MXPA01000455A - Metodo de tratamiento para el cancer usando conjugados terapeuticos que se enlazan con aminofosfolipidos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a descubrimiento de que los aminofosfolípidos, tales como fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina son marcadores específicos, accesibles y estables de la superficie luminal de los vasos sanguíneos de tumores. La presente invención de este modo proporciona construcciones de diagnóstico y terapéuticas dirigidas a los aminofosfolípidos para su uso en la intervención de tumores. Los conjugados de sustancias terapéuticas-anticuerpo y construcciones que se enlazan con los aminofosfolípidos se proporcionan particularmente, asícomo métodos de administrar específicamente las sustancias terapéuticas, incluyendo toxinas y coagulantes, a los aminofosfolípidos establemente expresados de los vasos sanguíneos de los tumores, mediante lo cual se induce trombosis, necrosis y regresión del tumor.

Description

MÉTODO DE TRATAMIENTO PARA EL CÁNCER USANDO CONJUGADOS TERAPÉUTICOS QUE SE ENLAZAN CON AMINOFOSFOLIPIDOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Campo de la Invención La presente invención se relaciona en general con los campos de los vasos sanguíneos y la biología de los tumores . Más particularmente, abarca los hallazgos sorprendentes de que los aminofosfolípidos, tales como la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina, son marcadores accesibles, estables y específicos de la vasculatura del tumor. La invención de este modo proporciona construcciones terapéuticas y conjugados que se enlazan con los aminofosfolípidos para su uso en administrar toxinas y coagulantes a los vasos sanguíneos de los tumores y para inducir trombosis y regresión del tumor. 2. Descripción de la Técnica Relacionada La resistencia de las células de tumor a las sustancias quimioterapéuticas representa un problema significativo en la oncología clínica. De hecho, esta es una de las principales razones por lass que muchas de las formas más prevalecientes de cáncer humano todavia resiste la intervención quimioterapéutica efectiva, a pesar de ciertos avances en el campo de la quimioterapia. Un problema significativo a atacar en los regímenes de tratamiento de tumores es el deseo de una "eliminación total celular" . Esto significa que los -regímenes de tratamiento mas efectivos se acercan mas a una eliminación de células total de todas las células malignas conocidas como "clonogénicas" , es decir células que tienen la capacidad para crecer incontroladas y reemplazar cualquier masa de tumor que podría haber sido removida por la terapia. Debido a la meta de desarrollar tratamientos que se acerquen a una eliminación de células total, ciertos tipos de tumores han sido más dóciles a la terapia que otros. Por ejemplo, los tumores de tejido blando, por ejemplo, linfornas, y los tumores de la sangre y de los órganos que forman la sangre, por ejemplo, leucemias, generalmente han respondido mejor a la terapia de quimioterapia que los tumores sólidos tales como los carcinomas. Una razón para la susceptibilidad de los tumores blandos y basados en sangre para la quimioterapia es la mayor accesibilidad del linfoma y de las células leucémicas a la intervención quimioterapéutica. Esto simplemente, es mucho más difícil para la mayoría de las sustancias quimioterapéuticas alcanzar todas las células de una masa de tumor sólido de lo que es alcanzar los tumores blandos y los tumores basados en sangre, y por lo tanto mucho más difícil lograr una eliminación de células total . Al aumentar la dosis de sustancias quimioterapéuticas frecuentemente da como resultado efectos secundarios tóxicos, que generalmente limitan la efectividad de las sustancias antitumor convencionales.

Otra estrategia de tratamiento de tumores es el uso de una "inmunotoxina", en la cual se usa un anticuerpo de células antitumor para administrar toxina a las células del tumor. Sin embargo, en común con los enfoques quimioterapéuticos descritos anteriormente, la terapia de inmunotoxinas también padece algunas desventajas significativas. Por ejemplo, las células antígeno-negativas, sin antígeno o deficientes de antígeno pueden sobrevivir y volver a poblar el tumor o conducir a otras metástasis. También, en el tratamiento de tumores sólidos, la masa del tumor generalmente es impermeable a moléculas del tamaño de anticuerpos e inmunotoxinas. Tanto las distancia de difusión física como la presión intersticial dentro del tumor son limitaciones significativas a este tipo de terapia. Una estrategia más reciente ha sido dirigirse a la vasculatura de tumores sólidos. Al dirigirse a los vasos sanguíneos de lo tumores, en vez de a las mismas células de los tumores, tiene ciertas ventajas porque no es probable dirigirse al desarrollo de las células de tumor resistentes, y porque las células objetivo son fácilmente accesibles. Más aún, la destrucción de los vasos sanguíneos conduce a la amplificación del efecto antitumor, ya que muchas células de los tumores dependen de un solo vaso para su oxígeno y nutrientes (Denekamp, 1990) . Las estrategias de objetivo .vascular ejemplares se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,855,866 y 5,965,132 (solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 08/350,212, emitida con derechos pagados) , la cual particularmente describe la administración dirigida de sustancias anticelulares y toxinas hacia marcadores de proteínas de la vasculatura de los tumores. Otra versión efectiva del enfoque de objetivo vascular es dirigir un factor de coagulación a un marcador de proteína expresado o adsorbido dentro de la vasculatura del tumor (Huang y colaboradores, 1997; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,877,289, 6,004,555 y 6,093,399 (solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica números 08/487,427 y 08/482,369; emitidas con derechos pagados)) . La administración de coagulantes, en vez de toxinas a la vasculatura de tumores tiene las ventajas adicionales de inmunogenicidad reducida y aún un riesgo más bajo de efectos secundarios tóxicos. Como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289, un factor de coagulación preferido para su uso en estos trombógenos específicos de tumores, o "coaguligandos" , es una versión truncada de la proteína que induce a la coagulación humana, el factor de tejido (FT) . El factor de tejido es el iniciador más importante de la coagulación de la sangre (Ruf y colaboradores, 1991; Edgington y colaboradores, 1991, Ruf y Edgington, 1994) . El tratamiento de ratones que tienen' tumores con estos coaguligandos da como resultado una necrosis significativa del tumor aún la regresión completa del tumor en muchos animales (Huamg y colaboradores, 1997; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289, 6,004,555 y 6,093,399 (solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica números 08/487,427 y 08/482,369; emitidas con derechos pagados) ) . Aunque la administración específica de sustancias terapéuticas, tales como las sustancias anticelulares, toxinas y factores de coagulación, a los marcadores de proteínas de los vasos del tumor representa un avance significativo en los protocolos de tratamiento de tumor, todavía hay lugar para terapias con objetivo vascular adicional. La identificación de objetivos estables adicionales para permitir la destrucción de los vasos de tumores específicos en vi vo naturalmente seria beneficioso al extender el número de opciones objetivos. Más particularmente,' el desarrollo de sustancias dirigidas para administrar sustancias terapéuticas aún más cerca de la membrana celular endotelial vascular del tumor representaría un avance importante . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a las necesidades de la técnica anterior proporcionando nuevas composiciones y métodos para formar imágenes y la destrucción de la vasculatura de los tumores. La invención se basa, en parte, en el hallazgo de que los componentes de la membrana de aminofosfolípidos, tales como fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, son marcadores accesibles, estables, de la vasculatura del tumor. La invención proporciona así ligandos de enlace y anticuerpos contra los aminofosfolípidos que se unen operativamente a las sustancias terapéuticas, y los métodos de usar las construcciones en la administración específica de diagnóstico y terapia a la superficie real de las membranas celulares endoteliales vasculares del tumor. Aspectos importantes de la invención son que las sustancias terapéuticas se pueden administrar en contacto íntimo con la membrana celular endotelial vascular del tumor, permitiendo ya sea la entrada rápida a la célula objetivo o la asociación rápida con las células efectoras, componentes de la cascada de coagulación, y similares. Ciertas características sorprendentes de la invención incluyen el descubrimiento de que la translocalización de aminofosfolípidos, tales como fosfatidilserina (PS) , en la superficie de las células endoteliales vasculares del tumor se presente, cuando menos en una parte significativa, independientemente del daño celular y apoptópico u otros mecanismos de muerte celular. De este modo la expresión superficial de la fosfatidilserina en este medio ambiente no es una consecuencia de la muerte celular, ni dispara la destrucción celular inmediata. El descubrimiento de la expresión de la fosfatidilserina suficientemente estable sobre células endoteliales celulares asociadas a tumores morfológicamente intactas es importante para la naturaleza dirigida de la presente invención. Si la translocalización de la fosfatidilserina hacia la superficie externa del endotelio vascular del tumor se presenta solamente en células que están muriendo, o si inevitablemente dispara la muerte celular, entonces la expresión de la fosfatidilserina se esperaría que fuera transitoria y la fosfatidilserina probablemente no sería un objetivo candidato bueno para la intervención terapéutica. Sorprendentemente, la presente invención muestra que se presenta expresión de fosfatidilserina estable significativa en células endoteliales viables en un medio ambiente de tumor, proporcionando de este modo oportunidades de objetivo amplias. La presente invención por lo tanto básicamente proporciona métodos para administrar sustancias de diagnóstico y terapéuticas seleccionadas a tumores o vasculatura intratumoral, que comprende administrar a un animal que tiene un tumor vascularizado una cantidad biológicamente efectiva de un ligando de enlace que comprende una sustancia de diagnóstico o terapéutica seleccionada operativamente unida a una sustancia objetivo que se enlaza a un aminofosfolípido, preferiblemente uno que se enlaza a fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, sobre la superficie luminal de los vasos sanguíneos o los vasos sanguíneos intratumorales del tumor vascularizado. Los métodos de la invención proporcionan la eliminación, o específicamente la eliminación, de células endoteliales vasculares de tumores o intratumorales, y comprende administrar a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende un ligando de enlace que comprende una sustancia terapéutica seleccionada operativamente unida a una sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido, preferiblemente una que se enlaza con fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, sobre la superficie luminal de tumor o las células endoteliales vasculares intratumorales . Los "ligandos de enlace" de la presente invención son de este modo "ligandos de enlace aminofosfolípidos " , "construcciones de ligandos de enlace de aminofosfolípidos terapéuticos", "sustancias terapéuticas dirigidas a los aminofosfolípidos" , "terapéuticos dirigidos a los aminofosfolípidos" , "construcciones de sustancias terapéuticas dirigidos a los aminofosfolípidos" , o "construcciones de sustancias dirigidas a los aminofosfolípidos-sustancias terapéuticas". Por simplicidad estas sustancias se denominan en la presente "ligandos de enlace" o "construcciones de sustancias objetivos-sustancias terapéuticas", entendiendo que estos términos se usan como una manera sucinta de referirse a un conjugado o a otra asociación operativa de una sustancia terapéutica seleccionada y una sustancia objetivo, anticuerpo, proteína de enlace o fragmento activo de los mismos, que se enlaza a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, expresada en la superficie luminal del tumor o las células endoteliales vasculares intratumorales. "Cantidades biológicamente efectivas" son las cantidades de la sustancia objetivo-terapéutica de la construcción efectiva para matar específicamente una porción, y preferiblemente una porción significativa de las células endoteliales vasculares intratumorales o del tumor, en oposición a las células endoteliales en los vasos normales, después de enlazarse a un aminofosfolípido preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, expresado sobre la superficie luminal del tumor o las células endoteliales vasculares intratumorales. Como tal, es una "cantidad eliminadora de células endoteliales" o una "cantidad eliminadora de células endoteliales vasculares del tumor" de una construcción de una sustancia objetivo-sustancia terapéutica. Como se usa en toda la solicitud entera, los términos "un" y "una" se usan en el sentido que significan "cuando menos uno o una", "cuando menos una primera", "uno o más" o "una pluralidad" de los componentes o pasos mencionados, excepto en casos en donde se especifica explícitamente después de eso un límite superior. Por lo tanto una "construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica" significa "cuando menos una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica". Los límites operativos y los parámetros de las combinaciones, como con las cantidades de una sola sustancia, serán conocidas para los técnicos con experiencia en el campo a la luz de la siguiente descripción. Los términos "un" y "una" también se usan para significar "cuando menos uno o una", "cuando menos un primer o una primera", "uno o mas" o "una pluralidad" de pasos en los métodos mencionados, excepto cuando específicamente se menciona. Esto es particularmente relevante a los pasos de administración en los métodos de tratamiento. De este modo, no solamente se pueden emplear muchas dosis diferentes con la presente invención, sino diferentes números de dosis, por ejemplo, se pueden usar inyecciones, hasta incluir inyecciones múltiples . Un "aminofosfolípido", como se usa en la presente significa un fosfolípido que incluye dentro de su estructura cuando menos un primer grupo amino primario. Preferiblemente, el término "aminofosfolípido" se usa para referirse a un fosfolípido que contiene un grupo amino primario que se presenta naturalmente en las membranas celulares de mamíferos. Sin embargo, esta no es una limitación del significado del término "aminofosfolípido", y que el término también se extiende a aminofosfolípidos que se presentan no naturalmente o sintéticos, sin embargo tiene usos en la invención, por ejemplo, como un inmunógeno en la generación de anticuerpos anti-aminofosfolípidos ("anticuerpos de reacción cruzada") que se enlazan a los aminofosfolípidos de las membranas del plasma de los mamíferos. Los aminofosfolípidos de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,767,298, incorporada en la presente mediante referencia, son ejemplos adecuados. Los aminofosfolípidos prominentes encontrados en sistemas biológicos de mamíferos son los fosfatidilserina cargados negativamente ("PS") y las fosfatidiletanolaminas zwitteriónicas o neutras ("PE"), que por lo tanto son los aminofosfolípidos preferidos para ser usados como blancos por la presente invención. Sin embargo, la invención de ninguna manera se limita a las fosfatidilserinas y a las fosfatidiletanolaminas como objetivos, y cualquier otro aminofosfolípido se puede emplear como objetivo (White y colaboradores, 1978; incorporado en la presente mediante referencia) en tanto esté expresado, sea accesible o esté acomplejado en la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor. Todos los componentes de aminofosfolípidos, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina están incluidos como objetivos de la invención independientemente del tipo de cadenas de ácidos grasos involucrados, incluyendo aquellos con ácidos grasos de cadena corta, intermedia o larga, y aquellos ácidos grasos saturados, insaturados y poli-insaturados. Las composiciones preferidas para cultivar anticuerpos para su uso en la presente invención pueden ser aminofosfolípidos con ácidos grasos de 18 átomos de carbono, siendo C18 : 1 los más preferidos (Levy y colaboradores, 1990; incorporados en la presente mediante referencia) . El grado en que son accesibles sobre las células endoteliales vasculares de los tumores, los productos de la degradación de aminofosfolípidos que tienen solamente un ácido graso (derivados y liso) , en vez de dos, también se pueden usar como blancos (Quamar y colaboradores, 1990; incorporada en la presente mediante referencia). Otro grupo de objetivos de aminofosfolípidos potenciales incluyen, por ejemplo, derivados de fosfatidal (plasmalógenos) , tales como fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina (que tienen ya sea un enlace que da un grupo alquenilo, en vez de un enlace éster que da un grupo acilo) . Sin duda, los objetivos para la intervención terapéutica mediante la presente invención incluyen cualquier componente basado en lípidos sustancialmente que comprende una base de nitrógeno que está presente, expresada, translocalizada, presentada o de otro modo acomplejada en una forma que puede ser dirigida sobre la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor, sin excluir la fosfatidilcolina ("PC") . Los lípidos que no contienen glicerol también pueden formar objetivos adecuados, tales como los esfingolípidos basados en la esfingosina y sus derivados La base biológica para incluir un rango de lípidos en el grupo de componentes que pueden ser blancos, está, en parte, en el fenómeno biológico observado de los lípidos y proteínas que se combinan en ambientes membranosos para formar complejos únicos de lípidos-proteína. Estos complejos de lípido-proteína se extienden a formas antigénicas e inmunogénicas de lípidos tales como la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina son, por ejemplo, proteínas tales como ß2-glicoproteína I, protombina, quininógenos y precalicreína. Por lo tanto, ya que las proteínas y los polipéptidos pueden tener uno o más grupos amino primarios libres se contempla que un rango de "objetivos aminofosfolípidos" puede ser formado en vivo a partir de componentes lípidos que no son aminofosfolípidos en el sentido más estricto. Sin embargo, todos estos complejos que pueden ser blancos que comprenden líquidos y grupos amino primarios constituyen un "aminofosfolípido" dentro del alcance de la presente invención. Los métodos de la invención también actúan para detener el flujo sanguíneo, o específicamente detener el flujo sanguíneo en la vasculatura de los tumores. Esto se logra administrando a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado cuando menos una dosis de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende una cantidad que induce a la coagulación, o una cantidad que ocluye el vaso, de cuando menos una primera sustancia citotóxica o coagulante unida operativamente a una sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, translocalizada en la superficie luminal de la vasculatura del tumor. La "cantidad que induce a la coagulación" o "cantidad que ocluye los vasos" es una cantidad de la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica efectiva para promover específicamente la coagulación en, y por lo tanto ocluir, cuando menos una porción, y preferiblemente una porción significativa, de los vasos del tumor o vasos intratumorales, en oposición a los vasos sanguíneos normales, después de unirse a un ' aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, translocalizada en la superficie luminal del tumor o de los vasos sanguíneos intratumorales. La "cantidad que ocluye los vasos" por lo tanto es una cantidad funcionalmente efectiva, y no es una masa física de construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica suficiente para extender el alcance de un vaso. Los métodos ' para destruir o específicamente destruir, la vasculatura del tumor que se proporcionan comprenden administrar a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado una o más dosis de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende una cantidad destructora de tumor de cuando menos una primera sustancia que ocluye o destruye operativamente unida a una sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presentada sobre la superficie luminal de la vasculatura del tumor o .intratumoral . La "cantidad destructora de tumor" es una cantidad de la construcción de sustancias objetivo-sustancia terapéutica efectiva para destruir específicamente u ocluir cuando menos una porción, y preferiblemente una porción significativa de vasos sanguíneos del tumor o intratumorales en oposición a los vasos sanguíneos normales, después de enlazarse a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presentado sobre la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor o de los vasos sanguíneos intratumorales . La invención además abarca métodos para tratar cáncer y tumores sólidos, que comprenden la administración a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado una cantidad o cantidades que inducen a la necrosis del tumor de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende cuando menos una primera sustancia terapéutica o necrótica unida operativamente a una sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, sobre la superficie luminal de vasos sanguíneos o los vasos sanguíneos intratumorales del tumor vascularizado. La "cantidad que induce a la necrosis del tumor" es una cantidad de la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica efectiva para inducir específicamente necrosis hemorrágica en cuando menos una porción, y preferiblemente una porción significativa, del tumor después de enlazarse a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, acomplejado en la superficie luminal de las células endoteliales vasculares de los vasos sanguíneos del tumor o intratumorales, al mismo tiempo que ejerce pequeños efectos secundarios en los tejidos normales, saludables. Los métodos de la invención se pueden resumir de este modo como métodos para tratar a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado que comprende administrar al animal o paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende cuando menos una primera construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica que se enlaza a un aminofosfolípido preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presente, expresado, translocalizado, presentado, acomplejado en la superficie luminal de los vasos que transportan sangre del tumor vascularizado . La esencia de la invención también se puede definir como una composición que comprende cuando menos una primera construcción de sustancia objetivo-sustancia de diagnóstico, o preferiblemente una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica, preferiblemente que se enlaza a fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, para su uso en la preparación de un medicamento para su uso en formación de imagen y/o destrucción de la vasculatura del tumor y para el diagnóstico y/o tratamiento de tumores humanos. Esto también se puede definir como una composición que comprende cuando menos una primera construcción de sustancia objetivo-sustancia de diagnóstico, o preferiblemente una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica, para su uso en la preparación de un medicamento para su uso en enlazarse a un aminofosfolípido preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presente, expresado, translocalizado, presentado o acomplejado en la superficie luminal de los vasos que transportan sangre de un tumor vascularizado y para su uso para formar una imagen de una vasculatura de tumor y/o para su uso para inducir la destrucción de la vasculatura del tumor y para el diagnóstico y/o tratamiento de tumor humano. En los métodos, medicamentos y usos de la presente invención, una de las ventajas está en el hecho de que la provisión de la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica o de diagnóstico, preferiblemente una que se enlaza a fosf tidilserina o fosfatidiletanolamina, en la circulación sistémica de un animal o paciente da como resultado la localización preferencial o específica a las mismas membranas de superficie vascular del tumor, y no a algún complejo de proteínas más distante de la membrana. La invención proporciona de este modo un contacto celular más íntimo que los métodos y sustancias antivasculares de la técnica anterior. En el contexto de la presente invención, el término "un tumor vascularizado" más preferiblemente significa un tumor maligno, vascularizado, tumor sólido, o "cáncer" . La invención es particularmente ventajosa para tratar tumores vascularizados de cuando menos aproximadamente tamaño intermedio, y para tratar tumores vascularizados grandes - - aunque esto de ninguna manera es una limitación de la invención. La invención por lo tanto se puede usar en el tratamiento de cualquier tumor que exhiba vasos sanguíneos positivos aminofosfolípidos, preferiblemente vasos sanguíneos positivos a fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina. En las modalidades preferidas, los tumores que se van a tratar con la presente invención exhibirán un número efectivo de eliminación de vasos sanguíneos positivos a la aminofosfolípido. "Un número efectivo de eliminación de vasos sanguíneos positivos a los aminofosfolípidos" como se usó en la presente, significa que cuando menos aproximadamente 3 por ciento del número total de vasos sanguíneos dentro del tumor serán positivos a la expresión de aminofosfolípidos, preferiblemente la expresión de fosfatidilserina y/o fosfatidiletanolamina. Preferiblemente, cuando menos aproximadamente 5 por ciento, cuando menos aproximadamente 8 por ciento, o cuando menos aproximadamente 10 por ciento o así sucesivamente del número total de vasos sanguíneos dentro del tumor serán positivos a la expresión de aminofosfolípido. Dada la naturaleza negativa a los aminofosfolípidos particularmente negativos a PS de los vasos sanguíneos dentro de los tejidos normales, los vasos del tumor actuarán como un resumidero para los anticuerpos administrados. Además, ya que la destrucción de solamente un número mínimo de vasos del tumor puede causar trombosis extendida, la necrosis y una avalancha de muerte celular de tumor, la localización de anticuerpo en toda, o en la mayoría, de los vasos del tumor no es necesaria para la intervención terapéutica efectiva. Sin embargo, en modalidades más preferidas, los tumores que se van a tratar por esta invención exhibirán un número significativo de vasos sanguíneos positivos a aminofos olípidos. "Un número significativo de vasos sanguíneos positivos a los aminofosfolípidos", como se usa en la presente, significa que cuando menos aproximadamente del 10 al 12 por ciento del número total de vasos sanguíneos dentro del tumor serán positivos para la expresión de aminofosfolípidos, preferiblemente fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina. Aún más preferiblemente, el porcentaje de vasos de tumor que expresan aminofosfolípido será cuando menos de aproximadamente 15 por ciento, cuando menos 20 por ciento, cuando menos aproximadamente 30 por ciento, cuando menos aproximadamente 40 por ciento, cuando menos aproximadamente 50 por ciento, cuando menos aproximadamente 60 por ciento, cuando menos aproximadamente 70 por ciento, o cuando menos aproximadamente 80 por ciento del número total de vasos sanguíneos dentro del tumor, hasta e incluyendo cuando menos aproximadamente 90 por ciento o 95 por ciento de los vasos . Las "cantidades terapéuticamente efectivas" para su uso en la invención son cantidades de construcciones de sustancia obj etivo- sustancia terapéutica, preferiblemente construcciones de enlace PS o PE efectivas para matar específicamente cuando menos una porción de las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales; para promover específicamente la coagulación en cuando menos una porción del tumor o los vasos sanguíneos intratumorales, para ocluir específicamente o destruir cuando menos una porción de los vasos que transportan sangre al tumor; para específicamente inducir necrosis en cuando menos una porción de un tumor; y/o para inducir la regresión o revisión del tumor después de la administración a animales o pacientes seleccionados. Estos efectos se logran al mismo tiempo que exhiben poco o ningún enlace con, o poco o ninguna eliminación de, células endoteliales vasculares en tejidos saludables, normales; poca o ninguna coagulación en, oclusión o destrucción de vasos sanguíneos en tejidos normales, saludables; y ejercer efectos secundarios adversos manejables o despreciables sobre tejidos saludables, normales, del animal o paciente. Los términos "preferencialmente" y "específicamente" como se usa en la presente en el contexto de promover la coagulación en, o destruir, la vasculatura del tumor, y/o en el contexto de causar necrosis en el tumor, de este modo significa que las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica funcionan para lograr la coagulación, destrucción y/o necrosis del tumor que se confina sustancialmente la vasculatura del tumor y el ciclo del tumor, y no se extiende sustancialmente al causar coagulación, destrucción y/o necrosis de tejido en tejidos saludables, normales, del animal o sujeto. La estructura y función de las células saludables y de los tejidos se mantiene sustancialmente sin daño por la práctica de la invención. Aunque no es necesario entender el mecanismo de la acción para la práctica de la presente invención, los métodos generalmente operarán con base en el modo de acción de una sustancia o sustancias terapéuticas particulares elegidas para la unión a la sustancia objetivo. Como tal, la sustancia de enlace de aminofosfolípidos que se conjugan con, o asocian operativamente con, sustancias citotóxicas o anticelulares ("inmunotoxina anti-aminofosfolípido" ) actuarán inicialmente vía la destrucción celular. Igualmente, la sustancia de enlace con aminofosfolípidos que se conjugan, o se asocian operativamente con, factores de coagulación ("coaguligandos anti-aminofosfolípidos" ) actuarán inicialmente vía coagulación. Sin embargo, estos mecanismos tendrán algún traslape, ya que la destrucción de células pone a las membranas de la base y da como resultado la coagulación, y la coagulación priva a las células de oxígeno y nutrientes y da como resultado la destrucción celular. Los anticuerpos naturales o no conjugados contra los componentes de aminofosfolípidos también son capaces de inducir específicamente la destrucción de los vasos sanguíneos de los tumores y la necrosis del tumor en vivo . Estos métodos de tratamiento de tumores también son contemplados por los presentes inventores, y se describen y reclaman en las solicitudes primera y segunda provisionales con números de serie 60/092,672 (presentada el 13 de julio de 1998) y 60/110,608 (presentada el 2 de diciembre de 1998) y en la solicitudes de Patentes Internacionales PCT de los Estados Unidos presentadas conjuntamente (números de expediente 4001.002200, 4001.002282 y 4001.002210), cada una incorporada específicamente en la presente mediante referencia. A la luz de los efectos benéficos de los anticuerpos anti-aminofosfolípidos naturales, el mecanismo de acción de los presentes conjugados se puede extender más allá del modo de acción de la sustancia o sustancias terapéuticas particulares empleadas . Por lo tanto, los siguientes mecanismos pueden contribuir al éxito de la invención: citotoxicidad mediada por células, lisis mediada por complemento, apoptosis, señalamiento de células inducido por anticuerpo (señalamiento directo) , o sendas de transducción de señales de imitación o alternas (señalamiento indirecto) . Los métodos de tratamiento así incluirán administrar a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende una cantidad de cuando menos una primera construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica efectiva para inducir, o inducir específicamente citotoxicidad por célula de cuando menos una porción del tumor o de las células endoteliales vasculares intratumorales. En la presente, la primera construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica se enlaza a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presente, expresada, translocalizada, presentada o complejada en la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales e induce la citotoxicidad mediada por células de cuando menos una porción de las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales, en oposición a las células endoteliales en vasos normales. Como se usa en la presente, "la citotoxicidad o destrucción mediada por células" incluye eliminación celular CCDA (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) y EN (eliminador natural) .

