienen lugar naturalmente pueden producirse utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la materia.
Tales variantes incluyen las producidas por substituciones, eliminaciones ó adiciones de nucleótidos de las secuencias de polinucleótidos descritas en la presente (incluyendo fragmento) . Las substituciones, eliminaciones ó adiciones pueden involucrar uno ó más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en regiones codificantes, regiones no-codificantes, ó ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir substituciones, eliminaciones ó adiciones de aminoácidos conservadoras ó no conservadoras. Especialmente preferida entre éstas son las substituciones, adiciones y eliminaciones silenciosas, las cuales no alteran las propiedades y actividades de la proteína TNF-gama ó pociones de la misma. También especialmente preferida a este respecto son las substituciones conservadoras.
Modalidades adicionales de la invención están dirigidas hacia moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de polinucleótidos al menos 70 % ó al menos 80 % idéntica, más preferiblemente al menos 90 % idéntica, y aún más preferiblemente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % idéntica a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa en SEC ID NO: 2 (ver, las posiciones -27 a 147 de la SEC ID NO: 2); (b)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa en SEC ID NO: 2 exceptuando a la metionina N-terminal (ver, posiciones -26 a 147 de la SEC ID NO: 2); (c)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa maduro que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2 expuesta como posiciones 1 a 147 de la SEC ID NO: 2; (d)una secuencia de nucleótidos que codifica a la región extracelular del polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2 expuesta como posiciones 1 a 147 de la SEC ID NO: 2; (e)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA HUV?.091 contenida en el Depósito ATCC No. 75927; (f)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N-terminal codificada por 1 clon de cDNA HUVE091 contenido en el Depósito ATCC No. 75927; (g) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-alfa maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenida en el Depósito en ATCC No. 75927; (h)una secuencia de nucleótidos que codifica a la región extracelular del polipéptido TNF-gama-alfa que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA HUVE091 contenida en el Depósito en ATCC No. 75927; (i) una seucneica de nucleótidos que codifica a un fragmento del polipéptido descrito en la presente; y (j) una secuencia de nucleótidos complementaria de cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f), (g) , (h) , ó (i), anteriores. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica, más preferiblemente al menos 90 % idéntica, y aún más preferiblemente 95 %, 96 %, 97 , 98 % ó 99 % idéntica a las descritas en (a), (b) , (c) , (d) , (e), (f), (g) , (h) , (i) ó (j) anteriores, así como también polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de similitud, y más preferiblemente al menos 95 % de similitud con las anteriores .
Modalidades adicionales de la invención están dirigidas hacia moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de polinucleótidos al menos 70 % ó al menos 80 % idéntica, más preferiblemente al menos 90 % idéntica, y aún más preferiblemente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % idéntica a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 20 (ver, posiciones 1 a 251 de la SEC ID NO: 20); (b)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 20 exceptuando a la metionina N- terminal (ver, posiciones 2 a 251 de la SEC ID NO: 20); (c)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta maduro que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 20 expuesta como posiciones 62 a 251 de la SEC ID NO: 20; (d)una secuencia de nucleótidos que codifica a la región intracelular del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 20 expuesta como posiciones 1 a 35 de la SEC ID NO: 20; (e)una secuencia de nucleótidos que codifica a la región extracelular del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 20 expuesta como posiciones 62 a 251 de la SEC ID NO: 20; (f)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el Depósito ATCC No. 203055; (g)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el Depósito ATCC No. 203055; (h)una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el Depósito en ATCC No. 203055; (i) una secuencia de nucleótidos que codifica a la región intracelular del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el Depósito ATCC No. 203055; (j)una secuencia de nucleótidos que codifica a la región extracelular del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el Depósito en ATCC No. 203055; y (k)una secuencia de nucleótidos complementaria de cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c), (d) , (e), (f), (g), (h) , (i) ó (j), anteriores. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica, más preferiblemente al menos 90 % idéntica, y aún más preferiblemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ó 99 % idéntica a las descritas en (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f), (g) , (h) , (i), (j) ó (k) , anteriores, así como también polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de similitud, y más preferiblemente al menos 95 % de similitud, con las anteriores.
Por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco puntos de mutación por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica al polipéptido TNF-gama. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser eliminados ó substituidos con otro nucleótido, ó un número de nucleótidos hasta 5 % del total de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser insertados en la secuencia de referencia. La secuencia de referencia (de consulta) puede ser la secuencia de nucleótidos completa expuesta en las figuras ÍA y B (SEC ID NO: 1) y figuras 20A y B (SEC ID NO: 19), ó cualquier fragmento que se describe en la presente.
Como un tema práctico, si alguna molécula de ácido nucleico particular es al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 % ó 99 % idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos expuesta en las figuras Ia y B (SEC ID NO: 1), figuras 20a y B (SEC ID NO: 19), ó a la secuencia de nucleótidos de los clones de cDNA depositados puede ser determinado convencionalmente utilizando programas de cómputo conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Seqúense Análisis Package, Versión 8 para Unís, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Sciencee Drive, madison, Wl 53711) . Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se utiliza Bestfit ó cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular e, por ejemplo, 95 % idéntica a una secuencia de referencia conforme a la presente invención, los parámetros son colocados , por supuesto, de tal modo que el porcentaje de identidad se calcula sobre la extensión total de la secuencia de nucleótidos de referencia y que son permitidos intervalos en homología de hasta 5 % del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
En una modalidad específica, la identidad entre una secuencia de referencia (de consulta) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia que se somete a alineación, también mencionada como una alineación de secuencias global, se determina utilizando el programa de cómputo FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y colaboradores ( Comp . App. Bi osci . 6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos utilizados en una alineación por FASTDB de secuencias de DNA para calcular el porciento de identidad son: Matriz= unitaria, k-tuplo=4, desventaja en desalíneo=l, Desventaja de juntas=30, Extensión del Grupo Aleatorizado=0, Calificación de Corte=l, Desventaja de intervalos=5, Desventaja del tamaño del intervalo, 0.05, Tamaño de la Ventana= 500 ó la extensión de la secuencia de nucleótidos sometida a la alineación, cualquiera es más corto. Conforme a esta modalidad, si la secuencia sometida a alineación es más corta que la secuencia de consulta a causa de las eliminaciones 5' ó 3', no a acusa de eliminaciones internas, se hace a los resultados una corrección manual para tomar en consideración el hecho de que el programa FASTDB no toma en cuenta truncaciones en 5' y 3' de la secuencia sometida a alineación cuando calcula el por ciento de identidad. Para secuencias sometidas a alineación truncadas en los extremos 5' ó 3' en relación a la secuencia de consulta, el por ciento de identidad es corregido por cálculo del número de bases de la secuencia de consulta que están en 5' y 3' de la secuencia sometida a alineación, 1 a cual no empareja/alinea, como un por ciento de las bases totales de la secuencia de consulta. Una determinación de si un nucleótido es emparejado/alineado se determina por los resultados del FASTDB de alineación de secuencias. Este porcentaje es sustraído del porciento de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificados, para llegar a una calificación de por ciento de identidad final. Esta calificación corregida es la que se usa para los propósitos de esta modalidad. Solamente las bases en 5' y 3' externas a las bases de la secuencia sometida, como se expuso para la alineación FASTDB, las cuales no emparejaron/alinearon con la secuencia de consulta, son calculados para los propósitos de ajustar manualmente la calificación de por ciento de identidad. Por ejemplo, una secuencia que se somete de 90 bases es alineada a una secuencia de consulta de 100 bases para determinar el por ciento de identidad. Las eliminaciones tienen lugar en los extermos 5' y 3' de la secuencia sometida y por consiguiente, la alineación FASTDB no muestra un emparejamiento/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5' . Las 10 bases impares representan el 10 % de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no emparejados/número total de bases en la secuencia de consulta) así, 10 % se resta de la calificación de porciento de identidad calculado mediante el programa FASTDB. Si las 90 bases remanentes fueron perfectamente emparejadas el por ciento de identidad total sería de 90 % . En otro ejemplo, una secuencia sometida a la alineación, de 90 bases se compara con una secuencia de consulta de 100 bases. Esta vez las eliminaciones, son eliminaciones internas de modo que no hay bases en los extremos 5' ó 3' de la secuencia sometida a alineación que no estén empare adas/alineadas con la de consulta. En este caso el por ciento de identidad calculado por DASTDB no es corregido manualmente. De nuevo, solamente bases 5' y 3' de la secuencia que se somete a alineación los cuales no están emparejados/alineados con la secuencia de consulta por lo que son manualmente corregidas. Ninguna otra corrección manual se hace para propósitos de esta modalidad.
En modalidades adicionales, la presente invención está dirigida hacia polinucleótidos que tienen al menos 90 % y más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con un polinucleótido que codifica al polipéptido de la SEC ID NO: 2 así como también a fragmentos del mismo, dichos fragmentos tienen al menos 30 bases y preferiblemente al menos 50 bases y a polipéptidos codificados por tales polipéptidos.
En modalidades adicionales, la presente invención está dirigida a polinucleótidos que tienen al menos un 70 % de identidad, preferiblemente al menos 90 % y más preferiblemente al menos 95 % de identidad con un polinucleótido que codifica al polipéptido de la SEC ID NO: 20 así como también fragmentos del mismo, dichos fragmentos tienen al menos 30 bases y preferiblemente al menos 50 bases y a polipéptidos codificados por tales polinucleótidos .
La presente solicitud está dirigida hacia moléculas de ácido nucleico al menos 70 %, 80 %, 90 , 95 , 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % idénticas a la secuencia de polinucleótidos expuesta en las figuras ÍA y B (SEC ID NO: 1), figuras 20a y B (SEC ID NO: 19), ó a la secuencia de ácidos nucleicos de los clones de cDNA depositados, ó fragmentos de la misma, independientemente de si codifican a un polipéptido que tiene actividad funcional de TNF-gama. Esto sucede igual en donde una molécula de ácido nucleico particular no codifica a un polipéptido que tiene actividad funcional de TNF-gama, un experto en la materia sabría como usar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, cuando una sonda de hibridización ó un iniciador de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican a un polipéptido que tiene actividad funcional TNF-gama incluyen, ínter. Alia, (1) aislar al gen de TNF-gama ó variantes alélicas del mismo en un acervo de cDNA; (2) hibridización in si tu (por ejemplo, "FISH") en la metafase de propagación cromosómica para proporcionarlocalizaciones cromosómicas precisas del gen de TNF-gama, como se describe en Verma y colaboradores, Human Chromosomes : A Manual of Basi c Techniques, pergamon Press, N.Y. (1988); y (3) análisis por Manchado Northern para detectar la expresión de mRNA de T?F-gama en tejidos específicos.
Se prefiere, sin embargo, moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ó 99 % idénticas a la secuencia de ácido nucleico de las figuras ÍA y B (SEC ID ?O: 1), figuras 20a y B (SEC ID ?O: 19) , ó a la secuencia de ácido nucleico de los clones de cDNA depositados, ó fragmentos de la mismas, la cual, de hecho, codifica a un polipéptido que tiene actividad funcional TNF-gama. Por un "polipéptido que tiene actividad funcional TNF-gama" se pretende polipéptidos que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica a una actividad del polipéptido TNF-gama de la invención (ya sea la proteína de extensión total ó, preferiblemente, la proteína madura) , como se determinó por medio de un inmunoensayo y/ó ensayo biológico particular. Por ejemplo, la actividad de TNF-gama puede determinarse utilizando un ensayo de apoptosis que se describe en el Ejemplo 7, por determinación de la capacidad relatica de TNF-gama para inhibir la formación inducida por FGF-2 de la formación de estructuras tubulares parecidas a capilares en cultivos de células ABAE que se describe en detalle en el Ejemplo 9 ó en ensayos por angiogénesis de membrana corioalantoica (CAM) que se describe en el ejemplo 10, por sus efectos sobre la activación de NF-kB celular y cinasa c-Jun (JNK) que se describe en el Ejemplo 12, y de varias maneras adicionales descritas en los Ejemplos restantes y en la especialidad.
Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, un experto en la materia ordinario reconocerá inmediatamente que un gran numero de las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 , 97 % , 98 %, ó 99 % idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos del cDNA depositado ó la secuencia de ácidos nucleicos de las figuras 1A y IB (SEC ID NO: 1), figuras 20A y 20B (SEC ID NO: 19), ó fragmentos de las mismas, codificará a un polipéptido "que tiene actividad TNF-gama". De hecho, puesto que las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican todas al mismo polipéptido, en muchos casos, ésto será claro para el experto en la materia igualmente sin efectuar los ensayos anteriormente descritos. Se reconocerá adicionalmente en la materia que, para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará a un polipéptido que tiene actividad TNF-gama. Esto es porque los expertos en la materia están completamente enterados de las substituciones de aminoácidos que son ya sea menos similares ó no similares para efectuar significativamente la función de la proteína, (por ejemplo, reemplazar un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático) . Por ejemplo, la Guía concerniente a como hacer substituciones de aminoácidos silenciosas fenotípicamente se proporciona en J.U. Bowie y colaboradores, "Decipherins the Message in Protein Seguences : Tolerance to Amino Acid Substi tutions ", Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que las proteína son sorprendentemente tolerantes de las substituciones de aminoácidos.
Modalidades adicionales de la invención están dirigidas a aislar moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TNF-gama (por ejemplo un fragmento de polipéptido TNF-gama descrito en la presente) que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una substitución de aminoácidos conservadora, pero no más de 50 substituciones de aminoácidos conservadoras, igualmente más preferiblemente, no más de 40 substituciones de aminoácidos conservadoras, aún más preferiblemente, no más de 30 substituciones de aminoácidos conservadoras, y aún igualmente más preferiblemente no más de 20 substituciones de aminoácidos conservadoras, 10-20 substituciones de aminoácidos conservadoras, 5-10 substituciones de aminoácidos conservadoras, 3-5 substituciones de aminoácidos conservadoras, ó 1-3 substituciones de aminoácidos conservadoras. Por supuesto que, a fin de que la preferencia aumente siempre, es altamente preferible para un polinucleótido que codifica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama tener una secuencia de aminoácidos que contenga no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ó una substitución de aminoácidos conservadora.
Ensayos con Polinucleótidos La invención también abarca el uso de los polinucleótidos TNF-gama para detectar polinucleótidos complementarios tales como, por ejemplo, como un reactivo de diagnóstico para detectar enfermedades ó susceptibilidad a enfermedades relacionadas con la presencia deTNF-gama-alfa ó TNF-gama-beta mutadas. Tales enfermedades están relacionadas con una sub-expresión de TNF-gama-alfa ó de TNF-gama-beta, tales como, por ejemplo, proliferación celular anormal tales como tumores ó cánceres.
Los individuos que llevan mutaciones en el gen de TNF-gama humano pueden ser detectados en el nivel de DNA por medio de una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para diagnosis pueden obtenerse de unas células de pacientes, tales como de la sangre, orina, saliva, biopsia de tejido y material de autopsia. El DNA genómico puede usarse directamente para detección ó puede ser amplificado enzimáticamente por utilización de PCR (Saiki y colaboradores, Na ture, 324: 163-166 (1986)) previo al análisis. El RNA ó cD?A puede también usarse para el mismo propósito. Como un ejemplo, iniciadores de PCR complementarios al ácido nucleico que codifica a TNF-gama-alfa ó TNF-gama-beta pueden utilizarse para identificar y analizar mutaciones de TNF-gama. Por ejemplo, eliminaciones e inserciones pueden detectarse por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Se pueden identificar puntos de mutaciones por hibridización del DNA amplificado a RNA de TNF-gama radiomarcado ó alternativamente, secuencias de DNA antisentido de TNF-gama. Se pueden distinguir secuencias perfectamente emparejadas de dupletos desalineados ó disparejos por digestión de la RNasa A ó por diferencias en temperaturas de fusión.
Verificaciones genéticas basadas en diferencias de secuencias de D?A pueden lograrse por detección de alteración en la movilidad de los fragmentos de D?A en geles con ó sin agentes desnaturalizantes. Se pueden visualizar eliminaciones e inserciones en secuencias pequeñas por electroforesis de alta resolución sobre gel. Fragmentos de D?A de secuencias diferentes pueden distinguirse sobre geles en gradiente de formamida desnaturalizante en la cual las movilidades de diferentes fragmentos de D?A se retardan en el gel a diferentes posiciones conforme a sus temperaturas de fusión específica y de fusión parcial (ver, por ejemplo, Myers y colaboradores, Science, 230:1242 (1985)).
Pueden revelarse cambios en la secuencia en localizaciones específicas por ensayos de protección de la nucleasa, tales como protección de RNasa y Sl ó por el método de fragmentación química (por ejemplo, Cotton y colaboradores, ONAS, USA, 85:4397-4401 (1985)).
Así la detección de una secuencia de DNA específica puede lograrse por métodos tales como hibridización, protección de RNasa, fragmentación química, formación de secuencias de DNA directa ó el uso de enzimas de restricción, (por ejemplo, "Polimorfismos en la Extensión de los Fragmentos de Restricción (RFLP)) y manchado Southern de DNA genómico.
Además de electroforesis sobre gel y formación de secuencias de DNA más convencionales las mutaciones se pueden detectar por análisis in si tu .
Los depósitos mencionados en la presente se conservaran bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Micro-organismos para propósitos de Procedimientos de Patentes.
Estos depósitos se proporcionan meramente como conveniencia a los expertos en la materia y no son una admisión, que se requiere un depósito bajo 35 U.S.C. § 112. La secuencia de los polinucleótidos contenida en los materiales depositados, así como también la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados con ella, se incorporan a la presente como referencia y son testigos de control en el evento de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias de la presente. Se puede requerir una licencia para hacer uso ó vender los materiales depositados, y ninguna licencia tal es con esto garantizada.
Vectores y Células Huéspedes La presente invención también concierne a vectores que incluyen a los polinucleótidos aislados de la presente invención, células huéspedes que son diseñadas genéticamente con los vectores recombinantes, ó que son de otro modo diseñados para producir a los polipéptidos de la invención, y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.
Las células huéspedes diseñadas genéticamente (transducidas ó transformadas ó transfectadas) con los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo un vector de clonación ó un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huéspedes diseñadas pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados de modo apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes ó amplificar los genes de TNF-gama. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y las similares, son las previamente usadas con las células huéspedes seleccionadas para expresión, y será obvio para los expertos en la materia.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, el polinucleótido puede ser incluido en uno cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de DNA cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; DNA de fagos; baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de DNA de plásmidos y de fagos, DNA virales tales como del virus de la vacuna de la viruela, adenovirus, virus pustular aviar, y pseudorabias . Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector mientras que sea replicable y viable en el huésped.
La secuencia de DNA apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de DNA se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado por procedimientos conocidos en la especialidad. Tales procedimientos y otros se cree que están al alcance de los expertos en la materia.
La secuencia de DNA en el vector de expresión está operablemente asociado con unas secuencias de control de expresión apropiadas (promotoras) para dirigir la síntesis de mRNA. Como ejemplos representativos de tales promotores, puede mencionarse: promotores de LTR ó SV40, el promotor lac ó trp de E. coli, el del fago lambda P y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procarióticas ó eucarióticas ó sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de enlace de ribosoma para iniciación de traslación y un finalizador de transcripción. Ei vector puede también incluir secuencias apropiadas para amplificar expresión.
Además, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno ó más genes marcadores seleccionables para proporcionar una característica fenotípica para seleccionar células huéspedes transformadas tales como dihidrofolato reductasa ó de resistencia a la neomicina para cultivo celular eucariótico, ó tales como de resistencia a la tetraciclina ó ampicilina en E. coli .
El vector que contiene la secuencia de DNA apropiada como se describió anteriormente, así como también una secuencia de control ó promotora apropiada, puede emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir al huésped expresar a la proteína.
Como ejemplos representativos de huéspedes apropiadas, puede mencionarse: células bacterianas, tales como E. coli , Streptomyces, Salmonella typhimuri um; células fúngicas, tales como levaduras; células de insectos tales como Drosophila S2 y Sf9; células de animales tales como CHO, COS ó de melanoma Bowes, adenovirus, células de plantas, etc. La selección de un huéped apropiado se cree que está al alcance de los expertos en la materia. De lo expuesto en la presente.
Más particularmente, la presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una ó más de las secuencias que se describieron ampliamente anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un vector plásmido ó viral, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en orientación directa ó contraria. En un. aspecto preferido de esta modalidad, la construcción comprende adicionalmente secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, un promotor, operablemente asociado con la secuencia. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y promotores adecuados y están comercialmente disponibles. Los siguientes vectores se proporcionan a manera de ejemplo. Bacterianos: pHE4-5 (No. de Acceso a ATCC: 209311; y variaciones del mismos.) , pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen) , pBS, pDlO, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNHlßa, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia) . EucarióticospWLNEO, PSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia) . Sin embargo puede ser utilizarse cualquier otro vector ó plásmido mientras que sean replicables y viables en el huésped. Pueden seleccionarse regiones promotoras de cualquier gen deseado utilizando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son PKK232-8 y PCM7. Promotores bacterianos particularmente mencionados incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P, P y trp. Promotores eucarióticos incluyen CMV precoz inmediato, cinasa de timidina HSV, SV40 precoz y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está al nivel de los expertos en la materia ordinarios.
En una modalidad adicional, la presente invención concierne a células huéspedes que contienen las construcciones anteriormente descritas. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, ó una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, ó la célula huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped puede efectuarse por transfección de fosfato de calcio, transfección media por DEAE-dextrano, ó electroporación. (Davis, L. Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Además para abarcar también las células huéspedes que contienen las construcciones de vectores discutidas en la presente, la invención también abarca células huéspedes primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, particularmente de origen mamífero, que han sido diseñadas para eliminar ó reemplazar material genético endógeno (por ejemplo, secuencia codificante TNF-gama) y/ó para incluir material genético (por ejemplo, secuencias de polinucleótidos heterólogas) que están operablemente asociadas con TNF-gama de la invención, y que activan, alteran, y/ó amplifican polinucleótidos TNF-gama endógenos. Por ejemplo, técnicas conocidas en la materia se pueden usar para asociar operablemente regiones de control heterólogas (por ejemplo, promotoras y/ó mej oradoras) y secuencias de polinucleótidos TNF-gama endógenas vía recombinación homologa (ver, por ejemplo, Patente USA No. 5,641,670, publicada en Junio 24 de 1997; Publicación Internacional No. WO 96/29411, publicada en Septiembre 26 de 1996; Publicación Internacional No. WO 94/12650 publicada en Agosto 4 de 1994; Koller y colaboradores Proc . Nati . Acad. Sci . USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra y colaboradores, Na ture 342: 435-438(1989), la descripción de cada una de ellas se incorporan en su totalidad como referencias) .
Las construcciones en células huéspedes pueden usarse de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos sintéticamente por sintetizadores de péptidos convencionales.
Las proteínas maduras pueden ser expresadas en células de mamíferos, levaduras, bacterias, u otras células bajo el control de los promotores apropiados. Sistemas de traslación libres de células pueden emplearse para producir tales proteínas utilizando RNAs derivados de las construcciones de D?A de la presente invención. Vectores de clonación y de expresión apropiados para uso con huéspedes procarióticos y eucarióticos son descritos por Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor, ?.Y., (1989), la descripción de la cual es incorporada a la presente como referencia.
La transcripción del D?A que codifica a los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores es aumentada por inserción de una secuencia mejoradora en el vector. Mejoradores son los elementos de D?A que actúan cis, usualmente aproximadamente de 10 a 300 bp que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Ejemplos que incluyen el mejorador SV40 sobre el lado tardío del origen de réplica 100 a 270 bp, un mejorador del promotor precoz de citomegalovirus, el mejorador de polioma sobre el lado tardío del origen de réplica, y mejoradores de adenovirus.
Generalmente, vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de réplica y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped, por ejemplo, los genes de resistencia a la penicilina de E. coli y el gen de TRPI de S. Cerevisiae, y un promotor derivado de un gen expresado altamente en la transcripción directa de una secuencia estructural en 3' . Tales promotores pueden derivarse de operones que codifican a enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato Cinasa (PGK) , factor-a, fosfatasa acida, ó proteínas que se conmocionan con el calor , entre otras. La secuencia estructural heteróloga es conjuntada en la fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de traslación, y preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína trasladada en el espacio periplásmico ó medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia hetróloga puede codificar a una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N-terminal que imparte las características deseadas, por ejemplo, estabilización ó purificación simplificada del producto recombinante expresado.
Vectores de expresión útiles para uso bacteriano son construidos por inserción de una secuencia de DNA estructural que codifica a una proteína deseada junto con indicadores de iniciación y terminación de la traslación adecuados en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno ó más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de réplica para asegurar el mantenimiento del vector y para, si se desea, proporcionar amplificación en el huésped. Huéspedes procarióticos adecuados para transformación incluyen E. coli , Bacill us substilis, Samonella typhimuri um, y varias especies en el género pseudomonas , Streptomyces, y Staphyl ococcus, aunque otros pueden también ser empleados como material de selección.
Como un ejemplo representativo, pero no limitante, vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable, y origen de réplica bacteriano derivado de plésmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación muy conocido pBR322 (ATCC 37017) . Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y GEMÍ (Promega Biotec, madison, Wl, USA) . Estas secciones "principales" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural es expresada.
A continuación de la transformación de la cepa huésped adecuada y crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular apropiada, se induce al promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura ó inducción química) y las células se cultivan por un período adicional. Las células se cosechan típicamente por centrifugación, desintegradas por medios físicos ó químicos, el extracto crudo resultante se retiene para purificación adicional.
Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser desintegradas por cualquier método conveniente, que incluyen ciclo de congelamiento-descongelamiento, sonicación, disrupción mecánica, ó uso de agentes lisadores celulares, talee métodos son muy conocidos por los expertos en la materia.
Varios sistemas de cultivo de células de mamíferos pueden emplearse también para expresar proteínas recombinantes. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175 (1981)), y otras líneas celulares capaces de expresar a un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de réplica, un promotor y mejorador adecuados, y también cualquier sitio de enlace de ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios de unión donantes y receptores, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias no transcritas colaterales a 5' . Las secuencias de DNA derivadas de la unión de SV40, y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos .
Los polipéptidos TNF-gama pueden recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes por métodos que incluyen precipitación con etanol ó sulfato de amonio, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico ó catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía a la lectina. Las etapas de redoblamiento de las proteínas, pueden usarse cuando sea necesario, en completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) puede emplearse en las etapas finales de purificación.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente ó un producto de procedimientos sintéticos químicos, ó producidos por técnicas recombinantes de un huésped procariótico ó eucariótico (por ejemplo, por células bacterianas, de levaduras, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos en cultivo) . Dependiendo de la célula huésped empleada en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados ó no glicosilados. Los polipéptidos de la invención pueden también incluir un residuo de aminoácido metionina inicial.
La invención abarca polipéptidos TNF-gama-alafa y TNF-gama-beta que son diferencialmente modificados durante ó después de traslación, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos de protección/bloqueadores conocidos, fragmentación proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo ó a otro ligando celular, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, que incluyen pero no se limitan a fragmentación química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4; acetilación formilación, oxidación, recucción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.
Además, polipéptidos de la invención pueden sintetizarse químicamente utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Por ejemplo, un péptido que corresponde a un fragmento de los polipéptidos TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta de la invención puede sintetizarse por utilización de un sintetizador de péptidos. Además, si se desea, minoácidos no clásicos ó análogos químicos de aminoácidos pueden introducirse como una substitución ó adición en la secuencia tardía. Aminoácidos no clásicos incluyen pero no se limitan a los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido 2, 4-diaminobutírico, ácido a-a ino isobutítico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino bitírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homoctrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, aminoáqcidos fluorados, aminoácidos constructores tales como aminoácidos b-metilados, aminoácidos sódicos metilados, aminoácidos calcicos metilados, y análogos de aminoácidos en general. Además, los aminoácidos pueden ser D (dextrorotatorio) ó L (levorotatorio) .
Al menos quince construcciones de expresión de TNF-gama-alfa han sido generados por los inventores de la presente para facilitar la producción de los polipéptidos TNF-gama de varios tamaños y en varios sistemas. De estos, se han construido cuatro que codifican al polipéptido TBF- gama de extensión total. Las construcciones de extensión total son: (i) pQE9TNFg-27/147, (ii) pQE70TNFg, (iii) pCITNFg, y pcDNA3TNFg. En el caso de la primera construcción de expresión enlistada (pQE9TNFg-27/147) , la construcción se usó para producir un polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total con un tag de aminoácido seis histidina N- terminal conforme al método del Ejemplo 1. Un polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total que carece del tag de histidina se produjo en bacterias por utilización de la construcción pQE70TNFg esencialmente como se dá en el Ejemplo 1. Además,, un polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total que carece del tag de histidina se produjo en células de mamíferos por utilización de ya sea la construcción pCITNFg ó bien pcDNA3TNFg conforme al método del ejemplo 3. Adicionalmente el polipéptido TNF-gama-alfa maduro se produjo y secretó desde células de mamíferos bajo la dirección del péptido indicador interleucina (IL)-6 desde una construcción denominada pcDNA3/IL6TNFg-l/149 (ver el ejemplo 11). Las construcciones de expresión de TNF-gama-alfa se usaron para expresar varias muteínas de TNF-gama desde sistemas bacterianos baculoviralee y de mamíferos. Cuatro mutaciones por eliminación N- terminales se generaron utilizando el vector de expresión bacteriano PQE60. Estas construcciones de mutaciones por eliminación N- terminales son: (i) pQE60TNFg-3/147 (que representa un posible polipéptido TNF-gama maduro; el polipéptido expresado por esta construcción es idéntico a los residuos de aminoácidos 107-251 del TNF-gama-beta de la SEC ID NO: 20), (ii) pQE60TNFgl2/147 (que representa los residuos de aminoácidos 12-147 de la SEC ID NO: 2 y los residuos 116-251 de la SEC ID NO:20), (iii) pQE60TNFg22/147 (que representa los residuos de aminoácidos 22-147 y los residuos 126-251 de la SEC ID NO: 20), y (iv) pQE60TNFg28/147 (que representa los residuos de aminoácidos 28-147 y los residuos 132-251 de la SEC ID NO: 20) . Cada una de estas construcciones de expresión pueden usarse para producir un polipéptido TNF-gama en un sistema bacteriano que exhibe una eliminación N terminal de los aminoácidos 25, 39, 49, y 55 , respectivamente, con respecto al polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total ó una eliminación N- terminal de los aminoácidos 106, 115, 125, y 131 , respectivamente con respecto al polipéptido TNF-gama-beta de extensión total.
Adicionalmente se generaron construcciones de expresión bacteriana de mutaciones por eliminación N-terminal. Una construcción llamada pHE4 VEGI T30-L174 se generó utilizando el vector de expresión bacteriana pHE4 para expresar los aminoácidos treonina-30 a leucina-174 de la secuencia de TBF-gama-alfa de las fisuras Ia v B (residuos treonina-3 a leucina-147 de la SEC ID NO: 2) que corresponden exactamente a los residuos de aminoácidos treonina-107 a leucina-251 de la secuencia de TNF-gama-beta de las figuras 20A. y 20B (residuos treonina-107 a leucina-251 de la SEC ID NO:20). Construcciones de expresión bacteriana adicionalmente generadas incluyen pQE9.VEGI.his.T28-L174, pHE4.VEGI . 28-L174, pHE4..VEGI . T51-L174, y pHE4.V?GI.T58-L174. Estas construcciones están basadas ya sea en el vector de expresión bacteriana pQE9 ó bien en el pHE4. La designación de las construcciones indican, el vector de expresión, el nombre del gen, y los residuos de aminoácidos expresados por la construcción (por ejemplo pQE9.VEGI .T28-L174 indica que el vector de expresión bacteriana pQE9 es usado para expresar los aminoácidos treonina (T) 28 hasta leucina (D-174 del polipéptido TNF-gama-alfa (VEGI es una designación de laboratorio para TNF-gama-alfa) ) .
Se generó una construcción de expresión de TNF-gama-alfa que puede ser usada para producir un polipéptido TNF-gama maduro secretado desde un sistema de mamíferos. La construcción se ha designado pCl/IL6TNFg-3/147. Codifica al péptido indicador del gen de IL-6 humano fusionado a la secuencia de TNF-gama maduro. Se generó una construcción similar que contiene el péptido indicador de CK-b8 (aminoácidos -21 a -1 de la secuencia de CK-b8 descrita enla solicitud de PCT publicada PCT/US 95/09058; registrada el 6/23/95) fusionado al terminus amino de los aminoácidos 12-149 de TNF-gama-alfa (SEC ID NO: 2; que son los aminoácidos 116-251 de TNF-gama-beta (SEC ID NO: 20) ) en el contexto del vector de expresión de mamíferos pC4. Esta construcción se designó pC4/CK-b8TNFgl2/147. Se generó una variante de esta construcción que puede ser usada para expresar a los aminoácidos 12-147 de TNF-gama fusionada a la región IgG Fc en el terminus carboxi de TNF-gama . esta proteína de fusión es también secretada bajo la dirección del péptido indicador de CK-b8 y se designó pC4/CK-b8TNFgl2/147/Fe . La secuencia de la porción Fc humano de la molécula de fusión se expone en la SEC ID NO: 18. Podrían usarse otras secuencias conocidas por los expertos en la materia.
Los aminoácidos -3 a 147 de TNF-gama-alfa (SEC ID NO: 2; que corresponden a los residuos de aminoácidos 102 a 251 de TNF-gama-beta (SEC ID NO: 20) ) pueden ser expresados y secretados desde un sistema de baculovirus por utilización de una construcción designada pA2GPTNFg-3/147. Esta construcción de expresión codifica al TNF-gama maduro que codifica a la secuencia fusionada en su terminus amino al péptido indicador GP baculoviral.
Se generaron dos construcciones de expresión de TNF-gama retrovirales. El primero de éstos se designó pGISamEN/Tnfg. -3/149. esta construcción de expresión puede usarse para producir la proteína TNF-gama de extensión total desde un sistema de mamíferos. Se generó una construcción relacionada, pGlSamEN/CK-b8TNFgl2/149, que puede usarse para producir y secretar una proteína TNF-gama madura desde un sistema de mamíferos bajo la dirección del péptido indicador CK-b8.
Polipéptidos adicionales de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen al menos 90 % de similitud, más preferiblemente al menos 95 % de similitud, y aún más preferiblemente al menos 96 %, 97 %, 98 %, ó 99 % de similitud con los descritos anteriormente. Los polipéptidos de la invención también comprenden los que son al menos 80 % idénticos, más preferiblemente al menos 90 % ó 95 % idénticos, aún más preferiblemente al menos 96 %, 97 % , 98 % ó 99 % idénticos al polipéptido codificado por el cDNA depositado ó al polipéptido de la SEC ID NO: 2, y también incluye porciones de tales polipéptidos con al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos .
Polipéptidos y Fragmentos La presente invención concierne adicionalmente a un polipéptido TNF-gama-alfa aislado que tiene al secuencia de aminoácidos deducida de las figuras ÍA y B (SEC ID ?O: 2) ó que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el cD?A depositado HVE091, así como también, análogos y derivados de tal polipéptido.
La presente invención también concierne a un polipéptido T?F-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras 20A y B (SEC ID ?O: 20) ó que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el cD?A depositado HMCZ56, así como también fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido.
Los polipéptidos y polinucleótidos de pa presente invención se proporcionan preferentemente en forma aislada, y preferiblemente son purificados hasta un punto en el rango de casi completa (por ejemplo > 90 %) ó hasta completa homogeneidad (por ejemplo > 99 % puro) . El término "aislado" significa que el material es retirado de su ambiente original (por ejemplo ambiente natural si es encontrado naturalmente) . Por ejemplo, un polinucleótido ó polipéptido encontrado naturalmente presente en animal viviente no es aislado, pero el mismo polinucleótido ó polipéptido, separado de uno ó de todos los materiales con los que coexiste en el sistema natural, es aislado. También se pretende que un "polipéptido aislado" son polipéptidos que se han purificado parcial ó substancialmente desde una célula huésped recombinante.. Por ejemplo, una versión producida recombinantemente de un polipéptido TNF-gama puede ser purificado substancialmente por el método de una etapa descrito por Smith y Johnson (Gene 67:31-40 (1988)). Tales polinucleótidos podrían formar parte de un vector y/ó tales polinucleótidos ó polipéptidos podrían formar parte de una composición, y aún estar aislados de modo que el vector ó composición tal no es parte de su ambiente natural. Polipéptidos y polinucleótidos aislados conforme a la presente invención también incluyen tales moléculas producidas natural ó sintéticamente. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también pueden purificarse desde fuentes naturales ó recombinantes utilizando anticuerpos anti-TNF-gama de la invención en métodos de purificación de proteínas que son muy conocidos en la especialidad.
Los términos "fragmento". "derivado" y "análogo" cuando se refiere a los polipéptidos de las figuras Ia y IB ó a las figuras 20A y 20B, y los polipéptidos codificados por por los cDNAs depositados, significa un polipéptido que conserva una actividad funcional TNF-gama, por ejemplo, despliega una ó más actividades funcionales asociadas con un polipéptido TNF-gama maduro y/ó de extensión total descrito en las figuras ÍA y B (SEC ID NO: 2), figuras 20a y B (SEC ID NO: 20) , y/ó codificado por uno ó ambos de los clones depositados (HUVE091 y HEMCZ56) . Como un ejemplo tales fragmentos, derivados ó análogos, que tienen la inmunogenicidad ó antigenicidad deseada pueden usarse, por ejemplo en inmunoensayos, para inmunización, para inhibición de la actividad de TNF-gama, etc. Así una modalidad específica de la invención concierne a un fragmento TNF-gama que puede ser enlazado por un anticuerpo que enlaza específicamente a la secuencia del polipéptido TNF-gama descrita en las figuras ÍA y B (SEC ID NO:2), figuras 20 y B (SEC ID NO: 20), y/ó que es codificado por uno ó ambos de los clones depositados (HUVE091 y HEMCZ56) .
Como otro ejemplo, se proporcionan los fragmentos, derivados ó análogos de TNF-gama que tienen actividad biológica de TNF-gama (por ej emplo, polipétido TNF-gama maduro ó la región extracelular de un polipéptido TNF-gama-beta) . Los fragmentos, derivados, y análogos de TNF-gama que conservan, ó alternativamente carecen de una propiedad de interés de TNF-gama deseada (por ejemplo, inhibición de proliferación celular, inhibición de tumor, inhibición de angiogénesis, anti-artritis por la inhibición de angiogénesis y/ó proliferación celular endotelial asociada con pannus invasor en hueso y cartílago, un inductor de NFkB y cinasa c-Jun ( JNK) , n inductor de adhesión celular y como un inductor de apoptosis (ver Ejemplos, particularmente los Ejemplos 12-15) ) pueden ser usados como inductores ó inhibidores, respectivamente, de tales propiedades y sus correlacionados fisiológicamente.
Los polipéptidos de la invención pueden existir como un receptor de enlace de membrana que tiene una región transmembrana y una región intra- y extracelular pueden existir en forma soluble en donde falta la región transmembrana. Un ejemplo de una forma tal de TNF-gama es el polipéptido TNF-gama-beta de las figuras 20A y B (SEC ID NO: 20) que contiene una región transmembrana, intracelular y extracelular.
Se reconoce en la especialidad que algunas secuencias de aminoácidos del polipéptido TNF-gama pueden variar sin efecto significativo de la estructura ó función de la proteína. Si se contempla tales diferencias en las secuencias, se recordará que habrá áreas críticas en la proteína que determinan la actividad. Así, la invención incluye adicionalmente variaciones del polipéptido TNF-gama que exhiben actividad substancial de polipéptido TNF-gama ó que incluyen regiones de la proteína TNF-gama como los fragmentos de polipéptido expuestos en la presente. Tales variantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y substituciones tipo seleccionadas conforme a las reglas generales conocidas en la materia, de modo que tienen poco efecto sobre la actividad.
Por ejemplo, guías que conciernen a cómo hacer substituciones de aminoácidos silenciosas fenotípicamente se proporciona en la presente, los autores indican que hay dos procedimientos principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos para cambiar (Bowie y colaboradores, Sci ence 247:1306-1310 (1990)). El primer método depende del proceso de evolución, en el cual las mutaciones son ya sea aceptadas ó rechazadas por selección natural. El segundo procedimiento usa ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y selecciona ó separa para identificación de secuencias que conservan la funcionalidad. Como establecen los autores, estos estudios revelaron que las proteínas son sorprendentemente tolerantes de las substituciones de aminoácidos. Los autores adicionalmente indican que los cambios en los aminoácidos son probablemente permitidos en una cierta posición de la proteína. Por ejemplo, residuos de aminoácidos en su mayoría enmascarados requieren cadenas laterales no pelares, mientras que generalmente, se conservan pocas características de cadenas laterales superficiales. Otras substituciones silenciosas fenotípicamente son descritas por Bowie y colaboradores (supra) y las referencias citadas en la presente. Típicamente se observa que substituciones conservadoras son los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e lie; intercambio de los residuos hidroxilo Ser y Thr, intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, substituciones entre los residuos amida Asn y Gln, intercambio de los residuos básicos Lys y Arg y reemplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr.
