MXPA01001088A

MXPA01001088A - Antigenos de chlamydia y los correspondientes fragmentos de adn y usos de los mismos.

Info

Publication number: MXPA01001088A
Application number: MXPA01001088A
Authority: MX
Inventors: Andrew D Murdin
Original assignee: Connaught Lab
Priority date: 1998-07-27
Filing date: 1999-07-27
Publication date: 2002-06-04
Also published as: AU4793099A; WO2000006740A1; US20030147924A1; CA2336708A1; JP2002524034A; EP1100918A1

Abstract

Como resumen de esta exposicion, la presente invencion proporciona un metodo de inmunizacion de un hospedero con acido nucleico, incluyendo al ADN, donde el hospedero incluye humanos, y la inmunizacion se hace contra enfermedades producidas por la infeccion con una cepa de Ch1amydia, especificamente C. pneunomiae, empleando un vector que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido CPN100149 de una cepa de Ch1amydia pneumoniae y un promotor para efectuar la expresion del polipeptido CPN100149 en el hospedero. Son posibles modificaciones dentro del alcance de esta invencion.

Description

ANTIGENOS DE CHLAMYDIA Y LOS CORRESPONDIENTES FRAGMENTOS DE ADN Y USOS DE LOS MISMOS SOLICITUD RELACIONADA DE LOS ESTADOS UNIDOS 5 La presente solicitud de patente reivindica la prioridad para la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos No. 60/094,191, presentada el 27 de julio de 1998.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con antígenos de Chlamydia y con las correspondientes moléculas de ADN que ¡pueden utilizarse en métodos para evitar y tratar enfermedades provocadas por infección con Chlamydia en mamíferos, como por ejemplo, en humanos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia Chlamydiae es procariota. Exhiben similitudes formológicas y estructurales con las bacterias gram- negativas, que incluyen una membrana externa trilaminar, que contiene lipopolisacárido y varias proteínas de membrana. La familia Chlamydiae se diferencia de otras bacterias gracias a su morfología y a un ciclo de desarrollo único. Son parásitos intracelulares obligados con Ln único ciclo de vida bifásico que consiste de una etapa extracelular metabólicamente inactiva, pero infecciosa y una etapa intracelular replicante, aunque no infecciosa. La etapa replicativa del ciclo de vida ocurre dentro de una inclusión ligada a la membrana que secuestra 5 la bacteria en alejamiento del citoplasma de la célula hospedera infectada. Debido a que la familia Chlamydiae es de tamaño pequeño y se multiplica solamente dentro de las células susceptibles, durante mucho tiempo se pensó que eran virus. 10 Sin embargo, tienen muchas características comunes con otras bacterias: (1) contienen tanto ADN como ARN, (2) se dividen por fisión binaria, (3) sus envolventes celulares se peirecen a las de otras bacterias gram-negativas, (4) contienen ribosomas similares a los de otras bacterias y 15 (5) son susceptibles a varios antibióticos. La familia Chlamydiae puede observarse al microscopio óptico y el genoma es de aproximadamente 1 tercio del tamaño del genoma de la Escherichia coli . De pájaros, el hombre y otros mamíferos se han 20 aislado muchas diferentes cepas de Chlamydiae y estas cepas pueden distinguirse sobre la base de la gama del hospedero, la virulencia, la patogénesis y la composición antigénica. Existe una fuerte homología del ADN dentro de cada especie, aunque en forma sorprendente, poca homología entre 25 especies, lo que sugiere una añeja separación evolutiva. |^¿^&^ t &u Í t La C. trachomatis tiene un elevado grado de especificidad por el hospedero, está casi totalmente limitada al hombre; provoca infecciones oculares y genitourinarias de gravedad muy variable. Por contraste, las cepas C. psi ttaci son raras en los seres humanos, aunque se encuentran en una amplia gama de pájaros y también en mamíferos silvestres, domésticos y de laboratorio en donde se multiplican en las células de muchos órganos . La C. pneumoniae es un patógeno humano común, descrito originalmente como la cepa TWAR de C. psi ttaci , aunque posteriormente reconocida como una nueva especie. La C. pneumoniae es antigénica, genética y morfológicamente distinta de otras especies de Chlamydia ( C. trachomatis, C. pecorum y C. psi ttaci ) . Muestra 10% o menos de homología en la secuencia de ADN con cualquiera de C. trachomatis o C. psi ttaci y hasta la fecha parece consistir solamente de una sola cepa, la TWAR. La C. pneumoniae es una causa común de la neumonía adquirida en la comunidad, sólo menos frecuente que Streptococcus pneumoniae y Mycoplasma pneumoniae . Grayston et al . , J. Infect . Dis . 168 : 1231 (1995); Campos et a l . , Invest . Ophtalmol . Vis . Sci . 36 : 1477 (1995), incorporadas cada una en la presente como referencia. También puede provocar síntomas en el tracto respiratorio superior y enfermedades que incluyen la bronquitis y la sinusitis. Véase, por ejemplo, Grayston et al . , J. Infect . Dis . 168 : 1231 (1995); Campos et al . , Invest . Ophtalmol . Vis . Sci . 36 : 1477 (1995), Grayston et al . , J. Infect . Dis . 161 : 618 (1990); Marrie, Clin . Infect . Dis . 18 : 501 (1993). La gran mayoría de la población adulta (más del 60%) tiene anticuerpos contra C. pneumoniae (Wang et al . , Chamidial Infections, Cambridge University Press, Cambridge, p. 329 (1986) ) , que indican una pasada infección que no fue reconocida o que fue asintomática. La infección por C. pneumoniae se presenta normalmente como una enfermedad respiratoria aguda (es decir, tos, dolor de garganta, ronquera y fiebre; sonidos anormales del pecho escuchados en la auscultación) . Para la mayoría de los pacientes, la tos persiste de 2 a 6 semanas y la recuperación es lenta. Aproximadamente en el 10% de estos casos, a la infección del tracto respiratorio superior le sigue la bronquitis o la neumonía. Además, durante una epidemia por C. pneumoniae, en aproximadamente la mitad de estos pacientes de neumonía se ha observado la posterior co-infección con pneumococos, particularmente en la población débil y de ancianos. Según se indicó anteriormente, hay más y más evidencias de que la infección con C. pneumoniae también está ligada a otras enfermedades diferentes a las infecciones respiratorias.

El receptor del organismo es, presumiblemente, el ser humano. Por contraste con las infecciones por C. psi ttaci , no existe ninguna ave o animal conocido que sea receptor. La transmisión no se ha definido con claridad. Puede resultar del contacto directo con secreciones de hormigas, o de la propagación por el aire. Hay un largo periodo de incubación, que puede durar muchos meses. Con base en el análisis de las epidemias, la C. pneumoniae parece propagarse lentamente a través de una población (promediando un intervalo de caso a caso de 30 días) , debido a que las personas infectadas son transmisores ineficaces del organismo. La susceptibilidad a la C. pneumoniae es universal. Las reinfecciones ocurren durante la vida adulta, después de la infección primaria que se presenta durante la niñez. La C. pneumoniae parece ser una enfermedad endémica en todo el mundo, notable por los intervalos sobrepuestos de aumento en la incidencia (epidemias) que persisten durante 2 ó 3 años. La infección por C. trachomatis no confiere inmunidad cruzada contra la C. pneumoniae . Las infecciones se tratan fácilmente con antibióticos orales, tetraciclina o eritromicina (2 g/día, durante por lo menos 10 a 14 días) . Un fármaco recientemente desarrollado, la azitromicina, es muy efectivo como una terapia de una sola dosis contra las infecciones clamidiales.

En la mayoría de los casos, la infección por C. pneumoniae es moderada y sin complicaciones y hasta el 90% de las infecciones son subagudas o no se reconocieron. Entre los niños de países industrializados, se ha pensado que las infecciones son raras hasta la edad de 5 años, aunque un estudio reciente ha reportado que muchos niños en este grupo de edad muestran evidencia de infección por PCR, a peear de ser seronegativos y estiman una prevalencia de 17 a 19% de los 2 a los 4 años de edad. Véase, Normann et al . , Acta Paediatrica, 87 : 23-27 (1998). En los países en vías de desarrollo, la seroprevalencia de los anticuerpos de C. pneumoniae entre los niños menores es elevada y existe la sospecha de que la C. pneumoniae pueda ser una causa importante de enfermedad aguda en el tracto respiratorio inferior y de la mortalidad de infantes y niños en las regiones tropicales del mundo. A partir de los estudios de seroprevalencia y de los estudios de las epidemias locales, la infección por C. pneumoniae inicial ocurre normalmente entre las edades de 5 y 20 años. Por ejemplo, en los Estados Unidos, se estima que hay 30,000 casos de neumonía infantil anualmente, provocados por C. pneumoniae . Las infecciones pueden agruparse entre grupos de niños o adultos jóvenes (por ejemplo, los alumnos de una escuela o los conscriptos militares) .