Los métodos además incluyen administrar a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado cuando menos una primera composición farmacéutica que contiene una cantidad de cuando menos una primera construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica efectiva para inducir, o específicamente inducir, la lisis mediada por complemento de cuando menos una porción del tumor o de las células endoteliales vasculares intratumorales. En la presente, la primera construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica se enlaza a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina presente, expresada, translocalizada, presentada o acomplejada en la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales que induce la lisis mediada por complemento de cuando menos una porción de las células endoteliales vasculares del .tumor o intratumorales, en oposición a las células endoteliales en vasos normales . Como se usa en la presente, "citotoxicidad o lisis dependiente del complemento o mediada por el complemento" significa el proceso mediante el cual se activa la cascada de coagulación dependiente del complemento, se ensamblan complejos multicomponentes, generando finalmente un complejo lítico que tiene una acción lítica directa, causando la permeabilización de las células. Las sustancias objetivo-sustancias terapéuticas para su uso para inducir la lisis mediada por complemento generalmente incluirán una porción Fc de anticuerpo. Los mecanismos basados en complemento mediante los cuales la presente invención puede operar además incluyen "CCDA activada por complemento". En estos aspectos, la sustancia objetivo-sustancia terapéutica administrada contiene un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza con un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presente, expresado, translocalizado, presentado o acomplejado, en la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales induce CDAA activado por complemento de cuando menos una porción de las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales, en oposición a las células endoteliales en vasos normales. "CCDA activada por complemento" se usa para referirse al proceso mediante el cual el complemento, no una porción Fc de anticuerpo en sí sujeta un complejo de componentes múltiples juntos y en el cual las células tales como los neutrófilos lisan la célula objetivo. En otras modalidades, los métodos incluyen administrar a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado cuando menos una primera composición farmacéutica que contiene una cantidad de cuando menos una primera construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica efectiva para inducir, o específicamente inducir, apoptosis en cuando menos una porción de las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales. En la presente, la primera construcción de sustancia ob etivo-sustancia terapéutica se enlaza a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presentada, expresada, translocalizada, presentada o acomplejada en la superficie luminal del tumor o las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales se induce apoptosis en cuando menos una porción de las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales, en oposición a las células endoteliales en vasos normales. Como se usa en la presente, "induce apoptosis" significa que induce el proceso de la muerte celular programada, que durante las etapas iniciales, mantiene la integridad de la membrana celular y luego transmite las señales que inducen la muerte en la célula. Esto se opone al mecanismo de necrosis celular durante la cual la membrana celular pierde su integridad y se vuelve frágil al surgir el proceso. Los beneficios terapéuticos se pueden considerar mediante la administración de cuando menos 2, 3, o más construcciones de sustancias objetivo llamadas sustancias terapéuticas. Las construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas también se pueden combinar con otras terapias para proporcionar cantidades efectivas terapéuticamente combinadas, como se describe en la presente. Los métodos de tratamiento de la presente invención generalmente implican la administración de una composición farmacéuticamente efectiva al animal, sistémicamente, tal como vía una inyección intravenosa. Sin embargo, cualquier vía de administración que permita que la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica se localice en el tumor o en las células endoteliales vasculares del tumor o intratumorales será aceptable. "Administración", como se usa en la presente, significa por lo tanto la provisión o entrega de construcciones de sustancias objetivo-sustancia terapéutica en una cantidad o cantidades durante un período de tiempo efectivo para permitir el enlace con un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presente, expresado, translocalizado, presentado o acomplejado en la superficie luminal de los vasos de transporte de sangre del tumor vascularizado y ejercer un efecto destructivo de la vasculatura del tumor y regresivo del tumor. Generalmente se prefiere la administración de las construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas proteináceas, en parte, por su simplicidad y reproducibilidad. Sin embargo, el término "administración" se usa en la presente para referirse a cualquier y todo medio mediante el cual las construcciones sustancia objetivo-sustancia terapéutica se administran o de otro modo se proporcionan a la vasculatura del tumor. "Administración" por lo tanto incluye la provisión de células que producen las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica de una manera efectiva para dar como resultado la administración de las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéuticas a la vasculatura del tumor y/o su localización a esta vasculatura. En estas modalidades, puede ser deseable formular o empacar las células en una membrana selectivamente permeable, estructura o dispositivo implantable, generalmente uno que se pueda remover para cesar la terapia. La administración de la sustancia objetivo-sustancia terapéutica exógena se preferirá generalmente, ya que esta representa un método no invasivo que permite que la dosis se supervise y controle más cercanamente. Los "métodos de administración de sustancia objetivo-sustancia terapéutica" de la invención también se extienden a la provisión de ácidos nucleicos que codifican las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica de una manera efectiva para dar como resultado la expresión de las construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas en la vecindad de la vasculatura del tumor, y/o en la expresión de construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica que pueden localizarse en la vasculatura del tumor. Cualquier técnica de terapia de genes se puede emplear, tales como administración de ADN natural, genes y vectores recombinantes, administración basada en células, incluyendo manipulación ex vivo de las células del paciente, y similares.

