MXPA01000692A - Interferon derivado de queratinocito - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una proteína novedosa de KDI la cual es un miembro de la familia del interferón. En particular, se proporcionan moléculas aisladas deácido nucleico que codifican para un polipéptido de interferón humano denominado KDI. Los polipéptidos de KDI también se proporcionan como vectores, células huéspedes y métodos recombinantes para producir los mismos. La invención se relaciona además con métodos de análisis para identificar agonistas y antagonistas de actividad de KDI. También se proporcionan métodos terapéuticos para tratar desórdenes relacionados con el sistema inmunitario.

Description

INTERFERÓN DERIVADO DE OÜERATINOCITO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un gen humano novedoso que codifica para un polipéptido el cual es miembro de la familia del interferón. Más específicamente, se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido humano denominado "interferón derivado de queratinocitos" o "KDI". Los polipéptidos de KDI también se proporcionan como vectores, células huéspedes y métodos recombinantes para su producción. También se proporcionan métodos de diagnóstico para detectar desórdenes relacionados con el sistema inmunitario y métodos terapéuticos para tratar desórdenes del sistema inmunitario. La invención se relaciona además con métodos de análisis para identificar agonistas y antagonistas de KDI .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los interferones (IFN) son una familia bien conocida de citocinas secretadas por una amplia variedad de células eucarióticas cuando se exponen a diversos estímulos. Los interferones se han clasificado por sus características químicas y biológicas en cuatro grupos: IFN-alfa (leucocitos), Ref: 126764 IFN-beta (fibroblastos) , IFN-gamma (linfocitos) e IFN-omega (leucocitos) . Los IFN-alfa y beta se conocen como interferones I; los IFN-gamma se conocen como tipo II o interferón inmune.

Un solo gen funcional en el genoma humano codifica para el interferón omega (IFN-omega) , una glicoproteína monomérica relacionada de manera distante en cuanto a estructura al IFN-alfa e IFN-beta, pero no relacionada con IFN-gamma. IFN-omega se secreta por leucocitos infectados con virus como un componente principal del interferón leucocitario humano. Los IFN muestran actividad antiviral, inmuno-reguladora y antiproliferativa. El potencial clínico de los interferones se ha reconocido y se resumirá en lo siguiente.

Potencial Antiviral : Los IFN se han utilizado clínicamente para terapia antiviral, por ejemplo, en el tratamiento de SIDA (Lañe, Semin. Oncol. 18:46-52 (Oct. 1991)), hepatitis viral que incluye hepatitis crónica B, hepatitis C ( oo, M.H. and Brunakis, T.G., Ann. Parmacother, 31:330-337 (marzo de 1997); Gibas, A.L., Gastroenterologist , 1:129-142 (junio de 1993)), hepatitis D, virus de papiloma (Levine, L.A. et al., Urology 47:553-557 (abril de 1996)), herpes (HO, M. , Annu. Rev. Med. 38:51 (1987)), encefalitis viral (Wintergest et al., Infection, 20:207-212 (julio de 1992) y en la profilaxis de rinitis e infecciones respiratorias (Ho, M. Annu, Rev. Med. 38:51-59 (1987)).

Potencial Antiparasi tario : Los IFN se han sugerido para terapia antiparasitaria, por ejemplo IFN-gamma para tratar infección por Cryptosporidium parvum (Rehg, J.E., J. Infect . Des. 174-229-232 (julio de 1996) Potencial Antibacteriano : Los IFN se han utilizado clínicamente para terapia antibacteriana. Por ejemplo, se ha utilizado IFN-gamma en el tratamiento de tuberculosis pulmonar resistente a medicamentos múltiples (Condos, R. et al., Lancet 349:1513-1515 (1997)).

Potencial Anticancerígeno : Se ha utilizado la terapia con interferón en el tratamiento de numerosos cánceres (por ejemplo leucemia de células pilosas (Hofman et al., Cáncer Treat. Rev. 12 (Suppl. B):33-37 (diciembre de 1985)), leucemia mieloide aguda (Stone, R.M. et al. Am. J. Clin. Oncol. 16:159-163 (abril de 1993)), osteosarcoma (Strander, H. et al., Acta Oncol. 34:877-880 (1995)), carcinoma de células básales (Dogan, B. et al., Cáncer Lett. 91:215-219 (mayo de 1995)), glioma (Fetell, M.R. et al., Cáncer 65: 78-83 (enero de 1990)), carcinoma de células renales (Asi, Y. et al. Prog. Clin. Biol. Res. 303:653-659 (1989)), mieloma múltiple (Peest, D. et al., Br. J. Haematol. 94:425-432 (septiembre de 1996)), melanoma (Ikic, D. et al., Int. J. Dermatol . 34:872-874 (diciembre de 1995)) y enfermedad de Hodkings ' s (Rybak, M.E., et al., J.

Biol. Response Mod. 9:1-4 (febrero de 1990)). El tratamiento sinergístico de cáncer avanzado con una combinación de interferón alfa y temozolomida también se ha reportado (publicación de patente WO 9712630 para Dugan, M.H.).

Potencial Inmunoterapéutico : Los IFN se han utilizado clínicamente para inmunoterapia o, más particularmente, (1) por ejemplo para evitar el rechazo de injerto contra huésped, o para interrumpir el progreso de enfermedades autoinmunes, tales como artritis, esclerosis múltiples (2) o diabetes (3) . El IFN-beta se ha aprobado para venta en los Estados Unidos para tratamiento (es decir como un inmunosupresor) de esclerosis múltiple. Recientemente se ha informado que pacientes con esclerosis múltiples tienen producción disminuida de interferones tipo I e interleucina 2 (Wandinger, K.P. et al., J. Neurol . Sci. 149:87-93 (1997)). Además la inmunoterapia con IFN-alfa recombinante (en combinación con IL-2 humana recombinante) se ha utilizado con éxito en pacientes con linfoma después de trasplante autólogo de médula ósea o células pluripotenciales sanguíneas, lo que puede intensificar la remisión después de la translación (Nagler, A. et al . , Blood 55:3951-3959 (junio de 1997)).

Potencial Antialérgico : La administración de IFN-gamma se ha utilizado en el tratamiento de alergias en mamíferos (Véase la publicación de patente WO 8701288 para Parkin, J. M. y Pinching, A.J.). También se ha demostrado recientemente que existe una producción reducida de IL-12 y de liberación de IFN-gamma dependiente de IL-12 en pacientes con asma alérgico (van der Pouw Kraan, T.C. et al . , J. Immunol . 158 : 5560 -5565 (1997)). Por lo tanto, IFN puede ser útil en el tratamiento de alergia al inhibir la respuesta humoral.

Potencial como adyuvante de vacuna : Los interferones se pueden utilizar como un adyuvante o coadyuvantes para mejorar o simular una respuesta inmune en casos de vacunación profiláctica o terapéutica (Heath A.W. y Playfair, J.H.L.

Vaccine 20:427-434 (1992)).

Claramente, existe la necesidad en la técnica por un descubrimiento de proteínas de interferón novedosas para aplicaciones numerosas, por ejemplo, en inmunoterapia, así como en terapias antivirales, antiparasitarias, antibacterianas o anticancerígenas, o en cualquier condición o situación médica en donde se desee una actividad aumentada de interferón.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica para por lo menos una porción de polipéptido de KDI que tiene la secuencia de aminoácidos completa que se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2 o la secuencia de aminoácidos completa codificada por la clona de ADN depositada como ADN plasmídico, con ATTC depósito número 203500 el 1 de diciembre de 1998. La secuencia nucleotídica determinada por secuenciado de la clona de KDI depositada (HKAPI15) la cual se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) contiene un marco de lectura abierta que codifica para un polipéptido completo de 207 residuos aminoácidos, que incluyen un codón de inicio que codifica para una metionina N terminal en las posiciones nucleotídicas 35-37. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen aquellas que codifican para una secuencia completa de aminoácidos exceptuando la metionina N terminal que se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2, moléculas las cuales también pueden codificar aminoácidos adicionales fusionados a la parte N terminal de la secuencia de aminoácidos de KDI . El polipéptido codificado tiene una secuencia líder predicha de 27 aminoácidos subrayados en la figura 1; y la secuencia de aminoácidos de la proteína madura predicha de KDI también se muestra en la figura 1 como los residuos aminoácidos 28-207 y como residuos 1-207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2. Los residuos 165 a 183 de la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 2) comprende la secuencia firma para polipéptidos de interferón y el polipéptido de KDI y en particular. - Por lo tanto, se prefieren los polipéptidos que comprenden los residuos 165 a 183 de la figura 1 los cuales son polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos. Por lo tanto, un aspecto de la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de KDI que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC. DE IDENT. NO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de KDI que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC. DE IDENT. NO: 2, exceptuando la metionina N terminal (es decir, los residuos 2-207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2); c) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido maduro de KDI mostrado como residuos 28-207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; (d) una secuencia nucleotídica que codifica para los residuos 165-183 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; (e) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido completo codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; (f) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido completo codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15, exceptuando la metionina N terminal; (g) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido maduro codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; y (h) una secuencia nucleotídica complementaria para cualquiera de las secuencias nucleotídicas en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) o (g) anteriores. Las modalidades adicionales de la invención incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos 90% idéntica, y de manera más preferible por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquier secuencia nucleotídica en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) anteriores, o un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones de hibridación astringentes a un polinucleótido en los incisos (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) anteriores. Este polinucleótido el cual hibridiza, no hibridiza bajo condiciones de hibridación astringentes a un polinucleótido que tenga una secuencia nucleotídica que consistan únicamente de residuos A o únicamente de residuos T. Una modalidad adicional de ácido nucleico de la invención se relaciona con una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido el cual codifica para la secuencia de aminoácidos de una porción que presenta un epitopo de un polipéptido KDI que tiene una secuencia de aminoácidos en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) o (g) anteriores. La presente invención también se relaciona con vectores recombinantes, los cuales incluyen las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención y con células huéspedes que contienen los vectores recombinantes, así como con métodos para elaborar tales vectores y células huéspedes, y para utilizarlos en la producción de polipéptidos de KDI o péptidos por técnicas recombinantes. La invención proporciona además un polipéptido aislado de KDI que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido de longitud completa de KDI que tiene la secuencia completa de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2; (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido de longitud completa de KDI que tiene la secuencia completa de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2 excepto la metionina N terminal (es decir, los residuos 2 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2) ; la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de KDI que se muestra como residuos 28-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; (d) la secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos 165 a 183 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; (e) el polipéptido de longitud completa de KDI codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; (f) el polipéptido de longitud completa de KDI codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15, excepto en la metionina N terminal; y (g) el polipéptido maduro de KDI codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica, de manera más preferible por lo menos 90% idéntica, y de manera aún más preferible 95%, 9 % , 97%, 98% o 99% idéntica a la descrita en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , o (g) anteriores, así como polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con por lo menos 90% de similitud, y de manera más preferible con por lo menos 95% de similitud con las anteriores. Una modalidad adicional de este aspecto de la invención se relaciona con un péptido o polipéptido el cual comprende la secuencia de aminoácidos de una porción que presenta un epitopo de un polipéptido de KDI que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , o (g) anteriores. Los péptidos o polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de una porción que presenta epitopo de un polipéptido de KDI de la invención incluyen porciones de tales polipéptidos con por lo menos seis o siete, preferiblemente por lo menos 9, y de manera más preferible por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, aunque los polipéptidos que presenten epitopos de cualquier longitud y que incluyan la totalidad de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención descrita antes también se incluyen en la invención. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido de KDI que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en los incisos (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , o (g) anteriores. La invención proporciona además anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido KDI que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la presente. Tales anticuerpos son terapéuticamente útiles como se describe posteriormente . La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos de KDI los cuales pueden ser utilizados, por ejemplo, para tratar desórdenes relacionados con el sistema inmunitario tales como infección viral, infección parasitaria, infección bacteriana, cánceres, enfermedades autoinmunes, esclerosis múltiple, linfoma y alergia. También se proporcionan métodos para tratar a individuos en necesidad de polipéptido de interferón. La invención proporciona además composiciones que comprenden un polinucleótido de KDI o un polipéptido de KDI para administración a células in vitro, a células ex vivo y a células in vivo, o a un organismo multicelular. En ciertas modalidades particularmente preferidas de este aspecto de la invención, las composiciones comprenden un polinucleótido de KDI para expresión de un polipéptido de KDI en un organismo huésped para tratamiento de enfermedad. A este respecto, la expresión particularmente preferida es la expresión en un paciente humano para tratamiento de una disfunción asociada con actividad endógena aberrante de un interferón.

La presente invención también proporciona un método de análisis para identificar compuestos capaces de mejorar o inhibir una actividad biológica de polipéptido de KDI, la cual involucra poner en contacto un receptor el cual es mejorado por el polipéptido de KDI con el compuesto candidato en presencia de un polipéptido de KDI enseñando, por ejemplo, la actividad antiviral en presencia del compuesto candidato y del polipéptido de KDI , y al comparar la actividad con un nivel estándar de actividad, el estándar se ensaya cuando se realiza el contacto entre el receptor y el KDI en ausencia de un compuesto candidato. En este ensayo, un incremento en la actividad sobre el estándar indica que el compuesto candidato es un agonista de la actividad de KDI, y una disminución en la actividad comparada con el estándar indica que el compuesto es un antagonista de la actividad de KDI . Se ha descubierto que KDI se expresa en los queratinocitos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos de la invención son útiles como sondas de hibridación para identificación diferencial del tejido o tejidos del tipo o tipos de células presentes en una muestra biológica. Similarmente, los polipéptidos y anticuerpos dirigidos a esos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para identificación diferencial de tejido o tejidos, o de tipo o tipos de células. Además, para muchos desórdenes de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmune, se pueden detectar en ciertos tejidos niveles significativamente mayores o menores de la expresión del gen de KDI (por ejemplo tejidos cancerosos o heridos) o en fluidos corporales (por ejemplo suero, plasma, orina, fluido sinovial y fluido espinal) , tomado de un individuo que tiene tal desorden, en relación con un nivel de expresión del gen de KDI "estándar" es decir, el nivel de expresión de KDI en tejido sano de un individuo que no tiene un desorden en el sistema inmune. Por lo tanto, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de tal desorden, el cual involucra: (a) realizar un ensayo para determinar el nivel de expresión del gen de KDI en células o fluido corporal de un individuo; (b) comparar el nivel de expresión de gen de KDI con un nivel de expresión de KDI estándar, por lo que un incremento o disminución en el nivel de expresión del gen de KDI ensayado en comparación con el nivel de expresión estándar es indicativo del desorden en el sistema inmune. Un aspecto adicional de la invención se relaciona con un método para tratar a un individuo en necesidad de un nivel aumentado de actividad de interferón en el cuerpo que comprende administrar a tal individuo una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido aislado de KDI de la invención, o un agonista del mismo. Un aspecto adicional de la invención se relaciona con un método para tratar a un individuo en necesidad de un nivel disminuido de actividad de interferón en el cuerpo, que comprende la administración a tal individuo de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de KDI . Los antagonistas preferidos para uso en la presente invención son anticuerpos específicos de KDI .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la secuencia nucleotídica (SEC. DE IDENT. NO: 1 y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 2) de KDI. La figura 2 muestra las regiones de identidad entre las secuencias de aminoácidos de la proteína de KDI y el producto de traducción del ARNm humano para Interferon Omega (SEC. DE IDENT. NO: 3), determinado por el programa de computadora Besfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison Wl 53711) . La figura 3 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos de KDI . Se muestran las regiones de giro alfa, beta y helicoidal; las regiones de hidrofilicidad e hidrofobicidad así como las antipáticas; las regiones flexibles, el índice antigénico y la probabilidad de superficie. En la gráfica de "índice antigénico-Jameson-Wolf" , los picos positivos indican posiciones de regiones altamente antigénicas de la proteína de KDI, es decir, regiones a partir de las cuales se pueden obtener péptidos de la invención que presenten epitopos . La figura 4 muestra una alineación del polipéptido de KDI de la presente invención con otros diversos miembros de la familia de polipéptido de interferón. Se muestran el interferón humano beta-1 (SEC. DE IDENT. NO: 4) , el interferón plaquetario humano (SEC. DE IDENT. NO: 5) , el interferón humano omega (SEC. DE IDENT. NO: 6) , el interferón humano alfa-C (SEC. DE IDENT. NO: 7) , el interferón humano alfa-F (SEC. DE IDENT. NO: 8), interferón humano II -1 (SEC. DE IDENT. NO: 9), interferón alfa humano-N (SEC. DE IDENT. NO: 10) , TP-1 bovino (SEC. DE IDENT. NO: 11), TP-1 ovino (SEC. DE IDENT. NO: 12), TP porcino (SEC. DE IDENT. NO: 13) , interferón humano beta 2a (IL-6) (SEC. DE IDENT. NO: 14), interferón bovino beta-2 (SEC. DE IDENT. NO: 15), interferon bovino beta-1 (SEC. DE IDENT. NO: 20) , interferón sintético beta-1 (SEC. DE IDENT. NO: 21) . La alineación se produce por la rutina de Megaling utilizando el método Clustal con una tabla de ponderación de residuos PAM250. Megaling está contenido dentro de la suite DNAstar de programas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interferón derivado de queratinocito (en lo siguiente denominado como "KDI") que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2. Se obtiene la secuencia nucleotídica que se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) por secuenciado de la clona de ADNc HKAPI15 la cual se depositó el 1 de diciembre de 1998 ante la American Type Culture Collection, 10801 University Bolulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos, y se le suministró el número de acceso ATCC 203500. El ADNc depositado está contenido en el plásmido pCMVSport 2.0 (Life Technologies, Gaithersburg MD) y se puede cortar por los sitios de enzima de restricción SalI/NotI que flanquean al ADNc humano. La proteína KDI de la presente invención comparte homología de secuencia con muchos miembros de la familia de interferón, de manera notable el producto de traducción del ARN humano para IFN-omega (figura 2) (SEC. DE IDENT. NO: 3) . Se ha demostrado que IFN-omega inhibe la proliferación de diversas líneas de células tumorales in vitro, estimula la actividad de células asesinas (killer) naturales, mejora la expresión de los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad clase I (pero no los de clase II) e inhibe la proliferación de linfocitos estimulada con mitógenos o células halogeneicas . Adolf, G.R., Human interferon omega-a review, Mul t Scler 1995:1 Suppl 1:S44-S47. Se ha determinado que la expresión de KDI se encuentra principalmente en los queratinocitos, células dendríticas y monocitos, pero es particularmente fuerte en queratinocitos. La estimulación de queratinocitos con TFN-alfa o PolylC (que simula una infección viral) estimula específica y rápidamente la sobreexpresión del transcrito de KDI . En base en su similitud estructural con INF-omega y su expresión aumentada en respuesta a la infección viral simulada, se considera que KDI comparte muchas de las actividades biológicas de IFN-omega y otras proteínas de interferón que incluyen inhibición de proliferación de tumores, actividades antivirales, activación de células NK y mejoramiento del sistema inmunitario.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO A menos que se indique de otra manera, todas las secuencias nucleotídicas determinadas por secuenciado de la molécula de ADN en la presente se determinan utilizando un secuenciador automatizado de ADN (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) , y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinadas en la presente se predicen por traducción de una secuencia de ADN determinada como en lo anterior. Por lo tanto, se conoce en la técnica que para cualquier secuencia de ADN determinada por esta solución automatizada, cualquier secuencia nucleotídica determinada en la misma puede contener algunos errores. Las secuencias nucleotídicas determinadas por automatización típicamente son por lo menos aproximadamente 90% idénticas, de manera más típica, por lo menos aproximadamente 95% a por lo menos aproximadamente 99.9% idénticas a la secuencia nucleotídica real de la molécula secuenciada de ADN. La secuencia real se puede determinar con mayor precisión por otras soluciones que incluyen métodos manuales de secuenciado de ADN, bien conocidos en la técnica. Como también se conoce en la técnica, la inserción o supresión única en una secuencia nucleotídica determinada comparada con la secuencia real provocará cierto desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia nucleotídica tal como la secuencia de aminoácidos predicha codificada por un secuencia nucleotídica determinada la cual será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada en la realidad por la molécula secuenciada de ADN, comenzando en el punto de tal inserción o supresión. Por "secuencia nucleotídica" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido se entiende, para una molécula de ADN o polinucleótido, una secuencia de desoxirribonucleótidos, y para una molécula de ARN o polinucleótido, la secuencia correspondiente de ribonucleótidos (A, G, C y U) , en donde cada desoxirribonucleótido de timidina (T) en la secuencia especificada de desoxirribonucleótido está sustituido por el ribonucleótido uridina (U) .