La C. pneumoniae provoca del 10 al 25% de las infecciones en el tracto respiratorio inferior adquiridas en ] a comunidad (según reportes de Suecia, Italia, Finlandia y los Estados Unidos) . Durante una epidemia, la infección por C. pneumoniae puede sumar del 50 a 60% de los casos de neumonía. Durante estos periodos, también se han reportado más episodios de infecciones combinadas con S . pneumoniae . La reinfección durante la vida adulta es común; la presentación clínica tiende a ser más moderada. Sobre la base de los estudios de seroprevalencia en la población, hay tendencia a un aumento en la exposición con la edad, lo que es particularmente evidente entre los hombres. Algunas investigadores han especulado que es común un persistente estado de infección por C. pneumoniae asintomático. En los adultos de edad media o mayores, la infección por C. pneumoniae puede progresar a bronquitis crónica y sinusitis. Un estudio en los Estados Unidos reveló que la incidencia de neumonía, provocada por C. pneumoniae en personas menores a los 60 años es de 1 caso por :.,000 personas por año; aunque en los ancianos, la incidencia de la enfermedad se triplicó. La infección por C. preumoniae raramente conduce a la hospitalización, con excepción de pacientes con una enfermedad subyacente. De considerable importancia es la asociación de aterosclerosis e infección por C. pneumoniae. Existen varios estudios epidemiológicos que muestran una correlación de las infecciones previas con C. pneumoniae y ataques cardiacos, enfermedad de la arteria coronaria y de la arteria carótida. Véase, Saikku et al., Lancet 2: 983 (1988); Thom et al., JAMA 268: 68 (1992); Linnanmaki et al., Circulation 81: 1030 (1993); Saikku et al., Annals Int. Med. 116: 273 (1992); Melnick et al., Am. J. Med. 95: 499 (1993) . Además, los organismos han sido detectados en los ateromas y en las estrías grasas de las arterias coronaria, carótida, periféricas y la aorta. Véase, Shor et al., South African Med. J. 82: 158 (1992); Kuo et al., J. Infect. Dis. 167: 841 (1993); Kuo et al., Arteriesclerosis and Thrombosis 13: 1500 (1993); Campbell et al., J. Infect. Dis. 172: 585 (1995); Chiu, et al., Circulation 96: 2144-2148 (1997) . Se ha recuperado C. pneumoniae viable de las arterias coronaria y carótida. Ramírez et al., Annals Int. Med. 125: 979 (1996); Jackson et al., Abst. K121, p272, 36th ICAAC, New Orleans (1996). Además, se ha mostrado que la C. pneumoniae puede inducir cambios de aterosclerosis en un modelo de conejo. Véase, Fong et al., (1997) Journal of Clinical Microbiology 35: 48. Considerados juntos, estos resultados indican que es muy probable que la C. pneumoniae pueda provocar aterosclerosis en humanos, aunque la importancia epidemiológica de la aterosclerosis clamidial continúa esperando ser demostrada. Varios estudios recientes también han indicado una asociación entre infección por C. pneumoniae y asma. La infección ha estado ligada a jadeos, bronquitis asmática, asma de inicio en adultos y la exacerbación aguda del asma en adultos y estudios de escala pequeña han mostrado que el prolongado tratamiento con antibióticos fue efectivo para reducir en gran medida la severidad de la enfermedad en algunos individuos. Hahn et al . , Ann Allergy Asthma Immunol . 80 : 45-49 (1998); Hahn et al . , Epide iol Infect . 117 : 513-517 (1996); Bjornson et al . , Scand J Infect Dis . 28 : 63-69 (1996); Hahn, J". Fam . Pract . 41 : 345-351 (1995); Allegra et al . , Eur. Respir. J. 7 : 2165-2168 (1994); Hahn, et al . , JAMA 266 : 225-230 (1991). A la luz de estos resultados, una vacuna protectora contra la enfermedad provocada por infección con C. p??eu-7i?OÍae sería de importancia considerable. Aún no hay una vacuna efectiva para la infección por C. pneumoniae humana. No obstante; los estudios con C. trachomatis y C. psi ttaci indican que ésta es una meta alcanzable. Por ejemplo, los ratones que se han recuperado de una infección pulmonar con C. trachomatis se protegieron contra la infertilidad inducida por una posterior inoculación vaginal. Pal et al . , Infection and Immuni ty 64 : 5341 (1996) . De manera similar, borregos inmunizados con C. psi ttaci inactivada se protegieron contra posteriores abortos y partos con producto muerto inducidos por chlamydia. Jones et al . , Vaccine 13 : 715 (1995) . La protección contra infecciones clamidiales ya estado asociada a las respuestas inmunitarias con Thl , particularmente a la inducción de células CD4+T que producen INF?. Igietsemes et al . , Immunology 5 : 317 (1993) . La transferencia adoptiva de líneas celulares CD4+ o de clones hacia ratones desnudos o SCID confirió protección contra la inoculación o enfermedad crónica despejada (Igietseme et al . , Regional Immunology 5 : 317 (1993); Magee et al . , Regional Immunology 5 : 305 (1993)), y en el agotamiento in vivo de células CD4+T exacerbó la enfermedad en forma posterior a la inoculación (Landers et al . , Infection & Immuni ty 59 : 3774 (1991); Magee et al . , Infection & Immuni ty 63 : 516 (1995)) . Sin embargo, la presencia de títulos suficientemente elevados de anticuerpos de neutralización en las superficies mucosales también pueden ejercer un efecto protector. Cotter et al . , Infection and Immuni ty 63 : 4704 (1995). El grado de variación antigénica dentro de las especies de C. pneumoniae no está bien caracterizado. Las serovars de C. trachomatis están definidas sobre la base de la variación antigénica en las proteínas principales de la membrana externa (MOMP, por sus siglas en inglés) , aunque las secuencias de genes MOMP de C. pneumoniae publicadas no muestran variación entre diversos aislados del organismo. Véase, Campbell et al., Infection and Immunity 58: 93 (1990); McCafferty et al., Infection and Immunity 63: 2381-9 (1995); Knudsen et al., Third Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna (1996) . Las regiones de la proteína que se sabe serán conservadas en otras MOMP clamidiales se conservan en C. pneumoniae. Véase, Campbell et al., Infection and Immunity 58: 93 (1990); McCafferty et al., Infection and Immunity 63: 2387- 9 (1995) . Un estudio ha descrito una cepa de C. pneumoniae con MOMP de mayor peso molecular que el normal, aunque el gen de ésta no ha sido secuenciado. Grayston et al., J. Infect. Dis. 168: 1231 (1995) . También se encontró que las secuencias parciales de la proteína de membrana externa 2 de nueve diversos aislados no variaba. Ramírez et al., Annals Int. Med. 125: 979 (1996) . Los genes de HSP60 y HSP70 muestran poca variación de otras especies clamidiales, como se esperaría. El gen que codifica para un artígeno de 76 kDa se ha clonado a partir de una sola cepa de C. pneumoniae. No tiene similitud significativa con otros genes clamidiales conocidos. Marrie, Clin. Infect. Dis. 18: 501 (1993) . Muchos antígenos reconocidos por los sueros inmunes a C. pneumoniae se conservaron a través de toda la familia Chlamydiae, aunque las proteínas de 98 kDa, 76 kDa y 54 kDa pueden ser específicas de C. pneumoniae. Campos et al., Invest. Ophthalmol . Vis. Sci. 36: 1477 (1995); Marrie, Clin. Infect. Dis. 18: 501 (1993) ; Wiedman-Al-Ahmad et al., Clin. Diagn. Lab Immunol . 4: 700-704 (1997). La inmunotransferencia de aislados con suero de pacientes muestra variación de patrones de transferencia entre aislados, que indica que pueden existir serotipos de C. pneumoniae. Grayston et al., J. Infect. Dis. 168: 1231 (1995); Ramírez et al., Annals Int. Med. 125: 979 (1996).

