MXPA01001256A - Vector fusogenico y cariofilico para transferencias genicas mediadas por receptor y usos consecuentes. . - Google Patents
Vector fusogenico y cariofilico para transferencias genicas mediadas por receptor y usos consecuentes. .Info
- Publication number
- MXPA01001256A MXPA01001256A MXPA01001256A MXPA01001256A MX PA01001256 A MXPA01001256 A MX PA01001256A MX PA01001256 A MXPA01001256 A MX PA01001256A MX PA01001256 A MXPA01001256 A MX PA01001256A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- fusogenic
- peptide
- vector
- plasmid dna
- lysine
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
La invencion concierne al acople de un peptido fusogenico al vector no viral de transferencia genica mediada por receptor y a la adicion de una senal de direccionamiento nuclear al DNA plasmidico, lo cual incrementa substancialmente la eficiencia de transferencia in vitro e in vivo. El vector fusogenico y cariofilico constituye la nueva generacion de vectores genicos no virales que son superiores a los primeros vectores por garantizar la expresion del gen contenido en el DNA plasmidico gracias a sus tres caracteristicas: 1) activacion especifica de la endocitosis mediada por receptor; 2) rescate oportuno del DNA plasmidico de los endosomas acidos; y 3) direccionamiento certero del DNA plasmidico al nucleo celular. La invencion fue implementada en los vectores neurotensina-SPDP-poli-L-lisina y poli-L-lisina lactosilada para transferir genes a neuronas dopaminergicas via el receptor a neurotensina y a hepatocitos via el receptor a galactosa, respectivamente, pero puede aplicarse a cualquier vector que utilice la via endocitica de receptores. La sintesis del vector fusogenico y cariofilico es un proceso sencillo, rapido, inocuo y economico en comparacion a la tecnologia utilizada para la fabricacion de vectores virales.
Description
Vector fusogénico y cariofílico para transferencias génicas mediadas por receptor y usos consecuentes
ANTECEDENTESDE LAINVENCIÓN
En la actualidad algunos vectores virales y no virales (liposomas) se han usado exitosamente para transferir genes in vivo al hígado [Kitten et al., Hum. Gene Ther. 8, 1491 (1997); Oh et al., Ann. Hematol. 78, 213 (1999)] y al sistema nervioso central (SNC) [Naldini et al., Science 272, 263 (1996); Barkats et al., Progress in Neurobiology 55, 333 (1998)] en animales de laboratorio; sin embargo, importantes limitaciones como la falta de especificidad y riesgos potenciales permanecen aún sin ser resueltas [Naldini et al., Science 272, 263 (1996)]. El sistema de transferencia génica basado en la endocitosis mediada por receptor (envío dirigido de genes) ofrece un inmenso potencial experimental y terapéutico debido a su alta especificidad y su bajo riesgo [Wu et al., J. Biol. Chem. 264, 16985 (1989); Wu G.Y. and Wu C.H., Targeted Diagn. Ther., 4, 127 (1991); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 14338 (1991); Martinez-Fong et al., Hepatology 20, 1602 (1994); Martinez-Fong et al., Mol Brain Res. 69, 249 (1999); Kollen et al., Hum. Gene Ther. 10, 615 (1999)]. Este sistema se fundamenta en la formación de un conjugado molecular entre la poli-L-lisina y un ligando para el cual las células blanco tienen receptores de superficie acoplados a endocitosis. El DNA plasmídico (polianión) es unido electrostáticamente al residuo de poli-L-lisina (policatión) del conjugado para formar un complejo conocido como poliplex [Felgner et al., Hum. Gene Ther. 8, 511 (1997)]. Cuando el ligando del poliplex reconoce los receptores celulares específicos, el poliplex es endocitado por el receptor, cotransportando el DNA foráneo (polifección) [Wu G.Y. and Wu C.H., Biochem. 27, 887 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 263, 14621 (1988); Martinez-Fong et al., Hepatology 20, 1602 (1994); Martinez-Fong et al., Mol Brain Res. 69, 249 (1999); Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I., Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)]. Si bien los sistemas de transferencia génica basados en la endocitosis mediada por receptor ofrecen como
principales ventajas ser específicos y menos nocivos en comparación a los vectores virales y liposomas, su desventaja fundamental radica en proveer baja eficiencia de transferencia génica. No obstante a esta desventaja, los sistemas de transferencia vía endocitosis por receptor se han usado con relativo éxito para enviar genes reporteros [Wu et al., J. Biol. Chem. 264, 16985 (1989); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 6099 (1992); Martinez-Fong et al., Hepatology 20, 1602 (1994); Ziady et al., J. Biol. Chem. 274, 4908 (1999)], oligonucleótidos antisentidos [Bunnell et al., Somat. Cell Molec. Gen. 18, 559 (1992)], y genes de interés fisiológico y terapéutico [Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 14338 (1991); Wilson et al., J. Biol. Chem. 267, 963 (1992); Kollen et al., Hum. Gene Ther. 10, 615 (1999)].
A pesar de los logros relativos alcanzados con la aplicación de los sistemas de transferencia vía endocitosis por receptor su aplicación no se había intentado en el SNC debido a no haberse encontrado una ruta endocítica que protegiera al gen contra la degradación durante su tránsito intracelular hacia el núcleo. La neurotensina resultó ser el ligando ideal para un vector que transfiriera genes a neuronas vía la ruta endocítica acoplada a su receptor de alta afinidad (NTRH) [Rostene et al., Eur. J. Pharmacol., 30, 337 (1986); Kitabgi P., Neurochem. Int. 14, 111 (1989); Faure et al., J. Neurosci. 15, 4140 (1995)]. Una vez que la neurotensina se une al NTRH, el complejo ligando-receptor es internalizado [Faure et al, J. Neurosci. 15, 4140 (1995); Nouel et al., J. Neurosci. 17, 1795 (1997)] y localizado más tarde sin alteración en la vecindad del núcleo celular [Castel et al., Biochem. Pharmacol. 47, 53 (1994); Boudin et al., J. Comp. Neurol. 373, 76 (1996); Boudin et al., J. Neurosci.. 18, 8473 (1998)]. La inferencia lógica es que el transporte intracelular de la neurotensina evade el compartimiento lisosomal, principal obstáculo de los sistemas de transferencia génica basados en la endocitosis mediada por receptor. Bajo la hipótesis de que la neurotensina como ligando del poliplex proveería el escape del DNA plasmídico del endosoma durante su transporte, resultando en una transferencia génica efectiva a células que expresaran el NTRH, sintetizamos el vector no viral uniendo la neurotensina con la poli-L-lisina por medio del entrecruzador bifuncional SPDP [Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I., Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)]. Este vector no viral fue capaz de
unir diferentes DNA plasmídicos y transferirlos específicamente a líneas celulares que expresan NTRH (polifectar) [Martinez-Fong et al., Mol Brain Res. 69, 249 (1999); Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I., Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)]. Más aún, nuestro sistema fue capaz de polifectar específicamente neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra de la rata [Alvarez-Maya et al., Soc. Neurosci. Abstr. 25, 67.7 (1999)], uno de los núcleos cerebrales con mayor densidad de NTRH [Rostene et al., Eur. J. Pharmacol. 30, 337 (1986); Kitabgi P. Neurochem. Int. 14, 111 (1989); Faure et al., J. Neurosci. 15, 4140 (1995); Méndez et al., J. Mol. Neurosci. 9, 93 (1997)], cuya degeneración es la causa de la enfermedad de Parkinson [Madrazo et al., Neurosurgery 29,165 (1991); Drucker-Colin et al., Arch. Med. Res. 30, 33 (1999)]. A semejanza de los otros sistemas de transferencia génica basados en la endocitosis mediada por receptor, nuestro vector de neurotensina comparte la desventaja de proveer una baja eficiencia de transfección en el cerebro maduro de la rata [Alvarez-Maya et al., Soc. Neurosci. Abstr. 25, 67.7 (1999)].
El principal obstáculo in vivo para los sistemas de transferencia génica mediada por receptor parece ser la degradación de los transgenes en el compartimiento lisosomal, lo que ha obligado a utilizar estrategias que mejoren la eficiencia de polifección. Por ejemplo, hepatectomía para inducir la regeneración del hígado, procedimiento que favorece la expresión de los transgenes por mecanismos aún no aclarados [Wu et al., J. Biol. Chem. 264, 16985 (1989); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 14338 (1991); Chowdhury et al., J. Biol. Chem. 268, 11265 (1993)], adenovirus defectivos en replicación para inducir el rompimiento de los endosomas que contienen el DNA plasmídico en tránsito [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 6099 (1992); Cristiano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 2122 (1993); Curiel D.T., Pro. Med. Virol. 40, 1 (1993)], cloroquina para neutralizar el pH acídico de los lisosomas [Martinez-Fong et al., Hepatology 20, 1602 (1994); Midoux P. and Monsigny M., Bioconjug. Chem. 10, 406 (1999)]. Sin embargo, el uso de procedimientos que apoyan la transferencia génica mediada por receptor adolece de las siguientes desventajas en relación con su aplicación en la terapia génica o en la transferencia de genes de interés fisiológico. En primer lugar, la mutilación de un órgano regenerable, como el hígado, para inducir mitosis en las células de la porción remanente
invalida las conclusiones sobre el papel que juega un gen, objeto de estudio, en un mecanismo fisiológico. El caso todavía es más dramático cuando la mutilación del órgano acompaña la transferencia génica con fines terapéuticos; no se debe inducir un mal para curar otro. En segundo lugar, la fusión de dos sistemas de transferencia génica como el caso de los adenovirus con el vector que utiliza la endocitosis mediada por el receptor de galactosa hepático, resulta en adición de las desventajas de ambos sistemas y en un procedimiento más complicado. En tercer lugar, el uso de fármacos para neutralizar el pH acídico de los lisosomas al parecer no ha dado resultados consistentes in vivo. Además, estos fármacos se pueden evitar si el DNA plasmídico fuera rescatado oportunamente antes de que la acidez del endosoma sea crítica para inducir la precipitación del poliplex.
Por otro lado, los mecanismos naturales de evasión del compartimiento lisosomal inherentes a moléculas que son endocitadas como consecuencia de la activación de receptores específicos, como es el caso de la neurotensina, no son suficientes para lograr una transferencia génica eficiente [Alvarez-Maya et al., Soc. Neurosci. Abstr. 25, 67.7 (1999)]. Estudios de nuestro laboratorio señalan que la acidificación gradual de la vesícula endocítica es el principal obstáculo para los poliplexes que transitan rutas no lisosomales. El exceso de H " en el interior del endosoma [Clague M.J., Biochem. J. 336, 271 (1998)] induce la precipitación del poliplex, reduciendo de esta manera la eficiencia de polifección.
En el curso de la invención se descubrió que los sistemas de transferencia génica mediada por receptor se enfrentan a dos obstáculos principales. El primero es la inactivación de los transgenes en el compartimiento endosomal. El segundo es la limitada capacidad de los mecanismos fisiológicos de importación de material genético exógeno al núcleo celular. Los virus que infectan a la célula mediante endocitosis activada por receptor han superado con ingenio ambos obstáculos gracias a péptidos específicos que son constituyentes esenciales del virus y que al encontrase en una situación estratégica les permiten realizar su función adecuadamente. Por un lado, esos virus han desarrollado una estrategia exitosa para evitar el compartimiento lisosomal y alcanzar el citoplasma, en donde ellos liberan su material genético. Una proteína capaz de fusionarse con la bicapa lipídica de las vesículas
endocíticas produce la liberación de la partícula viral al citoplasma [Skehel J.J. and Waterfield M.D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 93 (1975); Burger et al, Biochemistry 30, 11173 (1991)]. Una vez que el material genético viral se encuentra en el citoplasma, algunas proteínas virales que poseen secuencias de aminoácidos conocidas como señal de direccionamiento nuclear o determinante cariof?lico (NLS) intervienen para dirigir el material genético viral al núcleo de la célula huésped [Bukrinsky et al., J. Virol. 67, 6863 (1993): Heinzinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7311 (1994)].
Un péptido de 22 aminoácidos de largo (GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA) del extremo amino terminal de la hemaglutinina HA2 del virus de la influenza capaz de fusionarse con la bicapa lipídica de las vesículas endocíticas ha sido aislado y caracterizado [Skehel J.J. and Waterfield M.D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 93 (1975); Lear J.D. and Degrado W.F., J. Biol. Chem. 262, 6500 (1987)]. Se ha demostrado que la adición de este péptido fusogénico al medio de cultivo o a la polilisina incrementó significantemente la eficiencia de transferencia génica mediada por receptor [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 7934, (1992); Midoux et al, Nucleic Acids Res. 21, 871 (1993); Midoux P. and Monsigny M., Bioconjug. Chem. 10, 406 (1999)]. Sin embargo, esta estrategia no ha funcionado in vivo debido a que el péptido fúsogénico no va acoplado al vector.