Así, el fragmento, derivado ó análogo del polipéptido de la SEC ID NO: 2, ó de la SEC ID NO: 20, ó los codificados por los cDNAs depositados, pueden ser (i) uno en el cual uno ó más de los residuos de aminoácidos se substituyen con un residuo de aminoácido conservado ó no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido substituido puede ser ó puede no ser codificado a un lado del código genético, ó (ii) uno en el cual uno ó más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo substituyente, ó (iii) uno en el cual la forma madura del polipéptido TNF-gama está fusionada con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilen glicol) , ó (iv), uno en el cual los aminoácidos adicionales están fusionados a la forma anterior del polipéptido, tal como un péptido con región de fusión IgGFc ó secuencia líder ó secretora ó una secuencia que se emplea para purificación de la forma anterior del polipéptido ó una secuencia de proproteínas. Tales fragmentos, derivados y análogos se cree que están al alcance de los expertos en la materia de lo expuesto en la presente.
Así, el TNF-gama de la presente invención puede incluir una ó más substituciones, eliminaciones ó adiciones de aminoácidos, ya sea de mutaciones naturales ó bien de manipulaciones humanas. Como se indicó, los cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, tal como substituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente la dualidad funcional ó actividad de la proteína (ver la Tabla 1) .
TABLA 1. Substituciones de aminoácidos Conservadoras Aromática Fenilalanina Triptofano Tirosina Hidrofóbica Leucina Isoleucina Valina Polar Glutamina Aspargina Básica Arginina Lisina Histidina Acida Acido aspártico Acido glutámico Pequeña Alanina Serina Treonina Metionina Glicina Las modalidades de la invención están dirigidas hacia polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TNF-gama descrito en la presente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una substitución de aminoácidos conservadora, pero no más de 50 substituciones de aminoácidos conservadoras, igualmente más preferiblemente no más de 50 substituciones de aminoácidos conservadoras, igualmente más preferiblemente, no más de 40 substituciones de aminoácidos conservadoras, aún más preferiblemente, no más de 30 substituciones de aminoácidos conservadoras, y aún igualmente más preferiblemente, no más de 20 substituciones de aminoácidos conservadoras, en comparación con la secuencia del polinucleótido de TNF-gama descrito en la presente. Por supuesto, a fin de que la preferencia aumente siempre, es altamente preferible para un péptido ó polipéptido tener una secuencia de aminoácidos que comprenda la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama, que contenga al menns una, pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ó 1 substitución de aminoácidos conservadora.
En modalidades específicas adicionales, el número de substituciones, adiciones ó eliminaciones en la secuencia de aminoácidos de las figuras ÍA y B (SEC ID NO: 2), figuras 20A y B (SEC ID NO: 20), una secuencia de polipéptidos codificada por los clones depositados y/ó cualquiera de los fragmentos, de polipéptidos descritos en la presente (por ejemplo, ,1a región extracelular ó región intracelular) es 75, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, ó 150 150-50, 100-50, 50-20, 30-20, 20-15, 20-10, 15-10, 10-1, 5-10, 1-5, 1-3, ó 1-2.
Para mejorar ó alterar las características de los polipéptidos TNF-gama, se puede emplear ingeniería de proteínas. Puede utilizarse tecnología de DNA recombinante conocida por los expertos en la materia para crear nuevas proteínas mutantes ó muteínas que incluyen una sola ó substituciones, eliminaciones, adiciones múltiples de aminoácidos ó proteínas de fusión. Tales polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, actividad mejorada ó estabilidad aumentada. Además, pueden ser purificadas con rendimientos superiores y demostrar mejor solubilidad que el polipéptido natural correspondiente, al menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento.
Así, la invención también abarca derivados y análogos de TNF-gama que tienen uno ó más residuos de aminoácidos eliminados, adicionados, ó substituidos para generar polipéptidos TNF-gama que son mejor adaptados para expresión, aumentar a escala, etc., en las células huéspedes seleccionadas. Por ejemplo, residuos de cisteína pueden ser eliminados ó substituidos con otro residuo de aminoácido a fin de eliminar los puentes ó uniones disulfuro; sitios de glicosilación N-enlazados pueden alterarse ó eliminarse para lograr, por ejemplo, expresión de un producto homogéneo que es más fácilmente recuperado y purificado de huépedes levaduras que son conocidas por hiperglicosilar sitios N-unidos. Para este fin, una variedad de substituciones de aminoácidos a la vez ó ambas de la primera ó tercera posiciones de aminoácidos ó sobre una cualquiera ó más de las secuencias de reconocimiento de glicosilación en los polipéptidos TNF-gama de la invención, y/ó una eliminación de aminoácido en la segunda posición de una cualquiera ó más de tales secuencias de reconocimiento prevendrán la glicosilación del polipéptido TNF-gama en la secuencia tripéptida modificada (ver, por ejemplo, Miyajimo y colaboradores, EMBO J 5 (6) : 1193-1197) .
Los aminoácidos en la proteína TNF-gama de la presente invención que son esenciales para su función pueden identificarse por métodos conocidos en la especialidad. Tales como mutagénesis en sitio dirigido ó mutágenesis por exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). El procedimiento último procedimiento introduce solo mutaciones de alanina en cada residuo en la molécula. Las moléculas mutantes que resultan son entonces verificadas por actividad biológica tal como enlace de receptor ó actividad proliferadora in vi tro.
De especial interés son las substituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados ó neutrales que pueden producir proteínas con características deseables altamente mejoradas, tales como menos agregado. El agregado puede no solamente reducir la actividad sino también ser problemático cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, a causa de que los agregados pueden ser inmunogénicos (Pinckard y colaboradores, Clin. Exp. I munol . 2:331-340 (1967); Robín, y colaboradores, Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland, y colaboradores, Cri t . Rev. Therapeuti c Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)).
Puesto que TNF-gama es un miembro de la familia de proteínas relacionada con TNF, para modular preferentemente que se eliminen completamente las actividades biológicas de TNF-gama preferiblemente se hacen adiciones, substituciones, ó eliminaciones en secuencias que codifican a los aminoácidos en la región similar a TNF conservada, por ejemplo, en las posiciones 17-147 de la SEC ID NO: 2 ó en las posiciones 121-251 de la SEC ID NO: 20, más preferiblemente en los residuos en esta región que no se conservan en todos los miembros de la familia de proteínas relacionada con TNF (ver las figuras 2A-2C) . Forman también parte de la presente invención polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican a las variantes de TNF-gama anteriores.
Varios aminoácidos del polipéptido TNF-gama son altamente conservados a través de los miembros conocidos de la familia de proteínas relacionadas con TNF-gama. Por hacer una mutación específica en TNF-gama en residuos tales como tirosina-15 (como se numera en la SEC ID NO: 2), leucina-35, glicina-41, tirosina-43, tirosina-46, glutamina-48, leucina-90, leucina-116, glicina-119, ácido aspártico-120, fenilalanina-141, fenilalanina-142, y leucina-147, es probable que se observe un efecto notable sobre la actividad biológica. Estos residuos de aminoácidos idénticos estén, por supuesto, presentes en las posiciones correspondientes de TNF-gama-beta de la SEC ID NO: 20.
La presente invención también abarca fragmentos de los polipéptidos TNF-gama descritos anteriormente. Los fragmentos de polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos contenida en la SEC ID NO: 2, codificada por el cDNA contenido en el clon depositado (HUVE091), ó codificado por ácidos nucleicos que hibridizan (por ejemplo, bajo condiciones de severidad) a la secuencia de nucleótidos contenida en ,los clones depositados, que se muestran en las figuras ÍA y B (SEC ID NO: 1) y/ó figuras 20A y 20B (SEC ID NO: 19) , ó las cadenas complementarios de los mismos.
Los fragmentos de polipéptidos pueden estar en "reposo-libre" ó comprendidos en un 'polipéptido mayor del cual el fragmento forma una parte ó región, más preferiblemente como una sola región continua. Ejemplos representativos de fragmentos de polipéptidos de la invención incluyen por ejemplo, fragmentos que comprenden ó alternativamente, consisten de aproximadamente los residuos de aminoácidos, 1 a 20, 21 a 40, 41 a 60, 61 a 83, 84 a 100, 101 a 120, 121 a 140, 141 a 160, 160 a 167, 161 a 174, 161 a 180, 181 a 200, 201 a 2210, 221 a 240, 241 a 251 de la SEC ID NO: 2 y/ó la SEC ID NO: 20. Además, los fragmentos de polipéptidos pueden ser al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 aminoácidos de extensión. En este contexto "aproximadamente" significa que incluye los rangos particularmente mencionados, mayores ó menores por varios en ambos extremos .
En otras modalidades los fragmentos de polipéptidos de la invención (por ejemplo, . los descritos en la. presente) no son mayores de 250, 225, 200, 185, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140. 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 90, 80, 75, 60, 50, 40, 30 ó 25 residuos de aminoácidos de extensión.
Modalidades preferidas adicionales abarcan fra -üíentos de polipéptidos sue comprenden ó alternativamente consisten de, la región madura de TNF-gama-alfa (residuos de aminoácidos 1-147 de la SEC ID NO: 2) , la región intracelular de TNF—crama— eta -residuos de aminoácidos 1—35 de la SEC ID NO: 2 ^ í resión transmembrana de TNF— sama— beta (residuos de aminoácidos 36-61 de la SEC ID NO: 20), y/ó la resión extracelulsr óe TNF—,ama—beta 'residuos de aminoácidos 62-251 de la SE ID NO: 20) .
En modalidades específicas, fragmentos de polipéptidos de la invención comprenden,- ó alternativamente- consisten de, residuos de aminoácidos leucina-35 a valina-49, triptofano-104 a leucina—116,- "-Licina—119 a serina—127-lisin -139 a le?cina-147 de la SEC ID NO:21. Estas regiones de alta identidad identificadas por de los polipéptidos miembros de la familia de TNF de la.s figuras 2A, 2B y 2C.
Entre los fragmentos, preferidos especialmente de la invención están fragmentos caracterizados por atributos funcionales y estructurales de TNF-gama. Tales fragmentos incluyen residuos de aminoácidos que comprenden regiones alfa-helicoidal y formadoras de alfa-helicoidal ("regiones alfa"), regiones beta-laminar y formadoras de beta-laminar ("regiones beta") , regiones envolventes y formadoras de envolvente ("regiones envolventes", y regiones espirales y formadoras de espiral ("regiones espirales") , regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicae, y regiones de alto índice antigénico (por ejemplo, regiones de polipéptidos que consisten de residuos de aminoácidos que tienen un índice antigénico de ó igual a superior de 1.5, que se identifican urilizando los parámetros faltantes del programa Jameson-Wolf) de TNF-gama. Ciertas regiones preferidas son las descritas en la figura 17 e incluyen, pero no se limitan a, regiones de los tipos anteriormente mencionados identificadas por análisis de la secuencia de aminoácidos expuesta en las figuras 1A y B, tales regiones preferidas incluyen: regiones alfa, regiones beta, regiones envolventes, y regiones espirales predichas por Garnier-Robson; regiones alfa, regiones beta, regiones envolventes, y regiones espirales predichas por Chou-Fasman; regiones hidrofílicas e hidrofóbicae predichas por Kyte-Doolittle; regiones antipáticas alfa y beta de eieenberg; regiones formadoras de superficies , de Emini; y regiones de índice antigénico alto de Jameson-Wolf, que se predicen utilizando los parámetros faltantes de este programa de cómputo. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos son también abarcados por la invención.
Adicional ente, análogos de la invención incluyen una proporteína que puede ser activada por fragmentación de la porción proproteína para producir un polipéptido maduro activ . < n otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido TNF-gama /por ejemplo, fragmento) que comprende ó alternativamente consiste de, un polipéptido de la invención con una porción epítope de apoyo de la invención. El epítope de esta porción de polipéptido es un epítope inmunogénico ó antigénico. Un " epítope inmunogénico" es definido como una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es el inmunógeno. Por otro lado,- una región de una molécula de proteína a la cual un anticuerpo puede enlazar se define como un " epítope antigénico". El número de epítopes inmunogénicos de una proteína generalmente es menor que el número de epítopes antigénicos (ver, por ejemplo, Geysen, y colaboradores, Proc , Na ti - Acad. Sci . USA 81:3998-4002 .1 QP . \ .
En cuanto a la selección de polipéptidos ó polipéptidos relacionados con un epítope antigénico (por ejemplo que contiene una región de una molécula de proteína a la cual puede enlazar un anticuerpo) ,- es del conocimiento de los especialistas que péptidos sintéticos relativamente cortos que simulan parte de una secuencia de proteínas son rutinariamente capaces de producir un antis?ero que reacciona con la proteína imetizada parcialmente (ver, por ejemplo, Sutcliffe, J. G. y colaboradores, Science 219:660-666 (1983)). Péptidos capaces de provocar suero reactivo con la proteína son f ecuentemente representados en la secuencia primarias de una proteína, pueden ser caracterizados por un grupo de reglas químicas simples, y no son confinados a regiones inmunodominantes de proteínas intactas (por ejemplo epítopes inmunogénicos) ni a los 'éptidos y polipépi porción epítope antigénica de la invención son ,- por consiguiente útiles para aumentar anticuerpos,- incluyendo anticuerpos monoclonales, que enlazan específicamente a un .olipéptido de la invención (ver, o p pr-nlo. i .. n. colaboradores, Cell 37: 767-778 (1984)) Péptidos y polipéptidos con una porción epí ope antigénica de la invención preferiblemente contienen una secuencia de al menos siete, más preferiblemente al menos nueve y más preferiblemente entre aproximadamente 15 haeta 30 aminoácidos contenidos en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Ejemplos no limitantes de polipéptidos ó péptidos antigénicos que pueden ser usados para generar anticuerpos específicos TNF-gama incluyen: un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Thr hasta aproximadamente A.sn-32 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Ile-37 hasta aproximadamente Ile-45 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Met-54 hasta aproximadamente Arg-62 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproxi ada-nente Gln-63 best» aproximadamente Asp-71 en la SEC ID NQ: 2; un polipéptido que comprende residuos de atn ? no i dos -! r>? i mari-i n - r.i -.. hasta aproximadamente Gly-65 en la SEC ID NO: 2;un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Val-80 hasta aproximadamente Thr-88 en la SEC ID NO: 2; un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente Leu-116 hasta aproximadamente Val-124 en la SEC ID NO: 2; y un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente A.sp-133 hasta aproximadamente Phe-141 ,en la ?EC ID NO: 2; estos fragmentos de polipéptidos se han determinado co o partes epítopes antigénicas de la proteína TNF-gama por el análisis del índice antigénico de Jameson-Wolf,- como se expone en la figura l7, anterior.
Un experto en la materia puede determinar fácilmente regiones antigénicas para TNF-gama-beta por utilización de datos preparados por medio de análisis DNA*STAR de la secuencia (SEC ID NO: 20. del polipéptido TNF-gama-beta que utiliza los parámetros faltantes y regiones selectoras con un índice antigénico alto como ee describió anteriormente.
En otro aepecto, la invención proporciona péptidos y DoliDéotidos aue comprenden Dorciones con presencia de epítope de la presente invención. Estos epítopes son epítopes inmunogénicoe ó antigénicoe de los polipéptidos de la presente invención. Un " epítope inmunogénico" se define co o parte de una proteina que provoca una respuesta anticuerpo in vivo cuando el polipéptido entero de la presente invención. 6 frasmen o del mismo. es el inmunógeno. Por otro lado, una región de un polipéptido al cual un anticuerpo puede enlazar eetá definido como un "determinante antigénico" ó "epítope antigénico' - El número de epítopes inmunogénicos in vi vo de una proteína, generalmente es menor que el numero de epítopes antigénicos. Ver, por ejemplo, Geysen, y colaboradores, (1983) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 81: 3998-4002. Sin embargo^ los anticuerpos pueden eer hechos para cualquier epítope antigénico, indif rentemente de si es un epitope inmunogénico,- por utilización de métodos talee como exposición de fago. Ver por ejemplo,- Petersen G. y colaboradores (1995) Mol . Gen . Genet . 249:425-431. Por consiguiente, están incluidos en la presente invención ambos, epítopes inmunogénicos y epítopes antigénicos.
Una lista de secuencias de aminoácidos ejemplificadas que comprenden epí topes inmunogénicos se describieron anteriormente. Se hace notar que la lista de epítopes inmunogénicos solamente enlista residuos de aminoácidos que comprenden epítopes predichos para tener el grado más alto de antigenicidad utilizando el algoritmo de Jameson y Wolf, (1988) Comp. . Appl . Bicsci . 4:181-186 (dichas referencias incorporadas en su integridad como referencias) . El análisis antigénico de Jameson-Wolf se efectuó utilizando el programa de cómputo PROTEAN, que utiliza parámetros faltantes (Versión 3.11 para la Power Naclntoeh, DNASTAR, Inc. 1228 South Park Street Madiscn, Wl) . Porciones de polipéptidos no enlistadas en la lista anterior de epítopee inmunogénicos no se consideraron los no-inmunogénicos. Loe epítopee in uncgénicoe enlistados anteriormente ee una lista ejemplo, no una lista exhaustiva, porque otros epitopes inmunogénicos no son meramente reconocidos como talee por el algoritmo particular usado. Los residuos de aminoácidos que comprenden otros epítopes inmunogénicos pueden determinarse rutinariamente utilizando utilizando algoritmos similares al análisis de Jameson-Wolf ó por verificación in vivo para una respueeta antigénica utilizando métodoe conocidos en la materia. Ver por ejemplo. Ceysen y colaboradores, s pxa ; patente USA 4, 7Q8, "781; 5,194,392; 4,433,092; y 5,480,9"-. (dichas referencias se inc o ^ c mo r. fe on.-i a en sn integridad) .
Se hace notar de manera perticular que las secuencias de aminoácidos enlistadas anteriormente comprenden epítopes inmunogénicos. La lista de epítopes inmunogénicos enlista solamente los residuos críticos de epítopes inmunogénicos determinada por el análisis de Jameson-Wolf. Así, loe residuos laterales adicionales ya sea sobre los extremos N-terminal, C-terminal- ó ambos N-terminal y C- terminal pueden añadirse a las secuencias enlistadas anteriormente para generar un polipéptido con un epítope de apoyo de la presente invención. Por consiguiente, los epitopes inmunogénicos enlistados anteriormente pueden incluir residuos de aminoácidos N-terminal ó C- terminales. Los residuos de aminoácidos laterales adicionales pueden ser laterales contiguos a las secuencias N-terminal y/ó C- terminal de los polipéptidos de la presente invención, secuencias de polipéptidoe heterólogos,- ó pueden incluir ambas secuencias laterales contiguas de loe polipéptidos de la presente invención y secuencias de polipéptidos heteróloaos .
Loe polipéptidoe de la presente invención que comprenden epítopee inmunogénicoe ó antígenicos son al menos' sianifica sue un noliciér-ido de la oresente invención que comprende un epítope inmunogénico ó '>n antigénico puede tener 7 residuos de aminoácidos de extensión ó cualquier entero entre 7 aminoácidoe y el número de residuos de aminoácidos de los polipéptidos de »x e «=?? trst... rip 1 f. , r: T -n n A? Los polipéptidoe preferidoe que comprenden epítcpes inmunogénicos ó antigénicos son al menos 10, 15. 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ó 100 aminoácidos de extensión. Sin embargo ee hace notar que cada uno de loe enteros entre 7 y el número de reeiduos de aminoácidos del polipéptido de extensión total están incluidos en la presente invención. Loe fragmentos con apoyo de epítopee inmunogénicos ó antigñénicos pueden especificarse ya sea por el número de reeiduoe de aminoácidos contiguos, que se describen anteriormente, ó especificarse adicionalmente por las posiciones N-terminal y C-terminal de estoe fragmentos sobre la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Cada combinación de una posición N-terminal y C-terminal en la que un fragmento de, por ejemplo, > al menos 7 ó al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos de extensión podría ocupar sobre la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 se incluye en la invención. De nuevo, "al menos 7 residuos de aminoácidos contiguos en extensión" significa 7 residuos de aminoácidos en extensión ó cualquier entero entre 7 aminoácidos y el número de residuos de aminoácidos del polipéptido de extensión total de la presente invención. Específicamente, todos y cada uno de los enteros entre 7 y el número de residuos de aminoácidos del polipéptido de extensión total se incluyen en la presente invención. Adicionalmente, los fragmentos con epítopes de apoyo inmunogénicos ó antigénicos pueden especificarse de la misma manera para TNF-gama-beta por utilización de las técnicas deecritas en la presente.
Los polipéptidos con epítopes de apoyo inmunogénicos ó antigénicos de la invención, son útiles/ por ejemplo, para elaborar anticuerpos que específicamente enlacen al polipéptido de la invención. Los anticuerpos son útiles, por ejemplo, en purificación por afinidad de los polipéptidoe de la presente invención. Los anticuerpos pueden también rutinariamente usarse en una variedad de inmunoensayos cualitativos ó cuantitativos, específicamente para los polipéptidos de la presente invención utilizando métodos conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Harlow y colaboradores, Antibodies: A LaboratorY Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Prese; 2a. Ed., 1988).
Loe polipéptidoe con epítopee de apoyo de la presente invención pueden producirse por cualquier medio convencional para elaborar polipéptidos incluyendo métodos sintéticos y recombinantes conocidos en la materia. Por ejemplo, péptidos con epítopes de apoyo pueden sintetizarse utilizando métodos de síntesis química conocidos. Por ejemplo, Horghten describió un método simple para la eínteeie de gran número de péptidoe, talee como péptidos con 10-20 mgs de 248 residuos individuales y 13 distintos que representan variantes de aminoácidos únicas de un segmento del polipéptido HAI, todos los cuales ee prepararon y caracterizaren (por eetudioe de enlace tipo ELISA.) en menos de cuatro semanae (Houghten, R. A. Prcc . Na ti . Acad. Sci . USA 82: 5131-5135 (1985)). Este proceso de "Síntesis Simultánea de Péptido Múltiple (SMPS)" se describe adicionalmente en la Patente USA No. 4,631,211 de Houghten y colaboradores (1986). En este procedimiento lae resinas individuales para la síntesis en fase-sólida de varios péptidos están contenidas en contenedores separablee permeables al solvente, lo que facilita el uso óptimo de las muchas etapas repetitivas idénticas involucradas en métodos en fase-sólida. Un procedimiento manual completo permite que 500-1000 ó más síntesis sean conducidas simultáneamente (Houghten y colaboradores (1985) Proc . Na ti . Acad. Sci . 82:5131-5133 a 5134.
Los polipéptidos con epítopes de apoyo de la presente invención ee utilizan para inducir anticuerpos conforme a métodos conocidos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, inmunización in vivo, inmunización in vitro, y métodos de exposición de fago. Ver por ejemplo, Sutclife, y colaboradores, supra ; Wilson, y colaboradoree, supra, y Bittle, y colaboradores (1985 J. Gen . Virol . 66:2347-2354. Si se usa la. inmunización in vivo, los animales pueden ser inmunizados con péptido libre; nc obstante, el título de anticuerpo anti-péptido puede ser añadido por acoplamiento del péptido a un vehículo macromolecular, tal como hemocianina de coleóptero barrenador (KLH) ó toxoide tetánico. Por ejemplo, péptidos que contienen residuos de cisteína pueden acoplarse a vehículos que transportan a un hidroxisuccinimid (MBS) , mientras que otros péptidos pueden acoplarse a vehículos que utilizan un agente enlazante más general tal como el glutaraldehído. Animales tales como conejos, ratas y ratones son inmunizados ya sea con péptidos libres ó acoplados a venícu.los, por ejemplo, por inyección intraperitoneal y/ó intradérmica de emulsiones que contengan aproximadamente 100 µgs de péptido ó proteína vehículo y adyuvante de Freud. Varias inyecciones complementarias pueden ser necesarias, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos emanas, para proporcionar un título útil de anti-cuerpo anti-péptido que puede ser detectado, por ejemplo, por ensayos ELISA, que utilizan péptido libre adsorbido en una superficie sólida. El título de anticuerpos anti-péptido en suero de animal inmunizado puede aumentarse por selección de anticuerpos anti-péptido, por ejemplo, por adsorpción del péptido sobre un soporte sólido y elución del loe anticuerpos seleccionados conforme a métodos muy conocidos en la ?ua LCI _c? .
Como podré apreciar 1-1 experto en la materia, y se discutió anteriormente, los polipéptidoe de la presente invención que comprenden un epítope inmunogénico ó antigénico pueden fusionarse a secuencias de polipéptidos heterólogos. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden ser fusionados con la región constante de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) , ó porciones del mismo (CH1, CH2, CH3, cualquier combinación de éstos que incluyen ambas regiones y porciones completas de los mismos) que dan como resultado polipéptidos quiméricos. Estae proteínas de fusión facilitan la purificación, y muestran un aumento en la vida media in-vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que consisten de lae primeras dos regiones del polipéptido CD-4 humano y varias regiones de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas de mamíferos.
Ver, por ejemplo, EPA 0,394,827; Traunecker y colaboradores (1988) Nature 331:84-86. Proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica enlazada a disulfuro debido a la porción IgG puede también ser máe eficiente en enlazar y neutralizar otras moléculas que polipéptidos monoméricos, ó fragmentos de éstos eolos. Ver» por ejemplo» Fountoulakis y colaboradores (1995) J - . Biochem. 270:3958-3964. Los ácidos nucleicos que codifican a los epitopes anteriores pueden también eer recombinados con un gen de interés como un epítope tag para ayudar en la detección y purificación del polipéptido expresado.
Los péptidos y polipéptidos con epítope de apoyo de loe producidos por cualquier método convencional (ver, por ejemplo, Houghten,- R. A. Y colaboradores, Proc . Na ti . Acad.
Sci . USA 82:5131-5135 (1985); y Patente USA No. 4,631,211 hasta Houghten, y colaboradores (1986) ) .
Los péptidoe y polipéptidos con epítope de apoyo de la invención tienen usos que incluyen, pero no se limitan a, inducir a anticuerpos conforme a métodos muy conocidos en la materia (ver, por ejemplo, Su.tcliffe, y colaboradores, supra; Wilson, y colaboradores, supra Chow, M. Y colaboradores, Prcc . Na ti . Acad. Sci . USA 82:910-914; y Bittle, F. J. y colaboradores, J. Gen. Virol . 66:2347- 2354 (1985)) , Péptidos con epitopes de apoyo inmunogénicos de la invención, por ejemplo aquellos que son parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa ee el inmunógeno, ee identifican conforme a métodos conocidos en la materia (ver, por ejemplo, Geysen» y colaboradores supra) . Aún adicionalmente Patente USA. No. 5,194,392, registrada a Geysen, deecribe un método general de detectar ó determinar la secuencia de monómeros (aminoácidoe u otroe compueetoe) la cual ee topológica equivalente del epítope por ejemplc ver, " imotopo") el cual ee complementario a un paratopo particular (sitio enlazante de antígeno) de un anticuerpo de interés. Más generalmente, Patente USA No. 4,433,092, regietrada a Geysen, deecribe un método de detección ó determinación de una secuencia de monómeros la cual ee topográfica equivalente de un ligando que es complementario al sitio de enlace de ligando de un receptor particular de interée (por ejemplo DR3) . Si ilarmenete, la patente USA No. 5,480,971, regietrada a Houghten y colegae» eobre Mezclas de Oligopéptidos Pre-alquilados describe oligopéptidos prealquiladoe por C?-C--alqu?lo linealee y grupos y acervos de tales péptidoe, así como también métodos para utilizar tales grupos y acervos de oligopéptidos para determinar la secuencia de un oligopéptido prealquilado que preferencialmente enlaza a una molécula receptora de interés. Así análogos no-péptidoe de loe péptidoe con epítope de apoyo de la invención también pueden hacerse rutinariamente por estos métodos.
Como podrá apreciar un experto en la materia, los polipéptidoe TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta de la presente invención y los fragmentos con epítope de apoyo de los mismos descritos anteriormente pueden combinarse con partes de la región constante de inmunoglobulinas (IgG), que dan como resultado polipoéptidos quiméricos. Estae proteínas de fusión facilitan la purificación y exponen una vida media aumentada in vi vo . Eeto se demuestra, por ejemplo, por proteínas quiméricas que consisten de las primeras dos regiones del polipéptido CD4 humano y varias regiones de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas de mamífero (EP A 394,827; Traunacker, y colaboradores, Na ture 331:84-86 (1988). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica enlazada a disu.lfu.ro debido a la parte IgG puede también ser más eficiente en enlazar y neutralizar otras moléculas otras moléculas que la proteína TNF-gama monomérica ó fragmento de la proteína solo (Fountoulakis, y colaboradores, J. Biochem, 270: 3958-3964 (1995) ) , Como un ejemplo, una fusión TNF-gama-Fc tal se ha producido en la preeente como ee deecribe precedentemente.
Loe fragmentos (por ejemplo porciones) de los polipéotidos TNF-aama de la nresente tienen usos crue incluyen, pero no se limitan a, intermediarios para producir polipéptidoe de extensión total.
Para muchas proteínas, que incluyen la región extracelular de una proteína ahocicada a membrana ó las formas maduras de una proteína secretada, es sabido en la especialidad que uno ó más aminoácidos pueden ser eliminados desde el C-terminus ó N-terminus sin pérdida substancial de la función biológica. Por ejemplo, Ron y colegas ( J. Biol . . Chem . , 268:2984-2988 (1993)) reporta proteínas KGF modificadas que tienen actividad de enlace heparinaa igualmente si 3, 8, ó 27 residuos de aminoácios N-terminales estuvieran ausentes. Adicionalmente varios investigadores han publicado muteínas TNF-a en los cuales dos, cuatro ó siete aminoácidos N-terminales se han sido retirados que demostraron un incremento de 2 a 3 veces en actividad funcional en comparación con el polipéptido TNF-a como se encuentra naturalmente (Creaeey, A. A. Y colaboradores, Cáncer Res . 47:145-149 (1987); Sidhu, R. S. Y Bollón a. P. Anti cancer Res . , 9: 1569-1576 (1989); Kamij O/ R. Y colaboradores Biochem. Biophys . R.es . Comm. 160:820-827 (1989)). Además, igualmente si la eliminación de uno ó más aminoácidos del =termi us ó C=ter?r.inus de una proteína dá como resultado la modificación ó pérdida de una ó más funciones biológicae de la proteína, otrae actividades funcionales de TNF-gama pueden aún conservarse.
En el presente caso, puesto que las proteínas de la invención son miembros de , la familia del polipéptido TNF, las eliminaciones de loe aminoácidos N-terminales hasta el residuo leucina en posición 35 de la SEC ID NO: 2 (que corresponde exactamente al residuo leucina en posición 134 de la SEC ID NO: 20) puede conservar alguna actividad biológica tal como regulación de crecimiento y diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales- Los polipéptidos que tienen eliminaciones N-terminales adicionales que incluyen el residuo leucina-36 en la SEC ID NO: 2 (correspondiente a leucina-135 en la SEC ID NO: 20) no ee esperaría que retuviera tales actividades biológicas porque se sabe que este residuo en los polipéptidos relacionados con TN F está en el inicio de la región conservada requerida para actividades biológicas.
Sin embargo, igualmente si la eliminación de uno ó más aminoácidos del N-terminus de un polipéptido TNF-gama de extensión total dá como resultado modificaciones ó pérdidas de una ó más funciones biológicas del polipéptido, otras actividades biológicas pueden aún conservarse. Así, la capacidad del polipéptido acortado para inducir y/ó enlazar a anticuerpos que reconocen la forma de extensión total ó madura del polipéptido, generalmente será conservada cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido de extensión total ó maduro sea retirado del N- termmus . Si un polipéptido particular .carece de residuos N-termina de un polipéptido completo retiene tales actividadee inmunológicas puede fácilmente determinarse por métodos de rutina descritos en la presente y de otro modo conocidos en la materia.
Por consiguiente, la presente invención proporciona adicionalmente polipéptidos que tienen uno ó más residuos eliminados de amino terminus de la secuencia de aminoácidos del TNF-gama-alfa expuesto en la SEC ID NO: 2, hasta el residuo leucina en posición número 35, y polinucleótidos que codifican a talee polipéptidoe. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden ia secuencia de aminoácidos de los residuos n1-149 de la SEC ID NO: 2 en donde n1 es un entero en el rango de -27 a 35, y 35 es la posición del primer residuo del N-terminus del polipéptido TNF-gama completo (expuesto en la SEC ID NO: 2) se cree que se requiere para la regulación del crecimiento y diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales.
En modalidades específicas, la. invención proporciona, -olinucleótidos que codifican a polipéptidos que comprenden, ó alternativamente, consisten de» la secuencia H sminoácidcs de los residuos: -27 a 147, -26 a 147, —24 a 147, -23 a 147, -22 a 147, , -21 a. 147, -20 a. 147, -19 a 147, -18 a 147» -17 a 147, -16 a 147, -15 a 147, -14 a 147, -13 a 147, -12 a 147, -11 a 147, -11 a 147, -10 a 147, -9 a 147, -8 a 147, -7 a 147, -6 a 147, -5 a 147, -3 a 147, -2 a 147, -1 a 147, 1- a 147, 2 a 147, 3 a 147, 4 a 147, 5 a 147, 5 a 147, 6 a 147, 7 a 147, 8 a 147, 9 a 147, 10 a 147, 11 a 147, 12 a 147, 13 a 147, 14 a 147, 15 a 147, 16 a 147, 17 a 147, 18 a 147, 19 a 147, 20 a 147, 21 a 147, 22 a 147, 23 a 147, 24 a 147, 25 a 147, 26 a 147, 27 a 147, 28 a 147, 29 a 147, 30 a 147» 31 a 147, 32 a 147, 33 a 147, 34 a 147, 35 a 147 de la SEC ID NO: 2. Los polinucleótidos que codifican a eetoe polipéptidos son también abarcados por la invención .
Por consiguiente, la presente invención proporciona adicionalmente polipéptidos que tienen uno ó más residuoe c iiúipauOS u. _ a ino i_.erm.inus de la secuencia de aminoácidos del TNF-gama-beta expuesta en la SEC ID NO: 20, hasta el reeiduo leucina en posición número 134, y los polinucleótidos que codifican a tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos .no rnmnrDnHon la co/ . ion. H a Ho am.nná iH?o Ho 1 no '"OS _UOS r. -.0 .1 Ho l a CtTC Tn Hn • 00 OT. H-t?Ho t-?2 oq ??t-¡ pn pi-n pj-i pl ?-an/-r/-? Ho 1 a 1 ._, \t 1 ".^ oc la nno .ri?n Hol ri er rTS _!llO del N-terminus del polipéptido TNF-gama-beta completo fioYm ?oc+--> on la QTT.C Tn K¡Cl • 9D1 cp f po mío co r-ortiii aro n=r= la regulación del crecimiento y diferenciación de la actividad de muchos tipos de células hematopoyéticae y endoteliales del polipéptido TNF-gama-beta.
En modalidades específicas» la invención proporciona polinucleótidos que codifican a polipéptidos que comprenden, ó alternativamente» consisten de» la secuencia de aminoácidos d.e los residuos: 1 a 251, 2 a. 251, 3 a 251, 4 a 251, 5 a 251, 6 a 251» 7 a 251, 8 a 251» 9 a 251» 10 a 251, 11 a 251, 12 a 251, 13 a 251, 14 a 251, 15 a 251, 16 a .1 11 a .1 1 « -, O .1 . Q 0 .1 OQ -a O Í OT fx .1 O o 251, 23 a 251, 24 a 251, 25 a 251, 26 a 251, 27 a 251, 28 a 251, 29 a 251, 30 a 251, 31 a 251, 32 a 251, 33 a 251, 34 a 251, 35 a 251, 36 a 251 a 251, 37 a 251, 38 a 251, 39 a 251, 46 a 251, 47 a 251, 48 a 251, 49 a 251, 50 a 251, 51 a 0 .1. ?? a 0 .1 , . . =1 0 .1 ?¿ a O .l .c. a 0 .1 6 a 0 .1 t:"? a 251, 58 a 251, 59 a 251, 60 a 251, 61 a 251, 62 a 251, 63 a 251, 64 a 251, 65 a 251, 66 a 251, 67 a 251, 68 a 251, 69 a 251, 70 a 251, 71 a 251. 72 a 251, 73 a 251, 74 a. 251, 75 a 251, 76 a. 251. 77 a 251, 78 a 251, 79 a 251, 80 a 251, 81 a 251, 82 a 251, 83 a 251, 84 a 251, 85 a 251, 86 a 251, 87 a 251, 88 a 251, 89 a 251, 90 a 251, 91 a 251, 92 a 251, 93 a 251, 94 a 251, 95 a 251, 96 a 251» 97 a 251» 98 a 251» 99 a 5 251 100 a 251 101 a 251, , 102 a 251, 103 a 251, 104 a 251, 105 a 251, 106 a 251, 107 a 251, 108 a 251, 109 a 251, 110 a 251, 111 a 251, 112 a 251, 113 a 251, 114 a 251, 115 a 251, 116 a 251, 117 a 251, 118 a 251, 119 a 251, 120 a 251, 121 a 251, 122 a 251, 123 a 251, 124 a 251, 125 a 251, 126 10 a 251, 127 a 251, 128 a 251, 129 a 251, 130 a 251, 131 a 251, 133 a 251, 134 a 251 y 134 a 251 de la SEC ID NO: 20. Los polinucleótidos que codifican a estoe polipéptidos son también abarcados por la invención.
Como se mencionó anteriormente, igualmente si la eliminación de uno ó más aminoácidos del N-terminus del polipéptido dá como resultado una modificación de pérdida Ho nna A mác fnnr-i nnoc V-nlArr..-ac Hol 1 .t_ór-.,-.H.-.- ra actividades biológicas pueden aún conservarse. Así» la capacidad de la muteína de TNF-gama-alfa acortada para inducir y/ó enlazar a anticuerpos que reconocen a la forma m _U _ Ó de OV. OT-IC . AT. t-nf-al rio~¡ rj l -i rsór..- i Hn fjonoralmpnt-o será conservada cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido de extensión total ó maduro son retirados ?^ d l N— t?T -.11' s i llr? P<-> • i Dó?t- i Hn t->a'T-.- ..-'..l a -' <-.. ?o . a -p^o Ho residuoe N-terminales de una proteína completa conserva tales actividades biológicas puede fácile ente determinarse por métodos de rutina descritos en la presente y de otra manera conocidos en la materia. No sería improbable que una muteína de TNF-gama-alfa cpn un gran número de residuos de aminoácidos N-terminales eliminados pueda conservar alguna actividades biológicas ó inmunogénicas. De hecho, péptidos compuestoe de tan pocoe como eeis residuos de aminoácidos de TNF-gama-alfa pueden a menudo evocar una respuesta inmune.
Por consiguiente la presente invención proporciona adicionalmente polipéptidos que tienen uno ó más residuos eliminados del amino terminus de ia secuencia de aminoácidos madura predicha. del TNF-gama-alfa expuesto en las figuras 1A y IB (SEC ID NO: 2)» hasta el residuo fenilalanina en posición número 169 de la secuencia expuesta en las figuras 1A y IB (que corresponde a la posición número 142 de la SEC ID NO: 2) y los polinucleótidos que codifican a tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de loe reeiduos rX- 114 de la secuencia expuesta en las figuras Ia y IB (n3-147 de la SEC ID NO: 2), en donde n3 es un entero en el rango de 1 a 169, y 170 es la posición del primer residuo del N-terminus del polipéptido TNF-gama-alfa que se cree sue se resuiere ^a^- ai mgnos la actividad inmunogénica del poli?éntido TNF—gama- lfa .