Sin embargo, los resultados son potencialmente confundidos por el estado de infección de los pacientes, ya que los perfiles de inmunotransferencia del suero de un paciente cambian con el tiempo posterior a la infección. Una evaluación del número y la frecuencia relativa de cualesquiera serotipos y los antígenos de definición, aún no es posible. De este modo, sigue existiendo la necesidad de composiciones efectivas para prevenir, tratar y diagnosticar infecciones por Chlamydia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ADN aisladas y purificadas que codifican para Chlamiydia, las cuales pueden ser utilizadas en métodos para prevenir, tratar y diagnosticar la infección por Chlamydia . Los polipéptidos codificados incluyen polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y 4 y las moléculas de ADN incluyen las secuencias de longitud completa SEQ ID NO : 1 y la secuencia de codificación SEQ ID NO : 3 para el polipéptido maduro. Los experimentados en la técnica apreciarán que la invención también incluye moléculas de ADN que codifican para mutantes, variantes y derivados de estos polipéptidos, que resultan de la adición, supresión o sustitución de aminoácidos no esenciales, según se describe en la presente. La invención también incluye moléculas de ARN que corresponden a las moléculas de ADN de la invención. Además de las moléculas de ADN y de ARN, la invención incluye los correspondientes polipéptidos y anticuerpos monoespecíficos que se unen específicamente a estos polipéptidos. La presente invención tiene amplia aplicación e incluye casetes, vectores y células transformadas o transfectadas con los polinucleótidos de la invención. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona: (i) un método para producir un polipéptido de la invención en un sistema hospedero recombinante y los casetss de expresión, vectores y células transformadas o transfectadas relacionadas; (ii) vectores de vacuna viva, tales como los vectores de vacuna viva virales o bacterianos, que incluyen, virus de la viruela, alfavirus, vector de Salmonella typhimurium o Vibrio cholerae, que contienen un polinucleótido de la invención, estos vectores de vacuna son útiles para, por ejemplo, prevenir y tratar la infección por Chlamydia, en combinación con un diluyente o portador y las composiciones farmacéuticas relacionadas y los métodos terapéuticos y/o profilácticos asociados; (iii) un método terapéutico y/o profiláctico que incluye la administración de una molécula de ARN o de ADN de la invención, ya sea en forma directa o formulada con un vehículo de suministro, un polipéptido o combinación de polipéptidos o un anticuerpo monoespecífico de la invención y las composiciones farmacéuticas relacionadas; (iv) un método para diagnosticar la presencia de Chlamydia en una muestra biológica, que puede incluir el uso de una molécula de AEiN o de ARN, de un anticuerpo monoespecífico o de un polipéptido de la invención; y (v) un método para purificar un polipéptido de la invención mediante cromatografía de afinidad basada en anticuerpos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se comprenderá adici analmente a partir de la siguiente descripción con referencia a los dibujos, en los cuales: La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína CPN100149 de Chlamydia pneumoniae . La figura 2 muestra el análisis de la enzima de restricción del gen que codifica para el gen CPN100149 de C. pneumoniae .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el genoma de C. pneumoniae, se han identificado cuadros de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés) que codifican para polipéptidos clamidiales. Estos polipéptidos incluyen polipéptidos que se ercuentran de manera permanente en la estructura de la membrana bacteriana, polipéptidos que están presentes en la vecindad externa de la membrana bacteriana, incluyen polipéptidos que se encuentran de manera permanente en la estructura de la membrana de inclusión, polipéptidos que están presentes en la vecindad externa de la membrana de inclusión y polipéptidos que se liberan en el citoplasma de la célula infectada. Estos polipéptidos pueden utilizarse en los métodos de vacunación para prevenir y tratar la infección por Chlamydia . De conformidad con un primer aspecto de la invención, se proporcionan polinucléotidos aislados que codifican para las formas precursora y madura de polipéptidos de Chlamydia . Un polinucleótido aislado de la invención codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es homologa con una secuencia de aminoácidos de Chlamydia , la secuencias de aminoácidos de Chlamydia será seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NOS : 2 ó 4. El término "polinucléótido aislado" se define como un polinucleótido retirado del entorno en el que está presente en forma natural. Por ejemplo, una molécula de ADN que se presenta en la naturaleza, presente en el genoma de la bacteria, no está aislado, pero la misma molécula separada de la parte restante del genoma bacteriano, como resultado de, por ejemplo, un acontecimiento de clonación (amplificación), si está aislado. Normalmente, una molécula de ADN aislada está libre de las regiones de ADN (por ejemplo, regiones de codificación) de las que está inmediatamente contigua en el extremo 51 o 3' en el genoma natural. Estos polinucleótidos aislados podrían ser parte de un vector o de una composición y aún estar aislados ya que el vector o la composición no es parte de su entorno natural . Un polinucleótido de la invención puede estar en forma de ARN o de ADN (por ejemplo, ADNc, ADN genómico o ADN sintético) o modificaciones o combinaciones de los mismos. El ADN puede ser de doble cadena o de una sola cadena y, si es de una sola cadena, puede ser la cadena de codificación o la cadena que no es de codificación (antisentido) . La secuencia que codifica para un polipéptido de la invención, según se muestra en SEQ ID NOS : 2 y 4, puede ser: (a) la secuencia de codificación, según se muestra en SEQ ID NOS: 1 ó 3; (b) una secuencia de ribonucleótido, derivada por transcripción de (a) ; o (c) una secuencia de codificación diferente; esta última, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, que codifica para los mismos polipéptidos que las moléculas de ADN de las cuales en SEQ ID NOS : 1 y 3 se ilustran las secuencias de nucleótidos. Por "secuencia de aminoácidos homologa" se hace referencia a una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS : 2 ó 4, solamente en una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos o en una o más sustituciones de aminoácidos no conservadoras, deleciones o adiciones ubicadas en posiciones en las que éstas no destruyen la antigenicidad específica del polipéptido. De preferencia, esta secuencia es por lo menos 75%, con más preferencia 80% y con la máxima preferencia 90% idéntica a la secuencias de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 2 ó 4. Las secuencias de aminoácidos homologas incluyen secuencias que son idénticas o prácticamente idénticas a una secuencias de aminoácidos, según se muestra en SEQ ID NOS : 2 y 4. Por "secuencia de aminoácidos prácticamente idéntica" se hace referencia a una secuencia que es por lo menos 90%, de preferencia 95%, con más preferencia 97% y con la máxima preferencia 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia y que difiere preferentemente de la secuencia de referencia, si es que lo hace, en una mayoría de sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras normalmente incluyen sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Estas clases incluyen, por ejemplo: (a) aminoácidos que tienen cadenas laterales polares no cargadas, tales como asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina; (b) aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; (c) aminoácidos que tienen cadenas laterales acidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y (d) aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares, tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil lanina, metionina, triptófano y cisteína. La homología normalmente se mide utilizando software de análisis de secuencias (por ejemplo, el Paquete de Software de Análisis de Secuencias de Genetics Computer Group, University of Winsconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705) . Las secuencias de aminoácidos similares se alinean para obtener el máximo grado de homología (es decir, de identidad) . Con este fin, puede ser necesario introducir separaciones en la secuencia. Una vez que se ha establecido la alineación óptima, se establece el grado de homología (es decir, de identidad) al registrar todas las posiciones en las que los aminoácidos de ambas secuencias son idénticos, con respecto al número total de posiciones. Alternativamente, la homología puede determinarse alineando la secuencia candidato y la secuencia de referencia, utilizando una herramienta de alineación, tal como el algoritmo de programación dinámica, descrito en Needlsman et al . , J. Mol . Biol . 48 : 443 (1970), y el Programa Align, un paquete de software comercial producido por DNAstar, Inc., las enseñanzas de éstos se incorporan como referencia en la presente. Después que se efectúa la alineación inicial, ésta puede refinarse por comparación con múltiples alineaciones de secuencias de una familia de proteínas relacionadas. Una vez que se efectuó y refino la alineación entre las secuencias candidata y de referencia, se calcula una cifra de por ciento de homología. Los aminoácidos individuales de cada secuencia se comparan secuencialmente, de conformidad con similitud entre sí. Los factores de similitud incluyen tamaño, forma y carga eléctrica similar. Un método particularmente preferido para determinar similitudes de aminoácidos es la matriz PAM250, descrita en Dayhoff et al., 5 ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTRURE 345-352 (1978 & Supp.) , incorporada en la presente como referencia. Primero se calcula una cifra de similitud como la suma de cifras de similitud de aminoácidos alineados por pares. Las inserciones y deleciones se ignoran para los fines de porcentaje de homología e identidad. De conformidad con lo anterior, en este cálculo no se utilizan las faltas o castigos por separación. La cifra bruta se normaliza entonces dividiéndola entre la media geométrica de las cifras del compuesto candidato y de la secuencia de referencia. La media geométrica es la raíz cuadrada del producto de estas cifras. La cifra bruta normalizada es el porcentaje de homología . De preferencia, una secuencia homologa es aquella que es por lo menos 45%, con más preferencia 60% y con la máxima preferencia 85% idéntica a (i) una secuencia de codificación de SEQ ID NO : 1 o (ii) una secuencia de codificación de SEQ ID NO : 3. Los polipéptidos que tienen una secuencia homologa con una de las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 2 y 4, incluyen variantes alélicas naturales, tales como mutantes y variantes o cualesquiera otras variantes que o ocurren en forma natural , que son análogas en términos de antigenicidad, con un polipéptido que tiene una secuencia, según se muestra en SEQ ID NOS : 2 ó 4. Una variante alélica es una forma alterna de un polipéptido que está caracterizada por tener una sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos que prácticamente no alteran la función biológica del polipéptido. Por "función biológica" se hace referencia a la función del polipéptido en las células en las que ocurre en forma natural, incluso si la función no es necesaria para el crecimiento o la supervivencia de las células. Por ejemplo, la función biológica de una porina es permitir que entren a las células los compuestos presentes en el medio extracelular. La función biológica es distinta de la función antigénica. Un polipéptido puede tener más de una función biológica. Las variantes alélicas son muy comunes en la naturaleza. Por ejemplo, una especie de bacteria, por ejemplo, C. pneumoniae, está representada normalmente por una variedad de cepas que difieren entre sí en variaciones alélicas menores. Por supuesto que un polipéptido que cumple la misma función biológica en diferentes cepas puede tener una secuencia de aminoácidos que no es idéntica en cada una de las cepas. Esta variación alélica puede reflejarse igualmente en el nivel polinucleótido. El soporte para el uso de estas variantes alélicas de antígenos de polipéptido proviene de, por ejemplo, estudios del antígeno de la MOMP clamidial . La secuencia de aminoácidos de la MOMP varía de cepa a cepa, aún ocurre la unión de anticuerpo de cepa cruzada más la neutralización de la infectividad, que indica que la MOMP, cuando se utiliza como inmunógeno, tiene tolerancia a las variaciones de aminoácidos. Los polinucleótidos, por ejemplo, las moléculas de ADN, que codifican para variantes alélicas pueden recuperarse fácilmente mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de ADN bacteriano genómico extraído mediante métodos convencionales. Esto incluye el uso de cebadores de oligonucleótidos sintéticos que coinciden con el extremo 5' y el extremo 3' del dominio de codificación. Pueden diseñarse cebadores adecuados, de conformidad con la información de la secuencia de nucleótidos proporcionada en SEQ ID NOS : 1 y 3. Normalmente, un cebador puede consistir de 10 a 40, de preferencia de 15 a 25 nucleótidos. También puede ser ventajoso seleccionar cebadores que contienen nucleótidos C y G en una proporción suficiente para asegurar una hibridación eficiente; por ejemplo, una cantidad de nucleótidos C y G de por lo menos 40%, de preferencia 50% de la cantidad total de nucleótidos. Pueden diseñarse homólogos útiles que no se presentan en forma natural, utilizando métodos conocidos para identificar regiones de un antígeno que es probable que sean tolerantes a cambios en la secuencia de aminoácidos y/o a deleciones. Por ejemplo, las secuencias del antígeno proveniente de diferentes especies pueden ser comparadas para identificar las secuencias conservadas. Los derivados de polipéptido que son codificados por los polinucleótidos de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos, polipéptidos que tienen grandes deleciones internas derivados de polipéptidos de longitud completa y proteínas de fusión. Los fragmentos de polipéptido de la invención pueden derivarse a partir de un polipéptido que tiene una secuencia homologa con cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NOS : 1 y 3, en la medida en que los fragmentos retengan la antigenicidad substancial deseada del polipéptido precursor (antigenicidad específica) . Los derivados de polipéptido también pueden construirse mediante grandes deleciones internas que retiran una parte importante del polipéptido precursor, al tiempo que retiene la a. tigenicidad específica deseada. En general, los derivados de polipéptido deben tener una longitud de por lo menos 12 aminoácidos para mantener la antigenicidad. De manera ventajosa, pueden ser de por lo menos 20 aminoácidos, de preferencia de por lo menos 50 aminoácidos, con más preferencia de por lo menos 75 aminoácidos y con la máxima preferencia de por lo menos 100 aminoácidos de largo . Los derivados de polipéptido útiles, por ejemplo, fragmentos de polipéptido, pueden diseñarse utilizando análisis ayudado por computadora de las secuencias de aminoácidos, para identificar los sitios en antígenos de proteína que tienen potencial como regiones antigénicas de expuestos en la superficie. Hughes et al . , Infect . Immun . 60 : 3497 (1992) . Los fragmentos de polipéptido y los polipéptidos que tienen grandes deleciones internas pueden ser utilizados para revelar epítopes que de lo contrario están enmascarados en el polipéptido precursor y que pueden ser de importancia para inducir, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora dependiente de células T. Las deleciones también pueden eliminar regiones inmunodominantes de elevada variabilidad entre cepas. En el campo de la inmunología, una práctica aceptada es utilizar fragmentos y variantes de inmunógenos de proteína como vacunas e inmunógenos, como todo lo que se requiere para inducir una respuesta inmunitaria en una proteína puede ser una pequeña región (por ejemplo, de 8 a 10 aminoácidos) de la proteína. Esto se ha realizado para varias vacunas contra de otros patógenos diferentes a Chlamydia . Por ejemplo, los péptidos sintéticos cortos que corresponden a antígenos expuestos en la superficie de patógenos, tales como virus del tumor mamario en murinos, péptido que contiene 11 aminoácidos (Dion, et al . , Virology 179 : A1A -A11 (1990)); virus Semliki Forest, péptido que contiene 16 aminoácidos (Snijders et al . , J. Gen . Virol . 72 : 557-565 (1991)); y parvovirus canino, dos péptidos sobrepuestos, que contienen cada uno 15 aminoácidos (Langeveld et al . , Vaccine 12 : 1473-1480 (1994)) se ha mostrado que son antígenos de vacuna efectivos en contra de sus respectivos patógenos. Los polinucleótidos que codifican para fragmentos de polipéptido y polipéptidos que tienen grandes deleciones internas pueden construirse utilizando métodos estándar (véase, por ejemplo, Ausubel et al . , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons Inc., (1994)); por ejemplo, mediante PCR, incluyendo la PCR inversa mediante tratamiento con enzima de restricción de las moléculas de ADN clonadas o por el método de Kunkel el al . ( Proc . Nati . Acad . Sci . USA 82 : 448 (1985)); material biológico que puede obtenerse Strategene.

También puede producirse un derivado de polipéptido como un polipéptido de fusión que contiene un polipéptido o un derivado de polipéptido de la invención fusionado, por ejemplo, en el extremo terminal N o C, con cualquier otro polipéptido. Para la construcción de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos que corresponde a las proteínas de fusión híbridas, un primer ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos que corresponde con las porciones de la secuencia de nucleótidos CPN100149 (SEQ ID NOS : 1 ó 3) está unido a un segundo ADN utilizando los métodos descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos 5,844,095, incorporada aquí como referencia. Entonces, fácilmente puede obtenerse un producto mediante la traducción de la fusión génica. Los vectores para expresar polipéptidos de fusión están disponibles en forma comercial, como los sistemas pMal-c2 o pMal-p2 de New England Biolabs, en los que el péptido de fusión es una proteína de unión con maltosa, el sistema de glutatión-S-transferasa de Pharmacia o el sistema His-Tag, que puede obtenerse de Novagen. Estos y otros sistemas de expresión proporcionan medios convenientes para la purificación adicional de los polipéptidos y los derivados de la invención. Otro ejemplo particular de los polipéptido de fusión incluidos en la invención incluye un polipéptido o derivado de polipéptido de la invención, fusionado con un polipéptido que tiene actividad adyuvante, tal como por ejemplo la subunidad de ya sea de la toxina del cólera o de la toxina termolábil de E. coli . Pueden utilizarse diversas posibilidades para lograr la fusión. La primera, el polipéptido de la invención puede fusionarse con el extremo N-terminal o de preferencia al extremo C-terminal del polipéptido que tiene actividad adyuvante. La segunda, un fragmento de polipéptido de la invención puede fusionarse dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido que tiene actividad adyuvante. Como se mencionó anteriormente, los polinucleótidos de la invención codifican para polipéptidos de Chlamydia en forma precursora o en forma madura. También pueden codificar para precursores híbridos que contienen péptidos de señal heterólogos, que pueden madurar en polipéptidos de la invención. Por "péptido de señal heterólogo" se hace referencia a un péptido de señal que no se encuentra en el precursor que se presenta en la naturaleza de un polipéptido de la invención. Un polinucleótido de la invención, que tiene una secuencia de codificación homologa, se híbrida, de preferencia en condiciones rigurosas, con un polinucleótido que tiene una secuencia según se muestra en SEQ ID NOS : 1 y 3. Los procedimientos de hibridación se describen, por ejemplo, en Ausubel et al . , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOG?, John Wiley & Sons Inc., (1994)); Silhavy et al . , EXPERI^ENTS WITH GENE FUSIONS, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1984); Davis et al . , A MANUAL FOR GENETIC ENGINEERING: ADVANCED BACTERIAL GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1980), incorporadas aquí cada una como referencia. Los parámetros importantes que puedes considerarse para optimizar las condiciones de hibridación se reflejan en una fórmula que permite el cálculo de un valor crítico, la temperatura de fusión por encima de la cual se separan dos cadenas de ADN complementarias. Cascy y Davidson, Nucí .

Acid Res . 4 : 1539 (1977) . Esta fórmula es la siguiente: Tm = 81.5 + 0.5x(% G+C) + 1.6 log (concentración del ion positivo) - 0.6x(% de formamida) .