Por otro lado, la proteína Vpl, principal componente de la cápside del virus del simio SV40, posee un determinante cariof?lico potente responsable de su importación nuclear e incluso de viriones completos [Ishii et al., J Virol. 68, 8209 (1994)]. Análisis por mutagénesis dirigida demostraron que el péptido de 19 aminoácidos de largo (MAPTKRKGSCPGAAPNKPK) mutante de la señal de localización nuclear de Vpl fue uno de los más potentes que manifestaron una localización preferentemente nuclear [Ishii et al., J Virol. 68, 8209 (1994); Ishii et al., J. Virol. 70, 1317 (1996)]. A la fecha, este péptido mutante no se ha probado para transportar DNA plasmídico al núcleo celular. Recientemente se ha demostrado que la unión covalente de secuencias de la señal de direccionamiento nuclear del antígeno T largo del virus del simio SV40 a la poli-L-lisina aumenta la eficiencia de transfección mediada por el receptor de transferrina [Chan C.K.
and Jans D.A., Hum. Gene Ther. 10, 1695 (1999)]. Aunque efectivo, este abordaje tiene la desventaja de que el acople químico es un procedimiento difícil y largo que requiere, además, etapas de purificación. La alternativa ideal al acople químico es la unión electrostática del péptido cariof?lico al DNA plasmídico puesto que es una unión espontánea que simula las condiciones naturales. Por esta razón y por su potente determinante cariofílico se escogió el péptido de 19 aminoácidos de largo (MAPTKRKGSCPGAAPNKPK), mutante de la señal de localización nuclear de Vpl de SV40. Este péptido cariofílico se caracteriza por poseer una carga neta positiva (catión) conferida por la presencia de aminoácidos básicos (lisinas) en su estructura que han sido para facilitar la unión electrostática al DNA plasmídico (polianión), como lo ha demostrado nuestra invención.
Sobre la base de estos antecedentes la presente invención se implemento incorporando la estrategia viral a los vectores de neurotensina y de lactosa para propiciar el rescate oportuno de dichos vectores del endosoma y favorecer el direccionamiento certero del DNA plasmídico al núcleo celular. Para garantizar dichas funciones, el péptido fusogénico del extremo amino terminal de la hemaglutinina HA2 del virus de la influenza fue modificado por la adición de cuando menos tres lisinas en el extremo carboxílico (GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCAKKK) haciendo factible su conjugación con la poli-L-lisina y se acopló electrostáticamente el péptido cariof?lico mutante de la señal de direccionamiento nuclear de Vpl al DNA plasmídico. Esta estrategia confiere tres propiedades al vector no viral que son determinantes de la especificidad y de la eficiencia de transferencia génica. En consecuencia, el vector fusogénico y cariofílico será capaz de: 1) activar específicamente la endocitosis mediada por receptor, 2) escapar oportunamente del compartimiento endosomal y 3) dirigir certeramente el DNA plasmídico al núcleo celular. Nuestros resultados in vitro e in vivo utilizando los vectores de neurotensina y de lactosa demuestran fehacientemente que la incorporación de la estrategia viral incrementa el porcentaje de células polifectadas y provee altos niveles de expresión de los transgenes.
Los elementos constitutivos del vector fusogénico y cariofílico al parecer son más inocuos que todos los componentes de los vectores virales. Los ligandos tales como la neurotensina o la lactosa son biomoléculas no inmunogénicas. La neurotensina es un péptido de 13 aminoácidos con un alto grado de conservación filogenética [Reinecke M., Prog. Histochem. Cytochem. 16, 1 (1985)] y la lactosa es un disacárido de interés metabólico general [Kretchmer M., Sci. Am. 227, 74 (1972)]. La poli-L-lisina es degradada intracelularmente [Laurent et al., FEBS Lett., 443, 61 (1999)]. La corta longitud de los péptidos fusogénico y cariofílico hace poco probable que sus productos de degradación sean presentados por el complejo mayor de histocompatibilidad tipo II para activar la respuesta inmune [Cresswell P. Ann. Rev. Immunol. 12, 259 (1994); Germain et al., Immunol. Rev. 151, 5 (1996); Lanzavecchia A. Curr. Opin. Immunol. 8, 348 (1996)]. Además, desde el punto de vista de terapia se pretende que la aplicación del procedimiento no sea repetitiva, evitando de esta manera el desafío al sistema inmune.
Consecuentemente, la estrategia viral adaptada a los sistemas de transferencia génica mediada por receptor responde a la gran necesidad de contar con vectores génicos eficientes e inocuos para utilizarse en estudios fisiológicos y en la terapia génica.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona tanto con el acople de un péptido fusogénico a un vector no viral de transferencia génica mediada por receptor y la adición de una señal de direccionamiento nuclear al DNA plasmídico, como con la preparación del vector y su uso. Estas innovaciones están encaminadas a proveer una estrategia general que mejore la efectividad de los vectores que utilizan el proceso de endocitosis activado por receptor para realizar la transferencia génica. En consecuencia, la presente invención se desarrolló acoplando un péptido fusogénico a los vectores de neurotensina y de lactosa, además de añadir una señal de direccionamiento nuclear al DNA plasmídico objeto de la transferencia.
En su forma más simple, los componentes individuales de un vector para transferir genes vía endocitosis activada por receptor pueden ser arreglado como se ilustra en la FIG. 1. El ligando (componente a) tiene la función de unirse a su receptor específico, localizado en la membrana plasmática de la célula blanco, para activar la endocitosis del complejo ligando-receptor. Dicho ligando es conjugado de manera covalente a la poli-L-lisina o poli-D-lisina, ambas referidas como polilisina (componente b). El ligando conjugado a la polilisina se refiere como vector de genes o vector génico no viral, auque cualquier sinónimo del término vector puede ser utilizado indistintamente como los vocablos vehículo, transportador o acarreador. Para ser transportado, el DNA plasmídico (polianión) (componente c) se une electrostáticamente a la fracción de polilisina del vector (policatión) formando un complejo que se refiere como poliplex. El DNA plasmídico se refiere a cualquier plásmido convencional que contiene la codificación de un gen de interés fisiológico o terapéutico bajo el control de un elemento promotor que dirige la expresión en células eucariontes. En el caso de la forma simple del vector génico, el proceso de endocitosis es inducido por el componente a) al unirse a su receptor específíco. De esta manera, los otros componentes b) y c) sufren también el proceso de internalización y son secuestrados en la vesícula endocítica.
Para el caso de vías endocíticas lisosomales, si la célula se encuentra en división, por mecanismos aún desconocidos el DNA plasmídico escapa de la vesícula endosomal y llega al núcleo de una pequeña proporción de las células blanco (<10%) donde se expresa. Para el caso de vías endocíticas no lisosomales, un pequeña porcentaje de DNA plasmídico acompaña al ligando hasta el citoplasma de la célula y es transportado al núcleo de la célula por los mecanismos moleculares de importación nuclear. En este caso, la división celular no es una requisito para la expresión del transgén; sin embargo, la eficiencia de polifección es muy baja (<8%). La pobre eficiencia de los sistemas de transferencia génica mediada por receptor es consecuencia de dos obstáculos principales. El primero es la inactivación de los transgenes en el compartimiento endosomal por la precipitación del poliplex como consecuencia de la acidez. El segundo es la escasa posibilidad que tiene el DNA plasmídico de alcanzar el núcleo utilizando los mecanismos fisiológicos de importación nuclear. Por lo tanto, era necesario modificar la estructura básica de los vectores de esos sistemas para mejora su transferencia génica.
En concordancia con la presente invención se ofrece una estrategia novedosa para aumentar, sin detrimento de la especificad, la eficiencia de polifección entendida como un incremento significativo del porcentaje de la población celular que expresa el transgén. Como se muestran en la FIG. 2, la estrategia consiste en añadir un péptido fiísogénico (componente d) a la polilisina (componente b) del vector génico no viral y un péptido cariofílico (componente e) al DNA plasmídico (componente c), sujeto a transferencia. El ligando y el péptido cariof?lico conjugados a la polilisina se refiere como vector de genes fusogénico; el DNA plasmídico acoplado electrostáticamente con un péptido cariofílico se refiere como DNA plasmídico-cariofílico, y el complejo resultante de la unión electrostática del vector fusogénico con el DNA plasmídico-cariofílico se refiere como poliplex fusogénico-cariofílico.
Como se ilustra en la FIG. 3, a semejanza de la forma simple del vector génico no viral, el componente a) induce el proceso de endocitosis al unirse a su receptor específico. De esta manera, los otros componentes b), c) d) y e) sufren también el proceso de internalización y
son secuestrados en la vesícula endocítica. Una vez en la vesícula endocítica, el componente d) favorece el escape oportuno de los otros componentes a), b) c) y e) hacia el citoplasma de la célula. Ya en el citoplasma, el componente e), utilizando alguno de los mecanismos moleculares de importación nuclear, dirige certeramente al DNA plasmídico (componente c) al núcleo de la célula.
De acuerdo con la presente invención, el ligando (componente a) es una molécula biológicamente activa que puede ser sintetizada o no por las células del organismo y que tiene la función de unirse a su receptor específico para ser internalizado por la célula blanco vía la endocitosis del receptor. Ejemplos de biomoléculas que son internalizadas vía endocitosis del receptor son los factores tróficos como el EGF [Chen et al., FEBS Lett. 338, 167 (1994); Frederiksen et al., Cáncer Gene Ther. 7, 262 (2000)]; algunos neuropéptidos como la neurotensina [Martinez-Fong et al., Mol. Brain Res. 69, 249 (1999)]; carbohidratos como la lactosa [Martinez-Fong et al., Hepatology. 20, 1602 (1994)], mañosa [Nishikawa et al., J. Drug Target 8, 29 (2000)] y galactosa [Hashida et al., J. Control Reléase 53, 301 (1998)]; y enzimas [Ziady et al., J. Biol. Chem. 274, 4908 (1999)]. En particular, los fragmentos no tóxicos de toxinas como la cadena b de la toxina del cólera [Barrett et al., Biochem. Soc. Trans. 27, 851 (1999)] o el fragmento C (HC) de la toxina tetánica [Knight et al., Eur. J. Biochem. 259, 762 (1999)] se encuentran dentro de las modalidades de la invención debido a que conservan la capacidad de unión específica a células nerviosas y las propiedades de transporte de la holotoxina.
En una modalidad particular de la presente invención, el péptido fiísogénico del extremo amino terminal de la hemaglutinina del virus de la influenza HA2 (GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA) fue modificado por la adición de cuando menos tres lisinas en su extremo terminal carboxílico (GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCAKKK) para hacer posible su acoplamiento a los grupos e-amino de la poli-L-lisina mediante el entrecruzador bifuncional N-succinimidil-6-[3'-(2-piridildithio)propionamido]hexanoato, el cual se referirá como SPDP. La adición de cuando menos tres lisinas en el extremo amino terminal también queda cubierta por la modalidad de la invención debido a que esta
modificación es fundamental para garantizar la funcionalidad del vector. En particular, los péptidos capaces de fusionarse con la bicapa lipídica de las vesículas endocíticas a pH ácido [Kono et al., Biochim. Biophys. Acta 1164, 81 (1993); Rapaport et al., Biochemistry 32, 3291 (1993); Puyal et al., Biochim. Biophys. Acta 1195, 259 (1994); Zhang L. and Ghosh H.P. J. Virol. 68, 2186 (1994); Ishiguro et al., Biochemistry 35, 4976 (1996); Chavez et al., Biopolymers 58, 63 (2001)] pueden ser seleccionados y se encuentran dentro de las modalidades de la invención debido a que al eliminarse la posibilidad de fusión inespecífica con la membrana celular a pH fisiológico se conserva así la especificidad de polifección.
De acuerdo con la presente invención, el ligando (componente a) y el péptido fusogénico (componente d) se encuentran conjugados de manera covalente a la poli-L-lisina (componente b). La proporción de conjugación de ambos componentes debe ser mínimo para permitir la unión electrostática del DNA plasmídico, pero suficiente para activar el proceso de endocitosis y la fusión, respectivamente [Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I.,Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)]. El método de conjugación se puede realizar utilizando el entrecruzador bifuncional SPDP o metodologías convencionales y para la purificación del conjugado se pueden llevar a cabo por cromatografía líquida de exclusión molecular [Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I.,Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)], u otras metodologías comúnmente utilizadas en el arte previo. Las formas isoméricas de la polilisina, la poli-L-lisina y poli-D-lisina, son igualmente efectivas para ser utilizada como soporte para el ligando y el DNA plasmídico en la transferencia génica [Laurent et al., FEBS Lett. 443, 61 (1999)]. En particular el tamaño molecular de la poli-L-lisina es importante para facilitar la unión electrostática de diferentes tamaños moleculares de DNA plasmídico [Ziady et al, J. Biol. Chem. 274, 4908 (1999)].
En relación con la presente invención, el péptido de 19 amino ácido mutante de la señal de direccionamiento nuclear de Vpl del virus SV40 (componente e) es utilizado para asistir la importación nuclear del DNA plasmídico (componente c) debido a sus fuertes propiedades cariof?licas y a su naturaleza catiónica (cargas positivas). Debido a ésta última propiedad,
este péptido cariof?lico (MAPTKRKGSCPGAAPNKPK) será unido electrostáticamente al DNA plasmídico a una relación molar óptima. En particular, los péptidos cariofílicos o señales de direccionamiento nuclear que manifiesten características básicas o catiónicas pueden ser seleccionados y se encuentran dentro de las modalidades de la invención debido a la posibilidad de ser unidos electrostáticamente al DNA plasmídico. Como una modalidad particular, el vector fusogénico se puede utilizar para transferir DNA plasmídico que contenga un péptido cariofílico unido en forma covalente ya sea direcatmante a él [Zanta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 91 (1999)] o a la polilisina [Chan C.K. and Jans D.A., Hum. Gene Ther. 10, 1695 (1999)] debido a que aún en estas condiciones se preservan las características cariofílicas.
El término cDNA "ácido desoxiribonucleico complementario" se sobrentiende que significa estructuras de ácido nucleico artificial que puede ser transcrito en las células blanco. Tales estructuras son preferentemente insertadas en un plásmido. El uso de promotores específicos del tejido es un elemento importante para la presente invención ya que, además de reforzar la especificidad de la expresión del transgén, alarga la duración de la expresión del mismo [Wu et al., J. Biol. Chem. 264, 16985 (1989); Andersen et al, Hum. Gene Ther. 3, 487 (1992); Chen et al., Mol. Pharmacol. 54, 495 (1998); Navarro et al., Gene Ther. 6, 1884 (1999); Wang et al., Hum. Gene Ther. 10, 1763 (1999); Paterna et al., Gene Ther. 7, 1304 (2000)].