Al utilizar la información que se proporciona aquí, tal como la secuencia nucleotídica en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) , se puede obtener una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica para un polipéptido de KDI utilizando procedimientos convencionales o estándar de biología molecular, tales como aquellos para clonación de ADNc utilizando ARNm como material inicial. De manera ilustrativa de la invención, la molécula de ácido nucleico descrita en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) se descubrió en una biblioteca de ADNc derivada de queratinocitos aislados. La secuencia nucleotídica del ADN para KDI de la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) contiene un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de 207 residuos aminoácidos, con un codón de inicio en las posiciones nucleotídicas 35-37 de la secuencia nucleotídica en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) . La secuencia de aminoácidos de la proteína de KDI mostrada en la SEC. DE IDENT. NO: 2 es aproximadamente 35% idéntica a IFN-omega (figura 2) . Las secuencias de IFN-omega se pueden accesar a través de GenBank con acceso número gb|A12140. Como lo puede apreciar una persona habitualmente experta en la técnica, debido a las posibilidades de errores de secuenciado discutidas antes, el polipéptido KDI completo real codificado por el ADNc depositado, el cual comprende aproximadamente 207 aminoácidos, de alguna manera puede ser más largo o más corto. De manera más general, el marco de lectura abierta real puede estar en cualquier parte en el intervalo de + 20 aminoácidos, de manera más probable en el intervalo de + 10 aminoácidos del predicho a partir del codón de metionina en la parte N terminal mostrada en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) .

Secuencias Líder y Madura La secuencia de aminoácidos de la proteína completa de KDI incluye una secuencia líder y una proteína madura, como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2. De manera más particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para una forma madura de la proteína KDI . Por lo tanto, de acuerdo con la hipótesis de señal, una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena proteínica en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso, las proteínas secretoras por células de mamífero tienen una secuencia de señal o líder secretora la cual se separa del polipéptido completo para producir una forma "madura" secretada de la proteína. La mayor parte de las células de mamífero incluso las células de inserto separan las proteínas secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en algunos casos, la separación de la proteína secretada no es completamente uniforme, lo que resulta en dos o más especies maduras de la proteína. Además, se ha sabido durante mucho tiempo que la especificidad de separación de una proteína secretada se determina finalmente por la estructura primaria de la proteína completa, esto es, es inherente en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por lo tanto, la presente invención proporciona una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido maduro de KDI que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc humano en la clona HKAPI15 (ATCC depósito número 203500) . Por el término "polipéptido maduro del KDI que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc humano en la clona HKAPI15" se quiere significar la forma o formas maduras de la proteína de KDI producidas por expresión en una célula de mamífero (por ejemplo células COS, como se describe posteriormente) , o el marco de lectura abierto completo codificado por la secuencia de ADN humano de la clona contenida en el vector depositado. Además, están disponibles métodos para predecir si una proteína tiene un líder secretor así como el punto de separación para esa secuencia líder. Por ejemplo, el método de McGeoch (Virus Res . 3 : 211 -286 (1985)) utiliza la información de una región corta N terminal cargada y una región no cargada subsecuente de la proteína completa (sin separaciones) . El método de von Heinje (Nucleic Acids Res . 14:4683-4690 (1986)) utiliza la información de los residuos que rodean al sitio de separación, típicamente los residuos -13 a +2 , en donde +1 indica el amino terminal de la proteína madura. La precisión de predicción de los puntos de separación de las proteínas secretoras de mamífero conocidas para cada uno de estos métodos está en el intervalo de 75-80% (von Heinje, supra) . Sin embargo, los dos métodos no siempre producen los mismos puntos de separación predichos para una proteína dada. En el presente caso, la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido completo de KDI se analiza por un programa de computadora ("PSORT" disponible del Dr. Kenta Nakai del Institute for Chemical Research, Kyoto University (véase K. Nakai y M. Kanehisa, Genomics 14 : 891 - 911 (1992)), el cual es un sistema experto para predecir la posición celular de una proteína basada en la secuencia de aminoácidos. Como parte de esta predicción de localización computacional , se incorporaron los métodos de McGeoch y von Heinje". El análisis de computación anterior predice un sitio de separación potencial dentro de la secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEC. DE IDENT. NO: 2; esto es, entre los residuos 27 y 28 en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 2) . Por supuesto, la localización exacta del sitio de separación utilizado por enzimas que se presentan de manera natural puede variar ligeramente de un sitio de separación predicho y pueden variar entre especies. En consecuencia, los polipéptidos maduros que comienzan desde el residuo aproximadamente 20 hasta el residuo aproximadamente 34 son los que se proporcionan. De manera más particular, la invención proporciona un polipéptido que tiene una porción de la SEC. DE IDENT. NO: 2 como sigue: residuo 20-207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 21-207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 22-207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 23-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 24-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 25-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 26-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 27-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 28-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 29-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 30-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 31-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 32-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, residuos 33-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2 y residuos 34-127 de la SEC. DE IDENT. NO: 2. La invención también proporciona polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos. Como se indicó, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, o en forma de ADN. El ADN puede ser de cadena doble o de cadena sencilla. El ADN o ARN de cadena doble puede ser la cadena codificante, también conocido como la cadena directa o con sentido, o puede ser una cadena no codificante, también denominada como la cadena antisentido. En modalidades específicas, los polinucleótidos de esta invención tienen una longitud menor de 300 kb, 200 kb, 100 kb, 50 kb, 15 kb, 10 kb o 7.5 kb. En una modalidad adicional, los polinucleótidos de la invención comprenden por lo menos 15 nucleótidos contiguos de secuencia codificante para KDI, pero no comprenden la totalidad o una porción de cualquier intrón de KDI . En otra modalidad, el ácido nucleico que comprende la secuencia que codifica para KDI no contiene secuencias codificantes de un gen flanqueante genómico (es decir, 5' o 3' respecto a la secuencia codificante de KDI en el genoma) . Por molécula o moléculas de ácido nucleico "aisladas" significa una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, la cual se ha removido de su ambiente nativo. Por ejemplo, las moléculas recombinantes de ADN contenidas en un vector se consideran aisladas para los propósitos de la presente invención. Los ejemplos adicionales de moléculas aisladas de ADN incluyen moléculas recombinantes de ADN mantenidas en células huéspedes heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas aisladas de ARN incluyen transcrito de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Sin embargo, un ácido nucleico contenido en una clona que es un miembro de una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca genómica o de ADNc) que no se ha aislado de otros miembros de la biblioteca (por ejemplo en forma de una solución homogénea que contiene la clona u otros miembros de la biblioteca) o un cromosoma aislado o removido de una célula o lisado celular (por ejemplo un "cromosoma dispersado" como en un kariotipo) , no está "aislado" para los propósitos de esta invención. Como se discute adicionalmente en la presente, las moléculas aisladas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se pueden producir de manera natural, recombinante o sintética. Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención incluyen moléculas de ADN que comprenden un marco de lectura abierta (ORF) con un codón de inicio en las posiciones 35-37 de la secuencia nucleotídica mostrada en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) . También se incluyen moléculas de ADN que comprenden la secuencia codificante para la proteína KDI que carece de una metionina N terminal, mostrada en las posiciones 2-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2. Además, las moléculas aisladas de ácido nucleico de la invención incluyen moléculas de ADN las cuales comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las descritas antes pero las cuales, debido a la degeneración del código genético, aún codifican para la proteína KDI . Por supuesto, el código genético y cualquier preferencia de codón específico de especie es bien conocido en la técnica. Por lo tanto, es sistemático o habitual para una persona experta en la técnica generar variantes degeneradas descritas antes, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un huésped particular (por ejemplo, cambio de codones en el ARNm humano por aquellos preferidos por bacterias huéspedes tales como E. coli ) . En otro aspecto, la invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para el polipéptido de KDI en una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc humano en la clona HKAPI15 (ATCC depósito número 203500) . Preferiblemente, esta molécula de ácido nucleico codificará para el polipéptido maduro codificado por el ADNc humano, depositado, descrito antes. La invención proporciona además una molécula aislada de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) o la secuencia de nucleótidos del ADNc para KDI contenido en la clona depositada descrita antes, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una de las secuencias anteriores. Tales moléculas aisladas, particularmente moléculas de ADN, son útiles para la producción del polipéptido de KDI de la invención y como una sonda para la detección de ARNm en células transfectadas con un vector con el propósito de producir KDI; es decir, como un marcador para determinar la expresión del gen heterólogo en una célula huésped. La presente invención está dirigida adicionalmente a moléculas de ácido nucleico que codifican para porciones de las secuencias nucleotídicas descritas aquí, así como para fragmentos de las moléculas aisladas de ácido nucleico descritas en la presente. En particular, la invención proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica que representa la porción de la SEC. DE IDENT. NO: 1 la cual consiste de las posiciones 35-655 de la SEC. DE IDENT. NO: 1. Otros fragmentos polinucleotídicos particularmente preferidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten de residuos nucleotídicos 38-655, 41-655, 44-655, 47-655, 50-655, 53-655, 56-655, 59-655, 62-655, 65-655, 68-655, 71-655, 74-655, 77-655, 80-655, 83655, 86-655, 89-655, 92-655, 95-655. 98-655, 101-655, 104-655, 107-655, 110-655, 113-655, 116-655, 119-655, 122-655, 125-655, 128-655, 131-655, 134-655, 137-655, 140-655, 143-655, 146-655, 149-655, 152-655, 155-655. 158-655, 161-655, 164-655, 167-655, 170-655, 173-655, 176-655, 179-655. 182-655, 185-655, 188-655, 191-655, 194-655, 197-655, 200-655, 203-655, 206-655, 209-655, 212-655, 215-655, 218-655, 221-655, 224-655, 227-655, 230-655, 233-655, 236-655, 239-655, 242-655, 245-655, 248-655, 251-655, 254-655, 257-655, 260-655, 263-655, 266-655, 269-655, 272-655, 275-655, 278-655, 281-655, 284-655, 287-655, 290-655, 293-655, 296-655, 299-655, 302-655, 305-655, 308-655, 311-655. 314-655, 317-655, 320-655, 323-655, 326-655, 329-655, 332-655, 335-655, 338-655, 341655, 344-655, 347-655, 350-655, 353-655, 356-655. 359-655, 362-655, 365-655, 368-655, 371-655, 374-655, 377-655, 380-655, 383-655, 386-655, 389-655, 392-655, 395-655, 398-655, 401-655, 404-655, 407-655, 410-655, 413-655, 416-655, 419-655, 422-655, 425-655, 428-655, 431-655, 434-655, 437-655, 440-655, 443-655, 446-655, 449-655, 452-655, 455-655, 458-655. 461-655, 464-655, 467-655, 470-655, 473-655, 476-655, 479-655, 482-655, 485-655, 488-655, 491-655, 494-655. 497-655, 500-655, 503-655, 506-655, 509-655, 512-655, 515-655, 518-655. 521-655, 524-655, 527-655, 530-655, 533-655, 536-655, 539-655, 542-655, 545-655, 548-655, 551-655, 554-655, 557-655, 560-655, 563-655, 566-655, 569-655, 572-655, 575-655, 578-655, 581-655, 584-655, 587-655, 590-655, 593-655, 596-655, 599-655, 602-655, 605-655, 608-655, 611-655. 614-655, 617-655, 620-655, 623-655, 626-655, 629-655, 632-655, y 635-655 de la SEC. DE IDENT. NO: 1. Otros fragmentos polinucleotídicos particularmente preferidos adicionales de la invención comprenden, o alternativamente consisten de los residuos nucleotídicos 38-68, 38-71, 38-74, 38-77, 38-80, 38-83, 38-86, 38-89, 38-92, 38-95, 38-98, 38-101, 38-104, 38-107, 38-110, 38-113, 38-116, 38-119, 39-122, 38-125, 38-128, 38-131, 38-134, 38-137, 38-140, 38-143, 38-146, 38-149, 38-152, 38-155, 38-158, 38-161, 38-164, 38-167, 38-170, 38-173, 38-176, 38-179, 38-182, 38-185, 38-188, 38-191, 38-194, 38-197, 38-200, 38-203, 38-206, 38-209, 38-212, 38-215, 38-218, 38-221, 38-224, 38-227, 38-230, 38-233, 38-236, 38-239, 38-242, 38-245, 38-248, 38-251, 38-254, 38-257, 38-260, 38-263, 38-266, 38-269, 38-272 38-275, 38-278, 38-281, 38-284, 38-287, 38-290, 38-293, 38-296, 38-299, 38-302, 38-305, 38-308, 38-311, 38-314, 38-317, 38-320, 38-323, 38-326, 38-329, 38-335, 38-338, 38-341, 38-344, 38-347, 38-350, 38-353, 38-356, 38-359, 38-362, 38-365, 38-368, 38-371, 38-374, 38-377, 38-380, 38-383, 38-386, 38-389, 38-392, 38-395, 38-398, 38-401, 38-404, 38-407, 38-410, 38-413, 38-416, 38-419, 38-422, 38-425,-38-428, 38-431, 38-434, 38-437, 38-440, 38-443, 38-446, 38-449, 38-452, 38-455, 38-458, 38-461, 38-464, 38-467, 38-470, 38-473, 38-476, 38-479, 38-482, 38-485, 38-488, 38-491, 38-494, 38-497, 38-500, 38-503, 38-506, 38-509, 38-512, 38-515, 38-518, 38-521, 38-524, 38-527, 38-530, 38-533, 38-536, 38-539, 38-542, 38-545, 38-548, 38-551, 38-554, 38-557, 38-560, 38-563, 38-566, 38-569, 38-572, 38-575, 38-578, 38-581, 38-584, 38-587, 38-590, 38-593, 38-596, 38-599, 38-602, 38-605. 38-608, 38-611, 39-614, 38-617, 38-620, 38-623, 38-626, 38-629, 38-632, y 38-635 de la SEC. DE IDENT, NO: 1. Además, la invención incluye un polinucleótido que comprende cualquier porción de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos contiguos, preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos de la SEC. DE IDENT, NO: 1. De manera más general, por un fragmento de una molécula aislada de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica del ADNc depositado o la secuencia nucleotídica que se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT, NO: 1) se pretende incluir fragmentos de por lo menos aproximadamente 15 nt, y de manera más preferible de por lo menos aproximadamente 20 nt, de manera aún más preferible por lo menos aproximadamente 30 nt e incluso de manera más preferible por lo menos aproximadamente 40 nt de longitud los cuales sean útiles como sondas de diagnóstico y cebadores como se discute en la presente. Por supuesto, se contemplan específicamente fragmentos más grandes de 50-600 nt de longitud (fragmentos de 400 nt, 450 nt, 500 nt, 550 nt y 600 nt de longitud están contemplados específicamente como fragmentos de todas las longitudes entre 15 y 600, pero no se mencionarán específicamente por consideraciones de espacio) los cuales también son útiles de acuerdo con la presente invención los cuales son fragmentos que corresponden a la mayor parte, si no a la totalidad de la secuencia nucleotídica del ADNc depositado o como se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT, NO: 1) . Por un fragmento de por lo menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se consideran fragmentos los cuales incluyen 20 o más bases contiguas de la secuencia nucleotídica del ADNc depositado o la secuencia nucleotídica como se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT, NO: 1) y por supuesto puede comprender secuencias adicionales de ácido nucleico no derivadas de la SEC. DE IDENT, NO: 1 (o del ADNc depositado) fusionado a cualquier extremo de las 20+ bases contiguas de la SEC. DE IDENT, NO: 1 o del ADNc depositado. Los fragmentos preferidos de ácido nucleico de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para porciones que presentan epitopo del polipéptido de KDI como se identifica en la figura 3 y como se describe con mayor detalle en lo siguiente. En otro aspecto, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones de hibridación astringentes con una porción del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención descrita antes, por ejemplo, el ADNc humano en la clona HKAPI15 (ATCC, depósito número 203500) . Por "condiciones de hibridación astringentes" se pretende significar incubación durante la noche a 42 °C en una solución que comprende: formamida 50%, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt ' s 5x, sulfato de dextrano 10% y 20 µg/ml de /ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros dos veces en 0. lx SSC a aproximadamente 65°C. Por un polinucleótido el cual hibridiza con una "porción" de un polinucleótido se quiere significar un polinucleótido (ya sea ADN o ARN) que hibridiza con por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt) y de manera más preferible con por lo menos aproximadamente 20 nt, de manera aún más preferible con por lo menos aproximadamente 20 nt e incluso de manera mucho más preferible con aproximadamente 30-70 (por ejemplo 50) nt del polinucleótido de referencia.

Estos son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores como se discute en lo anterior y con más detalle posteriormente. Por una porción de un polinucleótido de "por lo menos 20 nt de longitud" por ejemplo, se pretende que 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia nucleotídica del polinucleótido de referencia (por ejemplo, el ADNc depositado o la secuencia nucleotídica como se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT, NO: 1) ) . Por supuesto, un polinucleótido el cual hibridiza únicamente con una secuencia polyA (tal como el tracto polyA 3 ' terminal del ADNc para KDI que se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT, NO: 1)), o con una cadena complementaria de residuos T (o U) , no se pueden incluir en un polinucleótido de la invención utilizado para hibridizar con una porción de un ácido nucleico de la invención, puesto que tal polinucleótido puede hibridizar con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga una cadena de poly (A) o el complemento de la misma (por ejemplo, prácticamente cualquier clona de ADNc de cadena doble) . En las modalidades específicas, los polinucleótidos de la invención son menores de 100000 kb, 50000 kb, 10000 kb, 1000 kb, 500 kb, 400 kb, 350 kb, 300 kb, 250 kb, 200 kb, 175 kb, 150 kb, 125 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 40 kb, 30 kb, 25 kb, 20 kb, 15 kb, 7.5 kb o 5 kb de longitud. Como se indicó, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención las cuales codifican para un polipéptido de KDI pueden incluir, pero no se limitan a aquellos que codifican para la secuencia de aminoácidos del polipéptido completo, por si mismo; y la secuencia codificante para el polipéptido completo y la secuencias adicionales, tales como aquellas que codifican para una secuencia líder secretora agregada, tal como una secuencia de proteína pre- o pro- o prepro- . También codificado por los ácidos nucleicos de la invención están las secuencias proteínicas anteriores junto con secuencias no codificantes adicionales que incluyen, por ejemplo, pero que no se limitan a intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas no traducidas que juegan un papel en la transcripción, procesamiento de ARNm, que incluyen empalme y señales de poliadenilación, por ejemplo - unión y estabilidad de ribosoma del ARNm; una secuencia codificante adicional la cual codifica para aminoácidos adicionales, tales como aquellos los cuales proporcionan funcionalidades adicionales. Por lo tanto, la secuencia que codifica para el polipéptido se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica para un péptido el cual facilite la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora de aminoácidos es un péptido hexa-histidina, tal como la etiqueta que se proporciona en el vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . USA 86: 821 -824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta "HA" es otro péptido útil para purificación el cual corresponde a un epitopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza, la cual se ha descrito por Wilson et al . , Cell 37 : 161 (1984) . Como se discute posteriormente, otra de tales proteínas de fusión incluye KDI fusionado a Fe en la parte N o C terminal .

Polinucleótidos Variantes y Mutantes La presente invención se relaciona adicionalmente con variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención las cuales codifican para porciones, análogos derivados de la proteína de KDI . Las variantes se pueden presentar de manera natural, tales como la variante alélica natural. Por una "variante alélica" se quiere significar una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un lugar dado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed. , John Wiley & Sons, New York (1985) . Las variantes que no se presenten de manera natural se pueden producir utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica.