En condiciones extremas apropiadas, la temperatura de hibridación (Th) es aproximadamente de 20-40°C, 20-25°C o, de preferencia, 30-40°C por debajo de la Tm calculada. Los experimentados en la técnica comprenderán que las condiciones de sal y temperatura óptimas pueden determinarse fácilmente de manera empírica en experimentos preliminares, utilizando procedimientos convencionales . Por ejemplo, pueden obtenerse condiciones rigurosa, tanto para las incubaciones de pre-hibridación como de hibridación, (i) de 4 a 16 horas a 42°C en 6xSSC que contiene 50% de formamida o (ii) de 4 a 16 horas a 65°C en una solución acuosa de 6xSSC (NaCl 1 M, citrato de sodio 0.1 M (pH 7.0) ) . Para los polinucleótidos que contienen de 30 a 600 nucleótidos, se utiliza la fórmula anterior y se corrige después sustrayendo (600/tamaño del polinucleótido en pares de bases) . Las condiciones extremas están definidas por una Th que es de 5 a 10 °C por debajo de Tm. Las condiciones de hibridación con oligonucleótidos más cortos de 20 a 30 bases no siguen exactamente las reglas anteriormente expuestas. En estos casos, la fórmula para calcular la Tm es como sigue: Tm = 4x(G+C)+2 (A+T) . Por ejemplo, un fragmento de 18 nucleótidos de 50% G+C tendría una Tm aproximada de 54 °C. Una molécula de polinucleótido de la invención, que contiene ARN, ADN o modificaciones o combinaciones de los mismos, puede tener varias aplicaciones. Por ejemplo, una molécula de ADN puede ser utilizada en: (i) un proceso para producir al polipéptido codificado en un sistema de hospedero recombinante, (2) la construcción de vectores de vacuna, tales como los virus de la viruela, que además se utilizan en métodos y composiciones para prevenir y/o tratar la infección por Chlamydia , (iii) como un agente de vacuna (tanto como una molécula de ARN) , en forma desnuda o directa (naked) o bien en forma formulada con un vehículo de suministro y, (iv) la construcción de cepas de Chlamydia atenuadas, que pueden sobreexpresar un polinucleótido de la invención o expresarlo en una forma modificada y mutada, como una forma no tóxica, si es apropiado. Para composiciones de vacuna y usos de las proteínas y péptidos y nucleótidos de codificación de la presente invención para la protección contra de enfermedades provocadas por Chlamydia, no se prefiere utiliza ADN desnudo (naked) que codifica para la proteína o péptidos y la administración de estos nucleótidos intranasal o intramuscularmente . Para estas proteínas, se prefiere administrar los ácidos nucleicos de codificación mediante otras vías, como intradérmica y/o por formulación de los ácidos nucleicos de codificación para mejorar (o ayudar) la respuesta inmunitaria. También se prefiere incluir al ácido nucleico de codificación como parte de un vector vivo recombinante, tal como un vector viral o bacteriano para utilizarse como el agente de inmunización. También se prefiere inmunizar con formulaciones de vacuna que comprenden las mismas proteínas o polipéptidos de la invención. Estas formulaciones de vacuna pueden incluir el uso de adyuvantes.

«»"»-"* --*••*- - De conformidad con un segundo aspecto de la invención, se proporciona por lo tanto: (i) un cásete de expresión que contiene una molécula de ADN de la invención, colocada bajo el control de los elementos requeridos para la expresión, en particular, bajo el control de un promotor apropiado; (ii) un vector de expresión que contiene un cásete de expresión de la invención; (iii) una célula procariótica o eucariótica transformada o transfectada con un cásete de expresión y/o un vector de la invención, así como (iv) un proceso para producir un polipéptido o derivado de polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención, que incluye cultivar una célula procariótica o eucariótica transformada o transfectada con un cásete de expresión y/o vector de la invención, en condiciones que permitan la expresión de la molécula de ADN de la invención y la recuperación del polipéptido codificado o derivado de polipéptido del cultivo celular. De hospederoes procarióticos y eucarióticos puede seleccionarse un sistema de expresión recombinante. Los hospederoes eucarióticos incluyen células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris) , células de mamífero (por ejemplo, células COSÍ, NIH3T3 O JEG3), células de artrópodos (por ejemplo, Spodoptera frugiperda (SF9) ) y células vegetales. De preferencia, se utiliza un hospedero procariótico, tal como E. coli . Las células bacterianas y eucarióticas están disponibles para los experimentados en la técnica a partir de varias fuentes diferentes, por ejemplo, la American Type Culture Collectioin (ATCC; Rockville, Maryland) . La elección del sistema de expresión depende de las particularidades deseadas del polipéptido expresado. Por ejemplo, puede ser útil producir un polipéptido de la invención en una forma lipidada particular o en cualquier otra forma. La elección del cásete de expresión dependerá del sistema hospedero seleccionado, así como de las particularidades deseadas para el polipéptido expresado. Normalmente, un cásete de expresión incluye un promotor que es funcional en el sistema hospedero seleccionado y puede ser constitutivo o inducible; un sitio de unión a ribosoma; un ccdón de inicio (ATG) si es necesario, una región que codifica para un péptido de señal, por ejemplo, un péptido de señal de lipidación; una molécula de ADN de la invención; un codón de detención y, opcionalmente, una región 3 ' terminal (terminador de traducción y/o de transcripción) . El péptido de señal que codifica para la región está adyacente al polinucleótido de la invención y colocado en el marco de lectura apropiado. La región que codifica para el péptido de señal puede ser homologa o heteróloga de la molécula de ADN que codifica para el péptido maduro y puede ser específica del aparato de secreción del hospedero utilizado para la expresión. El marco de lectura abierto constituido por la molécula de ADN de la invención, en forma sola o junto con el péptido de señal, se coloca bajo el control del promotor, de modo que en el sistema del hospedero ocurre la transcripción y la traducción. Los promotores, las regiones que codifican para el péptido de señal son ampliamente conocidos y están disponibles para los experimentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, al promotor de Salmonella Typhimurium (y derivados) que es inducible por arabinosa (promotor araB) y es funcional en bacterias Gram-negativas, tales como E. coli (según se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,028,530 y en Cagnon et al . , (Cagnon et al . , Protein Engineering 4 : 843(1991)); el promotor del gen del bacteriófago T7 que codifica para la polimerasa de ARN, que es funcional en varias cepas de E. coli que expresan la polimerasa T7 (descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 4,952,496); péptido de señal de lipidación OspA y péptido de señal de lipidación RlpB (Takase et al . , J. Bact . 169 : 5692 (1987)). El cásete de expresión normalmente es parte de un vector de expresión, que se selecciona por su habilidad para replicarse en el sistema de expresión elegido. Los vectores de expresión (por ejemplo, vectores plásmidos o virales) pueden elegirse de los que se describen en Pouwels et al . , (CLONING VECTORS: LABORATORY MANUAL, 85, Supp. 1987). Éstos pueden ser adquiridos en diversas fuentes comerciales . Los métodos para transformar/transfectar células hospederoas con vectores de expresión dependerán del sistema hospedero seleccionado, según describe en Ausubel et al . , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons Inc. , (1994) . Después de la expresión, se produce un polipéptido recombinante de la invención (o un derivado de polipéptido) y permanece en el compartimiento intracelular, se secreta/excreta al medio extracelular o en el espacio periplásmico o se embebe en la membrana celular. El polipéptido puede recuperarse entonces en una forma prácticamente purificada del extracto celular o del sobrenadante después de la centrifugación del cultivo celular recombinante. Normalmente, el polipéptido recombinante puede purificarse mediante purificación por afinidad basada en anticuerpos o mediante cualquier otro método que pueda ser fácilmente adaptado por alguien con habilidad en la técnica, tal como puede ser por fusión génica en un pequeño dominio de unión por afinidad. Los métodos de purificación por afinidad basados en anticuerpos también están disponibles para purificar un polipéptido de la invención, extraído de una cepa de Chlamydia . Los anticuerpos útiles para purificar por inmunoafinidad a los polipéptidos de la invención, pueden obtenerse según se describe más adelante. Un polinucleótido de la invención también puede ser útil en el campo de las vacunas, por ejemplo, para efectuar la vacunación con ADN. Existen dos posibilidades principales, utilizar ya sea un hospedero viral o bacteriano como vehículo de suministro de genes (vector de vacuna vivo) o administrar al gen en forma libre, por ejemplo, insertado en un plásmido. La eficacia terapéutica o profiláctica de un polinucleótido de la invención puede evaluarse, según se describe más adelante. De conformidad con lo anterior, en un tercer aspecto de la invención, se proporciona: (i) un vector de vacuna tal como un virus de viruela, que contiene una molécula de ADN de la invención, colocado bajo el control de los elementos requeridos para la expresión; (ii) una composición de material que contiene un vector de vacuna de la invención, junto con un diluyente o portador; particularmente (iii) una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un vector de vacuna de la invención; (iv) un método para inducir una respuesta inmunitaria en contra de Chlamydia en un mamífero (por ejemplo, un ser humano; en forma alternativa, el método puede ser utilizado en aplicaciones veterinarias para tratar o prevenir la infección por Chlamydia de animales, por ejemplo, de gatos o de aves) , que incluye administrar al mamífero una cantidad inmunogénicamenté efectiva de un vector de vacuna de la invención para producir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica ante Chlamydia; y, de manera particular, (v) un método para prevenir y/o tratar una infección por Chlamydia (por ejemplo, C trachomatis, C psi ttaci , C pOeuit.o.niae, C pecorum) , que incluye administrar una cantidad profiláctica o terapéutica de un vector de vacuna de la invención al individuo que lo necesite. Adicionalmente, el tercer aspecto de la invención abarca el uso de un vector de vacuna de la invención en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar la infección por C lainydi . Un vector de vacuna de la invención puede expresar uno o varios polipéptidos o derivados de la invención, así como por lo menos un antígeno de Chlamydia adicional, fragmento, homólogo, mutante o derivado del mismo. Además, puede expresar una citocina, tal como interLeucina-2 (IL-2) o interleucina-12 (IL-12), que aumenta la respuesta inmunitaria (efecto adyuvante) . De este modo, un vector de vacuna puede incluir una secuencia de ADN adicional que codifica para, por ejemplo, un antígeno clamidial o una citocina, colocada bajo el control de los elementos requeridos para la expresión en una célula de mamífero. 5 Alternativamente, una composición de la invención puede incluir varios vectores de vacuna, cada uno de ellos es capaz de expresar un polipéptido o derivado de la invención. Una composición también puede contener un vector de vacuna capaz de expresar un antígeno de Chlamydia adicional o una subunidad, fragmento, homóloogo, mutante o derivado del mismo; o una citocina tal como IL-2 o IL-12. En los métodos de vacunación para tratar o prevenir la infección en un mamífero, puede administrarse un vector de vacuna de la invención por cualquier vía convencional en uso en el campo de las vacunas, particularmente, a una superficie mucosal (por ejemplo, ocular, intranasal, oral, gástrica, pulmonar, intestinal, rectal, vaginal o en el tracto urinario) o por medio de la vía parenteral (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal) . Las vías preferidas dependen de la elección del vector de vacuna. La administración puede efectuarse en una sola dosis o repetirse a intervalos. La dosis apropiada depende de varios parámetros que son comprendidos por los experimentados en la técnica, tales como el mismo vector de J?Ua Bt~t-i ~.*...._,-^-.« vacuna, la vía de administración o la condición del mamífero que será vacunado (peso, edad y lo similar) . Los vectores de vacuna vivos disponibles en la técnica incluyen vectores virales, tales como adenovirus, 5 alfavirus y virus de la viruela, así como vectores bacterianos, por ejemplo, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacilo Calmette-Guérin (BCG) y Streptococcus . En la Patente de los Estados Unidos No. 0 4,920,209, se describe un ejemplo de un vector de adenovirus, así como de un método para construir un vector de adenovirus capaz de expresar una molécula de ADN de la invención. Los vectores del virus de la viruela que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, virus de vaccinia y virus 5 de la viruela del canario, descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,722,848 y en la Patente de los Estados Unidos No. 5,364,773, respectivamente (véase también, Tartaglia et al . , Virology 188 : 217 (1992)) para una descripción del vector del virus de vaccinia; y Taylor et 0 al . , Vaccine 13 : 539 (1995) para una referencia de la viruela del canario) . Los vectores del virus de la viruela capaces de expresar un polinucleótido de la invención pueden obtenerse mediante recombinación homologa, según se describe en Kieny et al . , Nature 312 : 163 (1984), de modo 5 que el polinucleótido de la invención se inserte en el "•- ---**--genoma viral en condiciones apropiadas para la expresión en células de mamífero. En general, la dosis del vector de vacuna viral, para uso terapéutico o profiláctico, puede ser de aproximadamente entre lxlO4 y lxlO11, en forma ventajosa de aproximadamente entre lxlO7 y lxlO10, de preferencia de aproximadamente entre lxlO7 y lxlO9 unidades formadoras de placa por kilogramo. Del preferencia, los vectores virales se administran parenteralmente; por ejemplo, en tres dosis, con cuatro semanas de separación. Los experimentados en la técnica reconocen que es preferible evitar la adición de un adyuvante químico a una composición que contiene un vector viral de la invención y, de esta manera, reducir al mínimo la respuesta inmunitaria al vector viral mismo. Las cepas mutantes de Vibrio cholerae no toxicogénicas que son útiles como vacuna oral viva se describen en Mekalanos et al . , 306 : 551 (1983) y en la Patente de los Estados Unidos No. 4,882,278 (cepa en la que se ha suprimido una cantidad importante de la secuencia de codificación de cada uno de los dos alelos ctxA de modo que no se produce la toxina cholerae funcional) ; WO 92/11354 (cepa en la que el lugar irgA está inactivado por mutación; esta mutación puede combinarse en una sola cepa con mutaciones ctxA) ; y WO 94/1533 (supresión mutante que carece de las secuencias de ADN funcionales ctxA y attRSI) .