Uno de los beneficios de la presente invención es que los aminofosfolípidos, preferiblemente la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina, generalmente se expresan o están disponibles en todos los vasos del tumor. La expresión de aminofosfolípidos en vasos sanguíneos intratumorales, establecidos, es ventajoso para dar en el blanco y destruir estos vasos ya que rápidamente se conducen los efectos antitumor. Sin embargo, en tanto las construcciones de las sustancias objetivo-sustancias terapéuticas administradas se enlacen a cuando menos una porción de los vasos de transporte de sangre, los efectos antitumor significativos serán el resultado. Esto no será problemático ya que los aminofosfolípidos, tales como fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, se expresan en vasos centrales, grandes, y también en venas, vénulas, arterias, arteriolas y capilares que transportan sangre en todas las regiones del tumor. En cualquier caso, la capacidad de las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica para destruir las vasculatura del tumor significa que se puede lograr la regresión del tumor, en vez de solamente la estasis del tumor. La estasis del tumor frecuentemente es el resultado de terapias anti-angiogénicas que solamente dan en el blanco en los vasos sobresalientes en la periferia de un tumor sólido y se detiene la proliferación de los vasos. Aún si la presente invención se dirige a más de las regiones periféricas del tumor en ciertos tipos de tumor, lo que no se cree actualmente que sea el caso, la destrucción de los vasos de transporte de sangre en estas áreas todavía conduciría a trombosis amplia y necrosis del tumor. Las porciones objetivo de las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica y/o de diagnóstico de la presente invención, ya sea unidas a fosfatidiletanolamina o fosfatidilserina, serían ya sea basadas en anticuerpo o basadas en ligando de enlace o proteína de enlace. Cualquier ligando o proteína de enlace de aminofosfolípido conocido en la técnica de este modo puede ser ventajosamente usada en la administración de sustancias terapéuticas en la vasculatura del tumor . A manera de ejemplo solamente, ligando y proteínas de enlace de aminofosfolípidos convenientes incluyen quininógenos de peso molecular bajo y alto, y otras proteínas de enlace de fosfatidiletanolamina de rata, bovinas, de mono o humanas; y una o más de varias anexinas de enlace de fosfatidilserina-serina. Las secuencias de proteínas y de ADN para esos ligandos de enlace se conocen en la técnica y se incorporan en la presente mediante referencia, facilitando la producción de proteínas de fusión recombinantes para su uso en la presente invención. Los reactivos de enlace de aminofosfolípidos abarcados por el término "ligandos de enlace o proteínas de enlace de aminofosfolípidos" se extienden a todos los ligandojS y proteínas de enlace de aminofosfolípidos de todas las especies, y los fragmentos de enlace de aminofosfolípidos de los mismos, incluyendo ligandos y proteínas diméricos, triméricos y multiméricos, ligandos y proteínas biespecífieos; ligandos y proteínas quiméricos; ligandos y proteínas humanos; ligandos y proteínas recombinantes diseñados técnicamente, y fragmentos de los mismos. Cuando se emplean porciones cuyo objetivo está basado en anticuerpos, ya sea con enlace con fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina el término "anticuerpo anti-aminofosfolípido" , como se usa en la presente, se refiere ampliamente a cualquier sustancia de enlace inmunológico, tal como anticuerpos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE policlonales y monoclonales. Generalmente, se prefieren IgG y/o IgM debido a que son los anticuerpos mas comunes en la situación fisiológica y debido a que se hacen más fácilmente en un escenario de laboratorio . Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos policlonales, obtenidos a través de antisuero, se pueden emplear en la invención. Sin embargo, el uso de anticuerpos anti-aminofosfolípidos monoclonales (MAbs) se preferirá generalmente. Los anticuerpos aminofosfolípidos monoclonales se reconoce que tiene -ciertas ventajas, por ejemplo, reproducibilidad y producción a gran escala, que los hace convenientes para el tratamiento clínico. La invención de este modo proporciona anticuerpos monoclonales de origen murino, humano, de mono, rata, hámster, conejo y hasta de sapo o pollo. Debido a la facilidad de preparación y rápida disponibilidad de reactivos, los anticuerpos monoclonales murinos se usarán en ciertas modalidades. Como se entenderá por los expertos en la técnica, los reactivos enlace inmunológico abarcados por el termino "anticuerpo anti-aminofosfolípidos" se extienden a todos los anticuerpos y aminofosfolípidos de todas las especies, y fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, incluyendo anticuerpos diméricos, triméricos y multiméricos; anticuerpos biespecífieos; anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanos y humanizados; anticuerpos recombinantes y diseñados técnicamente, y fragmento de los mismos. El término "anticuerpo anti-aminofosfolípído" se usa entonces para referirse a cualquier molécula parecida anticuerpo anti-aminofosfolípido que tiene una región de enlace de antígeno, e incluye fragmentos de anticuerpos tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio simple (DABs) , Fv, scFv (Fv de cadena simple) y similares. Las técnicas para preparar y usar varias construcciones y fragmentos basados en anticuerpos son muy conocidas en la técnica. En ciertas modalidades, los anticuerpos empleados en las construcciones de sustancia ob etivo-sustancia terapéutica serán anticuerpos humanos o "humanizados". Los anticuerpos "humanizados" generalmente son anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón, rata, u otras especies no humanas, que tienen dominios de regiones constantes y/o variables humanas ("anticuerpos quiméricos en parte-humano" ) . En gran medida, los anticuerpos monoclonales humanizados para su uso en la presente invención serán anticuerpos quiméricos en donde cuando menos una primera región de enlace de antígeno, o región de determinación de complementariedad (RDC) , de un ratón, rata u otro anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido no humano se une operativamente a, o se "injerta" en, una región constante de anticuerpo humano o "estructura" . Los anticuerpos monoclonales "humanizados" para su uso en la presente también pueden ser anticuerpos monoclonales anti-aminofosfolípido a partir de especies no humanas en donde uno o más aminoácidos seleccionados se han intercambiado por aminoácidos más comúnmente observados en anticuerpos humanos. Esto se puede lograr fácilmente a través del uso de tecnología recombinante de rutina, particularmente mutagénesis específica al sitio. Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos completamente humanos, en vez de "humanizados", también se pueden preparar y usar en las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica de la presente invención. Estos anticuerpos humanos pueden ser anticuerpos policlonales, obtenidos por pacientes humanos que tienen una o más de una variedad de enfermedades, desórdenes o condiciones clínicas asociadas con la producción de anticuerpos anti-aminofosfolípidos . Estos anticuerpos se pueden concentrar, parcialmente purificar o sustancialmente purificar para su uso en la presente. También está disponible un banco de técnicas para preparar anticuerpos monoclonales humanos. Como existen pacientes humanos con enfermedades que producen anticuerpos anti-aminofosfolípidos, las células que producen anticuerpos de anti-aminofosfolípidos de estos pacientes se pueden obtener y manipular in vi tro para proporcionar un anticuerpo monoclonal humano para su uso en la construcción de la sustancia objetivo-sustancia terapéutica. Las manipulaciones in vi tro o técnicas incluyen fusión para preparar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal y/o la clonación del gen o genes que codifican el anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de las células ("anticuerpos recombinantes humanos"). Las células que producen anticuerpos anti-aminofosfolípidos humanas también se pueden obtener a partir de sujetos humanos sin una enfermedad asociada con anticuerpos de anti-aminofosfolípidos es decir "sujeto sano" en el contexto de la presente invención" . Para lograr esto, simplemente se obtiene la población de linfocitos de sangre periférica mezclada de un sujeto humano, incluyendo células que presentan antígeno y producen anticuerpo, y estimulando la población de células in vi tro mezclando con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido. De nuevo, las células que producen anticuerpo anti-aminofosfolípidos humanas, en cuanto se obtiene, podrían usarse en la producción de hibridomas y/o anticuerpos recombinantes antes de la preparación de la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica. Otras técnicas para la producción de anticuerpo monoclonal humano incluyen inmunizar un animal transgénico, preferiblemente un ratón transgénico, que comprende una biblioteca de anticuerpo humano con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido. Esto también genera células que producen anticuerpo anti-aminofosfolípido humanas para su posterior manipulación en producción de hibridoma y/o anticuerpo recombinante, con la ventaja de que las células del bazo en vez de las células de la sangre periférica, se pueden obtener fácilmente del animal transgénico o ratón transgénico. Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos preferidos para su uso en las constiucciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica de la presente invención son anticuerpos anti-fosfatidilserina (anti-PS) y anti-fosfatidiletanolamina (anti-PE) . Los anticuerpos anti-PS generalmente reconocerán, se enlazará a, o tendrán inmunoespecificidad para la molécula PS presente expresada, translocalizada, presentada o acomplejada en la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor. Los anticuerpos convenientes se ligarán entonces a fosfatidil-L-serina (Umeda y colaboradores, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . Los anticuerpos anti-PE generalmente reconocerán, se enlazarán a o tendrán inmunoespecificidad para la molécula PE presente, expresada, translocalizada, presentada o acomplejada en la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor. La administración de las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica y/o de diagnóstico a un animal con un tumor dará como resultado el enlace específico a las moléculas de aminofosfolípido presentes, expresadas o translocalizadas en la superficie luminal de los vasos sanguíneos del tumor, es decir, las construcciones de sustancia de objetivo-sustancia terapéutica se enlazarán a las moléculas de aminofosfolípidos en un ambiente biológico, natural. Por lo tanto, no será necesaria ninguna manipulación particular para asegurar el enlace. Sin embargo, en términos de enlace de anticuerpos, es de interés científico notar que los aminofosfolípidos pueden ser más posiblemente reconocidos o enlazados, por anticuerpos anti -aminofosfolípidos cuando las moléculas de aminofosfolípidos se asocian con una o más proteínas u otros componentes biológicos que no sean lípidos. Por ejemplo los anticuerpos anti-PS que se presentan como un subconjunto de anticuerpos anti-fosfolípido (anti-PL) en pacientes con ciertas enfermedades y desórdenes se cree ahora que se enlazan a PS en combinación con proteínas tales como ß2-glicoproteína I (ß2-GPI o apolipoproteína H, apoH) y protombina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,344,758; Rote, 1996; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . De manera similar, los anticuerpos anti-PE que se presentan en estados de enfermedad ahora se cree que se enlazan a PE en combinación con proteínas tales como quininógeno de alto y bajo peso molecular (HK) , precalicreína y hasta un factor XI (Sugi y Mclntyre, 1995; 1996a; 1996b; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Este es el significado de los términos "presentados" y "acomplejado en" la superficie luminal de los vasos sanguíneos del tumor, como se usa en la presente, lo cual significa que las moléculas de aminofosfolípido están presente en la superficie de los vasos sanguíneos del tumor en un estado competente de enlace, o estado competente de enlace de anticuerpo, independientemente de la definición molecular de ese estado particular. PS se puede aún usar de blanco como un complejo con factor Il/Ila, VlI/VIIa, IX/IXa y X/Xa. Más aún, la naturaleza del objetivo aminofosfolípido puede cambiar durante la práctica de la invención, ya que los efectos de enlace de anticuerpo de aminofosfolípido inicial, célula anti-endotelial y antitumor puede dar como resultado cambios biológicos que alteran el número, la conformación y/o el tipo de objetivo aminofosfolípido epítope (s). El término "anticuerpo anti-aminofosfolípido" , como se usa en el contexto de la presente invención, por lo tanto significa cualquier anticuerpo, sustancia o antisuero de enlace inmunológico; anticuerpo monoclonal, humano, humanizado, dimérico, trimérico, multimérico, quimérico, biespecífico, recombinante o diseñado técnicamente; o Fab', Fab, F(ab')2, DABs, Fv o fragmento de enlace de antígeno scFv de los mismos; que cuando menos se enlaza a un lípido o a un complejo que contiene un grupo amino o un objetivo aminofosfolípido, preferiblemente un objetivo basado en fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina. El requisito de que el anticuerpo "cuando menos se enlace a un aminofosfolípido" se satisface por el anticuerpo que se enlaza a alguno y/o todas la formas fisiológicamente relevantes de los aminofosfolípidos, incluyendo el llamado PS y PE "hexagonal" y "hexagonal fase II" (HexII PS y HexII PE) (Rauch y colaboradores, 1986; Rauch y Janoff, 1990; Berard y colaboradores, 1993; cada una incorporada en la presente mediante referencia) y PS y PE en combinación con cualquier otra proteína, lípido, componente de membrana, plasma, o componente de suero, o cualquier combinación de los mismos. De este modo, un "anticuerpo anti-aminofosfolípido" es un anticuerpo que se enlaza a un aminofosfolípido en los vasos sanguíneos del tumor, sin importar el hecho de que la bicapa o micela de aminofosfolípidos se pueden considerar inmunogénicamente neutros . Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos pueden reconocer, enlazarse o tener inmunoespecificidad para moléculas aminofosfolípidos, o un complejo inmunogénico de las mismas (incluyendo aminofosfolípidos hexagonales y combinaciones de proteínas), para la exclusión de otros fosfolípidos o lípidos.