Ma c .articular,, la invención proporciona polinucleótidos que codifican a polipéptidos que conv-renden, ó alternativamente consisten de» la secuencia de aminoácidos de residuos de R-2 a L-174, R-3 a L-174, F- 4 a L-l74, L-5 a L-l74, S-6 a L-l74, K-7 a L-174, V-8 a L- 174, Y-9 a L-174, S-10 a L-174, F-ll a L-174, P-12 a L-174, M-13 a L-l74, P.-14 a L-l 4, K-15 a L-l74, L-16 a L-l74, I- 17 a L-174, L-18 a L-174, F-19 a L-174, L-20 a L-174, V-21 a T— 1 .4 TT-O a T-1 - D-.1 a T - 11 ? \T— ? a T-1 ~¡ & \T- O Z, =? L-174, R-26 a L-174, 0-27 a L-174, T-28 a L-174, P-29 a L- 174, T-30 a L-174, Q-31 a L-174, K-32 a L-174 a L-174, F-33 a L-174, K-34 a L-174, N-35 a L-174, Q-36 a L-174, F-37 a L-174, P-38 a L-l74, A-39 a L-174, L-40 a L-174, H-41 a L- 174 W-42 a L-174, E-43 a L-174 H-44 a L-174, E-45 a L- 11 ? L-46 a L-l 4, G-47 a L-l 4 L-48 a L-174, A-49 a L- 20 11 ? TG- .n L-l 4 T- .1 T -171 K-52 a L-174, N-53 a L- 11 ? R.-54 a L-l74 M-55 a L-l74 N-56 a L-174, Y-57 a L- 174 T-58 a L-174, N-59 a L-174 K-60 a L-174, F-61 a L- l74 L-62 a L-l74, L-63 a L-l74 1-64 a L-174, P-65 a L- 174 E-66 a L-174, S-67 a L-174 G-68 a L-174, D-69 a L- "> 174 v_ . n a T -1 "74 1-72 a L-174, Y-73 a L- 1 4, Q-7¿ a T-174. n-7 . a T-174, -7 => L-174, T~77 a L- 174, F-78 a L-174, R-79 a L-174, G-80 a L-174, M-81 a L- -74 T-82 a L-l 4 S-83 a L-l 4, E-84 a L-l 4, C-85 a L- 174, S-86 a L-174, E-87 a L-174, 1-88 a L-174, R-89 a L- ? ?? n-Qn t_i74 a_a? a t_? .4 (__QO a t-174 R-93 a t_ 174, P-94 a L-174, N-95 a L-174, K-96 a L-174, P-97 a L- 174, D-98 a L-l74, S-99 a L-l 4, 1-100 a L-l 4, T-101 a L- 174, V-102 a L-174, V-103 a L-174, 1-104 a L-174, T-105 a L-l 4 V- -107 a L- -1 4, T- -108 a L- -174, D- -109 a L-l74 S-110 a L-l 4 V- -111 a L- -174, P- -112 a L- -1 4, TT- -113 a L-l 4 P-114 a L-l74 T- -115 a L- -174, Q- -116 -•- L- -174, L- -ll7 a L-174 L-118 a L-174 M- -119 a L- -174, G- -120 a L- -174, T- -121 a L-174 K-122 a L-l74 s- -123 a L- -174, V- -124 a L- -174, c- -125 a I -174 F-126 a L-174 V- -127 a L- -174, G- -128 a L- -174, ñ- -129 a 1s - -131 a L- -174, p_ -132 n L- -174, 0- -133 a L-174 P-134 a L-174 I- -135 a L- -174, Y- -136 a L- -174, L- -137 a L-17 G-138 a L-l74 A- -139 a L- -1 4, M- -140 a L- -1 4, F- -141 a L-174 S-142 a L-174 L- -143 a L- -174, Q- -144 a L- -174, F- -145 a L-174 G-146 a L-l74 D- -147 a L- -1 4, K- -148 a L- -174, L- -149 a L-174 M-150 a L-174 V- -151 a L- -174, N- -152 a L- -174, V- -153 a L-l 4 S-154 a L-l74 D- •155 a L- -1 4, t_ •156 a L- -174, - -157 a L-174 L-158 a L-174 V- -159 a L- -174, D- -160 a L- -174, Y- -161 a -174 T-162 a L-l 4 K- -163 a L- -174, E- •164 a L- -174, D- -165 a L-174 K-166 a L-174 T- -167 a L- -174, F- -168 a L- -174, y F-169 ? _ 1?~ -.^4 3 .— 1^ de J-.3 STCUS?CIS de Tí-F— cf3??i ßxpußstñ en 3.3S figuras ÍA y IB (la secuencia de aminoácidos de TNF-gama- alfa expuesta en las figuras 1A y IB es idéntica a. la de la SEC ID NO: 2, sin embargo, el esquema de numeración difiere entre los dos; la numeración de los residuos de aminoácidos anteriores en este caeo refleja el de lae figuras 1A y IB) . Los polinucleótidos que codifican a estos polipéptidos son también abarcados por la invención.
Por consiguiente, La presente invención proporciona adicionalmente polipéptidcs que tienen uno ó máe residuos eliminados del amino términus de la secuencia de aminoácidos madura predicha del polipéptido TNF. gama-beta expuesta en la SEC ID NO: 20» haeta el residuo de fenilalanina en posición número 246 y polinucleótidos que codifican a tales polipéptidos. En particular, la. presente invención proporciona polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los residuos n4-251 de la SEC ID NO: 20, en donde n4 es un entero en el rango de 2 a 246, y 247 es la posición del primer residuo del N-terminus del ?n polipéptido TNF-gama-beta completo que se cree que se requiere para al menos la actividad inmunogénica de la proteína TNF-gama-beta.
Más en particular, la invención proporciona ?? polinucleótidos que codifican a polipéptidos que comprenden, ó alternativamente consieten de» la eecuenciae de aminoácidos d.e los residuos de A-2 a L-251, E- 3 a L-251, n-4 a T.-O .1 T.- •5 a L-251, G-6 a L-2 5.1» L-7 a L- 251, .-R L-251, F-9 a L-251, G-10 a L-251, E-ll a L-251, T-12 a L- o .i Z--1 -5 T— O .1 S-14 s., L-251 V-15 a L— 251, T _T-1_ £_ a_ _ 251 M-17 a L-251 L-18 a L-251, P-19 a L-251, E-20 a L- 251 H-21 a L-251 G-22 a L-251, S-23 a L-251, r-9¿ T.- 251 R-25 a L-251 P-26 a L-251, K-27 a L-251, A-28 a L- 251 R-29 a L-251 S-30 a L-251, S-31 a L-251, S-32 a T._ 251 A- 33 a L-251 R-34 a L-251, W-35 a L-251, A- 36 a L- 251 L-37 a L-251 T- .O a T.-O 1 , C- .Q a T.-O .1 C-40 a L- 251 L-41 a L-251 V-42 a L-251, L-43 a L-251, L-44 a L- o .1 XJ-? C. t._o .1 jr-46 3 L-251 L— 47 a L-251 A- 8 a L- 251 G-49 a L-251 L- 50 a L-251, T-51 a L-251, T-52 a L-i s 251 Y-53 a L-251 t._ 54 a L-251, L-55 a L-251, V-56 a L- 251 S-57 a L-251 0- 58 a L-251, L-59 a. L-251, R-60 a L- 251 Z--É.1 T _o .1 62 a L-251, G-63 a L-251, E-64 a L- 251 A-65 a L-251 C- 66 a L-251, V-67 a L-251, Q-68 a L- 251 F-69 a L-251 r. 70 a L-251, A- 71 a L— 251, L— 72 a L- 0 251 K-73 a L-251 - 7_ a L-251, Q-75 a L-251, E-76 a L- 251 F-77 a L-251 2--7ft a L-251, P-79 a L-251, S-80 a L- 251 H-81 a L-251 o- 82 a L-251, Q-83 a L-251, V-84 a L- o .1 v-fit a T.-O .1 ?- fifi a L— 251, P-87 a L— 251, L-88 a L— 251 R-89 a L-251 a-90 a L-251, D-91 a L-251, G-92 a L- s O .1 ?-QT T _o .i IC--Q4 a T.- ^l D-QC. ^ T.-O^l a L- 251, A.-97 a L— 251, H-98 a L-251, L—99 a L-251» T-100 a L— 251, V-101 a L-251, V-102 a L-251, R-103 a L-251, Q-104 a L-251 T-105 a L-251 P-106 a L— 251, T-107 a L-251, Q-108 a L-251 a L-251, H-109 a L-251, F-110 a L-251, K-lll a L-251 N-112 a L-251 /._! 3 a L— 2^1 F-114 a L-251, P-115 a L— 251 A-116 a L-251 L-1 7 a L-251 H-l 18 a L-251 -119 a L-251 2-120 a L-251 p-i oí t.-o .1 TT-100 a T.-O .1 T.-1 - "! a T.-O .1 G-124 a L-251 L-125 a L-251 A-126 a L-251 F-127 a L-251 T-128 a L— 251 K-129 a L-251 N-l30 a L—251 R-1 .1 a T.-O .1 -132 a L-251 T--1 .^ a t._o .1 V-1 .d a T,-0 .1 T-1 .R a T.-O .1 N-136 a L— 251 K-137 a L-251 F-138 a L— 251, L-139 a L-251 L-140 a L-251 1-141 a L-251, P-142 a L-251, E-143 a L-251 S-144 a L-251 G-145 a L— 251, D-146 a L-251, Y-147 a L-251 F-148 a L-251 1-149 a L-251, Y-150 a L-251, S-151 a L-251 K / n.-_1.5.2o a L t.-_2o5.1i v_? .^ t._om t_? . t._os? F-i ^ t._os? R-156 a L-251 G-157 a L-251, M-158 a L-251, T-159 a L-251 S-160 a L-251 E-161 a L-251 a L-251, C-162 a L-251, S-163 a L-251, E-164 a L-251, 1-165 a L-251, R-166 a L-251, Q-167 a L-251, A.- 168 a L— 251, G-169 a L-251, R.-17Q a L-251, P-171 a L-251, N-172 a L-251, K-173 a L-251, P-174 a L-251, D-175 a L— 251, S-176 a L-251, 1-177 a L-251, T-178 a L-251, V-179 a L-251, V-180 a L-251, 1-181 a L-251, T-182 a L-251, K-183 a L-251, Y-184 a L-251, T-185 a L-251 a L-251, D-186 a L- 251, S-187 a L-251, Y-188 a L-251, P-189 a L-251, E-190 a <. . T.- 1 D-1 Ql a T.-O .1 T-1i QaOo T.-OSI p-i a^ a T — - I T.-I QJ L-251, L-195 a L-251, M-196 a L-251, G-197 a L-251, T-198 a L-251, K-199 a L-251, S-200 a L-251, V-201 a L-251, C-202 a L— 251, E-203 a L— 251, V-204 a L-251, G-205 a L-251, S-206 a L-251, N-207 a L-251, W-208 a L-251, F-209 a L-251, Q-210 a T o?i . p-211 => t °p'l 1—21° a L— 251 Y-213 a L-251 L-214 a L-251, G-215 a L-251, A-216 a L-251, M-217 a L-251, F-218 a L— 251 S-219 a L— 251 L-220 a L-251, Q-221 a .L-251 a L-251 E-222 a L-251, G-223 a L-251, K-225 a L-251, L-226 a L-251 M-227 a L— 251, V-228 a L— 251, N-229 a L-251, V-230 a L— 251 S-231 a. L-251, D-232 a. L-251, 1-233 a L-251, S-234 a L-251 T.- .c. __, T.-O .1 \T-0 ... a T.-O .1 T.-0 .7 a T.- .1 V-O .ft a T.-O 1 T-239 a L-251, K-240 a L-251, E-241 a L-251, D-242 a L-251 lí-Od . a T.-O .l . T- ?? a T.-O .l , TT- A ^ a T.-O .l . „ TT- 4 fi a L~ 251 a L-251 de la secuencia, d.e TNF-gama-beta. en la SEC ID !5 NO: 20. Loe polinucleétidos que codifican a estoe r^?oli^ r^tidos son tambi n abarcados por la invención. .. m -i 1 a -rm--.ri.-o pipr' nc! o-ipmnlnc rio mntpí ac C<~> eliminación C-terminal funcionales biológicamente son '>n conocidas. Por ejemplo, El interferon gama muestra hasta diez veces mayor actividad por eliminación de 8 a 10 y o c . rí p n ; Ho amipná ifinc: Hol tO minnc rarbnyi río l prn pína (Dobeli, y colaboradores, J. Biotechnology 7:199-216 (1988) ) . A-demás, varios investigadores han publicado muteínas de TNF-a inactivas biológicamente en las cuales tan pocos co o dos aminoácidos se han eliminado del C-terminus (Carlino, -3. A.» y colaboradores, J. Bicl.. Chem. 262:958-961 (1987) ; Crease", A. A., y colaboradoree C ncer Res. 47:145-149 (1987); Sidhu, R. S. Y Bollón, A. P. Antic ncer Res. 9:15ß9 1576 (1989); Gase, K., y colaboradores, Xí-Tü-.-oiocy 71: 368—371 (1990) ) .
En el presente caso, puesto que las proteínas de la invención son miembros de la familia de polipéptidos TNF, eliminaciones de aminoácidos C-terminales hasta la leucina en posición 146 de la SEC ID NO: 2 (la cual corresponde a la leucina en posición 250 de la SEC ID NO: 20) pueden conservar algu actividad biológica tal co o recruíación de crecimiento y diferenciación de muchos tipos de células Vi orna +-í .t-?. t..-_?.--i . -3c: onHp pl i al p T.r. c: r^ >1 '¡ r»<at~t- ..S .c: rrno f-i p-Tpri aHomác 1imi cio r-t-ortnt_na --c m.o incíuven el residuo leucina en posición 146 de la SEC ID NO: 2 (ó el residuo de le?cina en posición 250 de la SEC ID NO: 20) o se esperaría que conservara tales actividades biológicas porgue se sabe que este residuo en los polipéptidos relacionados con TNF esté en el principio de la región conservada requerida para actividades biológicas.
Sin embargo, igualmente si la eliminación de uno ó más aminoácidos del C—terminus de una proteína dá como resultado la modificación d.e l pérdid de una. ó más funciones biológicas de la proteína, otras actividades biológicas pueden aún conservaree. Así, la capacidad de la proteína acortada para inducir y/ó enlazar a anticuerpos que reconocen la. forma madura ó completa de la proteína generalmente será conservada, cuando menos de la mayoría de los residuoe de la proteína completa ó madura eon retiradoe del C-terminus. Si un polipéptido particular que carece de residuos C-terminales de una proteína completa, retiene tales actividades inmunológicas» puede fácilmente eer determinada por métodos de rutina descritos en la presente y de otra manera conocidos en la materia.
En modalidades adicionales, la. presente invención proporciona polipéptidoe adicionales que tienen uno ó más residuoe del terminus carboxi de la secuencia de aminoácidos del TNF-gama-alfa expuesto en la SEC ID NO: 2, hasta el residuo de leucina en posición 146 d.e la. SEC ID NO: 2, y polinucleótidos que codifican a tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de residuos -27-m1 de la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2, en donde m1 es cualquier entero en el rango de 146 a 147, y el residuo 146 es la posición del primer residuo del C-terminus del polipéptido TNF-gama-alfa completo (expuesto en la SEC ID NO: 2) se cree que se requiere para la regulación de crecimiento y diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales por el polipéptido TNF-gama-alfa.
Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que codifican a polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidoe de residuos -27-146 y -27-147 de la SEC ID NO: 2. Polinucleótidos que codifican a estoe polipéptidos también se proporcionan.
La presente invención también proporciona polipéptidos que tienen uno ó más residuos retirados del terminus carboxi de la secuencia de aminoácidos del TNF-gama-beta expuesto en la SEC ID NO: 20, hasta el residuo de leucina en posición 250 de la SEC ID NO: 20, y polinucleótidos que codifican a tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de residuos 1-m2 de la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 20, en donde m2 es cualquier entero en el rango de 250 a 251, y residuo 249 es la posición del primer residuo del C-terminus del polipéptido TNF-gama-beta completo (expuesto en la SEC ID NO: 20) se cree que se requiere para regulación de crecimiento y diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales .
Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que codifican a polipétidos que tienen la secuencia de aminoácidos de residuos 1-250 y 1-251 de la SEC ID NO: 20. También se proporcionan los polinucleótidos que codifican a estos polipéptidos.
La invención también proporciona fragmentos de polipéptidos que comprenden, ó alternativamente consisten de, uno ó más aminoácidos eliminadoe de ambos terminus amino y carboxilo de TNF-alfa, que puedem ser descritos generalmente como que tienen los residuos n1-m1 de la SEC ID NO: 2, en donde n y m son enteros que se describieron anteriormente. La invención proporciona adicionalmente polipéptidos que tienen uno ó más aminoácidos eliminados de ambos terminus amino y carboxilo de TNF-gama-beta, que pueden ser descritoe generalemente como que tienen loe residuos n-m2 de la SEC ID NO: 20, en donde n2 y m2 son enteros que se describieron anteriormente.
Como se mencionó anteriormente, si la eliminación de uno ó más aminoácidos de C-terminus del polipéptido dá como resultado la modificación de la pérdida de una ó más funciones biológicas del polipéptido, pueden conservarse otras actividades biológicas. Así, la capacidad de la muteína de TNF-gama-alfa acortada para inducir y/ó enlazar a anticuerpos que reconocen la extensión total ó la madurez del polipéptido generalmente se conservará cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo ó maduro son retirados del C-terminus. Si un polipéptido particular carece de residuos C-terminales de un polipéptido de extensión total retiene tales actividades inmunológicas puede fácilmente determinarse por métodos de rutina descritos en la presente y de otro modo conocidos en la materia. No es improbable que una muteína de TNF-gama-alfa con un gran número de residuoe de aminoácidos C-terminales eliminados pueda retener alguna de las actividades biológicas ó inmunológicae . De hecho, los péptidoe compuestos de tan pocas como 6 residuos de aminoácidos TNF-gama pueden a menudo evocar una respuesta inmune .
Por consiguiente, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen uno ó más residuos eliminados del terminus carboxi de la secuencia de aminoácidos del TNF-gama-alfa expuesto en las figuras ÍA y IB (ó en la SEC ID NO: 2) , hasta el residuo de serina en posición número 6 en las figuras ÍA y IB (ó -22 en la SEC ID NO: 2), y polinucleótidos que codifican a tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de residuos 1-pr de la SEC ID NO: 2, en donde m3 es un entero en el rango de 6 a 174, y 6 es la posición del primer residuo del C-terminue del polipéptido TNF-gama-alfa completo que ee cree que se requiere para al menos la actividad inmunogénica de TNF-gama-alfa.
Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que codifican a polipéptidos que comprenden, ó alternativamente consisten de, la secuencia de aminoácidos de residuos M-l a L-173, Ml a F-172, Ml a A-171, Ml a G-170, Ml a F-169, Ml a F-168, Ml a T-167, Ml a K-166, Ml a D-165, Ml a E-164, Ml a K-163, Ml a T-162, Ml a Y-161, Ml a D-160, Ml a V-159, Ml a L-158, Ml a S-157, Ml a 1-156, Ml a D-155, Ml a S-154, Ml a V-153, Ml a N-152, Ml a V-151, Ml a M-150, Ml a L-149, Ml a K-148, Ml a D-147, Ml a G-146, Ml a E-145, Ml a Q-144, Ml a L-143, Ml a S-142, Ml a F-141, Ml a M-140, Ml a A-139, Ml a G-138, Ml a L-137, Ml a Y-136, Ml a 1-135, Ml a P-134, Ml a Q-133, Ml a F-132, Ml a -131, Ml a N-130, Ml a S-129, Ml a G-128, Ml a V-127, Ml a E-126, Ml a C-125, Ml a V-124, Ml a S-123, Ml a K-122, Ml a T-121, Ml a G-120, Ml a M-119, Ml a L-118, Ml a L-117, Ml a Q-116, Ml a T-115, Ml a P-114, Ml a E-113, Ml a P-112, Ml a Y-lll, Ml a S-110, Ml a D-109, Ml a T-108, Ml a V-107, Ml a K-106, Ml a T-105, Ml a 1-104, Ml a V-103, Ml a V-102, Ml a T-101, Ml a 1-100, Ml a S-99, Ml a D-98, Ml a P-97, Ml a K-96, Ml a N-95, Ml a P-94, Ml a R-93, Ml a G-92, Ml a A-91, Ml a Q-90, Ml a R-89, Ml a, 1-88, Ml a E-87, Ml a S-86, Ml a C-85, Ml a E-84, Ml a S-83, Ml a T-82, Ml a M-81, Ml a G-80, Ml a R-79, Ml a F-78, Ml a T-77, Ml a V-76, Ml a Q-75, Ml a S-74, Ml a Y-73, Ml a 1-72, Ml a F-71, Ml a Y-70, Ml a D-69, Ml a G-68, Ml a S-67, Ml a E-66, Ml a P-65, Ml a I-64, Ml a L-63, Ml a L-62, Ml a F-61, Ml a K-60, Ml a N-59, Ml a T-58, Ml a Y-57, Ml a N-56, Ml a M-55, Ml a R-54, Ml a N-53, Ml a K-52, Ml a T-51, MI a F-50, Ml a A-49, Ml a L-48, Ml a G-47, Ml a L-46, Ml a E-45, Ml a H-44, Ml a E-43, Ml a -42, Ml a H-41, Ml a L-40, Ml a A-39, Ml a P-38, Ml a F-37, Ml a Q-36, Ml a N-35, Ml a K-34, Ml a F-33, Ml a H-32, Ml a Q-31, Ml a T-30, Ml a P-29, Ml a T-28, Ml a Q-27, Ml a R-26, Ml a V-25, Ml a V-24, Ml a P-23, Ml a F-22, Ml a V-21, Ml a L-20, Ml a F-19, Ml a L-18, Ml a 1-17, Ml a L-16, Ml a K-15, Ml a R-14, Ml a M-13, Ml a P-12, Ml a F-ll, Ml a S-10, Ml a Y-9, Ml a V-8, Ml a K-7, y Ml a S-6 de la secuencia de la secuencia de TNF-gama-alfa expuesta en las figuras ÍA y IB (la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa de lae figuras ÍA y IB es idéntica a la de la SEC ID NO: 2, sin embargo, el esquema de numeración difiere entre las dos; la numeración de los residuos de aminoácidos anterior en este caso refleja el de las figuras ÍA y IB) . También se proporcionan los polinucleótidos que codifican a estos polipéptidos.
La invención también proporciona polipéptidos que tienen uno ó más aminoácidos eliminados de ambos termini amino y carboxilo del polipéptido TNF-gama-alfa, que puede ser descrito generalmente como que tiene residuos n3-m3 de la SEC ID BO: 2, n donde n3 y m3 son enteros que se describieron anteriormente. Los polinucleótidos que codifican a los polipéptidos son también abarcados por la invención.
La presente invención adicionalmente proporciona polipéptidos que tienen uno ó más residuos eliminados del terminus carboxi de la secuencia de aminoácidos del TNF-gama-beta de la SEC ID NO: 20, hasta el reeiduo glicina en poeición número 6, y polinucleótidos que codifican a tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de residuos 1-m4 de la SEC ID NO: 20, en donde m4 es un entero en el rango de 6 a 250, y 6 es la posición del primer residuo del C-terminus del polipéptido TNF-gama-beta que se cree que se requiere para al menos la actividad inmunogénica de la proteína TNF-gama-beta.
Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que codifican a polipéptidos que comprenden, ó alternativamente consisten de, la secuencia de aminoácidos de residuos, M-l a L-250, M-l a F-249, M-l a A-248, M-l a G-247, M-l a F-246, M-l a F-245, M-l a T-244, M-l a K-243, M-l a D-242, M-l a E-241, M-l a K-240, M-l a T-239, M-l a Y-238, M-l a D-237, M-l a V-236, M-l a L-235, M-l a S-234, M-l a 1-233, M-l a D-232, M-l a S-231, M-l a V-230, M-l a N-229, M-l a V-228, M-l a M-227, M-l a L-226, M-l a K-225, M-l a D-224, M-l a G-223, M-l a E-222, M-l a Q-221, M-l a L-220, M-l a S-219, M-l a F-218, M-l a M-217, M-l a A-216, M-l a G-215, M-l a L-214, M-l a Y-213, M-l a 1-212, M-l a P-211, M-l a Q-210, M-l a F-209, M-l a W-208, M-l a N-207, M-l a S-206, M-l a G-205, M-l a V-204, M-l a E-203, M-l a C-202, M-l a V-201, M-l a S-200, M-l a K-199, M-l a T-198, M-l a G-197, M-l a M-196, M-l a L-195, M-l a L-194, M-l a Q-193, M-l a T-192, M-l a P-191, M-l a E-190, M-l a P-189, M-l a Y-188, M-l a S-187, M-l a D-186, M-l a T-185, M-l a V-184, M-l a K-183, M-l a T-182, M-l a 1-181, M-l a V-180, M-l a V-179, M-l a T-178, M-l a 1-177, M-l a S-176, M-l a D-175, M-l a P-174, M-l a K-173, M-l a N-172, M-l a P-171, M-l a R-170, M-l a G-169, M-l a A-168, M-l a Q-167, M-l a R-166, M-l a 1-165, M-l a E-164, M-l a S-163, M-l a C-162, M-l a E-161, M-l a S-160, M-l a T-159, M-l a M-158, M-l a G-157, M-l a R-156, M- -1 a F-155, M-l a T-154, M-l a V-153, M-l a Q-152, M-l a S- 151, M-l a Y-150, M-l a 1-149, M-l a F-148, M-l a Y-147, M- -1 a D-146, M-l a G-145, M-l a S-144, M-l a E-143, M-l a P- 142, M-l a 1-141, M-l a L-140, M-l a L-139, M-l a ,F-138, M- •1 a K-137, M-l a N-136, M-l a T-135, M-l a Y-134, M-l a N- 133, M-l a M-132, M-l a R-131, M-l a N-130, M-l a K-129, M- •1 a T-128, M-l a F-127, M-l a A-126, M-l a L-125, M-l a G- 124, M-l a L-123, M-l a E-122, M-l a H-121, M-l a E-120, M- •1 a -119, M-l a H-118, M-l a L-117, M-l a A-116, M-l a P- 115, M-l a F-114, M-l a Q-113, M-l a N-112, M-l a K-lll, M- -1 a F-110, M-l a H-109, M-l a Q-108, M-l a T-107, M-l a P- 106, M-l a T-105, M-l a Q-104, M-l a R-103, M-l a V-102, M- •1 a V-101, M-l a T-100, M-l a L-99, M-l a H- -98, M-l a A-97, M-l a R-96, M-l a P-95, M-l a K-94, M-l a D- -93, M-l a G-92, M-l a D-91, M-l a a-90, M-l a R-89, M-l a L- -88, M-l a P-87, M-l a A-86, M-l a Y-85, M-l a V-84, M-l a Q- -83, M-l a- Q-82, M-l a H-81, M-l a S-80, M-l a P-79, M-l a A- -78, M-l a F-77, M-l a E-76, M-l a Q-75, M-l a G-74, M-l a K- -73, M-l a L-72, M-l a A-71, M-l a Q-70, M-l a F-69, M-l a Q- -68, M-l a V-67, M-l a C-66, M-l a A-65, M-l a E-64, M-l a G- -63, M-l a Q-62, M-l a A-61, M-l a R-60, M-l a L-59, M-l a Q- -58, M-l a S-57, M-l a V-56, M-l a L-55, M-l a L-54, M-l a Y- -53, M-l a T-52, M-l a T-51, M-l a L-50, M-l a G-49, M-l a A- -48, M-l a L-47, M-l a F-46, M-l a P-45, M-l a L-44, M-l a L- -43, M-l a V-42, M-l a L-41, M-l a C-40, M-l a C-39, M-l a T-38, M-l a L-37, M-l a A-36, M-l a W-35, M-l a R-34, M-l a A-33, M-l a S-32, M-l a S-31, M-l a S-30, M-l a R-29, M-l a A-28, M-l a K-27, M-l a P-26, M-l a R-25, M-l a C-24, M-l a S-23, M-l a G-22, M-l a H-21, M-l a E-20, M-l a P-19, M-l a L-18, M-l a M-17, M-l a E-16, M-l a V-15, M-l a S-14, M-l a A-13, M-l a T-12, M-l a E-ll, M-l a G-10, M-l a F-9, M-l a S-8, M-l a L-7, y MI- a G-6 de la secuencia de la secuencia de TNF-gama-beta en la SEC ID NO: 20. Se proporcionan también los polinucleótidos que codifican a estos polipéptidos.
La invención también proporciona polipéptidos que tienen uno ó más aminoácidos eliminados de ambos terminus carboxilo y amino del polipéptido TNF-gama-beta, que puede describirse generalmente como que tienen residuos n4-m4 de la SEC ID NO: 20, en donde n4 y m4 son enteros que se describieron anteriormente. Los polinucleótidos que codifican a estos polipéptidos son también abarcados por la invención.
Modalidades adicionales de la invención están dirigidas hacia fragmentos se polipéptidos que comprenden, ó alternativamente consisten de, aminoácidos descritos por la fórmula general mx a n? , en donde m y n corresponden a uno cualquiera de los residuos de aminoácidos especificados anteriormente por estos símbolos, respectivamente, y x representa cualquier entero. La invención abarca también a los polinucleótidos que codifican a estos polipéptidos.
Modalidades específicae de la invención están dirigidas hacia las secuencias de nucleótidos que codifican a un polipéptido que consieten de una porción de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-alfa completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927, en donde esta porción excluye desde 1 hasta 62 aminoácidos del terminus amino de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depóeito en ATCC No. 75927, ó aproximadamente 1 aminoácido desde el terminus carboxi, ó cualquier combinación de las eliminaciones amino terminal y ^~? brvi ^~c_.-.i l Ho ]_a c?Ocu ^i3 Ho -ninoá'^idos completa codificada por el clon de cDNA. contenida en el Depósito en ATCC No. 75927. También se proporcionan los polinucleótidos que codifican a todas las formas de polipéptidos mutantes por eliminación anteriores.
En otra modalidad la invención está dirigida hacia una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que consiste de una porción de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta completo codificado por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055, en donde esta porción excluye desde 1 hasta 134 aminoácidos del terminus amino de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenida en el Depósito en ATCC No. 203055, ó excluye un número de aminoácidos del terminus amino de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055 (en donde el número es seleccionado de cualquier entero desde 1 hasta 134), ó aproximadamente 1 aminoácido del terminus carboxi, ó cualquier combinación de lae eliminaciones amino terminal y carboxi terminal anteriores, de la secuenca de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenida en el Depósito en ATCC No. 203055. La invención también abarca a los polinucleótidos que codifican a todos los polipéptidos anteriores .
La invención proporciona además un polipéptido TNF-gama aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID NO: 2 (por ejemplo, posiciones -27 a 147 de la SEC ID NO: 2); (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-alfa de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID NO: 2 exceptuando la metionina N-terminal (por ejemplo posiciones -26 a 147 de la SEC ID NO: 2), (c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-alfa maduro predicho que tiene la secuencia de aminoácidos en posiciones 1-147 en la SEC ID NO: 2 (d)la secuencia de aminoácidos completa codificada por 1 clon de cDNA HUVE091 contenida en el Depósito en ATCC No. 75927; (e) la secuencia de aminoácidos completa exceptuando la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927; y (f)la secuencia de aminoácidos completa del polipéptido TNF-gama maduro predicho codificado por el clon de cDNA HUVE091 contenido en el Depósito en ATCC No. 75927. Los polipéptidos de la presente invención también incluye polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 70 % idéntica, al menos 80 % idéntica, más preferiblemente al menos 90 % idéntica, y aún más preferiblemente 95 %, 96 , 97 %, 98 % ó 99 % idéntica a las descritas en (a), (b) , (c) , (d) , (e) ó (f), anteriores, ó fragmentos de éstos, como se describe en la presente.
La invención proporciona adicionalmente un polipéptido TNF-gama aielado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-beta de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID NO: 20 (por ejemplo, posiciones 1 a 251 de la SEC ID NO: 20); (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-beta de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la SEC ID NO: 20 exceptuando la metionina N-terminal (por ejemplo, posiciones 2 a 251 de la SEC ID NO. 20); (c) la secuencia de aminoácidos del poklipéptido TNF_gama-beta maduro predicho que tiene la secuencia de aminoácidos en posicionee 62-251 en la SEC ID NO: 20; (d) la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenida en el Depósito en ATCC No. 203055; (e)la eecuencia de aminoácidoe completa exceptuando la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el Depósito en ATCC No. 203055; y (f) la secuencia de aminoácidos completa del polipéptido TNF-gama maduro predicho codificado por el clon de cDNA HEMCZ56 contenido en el Depósito en ATCC No. 203055. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 70 % idéntica, al menos 80 % idéntica, más preferiblemente al menos 90 % idéntica y aún más preferiblemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99% idéntica a las descritas en (a), (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) anteriores, ó fragmentos de éstas, como se describe en la presente. En modalidades específicas, estos polipéptidos son al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.
Por un polipéptido , que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95 % "idéntica" a una eecuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido TNF-gama se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones en aminoácidos por cada 100 aminoácidos de los aminoácidos del polipéptido TNF-gama de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una eecuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5 % de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden eer eliminadoe ó substituidoe con otro aminoácido, ó un número de aminoácidos de hasta 5 % de los residuos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia pueden eer ineertados en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones amino ó carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia ó en donde sea entre las posiciones terminales, esparcidos ya sea individualmente entre residuos en la secuencia de referencia ó en uno ó máe grupoe contiguos en la secuencia de referencia.
Como un tema práctico, si cualquier polipéptido particular es al menos 90 ,%, 95 % , 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de las figuras ÍA y B (SEC ID NO: 2), la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA HUVE091 depositado, ó fragmentos de éste, puede determinarse convencionalmente utilizando programas de cómputo conocidos tales como el programa Bestfit (Wieconein Séquenee Análisis Package, Versión 8 para Unís, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI53711). Cuando se utiliza Bestfit ó cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo 95 % idéntica a una secuencia de referencia conforme a la presente invención, los parámetros se agrupan, por supuesto, de tal modo que el porcentaje de identidad se calcula en toda la extensión total de la secuencia de aminoácidos de referencia y que son permitidos espacios en la homología de hasta 5 % del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia. En una modalidad específica, la identidad entre una secuencia de referencia (de consulta) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia que se somete a la alineación, también mencionada como una alineación de secuenciae global, se determina utilizando el programa de cómputo FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y colaboradores ( Comp. . App. Biosci . 6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos usados en una, alineación de aminoácidos por FSTDB son: Matriz=PAM =, k-tuplo=2, Desventaja en desalíneo=l, Deeventaja en uniones=20, Extensión del Grupo de Aleatorizacíón=0, Interrupciones en los Registros= 1, Tamaño de la Ventana = Extensión de la Secuencia, Desventaja en los Espacios= 5, Desventaja en el tamaño de los Espacios = 0.05, tamaño de la ventana =500 ó la extensión de la secuencia de aminoácidos sometida a alineación, cualquiera que sea más corta. Conforme a esta modalidad, si la secuencia sometida a alineación es más corta que la secuencia de consulta debido a eliminaciones N- ó C-terminales, no a causa de eliminaciones internas, una corrección manual se hace a los resultados en consideración al hecho que el programa FASTDB no toma en cuenta de las truncaciones N- y C-terminales en la secuencia sometida a alineación cuando se calcula el por ciento de identidad global. Para las secuencias sometidas a alineación truncadas en los N- y C- terminus, en relación a la secuencia de consulta, el por ciento de identidad se corrige por cálculo del número de residuoe de la eecuencia de consulta que son N- y C- terminales de la secuencia sometida a alineación, los cuales no están emparejados/alineados con un reeiduo sometido a alineación correspondiente, como un por ciento de las bases totales de la secuencia de consulta. Una determinación de si un residuo es emparejado/alineado se determina por el resultado de la alineación de secuencias por FASTDB. Este porcentaje es entonces restado del por ciento de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros especificadoe, para llegar a la calificación del por ciento de identidad total. Esta calificación de por ciento de identidad total es el que se usa para propósitos de esta modalidad. Solamente los residuos en el N- y C-terminus de la secuencia sometida a alineación, que no están emparejados/alineados con la secuencia de consulta, se consideran para los propósitos de ajustar manualmente la calificación del % de identidad total. Esto es, solamente las posiciones de los residuos de consulta más lejanas a los residuos N- y C- terminales de la secuencia sometida a alineación. Por ejemplo, una secuencia sometida a alineación de 90 residuos de aminoácidos se alinea con una secuencia de consulta de 100 residuos para determinar el por ciento de identidad. La eliminación tiene lugar en el N-terminus de la secuencia sometida a alineación y por consiguiente, la alineación por FASTDB no demuestra emparejamiento/alineación de los primeros diez residuos en el N-terminus. Los diez residuoe no emparejados representan el 10 % de la secuencia (Número de residuos en los N- y C- terminus no emparejados/número total de residuos en la secuencia de consulta) así 10 % se resta de la calificación de por ciento de identidad calculado por el programa FASTDB. Si los 90 resíduoe restantes fueran perfectamente emparejados el por ciento de identidad total sería de 90 % . En otro ejemplo, una secuencia eometida a alineación de 90 residuos se compara con una secuencia de consulta de 100 residuos. Esta vez las eliminaciones son internae de modo que no hay residuos en el N- ó C- terminales de la secuencia sometida a alineación que no emparejen/alineen con la de consulta. En este caso el por ciento de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, solamente las posiciones de los residuos externos a los extremos N- y C-terminalee de la eecuencia sometida a alineación, son expuestos a la alineación por FASTDB, los cuales no se emparejan/alinean con la secuencia de consulta son corregidos manualmente. Ninguna otra corrección manual se hace para los propósitos de esta modalidad.
Los polipéptidos de la presente invención incluyen al polipéptido de la SEC ID NO: 2 (en particular al polipéptido maduro) así como también a polipéptidos que tienen 70 % de similitud (preferiblemente al menos 70 % de identidad) al polipéptido de la SEC ID NO: 2 y más preferiblemente al menos 90 % de similitud (más preferiblemente al menos 90 % de identidad) al polipéptido de la SEC ID NO: 2 y aún más preferiblemente al menos 95 % de similitud (aún más preferiblemente al menos 95 % de identidad) al polipéptido de la SEC ID NO: 2 y también incluye porciones de tales polipéptidos con tal porción del polipéptido generalmente que contiene al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen al polipéptido de la SEC ID NO: 20 (en particular la región extracelular del polipéptido) así como también polipéptidos que tienen al menos 70 % de similitud (preferiblemente al menos 70 % de identidad) al polipéptido de la SEC ID NO: 20 y más preferiblemente al menos 90 % de similitud (más preferiblemente al menos 90 % de identidad) al polipéptido de la SEC ID NO: 20 y aún más preferiblemente al menos 95 % de similitud (aún más preferiblemente al menos 95 % de identidad) al polipéptido de la SEC ID NO: 20 y también incluye porciones de tales polipéptidos con tal porción de polipéptido que contiene generalmente al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.
Polipéptidos adicionales de la presente invención incluye polipéptidos que tienen al menos 70 % de similitud, al menos 90 % de similitud, más preferiblemente al menos 95 % de similitud, y aún más preferiblemente al menos 96 % , 97 %, 98 % ó 99 % de similitud con los polipéptidos descritoe en la presente. Los polipéptidos de la invención también comprenden aquellos que son al menos 70 % idénticos, al menos 80 % idénticos, más preferiblemente al menos 90 % ó 95 % idénticos, aún más preferiblemente al menos 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % idénticos a los polipéptidos descritos en la presente. En modalidades específicas, tales polipéptidos comprenden al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente 50 aminoácidos .
Como es sabido en la especialidad la "similitud" entre dos polipéptidos se determina por comparación de la secuencia de aminoácidoe u sus aminoácidos substitutos conservados de un polipéptido de la secuencia de un segundo polipéptido. Por "o de similitud" para dos polipéptidos se entiende una calificación de similitud producida por la comparación de las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos utilizando el programa Bestfit (Wisconsin Seqúense Análisis Package, Versión 8 para Unís, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) y los grupos faltantes para la determinación de similitud. Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.
Los polipéptidos TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta de la invención pueden ser monómeros ó multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores) . En modalidades específicas, los polipéptidos de la invención son monómeros, dímeros, trímeros ó tetrámeros. En modalidades adicionalee, loe multímeroe de la invención son al menos dímeros, al menos trímeros, ó al menos tetrámeros.
Los multímeros que abarca la invención pueden ser homómeros, ó hetrómeros . Como se utiliza en la presente, el término homómero se refiere a un multímero que contiene solamente polipéptidos TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta de la invención (incluyendo fragmentos, variantes, y proteínas de fusión de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta, que se describen en la presente) . Estos homómeros pueden contener polipéptidos TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta que tienen secuencias de aminoácidos idénticas ó diferentes. En una modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene solamente polipéptidos TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica. En otra modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene polipéptidos TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta que tienen secuencias de aminoácidos diferentes. En modalidades específicas, el multímero de la invención es un homodímero (por ejemplo, que contenga polipéptidos TNF-gama-alfa que tenga secuencias de aminoácidos idénticas ó diferentes) ó un homotrímero (por ejemplo, que contenga polipéptidos TNF-gama-alfa que tengan secuenciae de aminoácidoe idénticas ó diferentes) . En modalidades adicionales, el multímero homomérico de la invención es al menos un homodímero, al menos un homotrímero, ó al menos un homotetrámero .
Como se utiliza en la presente, el término heterómero se refiere a un multímero que contiene polipéptidos heterólogoe (por ejemplo polipéptidoe de una proteína diferente) además de los polipéptidos TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta de la invención. En una modalidad específica, el multímero de la invención es un heterodímero, un heterotrímero, ó un heterotetrámero . En modalidades adicionales, el multímero homomérico de la invención es al menos un homodímero, al menos un homotrímero, ó al menos un homotetrámero .