Tales variantes incluyen aquellas producidas por sustituciones, supresiones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, supresiones o adiciones pueden involucrar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en las regiones codificantes, regiones no codificantes o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Especialmente preferidas entre este están las sustituciones, adiciones y supresiones silenciosas las cuales no alteran las propiedades ni las actividades de la proteína de KDI o de porciones de la misma. También se prefieren especialmente a este respecto las sustituciones conservadoras. Las modalidades adicionales incluyen una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos 90% idéntica y, de manera más preferible, por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleótido que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de KDI que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC. DE IDENT. NO: 2; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de KDI que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC. DE IDENT. NO: 2, exceptuando la metionina N terminal (es decir, los residuos 2-161 en la SEC. DE IDENT . NO: 2; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido maduro de KDI que tiene la secuencia que se muestra como residuos 28-207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; (d) una secuencia nucleotídica que codifica para los residuos 165-183 mostrados en la SEC. DE IDENT. NO: 2; (e) una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia completa de aminoácidos por el /ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; (f) una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia completa de aminoácidos codificada por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15, exceptuando la metionina N terminal; (g) una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; y (h) una secuencia nucleotídica complementaria para cualquiera de las secuencias nucleotídicas en los incisos (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f) y (h) anteriores. Las modalidades adicionales de la invención incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos 90% idéntica, y de manera más preferible por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquier secuencia nucleotídica en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) anteriores, o un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones de hibridación astringentes a un polinucleótido en los incisos (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) anteriores. Este polinucleótido el cual hibridiza, no hibridiza bajo condiciones de hibridación astringentes a un polinucleótido que tenga una secuencia nucleotídica que consistan únicamente de residuos A o únicamente de residuos T. Una modalidad adicional de ácido nucleico de la invención se relaciona con una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido el cual codifica para la secuencia de aminoácidos de una porción que presenta un epitopo de un polipéptido KDI que tiene una secuencia de aminoácidos en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) o (g) anteriores. La presente invención también se relaciona con vectores recombinantes, los cuales incluyen las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención y con células huéspedes que contienen los vectores recombinantes, así como con métodos para elaborar tales vectores y células huéspedes, y para utilizarlos en la producción de polipéptidos de KDI o péptidos por técnicas recombinantes. Por un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos, por ejemplo 95% "idéntica" a una secuencia nucleotídica de referencia que codifica para un polipéptido de KDI, se pretende que la secuencia nucleotídica del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótido de referencia que codifica para el polipéptido KDI . En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos 95% idéntica a una secuencia nucleotídica de referencia, se pueden suprimir o sustituir hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia con otros nucleótidos, o una cantidad de nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar dentro de la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia se pueden presentar en las posiciones 5 ' o 3 ' terminales de la secuencia nucleotídica de referencia o en cualquier otra parte entre estas posiciones terminales, interpuestas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia, o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Prácticamente, cuando cualquier molécula particular de ácido nucleico es por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica, por ejemplo a la secuencia nucleotídica que se muestra en la figura l o a las secuencias nucleotídicas de la clona de ADNc depositada se puede determinar convencionalmente utilizando programas de computadora tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) . Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias {Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)). Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se establecen, por supuesto, de manera que se calcule el porcentaje de identidad sobre toda la longitud de la secuencia nucleotídica de referencia y se permiten separaciones en homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia completa entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objetivo, también denominada como una alineación de secuencia global, se puede determinar utilizando el programa de computadoras FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et . al. (Comp. App . Biosci . (1990) 6:237-245). En una alineación de secuencia, las secuencias en cuestión y objeto son ambas secuencias de ADN. Se puede comparar una secuencia de ARN al convertir U a T. El resultado de tal alineación de secuencia global es el por ciento de identidad. Los parámetros preferidos utilizados en la alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el por ciento de identidad son: matriz= unitaria, múltiplo de k = 4 , castigo por mal pareamiento = 1, castigo por unión = 30, longitud del grupo de aleatorización = 0, calificación de corte = 1, castigo por separación = 5, castigo por tamaño de separación 0.05, tamaño de intervalo = 500 o la longitud de la secuencia nucleotídica objeto, lo que sea más corto. Si la secuencia objetivo es más corta que la secuencia en cuestión debido a las supresiones 5 ' ó 3 ' y no debido a supresiones internas, se debe realizar una corrección manual de los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no toma en cuenta las partes truncadas 5 ' y 3 ' de la secuencia sujeto cuando calcula el por ciento de identidad. Para secuencias sujeto truncadas en los extremos 5' y 3' en relación a la secuencia en cuestión, el por ciento de identidad se corrige al calcular el número de bases de la secuencia en cuestión que están 5' y 3' de la secuencia objeto, las cuales no coinciden/se alinean, como el por ciento de bases totales de la secuencia en cuestión. Cuando un nucleótido está coincidente/alineado se determina por los resultados de la alineación de la secuencia FASTDB. Este porcentaje después se resta del por ciento de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros específicos, para llegar a una calificación de identidad en por ciento final. Esta calificación corregida es la que se utiliza para propósitos de la presente invención. Únicamente bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia sujeto, se muestran por la alineación FASTDB, la cual no está coincidente/alineada con la secuencia en cuestión, y se calculan con propósitos de ajustar manualmente la calificación de por ciento de identidad.

Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se alinea hasta una secuencia en cuestión de 100 bases para determinar el por ciento de identidad. Las supresiones se presentan en el extremo 5' de la secuencia sujeto y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra una coincidencia/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no pareadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no coincidentes/número total de bases en la secuencia en cuestión) , de manera que se resta 10% de la calificación de por ciento de identidad calculada por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes coinciden perfectamente, el por ciento de identidad final será de 90%. En otro ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se compara con una secuencia en cuestión de 100 bases. Esta vez las supresiones son supresiones internas de manera que no hay bases en los extremos 5' o 3' de las secuencias de objeto los cuales no coincidan/se alineen con la secuencia en cuestión. En este caso, el por ciento de identidad se calcula por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, únicamente las bases 5 ' y 3 ' de las secuencias sujeto las cuales no coinciden/se alinean con la secuencia en cuestión son corregidas manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los propósitos de la presente invención. La presente solicitud se dirige a moléculas de ácido nucleico por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) o a la secuencia de ácido nucleico del ADN depositado, sin importar si codifica para un polipéptido que tiene actividad para KDI . Esto es debido a que incluso cuando la molécula particular de ácido nucleico no codifica para un polipéptido que tiene actividad para KDI , una persona experta en la técnica aún sabrá como utilizar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como una sonda de hibridación o un cebador de una reacción en cadena de polimerasa (PCR) . El uso de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican para un polipéptido que tiene actividad de KDI incluyen, por ejemplo, aislar variantes alélicas en una biblioteca de ADNc. Sin embargo, se prefiere que las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) o con la secuencia de ácido nucleico del ADN depositado el cual de hecho, codifica para un polipéptido que tiene actividad de proteína de KDI . Por el término "un polipéptido que tiene actividad de KDI" se quiere significar polipéptidos que muestren actividad similar, aunque no necesariamente idéntica a la actividad de la proteína de KDI de la invención, medida en un ensayo biológico particular. Por ejemplo, la proteína de KDI de la presente invención inhibe la formación de colonias de médula ósea in vitro y se pueden realizar ensayos de acuerdo con el método de Tiefenthaler M, et al., ( Interferon Cytokine Res . 1997 Junio:17(6) :327-329, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . Además, KDI puede inhibir la proliferación inducida por GM-CSF de la línea de " células eritroleucémicas TF-1 de acuerdo con los ensayos reportados por Mire-Sluis A.R. et al. (J. Immunol . Methods 1996 Septiembre 9:195(1-2) : 55-61, incorporado en la presente como referencia) . Alternativamente, se puede ensayar KDI para la actividad clásica antiviral por cualquiera de los diversos ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo en el ensayo reportado por Sugiyama K. et al. ( Yakugaku Zasshi 1995 Mayo:115 (5) :390-393) . La proteína de KDI de la presente invención inhibe la proliferación de médula ósea y muestra actividad antiviral de una manera dependiente de la dosis en los ensayos descritos antes. Por lo tanto, "un polipéptido que tiene actividad de proteína de KDI" incluye polipéptidos que también muestran cualquiera de las mismas actividades en los ensayos descritos antes, de una manera dependiente de la dosis. Aunque el grado de actividad dependiente de la dosis no necesita ser idéntico al de la proteína de KDI, preferiblemente "un polipéptido que tenga actividad de proteína de KDI" mostrará una dependencia de la dosis sustancialmente similar a la actividad dada en comparación con la proteína de KDI (es decir, el polipéptido candidato mostrará mayor actividad y no más de aproximadamente 25 veces menos y, preferiblemente, no más de aproximadamente 10 veces menos actividad en relación a la proteína de KDI de referencia) . Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, una persona habitualmente experta en la técnica reconocerá de inmediato que una gran cantidad de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico del ADNc depositado o la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) codificada por un polipéptido que "tiene actividad de proteína de KDI". De hecho, puesto que las variantes degeneradas de estas secuencias nucleotídicas codifican todas para el mismo polipéptido, será claro para aquellos expertos en la técnica, incluso sin realizar el ensayo de comparación descrito antes. Se reconocerá además en la técnica que, tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará para un polipéptido que tiene actividad de proteína KDI . Esto es debido a que los expertos en la técnica saben completamente de las sustituciones de aminoácidos que es menos probable o que no es probable que tengan efecto significativo en la función proteínica (por ejemplo al sustituir un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático) , como se describe adicionalmente después.

Vectores y Células Huésped+ La presente invención también se relaciona con vectores los cuales incluyen las moléculas aisladas de ADN de la presente invención, células huésped las cuales han sido sometidas a ingeniería genética con los vectores recombinantes y la producción de los polipéptidos de KDI o fragmentos de los mismos por técnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes en cuanto a replicación o defectuosos en cuanto a replicación. En este último caso, la propagación viral generalmente se producirá únicamente en células huéspedes complementarias. Los polinucleótidos se pueden unir a un vector que contenga un marcador seleccionable para propagación en un huésped. Generalmente, se introduce un vector plasmídico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede empacar in vitro utilizando una línea de células apropiadas de empacado y después se somete a transducción dentro de las células huéspedes. El inserto de ADN debe estar unido operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli , los promotores temprano y tardío de SV40 y los promotores de las LTR retrovirales, por mencionar algunos. Otros promotores adecuados serán conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los constructos de expresión contienen además sitios para inicio de transcripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de unión de ribosoma para traducción. La porción codificante de los transcritos expresadas por los constructos preferiblemente incluirán un codón de inicio de traducción del inicio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) , colocado apropiadamente al final del polipéptido que se va a traducir. Como se indicó, los vectores de expresión preferiblemente incluirán por lo menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasas, resistencia a G418 o neomicina para cultivo de células eucarióticas y genes de resistencia a tetraciclina, canamicina o ampicilina para cultivarse en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero no se limitan a células bacterianas, tales como E. coli , Streptomyces y células de Salmonella typhi urium: células micóticas tales como células de levadura; células de insectos tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, 293 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios de cultivo y las condiciones apropiadas para las células huéspedes descritas antes de conocen en la técnica.

Entre los vectores preferidos para uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de QIAGEN, Inc., supra ; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18a, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG, disponibles de Stratagene; y pSVK3 , pBPV, pMSG y pSVL, disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán evidentes fácilmente para un experto en la técnica. La introducción del constructo dentro de la célula huésped se puede llevar a cabo por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, traducción, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio, tales como Davis et al . , Basic Methods In Molecular Biology (1986) . El polipéptido se puede expresar en una forma modificada, por ejemplo como una proteína de fusión y puede incluir no solo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, se puede agregar a la parte N terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia de la célula huésped durante la purificación o durante el manejo subsecuente y almacenamiento. Además, se pueden agregar porciones peptídicas al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones se pueden remover antes de la preparación final del polipéptido. La adición de porciones peptídicas a polipéptidos para generar secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otras cosas, son procedimientos familiares y técnicas rutinarias o habituales en la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para estabilizar y purificar proteínas. Por ejemplo, el documento EP-A-0 464 533 (contraparte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de la región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fe en una proteína de fusión es cuidadosamente ventajosa para uso en terapia y diagnóstico y por lo tanto resulta, por ejemplo, en propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A- 0232 262) . Por otra parte, para algunos usos es deseable ser capaces de suprimir la parte Fe después de que la proteína de fusión se ha expresado, detectado y purificado de una manera ventajosa descrita. Este es el caso cuando la porción Fe demuestra ser un impedimento para uso en terapia y diagnóstico, por ejemplo, cuando la proteína de fusión se va a utilizar como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de medicamentos, por ejemplo, las proteínas humanas tales como hIL-5 se han fusionado con porciones de Fe con el propósito de realizar ensayos de análisis de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Véase D. Bennett et al . , J. Molecular Recogni tion 8:52-58 (1995) y K. Johanson et al . , J. Biol . Chem. 270:9459-9471 (1995) . La proteína de KDI se puede recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción acida, intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía con lectina. De manera más preferible., se utiliza para purificación la cromatrografía líquida de alta resolución ("CLAR"). Los polipéptidos de la presente invención incluyen: productos purificados de fuentes naturales que incluyen fluidos corporales, tejidos y células, ya sea aislados o cultivados directamente; productos de procedimientos de síntesis química; y productos elaborados por técnicas recombinantes a partir de huéspedes procariotes o eucarióticos que incluyen, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. En base en el huésped utilizado en el procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención se pueden glicosilar o pueden ser no glicosilados .

Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo metionina modificado inicial. En algunos casos, como resultado de los procesos mediados por huéspedes. Por lo tanto, es bien sabido en la técnica que la metionina N terminal codificada por el codón de inicio de traducción generalmente se remueve con alta eficiencia a partir de cualquier proteína después de la traducción en todas las células eucarióticas. Mientras que la metionina N terminal de la mayor parte de las proteínas también se remueve eficientemente en la mayor parte de las procariotas, para algunas proteínas este proceso de remoción procariótico es ineficiente, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al cual se une covalentemente la metionina N terminal.

Polipéptidos y Fragmentos La invención proporciona además un polipéptido de KDI aislado que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADN depositado, o la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE IDENT. NO: 2, o un péptido o polipéptido que comprende una porción de los polipéptidos anteriores.

Polipéptidos Variantes y Mutantes Con el fin de mejorar o alterar las características de los polipéptidos de KDI, se puede utilizar ingeniería de proteínas. La tecnología de ADN recombinante conocida por aquelloss expertos en la técnica se puede utilizar para crear proteínas mutantes novedosas o "muteínas" que incluye sustituciones, supresiones, adiciones o de aminoácidos únicos o múltiples, o proteínas de fusión. Tales polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, actividad mejorada o estabilidad aumentada. Además, se pueden purificar con rendimientos mayores y mostrar mejor solubilidad que los polipéptidos naturales correspondientes, por lo menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento.