En concordancia con la presente invención se provee un método para conjugar en forma simultánea la neurotensina o la lactosa a la poli-L-lisina mediante el entrecruzador bifuncional SPDP y purificar los productos resultantes en los diferentes pasos de conjugación. Además, se provee un método para determinar en forma rápida la relación molar óptima entre el DNA plasmídico y el péptido cariofílico, y la relación molar óptima del DNA plasmídico-cariof?lico y el vector fusogénico neurotensina-SPDP-(péptido fusogénico-SPDP)-poli-L-lisina o péptido fusogénico-SPDP-poli-L-lisina lactosilada).
El grado de conjugación del ligando y del péptido fusogénico a la poli-L-lisina se establece sobre la base de la siguiente consideración teórica. Puesto que los grupos NH2 libres de la poli-L-lisina están involucrados en la unión del DNA plasmídico, el porcentaje de grupos NH2 utilizados en la conjugación debe ser mínima pero suficiente para activar la endocitosis y la acción fusogénica. Por ejemplo, considerando una poli-L-lisina de 46,000 Da, la cantidad de grupos NH2 libres (valencias) se calcula de la siguiente manera: (46,000 Da de poli-L-lisina/146 Da de lisina = 315 grupos e-amino/molécula de poli-L-lisina), los cuales pueden reaccionar con el entrecruzador bifuncional SPDP. Las valencias del ligando varían de acuerdo a su naturaleza química; por ejemplo, la neurotensina tiene 4 grupos NH2 por molécula, mientras que la lactosa tiene una valencia. Puesto que el péptido fusogénico fue modificado por la adición de tres lisinas, por lo tanto, el número de grupos NH2 libres (valencias) son 4. Nuestra investigación ha mostrado que una relación funcional de la neurotensina con respecto a la poli-L-lisina es 5/1 [Martinez-Fong et al., Mol Brain Res. 69, 249 (1999); Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I.,Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)]. Para el caso del vector de lactosa, la proporción de lactosilación de la poli-L-lisina (disacárido/poli-L-lisina) que resultó ser la más efectiva en la transferencia génica estuvo entre el 30% y 40% [Martinez-Fong et al., Hepatology 20, 1602 (1994)].
La neurotensina (peso molecular 1,673 Da) y el péptido fusogénico modificado de la hemaglutinina HA2 del virus de la influenza (peso molecular 2,695 Da) pueden ser conjugados a la poli-L-lisina (peso molecular promedio 46,000 Da) utilizando el entrecruzado bifuncional N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP) de acuerdo al método que describimos para la conjugación de la neurotensina a la poli-L-lisina
[Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I.,Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)]. La reacción de conjugación se puede dividir en 3 pasos que pudieran llevarse a cabo en forma paralela, y un 4° paso donde se hace reaccionar simultáneamente la neurotensina-SPDP y el péptido fusogénico-SPDP con la poli-L-lisina-SPDP-SH. Por lo tanto, el esquema de conjugación es como sigue: 1) Conjugación del SPDP a la neurotensina. 2) Conjugación del SPDP al péptido fusogénico. 3) Conjugación del SPDP a la poli-L-lisina y formación del-SH, radical altamente reactivo, por la reducción subsecuente del grupo SPDP
conjugado a la poli-L-lisina. 4) Conjugación simultánea de la neurotensina-SPDP y el péptido ftisogénico-SPDP con la poli-L-lisina-SPDP-SH. La separación y purificación de los conjugados resultantes en cada paso de reacción puede llevarse a cabo utilizando combinaciones apropiadas de métodos cromatográficos de exclusión molecular seguidos de métodos físicos de concentración tendientes a reducir el volumen de la fracción cromatográfica útil. La última etapa requiere, además de la purificación cromatográfica, métodos de ultrafiltración y diálisis.
La relación molar entre el DNA plasmídico y el vector fusogénico puede ser calculada teóricamente tomando en consideración las cargas positivas de la fracción de polilisina del vector y las cargas negativas del DNA plasmídico [Felgner et al., Hum. Gene Ther. 8, 511 (1997); Toncheva et al., Biochim. Biophys. Acta 1380, 354 (1998); Kwoh et al, Biochim. Biophys. Acta 1444, 171 (1999)]. Puesto que el procedimiento teórico requiere de confirmación experimental, el microensayo de retención que es un procedimiento práctico y rápido para determinar la relación molar óptima [Martinez-Fong et al., Hepatology 20, 1602 (1994); Martinez-Fong et al., Mol Brain Res. 69, 249 (1999); Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I., Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)] es una modalidad preferida.
Aunque el ensamblaje de los componentes fiísogénico, cariofílico, vector y DNA plasmídico pareciera ser sencilla, se descubrió que esos componentes debían ensamblarse a una relación molar precisa para garantizar la eficiencia de transferencia génica y producir resultados consistentes. Para reducir el número de variables y evitar cantidades prohibitivas de tiempo y trabajo invertido en encontrar la relación óptima de la combinación de esas 4 variables, se diseñó un procedimiento que comprime el ligando (neurotensina o lactosa), péptido fusogénico y poli-L-lisina a una sola variable (vector fiísogénico), y al acoplar por separado el péptido cariofílico al DNA plasmídico a la relación molar óptima facilitó determinar rápidamente la relación óptima del DNA plasmídico-cariof?lico con respecto al vector fusogénico. En una modalidad particular, el ligando (componente a) y el péptido fusogénico (componente d) pueden ser conjugados por separado a la polilisina de peso molecular semejante. En este caso, el vector fusogénico se obtiene haciendo mezclas de las
soluciones que contienen ambos componentes. Al formarse el poliplex fusogénico-cariof?lico utilizando esta última modalidad, el DNA plasmídico (componente c) deberá contender cuando menos la cantidad mínima de ligando y de péptido fiísogénico para que se produzcan la funciones esperadas (internalización, rescate y direccionamiento nuclear).
En cualquiera de las modalidades descritas, el vector no viral de transferencia génica vía endocitosis del receptor conserva en todo momento la finalidad de la estrategia fusogénica-cariof?lica, esto es: 1) activar específicamente la endocitosis mediada por receptor, 2) escapar oportunamente del compartimiento endosomal y 3) dirigir certeramente el DNA plasmídico al núcleo celular. Modificando de esta manera la estructura básica de los vectores pertenecientes a los sistemas de transferencia génica medida por receptor, se logró mejorar significativamente su eficiencia de transferencia génica sin menoscabo de su especificidad.
EJEMPLOS
La presente invención es descrita en más detalle a través de los siguientes ejemplos. Se sobrentiende, desde luego, que estos Ejemplos no tienen la intención de limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1
Conjugación del péptido fusogénico al vector de neurotensina: vector fusogénico de neurotensina
Se utiliza el péptido de 22 amino ácidos de largo (GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA) del extremo terminal de la hemaglutinina HA2 del virus de la influenza, pero modificado por la adición de 3 lisinas en el extremo carboxílico (GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCAKKK) para hacer posible su acoplamiento a los grupos e-amino de la poli-L-lisina mediante el entrecruzador bifuncional N-succinimidil-6-[3'-(2-piridildithio)propionamido]hexanoato, el
cual se referirá como SPDP. Donde se lea péptido fusogénico se refiere a péptido fusogénico HA2 del virus de la influenza modificado por la adición de 3 lisinas.
La composición de la solución salina amortiguada por fosfatos (PBS) que se utiliza en algunos pasos cromatográficos es como sigue: (17.42 mM Na2HPO4, 2.58 mM KH2PO4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.02 % azida de sodio, pH 7.2) y se referirá como PBS para cromatografía.
La composición de la solución salina amortiguada por fosfatos (PBS) que se utiliza en cultivos celulares es como sigue: (8.1 mM Na2HPO4, 1.2 mM KH2PO4, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4) y se referirá como PBS para células.
Paso 1. Formación de la fracción SH-SPDP-poli-L-lisina
Se disuelven 40.74 mg de poli-L-lisina a (46,000 Da, 315 valencias) en 1.940 ml de PBS para cromatografía, resultando una concentración de 0.457 mM. Enseguida se agregan 60 µl de una solución 204 mM de SPDP (425.5 Da; 5.2 mg/60 µl dimetilsulfóxido) y se efectúa la mezcla por agitación rápida y vigorosa para evitar la formación de precipitados. Las concentraciones finales son 6.1 mM para el SPDP y 0.443 mM para la poli-L-lisina. La mezcla de reacción se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad (SPDP es sensible a la luz).
Para purificar el conjugado SPDP-poli-L-lisina, la muestra se somete a cromatografía de exclusión molecular en Bio-gel P-6 (1.5 X 6 cm, lecho de la resina) equilibrado con PBS para cromatografía a temperatura ambiente, y se colectan 17 fracciones de 1 ml. Alícuotas de 100 µl de cada fracción se transfieren a tubos de 0.5 ml de capacidad y se diluyen a 300 µl con PBS para cromatografía (sin azida de sodio) para leer la absorbancia a 280 nm. Se obtiene el cromatograma graneando la absorbancia versus el volumen de elución (Fig. 4). El primer pico corresponde a moléculas de alto peso molecular y su presencia a 280 nm indica que la conjugación del SPDP a la poli-L-lisina se llevó a cabo, puesto que la poli-L-
lisina no absorbe a esa longitud de onda. Por lo tanto, las fracciones 3 a 6, donde eluye el primer pico, se juntan y se reduce el volumen a 1 ml utilizando un microconcentrador al vacío.
Cuando se alcanza el volumen de 1 ml, inmediatamente se añaden 0.5 ml de una solución 156 mM de ditiotreitol (154 Da; 12 mg de DTT en 0.5 ml de PBS para cromatografía) para reducir la SPDP-poli-L-lisina a SH-SPDP-poli-L-lisina; la mezcla se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, 20 µl de la mezcla de reacción se diluyen con 180 µl de PBS para cromatografía (dilución 10X) y se lee la absorbancia a 343 nm para calcular la eficiencia de la reacción a través de la piridina-2-tiona que se libera durante la conjugación. Se utiliza la siguiente ecuación:
C = (Abs343 nm /E3 3 nm) F.D.
Donde C es la concentración de la piridina-2 -tiona, Abs34 nm es la absorbancia de la piridina-2 -tiona a 343 nm, E 4 nm es el coefíciente de extinción molar de la piridina-2- tiona a 343 nm cuyo valor es 8.08 x 103 cm"1 M"1, y F. D. es el factor de dilución.
Dada una Abs 4 nm = 1 -533 C = (1.533 era-1 / 8.08 x 103 ern-1 M_1) X 10 C = 1.897 x lO"3 M
Considerando 6.1 mM como la concentración inicial del SPDP, fuente directa de la piridina-2 -tiona, la eficiencia de la reacción será entonces: (1.497 mM / 4 mM) X 100% = 31.1%.
Para purificar la fracción SH-SPDP-poli-L-lisina, la muestra se somete a cromatografía de exclusión molecular en Bio-gel P-6 (1.5 X 6 cm, lecho de la resina) equilibrado con PBS para cromatografía a temperatura ambiente y se colectan diecisiete fracciones de 1 ml. Alícuotas de 100 µl de cada fracción se transfieren a tubos de 0.5 ml de capacidad, se
añaden 200 µl de PBS para cromatografía a cada mbo, se mezcla bien, y se lee la absorbancia simultáneamente a 215, 280 y 343 nm. El cromatograma se obtiene graneando la absorbancia versus el volumen de elución (Fig. 5). La ausencia del primer pico a 280 nm y la aparición del segundo pico a 343 nm indican que la reducción del SPDP conjugado a la poli-L-lisina se llevó a cabo. El primer pico a 215 nm es indicativo de la presencia de la SH-SPDP-poli-L-lisina (Fig. 5). Por lo tanto, las fracciones 3 a 6 donde eluye el primer pico se juntan y el volumen se reduce a 1 ml en un microconcentrador al vacío.
Paso 2. Formación de la fracción neurotensina-SPDP
Se disuelven 5.17 mg de neurotensina (1,673 Da) en 970 µl de PBS para cromatografía, resultando una concentración de 3.19 mM. Enseguida se agregan rápidamente 30 µl de una solución 203 mM de SPDP (425.5 Da, 2.6 mg/30 µl dimetiisulfóxido) y se efectúa la mezcla por agitación vigorosa para evitar la formación de precipitados. Las concentraciones finales son 6.1 mM para el SPDP y 3.09 mM para la neurotensina. La mezcla de reacción se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad.
Para purificar la neurotensina-SPDP, la muestra se somete a cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G10 (1 X 22 cm, lecho de la resina) equilibrado con PBS para cromatografía a temperatura ambiente, y se colectan 25 fracciones de 0.5 ml. Alícuotas de 100 µl de cada fracción se diluyen con 200 µl de PBS para cromatografía (sin azida de sodio) y se lee la absorbancia a 280 nm. Se obtiene el cromatograma graneando la absorbancia versus el volumen de elución (Fig. 6). El primer pico indica la conjugación del SPDP a la neurotensina, ya que la neurotensina no absorbe a 280 nm. Por lo tanto, se juntan las fracciones donde eluye el primer pico (5 a 6.5 ml; Fig. 6) y se reduce el volumen a 0.5 ml utilizando un microconcentrador al vacío.
Paso 3. Formación de la fracción péptido fusogénico-SPDP
Se disuelven 8.3 mg de péptido fusogénico (2,695 Da) en 970 µl de PBS para cromatografía, resultando una concentración de 3.17 mM. Enseguida se agregan rápidamente 30 µl de una solución 203 mM de SPDP (425.5 Da, 2.6 mg/30 µl dimetiisulfóxido) y se efectúa la mezcla por agitación vigorosa para evitar la formación de precipitados. Las concentraciones finales son 6.1 mM para el SPDP y 3.08 mM para el péptido fusogénico. La mezcla de reacción se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad.