Estos anticuerpos se pueden denominar "anticuerpos específicos de aminofosfolípidos o restringidos de aminofosfolípidos", para su uso en las construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas de la invención frecuentemente serán preferidas. "Los anticuerpos específicos para aminofosfolípidos o restringidos a los aminofosfolípidos" generalmente exhibirán un enlace significativo a los aminofosfolípidos, al mismo tiempo que exhiben poco o ningún enlace significativo con otros componentes lípidos, tales como fosfatidilinositol (Pl) , fosfatidilglicerol (PG) y hasta fosfatidilcolina (PC) en ciertas modalidades. "Los anticuerpos específicos para PS o restringidos a PS" generalmente exhibirán enlaces significativo a PS, al mismo tiempo que exhiben poco o ningún enlace significativo a los componentes lípidos tales como la fosfatidiletanolamina y la cardiolipina (CL) , así como PC, Pl y PG. "Los anticuerpos específicos para PE o restringidos a PE" generalmente exhiben enlace significativo a PE, al mismo tiempo que exhiben poco o ningún enlace significativo a los componentes lípidos tales como la fosfatidilserina, la cardiolipina, así como a PC, Pl y PG. La preparación de anticuerpos específicos anti-aminofosfolípidos se logra fácilmente, por ejemplo, como se describe por Rauch y colaboradores, (1986) ; Umeda y colaboradores, (1989) ; Rauch y Janoff (1990) ; y Rote y colaboradores, (1993); cada uno incorporado en la presente mediante referencia. Los "anticuerpos anti-aminofosfolípidos de reacción cruzada" que reconocen, se enlazan o tienen inmunoespecificidad para una molécula de aminofosfolípido, o un complejo inmunogénico de la misma (incluyendo aminofosfolípidos hexgonales y combinaciones de proteínas) , además de exhibir un menor enlace pero detectable a otros fosfolípidos o componentes lípidos de ninguna manera se excluyen de su uso en la invención. Estos "anticuerpos anti-aminofosfolípidos de reacción cruzada" se pueden emplear en tanto se enlacen con un aminofosfolípido presente, expresado, translocalizado, presentado o acomplejado en la superficie luminal de las células endoteliales vasculares del tumor in vivo . Otros anticuerpos convenientes específicos de aminofosfolípidos o restringidos a los aminofosfolípidos son aquellos anticuerpos anti-aminofosfolípidos que se enlazan tanto a PS como a PE. Aunque claramente son específicos o restringidos a los aminofosfolípidos, en oposición a otros componentes lípidos, existen anticuerpos que se enlazan a cada uno de los objetivos preferidos de la presente invención. Ejemplos de esos anticuerpos para su uso en las construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a PS3A, PSF6, PSF7 , PSB4 , PS3H1 y PS3E10 (Igarashi y colaboradores, 1991; incorporado en la presente mediante referencia) . Otros anticuerpos anti-PS ejemplares para su uso en la construcción de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas incluyen, pero no se limitan a BA3B5C4, PS4A7, PS1G3 y 3SB9b; siendo los preferidos PS4A7, PS1G3 y 3SB9b. Los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos humanizados y/o los fragmentos de enlace de antígenos basados en el anticuerpo 3SB9b (Rote y colaboradores, 1993; incorporado en la presente mediante referencia) actualmente son los más preferidos . Aunque los aminofosfolípidos, tales como PS y PE, en forma de bicapa o de micela se ha reportado que no son antigénicos o son débilmente antigénicos, o son no inmunogénicos o débilmente inmunogénicos, la literatura científica ha reportado que no hay dificultad en general anticuerpos anti-aminofosfolípidos, tales como anti-PS y anti-PE. Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos o anticuerpos monoclonales se pueden fácilmente preparar mediante procesos preparativos y métodos que comprenden: (a) preparar una célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido; y (b) obtener un anticuerpo anti-aminofosfolípido o anticuerpo monoclonal a partir de la célula que produce el anticuerpo. Los procesos para preparar células que producen anticuerpos anti-aminofosfolípidos y que obtienen anticuerpos anti-aminofosfolípidos de los mismos se pueden conducir en el sitio en un paciente dado. Esto es, simplemente proporcionando un cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido inmunogénico a un paciente dará como resultado una generación de anticuerpo anti-aminofosfolípido . De este modo, el anticuerpo anti-aminofosfolípido se "obtiene" de la célula que produce el anticuerpo, pero no tiene que ser aislado de una hospedera y posteriormente proporcionarse a un paciente, siendo capaz de localizar espontáneamente la vasculatura del tumor y ejercer sus efectos antitumor biológicos. Como se describe en la presente, las células que producen anticuerpo anti-aminofosfolípido se pueden obtener, y los anticuerpos posteriormente aislados y/o purificar, a partir de paciente humanos con enfermedades que producen anticuerpos anti-aminofosfolípidos, a partir de estimular los linfocitos de la sangre periférica con aminofosfolípidos in vi tro, y también mediante procesos y métodos de inmunización. Los últimos de los cuales generalmente comprenden: (a) inmunizar un animal administrando al animal cuando menos una dosis, y opcionalmente más de una dosis, una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido inmunogénico (tal como una forma hexagonal, o hexagonal fase II de un aminofosfolípido), preferiblemente una muestra de PS o PE inmunogénico; y (b) una célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir del animal inmunizado. La cantidad inmunogénicamente efectiva de la muestra de aminofosfolípido o muestras puede ser una muestra de aminofosfolípido recubierta con Salmonella (Umeda y colaboradores, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) ; una micela, liposoma, complejo lípido o muestra de formulación de lípido aminofosfolípido; o una muestra de aminofosfolípido fabricada con SDS. Cualquiera de estas muestras de aminofosfolípido se puede administrar en combinación con cualquier adyuvante conveniente, tal como el adyuvante completo de Freunds (Rote y colaboradores, 1993; incorporado en la presente mediante referencia) . Cualquier técnica empírica o variación se puede emplear para aumentar la inmunogenicidad, y/o las formas hexagonal o hexagonal fase II de los aminofosfolípidos se puede administrar. La inmunización se puede basar en una o más inyecciones intraesplénicas de una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra aminofosfolípida (Umeda y colaboradores, 1989; incorporado en la presente mediante referencia) . Independientemente de la naturaleza del proceso de inmunización, o del tipo de animal inmunizado, las células que producen anticuerpo anti-aminofosfolípido se obtienen a partir del animal inmunizado, preferiblemente, además se manipulan por la mano del hombre. "Un animal inmunizado" como se usa en la presente, es una animal no humano, a menos que se diga expresamente otra cosa. Aunque se puede usar cualquier célula que produce anticuerpo, más preferiblemente se obtienen células del bazo como la fuente de células que producen anticuerpos. Las células que producen anticuerpos anti-aminofosfolípidos se pueden usar en un proceso preparativo que comprende: (a) fusionar una célula que produce anticuerpos anti-aminofosfolípidos con una célula inmortal para preparar un hibridoma que produzca un anticuerpo anti-aminofosfolípido monoclonal y (b) obtener un anticuerpo anti-aminofosfolípido monoclonal a partir de hibridoma. Los métodos preparativos de anticuerpos monoclonales basados en hibridoma de este modo incluyen aquellos que comprenden: (a) inmunizar un animal administrando al animal cuando menos una dosis, y opcionalmente una dosis, de una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido inmunogénico (tal como una forma hexagonal, o hexagonal fase II de un aminofosfolípido) , preferiblemente una muestra de PS o PE inmunogénica; (b) preparar una colección de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales a partir del animal inmunizado; (c) seleccionar de la colección cuando menos un primer hibridoma que produzca cuando menos un primer anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido, y preferiblemente cuando menos un primer anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido, y preferiblemente, cuando menos un primer anticuerpo monoclonal específico para aminofosfolípido; y (d) cultivar cuando menos un primer hibridoma que produce anti-aminofosfolípido o específico para aminofosfolípido para proporcionar el cuando menos un primer anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido o anticuerpo monoclonal específico para aminofosfolípido; y preferiblemente (e) obtener el cuando menos un primer anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido o anticuerpo monoclonal específico para aminofosfolípido a partir del cultivo de cuando menos un primer hibridoma . Como se usan animales no humanos para la inmunización, los anticuerpos monoclonales anti-aminofosfolípidos obtenidos de este hibridoma frecuentemente tendrán una conformación no humana. Estos anticuerpos se pueden someter opcionalmente a un proceso de humanización, injerto o mutación, como es conocido para los expertos en la técnica y se describe adicionalmente en la presente. De manera alternativa, los animales transgénicos, tales como ratones, se pueden usar que comprendan una biblioteca de genes de anticuerpos humanos. La inmunización de estos animales por lo tanto dará como resultado directamente la generación de anticuerpos anti-aminofosfolípidos humanos.

Después de la producción de una célula que produce anticuerpo conveniente, más preferiblemente un hibridoma, ya sea produciendo anticuerpos humanos o no humanos, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo monoclonal se pueden clonar para preparar un anticuerpo monoclonal "recombinante". Se puede utilizar cualquier técnica de clonación recombinante, incluyendo el uso de reacción de cadena de polimerasa para iniciar la síntesis de la secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos. Por lo tanto, métodos todavía más apropiados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen aquellos que comprende usar la célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido como sigue: (a) obtener cuando menos una primera molécula de ácido nucleico o segmento que codifica anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de una célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido, preferiblemente un hibridoma; y (b) expresar la molécula de ácido nucleico o el segmento en una célula hospedera recombinante para obtener un anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido recombinante. Sin embargo, otras técnicas recombinantes poderosas están disponibles que están idealmente adaptadas a la preparación de anticuerpos monoclonales recombinantes . Estas técnicas recombinantes incluyen los métodos preparativos de anticuerpos monoclonales basados en biblioteca de fagémido que comprenden: (a) inmunizar un animal administrando al animal cuando menos una dosis, y opcionalmente más de una dosis, de una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido inmunogénico (tal como una forma hexagonal o hexagonal fase II de un aminofosfolípido) , preferiblemente una muestra de PS o PE inmunogénico; (b) preparar una biblioteca de fagémido de inmunoglobulina combinatoria que expresa ARN aislado a partir de células que producen anticuerpo, preferiblemente del bazo, del animal inmunizado; (c) seleccionar de la biblioteca del fagémido cuando menos una primera clona que expresa cuando menos un primer anticuerpo anti-aminofosfolípido, y preferiblemente, cuando menos un primer anticuerpo específico para aminofosfolípido; (d) obtener ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-aminofosfolípidos a partir de cuando menos una primera clona seleccionada y expresar los ácidos nucleicos en una célula hospedera recombinante para proporcionar el cuando menos un primer anticuerpo de anti-aminofosfolípido o anticuerpo específico para aminofosfolípido o anticuerpo específico para aminofosfolípido y preferiblemente (e) obtener el cuando menos un primer anticuerpo anti-aminofosfolípido o anticuerpo específico para aminofosfolípido expresado por los ácidos nucleicos obtenidos a partir de cuando menos una primera clona seleccionada . De nuevo, en estas técnicas basadas en biblioteca de fagémidos, se pueden emplear animales transgénicos que llevan bibliotecas de genes de anticuerpos humanos produciendo de este modo anticuerpos monoclonales humanos recombinantes . Independientemente de la manera de preparación de un primer segmento de ácido nucleico de anticuerpo anti-aminofosfolípido, otros segmentos de ácido nucleico de anticuerpo anti-aminofosfolípido convenientes se pueden fácilmente preparar mediante técnicas de biología molecular estándares. Con el fin de confirmar que cualquier segmento de ácido nucleico de anticuerpo anti-aminofosfolípidó variante como mutante o de segunda generación es conveniente para su uso en la presente invención, el segmento de ácido nucleico se probará para confirmar la expresión de un anticuerpo que se enlaza a un aminofosfolípido. Preferiblemente, el segmento de ácido nucleico de anticuerpo anti-aminofosfolípido variante, mutante o de segunda generación, también se probará para confirmar la hibridización a un segmento de ácido nucleico de anticuerpo anti-aminofosfolípido bajo condiciones estándares, más preferiblemente, condiciones de hibridización estándares estrictas. Las condiciones de hibridización convenientes ejemplares incluyen la hibridización en aproximadamente 7 por ciento de dodecil sulfato de sodio (SDS), aproximadamente 0.5 M NaP04, aproximadamente 1 mM AEDT a aproximadamente 50 °C; y lavado con aproximadamente 1 por ciento SDS a aproximadamente 42°C. Ya que una variedad de anticuerpos monoclonales recombinantes, ya sea humanos o no humanos en origen, se pueden preparar fácilmente, los métodos de tratamiento de la invención se pueden ejecutar proporcionando al animal o paciente cuando menos un primer segmento de ácido nucleico que expresa una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica en el paciente. El "segmento de ácido nucleico que expresa una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica" generalmente estará en forma de cuando menos una construcción de expresión, y puede estar en forma de una construcción de expresión que comprende un virus o dentro de una célula hospedera recombinante. Preferiblemente los vectores de terapia de genes de la presente invención generalmente serán vectores virales, tales como compuestos dentro de retrovirus recombinantes, virus de herpes simple (VHS), adenovirus, virus adenoasociados (VAA) , citomegalovirus (CMV), y similares. En cuanto se ha seleccionado la sustancia objetivo, ya sea basada en anticuerpo o basada en ligando de enlace, y ya sea enlazada a una fosfatidiletanolamina y/o fosfatidilserina, la sustancia objetivo se une operativamente a una o más sustancias terapéuticas y/o de diagnóstico o porciones "efectivas". Las sustancias terapéuticas de las presentes construcciones generalmente serán ya sea sustancias anticelulares, citotóxicas o anti-angiogénicas , o factores de coagulación (coagulantes) . El uso de sustancias anti-celulares, citotóxicas y/o anti-angiogénicas da como resultado las "inmunotoxinas aminofosfolípidos" (o inmunotoxinas anti-aminofosfolípidas) , mientras que el uso de factores de coagulación da como resultado unos "coaguligandos aminofosfolípidos" (o coaguligandos anti-aminofosfolípidos) . Estos términos se usan de nuevo por simplicidad y sucintamente se refieren a ligandos de enlace de aminofosfolípidos o construcciones de sustancias objetivo de aminofosfolípidos-sustancias terapéuticas en términos de su fracción terapéutica unida. La presente invención además proporciona ligandos de enlace, y métodos de uso, que comprended cuando menos dos sustancias terapéuticas operativamente unidas a una sustancia objetivo que comprende un solo sitio de enlace aminofosfolípido. Los ligandos de enlace pueden comprender cuando menos dos sustancias terapéuticas operativamente unidas a una sustancia objetivo que comprende cuando menos dos sitios de enlace de aminofosfolípidos, o una pluralidad de sustancias terapéuticas operativamente unidas a una sustancia objetivo que comprende una pluralidad de sitios de enlace aminofosfolípidos, generalmente en regiones distintas de los sitios de enlace de aminofosfolípidos . Combinaciones de sustancias anti-celulares y citotóxicas con factores de coagulación también se contempla, independientemente - del número de sitios de enlace de aminofosfolípidos. El uso combinado de sustancias terapéuticas de diferentes clases, tales como citotoxinas y coagulantes, también se contemplan modalidades en donde dos o más ligandos de enlace se administran al animal, conteniendo cada uno un solo tipo de sustancia terapéutica. Las citotoxinas diferentes también se pueden emplear en uno o más ligandos o métodos de enlace tales como medidores de síntesis de ADN combinados con citotoxinas clásicas, tales como ricina. En ciertas aplicaciones, las construcciones dirigidas a aminofosfolípidos deberán unirse operativamente a sustancias citotóxicas, citostáticas o de otro modo anticelulares que tengan la habilidad para eliminar o suprimir el crecimiento de la división celular de células endoteliales. Las sustancias anti-celulares convenientes incluyen sustancias quimioterapéuticas, así como citotoxinas y sustancias citostáticas. Las sustancias citostáticas generalmente son aquellas que perturban el ciclo natural de las células de una célula objetivo, preferiblemente de manera que la célula se saca del ciclo de la célula. Las sustancias quimioterapéuticas ejemplares incluyen: esteroides, citocinas; antimetabolitos tales como citocina arabinosida, fluorouracilo, metotrexaco o aminopterina; antraciclina; mitomicina C; alcaloides vinca; antibióticos; demecolcina; etoposida; mitramicina; y sustancias alquilantes antitumor, tales como clorambucilo o melfalano. Además, cualquiera de las sustancias descritas en la presente en la tabla C podría usarse. Ciertas sustancias anti-celulares preferidas son inhibidores de la síntesis del ADN, tales como daunorrubicina, doxorrubicina, adriamicina, y similares . En otras modalidades, las construcciones dirigidas a los aminofosfolípidos de la invención se pueden unir operativamente a sustancias anti-angiogénicas de manera que, actuando ya sea solas o en concierto con otro factores hospederos, o sustancias terapéuticas administradas, tengan la capacidad de evitar o inhibir la vascularización y/o inducir la regresión de los vasos sanguíneos. Las sustancias anti-angiogénicas convenientes incluyen aquellas enlistadas en la tabla D, así como otras sustancias anti-angiogénicas conocidas para los expertos en la técnica. A manera de ejemplo solamente uno puede mencionar las angiopoyetinas, preferiblemente, angiopoyetina-2 (Ang-2; SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4) , pero también la angiopoyetina-1 (Ang-1; SEQ ID NO:l, SEQ ID N0:2), las proteínas de fusión de angiopoyetina (por ejemplo, como en SEQ ID N0:5) y hasta angiopoyetina-3 y hasta angiopoyetina-4. En ciertas aplicaciones terapéuticas, las fracciones de toxinas se preferirán, debido a la capacidad mucho mayor de la mayoría de las toxinas para administrar un efecto eliminador de células, en comparación con otras sustancias potenciales. Por lo tanto, ciertas sustancias anticelulares preferidas para las construcciones objetivo-aminofosfolípido son las toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias. Las toxinas ejemplares incluyen epipodofilotoxinas; endotoxina bacteriana o la fracción del lípido A de la endotoxina bacteriana; proteínas que inactivan el ribosoma, tal como saporina o gelonina; a-sarcina; aspergilina; restrictocina; ribonucleasas, tales como ribonucleasa placentaria; toxina de la difteria y exotoxina de Pseudomonas . Las toxinas preferidas para ciertas modalidades son gelonina y/ó las toxinas de cadena A, tales como la cadena de ricina A. La fracción de toxina más preferida frecuentemente es la cadena ricina A que ha sido tratada para modificar o remover los residuos de carbohidratos, denominados "cadena A desglicosilada" (dgA) . La cadena de ricina A desglicosilada se prefiere debido a su extrema potencia, vida media más larga, y debido a que es factible económicamente fabricarla en grado y escala clínicos. La cadena de ricina A recombinante y/ó truncada también se puede usar. Para dirigirse a tumores y tratamiento con imunotoxinas , las siguientes patentes y solicitudes de patentes se incorporan específicamente en la presente mediante referencia, con el propósito de suplementar todavía adicionalmente las presentes enseñanzas con respecto a las sustancias anticelulares y citotóxicas: Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,776,427; 5,863,538; 6,004,555; 5,965,132; 6,051,230 y 5,660,827; y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 07/846,349. Las construcciones dirigidas a aminofosfolípidos de la invención pueden comprender un componente que sea capaz de promover la coagulación, es decir, un coagulante. Aquí, el anticuerpo o ligando objetivo se puede enlazar directamente o indirectamente, por ejemplo, vía otro anticuerpo, a un factor que directamente o indirectamente estimula la coagulación. Los factores de coagulación preferidos para estos usos son el Factor de Tejido (TF) y los derivados del Factor de Tejido, tales como el Factor de Tejido truncado (tTF) , el Factor de Tejido dimérico, trimérico, polimérico/multimérico, y el Factor de Tejido mutante deficiente en la capacidad para activar el Factor VII. Otros factores de coagulación convenientes incluyen coagulantes dependientes de la vitamina K, tal como el Factor Il/IIa, el Factor Vll/VIIa, el Factor IX/lXa y Factor X/Xa; los factores de coagulación dependientes de la vitamina K que carecen de la modificación Gla; el activador de Factor X de veneno de víbora de Russell; compuestos que activan las plaquetas, tales como tromboxano A2 y tromboxano A2 sintasa; e inhibidores de la fibrinolisis, tales como la a^-antiplasmina. El objetivo y el tratamiento contra tumores con coaguligandos se describe en las siguientes patentes y solicitudes de patentes, cada una de las cuales se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para los propósitos o aún adicionalmente suplementar las presentes enseñanzas con respecto a los coaguligandos y los factores de coagulación: Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,877,289; 5,965,132; 6,036,955 y 6,093,399 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 07/846,349.