Ahitantes con Supresión en la Parte N Terminal y C terminal Por ejemplo, para muchas proteínas, incluyendo el dominio extracelular de una proteína asociada a membrana o la forma o formas maduras de una proteína secretada, se conoce en la técnica que uno o más aminoácidos se pueden suprimir de la parte N terminal o C terminal sin pérdida sustancial de la función biológica. Por ejemplo, Ron et al., J. Biol . Chem . , 268 : 2984 - 2988 (1993) informó de proteínas modificadas de KGF que tienen actividad de unión de heparina incluso si se han perdido 3, 8 ó 27 residuos aminoácidos de la parte amino terminal. En el presente caso, puesto que la proteína de la invención es un miembro de la familia de polipéptidos de interferón, las supresiones de los aminoácidos en la parte N terminal hasta la cisteína en la posición 59, como se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2 puede retener cierta actividad biológica tal como actividad antiviral o inhibición de proliferación de médula ósea. Los polipéptidos que tienen más supresiones en la parte N terminal incluyendo al residuo Cys-59 en la SEC. DE IDENT. NO: 2 no se espera que retengan tales actividades biológicas debido a que se sabe que este residuo es un polipéptido relacionado con interferón conservado entre muchos, si no todos, los miembros de la familia como lo es el residuo leucina inmediatamente adyacente al mismo (residuo 60) . El residuo cisteína en la posición 59 se considera que se requiere para formar un puente disulfuro para proporcionar estabilidad estructural la cual es necesaria para la unión del receptor y la transducción de señal . Sin embargo, incluso si la pérdida de uno o más aminoácidos de la parte N terminal de una -proteína resulta en una modificación de pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, aún se pueden retener otras actividades biológicas. Por lo tanto, la capacidad de la proteína acortada para inducir o unirse a anticuerpos, o ambas cosas, los cuales reconocen la proteína completa generalmente se retendrá cuando menos de la mayor parte de los residuos de la proteína completa se remuevan de la parte N terminal. Cuando un polipéptido particular que carece de los residuos de la parte N terminal de una proteína completa retiene tales actividades inmunológicas se puede determinar fácilmente por métodos sistemáticos o habituales descritos en la presente y conocidos de alguna otra manera en la técnica. En consecuencia, la presente invención proporciona además polipéptidos que tienen uno o más residuos suprimidos de su parte amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la KDI mostrada en la SEC. DE IDENT. NO: 2, hasta Cys-59, y polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los residuos N-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, en donde n es un número entero en el intervalo de 1-59 y en donde Cys-59 es la posición del primer residuo desde la parte N terminal del polipéptido KDI completo (mostrado en la SEC. DE IDENT. NO: 2) que se considera necesaria para actividad de la proteína KDI . De manera más particular, la invención proporciona polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-207, 2-207, 3-207, 4-207, 5-207, 6-207, 7-207, 8-207, 9-207, 10-207, 11-207, 12-207, 13-207, 14-207, 15-207, 16-207, 17-207, 18-207, 19-207, 20-207, 21-207, 22-207, 23-207, 24-207, 25-207, 26-207, 27-207, 28-207, 29-207, 30-207, 31-207, 32-207, 33-207, 34-207, 35-207, 36-207, 37-207, 38-207, 39-207, 40-207, 41-207, 42-207, 43-207, 44-207, 45-207, 46-207, 47-207, 48-207, 49-207, 50-207, 51-207, 52-207, 53-207, 54-207, 55-207, 56-207, 57-207, 58-207, y 59-207, todos de la SEC. DE IDENT. NO: 2. También se proporcionan polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos. Similarmente, se conocen muchos ejemplos de muteínas de supresión en la parte C terminal biológicamente funcionales. Por ejemplo, el interferón gamma muestra hasta diez veces actividades más altas al suprimir 8-10 residuos aminoácidos de la parte carboxi terminal de la proteína (Dóbeli et al . , J. Biotechnology 7:199-216 (1988) . En el presente caso, puesto que la proteína de la invención es un miembro de la familia de polipéptidos de interferón, las supresiones de los aminoácidos en la parte C terminal hasta el residuo triptófano en la posición 183 (W-183) en la SEC. DE IDENT. NO: 2 puede retener cierta actividad biológica tal como actividad antiviral o inhibición de la proliferación en médula ósea. Los polipéptidos que tienen supresiones adicionales en la parte C terminal incluyen lie-183 de la SEC. DE IDENT. NO: 2 no se esperaría que retengan tales actividades biológicas debido a que se sabe que este residuo es un polipéptido relacionado con interferón que se conserva entre muchos miembros y se piensa que es importante para la unión de receptor y la transducción de señal. Además, el residuo cisteína en la posición 181 está altamente conservado y se sabe que se requiere para actividad antiviral de miembros de la familia de interferón. Sin embargo, incluso si la supresión de uno o más aminoácidos de la parte C terminal de una proteína resulta en una modificación de pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, aún se pueden retener otras actividades biológicas. Por lo tanto, la capacidad de la proteína para inducir o unirse a anticuerpos el cual reconocerá a la proteína completa generalmente se retendrá cuando menos de la mayoría de los residuos de la proteína completa se remuevan de la parte C terminal. Siempre que un polipéptido particular carezca de residuos C terminales de una proteína completa retenga tales actividades inmunológicas se puede determinar fácilmente por métodos sistemáticos descritos en la presente y conocidos de alguna otra manera en la técnica. En consecuencia, la presente invención proporciona además polipéptidos que tienen uno o más residuos de la parte carboxi terminal de la secuencia de aminoácidos del KDI que se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2, hasta Trp-183 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, y polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-m de la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE IDENT. NO: 2, en donde m es cualquier número entero en el intervalo de 183-207, y el residuo Trp-183 es la posición del primer residuo desde la parte C terminal del polipéptido completo de KDI (que se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2) que se considera se requiere para actividad de la proteína KDI . De manera más particular, la invención proporciona polipéptidos que tengan la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-183, 1-184, 1-185, 1-186, 1-187, 1-188, 1-189, 1-190, 1-191, 1-192, 1-193, 1-194, 1-195, 1-196, 1-197, 1-198, 1-199, 1-200, 1-201, 1-202, 1-203, 1-204, 1-205, 1-206 y 1-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2. También se proporcionan polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos. La invención también proporciona polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos suprimidos de las partes terminales tanto amino como carboxilo, los cuales se pueden describir generalmente con residuos n-m de la SEC. DE IDENT. NO: 2, en donde n y m son números enteros como se describe en lo anterior. Además, la invención proporciona estos polipéptidos mutantes que opcionalmente tienen una metionina N-terminal. Los polipéptidos por lo tanto también se pueden describir por la fórmula x-n-m en donde X es cualquiera de NH2 o met y n y m son números enteros como se describe antes. Por supuesto, también se proporcionan polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos. De manera más particular, la invención preferiblemente proporciona polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de residuos: 20-183, 21-183, 22-183, 23-183 24-183, 25-183, 26-183, 27-183, 28-183, 29-183, 30-183, 31-183 32-183, 33-183, 34-183, 35-183, 36-183, 37-183, 38-183, 39-183 40-183, 41-183, 42-183, 43-183, 44-183, 45-183, 46-183, 47-193 48-183, 49-183, 50-183, 51-183, 52-183, 53-183, 54-183, 55-183 56-183, 57-183, 58-183, 59-183, 20-184, 21-184, 22-184, 23-184 24-184, 25-184, 26-184, 27-184, 28-184, 29-194, 30-194, 31-184 32-184, 33-184, 34-184, 35-184, 36-184, 37-194, 38-184, 39-184 40-184, 41-184, 42-184, 43-184, 44-184, 45-184, 46-184, 47-184 48-184, 49-184, 50-184, 51-184, 52-184, 53-184, 54-184, 55-184 56-184, 57-184, 58-184, 59-184, 20-185, 21-185, 22-185, 23-185 24-185, 25-185, 26-185, 27-185, 28-185, 29-185, 30-185, 31-185 32-185, 33-185, 34-185, 35-185, 36-185, 37-185, 38-185, 39-185 40-185, 41-185, 42 -185, 43-185, 44-185, 45-185, 46-185, 4 -185, 48-185, 49-185, 50-185, 51-185, 52-185, 53-185, 54-185 55-185, 56-185, 57-185, 58-185, 59-185, 20-186, 21-186, 22-186 23-186, 24-186, 25-186, 26-186, 27-186, 28-186, 29-186, 30-186 31-186, 32-186, 33-186, 34-186, 35-186, 36-186, 37-186, 38-186 39-186, 40-186, 41-186, 42-186, 43-186, 44-186, 45-186, 46-186 47-186, 48-186, 49-186, 50-186, 51-186, 52-186, 53-186, 54-186 55-186, 56-186, 57-186, 58-186, 59-186, 20-187, 21-187 22-187, 23-187, 24-187, 25-187, 26-187, 27-187, 28-187, 29-187 30-187, 31-187, 32-187, 33-187, 34-187, 35-187, 36-187, 37-187 38-187, 39-187, 40-187, 41-187, 42-187, 43-187, 44-187, 45-187 46-187, 47-187, 48-187, 49-187, 50-187, 51-187, 52-187, 53-187 54-187, 55-187, 56-187, 57-187, 58-187, 59-187, 20-188, 21- -188, 22- -188, 23- -188, 24- -188, 25 -188, 26 -188, 27 -188, 28 -188, 29- -188, 30- -188, 31- -188, 32- -188, 33- -188, 34- -188, 35 -188, 36- -188, 37- -188, 38- -188, 39- -188, 40- -188, 41- -188, 42- -188, 43- -188, 44- -188, 45- -188, 46- -198, 47- -188, 48- -188, 49- -188, 50- -188, 51- -188, 52- -188, 53- -188, 54- -188, 55- -188, 56- -188, 57- -188, 58- -188, 59- -199, 20- -189, 21- -189, 22- -189, 23- -189, 24- -189, 25- -189, 26- -189, 27- -189, 28- -189, 29- -189, 30- -189, 31- -189, 32- -189, 33- -189, 34- -189, 35- -189, 36- -189, 37- -189, 38- -189, 39- -189, 40- -189, 41- -189, 42- -189, 43- -189, 44- -189, 45- -189, 46- -189, 47- -189, 48- -189, 49- -189, 50- -189, 51- -189, 52- -189, 53- -189, 54- -189, 55- -189, 56- -189, 57- -189, 58- -189, 59- -189, 20- -190, 21- -190, 22- -190, 23- -190, 24- -190, 25- -190, 26- -190, 27- -190, 28- -190, 29- -190, 30- -190, 31- -190, 32- -190, 33- -190, 34- -190, 35- -190, 36- -190, 37- -190, 38- -190, 39- -190, 40- -190, 41- -190, 42- -190, 43- -190, 44- -190, 45- -190, 46- -190, 47- -190, 48- -190, 49- -190, 50- -190, 51- -190, 52- -190, 53- -190, 54- -190, 55- -190, 56- -190, 57- -190, 58- -190, 59- -190, 20- -191, 21- -191, 22- -191, 23- -191, 24- -191, 25- -191, 26- -191, 27- -191, 28- -191, 29- -191, 30- -191, 31- -191, 32- -191, 33- -191, 34- -191, 35- -191, 36- -191, 37- -191, 38- -191, 39- -191, 40- -191, 41- -191, 42- -191, 43- -191, 44- -191, 45- -191, 46- -191, 47- -191, 49- -191, 49- -191, 50- -191, 51- -191, 52- -191, 53- -191, 54- -191, 55- -191, 56- -191, 57- -191, 58- -191, 59- -191, 20- -192, 21- -192, 22- -192, 23- -192, 24- -192, 25- -192, 26- -192, 27- -192, 28- -192, 29- -192, 30- -192, 31- -192, 32- -192, 33- -192, 34- -192, 35- -192, 36- •192, 37- -192, 38.- -192, 39- -192, 40- -192, 41- -192, 42- -192, 43- -192, 44- •192, 45- •192, 46- •192, 47- 192, 48- -192, 49- -192, 50- •192, 51- •192, 52- 192, 53- -192, 54- -192, 55- 192, 56- -192, 57- -192, 59- •192, 59- -192, 20- 193, 21-193 22-193,, 23-193, 24-193, 25-193, 26-193, 27-193, 28-193 29-193, 30-193, 31--193, 32-193, 33-193, 34-193, 35-193, 36-193 37-193, 38-193, 39--193, 40-193, 41-193, 42-193, 43-193, 44-193 45-193, 46-193, 47- 193, 48-193, 49-193 ,, 50-193 , 51-193, 52-193 53-193, 54-193, 55--193, 56-193, 57-193, 58-193, 59-193, 20-194 21-194, 22-194, 23--194, 24-194, 25-194, 26-194, 27-194, 28-194 29-194, 30-194, 31--194, 32-194, 33-194, 34-194, 35-194, 36-194 37-194, 38-194, 39--194, 40-194, 41-194, 42-194, 43-194, 44-194 45-194, 46-194, 47-194, 48-194, 49-194, 50-194, 51-194 52-194 53-194, 54 -194 55-194, 56-1 94, 57-194, 58-194, 59-194 20-195 21-195, 22 -195, 23-195, 24-195, 25-195, 26-195, 27-195 28-195 29-195, 30 -195, 31-195, 32-195, 33-195, 34-195, 35-195 36-195 37-195, 38- 195, 39-195, 40-195, 41-195, 42-195, 43-195 44-195 45-195, 46- 195, 47-195, 48-195, 49-195, 50-195, 51-195 52-195 53-195, 54- 195, 55-195, 56-195, 57-195, 58-195, 59-195 20-196 21-196, 22 196, 23-196, 24-196, 25-196, 26-196, 27-196 28-196 29-196, 30-•196, 31-196, 32-196, 33-196, 34-196, 35-196 36-196 37-196, 38- 196, 39-196, 40-196, 41-196, 42-196, 43-196 44-196 45-196, 46- 196, 47-196, 48-196, 49-196, 50-196, 51-196 52-196 53-196, 54- 196, 55-196, 56-196, 57-196, 58-196, 59-196 20-197 21-197, 22- 197, 23-197, 24-197, 25-197, 26-197, 27-197 28-197 29-197, 30- 197, 31-197, 32-197, 33-197, 34-197, 35-197 36-197 37-197, 38- 197, 39-197, 40-197, 41-197, 42-197, 43-197 44-197 45-197, 46- 197, 47-197, 48-197, 49-197, 50-197, 51-197 52-197 53-197, 54- 197, 55-197, 56-197, 57-197, 58-197, 59-197 20-198 21-198, 22 -198, 23 -199, 24-198 25-198 26-198, 27-198 28-198 29-198, 30 -198, 31-198, 32-198 33-198 34-198, 35-198 36-198 37-198, 38 -198, 39 -198, 40-198 41-198 42-198, 43-198 44-198 45-198, 46 -198, 47-198, 48-198 49-198 50-198, 51-198 52-198 53-198, 54 -198, 55 -198, 56-198 57-198 58-198, 59-198 20-199 21-199, 22 -199, 23 -199, 24-199 25-199 26-199, 27-199 28-199 29-199, 30 -199, 31 -199, 32-199 33-199 34-199, 35-199 36-199 37-199, 38 -199, 39 -199, 40-199 41-199 42-199, 43-199 44-199 45-199, 46 -199, 47-199, 48-199 49-199 50-199, 51-199 52-199 53-199, 54 -199, 55 -199, 56-199 57-199 58-199, 59-199 20-200 21-200, 22 -200, 23 -200, 24-200 25-200 26-200, 27-200 28-200 29-200, 30 -200, 31 -200, 32-200 33-200 34-200, 35-200 36-200 37-200, 38 -200, 39 -200, 40-200 41-200 42-200, 43-200 44-200 45-200, 46- 200, 47--200, ,48-200 49-200 50-200, 51-200 52-200 53-200, 54--200, 55 -200, 56-200 57-200 58-200, 59-200 20-201 21-201, 22 -201, 23 -201, 24-201 25-201 26-201, 27-201 28-201 29-201, 30-•201, 31 -201, 32-201 33-201 34-201, 35-201 36-201 37-201, 38--201, 39 -201, 40-201 41-201 42-201, 43-201 44-201 45-201, 46--201, 47 -201, 48-201 49-201 50-201, 51-201 52-201 53-201, 54--201, 55--201, 56-201 57-201 58-201, 59-201 20-202 21-202, 22--202, 23--202, 24-202 25-202 26-202, 27-202 28-202 29-202, 30--202, 31--202, 32-202 33-202 34-202, 35-202 36-202 37-202, 38--202, 39--202, 40-202 41-202 42-202, 43-202 44-202 45-202, 46- 202, 47--2021 48-202 49-202 50-202, 51-202 52-202 53-202, 54- 202, 55--202, 56-202 57-202 58-202, 59-202, 20-203, 21-203, 22-203, 23-203, 24-203, 25-203, 26-203, 27-203, 28-203, 29-203, 30-203, 31-203, 32-203, 33-203, 34-203, 35-203, 36-203, 37-203, 38-203, 39-203, 40-203, 41-203, 42-203, 43-203, 44-203, 45-203, 46-203, 47-203, 48-203, 49-203, 50-203, 51-203, 52-203, 53-203, 54-203, 55-203, 56-203, 57-203, 58-203, 59-203, 20-204, 21-204, 22-204, 23-204, 24-204, 25-204, 26-204, 27-204, 28-204, 29-204, 30-204, 31-204, 32-204, 33-204, 34-204, 35-204, 36-204, 37-204, 38-204, 39-204, 40-204, 41-204, 42-204, 43-204, 44-204, 45-204, 46-204, 47-204, 48-204, 49-204, 50-204, 51-204, 52-204, 53-204, 54-204, 55-204, 56-204, 57-204, 58-204, 59-204, 20-205, 21-205, 22-205, 23-205, 24-205, 25-205, 26-205, 27-205, 28-205, 29-205, 30-205, 31-205, 32-205, 33-205, 34-205, 35-205, 36-205, 37-205, 38-205, 39-205, 40-205, 41-205, 42-205, 43-205, 44-205, 45-205, 46-205, 47-205, 48-205, 49-205, 50-205, 51-205, 52-205, 53-205, 54-205, 55-205, 56-205, 57-205, 58-205, 59-205, 20-206, 21-206, 22-206, 23-206, 24-206, 25-206, 26-206, 27-206, 28-206, 29-206, 30-206, 31-206, 32-206, 33-206, 34-206, 35-206, 36-206, 37-206, 38-206, 39-206, 40-206, 41-206, 42-206, 43-206, 44-206, 45-206, 46-206, 47-206, 48-206, 49-206, 50-206, 51-206, 52-206, 53-206, 54-206, 55-206, 56-206, 57-206, 58-206 y 59-206 de la SEC. DE IDENT. NO: 2. Cada uno de los polipéptidos anteriores puede incluir adicionalmente un residuo metionina N terminal, también se proporcionan polinucleótidos que codifican para cada uno de estos polipéptidos, con o sin un residuo metionina N terminal.

También se incluyen polipéptidos que consisten de una porción de la secuencia completa de aminoácidos de KDI codificados por el ADNc humano en la clona HKAPI15, en donde esta porción excluye de uno a aproximadamente 58 aminoácidos de la parte amino terminal de la secuencia completa de aminoácidos codificada por el ADNc humano en la clona HKAPI15, o de 1 a aproximadamente 23 aminoácidos de la parte carboxi terminal, o cualquier combinación de las supresiones amino terminal y carboxi terminal anteriores, de la secuencia completa de aminoácidos codificada por el ADNc humano en la clona HKAPI15. También se proporcionan polinucleótidos que codifican para la totalidad de las formas polipeptídicas mutantes por supresión anteriores.

Otros Mutantes Además de las formas de supresión terminal de las proteínas discutidas antes, también se reconocerá por aquellos habitualmente expertos en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de polipéptido de KDI pueden variar sin efecto significativo en la estructura o la función de la proteína. Si se contemplan tales diferencias en la secuencia, se debe recordar que habrá áreas críticas en la proteínas las cuales determinan la actividad.

Por lo tanto, la invención incluye además variaciones del polipéptido de KDI las cuales muestran actividad sustancial del polipéptido KDI o las cuales incluyen regiones de la proteína de KDI tales como las porciones de proteína discutidas posteriormente. Tales mutantes incluyen supresiones, inserciones, inversiones, secuencias repetidas y tipos de sustitución que se seleccionan de acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica de manera que tienen poco efecto sobre la actividad. Por ejemplo, una guía respecto a como realizar sustituciones silenciosas de aminoácidos fenotípicamente se proporciona en Bowie J. U et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions , " Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que existen dos soluciones principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio. El primer método se basa en el proceso de evolución, en el cual las mutaciones son aceptadas o rechazadas por selección natural. El segundo enfoque utiliza ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y selecciones o análisis para identificar secuencias que mantienen funcionalidad . Como lo establecen los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además cuales cambios de aminoácidos es probable que sean permisivos en cierta posición de la proteína. Por ejemplo, los residuos aminoácidos más enterados requieren cadenas laterales no polares, mientras que algunas características de las cadenas laterales de superficie generalmente se conservan. Otras de tales sustituciones fenotípicamente silenciosas se describen en Bowie, J. U. et al . , supra y en las referencias mencionadas en ese documento. Visto típicamente como sustituciones conservadoras están los reemplazos, unos por otros, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e lie. El intercambio de residuos hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los residuos amida Asn y Gln, el intercambio de los residuos básicos Lys y Arg y las sustituciones entre los residuos aromáticos Phe, Tyr. Por lo tanto, el fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO: 2 o aquella codificada por el ADNc depositado puede ser (i) una en la cual uno o más de los residuos aminoácidos están sustituidos con residuos aminoácidos conservados o no conservados (preferiblemente un residuo aminoácido conservado) y tal residuo aminoácido sustituido puede o no estar codificado por el código genético, o (ii) uno el cual es uno o más de los residuos aminoácidos que incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido de KDI se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo polietilenglicol) o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales se fusionan a la forma anterior de polipéptido, tal como un péptido de la región de fusión Fe de IgG o una secuencia líder o secretora, o una secuencia la cual se utiliza para purificación de la forma anterior del polipéptido o una secuencia de proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se consideran dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente. Por lo tanto, el KDI de la presente invención puede incluir uno o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, ya sea de mutaciones naturales o de manipulación humana. Como se indicó, los cambios preferiblemente son de una naturaleza menor, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente el plegado o la actividad de la proteína. Los aminoácidos en la proteína de KDI de la presente invención que son esenciales para función se pueden identificar por métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham, and Wells, Science 244 : 1081 - 1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes después se prueban para determinar actividad biológica tal como unión de receptor o actividad proliferativa in vitro.

Son de interés especial las sustituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros los cuales pueden producir proteínas con características mejoradas altamente deseables, tales como menos agregación. La agregación no solo puede reducir la actividad sino que también es problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, debido a que los agregados pueden ser inmunogénicos (Pinckard et al . , Clin . Exp . I munol . 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al . , Cri t . Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10 : 301 -311 (1993) . La sustitución de aminoácidos también puede cambiar la selectividad de la unión de un ligando a los receptores de superficie celular. Por ejemplo, Ostade et al . , Nature 361 : 266 -268 (1993) describen ciertas mutaciones que resultan en unión selectiva de TNF-a a únicamente uno de los dos tipos conocidos de receptores de TNF. Los sitios que son críticos para la unión de ligando-receptor también se pueden determinar por análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o etiquetado por fotoafinidad (Smith et al . , J. Mol . Biol . 224:899-904 (1992) y de Vos et al . , Science 255 : 306 -312 (1992) ) . Las sustituciones particularmente preferidas para cada uno de los polipéptidos de KDI descritos aquí es la sustitución de los residuos arginina en la posición 192 con lisina (algunas veces denominada en lo siguiente como "R192K") , y la sustitución del residuo cisteína en la posición 193 con un residuo serina (algunas veces denominado en lo siguiente como "C193S"). Estas sustituciones se pueden encontrar en un polipéptido de KDI individualmente o se pueden presentar en el mismo polipéptido de KDI . Los polinucleótidos que codifican para la totalidad de los polipéptidos de KDI anteriores contienen sustituciones. Los polipéptidos de la presente invención preferiblemente se proporcionan en una forma aislada, y preferiblemente están sustancialmente purificados. Una versión producida recombinantemente del polipéptido de KDI se puede purificar sustancialmente por el método de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Los polipéptidos de la invención también se pueden purificar a partir de fuentes naturales o recombinantes utilizando anticuerpos contra-KDI de la invención en métodos los cuales son bien conocidos en la técnica de purificación de proteínas. La invención proporciona además un polipéptido aislado de KDI constituido de una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido de KDI de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos completa en la SEC. DE IDENT. NO: 2; (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido KDI de longitud completa que tiene la secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEC. DE IDENT. NO: 2, exceptuando la metionina N terminal (es decir, los residuos 2 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2 ) ; la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de KDI mostrado como residuos 28-207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; (d) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. DE IDENT. NO: 2 como residuos 165-183; (e) el polipéptido de KDI de longitud completa codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; (f) el polipéptido de longitud completa de KDI codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15, excepto la metionina N terminal; y (g) el polipéptido maduro de KDI codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15. Los polipéptidos adicionales de la presente invención incluyen polipéptidos los cuales tienen por lo menos 90% de similitud, de manera más preferible por lo menos 95% de similitud, y de manera aún más preferible por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% de similitud con los descritos antes. Los polipéptidos de la invención también comprenden aquellos los cuales son por lo menos 80% idénticos, de manera más preferible por lo menos 90% o 95% idénticos, y de manera aún más preferible por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% idénticos al polipéptido codificado por el ADN depositado o al polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO: 2 y que también incluye porciones de tales polipéptidos con por lo menos 10, 20 ó 30 aminoácidos y de manera más preferible con por lo menos 50 aminoácidos.