Para purificar el péptido fusogénico-SPDP, la muestra se somete a cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G10 (1 X 22 cm, lecho de la resina) equilibrado con PBS para cromatografía, y se colectan 25 fracciones de 0.5 ml. Alícuotas de 100 µl de cada fracción se diluyen a 300 µl con PBS para cromatografía (sin azida de sodio) para leer la absorbancia a 280 nm. Se obtiene el cromatograma graficando la absorbancia versus el volumen de elución (Fig. 7). El primer pico contiene la fracción péptido fusogénico-SPDP; por lo tanto, se juntan las fracciones donde eluye el primer pico (4 a 5.5 ml; Fig. 7) y se reduce el volumen a 0.5 ml utilizando un microconcentrador al vacío.
Paso 4. Síntesis de neurotensina-SPDP-(péptido fusogénico-SPDP)-poli-L-lisina: el vector fusogénico de neurotensina
Se mezclan los volúmenes de 0.5 ml correspondientes a las fracciones de neurotensina-SPDP y péptido fusogénico-SPDP con el mililitro de la fracción SH-SPDP-poli-L-lisina bajo agitación vigorosa para evitar la formación de precipitados. Se continúa con la agitación por 36 h a temperatura ambiente y en la oscuridad. Al término de la incubación, se diluyen 20 µl de la mezcla de reacción con 180 µl de PBS para cromatografía (dilución 10X) y se lee la absorbancia a 343 nm para determina la eficiencia de la reacción basándose en la concentración de la piridina-2-tiona liberada durante la conjugación. Se utiliza la siguiente ecuación:
C = (AbS3 3 nm /E343 „m) F.D.
Donde C es la concentración de la piridina-2-tiona, Abs343 nm es la absorbancia de la piridina-2 -tiona a 343 nm, E343 nm es el coeficiente de extinción molar de la piridina-2- tiona a 343 nm cuyo valor es 8.08 x 103 cm"1 M"1, y F. D. es el factor de dilución.
Dada una Abs3 3 nm = 0.924 C = (0.751 cm"1 / 8.08 x 103 cm"1 M"1) X 10 C = 0.93 x lO"3 M
Considerando 3.1 mM como la concentración inicial del SPDP, fuente directa de la de la piridina-2-tiona, la eficiencia de la reacción será entonces: (0.93 mM / 3.1 mM) X 100% = 30%.
El conjugado neurotensina-SPDP-(péptido fi?sogénico-SPDP)-poli-L-lisina se purifica por cromatografía de exclusión molecular en Biogel A- 1.5 m (1.5 X 45 cm, lecho de la resina) equilibrada con 2 M guanidina en 10 mM Hepes, pH 7.4, recolectando 100 fracciones de 1 ml. Se diluyen 100 µl de cada fracción con 200 µl de agua desionizada y se lee la absorbancia simultáneamente a 215, 280 y 343 nm. Se obtiene el cromatograma de purificación considerando las tres longitudes de onda. El pico a 343 nm en la región de exclusión de moléculas de bajo peso (fracciones 65-70) se debe a la presencia de la piridina-2-tiona y es indicio de que la conjugación se llevó a cabo (Fig. 8A). La correspondencia de los cromatogramas a 215 y 280 nm en la región de exclusión de moléculas de alto peso (fracciones 27-47) es sugerente de que esas fracciones contienen conjugados neurotensina-SPDP-(péptido füsogénico-SPDP)-poli-L-lisina (Fig. 8B). Se juntan las fracciones 35 a 45 donde eluyen conjugados de peso molecular en un rango de 200,000 a 66,000 Da (Fig. 8) y se reduce el volumen a 1 ml utilizando una membrana 25, PM 10 montada en una celda de ultrafiltración modelo 12 (Amicon) bajo atmósfera de N2.
Se dializa la solución que contiene el conjugado neurotensina-SPDP-(péptido fusogénico-SPDP)-poli-L-lisina contra 1 L de PBS para células durante 4 h. El proceso de diálisis se repite cuatro veces utilizando en cada ocasión PBS para células fresco. Finalmente la solución que contiene la neurotensina-SPDP-(péptido fusogénico-SPDP)-poli-L-lisina se esteriliza por filtración en membrana hidrofílica de 0.22-µm de poro, y enseguida se distribuye en alícuotas de 0.1 ml, las cuales se pueden almacenar a -70 °C hasta por un año. En una alícuota, se cuantifica la concentración del conjugado basándose en el contenido de la poli-L-lisina y el peso molecular promedio.
Considerando 3.52 mg/ml de poli-L-lisina y 133,000 Da de peso molecular promedio.
Entonces la concentración será: (3.52 mg/ml de poli-L-lisina) (mmol/133,000 mg) = 2.646 x 10"5 M.
Paso 5. Acoplamiento del péptido cariof?lico al DNA plasmídico
Se utilizan los plásmidos pGreen Lantern 1 (5.031 kb) y pEGFP-Nl (4.7 kb) que codifican para la proteína verde fluorescente (GFP) y cuya regulación se encuentra bajo el promotor temprano de CMV. A estos plásmidos se les acopla electrostáticamente el mutante de la señal de direccionamiento nuclear Vpl (MAPTKRKGSCPGAAPNKPK) para formar el DNA plasmídico-cariofílico. A dicha señal de direccionamiento nuclear se referirá como péptido cariofílico. El péptido cariofílico y el DNA plasmídico se disuelven en medio mínimo Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) libre de suero. Se incuban por separado concentraciones crecientes de péptido cariofílico (2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0, 25.0 µM) con una concentración constante de DNA plasmídico (6 nM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los complejos resultantes se analizan por electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, a 80 voltios durante 2 h. El DNA se identifica por tinción con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) en un transiluminador de luz ultravioleta.
El análisis del patrón electroforético en la fotografía del gel revela un retardo en el corrimiento del DNA que es dependiente de la concentración del péptido cariofílico (Fig.
9). La completa retención del DNA plasmídico se produjo con 25 µM de péptido cariof?lico sugiriendo que esta concertación neutraliza totalmente las cargas eléctricas negativas del DNA. La formación del poliplex fusogénico y cariofílico se logra utilizando aquella concentración de péptido cariofílico que retrase evidentemente la migración electroforética del DNA plasmídico pero que no neutralice la totalidad de sus cargas negativas, para permitir la unión electrostática del vector fusogénico. En este ejemplo se escogió la concertación de 10 µM (Fig. 9).
Paso 6. Formación del poliplex fusogénico-cariofílico de neurotensina (gel de retardo)
El DNA plasmídico-cariofílico se une electrostáticamente al vector fusogénico para formar el poliplex füsogénico-cariof?lico de neurotensina. Los complejos se forman a relaciones molares crecientes (1:0, 1 :4, 1 :6, 1:8, 1 :10 y 1:12; DNA:vector fusogénico) añadiendo gota a gota 0.6 ml del vector fusogénico a 1.4 ml de la solución del DNA plasmídico-cariofílico (6 nM:10 µM). Las relaciones que resultan considerando la concentración del péptido cariofílico son: 1 :0:0, 1 :1666:0, 1 :1666:4, 1:1666:6, 1:1666:8, 1:1666:10 y 1 :1666:12; DNA:péptido cariofílico: vector fusogénico de neurotensina. La mezcla de reacción se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los complejos resultantes se someten a electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, a 80 voltios durante 2 h y el DNA es teñido con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) para su identificación en un transiluminador de luz ultravioleta.
El análisis del patrón electroforético en la fotografía del gel revela un retardo gradual y una retención completa en el corrimiento del DNA-cariofílico que es dependiente de la concentración del vector fusogénico, hasta el punto de no entrar en el gel a relaciones mayores a 1:1666:12, DNA:péptido cariofílico:vector fusogénico (Fig. 10). En consecuencia, para los ensayos de internalización y expresión se escoge aquella relación que retenga DNA y que quede alejada cuando menos dos relaciones de aquélla en la que empieza la precipitación del complejo (identificado por la ausencia de marca fluorescente en el pozo y el carril correspondiente); en este caso se escogió la relación 1 :1666:8;
DNA:péptido cariofílico:vector fiísogénico de neurotensina. Como a la relación seleccionada el poliplex es soluble y generalmente produce transferencia exitosa de genes, a esa relación se le conoce como relación molar óptima.
Ejemplo 2
Conjugación del péptido fiísogénico a la poli-L-lisina lactosilada: vector fusogénico de lactosa
Paso 1. Acoplamiento reductivo de la lactosa a la poli-L-lisina
La relación lactosa/poli-L-lisina se calcula sobre la base del número de grupos reactivos por molécula (normalidad), de esta manera, la lactosa tiene una valencia por molécula y la poli-L-lisina 304 por molécula (44,500 Da de poli-L-lisina/ 146 Da de lisina = número de grupos e-amino/molécula de poli-L-lisina). El ejemplo se ilustra con la relación 7/1, lactosa/poli-L-lisina. Se pesan 14.638 mg de poli-L-lisina y se disuelven en 0.5 ml de buffer de borato de sodio pH 8.5 para obtener una concentración de 6.579 X 10"4 M (0.2 N). Se pesan 25.221 mg de a-lactosa (PM = 360.3 Da) y se disuelven en 0.5 para obtener una concentración de 0.14 M. Ambas soluciones se mezclan y se agregan 19 mg de cianoborohidrato de sodio (PM = 62.84). Las concentraciones finales son: 0.1 N para la poli-L-lisina, 0.07 N para la lactosa y 0.3 M el cianoborohidrato de sodio. La mezcla de reacción se deja incubando a 37°C con agitación constante por 48 hr.
Al término de la incubación, la solución se observa ligeramente turbia por lo que se recomienda agregarle 2 ml de PBS (sin azida de sodio) y calentarla en baño maría a 65°C durante 10 min para lograr la completa solubilización del producto. Enseguida la mezcla de reacción se someta a cromatografía de exclusión molecular en Bio-gel P-6 (1.5 X 6 cm, lecho de la resina) equilibrado con PBS para células y se recolectan 20 fracciones de lml. Se determina la presencia de poli-L-lisina en las fracciones por medio de su absorbancia a 215 nm. Se toman 10 µl de cada una de las fracciones y se diluyen a 2 ml con agua para
cuantificar el contenido de carbohidratos utilizando el método calorimétrico descrito por Dubois y cois. (Dubois M, Gilíes KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 1966; 28:350-356). El cromatograma se obtiene graficando, en las ordenadas, la absorbancia de la poli-L-lisina a 215 nm y la absorbancia del contenido de lactosa a 490 nm y, en las abscisas, el volumen de elución.
La correspondencia del primer pico en los cromatogramas a 215 y 490 nm demuestra la presencia de poli-L-lisina lactosilada (Fig. 11). Por lo tanto, se juntan las fracciones 3-6 correspondiente al primer pico, se dializan contra PBS para células y se determina nuevamente el contenido de poli-L-lisina en alícuotas de 10 µl diluidas a 300 µl con PBS para células y el contenido de lactosa en alícuotas de 10 µl diluidas a 2 ml con agua. El porcentaje de lactosilación se calcula como sigue:
Considerando que la concentración de poli-L-lisina es 3.79 mg/ml. Entonces su concentración es: (3.79 mg/ml) (mmol/44500 mg) = 8.516x 10"5 M. Considerando que la concentración de carbohidratos es 2.222 mg/ml. Entonces su concertación es: (2.222 mg/ml) (mmol/342.3 mg) = 6.491 10"3 M. Por lo tanto, 6.491 10"3 M de lactosa 8.516x 10"5 M de poli-L-lisina = 76.221 moléculas de lactosa /molécula de poli-L-lisina. Como la poli-L-lisina utilizada tiene 304 valencias, entonces el porcentaje de lactosilación es: (76.221 lactosas/304 valencias de poli-L-lisina) x 100% = 25.07%.
Se esteriliza la solución que contiene la poli-L-lisina lactosilada (el vector de lactosa) por filtración en membrana hidrofílica de 0.22 µm de poro y se conserva a 4°C.
Paso 2. Conjugación del péptido fusogénico a la poli-L-lisina lactosilada: el vector fusogénico de lactosa
a) Conjugación del SPDP a la poli-L-lisina lactosilada
Se disuelve 0.81 mg de SPDP (PM = 425.5 Da) en 14.07 µl de dimetiisulfóxido obteniéndose una concentración de 0.1352 M e inmediatamente se agrega todo el volumen a 2 ml de la solución de poli-L-lisina lactosilada (3.79 mg/ml) agitando enérgicamente. Las concentraciones finales son 9.45 x 10"4 N para el SPDP y 0.0259 N para la poli-L-lisina es. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se purifica el conjugado SPDP-poli-L-lisina lactosilada por cromatografía de exclusión molecular en Bio-gel P-6 (1.5 X 6 cm, lecho de la resina), equilibrado con PBS para cromatografía (sin azida de sodio) y se recolectan 20 fracciones de 1 ml. La absorbancia en las fracciones se lee a 215 y 280 nm, mientras que el contenido de carbohidratos se determina a 490 nm en alícuotas de 30 µl de fracciones utilizando el método calorimétrico descrito por Dubois y cois. (Dubois M, Gilíes KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 1966; 28:350-356). Se obtiene el cromatograma graficando la absorbancia a 215 (poli-L-lisina), 280 nm (SPDP) y 490 nm (lactosa) versus el volumen de elución.