Como una distribución algo más amplia de las sustancias coagulantes, no se asociarán con efectos secundarios severos, hay un requerimiento menos estricto impuesto sobre el elemento objetivo de los coaguligandos que con las inmunotoxinas. Por lo tanto, lograr los objetivos específicos significa que la coagulación se promueve en la vasculatura del tumor en relación con la vasculatura de sitios que no tienen tumor. De este modo, la dirección específica de un coaguligando es un término funcional, en vez de puramente un término físico relacionado con las propiedades de biodistribución de la sustancia objetivo.

La preparación de inmunotoxinas generalmente es muy conocida en la técnica (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,340,535, incorporada en la presente mediante referencia). Cada una de las siguientes patentes y solicitudes de patentes se incorporan adicionalmente en la presente mediante referencia con los propósitos de suplementar todavía además las presentes enseñanzas con respecto a la generación de inmunotoxinas, purificación y uso; las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,776,427; 5,863,538; 6,004,555; 5,965,132; 6,051,230 y 5,660,827; y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 07/846,349. En la preparación de inmunotoxinas, las ventajas se pueden lograr a través del uso de ciertos enlazadores. Por ejemplo, los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está estéricamente "impedido" se prefieren frecuentemente, debido a su mayor estabilidad en vivo, evitando de este' modo la liberación de la reacción toxina antes de enlazarse al sitio de acción. Generalmente se desea tener un conjugado que permanecerá intacto bajo condiciones encontradas en cualquier lado en el cuerpo, excepto en el sitio pretendido de acción, en este punto es deseable que el conjugado tenga buenas características de "liberación".

Dependiendo del compuesto de toxina específico usado, puede ser necesario proporcionar un separador de péptido que operativamente se una a la sustancia objetivo y al compuesto de toxina, en donde el separador de péptido sea capaz de doblarse en una estructura de ciclo de disulfuro ligado. La disociación proteolítica dentro del ciclo proporcionaría entonces un polipéptido heterodimérico, en donde la sustancia objetivo y el compuesto de toxina se enlazan solamente mediante un enlace disulfuro simple. Cuando se utilizan ciertos compuestos diferentes de toxinas, se puede proporcionar un separador de péptido no disociable para unir operativamente la sustancia objetivo y el compuesto de toxina. Las toxinas que se pueden usar junto con separadores de péptidos no disociables son aquéllas que pueden, en sí mismas, convertirse mediante disociación proteolítica, en una forma citotóxica de disulfuro enlazado. Un ejemplo de este compuesto de toxina es un compuesto de exotoxinas de Pseudomonas . Una variedad de sustancias quimioterapéuticas y otras sustancias farmacológicas también se pueden conjugar con éxito a los anticuerpos de aminofosfolípidos o ligandos objetivos. Las sustancias antineoplásicas ejemplares que han sido conjugados en anticuerpos incluyen desoxorrubicina, daunomicina, metotrexato y vinblastina. Más aún, la unión de otras sustancias, tales como neocarcinostatina, macromicina, trenimón y -amanitina se han descrito (ver la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; y Patente No. 5,965,132 (Solicitud con Número de Serie 08/350,212, Emisión de Derechos pagados) y las referencias incorporadas en las mismas. A la luz de un trabajo anterior de los presentes inventores, la preparación de coaguligandos se practica ahora fácilmente. La asociación operable de uno o más factores de coagulación con una sustancia objetivo de aminofosfolípidos puede ser un enlace directo, tal como el descrito anteriormente, para las inmunotoxinas. Alternativamente, la asociación operativa puede ser una unión indirecta, tal como la sustancia objetivo se une operativamente a una segunda región de enlace como preferiblemente y la región de enlace de anticuerpo o antígeno de un anticuerpo, que se enlaza con el factor de coagulación. El factor de coagulación deberá unirse a la sustancia objetivo en un sitio distinto de su sitio de coagulación funcional, particularmente cuando se usa el enlace covalente para unir las moléculas. Los coaguligandos enlazados indirectamente frecuentemente se basan en anticuerpos biespecíficos . La preparación de anticuerpos biespecíficos también es muy conocido en la técnica. Un método de preparación implica la preparación por separado de anticuerpos que tienen especificidad para el componente de tumor objetivo, por un lado, y la sustancia coagulante por el otro. Los fragmentos de péptido F(ab'?)2 a partir de los dos anticuerpos elegidos se generan entonces, seguidos por la reducción de cada uno para proporcionar fragmentos Fab ' ySH por separado. Los grupos SH en una de los dos compañeros que se van a acoplar se alquilan entonces con un reactivo de reticulación, tal como el o-fenilendimaleimida, para proporcionar grupos maleimida libres sobre un compañero. Este compañero se puede entonces conjugar con el otro por medio de un enlace de tioéter, para dar el deseado heteroconjugado F(ab'?)2 (Glennie y colaboradores, 1987; incorporado en la presente mediante referencia) . Otros enfoques, tales como la reticulación con SPDP o la proteína A también se pueden llevar a cabo. Otro método para producir anticuerpos biespecíficos es mediante la fusión de dos hibridomas para formar un cuadroma. Como se usa en la presente, el término "cuadroma" se usa para describir la fusión productiva de dos hibridomas de células B. Usando ahora técnicas estándares, dos hibridomas que producen anticuerpos se fusionan para dar células hijas, y esas células que han mantenido la expresión de ambos conjuntos de clonotipos de genes de inmunoglobulinas se seleccionan entonces . Un método preferido para generar un cuadroma involucra la selección de un mutante deficiente de enzima de cuando menos una de las hibridomas padres. Esta primera línea celular de hibridoma mutante se fusiona entonces en células de un segundo hibridoma que se ha expuesto letalmente, por ejemplo, a yodoacetamida, impidiendo su supervivencia continuada. La fusión celular permite el rescate del primer hibridoma adquiriendo el gen para su deficiencia de enzima a partir del hibridoma tratado letalmente, y el rescate del segundo hibridoma a través de la fusión con el primer hibridoma. Se prefiere, pero no se requiere, la fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de una subclase diferente. Un anticuerpo de subclase mezclado permite el uso si un ensayo alternativo del aislamiento es un cuadroma preferido. Las modalidades de identificación de microtitulación, FACS, manchado de inmunofluorescencia, anticuerpos específicos de idiotipo, ensayos de competición de enlace de antígenos, y otros métodos comunes en la técnica de caracterización de anticuerpos pueden ser usados para identificar los cuadromas preferidos. Después del elemento del cuadroma, los anticuerpos biespecíficos se purifican alejados de otros productos celulares. Esto se puede llevar a cabo mediante una variedad de procedimientos de aislamiento de anticuerpos, conocidos para los expertos en la técnica de purificación de inmunoglobulina (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 1998; incorporado en la presente mediante referencia) . Se prefieren las columnas de sefarosa de proteína A o proteína G.

En la preparación de tanto inmunotoxinas como coaguligandos, se puede expresar la expresión recombinante. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la sustancia objetivo elegida, y la toxina o coagulante, se unen en estructura en un vector de expresión. La expresión recombinante de este modo da como resultado la traducción del ácido nucleico para producir el compuesto de sustancia objetivo-toxina/coagulante deseado. Los reticuladores químicos y los puentes de avidina: biotina también pueden unir la sustancia o sustancia terapéuticas con la sustancia o las sustancias objetivos. Las siguientes patentes y solicitudes de patente se incorpora cada una en la presente mediante referencia para los propósitos de suplementar todavía adicionalmente las presentes enseñanzas con respecto a la preparación de coaguligandos, purificación y uso, incluyendo los coaguligandos de anticuerpos biespecíficos : Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,965,132; 6,004,555; 6,036,955; 5,877,289; y 6,093,399; y las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 07/846,349; 08/273,567; 08/485,482; 08/472,631; y 08/481,904.