Los multímeros de la invención pueden ser el resultado de asociaciones covalentes y/ó iónicas hidrofóbicas, hidrofílicas. De ese modo, en una modalidad, multímeros de la invención, tales como por ejemplo, homodímeros u homotrímeros, se forman cuando polipéptidos de la invención contactan a otro en solución. En otra modalidad, heteromultímeros de la invención, tales como, por ejemplo, heterotrímeros ó heterotetrámeros, se forman cuando polipéptidos de la invención contactan a anticuerpos de los polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos de la secuencia del polipéptido heterólogo en una proteína de fusión de la invención) en solución. En otras modalidades, multímeros de la invención se forman por interacción covalente con y/ó entre los polipéptidos TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta de la invención. Tales interacciones covalentes pueden involucrar uno ó más residuos de aminoácidos correspondientes a los multimencionados en la SEC ID NO: ó la SEC ID NO: , ó correspondientes a uno ó más residuos de aminoácidos codificados por el clon . Alternativamente, tales interacciones covalentee pueden involucrar a uno ó más residuos de aminoácidos contenidos en la secuencia de polipéptido heterólogo en una proteína de fusión TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta, tal como por ejemplo, la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión TNF-gama-alfa-Fc (como se describe en la presente) , y la secuencia heteróloga contenida en una fusión con una secuencia de polipéptido heterólogo de otro miembro receptor/ligando de la familia TNF, tal como, por ejemplo, osteoprotegerina, que es capaz de formar multímeros asociados covalentemente.
La invención también abarca proteínas de fusión en las cuales el polipéptido TNF—gama de extensión total ó fragmento, variante, derivado ó análogo del mismo se fusiona a una proteína no relacionada. Las proteínas de fusión de la invención pueden ser construidas como fusión directa del polipéptido TNF-gama (ó fragmento, variante, derivado, ó análogo) y una secuencia heteróloga, ó puede ser construida con una región espaciadora ó adaptadora que tenga uno ó más aminoácidos insertados entre las dos porciones de la proteína. Opcionalmente la región espaciadora puede codificar a un sitio de fragmentación de proteasa. El sitio preciso de la fusión no es crítico y puede ser variado rutinariamente por los expertos en la materia a fin de maximizar las características de enlace y/ó de actividad biológica de las secuencias homologas y/ó heterólogas. Las proteínas de fusión de la invención pueden ser rutinariamente designadae sobre las bases de las secuencias del polipéptido y de nucleótidos de TNF-gama, expuestas en la presente. Por ejemplo, como apreciará un experto en la materia, los polipéptidos TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta y fragmentos (que incluyen fragmentos con epítopes de apoyo) de éstos descritos en la presente pueden combinarse con partes de la región constante de inmunoglobulinas (IgG) , que dan como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilita la purificación y exhibe una vida media incrementada in vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que consieten de las primeras dos regiones del polipéptido CD4 humano y varias regiones de lae regionee constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas de mamíferos (EP A 394,827; Traunecker, y colaboradores, Na ture 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica enlazada a disulfuro debido a la parte IgG pueden también ser más eficientes en enlazar y neutralizar otras moléculas que la proteína TNF-gama monomérica ó fragmento de proteína sola (Fountoulakis, y colaboradores, J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). Como un ejemplo, una fusión TNF-gama-Fc tal se ha producido en la presente como se describió anteriormente. En otras modalidades, el polipéptido TNF-gama de extensión total ó fragmento, variante, derivado, ó análogo del mismo está fusionado a uno ó más secuencias de polipéptidos heterólogos que son capaces de formar formaciones multiméricas, tales como, por ejemplo, la región de dimerización de osteoprotegrina (ver, por ejemplo, EP 0 721 983, Patente USA No. 5,478,925, y la Publicación Internacional No. WO 98/49305, cada uno de los cualee es incorporado a la presente en su integridad como referencia) . Ejemplos adicionales de proteínas de fusión TNF-gama que son abarcados por la invención incluyen, pero no se limitan a, fusión de la secuencia del polipéptido de TNF-gama a cualquier secuencia de aminoácidos que permita a la proteína de fusión desplegarse sobre la superficie celular; ó fusionee a una enzima, proteína fluorescente, ó proteína luminescente que proporciona una función marcadora.
Modificaciones de polipéptidos OPG quiméricos son abarcados por la invención e incluyen modificaciones post-translacionales (por ejemplo cadenas de carbohidratos N-enlazadae u O-enlazadae, proceeadoras de extremos N-terminal ó C- terminal), fijación de porciones químicas a la estructura central de aminoácidos, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos N-enlazados u 0-enlazadoe, y adición de un reeiduo metionina N-terminal como un resultado de expresión en células huéspedes procarióticas. Los polipéptidos pueden también ser modificados con un marcador detectable, tal como marcador enzimático, fluorescente, isotópico ó por afinidad para permitir la detección y aislamiento de la proteína.
La invención proporciona también derivados de OPG modificados químicamente que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como incremento de la solubilidad, estabilidad y tiempo circulante del polipéptido, ó disminución de la inmunogenicidad (ver patente USA NO. 4,179,337). Las porciones químicas para derivación pueden seleccionarse de polímeros solubles en agua tales como polietilen glicol, etilen glicol/copolímeros de propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y los similaree. Loe polipéptidos pueden ser modificados en posiciones al azahar en la molécula, ó en posiciones predeterminadas en la molécula y puede incluir uno, dos, tres, ó más porciones químicas fijadas.
El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado ó no ramificado. Para el polietilen glicol el peso molecular está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en preparaciones de polietilen glicol algunas moléculas pesaran más algunas menos, que el peso molecular establecido) para facilidad en manejo y fabricación. Pueden usarse otros tamaños dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos sobre la actividad biológica, si hay alguno, la facilidad en el manejo, el grado ó falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilen glicol en una proteína terapéutica ó análogo) .
Las moléculas de polietilen glicol (u otras porciones químicas) serían fijadas a la proteína considerando los efectos sobre las regiones funcionales ó antigénicas de la proteína. Hay un número de métodos de fijación disponibles para los expertos en la materia, por ejemplo, EP 0 401 384, incorporada a la presente como referencia (acoplamiento PEG a G-CSF), ver también Malik y colaboradores, Exp. Hema tol . 20:1028-1035 (1992) (que reporta la pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo) . Por ejemplo, el polietilen glicol puede ser enlazado covalentemente hasta a residuos de aminoácidos vía un grupo reactivo, tal como, grupo amino ó carboxilo libre. Grupos reactivos son aquellos en los cuales una molécula de polietilen glicol puede enlazarse. Los residuos de aminoácidoe que tienen un grupo amino libre incluyen reeiduos de lisina y residuos de aminoácidos N-terminales; aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y residuo de aminoácido C-terminal. Los grupos sulfhidrilo pueden usarse también como grupo reactivo para fijar la molécula de polietilen glicol. Para propósitos terapéuticos se prefiere fijación a un grupo amino, tal como fijación al N-terminus ó grupo lisina.
Se puede desear específicamente proteínas químicamente modificadas en el N- terminus. Utilizando polietilen glicol como una ilustración de la presente composición, se puede seleccionar desde una variedad de moléculas de polietilen glicol (por peso molecular, ramificación, etc.) la proporción de moléculas de polietilen glicol a moléculas de proteína (ó péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación a ser efectuada, y el método de obtención de la proteína pegilada N-terminalmente seleccionada (por ejemplo, separar estas porciones de otras porciones monopegiladas si es necesario) puede ser por purificación del material pegilado N-terminalmente de una población de moléculas de proteínas pegiladas. Proteínas selectivas químicamente modificadas en la modificación N-terminus puede lograrse por alquilación reductiva que explota la reactividad diferencial ó diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina versus el N- terminal) disponible para derivación en una proteína particular. En las condiciones de reacción apropiadas, se logra, la derivación substancialmente selectiva de la proteína en N-terminus con un grupo carbonilo que contiene el polímero.
Los polipéptidos de la presente invención tienen usos que incluyen, pero no s„e limitan a, marcador de peso molecular sobre geles SDS-PAGE ó sobre columnas de filtración de geles de malla molecular que utilizan métodos conocidos por los expertos en la materia.
Actividades Funcionales La actividad funcional de los polipéptidos TNF-gama, y fragmentos, variantes, derivados, y análogos de los mismos, pueden ensayarse por varios métodos.
Por ejemplo, en una modalidad en donde se ensaya por la habilidad para enlazar ó comparar con el polipéptido TNF-gama de extensión total por enlazar al anticuerpo anti-TNF-gama, pueden usarse varios inmunoensayos conocidos por los expertos en la materia, que incluyen pero no se limitan a sistemas de ensayo comparativos ó no- comparativos utilizando técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente de enlace de enzimas), inmunoensayo "sandwich", ensayo inmunoradiométrico, reacciones de precipitación por difusión de gel, ensayos por inmunodifusión, inmunoensayos in situ (utilizando marcadores como oro coloidal, enzima ó radioisótopos, por ejemplo), , ensayos por manchado Western, por reacciones de precipitación, por aglutinación (por ejemplo ensayos por aglutinación sobre gel),, ensayos por hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayoe por inmunofluorescencia, ensayos con la proteína A, e ensayos por inmunoelectroforesis, etc. En una modalidad, se detecta el anticuerpo enlazante por detección de un marcador sobre el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario se detecta por detección del enlace de un anticuerpo ó reactivo secundario a un anticuerpo primario. En una modalidad adicional, el anticuerpo secundario está marcado. Muchos medios se conocen en la materia para detectar enlaces en un inmunoensayo y están en el alcance de la presente invención.
En otra modalidad, en el que se identifica un TNF-ligando puede ensayarse el enlace, por ejemplo, por medios conocidos en la materia. En otra modalidad, puede ensayarse la correlación fisiológica del enlace de TNF-gama a sus substratos (indicación de transducción) .
Además, los ensayos descritos en la presente (ver los ejemplos 5, 6, y 9-15, y de otra forma conocidos en la materia pueden rutinariamente aplicarse para medir la capacidad de los polipéptidos TNF-gama y fragmentos, variantes, derivados y análogos del mismo par provocar la actividad biológica relacionada con TNF-gama (por ejemplo, inhibir, ó alternativamente promover, la proliferación celular, formación de tumores, angiogénesie, adhesión celular y activación de NF-kB in vi tro ó in vivo) .
Otros métodos serán conocidoe por los expertos en la materia y están en el alcance de la invención.
Anticuerpos La presente invención concierne adicionalmente a anticuerpos y receptores de antígenos de células T (TCR) los cuales enlazan específicamente a los polipéptidos de la invención. Los anticuerpos de la presente invención incluyen IgG (que incluyen IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4) , IgA (que incluye IgAl e IgA2) , IgD, IgE, ó IgM e IgY. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" (Ab) significa incluir los anticuerpos en sutotalidad, incluyendo el conjunto de anticuerpos de una sola cadena, y los fragmentos enlazantes de antígeno de los mismos. Más preferiblemente los anticuerpos son fragmentos de anticuerpoe que enlazan a antígeno humanos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab' , y F(ab')2, Fd, Fvs de una sola cadena (scFv) , anticuerpos de una sola cadena, Fvs enlazados s disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden ya sea un región VL ó VH. Los anticuerpos pueden ser originarios de cualquier animal, incluyendo pájaros y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos eon humanos, de murina, de conejo, cabra, cobayo, camello, caballo, ó pollo.
Los fragmentos de anticuerpo enlazantes de antígeno, que incluyen anticuerpos de una sola cadena, pueden comprender las regiones variables solas ó en combinación con la totalidad ó parte de los siguientes: región eje, regiones CH1, CH2 y CH3. También se incluyen el la invención cualquier combinación de lae regiones variables y región eje, regiones CH1, CH2 y CH3. la presente invención incluye adicionalmente anticuerpos quiméricos, humanizados, y monoclonales y policlonales humanos que específicamente enlazan a los polipéptidos de la presente invención. La presente invención incluye adicionalmente anticuerpos que son anti-idiotípicos de los anticuerpos de la presente invención.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecífieos, biespecíficos ó triespecíficos ó de multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecífieos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido de la presente invención ó pueden ser específicos para ambos un polipéptido de la presente invención así como también para composiciones heterólogas, tales como un polipéptido heterólogo ó material de soporte sólido. Ver, por ejemplo WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. y colaboradores (1991) J. Immunol . 147:60-69; patentes USA 5,573,920, 4,474,893, 5,601,819, 4,714,681, 4,925,648; Kostelny, S.A. y colaboradores (1992) J. I munol . 148:1547-1553.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser descritos ó especificados en términos de los epítopes ó porciones de un polipéptido de la presente invención que son reconocidos ó específicamente enlazados por el anticuerpo. Los epítopes ó porciones de polipéptidos pueden especificarse como se describe en la presente. Por ejemplo, por posiciones N- teminal y C-terminal, por tamaño en residuos de aminoácidos contiguos, ó enlistados en las Tablas y Figuras. Los anticuerpos que específicamente enlazan a cualquier epítope ó polipéptido de la presente invención pueden excluirse. Por consiguiente, la presente invención incluye anticuerpos que específicamente enlazan a polipéptidos de la presente invención y tienen en cuenta la exclusión del mismo.
Los anticuerpos de la presente invención pueden también deecribirse ó especificarse en términos de su reactividad cruzada. Se incluyen los anticuerpos que no enlazan a cualquier otro análogo, ortólogo, u homólogo de los polipéptidos de la presente invención. Los anticuerpos que no enlazan a polipéptidos con menos de 95 %, menos de 90 %, menos de 85 %, menos de 80 % , menos de 75 %, menos de 70 -, menos de 65 % , menos de 60 % , menos de 55 %, y menos de 50 % de identidad (como se calculó utilizando métodos conocidos en la materia y descritos en la presente) . Adicionalmente incluidos en la presente invención son los anticuerpos que solamente enlazan a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridizan a un polinucleótido de la presente invención en condiciones de hibridización severas (como se describe en la preeente) . Los anticuerpos de la presente invención pueden también describirse ó especificarse en términos de su afinidad de enlace. Afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación ó Kd inferior a 5X10_6M, 10_6M, 5X10"7M, 10"7M, 5X10~_-, 10"8M, 5X10_9M, 10_9M, 5X10"10M, 10"10M, 5X10"1--, 10~1XM, 5X10~12M, 10"12M, 5X10"13M, 10"13M,5X10~ 14M, 10"14M, 5X10"1 --, 10"15M.
Los anticuerpos de la presente invención tienen usoe que incluyen, pero no ee limitan a, métodos conocidos en la materia para purificar, detectar y seleccionar como objetivo los polipéptidos de la presente invención que incluyen ambos métodos de diagnóstico y terapéutica in vi vo e in vi tro . Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayoe para determinar cuantitativamente y cualitativamente nivelee de los polipéptidos de la presente invención en muestrae biológicae. Ver, por ejemplo, Harlow y colaboradores, ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a. Ed 1988) (incorporado a la presente como referencia en su integridad) .
Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse ya sea solos ó en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos pueden adicionalmente ser fusionados recombinantemente a un polipéptido heterólogo en el ?- ó C-terminus ó conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentemente y no covalentemente) a polipéptidos o a otras composiciones: Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse ó conjugarse recombinantemente a moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipoéptidos hetrólogos, fármacos, ó toxinas.
Ver, por ejemplo, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente USA 5,314,995; y EP 0 396 387.
Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por métodoe adecuados conocidos en la materia. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención ó un fragmento antigénico del mismo puede administrarse a un animal a fin de inducir la producción de suero que contenga anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una variedad de técnicas conocidas en la materia que incluyen el uso de tecnología de hibridoma y recombinante. Ver, por ejemplo, harlow y colaboradores, ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a. Ed. 1988); Hammerling, y colaboradores, en MO?OCLO?AL A?TIBODIES A?D T-CALL HYBRIDOMAS 563-681 (Elsevier, ?.Y. 1981) (dichas refeencias se incorporan en su integridad como referencias) .
Los fragmentos F(ab')2 pueden producirse por fragmentación proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) ó pepsina (para producir fragmentos F(ab')2).
Alternativamente, los anticuerpos de la presente invención pueden producirse a través de la aplicación de la tecnología de DNA recombinante ó a través de química sintética utilizando métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse utilizando varios métodos de exposición de fago conocidos en la materia. , En los métodos de exposición de fago, regiones de anticuerpos funcionales se exponen sobre la superficie de una partícula de fago que lleva secuencias de polinucleótidos que los codifican. Los fagos con una propiedad de enlace deseada son seleccionados de un repertorio ó acervo de anticuerpos combinatorio (por ejemplo humano ó de murina) seleccionando directamente con antígeno, antígeno típicamente enlazado ó capturado a una superficie sólida ó perla. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentoso que incluyen fd y M13 con regiones Fab, Fv ó Fv estabilizada con disulfuro del anticuerpo recombinantemente fusionadas ya sea al gen III del fago ó a la proteína del gen VIII. Ejemplos de los métodos de exposición de fago que pueden usarse para elaborar los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman U. y colaboradores (1995) J. I munol . Methods 182:41-50; Ames, R. S. y colaboradores (1995)) J. Immunol . Methods 184:177-186; Kettleborough, C.a. y colaboradores (1994) Eur. J. Immunol . 24:952-958; Persic. L. y colaboradores (1997) Gene 187 9-18; Burton, D.R. y colaboradores (1994) Advances in Immunology 57:191-280; PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15984; WO 95/20401; y Patentes USA 5,698,426, 5,223,409,5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5„658,727, y 5,733,743 (dichas referencias se incorporan a la presente en su integridad) .
Como se describió en referencias anteriores, después de la selección del fago, el anticuerpo que codifica las regiones del fago puede ser aislado y usado para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, ó cualsuier otro fragmento con enlace antigénico deseado, y expresado en cualquier huésped deseado incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levaduras, y bacterias. Por ejemplo, técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 pueden emplearse también utilizando métodoe conocidos en la materia tales como los descritos en WO 92/22324; Mullinax, R. L. y colaboradores (1992) Biotechniques 12 ( 6) : 864-869; y Sawai, H. y colaboradores (1995) AJRI 34:26-34; y Better, M. y colaboradores (1988) Sci ence 240:1041-1043 (mismas que se incorporan en su integridad como referencia) .
Ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fvs de una sola cadena y anticuerpos incluyen los descritos en las Patentes USA 4,946,778 y 5,258,498; Huston y colaboradores (1991) Methods in Enzymology 203:46-88; Shu, L. y colaboradores (1993) PNAS 90:7995-7999; y Skerra, A. Y colaboradores (1988) Science 240:1038-1040. Para algunos usos, que incluyen el uso in vivo de anticuerpos en Humanos y en ensayos de detección in vi tro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados ó humanos. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la materia. Ver por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y colaboradores, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies, S. D. Y colaboradores (1989) J. Immunol . Methods 125:191-202; y Patente USA 5,807,715. Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una variedad de técnicas que incluyen injerto-CDR (EP 0 239 400; WO 91/09967; Patente USA 5,530,101; y 5,585,089), revestidos ó superficiales (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E.A., (1991) Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M. Y colaboradores (1994) Protein Engineering 7 (6) : 805-814; Roguska M.A. y colaboradores (1994) PNAS 91:969-973), y redistribución de cadena (Patente USA 5,565332). Los anticuerpos humanos pueden elaborarse por una variedad de métodos conocidos en la materia que incluyen los métodos de exposición de fago deecritos anteriormente. Ver también, Patentes USA 4,444,887, 4,716,111,5,545,806, y 5,814,318; y WO 98/46645 (mismas que se incorporan en su integridad como referencia) .
Son incluidos adicionalmente en la invención anticuerpos fusionados recombinantemente ó conjugados químicamente ( incluyendo ambas conjugaciones covalentemente y no covalentemente) a un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse para seleccionar objetivos de los polipéptidos de la invención en particular tipos celulares, ya sea in vi tro ó in vivo, por fusión ó conjugación de los polipéptidos de la presente invención a anticuerpos específicos por receptores superficiales celulares particulares.
Los anticuerpos fusionados ó conjugados a los polipéptidos de la presente invención pueden también usarse en inmunoensayos in vi tro y métodos de purificación que utilizan métodos conocidos en la materia. Ver por ejemplo, harbor y colaboradores , supra y WO 93/21232; EP 0 439 095; Naramura, M. y colaboradores (1994) Immunol . Lett 39:91-99; Patente USA 5,474,981; Gillies, S.O. y colaboradores (1992) PNAS 89: 1428-1432; Fell, H.P. y colaboradores (1991) J.
I munol . 146:2446-2452 (mismas que se incorporan en su integridad como referencia) .
La presente invención incluye adicionalmente composiciones que comprenden loe polipéptidos de la presente invención fusionados ó conjugados a regiones de anticuerpos diferentes de las regionee variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden estar fusionados ó conjugados a una región Fc de un anticuerpo, ó a una porción de la misma. La porción de anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede comprender la región eje, la región CH1, la región CH2 y la región CH3 ó cualquier combinación de regiones completas ó porciones de ellas. Los polipéptidos de la presente invención pueden estar fusionados ó conjugados a las porciones de anticuerpos anteriores para aumentar la vida media in vivo de los polipéptidos ó para uso en inmunoeneayoe utilizando métodos conocidos en la materia. Los polipéptidos pueden estar fusionados ó conjugados a las porciones de anticuerpos anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, porciones Fc fusionadas a los polipéptidos de la presente invención pueden formar dímeros a través de enlaces disulfuro entre las porciones Fc. Pueden elaborarse formas multiméricas superiores por fusión de los polipéptidos a porciones de IgA e IgM.
Métodos para fusionar ó conjugar los polipéptidos de la presente invención a porciones de anticuerpos, son conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, Patentes USA 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,112,946; EP 0 307 434, , EP 0 367 166; WO 96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi, A. Y colaboradores (1991) PNAS 88:10535-10539; Zheng, X. X. Y colaboradores (1995) J. Immunol . 154:5590-5600; y Vil, H. Y colaboradores (1992) PNAS 89:11337-11341 (mismas que se incorporan en su integridad como referencia) .
La invención concierne adicionalmente a anticuerpos que actúan como agonistas ó antagonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que interrumpen las interacciones del receptor/ligando con los polipéptidos de la invención ya sea parcial ó totalmente. Se incluyen ambos los anticuerpos específicos para receptores y los anticuerpos específicos para ligandos. Se incluyen los anticuerpos específicos para receptores que no previenen el enlace del ligando pero previenen la activación del receptor. La activación del receptor (por ejemplo, indicadores) pueden determinarse por técnicas descritas en la presente ó de otra manera conocidos en la materia. También se incluyen los anticuerpos específicos para receptores que previenen ambos enlace de ligando y activación de receptor. Similarmente, se incluyen anticuerpos neutralizantes que enlazan al ligando y previenen el enlace del ligando al receptor, así como también anticuerpos que enlazan al ligando, con lo que se previene la activación del receptor, pero no se previene al ligando de enlazar al receptor. Se incluyen adicionalmente anticuerpos que activan al receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas ya sea para todas ó bien para menos de las actividades biológicas afectadas por la activación del receptor mediada por el ligando. Los anticuerpos pueden especificarse como agonistas ó antagonistas de actividades biológicas que comprenden las actividades específicas descritas en la presente invención-Los anticuerpos agonistas pueden elaborarse utilizando métodos conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, WO 96/40281; Patente USA 5,811,097; Deng, B. y colaboradores (1998) Blood 92(6): 1981-1988; Chen, Z. y colaboradores (1998) Cáncer Res . 58 (16) : 3668-3678; Harrop, J. A. Y colaboradores (1998) J. Immunol . 161 (4) : 1786-1794; Zhu, Z. y colaboradores (1998) Cáncer Res . 58 (15) : 3209-3214; Ion, D. Y. Y colaboradoree (1998) J. Immunol . 160 (7) : 33170-3179; Prat, M. y colaboradores (1998) J. Cell . Sci . 111 (Pt2) : 237-247; Pitard, V. Y colaboradores (1997) J. Immunol . Methods 205(2) : 177-190; Liautard, J. y colaboradores (1997) Cytokine 9 (4) :233-241; Carlson, N. G. y colaboradores (1997) J. Biol . Chem. 272 (17) : 11295-11301; Taryman, R.E. y colaboradores (1995) Neuron 14 (4) :755-762; Muller, y. A. Y colaboradores (1998) Structure 6 (9) : 1153-1167; Bartunek, P. y colaboradores (1996) Cypokine 8(l):14-20 (mismas que se incorporan en su integridad como referencia) .
Transgénicos Los polipéptidos de la invención expresarse también en animales transgénicos. Animales de cualquier especie, que incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, hámster, cobayos, cabras, ovejas, vacas y primates no-humanos, por ejemplo, mandriles, monos, y chimpancés pueden usarse para generar animales transgénicos. En una modalidad específicas, se utilizan técnicas descritas en la presente ó conocidas de otra manera en la materia, para expresar polipéptidos de la invención en humanos, como parte de un protocolo de terapia genética.
Puede usarse cualquier técnica conocida en la materia para introducir el transgen (por ejemplo, polinucleótidos de la invención) en animales para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a microinyección pronuclear (cada una de las referencias siguientes se incorporan a la presente) Paterson y colaboradores, Appl . Microbiol . Biotechnol . 40:691-698 (1994); Carver y colaboradores, Biotechnology (NY) 11 : 1263-1270 (1993); Wright y colaboradores, Biotechnology (NY) 9:830-834(1991); y Hoppe y colaboradores, patente USA No. 4,873,191 81989)); transferencia genética mediada por retrovirus en líneas germinales (las siguientes referencias se incorporan a la presente) Van der Putten y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 82:6148-6152)), de blastocitos ó embriones; por selección del objetivo genético en célulae germinales embrionarias (cada una de las siguientes referencias se incorpora a la presente) Thompson y colaboradores, Cell 56:313-321 (1989)); electroporación de células ó embriones (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol.. 3:1803-1814 (1983)); introducción de los polinucleótidos de la invención utilizando un gen de arranque ( (las siguientes referencias se incorporan a la presente) ver, por ejemplo, Ulmer y colaboradores, Sci ence 259:1745 (1993); introducción de construcciones de ácidos nucleicos en células germinales pleuripotenes embrionarias y transferencia de células germinales de retorno en el blastocito; y transferencia genética mediada por esperma ( (las siguientes referencias se incorporan a la presente) Lavitrano y colaboradores, Cell 57:717-723 (1989); etc. Para una revisión de tales técnicas ver Gordon, "Transgenic Animáis," Intl . Rev. Cytol . 115:171-229 (1989), que se incorpora en su integridad como referencia.
Puede utilizarse cualquier técnica conocida en la materia para producir clones transgénicos que contengan polinucleótidos de la invención, por ejemplo, transferencia nuclear en oocitos anucleados de núcleos de células embriónicas, fetales, ó de adulto cultivadas, inducidas para quiescencia ( (cada una de las referencias se incorpora al la presente) Campell y colaboradores, Nature 380:64-66 (1996); Wilmut y colaboradores, Na ture 385:810-813 (1997)).
La presente invención cubre la necesidad de animales transgénicos que lleven el transgen en todas sus células, así como también animalee que lleven el transgen en algunas pero no en todas sus células, por ejemplo, animales en mosaico ó quiméricos. El transgen puede integrarse como un solo transgen ó como copias múltiples tal como en concatámeros, por ejemplo, tándems cabeza-cabeza ó tándems cabeza-cola. El transgen puede también introducirse selectivamente en y activado en un tipo celular particular por lo siguiente: por ejemplo, la demostración de lasko y colaboradores ( (las siguientes referencias se incorporan a la presente) Lasko y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci .
USA 89:6232-6236 (1992)). Las secuencias reguladoras requeridas para una activación específica del tipo celular tales dependerán del tipo celular particular de interés, y será obvio a los expertos en la materia. Cuando se desea que el transgen del polinµcleótido se integre en el sitio cromosómico del gen endógeno, se prefiere la selección del objetivo genético. Brevemente, cuando una técnica tal se utiliza, los vectores que contienen algunas secuencias de nucleótidos homologas en el gen endógeno están indicadas para el propósito de integración, vía recombinación homologa con secuencias cromosómicas, en e interrumpiendo la función de la secuencia de nucleótidos del gen endógeno. El transgen puede también introducirse selectivamente en un tipo celular particular, inactivando de ese modo al gen endógeno en solamente ese tipo celular, por lo siguiente, por ejemplo, lo demostrado por Gu y colaboradores ( (la siguiente referencia se incorpora a la presente) Gu y colaboradores, Science 265:103-106 (1994)). Las secuencias reguladoras que se requieren para una inactivación específica de tipo celular tal dependerá del tipo celular particular de interés, y será obvio para los expertos en la materia .
Una vez que se han generado los animales transgénicos, la expresión del gen recombinante puede ensayarse utilizando técnicas estándares. La selección inicial puede lograrse por análisis por manchado Southern ó por técnicas de PCR para analizar los tejidos del animal para verificar que ha tenido lugar la integración del transgen. El nivel de expresión de mRNA del, transgen en los tejidos de los animales transgénicos puede también evaluarse utilizando técnicas que incluyen, pero no se limitan a, análisis por manchado Northern de muestras de tejido obtenidas del animal, análisis por hibridización in si tu, y PCR de la transcriptasa inversa (rt-PCR) . Las muestras de tejido que expresó el gen transgénico pueden también evaluarse inmunoquímicamente ó inmunohistoquímicamnete utilizando anticuerpos específicos para el producto transgénico.
Una vez que se han producido los animales fundadores, pueden ser reproducidos, por indogamia, por exogamia ó por reproducción cruzada para producir colonias del animal particular. Ejemplos de tales estrategias de reproducción incluyen, pero no se limitan a, exogamia de los animales fundadores con más de un sitio de integración a fin de establecer líneas separadas; indogamia de líneas separadas a fin de producir transgénicos compuestos que expresan el transgen a niveles superiores a causa del efecto de la expresión aditiva de cada transgen; cruzamiento de animales transgénicos heterocigóticos para producir animales homocigóticos para un sitio de integración dado a fin de logra ambas, el aumento de la expresión y eliminar la necesidad de la selección de los animales por análisis de DNA; cruzamiento de líneas homocigóticas separadas para producir líneas homocigótipas ó heterocigóticas compuestas; y que la reproducción del transgen tenga lugar sobre un campo diferente que sea apropiado para un modelo experimental de interés.
Los animales transgénicos y "agotados" de la invención tienen usoe que incluyen, pero no se limitan a, sistemas modelo de animales útiles en la elaboración de la función biológica de los polipéptidos TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta, estudiando las condiciones y/ó transtornos asociados con expresiones de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta aberrantes, y en la selección de compuestos efectivos en el mejorar tales condiciones y/ó transtornos.
La expresión de genes endógenos puede reducirse por inactivación ó "agotamiento" del gen y/ó su promotor que utiliza la selección de objetivos para recombinación homologa. (cada una e las siguientes referencias se incorporan a la presente) Por ejemplo, ver Smithies y colaboradores, Na ture 317:230-234 (1985); Thomas & Capecchi, Cell 51:503-512 (1987); Thompson y colaboradores, Cell 5:313-321 (1989); cada uno de los cuales se incorpora en su integridad a la presente como referencia) . Por ejemplo, puede usarse un polinucleótido mutante, no- funcional de la invención (ó una secuencia de DNA ein relación completamente) flanqueado por DNA homólogoe en la secuencia de polinucleótidos endógena (ya sea regiones codificantes ó regiones reguladoras del gen) , con ó sin un marcador seleccionable y/ó un marcador seleccionable negativo, para transfectar células que expresen a los polipéptidos de la invención in vivo. En otra modalidad, se usan técnicas conocidas en la materia para generar agotamiento en células que contengan, pero que no expresen el gen de interés. La inserción de la construcción de DNA, vía recombinación homologa por selección de objetivos, dá como resultado la inactivación del gen objetivo. Tales procedimientos son particularmente satisfactorios en los campos de investigación y agricultura en donde las modificaciones en células germinales embriónicas pueden usarse para generar la descendencia del animal con un gen objetivo inactivo ( (cada una de las siguientes referencias se incorporan a la presente) por ejemplo, ver Thomas Capecchi 1987 y Thompson 1989, supra ) . Sin embargo este procedimiento puede adaptarse rutinariamente para uso en humanos a condición de que las construcciones de DNA recombinante sean directamente administradas ó aplicadas en el sitio requerido in vivo, utilizando vectores virales apropiados que serán obvios para los expertos en la materia.
En modalidades adicionales de la invención, las células diseñadas genéticamente para expresar a los polipéptidos de la invención, ó alternativamente, que se diseñan genéticamente para no expresar a los polipéptidos de al invención (por ejemplo agotadas) se administran a un paciente in vivo. Tales células pueden obtenerse del paciente (por ejemplo, animal, incluyendo humano) ó un donador de MHC compatible y puede incluir pero no limitarse a fibroblastos, células de médula ósea, células sanguíneas, (por ejemplo, linfocitos), adipositos, células musculares, células endoteliales, etc. Las células son genéticamente diseñadas in vi tro utilizando técnicas de DNA recombinante para introducir la secuencia codificante de los polipéptidos de la invención en las células, ó alternativamente, para disruptar la secuencia codificante y/ó la secuencia reguladora endógena asociada con los polipéptidos de la invención, por ejemplo, por procedimientos de transducción (utilizando vectores virales, y preferiblemente vectores que integran el transgen en el genoma celular) ó de transfección, que incluyen, pero no se limitan a, el uso de plásmidos, cósmidos, YACs, DNA puros, electroporación, liposomas, etc. La secuencia codificante de los polipéptidos de la invención puede colocarse bajo el control de un promotor constitutivo resistente ó promotor inducible ó promotor/mejorador para , lograr la expresión, y preferiblemente secreción, de los polipéptidos de la invención. Las células diseñadas que expresan y preferiblemente secretan los polipéptidos de la invención pueden ser introducidas en el paciente sistemáticamente, por ejemplo, en la circulación ó intraperitonealmente. Alternativamente, las células pueden incorporarse en una matriz e implantarse en el cuerpo, por ejemplo, fibroblastos diseñados genéticamente pueden implantarse como parte de un injerto de piel; células endoteliales diseñadas genéticamente pueden implantarse como parte de un injerto vascular ó linfático. ((cada una de las siguientes referencias se incorporan a la presente) Ver, por ejemplo, Anderson y colaboradores Patente USA No-5,399,349; y Mulligan & Wilson, Patente USA No. 5,460,959 cada una de las cuales se incorpora totalmente a la presente como referencia) .
Cuando las células a ser administradas son células no-autólogas ó no-compatibles con MHC, pueden administrarse utilizando técnicas muy conocidas que previenen el desarrollo de una respuesta en el huésped contra las células introducidas. Por ejemplo, las células pueden introducirse en una forma encapsulada la cual, mientras que admite un intercambio de componentes con el ámbito extracelular inmediato, , no permite a las células introducidas ser reconocidas por el sistema inmune del huésped.
Transtornos Relacionados con los Sistemas Inmune y Circulatorio Diagnóstico Los inventores de la presente descubrieron que TNF-gama es expresado en células endoteliales de la vena umbilical, células endoteliales inducidas, macrófagos, y tejido de substancia negra. Para un número de transtornos relacionados con los sistemas inmune y circulatorio, niveles substancialmente alterados (aumento ó disminución) de la expresión genética de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta pueden detectarse en tejidos de los sistemas inmune y circulatorio ú otras células ó fluidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, fluido sinovial ó fluido espinal) tomados de un individuo que tenga un transtorno tal, relacionado con un nivel de expresión genética de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta "estándar", esto es, el nivel de expresión de T?F-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta en los tej idos de los sistemas inmune y circulatorio ó fluidos corporales de un individuo que no tenga transtornos en los sistemas inmune y circulatorio. Así, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de un transtorno en los sistemas inmune y circulatorio, que involucra la determinación del nivel de expresión del gen que codifica a la proteína TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta en tejidos de los sistemas inmune y circulatorio u otras células ó fluidos corporales de un individuo y comparar la determinación del nivel de expresión genética con un nivel de expresión genética de T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta estándar, por medio de lo cual un incremento ó disminución en el nivel de expresión genética comparado al estándar es un indicador de un transtorno en los sistemas inmune y circulatorio.
En particular, se cree que ciertos tejidos en mamíferos con cáncer de los sistemas inmune y circulatorio expresan niveles significativamente reducidos de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta y del mRNA que codifica a la proteína TNF-gama-alfa y T?F-gama-beta cuando se compara con el nivel ""estándar'1 correspondiente. Además, se cree que niveles mejorados de la proteína TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta pueden detectarse en ciertos fluidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, y fluido espinal) de mamíferos con un cáncer tal cuando se compara al suero de mamíferos de las mismas especies que no tengan el cáncer.
Así, la invención proporciona un método de diagnóstico útil duarante el diagnóstico de un transtorno en los sistemas inmune y circulatorio, que incluyen cánceres de estos sistemas, el cual involucra la determinación del nivel de expresión del gen que codifica a la proteína TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta en el tejido de los sistemas inmune y circulatorio u otras células ó fluidos corporales de un individuo y comparación del nivel de la expresión genética determinada con un nivel de expresión genética de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta estándar, por medio de lo cual un aumento ó disminución en el nivel de la expresión genética comparado al estándar ee indicador de un transtorno en los sistemas inmune y circulatorio.
Cuando un diagnóstico de un transtorno en los sistemas inmune y circulatorio, que incluyen diagnóstico de tumor, ha sido ya hecho conforme a métodos convencionales, la presente invención es útil como un indicador de pronóstico, por medio del cual pacientes que exhiben expresión genética de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta abatido pondrá en evidencia un resultado clínico malo en relación a pacientes que expresan el gen a un nivel más próximo al nivel estándar.
Por "ensayar el nivel de expresión del gen que codifica a la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta" se entiende determinar cualitativamente ó cuantitativamente ó estimar el nivel de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta ó el nivel de mR?A que codifica a la proteína TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta en una primera muestra biológica ya sea directamente (por ejemplo, por determinación ó estimación del nivel de la proteína ó nivel de mR?A absolutos) ó relativamente (por ejemplo, por comparación del nivel de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta ó nivel de mR?A en una segunda muestra biológica) . Preferiblemente, el nivel de la proteína T?F-gama-alfa yó T?F-gama-beta ó nivel de mRNA en la primera muestra biológica se determina ó estima y se compara a un nivel de proteína TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta ó nivel de mR?A estándar, el estándar que es tomado de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tenga el transtorno ó que es determinado por niveles promedio de una población de individuos que no tengan un transtorno en los sistemas inmune y circulatorio. Como es evidente en la especialidad, una vez que un nivel de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta ó nivel de mRNA estándar es conocido, puede usarse repetidamente como un estándar para comparación.
Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, fluido corporal, línea celular, cultivo de tejido, u otra fuente que contenga proteína T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta ó mR?A. Como se indicó, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como suero, plasma, orina, fluido sinovial y fluido espinal) que contengan la proteína TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta libre, tejido de los sistemas inmune y circulatorio, y otras fuentes de tejidos encontradas para expresar a T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta completa ó madura ó a un receptor de TNF_gama-alfa y/ó T?F-gama-beta. Métodos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales de mamíferos son muy conocidas en la materia. En donde la muestra biológica es para incluir mRNA, una biopsia de tejido es la fuente preferida.
El R?A celular total puede aislarse de una muestra biológica utilizando cualquier técnica disponible tal como el método de una sola etapa de guanidinium-tiocianato-fenol-cloroformo descrito por Chomczynski y Sacchi (Anal.
Biochem. 162:156-159 (1987)). Los niveles de mRNA que codifica a la proteína T?F-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta son entonces verificados utilizando cualquier método apropiado. Estos incluyen análisis por manchado Northern, mapeo de la nucelasa Sl, reacción en , cadena de la polimerasa (PCR) , transcripción inversa en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) , y transcripción inversa en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR) .
La verificación de los niveles de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta en una muestra biológica puede tener lugar utilizando técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, la expresión de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta en tejidos puede estudiarse con métodos inmunológicos clásicos (Jalkanen, M. y colaboradores, J. Cell . Biol . 101:976-985 (1985); Jankanen, M. Y colaboradores J. Cell Biol . 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión genética de la proteína T?F-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente de enlace enzimático (ELISA) y el radioensayo (RÍA) . Ensayos con anticuerpos adecuados marcados son conocidos en la materia e incluyen marcadores enzimáticos, tales como, glucosa oxidasa, y radioisótopos, tales como yodo (X2?I, X2 I) , carbono ( 4C) , azufre (3?S) , tritio (3H) , indio ( 2In) , y tecnetio (99roTc) , y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
Además, para verificar los niveles de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta en una muestra biológica obtenida de un individuo, la proteína T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta puede también detectarse in vivo por formación de imágenes. Marcadores de anticuerpos ó marcadores para formar imágenes in viwo de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta incluyen aquellos detectables por radiografía-X, ?MR ó ESR. Por Radiografía-X, marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario ó cesio, los cuales emiten radiación detectable pero no manifiestamente dañinos para el sujeto. Marcadores adecuados por ?MR y ESR incluyen aquellos con una rotación característica detectable, tal como deuterio, el cual puede incorporarse al anticuerpo por marcado de nutrientes para el hibridoma relevante .
Un anticuerpo ó fragmento de anticuerpo específico de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta que se ha marcado con una porción formadora de imágenes detectable apropiada, tal como un radioisótopo (por ejemplo, 3 I, x2In, 99mTc) , una substancia radio-opaca, ó un material detectable por resonancia magnética nuclear, se introduce, por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente ó intraperitonealmente) en el mamífero a ser examinado por trasntornos del sistema , inmune . Se comprenderá en la especialidad que la talla del sujeto y el sistema de formación de imágenes usado determinará la cantidad de porción formadora de imágenes necesitada para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada estará normalmente en el rango de aproximadamente 5 a 20 milicurios de 99t?pTc. El anticuerpo ó fragmento de anticuerpo marcado se acumulará entonces en la localización de las células que contengan proteínas TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta. La formación de imágenes de tumores in vivo se describe por Burchiel y colaboradores (Capítulo 13 en Tumores Imaging: The Radiochaemical Detection of Cáncer, Burchiel, S. W., S.W. y Rodees, B. A., eds. Masson Publisshing Inc. (1982)).