El primer pico aparece en los cromatogramas a 215, 280 y 490 nm, y demuestra por lo tanto la realización de la conjugación del SPDP con la poli-L-lisina lactosilada, ya que ésta no absorbe a 280 nm (Fig. 12). Por lo tanto, las fracciones donde eluye el primer pico (3-6) se juntan y se concentran a 1 ml en un microconcentrador al vacío).
b) Conjugación del SPDP al péptido fusogénico
Se disuelven 2.56 mg de péptido fusogénico (PM = 2695 Da) en lml de PBS para cromatografía. Inmediatamente se le agregan 14.07 µl de una solución 0.1352 M de SPDP (PM = 425.5 Da, 0.81 mg/14.07 µl de dimetiisulfóxido) agitando vigorosamente. La
concentración final de SPDP es 0.0019 M, mientras que la del péptido fiísogénico es 9.499 x 10"4 M. La mezcla se incuba a temperatura ambiente por 30 minutos. Al término de la incubación, la mezcla de reacción se somete a cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G10 (1 X 22 cm, lecho de la resina) equilibrado con PBS para cromatografía y se recolectan 30 fracciones de 0.5 ml. Se determina la absorbancia en las muestras a 280 nm y se obtiene el cromatograma graficando absorbancia versus el volumen de elución.
En el cromatograma se observa la presencia de dos picos, el primero contiene moléculas mayores a los 700 Da, mientras que el segundo contiene moléculas inferiores a 700 Da (Fig. 13). Por lo tanto, el conjugado péptido fusogénico-SPDP eluye en el primer pico. En consecuencia, se juntan las fracciones del pico primer pico (5 a 7.5 ml) y se reduce el volumen a 1 ml utilizando un microconcentrador al vacío.
Enseguida se reduce el SPDP conjugado al péptido fusogénico agregando 0.5 ml de una solución 156 mM de ditiotreitol (154 Da; 12 mg de DTT en 0.5 ml de PBS) y la mezcla se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al término de la incubación, una alícuota de 30 µl se diluye a 300 µl con PBS para cromatografía y se lee la absorbancia a 343 nm para calcular la eficiencia de conjugación utilizando el coeficiente de extinción molar de la piridina-2-tiona, la cual se libera en la reacción de reducción. Se utiliza la siguiente ecuación:
C = (Abs3 3 nm /E343 nm) F.D.
Donde C es la concentración de la piridina-2-tiona, Abs3 3 nm es la absorbancia de la piridina-2 -tiona a 343 nm, E343 nm es el coeficiente de extinción molar de la piridina-2- tiona a 343 nm = 8.08 x 103 cm"1 M"1, y F. D. es el factor de dilución.
Dada una Abs343 nm = 0.2594 C = (0.2594 cm"1 / 8.08 x 103 cm"1 M"1) X 10 C = 3.21 x lO"4 M
Considerando 1.9 x 10"3 M como la concentración inicial del SPDP, fuente directa de la de la piridina-2-tiona, la eficiencia de la reacción será entonces: (3.21 x 1(T M / 1.9 x 10 -"3J M) x 100% = 17%
La mezcla de reacción se purifica en Sephadex G10 (1 X 22 cm, lecho de la resina) equilibrado con PBS para cromatografía y se recolectan 50 fracciones de 0.5ml. Se determina la absorbancia en las muestras a 280 y 343 nm y se obtiene el cromatograma graficando absorbancia versus volumen de elución.
El segundo pico (fracciones 20-24) en el cromatograma a 343 nm corresponde a la piridina-2-tiona y demuestra que el SPDP conjugado al péptido fusogénico fue reducido al grupo sulfidrílo altamente reactivo SH-SPDP (Fig. 14). Por lo tanto, las fracciones del primer pico contienen el conjugado péptido fusogénico-SPDP-SH. En consecuencia, se juntan las fracciones del primer pico (5 a 8 ml) y se reduce el volumen a 1 ml en un microconcentrador al vacío.
c) Formación del vector fusogénico de lactosa
Se mezcla inmediatamente el volumen de 1 ml de la solución de poli-L-lisina lactosilada-SPDP con el volumen de lml del péptido fusogénico-SPDP-SH y se dejan incubando bajo agitación constante durante 36 horas a temperatura ambiente. Al término de la incubación, 50 µl de la mezcla anterior se llevan a 300 µl con PBS (sin azida de sodio) y se lee la absorbancia a 343 nm para calcular la eficiencia de conjugación utilizando el coeficiente de extinción molar de la piridina-2 -tiona. Se utiliza la siguiente ecuación:
C = (Abs343 nm /E3 3 nm) F.D.
Donde C es la concentración de la piridina-2-tiona, Abs343 nm es la absorbancia de la piridina-2 -tiona a 343 nm, E343 nm es el coeficiente de extinción molar de la piridina-2- tiona a 343 nm cuyo valor es 8.08 x 103 cm"1 M"1, y F. D. es el factor de dilución.
Dada una Abs343 nm = 0.4641 C = (0.4641 cm"1 / 8.08 x 103 cm"1 M"1) X 6 C = 3.44 x lO"4 M Considerando 1.9 x 10"3 M como la concentración inicial del SPDP, fuente directa de la de la piridina-2-tiona, la eficiencia de la reacción será entonces: (3.44 x 10"4 M / 1.9 x 10"3 M) x 100% = 18%.
El resto de la muestra se procesa por cromatografía de exclusión molecular en Biogel A1.5m (1.5 x 45 cm, lecho de la resina), equilibrado con 2 M guanidina en 10 mM Hepes, pH 7.4, y se colectan 80 fracciones de 1 ml. Se lee la absorbancia en alícuotas de cada fracción diluidas 1 :3 con PBS (sin azida de sodio) a 215, 280 y 343 nm, en forma simultánea. Se determina el contenido de lactosa a 490 nm en alícuotas de 80 µl utilizando el método descrito por Dubois y cois. (Dubois M, Gilíes ICA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 1966; 28:350-356). Se obtiene el cromatograma graficando las absorbancias versus el volumen de elución.
La presencia de un pico a 343 nm en las fracciones de peso molecular bajo (fracciones 60-70) confirma el éxito de la conjugación del péptido fusogénico a la poli-L-lisina lactosilada (Fig. 15 A). Además, la concordancia de las tres curvas de los cromatogramas a 215, 280 y 490 nm en las fracciones 25-50 demuestra la presencia de conjugados de diferentes pesos moleculares que contienen péptido fusogénico (280 nm), lactosa (490 nm) y poli-L-lisina (215 nm) (Fig. 15B).
Se juntan las fracciones 35 a 47 que contienen conjugados cuyo peso molecular promedio se calculó en 235,000 Da basándose en la calibración de la columna con marcadores de
peso molecular. Se reduce el volumen a 2 ml utilizando una membrana 25, PM 10 montada en una celda de ultrafiltración modelo 12 (Amicon) bajo atmósfera de N2. Después de varias diálisis sucesivas contra PBS, las muestras se esterilizan por filtración a través de una membrana hidrof?lica de 0.22 µm y se almacenan a -70°C hasta su uso. Finalmente se determina la concentración de lactosa, poli-L-lisina y péptido fusogénico (utilizando para este último una curva patrón de albúmina) en alícuotas de 20 µl, para lactosa, y 30 µl, para poli-L-lisina y péptido fiísogénico. Para obtener la concentración molar del conjugado, se considera únicamente la concentración de poli-L-lisina (mg/ml) y el peso molecular promedio:
Considerando 1.47128 mg/ml de poli-L-lisina y 235,000 Da de peso molecular promedio. Entonces la concentración será: (1.47128 mg/ml de poli-L-lisina) (mmol/235,000 Da) = 6.26 x 10"6 M.
Paso 3. Acoplamiento del péptido cariofílico al DNA plasmídico
El DNA plasmídico-cariofílico se obtiene al acoplar en forma electrostática el péptido de la mutante de la señal de direccionamiento nuclear Vpl (MAPTKRKGSCPGAAPNKPK) a los plásmidos pGreen Lantern-1 (5.031 kb) y pEGFP-Nl (4.7 kb). El péptido cariofílico y el DNA plasmídico son disueltos en DMEM libre de suero. Se incuban concentraciones crecientes de péptido cariofílico (4.2, 4.5, 4.8, 5.1, 5.4, 5.7, 6.0 µM) con una concentración constante de DNA plasmídico (6 nM) durante 30 minutos a temperatura ambiente para favorecer la unión por cargas electrostáticas. Los complejos resultantes se someten a electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, a 80 voltios durante 2 h. El DNA se identifica por tinción con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) en un transiluminador de luz ultravioleta.
El análisis del patrón electroforético en la fotografía del gel revela un retardo en el corrimiento del DNA que es dependiente de la concentración del péptido carioñlico (Fig. 16). El retardo en el corrimiento del DNA en un campo electroforético inducido por el péptido cariofílico pone de manifíesto la presencia de dicho péptido en el DNA plasmídico.
La retención completa del DNA plasmídico se puede lograr con concertaciones de péptido cariofílico mayores que las ilustradas, pero tales concentraciones evitan la formación del poliplex fusogénico y cariofílico debido a la neutralización total de las cargas negativas del DNA. La formación del poliplex fusogénico y cariofílico se logra utilizando aquella concentración de péptido cariofílico que retrase evidentemente la migración electroforética del DNA plasmídico pero que no neutralice la totalidad de sus cargas negativas, para permitir la unión electrostática del vector fusogénico. En este ejemplo se seleccionó la concertación de 4.2 µM (Fig. 16).
Paso 4. Formación del poliplex fusogénico-cariof?lico de lactosa
El DNA plasmídico-cariofílico (6 nM:4.2 µM) se une electrostáticamente al vector fusogénico de lactosa para formar el poliplex fusogénico-cariofílico de lactosa. Los complejos se forman a relaciones molares crecientes (1 :0:0, 1 :700:0, 1:700:6, 1:700:8, 1:700:10, 1:700:12, 1:700:20; DNA:péptido cariofílico: vector fusogénico) añadiendo gota a gota 0.6 ml del vector fusogénico de lactosa a 1.4 ml de la solución del DNA plasmídico-cariof?lico (6 nM:4.2 µM). La mezcla de reacción se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los complejos resultantes se someten a electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, a 80 voltios por 2 h y el DNA es teñido con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) para su identificación en un transiluminador de luz ultravioleta.
El análisis del patrón electroforético en la fotografía del gel revela un retardo gradual y una retención completa en el corrimiento electroforético del DNA-cariofílico que es dependiente de la concentración del vector fusogénico de lactosa, hasta el punto de no entrar en el gel a relaciones mayores a 1:700:20; DNA:péptido cariofílico: vector fusogénico (Fig. 17). En consecuencia, para los ensayos de internalización y expresión se escoge aquella relación que retenga DNA y que quede alejada cuando menos dos relaciones de aquélla en la que empieza la precipitación del complejo (identificado por la ausencia de marca fluorescente en el pozo y el carril correspondiente); en este caso se seleccionó la relación 1:700:8; DNA:péptido cariof?lico:vector fusogénico de lactosa. Como a la relación
seleccionada el poliplex es soluble y generalmente produce transferencia exitosa de genes, a esa relación se le conoce como relación molar óptima.
Ejemplo 3.
Polifección in vitro mediante los vectores fiísogénico-cariofílico de neurotensina o de lactosa
Se utilizan los plásmidos pGreen Lantern-1 y pEGFP-Nl, los cuales codifican para la proteína verde fluorescente (GFP) y cuya regulación se encuentra bajo el promotor temprano de CMV.
Para la transferencia génica vía el vector fusogénico-cariofílico de neurotensina se utilizan líneas celulares que expresen el receptor de alta afinidad a neurotensina (NTRH), como son las líneas derivadas de neuroblastoma murino N1E-115 o líneas derivadas de adenocarcinoma humano de colón HT-29 [Amar et al., FEBS Lett. 201, 31 (1986); Amar et al., J. Neurochem. 49, 999 (1987); Martinez-Fong et al., Mol Brain Res. 69, 249 (1999); Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I., Brain Res. Protocols 6, 13 (2000)] (Fig. 18).
Para la transferencia génica vía el vector fusogénico-cariofílico de lactosa se utilizan líneas celulares que expresen el receptor a galactosa como las líneas HepG2 o C3A, ambas derivadas de hepatoma humano [Wu G.Y. and Wu C.H., Biochem., 27, 887 (1988); Martinez-Fong et al., Hepatology. 20, 1602 (1994); Zanta et al, Bioconjug. Chem. 8, 839 (1997)] (Fig. 19).
Las células N1E-115 y HT9 se cultivan en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina-estreptomicina (100 µg/ml) y anfotericina (0.25 µg/ml). Las células HepG2 o C3A se cultivan en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero fetal bovino al 5% inactivado, antibióticos (penicilina-estreptomicina), L-glutamina (2mM),
aminoácidos no esenciales (O.lmM), piruvato (lmM) y d-biotina (lOOnM). Las células se mantienen a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%.
Cuarenta y ocho horas previas a los ensayos de transfección con pEGFP-Nl, se siembran 50,000 a 60,000 células sobre cubreobjetos de vidrio (1 cm2) en cajas de 4 pozos. Se preparan los diversos poliplexes fusogénicos-cariofílicos sobre la base de la relación molar óptima calculada en el gel de retardo (Figs. 10 y 17) y se adicionan a los cultivos celulares adecuados. Después de 4 horas de incubación, se remueve el medio de polifección, se agrega medio fresco suplementado y se continúa la incubación de las células por 58 a 62 horas adicionales. Al término de la incubación, las células se lavan con PBS y se fijan con paraformaldehído al 4% en PBS. Después de contrateñir las células con 2.5 µM de yoduro de propidio, se montan en portaobjetos utilizando medio protector de la fluorescencia (Vectashield, Vector Laboratories) para ser analizadas en el microscopio confocal utilizando el objetivo de inmersión en aceite 60X, a las condiciones de excitación/emisión (Ex/Em) fijadas en 488/522 nm (canal verde) y 568/585 nm (canal rojo). Usualmente se obtienen 10 a 20 secciones ópticas consecutivas de 1-µm de intervalo en la serie z. Las imágenes resultantes se proyectan en un plano bidimensional y se sobreponen sobre la pantalla del monitor asignando el color verde para GFP, y el rojo para el yoduro de propidio.