Estas cepas pueden diseñarse genéticamente para expresar antígenos heterólogos, según se describe en WO 94/19482. Una dosis de vacuna efectiva de una cepa de Vibrio cholerae capaz de expresar un polipéptido o derivado de polipéptido codificado mediante una molécula de ADN de la invención puede contener, por ejemplo, de aproximadamente entre lxlO5 y lxlO9, de preferencia de aproximadamente entre lxlO6 y lxlO8 de bacterias viables en un volumen apropiado para la vía de administración seleccionada. Las vías de administración preferidas incluyen todas las vías mucosales; con la mayor preferencia, estos vectores se administran intranasalmente u oralmente. Las cepas de Salmonella typhmurium atenuadas, diseñadas genéticamente o no para la expresión recombinante de antígenos heterólogos y su uso como vacunas orales, se describen en Nakayama et al . , Bio/Technology 6 : 693 (1988) y WO 92/11361. Las vías de administración preferidas incluyen todas las vías mucosales; con la máxima preferencia, estos vectores se administran intranasalmente u oralmente. Otras cepas bacterianas útiles como vectores de vacuna se describen en High et al . , EMBO 11 : 1991 (1992); Sizemore et al . , Science 270 : 299 (1995) ( Shigella flexneri ) ; Medaglini et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA 92 : 6868 (1995) (Stjreptococcus gordonii ) ; y Flynn, Cell . Mol .

Biol . 40 : 1 (1994), WO 88/6626, WO/90/0594, WO 91/13157, WO 92/1796 y WO 92/21376 (Bacille Calmette Guerin) . En los vectores bacterianos, el polinucleótido de la invención puede insertarse en el genoma bacteriano o puede permanecer en estado libre, transportado en un plásmido . También puede añadirse un adyuvante a la composición que contiene un vector bacteriano de vacuna. Los experimentados en la técnica conocen varios adyuvantes. Los adyuvantes preferidos pueden seleccionarse de la lista que se proporciona más adelante. De conformidad con un cuarto aspecto de la invención, también se proporciona: (i) una composición de material que contiene un polinucleótido de la invención, junto con un diluyente o portador; (ii) una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un polinucleótido de la invención; (iii) un método para inducir una respuesta inmunitaria en contra de Chlamydia, en un mamífero, administrando al mamífero una cantidad inmunogénicamenté efectiva de un polinucléotido de la invención para producir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora ante Chlamydia ; y, particularmente (iv) un método para prevenir y/o tratar una infección por Chlamydia (por ejemplo, C. trachomatis, C. psi ttaci , C. pneumoniae o C. pecorum) , administrando una cantidad profiláctica o terapéutica de un polinucleótido de la invención a un individuo que la necesite. Adicionalmente, el cuarto aspecto de la invención abarca el uso de un polinucleótido de la invención en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar la infección por Chlamydia . El cuarto aspecto de la invención incluye preferentemente el uso de una molécula de ADN colocada en condiciones para la expresión en una célula de mamífero, por ejemplo, en un plásmido que es incapaz de replicarse en células de mamífero y para integrarse prácticamente en un genoma de mamífero. Los polinucleótidos (ADN o ARN) de la invención también pueden administrarse a un mamífero para fines de vacuna, por ejemplo, terapéutica o profiláctica. Cuando se utiliza una molécula de ADN de la invención, ésta puede estar en forma de un plásmido que es incapaz de replicarse en una célula de mamífero e incapaz de integrarse al genoma del rramífero. Normalmente, una molécula de ADN se coloca bajo el control de un promotor adecuado para la expresión en una célula de mamífero, el promotor puede funcionar en forma ubicua o específica de un tejido. Ejemplo de promotores que no son específicos de tejido incluyen al anterior promotor de citomegalovirus (CMV) (descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,168,062) y el promotor del virus de Sarcoma de Rous (descrito en Norton & Coffin, Molec . Cell Biol . 5 : 281 (1985)). El promotor desmin (Li et al . , Gene 78 : 243 (1989), Li & Paulin, J. Biol . Chem . 266 : 6562 (1991), y Li & Paulin, J. Biol . Chem. 268 : 10403 5 (1993)) es específico de tejido e impulsa la expresión en células musculares. De manera más general, los vectores útiles se describen entre otros WO 94/21797 y Hartikka et al . , Human Gene Therapy 7 : 1205 (1996). Para la vacunación con ADN/ARN, el polinucleótido de la invención puede codificar para una forma precursora o madura. Cuando codifica para una forma precursora, la forma precursora puede ser homologa o heteróloga. En este último caso, puede utilizarse una secuencia conductora eucariótica, tal como la secuencia conductora del factor de plasminógeno de tipo tejido (tPA) . Una composición de la invención puede contener uno o varios polinucleótidos de la invención. También puede contener por lo menos un polinucleótido adicional que codifica para otro antígeno de Chlamydia o para un fragmento, derivado, mutante o análogo del mismo. A la composición también puede añadirse un polinucleótido que codifique para citocina, tal como puede ser interleucina-2 (IL-2) o interleucina-12 (IL-12) , de modo que se aumente la respuesta inmunitaria. Estos polinucleótidos adicionales se colocan bajo el control apropiado para la expresión. En forma ventajosa, las moléculas de ADN de la invención y/o las moléculas de ADN adicionales que se van a incluir en la misma composición, pueden transportarse en el mismo plásmido. En la preparación del polinucleótido terapéutico de ] a presente invención pueden utilizarse técnicas estándar de biología molecular para preparar y purificar polinucleótidos. Para utilizarse como una vacuna, puede formularse un polinucleótido de la invención, de conformidad con diversos métodos. En primer lugar, puede utilizarse un polinucleótido en forma directa, libre de cualesquiera vehículos de suministro, tales como liposomas aniónicos, lípidos catiónicos, micropartículas, por ejemplo, micropartículas de oro, agentes de precipitación, por ejemplo, fosfato de calcio o cualquier otro agente que facilite la transfección. En este caso, el polinucleótido puede simplemente diluirse en una solución fisiológicamente aceptable, tal como una solución salina estéril o solución salina amortiguada estéril, con o sin un portador. Cuando está presente, el portador preferentemente es isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una fuerza iónica relativamente baja, tal como se proporciona mediante una solución de sacarosa, por ejemplo, una solución que contisne 20% de sacarosa.

Alternativamente, un polinucleótido puede asociarse con agentes que ayudan as la absorción celular. Entre otros, éstos pueden estar: (i) complementados con un agente químico que modifica la permeabilidad celular, tal como bupivacaína (véase, por ejemplo, WO 94/16737) , (ii) encapsulados en liposomas o (iii) asociados con lípidos catiónicos o micropartículas de sílice, oro o tungsteno. Los liposomas aniónicos y neutros son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, LIPOSOMES: A PRACTICAL APPROACH, RPC New Ed, IRL press (1990) ) , para una descripción detallada de los métodos para preparar liposomas) y son útiles para suministrar una amplia gama de productos, incluyendo polinucleótidos. En la técnica, también se conocen lípidos catiónicos y se utilizan normalmente para el suministro de genes. Estos lípidos incluyen LipofectinMR también conocido como DOTMA (cloruro de N- [1- (2 , 3-dioleiloxi) propil] -N,N,N-trimetilamonio) , DOTAP (1 , 2-bis (oleiloxi) -3- (trimetilamonio) propano) , DDAB (bromuro de dimetildioctadecilamonio), DOGS (dioctadecilamidologlicil espermina) y derivados del colesterol, tales como DC-Chol (3 beta- (N- (N' ,N' -cimetil aminometano) -carbamoil) colesterol) . Se puede encontrar una descripción de estos lípidos catiónicos en EP 187,702, WO 90/11092, Patente de los Estados Unidos No. 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 y Patente de los Estados Unidos No. 5,527,928. Los iípidos catiónicos para el suministro de genes se utilizan preferentemente en asociación con un lípido neutro, tal como DOPE (dioleil fosfatidiletanolamina) , 5 según se describe, por ejemplo, en WO 90/11092. Otros compuestos que facilitan la transfección pueden añadirse a una formulación que contiene liposomas catiónicos. Algunos de ellos se describen, por ejemplo, en WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608 y WO 95/2397. Éstos incluyen, entre otros, derivados de espermina útiles para facilitar el transporte del ADN a través de la membrana nuclear (véase, por ejemplo, WO 93/18759) y compuestos de permeabilización de membrana, tales como GALA, Gramicidina S y sales biliares catiónicas (véase, por ejemplo, WO 93/19768) . También pueden utilizarse micropartículas de oro o de tungsteno para el suministro de genes, según se describe en WO 91/359, WO 93/17706 Y Tang et al . , (Nature 356 : 152 (1992)). En este caso, los polinucleótidos recubiertos con micropartículas pueden inyectarse a través de las vías intradérmica o intraepidérmica, utilizando un dispositivo de inyección sin aguja ("pistola de genes"), tales como los que se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 4,945,050, en la Patente de los Estados Unidos 5,015,580 y WO 94/24263. . _a&¿_ .__*._j^__..