Una modalidad adicional de la invención se relaciona con un péptido o polipéptido el cual comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de KDI que tiene una secuencia de aminoácidos la cual contiene por lo menos una sustitución conservadora de aminoácido, pero no más de 50 sustituciones conservadoras de aminoácidos, incluso de manera más preferible, no más de 40 sustituciones conservadoras de aminoácidos, de manera aún más preferible, no más de 30 sustituciones conservadoras de aminoácidos, y de manera aún más preferible no más de 20 sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por supuesto, con el fin de una preferencia cada vez mayor, es altamente preferible que un péptido o polipéptido tenga una secuencia de aminoácidos la cual comprenda la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de KDI el cual contenga por Lo menos 1, pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o l sustitución conservadora de aminoácidos. Por "% de similitud" para los dos polipéptidos se pretende una calificación de similitud producida al comparar las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos utilizando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University research Park, 575 Science Drive Madison, Wl 53711) y los ajustes intrínsecos para determinar similitud. Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Mediante un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de referencia de aminoácidos de un polipéptido IL-20, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sea idéntica a la secuencia en cuestión excepto que la secuencia polipeptídica puede incluir hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia del polipéptido IL-20. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos y por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos en cuestión, hasta 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia en cuestión se pueden suprimir o sustituir con otros aminoácidos, o un número de aminoácidos de hasta 5% de los residuos aminoácidos tales en la secuencia de referencia se puede insertar dentro de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden presentar en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier otra parte entre estas posiciones terminales, interpuestas ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Prácticamente, siempre que un polipéptido particular es por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE IDENT. NO: 2 o la secuencia de aminoácidos codificada por la clona de ADNc depositada, se puede determinar convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analisys Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) . Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar que una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se ajustan, por supuesto, de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y se permiten separaciones en la homología de hasta 5% del número total de residuos aminoácidos en la secuencia de referencia. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia total entre la secuencia en cuestión (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominada como una alineación de secuencia global, se puede determinar utilizando el programa de computadora FASTDB en base en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). En una alineación de secuencia, las secuencias en cuestión y sujeto son- ambas secuencias nucleotídicas o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de la alineación de la secuencia global es el por ciento de identidad. Los parámetros preferidos utilizados en una alineación de aminoácidos FASTDB son: matriz = PAM 0, múltiplo de k = 2 , castigo por mal pareamiento = 1, castigo por unión = 20, longitud del grupo de aleatorización = 0, calificación de corte = 1, tamaño de intervalo = longitud de la secuencia, castigo por separación = 5, castigo por tamaño de separación = 0.05, tamaño de intervalo = 500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos sujeto, cualquiera que sea más corta. Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia objetivo debido a las supresiones N o C terminales, no debido a supresiones internas, se debe realizar una corrección manual de los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no toma en cuenta las partes truncadas N o C terminales de la secuencia sujeto cuando calcula el por ciento de identidad global. Para secuencias sujeto truncadas en las partes N y C terminales, en relación a la secuencia en cuestión, el por ciento de identidad se corrige al calcular el número de residuos de la secuencia en cuestión que son N y C terminales de la secuencia sujeto, las cuales no coinciden/se alinean, con el residuo sujeto correspondiente como el por ciento de bases totales de la secuencia en cuestión. Si un residuo coincide/se alinea, se determina por los resultados de la alineación de la secuencia FASTDB. Este porcentaje después se resta del por ciento de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior utilizando los parámetros específicos, para llegar a una calificación de identidad en por ciento final. Esta calificación de identidad de por ciento final es la que se utiliza para propósitos de la presente invención. Únicamente los residuos en las partes terminales N y C de la secuencia sujeto, los cuales no coinciden/están alineados con la secuencia en cuestión, son los que se consideran para los propósitos de un ajuste manual de la calificación del por ciento de identidad. Esto es, únicamente las posiciones de residuos en cuestión fuera de los residuos N y C terminales más alejados de la secuencia sujeto. Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos aminoácidos se alinea hasta una secuencia en cuestión de 100 residuos para determinar el por ciento de identidad. Las supresiones se presentan en la parte N terminal de la secuencia sujeto y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra una coincidencia/alineación de los primeros 10 residuos en la parte N terminal. Los 10 residuos no pareados representan 10% de la secuencia (el número de los residuos en las partes terminales N y C que no coinciden/número total de residuos en la secuencia en cuestión) , de manera que se resta 10% de la calificación del por ciento de identidad calculada por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes coinciden perfectamente, el por ciento de identidad final será de 90%. En otro ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos se compara con una secuencia en cuestión de 100 residuos. Esta vez las supresiones son supresiones internas de manera que no hay residuos en las partes terminales N o C de las secuencias sujeto las cuales no coincidan/se alineen con la secuencia en cuestión. En este caso, el por ciento de identidad se calcula por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, únicamente las posiciones de residuos fuera de los extremos N y C terminales de las secuencias sujeto como se muestran en la alineación FASTDB, las cuales no coinciden/se alinean con la secuencia en cuestión son corregidas manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los propósitos de la presente invención. El polipéptido de la presente invención se puede utilizar como un marcador de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración de gel de tamiz molecular utilizando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Como se describe con detalle en lo siguiente, los polipéptidos de la presente invención también se pueden utilizar para incrementar los anticuerpos policlonales y monoclonales, los cuales son útiles en ensayos para detectar la expresión de proteína de KDI como se describe en lo siguiente o como agonistas y antagonistas capaces de mejorar o inhibir la función de la proteína de KDI . Además, tales polipéptidos se pueden utilizar en un sistema de levadura de dos híbridos para "capturar" proteínas que se unen a proteína de KDI las cuales también son agonistas y antagonistas candidatos, de acuerdo con la presente invención. El sistema de levadura de dos híbridos se describe en Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989).

Porciones que Presentan Epi topos En otro aspecto, la invención proporciona un péptido o polipéptido que comprende una porción que presenta epitopo de un polipéptido de la invención. El epitopo de esta porción de polipéptido es un epitopo inmunogénico o antigénico de un polipéptido de la invención. Un "epitopo inmunogénico" se define como parte de una proteína que induce una respuesta de anticuerpos cuando toda la proteína es el inmunógeno. Por otra parte, una región de una molécula de proteína a la cual se puede unir un anticuerpo se define como un "epitopo antigénico" . El número de epitopos inmunogénicos de una proteína generalmente es menor que el número de epitopos antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 81:3998-4002 (1983). Respecto a la selección de péptidos o polipéptidos que presentan un epitopo antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula de proteína a la cual se puede unir un anticuerpo) , es bien sabido en esa técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan parte de una secuencia proteínica habitualmente son capaces de inducir un antisuero que reaccione con la proteína imitada parcialmente. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J. G. , Shinick, T. M. , Green, N y Learner, R. A. (1983) "Antibodies taht react with predetermined sites on proteins," Science, 219 : 660 - 666 . Los péptidos capaces de inducir sueros reactivos a proteína con frecuencia están representados en la secuencia primaria de una proteína, y pueden ser caracterizados por un conjunto de reglas químicas sencillas, y se confinan ni a regiones inmunodominantes o a proteínas intactas (es decir, epitopos inmunogénicos) ni tampoco a las partes terminales amino o carboxilo. Los péptidos y polipéptidos que presentan epitopos antigénicos de la invención por lo tanto son útiles para incrementar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido de la invención. Véase, por ejemplo, Wilson et al . , Cell 37 : 161 - 118 (1984) a 777. Los péptidos y polipéptidos que presentan epitopo antigénico de la invención preferiblemente contienen una secuencia de por lo menos 7, de manera más preferible por lo menos 9 y de manera mucho más preferible entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos o péptidos antigénicos que pueden ser utilizados para generar anticuerpos específicos para KDI incluyen: un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Ser 49 hasta aproximadamente Ser 54 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende residuos aminoácidos desde aproximadamente Cys 59 hasta aproximadamente Ala 65 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Pro 78 hasta aproximadamente Tyr 88 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente His 101 hasta aproximadamente Gln 113 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos Gln 120 hasta aproximadamente Glu 123 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos Cys 128 a aproximadamente Pro 155 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Leu 160 hasta aproximadamente Arg 168 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Asn 171 hasta aproximadamente Asp 180 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Val 186 hasta aproximadamente Cys 193 en la SEC. DE IDENT. NO: 2 ; y un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos Phe 204 hasta aproximadamente Lys 207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2. Se ha determinado que estos fragmentos polipeptídicos presentan epitopos antigénicos de la proteína de KDI por el análisis del índice antigénico de Jameson-Wolf , como se muestra en la figura 3 anterior. Los péptidos y polipéptidos de la invención que presentan epitopo se pueden producir por cualquier medio convencional. Véase, por ejemplo, Houghten, R.A. (1985) "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids". Proc . Nati . Acad. Sci . USA 82:5131-5135; este proceso de "Síntesis peptídica múltiple simultánea (SMPS) " se describe adicionalmente en la patente de los Estados Unidos No. 4,631,211 para Houghten et al . (1986). Los péptidos y polipéptidos de la invención que presentan epitopo se utilizan para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow, M. et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . USA 82:910-914; y Bittle, F. J. et al . , J. Gen . Virol . 66: 2341-2354 (1985). Los péptidos de la invención que presentan epitopos inmunogénicos, es decir, aquéllas partes de una proteína que inducen una respuesta de anticuerpo cuando la totalidad de la proteína es inmunogénica, están definidos de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Geysen et al. supra . Además, la patente de los E.U. No. 5,194,392 para Geysen (1990) describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros compuestos) el cual es un equivalente topológico de un epitopo (es decir, un "mimotopo") , el cual es complementario a un paratopo (sitio de unión de antígeno) particular de un anticuerpo de interés. De manera más general, la patente de los E.U. No. 4,433,092 para Geysen (1989) describe un método para detectar o determinar una secuencia de monómeros la cual es un equivalente topográfico de un ligando el cual es complementario al sitio de unión de ligando de un receptor particular de interés. De manera muy similar, la patente de los E.U. No. 5,480,971 para Houghten, R. A. et al. (1996) en Peralkylated Oligopeptide Mixtures describe oligopéptidos peralquilados de alquilo de 1 a 7 átomos de carbono lineales y conjuntos y bibliotecas de tales péptidos, así como métodos para utilizar tales conjuntos oligopeptídicos y bibliotecas para determinar la secuencia de un oligopéptido peralquilado que preferiblemente se une a una molécula aceptora de interés. Por lo tanto, los análogos no peptídicos de los péptidos que presentan epitopo de la invención también se pueden elaborar habitualmente por estos métodos .

Proteínas de fusión Como lo apreciará una persona experta en la técnica, los polipéptidos de KDI de la presente invención y los fragmentos que presentan anticuerpos de los mismos descritos antes se pueden generar con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG) , lo que resulta en polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media aumentada in vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo para proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4 humano y de diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulina de mamífero (EP A 394,827: Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica unida a disulfuro debido a la parte IgG también pueden ser más eficientes en la unión y neutralización de otras moléculas en comparación con la proteína de KDI monomérica o del fragmento proteínico sólo (Fountoulakis et al . J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)).

Anticuerpos Los anticuerpos específicos para la proteína de KDI para uso en la presente invención se pueden generar contra la proteína de KDI intacta o un fragmento polipeptídico o antigénico de la misma, el cual se puede presentar junto con una proteína portadora, tal como una albúmina, en un sistema animal (tal como conejo o ratón) o, si es lo suficientemente grande (por lo menos de aproximadamente 25 aminoácidos) , sin un portador. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) significa incluir moléculas intactas así como fragmento de anticuerpo (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) los cuales son capaces de unirse específicamente a la proteína de KDI . Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fe del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación y pueden tener una unión a tejido menos inespecífica de un anticuerpo intacto (Wahl et al . , J. Nucí . Med . 24:316-325 (1983)). Por lo tanto, se prefieren estos fragmentos . Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar por cualquiera de los diversos métodos. Por ejemplo, las células que expresan la proteína de KDI o un fragmento antigénico de la misma se pueden administrar a un animal con el fin de inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales. En un método preferido, se prepara una preparación de proteína de KDI y se purifica para volverla sustancialmente libre de contaminantes naturales. Tal preparación después se introduce en un animal con el fin de producir antisueros policlonales de mayor actividad específica. En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de unión de proteína de KDI de los mismos) . Tales anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando tecnología de hibridoma (Kóhler et al . , Nature 256 : 495 (1975); Kóhler et al . , Eur. J. Immunol . 6:511 (1976); Kóhler et al., Eur. J. Immunol . 6:292 (1976); Hammerling et al . , in : Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., (1981) pp . 563-681). En general, tales procedimientos involucran inmunizar un animal (preferiblemente un ratón) con un antígeno de proteína de KDI o, más preferiblemente, con una célula que expresa la proteína de KDI . Las células adecuadas se pueden reconocer por su capacidad para unirse al anticuerpo de proteína contra KDI . Tales células se pueden cultivar en cualquier medio de cultivo de tejido adecuado; sin embargo, es preferible cultivar las células en medio de Earle modificado por Eagle suplementado con suero bovino fetal 10% (inactivado a aproximadamente 56°C), y suplementado con aproximadamente 10 g/1 de aminoácidos no esenciales, aproximadamente 1,000 µg/ml de penicilina y aproximadamente 100 µg/ml de estreptomicina. Los esplenocitos de tal ratón se extraen y se fusionan con una línea de células de mieloma adecuada. Se puede utilizar cualquier línea de células de mieloma adecuada, de acuerdo con la presente invención; sin embargo, es preferible utilizar la línea de células de mieloma parental (SP20) , disponible de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT y después se clonan por dilución limitante, como se describe por Wands et al. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)) . Las células de hibridoma obtenidas a través de tal selección después se someten a ensayos para identificar clonas las cuales secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno de proteína de KDI . Alternativamente, se pueden producir anticuerpos adicionales capaces de unirse al antígeno de proteína de KDI en un procedimiento de dos etapas mediante el uso de anticuerpos antiidiotípicos. Tal método hace uso del hecho de que los anticuerpos en sí mismos son antígenos y que, por lo tanto, es posible obtener un anticuerpo el cual se une a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este método, los anticuerpos específicos para proteína de KDI se utilizan para inmunizar a un animal, preferiblemente un ratón. Los esplenocitos de tal animal después se utilizan para producir células de hibridoma, las células de hibridoma se analizan para identificar clonas las cuales producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico para la proteína de KDI se puede bloquear por el antígeno de proteína de KDI . Tales anticuerpos comprenden anticuerpos antiidiotípicos para el anticuerpo específico para la proteína de KDI y se pueden utilizar para inmunizar un animal para inducir la formación de anticuerpos adicionales específicos para proteína de KDI . Se apreciará que los fragmentos Fab y F(ab')2 así como otros fragmentos de los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar de acuerdo con los métodos descritos aquí. Tales fragmentos típicamente se producen por separación proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Alternativamente, se pueden producir fragmentos que se unan a proteínas de KDI a través de la aplicación de tecnología de ADN recombinante o a través de química de síntesis. Para uso in vivo de anti-KDI en humanos, puede ser preferible utilizar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Tales anticuerpos se pueden elaborar utilizando constructos genéricos derivados de células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales descritos antes. Se conocen en la técnica los métodos para producir anticuerpos quiméricos. Para una revisión, véase, Morrison, Science 229 : 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al., patente de los E.U. No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671; Boulianne et al . , Nature 312:643 (1984); Neuberger et al . , Nature 314 : 268 (1985).

Desórdenes relacionados con el sistema inmunitario Tratamiento También se apreciará por una persona habitualmente experta en la técnica que, puesto que la proteína de KDI de la invención es un miembro de la familia de interferón, cuando se agrega KDI a las células, tejidos o al cuerpo de un individuo, la proteína ejercerá actividades fisiológicas en sus células objetivo en ése individuo. Por lo tanto se apreciará que las condiciones causadas por una disminución en el nivel estándar o normal de actividad de interferón en un individuo, particularmente desórdenes del sistema inmune, se pueden tratar por administración del polipéptido de KDI . Por lo tanto, la invención también proporciona un método de tratamiento de un individuo en necesidad de un nivel aumentado de actividad de interferón que comprende administrar a tal individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un polipéptido aislado de KDI de la invención, efectivo para incrementar el nivel de actividad de interferón en tal individuo. El complejo receptor de FIN clase I el cual media la actividad biológica de IFN-alfa e IFN-beta también se une a IFN-omega y se espera que se una a KDI . En consecuencia, se puede utilizar KDI clínicamente para terapia antiviral, por ejemplo en el tratamiento de SIDA, hepatitis viral que incluye hepatitis B crónica, hepatitis C, virus de papiloma, encefalitis viral y en la profilaxis de rinitis e infecciones respiratorias . KDI también es útil en el tratamiento de numerosos cánceres (por ejemplo leucemia de células pilosas, leucemia mieloma aguda, osteosarcoma, carcinoma de células de sales, glioma, carcinoma de células renales, mieloma múltiple, melanoma y enfermedad de Hodgking) . Se consideran que KDI estimula la actividad de las células asesinas naturales. En consecuencia, se puede utilizar KDI para tratar infecciones parasitarias y bacterianas, por ejemplo para tratar infección por Cryptosporidium parvum y tuberculosis pulmonar resistente a medicamentos múltiples. También se considera que KDI es útil como un agente inmunoterapéutico, más específicamente como un agente inmunosupresor . Por ejemplo, se considera que KDI inhibe la proliferación de linfocitos estimulados con mitógenos por células halogeneicas, células progenituras mieloides y otras células de médula ósea. En consecuencia, KDI es útil como un agente protector cuando se administra antes de quimioterapia y además se puede utilizar para tratar hiperproliferación de linfocitos, progenitores mieloides y células pluripotenciales de médula ósea, por ejemplo en el tratamiento de leucemia mielógena crónica. Los polipéptidos de KDI también se pueden utilizar en la prevención de rechazo de injerto contra huésped o para corte del progreso de enfermedades autoinmunes, tales como artritis, esclerosis múltiple, (2) o diabetes (3) . KDI también es útil en el tratamiento de alergias en mamífero, por ejemplo por inhibición de la respuesta humoral. Se puede utilizar KDI como un adyuvante o coadyuvante para mejorar o estimular la respuesta inmune en casos de vacunación profiláctica o terapéutica. Además, se proporciona un método para tratar la infección en un paciente que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención a un paciente en necesidad de terapia antiinfectiva. En una modalidad preferida, la infección es de etiología viral, bacteriana o parasitaria. En una modalidad particularmente preferida, la infección es una infección viral. Además, se proporciona un método para tratar cáncer en un paciente que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención a un paciente en necesidad de terapia anticancerígena. Además, se proporciona un método de inmunoterapia en un paciente que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención a un paciente en necesidad de inmunoterapia .

Formulaciones La composición de polipéptido de KDI se formulará y dosificará de una manera consistente con la buena práctica médica, considerando la condición clínica del paciente (especialmente los efectos colaterales de tratamiento con el polipéptido de KDI solo) , el sitio de suministro de la composición de polipéptido de KDI, el método de administración, el protocolo de administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad efectiva" de polipéptido de KDI para los propósitos en la presente se determina por lo tanto por tales consideraciones. Como una proposición general, la cantidad total farmacéuticamente efectiva de polipéptido de KDI administrada parenteralmente por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 1 µg/kg/día hasta 10 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, como se indica antes, esto se someterá a decisión terapéutica. De manera más preferible, esta dosis es de por lo menos 0.01 mg/kg/día y de manera más preferible para humanos, entre aproximadamente 0.01 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se administra continuamente, el polipéptido de ADI típicamente se administra a un régimen de dosis de aproximadamente 1 µg/kg/hora hasta aproximadamente 50 µg/kg/hora, ya sea en 1-4 inyecciones por día por infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, utilizando una minibomba . También se puede utilizar una solución intravenosa en bolsa. La duración de tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo posterior al tratamiento para que se presenten respuestas parece variar dependiendo del efecto deseado. Las composiciones farmacéuticas que contienen el KDI de la invención se pueden administrar por vía oral, rectal, parenteral, intrasistémica, intravaginal, intraperitoneal, tópica (por ejemplo como polvos, ungüentos, gotas o un parche transdérmico), bucal o por aspersión oral o nasal. Por "portador farmacéuticamente aceptable" se quiere significar un material de relleno, diluyente, material encapsulante o auxiliar de formulación de cualquier tipo no tóxico sólido, semisólido o líquido. El término "parenteral" como se utiliza en la presente, se refiere a modos de administración los cuales incluyen la inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal , subcutánea e intraartricular así como la infusión. El polipéptido de KDI también es administrado adecuadamente por sistemas de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas .

Las matrices de liberación sostenida incluyen polilactidas (patente de los E.U. No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman, U. et al., Biopoly ers 22:547-556 (1983)), poli (2-metacrilato de 2-hidroxietilo) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res . 15 : 161 -277 (1981) y R. Langer, Chem. Tech . 12:98-105 (1982)), acetato de etilenovinilo (R. Langer et al., Id.) o ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutírico (EP 133,988) . Las composiciones del polipéptido de KDI de liberación sostenida también incluyen un polipéptido de KDI atrapado liposómicamente . Los liposomas que contienen el polipéptido de KDI se preparan por métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patente de los E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324.

Habitualmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en el cual el contenido de líquido es mayor de aproximadamente 30 moles por ciento de colesterol, la proporción seleccionada se ajusta para la terapia de polipéptido de KDI óptima. Para administración parenteral, en una modalidad, el polipéptido de KDI se formula generalmente al mezclarlo en un grado de pureza deseado, en una forma de unidad de dosificación inyectable (solución, suspensión o emulsión) con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir uno que es no tóxico a los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas y que sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que son conocidos como dañinos para los polipéptidos. Generalmente, las formulaciones se preparan al poner en contacto al polipéptido de KDI de manera uniforme e íntima con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos. Después, si es necesario, el producto se conforma en la formulación deseada. Preferiblemente, el portador es un portador parenteral, de manera más preferible una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen agua, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo también son útiles en la presente, así como liposomas. El portador contiene adecuadamente cantidades menores de aditivos tales como áustancias que mejoran la isotonicidad en la estabilidad química. Tales materiales son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular bajo (menores de aproximadamente 10 residuos) , por ejemplo poliarginina o tripéptidos; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa o dextrina; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes y azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; o tensioactivos tales como polisorbatos, poloxámeros o PEG. El polipéptido de KDI típicamente se formula en tales vehículos a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a 100 mg/ml, de manera más preferible de 1-10 mg/ml a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se comprenderá que el uso de ciertos excipientes, portadores o estabilizantes extraños resultará en la formulación de sales del polipéptido KDI . El polipéptido de KDI para ser utilizado para administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se obtiene fácilmente por filtración a través de membrana de filtración estéril (por ejemplo membranas de 0.2 micrómetros) . Las composiciones terapéuticas de polipéptido de KDI generalmente se colocan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica. El polipéptido de KDI habitualmente se almacenará en recipientes de dosis unitaria o dosis múltiples, por ejemplo, ampollas o frascos sellados, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como un ejemplo de una formulación liofilizada, se llenan frascos de 10 ml con 5 ml de solución de polipéptido de KDI acuosa 1% ,(p/v) filtrada y estéril, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara al reconstituir el polipéptido liofilizado de KDI utilizando agua para inyección bacteriostática. La invención también proporciona un paquete o equipo farmacéutico que comprenden uno o más de los recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Se puede encontrar asociado a tal recipiente o recipientes una nota en forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la manufactura, uso o venta de sustancias farmacéuticas o productos biológicos, nota la cual refleja la aprobación de la agencia para la manufactura, uso o venta de administración humana. Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar junto con otros compuestos terapéuticos.