Los resultados muestran que la adición de los péptidos fusogénico y cariofílico incrementa la eficiencia del vector original de neurotensina de 6.5 ± 1.5% [Martinez-Fong et al., Mol Brain Res. 69, 249 (1999)] a más del 50% (Fig. 18) en la línea celular N1E-115, conocidas por poseer NTRH. Definiéndose la eficiencia de transfección como la proporción de la población celular que expresa fuertemente el producto del gen transferido, entonces, una eficiencia del 50% del vector fusogénico y cariofílico de neurotensina significa que 50 células de una población de 100 expresan la GFP (Fig. 18A).
En forma semejante, la adición de los péptidos fiísogénico y cariofílico incrementó la eficiencia del vector original de lactosa de 3.5 ± 0.5%, n = 3, (Figs. 19D, 19E y 19F) a 35 ±
5%, n = 3, (Figs. 19G, 19H y 191) en células C3A que poseen el receptor de galactosa. Las células C3A sin polifectar (Fig. 19B) no mostraron fluorescencia verde (Fig. 19A).
Estos ejemplos demuestran claramente que la estrategia fusogénica y cariofílica incrementa 10 veces la efíciencia de polifección. Además, las ilustraciones de la polifección inducida por ambos vectores fusogénicos y cariofílicos muestran la fuerte expresión del transgén, la GFP. Estas dos características, una gran proporción de células expresando fuertemente el transgén, hace atractivo el uso de estos vectores para estudiar el efecto de genes de interés fisiológico o terapéutico in vitro.
Ejemplo 4.
Polifección in vivo mediante los vectores fusogénico-cariofílico de neurotensina o de lactosa
Se utilizan los plásmidos pGreen Lantern-1 y pEGFP-Nl, los cuales codifican para la proteína verde fluorescente (GFP) y cuya regulación se encuentra bajo el promotor temprano de CMV.
A. Polifección de neuronas dopaminérgicas de la substancia negra compacta.
Ratas Wistar macho (200-230 g) son anestesiadas con hidrato de cloral (300 mg/Kg) por vía intraperitonial y colocadas en un estereotáxico David Kopff. Después de la trepanación, se inyectan 2 µl del poliplex fusogénico cariofílico de neurotensina sobre el borde superior de la sustancia negra compacta utilizando las siguientes coordenadas: Anteroposterior, -4.6 mm del bregma, Lateralidad, +1.5 mm de la línea media y Profundidad, -6.6 mm de la duramadre. Para disminuir la probabilidad de degradación de la neurotensina por endopeptidasas endógenas, 1 µl de kelatorfán (50 mM) es microiny ectado junto con el poliplex. La aguja se mantiene dentro del cerebro 15 minutos para permitir una mayor difusión del complejo y se retira lenta y gradualmente para evitar la generación de presión
negativa que pudiera absorber al poliplex en el trayecto de la aguja. Las ratas son suturadas y mantenidas en condiciones normales de bioterio con agua y comida ad libitum hasta el día en el que se observe la expresión de la GFP. Entonces, las ratas son anestesiadas profundamente y sacrificadas a través de perfusión intracardíaca con solución fijadora de paraformaldehído al 4% en PBS.
El cerebro se mantiene el mismo fijador a 4°C por 24 h y toda la noche en una solución crioprotectora de sacarosa al 6%. El cerebro es seccionado en cortes sagitales seriados de 30 µm de grosor mediante la ayuda de un criostato. Las neuronas dopaminérgicas son identificadas por inmunotinción contra la tirosina hidroxilasa, enzima limitante en la síntesis de dopamina, utilizando el segundo anticuerpo rodaminado. Las rebanadas se montan en portaobjetos con medio protector de la fluorescencia (Vectashield, Vector Laboratories) y son analizadas en el microscopio confocal utilizando el objetivo de inmersión en aceite 60X, a las condiciones de excitación /emisión fijadas en 488/522 nm (canal verde) y 568/585 nm (canal rojo). Usualmente se obtienen 10 a 20 secciones ópticas consecutivas de 1 µm de intervalo en la serie z. Las imágenes resultantes se proyectan en un plano bidimensional y se sobreponen sobre la pantalla del monitor asignando el color verde para GFP, y el rojo para la rodamina.
En concordancia con los resultados in vitro, el vector fusogénico y cariofílico produjo expresión de la GFP (Fig. 20A) aproximadamente en un 50% de la población neuronal dopaminérgica de la substancia negra compacta (Figs. 20B y 20C), lo cual representa un incremento de 10 veces con respecto a la eficiencia del vector original que es 5 ± 4% [Alvarez-Maya et al., Soc. Neurosci. Abstr. 25, 67.7 (1999)]. La duración de la expresión de la GFP pudo ser evidenciada hasta por 1 mes en la rata.
B. Polifección de hepatocitos in vivo
Ratas Wistar machos de 200 a 220g son inyectadas por la vena iliaca con 1 ml del poliplex fusogénico-cariofílico lactosilado formado a la relación molar óptima basándose en el gel
de retardo (Fig. 17). Las ratas control son inyectadas con el mismo poliplex pero formado a relaciones inoperantes (relaciones superiores que favorecen la precipitación del poliplex). Los animales son sacrificados a diferentes tiempos. Para detectar la expresión de la proteína verde fluorescente, las ratas son perfundidas con PBS y paraformaldehido al 4% para obtener bloques de hígado de aproximadamente 1 cm3 que son seccionados a intervalos de 30 µm espesor. Los cortes hepáticos son contrateñidos con yoduro de propidio (2.5 µM) y montados en portaobjetos con medio protector de la fluorescencia (Vectashield, Vector Laboratories) para ser analizados por microscopía confocal. La fluorescencia es detectada con el objetivo de inmersión en aceite 60X utilizando longitudes de ondas de excitación/emisión de 488/522 nm (canal verde) y 568/585 nm (canal rojo). Diez a veinte cortes ópticos consecutivos de 1-µm se obtienen en la serie z. Las imágenes son proyectadas en un plano bidimensional y son sobrepuestas en la pantalla de un monitor para color utilizando el verde para GFP, y el rojo para el yoduro de propidio.
Los resultados demuestran que el acoplamiento de los péptidos fusogénico y cariof?lico al vector de lactosa produjo en forma consistente expresión de la GFP (Fig. 2 ID) en hepatocitos localizados en la triada porta (Figs. 21E y 21F) en ausencia de hepatectomía. En forma intermitente, también se observó expresión de GFP en hepatocitos de cordones perisinusoidales (dato no mostrado). La expresión se pudo demostrar hasta por 15 días (fín del estudio). Este hallazgo es de suma relevancia para la estrategia fusogénica-cariofílica debido a que en ausencia de hepatectomía parcial no se había podido polifectar el hígado in vivo [Wu et al., J. Biol. Chem. 264, 16985 (1989); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 14338 (1991); Chowdhury et al., J. Biol. Chem. 268, 11265 (1993)]. No se observó fluorescencia verde (Fig. 21 A) en cortes hepáticos (Figs. 2 IB y 21F) de las ratas controles.
En consecuencia, el poliplex fusogénico-cariofílico conduce a un incremento significativo en el porcentaje de la población celular blanco capaz de expresar fuertemente la proteína codificada en el DNA plasmídico transferido.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Representación diagramática de la estructura básica de un vector de transferencia génica mediada por receptor que comprende los componentes a), b) y c). cDNA = DNA plasmídico.
FIG. 2. Representación diagramática de la nueva generación de vectores de transferencia génica mediada por receptor que resulta de la adición de los componentes d) y e) al vector original. cDNA = DNA plasmídico.
FIG. 3. Representación diagramática de un corte de la célula que ilustra la función de cada componente del poliplex fiísogénico-cariofílico. La punta de la flecha corresponde al ligando (componente a); PF = péptido fusogénico (componente d); PC = péptido cariof?lico (componente e); la polilisina (componente b) está representada por los signos positivos en el cuerpo de la flecha y su función es unir el ligando y el péptido fiísogénico con el DNA plasmídico (componente c), representado por el círculo rojo de doble hebra; la vesícula amarilla representa el endosoma inducido por la activación del receptor; L = lisosoma.
FIG. 4. Purificación del conjugado SPDP-poli-L-lisina por cromatografía de exclusión molecular en Bio-gel P-6. Lecho de la resina, 1.5 X 6 cm. Fase móvil, PBS para cromatografía.
FIG. 5. Purificación del conjugado SH-SPDP-poli-L-lisina por cromatografía de exclusión molecular en Bio-gel P-6. Lecho de la resina, 1.5 X 6 cm. Fase móvil, PBS para cromatografía. La poli-L-lisina fue monitoreada a 215 nm, y la efectividad de la reducción del SPDP conjugado fue constatada por la presencia de la piridina-2-tiona a 343 nm y la ausencia del primer pico a 280 nm.
FIG. 6. Purificación del conjugado neurotensina-SPDP por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-10. Lecho de la resina, 1 X 22 cm. Fase móvil, PBS para cromatografía.
FIG. 7. Purificación del conjugado péptido fusogénico-SPDP por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-10. Lecho de la resina, 1 X 22 cm Fase móvil PBS para cromatografía.
FIG. 8. Purificación del conjugado neurotensina-SPDP- (péptido fi?sogénico-SPDP)-poli-L-lisina por cromatografía de exclusión molecular en Biogel A 1.5m. Lecho de la resina, 1.5 X 45 cm. Fase móvil, guanidina 2M en Hepes 0.01 M, pH 7.4. (A) Cromatograma completo; la efectividad de la reacción fue constatada por la presencia del grupo piridina-2-tiona a 343 nm. (B) Amplificación de la región del cromatograma correspondientes a las fracciones 27 a 47 para enfatizar el paralelismo de las curvas de la poli-L-lisina (215 nm) y del péptido fiísogénico (280 nm).
FIG. 9. Retardo de la migración electroforética del DNA por la unión electrostática del péptido cariof?lico. Los números sobre los carriles corresponden a las concentraciones (µM) del péptido cariofílico que fueron incubadas con una concertación constante (6 nM) del plásmido pGreen Lantern 1.
FIG. 10. Formación del poliplex fusogénico-cariof?lico de lactosa. Los números sobre los carriles indican las relaciones molares plásmido pGreen Lantern 1 (6 nM):péptido cariofílico (10 µM ):péptido fusogénico-SPDP-poli-L-lisina-lactosilda (24, 36, 48, 60 y 72 nM) a la que fueron formados los poliplexes. Vector = péptido fusogénico-SPDP-poli-L-lisina-lactosilda; NLS = péptido cariof?lico; DNA, plásmido pGreen Lantern 1.
FIG. 11. Purificación de la poli-L-lisina lactosilada por cromatografía de exclusión molecular en Bio-gel P-6. Lecho de la resina, 1.5 X 6 cm. Fase móvil, PBS para
cromatografía. La separación de la poli-L-lisina-lactosilada fue monitoreada a través del contenido de poli-L-lisina a 215 nm y del contenido de lactosa a 490 nm.
FIG. 12. Purificación del conjugado SPDP-poli-L-lisina lactosilada por exclusión molecular en Bio-gel P-6. Lecho de la resina, 1.5 X 6 cm. Fase móvil, PBS para cromatografía.
FIG. 13. Purificación del conjugado péptido ftisogénico-SPDP por exclusión molecular en Sephadex G-10. Lecho de la resina, 1 X 22 cm. Fase móvil, PBS para cromatografía.
FIG. 14. Purificación del conjugado péptido fusogénico-SPDP-SH por exclusión molecular en Sephadex G-10. Lecho de la resina, 1 X 22 cm. Fase móvil, PBS para cromatografía.
FIG. 15. Purificación del conjugado péptido fusogénico-SPDP-poli-L-lisina lactosilada por exclusión molecular en Biogel A 1.5m. Lecho de la resina, 1.5 X 45 cm. Fase móvil, guanidina 2M en Hepes 0.01 M, pH 7.4. (A) Cromatograma completo; la efectividad de la reacción fue constatada por la presencia del grupo piridina-2-tiona a 343 nm. (B) Amplificación de la región del cromatograma correspondientes a las fracciones 20 a 50 para enfatizar la concordia de las curvas de la poli-L-lisina (215 nm), de la lactosa (490 nm) y del péptido fusogénico (280 nm).
FIG. 16. Retardo de la migración electroforética del DNA por la unión electrostática del péptido cariofílico. Los números sobre los carriles corresponden a las concentraciones (µM) del péptido cariofílico que fueron incubadas con una concertación constante (6 nM) del plásmido pEGFP.
FIG. 17. Formación del poliplex fusogénico-cariofílico de lactosa. Los números sobre los carriles indican las relaciones molares plásmido pEGFP (6 nM):péptido cariofílico (4.2 µM):péptido fusogénico-SPDP-poli-L-lisina-lactosilda (36, 48, 60, 72 y 120 nM) a la que
fueron formados los poliplexes. Vector = péptido fusogénico-SPDP-poli-L-lisina-lactosilda; NLS = péptido cariof?lico; DNA, plásmido pEGFP.
FIG. 18. El acoplamiento de los péptidos fusogénico y cariofílico al vector de neurotensina incrementa su eficiencia de transfección. Se utilizó el plásmido pGreen Lantern 1 para la trasfección de las células NIE- 115. El panel A muestra la fluorescencia de GFP observada a 488/522 nm, Ex/Em. El panel B muestra la fluorescencia de las células contrateñidas con yoduro de propidio observada a 568/585 nm, Ex/Em. El panel C es la sobreposición de las imágenes de los paneles A y B. Todas las imágenes son proyecciones de las secciones horizontales en la serie-z. Amplificación 60X.