La cantidad de ADN que será utilizada en el receptor de la vacuna depende de, por ejemplo, la concentración del promotor utilizado en la construcción del ADN, la inmunogenicidad del producto génico expresado, la condición del mamífero que será el blanco de la administración (por ejemplo, su peso, edad y estado general de general del mamífero) , el modo de administración y el tipo de formulación. En general, a los adultos humanos se puede administrar una dosis terapéutica o profilácticamente efectiva de aproximadamente entre 1 µg y 1 mg, de preferencia de aproximadamente entre 10 µg y 800 µg y, con mayor preferencia de aproximadamente entre 25 µg y 250 µg . La administración puede efectuarse en una sola dosis o repetirse a intervalos. La vía de administración puede ser cualquier vía convencional utilizada en el campo de las vacunas. Como guía general, un polinucleótido de la invención puede administrarse a través de una superficie mucosal, por ejemplo, una superficie ocular, intranasal, pulmonar, oral, intestinal, rectal, vaginal y de vías urinarias; o a través de una vía parenteral, por ejemplo, mediante una vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intraepidérmica o intramuscular. La elección de la vía de admin stración dependerá de, por ejemplo, la formulación que se seleccione. Un polinucleótido formulado en asociación con bupivacaína se administra en forma ventajosa a los músculos. Cuando se utiliza un liposoma neutro o aniónico o un lípido catiónico, tal como DOTMA o DC-Chol, la formulación puede inyectarse en forma ventajosa a través 5 de Las vías intravenosa, intranasal (en aerosol) , intramuscular, intradérmica y subcutánea. A través de las vías intramuscular, intradérmica o subcutánea puede administrarse en forma ventajosa un polinucleótido en forma directa . 10 Aunque no es totalmente requerido, esta composición también puede contener un adyuvante. Si es así, se prefiere un adyuvante sistémico que no requiera la administración concomitante con el fin de exhibir un efecto adyuvante, tal como por ejemplo, PS21, que se describe en 15 la Patente de los Estados Unidos No. 5,057,546. La información de la secuencia proporcionada en la presente solicitud permite el diseño cebadores y sondas de nucleótido específicos, que pueden utilizarse para diagnóstico. De conformidad con esto, en un quinto aspecto 20 de la invención, se proporciona una sonda de nucleótido o cebador que tiene una secuencia que se encuentra o se deriva por degeneración del código genético a partir de una secuencia mostrada en SEQ ID NOS : 1 y 3. El término "sonda", conforme se utiliza en la 25 presente solicitud, se refiere a moléculas de ADN - -»j^.^--Ml8?i?S»»-.t ¿* - ! < •> . - «•_»».,.w»-ya?« (preferentemente de una sola cadena) o de ARN (o modificaciones o combinaciones de las mismas) que hibridan en condiciones rigurosas, según se definió anteriormente, en moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias 5 homologas a las mostradas en SEQ ID NOS : 1 y 3 o a una secuencia complementaria o antisentido. En general, las sondas son significativamente más cortas que las secuencias de lcngitud completa que se muestran en SEQ ID NOS : 1 y 3 ; por ejemplo, pueden contener de aproximadamente entre 5 y 10 100, de preferencia de aproximadamente entre 10 y 80 nucleótidos. En particular, las sondas tienen secuencias que por lo menos son 75%, de preferencia por lo menos 85%, con pás preferencia 95% homologas a una porción de una secuencia según se muestra en SEQ ID NOS : 1 y 3 o que son 15 complementarias de estas secuencias. Las sondas pueden contener bases modificadas, tales como inosina, metil-5- desoxicitidina, desoxiuridina, dimetilamino-5-desoxiuridina o diamino-2, 6 -purina. También pueden modificarse o sustituirse residuos de azúcar o de fosfato. Por ejemplo, 20 un residuo de desoxirribosa puede ser reemplazado por una poliamida (Nielsen et al . , Science 254 : 1497 (1991)) y los residuos de fosfato pueden ser reemplazados por grupos éster, tales como éster de difosfato, alquilo, arilfosfonato y fosforotionato . Además, el grupo 2'- 25 hidrófilo en los ribonucleótidos puede modificarse mediante iM¡ *j **jta? tan,.M,.a*M t .. <... J. , ..«...-«. . ...... , , . t ^azOn la inclusión de, por ejemplo, grupos alquilo. Las sondas de la invención pueden ser utilizadas en pruebas de diagnóstico, como sondas de captura o detección. Estas sondas de captura pueden inmovilizarse convenientemente sobre un soporte sólido, directa o indirectamente, por medios covalentes o mediante la adsorción pasiva. Una sonda de detección puede marcarse mediante un marcador de detección seleccionado de isótopos radioactivos; enzimas como la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y enzimas capaces de hidrolizar un substrato cromogénico, fluorogénico o luminiscente; compuestos que son cromogénicos, fluorogénicos o luminiscentes; análogos de la base de nucleótido y biotina. Las sondas de la invención pueden ser utilizadas en cualquier técnica de hibridación convencional, tal como la t ansferencia por puntos (Maniatis et al . , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), la transferencia southern (Southern, J". Mol . Biol . 98 : 503 (1975) ) , la transferencia northern (idéntica a la transferencia southern con excepción de que se utiliza el ARN como blanco) o la técnica del emparedado (Dunn et al . , Cell 12 : 23 (1977)) . Esta última técnica incluye el uso de una sonda de captura específica y/o una sonda de detección específica con secuencias de nucleótidos que por lo menos parcialmente difieren entre sí . Un cebador normalmente es una sonda de aproximadamente entre 10 y 40 nucleótidos que se utiliza para iniciar la polimerización enzimática del ADN en un proceso de amplificación (por ejemplo, PCR) , en un proceso de alargamiento o en un método de transcripción inversa. En un método diagnóstico que incluya PCR, los cebadores pueden etiquetarse. De este modo, la invención también abarca: (i) un reactivo que contiene una sonda de la invención para detectar y/o identificar la presencia de Chlamydia en un material biológico; (ii) un método para detectar y/o identificar la presencia de Chlamydia en un material biológico, en el que: (a) del material biológico se recupera o deriva una muestra, (b) el ADN o el ARN se extraen del material y se desnaturalizan y (c) se exponen a la sonda de la invención, por ejemplo, una sonda de captura, de detección o ambas, en condiciones de hibridación rigurosas, de tal modo que se detecta la hibridación; y (iii) un método para detectar y/o identificar la presencia de Chlamydia en un material biológico, en el que: (a) del material biológico se recupera o deriva una muestra, (b) de la muestra se extrae ADN, (c) el ADN extraído se ceba por lo menos con un cebador, y de preferencia con dos cebadores de la invención y se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa y (d) se produce el fragmento de ADN amplificado. Como se mencionó previamente, los polipéptidos 5 que pueden producirse con la expresión de los cuadros de lectura abierta recientemente identificados son agente de vacuna útiles. Por lo tanto, un sexto aspecto de la invención presenta un polipéptido o derivado de polipéptido 10 prácticamente purificado que tiene una secuencia de aminoácidos que codifica para un polinucleótido de la invención. Un "polipéptido prácticamente purificado" se define como un polipéptido que está separado del entorno en 15 el que está presente en forma natural y/o que está libre de la mayoría de los polipéptidos que están presentes en el entorno en el que fue sintetizado. Por ejemplo, un polipéptido prácticamente purificado está libre de polipsptidos citoplásmicos . Los experimentados en la 20 técnica comprenderán que los polipéptidos de la invención pueden purificarse a partir de una fuente natural, es decir, una cepa de Chlamydia, o pueden producirse por medios recombinantes. Los polipéptidos homólogos o derivados de 25 polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la ••"--— *»--—»-invención pueden clasificarse de acuerdo a la antigenicidad específica, mediante pruebas de reactividad cruzada con un antisuero cultivado contra el polipéptido de referencia, que t.iene una secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID NOS : 2 y 4. En resumen, un antisuero hiperinmune monoespecífico puede obtenerse contra un polipéptido purificado de referencia, tal cual está o bien como un polipéptido de fusión, por ejemplo, un producto de expresión de MBP, GST o sistemas de marcado con His o un péptido sintético que se predice como antigénico. El polipéptido homólogo o el derivado clasificado de acuerdo a la antigenicidad específica puede producirse tal como está o como un polipéptido de fusión. En este último caso y si el antisuero también se obtiene contra un polipéptido de fusión, los dos sistemas de fusión diferentes se emplearán.

La antigenicidad específica puede determinarse de acuerdo a varios métodos, entre los que se incluyen la transferencia Western (Towbin et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . USA 76:4350 (1979)), la transferencia por punto y ELISA, como se describe a continuación. En un ensayo de transferencia Western, el producto que se va a clasificar, ya sea como una preparación purificada o como un extracto total de E. coli , se somete a electroforesis SDS-Page como se describe en Laemmli, Na ture 227:680(1970) . Después de la transferencia a una membrana de nitrocelulosa, el material se incuba adicionalmente con el antisuero hiperinmune monoespecífico diluido en una gama de diluciones que va de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:5000, de preferencia de entre 5 aproximadamente 1:100 y 1:500. La antigenicidad específica se muestra una vez que una banda correspondiente del producto exhibe reactividad a cualquiera de las diluciones en el intervalo anterior. En un ensayo ELISA, el producto que se va 10 clasificar de preferencia se utiliza como antígeno de recubrimiento. Una preparación purificada es la preferida, aunque también puede utilizarse extracto de célula completa. En resumen, aproximadamente 100 µl de una preparación a aproximadamente 10 µg proteína/ml se 15 distribuyen en las cavidades de una placa ELISA de policarbonato con 96 cavidades. La placa se incuba por 2 horas a 37°C y después por toda la noche a 4°C. La placa se lava con solución salina de amortiguador de fosfatos (PBS) que contiene Tween 20 al 0.05% (amortiguador 20 PBS/T?/een) . Las cavidades se saturan con 250 µl de PBS que contiene 1% de albúmina de suero de bovino (BSA) para evitar la unión no específica del anticuerpo. Después de 1 hora de incubación a 37°C, la placa se lava con amortiguador PBS/Tween. El antisuero se diluye en serie en 25 el amortiguador PBS/Tween que contiene BSA al 0.5%. 100 µl ^ (^^£^ m Mmut .^j¡^^* ^.-as.*^ »a de las diluciones se adicionan por cavidad. La placa se incuba durante 90 minutos a 37°C, se lava y se evalúa de acuerdo a los procedimientos estándares. Por ejemplo, un conjugado de peroxidasa de cabra anti-conejo se añade a las 5 cavidades cuando los anticuerpos específicos se cultivan en los conejos. La incubación se lleva a cabo por 90 minutos a 37°C y la placa se lava. La reacción se desarrolla con el substrato adecuado y la reacción se mide por colorimetría (absorbancia medida espectrofotométricamente) .