Tratamiento Como se hizo notar anteriormente, los polinucleótidos y polipéptidos de TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta son útiles para el diagnóstico de condiciones que involucran expresiones anormalmente altas ó bajas de las actividades de TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta. Dado que las células y tejidos en donde normalmente se expresan TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta, así como también las actividades moduladas por TNF-gama-alfa y/ó TN?'-gama-beta, es fácilmente obvio que un nivel de expresión substancialmente alterado de TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta en un individuo en comparación con los niveles estándares ó normales produce condiciones patológicas relacionadas a los sistemas corporales en los que TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta está expresado y/ó activo.
Es bien sabido en la especialidad, además de una función celular específica, las moléculas receptoras pueden también a menudo ser explotados por un virus como un medio de iniciar la entrada a una célula huésped potencial . Por ejemplo, Fué descubierto recientemente por Wu y colegas ( ". Exp. Med. 185:1681-1691 (1997)) que el receptor de la quemocina CCR5 funciona no solamente como un receptor celular de quemocina, sino también como un receptor del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)-I trópica-macrófago. Además, RANTES , MIP-la, y MlP-lb, los cuales son agonistas para el receptor del receptor de la quemocina celular CCR5, inhiben la entrada de varias cepas de HIV en líneas celulares susceptibles (Cocchi, F. y colaboradores, Science 270:1811-1815 (1995)). De ese modo, la invención también proporciona un método de tratar a un individuo expuesto a, ó infectado con, un virus a través de la administración profiláctica ó terapéutica de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta, ó un , agonista ó antagonista de los mismos . Para bloquear ó destruir la interacción de una partícula viral con el receptor de TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta y, como resultado, bloquear la iniciación ó continuación de la infección viral .
El T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta de la presente invención enlaza al receptor de T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta, y de ese modo, probablemente se bloquea las infecciones virales trópicas celulares inmuno- y endoteliales. Los patrones de expresión del clon de cD?A codificante de la presente invención sugiere que esta molécula es primariamente expresada en cálulas endoteliales y tejidos hematopoyéticos seleccionados. Cuando se consideran juntas, estas observaciones sugieren que agonistas y antagonistas que incluyen a un receptor de TNF-fama-alfa y/ó TNF-gama-beta pueden ser útiles como un método de bloqueo ó de otra manera regular la infecciocidad de infecciones virales inmunotrópicas . Una lista no limitante de virus que infectan al humano y pueden infectar células de sistemas henatopoyéticos incluyen retrovirus tales como HIV-1, HIV-2, virus linfotrópicos de células T humanas (HTLV)-I, y HTLV-II así como también otros virus de DNA y RNA tales como virus del herpes simples (HSV)-l, HSV-2, HSV-6, citomegalovirus (CMV) virus de Epstein-Barr (EBV) , Herpes samirii, adenovirus, rinovirus, virus de la influenza, reovirus, y los similares.
La capacidad del TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta de la presente invención, ó agonistas ó antagonistas de los mismos, para bloquear profiláctica ó terapéuticamente infecciones virales puede fácilmente verificarse por los expertos en la materia. Por ejemplo, Simmons y colaboradores (Science 276:276-279 (1997)) y Arenzana-Seisdedos y colegas (Nature 383:400 (1996)) cada uno de ellos expone un método de observar la supresión de la infección HIV-1 por un antagonista del recpertor de la quemocina CCR5 y de la quemocina RANTES CC, respectivamente, en células mononucleares de sangre periférica cultivadas. Las células son cultivadas e infectadas con un virus, HIV-l en ambos casos mencionados anteriormente. Un agonista ó antagonista de la quemocina CC ó su receptor es luego añadido inmediatamente al medio de cultivo. La evidencia de la capacidad del agonista ó antagonista de la quemocina ó receptor celular se determina por evaluación del éxito relativo de la infección viral a 3, 6, y 9 días post-infección.
La administración de una composición farmacéutica que comprende una cantidad de, un TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta aislado, ó un agonista ó antagonista del mismo, de la invención a un individuo ya sea infectado con virus ó en riesgo de infección con un virus se efectúa como se describe a continuación.
La presente invención es también útil para diagnóstico ó tratamiento de varios transtornos relacionados con el sistema inmune y circulatorio en mamíferos, preferiblemente humanos. Tales transtornos incluyen tumores (una lista incompleta de tumores humanos) incluyen cáncer de seno, cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer del estómago, neuroblastoma, mixoma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, adenoma, y los similares) y metástasis de tumor, infecciones por bacterias, virus, y otros parásitos, inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatías, enfermedades autoinmunes, enfermedades por injertos versus huésped, y cualquier irregularidad de las funciones de las células de los sistemas inmune y circulatorio, que incluyen, pero no se limitan a, autoinmunidad, artritis, leucemias, linfomas, inmunosupresiones, inmunidad, inmunidad humoral, enfermedades inflamatorias del intestino, mielo supresión, y los similares.
Puesto que se ha demostrado que TNF gama induce la activación de ?F-kB celular y de la cinasa ?-terminal c-jun (J?K) , es también útil en regular terapéuticamente transtornos sistemáticos celulares e inmunes tales como tumores y metástasis de tumores, infecciones por bacterias, virus y otros parásitos, inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatías, enfermedades autoinmunes, enfermedades por injerto versus huésped, autoinmunidad, artritis, leucemias, linfomas, inmunosupresión, enfermedades inflamatorias del intestino, mielosupresión, y secuelas relacionadas.
Puesto que, TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta pertenecen a la superfamilia TNF, también pueden modular angiogénesis. Además, puesto que T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta inhibe las funciones celulares inmunes, tendrán un amplio rango de actividades anti-inflamatorias. T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta pueden emplearse como un agente anti-neovascularizante para tratar tumores sólidos por estimulación de la invasión y activación de células de defensa del huésped. Por ejemplo, células T y macrófagos citotóxicos y por inhibición de la angiogénesis de tumores. Los expertos en la materia reconocerán otras indicaciones no-cancerosas en donde la proliferación de los vasos sanguíneos no se requiere. Pueden también emplearse para mejorar las defensas del huésped contra contra infecciones crónicas y agudas resistentes, por ejemplo, infecciones micobacterianas vía la atracción y activación de leucocitos microbicidas. TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta pueden también emplearse para inhibir la proliferación de células T por la inhibición de la biosíntesis de IL-2 para el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes mediadas por células T y leucemias linfocíticas . TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta pueden emplearse para estimular la cicatrización de heridas, ambas vía la repoblación cinegéstica de eliminación de detritus y tejido conectivo que promueve las células inflamatorias. De esta misma manera, TNF-gama-alfa y TNF-gama-beta pueden también emplearse para tratar otros transtornos fibróticos, que incluyen cirrosis hepática osteoartritis y fibrosis pulmonar. TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta también incrementan la presencia de eosinófilos que tienen la función distintiva de matar las larvas y parásitos que invaden los tejidos , como en esquitosomiasis, triquinosis y ascariasis. TNF-gama-alfa y/ó TNF-gama-beta pueden emplearse para regular la hematopoyesis por medio de la activación y diferenciación de varias células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, para liberar leucocitos maduros de la médula ósea a continuación de quimioterapia, por ejemplo, movilización de células germinales. TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta pueden también emplearse para tratar sepsis.
En un modo similar, TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta pueden usarse para tratar artritis reumatoide (RA) por inhibición del aumento de angiogénesis ó el aumento de la proliferación de células endoteliales requerido para sistener una invasión de queratitis vascular en hueso y cartílago como se observa a menudo en RA. La proliferación de células endoteliales se aumenta en la sinovia de pacientes con RA en comparación con pacientes con osteoartritis (OA) ó con individuos no afectados. Se necesita la neovascularización para sostener el incremento másico de la invasión de queratitis vascular en hueso y cartílago. La inhibición de la angiogénesis está asociada con un decremento significativo en la severidad de ambos artritis precoz y crónica en modelos animales.
Será también obvio para los expertos en la materia que, puesto que las proteínas TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta de la invención son miembros de la familia TNF la forma madura secretada de la proteína puede ser liberada en forma soluble desde las células que expresan a T?F-gama por fragmentación proteolítica. Por consiguiente cuando la forma madura de T?F-gama7alfa y/ó T?F-gama-beta ó las regiones extracelulares solubles se añaden desde una fuente exógena a células, tejidos ó al cuerpo de un individuo, la proteína ejercerá sus actividades fisiológicas ó sus células objetivo de ese individuo. También células que expresan este tipo II de proteína transmembrana pueden añadirse a células, tejidos, ó al cuerpo de un individuo y éstas células añadidas enlazarán á células que expresan al receptor de TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta, con lo cual, las células que expresan a T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta pueden causar acciones (por ejemplo, regulación del crecimiento y regulación de células endoteliales) sobre las célulads objetivo parcialmente receptoras.
Por consiguiente, será obvio que las condiciones causadas por una disminución en el nivel estándar y normal de las actividades T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta en un individuo, particularmente transtornos de los sistemas inmune y circulatorio, pueden ser tratados por administración del polipéptido T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta (en la forma de la proteína madura) . De ese modo, la invención también proporciona un método de tratamiento de un individuo en necesidad de una disminuación en el niveel de la actividad de TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta que comprende administrar a un individuo tal una composición farmacéutica que que comprenda una cantidad del polipéptido TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta aislado de la invención, particularmente una forma madura de la proteína TNF-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta de la invención, efectiva para incrementar el nivel de actividad de T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta en un individuo tal .
El polipéptido T?F-gama-alfa y/ó T?F-gama-beta de la presente invención puede emplearse para inhibir el crecimiento de células tumorales ó neoplasia. El polipéptido T?F-alfa y/ó T?F-gama-beta puede ser responsable de la destrucción de tumores por medio de apoptosis que está caracterizada por la formación de burbujas ó vejigas en la membrana (zeiosis) , condensación de citoplasma y la activación de una endonucleasa endógena (Figura 12) . Como se expone en la Tabla 1, T?F-gama tiene actividad citotóxica fuerte por las líneas celulares verificadas que tienen proliferación y regulación celular anormal, por ejemplo la línea celular de fibrosarcoma y de carcinoma. Esto se ilustra también en las figuras 7A, 7B, y 8 en donde se demuestra que TNF-gama tiene la capacidad para inhibir el crecimiento de células L929 y a WEHI 164 por medio de actividad citotóxica. Las células EWHI 164 son células de fibrosarcoma de ratón. Un método preferible de administrar el TNF-gama es por inyección directamente en el tumor .
La actividad de adhesión celular de TNF-gama puede emplearse para cicatrización de heridas. Como se muestra en la Tabla 1 y la figura 9, TNF-gama tiene un fuerte efecto sobre la proliferación celular lo cual es un indicador de que T?F-gama desempeña un papel en la cicatrización de heridas. Los efectos adhesivos de las células de T?F-gama pueden también desempeñar un papel en la cicatrización de heridas .
TNF-gama puede también emplearse para tratar enfermedades que requieren actividad de promoción del crecimiento, por ejemplo, restenosis. Como se estableció anteriormente, Se demuestra que T?F-alfa tiene fuertes efectos de proliferación celular sobre el crecimento celular endotelial. Por consiguiente, TNF-gama puede también emplearse para regular la hematopoyesis y el desarrollo de células endoteliales.
El polipéptido TNF-gama, por su capacidad para estimular la activación de células T, es un mediador importante de la respuesta inmune. Por consiguiente, este polipéptido puede usarse para estimular una respuesta inmune contra una variedad de infecciones parasitarias, bacterianas y virales. T?F-gama puede lisar células infectadas por virus y, por consiguiente, emplearse para detener a células infectadas por HIV.
El polipéptido TNF-gama puede emplearse para tratar enfermedades autoinmunes tales como diabetes tipo I por mejoramiento en la respuesta proliferativa de las células T, Tabla 2 Breve descripción de la actividad de TNF-gama Líneas Fuente ,citoto- proli- Diferen..Adhe- y Tipo xicidad feración ciación sión L929 fibroblasto + - - - de ratón WEHI 164 fibrosarcoma de riñon de rata +++ - NRK-54E similares a epiteliales de humano + - - - THP-1 leucemia monocítica + - ++ ++ de humano HL-60 leucemia promielo- cítica Tabla 2 (continuación) Líneas Fuente citoto- proli- Diferen..Adhe- y Tipo xicidad feración ciación sión de humana ++ Raji linfoma de Burkitt de humano Jurkat células T De linfoma Primario HUVEC arterial humano ++ Primario endotelial +* ++ Humano A-431 carcinoma epidérmico humano ++ Tabla 2 (continuación) Líneas Fuente citoto- proli- Diferen..Adhe- y Tipo xicidad feración ciación sión 293 de riñon embrionario de ratón - ++ - - Leyenda: *solamente a dosis altas. El número de "+ " indica el nivel relativo de actividades "-" indica que no se detectó actividad en el rango de concentración probada.
TNF-gama puede usarse para inhibir la proliferación de células endoteliales, por ejemplo, células endoteliales aórticas. Como se ilustra en la figura 10, a concentraciones de hasta 10 µg/ml, T?F-gama puede inhibir casi completamente el crecimiento de células endoteliales mientras que no tiene un efecto aparente sobre el crecimiento de células cancerosas en seno humano. Como resultado, TNF-gama, puede usarse para tratar enfermedades y transtornos en los cuales la inhibición del crecimiento celular endotelial es favorable. Inhibir el crecimiento de células endoteliales es deseable en el tratamiento de muchos tipos de cánceres que dependen de la generación de vasos sanguíneos nuevos para soportar el crecimiento del tumor. TNF-gama puede usarse para inhibir el crecimiento de tales tumores por inhibición del crecimiento de células endoteliales las cuales son un componente celular principal de los vasos sanguíneos. ,La evidencia de la capacidad de TNf -gama para ser usada efectivamente en esta forma se presenta en las figuras 16a y 16B. Estos experimentos se discuten en mayor detalle a continuación.
En particular, TNF-gama puede usarse para regular el crecimiento celular endotelial cuando las células endoteliales ya han comenzado a proliferar. Se presenta una situación tal cuando la angiogénesis tiene lugar como un mecanismo de apoyo a tumor como se describió anteriormente . La expresión endógena de T?F-gama se reduce en cultivos que proliferantes de células endoteliales, mientras que la expresión de TNF-gama endógena se mejora en cultivos celulares endoteliales en reposo (Figura 4) . Como resultado, es preferible usar T?F-gama de la presente invención para reducir la proporción del crecimiento celular en cultivos de células endoteliales proliferantes, por ejemplo, durante el incremento en tamaño de un tumor en un estado canceroso.
TNF-gama de la presente invención se ha usado para reducir la formación de estructuras tubulares similares a capilares formadas por células endoteliales in vi tro . Como se ilustra en la figura 14, TNF-gama de la presente invención puede usarse para inhibir la formación de células endoteliales organizadas en estructuras similares a capilares en respuesta a factores angiogénicos tales como FGF-2. Además, TNF-gama aislado de la presente invención puede también usarse para inhibir el crecimiento y la organización de células endoteliales en los vasos capilares en una membrana corioalantoica de embrión de pollo (CAM) como se expone en la figura 15. Como resultado, TNF-gama de la presente invención puede usarse para inhibir la formación de capilares ó estructuras similares a capilares de células endoteliales in vi tro .
T?F-gama de la presente invención puede usarse como agente anti-canceroso. Como se ilustra en la figura 16, T?F-gama se usa para inhibir el crecimiento de células cancerosas de seno humano en un modelo de tumor xenoinjertado. A pesar de la alta tumorigenicidad de estas células, el tratamiento con T?F-gama de la presente invención dio como resultado una inhibición marcado del crecimiento de tumores xenoinjertados. T?F-gama, ó una muteína del mismo, de la presente invención, puede usarse para tratar un número de cánceres que incluyen, pero no se limitan a, cánceres de seno, cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer estqmacal, neuroblastoma, mixoma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, adenoma, y los similares.
Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención pueden emplearse como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos para enfermedades humanas .
Esta invención proporciona un método para la identificación del receptor para TNF-gama . El gen que codifica al receptor puede identificarse por numerosos métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, ligando separador y FACS clasificador (Coligan, y colaboradores, Current Protocols in Im un . , 1(2), Capítulo 5, (1991)). Preferiblemente se emplea la clonación por expresión en donde el R?A poliadenilado se prepara desde una célula correspondiente a TNF-gama, y un acervo de cD?A creado desde este R?A se divide en grupos y se usa para transfectar células COS u otras células que no corresponden TNF-gama . Las células transfectadas que crecieron sobre placas de vidrio se exponen al TNF-gama marcado. El TNF-gama puede marcarse por una variedad de medios que incluyen iodación ó inclusión de un sitio de reconocimiento para una cinasa. A continuación se fija y se incuba, las placas se someten a análisis autoradiográfico. Los grupos positivos se identifican y los sub-grupos se preparan y se re-transfectan utilizando un sub-agrupamiento iteractivo y proceso de re-selección, se produce eventualmente un solo clon que codifica al receptor putativo.
Como un procedimiento alternativo para identificación del receptor, el T?F-gama marcado puede enlazarse por fotoafinidad con la membrana celular ó preparaciones extractos que expresan a la molécula receptora. El material reticulado es resuelto por PAGE y expuesto a película de rayos-X. El complejo marcado que contiene al receptor de T?F-gama puede excisarse, resolverse en fragmentos de péptido, y someterse a micro formación de secuencias de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida de la micro formación de secuencias se usaría para designar un grupo de sondas de oligonucleótidos degeneradas para seleccionar un acervo de cD?A para identificar el gen que codifica al receptor putativo.
TNF-gama no enlaza significativamente a dos receptores de TNF solubles, TNFs-RI (?55) y TNFs-RII (?75) . Por consiguiente, TNF-gama puede tener actividades inclusive de y adicionales para conocer las proteínas TNF (ver la figura 13) .
Formulaciones Las composiciones del polipéptido TNF-gama serán formuladas y dosificadas de una manera consistente con las buenas prácticas médicas, tomando en cuenta las condiciones clínicas del paciente individual (especialmente los efectos colaterales de tratamiento con el polipéptido TNF-gama solo) , el sitio de liberación de la composición del polipéptido TNF-gama, el método de administración, el programa de administración , y otros factores conocidos de los médicos. La "cantidad efectiva" del polipéptido TNF-gama para propósitos de la presente es determinada de ese modo por medio de tales consideraciones.
Pueden emplearse los antagonistas en una composición con un vehículo farmacéutico aceptable, por ejemplo, como se describirá en lo sucesivo.
Los polipéptidos TNF-gama y agonistas y agonistas de la presente invención pueden emplearse en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, y un vehículo, ó excipiente farmacéuticamente aceptable. Un vehículo tal incluye pero no se limita a solución salina, solución salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La formulación se adapta al modo de administración.
La invención también proporciona un paquete ó equipo farmacéutico que comprende uno ó más contenedores llenos con uno ó más de los ingredientes de la composición farmacéutica de la invención. Asociado con tales contenedores puede estar un folleto en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la manufactura, uso ó venta de productos farmacéuticos ó biológicos, dicho folleto refleja la aprobación por la agencia de la manufactura, uso ó venta para administración humana. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden emplearse conjuntamente con otros compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de una manera conveniente como por las vías, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, ó intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es efectiva para tratamiento y/ó profilaxis de la indicación específica. En general, se administran , en una cantidad de al menos aproximadamente 10 g/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos serán administradas en una cantidad que no exceda de aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. En la mayoría de los casos, la dosificación es desde aproximadamente 10 g/kg hasta aproximadamente l mg/kg de peso corporal diariamente, tomando en cuenta las vías de administración, síntomas, etc.
Terapia Genética Los polipéptidos TNF-gama y agonistas y antagonistas que son polipéptidos pueden también emplearse de conformidad con la presente invención para expresión de tales polipéptidos in vivo, lo cual a menudo se menciona como "terapia genética".
De ese modo, por ejemplo, las células de un paciente pueden diseñarse con un polinucleótido (DNA ó RNA) que codifica a un polipéptido ex vivo, con las células diseñadas, que son luego proporcionadas a un paciente a ser tratado con el polipéptido. Tales métodos son muy conocidos en la materia y son obvios de lo expuesto en la presente. Por ejemplo, pueden diseñarse células por el uso de una partícula retroviral que contenga RNA que codifique a un polipéptido de la presente, invención.
Similarmente, pueden diseñarse células in vivo para expresión de un polipéptido in vivo por, por ejemplo, procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, una célula productora para producir una partícula retroviral que contenga RNA que codifique a un polipéptido de la presente invención puede administrarse a un paciente para diseñar células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo. Estos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención por tal método serían obvios para los expertos en la materia de lo expuesto en la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para el diseño de células puede eer diferente de un retrovirus, por ejemplo, un adenovirus que pueda ser usado para diseñar células in vivo después de combinación con un vehículo liberador adecuado.
Los retrovirus de los cuales pueden derivarse los vectores plásmidos retrovirales mencionados anteriormente, incluyen, pero no se limitan a Virus de la leucemia de la murina Moloney, virus de la necrosis del bazo, retrovirus tales como virus del Sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de leucosis aviar, virue de la leucemia del simio gibon, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus del sarcoma mieloproliferativo, y virus de tumor mamario. En una modalidad, el vector plásmido retorviral se deriva del virus de la leucemia de la murina Moloney.
El vector incluye uno ó más promotores. Los promotoree adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, el LTR retroviral; el promotor de SV40; y el promotor de citomegalovirus (CMV) humano descritos por Miller y colegas (Biotechniques 7:980:990 (1989)), ó cualquier otro promotor (por ejemplo promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos que incluye, pero no se limitan a, la promotores de histona, pol III, y b-actina) . Otros promotores virales que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a promotores de adenovirus, promotores de la timidina cinasa (TK) , y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será obvia para los expertos en la materia de las demostracionee contenidas en la presente .
La eecuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovirales, tales como, el promotor tardío adenoviral principal; ó promotores heterólogos, tales como promotor de citomegalovirus (CMV) , promotor del virus sincitial respiratorio (RSV) ; promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de metalotioneína; promotores de choque térmico; promotor de la albúmina; el promotor Apoya; promotoree de la globina humana; promotores de la timidina cinasa virales, tales como el promotor de la timidina cinasa del herpes simples; LTRs retrovirales (que incluyen los LTRs retrovirales modificados, descritoe anteriormente) ; el promotor de b-actina; y loe promotoree de la hormona del crecimiento humano. El promotor puede también eer el promotor nativo que controla al gen codificante del polipéptido.
El vector pláemido retroviral ee emplea para transducir líneas celulares encapsuladas para formar líneas celulares productoras. Ejemplos de célulae encapsuladas que pueden eer tranefectadas incluyen, pero no ee limitan a, lae líneae celularee PE501, PA317, b-2, b-AM, PA-12, T-19-14X, VT-19-17-H2, CRE, b-CRIP, GP+E-86, GP+envAml2 , y DAN como deecribió Miller (Human Gene Therapy 1: 5-14 (1990)), que se incorpora en su integridad a la presente como referencia. El vector puede transducir a las células encapsuladae a travée de cualquier medio conocido en la materia. Talee medioe incluyen, pero no ee limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y la precipitación por CaP04. En una alternativa, el vector plásmido viral puede encapsularee en un lipoeoma, ó acoplarse a un lípido, y luego administraree a un huéeped.
La línea celular productora genera partículae de vector retroviral infecciosas las cualee incluyen a lae eecuenciae de ácidoe nucleicos que codifican a los polipéptidos. Tales partículas de vector retroviral pueden emplearse luego, para transducir células eucarióticae, ya eea in vi tro ó in vivo . Las células eucarióticas traneducidae expreearan a lae eecuenciae de ácido nucleico que codifican al polipéptido. Célulae eucarióticae que pueden eer traeducidae incluyen, pero no ee limitan a, células germinales embrionariae, célulae de carcinoma embrionario, aeí como también, célulae embrionariae hematopoyéticae, hepatocitoe, fibroblastos, mioblastoe, queratinocitoe, célulae endotelialee, y célulae epitelialee bronquialee .
Agonistas y Antagonistas - Ensayos y Moléculas Esta invención concierne también a un método de eeleccionar compueetoe para identificar a loe TNF-gama mímicoe (agonistas) ó prevenir el efecto de TNF-gama (antagonistae) . Un ejemplo de un método tal aprovecha la capacidad de TNF-gama para eetimular eignificativamente la proliferación de células endoteliales humanas en presencia del comitogen Con A. Las célulae endotelialee ee obtienen y cultivan en placae de cultivo de 96 pocilloe de fondo plano (Coetar, Cambridge, MA) en RPMI 1640 euplementado con euero bovino fetal inactivado térmicamente al 10 % (Hyclone Labe.
Logan, UT) , L-glutamina al 1 %, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de eetreptomicina, gentamicina al 0.1 % (Gibco Life Technologies, Grand Island, NY) en presencia de 2 g/ml de Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA) . Se añaden Con-A y el compuesto a eer cribado haeta un volumen final de 0.2 ml . Deepuée de 60 h a 37 °C, los cultivos se impulsan con 1 Ci de [3H] timidina (5 Ci/mmol; 1 Ci=37 BGq; NEN) por 12 a 18 horas y se cosecha eobre filtroe de fibra de vidrio (PhD; Cambridge Technology, Waterton, MA) . La incorporación del medio de [3H] timidina (cpm) de cultivoe por triplicado se determina utilizando un contador de cenetelleo líquido (Beckman Instrumente, Irvine, CA) . La incorporación eignificativa de [3H]-timidina indica la eetimulación de la proliferación de célulae endotelialee.
Alternativamente, la reepueeta de un eegundo eietema meneajero conocido que sigue lae interacciones de TNF-gama y del receptor se mediría y compararía en presencia ó ausencia del compuesto. Segundoe sistemae meneajeroe talee, incluyen, pero no ee limitan a, CAMP guanilato de ciclaea, canalee iónicoe ó hidrólieie de la foefoinoeitida.
Para verificar para antagonietae, el ensayo deecrito anteriormente ee efectúa, ein embargo, en eete eneayo TNF-gam ee añade en el tranecureo con el compueeto a eer cribado y la capacidad del compueeto para inhibir la incorporación de [3H]timidina en preeencia de TNF-gama, indica que el compueeto ee un antagonieta de TNF-gama. Alternativamente, antagonietae de TNF-gama pueden detectaree por combinación de TNF-gama y un antagonieta potencial con receptoree de TNF-gama de enlace de membrana ó receptoree recombinantes en condiciones apropiadas para un eneayo comparativo de inhibición.
TNF-gama puede ser marcado, por ejemplo por radioactividad, de modo que el número de moléculas de TNF-gama enlazadas al receptor puede determinar la efectividad del antagonista potencial.
Alternativamente, una célula de mamífero ó preparación de membrana que expresa al receptor de TNF-gama se incuba con TNF-gama marcado en presencia de del compuesto. La capacidad del compuesto para mejorar ó bloquear esta interacción podría entonces medirse.
En otro aspecto de esta modalidad la invención proporciona un método para identificar a una proteína receptora ó a otra proteína enlazante de ligando que enlace específicamente a un polipéptido TNF-gama (por ejemplo DR3) . Por ejemplo, un compartimiento celular, tal como una membrana ó una preparación de ésta, puede prepararse desde una célula que exprese a una molécula que enlaza a TNF-gama. La preparación se incuba con TNF-gama marcado y complejos de TNF-gama enlazados al receptor u otro que enlaza a la proteína se aislan y caracterizan conforme a métodos de rutina conocidos en la materia.
Aternativamente, el polipéptido TNF-gama puede enlazarse a un soporte sólido de modo que las moléculas enlazantes solubilizadas desde células son enlazadas a la columna y luego eludías y caracterizadas conforme a métodos de rutina.
En el ensayo de la invención para agonietas ó antagonistas, un compartimiento celular, tal como una membrana ó una preparación de la misma, puede prepararse desde una célula que expresa a una molécula que enlaza a TNF-gama, tal como una molécula de un ciclo indicador ó regulador modulado por TNF-gama. La preparación se incuba con TNF-gama marcado en ausencia ó presencia de un molécula candidata que pueda ser un agonista ó antagonista de TNF-gama. La capacidad de la molécula candidata para enlazar a la molécula enlazante se refleja en el enlace disminuido del ligando marcado. Las moléculas que enlazan gratuitamente, por ejemplo sin inducir los efectos de TNF-gama sobre el enlace de la molécula que enlaza a tNF-gama, más probablemente buenas antagonistas. Las moléculas que enlazan bien y provocan efectos que son iguale que ó próximamente relacionados a TNF-gama son agonistas.
Los efectos similares a los de TNF-gama de agonistas y antagonistas potenciales pueden medirse, por ejemplo, por determinación de la actividad de un segundo sistema mensajero que sigue a la interacción de la molécula candidata con una célula ó preparación celular apropiada, y comparación del efecto con el de TNF-gama ó moléculas que provocan los mismos efectos que TNF-gama. Los segundos sistemas mensajeros que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no se limitan a sistemas de segundo mensajero de AMP guanilato de ciclasa, canal iónico ó hidrólisis de fosfoinositida.
Otro ejemplo de un ensayo para antagonistas de TNF-gama es un ensayo comparativo que combina a TNf-gama y a un antagonista potencial con moléculas receptoras de TNF-gama con enlace de membrana ó moléculas receptoras de TNF-gama recombinantes en condiciones apropiadas para un ensayo comparativo de inhibición. TNF-gama puede ser marcada, por radioactividad, de modo que el número de moléculas de TNF-gama enlazadas a una molécula receptora puede determinarse precisamente para evaluar la efectividad del antagonista potencial .
Antagonistas potenciales incluyen pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que enlazan a un polipéptido de la invención y de tal modo que inhiba ó extinga su actividad. Antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido ó un polipéptido tal como una proteína ó anticuerpo estrechamente relacionados que enlazan en los mismos sitios sobre una molécula enlazante, tal como una molécula receptora, sin inducir las actividades inducidas por TNF-gama, de modo de prevenir la acción de TNF-gama por exclusión de TNF-gama del enlace.
Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido. La tecnología antisentido puede usaree para el control de la expresión genética por medio de DNA ó RNA ó por medio de formación en triple hélice. Las técnicas anti-sentido se han discutido en un número de estudios por ejemplo, Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); "Oligodesoxynucleotides as antisense Inhibitors of Gene Expresión." CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). La formación en triple hélice se discute en un número de estudios, taambien (por ejemplo, Lee, y colaboradores, Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney, y colaboradores, Science 241:456 (1988); Dervan, y colaboradores, science 251:1360 (1991)). Los métodos están basados en el enlace de un polinucleótido a un DNA ó RNA complementario. Por ejemplo, la porción codificante 5' de un polinucleótido que codifica al polipéptido maduro de la presente invención puede usarse para diseñar un oligonucleótido de RNA antisentido de desde aproximadamente 10 hasta 50 pares de bases de extensión. Un oligonucleótido de DNA se diseña para ser complementario a una región del gen involucrada en la transcripción de modo de prevenir la transcripción y la producción de TNF-gama. El oligonucleótido de RNA antisentido hibridiza al mRNA in vivvo y bloquea la translación de la molécula de mRNA en el polipéptido T?F-gama. Los oligonucleótidos descritos anteriormente pueden también ser liberados en células de modo que el R?A ó D?A pueda ser expresado in vivo para inhibir la producción de la proteína T?F-gama.
Los anticuerpos específicos para T?F-gama pueden usarse como antagonistas para enlazar a T?F-gama y prevenirlo de enlazar a su receptor. Anticuerpos monoclonales eon particularmente efectivos a este respecto. Los anticuerpos específicos para el receptor de T?F-gama, sin embargo, pueden mediar distintas respueetas celulares que sirven para combatir los efectos de T?F-gama sobre la interacción con su receptor.
Los antagonistas de T?F-gama potenciales también incluyen mutantes de T?F-gama que enlazan al receptor de T?F-gama y no provocan la segunda respuesta del mensajero para bloquear efectivamente al receptor desde su ligando natural. Oligonucleótidos específicamente diseñados y moléculas pequeñas pueden también enlazar al receptor de T?F-gama (por ejemplo, DR3) y bloquearlo desde T?F-gama.
Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a péptidos pequeños ó moléculas similares a péptidos.
Otros antagonistas de TNF-gama potenciales es una forma soluble del receptor de TNF-gama que enlaza a TNF-gama y lo previene de interactuar con los receptoree de TNF gama con enlace de membrana. De eeta manera, los receptores no son estimulados por TNF-gama.
Otros antagonistas de TNF-gama potenciales es una construcción preparada utilizando tecnología antisentido. La tecnología antieentido puede usarse para el control de la expresión genética por medio de la formación entriple hélice ó de DNA ó RNA antisentido, ambos de estos métodos se basan en el enlace de un polinucleótido a DNA ó RNA. Por ejemplo, la porción 5' codificante de la secuencia de polinucleótidos, que codifica para los polipéptidos maduros de la presente invención, se usan para diseñar un oligonucleótido de PNA antisentido de desde aproximadamente 10 a 40 pares de basee de extensión. Un polinucleótido de D?A se diseña para se complementario a una región del gen involucrado en la transcripción (triple-hélice - ver Lee y colaboradores, ?ucl . Acids. Res. 6:3073 (1979); Cooney y colaboradores, Science, 241: 456 (1988); y Dervan y colaboradores, Science, 251: 1360 (1991)), de modo de prevenir la transcripción y la producción de TNF-gama. El oligonucleótido de RNA antisentido hibridiza al mRNA in vivo y bloquea la traslación de la molécula de mRNA en el polipéptido TNF-gama (Antisenee- Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodesoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expresión, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) ) . Los oligonucleótidos descritos anteriormente pueden también ser liberados en las células de modo que el PNA ó D?A antisentido puedan ser expresados in vivo para inhibir la producción de T?F-gama.
Los antagonistas-T?F pueden también emplearse para tratar caquexia, la cual un defecto de purificación de lípidos que resulta de una deficiencia sistemática de la lipoproteína lipasa la cual es abatida por T?F-gama. Los antagonistas de T?F_gama se emplean también para tratar malaria cerebral en la cual T?F-gama parece desempeñar un papel patogénico. Los antagonistas pueden también emplearse para tratar artritis reumatoide por inhibición de la producción inducida de T?F-gama de citocinas inflamatorias tales como IL-1 en las células sinoviales. Cuando se trata de artritis T?F-gama es inyectada preferiblemente intra-articularmente .
Los antagonistas de TNF-gama pueden también emplearse para prevenir el rechazo de injertos por prevención del estímulo del sistema inmune en presencia de un injerto por medio de TNF-gama.
Los antagonistas de TNF-gama pueden también emplearse para tratar osteoporosis puesto que TNF-gama puede inducir la resorpción ósea.
Los antagonistas para TNF-gama pueden también emplearse como agentes anti-inflamatorios puesto que TNF-gama es intermediario para una respuesta inflamatoria me orada.
Los antagonistae pueden también usarse para tratar choque endotóxico, también mencionado como choque séptico. Estas condiciones críticas resultan de una respuesta exagerada a infecciones bacterianas y de otroe tipos. Esta respuesta conduce a niveles elevados dd TNF-gama lo cual ocasiona choque y daños a tejido.
La presente invención también concierne a un ensayo de diagnóstico para detectar niveles alterados de la proteína TNF-gama en varios tejidos, puesto que una sobre-expresión de las proteínas comparada a muestras de te ido control normales puede detectar la presencia de una enfermedad ó susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo, tumores y malaria cerebral. Los expertos en la materia conocen los ensayoe usados para detectar niveles de la proteína TNF-gama en una muestra derivada de un huésped e incluye radioinmunoensayos, ensayos de enlace comparativo, análisis por manchado Western, ensayos ELISA y ensayo "sandwich". Un ensayo ELISA (Coligan y colaboradores, Current Protocols in Inmunology, 1(2), Capítulo 6, (1991)) que comprende inicialmente preparar un anticuerpo específico para el antígeno de TNF-gama, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además un anticuerpo reportero se prepara contra el anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo reportero se fija un reactivo detectable tal como radioactividad, fluorescencia ó en este ejemplo enzima peroxidasa de rábano. Se retira una muestra de un huésped y se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo, un disco de poliestireno, que enlaza a las proteínas en la muestra. Algunos sitios de enlace de proteína libres sobre el disco son luego cubiertos para incubación con una proteína no-específica similar a BSA. Después, el anticuerpo monoclonal se incuba en el disco durante el tiempo en el cual los anticuerpos monoclonales ee fijan a algunae proteínas TNF-gama fijadas al disco de poliestireno. Todo anticuerpo monoclonal no enlazado se retira por lavado con regulador.
El anticuerpo reportero enlazado a la peroxidaea de rábano es ahora colocado en el disco dando como resultado el enlace del anticuerpo reportero a cualquier anticuerpo monoclonal enlazado a TNF-gama. El anticuerpo reportero no fijado es entonces retirado por lavado.Los substrato de peroxidasa se añaden entonces al disco y la cantidad de color desarrollado en un período de tiempo dado es una medida de la cantidad de proteína TNF-gama presente en un volumen dado de muestra de paciente comparado contra una curva estándar. Un ensayo comparativo puede emplearse en el que los anticuerpos específicoe para TNF-gama son fijados a un soporte sólido y TNF-gama marcados y una muestra derivada del huésped se pasan sobre el soporte sólido y la cantidad de marcador detectado, por ejemplo por cromatografía de centelleo líquida, puede ser correlacionado con una cantidad de TNF-gama en la muestra.
Un ensayo "sandwich" es similar a un ensayo ELISA. En un ensayo "sandwich" TNF-gama se pasa sobre un soporte sólido y enlaza al anticuerpo fijado a un soporte sólido. Un segundo anticuerpo es entonces enlazado al TNF-gama. Un tercer anticuerpo que está marcado y es específico al segundo anticuerpo es luego pasado sobre el soporte sólido y enlaza al segundo anticuerpo y una cantidad puede entonces ser cuantificada.
Mapeo Genético Las secuencias de la presente invención son también útiles para identificación cromosómica. La secuencia es específicamente seleccionada como objetivo para y puede hibridizar con una localización particular sobre un cromosoma humano individual. Además, hay una corriente necesaria para identificar sitios particulares sobre el cromosoma. Pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en los datos de la secuencia actual (polimorfismos repetidos) están actualmente disponibles para marcar la localización cromosómica. El mapeo de DNAs en cromosomas conforme a la presente invención es una primera etapa muy importante para correlacionar las secuencias con genes asociados con enfermedades.
Brevemente, las secuencias pueden ser mapeadas en cromosomas por preparación de iniciadores de PCR (preferiblemente 15-25 bp) desde el cDNA. Análisis computacional de la región sin translación 3' de la secuencia se usa para seleccionar rápidamente iniciadores que no están espaciados por más de un exon en el DNA genómico, complicando así el proceso de amplificación. Estos iniciadores son entonces usados para cribado por PCR de células somáticas híbridas que contengan cromosomas humanos individuales. Solamente aquellos híbridos que contengan el gen humano correspondiente al iniciador, producirán un fragmento amplificado.
El mapeo por PCR de células somáticas híbridas es un procedimiento rápido para asignar un DNA particular a un cromosoma particular. Utilizando la presente invención con los iniciadores oligonucleótidos iguales, la sub-localización puede lograrse con tablas de fragmentos de cromosomas específicos ó grupos de grandes clones genómicos de una manera análoga. Otras estrategias de mapeo que pueden usarse similarmente para mapear a sus cromosomas incluyen hibridización in situ, pre-cribado con cromosomas seleccionadoe en flujo marcados y preselección por hibridización para construir acervos de cDNA específicos del cromosoma.
Puede usaree hibridización con fluorescencia in situ (FISH) de un clon de cDNA en una metafase de propagación cromosómica para proporcionar una localización cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica puede usarse con cDNA tan cortos como de 50 ó 60 basee . Para una revieión de esta técnica, ver Ver a y colaboradores, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) .
Una vez que una secuencia ha sido mapeada en una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKueic, Mendelian Inheritance in Man (dieponible en línea por medio de Johns Hopkins University Welch Medical Library) . La relación entre genes y enfermedades que han sido mapeados en la misma región cromosómica son luego identificadas por medio de análisis de enlace (co-herencia de genes adyacentes físicamente) .Despuée, ee necesario determinar las diferencias en el cDNA ó secuencia genómica entre individuos afectados y no afectadoe. Si ee obeerva una mutación en alguno ó todoe los individuos afectados pero no en algunos individuos normales, entonces las mutación es probablemente el agente causal de la enfermedad.
Con la resolución corriente de técnicas de mapeo físico y mapeo genético, un cDNA precisamente localizado en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de entre 50 y 500 genes causales potenciales. (Esto supone resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb) .