Agonistas y antagonistas - Ensayos y moléculas La invención también proporciona un método de analizar compuestos para identificar aquéllos los cuales mejoran o bloquean la acción de KDI en células, tal como su interacción con moléculas que tienen KDI , tales como moléculas receptoras. Un agonista es un compuesto el cual incrementa las funciones biológicas naturales de KDI o el cual funciona de una manera similar a KDI, mientras que los antagonistas disminuyen o eliminan tales funciones. En otro aspecto de esta modalidad, la invención proporciona un método para identificar una proteína receptora u otra proteína que une ligando, la cual se une específicamente a un polipéptido de KDI . Por ejemplo, se puede preparar un compartimiento celular, tal como una membrana o una preparación de la misma, a partir de una célula que expresa una molécula que una KDI . La preparación se incuba con KDI marcado . El KDI y los complejos de KDI se unen al receptor u otra proteína de unión y se aislan y caracterizan de acuerdo con métodos sistemáticos conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido de KDI se puede unir a un soporte sólido de manera que las moléculas de unión solubilizadas a partir de las células se unen a la columna y después se eluyen y caracterizan de acuerdo con los métodos sistemáticos. En el ensayo de la invención para agonistas o antagonistas, se puede preparar un compartimiento celular, tal como una membrana o una preparación de las mismas, a partir de una célula que exprese una molécula que una KDI tal como una molécula de una vía de señalización o reguladora modulada por KDI . La preparación se incuba con KDI marcado en ausencia o presencia de una molécula candidato la cual puede ser un agonista o antagonista de KDI . La capacidad de la molécula candidato para unir la molécula de unión refleja en una unión disminuida del ligando marcado. Las moléculas las cuales se unen de manera gratuita, es decir, sin inducir los efectos de KDI sobre la unión de la molécula de unión de KDI, es muy probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien e inducen efectos que son iguales o que se relacionan estrechamente con KDI , son agonistas. Los efectos similares a KDI de agonistas y antagonistas potenciales se puede medir, por ejemplo, al determinar la actividad de un sistema de segundo mensajero después de la interacción de la molécula candidato con una célula o preparación celular apropiada, y al comparar el efecto con el KDI o moléculas que inducen los mismos efectos tales como KDI . Los sistemas de segundo mensajero que pueden ser útiles a este respecto incluye, pero no se limitan a AMP guanilatos ciclasa, canal de guiones o sistemas de segundo mensajero de hidrólisis de fosfoinositida . Otro ejemplo de un ensayo para antagonistas de KDI es un ensayo competitivo que combina KDI y un antagonista potencial con moléculas receptoras de KDI unidas a membrana o moléculas receptoras de KDI recombinantes bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. Se puede marcar KDI, por ejemplo por radioactividad, de manera que el número de moléculas de KDI unidas a una molécula receptora se pueda determinar con precisión para determinar la efectividad del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polipéptido de la invención y por lo tanto inhiben o extinguen su actividad. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína relacionada estrechamente o un anticuerpo que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula receptora, sin inducir actividades inducidas por KDI , por lo que se evita la acción de KDI al excluir a KDI de la unión. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido. Se ha utilizado la tecnología antisentido para controlar la expresión de genes a través de ADN o ARN antisentido o a través de la formación de triple hélice. Las técnicas antisentidos se discute, por ejemplo, en Okano, J".

Neurochem. 56 : 560 (1991) ; "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressión." CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) . La formación de una triple hélice se discute, por ejemplo, en Lee et al . , Nucleic Acids Research 6 : 3073 (1991) ; Cooney et al . , Science 241:456(1988); y Dervan et al . , Science 251:1360(1991). Los métodos se basan en la unión de un polinucléotido a un ADN o ARN complementario. Por ejemplo, la porción codificante 5 ' de un polinucléotido que codifica para un polipéptido maduro de la presente invención se puede utilizar para diseñar un oligonucléotido ARN antisentido o desde aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucléotido de ADN se designa como complementario a una región de un gen involucrado en la transcripción por lo que se evita la transcripción y la producción de KDI . El oligonucléotido de ARN antisentido hibridiza con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm dentro del polipéptido de KDI . Los oligonucléotidos descritos antes también se pueden suministrar a células de manera que el ARN o ADN antisentido se pueda expresar in vivo para inhibir la producción de proteína KDI . Los agonistas y antagonistas se pueden utilizar en una composición con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe antes. Los antagonistas se pueden utilizar, por ejemplo, para inhibir la actividad de interferón, por ejemplo después de quimioterapia para estimular la proliferación de células progenituras de médula osea y hematopoyética . Cualquiera de los antagonistas anteriores se puede utilizar en una composición con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe en lo anterior. Habiendo descrito de manera general la invención, la misma se comprenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan a manera de ilustración y no se pretende que sean limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Clonación y Expresión de KDI en E. coli La serie novedosa pHE4 de vectores de expresión bacteriana, en particular el vector pHE4a se utiliza para expresión bacteriana con este ejemplo. (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) . El ADN plasmídico del vector pHE4-5/KDI contiene el polinucleótido que codifica para KDI marcado en la Figura 1 insertado entre el sitio de enzima de restricción único Ndel y Asp718. El constructo se depositó ante la ATCC el 25 de febrero de 1998 y se le proporciona el No. de Acceso 209645, para conveniencia de aquellos expertos en la técnica. El vector de expresión bacteriana pHE4a incluye un gen para neomicina fosfotransferasa para selección de origen de replicación de E. coli , una secuencia promotora del fago T5 , dos secuencias operadoras lac, una secuencia de Shine-Delgarno y un gen represor de operon de lactosa (laclq) . Estos elementos se disponen de manera tal que el paciente infectado de ADN se purifica para un polipéptido se frota a este polipéptido con seis residuos His (es decir una "etiqueta 6 X His") unida covalentamente a la parte amina terminal de este polipéptido. Secuencia de ADN que codifica para la proteína KDI madura se amplifica utilizando cebadores oligonucleotídicos para PCR los cuales se reasocian en las secuencias amino terminales de la porción deseada de la proteína KDI y en las secuencias con el constructo depositado 3 ' respecto a la secuencia codificante de ADNc. Los nucleótidos adicionales que contienen sitios de restricción para facilitar la clonación en el vector pHE4a se agregan a las secuencias cebadoras 5 ' y 3 ' , respectivamente . Para clonación de la región codificante de la proteína KDI, el cebador 5' tiene la secuencia 5' GGCCGCATATGCTGGACTGTAACTTACTG 3' (SEC. DE IDENT. NO.: 16) que contiene el sitio de restricción Ndel. Una persona habitualmente experta en la técnica apreciará como consecuencia, que el punto en donde la secuencia codificante de proteína en donde comienza el cebador 5 ' puede variar para amplificar un segmento de ADN que codifique para cualquier porción deseada de la proteína KDI completa. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC 3' (SEC. DE IDENT. NO. :17) , que contiene el sitio de restricción subrayado Asp718. El fragmento de ADN para KDI amplificada se digiere con Ndel y Asp718 y el plásmido linealizado después se une por ligación. La inserción de ADN para KDI dentro del vector pHE4a restringido coloca la región codificante de la proteína de KDI hacia el extremo 3 ' a partir del promotor inducible por IPTG y en marco con un AUG de inicio y los seis codones de histidina. La mezcla de ligación se transforma en células E. coli competentes utilizando requerimientos estándares convencionales tales como los descritos por Sambrook y colaboradores (Molecular Clonin: a Laboratory manual , 2a Edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). E. coli , cepa M15/rep4, contiene copias múltiples del plásmido pREP4 , el cual expresa el represor lac y confiere resistencia a kanamicina ("Kanr"), se utiliza para llevar a cabo el ejemplo ilustrativo descrito aquí. Esta cepa, la cual únicamente es una de muchas que pueden ser adecuadas para expresar la proteína de KDI, está disponible comercialmente (QIAGEN, Inc., supra) . Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB en presencia de ampicilina y kanamicina. El ADN plasmídico se aisla de colonias resistentes y la identidad del ADN clonado se confirma por análisis de restricción, PCR y secuenciado de ADN. Las clonas que contienen el constructo deseado se hacen crecer durante la noche ("0/N") en cultivo líquido en media LB suplementado junto con ampilicina (100 µg/ml) como con kanamicina (25 µg/ml) . Se utiliza el cultivo 0/N para inocular un cultivo grande, a una dilución de aproximadamente 1:25 a 1:250. Se hacen crecer células hasta una densidad óptica a 600 nm ("OD600") o entre 0.4 y 0.6. Después se agrega isopropil -ß-D-tiogalactopiranosida ("IPTG") a una concentración final de 1 mM para inducir transcripción a partir del promotor sensible al represor lac, por inactivación del represor lacl. Las células subsecuentemente se incuban adicionalmente durante 3 a 4 horas. Las células posteriormente se cosechan por centrifugación . Las células después se agitan durante 3-4 horas a 4°C en clorhidrato de guanidina-HCl 6M, pH 8. El residuo celular se remueve por centrifugación y en sobrenadante que contiene el polipéptido de KDI se cargan en una columna de resina de afinidad de níquel-nitrilo-ácido triacético ("Ni-NTA") (QIAGEN, Inc., supra) . Las proteínas con la etiqueta 6 x His se unen a la resina Ni-NTA con alta afinidad y se pueden purificar en un procedimiento sencillo de una etapa (para detalles véase : The QIAexpressionist , 1995, QIAGEN, Inc., supra) . Previamente, se carga el sobrenadante en una columna en clorhidrato de guanidina 6M pH 8, la columna se eleva primero con 10 volúmenes de clorhidrato de guanidina 6 M pH 8, y después se lava con 10 volúmenes de clorhidrato de guanidina 6 M, pH 6, y finalmente se eluye KDI con clorhidrato de guanidina 6M, pH 5. La proteína purificada se renaturaliza al dializarla contra una solución salina amortiguada con fosfato (PBS) o acetato de Na 50 mM, pH 6 amortiguador más NaCl 200 mM. Alternativamente, la proteína puede ser renaturalizada con éxito mientras está inmovilizada en la columna de Ni-NTA. Las condiciones recomendadas son las siguientes: renaturalizar utilizando un gradiente lineal de urea 6M-1M en NaCl 500 mM, glicerol 20%, Tris/HCl 20mM pH 7.4, que contiene inhibidores de proteasa. La renaturalización se debe realizar durante un período de 1.5 horas o más. Después de la renaturalización las proteínas se pueden eluir por la adición de imidazol 250 mM. El imidazol se remueve por una etapa de diálisis final contra PBS o acetato de sodio 50 mM, amortiguador pH 6 más NaCl 200 mM. La proteína purificada se almacena a 4°C o se congela a -80°C. Se puede utilizar el siguiente método alternativo para purificar KDI expresada en E. coli cuando está presente en forma de cuerpos de inclusión. A menos que se especifique de otra manera, todas las etapas siguientes se llevan a cabo a 4-10°C. Al completar la fase de producción de la fermentación de E. coli , el cultivo celular se enfría a 4-10°C y las células se cosechan por centrifugación continua a 15,000 rpm (Heraeus Sepatech) . En base en el rendimiento esperado de proteína por unidad de peso de pasta de celular y la cantidad de proteína requerida, una cantidad apropiada de pasta celular, en peso, se suspende en una solución amortiguadora que contiene Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7.4. Las células se dispersan en una suspensión homogénea utilizando un mezclador de corte alto.

Las células sometidas a este proceso después se lisan al hacer pasar la solución a través de un microfluidizador dos veces (Microfuidics, Corp. o APV Gaulin, Inc.) a una presión de 27.6 - 41.4 MPa (4,000-6,000 psi). El homogeneizado después se mezcla con una solución de NaCl a una concentración final de NaCl 0.5 M , seguido por centrifugación a 7,000 x g durante 15 min. El sedimento resultante se lava nuevamente con NaCl 0.5M, Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7.4. Los cuerpos de inclusión lavados resultantes se solubilizan con clorhidrato de guanidina 1.5 M (GuHCl) durante 2-4 horas. Después de centrifugación a 7,000 x g durante 15 min., el sedimento se desecha y el sobrenadante que contiene polipéptidos de KDI se incuba a 4°C durante la noche para permitir extracción adicional de GuHCl. Después de una centrifugación a alta velocidad (30,000 x g) para remover las partículas insolubles, la proteína solubilizada de GuHCl se renaturaliza al mezclar rápidamente el extracto de GuHCl con 20 volúmenes de amortiguador que contienen sodio 50 mM, pH 4.5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM con agitación vigorosa. La solución de proteína diluida renaturalizada se mantiene a 4°C sin mezclarla durante 12 horas antes de etapas de purificación adicionales. Para clarificar la solución polipeptídica de KDI renaturalizada, se utiliza un equipo de filtración tangencial preparado previamente equipado con un filtro de membrana de 0.16 µm con un área superficial apropiada (por ejemplo Filtron), equilibrado con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0. la muestra de filtros se carga en una región de intercambio catiónico (por ejemplo, Poros HS-50, Perseptive Biosystems). La columna se lava con acetato de sodio 40mM, pH 6.0 y se eluye con NaCl 250 mM, 500 mM, 1,000 mM y 1,500 mM en el mismo amortiguador, de una manera paulatina. La absorbancia a 280 nm del efluente se monitorea continuamente. Las fracciones se recolectan y se analizan adicionalmente por SDS-PAGE. Las fracciones que contienen el polipéptido de KDI después se acumulan y se mezclan con 4 volúmenes de agua. La muestra diluida se carga posteriormente en un conjunto preparado previamente de columnas en batería de resinas de intercambio anionico fuerte (Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) y anionico débil (Poros CM-20, Perseptive Biosystems) . Las columnas se equilibran con acetato de sodio 40 mM, Ph 6.0. Ambas columnas se lavan con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0, NaCl 200 mM. La columna CM-20 después se eluye utilizando un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna que varía de NaCl 0.2 M, acetato de sodio 50 mM, pH 6.0 a NaCl 1.0 M, acetato de sodio 50 mM, pH 6.5. Las fracciones se recolectan bajo A280 constante monitoreado del efluente. Las porciones que contienen el polipéptido de KDI (determinado, por ejemplo, por SDS-PAGE 16%) después se acumulan.

El polipéptido de KDI resultante muestra más de 95% de pureza después de las etapas anteriores de renaturalización y purificación. No se observan bandas principales de contaminantes a partir del gen de SDS-PAGE 16% teñido con azul de Commassie cuando se cargan 5µg de proteína purificada. La proteína purificada también se prueba para determinar contaminación por endotoxina/LPS, y típicamente el contenido de LPS es menor de 0.1 ng/ml, de acuerdo con los ensayos de LAL. Se puede utilizar el siguiente método alternativo para purificar KDI expresada en E. coli cuando está presente en forma de cuerpos de inclusión. A menos que se especifique de otra manera, la totalidad de las siguientes etapas se llevan a cabo a 4-10°C. Al completar la fase de producción de la fermentación de E. coli , el cultivo celular se enfría a 4-10°C y las células se cosechan por centrifugación continua a 15,000 rpm (Heraeus Sepatech) . En base en el rendimiento esperado de proteína por peso unitario de pasta celular y la cantidad de proteína purificada requerida, una cantidad apropiada de pasta celular, en peso, se suspende en una solución amortiguadora que contiene Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7.4. Las células se dispersan en una suspensión homogénea utilizando un mezclador de corte amplio .

Las células sometidas a este tratamiento se lisan posteriormente al hacer pasar la solución a través de un microfluidizador (Microfuidics, Corp. o APV Gaulin, Inc.) dos veces a 27.6-41.4 mpa (4,000-6,000 psi). El homogeneizado después se mezcla con una solución de NaCl a una concentración final de NaCl 0.5 M, seguido por centrifugación a 7,000 x g durante 15 min. El sedimento resultante se lava nuevamente utilizando NaCl 0.5 M, Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7.4. Los cuerpo de inclusión lavados resultantes se solubilizan con clorhidrato de guanidina 1.5 M (GuHCl) durante 2-4 horas. Después de centrifugación a 7,000 x g durante 15 min., el sedimento se desecha y el sobrenadante que contiene el polipéptido de KDI se incuba a 4°C durante la noche para permitir extracción adicional de GuHCl. Después de la centrifugación a alta velocidad (30,000 x g) para remover las partículas insolubles, la proteína solubilizada con GuHCl se renaturaliza al mezclar rápidamente el extracto de GuHCl con 20 volúmenes de amortiguador que contiene sodio 50 mM, pH 4.5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM por agitación vigorosa. La solución de proteína diluida renaturalizada se mantiene a 4°C sin mezclado durante 12 horas antes de las etapas de purificación adicionales. Para clarificar la solución de polipéptido de KDI renaturalizada, se utiliza una unidad e filtración tangencial preparada previamente, equipada con un filtro de membrana de 0.16 µm con un área superficial apropiada (por ejemplo Filtron), equilibrado con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0. La muestra filtrada se carga en una resina de intercambio cationico ( por ejemplo, Poros HS-50, Perseptive Biosystems). La columna se lava con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0 y se eluye con NaCl 250 mM, 500 mM, 1,000 mM, y 1,500 mM en el mismo amortiguador, de una manera paulatina. La absorbancia a 280 mm del efluente se monitorea continuamente. Las fracciones se recolectan y se analizan adicionalmente por SDS-PAGE. Las fracciones que contienen el polipéptido de KDI después se acumulan y mezclan con 4 volúmenes de agua. La muestra diluida después se carga en un equipo preparado previamente de columnas en batería de resinas de intercambio anionico fuerte (Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) y anionico débil (Poros CM-20, Perseptive Biosystems). Las columnas se equilibran con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0. Ambas columnas se lavan con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0, NaCl 200 mM. La columna CM-20 después se eluye utilizando un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna que varía desde NaCl 0.2 M, acetato de sodio 50 mM, pH 6.0 hasta NaCl 1.0 M, acetato de sodio 50 mM, pH 6.5. Las fracciones se recolectan bajo monitoreo constante a A280 del efluente. Después se acumulan las fracciones que contienen el polipéptido de KDI (determinado, por ejemplo, por SDS-PAGE 16%) .

El polipéptido de KDI resultante muestra más de 95% de pureza después de las etapas anteriores de replegado y purificación. No se observan bandas contaminantes principales a partir del gen de SDS-PAGE 16% teñido con azul de Commassie cuando se cargan 5µg de proteína purificada. La proteína purificada también se prueba para determinar contaminación por endotoxina/LPS, y típicamente el contenido de LPS es menor de 0.1 ng/ml, de acuerdo con los ensayos LAL. Se han generado por los inventores en este documento constructos de expresión múltiple de KDI para facilitar la producción de polipéptidos de KDI de varios tamaños y en varios sistemas. Los constructos basados en E. coli son los siguientes: (1) pQE9 :KDI . S27-K207 (que expresa los aminoácidos 27-207 de la SEC. DE IDENT. NO.: 2); (2) pHE4 ;KDI . S27-K207 (que expresa los aminoácidos 27-207 de la SEC. DE IDENT. NO. : 2) ; (3) pHE4;KDI,A23-K207 (que expresa los aminoácidos 23-207 de la SEC. DE IDENT. NO.: 2); (4) pHE4. KDI . G24-K207 (que expresa los aminoácidos 24-207 de la SEC. DE IDENT. NO. : 2) ; y (5) pHE4.KDI.C30-K207 (que expresa los aminoácidos 30-207 de la SEC. DE IDENT. NO . : 2) .

Ejemplo 2: clonación y expresión de proteína de KDI en un sistema de expresión de baculovirus En este ejemplo ilustrativo, se utiliza el vector conductor plasmídico pA2 GP para insertar el ADN clonado que codifica para KDI, en un baculovirus para expresar la proteína de KDI, utilizando un líder de baculovirus y métodos estándar o convencionales como se describen en A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Cul ture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987) . Este vector de expresión contiene el promotor de poliedrina fuerte del virus de poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por el péptido (líder) de señal secretora de la proteína gp67 de bacoluvirus y sitios de recesión convenientes tales como BamHI , Xba I y Asp718. Se utiliza el sitio de poliadenilación del virus simian 40 ("SV40") para poliadenilación eficiente. Para una selección fácil del virus recombinante, el plásmido contiene el gen para beta-galactosidasa de E. Coli bajo el control del promotor de drosófila débil en la misma orientación, seguido por la señal de poliadenilación del gen para poliedrina. Los genes insertados están flanqueados en ambos lados por secuencias virales para recombinación homologa mediada por células con ADN de tipo silvestre para generar virus viables que expresen el polinucléotido clonado.