Bajo las condiciones experimentales anteriores, una reacción positiva se muestra con valores de densidad óptica (O.D.) mayores a las del suero control no inmune. En un ensayo de transferencia por punto, un producto purificado es el preferido, aunque también puede utilizarse un extracto de célula completa. En resumen, una solución del producto a aproximadamente 100 µg/ml se diluye dos veces en serie en 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) . 100 µl de cada dilución se aplican a una membrana de nitrocelulosa de 0.45 µm colocada en un aparato de transferencia por puntos de 96 cavidades (Biorad) . El amortiguador se retira aplicando vacío al sistema. Las cavidades se lavan por adición de 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) y la membrana se seca al aire. La membrana se satura con amortiguador de bloqueo (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 0.15 M NaCl, 10 g/L leche descrismada) y se incuba con una dilución de antisuero de entre aproximadamente 1:50 y 1:5000, de preferencia aproximadamente 1:500. La reacción se revela de acuerdo a los procedimientos estándares. Por ejemplo, el conjugado de peroxidasa de cabra anti-conejo se añade a las cavidades cuando se utilizan anticuerpos de conejo. La incubación se lleva a cabo 90 minutos a 37°C y después la mancha o punto se lava. La reacción se desarrolla con el substrato adecuado y se detiene. La reacción se mide en forma visual por la aparición de un punto coloreado, por ejemplo, mediante colorimetría. De acuerdo a las condiciones experimentales anteriores, se muestra una reacción positiva cuando un punto coloreado está asociado con una dilución de por lo menos aproximadamente 1:5, de preferencia por lo menos aproximadamente 1:500. La eficacia terapéutica o profiláctica de un polipéptido o derivado de la invención puede evaluarse como se describe a continuación. De acuerdo a un séptimo aspecto de la invención, se proporciona: (i) una composición de materia que tiene un polipáptido de la invención junto con un diluyente o portador, en particular, (ii) una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz en terapia o profilaxis, de un polipéptido de la invención; (iii) un método para inducir una respuesta inmunitaria contra Chlamydia en un mamífero, al administrar al mamífero una cantidad eficaz en el área inmunogénica, de un polipéptido de la infección a fin de producir una respuesta inmunitaria, por ejemplo una respuesta inmunitaria protectora anti Chlamydia , y, particularmente, (iv) un método para evitar y/o tratar una infección por Chlamydia por ejemplo: C. trachomatis, C. psi ttaci , C. pneumoniae o C. pecorum) , al administrar una cantidad profiláctica o terapéutica de un polipéptido de la invención a un individuo que necesita de éste. Adicionalmente, el séptimo aspecto de la invención abarca el uso de un polipéptido de la invención en la preparación de un medicamento para evitar y/o tratar infección por Chlamydia . Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse por cualquier ruta convencional que se utilice en el campo de las vacunas, en particular hacia una superficie mucosal (por ejemplo, ocular, intranasal, pulmonar, oral, gástrica, intestinal, rectal, vaginal o en el tracto urinario) o mediante la vía parenteral (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal) . La elección de la administración de la vía depende de varios parámetros. Por ejemplo, el adyuvante asociado con el polipéptido. Por ejemplo, si se utiliza un adyuvante mucosal, la vía oral o intranasal será preferida y si se utiliza una formulación lípida o un compuesto de aluminio, se prefiere la vía parenteral. En este último caso, las vías subcutánea o intramuscular son las más preferidas. La elección puede depender de la naturaleza del agente de la vacuna. Por ejemplo, un polipéptido de la invención fusionado a CTB o a 5 LTB se administrará mejor a una superficie mucosal. Una composición de la invención puede contener uno o varios polipéptidos o derivados de la invención. También puede contener por lo menos un antígeno adicional de Chlamydia, o una subunidad, fragmento, homólogo, mutante o derivado del mismo. Para utilizarse en la composición de la invención, un polipéptido o derivado del mismo puede formularse dentro de liposoma o con liposomas, de preferencia en liposomas neutros o aniónicos, microesferas, ISCOM3 o partículas semejantes a virus (VLP - virus-like- particles) para facilitar la administración y/o refuerzo de la respuesta inmunitaria. Estos compuestos están disponibles con facilidad para los expertos en esta área, por ejemplo ver: LIPOSOMES: A PRACTICAL APPROACH ( supra) . 20 Los adyuvantes distintos a los liposomas y semejantes también pueden utilizarse y son conocidos en este campo. Una selección adecuada puede hacerse conve cionalmente por los expertos, por ejemplo, a partir de la lista que se proporciona a continuación. 25 La administración puede lograrse en una sola __«__.t.t-__._.._ dosis o en forma repetida, según sea necesario, a intervalos que determinarán los expertos. Por ejemplo, una dosis de cebado, puede estar seguida de tres dosis de refuerzo en intervalos semanales o mensuales. Una dosis adecuada depende de varios parámetros, entre los que se incluye el receptor (por ejemplo, adulto o niño) , antígeno particular de la vacuna, vía y frecuencia de administración, presencia/ausencia o tipo de adyuvante y el efecto deseado (por ejemplo, protección y/o tratamiento) , según lo determine el experto en esta área. En general, un antígeno de vacuna de la invención puede administrarse por una vía mucosal en una cantidad que va de entre aproximadamente 10 µg y 500 mg, de preferencia entre aproximadamente 1 mg y 200 mg. Para la vía parenteral de administración, la dosis normalmente no debe exceder de 1 mg, y de preferencia debe ser de aproximadamente 10 µg . Cuando se utilizan como agentes para vacuna, los polinacleótidos y los polipéptidos de la invención podrán utilizarse en forma secuencial como parte de un proceso de inmunización en múltiples pasos. Por ejemplo, un mamífero puede cebarse inicialmente con un vector de vacuna de la invención, por ejemplo un virus de viruela, por ejemplo por la vía parenteral, y después se refuerza dos veces con el polipéptido codificado por el vector de la vacuna, por ejempLo, por vía mucosal. En otro ejemplo, los liposomas asociados con un polipéptido o derivado de la invención también pueden utilizarse para el cebado, y el refuerzo se lleva a cabo por vía mucosal utilizando un polipéptido o derivado soluble de la invención, en combinación con un adyuvante mucosal (por ejemplo, LT) . Un derivado de polipéptido de la invención también es útil como un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos anti - Chlamydia, por ejemplo, una muestra de sangre. Estos polipéptidos tienen aproximadamente de 5 a 80 aminoácidos de longitud, de preferencia entre 10 y 50 aproximadamente, y pueden estar marcados o no marcados, dependiendo del método de diagnóstico. Los métodos de diagnóstico implican los reactivos que se describen a continuación. Durante la expresión de una molécula de ADN de la invención, un polipétido o derivado de polipéptido se produce y puede purificarse utilizando las técnicas de laboratorio ya conocidas. Por ejemplo, el polipéptido o derivado de polipéptido puede producirse como una proteína de fusión que contiene una cola fusionada que facilita la purificación. El producto de fusión puede utilizarse para inmunizar a un mamífero pequeño, por ejemplo a un ratón o conejo, a fin de producir anticuerpos contra el polipéptido o derivado de polipéptido (anticuerpos monoespecíficos) . El octavo aspecto de la invención proporciona entonces un . . . i___ü anticuerpo monoespecífico que se une a un polipéptido o derivado de polipéptido de la invención. Por "anticuerpo monoespecífico" se entiende un anticuerpo que es capaz de reaccionar con un polipéptido de 5 Chlamydia único, que se presenta en forma natural. Un anticuerpo de la invención puede ser policlonal o monoclonal . Los anticuerpos monoespecíficos pueden ser recombinantes, por ejemplo quiméricos (por ejemplo, constituidos por una región variable de origen murino asociada con una región constante humana) , humanizados (una estructura constante de inmunoglobulina humana junto con una región hipervariable de animal, por ejemplo de origen murino), y/o de una sola cadena. Los anticuerpos policlonales y monoespecíficos también pueden estar en forma de fragmentos de inmunoglobulina, por ejemplo fragmentos F(ab) '2 o Fab. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG o IgA y los anticuerpos policlonales pueden ser de un solo isotipo o pueden contener una mezcla de isotipos. 20 Los anticuerpos de la invención que se cultivan contra una polipéptido o derivado de polipéptido de la invención pueden producirse e identificarse utilizando ensayos inmunológicos de tipo estándar, por ejemplo, el análisis de transferencia Western, el análisis de transferencia por puntos o ELISA (ver, por ejemplo, Coligan et al . , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (1994) John Wiley & Sons, Inc, New York, NY) . Los anticuerpos pueden utilizarse en métodos de diagnóstico para detectar la presencia de un antígeno de Chlamydia en una muestra, por ejemplo una muestra biológica. Los anticuerpos también pueden utilizarse en métodos de cromatografía por afinidad para purificar un polipéptido o derivado de polipéptido de la invención. Como se menciona a continuación, estos anticuerpos pueden utilizarse en métodos de inmunización pasiva terapéutica y profiláctica. En consecuencia, un noveno aspecto de la invención proporciona: (i) un reactivo para detectar la presencia de Chlamydia en una muestra biológica que contiene un anticuerpo, polipéptido o derivado de polipéptido de la invención; y (ii) un método de diagnóstico para detectar la presencia de Chlamydia en una muestra biológica, poniendo en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, un polipéptido o un derivado de pclipéptido de la invención, de manera que se forma un complejo inmunitario, y detectando este complejo para indicar la presencia de Chlamydia en la muestra o el organismo a partir del cual se derivó la muestra. Los expertos en este campo comprenderán que el complejo inmunitario se forma entre un componente de la muestra y el anticuerpo, polipéptido o derivado del polipéptido, según el que se use, y que cualquier material que ro se haya unido puede retirarse antes de detectar el complejo. Como se entenderá fácilmente, un reactivo del polipéptido es útil para detectar la presencia de anticuerpos anti - Chlamydia en una muestra, por ejemplo una muestra de sangre, mientras que un anticuerpo de la invención puede utilizarse para clasificar una muestra, por ejemplo extracto gástrico o biopsia, para determinar la presencia de polipéptidos de Chlamydia . Para utilizarse en aplicaciones de diagnóstico, el reactivo (por ejemplo el anticuerpo, polipéptido o derivado de polipéptido de la invención) puede estar en un estado libre o inmovilizado sobre un soporte sólido, por ejemplo un tubo, una perla o cualquier otro soporte convencional utilizado en este campo. La inmovilización puede lograrse utilizando un medio directo o indirecto. El medio directo incluye adsorción pasiva (unión no covalente) o unión covalente entre el soporte y el reactivo. Por "medio indirecto" se entiende que un compuesto anti-reactivo que interactúa con un reactivo se une primero al soporte sólido. Por ejemplo, si se utiliza un reactivo de polipéptido, un anticuerpo que se une a éste puede servir como un anti-reactivo, siempre y cuando se una a un epitope que no está implicado en el reconocimiento de anticuerpos en muestras biológicas. También pueden emplearse medios indirectos como un sistema ligando y un receptor, por ejemplo, una molécula como una vitamina, puede injertarse sobre el reactivo de polipéptido y el receptor correspondiente puede inmovilizarse sobre la fase sólida. Esto se ilustra con el sistema biotina-estreptavidina. Alternativamente, puede utilizarse un medio indirecto, por ejemplo, la adición al reactivo de una cola de péptido, manipulada químicamente o genéticamente, y la inmovilización del producto fusionado o injertado mediante adsorción pasiva o unión covalente de la cola de péptido. De acuerdo a un décimo aspecto de la invención, se proporciona un proceso para purificar, a partir de una muestra biológica, un polipéptido o derivado del polipéptido de la invención, que implica llevar a cabo una cromatografía por afinidad con base en un anticuerpo, en la muestra biológica, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico de la invención. Para utilizarse en un proceso de purificación de la invención, el anticuerpo puede ser de tipo policlonal o monoespecífico y de preferencia es de tipo IgG. Las IgG purificadas pueden prepararse a partir de un antisuero utilizando métodos estándar (ver, por ejemplo, Coligan et al . , supra) . El material de apoyo para la cromatografía convencional y para los métodos estándares de injerto de anticuerpos se expone en ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, D.