Utilizando la técnica anteriormente descrita, la localización cromosómica de TNF-gama se determinó con muy alta confianza , siendo de 9q32.Estudios de mapeo cromosómico previos han relacionado varios defectos de desarrollo a loci en esta área del cromosoma 9.
Ejemplos La presente invención será adicionalmente descrita con referencia a los siguientes ejemplos; no obstante se comprende que la presente invención no ee limita a tales ejemploe. Todas las partes ó cantidades, a menos que se espeficique de otra manera, están en peso.
A fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos se describirán ciertos métodos que tienen lugar frecuentemente y/ó términos.
Los "plásmidos", son deeignados por una p minúscula precedida y/ó seguida por letras mayúsculas y/ó números.
Los plásmidos inicialee de la presente son ya sea disponibles comercialmente, disponibles públicamente sobre una base sin restricción, ó pueden ser construidos desde plásmidos disponibles de conformidad con los procedimientos publicados, a menos que se establezca de otra manera. Además, plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la materia y serán obvios para los expertos en la materia.
"Digestión" de DNA se refiere a fragmentación catalítica del DNA con una enzima de restricción que actúa solamente en ciertas secuencias en el DNA. Las varias enzimas de restricción usadas en la presente están comercialmente disponibles y sus condiciones de reacción, co-factores y otros requerimientos se usaron como lo harían el experto en la materia ordinario. Para propósitos de análisis, típicamente 1 µg de plésmido ó fragmento de DNA se usa con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µl de solución reguladora. Para el propósito de aislar fragmentos de DNA para construcción de plásmidos, típicamente 5 a 50 µg de DNA se digieren con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Las cantidades de los reguladores y substratos apropiados para enzimas de restricción particulares son especificadas por el fabricante. Los tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37 °C son ordinariamente usados, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Después de digestión la reacción es electroforizada directamente sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La separación por tablas de los fragmentos divididos se efectúa utilizando gel de poliacrilamida al 8 % descrito por Goeddel, D. Y colaboradores, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) .
"Oligonucleótidos", se refiere ya sea a polidesoxinucleótido de una sola cadena ó a polidesoxinucleótido de dos cadenas complementarias que puedan ser químicamente sintetizados. Tales oligonucleótidos no tienen 5' fosfato y por consiguiente no ligan a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético ligará a un fragmento que no ha sido desfoeforilado.
"Ligación" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiésteres entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble cadena (Maniatis, T. y colaboradores, Id., p. 146) . A menos que se condicione de otra manera, el ligado puede lograrse utilizando reguladores y condiciones conocidas con 10 unidades de T4 DNA ligasa ("ligasa") por 0.5 µg de aproximadamente cantidades equimolares de los fragmentos de DNA a ser ligados. A menos que se establezca de otra manera, la transformación se efectuó como se describe en el método de Graham, F. Y Van der Eb, A. Virology, 52:456-457 (1973),.
Ejemplo 1: Expresión Bacteriana y purificación de TNF-gama La secuencia de DNA que codifica a la TNF-gama ORF de extensión total, Depósito ATCC No. 75927, fue amplificada inicialmente utilizando oligonucleótidos iniciadores para PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' de la proteína TNF-gama. Nucleótidos adicionales que corresponden a TNF-gama fueron añadidos en las secuencias 5' y 3' respectivamente. El oligonucleótido iniciador 5' se expone como la SEC ID NO: 13 y tiene la secuencia 5' -GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAÁ AGT C - 3' la cual contiene un sitio de enzima de restricción Bam Hl seguido por los primeros 24 nucleótidos de TNF-gama que codifican a la secuencia inicial desde el codón de la metionina inicial. La secuencia 3', 5' -CGC GTC TAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAÁ AGA AGG -3' (SEC ID NO: 14) contiene secuencias complementarias a un sitio Xba I y 22 nucleótidos de TNF-gama. Los sitios de enzimas de restricción corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-9 (Qiagen) . pQE-9 se digirió entonces con Bam Hl y Xba I. Las secuencias amplificadas se ligaron en pQE-9 y se insertaron en la estructura con la secuencia que codifica par,a la histidina tag y la RBS . La mezcla de ligado se uso entonces para transformar una cepa de E. coli disponible de Qiagen con la marca registrada M15/rep 4 por el procedimiento descrito en Sambrook, J. Y colaboradores, Molecular Cloning: a laboratory Manual, Cold Spring Laboratory prese, (1989) . M15/rep4 contiene copias múltiples del plásmido pREP4, que expresa al represor lacl y también confiere resietencia a la kanamicina (Kanr) .Los transformantes fueron identificados por su capacidad para crecer en placas LB y se seleccionaron las colonias resietentes a la kanamicina/ampicilina. El DNA plásmido se aisló y confirmó por análisis de restricción. Los clones que contienen la construcción deeeada se desarrollaron durante toda la noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado con ambas Amp (100 µg/ml) y Kan (25 µg/ml) . El cultivo O/N se utilizó para inocular un cultivo grande en una proporción de 1:100 hasta 1:250. las células se desarrollaron a una densidad óptica de 600 (O.D.6oo) de entre 0.4 y 0.6. Luego se añadió IPTG ("Ieopropil-B-D-tiogalactopiranosida") hasta la concentración final de 1 mM. El IPTG induce por activación al represor lacl, que purifica al P/O que conduce al aumento de la expresión genética. Las células se desarrollaron 3 a 4 horas extras. Las células fueron entonces cosechadas por centrifugación. El compacto de las células en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 M (las concentraciones de Guanididna HCl mayores ó iguales a 2.5 M, se encontraron empíricamente como resultado de un nivel superior de pureza de la proteína recombinante recuperada) . Después de clarificación, la TNF-gama solubilizada se purificó con esta solución por cromatografía sobre una columna quelato-níquel en condiciones que permiten en enlace hermético por proteínas que contienen el 6-His tag (Hochuli, E. y colaboradores, J. Chromatography 411:177-184 (1984)). La TNF-gama se purificó adicionalmente en una segunda corrida sobre la columna quelato-níquel . La TNF-gama (90 % pura) se eluyó de la columna en guanidina HCl 6 M pH 5.0 y para el propósito de renaturalización se dializó en regulador PBS. El producto de expresión se electroforó por SDS-PAGE, y los resultados se exponen en la figura 5 en donde las franjas marcadas "M" contienen marcadores de peso molecular; la franja 1 es el lisado celular inducido; la franja 2, es el lisado celular no inducido; la franja 3 es la proteína TNF-gama después de dos purificaciones sobre la columna níquel-quelato; la franja 4, es la proteína TNF-gama después de una purificación sobre la columna.
Un experto en la materia ordinario reconocerá que los vectores de expresión bacteriana diferentes de pQE-9 pueden usarse también para expresar a TNF-gama. Un vector de expresión bacteriana preferido tal es pHE4-5. pHE4-5 se obtuvo como DNA plásmido pHE4-5/MPIFD23 (esta construcción contiene un inserto no tratado que codifica a un ORF no 'relacionado). El plásmido pHE4-5/MPIFD23 se depositó con el American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, maryland 20852, en Septiembre 30 de 1997 (No. de acceso 209311). Utilizando los sitios de restricción Nde I y Asp 718 que colaterales al inserto MPIF ORF no relacionado, un experto en la materia podría fácilmente utilizar técnicas de biología molecular corrientes para reemplazar al ORF no relacionado en el plásmido pHE4- 5/MPIFD23 con el ORF de TNF-gama, ó variaciones de éstos, de la presente invención.
Ejemplo 2: Clonación y Expresión de TNF-gama utilizando el sistema de expresión en baculovirus La secuencia de DNA que codifica a la proteína TNF- gama de extensión total, ATCC No. 75927, se amplificó utilizando oligonucleótidos iniciadores de PCR correspondientes al las secuencias 5' y 3' del gen: el iniciador de 5' tiene la secuencia 5' -GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAÁ AGT C-3' (SEC ID NO: 15) y contiene un sitio de enzima de restricción Ba HI (en negrillas) seguido por 24 nucleótidos del gen de TNF-gama (el codón de iniciación para traslación "ATG" está subrayado) . El iniciador de 3' tiene la secuencia 5' -CGC GTC TAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAÁ AGA AGG-3' (SEC ID NO: 16) y contiene el sitio de fragmentación para la endonucleasa Xba I y 22 nucleótidos complementarios a la secuencia 3' no trasladada del gen de TNF-gama. Las secuencias amplificadas se aislaron desde un gel de agarosa al 1% utilizando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean, " BIO 101 Inc. La Jolla, CA) . El fragmento se digirió con las endonucleasas Bam Hl y Xba I y luego se purificó otra vez sobre un gel de agarosa al 1 %. Este fragmento se denominó F2.
El vector pA2 (modificación del vector pVL941, discutido posteriormente) se utilizó para la expresión de la proteína TNF-gma utilizando el sistema de expresión en baculovirus (para revisión ver: Summers, M. D. Y smith, G.E. 1987, a manual of Methods for Baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555) . Este vector de expresión contiene el promotor de polihedrina resistente del virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV) seguido por los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción Bam Hl y Xba I. El sitio de poliadenilación del virus SV40 simiano se usa para una poliadenilación eficiente. Para una selección fácil del virus recombinante el gen^ de beta-galactosidasa desde E. coli se insertó en la misma orientación que el promotor de polihedrina seguido por la indicación de poliadenilación del gen de polihedrina. Las secuencias de polihedrina se flanquearon en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homologa mediada por células de DNA viral tipo nativo co-transfectado . Muchos otros vectores de baculovirus podrían haber sido usados en lugar de pA2, tales como pRGl, pAc373, pVL941 y pAcIMl (Luckow, V.A. y Summers, M. D. Virology, 170:31-39).
El plásmido se digirió con las enzimas de restricción Bam Hl y Xba I y luego se desfosforiló utilizando fosfatasa intestinal de ternera por procedimientos conocidos en la materia. Se aisló el DNA desde gel de agarosa al 1 % utilizando el equipo comercialmente disponible ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, CA) . Este DNA vector se designó V2.
El fragmento F2 y el V2 plásmido desfosforilado se ligó con T4DNA ligasa. Células azules de E. coli XLl se transformaron entonces. La secuencia del fragmento clonado se confirmó por formación de secuencias de DNA. µg del TNF-gama del plásmido pBac se constransfectaron con 1.0 µg de un baculovirus linearizado disponible comercialmente ("DNA de baculovirus BaculoGold", Pharmigen, San Diego, CA. ) utilizando el método de lipofección (Felgner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)). lµg del DNA del virus Baculogold y 5µg del TNF-gama del plásmido pBac se mezclaron en un pocilio estéril de una placa de microtítulo que contenía 50 µg de medio de Grace libre de suero (life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Despuée de protección, se añadieron 10 µl de Lipofectina más 90 µl de medio de Grace , se mezcló e incubó por 15 minutos a la temperatura ambiente. Luego la mezcla de transfección se añadió gota a gota a células de insectos Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa para cultivo de tejido con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se volteó y se se regresó a su poeición para mezclar la solución añadida nuevamente. La placa se incubó por 5 horas a 27 °C. Después de 5 horas, la solución de transfección se retiró de la placa y se añadió 1 ml del medio del insecto de Grace suplementado con suero fetal de ternera al 10 % .
La placa se puso en la parte inferior de una incubadora y el cultivo continuó a 27 °C por cuatro días. Después de cuatro días, se colectó el sobrenadante y se efectuó un ensayo en placa esencialmente como describe Summers y Smith (supra) . Como una modificación, se utilizó un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., gaithersburg) , que permite un asilamiento fácil de las placas manchadas de azul. ((Una descripción detallada de un "ensayo de placa" puede encontrarse también en la Guía del usuario para cultivos celulares de insectoe y baculovirología distribuido por Life Technologies Inc., Gaithersburg, página 9-10) .
Cuatro días después de la dilución seriada, se añadió el virus a las células, las placas manchadas de azul fueron tomadas con el extremo de una Pipeta Eppendorf. El agar que contenía los virus recombinantes fue entonces resuspendido en un tubo Eppendorf que contenía 200 µl de medio de Grace. El agar se retiró por una centrifugación breve y el sobrenadante que contenía el baculovirus recombinante se utilizó para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días después los sobrenadantes de estas placas de cultivo se cosecharon y luego se almacenaron a 4 °C.
Las células Sf9 crecieron en el medio de Grace suplementado con FBS inactivado térmicamente al 10 % . Las células se infectaron con el baculovirus recombinante V-TNF-gama en una multiplicidad de infecciones (MOI) de 2. Seis horas después el medí-o se retiró y se reemplazó con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas después 5 µCi de [35S]-metiomima y 5 µCi [35S]-cisteína (Amersham) se añadieron. Las células se incubaron adicionalmente por 16 horas antes de que fueran cosechadas por centrifugación y las- proteínae marcadas fueran visualizadas por SDS-PAGE y autoradiografía. La figura 6 ilustra un gel en donde las franjas 1 y 3 son el medio del TNF-gama y cultivos control y las franjas 2 y 4 son los lisados celulares de TNF-gama y los cultivos control.
Ejemplo 3: Expresión de TNF-gama recombinante en células COS La expresión del plásmido, TNF-gama-HA se deriva de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) origen de réplica de SV40, 2) gen de resistencia a la penicilina, 3) origen de réplica de E.coli, 4) promotor de CMV seguido por una región polieslabonada, un intron de SV40, y un sitio de poliadenilación. Un fragmento de DNA que codifica al precursor de TNF completo y un antígeno hemaglutinina (HA) tag fusionado en estructura a su extremo 3' se clonó a la región polieslabonada del vector. Por consiguiente, la expresión de la proteína recombinante está bajo la dirección del promotor de, CMV. El HA tag corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina influenza que previamente se describió (I. Wileon, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly, y R. Lerner, 1984, Cell 37, 767) . La fusión de HA tag a nuestra proteína objetivo permite detectar fácilmente a la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítope de HA.
La estrategia de construcción del plásmido se describe como sigue: La secuencia de DNA que codifica a TNF-gama, ATCC # 75927, se construyó por PCR sobre el EST original clonado utilizando dos iniciadores: el iniciador 5' (SEC ID NO: 15) contiene un sitio BAM Hl seguido por 24 nucleótidos de TNF-gama que codifican a la secuencia de inicio desde el codón de iniciación; la secuencia 3' 5' -CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG ATA GTA AGA AGG CTC CAÁ AG-3' (SEC ID NO: 17) contiene secuencias complementarias al sitio Xba I, codón de detención de la traslación, HA tag y los últimos 18 nucleótidos de la secuencia codificante de TNF-gama (que no incluye el codón de detención) . Por consiguiente, el producto de PCR contiene un sitio Bam Hl, una secuencia codificante de TNF-gama seguida por HA tag fusionados en estructura, un codón de detención para terminación de la traslación que sigue al HA tag, y un sitio Xba I. El fragmento de DNA amplificado por PCR y el vector pcDNAI/Amp, se digirieron con las enzimas de restricción Bam Hl y Xba I y se ligaron juntas. La mezcla de ligado se transformó en la cepa SURE de E. coli (disponible de Stratagen Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) el cultivo transformado se plaqueó sobre placas con medio de ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. El DNA plásmido se aisló de los transformantes y se examinó por análisis de restricción para la presencia del fragmento correcto. Para expresión del TNF-gama recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método DEAE-DEXTRAN . (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989) ) . La expresión de la proteína HA T?F-gama se detectó por el método de radiomarcado e inmunoprecipitación. (E. Harlow, D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron por 8 horas con [35S]-S-cieteína dos días post-transfección. El medio de cultivo se colectó luego y las células se usaron con detergente (regulador RIPA (150 mM de ?aCl, ?P-40 al 1 %, SDS al 0.1 %, NP-40 al 1 %, DOC al 0.5 %, 50 mM de Tris, pH 7.5; Wilson, I. Y colaboradores, Id. 37:767 (1984)). Ambos lisados celulares y medio de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizaron, entonces sobre geles SDS-PAGE al Ejemplo 4: Patrones de Expresión de TNF-gama en Tejido Humano Se llevó a cabo análisis por manchado de RNA para examinar los niveles de expresión de TNF-gama en tejidos humano. Muestras de RNA celular total se aislaron con el sistema R?Azol™ B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033) . Aproximadamente 2 µg (para el manchado de R?A de la figura 3A) de R?A total aislado de cada tejido humano especificado se separaron sobre gel de agarosa-formaldehído al 1% y se manchó sobre un filtro de nylon (Sambrook, Fritz, y Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring harbor Press, (1989) ) . La reacción de marcado se dio conforme al equipo Stratagene Prime-It con 50 ng de cD?A de T?F-gama, para producir cD?A de T?F-gama [32P]-marcada. El D?A ,marcado se purificó con una columna Select-G-50 (5 Prime - 3 Prime Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303) . El filtro se hibridizó luego con el gen de T?F-gama de extensión total a 1,000,000 cpm/ml en NaP04 0.5 M, pH 7.4 y SDS al 7 % toda la noche a 65 °C. Después de lavarse dos veces a la temperatura ambiente y dos veces a 60 °C con 0.5 x SSC, SDS al 0.1 %, la película de rayos-X se expuso entonces al manchado a -70,°C toda la noche con un protector intensificante. El RNA mensajero para TNF-gama es abundante en riñon.
La misma reacción se dio para obtener los resultados de la figura 3B, con la excepción de que se usaron 10 µg de RNA poli-A aislado de los tejidos indicados. En este experimento, el RNA mensajero que codifica a T?F gama es expresado predominantemente en células HUVEC (figura 3B; franja 9), pero no en otrae líneae celulares examinadas; por ejemplo; la franja 1 es CAMA1 (cáncer de seno); la franja 2 es A?3CA (cáncer uterino); la franja 3 es SK.UT.l (cáncer uterino) ; la franja 4 es MG63 (osteoblastoma) ; la franja 5 es HOS (osteoblastoma) ; la franja 6 es MCF7 (cáncer de seno) ; la franja 7 es OVCAR-3 (cáncer ovárico) ; la franja 8 es CAOV-3 (cáncer ovárico) ; la franja 10 es AOSMIC (músculo liso); y la franja 11 es fibroblasto de piel externa.
Los análisis por manchado Northern se efectuaron para determinar el nivel de expresión relativa del RNA de TNF-gama con respecto al estado de proliferación de los cultivos de células HUVEC. En estos experimentos, cantidades idénticas de RNA total aislado de células HUVEC (15 µg) se separaron electroforéticamente y se mancharon como se describió anteriormente. El RNA se aisló de los cultivos 1, 2, 3, 4, 6 y 7 días post-siembra. Como s eilustra en la figura 4, el RNA de T?F-gama ("VEGI" marcado) se vio solamente en bajos niveles en cultivos recientemente sembrados (1, 2 y 3 días) . Sin embargo, la expresión del R?A de T?F-gama fue obvia de modo que las células HUVEC en los cultivos comenzaron a alcanzar confluencia (4, 6 y 7 días) . Estos experimentos indican que la expresión de T?F-gama aumenta cuando las células en un cultivo comienzan a alcanzar es estado de reposo de proliferación reducida ó no.
Ejemplo 5: Capacidad de T?F-gama recombinante para inhibir el crecimiento celular de WEHI 164, ABAE, y L929, y para inducir la adhesión celular en células HL-60 Las células adherentes objetivo se prepararon desde cultivos confluentes por triptinización en PBS, y células objetivos no-adherentes se cosecharon desde cultivos estacionarios y se lavaron una vez con medio. Las células objetivo se suspendieron a 3 x 105 células/ml en medio que contenía FCS al 10 %. Alícuotas de 0.1 ml se dispensaron en placas de microtítulo de 96 pocilios de fondo plano que contenían 0.1 ml de muestras de células para verificación diluidas seriadamente (WEHI 164 y L929) . Se continuó la incubación por 70 horas. TNF-a, TNF-b y TNF-gama producidas bacterianamente se añadieron a concentraciones de 0.5 µg/ml. La citotoxicidad y actividad de proliferación se cuantificó utilizando un ensayo MTS efectuado por adición de 20 µl de solución de MTS y metosulfato de fenazina (PMS) a cada pocilio. Después de tres horas de incubación, el OD a 492 nm se midió por un lector para placas ELISA. El OD492 es proporcional al número de células viables en los pocilios. El por ciento de citotoxicidad se calculó como sigue: % de citotoxicidad = (100 - ODexper?mentai/ODcontroi) 100. Se tomaron las fotografías después de 72 horas. Como se expone en las figuras 7A y 8, TNF-gama indujo un cambio morfológico que aparece como células redondas obscuras ( que indican las células muertas) .
En la gráfica de la figura 7B, el ensayo se efectuó como se describió anteriormente, no obstante, se cantidades incrementadas de TNF-a, TNF-b y TNF-gama a los cultivos. Los resultados indican que TNF-gama es un inhibidor del crecimiento de la línea de células endoteliales WEHI 164, dependiente de la dosis, pero no de la línea celular de fibroblasto L929 (figuras 8 y 9) .
Una forma truncada del polipéoptido TNF-gama que consiste de los aminoácidos 12-147 de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama completa expuesta como la SEC ID NO: 2 (denominada TNF-gama?2-147) , se utilizó también para examinar el efecto' de TNF-gama sobre el crecimiento de células endoteliales. El tratamiento de células endoteliales aórticas de bovino adulto (ABAE) con TNF-ga ai2-i47 dio como resultado la inhibición casi completa del crecimiento de las células el cultivo de ABAE, pero no de las células en las líneas celulares de cáncer de seno MDA-MB-435 ó MDA-MB-231 (figura 10; TNF-gama es denominada "VEGI" en esta figura) . La inhibición casi completa del crecimiento de las células endoteliales se logró a 10 µg/ml de TNF-gama3,-i74» con un valor de la concentración inhibidora máxima de la mitad (IC50) de aproximadamente 1 µg/ml (aproximadamente 70 nM) .
Para verificar la capacidad de adhesión de TNF-gama, se usaron células HL-60 y la adhesión celular y el contacto célula-célula se determinó por observación en el microscopio y calificación subjetiva por dos ó más investigadores. La figura 11 ilustra la capacidad de TNF-gama para inducir la adhesión celular. Los cultivos que no se trataron con TNF-gama contenían células que tuvieron propagación en la extensión de la placa de cultivo. Sin embargo, los que se trataron con TNF-gama, contenían células que claramente se congregaron juntas.
Ejemplo 6: Determinación de la capacidad de apoptosis de TNF-gama En una primera etapa de incubación, el anticuerpo anti-histona se fijó adsorbentemente sobre la pared de un módulo de placa de microtítulo. Subsecuentemente, los sitios de enlace no-específico sobre la pared se saturaron por tratamiento con regulador de incubación (por ejemplo, solución bloqueadora) , Durante la segunda etapa de incubación, los nucleosomas contenidos en la muestra de células WEHI 164 tratada con TNF-a, TNF-b ó TNF-gama producidas bacterianamente se enlazaron vía sus componentes histona al anticuerpo anti-histona inmovilizado. En la tercera etapa de incubación, anti-DNA-peroxidasa (POD) reaccionó con el componente DNA de los nucleosomas. Después de eliminar una peroxidasa conjugada no enlazada por una etapa de lavado, la cantidad de peroxidasa retenida en el inmunocomplejo se determinó espectrofotométricamente utilizando el substrato ABTS (2, 2' -azino-di-[3-etilbenzotiazolin sulfonato]) . El anticuerpo anti-histona reaccionó con las histonas Hl, H2A, H2B, H3, y H4 de la muestra. El anticuerpo anti-DNA POD enlazó al DNA de una sola cadena y de doble cadena. Por consiguiente, el ELISA permitió la detección de mono- y oligonucleosomas y puede aplicarse para determinar la muerte celular apoptótica. El nivel de muerte celular se determinó por la cantidad de fragmentos de DNA asociados a histona citoplásmica que se indica por la proporción de la absorbancia observada a 405 nm y 490 nm (A405/A490) • Los resultados de estos experimentos se ilustran en la figura 12 (ver Boehringer Mannheim Catalogue, 0990 C 93 2 1541170) .
Como se expone en la figura 12, células WEGI 164 se indujeron para sufrir altos niveles crecientes de apoptosis, dando como resultado la muerte celular, en presencia de cantidades crecientes de TNF-gama. Este efecto se observó también en presencia de cantidades crecientes del control TNF-b ó en presencia de cualquiera de los niveles analizados del control TNF-a.
Ejemplo 7: Ensayo de enlace del receptor que utiliza TNF-gama TNF-a y TNF-gama producido bacterianamente se purificaron por cromatografía de afinidad con Ni-NTA que utiliza el 6 His tag fusionado al terminus de las proteínas recombinantes. 1 µg/pocillo de cada una de las proteínas se añadió a una placa recubierta de quelato de níquel (Xenopore Corp.) y se incubó por 2 horas. Después de lavar tres veces, 100 ng de los receptores de TNF soluble humanos (específicamente, TNFs Rl ó TNFs RII) se añadieron a cada pocilio e incubaron por 2 horas. La placa se lavó entonces tres veces y se añadieron anticuerpos policlonales marcados con fosfatasa alcalina criados contra ya sea TNFs Rl ó TNFs RII hasta un volumen total de 200 µl . Una alícuota de solución substrato (200 µl) se añadió entonces a cada pocilio y se incubó la placa por dos horas adicionales. Se determinó entonces el OD utilizando un lector ELISA (a una longitud de onda de prueba de 450 nm y una longitud de onda de corrección de 590 nm) . Los resultados expuestos en la figura 13 ilustran que TNF-gama no enlaza significativamente a los receptores de TNFs en comparación con el enlace del control observado con TNF-a.
Ejemplo 8: Expresión vía terapia genética Se obtienen fibroblastoe de un sujeto por biopsia de piel. El tejido resultante se coloca en medio de cultivo de tejido y se separa en piezas pequeñas. Los pedazos del tejido se colocan sobre una superficie húmeda de un matraz para cultivo de tejido, aproximadamente diez piezas se colocan en cada matraz. El matraz se gira de arriba abajo, se cierra herméticamente, y se deja a la temperatura ambiente toda la noche. Después de 24 horas a la temperatura ambiente, el matraz se invierte y los trocitos de tejido permanecen fijos en el fondo del matraz. En ese momento se añade medio recientemente preparado (por ejemplo, medio F 12 de Ham, suplementado con FBS al 10 %, penicilina, y estreptomicina) . El cultivo se incuba luego a 37 °C por aproximadamente una semana. En ese momento, se añade medio recientemente preparado y subsecuentemente se cambia cada 2-3 días. Después de dos semanas de cultivo adicionales, una monocapa de fibroblastos habrá emergido, la monocapa se triptiniza y se raspa y se pasa a matraces más grandes.
El pMV-7 (Kirchmeier, P. T. y colaboradores, DNA, 7:219-25 (1988)) que está flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de murina de Moloney, se digiere con Eco Rl y Hind III, y, subsecuentemente, se trata con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona sobre gel de agarosa y se purifica utilizando perlas de vidrio.
El cDNA que codifica a un polipéptido de la presente invención se amplifica utilizando iniciadores de PCR que corresponden a las secuencias de los extremos 5' y 3' respectivamente. El iniciador de 5' que contiene un sitio Eco Rl y el iniciador de 3' incluye un sitio Hind III. Cantidades iguales de la estructura lineal principal del virus del sarcoma de murina de Moloney y de los fragmentos Eco Rl y Hind III se añaden juntas, en presencia de la T4 DNA ligasa. La mezcla que resulta se mantiene en condiciones apropiadas para ligado de los dos fragmentos. La mezcla de ligado se usa para transformar la bacteria HB 101, que es entonces plaqueada sobre kanamicina que contiene agar para el propósito de confirmar que el vector tiene el gen de interés insertado apropiadamente.
Las células anfotrópica pA317 ó encapsuladas GP+aml2 se desarrollan en cultivo de tejido hasta densida confluente en el medio "Dulbecco' s Modified Eagles Médium" (DMEM) con suero de ternera al 10 % (CS) , penicilina y estreptomicina. Se añade entonces el vector MSV que contiene el gen al medio y las células encapsuladas se transducen con el vector. Las células encapsuladas producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células encapsuladas se mencionaran ahora como células productoras) .
Se añade medio recientemente preparado a las células productoras transducidae, ,y, subsecuentemente, el medio es cosechado desde una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro Millipore para retirar células productoras desprendidas. Este medio es entonces usa para infectar células de fibroblastos. El medio se retira de la placa sub-confluente de fibroblastos y rápidamente se reemplaza con el medio de. las células productoras. Este medio se retira y reemplaza con medio recientemente preparado. Si el título del virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos serán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces puede ser necesario usar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo ó his.
Los fibroblastos diseñados se inyectan entonces en el huésped, ya sea solos ó después de haber sido desarrollados hasta confluencia sobre perlas microtransportadoras citodex 3. Los fibroblastos producen ahora la proteína producto.
Ejemplo 9: Ensayo de angiogénesis in vitro Este ensayo se usa para determinar la capacidad relativa de TNF-gamai2-i47 para inhibir la formación inducida por FGF2 de estructuras tµbulares similares a capilares en cultivos de células endoteliales aórticas de bovino adulto (ABAE) . Se prepararon placas de gel de colágeno tridimensionales (24 pocilios) por adición de 0.5 ml de solución refrigerada de 0.7 mg/ml de colágeno tipo I de cola de rata (Becton Dickinson Labwares, Bedford, MA) a cada pocilio que contenía 1 x DMEM y ajuste a pH neutro con NaHC03. Después de la formación del gel de colágeno (aproximadamente 1-2 mm de espesor) , se sembraron las células ABAE a 5 x 104 células por pocilio. Los cultivos se mantuvieron en una incubadora humidificada al 5 % a 37 °C en DMEM que contenía suero de ternera al 10 % (HyClone, Logan, UT) suplementado con L-glutamina (2 mM) hasta que los cultivos alcanzaron la confluencia. El medio se reemplazó entonces con medio recientemente preparado que contenía 20 ng/ml de FGF-2. El efecto de TNF-gama?2-?47 como un inhibidor de la formación inducida con FGF-2 de estructuras tubulares similares a capilares en cultivos de ABAE se analizó por suplementación del medio de cultivo con 0.1, 0.3, 1, 3, ó 10 µg/ml de TNF-gama?2-?47. Todos los cultivos se mantuvieron luego a 37 °C por 48 horas adicionales y luego se discontinuaron por fijación con metanol frío (-20 °C) .
La abundancia de las estructuras similares a capilares formadas por células ABAE .se analizó por utilización de un analizador de Imagen Kotron IBAS asistido con una video cámara Hamamatsu C2400 y un microscopio Zeiss Axioshop. La abundancia de las estructuras similares a capilares se midió como porcentajes de las áreas blancas sobre las áreas totales medidas. Como un control, el valor de EC5o para el factor de angiogénesis FGF-2 para estimular in vi tro angiogénesis fue aproximadamente 5 ng/ml. Como un control adicional, se observó un efecto estimulador máximo a 10 ng/ml de FGF-2.
Como se muestra en la figura 14 (en la cual TNF-gama se designa "VEGI") , la inhibición observable de las formaciones tubulares inducidas por FGF-2 en cultivos de ABAE se observó por adición de 1, 3, y 10 µg/ml de TNF-gamal2-147 (señalado como VEGI) . El valor de IC50 para la inhibición de las formaciones tubulares inducidas por FGF-2 fué aproximadamente 1 µg/ml, que fue similar al observado para la inhibición del crecimiento de células endoteliales (ver ejemplo 5) .
Ejemplo 10: Ensayo de angiogénesis en Membrana Corioalantoica Embrionaria de Pollo (CAM) El ensayo CAM se llevó a cabo esencialmente como describe Nguyen y colegas ,(Microvasc. Res. 47:31-40 (1994)) e Iruela-Arispe y Dvorak (Thromb. Haemost. 78:672-677 (1997)). Los métodos están basados en el crecimiento de nuevos vasos capilares en un comprimido de gel de colágeno colocado directamente sobre la membrana corioalantoica (CAM) Los factores angiogénicos FGF-2 (100 ng) ó VEGF (250 ng) se embebieron en el comprimido de gel de colágeno y se colocaron en contacto con CAM. La cuantificación de la angiogénesis en los geles se llevó a cabo 24 horas después de la colocación de los comprimidos de gel por utilización de un microscopio para fluorescencia Nikon. Las imágenes se transfirieron a un Power PC 100 AV, utilizando una cámara CCD Sony. La intensidad de la fluorescencia se evaluó con el programa NH Image 1.61. La intensidad de la fluorescencia para los controles positivos (que contenían un factor angiogénico solo) se consideró como la respuesta angiogénica máxima, y se colocó arbitrariamente, en 100. Debido a la variabilidad del ensayo, la inhibición mayor de 20 % se consideró significativa.
Como una determinación experimental del efecto de TNf-gama sobre la angiogénesis inducida por FGF-2 ó VEGF, TNF-gama producido bacterianamente (250 ng) se mezcló con ya sea FGF-2 (100 ng) ó VEGF (250 ng) y se embebieron en el comprimido de gel de colágeno. Los comprimidos se pusieron entonces en contacto con la CAM como se describió anteriormente. Como se expone en la figura 15 (en la cual TNF-gama se designa "VEGI") , TNF-gama marcadamente inhibió nuevo crecimiento de capilaridad en geles de colágeno.
Ejemplo 11: Ensayo de Tumorigenicidad In Vivo Un análisis in vivo del efecto potencial de TNF-gama sobre la angiogénesis se efectuó utilizando un modelo de tumor xenoinjertado. En este procedimiento experimental, un millón de células de carcinoma de seno humano (MDA-MB-231 ó MDA-MB-435) ee inyectaron en el acolchado graso mamario de ratones desnudos hembras ya sea solos ó mezclados con células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con TNF-gama ó células CHO transfectadas solamente con el vector de CHO (5 x 106 células por ratón) . El polipéptido TNF-gama expresado en estos experimentos consistió de los polipéptidos expuestos como SEC ID NO: 2 excluyendo los 22 aminoácidos N-terminales. Los 22 aminoácidos N-terminales de esta muteína de TNF-gama se reemplazaron por el péptido indicador secretor de interleucina-6 humano (Hirano, T., y colaboradores, Nature 324: 73-76 (1986)).
Los ratones que fueron co-inyectados con células de carcinoma de seno humano , y con, ya sea células COS que expresa a TNF-gama ó células COS transfectadas en vector luego se aleatorizaron y se midieron los tumores dos veces semanalmente. El tamaño del tumor se evaluó por medición de diámetros perpendiculares con un vernier y se calculó por multiplicación de las medidas de los diámetros en dos dimensiones. Se presentan los datos en las figuras 16a y 16B como la media +/- la desviación estándar de seis ratones en cada grupo.
Los resultados presentados en la figura 16a y 16B (en la que TNF-gama se designa como "VEGI") ilustran los tamaños del MDA-MB-231 y MDA-MB-435, respectivamente, los tumores xenoinjertados (mm2) como una función del tiempo (días post-inoculación) . Los tumores se midieron comenzando en el día cero y aproximadamente a intervalos de 5 días hasta aproximadamente los 28 días. En cada caso los tumores que resultaron de células de carcinoma de seno coinyectados con células CHO que expresan a TNF-gama (representados por los círculos cerrados en las figuras 16a y 16B) permanecieron significativamente más pequeños en tamaño que los que resultaron de células de carcinoma de seno co-inyectadas con células CHO-vector solamente (representados por los círculos abiertos en las figuras 16a y 16B) .
Ejemplo 12: Inducción de la cinasa c-Jun (JNK) y NF-kB por TNF-gama La activación de NF-kB celular se predice por la fosforilación, ubiquitinación, y degradación última de una molécula inhibidora de NF-kB endógena designada IkBa. La degradación del inhibidor permite a la sub-unidad p65 de NF-kB traslocar al núcleo en donde pueda actuar como un regulador transcripcional. Por esta razón, un análisis del cambio en la movilidad electroforética (EMSA) es un método apropiado para analizar la activación de NF-kB celular por tratamiento de células cultivadas con TNF-gama.
En estos análisis las células (2 X 106 por ml) se trataron con diferentes concentraciones (0.1-1.0 µg/ml) de TNF-gama producido bacterianamente a 37 °C por 12 horas. De las células cultivadas se prepararon luego, los extractos nucleares y se efectuó EMSA como se conoce en la materia y esencialmente como describió (Singh, S. Y Aggarwal, B. B. J. Biol.. Chem. 270: 10631-10636 (1995)).
El tratamiento de las células U-937 con TNF-gama por 12 horas dio como resultado un aumento en los enlaces de DNA por la sub-unidad p65 de NF-kB. La activación del pico de enlace-DNA p65 se observó cuando las células U-937 se trataron con 1 µg/ml de TNF-gama por 12 horas. Sin embargo, el tratamiento de células U-937 con tan poco como 0.2 µg/ml de TNF-gama por 12 horas dio como resultado un incremento observable en el enlace-DNA p65. Se observó que TNF-gama activó el enlace-DNA p65 durante los niveles inferiores de 30 minutos hasta 18 horas después de la iniciación del tratamiento en células U-937.
Estos experimento se elaboraron para determinar un perfil de degradación para IkBa en células U-937 en respuesta al tratamiento con TNF-gama. Se determinó un curso cronológico de la degradación de IkBa por análisis por manchado Western, una técnica que es muy conocida por un experto en la materia y se ha descrito por Singh y Aggarwal (J. Biol.. Chem. 270:24995-25000 (1995)). IkBa se degradó completamente cuando las células U-937 se trataron con 0.1-1.0 µg/ml de TNF-gama por 12 horas.
La cinasa celular designada cinasa c-Jun (JNK) es un evento precoz en activación celular. La activación de JNK por TNF-gama se analizó como un método adicional de determinar la reacción celular al tratamiento con TNF-gama. El ensayo de activación de la cinasa JNK es muy conocido por los expertos en la materia y ha sido descrito por Derijard y colegas (Cell ,76:1025-1029 (1994)). Después de tratamiento de las células U-937 con 0.1-1.0 µg/ml de TNF-gama por 12 horas, las células se cosecharon y se ensayaron para actividad de cinasa JNK. Por 6 y 12 horas, la actividad de JNK tuvo incrementos 2- y 3, 6 veces, respectivamente.
Ejemplo 13: Efecto de TNF-gama en el tratamiento de artritis inducida con adyuvante, en ratas Un análisis del uso de TNF-gama para tratar artritis reumatoide (RA) puede efectuarse por medio del uso de un modelo de artitis inducida por adyuvante (AIA) en ratas. AIA es un modelo animal bien caracterizado y reproducible de artritis reumatoide que es muy conocido por cualquier experto ordinario en la materia (Pearson, Ann. Rheum. Dis. 15:379 (1956); Pearson & Wood, Artritis Rheum. 2:440 (1959) ) .Se espera que TNF-gama inhiba el incremento de angiogénesis ó el incremento de la proliferación de células endoteliales requerido para sostener la invasión de queratitis vascular en hueso y cartílago observada en esete modelo animal de RA. Las ratas de Lewis y BB (disponibles de Charles River Lab, Raleigh, NC y the University of Massachussets Medical Center, Worcester, MA) se usan como las cepas responsables y comunes para artritis inducida por adyuvante en estos experimentos.
La iniciación de las condiciones artríticas es inducida por la inyección intradérmica de 0.1 ml de adyuvante (5 mg/ml) en la base de la cola. Grupos de 5 a 6 ratas recibieron ya sea 0.1 a 1.0 mg/kg de TNF-gama ó vehículo intra-articularmente 20 días después de la inyección del adyuvante. En este punto la inflamación aguda alcanza un nivel máximo y la formación de queratitis vascular crónica habrá justo comenzado. El efecto de TNF-gama sobre la formación de queratitis vascular se analiza radiológicamente una vez cada semana después de los 15 días siguientes a la aplicación del adyuvante esencialmente como se describe en Turog y colegas (J. Exp. Med. 162:962 (1985)). Brevemente, se anestesia a las ratas con éter ó hidrato de cloral y se colocan de manera que ambas piernas posteriores sean sometidas a Rayos-X juntas. Las películas de Rayos-X son examinadas a obscuras utilizando un sistema de calificación de 0-3 para la reacción perióstica, erosiones óseas, espacio y destrucción de las uniones medulares. Cuando hay una cantidad significativa de daño en las uniones en ratas tratadas con el vehículo, los animales son sacrificados. En este punto, las garras se evalúan histológicamente para el grado relativo de daño en tejido y para el efecto terapéutico que TNF-gama ha provocado sobre estas uniones.
Finalmente, los animales tratados con TNF-gama y los tratados con el vehículo se someten a una evaluación clínica dos veces por semana para evaluar el volumen de las garras posteriores utilizando un sistema de pletismómetro y peso corporal.
Ejemplo 14: El ligando de DR3 ( TNF-gama) es una nueva citosina antitumor que existe en dos formas diferentes y diferencialmente expresadas en diferentes células y tejidos .