En ciertas modalidades, primero tiene que formarse una imagen de la vasculatura del tumor vascularizado del animal o paciente que se va a tratar. Generalmente esto se logra administrando al animal o al paciente una cantidad diagnósticamente efectiva de cuando menos una primera composición farmacéutica que comprende cuando menos una primera construcción de enlace aminofosfolípido detectablemente etiquetada que se enlaza con, e identifica un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presente, expresado, translocalizado, presentado o acomplejado en la superficie luminal de los vasos sanguíneos o los vasos sanguíneos intratumorales del tumor vascularizado. La invención de este modo proporciona además composiciones para su uso en, y métodos de, distinguir entre los vasos sanguíneos de tumor y/ó intratumorales y los vasos sanguíneos normales. La "distinción" se logra administrando una o más de las construcciones de aminofosfolípidos de enlace detectablemente etiquetados descritos. La construcción de enlace de aminofosfolípidos detectablemente etiquetados puede comprender un compuesto detectable por rayos X, tales como bismuto (III) , oro (III) , lantano (III) o plomo (II); un ion radioactivo, tal como cobre67, galio67, galio68, indio111, indio113, yodo123, yodo125, yodo131, mercurio197, mercurio203, renio186, renio188, rubidio97, rubidio103, tecnetio99m o itrio90; un isótopo de resonancia de giro magnética nuclear, tal como cobalto (II), cobre (II), cromo (III) , disprosio (III) , erbio (III) , gadolinio (III) ; holmio (III), hierro (II), hierro (III), manganeso (II); neodimio (III), níquel (II), samario (III), terbio (III), vanadio (II) o iterbio (III); o rodamina o fluoresceína. La formación de imagen antes del tratamiento del tumor de este modo se puede llevar a cabo mediante: (a) administrar al animal o paciente una cantidad diagnósticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende cuando menos una primera construcción de enlace de aminofosfolípido detectablemente etiquetada que comprende una sustancia de diagnóstico operativamente unida a un anticuerpo, proteína de enlace o ligando, o un fragmento de enlace de aminofosfolípido de los mismos, que se enlaza a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, presente, expresada, translocalizada, presentada o acomplejada en la superficie luminal de los vasos sanguíneos o los vasos sanguíneos intratumorales del tumor vascularizado; y (b) detectar posteriormente la construcción de enlace de aminofosfolípido detectablemente etiquetada unida a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, en la superficie luminal del tumor o vasos sanguíneos intratumorales, mediante lo cual se obtiene una imagen de la vasculatura del tumor. El tratamiento para el cáncer también se puede llevar a cabo mediante: (a) formar una imagen de un tumor vascularizado administrando a un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado una cantidad mínima diagnósticamente de cuando menos una primera construcción de enlace de aminofosfolípido detectablemente etiquetada que comprende una sustancia de diagnóstico operativamente unida a un anticuerpo, enlazar la proteína o ligando, o el fragmento de enlace de aminofosfolípido de las mismas, que se enlaza con un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, en la superficie luminal del tumor o los vasos sanguíneos intratumorales del tumor vascularizado, formando mediante esto una imagen detectable de la vasculatura del tumor; y (b) posteriormente administrar al mismo animal o paciente una cantidad terapéuticamente optimizada de cuando menos una primera construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica que se enlaza con un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, en el tumor o en la superficie luminal de los vasos sanguíneos intratumorales y mediante esto se destruye la vasculatura del tumor . Las formulaciones para formación de imagen y tratamiento o medicamentos se proporcionan así, que generalmente comprenden: (a) una primera composición farmacéutica que comprende una cantidad diagnósticamente efectiva de una construcción de enlace de aminofosfolípido detectablemente etiquetada que comprende una sustancia detectable operativamente unida a un anticuerpo, una proteína o ligando de enlace, o un fragmento de enlace de aminofosfolípido de la misma, que se enlaza a un aminofosfolípido, preferiblemente fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina, en la superficie luminal del tumor o en los vasos sanguíneos intratumorales del tumor vascularizado; y (b) una segunda composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica, preferiblemente una que se enlace con fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina . En estos métodos y medicamentos, se tendrán ventajas en donde la primera y segunda composiciones farmacéuticas comprenden las mismas sustancias objetivos, por ejemplo, anticuerpos anti-aminofosfolípido, o fragmentos de los mismos, de la misma preparación de anticuerpos, o preferiblemente, del mismo hibridoma que produce el anticuerpo. Los medicamentos anteriores también pueden comprender una o más sustancias anticáncer. En los aspectos de formación de imagen de la vasculatura de la invención, se reconoce que la construcción de enlace de aminofosfolípido detectablemente etiquetada administrada, o la sustancia de anticuerpo detectable de anti-aminofosfolípido, puede en sí misma tener un efecto terapéutico. Mientras que esto no se excluye de la invención, las cantidades de las construcciones detectablemente etiquetadas que se van a administrar generalmente se eligirían como "cantidades diagnósticamente efectivas", las cuales típicamente son menores que las cantidades requeridas para el beneficio terapéutico. En las modalidades de formación de imagen, como con los terapéuticos, la sustancia objetivo puede ser, ya sea basado en anticuerpo o basado en ligando de enlace o proteína de enlace. Aunque no se conecta previamente con tumores o con la vasculatura del tumor, las composiciones de ligando de enlace de aminofosfolípido detectablemente etiquetadas son conocidas en la técnica y ahora pueden, a la luz de esta motivación y la presente descripción, ser usadas en la presente invención. Las anexinas detectablemente etiquetadas de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,627,036; Publicaciones Internacionales WO 95/19791; WO 95/27903; WO 95/34315; WO 96/17618; y WO 98/04294; cada una incorporada a la presente mediante referencia; se pueden emplear de este modo. En todavía otras modalidades, los animales o pacientes que se van a tratar mediante la presente invención se someten además a cirugía o radioterapia, o se les proporciona una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una primera sustancia anticáncer. La "cuando menos una primera sustancia anticáncer" en este contexto significa "cuando menos una primera sustancia anticáncer además de la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica de la invención". La "cuando menos una primera sustancia anticáncer" de este modo se puede considerar que es "cuando menos una segunda sustancia anticáncer", en donde la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica es una primera sustancia anticáncer. Sin embargo, esto es puramente materia de semántica, y el significado práctico quedará claro para los expertos en la técnica. La cuando menos una primera sustancia anticáncer se puede administrar al animal o paciente sustancialmente simultáneamente con la sustancia con la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica; tal como a partir de una sola composición farmacéutica o a partir de dos composiciones farmacéuticas administradas muy cercana una de la otra. De manera alternativa, la cuando menos una primera sustancia anticáncer se puede administrar al animal o paciente en un momento secuencial a la administración de la cuando menos una primera construcción de sustancia obj etivo-sustancia terapéutica. "En un momento secuencial", como se usa en la presente, significa "escalonadas", de manera que la cuando menos una primera sustancia anticáncer se administra al animal o paciente en un tiempo distinto a la administración de la cuando menos una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica. Generalmente, las dos sustancias se administran en momentos efectivamente separados para permitir que las dos sustancias ejerzan sus efectos terapéuticos respectivos, es decir, se administran en "intervalos de tiempo biológicamente efectivos" . La cuando menos una primera sustancia anticáncer se puede administrar al animal o paciente en un momento biológicamente efectivo antes de la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica, o en un tiempo biológicamente efectivo posterior a la construcción de la sustancia objetivo-sustancia terapéutica. 'La administración de una sustancia anticáncer dirigida a un no-aminofosfolípido en un tiempo terapéuticamente efectivo subsecuente a la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica se puede desear particularmente en donde la sustancia anticáncer es una inmunotoxina de células antitumor diseñada para matar las células del tumor en la circunferencia más externa del tumor, y/ó en donde la sustancia anticáncer es una sustancia antiangiogénica diseñada para evitar la micrometástasis de cualquier célula tumoral restante. Estas consideraciones serán conocidas por los expertos en la técnica. La administración de una o más sustancias anticáncer dirigidas a no-aminofosfolípidos en un tiempo terapéuticamente efectivo antes de una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica se puede emplear particularmente cuando la sustancia anticáncer se diseña para aumentar la expresión de aminofosfolípidos. Esto se puede lograr usando sustancias anticáncer que dañan, o inducen apoptosis en, el endotelio del tumor. Las sustancias anticáncer ejemplares incluyen, por ejemplo, taxol, vincristina, vinblastina, neomicina, combretastatina (s) , podofilotoxina (s) , TNF-a, angiostatina, endostatina, vasculostatina, avß3 antagonistas, ionóforos de calcio, sustancias que inducen el flujo de calcio, cualquier derivado o profármaco de los mismos . La una o más sustancias anticáncer adicionales pueden ser sustancias quimioterapéuticas, sustancias radioterapéuticas, citocinas, sustancias anti-angiogénicas, sustancias que inducen apoptosis o inmunotoxinas o coaguligandos anticáncer. "Sustancias quimioterapéuticas", como se usan en la presente, se refieren a sustancias o fármacos quimioterapéuticos clásicos usados en el tratamiento de malignidades. Este término se usa para simplicidad independientemente del hecho de que otros compuestos se pueden describir técnicamente como sustancias quimioterapéuticas, porque ejercen efecto anticáncer. Sin embargo, "quimioterapéutico" ha llegado a tener un significado distinto en la técnica y se está usando de acuerdo con este significado estándar. En la presente se describen varias sustancias quimioterapéuticas ejemplares. Las personas con experiencia ordinaria en la técnica fácilmente entenderán los usos y dosis adecuadas de las sustancias quimioterapéuticas, aunque las dosis se pueden reducir cuando se usan en combinación con la presente invención. Una nueva clase de fármacos que también se puede denominar "sustancias quimioterapéuticas" son sustancias que inducen la apoptosis. Cualquiera de uno o más de estos fármacos, incluyendo genes, vectores y construcciones antisentido, como sea apropiado, también se puede usar junto con la presente invención. Las inmunotoxinas o coaguligandos anticáncer son otras sustancias anticáncer adecuadas. "Inmunotoxinas o coaguligandos anticáncer", o construcciones de sustancias terapéuticas/sustancias objetivo, se basan en sustancias objetivo, incluyendo anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, que se enlazan a un componente que es blanco de una célula tumoral, vasculatura de tumor o estroma de tumor, y que están unidos operativamente a una sustancia terapéutica, generalmente una sustancia citotóxica (inmunotoxina) o factor de coagulación (coaguligando) . Un "componente dirigible" de una célula de tumor, vasculatura de tumor o estroma de tumor, preferiblemente es un componente que se expresa en superficie, accesible en superficie o localizado en superficie, aunque los componentes liberados de células tumorales necróticas o dañadas de otra manera, o las células endoteliales vasculares también pueden ser el blanco, incluyendo los antígenos de células tumorales citosólicas y/ó nucleares . Se pueden usar tanto sustancias de objetivo de anticuerpo y no anticuerpo, incluyendo factores de crecimiento, tales como VEGF y FGF; péptidos que contienen el tripéptido R-G-D, que se enlazan específicamente a la vasculatura del tumor; y otros componentes objetivo, tales como anexinas y ligandos relacionados . Las inmunotoxinas o coaguligandos de células antitumores pueden comprender anticuerpos ejemplificados mediante el grupo que consiste en B3 (ATCC HB 10573) , 260F9 (ATCC HB 8488), D612 (ATCC HB 9796) y KSl/4, este anticuerpo KSl/4 obtenido a partir de una célula que comprende el vector pGKC2310 (NRRL B-18356) o el vector pG2A52 (NRRL B-18357) . Las inmunotoxinas o coaguligandos de estromas antitumor generalmente comprenden anticuerpos que se enlazan a un componente de tejido conectivo, un componente de membrana de base o un componente de plaqueta activada; como se ejemplifica enlazándose a fibrina, RIBS o LIBS. Las inmunotoxinas o coaguligandos de vasculatura antitumor pueden comprender ligandos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, que se enlazan a un componente expresado en superficie, accesible en superficie o localizado en superficie de los vasos de transporte de sangre, preferiblemente los vasos sanguíneos intratumorales, de un tumor vascularizado. Estos anticuerpos incluyen aquellos que se enlazan a componentes expresados en superficie de los vasos sanguíneos intratumorales de un tumor vascularizado, incluyendo los mismos aminofosfolípidos, y los receptores de superficie de células de la vasculatura antitumoral, tales como endoglina (anticuerpos TEC-4 y TEC-11) , un receptor TGFß, selectina-E, selectina-P, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, un TIE, integrina ?ívß3, pleiotropina, endosialina y proteínas MHC Clase II. Los anticuerpos también se pueden enlazar a componentes inducibles por citocina o inducibles por coagulante de los vasos sanguíneos intratumorales . Otras inmunotoxinas o coaguligandos de vasculatura antitumor pueden comprender anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que se enlazan a un factor de crecimiento que se enlaza a un receptor de superficie de célula de vasculatura intratumoral . Estos anticuerpos incluyen aquellos que se enlazan con VEGF/VPF (anticuerpos GV39 y GV97) , FGF, TGFß, un ligando que se enlaza a un TIE, una isoforma de fibronectina asociada con tumor, factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocito (HGF) , factor de plaqueta 4 (PF4) , PDGF y TIMP. Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, también se pueden unir a un complejo de ligando : receptor o a un complejo de factor de crecimiento : receptor, pero no el ligando o factor de crecimiento, o al receptor, cuando el ligando o factor de crecimiento o el receptor no está en el complejo de ligando: receptor o factor de crecimiento : receptor . Las construcciones de célula antitumor, estroma antitumor o sustancia terapéutica-anticuerpo de vasculatura antitumor puede comprender sustancias citotóxicas, tales como toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias (inmunotoxinas) . Frecuentemente se preferirá la cadena de ricina A y ricina A desglicosilada, y gelonina y angiopoyetinas también se contemplan. Las construcciones de células antitumor, estroma antitumor o sustancia terapéutica-anticuerpo de vasculatura antitumor pueden comprender factores de coagulación o una segunda regiones de enlace con anticuerpos que se enlazan a los factores de coagulación (coaguligandos) . La asociación operativa con el Factor de Tejido o los derivados del Factor de Tejido, tales como el Factor de Tejido truncado, frecuentemente se preferirán. La invención además todavía proporciona una serie de ligandos de enlace terapéuticos novedosos, composiciones de ligandos de enlace y composiciones farmacéuticas, cada uno de los cuales comprende cuando menos una primera sustancia objetivo que se enlaza a un aminofosfolípido, operativamente unido a cuando menos una primera sustancia terapéutica, tal como una citotoxina, sustancia anti-angiogénica o coagulante. Las radioetiquetas generalmente se excluyen de los ligandos de enlace y de las composiciones de ligandos de enlace; aunque no de los métodos de diagnóstico, o tampoco de los métodos terapéuticos descritos anteriormente. Las sustancias objetivo de los ligandos de enlace preferiblemente se enlazan a una fosfatidiletanolamina y/ó fosfatidilserina. El rango entero de ligandos de enlace descritos anteriormente en el contexto de los métodos terapéuticos y combinados se puede emplear en las presentes composiciones.' Los conjugados y construcciones de anexina; conjugados y construcciones anti-PS, anti-PE, anticuerpos humanos, humanizados y monoclonales; conjugados de ricina; y conjugados de Factor de Tejido y construcciones se prefieren actualmente. Las composiciones que comprenden uno o más anticuerpos anti-PS operativamente unidos a uno o m{as derivados de Factor de Tejido, preferiblemente, Factor de Tejido truncado, se prefieren actualmente en particular. Las uniones y enlaces directos o indirectos se pueden emplear en las composiciones de ligando de enlace, incluyendo todas las variaciones y anticuerpos biespecíficos . Combinaciones operativas de una primera región de enlace de antígeno de un anticuerpo que se enlaza a un aminofosfolípido, con una segunda región de enlace de antígeno de un anticuerpo que se enlaza con Factor de Tejido o un derivado de Factor de Tejido también se prefieren. En las construcciones o conjugados de proteínas que se enlazan con aminofosfolípidos, se prefieren las anexinas, siendo la más preferida la Anexina V, y Anexina V operativamente unida a un Factor de Tejido truncado actualmente siendo el más preferido. Los componentes de la invención por lo tanto incluyen una construcción de anticuerpos que comprende cuando menos un primer anticuerpo anti-aminofosfolípido, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, operativamente unido a cuando menos una primera sustancia terapéutica; y un anticuerpo biespecífico, que comprende una primera región de enlace de antígeno que se enlaza a un aminofosfolípido operativamente unido a una segunda región de enlace de antígeno que se enlaza a una sustancia terapéutica. Las composiciones y las composiciones farmacéuticas pueden comprender cuando menos un primer y segundo ligando de enlace, tales que, cada uno comprende cuando menos una primera sustancia objetivo operativamente unida a cuando menos una primera sustancia terapéutica; en donde cada sustancia objetivo se enlaza a un aminofosfolípido. Las composiciones y las composiciones farmacéuticas que comprenden cuando menos un primer ligando de enlace que se enlaza con una fosfatidiletanolamina y cuando menos un segundo ligando de enlace que se enlaza a una fosfatidilserina son composiciones combinadas ejemplares. La presente invención todavía además proporciona una serie de juegos terapéuticos novedosos, medicamentos y/ó cocteles para su uso, junto con los métodos de la invención. Los juegos, medicamentos y/ó cocteles generalmente comprenden una cantidad efectiva combinada de una sustancia anticáncer y una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica preferiblemente una que se enlaza con fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina. También se pueden incluir componentes para formación de imagen. Los juegos y medicamentos comprenderán, preferiblemente en elementos contenedores convenientes, una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una primera construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica, preferiblemente enlazada a una fosfatidilserina o fosfatidiletanolamina; en combinación con una cantidad biológicamente efectiva de cuando menos una primera sustancia anticáncer. Los componentes de los juegos y medicamentos se pueden contener dentro de un solo contenedor o elemento contenedor, o contener dentro de distintos contendores o elementos contenedores. Los cocteles generalmente se mezclarán entre sí para uso combinado. El rango entero de construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica, como se describió anteriormente, se puede emplear en los juegos, medicamentos y/ó cocteles, con conjugados y construcciones de anexina,-conjugados y construcciones de anticuerpo humano, humanizado y monoclonal anti-PS, anti-PE; conjugados de ricina; y siendo los conjugados y construcciones preferidos los de Factor de Tejido. Las sustancias anticáncer son aquéllas como se describieron anteriormente, incluyendo sustancias quimioterapéuticas, sustancias radioterapéuticas, sustancias anti-angiogénicas, sustancias apoptópicas, inmunotoxinas y coaguligandos. Las sustancias formuladas para administración intravenosa frecuentemente serán las preferidas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación, y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente. Figura ÍA y Figura IB. Actividad de anti-VCAM-l»tTF unido a la célula in vi tro . Figura ÍA. Enlace del coaguligando anti-VCAM-l»tTF con células bEnd.3 no estimuladas (de control) y activadas con IL-la. Figura IB. Generación del factor Xa por coaguligando anti-VCAM-l»tTF ligado a la célula. Figura 2. Retardo de crecimiento de tumores L540 en ratones tratados con anti-VCAM-l»tTF. Ratones que llevan el tumor L540 se inyectaron intravenosamente, ya sea con solución salina, 20 µg de anti-VCAM-l»tTF, 4 µg de tTF no conjugado, o 20 µg de IgG^tTF de control. Las inyecciones se repitieron en el día 4 y 8 después del primer tratamiento. Los tumores se midieron diariamente . El volumen medio del tumor y la desviación estándar de 8 ratones por grupo se muestra.