Muchos otros vectores de baculovirus pueden ser utilizados en lugar del vector anterior, tales como pAc373, pVL941 y pAcIMl, como lo puede apreciar fácilmente un experto en la técnica, en la medida en que el constructo proporcione las señales localizadas apropiadamente para transcripción, traducción, secreción y similares, incluyendo un péptido señal y un AUG en marco, según se requiere. Tales vectores se describen, por ejemplo en Virology 170:31-39(19989). La secuencia de ADNc que codifica para la proteína de KDI madura en la clona depositada, que carece del codon de inicio AUG y la secuencia líder asociada naturalmente mostrada en la SEC. DE IDENT. NO: 2, se amplifica utilizando cebadores oligonucleotídicos de PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' del gen. El cebador 5' tiene la secuencia 5 ' GGCCGGGATCCGCCATCATGAGCACCAAACCTGATATG 3 ' (SEC. DE IDENT. NO: 18) que contiene el sitio de la enzima de restricción BamHI subrayado. El cebador 3' tiene la secuencia 5 ' GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC 3' (SEC. DE IDENT. NO: 19) que contiene el sitio de restricción Asp718 subrayado . El fragmento amplificado se aisla a partir de un gel de agarosa 1% utilizando un equipo disponible comercialmente ("Geneclean, " BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento después se digiere con BamHI y Asp718 y nuevamente se purifica en un gel de agarosa 1%. El plásmido se digiere con las enzimas de restricción BamHI y Asp718 y opcionalmente puede ser desfosforilado utilizando fosfatasa intestinal bovina, utilizando procedimientos habituales conocidos en la técnica. El ADN después se aisla de gel de agarosa 1% utilizando un equipo disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca. ) . El fragmento y el plásmido desfosforilado se unen por ligación con ADN ligasa T4. Se transforma E. Coli BH101 u otras células de E. Coli huéspedes adecuados tales como XL-1 Blue (Statagene Cloning Systems, La Jolla, CA) con la mezcla de ligación y se difunde en placas de cultivo. Se identifican las bacterias que contienen el plásmido con el gen para KDI humana al digerir ADN de colones individuales utilizando BamHI y Asp718 y después analizando el producto de digestión por electroforesis en gel. La secuencia del fragmento clonado se confirma por secuenciado de ADN. Este plásmido se denomina en la presente pA2GPKDI . Se cotransfectan 5 µg del plásmido pA2GPKDI con 1.0 µg de un ADN de baculovirus linealizado, disponible comercialmente ( "BaculoGoldMR baculovirus DNA" , Pharmingen, San Diego, CA) , utilizando el método de lipofección descrito por Felgner et al., Proc . Na ti , Acad. Sci . USA 84:7413-7417(1987).

Se mezclan 1 µg de ADN de virus BaculoGold*® y 5 µg del plásmido pA2GPKDI en un pozo estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 µl de medio de grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Posteriormente se agregan 10 µl de lipofectina mas 90 µl de medio de grace, se mezclan y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente la mezcla de transfección se agrega a gotas a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejido de 35 mm con 1 ml de medio de grace sin suero. La placa después se incuba durante 5 horas a 27°C. La solución de transfección posteriormente se remueve de la placa y se agrega 1 ml de medio de insecto de grace y suplementado con suero bovino fetal 10%. El cultivo continúa después a 27°C durante 4 días. Después de 4 días se recolecta el subrelevante y se realiza un ensayo en placa, como se describe por Summers y Smith, supra . Se utiliza un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir una identificación y aislamiento fáciles de las clonas que expresen gal, las cuales producen placas continción azul. (Una descripción detallada de un "ensayo en placa" de este tipo también se puede encontrar en la guía de usuarios para cultivo de célula de insecto y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, página 9-10). Después de incubación apropiada, las placas teñidas de azul se toman con la punta de un micropipeteador (por ejemplo Eppendorf) . E agar que contiene los virus recombinantes después se resuspende en un tubo de microcentrífuga que contiene 200 µl de medio de grace y se utiliza la suspensión que contiene el baculovirus recombinante para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. 4 días después, los sobrenadantes de estos recipientes de cultivo se cosechan y después se almacenan a 4°C. El virus recombinante se denomina V-KDI. Para verificar la expresión el gen para KDI , se hacen crecer células Sf9 en medio de grace suplementado con FBS inactivado con calor, 10%. Las células se infectan con el baculovirus recombinante V-KDI a una multiplicidad de infeccion ("MOI") de aproximadamente 2. Si se desean proteínas radiomarcadas, 6 horas después se retira el medio y se sustituye con medio SF900 II menos metionina y cisteína (disponible de Life Technologies Inc., Rockville, MD) . Después de 42 horas, se agregan 5 µCi de 35S-metionina y 5 µCi de 35S-cisteína (disponible de Amersham) . Las células se incuban adicionalmente durante 16 horas y después se cosechan por centrifugación. Las proteínas en el sobrenadante así como las proteínas intracelulares se analizan por SDS-PAGE seguido por autoradiografía (si se radiomarcan) . Se puede utilizar el microsecuenciado de la secuencia de aminoácidos de la parte aminoterminal de la proteína purificada para determinar la secuencia aminoterminal de la proteína KDI . Otros constructos de expresión de baculovirus se construyen como sigue: (1) pA2:KDI (el cual expresa los residuos 1-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2); (2) pA2 : KDI .M7-K207 (el cual expresa los residuos 7-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2); (3) pA2gp.KDI.L28.K207 (el cual expresa los residuos 28-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2); (4) pA2gp . KDI . C30-K207 (el cual expresa los residuos 30-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2) ; y (5) pA2. KDI .M1-R192 (el cual expresa los residuos 1 a 192 de la SEC. DE IDENT. NO: 2) .

Ejemplo 3 : Clonación y expresión de KDI en células de mamífero Un vector de expresión típico de mamífero contiene el elemento promotor, el cual media el inicio de transcripción de ARNm, la secuencia codificante de proteínas y señales necesarias para terminación de transcripción y poliadenilación del transcripto. Los elementos adicionales incluyen alargadores, secuencias de Kozak y secuencias interpuestas planteadas por sitios donadores y aceptores para empalme de ARN. Se puede obtener una transcripción altamente eficiente con promotores tempranos y tardíos de SV40, las secuencias repetidas terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo RSV, HTLVI , HIVI y el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) . Sin embargo también se pueden utilizar elementos celulares (por ejemplo el promotor de actina humana) . Los vectores de expresión adecuados para uso en la práctica de la presente invención incluye, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia) , pRSV de gato, (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las células huéspedes de mamífero que se pueden utilizar incluyen HeLa humana, 293, células H9 y Jurkat, de ratón las células NIH3T3 y C127, células Cos 1, Cos 7 y CV1 , de codorniz QC1-3, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO) . Alternativamente, el gen se puede expresar en líneas células estables que contienen el gen integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas. El gen transfectado también se puede amplificar para expresar grandes cantidades de la proteína codificada. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas de células que presentan varios cientos o varios miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (murphy et al., Biochem J. 227:277-279(1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10 -. 169 - 115 ( 1992 ) ) . Utilizando estos marcadores, las células de mamíferos se hacen crecer en medio selectivo y las células con la mayor resistencia son las que se seleccionan. Estas líneas de células contienen el gen o genes amplificados integrados en un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO con frecuencia se utilizan para la producción de proteínas. Los vectores de expresión pCl y pC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Cullen et al . , Molecular y Cellular Biolgy, 438-447 (Marzo, 1985)) más un fragmento del alargador de CMV (Boshart et al . , Cell 41 : 521 -530(1985)) . Los sitios de clonación múltiples, por ejemplo con los sitios de separación de enzima de restricción BamHI , Xbal y Asp718, facilitan la clonación de los genes de interés. Los vectores contienen además del intron 3 ' , la señal de poliadenilación y terminación del gen de preproinsulina de rata .

Clonación y expresión en células CHO Se utiliza el vector pC4-Sig para la expresión del polipéptido de KDI . El plásmido pC4-Sig es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (ATCC, acceso número 37146) . Contiene una región codificante para la secuencia líder secretor de la quimocina beta-8 (véase el documento US95/09508) hacia el extremo 5 ' del sitio de clonación múltiple y se denomina como dentro del marco con ADN heterólogo insertado. El plásmido contiene el gen DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano de SV40. Células de ovario de hámster chino u otras células que carecen de actividad de dihidrofolato que se transfectan con estos plásmidos se pueden seleccionar al hacer crecer las células en un medio selectivo (MEM alfa menos, Life Technologies) suplementado con un agente quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes de DHFR en células resistentes a metotrexato (MTX) ha sido bien documentada (véase, por ejemplo, Alt, F. W. , Kellems, R. M. , Bertino, J. R. , y Schimke, R. T., 1978, J. Biol . Chem . 253:1357-1370, Hamlin, J. L. y Ma, C. 1990, Biotechnology 5:64-68) . Las células crecen en concentración cada vez mayores de MTX desarrollando resistencia al medicamento por sobreproducción de la enzima objetivo, DHFR, como resultado de la amplificación del gen para DHFR. Si un segundo gen está unido al gen para DHFR, habitualmente se coamplifica y se sobreexpresa . Se conoce en la técnica que este enfoque se puede utilizar para desarrollar líneas de células que presenten más de 1,000 copias del gen o genes amplificados. Subsecuentemente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen líneas de células las cuales contienen el gen amplificado integrado dentro de uno o más cromosomas de la célula huésped. El plásmido pC4 contiene, para la expresión del gen de interés, el promotor fuerte de la secuencia repetida terminal larga (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molecular y Cellular Biology, Marzo 1985:438-447) más un fragmento aislado de un alargador del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart et al., Cell 41 : 521 -530(1985)). Hacia el extremo 5' del promotor están los siguientes sitios de separación de enzimas de restricción únicos que permiten la integración de los genes BamHI , Xba I, y Asp718. Detrás de estos sitios de clonación, el plásmido contiene el intron 3 ' y el sitio de poliadenilación del gen de proinsulina de rata. Otros promotores de alta eficiencia también se pueden utilizar para la expresión, por ejemplo, del promotor ß-actina humano, los promotores temprano o tardío de SV40 o las secuencias repetidas terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo, VIH y HTLVI . Los sistemas de expresión de genes Tet-Off y Tet-On de Clontech y sistemas similares se pueden utilizar para expresar el polipéptido de KDI de una manera regulada en células de mamífero (Gossen, M. , & Bujard, H. 1992, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89.-5547-5551) . Para la poliadenilación del ARNm, también se pueden utilizar otras señales, por ejemplo, de la hormona del crecimiento humana de genes para globina. Las líneas de células estables que presentan un gen de interés integrado en los cromosomas también se pueden seleccionar por cotransfección con un marcador seleccionable tal como gpt , G418 o higromicina. Es ventajoso utilizar más de un marcador seleccionable al inicio, por ejemplo G418 mas metotrexato.

El plásmido pC4 se digiere con las enzimas de restricción BamHI y Asp718 y después se desfosforila utilizando fosfatos intestinales bovinos por procedimientos conocidos en la técnica. Después el vector se aisla a partir de gel de agarosa 1%. La secuencia de ADN que codifica para el polipéptido KDI se amplifica utilizando cegadores oligonucleotídicos de PCR que corresponden a las secuencias 5 ' y 3 ' de la porción deseada del gel. El cebador 5' que contiene el sitio BamHI subrayado, una secuencia Kozak y el codon de inicio AUG, tiene la siguiente secuencia: 5 ' GGCCGGGATCCGCCATCATGAGCACCAAACCTGATATG 3 ' (SEC. DE IDENT. NO: 18). El cebador 3', que contiene el sitio de restricción Asp718 subrayado, tiene la siguiente secuencia: 5 ' GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC 3' (SEC. DE IDENT. NO: 19) . El fragmento amplificado se digiere con las cendonucleasas BamHI y Asp718, y después se purifica nuevamente en un gel de agarosa 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan posteriormente con ADN ligasa T4. Después se transforman células E. Coli HB101 o XL-1 Blue y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC4 utilizando, por ejemplo, análisis de enzimas de restricción.

Para la transfección se utilizan células de ovario de hámster chino que carecen del gen activo para DHFR. Se contrasfectan 5 µg del plásmido de expresión pC4 con 0.5 µg del plásmido pSVneo utilizando lipofectina (Felgner et al . , supra) . El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica para una enzima de confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo a G418. Las células se siembran en MEM alfa menos suplementado con 1 mg/ml de G418. Después de 2 días, las células se tripsinizan y se siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania), en MEM alfa menos suplementado con 10, 25 o 50 ng/ml de metotrexato más 1 mg/ml de G418. Después de aproximadamente 10-14 días las colonias solas se tripsinizan y después se siembran en caja de petri de 6 pozos o en matraces de 10 ml utilizando concentraciones diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) . Las clonas que crecen a las concentraciones más altas de metotrexato después se tranfieren a placas nuevas de 6 pozos que contienen concentraciones cada vez mayores de metotrexato (1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 mM, 20mM) . Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clonas las cuales crecen a una concentración de 100-200 µM. Se analiza la expresión del producto de gen deseado, por ejemplo, por SDS-PAGE y por transferencia Western (Western blot) o por análisis CLAR en fase inversa.