Antecedentes Loe miembros de la superfamilia TNF (factor de necrosis de tumor) desempeñan papeles muy importantes en la activación, proliferación, diferenciación, apoptosis, citotoxicidad celular y regulación inmune. Los miembros de la superfamilia del ligando y receptor de TNF son a menudo sobre-expresados en varias células cancerosas humanas y/ó linfocitos activados, su accesibilidad extracelular los hace excelentes objetivos celulares para terapia antitumoral específica y terapia de inmunomodulación. De unos años a la fecha la lista de moléculas pertenecientes a la superfamilia de ligandos y recptores de TNF-gama ha crecido rápidamente. La familia de ligandos de TNF de las citocinas consiete de las 13 proteínas transmembrana tipo II (excepto TNF-b) , la superfamilia de receptores de TNF consiete de los 18 tipos de proteínas transmembrana tipo I excepto ODP, también conocida como OCIF ó TRl, que es una proteína secretada, y TRID/DcRl/TRIAL-R3, que es una molécula de superficie celular unida a GPl.
Varios miembros de la superfamilia de receptores de TNF-gama así como también algunos de los transductores indicadores intracelulares involucrados en la apoptosis contienen una extensión de aproximadamente 60 a 80 aminoácidos de longitud, mencionada como La "región letal", estos receptores que contienen la región letal, tales como TNFR1, Fas/Apo-l/CD95, DR3 (también conocidos como Wsl, Apo3, TRAMP ó LARD) , DR4, DR5 ó TRAIL-R2, para activación por sus ligandos, regeneran a varias proteínas que intervienen en la muerte celular hasta la región letal.
Estas proteínas a su vez regeneran a otras proteínas vía sus regiones letales ó regiones efectoras de muerte para transducir la señal de muerte. TNFR1 es expresada en la mayoría de los tipos de células y de tejidos y está involucrada en la transducción de tres tipos principales de señales: activación del factor de transcripción NF-kB, cinasa de la proteína ,N-terminal c-jun y apoptosis. Mientras que Fas es expresado en linfocitos, hígado, corazón, pulmón, riñon, y ovario. En contraste, DR3 es predominantemente expresada en bazo, timus, y linfocitos de sangre periférica. El ligando para DR3 no ha sido todavía identificado. DR3 interactúa con TRADD, asociada con RIP ordinariamente solamente semanalmente, pero se asocia fuertemente cuando TRADD está sobre-expresado. En presencia de TRADD, también se asocia fuertemente con FADD. Estos resultados sugieren que el mecanismo de la apoptosis inducida por DR3 es similar al inducido por Fas y TNFR1. Similarmente TNFR1, DR3 también activan a NF-kB.
Se identificaron varios nuevos miembros de la superfamilia de receptores y ligandos de TNF utilizando varias eetrategias de inveetigación. Un nuevo ligando similar a TNF, TNF-gama, se expresó predominantemente en células endoteliales. Aunque TNF-gama comparte algunas de las actividades de TNF, no enlaza a TNFR1 y TNFR2, lo que indica que TNF enlaza a un receptor distinto. En la presente demostramos que TNF-gama enlaza a DR3 en varios ensayos de enlace ligando-receptor. Interesantemente, TNF-gama existe en dos formas diferentes que son expresadas de manera distinta en diferentes células y tejidos.
Resultados y Discusión: Se identificaron nuevos miembros de la superfamilia de receptores y ligandos de TNF desde la base de datos HGS que contiene en total 1.5 millones de ESTs desde el total de 620 acervos de cDNA. Un nuevo ligando de TNF-similar predominantemente expresado en un acervo de células endoteliales exhibió 20-30 % de homología de secuencia con otros miembros de la familia TNF La proteína se denominó TNF-alfa (ó VEGIa por "Vascular Endotelial derived tumor Growth Inhibitor alfa") . El análisis de base de datos y cribado de acervos subsecuentes identificaron una nueva variante de unión de TNF-gama, designada TNF-gama-beta (ó VEGIb) . Esta isoforma se encontró predominantemente en acervos de cDNA de células endoteliales inducidas por TNFa-e IL-1, monocitos y células T activadas. El cDNA para TNF-alfa codifica a 24 residuos de aminoácidos y TNF-gama-beta codifica 251 aminoácidos. Solamente difieren en el N-terminus que corresponde a las regiones intracelular y transmembrana (Figura 18a-D y 19) .
TNF-gama recombinante induce apoptosis en varias líneas celulares tales como células endoteliales de arteria pulmonar bovina y células endoteliales aórticas de bovino adulto. [las células endoteliales de arteria pulmonar bovina se incubaron con vaxias concentraciones de TNF-gama por 48 horas. La apoptosis se evaluó por manchado nuclear con tintura fluorescente Hoechst 33342 (10 mg/ml) .] TNF-gama también induce la activación del factor nuclear kB (NF-kB) y de la cinasa N-terminal c-Jun (JNK) , inhibe la angiogénesis in vi tro . [Se tranfectaron células U937 utilizando lipofectamina (siguiendo las instrucciones del fabricante) con 0.2 mg de plásmido reportero (NF-kB-SEAP) . Las células U937 transfectadas se colectaron y añadieron a la placa de 96 pocilios (200 ml/pocillo) con varios concentrados de TNF-gama. Después de incubación a 37 °C por 72 horas, la actividad de NF-kB se midió con luminómetro a absorbancia de 450 nm.] Para identificar el nuevo par de receptor y ligando, se establecieron varios ensayos de enlace receptor-ligando. El enlace de TNF-gama soluble recombinante que contiene ecto-región completa a la proteína de fusión DR3-Fc inmovilizada sobre el microelemento BIAcore, DR3-Fc purificada también enlaza al microelemento BIAcore inmovilizado con TNF-gama. [DR3-Fc purificada ó TNF-gama se analizaron en un instrumento BIAcore de flujo celular derivado con TNF-gama ó DR3-Fc. Los datos expuestos representan la región de enlace neta (sin proporción) de la gráfica después del enlace de TNF-gama al receptor DR3-Fc inmovilizada, ó enlace de DR3-Fc a TNF-gama inmovilizada, lo cual es determinado en unidades de masa relativas (RU) contra el tiempo. Las condiciones de enlace se llevaron a cabo a densidades del microelemento receptor altas bajo condiciones limitadas de difusión.] Utilizando técnicas de inmunoprecipitación, TNF-gama recombinante se co-inmunoprecipitó junto a DR3-Fc, pero no a las inmunoadhesiñas LTbR-Fc. [Las regiones extracelulares Fc de DR3 ó Fc sola y los ligandos correspondientes se prepararon y se efectuaron ensayos de enlace como se describe en otra parte. Las fusiones de Fc respectivas se precipitaron con la proteina G-Sepharose y loe ligandos solubles que co-precipitaron se detectaron por inmunomanchado con anticuerpo anti-TNF-gama. Se efectuó el manchado y la detección como se describe en el protocolo del equipo BM para Manchado Western por Quimioluminiscencia.] Para demostrar adicionalmente la interacción entre DR3 y TNF-gama, se cribaron varias líneas celulares para expresión sobre superficie celular de TNF-gama utilizando anticuerpos policlonales para TNF-gama soluble recombinante. Consistente con el análisis por manchado Northern, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) expresaron a TNF-gama sobre la superficie celular por inmunmanchado con anticuerpo a TNF-gama. [Las células se colectaron por triptinización ó aspiración, y se centrifugaron a 1500-2000 rpm por 5 minutos. El compactado celular se resuspendió y lavó en 5 ml de PBS-frío-hielo dos veces. Las células se incubaron por 30 minutos a 40 °C con anticuerpo (10 mg/ml) en TNF-gama para detectar la expresión de TNF-gama sobre la superficie celular, con DR3-Fc ó LTbR-Fc (10 mg/ml) para enlace de receptor y ligando en el regulador de enlace (HBSS que contiene BSA al 10 %, 20 mM de HEPES, pH 7.2, NaN3 al 0.02 %). Se usó IgG humana purificada (25 mg/ml) como control. Las células se lavaron luego y se mancharon con ficoeritrina (PR) conjugada con IgG de cabra anti-conejo ó anti-humano a 20 mg/ml. Se analizó la fluorescencia por citómetro de flujo FACscan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) .] Dos líneas celulares tumorales (MC-38/TNF-gama y MDA-231/TNF-gama) transfectadas con TNF-gama también expresaron a TNF-gama sobre la superficie celular. El análisis FACS demostró que hubo un cambio en la mayoría de la población a continuación de la exposición de las células MC-38/TNF-gama a DR3-Fc, que indica el enlace en superficie celular entre TNF-gama y DR3. Similarmente, se observó un cambio en las células MDA-231 transfectadas con TNF-gama. Además, la proteína DR3-Fc también enlaza a células HUVEC y PBMC. Es digno de atención que la expresión de DR3 y el enlace de TNF-gama a PBMC declinó después de estímulo prolongado con PHA. Como se predijo, DR3-Fc inhibe la TNF-gama inducida por NF-kB activada de una manera dependiente de la dosis. [Células U937 se transfectaron utilizando lipofectamina (siguiendo las instrucciones del fabricante) con 0.2 mg de plásmido reportero (NF-kB-SEAP) . Las células U937 transfectadas se colectaron y añadieron a la placa de 96 pocilios (200 ml/pocillo con varias concentraciones del receptor DR3-Fc y 100 ng/ml de TNF-gama. Después de incubación a 37 °C por 72 horas, la actividad de NF-kB se midió con luminómetro a absorbancia de 450 nm.] Mapas de TNF-gama para la localización cromosómica en la banda 9q32. Esta localización cromosómica es próxima de CD30L (9q33), pero es diferente de los genes para TNFa, LTa y LTß los cuales están herméticamente unidos al complejo sobre el cromosoma 6. Interesantemente, el receptor de TNF-gama, DR3 se asignó al brazo largo del cromosoma 1, región p36.2, está localizado en una región en donde han sido mapeado CD30, TNFR2 y 0X40.
Consistente con el papel de TNF-gama y DR3 en la apoptosis y regulación inmune así como también la interacción de DR3 con TNF-gama, la producción local de TNF-gama ocasionó supresión de tumor completa in vivo en modelos de cáncer de colon de murina MC-38 singeneico. En el mismo modelo animal, la producción local de DR3 soluble, que puede bloquear la función de TNF-gama, promuve el crecimiento tumoral. [La TNF-gama de extensión total y la región extracelular de DR3 se clonaron en el vector de expresión pcDNA3 y se transfectaron a células MCA 38, respectivamente. Después de selección y clonación, tres clones de cada construcción se resembraron para estudio de inmunogenicidad. Las células MCA 38 (1 x 106 células/ratón) que expresan a TNF-gama ó a la región extracelular de DR3 se inyectaron en ratones C57BL6/6. El tamaño de tumor se evaluó por medición de los diámetros perpendiculares con un vernier y se calculó por multiplicación de las medidas de los diámetros en dos dimensiones. Los datos se presentaron como la media +/- desviación estándar (SD) de 6 ratones en cada grupo.] Es claro que la mayoría de las células inmunes y células cancerosas pueden expresar a más de un miembro de la superfamilia de receptores ( igualmente más de un receptor muerto) y ligandos. La existencia de receptores múltiples para un ligando ó de ligandos mútiples para un receptor, y formas variantes de unión múltiple de receptor ó ligando sugiere una complejidad inesperada en la regulación de apoptosis y de la función inmune, estos receptores y ligandos parecen ser funcionalmente redundantes, pero sus patrones de expresión son diferentes, lo que sugiere un involucramiento de un tejido distinto ó célula específica en una función particular. Además, la expresión de estos ligandos y receptores puede diferir en el nivel de tipos celulares individuales en tejidos y el nivel de expresión sobre el mismo tipo celular puede también diferir.
Se estima que el 10 % de los genes pueden unirse alternativamente, pero en muchos casos la función de las proteínas producidas permanece obscura. Para examinaar el significado funcional potencial de las dos variantes de unión de TNF-gama, se efectuó análisis por PCR en un total de 100 acervos de cDNA. Estos resultados se exponen en la siguiente tabla.
O l/i Patrones de expresión diferenciales de DR3, TNF-gama-alfa, y TNF-gama-beta Acervo DR3 TNF-ga TNF-gb Acervo DP3 TNF-ga TNF-gb Tejido Normal Tejido anormal y Célula Hígado + Tumor hepatocelular + Nóduloe linfáticos + Linfoma de Hodgkin + Amígdalas + Rabdomiosarcoma Médula ósea . Pólipos nasales Bazo + Bazo, melanoma metástico o Corazón + Bazo, crónico Timo + Leucemia linfocítica Pericardio + Cicatrización de Heridas (piel + Cerebro Linfoma de células B Pulmón Hemangiopericitoma Músculo esquelético Tumor pancreático Placenta Piel quemada ) Acervo DR3 TNF-ga TNF-gb Acervo DR3 TNF-ga TNF-gb Próstata Cáncer de próstata. Etapa C Pituitaria Células UP937 + Testículos Tumor ovárico Colon Cáncer de colon Metasticizado + Páncreas Cáncer de hígado Corteza del riñon Cáncer de colon Pulmonar Enfermedad de Crhon Adiposo Riñon rechazado + Ovario Linfoma de células T Cerebelo Tumor endometrial Hipocampus Tumor en piel Hipertálamus Carcinoma pancreático Epitelio olfatorio Células de Jurkat Depresión estriada Línea célula Hela + O Acervo DR3 TNF-ga TNF-gb Acervo DR3 TNF-ga TNF-gb Glándula pineal LNCAP+0.3 nM de Andrógeno LNCAP+30 nM de andrógeno Células Normales Tejido fetal HUVEC Embrión de 8 semanas VO Embrión de 9 semanas Endotelial dérmica Cerebro fetal + Células T en reposo Riñon fetal + Células T activadas (12 horas) Corazón fetal Células T activadas (16 horas) + O Acervo DR3 TNF-ga TNF-gb Acervo DR3 TNF-ga TNF-gb Timo fetal Células T 'activadas (24 horas) + Pulmón fetal Auxiliar I de células T Hígado fetal Auxiliar II de células T Bazo fetal CD34+ NJ VO Ul Células dentríticas Primarias + Eosinófilos Monocitos + Osteoblastos Queratinocito + Células endometriales Estromales Células estromales TF274 Como se muestra en la tabla, DR3 y dos formas de TNF-gama son expresadas diferencialmente en diferentes tejidos y células. En los acervos verificados, Se encontró que DR3 fue expresado en la mayoría de los tejidos, en células T activadas, en células TH2, , y en varias otras lineas celulares (tales como UP37, HeLa) y tejidos tumorales (tales como tumor hepatocelular y linfoma de Hodgkin) . La expresión de DR3 aumentó en la línea celular LNCAP de carcinoma de la próstata tratada con 30 nM de andrógeno sintético. TNF-gama-alfa es solamente expresada en unos cuantos tejidos ó célulae tales como cerebro fetal, corazón fetal, adiposo, corteza del riñon, epitelio olfativo, carcinoma pancreático y HUVEC. En contraste, TNF-gama-beta tuvo un patrón de expresión muy amplio. Al nivel celular, solamente células endoteliales, células T activadas, monocitos, queratinocitos, Hela y células de Jurkat expresan a TNF-gama-beta. Solamete acervos de cDNA de HUVEC, de cerebro fetal, y de corazón fetal expresan ambas formas de TNF-gama y DR3. TNF-gama-alfa, TNF-gama-beta, y DR3 no son expresadas en células T en reposo ó etapa precoz de células T activadas (12 horas) . DR3 detectable a 16 horas, y ambos DR3 y TNF-gama-beta se vuelven detectables en células T a 24 horas después de esímulo PHA. La inducción dependiente del tiempo de DR3 y luego TNF-gama-beta en células T activadas sugiere que DR33 y TNF-gama pueden desempeñar un papel importante en apoptosis inducida por la activación.
Análisis de bases de datos de cDNA y de manchado Northern indicaron que la expresión de DR3 se encontró predominantemente en tejidos con alto contenido de linfocitos, TNF-gama se expresó predominantemente en células endoteliales, monocitos y células T activadas. De ese modo,DR3 y TNF-gama pueden estar involucradas en la apoptosis inducida por activación y la selección negativa de linfocitos. El patón de expresión de DR3, TNF-gama-alfa, y TNF-gama-beta por células y tejidos diferentes. La expresión de formas variantes de unión diferentes de DR3 ó TNF-gama es probablemente colocada en la balanza entre la susceptibilidad y la protección de la apoptosis mediada por DR3. Es cairo que el camino que conduce a apoptosis es un proceso altamente regulado y que involucra una serie de proteínas .
Otro ligando para DR3 denominado apo *L se ha descrito recientemente, el cual se publicó también como Tweak. Diferentemente expresados TNF-gama, Apo3L/Tweak en una amplia variedad de tejidos. La interrelación y la importancia funcional entre estos dos ligandos de DR3 queda para ser investigada.
Conclusiones : Se ha identificado, un par de nuevos receptores y ligandos de la superfamilia de TNF, DR3 y TNF-gama. Otros ligandos diferentes de la familia TNF, TNF-gama existe en dos diferentes formas y es expresado diferencialmente en células y tejidos diferentes. Se ha sugerido que uno de los mecanismos para regular la función de DR3 es a través de la unión alternativa de DR3. La unión alternativa pre-mRNA genera al menos 11 isoformas de DR3, que proporcionan un rango de efectos funcionales que pueden ayudar a conformar la respuesta inmune. Nuestros datos sugieren que la función de DR3 puede también ser regulada a través de unión alternativa y expresión diferencialmente de su ligando, TNF-gama. Estos logros tienen gran impacto sobre como se ve la regulación de la apoptosis y la función de la superfamilia TNF. La identificación de dos variantes del ligando DR3 expresado diferencialmente aumentó la posibilidad para la apoptosis modulada selectivamente, respuesta inmune y vigilancia inmune de tumor. La caracterización adicional de la función fisiológica y patológica de dos TNF-gama expreeadas diferencialmente puede proporcionar nueva penetración en las actividades biológicas y funciones fisiológicas así como atmbien aplicación terapéutica de la superfamilia de receptores y ligandos de TNF-gama. Se comprende que el papel y mecanismos de acción de estos genes nos permitiría modos de desarrollo para regular la apoptosis y proliferación celular en una variedad, de condiciones fisiológicas y patológicas.
Materiales y Métodos: Ensayo de Apoptosis Se incubaron células endoteliales de arteria pulmonar bovina (BPAEC) con varias concentraciones de TNF-gama por 48 horas. La apoptosis se evaluó morfológicamente y por manchado nuclear con la tintura fluorescente Hoechst 33342 (10 mg/ml) por triplicado. Las célulae vivae y apoptóticae ee calificaron en 4 campoe aleatorioe, ee contaron aproximadamente 1,000 células. Se analizó la fragmentación de DNA como se describió previamente.
Ensayo de enlace ligando -receptor BIAcore La generación del receptor recombinante DR3-proteína de fusión Fc y TNF-gama se describe en documentos previoe . TNF-gama purificada ó DR3-Fc ee inmovilizaron eobre BIAcore reepectivamente. DR3-Fc purificada ó TNF-gama ee analizaron en un inetrumento para derivación de flujo celular BIAcore con TNF-gama ó DR3-Fc. La región neta de enlace (ein proporción) de la gráfica deepuée del enlace de TNF-gama al receptor DR3 inmovilizado, ó del de DR3-Fc a T?F-gama inmovilizada, ee determinó en unidadee máeicae relativae (RU) contra el tiempo. Lae condicionee de enlace ee efectuaron a deneidadee altae del microelemento receptor bajo en condicionee limitadae de difueión.
Análisis por manchado Western y co-inmunoprecipi tación Se preparó antisuero policlonal ccontra T?F-gama en conejos como se describió previamente (?i, J., y colaboladores, J. Biol. Chem. 272:10853-10858, (1977)). Se prepararon las regiones extracelulares Fc de D3 ó Fc sola y los ligandos correspondientes y se hicieron ensayos de enlace como en otra parte. Las respectivas fusiones de Fc se precipitaron con la proteína G Sepharose y se detectó el co-precipitado soluble de ligandos por inmunomanchado con anti-cuerpo anti-T?F-gama. Las muestras se cargaron en un gel [?OVEX Pre-vcast Gels] (Gel Tris-Glicina al 4-20 % ) . Se efectuó el manchado y detección como se describe en el protocolo del equipo para Manchado Western para Quimioluminiscencia BM.
Análisis FACS Se colectaron las células por triptinización ó aspiración, y se centrifugaron a 1500-2000 rpm por 5 minutos. El compactado de células se resuspendió y lavó en 5 ml de PBS frio-helado dos veces. Las células se incubaron por 30 minutos a 40 °C con anticuerpo (10 mg/ml) para TNF-gama para detectar la expresión de TNF-gama sobre la superficie celular, con DR-Fc ó LTbR-Fc (10 mg/ml) por enlace de receptor y ligando en el regulador para enlace (HBSS que contenía BSA al 10 %, 20 mM de HEPES, pH 7.2, NaN3 al 0.02 %). Se usó como control IgG humana purificada.
Las células se lavaron entonces y mancharon con ficoeritrina (PE) conjugada a IgG de cabra anti-ratón ó anti-humano a 20 mg/ml. Se analizó la fluorescencia por un citómetro de flujo FACscan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) .
Ensayo de NF-kB-SEAP (fosfatasa alcalina secretada) reportera Se transfectaron células U937 utilizando lipofectamina (siguiendo las instrucciones del fabricante) con O.d mg de plásmido reportero (NF-kB-SEAP) . Las células U937 se colectaron y añadieron a la placa de 96 pocilios (200 ml/pocillo) con varias concentraciones de TNF-gama alctiva ó TNF-gama inactivada (por ebullición) ó en combinación con varias concentraciones de receptor DR3-FC y 100 ng/ml de TNF-gama. Después de incubación a 37 °C por 73 horas, la actividad de NF-kB se midió con luminómetro a absorbancia de 450 nm.
Análisis de la distribución de cél ulas y tejidos utilizando PCR sobre una amplia colección de base de datos de cDNA y acervos de cDNA Para estudiar la distribución de tejido de DR3, TNF-gama y TNF-gama-beta, se sintetizaron dos iniciadores específicos del gen para cada uno de los genes. Se verificaron los 100 acervos de cDNA y los acervos dieron una dimensión de señal predicha positiva se indican como + .
Ensayo de tumorigenicidad in vivo Se clonaron TNF-gama de extensión total y la región extracelular de DR3 en el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transfectaron a células MCA 38, respectivamente, Subsecuentemente a la transfección, selección de G418, y clonación, se resembraron tres clones de cada construcción para estudio de inmunogenicidad. La expresión de TNF-gama y DR3 en células MCA38 se confirmó por análisis Northern. Se inyectaron células MCA 38 (1 x 106) células/ratón) que expresan a TNF-gama ó a la región extracelular de DR3, en patones C57BL6/6. Los ratones se aleatorizaron y los tumores se midieron dos veces por semana. El tamaño del tumor se evaluó por medición de los diámetros perpendiculares con un vernier y se calculó por multiplicación de las medidas de los diámetros en las dos dimensiones. Los datos de representaron como la media +/-SD (desviación estándar) de 6 ratones en cada grupo.
Ejemplo 15: TNF-gama-alfa, un nuevo miembro de la familia citosina de TNF, causa apoptosis celular.
Antecedentes : TNF-gama-alfa es una nueva proteína con un peso molecular de 22 kD que se identificó recientemente por investigación de la base de datos de cDNA del Human Genom Sciences (HGS) (Tan. K. B., y colaboradores, Gene 204:35-46 (1997)). TNF-gama es una proteína de membrana tipo II y exhibe aproximadamente 30 % de homología de secuencia con el factor de necrosis de tumor humano (TNFa) . Este miembro recientemente identificado de la familia TNF se ha demostrado que se expresa abundantemente en células endoteliales así como también en riñon, pulmón y próstata. La expresión de TNF-gama en células HL.60 y THPl se indujo por tratamiento con PMA. El mapeo del híbrido por radiación localizó el gen de TNF-gama sobre el cromosoma 9q32, cerca de CD30L. A causa de su sobre-expresión en células endoteliales, se ha sugerido la posibilidad de que TNF-gama-alfa desempeña un papel en las funciones vasculares (Tan, K. B., y colaboradores, Gene 204:35-46). El presente estudio, emprendido para explorar ya sea si TNF-gama-alfa induce la apoptosis de células endoteliales, un fenómeno que se sugiere que es una de las causas de daño de las células endoteliales que contribuye a varios transtornos inflamatorios y mal funcionamiento vascular (Bryant, D. Y colaboradores, Circulation 97: 1375-1381 (1998)). Para examinar esta posibilidad, se utilizó células endoteliales de arteria pulmonar bovina (BPAEC) en las cuales se demostró apoptosis inducida por TNFa (Polunovsky, V. A. Y colaboradores, Exp. Cell Res. 214:584-594 (1994)). se determinó la apoptosis en base a características morfológicas (que incluyen ultra estructurales) y bioquímicas (fragmentación de DNA) . Además, se estudió los efectos de TNF-gama-alfa sobre la actividad de cinasas agotadas, cinasa de la proteína activada-agotada (SAPK/JNK) y cinasa de la proteína activada mitógena p38 (p38 MAPK) , y las caspazas. Ambas vías indicaron que se cree que están implicadas en la muerte celular programada (Xia, Z. Y colaboradores, Science 270:1326-1331 (1995)). La expresión de Fas y Bcl-2 en BPAEC estimulada por TNF-gama-alfa se determinó también envista, del efecto promotor de muerte celular de Fas y el efecto anti-apoptótico de Bcl-2 (Nagata, S. y Goldstein, P. Science 267:1449-1456 (1995)).
MATERIALES Y MÉTODOS: Materiales La proteína TNF-gama-alfa fue proporcionada po HGS . Ac-YVAD-AMC y Ac-DEVD-AMC se adquirieron de American Peptide (Sunnyvale, CA, USA) . ZVAD-fmk y AcYVAD-CHO se obtuvieron de Enzyme Systeme (Dublín, CA, USA) y Peptides International (Luoisville, KY, USA), respectivamente. AcDQMD-AMC, AcLEED-AMC, Ac-VETD-AMC y anti-p38 MAPK mAb fueron proporcionados por Smith Kline Beecham (SB) Pharmaceuticals (King of Prusia, PA, USA) . AcIETD-AMC y JNK mAb de aratón antihumano se adquirió de Biomol research Laboratories (Piymouth Meeting, PA, USA) y Phar-Mingen (San Diego, CA, USA) , respectivamente, El receptor 1 de TNF soluble de ratón (TNFsRI) y el receptor 2 de TNF (STNFR2) se obtuvieron de R & D Systems (Minneapolis, MN, USA) .
Cultivos celulares Se obtuvo BPAEC del American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) . Las células se desarrollaron en DEMEM suplementado con FCS al 10 % inactivado térmicamente en un ambiente humedecido de 5 % C02/85 % aire a 37 °C como se describió previamente. (Yue, T. L., y colaboradores, Mol. Pharmacol. 51:951-962 (1997)). Se utilizaron las células a una densidad de confluencia. Antes de los experimentos, el medio se cambió a DMEM contenido en FCS al 2 % . Se utilizaron en todos los estudios células BPAEC de los pasos 17-20.
Evaluación morfológica y cuantificación de la apoptosis Para cuantificar las células que se sometieron a apoptosis, las monocapas celulares se fijaron y mancharon con Hoechst 33324 (Molecular probé, eugene, OR, USA) como se describió previamente (Yue, T. L., y colaboradores, Mol. Pharmacol. 51:951-962 (1997)). las características morfológicas de la apoptosis (contracción celular, condensación de cromatina, formación de burbujas, y fragmentación) se monitorearon por microscopía de fluorescencia. Se hizo el estudio de microscopía electrónica de transmisión como se reportó previamente (Yue, T. L., y colaboradores, Mol. Pharmacol. 51:951-962 (1997) ) .
Análisis de Fragmentación del DNA (a) Formación de las escalas de DNA: Las células tratadas con vehículo ó TNF-gama-alfa se lisaron en regulador para lisis que contenía 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 2.5 mM de EDTA, SDS al 5 %, y 100 µg/ml de cinasa K de proteína. Los lisados se incubaron a 55 °C por 16 horas. Después de incubación, los lisados se extrajeron suavemente tres veces con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, el precipitado en etanol se trató con RNAsa libre de DNAsa, se re-extrajo, y se precipitó otra vez como se describió previamente.se llevó a cabo la electroforesis del DNA en geles de agarosa al 1.8 % que contenía bromuro de etidio, y se visualizó la fragmentación de DNA bajo la luz ultravioleta. (b) Marcado final in situ (T NEL) : se cultivaron células BPAEC en cámaras dobles deslizables (Nunc) y se trataron con TNF-gama-alfa por 8 a 24 horas. La detección in situ de células apoptoticas se efectuó por utilización de dUTP mediada por la transferasa desoxiribonucleótida terminal y marcado final con un equipo para detección de apoptosis in situ Apop Tag (Oncor) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Ensayo para la Proteina Cinasa activada-agotada (SAJPK/JNK) La actividad de SAPK se midió utilizando GST-c-Jun(?-8i) que enlazó a Glutation-Sepharose 4B como se describió previamente (Yuc, T. L., y colaboradores, Mol. Pharmacol. 51:951-962 (1997)). Brevemente, las células se trataron con vehículo ó TNF-gama-alfa, se lavaron, y se lisaron en regulador para lisis. El sobrenadante nuclear-libre se normalizó por contenido de proteína y se inmunoprecipitó con perlas de Sepharose conjugada con el anticuerpo anti-SPAK. La mezcla se rotó a 4 °C por 3 horas. El regulador de fosforilación que contenía GST-Jun(?-8i) , 10 µgC[g~32PI-ATP, 125 µM de ATP y 100 mM de MgCl, se añadió a las perlas de enlace-SAPK en regulador para ensayo. Se terminó la reacción después de 20 minutos a 30 °C por adición del regulador que contiene la proteína y se calentó a 90 °C por 3 minutos. Las proteínas fosforiladas se resolvieron por electroforesis sobre gel de SDA-poliacrilamida al 10 % seguida por autoradiografía. La intensidad de las bandas se cuantificó por Phosphorlmarger (Yuc, T. L. Y colaboradores, J. Mol. Cell. Cardiol. 30: 495-507 (1998)).
Ensayo para p38 MAPK Los lisados celulares preparados anteriormente se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-p38 MAKP enlazado a la Proteína Agarosa por 4 horas a 4 °C. Las perlas se lavaron con regulador de lisis y luego con regulador para cinasa como se describió previamente (Kumar, S. M., y colaboradores, J. Biol.. Chem. 271:30864-30869 (1996)). El ensayo para la cinasa del complejo-inmune se inició por adición de 25 µl de regulador para cinasa que contiene 2 µg de GST-ATF2 y 50 µM [?-32P] ATP (20 Ci/mmol) . Los productos fosforilados se resolvieron por SDA-PAGE y se visualizó por Fósforoimágen.
Transfección in vi tro del mutante de c-JUN que interfiere domi na temente , en BPAEC Las células se plaquearon en cámaras dobles deslizables. Las células se cotransfectaron con 0.5 µl/ml de Pegfp-c-1 (Clontech; Li, Y. Y Horwitz, M. S.
Biotechnology 23:1026-1028) cuando un marcador fluorescente de células transfectadas junto con 1 µg/ml de ya sea el vector de clonación pCDNAl vacío (control) ó bien el mutante de c-JUN que interfiere dominantemente, pcDNAl-fig?l69 (Xiá, Z. y colaboradores, Science 270:1326-1331 (1995) ) utilizando el equipo Calphos Maximizer Transfection (Clontec) conforme a las recomendaciones del fabricante. A continuación de la transfección, las células se mantuvieron para recuperación en medio completo por 24 horas. Las células se trataron con TNF-gama-alfa y el número de células apoptóticas se evaluó por manchado nuclear después de fijación como se describe en Métodos.
Ensayo de Actividad de caspasa Las células se trataron con vehículo de TNF-gama-alfa. Los ensayos de la actividad de caspasa se efectuaron como se reportaron previamente (Yuc. T. L., y colaboradores, ssupra) . Brevemente, las células se cosecharon y suspendieron en regulador que contenía 25 mM de HEPES, pH 7.5, sacarosa al 10 %, CHAPS al 0.1 %, 2 mM de DDT, 5 mM PMSF, 1 µM pepstatina A. La suspensión se forzó a través de un calibrador de agujas 25 , diez veces para romper las células, el homogeneizado se centrífugo a 100,000 x g por 1 hora, y el lisado clarificado se usó para ensayos enzimáticos. Los extractos celulares (5-20 µg de proteína) se diluyó en el regulador de ensayo (Tabla 2) y se preincubó por 10 minutos a 30 °C antes de la adición de los substratos. Se midieron los niveles de 7-amino-4-metilcumarina (AMC) liberados con un lector de placas fluorescentes Cytofluor-4000 (Perspective Bioeystems) a una excitación y longitud de onda de emisión de 360 nm y 460 nm, respectivamente.
Análisis Inmunohistoquímico para la Expresión de Fas , Bel -2 y Caspasa .
Las células se cultivaron en cámaras dobles deslizables. Después de tratamiento con el vehículo ó TNF-gam-alfa, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % por 30 minutos a 4 °C y luego se cambiarona PBS frío. Las células se trataron con Tritón X-100 al 0.2 % por 40 minutos a 4 °C, se lavaron con PBS frío y luego se bloquearon los sitios de enlace no específicos de inmunoglobulina con suero de cabra normal (Vector Laboratories) por 1 hora a la temperatura ambiente. Las muestras de células se incubaron con el anticuerpo primario Fas de ratón anti-humano (Upstate Biotechnology) , Bcl-2 anti-humano de ratón (DAKO) ó péptido policlonal antisuero CPP32pl7 de conejo anti-humano (Smith-Kline Beecham) , por 1 hora a la temperatura ambiente. Como un control negativo, las muestras celulares se incubaron con IgG no inmune (para Bcl-2 y CPP32) ó IgM (para Fas) en vez del anticuerpo primario. Después de incubación con el anticuerpo primario, las células se lavaron con PBS y luego se incubaron por 30 minutos con un anticuerpo secundario conjugado a isotiocianato de fluoresceí.na. Las células se lavaron, se trataron con el medio de "Veetashield mounting" (Vector Laboratories) y se vieron por microscopio para fluorescencia (Olympus 1X70) .
Análisis Estadístico Todos los valores se representan como la media +/- S.E.M. de n experimentos independientes. Se efectuó la evaluación estadística por utilización de análisis de varianza de una vía. Las diferencias con un valor de p<0.05 se consideraron significativas.
RESULTADOS: TNF-gama -alfa induce apoptosis en BPAEC Cuando las células BPAEC se expusieron a TNF-gama-alfa las células se contrajeron y se retrajeron de sus células vecinas, y el citoplasma se condensó. Las células manchadas con Hoechst 33324 y evaluadas por microscopía de fluorescencia demostraron cromatina condensada de fragmentos de núcleo y burbujas de la membrana plasmática. El estudio con microscopio electrónico de transmisión demostró que BPAEC tratada con TNF-gama-alfa contenía muchas células que sufrieron alteraciones morfológicas características de apoptosis que incluye la condensación de la cromatina y la aparición de cuerpos apoptóticos. La degradación característica del DNA en la fragmentación en la extensión oligonucleosomática se observó cuando las células se expusieron a TNF-gama-alfa (30-300 ng/ml) por 24 horas. Los fragmentos de DNA in situ se observaron adicionalmente por utilización del método TÚNEL . Una fracción considerable de células endoteliales tratadas con T?F-gama-alfa demostraron manchado positivo; se encontraron en los cultivos tratados con vehículo células no manchadas positivamente.
La apoptosis en células endoteliales inducida por T?F-gama-alfa fue un proceso dependiente de la concentración y del tiempo con un valor de EC30 de 72 ng/ml. Un incremento significativo en el número de células con cambios morfológicos apoptóticos fue obvio 6-8 horas después de la exposición de las células a T?F-gama-alfa. En condiciones similares, T?F-a a 10 ng/ml indujo apoptosis en PEAPC por 16.7 +/- 3.2 % (n=4) .
Efectos de sTNFRl y sTNFR2 sobre la apoptosis inducida por TNF-gama-alfa en BPAEC.
Ni sTNFRl no sTNFR2 demostraron efecto sobre la apoptosis inducida por TNF-gama-alfa en BPAEC. En las mismas condiciones la apoptosis inducida por TNFa en BPAEC se redujo por sTNFRl significativamente.
La regulación de la expresión de Fas y Bcl-2 en Células Endoteliales por TNF-gama-alfa . análisis inmunohistoquímico de las proteínas Fas y Bcl-2 se determinó a 8 y 24 horas después de tratamiento con TNF-gama-alfa. El nivel básico de Fas en BPAEC fue indetectable. Sin embargo, un número significativo de células que expresan al receptor de Fas se detectaron a 8 y 24 horas después de estímulo. Cuando el IgM de ratón se substituyó por el anticuerpo primario, no se detectó la inmunoreactividad de Fas positiva. En contraste, la expresión de Bcl-2 no se detectó en BPAEC tratadas con TNF-gama-alfa ni en las no estimuladas.
Activación de SAPK/JNK y p-38 MAPK.
Con respecto a los efectos de TNF-gama-alfa sobre la actividad de SAPK/JNK en BPAEC, exposición de células endoteliales a T?F-gama-alfa indujo una activación rápida de SAPK/JNK. Un incremento significativo en la actividad de SAPK/J?K se detectó 20 minutos después de estímulo, alcanzó el máximo a los 40 minutos y luego regresó al nivel básico después de 60 minutos. La activación inducida por T?F-gama-alfa de SAPK/J?K en células endoteliales es un proceso dependiente de la concentración. Algunas actividades inferiores de la actividad de SAPK/JNK aumentaron en 5.6 +/- 1.4 veces (p<0.05 n=4) y 9.1 +/- 1.8 veces (p<0.01 n=6) durante el nivel básico en presencia de 50 y 300 ng/ml de T?F-gama-alfa, respectivamente. p38 MAPK activado por T?F-gama-alfa en BPAEC con un transcurso de tiempo similar que SAPK/J?K pero en una extensión más muy inferior. El pico de la actividad de p38 MAKP fue incrementado en 3.1 +/-0.5 y 3.8 +/- 0.4 veces sobre el nivel básico en presencia de 100 y 300 ng/ml de T?F-gama-alfa, respectivamente.
Efectos sobre la apoptosis inducida por TNF-gama -alfa por expresión de mutantes de c-JUN con interferencia dominante, en BPAEC ó por el inhibidor p38 MAPK, SB203580 Para investigar el papel de SAPK/JNK en la apoptosis inducida por T?F-gama-alfa en BPAEC, se transfectó BPAEC con un mutante de c-JUN con interferencia dominante, pCDNAl-Flag?l69, en el cual una eliminación en la región de transactivación NH2-terminal que incluye el sitio de enlace para JNK (Xía, Z. y colaboradores, supra) . La expresión de la construcción de c-JUN , con interferencia dominante en BPAEC redujo la apoptosis inducida por TNF-gama-alfa en 62.8 % (p<0.05). La apoptosis inducida por TNF-gama-alfa en BPAEC se atenuó también por un inhibidor específico de p38 MAPK, SB203580, de una manera dependiente de la concentración. En presencia de 3 y 10 µM de SB203580, la apoptosie de BPAEC inducida por TNF-gama-alfa se redujo en 33 % (p<0.05) y 51 % (p<0.01), respectivamente. No se observó ninguna inhibición adicional cuando la concentración de SB203580 se aumentó.
Activación de Caspasas en BPAEC por TNF-gama -alfa La apoptosis de BPAEC inducida por TNF-gama-alfa se atenuó por ZVAD-fmk, un inhibidor permeable celular irreversible de caspasa (Jacobson, N. L. Y colaboradores, Cell Biol. 133:1041-1051 (1996)), añadido al medio de cultivo 1 hora antes del tratamiento con TNF-gama-alfa. En las miemas condiciones, la adición de Ac-YYAD-CHO, un inhibidro relativamente específico de caspasa-1 (Thorberry, N. A. Y colaboradores, Nature (Lond) 356:768-774 (1992)), hasta 100 µM no demostró efecto en mejorar el rescate de BPAEC. Para determinar adicionalmente cual de los miembros de la familia de las caspazas son activados en el proceso apoptótico inducido por TNF-gama-alfa en las células endoteliales, se examinaron extractos celulares para actividad proteolítica. Las proporciones relativas de formación de AMC se midió con una serie de variantes de secuencias de péptidos definidas que son relativamente específicas para caspazas 1, 3, 4, 7, u 8 en las condicione sóptimas que se describieron previamente (Yuc, T. L. Y colaboradores, supra) . Resultados similares se observaron de los tres experimentos repetidos. Extractos celulares de BPAEC tratada con TNF-gama-alfa fueron altamente activos sobre Ac-DEVD-AMC y en una extensión menor sobre Ac-DQMD-AMC, pero no activos en los tres substratos remanentes que son más específicos para las caspasas 1, 4, y 8. La actividad proteolítica 6 horas después de que las células fueron tratadas con TNF-gam-alfa el pico a las 24 horas, y gradualmente retornó a los niveles básicos en 48 horas. Las velocidades relativas de la proporción de hidrólisis de cuatro substratos por los extractos celulares tratados con TNF-gama-alfa y la caspasa-3 recombinante se compararon. Las velocidades relativas de las dos fuentes enzimáticas de los cuatro substratos fueron muy similares.