Figura 3. La activación del coaguligando en bloques de Anexina V del Factor X in vi tro . Se incubaron células bEnd.3 estimuladas con IL-IOÍ con coaguligando anti-VCAM-l»tTF en placas de microtitulación de 96 pozos, como se describe en el Ejemplo V. La anexina V se añadió a concentraciones que varían de 0.1 a 10 µm/mililitro (como se muestra) , y las células se incubaron durante 30 minutos antes de la adición de Proplex T diluido. La cantidad de Factor Xa generado en la presencia o ausencia de Anexina V se determinó usando un sustrato cromogénico, como se describe en el Ejemplo V. Figura 4A y Figura 4B. Efectos antitumor de anticuerpos anti-PS naturales en animales con tumores singénicos y xenogénicos. lxlO7 células de carcinoma colórrectal murino Coló 26 (Figura 4A) , o linfoma de Hodgkin humano L540 (Figura 4B) se inyectaron simultáneamente en el flaco derecho de ratones Balb/c (Figura 4A) , o ratones machos CB17 SCID (Figura 4B) , respectivamente. Los tumores se dejaron crecer a un tamaño de aproximadamente 0.6-0.9 cm3, y luego los ratones (4 animales por grupo) se inyectaron intraperitonealmente con 20 µg de anticuerpo anti-PS natural (cuadros abiertos) o solución salina (círculos abiertos) (IgM de ratón de control dio resultados similares que la salina) . El tratamiento se repitió 3 veces con un intervalo de 48 horas. Los animales se monitorearon diariamente para mediciones de tumor y peso corporal. El volumen del tumor se calculó como se describe en el Ejemplo VII. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 2 cm3, o antes si los tumores mostraron signos de necrosis o ulceración. DESCRIPCIÓN DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS A. Destrucción de Tumor Usando Coaguligando VCAM-1 Los tumores sólidos y carcinomas son más del 90 por ciento de todos los cánceres en el hombre . Aunque el uso de anticuerpos monoclonales e inmunotoxinas se han investigado en la terapia de linfornas y leucemias (Vitetta y colaboradores, 1991) , estas sustancias han sido desafortunadamente ineficaces en ensayos clínicos contra carcinomas y otros tumores sólidos (Abrams y Oldham, 1985) . Una razón principal para la ineficacia de los tratamientos basados en anticuerpos es que las macromoléculas no se transportan fácilmente a los tumores sólidos. Aun cuando ya están dentro de una masa tumoral, estas moléculas fallan en distribuirse uniformemente, debido a la presencia de uniones fuertes entre las células de tumores, estroma fibroso, gradientes de presión intersticial y barreras del sitio de unión (Dvorak y colaboradores, 1991) . Para desarrollar nuevas estrategias para tratar tumores sólidos, los métodos que involucran dirigirse a la vasculatura del tumor, en vez de a las células del tumor, ofrecen distintas ventajas. Una destrucción efectiva o bloqueo de los vasos del tumor detiene el flujo sanguíneo a través del tumor y da como resultado una avalancha de la muerte celular del tumor. Las construcciones de anticuerpo-toxina y anticuerpo-coagulante han sido ya efectivamente usadas en la dirección específica y destrucción de vasos del tumor, dando como resultado la necrosis del tumor (Burrows y colaboradores, 1992; Burrows y Thorpe, 1993; Publicación Internacional WO 93/17715; WO 96/01653; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5, 855, 866; 5,877,289; 5,965,132; 6,004,555 y 6,093,399 (correspondientes a las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 08/350,212; 08/487,427 y 08/482,369; Emisión de Derechos pagados; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Cuando se usan anticuerpos, factores de crecimiento u otros ligandos de enlace para administrar específicamente un coagulante a la vasculatura del tumor, estas sustancias se denominan "coaguligandos". Un coagulante actualmente preferido para su uso en coaguligandos es el Factor de Tejido truncado (tTF) (Huang y colaboradores, 1997; Publicación Internacional WO 96/01653; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,877,289). El Factor de Tejido es un iniciador importante de la coagulación de la sangre (Ruf y colaboradores, 1991) . En sitios de lesiones, el Factor Vll/VIIa en la sangre se pone en contacto con, y se enlaza con, el Factor de Tejido en las células en los tejidos perivasculares . El complejo TF:VIIa, en presencia de la superficie del fosfolípido, activa los factores IX y X. Esto, a su vez, conduce a la formación de trombina y fibrina y, finalmente, un coágulo sanguíneo (Ruf y Edgington, 1994) . La forma recombinante, truncada del factor de tejido (tTF) , que carece de los dominios citosólicos y de transmembrana, es una proteína soluble que tiene aproximadamente cinco órdenes de magnitud de coagulación más baja que induce la capacidad que el factor de tejido natural (Stone y colaboradores, 1995; Huang y colaboradores, 1997) . Esto se debe a que el factor de tejido necesita asociarse con fosfolípidos para el complejo con Vlla para activar el IXa o Xa eficientemente. Sin embargo, cuando tTF se administra al endotelio vascular del tumor por medio de un anticuerpo o sustancia objetivo, se pone de nuevo en proximidad con una superficie de lípido y regana la actividad trombogénica (Huang y colaboradores, 1997; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,877,289; 6,004,555; y 6,093,399). De este modo se crea un coaguligando que trombosa selectivamente la vasculatura del tumor. El factor de tejido truncado tiene varias ventajas que recomiendan su uso en coaguligandos dirigidos al tejido vascular: el tTF humano está fácilmente disponible, y la proteína humana tendrá inmunogenicidad despreciable o baja en el hombre; tTF humano es completamente funcional en animales experimentales, incluyendo ratones; y tTF objetivo es muy potente, debido a que dispara la activación de una cascada de proteínas de coagulación, dando un efecto muy amplificado (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,877,289; 6,004,555 y 6,093,399). Un rango de moléculas objetivo convenientes que están disponibles en el endotelio del tumor, pero muy ausentes del endotelio normal, se han descrito. Por ejemplo, se pueden utilizar objetivos expresados, tales como endoglina, selectina-E, selectina-P, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, un TIE, un ligando reactivo con LAM-1, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, integrina vß3, pleiotropina o endosialina (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,877,289 y 6,004,555; que corresponden a las Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 08/487,427; Burrows y colaboradores, 1992; Burrows y Thorpe, 1993; Huang y colaboradores, 1997; Liu y colaboradores, 1997; Ohizumi y colaboradores, 1997; cada una incorporada a la presente mediante referencia) . Los objetivos adsorbidos son otro grupo conveniente, tales como VEGF, FGF, TGFß, HGF, PF4 , PDGF, TIMP, un ligando que se enlaza con un TIE o una isoforma de fibronectina asociada con un tumor (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,877,289; 5,965,132 y 6,004,555; que corresponden a las Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 08/350,212 y 08/487,427, Emisión de Derechos pagados; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Las isoformas de fibronectina son ligandos que se enlazan a la familia de integrina de los receptores. Las isoformas de fibronectina asociadas con tumores son componentes dirigibles, tanto de la vasculatura del tumor como del estroma del tumor. El anticuerpo monoclonal BC-1 (Carnemolla y colaboradores, 1989) específicamente se enlaza a las isoformas de fibronectinas asociadas con tumor. Otros objetivos inducibles mediante el ambiente del tumor natural o que siguen la intervención del hombre también son entidades dirigibles, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,776,427; 5,863,538 y 6,036,955 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/479,727, Emisión de Derechos pagados; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Cuando se usa junto con la supresión anterior en tejidos normales y para inducción vascular del tumor, se pueden también emplear los antígenos MHC Clase II como objetivos (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,776,427; 5,863,538; 6,004,555 y 6,036,955 (Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 08/295,868 y 08/479,727, Emisión de Derechos pagada); cada una incorporada a la presente mediante referencia) . Un objetivo preferido para aplicaciones clínicas es la molécula de adhesión endotelial vascular-1 (VCAM-1) (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,877,289; 6,004,555 y 6,093,399 (que corresponden a las Solicitudes de 'Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de serie 08/482,369 y 08/487,427, Emisión de Derechos pagada) ; cada una incorporada a la presente mediante referencia) . La VCAM-1 es una molécula de adhesión celular que se induce mediante citocinas inflamatorias IL-l , IL-4 (Thornhill y colaboradores, 1990) y TNFa (Munro, 1993), cuyo papel en vivo es reclutar leucocitos en sitios de inflamación aguda (Bevilacqua, 1993). La VCAM-1 está presente en células endoteliales vasculares en muchos tumores malignos humanos, incluyendo el neuroblastoma (Patey y colaboradores, 1996), carcinoma renal (Droz y colaboradores, 1994) , carcinoma de pulmón no pequeño (Staal-van den Brekel y colaboradores, 1996) , enfermedad de Hodgkin (Patey y colaboradores, 1996) , y angiosarcoma (Kuzu y colaboradores, 1993) , así como en tumores benignos, tales como angioma (Patey y colaboradores, 1996) y hemangioma (Kuzu y colaboradores, 1993) . La expresión constitutiva de la VCAM-1 en el hombre se confina a sólo algunos vasos en la tiroides, el timo y el riñon (Kuzu y colaboradores, 1993; Bruijn y Dinklo, 1993) , y en el ratón a vasos en el corazón y el pulmón (Fries y colaboradores, 1993) . Ciertos datos presentados en la presente suplementan aún más los proporcionados en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,877,289 y 6,004,555 (correspondientes a la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/487,427, Emisión de Derechos pagada; cada una incorporada a la presente mediante referencia) , y muestran la inducción -selectiva de trombosis e infarto de tumor resultante de la administración del coaguligando anti-VCAM-1*tTF. Los resultados presentados se generan usando ratones que tenían linfoma de Hodgkin humano L540. Cuando se cultivan como xenoinjerto en ratones SCID, este tumor muestra una similaridad cercana a la enfermedad humana con respecto a la expresión de citocinas inflamatorias (Diehl y colaboradores, 1985), y la presencia de la VCAM-1 y otras moléculas de activación celular endoteliales en su vasculatura. Usando un coaguligando anti-VCAM-1»tTF covalentemente enlazado, en la cual tTF se enlaza directamente al anticuerpo anti-VCAM-1, se muestra en la presente que el coaguligando se localiza selectivamente en vasos de tumor, induce trombosis de aquellos vasos, causa que la necrosis se desarrolle en todo el tumor y retarda el crecimiento del tumor en los ratones que tienen tumores Hodgkin L540 sólidos. Los tumores generalmente necesitan tener cuando menos aproximadamente 0.3 centímetros de diámetro para responder al coaguligando, debido a que la VCAM-1 estaba ausente de tumores más pequeños. Presumiblemente, en los tumores pequeños, los niveles de citocinas segregadas por las células del tumor o las células huésped que infiltran al tumor son demasiado bajas para la inducción de la VCAM-1. Esto es de acuerdo con los estudios en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,877,289; 5,776,427; 6,004,555 y 6,036,955 (Solicitudes con Números de Serie 08/487,427 y 08/479,727, Emisión de Derechos pagada) , en donde las invenciones mostraron ser más útiles en tumores sólidos más grandes. Aunque inicialmente la mancha de VCAM-1 se observó más en la periferia del tumor, el coaguligando evidentemente se enlaza y tapa los vasos de transporte de sangre -- ya que es capaz de detener el flujo sanguíneo en todas las regiones del tumor. Además, uno de los inventores contempla que la generación de trombina causada por la administración inicial del coaguligando probablemente conduce a la inducción adicional de la VCAM-1 en los vasos centrales (Sluiter y colaboradores, 1993) , dando como resultado una señal amplificada y la destrucción evidente de la región intratumoral . Este tipo de expresión inducida por coagulante de marcadores dirigibles adicionales, y por lo tanto la amplificación de señal, también se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,036,955. B. Mecanismo de la Destrucción del Tumor Dirigida con VCAM-1.

Como se muestra en la presente, aunque la localización a los vasos que expresan la VCAM-1 en el corazón y pulmones de los ratones se observó después de la administración de un coaguligando anti-VCAM-1, esta construcción no induce a trombosis en estos sitios que no son del tumor. Además, el coaguligando anti-VCAM-1 no fue más tóxico para los ratones de lo que fue el coaguligando de control de especificidad irrelevante, lo que indica de nuevo que la expresión constitutiva de la VCAM-1 en los vasos del corazón y del tumor no conduce a la toxicidad. Estos vasos son importantes para el progreso de inmediato de la terapia de coaguligandos, dando que la VCAM-1 es un marcador que se presenta naturalmente del endotelio vascular del tumor en humanos. Sin embargo, este fenómeno también proporcionó a los inventores una idea única, conduciendo a otros enfoques para la destrucción de la vasculatura del tumor. Los inventores buscaron entender el mecanismo detrás de la capacidad del coaguligando anti-VCAM-1 para enlazarse con la VCAM-1 constitutivamente expresada en los vasos sanguíneos en el corazón y los pulmones, y aun no causar trombosis en estos vasos. Hay numerosas posibilidades científicas para esta observación empírica, generalmente conectadas con la naturaleza protrombótica del ambiente del tumor con alguna predisposición fibrinolítica en el corazón y los pulmones.