Lañe, E. Harlow, Eds. (1988). En resumen, una muestra biológica, por ejemplo un extracto de C. pneumoniae, de preferencia en una solución amortiguadora, se aplica a un material de cromatografía y de preferencia se equilibra con el amortiguador utilizado a fin c.e diluir la muestra biológica para que se permita al polipéptido o derivado de polipéptido de la invención (es decir, el antígeno) que se adsorba sobre el material. El material de cromatografía, por ejemplo un gel o resina acoplado a un anticuerpo de la invención, puede estar en una columna o en forma de lote. Los componentes no ligados se eliminan por lavado y el antígeno se eluye con un amortiguador de elusión adecuado, por ejemplo amortiguador de glicina o un amortiguador que contiene un agente caotrópico, por ejemplo, guanidina HCl o alta concentración de sal (por ejemplo, 3 M MgCl2) . Las fracciones romas se recubren y la presencia del antígeno se detecta, por ejemplo, por la medición de la absorbancia a 280 nm. Un anticuerpo de la invención puede clasificarse de acuerdo a su eficacia terapéutica tal como se describe a continuación. De acuerdo al décimo primer aspecto de la invención, se proporciona: (i) una composición de material que contiene un anticuerpo monoespecífico de la invención, junto con un diluyente o portador; (ii) una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéutica o profiláctica eficaz, de un anticuerpo monoespecífico de la invención, y (iii) un método para tratar o evitar una infección por Chlamydia (por ejemplo, C. trachomatis, C. psi ttaci , C. pneumoniae o C. pecorum) , mediante la administración de una cantidad terapéutica o profiláctica de un anticuerpo monoespecífico de la invención, a un individuo que necesita de éste. Adicionalmente, el décimo primer aspecto de la invención abate el uso de un anticuerpo monoespecífico de la invención para la preparación de un medicamento para tratar o evitar infecciones por Chlamydia . Para este fin, el anticuerpo monoespecífico puede ser de tipo policlonal o monoclonal, de preferencia del isotipo IgA (predominantemente) . En la inmunización pasiva, el anticuerpo puede administrarse a una superficie mucosal de un mamífero, por ejemplo, la mucosa gástrica, por ejemplo en forma oral o intragástrica, ventajosamente, en presencia de un amortiguador de bicarbonato. Alternativamente, la administración sistémica, que no requiere de un amortiguador de bicarbonato, puede realizarse. Un anticuerpo monoespecífico de la invención puede administrarse como un solo componente activo o como una mezcla con por lo menos un anticuerpo monoespecífico, específico para un polipéptido de Chlamydia diferente. La cantidad de anticuerpo y el régimen particular que se utilizan pueden determinarse fácilmente por los expertos. Por ejemplo, para la mayoría de los propósitos, los regímenes efectivos pueden ser: administración diaria de entre aproximadamente 100 y 1,000 mg de anticuerpos durante 5 una eiemana, o tres dosis al día de aproximadamente 100 a 1,000 mg de anticuerpos durante dos a tres días. La eficacia terapéutica o profiláctica puede evaluarse utilizando métodos estándares en este campo, por ejemplo, por la medición de inducción de una respuesta 10 inmunitaria mucosal o inducción de inmunidad terapéutica y/o protectora, utilizando por ejemplo el modelo de ratón con C. pneumoniae . Los expertos en este campo reconocerán que la cepa de C. pneumoniae en el modelo puede reemplazarse por otra cepa de Chlamydia . Por ejemplo, la 15 eficacia de las moléculas de ADN y los polipéptidos provenientes de C. pneumoniae de preferencia se evalúa en un mcdelo de ratón utilizando una cepa C. pneumoniae . La protección puede determinarse comparando el grado de infección con Chlamydia respecto al grupo control . Se 20 demuestra protección cuando la infección se reduce en comparación con el grupo control . Esta evaluación puede hacerse por polinucleótidos, vectores de vacuna, polipéptidos y derivados de los mismos, así como con los anticuerpos de la invención. 25 Los adyuvantes útiles en cualquiera de las ¿..^^¿ *^ ^^&>*^ tj$k^ composiciones de vacuna que se describen antes son los siguientes : Adyuvantes para administración parenteral que incluyen compuestos de aluminio, por ejemplo hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio e hidroxifosfato de aluminio. El antígeno puede precipitarse con el compuesto de aluminio o adeiorberse sobre el mismo, de acuerdo a los protocolos estándares. Otros adyuvantes, por ejemplo RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT) , podrán utilizarse en la administración parenteral . Los adyuvantes para la administración mucosal incluyen toxinas bacterianas, por ejemplo toxina del cólera (CT) , toxina termolábil de E. coli (LT) , toxina A de Clostridium difficile y toxina pertussis (PT) o combinaciones, subunidades, toxoides o mutantes de las mismas. Por ejemplo, una preparación purificada de la subunidad B de la toxina nativa del cólera (CTB) podrá utilizarse. Los fragmentos, homólogos, derivados y fusiones de cualquiera de estas toxinas también son adecuados, siempre y cuando retengan la actividad de adyuvante. De preferencia, se utiliza el mutante que tenga toxicidad reducida. Los mutantes adecuados se describen, como por ejemplo en WO 95/17211 (mutante Arg-7-Lys CT) , WO 96/6627 (mutante Arg-192-Gly LT) y WO 95/34323 (mutante Arg-9-Lys y Glu-129-Gly PT) . Los mutantes LT adicionales que pueden utilizarse en los métodos y composiciones de la invención incluyen, por ejemplo: mutantes Ser-63 -Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp y Glu-112-Asp. Otros adyuvantes como el mcnofosforil lípido A bacteriano (MPLA) de por ejemplo, E. coli , Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium o Shigella flexneri ; saponinas o microesferas de polilactide glicolide (PLGA) , podrán utilizarse en la administración mucosal . Los adyuvantes útiles para administración mucosal y parenteral incluyen polifosfazeno (WO 95/2415) , DC-chol (3 b- (N- (N' ,N' -dimetil aminometano) -carbamoil) colesterol (Patente de los Estados Unidos Nos. 5,283,185 y WO 96/14831) y QS-21 (WO 88/9336) . Cualquier composición farmacéutica de la invención que contenga un polinucleótido, un polipéptido, un derivado de polipéptido o un anticuerpo de la invención podrá manufacturarse de manera convencional . En particular, puede formularse con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, agua o solución salina, como solución salina amortiguada con fosfatos. En general, un diluyente o portador podrá seleccionarse con base en el modo o vía de administración, y con la práctica farmacéutica estándar. Los portadores o diluyentes farmacéuticos adecuados, así como las necesidades farmacéuticas para su uso en formulaciones farmacéuticas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en este campo y en la USP/NF. La invención también incluye métodos donde la infección por Chlamydia se trata por administración oral de un polipéptido de Chlamydia de la invención y un adyuvante mucosal, en combinación con un antibiótico, un antiácido, sucralfato o una combinación de los mismos. Los ejemplos de les compuestos que pueden administrarse con el antígeno de la vacuna y los adyuvantes son antibióticos, entre los que e:e incluyen, por ejemplo, macrólidos, tetraciclinas y derivados de los mismos (los ejemplos específicos de antibióticos que pueden utilizarse incluyen azitromicina o dixiciclina o inmunomoduladores como citocinas o esteroides) . Además, pueden utilizarse también los compuestos que contienen más de uno de los componentes antes mencionados acoplados entre sí . La invención incluye también composiciones para llevar a cabo estos métodos, es decir, composiciones que contienen un antígeno de Chlamydia (o varios antígenos) de la invención, un adyuvante y uno o más de los compuestos antes mencionados, en un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Las cantidades de los compuestos antes mencionados que se utilizan en los métodos y composiciones de la invención pueden determinarse fácilmente por el experto. Además, un experto en esta área puede diseñar fácilmente programas de tratamiento/inmunización. Por ejemplo, los componentes que no son de la vacuna pueden administrarse en los días 1 a 14 , y el antígeno de la vacuna + el adyuvante puede administrarse en los días 7, 14, 21 y 28. La exposición anterior en general describe a la presente invención. Una comprensión más completa podrá obtenerse con relación a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen únicamente como forma de ejemplificación y no pretenden limitar el alcance de la invención. Los cambios en la forma y la substitución de equivalentes se contemplan como circunstancias que podrán sugerirse o hacer más fácil la invención. Aunque en la presente se han utilizado términos específicos, éstos términos no pretenden ser de ninguna manera descriptivos ni limitativos .

EQUIVALENTES A partir de la descripción anterior de las modalidades específicas de la invención, será evidente que se ha descrito un antígeno único de Chlamydia . Aunque se han expuesto modalidades particulares con detalle, esto se ha hecho sólo a manera ejemplificativa y con fines de ilustración, y no se pretende ninguna limitación respecto al alcance de las reivindicaciones anexas. En particular, el inventor contempla que pueden hacerse varias substituciones, alteraciones y modificaciones a la invención sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, que se define en las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES ; 1. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia que comprende a la secuencia de nucleótido SEQ ID N0:1 y a los fragmentos funcionales de la misma; (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia que es por lo menos 75% homologa a la SEQ ID NO: 2; y a los fragmentos funcionales del mismo; y (c) un polinucleótido capaz de hibridizarse bajo condiciones extremas para dar un polinucleótido que tiene una secuencia que comprende la secuencia de nucleótido SEQ ID NO : 1 y los fragmentos funcionales del mismo.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1, unido a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de fusión.
3. El nucleótido de la reivindicación 2, en donde el polipéptido de fusión es un péptido de señal heterólogo.
4. El nucleótido de la reivindicación 2, en donde el polinucleótido codifica para un fragmento funcional del polipéptido que tiene la SEQ ID NO:2.
5. Un polipéptido aislado que tiene una secuencia que es por lo menos 75% homologa a la SEQ ID NO: 4 y fragmentos funcionales del mismo.
6. El polipéptido según la reivindicación 5, en donde el polipéptido tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 o fragmentos funcionales del mismo.
7. Un polipéptido que comprende al polipéptido de la reivindicación 5, unido a un polipéptido de fusión.
8. El polipéptido según la reivindicación 7, en donde el polipéptido de fusión es un péptido de señal.
9. El polipéptido según la reivindicación 7, en donde el polipéptido de fusión comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad adyuvante.
10. Un cásete de expresión, que comprende al polipéptido de la reivindicación 1 unido operativamente a un promotor.
11. Un vector de expresión que comprende al cásete de expresión de la reivindicación 10.
12. Una célula hospedera que comprende al cásete de expresión de la reivindicación 10.
13. La célula hospedera de la reivindicación 10, en donde la célula hospedera es una célula procariótica.
14. La célula hospedera de la reivindicación 13, en donde la célula hospedera es una célula eucariótica.
15. Un método para producir un polipéptido recomoinante CPN100149, que comprende: (a) cultivar una célula hospedera de la . . ..^.a»-reivindicación 12, bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido recombinante.
16. Un vector de vacuna que comprende al cásete de expresión de la reivindicación 10.
17. El vector de vacuna de la reivindicación 16, en donde el mamífero hospedero es un humano.
18. El vector de vacuna de la reivindicación 16, en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
19. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del vector de vacuna de la reivindicación 14.
20. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero, en donde el método comprende: administrar al mamífero una cantidad inmunológicamente eficaz del vector de vacuna de la reivindicación 16, en donde la administración induce una respuesta inmunitaria.
21. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del polipéptido de la reivindicación 5 y un diluyente farmacéuticamente acept ble .
22. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, que comprende además un adyuvante.
23. La composición farmacéutica de la __ . . .._ __ ... _ - „ . ._ . .. ._ ._. -•-.- '.* reivindicación 21, que además comprende uno o más de los antígenos de Chlamydia .
24. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende: administrar al mamífero una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 21, en donde la administración induce una respuesta inmunitaria.
25. Un reactivo de sonda de polinucleótido capaz de detectar la presencia de Chlamydia en material biológico, que comprende a un polinucleótido que se hibridiza con el polinucleótido de la reivindicación 1, bajo condiciones extremas.
26. El reactivo de sonda de polinucleótido de la reivindicación 25, en donde el reactivo es un cebador de ADN.
27. Un método de hibridización para detectar la presencia de Chlamydia en una muestra, que comprende los pasos de : (a) obtener un polinucleótido a partir de la muestra; (b) hibridizar el polinucleótido obtenido con un reactivo de sonda de polinucleótido de la reivindicación 21, bajo condiciones que permiten la hibridización de la sonda y de la muestra; y (c) detectar la hibridización del reactivo de detección con un polinucleótido en la muestra.
28. Un método de amplificación para detectar la presencia de Chlamydia en una muestra, que comprende los pasos de : (a) obtener el polinucleótido de la muestra; (c) amplificar el polinucleótido obtenido utilizando uno o más reactivos de sonda de polinucleótido de la reivindicación 25; y (c) detectar el polipéptido amplificado.
29. Un método para detectar la presencia de Chlamydia en una muestra, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto la muestra con un reactivo de detección que se une al polipéptido CPN100149 para formar un complejo; y (b) detectar el complejo formado.
30. El método según la reivindicación 29, en donde el reactivo de detección es un anticuerpo.
31. El método según la reivindicación 30, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
32. El método según la reivindicación 30, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
33. Un método de cromatografía por afinidad para purificar substancialmente un polipéptido CPN100149, que comprende los pasos de : (a) poner en contacto una muestra que comprende un polipéptido CPN100149 con un reactivo de detección que se une al polipéptido CPN100149 para formar un complejo; (b) aislar el complejo formado; (c) disociar el complejo formado; y (d) aislar el polipéptido disociado CPN100149.
34. El método según la reivindicación 33, en donde el reactivo de detección es un anticuerpo.
35. El método según la reivindicación 34, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
36. El método según la reivindicación 34, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal .
37. Un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de la reivindicación 5, o un fragmento derivado del anticuerpo que contiene al dominio de unión del mismo. ....*«•>....-.*¿... t^^A^&