Otros vectores de expresión de mamífero construidos son los siguientes: (1) pC4:KDI (el cual expresa los residuos 1-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2); (2) pC4sp : KDI . C30-K207 (el cual expresa un péptido de señal heterólogo (la quimocina beta-8 (MPIF-1) péptido señal) seguido por los aminoácidos 30-207 de KDI; y (3) pC4sp : KDI .L28-K207 (el cual expresa un péptido señal heterólogo (la quimocina beta-8 (MPIF-1) péptido señal) seguido por los residuos aminoácidos 28-207 de KDI . Será claro que la invención se puede llevar a la práctica de otra manera a la descrita particularmente en la descripción anterior y los ejemplos. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanza anteriores, y por lo tanto están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. La totalidad de la descripción de todas las publicaciones (incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos de revistas, manuales de laboratorio, libros u otros documentos) mencionados aquí se incorporan en la presente como referencia . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la sitada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECU ENCIAS .<110> Human Genome Sciences . Inc . . ec al . <120> Interferón Derivado de Queratinocito <130> PF482 <140> Unasßigned <141> 1999-07-21 <:50> 60/093. 6*3 <151> 1998-07-21 <160> 21 <170> Patßntln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1170 <212> DMA 10 <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222>' (35).. (655) <400> 1 ccacgcgtcc gggatttttt agcttgcaaa aaaa atg age acc aaa ect gac atg 55 Met Ser Thr Lys Pro Asp Met 1 5 •Ct caá aag tgt ttg tgg ctt gag ate ctt atg ggt ata ttc att gct 103 5 lie Gln Lys Cys Leu Trp Leu Glu ríe Leu Met Gly II» Phe He Al* 10 15 20 ggc acc cta tec ctg gac tgt aac tta ctg aac ?rtt cae ctg aga aga 151 Gly Thr Leu Ser Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg 25 30 35 gtc acc tgg caá aat ctg aga cae ctg agt agt atg age aat tea ttt 199 Val Thr Trp Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe 40 45 50 55 ect gta gaa tgt cta cga gaa aac ata gct ttt gag ttg ccc caá gag 247 Q Pro Val Glu Cys Leu Ajr G-u Asr. lie Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu 60 65 70 ttt ctg caá tac acc caá ect atg aag agg gac ate aag aag gcc ttc 295 Phe Leu Gln Tyr Thr Gln Pro Me. Lys Arg Asp He Lys Lys Ala Phe 75 80 85 tat gaa atg tec cta cag gcc ttc aac ate ttc age caá cae acc ttc 343 Tyr Glu Met Ser Leu Gin Ala Pne Asr. He Phe Ser Glp His Thr Phe 90 95 100 aaa tat tgg aaa gag aga cae etc aaa caá ate caá ata gga ctt gat 391 c Lys Tyr Trp Lys Glu Arg His Leu Lys Gln He Gln He Gly Leu Asp . 105 110 115 eag caá gca gag tac ctg aac eaa tge ttg gag gaa gac gag aat gaa 439 Gln Gln Ala Glu Tyr Leu ?sn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Glu Asn Glu 120 125 130 135 aat gaa gac atg aaa gaa atg aaa gag aat gag atg aaa ccc tea gaa 487 Asn Glu Asp Met Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu 140 145 150 gee agg gtc ccc cag ctg age age etg gaa ctg agg aga tat ttc cae 535 Ala Arg Val Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His 155 160 165 agg ata gac aat tte ctg aaa gaa aag aaa tac agt gac tgt gcc tgg 583 Arg lie Asp ?sn Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp 170 175 180 gag att gtc cga gtg gaa ate aga aga tgt ttg tat tac ttt tac aaa 631 Glu Xle' Val Arg Val Glu He Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys 185 190 195 ttt acá gct cta ttc agg agg aaa taagaatcat ctaccttcaa gcaagaatta 685 Phe Thr Ala Leu Phe Arg Arg Lys 10 200 205 acagagattg tggctacgca aatgcaceaa aaaagggtga aatatatctg aaatgtacet 745 ggttetgccc ttggaagcca cttcctgctc atgccactaa eagcatgctg ccaaactgtt 805 cagattcaag attattecaa gcgeagggcc caaatgttat agccaaagaa agtcttatga 865 taaaagtgag gcaaatttea gccaagaagt tagaagagat gtttaaaaga acaagaacaa 925 attgtggatc atggtatatg caggctatca gcagaaggat cagacaa aa aatgagttag 985 tgcaaaccat ttagtaaaaa taactatcag cagagttgtt ccagattaaa aatagtacta 1045 caagcttgta aaggagttag gacatgeaag ctactgagca taaaatatat acttgctatt 1105 tttcatgact ttetetaata aagtctttga ctgttctete taataaaaaa aaaaaaaaaa 1165 aaaaa 1170 <210> 2 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens 20 <400> 2 Met Ser Thr Lys Pro Asp Met He Gln Lys Cys Leu Trp Leu Glu He 1 5 10 15 Leu Met Gly He Phe He Ala Gly Thr Leu Ser Leu Asp Cys Asn Leu 20 25 30 Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp Gln Asn Leu Arg His Leu 35 40 45 Sez Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu Cys Leu Arg Glu Asn He 25 50 55 60 Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln Tyr Thr Gln Pro Met Lys 65 70 75 80 Arg Asp He Lye Lys Ala Phe Tyr Glu Met Ser Leu Gln Ala Phe Asn 85 90 95 He Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp Lys Glu Arg His Leu Lys 100 105 110 Gln He Gln He Gly Leu Asp Gln Gln Ala Glu Tyr Leu Asn Gln Cys 115 120 125 Leu Glu Glu Asp Glu ?sn Glu Asn Glu Asp Met Lys Glu Met Lys Glu 130 135 140 Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val Pro Gln Leu Ser Sei Leu 145 150 155 160 Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Xle Asp Asn Phe Leu Lys Glu Lys 165 170 175 Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu He Val Arg Val Glu He Arg Arg 180 185 190 Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Phe Arg Arg Lys 195 200 205 <210> 3 <211> 238 < 12> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro G n Asn His Gly Leu 20 25 30 Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg He Ser 35 . 40 45 Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln- Glu 50 55 60 Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala Kis Val Met Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln He Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Glu Leu 100 105 110 His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly 115 120 125 Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala He Ser Ser Val Pro Gln Leu Ser Ser 130 135 140 Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg He Asp Asn Phe Leu Lys Glu 145 150 155 160 Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu He Val Arg Val Glu He Arg 165 170 175 ?rg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr ?la Leu Pro ?la Leu Thr 180 185 190 Leu ?rg ?rg Tyr Phe Gln Gly He Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys 195 200 205 Tyr Ser Asp Cys ?la Trp Glu Val Val ?rg Met Glu He Met Lys Ser 210 215 220 Leu Phe Leu Ser Thr ?sn Met Gln Glu ?rg Leu ?rg Ser Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr ?sn Lys Cys Leu Leu Gln He ?la Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr ?la Leu Sex Met Ser Tyr ?sn Leu Leu Gly Phe Leu Gln ?rg 20 25 30 Ser Ser ksti Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu ?sn Gly Arg 35 40 45 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp ?rg Met ?sn Phe ?sp He Pro Glu Glu 50 55 60 Xle Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr He 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln ?sn He Phe Ala He Phe ?rg Gln ?sp Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp ?sn Glu Thr He Val Glu ?sn Leu Leu ?la ?sn Val 100 105 110 Tyr His Gln He ?sn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 Lys Glu ?sp Phe Thr ?rg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 ?rg Tyr Tyr Gly ?rg He Leu His Tyr Leu Lys ?la Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 His Cys ?la Trp Thr He Val ?rg Val Glu He Leu ?rg ?sn Phe Tyr 165 170 175 Phe He ?sn ?rg Leu Thr Gly Tyr Leu ?rg ?sn 180 185 <210> 5 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met ?la Phe Val Leu Ser Leu Leu Met ?la Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Phe Gly Ser Leu Gly Cys ?sp Leu Ser Gln ?sn His Val Leu 20 25 30 Val Gly ?rg Lys ?sn Leu ?rg Leu Leu ?sp Glu Met ?rg ?rg Leu Ser 35 40 45 Pro His Phe Cys Leu Gln ?sp ?rg Lys ?sp Phe ?la Leu Pro G n Glu 50 55 60 Met Val Glu Gly Gly G n Leu Gln Glu ?la Gln ?la He Ser Val Leu 65 70 75 80 .His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe ?sn Leu Phe His Thr Glu His Ser 85 90 . 95 Ser ?la ?la Trp ?sp Thr Thr Leu Leu Glu Pro Cys ?rg Thr Gly Leu 100 105 110 His Gln Gln Leu ?sp ?sn Leu ?sp ?la Cys Leu Gly G n Val Met Gly 115 120 125 Glu Glu ?sp Ser ?la Leu Gly ?rg Thr Gly Pro Leu ?la Leu Lys ?rg 130 135 140 Tyr Phe Gln Gly He His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser ?sp 145 . 150 155 160 Cys ?la Trp Glu Thr Val ?rg Leu Glu He Met ?rg Ser Phe Ser Ser 165 170 175 Leu He Ser Leu Gln Glu ?rg Leu ?rg Met Met ?sp Gly ?sp Leu Ser 180 185 190 Ser Pro <210> 6 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys ?sp Leu Pro Gln ?sn His Gly Leu 20 25 30 Leu Ser Arg ?sn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg He Ser 35 40 45 Pro Phe Leu Cys Leu Lys ?sp ?rg ?rg ?sp Phe ?rg Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Lys Gly Ser G n Leu Gln Lys ?la Kis Val Met Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu G n Gln He Phe Ser Leu Phe His Thr Glu ?rg Ser 85 90 95 Ser ?la ?la Trp ?sn Met Thr Leu Leu ?sp Gln Leu His Thr Glu Leu 100 105 110 His G n Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly 115 120 125 Glu Gly Glu Ser ?la Gly ?la He Ser Ser Val Pro Gln Leu Ser Ser 130 135 140 Leu Glu Leu ?rg ?rg Tyr Phe His ?rg He ?sp ?sn Phe Leu Lys Glu 145 150 155 160 Lys Lys Tyr Ser ?sp Cys ?la Trp Glu Xle Val ?rg Val Glu He ?rg 165 170 175 Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Pro Ala Leu Thr 180 185 190 Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly He Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys 195 200 205 Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu He Met Lys Ser 210 215 220 Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu ?rg Ser Lys ?sp Arg 225 230 235 240 Asp Leu Gly Ser Ser 245 <210> 7 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ser He Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Asn ?rg ?rg ?la Leu He Leu Leu Gly Gln Met Gly ?rg He Ser 35 40 45 Pro Phe Ser Cys Leu Lys ?sp Arg His Asp Phe Arg He Pro Gln Glu 50 55 60 Glü Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Asp ?la Gln ?la He Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Xle Gln Gln Thr Phe ?sn Leu Phe Ser Thr Glu ?sp Ser 85 90 95 Sel Ala ?la Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu 100 105 110 Tyr Gln Gln Leu ?sn ?sp Leu Glu ?la Cys Val He Gln Glu Val Gly 115 120 125 Val Glu Glu Thr Pro Leu Met ?sn Glu ?sp Ser Xle Leu ?la Val ?rg 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln ?rg He Thr Leu Tyr Leu He Glu ?rg Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Cys ?la Trp Glu Val Val ?rg ?la Glu He Met ?rg Ser Leu Ser 165 170 175 Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg Leu Arg ?rg Lys ?sp 180 185 <210> 8 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met ?la Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met ?la Val Leu Val Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ser He Cys Ser Leu Gly Cys ?sp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly ?sn ?rg ?rg ?la Leu He Leu Leu ?la Gln Met Gly ?rg He Ser 35. 40 45 Pro Phe Ser Cys Leu Lys ?sp ?rg His ?sp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Glu Phe ?sp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln Xle Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu 100 105 110 Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Xle Gln Glu Val Gly 115 120 125 Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val ?sp Ser He Leu ?la Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln ?rg He Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Cys ?la Trp Glu Val Val ?rg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser 165 170 175 Leu Ser Lys He Phe Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 180 185 <210> 9 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met ?la Leu Leu Phe Pro Leu Leu ?la ?la Leu Val Met Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys ?sp Leu Pro Gln ?sn His Gly Leu 20 25 30 Leu Ser ?rg ?sn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met ?rg ?rg He Ser 35 40 45 Pro Phe Leu Cys Leu Lys ?sp Arg ?rg ?sp Pbe ?rg Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys ?la His Val Met Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln He Phe Ser Leu Phe His Thr Glu ?rg Ser 85 90 95 Ser ?la ?la Trp ?sn Met Thr Leu Leu ?sp Gln Leu His Thr Glu Leu 100 105 110 His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly 115 120 125 Glu Gly Glu Ser ?la Gly ?la He Ser Ser Pro ?la Leu Thr Leu Arg 130 135 140 Arg Tyr Phe Gln Gly He Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Asp Cys Ala Trp Gl? Val Val Arg Met Glu He Met Lys Ser Leu Phe 165 170 175 Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu ?rg Leu ?rg Ser Lys ?sp Arg Asp Leu 180 1B5 190 Gly Ser Ser 195 <210> 10 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Pro Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Xle Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr Kis Ser Leu 25 30 Gly ?sn ?rg ?rg ?la Trp He Leu Leu ?la Gln Met Gly ?rg He Ser 35 40 45 His Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala He Ser Ala Phe 65 70 75 80 His Glu Met He Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Xle Glu Leu 100 105 110 Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly 115 120 125 Val Glu Glu He ?la Leu Met Asn Glu ?sp Ser He Leu ?la Val. ?rg 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln ?rg He Thr Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Cys ?la Trp Glu Val Val ?rg ?la Glu He Met ?rg Ser Phe Ser 165 170 175 Phe Ser Thr ?sn Leu Gln Lys Gly Leu ?rg ?rg Lys ?sp Met Pro Leu 180 185 190 Ser Phe Ser Leu Leu Met ?la Val Leu Val Leu Ser Tyr Lys Ser Xle 195 200 205 Cys Ser Leu Gly Cys ?sp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly ?sn ?rg 210 . 215 220 ?rg ?la Trp He Leu Leu ?la Gln Met Gly ?rg He Ser His Phe Ser 225 230 235 240 Cys Leu Lys ?sp ?rg Tyr ?sp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe ?sp 245 250 255 Gly ?sn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala He Ser Ala Phe His Glu Met 260 265 270 He Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala 275 280 285 Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe Gln Gln 290 295 300 Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu 305 310 315 320 He ?la Leu Met ?sn Glu ?sp Ser He Leu Ala Val ?rg Lys Tyr Phe 325 330 335 Gln ?rg He Thr Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 340 345 350 Trp Glu Val Val ?rg ?la Glu He Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr 355 360 365 Asn Leu G n Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp 370 375 <210> 11 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Gly Arg Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu 20 25 30 Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg Leu Leu Ala ?rg Met ?sn ?rg Leu Ser 35 40 45 Pro His Pro Cys Leu Gln ?sp ?rg Lys ?sp Phe Gly Leu Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Glu Gly ?sn G n Leu Gln Lys ?sp Gln ?la Xle Ser Val Leu 65 70 75 80 Has Glu Met Leu Gln Gln Cys Phe ?sn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser 85 90 95 Ser ?la ?la Trp ?sn Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu 100 105 110 Gln Gln Gln Leu Glu ?sp Leu ?sp ?la Cys Leu Gly Pro Val Met Gly '115 120 125 Glu Lys Asp Ser Asp Met Gly Arg Met Gly Pro He Leu Thr Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln Gly He His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 Asp Cys Ala Trp Glu He He ?rg Met Glu Met Met ?rg ?la Leu Ser 165 170 175 Ser Ser Thr Thr Leu Gln Lys ?rg Leu ?rg Lys Met Gly Gly ?sp Leu 180 185 190 ?sn Ser Leu 195 <210> 12 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met ?la Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 11 Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Gln ?rg Leu Met Leu 20 25 30 ?sp ?la ?rg Glu ?sn Leu Lys Leu Leu Glu Pro Met Asn Arg Leu Ser 35 40 45 Pro His Ser Cys Leu Gln Asp Arg Lys ?sp Phe Gly Leu Pro Gln Glu 5 50 55 60 Met Val Glu Gly ?sp Gln Leu Gln Lys ?sp Gln ?la Phe Pro Val Leu 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe ?sn Leu Phe His Thr Glu His Ser 85 90 95 Ser ?la ?la Trp ?sp Thr Thr Leu Leu Glu G n Leu Cys Thr Gly Leu 100 105 110 Gln Gln Gln Leu Glu ?sp Leu ?sp Thr Cys Cys ?rg Gly Gln Val Met 115 120 125 Gly Glu Glu ?sp Ser Glu Leu Gly Asn Met Asp Pro Xle Val Thr Val 130 135 140 Lys Lys Tyr Phe Gln Gly He Tyr ?sp Tyr Leu Gln Gl? Lys Gly Tyr 145 150 155 160 Ser ?sp Cys ?la Trp Glu He Val ?rg Val Glu Met Met Arg Ala Leu 165 170 175 Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp 15 180 185 190 Leu Asn Ser Pro 195 <210> 13 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 -)n Met Ala Gln He Tyr Leu Val Met ?la Gly Val Met Leu Cys Ser He V 1 5 10 15 Ser Val Cys Phe Leu ?sp Gln ?sn Leu Ser Ala Val His Cys Val Glu 20 25 30 Lys ?rg Glu He Phe Lys His Leu Gln Glu He Lys Lys He Pro Ser 35 40 45 Gln Leu Cys Leu Lys ?sp Arg He Asp Phe Lys Phe Pro Trp Lys ?rg 50 55 60 5 Glu Ser Xle Thr Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr 65 70 75 80 Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe ?sn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser 85 90 95 22 Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Asp Gln Leu Leu Ser Ser Leu Asp 100 105 no Leu Gly Leu Arg Arg Leu Glu His Met Lys Lys ?sp ?sn Met Asp Cys 115 120 125 Pro His Val Gly Ser Ala Leu Arg Lys Ty Phe Gln Gly He Gly Leu 130 135 140 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu He Val ?rg 145 150 155 160 Val Glu He Glu ?rg Cys Phe Ser Leu Thr 165 17 <210> 14 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met ?sn Ser Phe Ser Thr Ser ?la Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val ?la Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg He ?sp Lys Gln He Arg Tyr He Leu ?sp Gly He 50 55 60 Ser ?la Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Lys Glu Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys He He Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn ?rg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln ?la ?rg ?la Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu He Gln Phe Leu Gln Lys Lys ?la Lys ?sn 145 150 155 160 Leu ?sp ?la He Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu G n Ala Gln ?sn Gn Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu He Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gn Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu ?rg G n Met 210 <210> 15 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Thr His Arg Cys Leu Leu Gln Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu ?rg Phe Gln Gln ?rg 20 25 30 ?rg Ser Leu ?la Leu Cys Gln Lys Leu Leu ?rg Gln Leu Pro Ser Thr 35 40 45 Pro Gln His Cys Leu Glu ?la ?rg Met ?sp Phe Gln Met Pro Glu Glu 50 55 60 Met Lys Gln ?la Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Xle Leu Val Xle 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Gln He Phe Asn He Leu Thr Arg ?sp Phe Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Ser Glu Thr He He Glu ?sp Leu Leu Glu Glu Leu 100 105 110 Tyr Glu Gln Met ?sn His Leu Glu Pro He Gln Lys Glu He Met Gln 115 120 125 Lys Gln ?sn Ser Thr Met Gly ?sp Thr Thr Val Leu His Leu ?rg Lys 130 135 140 Tyr Tyr Phe ?sn Leu Val Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Glu Tyr ?sn ?rg 145 150 155 160 Cys ?la Trp Thr Val Val ?rg Val Gln He Leu ?rg ?sn Phe Ser Phe 165 170 175 Leu Thr ?rg Leu Thr Gly Tyr Leu ?rg Glu 180 185 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggccgcatat gctggactgt aacttactg 29 <210> 17 <211> 33 <212> DN? <213> Homo sapiens 14 <400> 17 ggccgcggta ccttatttcc tcctgaatag age 33 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Ho o sapiens <400> 18 ggccgggatc cgccatcatg agcaccaaac ctgatatg 38 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggccgcggta ccttatttcc tcetgaatag age 33 <210> 20 <211> 156 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Thr Tyr ?rg Cys Leu Leu Gln Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr ?la Leu Ser ?rg Ser Tyr Ser Leu Leu ?rg Phe Gln Gln ?rg 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Glu Cys Gln Lys Leu Leu Gly Gln Leu Pro Ser Thr 35 40 45 Ser G n His Cys Leu Glu Ala ?rg Met ?sp Phe Gln Met Pro Glu Gl? 50 55 60 Met Lys Gln Glu Gln Gln Phe Gln Lys Glu ?sp ?la He Leu Val Met 65 70 75 80 Tyr Glu Val Leu Gln His He Phe Gly He Leu Thr ?rg ?sp Phe Ser 85 90 95 20 Ser Thr Gly Trp ?sn Ser Thr Thr Glu ?sp Thr He Val Pro His Leu 100 105 110 Gly Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Met Gln Tyr Leu Glu Ser Lys Glu Tyr 115 120 125 ?sp ?rg Cys ?la Trp Thr Val Val Gln Val Gln He Leu Thr ?sn Val 130 135 140 Ser Phe Leu Met Arg Leu Thr Gly Tyr Val Arg Asp 145 150 155 25 <210> 21 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Tyr ?sn Leu Leu Gly Phe Leu Gln ?rg Ser Ser ?sn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu ?sn Gly ?rg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys ?sp ?rg Met ?sn Phe ?sp He Pro Glu Glu Xle Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu ?sp Ala Ala Leu Thr He Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn He Phe Ala He Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Xle Val Glu Asn Leu Leu Ala ?sn Val Tyr His Gln Xle ?sn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu ?sp Phe Thr 100 105 110 ?rg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys ?rg Tyr Tyr Gly ?rg 115 120 125 Xle Leu His Tyr Leu Lys ?la Lys Glu Tyr Ser His Cys ?la Trp Thr 130 135 140 15 He Val ?rg Val Glu He Leu ?rg ?sn Phe Tyr Phe He ?sn ?rg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Gly Asn 165 25

Claims (20)

- 122 - REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención, antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polinucléotido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico la cual es por lo menos 95% idéntica a un miembro que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido mostrado como los residuos 1 a 207 de la SEC. DE IDENT . NO : 2 ; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido mostrado como los residuos 2 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; (c) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido mostrado como los residuos 28 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2 ; (d) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido mostrado como los residuos 30 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; (e) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido mostrado como los residuos 165 a 183 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; - 123 - (f ) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido completo codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; (g) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido completo codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15, excepto la metionina N terminal; (h) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido maduro codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; y (i) una secuencia nucleotídica complementaria a cualquiera de las secuencias nucleotídicas en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) anteriores.

2. Un polinucléotido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica la cual codifica para un fragmento biológicamente activo del polipéptido que se muestra como los residuos 1 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2 ; y (b) una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica del inciso (a) .

3. La molécula de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucléotido - 124 -tiene la secuencia nucleotídica en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) que codifica para el polipéptido KDI que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 165 a 183 de la SEC. DE IDENT . NO : 2.

4. La molécula de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucléotido tiene la secuencia nucleotídica en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 1) que codifica para el polipéptido KDI que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 28 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2.

5. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucléotido que tiene una secuencia nucleotídica por lo menos 95% idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos n-207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2, en donde n es un número entero en el intervalo de 1 a 59; (b) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-m de la SEC. DE IDENT. NO: 2, en donde m es un número entero en el intervalo de 183 a 207; - 125 - (c) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste de los residuos n-m de la SEC. DE IDENT. NO: 2, en donde n y m son números enteros como se definen respectivamente en los incisos (a) y (b) anteriores; (d) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido codificado por el ADNc humano en la clona HKAPI15, en donde el polipéptido carece de entre los aminoácidos 1 y 58 de su parte N terminal ; (e) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido codificado por el ADNc humano en la clona HKAPI15, en donde el polipéptido carece de entre 1 y 23 aminoácidos de su parte C terminal ; y (f) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido codificado por el ADNc humano en la clona HKAPI15, en donde el polipéptido tiene cualquier combinación de supresiones en las partes N terminal y C terminal descritas en los incisos (d) y (e) anteriores.

6. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucléotido el cual hibridiza bajo condiciones de hibridación astringentes a un polinucléotido que tiene una secuencia nucleotídica idéntica a la secuencia nucleotídica en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f ) , (g) o (h) de conformidad con la reivindicación 1, en - 126 -donde el polinucléotido el cual hibridiza no hibridiza bajo condiciones de hibridación astringentes a un polinucléotido que tiene una secuencia nucleotídica que consiste de únicamente residuos A o únicamente residuos T.

7. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucléotido el cual codifica para la secuencia de aminoácidos de una porción que presenta un epitopo de un polipéptido de KDI que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en los incisos (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) o (g) de conformidad con la reivindicación 1.

8. La molécula aislada de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico la cual codifica para una porción que presenta un epitopo de un polipéptido de KDI que se selecciona del grupo que consiste de: un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Ser 49 hasta aproximadamente Ser 54 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Cys 59 hasta aproximadamente Ala 65 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Pro 78 hasta aproximadamente Tyr 88 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende - 127 -los residuos aminoácidos desde aproximadamente His 101 hasta aproximadamente Gln 113 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos Gln 120 hasta aproximadamente Glu 123 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos Cys 128 a aproximadamente Pro 155 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Leu 160 hasta aproximadamente Arg 168 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Asn 171 hasta aproximadamente Asp 180 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Val 186 hasta aproximadamente Cys 193 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, y un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos Phe 204 hasta aproximadamente Lys 207 en la SEC. DE IDENT. NO: 2.

9. Un método para elaborar un vector recombinante, caracterizado porque comprende insertar una molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 en un vector.

10. El vector recombinante, caracterizado porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 9. - 128 -

11. Un método para elaborar una célula huésped recombinante, caracterizado porque comprende introducir el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 10 en una célula huésped.

12. Una célula huésped recombinante, caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 11.

13. Un método recombinante, para producir un polipéptido de KDI, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 12, bajo condiciones tales que se exprese el polipéptido, y recuperar tal polipéptido.

14. Un polipéptido aislado de KDI, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a un miembro que se selecciona del grupo que consiste de: (a) el polipéptido mostrado como residuos 1 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; (b) el polipéptido mostrado como residuos 2 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; (c) el polipéptido mostrado como residuos 28 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2; - 129 - (d) el polipéptido mostrado como residuos 165 a 183 de la SEC. DE IDENT. NO: 2 ; (e) el polipéptido completo codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15; (f) el polipéptido completo codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15, excepto la metionina N terminal ; (g) el polipéptido maduro codificado por el ADNc humano contenido en la clona HKAPI15.

15. Un péptido aislado, caracterizado porque comprende una porción que presenta epitopo de la proteína de KDI, en donde la porción se selecciona del grupo que consiste de: un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Ser 49 hasta aproximadamente Ser 54 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Cys 59 hasta aproximadamente Ala 65 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Pro 78 hasta aproximadamente Tyr 88 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente His 101 hasta aproximadamente Gln 113 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos Gln 120 a aproximadamente Glu 123 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos - 130 -aminoácidos Cys 128 a aproximadamente Pro 155 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Leu 160 hasta aproximadamente Arg 168 en la SEC. DE IDENT. NO: 2, un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Asn 171 hasta aproximadamente Asp 180 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; un polipéptido que comprende los residuos aminoácidos desde aproximadamente Val 186 hasta aproximadamente Cys 193 en la SEC. DE IDENT. NO: 2; y unpolipéptido que comprende los residuos aminoácidos Phe 204 a aproximadamente Lys 207 en la SEC. DE IDENT . NO : 2.

16. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se une específicamente a un polipéptido de KDI, de conformidad con la reivindicación 14.

17. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende un polinucléotido que tiene una secuencia nucleotídica la cual es por lo menos 95% idéntica en por lo menos 50 nucléotidos contiguos de la SEC. DE IDENT. NO: 1.

18. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de un fragmento - 131 -biológicamente activo del polipéptido que se muestra como residuos 1 a 207 de la SEC. DE IDENT. NO: 2. 19. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, en un portador farmacéuticamente aceptable. 20. Un método para tratar una infección viral en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente la composición de conformidad con la reivindicación

19. - 132 - RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una proteína novedosa de KDI la cual es un miembro de la familia del interferón. En particular, se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de interferón humano denominado KDI . Los polipéptidos de KDI también se proporcionan como vectores, células huéspedes y métodos recombinantes para producir los mismos. La invención se relaciona además con métodos de análisis para identificar agonistas y antagonistas de actividad de KDI . También se proporcionan métodos terapéuticos para tratar desórdenes relacionados con el sistema inmunitario.