FIG. 19. El acoplamiento de los péptidos fiísogénico y cariof?lico al vector de lactosa incrementa su eficiencia de transfección. Se utilizó el plásmido pEGFP-Nl para la trasfección de las células C3A. Los paneles A, D y G muestran la fluorescencia de GFP observada a 488/522 nm, Ex/Em. Los paneles B, E y H muestran la fluorescencia de las células contrateñidas con yoduro de propidio observada a 568/585 nm, Ex/Em. Los paneles C, F e I son la sobreposición de las imágenes de los paneles respectivos. Los paneles A-C corresponden a células sin polifectar. Los paneles D-F corresponden a células polifectadas con el vector de lactosa. Los paneles G-I corresponden a células transfectadas con el poliplex fusogénico-cariofílico de lactosa. Todas las imágenes son proyecciones de las secciones horizontales en la serie-z. Amplificación 10X.
FIG. 20. El acoplamiento de los péptidos fiísogénico y cariofílico al vector de neurotensina incrementa su eficiencia de transferencia génica a neuronas dopaminérgicas in vivo. Se utilizó el plásmido pGreen Lantern 1. El panel A muestra la fluorescencia de GFP observada a 488/522 nm, Ex/Em. El panel B muestra la fluorescencia de las neuronas dopaminérgicas inmunoteñidas con rodamina observada a 568/585 nm, Ex Em. El panel C es la sobreposición de las imágenes de los paneles A y B. Todas las imágenes son proyecciones de las secciones horizontales en la serie-z. Las barras corresponden a 20 µm.
FIG. 21. El acoplamiento de los péptidos fiísogénico y cariof?lico al vector de lactosa incrementa su eficiencia de transferencia génica a hepatocitos in vivo. Se utilizó el plásmido pEGFP-Nl. Los paneles A y D muestran la fluorescencia de GFP observada a 488/522 nm, Ex/Em. Los paneles B y E muestran la contratinción de las células hepáticas con yoduro de propidio observada a 568/585 nm, Ex/Em. Los paneles C y F son la sobreposición de las imágenes de los paneles respectivos. Los paneles A-C corresponden a un corte representativo del hígado de rata control. Los paneles D-F corresponden a un corte representativo del hígado de rata transfectada con el poliplex fusogénico-cariofílico de lactosa. Todas las imágenes son proyecciones de las secciones horizontales en la serie-z. Amplificación 60X.
REFERENCIAS CITADAS
Alvarez-Maya I., Meraz-Rios M.A., Navarro-Quiroga I., Aceves J. and Martinez-Fong D.
(1999) In vivo transfection of dopaminergic neurons by targeted gene delivery. Soc. Neurosci. Abstr., 25, 67.7. Amar S., Kitabgi P. and Vincent, J.P. (1986) Activation of phosphatidylinositol turnover by neurotensin receptors in the human colonic adenocarcinoma cell line HT29. FEBS Lett.,
201, 31-36. Amar S., Kitabgi P. and Vincent J.P. (1987) Stimulation of inositol phosphate production by neurotensin in neuroblastoma NI El 15 cells: Implication of GTP-binding proteins and relationship with the cyclic GMP response. J. Neurochem., 49, 999-1006. Andersen J.K., Garber D.A., Meaney C.A. and Breakefield X.O. (1992) Gene transfer into mammalian central nervous system using hefes virus vectors: extended expression of bacterial lacZ in neurons using the neuron-specific enolase promoter. Hum. Gene Ther., 3, 487-499. Barkats M., Bilang-Bleuel A., Buc-Caron M.H., Castel-Barthe M.N., Corti O., Finiels F.,
Horellou P. Revah F. Sabate O. and Mallet J. (1998) Adenovirus in the brain: Recent advances of gene therapy for neurodegenerative diseases. Progress in Neurobiology, 55,
333-341. Barrett L.B., Logan A., Berry M., Ying W., González A.M., Baird A. and Seymour L.W.
Targeted transfection of neuronal cells using a poly(D-lysine)-cholera-toxin b chain conjúgate. Biochem. Soc. Trans. (1999) 27, 851-857. Boudin H., Pelaprat D., Rostene W. and Beaudet A. Cellular distribution of neurotensin receptors in rat brain: immunohistochemical study using an antipeptide antibody against the cloned high affinity receptor. J. Comp. Neurol. (1996) 373:76-89. Boudin H., Pelaprat D., Rostene W., Pickel V.M. and Beaudet A.
Correlative ultrastructural distribution of neurotensin receptor proteins and binding sites in the rat substantia nigra J. Neurosci. (1998) 18:8473-8484.
Bukrinsky M., Sharova N. and Stevenson M. (1993) Human immunodeficiency virus type
1 2-LTR circles reside in a nucleoprotein complex which is different from the preintegration complex. J. Virol., 67, 6863-6865. Bunnell B.A., Askari F.K. and Wilson J.M. (1992) Targeted delivery of antisense oligonucleotides by molecular conjugates. Somat. Cell Molec. Gen., 18, 559-569. Burger K.N., Wharton S.A., Demel R.A. and Verkleij A.J. (1991). Interaction of influenza virus hemagglutinin with a lipid monolayer. A comparison of the surface activities of intact virions, isolated hemagglutinins, and a synthetic fusión peptide. Biochemistry,
30, 11173-11180. Castel M.N., Beaudet A. and Laduron P.M. (1994) Retrograde axonal transport of neurotensin in rat nigrostriatal dopamine neurons, modulation during ageing and possible physiological role. Biochem. Pharmacol., 47, 53-62. Chan C.K. and Jans D.A. (1999) Enhancement of polylysine-mediated transferrinfection by nuclear localization sequences: poly lysine does not function as a nuclear localization sequence. Hum. Gene Ther., 10, 1695- 1702. Chavez A., Pujol M., Haro I., Alsina M.A. and Cajal Y. (2001) Membrane fusión by an
RGD-containing sequence from the core protein VP3 of hepatitis A virus and the RGA- analogue: implications for viral infection. Biopolymers, 58, 63-77. Chen J., Gamou S., Takayanagi A. and Shimizu N. A novel gene delivery system using EGF receptor-mediated endocytosis. FEBS Lett. (1994), 338, 167-169. Chen J., Kelz M.B., Zeng G., Sakai N., Steffen C, Shockett P.E., Picciotto M.R., Duman
R.S. and Nestler E.J. (1998) Transgenic animáis with inducible, targeted gene expression in brain. Mol. Pharmacol.,54, :495-503. Chowdhury N.R., Wu C.H., Wu G., Yerneni P.C., Bommineni V.R. and Chowdhury J.R. (1993) Fate of DNA targeted to the liver by asialoglycoprotein receptor-mediated endocytosis in vivo. J. Biol. Chem., 268, 11265-11271. Clague M.J. (1998) Molecular aspects of the endocytic pathway. Biochem. J., 336, 271- 282. Cresswell P. (1994) Assembly, Transport and Function of MHC class II molecules. Ann. Rev. Immunol., 12, 259-293.
Cristiano R.J., Smith L.C. and Woo S.L. (1993) Hepatic gene therapy: adenovirus enhancement of receptor-mediated gene delivery and expression in primary hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 2122-2126. Curiel D.T. (1993) Adenovirus facilitation of molecular conjugate-mediated gene transfer. Pro. Med. Virol., 40, 1-18. Drucker-Colin R., Verdugo-Diaz L., Morgado- Valle C, Solis-Maldonado G., Ondarza R., Boíl C, Miranda G., Wang G.J. and Volkow N. (1999) Transplant of cultured neuron- like differentiated chromaf in cells in a Parkinson's disease patient. A preliminary report. Arch. Med. Res., 30, 33-39. Faure M.N., Alonso A., Nouel D., Gaudriault G., Dennis M., Vincent J.P. and Beaudet A. (1995) Somatodendritic internalization and perinuclear targeting of neurotensin in the mammalian brain. J. Neurosci., 15, 4140-4147. Felgner P.L., Barenholz Y., Behr J.P., Cheng S.H., Cullis P., Huang L., Jessee J.A., Seymour L., Szoka F., Thierry A.R., Wagner E. and Wu G. (1997) Nomenclature for synthetic gene delivery systems. Hum. Gene Ther., 8, 511-512. Frederiksen K.S., Abrahamsen N., Cristiano R.J., Damstrup L. and Poulsen H.S. (2000) Gene delivery by an epidermal growth factor/DNA polyplex to small cell lung cáncer cell lines expressing low levéis of epidermal growth factor receptor. Cáncer Gene Ther., 7, 262-268. Germain R.N., Castelino F., Han R.E., Sousa C.R., Romagnoli P., Sadegh Nasseri S. and Zhong G.M. (1996) Processing and presentation of endocytically acquired protein antigens by MHC class I and class II molecules. Immunol. Rev., 151, 5-30. Hashida M., Takemura S., Nishikawa M. and Takakura Y. (1998) Targeted delivery of plasmid DNA complexed with galactosylated poly(L-lysine). J. Control Reléase, 53, 301-310. Heinzinger N.K., Bukinsky M.I., Haggerty S.A., Ragland A.M., Kewalramani V., Lee M.A., Gendelman H.E., Ratner L., Stevenson M. and Emerman M. (1994) The Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1 influences nuclear localization of viral nucleic acids in nondividing host cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 7311-7315.
Ishiguro R., Matsumoto M. and Takahashi S. (1996) Interaction of fusogenic synthetic peptide with phospholipid bilayers: orientation of the peptide alpha-helix and binding isotherm. Biochemistry, 35, 4976-4983. Ishii N., Nakanishi A., Yamada M., Macalalad M.H. and Kasamatsu H. (1994) Functional complementation of nuclear targeting-defective mutants of simian virus 40 structural proteins. J. Virol., 68, 8209-8216. Ishii N., Minami N., Chen E.Y., Medina A.L., Chico M.M. and Kasamatsu H. (1996)
Analysis of a nuclear localization signal of simian virus 40 major capsid protein Vpl. J.
Virol., 70, 1317-1322. Kitabgi P. (1989) Neurotensin modulates dopamine neurotransmission at several levéis along brain dopamine pathways. Neurochem. Int., 14, 111-119. Kitten O., Cosset F.L. and Ferry N. (1997) Highly efficient retrovirus-mediated gene transfer into rat hepatocytes in vivo. Hum. Gene Ther., 8, 1491-1494. Knight A., Carvajal J., Schneider H., Coutelle C, Chamberlain S. and Fairweather N. (1999) Non- viral neuronal gene delivery mediated by the HC fragment of tetanus toxin.
Eur. J. Biochem. 259, 762-769. Kollen W.J., Mulberg A.E., Wei X., Sugita M., Raghuram V., Wang J., Foskett J.K., Glick
M.C. and Scanlin T.F. (1999) High-efficiency transfer of cystic-fibrosis transmembrane conductance regulator DNA plasmídico into cystic-fibrosis airway cells in culture using lactosylated polylysine as a vector. Hum. Gene Ther., 10, 615-622. Kono K., Nishii H. and Takagishi T. (1993) Fusión activity of an amphiphilic polypeptide having acidic amino acid residues: generation of fusión activity by alpha-helix formation and charge neutralization. Biochim. Biophys. Acta , 1164, 81-90. Kretchmer M. (1972) Lactose and Lactase. Sci. Am. 227, 74-78. Kwoh D.Y., Coffin C.C., Lollo C.P., Jovenal J., Banaszczyk M.G., Mullen P., Phillips A.,
Amini A., Fabrycki J., Bartholomew R.M., Brostoff S.W. and Cario D.J. (1999)
Stabilization of poly-L-lysine/DNA polyplexes for in vivo gene delivery to the liver.
Biochim. Biophys. Acta, 1444, 171-190. Lanzavecchia A. (1996) Mechanisms of antigen uptake for presentation. Curr. Opin. Immunol., 8, 348-354.
Laurent N., Wattiaux-De Coninck S., Mihaylova E., Leontieva E., Warnier-Pirotte M.T.,
Wattiaux R. and Jadot M. (1999) Uptake by rat liver and intracellular fate of plasmid
DNA complexed with poly-L-lysine or poly-D-lysine. FEBS Lett., 443, 61-65. Lear J.D. and Degrado W.F. (1987) Membrane binding and conformational properties of peptides representing the NH2 terminus of influenza HA-2. J. Biol. Chem., 262, 6500- 6505. Madrazo I., Franco-Bourland R., Aguilera M., Ostrosky-Solis F., Cuevas C, Castrejon H.,
Magallon E. and Madrazo M. (1991) Development of human neural transplantation.
Neurosurgery, 29,165-176; discussion 176-177. Review. Martinez-Fong D., Mullersman J.E., Purchio A.F., Armendariz-Borunda J. and Martinez- Hernandez A. (1994) Nonenzymatic glycosylation of poly-L-lysine: a new tool for targeted gene delivery. Hepatology, 20, 1602-1608. Martinez-Fong D., Navarro-Quiroga L, Ochoa I., Alvarez-Maya I., Meraz M.A., Luna J. and Arias-Montano J.A. (1999) Neurotensin-SPDP-poly-L-lysine conjúgate: a nonviral vector for targeted gene delivery to neural cells. Mol. Brain Res., 69, 249-262. Martinez-Fong D. and Navarro-Quiroga I. (2000) Synthesis of a non-viral vector for gene transfer via the high-affinity neurotensin receptor. Brain Res. Prot., 6, 13-24. Méndez M., Souaze F., Nagano M., Kelly P.A., Rostene W. and Forgez P. (1997) High affinity neurotensin receptor mRNA distribution in rat brain and peripheral tissues. Analysis by quantitative RT-PCR. J. Mol. Neurosci., 9, 93- 102. Midoux P., Mendes C, Legrand A., Raimond J., Mayer R., Monsigny M. and Roche A.C.