Para confirmar adicionalmente que la caspasa-3 es activada por TNF-gama-alfa en BPAEC, se efectuó la detección de su forma activa enzimáticamente, la sub-unidad 17-kD. El anticuerpo fue puesto contra un péptido de la porción C-terminal de la, sub-unidad pl7. El anticuerpo neoepítope solamente enlaza a la caspasa-3 si ha habido segmentación específica entre las sub-unidades "p-10" y "p-20".Utilizando estos anticuerpos neoepítopes, solamente se detecta la caspasa-3 procesada, pero no la proenzima (Yuc, T. L. Y colaboradores, supra) . La sub-unidad de 17 kD de la caspasa-3 se detectó en BPAEC tratada con TNF-gama-alfa pero no rn las tratadae con el vehículo, y se localizó con el núcleo fragmentado en las células.
DISCUSIÓN: Los estudios presentados en este documento demuestran que TNF-gama-alfa, una nueva citosina similar a TNF y un tipo II de proteína transmembrana, inducen apoptosis intensiva en células endoteliales cultivadas como se refleja por los criterios morfológicos y bioquímicos. En nuestras condiciones experimentales, las muertes de BPAEC espontáneas fueron de 2- a 4 % lo cual está de acuerdo con una observación previa (Polunovsky, V. A., y colaboradores, supra) . El efecto de TNF-gama-alfa fue dependiente de la concentración con un valor de EC8o de 72 ng/ml (3.5 nM) y un número significativo de células apoptóticae se detectó 6-8 horas después de tratamiento. Además, la expresión del gen pro-apoptótico, Fas, se demostró en BAPEC tratada con TNF-gama-alfa, lo cual es consistente con la observada en células endoteliales apoptóticas reportadas previamente (Yuc, T. L. Y colaboradores, supra).
Los receptores que median la actividad de TNF-gama-alfa no se han identificado todavía. Para examinar si TNF-gama-alfa actúa vía receptores diferentes, se examinaron los efectos de sTNFRl y sobre la apoptosis producida por TNF-gama-alfa en BPAEC. Se ha demostrado previamente que estas dos TNFRs bloquean las bioactividades de TNF mediadas por TNFR1 y TNFR2 de superficie celular sobre las líneas celulares responsables (datos de R & D Systems) . Ni sTNFRl ni sTNFR2 inhibieron el efecto de TNF-gama-alfa sobre BPAEC. En contraste, la apoptosis en BPAEC inducida por TNFa fue significativamente reducida por sTNFl. Los resultados sugieren claramente que la muerte celular inducida por TNF-gama-alfa es dependiente de sTNFRl ó TNFR2.
Esfuerzos de investigación recientes sobre los miembros de la familia TNF demostraron que TNFa y las cinasas de proteína agotada activan a Fas, SAPK/JNK y p38 MAPK, en una variedad de tipos celulares (Sluss, H. K., y colaboradores, Cell Biol.. 14:8376-8384 (1994)). ?o obstante, los efectos de otros miembros de esta familia sobre SAPK y p38 MAPK no s,e han estudiado bien. Además, se han publicado las controversias con respecto al papel de SAPK/J?K y p38 MAPK en T?Fa ó en la muerte celular mediada por Fas. Por ejemplo, la apoptosis inducida por T?Fa es dependiente de la actividad de JNK en células U937 (Verjeij, M. Y colaboradores, ?ature (Lond) 380: 75-79 (1995); Zanke, B. W., y colaboradores Curr. Biol.. 6:606-613 (1996) ) pero no en fibroblastos (Reinhardt, C. y colaboradores EMBO J. 16:1080-1092 (1997)) que indica que las consecuencias de la activación de JNK, varía considerablemente entre tipos celulares. La activación de J?K mediada por Fas tiene lugar con una cinética diferente que la de T?Fa, lo que sugiere que T?Fa y Fas muy probablemente activan a JNK a través de un mecanismo diferente (Wilson, D. J., y colaboradores, Eur. J. Immunol . 26:989-994 (1996)). Además, Juo, y colaboradores, reportaron recientemente que el bloqueo de p38 MAPK por un inhibidor específico de p38 MAPK no afectó la apoptosis mediada por Fas en células de Jurkat (Juo, P., y colaboradores Mol. Cell Biol.. 17:24-35 (1997)). Por consiguiente, nos interesamos en encontrar si T?F-gama-alfa activa a JNK y p38 MAPK, y cual es el papel de esta activación en apoptosis mediada por T?F-gama-alfa en BPAEC. La presente investigación claramente demuestra que ambas JNK y p38 MAPK fueron activadas rápidamente por T?F-gama-alfa en una manera similar, a la observada en U937 activada por T?Fa. Además, la expresión de mutantes de c-JU? que interfieren dominantemente en BPAEC redujo la muerte celular inducida por T?F-gama-alfa, lo que indica que la apoptosis inducida por T?F-gama-alfa en BPAEC es dependiente de la actividad de J?K. Para dirigir el involucramiento potencial de p 38 MAPK en la apoptosis mediada por T?F-gama-alfa en BPAEC, se examinó un inhibidor específico de p38 MAPK, SB203580. Este inhibidor ha demostrado que inhibe específicamente la actividad de p38 MAPK in vi tro con ningún efecto sobre una variedad de cinasas examinadas, que incluyen a JNK y ERK-1 (Cuenda, A., y colaboradores FEBS Lett. 364:229-233 (1995)). BP203580 redujo también la apoptosis inducida por T?F-gama-alfa en BPAEC de una manera dependiente de la concentración, lo que indica que las vía indicadora de p38 MAPK está involucrada en la apoptosie de BPAEC, mediada por T?F-gama-alfa. Este efecto es diferente del observado en apoptosis mediada por Fas en células de Jurkat en las cuales SB203580 no tuvo efecto protector (Juo, P. y colaboradores, eupra) . Además, la activación de p38 MAPK inducida por T?F-gama-alfa tiene lugar con cinéticas más rápidas en BPAEC que la observada en células de Jurkat en las cuales el pico de activación de p38 MAPK fue en 2-4 horas después de estímulo por Fas, lo que indica que TNF-gama-alfa y Fas muy probablemente acrivan a p,38 MAPK a través de diferentes mecanismos con un resultado diferente. Nuestros datos sugieren adicionalmente que miembros diferentes de la familia TNF pueden tener diferentes vías indicadoras para mediar la muerte celular ó tener diferentes efectos en diferentes tipos celulares.
Trabajos recientes han apoyado un papel central para los miembros de la familia de las caspasas, como efectoras de apoptosis (Kumar, S. M. Y colaboradores, supra). No obstante, el papel de las caspazas en la apoptosis de células endoteliales no ha sido explorado suficientemente. Se han elucidado dos aspectos característicos de la familia de las caspasas; ellas segmenta a sus proteínas objetivo, después de que ácidos aspárticos, que dan como resultado dos sub-unidades que forman juntas el sitio activo de la enzima (Nicholson, D. W. y colaboradores, Nature, Lond) 376:37-43 (1995); Kumar, S. M., y colaboradores, supra). Entre la familia caspaea, se considera a la caspasa-3 (CPP32) como un componente central de la cascada proteolítica durante la apoptosis y desempeña un papel clavee en esta familia (Wang, X., EMBO J. 15: 1012-1020 (1996); Woo, M., y colaboradores, Gene Developement 12:806-819 (1998)). La apoptosis de BPAEC inducida por TNF-gama-alfa fue inhibida por ZVAD-fmk, lo que indica un papel potencial para la familia de las caspazas en exta vía efectora de apoptosis. Para determinar cuales de los miembros de la familia de las caspasas están involucrados, se examinó la especificidad de substrato de la actividad proteolítica en los extractos de BPAEC activada por TNF-gama-alfa por medición de la velocidad relativa de formación de AMC de 6 substratos diferentes que son relativamente específicos para las caspazas 1, 3, 4, 7 y 8 (Talanian, R. V. y colaboradores, J. Biol.. Chem. 272:9677-9682 (1997)). El tratamiento de BPAEC con TNF-gama-alfa dio como reeultado un incremento significativo de la actividad proteolítica hacia DEVD-AMC principalmente y DQMD-AMC en alguna extensión, ambas de la s cuales demuestran especificidad relativa por la caspasa-3 (Kumar, S. M., y colaboradores, supra) . No hubo inducción en la actividad proteolítica en los extractos celulares activados con TNF-gama-alfa cuando se usaron Ac-YVAD-AMC, LEED-AMC ó VETD-AMC como substrato, lo que indica que las caspazas 1, 4 y 8 no deben estar involucradas. Además, la comparación de la especificidad de substrato de los extractos de BPAEC tratada con TNF-gama-alfa con la caspasa-3 recombinante demostró un patrón similar que sugiere adicionalmente que la caspasa-3 puede ser el miembro predominante en la familia de las caspazas activado por TNF-gama-alfa. Además, estudios inmunoquímicos detectaron la forma activa de la caspasa-3 en BPAEC tratada con TNF-gama-alfa. Se reportó que se encontraron múltiples homólogos de la caspasa en ambos, el citoplasma y el núcleo en apoptosis inducida por etoposida en células HL.60 (Martins, I. M., y colaboradores, J. Biol.. Chem. 272:7421-7430 (1997)). De manera interesante, en BPAEC apoptótica inducida por TNF-gama-alfa la sub-unidad de 17kD inmunoreactiva de la caspasa-3 se localizó solamente con núcleo fragmentado, lo que indica adicionalmente un papel de la caspasa-3 en la apoptosis inducida por TNF-gama-alfa. Si esta caspasa-3 activa fué transportada en el núcleo ó la caspasa-3 inactiva está ya en el núcleo esperando la activación promovida por TNF-gama-alfa requiere de investigación adicional. Tomados juntos, estos resultados sugieren que la caspasa-3 fue activada por la apoptosis celular inducida por TNF-gama-alfa. Sin embargo, los resultados no pueden excluir a otros miembros de eeta familia, especialmente a los estrechamente relacionados con la caspasa-3, tales como la caspasa-7, en la mediación de la apoptosis inducida por TNF-gama-alfa. Además, ZVAD-fmk fue menos efectiva en el tiempo tardío • (30 horas) en comparación con el tiempo temprano ó precoz (14 horas) para inhibir la apoptosis inducida por TNF-gama-alfa en BPAEC, que sugiere una caspasa-independiente de los mecanismos de retroalimentación negativos puede existir en la etapa tardía de la apoptosis de BPAEC inducida por TNF-gama-alfa En resumen los presentes estudios han demostrado que TNF-gama-alfa, un nuevo miembro de la familia de las citocinas, causa apoptosis en células endoteliales. TNF-gama-alfa parece actuar a través de un receptor que es distinto de los receptores 1 ó 2 de TNF. El efecto de TNF-gama-alfa es vía activación de las cinasas de proteína agotadas, SAPK/JNK y p38 MAPK, y las caspazas, principalmente la proteasa similar a caspasa-3. Se que sugiere la muerte celular programada apoptótica es una causa del daño en célulae endoteliales que contribuye a varioe transtornos inflamatorios y daños cardiovasculares (Karsan, A. Trends Cardiovasc. Med. 8: 19-24 (1998) ) .Además, la apoptosis en ce 'lulas endoteliales tiene un mecanismo importante, involucrado en un equilibrio entre procesos anti-angiogénicos y pro-angiogénicos, y la pérdida de este equilibrio conduce a una variedad de enfermedades tales como métastaeie en tumor sólido y retinopatía (Folkman, J. Y Shing, J., J. Biol.. Chem. 267:10931-10934 (1992); Brooks, P. C. y colaboradores, Cell 79:1157-1164 (1994) ) .
Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la, luz de lo anteriormente expuesto y, por consiguiente, en el alcance de las reivindicaciones anexas, pa invención puede ser practicada de otra manera que a la descrita particularmente.
La descripción completa de todas las publicaciones (que incluyen patentes, solicitudes de patentes, artículos periódicos, manuales de laboradorios, libros, u otros documentos) citados en la presente son incorporados a la presente como referencia.
Adicionalmente, el Listado de Secuencias propuesto, adjunto en ambas formas en papel y de computadora se incorporan a la presente como referencia en su totalidad.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Yu, Guo-Liang Ni, Jian Roeen, Craig A., <120> Factor Gama de Necroeis de Tumor <130> PF141P4.PCT <140> PCT/US99/02722 <141> 1998-08-06 <150> 60/074,047 <151> 1998-02-09 <150> 09/131,237 <151> 198-08-07 <150> 09/005,020 <151> 1998-01-09 <150> 08/461,246 <151> 1995-06-05 <151> 1994-11-07 <160> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2442 <212> DNA <213> Ho o eapiene <220> <221> CDS <222> (783) ... (1304) <220> <22l> mat_péptido <222> (864) ... (1304) <220> <221> ind_péptido <222> (783) ... (863) <400> 1 cccaatcaag agaaattcca tactatcacc agttggccga ctttccaagt ctagtgcaga 60 aatccaaggc acctcacacc tagagttcct atacctctga gactccagag gaaagaacaa 120 gacagtgcag aaggatatgt tagaacccac tgaaaaccta gaaggttgaa aaggaagcat 180 accctcctga cctataagaa aattttcagt ctgcaggggg atatccttgt ggcccaagac 240 attggtgtta tcatttgact aagaggaaat tatttgtggt gagctctgag tgaggattag 300 gaccagggag atgccaagtt tctatcactt acctcatgcc tgtaagacaa gtgttttgtt 360 ccaattgatg aat?gggaga aaacagttca gccaatcact tatgggcaca gaatggaatt 420 tgaagggtct ggtgcctgcc cttgtcatac gtaaacaaga gaggcatcga tgagttttat 480 ctgagtcatt tgggaaagga taattcttgc accaagccat tttcctaaac acagaagaat 540 agggggattc cttaaccttc attgttctcc aggaccatag gtctcaggat aaattaaaaa 600 ttttcaggtc agaccactca gtctcagaaa ggcaaagtaa tttgccccag gtcactagtc 660 caagatgtta ttctctttga acaaatgtgt atgtccagtc acatattctt cattcattcc 720 tccccaaagc agtttttagc tgttaggtat attcgatcac tttagtctat tttgaaaatg 780 at atg aga cgc ttt tta age aaa gtc tac agt ttc c a atg aga aaa 827 Met Arg 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Gln Thr Pro Thr Gln His -10 -5 -1 1 5 Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu 10 15 20 Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu He 25 30 35 Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe He Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly 40 45 50 Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu He Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys 55 60 65 Pro Asp Ser He Thr Val Val He Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro 70 75 80 85 Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly 90 95 100 Ser Asn Trp Phe Gln Pro He Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln 105 110 115 Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp He Ser Leu Val Asp 120 125 130 Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu 135 140 145 <210> 3 <211> 233 <212> PRT <213> Homo eapiene <400> 3 Met Ser Thr Glu Ser Met He Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 - Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu He Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val He Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu He Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly Leu Tyr Leu He Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr He Ser Arg He Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu He Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly He He Ala Leu 225 230 <210> 4 <211> 205 <212> PRT <213 Homo eapieen <400> 4 Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Arg Gly Thr Thr 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala 20 25 30 Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala 35 40 45 Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala 50 55 60 Ala His Leu He Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg 65 70 75 B Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn 85 90 95 Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly He Tyr Phe Val Tyr Ser Gln 100 105 110 Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro 115 120 125 Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe 130 135 140 His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln 145 150 155 160 Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr 165 170 175 Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly He Pro His Leu Val 180 185 190 Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu 195 200 205 <210> 5 <211> 244 <212> PRT <213> Homo eapiens <400> 5 Met Gly Ala Leu Gly Leu Glu Gly Arg Gly Gly Arg Leu Gln Gly Arg 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Gly Ala Thr Ser Leu Val Thr Leu 20 25 30 Leu Leu Ala Val Pro He Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Pro 35 40 45 Gln Asp Gln Gly Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly Ala Gln 50 55 60 Ala Gln Gln Gly Leu Gly Phe Gln Lys Leu Pro Glu Glu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Thr Asp Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu He Gly Ala Pro 85 90 95 Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gln Ala Phe 100 105 110 Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu Ala Leu Pro 115 120 125 Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr Arg Gly Arg 130 135 140 Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val Thr Leu Arg 145 150 155 160 Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Glu 165 1 0 175 Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala 180 185 190 Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe Gly 195 200 205 Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn He Ser 210 215 220 His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala 225 230 235 240 Val Met Val Gly <210> 6 <211> 281 <212> PRT <213> Homo eapiens <400> 6 Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln He Tyr Trp Val Asp 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys 20 25 30 Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro 50 55 60 Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly 65 70 75 80 Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly 85 90 95 Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala 100 105 110 Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu 115 120 125 Lys Gln He Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg 130 135 140 Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu 145 150 155 160 Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly He Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr 165 170 175 Lys Lys Gly Gly Leu Val He Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 180 185 190 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser 195 200 205 His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met 210 215 220 Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 225 230 235 240 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His 245 250 255 Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser 260 265 270 Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280 <210> 7 <211> 235 <212> PRT <213> Homo eapiene <400> 7 Met Ser Thr Glu Ser Mét He Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Gly Pro 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Ala Gly Gly Pro Gln Gly Ser Lys Arg Cys Leu Cvs 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 40 45 Cys Leu Leu His Phe Arg Val He Gly Pro Gln Glu Glu Glu Gln Ser 50 55 60 Pro Asn Asn Leu His Leu Val Asn Pro Val Ala Gln Met Val Thr Leu 65 70 75 80 Arg Ser Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro Leu Ala His Val Val 85 90 95 Ala Asn Pro Gln Val Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Ser Gln Arg Ala 100 105 110 Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Lys Leu Thr Asp Asn Gln Leu Val 115 120 125 Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu He Tyr Ser Gln Val Leu Phe Ser 130 135 140 Gly Gln Gly Cys Arg Ser Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg 145 150 155 160 Phe Ala Val Ser Tyr Pro Asn Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys 165 170 175 Ser Pro Cys His Arg Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala Trp 180 , 185 190 Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp 195 200 205 Arg Leu Ser Thr Glu Val Asn Gln Pro Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Glu 210 215 220 Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly He He Ala Leu 225 230 235 <210> 8 <211> 434 <212> DNA <213> Ho o eapiene <220> <221> características_misc <222> 15 <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (19) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (133) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (388) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> característ?cas_misc. <222> (424) <223> n iguales a a, t, g, ó c <400> 8 tctacacaag gtacngacng ctaccctgag ccaacccagc tcctcatggg gaccaagtct 60 gtatgcgaag taggtagcaa ctggttccag cccatctacc tcggagccat gttctccttg 120 caagaagggg acnagctaat ggtgaacgtc agtgacatct etttggtgga ttacacaaaa 180 gaagataaaa ccttctttgg ageettetta ctataggagg agagcaaata tcattatatg 240 aaagtcctct gccaccgagt tcctaatttt ctttgttcaa atgtaattat aaccaggggt 300 tttcttgggg ccgggagtag ggggcattcc cacagggaca acggtttagc tatgaaattt 360 ggggggccca aaatttcaca acttcatngt tgcccttact tgatgagaag tacttaactt 420 gganaaaagg cttg 434 <210> 9 <211> 493 <212> DNA <213> Homo sapiene <220> <221> características_misc <222> (288) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (296) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (309) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (314) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (343) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (348) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (369) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (385) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (410) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (417) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (423) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (431) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222 (434) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (437) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (444) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (459) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (458) ... (485) <223> n iguales a a, t, g, ó c <400> 9 aattcggcag agaaattcca tactatcacc agttggccaa ctttccaagt ctagtgcaga 60 aatccaaggc acctcacacc tagagttcct atacctctga gactccagag gaaagaacaa 120 gacagtgcag aaggatatgt tagaacccac tgaaaaccta gaaggttaaa aaggaagcat 180 accctcctga cctataagaa aattttcagt ctgcaggggg atatccttgt ggcccaagac 240 attggtgtta tcatttgact aagaggaaat tatttgtggt gagctccnag tgaggnttag 300 ggaccaggng gtgnccaagt ttctatcact tacctcatgn ctntaagnca agtgttttgt 360 tcccattgnt gatggggtta aaacnttcag ccatcacttt tggggcaagn atggggnttt 420 gangggttgg ngcnggnctt gtcntcgtaa acagggggnt tggtgggttt ttctgggtcc 480 ttgggnagga ctt 493 <210> 10 <211> 380 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> características_misc <222> (53) <223> n iguales a a, t, g, ó <220> <221> características_misc. <222> (258) <223> n iguales a a, t, g, ó <220> <221> características_misc. <222> (316) <223> n iguales a a, t, g, ó <220> <221> características_misc. <222> (324) <223> n iguales a a, t, g, ó <220> <221> características__misc . <222> ( 346 ) <223> n iguales a a, t, g, ó <220> <221> características_misc. <222> (367) <223> n iguales a a, t, g, ó <220> <221> características_misc. <222> (378) <223> n iguales a a, t, g, ó <400> 10 ggcagaggtt caatttgatc ataaatttgc ttcaattcag gagctttgaa ggnngtccaa 60 ggaaagctct agaaaacagt ataaactttc^ agaggcaaaa tccttcacca atttttccac 120 atactttcat gccttgccta aaaaaaatga aaagagagtt ggtatgtctc atggaatgtt 180 cacacagaag gagttggttt tcatgtcatc tacageatat gagaaaagct acctttcttt 240 tgattatgta cacaggtntc taaataagga agtatgagtt tcacatgtat attcaaaaat 300 acaacagttg cttgtnttca gttngggttt ttcttggccc acccantttt ggtgctgggg 360 gttctanctt taaccccnga 380 <210> 11 <211> 458 <212> DNA <213> Homo sapiene <220> <221> características_misc <222> (9) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (12) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (119) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (303) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (311) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (387) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (409) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (425) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (427) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (453) <223> n iguales a a, t, g, ó c <400> 11 ggcacagcng gnagtagggg gcattccaca gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg 60 cccaaaattt cacacttcat gtgccttact gatgagagta ctaactggaa aaaggctgna 120 agagagcaaa tatattatta agatgggttg gaggattggc gagtttctaa atattaagac 180 actggatcac tgaaatgaat ggatgatcta ctcgggtcca ggattgaaag agaaatattt 240 caacaccttc ctgctataca atggtcacca gtggtccagt tattgttcca atttggatcc 300 atnaatttgc nttcaattcc aggagctttg gaaggaattc caaggaaagc tccaggaaaa 360 ccgtattaaa ctttccaggg gccaaantcc ttcaccaatt ttttccacna actttccagg 420 cctgncncaa aaaaatggaa agggagttgg tangtccc 458 <210 > 12 <211> 388 <212 > DNA <213 > Homo sapiene <220> <221 > características_misc <222 > ( 11 ) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (46) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (50) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (81) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (138) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (155) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (182) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (188) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (269) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (317) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (322) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (358) <223> n iguales a a, t , g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (363) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (375) <223> n iguales a a, t, g, ó c <400> 12 ctgcactggg nncatgaact aggcctggcc ttcaccaaga accgantgan ctataccaac 60 aaattcctgc tgatcccaga ntcgggagac tacttcattt actcccaggt cacattccgt 120 gggaatgaac ctctgaantg ccagtgaaaa teagncaage aggccgacca aacaagccag 180 antecatnca ctgtggtcat caccaaggta acagacaget accctgagcc aacccagctc 240 cttcatgggg accaagtttg tttgcgaant aggttagcaa ctggttccag cccattttac 300 cttgggggcc agttctnctt gncaagaagg ggacaagctt atggtggaac gtteatanca 360 tcntttttgg gtggntttac acaaaagg .- 388 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Ho o eapiens <400> 13 gcgcggatcc accatgagac gctttttaag caaagtc 37 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Ho o eapiene <400> 14 cgcgtctaga ctatagtaag aaggctccaa agaagg 36 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Homo eapiens <400> 15 gcgcggatcc accatgagac gctttttaag caaagtc 37 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Homo eapiene <400> 16 cgcgtctaga ctatagtaag' aaggctccaa agaagg 36 <210> 17 <211> 56 <212> DNA <213> Homo eapiene <400> 17 cgctctagat caagcgtagt ctgggacgtc gtatggatag taagaaggct ccaaag 56 <210> 18 <211> 733 <212> DNA <213> Homo sapiene <400> 18 gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60 aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180 tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240 aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360 agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480 atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gcc?gagaac aactacaaga 540 ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720 gactctagag gat 733 <210> 19 <211> 1116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 atggccgagg atctgggact gagctttggg gaaacagcca gtgtggaaat gctgccagag 60 cacggcagct gcaggcccaa ggccaggagc agcagcgcac gctgggctct cacctgctgc 120 ctggtgttgc tccccttcct tgcaggactc accacatacc tgcttgtcag ccagctccgg 180 gcccagggag aggcctgtgt gcagttccag gctctaaaag gacaggagtt tgcaccttca 240 catcagcaag tttatgcacc tcttagagca gacggagata agccaagggc acacctgaca 300 gttgtgagac aaactcccac acagcacttt aaaaatcagt tcccagctct gcactgggaa 360 catgaactag gcctggcctt caccaagaac cgaatgaact ataccaacaa attcctgctg 420 atcccagagt cgggagacta cttcatttac tcccaggtca cattccgtgg gatgacctct 480 gagtgcagtg aaatcagaca agcaggccga ccaaacaagc cagactccat cactgtggtc 540 atcaccaagg taacagacag ctaccctgag ccaacccagc tcctcatggg gaccaagtct 600 gtatgcgaag taggtagcaa ctggttccag cccatctacc tcggagccat gttctccttg 660 caagaagggg acaagctaat ggtgaacgtc agtgacatct etttggtgga ttacacaaaa 720 gaagataaaa ccttctttgg ageettetta ctataggagg agagcaaata tcattatatg 780 aaagtcctct gccaccgagt tcctaatttt ctttgttcaa atgtaattat aaccaggggt 840 tttcttgggg ccgggagtag gggcattcca cagggacaac ggtttagcta tgaaatttgg 900 ggcccaaaat ttcacacttc atgtgcctta ctgatgagag tactaactgg aaaaaggctg 960 aagagagcaa atatattatt aagatgggtt ggaggattgg cgagtttcta aatattaaga 1020 cactgatcac taaatgaatg gatgatctac tcgggtcagg attgaaagag aaatatttca 1080 acaccttcct gctatacaat ggtcaccagt ggtcca 1116 <210> 20 <211> 251 <212> PRT <213> Homo eapiens <400> 20 Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu 1 5 10 15 Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser 20 25 30 Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala 35 40 45 Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu 50 55 60 Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser 65 70 75 80 His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg 85 90 95 Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn 100 105 110 Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr 115 120 125 Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu He Pro Glu Ser 130 135 140 Gly Asp Tyr Phe He Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser 145 150 155 160 Glu Cys Ser Glu He Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser 165 170 175 He Thr Val Val He Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr 180 185 190 Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp 195 200 205 Phe Gln Pro He Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp 210 215 220 Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp He Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys 225 230 235 240 Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu 245 250 <210> 21 <211> 434 <212> DNA <213> Homo eapiens <220> <221> características_misc. <222> (15) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (19) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (133) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (388) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (424) <223> n iguales a a, t, g, ó c <400> 21 tctacacaag gtacngacng ctaccctgag ccaacccagc tcctcatggg gaccaagtct 60 gtatgcgaag taggtagcaa ctggttccag cccatctacc tcggagccat gttctccttg 120 caagaagggg acnagctaat ggtgaacgtc agtgacatct etttggtgga ttacacaaaa 180 gaagataaaa ccttctttgg ageettetta ctataggagg agagcaaata tcattatatg 240 aaagtcctct gccaccgagt tcctaatttt ctttgttcaa atgtaattat aaccaggggt 300 tttcttgggg ccgggagtag ggggcattcc cacagggaca acggtttagc tatgaaattt 360 ggggggecca aaatttcaca aetteatngt tgcccttact tgatgagaag taettaaett 420 gganaaaagg cttg 434 <210> 22 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> características_misc. <222> (4) <223> n iguales a a, t , g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (8) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (17) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (24) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (28) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc . <222> (31) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (35) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (41) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (43) <223> n iguales a a, t, g, 6 c <220> <221> características_misc. <222> (46) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (48) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (50) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (53) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (55) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (61) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (63) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (66) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (202) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (209) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (282) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (306) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc . <222> (321) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (344) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (380) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (395) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (405) <223> n iguales a a, t, g, ó c <400> 22 attncggnac gagcagnggc atgnccgngg nnctnggact nnnctntngn gananagcca 60 nnnttnnaat gctgccagag cacggcagct gcaggcccaa ggccaggagc agcagcgcac 120 gctgggctct cacctgctgc ctggtgttgc tccccttcct tgcaggactc accacatacc 180 tgettgtcag ccagcttcgg gnccagggng aggcctgtgt gcagttccag ggtctaaaag 240 gacaggagtt tgcaccttca catcagcaag tttatgeace tnttagagca gacggagata 300 agccangggg acaactgaca nttgtgagac aaattecaca cagnanttta aaatcagttt 360 ccagttttga atggggacan nattaggctg gcttnacaag accgntggat tttacag 417 <210> 23 <211> 388 <212> DNA <213> Homo eapiene <220> <221> características_misc. <222> (11) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (46) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (50) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (81) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (138) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc . <222> (155) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (182) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (188) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (269) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (317) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (322) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (358) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (363) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (375) <223> n iguales a a, t, g, ó c <400> 23 ctgcactggg nncatgaact aggcctggcc ttcaccaaga accgantgan ctataccaac 60 aaattcctgc tgatcccaga ntcgggagac tacttcattt actcccaggt cacattccgt 120 gggaatgaac ctctgaantg ccagtgaaaa teagncaage aggccgacca aacaagccag 180 antecatnca ctgtggtcat caccaaggta acagacaget accctgagcc aacccagctc 240 cttcatgggg accaagtttg tttgcgaant aggttagcaa ctggttccag cccattttac 300 cttgggggcc agttctnctt gncaagaagg ggacaagctt atggtggaac gtteatanca 360 tcntttttgg gtggntttac acaaaagg 388 <210> 24 <211> 458 <212> DNA <213> Homo sapiene <220> <221> características_misc. <222> (9) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (12) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (119) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (303) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (311) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (387) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (409) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (425) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (427) <223> n iguales a a, t, g, ó c <220> <221> características_misc. <222> (453) <223> n iguales a a, t, g, ó c <400> 24 ggcacagcng gnagtagggg gcattccaca gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg 60 cccaaaattt cacacttcat gtgccttact gatgagagta ctaactggaa aaaggctgna 120 agagagcaaa tatattatta agatgggttg gaggattggc gagtttctaa atattaagac 180 actggatcac tgaaatgaat ggatgatcta ctcgggtcca ggattgaaag agaaatattt 240 caacaccttc ctgctataca atggtcacca gtggtccagt tattgttcca atttggatcc 300 atnaatttgc nttcaattcc aggagctttg gaaggaattc caaggaaagc tccaggaaaa 360 ccgtattaaa ctttccaggg gccaaantcc ttcaccaatt ttttccacna actttccagg 420 cctgncncaa aaaaatggaa agggagttgg tangtccc 458 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad en las siguientes :

Claims (41)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislado que está caracterizada porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 2 (por ejemplo, posiciones -27 a 147 de la SEC ID NO: 2) ; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 2 exceptuando a la metionina N-terminal (por ejemplo, posiciones -26 a 147 de la SEC ID NO : 2 ) ; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama maduro que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2 expuesta como posiciones 1 a 147 de la SEC ID NO: 2; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido de TNF-gama que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N- terminal codificada por el clon cDNA en el Depósito en ATCC No. 75927; (f) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenida en el Depósito en ATCC No. 75927; y (g) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , ó (f), anteriores.
2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos completa en las Figuras ÍA y IB (SEC ID NO: 1) .
3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos en las Figuras ÍA y IB (SEC ID NO: 1) que codifica al polipéptido TNF-gama que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones -27 a 147 de la SEC ID NO: 2.
4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos en las Figuras ÍA y IB (SEC ID NO: 1) que codifica al polipéptido TNF-gama maduro que tiene la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 147 en la SEC ID NO: 2.
5. Una molécula de ácido nucleico aislada que está caracterizada porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos nx-147 de la SEC ID NO: 2, en donde n1 es un entero en el rango de -27 a 35; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos -27-m1 de la SEC ID NO: 2, en donde m1 es un entero en el rango de 146 a 147; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste de los residuos nl-ml de la SEC ID NO: 2, en donde n y m son enteros que se definieron respectivamente en (a) y (b) anteriores; y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que consiste de una porción de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927 en donde dicha porción excluye de 1 hasta aproximadamente 62 aminoácidos del amino terminus de dicha secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica a una porción de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Deepósito en ATCC No. 75927 en donde dicha porción excluye a 1 aminoácido desde el carboxi terminus de dicha secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon cDNA en el Depósito en ATCC No. 75927; y (f) una secuencia de nucleótidos que codifica a una porción de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927 en donde dicha porción incluye una combinación de cualquiera de las eliminaciones amino terminal y carboxi terminal en (d) y (e) , anteriores.
6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos completa del clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927.
7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927.
8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927.
9. Una molécula de ácido nucleico aislada que está caracterizada porque comprende un polinucleótido que hibridiza en condiciones de hibridización severas a un polinucleótido que tiene, una secuencia de nucleótidos idéntica a una secuencia de nucleótidos en (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) ó (g) de la reivindicación 1, en la que dicho polinucleótido que hibridiza no hibridiza en condiciones de hibridización severas a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste de solamente residuos A ó de solamente residuos T.
10. Una molécula de ácido nucleico aislada que está caracterizada porque comprende un polinucleótido que codifica a la secuencia de aminoácidos de una porción epítope de apoyo de un polipéptido TNF-gama que tiene una secuencia de aminoácidos en (a), (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) de la reivindicación 1.
11. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 10, que está caracterizada porque codifica a una porción epítope de apoyo de un polipéptido TNF-gama en donde la secuencia de aminoácidos de dicha porción es seleccionada del grupo de secuencias en la SEC ID NO: 2 que consiste de: aproximadamente Thr-24 hasta aproximadamente Asn-32; aproximadamente Ile-37 hasta aproximadamente Ile-45; aproximadamente Met-54 hasta aproximadamente Arg-62; aproximadamente Gln-63 hasta aproximadamente Asp-71; aproximadamente Glu-57 hasta aproximadamente Gly-65; aproximadamente Val-80 .hasta aproximadamente Thr-88; aproximadamente Leu-116 hasta aproximadamente Val-124; y aproximadamente Asp-133 hasta aproximadamente Phe-141.
12. Un método para elaborar un vector recombinante que está caracterizado porque comprende insertar una molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 en un vector.
13. Un vector recombinante que se está caracterizado porque es producido por el método de la reivindicación 12.
14. Un método de elaborar una célula huésped recombinante que está caracterizado porque comprende introducir el vector recombinante de la reivindicación 13 en una célula huésped.
15. Una célula huésped recombinante que está caracterizada porque es producida por el método de la reivindicación 14.
16. Un método recombinante para producir un polipéptido TNF-gama que está caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped recombinante de la reivindicación 15 en condiciones tales que dicho polipéptido es expresado y, recuperar dicho polipéptido.
17. Un polipéptido TNF-gama aislado que está caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEC ID NO: 2 (ver las posiciones -27 a 147 de la SEC ID NO: 2) ; (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama de extensión total expuesta en la SEC ID NO: 2, exceptuando la metionina N-terminal (ver las posiciones -26 a 147 de la SEC ID NO: 2); (c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama maduro predicho que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 1-147 en la SEC ID NO: 2; (d) la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927; (e) la secuencia de ,aminoácidos completa exceptuando la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927; y (f) la secuencia de aminoácidos completa del polipéptido TNF-gama maduro predicho codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 75927.
18. Un anticuerpo aislado que enlaza específicamente a un polipéptido TNF-gama de la reivindicación 17.
19. Un método para el tratamiento de un tumor en un paciente que está caracterizado porque comprende: administrar al paciente la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1.
20. Un método para el tratamiento de un tumor en un paciente que está caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido TNF-gama de la reivindicación 17.
.21. Un método para el tratamiento de Artritis Reumatoide en un paciente que está caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido TNF-gama de la reivindicación 17.
22. Una molécula de ácido nucleico aislada que está caracterizada porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 20 (ver las posiciones 1 a 251 de la SEC ID NO: 20) ; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC ID NO: 20 exceptuando a la metionina N-terminal (ver las posiciones 2 a 251 de la SEC ID NO: 20) ; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica a la región extracelular del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 20 expuesta en las posiciones 62 a 251 de la SEC ID NO: 20; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta, que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de ATCC No. 203055; (f)una secuencia de nucleótidos que codifica a la región extracelular del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055; y (g) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c) , (d) , (e) ó (f), anteriores.
23. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 22 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos completa en las Figuras 20A y 20B (SEC ID NO: 19) .
24. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 22 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos en las Figuras 20A y 20B (SEC ID NO: 19) que codifica al polipéptido TNF-gama que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 1 a 251 de la SEC ID NO: 20.
25. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 22 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos en las Figuras 20A y 220B (SEC ID NO: 19) que codifica a la región extracelular del polipéptido TNF-gama- que tiene la secuencia de aminoácidos de aproximadamente 62 hasta aproximadamente 251 en la SEC ID NO: 20.
26.Una molécula de ácido nucleico aislado que está caracterizada porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos n4-251 de la SEC ID NO: 20, en donde n4 es un entreo en el rango de 2 a 246; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que comprende , la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-m4 de la SEC ID NO: 20, en donde m4 es un entero en el rango de 6 a 250; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste de los residuos n-m4 de la SEC ID NO: 20, en donde n4 y m4 son enteros que se definieron respectivamente en (a) y (b) anteriores; y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que consiste de una porción de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta completa codificada por el clon de cDNA ccontenido en el Depósito en ATCC No. 203555 en donde dicha porción excluye desde 1 hasta aproximadamente 246 aminoácidos del amino terminus de dicha secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito de ATCC No. 203055; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que consiste de una porción de la secuencia de aminoácidos TNF-gama-beta completa codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203555 en donde dicha porción excluye 1 aminoácido del carboxi terminus de dicha secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de .cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055; y (f) una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que consiste de una porción de la secuencia de aminoácidos de TNF-gama-beta completa codificada por el clon de cDNA contenida en Depósito en ATCC No. 203055 en donde dicha porción incluye una combinación de cualquiera de las eliminaciones amino terminal y carboxi terminal en (d) y (e) , anteriores.
27. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 22 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos completa del clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055.
28. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 22 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N-terminal codificada por el clon de CDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055.
29. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 22 que está caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos que codifica a la región extracelular del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055.
30. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que está caracterizado porque hibridiza en condiciones de hibridización severas a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica a una secuencia de nucleótidos en (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f), ó (g) de la reivindicación 22 en donde dicho polinucleótido que hibridiza no hibridiza en condiciones de severidad a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste de solamente residuos A ó de solamente residuos T.
31. Una molécula de ácido nucleico aislado que está caracterizada porque comprende un polinucleótido que codifica a la secuencia de aminoácidos de una porción con apoyo epítope de un polipéptido TNF-gama-beta que tiene una secuencia de aminoácidos en (a), (b) , (c) , (d) , (e) , ó (f) de la reivindicación 22.
32. Un método para elaborar un vector recombinante que está caracterizado porque , comprende insertar una molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 22 en un vector.
33. Un vector recombinante que está caracterizado porque es producido por el método de la reivindicación 32.
34. Un método de elaborar una célula huésped recombinante que está caracterizado porque comprende introducir el vector recombinante de la reivindicación 33 en una célula huésped. o
35. Una célula huésped que está caracterizada porque es producida por el método de la reivindicación 34.
36. Un método recombinante para producir un polipéptido TNF-gama-beta, que está caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped recombinante de la reivindicación 35 en condiciones tales que dicho polipéptido es expresado y recuperar a dicho polipéptido.
37. Un polipéptido TNF-gama-beta aislado que está caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-beta de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEC ID NO: 20 (ver las posiciones 1 a 251 de la SEC ID NO: 20); (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNF-gama-beta de extensión total que tiene la secuencia de aminoácidos completa expuesta en la SEC ID NO: 20 exceptuando a la metionina N-terminal (ver las posiciones 2 a 251 de la SEC ID NO: 20); (c) la secuencia de aminoácidos de la región extracelular predicha del polipéptido TNF-gama-beta que tiene la secuencia de aminoácidos en posiciones 62-251 en la SEC ID NO: 20; (d) la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenida en el Depósito en ATCC No. 203055; (e) la secuencia de aminoácidos completa exceptuando a la metionina N-terminal codificada por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055; y (f) la secuencia de aminoácidos completa de la región extracelular predicha del polipéptido TNF-gama-beta codificado por el clon de cDNA contenido en el Depósito en ATCC No. 203055.
38. Un anticuerpo aislado que enlaza específicamente a un polipéptido TNF-gama de la reivindicación 37.
39. Un método para el tratamiento de un tumor en un paciente que está caracterizado porque comprende: administrar al paciente la molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 22.
40. Un método para el tratamiento de un tumor en un paciente que está caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido TNF-gama de la reivindicación 37.
41. Un método para el tratamiento de Artritis Reumatoide en un paciente, que comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido TNF-gama de la reivindicación 37.
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