(1993) Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-L-lysine into hepatoma cells, Nucleic Acids Res., 21, 871-878. Midoux P. and Monsigny M. (1999) Efficient gene transfer by histidylated polylysine/pDNA complexes. Bioconjug. Chem., 10, 406-411. Naldini L., Blómer U., Gallay P., Ory D., Mulligan R., Gage F.H., Verma I.M., and Trono
D. (1996) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science, 272, 263-267.
Navarro V, Millecamps S., Geoffroy M.C., Robert J.J., Valin A., Mallet J. and Gal La Salle
G.L. (1999) Efficient gene transfer and long-term expression in neurons using a recombinant adenovirus with a neuron-specific promoter. Gene Ther., 6, 1884-1892. Nishikawa M., Takemura S., Yamashita F., Takakura Y., Meijer D.K., Hashida M. and Swart P.J. (2000) Pharmacokinetics and in vivo gene transfer of plasmid DNA complexed with mannosylated poly(L-lysine) in mice. J. Drug Target 8, 29-38. Nouel D., Faure M.P., St Pierre J.A., Alonso R., Quirion R. and Beaudet A. (1997)
Differential binding profile and internalization process of neurotensin via neuronal and glial receptors. J. Neurosci., 17, 1795-1803. Oh S.H., Kim S.H., Kim H.W. and Kim Y.J. (1999) An efficient retrovirus-mediated transduction of human blood coagulation factor VIII DNA plasmídico in regenerating rat liver. Ann. Hematol., 78(5), 213-218. Paterna J.C., Moccetti T., Mura A., Feldon J. and Bueler H. (2000) Influence of promoter and WHV post-transcriptional regulatory element on AAV-mediated transgene expression in the rat brain. Gene Ther. , 7, 1304- 1311. Puyal C, Maurin L., Miquel G., Bienvenue A,. Philippot J. (1994) Design of a short membrane-destabilizing peptide covalently bound to liposomes. Biochim. Biophys.
Acta, 1195, 259-266. Rapaport D., Hague G.R., Pouny Y. and Shai Y. (1993) pH- and ionic strength-dependent fusión of phospholipid vesicles induced by pardaxin analogues or by mixtures of charge-reversed peptides. Biochemistry, 32, 3291-3297. Reinecke M. (1985) Neurotensin. Immunohistochemical localization in central and peripheral nervous system and in endocrine cells and its functional role as neurotransmitter and endocrine hormone. Prog. Histochem. Cytochem., 16, 1-172. Rostene W.H., Mazella J., Dussaillant M. and Vincent J.P. Photoaffinity labeling of neurotensin binding sites on rat brain sections. Eur. J. Pharmacol. (1986) 30:337-340. Skehel J.J., and Waterfield M.D. (1975) Studies on the primary structure of the influenza virus hemagglutinin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 93-97. Toncheva V., Wolfert M.A., Dash P.R., Oupicky D., Ulbrich K., Seymour L.W. and Schacht E.H. (1998) Novel vectors for gene delivery formed by self-assembly of DNA
with poly(L-lysine) grafted with hydrophilic polymers. Biochim. Biophys. Acta, 1380,
354-368. Wagner E., Plank C, Zatloukal K., Cotten M. and Birnstiel M.L. (1992) Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferrin-polylysine-DNA complexes: toward a synthetic virus-like gene-transfer vehicle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 7934-7938. Wagner E., Zatloukal K., Cotton M., Kirlappos H., Mechtler K., Curiel D.T. and Birnstiel
M.L. (1992) Coupling of adenovirus to transferrin-polylysine/DNA complexes greatly enhances receptor-mediated gene delivery and expression of transfected genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 6099-6103. Wang Y., Yu L. And Geller A.I. (1999) Diverse stabilities of expression in the rat brain from different cellular promoters in a helper virus-free herpes simplex virus type 1 vector system. Hum. Gene Ther., 10, 1763-1771. Wilson J.M., Grossman M., Wu C.H., Chowdhury N,R., Wu G.Y. and Chowdhury J.R. (1992) Hepatocyte-directed gene transfer in vivo leads to transient improvement of hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor-deficient rabbits. J. Biol.
Chem., 267, 963-967. Wu G.Y. and Wu C.H. (1988) Evidence for targeted gene delivery to Hep G2 hepatoma cells in vitro. Biochem., 27, 887-892. Wu G.Y. and Wu C.H. (1988) Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo. J.
Biol. Chem., 263, 14621-14624. Wu C.H., Wilson J.M. and Wu G.Y. (1989) Targeting genes: delivery and persistent expression of a foreign gene driven by mammalian regulatory elements in vivo. J. Biol.
Chem., 264, 16985-16987. Wu G.Y., Wilson J.M., Shalaby F., Grossman M., Shafritz D.A. and Wu C.H. (1991)
Receptor-mediated gene delivery in vivo. Partial correction of genetic analbuminemia in
Nagase rats. J. Biol. Chem., 266, 14338-14342. Wu G.Y. and Wu C.H. (1991) Targeted delivery and expression of foreign genes in hepatocytes. Targeted Diagn. Ther., 4, 127-149.
Zanta M.A., Boussif O., Adib A. and Behr J.P. (1997) In vitro gene delivery to hepatocytes with galactosylated polyethylenimine. Bioconjug. Chem., 8, 839-844. Zanta M.A., Belguise-Valladier P. and Behr J.P. (1999). Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 96, 91-96. Zhang L. and Ghosh H.P. (1994) Characterization of the putative fusogenic domain in vesicular stomatitis virus glycoprotein G. J. Virol., 68, 2186-2193. Ziady A.G., Ferkol T., Dawson D.V., Perlmutter D.H. and Davis P.B. (1999) Chain length of the polylysine in receptor-targeted gene transfer complexes affects duration of repórter gene expression both in vitro and in vivo. J. Biol. Chem., 274, 4908-4916.
Claims (12)
1. Un vector fusogénico-cariof?lico capaz de transferir DNA plasmídicos a células de mamífero, para lo cual debe de poseer las siguientes características: a) Activar el proceso de endocitosis mediado por receptor mediante la utilización del ligando específíco para dicho receptor, con la finalidad de efectuar la entrada del DNA plasmídico en la población celular blanco. b) Favorecer el escape del DNA plasmídico desde el interior del compartimiento endosomal al citoplasma de la célula blanco mediante la utilización de un péptido fusogénico. c) Asistir el traslado del DNA plasmídico al núcleo celular mediante la integración de una señal de direccionamiento nuclear, el cual se refiere como péptido cariofílico.
2. Un vector fusogénico-cariof?lico de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por contener los siguientes elementos según el orden siguiente: a) Un ligando acoplado químicamente a la polilisina, el cual se utilizarán como inductor del proceso de endocitosis al activar su receptor específico, operacionalmente relacionado a; b) Al menos un péptido fusogénico acoplado químicamente a la polilisina, el cual favorecerá la transferencia del DNA plasmídico desde el compartimiento endosomal al citoplasma, y estará operacionalmente relacionada a; c) Una polilisina en su forma isomérica L o D y de diferente tamaño molecular a la cual estarán acoplados químicamente el ligando y el péptido fusogénico, y la cual unirá electrostáticamente al DNA plasmídico, y estará operacionalmente relacionada a; d) Al menos un péptido cariofílico o señal de direccionamiento nuclear, el cual se unirá electrostáticamente al DNA plasmídico y el cual asistirá el traslado de dicho DNA plasmídico desde el citoplasma al núcleo de la célula.
3. El péptido fusogénico de 22 aminoácidos de largo del extremo amino terminal de la hemaglutinina HA2 del virus de la influenza modificado por la adición de cuando menos tres lisinas en el extremo carboxílico, de acuerdo con las reclamaciones l.b) y 2.b), donde se diga péptido fusogénico está representado por la siguiente secuencia de aminoácidos: GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCAKKK.
4. El uso del péptido de 19 aminoácidos de largo (MAPTKRKGSCPGAAPNKPK) mutante de la señal de direccionamiento nuclear de Vpl, principal componente de la cápside del virus del simio SV40, para conferir determinante cariofílico al DNA plasmídico de acuerdo con las reclamaciones l.c) y 2.d) .
5. El procedimiento para obtener el vector fusogénico de neurotensina, donde se mencione vector fusogénico de neurotensina se refiere al conjugado que resulta de acoplar simultáneamente la neurotensina y el péptido fusogénico con la poli-L-lisina.
6. El procedimiento para purificar el vector fusogénico de neurotensina.
7. El procedimiento para obtener el vector fusogénico de lactosa, donde se mencione fusogénico de lactosa se refiere al conjugado que resulta de acoplar un péptido fiísogénico a la poli-L-lisina lactosilada.
8. El procedimiento para purificar el vector fusogénico de lactosa.
9. El procedimiento para unir electrostáticamente el péptido cariofílico al DNA plasmídico a la relación molar óptima (DNA plasmídico-péptido cariof?lico) con el fín de añadir secuencias de direccionamiento nuclear al DNA plasmídico.
10. El procedimiento para obtener el vector fusogénico-cariofílico funcional, el cual resulta de la unión electrostática a la relación molar óptima del DNA plasmídico-péptido cariofílico con el vector fusogénico de neurotensina o de lactosa.
11. El procedimiento para usar los vectores fusogénicos-cariofílicos de neurotensina y de lactosa en la transferencia génica in vitro.
12. El procedimiento para usar los vectores fusogénicos-cariof?licos de neurotensina y de lactosa en la transferencia génica in vivo.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
MXPA01001256 MXPA01001256A (es) | 2001-02-02 | 2001-02-02 | Vector fusogenico y cariofilico para transferencias genicas mediadas por receptor y usos consecuentes. . |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
MXPA01001256 MXPA01001256A (es) | 2001-02-02 | 2001-02-02 | Vector fusogenico y cariofilico para transferencias genicas mediadas por receptor y usos consecuentes. . |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
MXPA01001256A true MXPA01001256A (es) | 2003-04-08 |
Family
ID=33129096
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
MXPA01001256 MXPA01001256A (es) | 2001-02-02 | 2001-02-02 | Vector fusogenico y cariofilico para transferencias genicas mediadas por receptor y usos consecuentes. . |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
MX (1) | MXPA01001256A (es) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012107908A3 (en) * | 2011-02-10 | 2012-12-27 | Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional | Nts-polyplex nanoparticles system for gene therapy of cancer |
-
2001
- 2001-02-02 MX MXPA01001256 patent/MXPA01001256A/es active IP Right Grant
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012107908A3 (en) * | 2011-02-10 | 2012-12-27 | Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional | Nts-polyplex nanoparticles system for gene therapy of cancer |
CN103458931A (zh) * | 2011-02-10 | 2013-12-18 | 国立理工学院高级研究中心 | 用于癌症的基因疗法的nts-多聚复合纳米颗粒系统 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Varkouhi et al. | Endosomal escape pathways for delivery of biologicals | |
Boeckle et al. | Melittin analogs with high lytic activity at endosomal pH enhance transfection with purified targeted PEI polyplexes | |
Pichon et al. | Histidine-rich peptides and polymers for nucleic acids delivery | |
Peeler et al. | pH-sensitive polymer micelles provide selective and potentiated lytic capacity to venom peptides for effective intracellular delivery | |
Plank et al. | The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. | |
Erbacher et al. | Glycosylated polylysine/DNA complexes: gene transfer efficiency in relation with the size and the sugar substitution level of glycosylated polylysines and with the plasmid size | |
Simões et al. | Gene delivery by negatively charged ternary complexes of DNA, cationic liposomes and transferrin or fusigenic peptides | |
US5916803A (en) | Target cell-specific non-viral vectors for inserting genes into cells, pharmaceutical compositions comprising such vectors and their use | |
Plank et al. | Gene transfer into hepatocytes using asialoglycoprotein receptor mediated endocytosis of DNA complexed with an artificial tetra-antennary galactose ligand | |
Park et al. | Degradable polyethylenimine-alt-poly (ethylene glycol) copolymers as novel gene carriers | |
Pack et al. | Design and development of polymers for gene delivery | |
Boeckle et al. | Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems | |
Midoux et al. | Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-L-lysine into hepatoma cells | |
Trentin et al. | Non-viral gene delivery for local and controlled DNA release | |
Cook et al. | Galactosylated polyethylenimine-graft-poly (vinyl pyrrolidone) as a hepatocyte-targeting gene carrier | |
CA2192687C (en) | Use of a bacterial component to enhance targeted delivery of polynucleotides to cells | |
He et al. | Combinatorial optimization of sequence-defined oligo (ethanamino) amides for folate receptor-targeted pDNA and siRNA delivery | |
Dhande et al. | N-acetylgalactosamine block-co-polycations form stable polyplexes with plasmids and promote liver-targeted delivery | |
FR2719316A1 (fr) | Nouveaux complexes d'acide nucléique et de polymère, leur procédé de préparation et leur utilisation pour la transfection de cellules. | |
Frese Jr et al. | Targeting of genes to the liver with glycoprotein carriers | |
Berthold et al. | Cellular delivery and antisense effects of peptide nucleic acid conjugated to polyethyleneimine via disulfide linkers | |
Yu et al. | Bioresponsive polymers for nonviral gene delivery | |
Morys et al. | EGFR targeting and shielding of pDNA lipopolyplexes via bivalent attachment of a sequence‐defined PEG agent | |
Fabre et al. | Synthetic peptides as non-viral DNA vectors | |
Kim et al. | Galactosylation of chitosan-graft-spermine as a gene carrier for hepatocyte targeting in vitro and in vivo |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG | Grant or registration |