Generalmente, hay un equilibrio biológico entre el sistema de coagulación (depósito de fibrina) y el sistema fibrinolítico (degradación de fibrina mediante enzimas) . Sin embargo, en enfermedad maligna, particularmente carcinomas, este equilibrio se rompe, dando como resultado la activación anormal de la coagulación (hipercoagulabilidad o el "estado protrombótico" ) . La evidencia también indica que varios componentes de estas sendas pueden contribuir a características desordenadas de la malignidad, tales como la proliferación, invasión, y metástasis (Zacharski y colaboradores, 1993) . Donati (1995) revisó la interacción compleja entre observaciones clínicas originales de las complicaciones trombóticas de las enfermedades malignas, y el progreso subsecuente en la biología celular y bioquímica de las actividades celulares del tumor. Sin embargo, a pesar de investigación extensa, no se pudo proporcionar una explicación molecular clara de la naturaleza protrombótica del ambiente del tumor (Donati, 1995) . Donati sí hizo énfasis, sin embargo, al papel de las células del tumor en el proceso. Se explicó que las células del tumor expresan actividades precoagulantes, tales como la tromboplastina del tejido y el procoagulante de cáncer (CP) (Donati, 1995) . La Publicación Internacional WO 91/07187 también reportó una actividad procoagulante de las células de tumores. Otros numerosos estudios también han identificado las células del tumor mismas como responsables del estado protrombótico dentro de un tumor. Por ejemplo, Nawroth y colaboradores, (1988) reportó que el factor o los factores elaborados por las células de sarcoma aumentan la respuesta procoagulante del endotelio cercano a TNF. Estos autores reportaron que la formación de fibrina ocurrida a través del lecho vascular del tumor 30 minutos después de la infusión de TNF, pero que no se observaron depósitos de fibrina y agregados de plaquetas en la vasculatura normal (Nawroth y colaboradores, 1988) . El TNF después mostró que aumentaba la expresión del factor de tejido en la superficie de las células endoteliales (Murray y colaboradores, 1991) . Esto se propuso para explicar estudios anteriores que muestran que las células endoteliales cultivadas incubadas con TNF recombinante han aumentado la actividad procoagulante, el factor de tejido, y la supresión concomitante de la senda de proteína C, un mecanismo anti-trombótico que funciona en la superficie de células endoteliales quietas (Nawroth y colaboradores, 1985; Nawroth y Stern, 1986) . Datos de Sugimura y colaboradores, (1994) también implican las células tumorales como los componentes clave de la actividad procoagulante del tumor. Se reportó que cuatro líneas celulares de tumores eran capaces de soportar diferentes etapas de la senda extrínseca de coagulación (Sugimura y colaboradores, 1994) . Otro estudio reportó que la línea celular del carcinoma de ovario humano, OC-2008, constitutivamente expresó actividad del Factor de Tejido de membrana superficial y exhibió actividad compleja de protrombinasa dependiente de la superficie celular (Rao y colaboradores, 1992) . Connor y colaboradores, 1989) además sugirieron que son las células patológicas las que controlan la coagulación. Sus resultados indican que las células eritroleucémicas de murinas no diferenciadas, tumorigénicas, exhiben un aumento de 7 a 8 veces en la potencia de su actividad procoagulante (Connor y colaboradores, 1989) . Zacharski y colaboradores, (1993) también se enfocaron en células de tumor y buscaron definir el modo de interacción de las células de carcinoma de ovario con la coagulación (iniciada por procoagulante) y fibrinolisis (iniciada por activador plasminógeno tipo uroquinasa, u-PA) sendas . Reportaron que las células de tumor expresaron las sendas del Factor de Tejido y de coagulación intermedias que dieron como resultado la generación de trombina local - - como se evidencia mediante la conversión de fibrinógeno, presente en el tejido conectivo del tumor, a la fibrina que fue encontrada para abrazar las superficies de los nodulos del tumor y las células de tumor individuales. La fibrina detectada no sirvió como base de necrosis o de infiltrado celular inflamatorio local (Zacharski y colaboradores, 1993). Estos autores concluyeron que existía una senda procoagulante asociada con célula de tumor dominante que conduce a la generación de trombina e hipercoagulabilidad. Otras hipótesis han propuesto que son los cambios en los vasos de sangre del tumor los que vuelven a estos vasos más capaces de soportar la formación de trombos y/ó menos capaces de disolver la fibrina. Por ejemplo, los vasos del tumor se han reportado que exhiben regulación hacia arriba del Factor de Tejido, regulación hacia abajo de activadores de plasminógeno y/ó regulación hacia arriba del inhibidor de activadores de plasminógeno, PAI-1 (Nawroth y Stern, 1986; Nawroth y colaboradores, 1988) . Estos efectos se cree que se amplifican por factores derivados del tumor (Murray y colaboradores, 1991; Ogawa y colaboradores, 1990) , posiblemente VEGF. Por ejemplo, Ogawa y colaboradores (1990) reportaron que la hipoxia causó que las propiedades coagulantes de superficie celular endotelial se cambiaran para promover la activación de la coagulación. Esto fue acompañado por la supresión del cofactor anticoagulante, la trombomodulina, y la inducción de un activador del factor X, distinto de los sistemas clásicos extrínseco e intrínseco (Ogawa y colaboradores, 1990) . También, pudo haber un aumento en la concentración local de los Factores Vlla, IXa, Xa, u otras moléculas que interactúan con el Factor de Tejido, dentro de los vasos del tumor, alentando de este modo la trombosis. Adicionalmente, las plaquetas son un componente importante de cualquier estado procoagulante. Recientemente, el procoagulante de las plaquetas ha sido ligado a su capacidad para cubrir micropartículas procoagulantes de la membrana del plasma (Zwaal y colaboradores, 1989; 1992; Dachary-Prigent y colaboradores, 1996) . Se propuesto que una proporción creciente de micropartículas circulantes, vesículas o fragmentos de membranas de las plaquetas contribuye a los estados "pretrombóticos" (protrombótico) en varias condiciones patológicas (Zwaal y colaboradores, 1989; 1992; Dachary-Prigent y colaboradores, 1996; página 159 y referencias citadas en la misma) . McNeil y colaboradores (1990) también reportó que la ß2-GPI ejercer múltiples efectos inhibitorios en la coagulación y la agregación de plaquetas . La biología de las plaquetas de tumor podría de este modo explicar la efectividad de un coaguligando anti-VCAM-1. Otras explicaciones tentativas incluyen la simple posibilidad de que la VCAM-1 se exprese en niveles altos en los vasos del tumor que en los vasos de sangre en el corazón y los pulmones, probablemente debido a la inducción de las citocinas derivadas del tumor, y que el enlace con los vasos saludables no puede subir el balance en trombosis sostenida. También los mecanismos fibrinolíticos podrían ser regulados hacia arriba en el corazón, como se ejemplifica por un inhibidor de la senda de Factor de Tejido incrementada (TFPI) , activadores de plasminógeno aumentados, y/ó inhibidores de activador de plasminógeno disminuidos. Si la fisiología fibrinolítica del corazón y los vasos del tumor demuestra ser la mayor razón que está debajo de los efectos específicos del tumor del coaguligando anti-VCAM-1, esto generalmente evitaría el desarrollo de terapias adicionales antitumor dirigidas a los aspectos únicos de la biología del tumor. A pesar de todas las opciones posibles, los inventores razonaron que una falla del coaguligando anti-VCAM-1 para causar trombosis en vasos de tejidos normales se debe a la ausencia de aminofosfolípido, fosfatidilserina (PS) , de la superficie luminal de estos vasos. Para completar la teoría, por lo tanto, no sólo tendría la fosfatidilserina que mostrar que estaba ausente de estos vasos normales, sino su presencia en el lado luminal de los vasos asociados con tumores tendría que demostrarse de manera concluyente . Los inventores por lo tanto usaron manchado inmunohistoquímico para evaluar la distribución de un anticuerpo anti-fosfatidilserina monoclonal (anti-PS) inyectado intravenosamente en ratones que tienen tumor. Estos estudios revelaron que los vasos que expresan VCAM-1 en el corazón y los pulmones carecían de PS, mientras que los vasos que expresan VCAM-1 en el tumor expresaron PS . La necesidad para la expresión superficial de PS en la acción de coaguligando se indica además por el hallazgo de los inventores que la anexina V, la cual enlaza con PS, bloquea la acción del coaguligando anti-VCAM-1»tTF, tanto in vi tro como en vivo. La falta de efecto trombótico del coaguligando anti-VCAM-1 en vasos del corazón y pulmón normales se puede explicar de este modo, cuando menos en parte: la ausencia de aminofosfolípido, fosfatidilserina, significa que los vasos normales carecen de una superficie procoagulante, sobre la cual se pueden ensamblar los complejos de coagulación. En ausencia de PS en la superficie, el anti-VCAM-l»tTF se enlaza con la VCAM-1 que expresa los vasos de corazón y pulmón, pero no puede inducir trombosis. En cambio, los vasos que expresan VCAM-1 en el tumor muestran expresión coincidente de PS de superficie. El coaguligando de este modo se enlaza con los vasos del tumor y activa los factores de coagulación localmente para formar un trombo oclusivo. Además de delinear los efectos trombóticos específicos del tumor de los coaguligandos anti-VCAM-1, la expresión específica del aminofosfolípido, fosfatidilserina, en la superficie luminal de los vasos sanguíneos del tumor también permitió a los inventores explicar el fenotipo protrombótico observado, pero no entendido, en estudios anteriores (Zacharski y colaboradores, 1993; Donati, 1995) . En vez de deberse predominantemente a células de tumor o factores elaborados : plaquetas, micropartículas procoagulante o fragmentos de membrana; o debido a desequilibrios en la tromboplastina, trombomodulina, procoagulante de cáncer, Factor de Tejido, senda de proteína C, activadores de plasminógeno o inhibidores de activador de plasminógeno (por ejemplo, PAI-1) , los estudios de los inventores indica que es la expresión de PS la que representa un papel significativo en el estado protrombótico de la vasculatura del tumor. C. Aminofosfolípidos como Marcadores de la Vasculatura del Tumor . Siguiendo su descubrimiento de que el aminofosfolípído representativo, fosfatidilserina, se expresaba específicamente el la superficie luminal de los vasos sanguíneos del tumor, pero no el los vasos sanguíneos normales, los inventores razonaron que los aminofosfolípidos tenían potencial como objetivos para la intervención terapéutica. La presente invención por lo tanto proporciona composiciones y métodos para la administración dirigida de sustancias terapéuticas a los constituyentes de la membrana de aminofosfolípidos, particularmente fosfatidilserina (PS) y fosfatidiletanolamina (PE) . Aunque los efectos anti-tumor a partir de la administración dirigida de aminofosfolípido se demuestran en la presente, usando modelos animales aceptados en la técnica, la capacidad de los aminofosfolípidos para actuar como marcadores dirigibles tan seguros y efectivos de la vasculatura del tumor no podría haberse predicho de los estudios anteriores. Por ejemplo, aunque los vasos del tumor generalmente son de naturaleza protrombótica, en oposición a otros vasos sanguíneos, es una propiedad inherente del tumor mantener una red de vasos sanguíneos con el fin de administrar oxígeno y nutrientes a las células del tumor. Evidentemente, los vasos de la sangre asociados al tumor no pueden predisponerse de esa manera hacia la trombosis, de manera que espontáneamente y fácilmente soporten la coagulación, ya que la coagulación necesariamente causaría que el tumor se autodestruyera. De este modo se espera que un marcador de vaso de tumor asociado con trombosis, tal como la fosfatidilserina identificada actualmente, pudiera descubrirse que se expresa en cantidades suficientes para permitir la intervención terapéutica efectiva dirigiéndola, y así se expresa a niveles suficientemente bajos para mantener ordinariamente el flujo sanguíneo a través del tumor. La presente identificación de aminofosfolípidos como objetivo de vasculatura de tumor efectivos y seguros es aún más sorprendente, dado (1) las anteriores especulaciones con respecto al papel de otros tipos de células y/ó varios factores, activadores e inhibidores que están por debajo del estado protrombótico, complejo, del tumor (como se discutió anteriormente) ; y (2) el estado de confusión y contradictorio de la técnica con respecto a la biología de los aminofosfolípidos, en términos tanto de la expresión como de la función en varios tipos de células.

La fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina normalmente son segregadas hacia la superficie interna de la bicapa de membrana de plasma en diferentes células (Gaffet y colaboradores, 1995; Julien y colaboradores, 1995) . En cambio, la hoja externa de la membrana de bicapa es rica en análogos de fosfatidilcolina (Zwaal y colaboradores, 1989; Gaffet y colaboradores, 1995) . Esta segregación de lípidos crea una transbicapa asimétrica. Aunque la existencia de asimetría de membrana se ha discutido durante algún tiempo, la razón para su existencia y los mecanismos para su generación y control se entienden mal (Williamson y Schlegel, 1994) , particularmente en células distintas de las plaquetas. Hay aún numerosos reportes de conflictos con respecto a la presencia o ausencia de PS y PE en diferentes células y tejidos, sea sólo concerniente al papel probable que estos aminofosfolípidos pueden jugar. Por ejemplo, los muchos estudios de PS conducidos con plaquetas, componentes claves en la coagulación de la sangre (Dachary-Prigent 1996) , han producido resultados muy variables. Bevers y colaboradores, (1982) midieron la actividad de conversión de protrombina de plaquetas, de plaquetas no activadas después del tratamiento con varias fosfolipasas o enzimas proteolíticas. Concluyeron que la fosfatidilserina negativamente cargada, y posiblemente el fosfatidilinositol, estaban involucrados en la actividad de conversión de protrombina de plaquetas no activadas (Bevers y colaboradores, 1982). Brevers y colaboradores, (1983) reportaron entonces una exposición aumentada de fosfatidilserina, y una exposición disminuida de esfingomielinasa, en plaquetas activadas. Sin embargo, estas alteraciones fueron mucho menos aparentes en las plaquetas activadas, ya sea por trombina o por colágeno solamente, en contraste con colágeno más trombina, diamida, o un ionóforo de calcio (Bevers y colaboradores, 1983) . La expresión de superficie de PS en respuesta a la diamida se contradijo por estudios en eritrocitos, los cuales mostraron ninguna exposición de PS estimulada por diamida (de Jong y colaboradores, 1997) . Aunque haciendo eco a sus resultados anteriores, Bevers y sus colegas más tarde reportaron entonces que los cambios en la interacción de citoesqueleto en la membrana del plasma, particularmente aumentó la degradación de la proteína de enlace de actina citoesquelética, fue importante para los cambios superficiales de las plaquetas (Bevers y colaboradores, 1985; páginas 368-369) . Maneta-Peyret y colaboradores (1989) también reportaron la detección de PS en plaquetas humanas. Estos autores notaron que la superficie procoagulante de la plaqueta podría formarse mediante fosfolípidos cargados negativamente, tales como fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina (generalmente neutros o zwitteriónicos), o ambos. El papel de la fosfatidilserina en el proceso de coagulación ha sido cuestionado en favor de la fosfatidiletanolamina (Maneta-Peyret y colaboradores, 1989; Schick y colaboradores, 1976; 1978) . Por ejemplo, los estudios han reportado que 18 por ciento de la fosfatidiletanolamina se vuelve accesible en superficie después de 2 horas, en contraste con cero fosfatidilserina (Schick y colaboradores, 1976) . Estudios actuales con plaquetas también reportaron que muestran un aumento adicional de 16 por ciento en la exposición de fosfatidiletanolamina después del tratamiento con trombina, sin aumento en los niveles de fosfatidilserina (Schick y colaboradores, 1976) . Por lo tanto, se dice que PS no es un componente de la superficie funcional de la membrana de plasma de las plaquetas (Schick y colaboradores, 1976; 1978) . No obstante, la evidencia actual s£ parece indicar que tanto la PS como PE están mezcladas en la asimetría de fosfolípidos observadas en la membrana externa de las plaquetas y eritrocitos, y que PS está participando en la actividad procoagulante de las plaquetas (Gaffet y colaboradores, 1995; de Jong y colaboradores, 1997; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,627,036) . Los mecanismos para lograr y mantener la distribución de aminofosfolípido diferencial, sea sólo la significancia funcional de hacerlo, desde hace mucho son el objeto de especulaciones controversiales . Al revisar la regulación del movimiento de fosfolípidos de transbicapa, Williamson y Schlegel (1994) indicaron que elevando el Ca2 intracelular se permite que la clases más grandes de fosfolípidos se muevan libremente a través de la bicapa, revolviendo los lípidos y disipando la asimetría. De Jong y colaboradores (1997) también reportaron que el aumento de calcio intracelular conduce a una revoltura rápida de la bicapa de lípidos y la exposición de PS, lo cual podría ser parcialmente inhibido por la oxidación celular. La interacción de los aminofosfolípidos con proteínas citoesqueléticas también ha sido propuesta como un mecanismo para regular la asimetría de fosfolípidos de la membrana (Zwaal y colaboradores, 1989) . Gaffet y colaboradores (1995) declararon que la redistribución transversal de fosfolípidos durante la activación de las plaquetas humanas se logra mediante un flujo hacia afuera vectorial dc los aminofosfolípidos, no contraequilibrado por un flujo recíproco rápido de fosfolípidos con cabeza de colina, es decir, sin mezclarse. Ellos sugirieron que el flujo hacia afuera vectorial específico de los aminofosfolípidos podría ser catalizado mediante una actividad "translocasa de aminofosfolípidos en reversa" (Gaffet y colaboradores, 1995) . Una hipótesis de alternativa sería que la actividad de una translocasa hacia adentro fue inhibida. Zwaal y colaboradores (1989) propusieron la participación de una translocasa-fosfolípido que catalizó tanto el movimiento hacia afuera como hacia adentro de los aminofosfolípidos.

La presencia de una actividad translocasa de aminofosfolípidos dependiente de energía y dependiente de proteína que transporta fosfatidiletanolamina a partir de la hoja externa hacia la hoja interna de la bicapa de lípidos fue reportada por Julien y colaboradores (1993) . Ellos entonces mostraron que la actividad translocasa de aminofosfolípidos podría también transferir fosfatidilserina, y que la actividad podría ser mantenida, suprimida y restaurada, dependiendo de las condiciones de la incubación celular (Julien y colaboradores, 1993) , e inhibidas por el promotor del tumor, 12-0- tetradecanoilforbol-13 -acetato (TPA) (Julien y colaboradores, 1997) . Una escramblasa de fosfolípido de 35 kD que promueve el movimiento bidireccional dependiente de Ca2+ de la fosfatidilserina y otros fosfolípidos recientemente se clonó a partir de una biblioteca de ADNc (Zhou y colaboradores, 1997) . Esta proteína "escramblasa PL" es una proteína de membrana de plasma tipo II, rica en prolina, con un solo segmento de transmembrana cerca del término C. Estudios posteriores confirmaron que esta proteína era responsable del movimiento rápido de los fosfolípidos desde las hojas de membrana de plasma interna a la externa en las células expuestas a elevadas concentraciones de calcio citosólico (Zhao y colaboradores, 1998) . La actividad translocasa de aminofosfolípido reportada por Julien y colaboradores (1993; 1997), la cual transporta PS y PE a partir de la hoja externa a la interna, es diferente a la escramblasa dependiente de Ca2+ bidireccional (Zhou y colaboradores, 1997; Zhao y colaboradores, 1998) . La escramblasa es activada por Ca2+, y principalmente funciona para mover la PS desde la hoja interna a la externa como respuesta a los niveles aumentados de Ca2+. Ahora se cree generalmente que la translocasa de aminofosfolípidos mantiene la asimetría de la membrana durante condiciones normales, pero que la escramblasa es activada por el influjo de Ca2+, superando la translocasa y haciendo aleatoria la distribución de los aminofosfolípidos. La segregación normal de PS y PE a la superficie interna de la membrana del plasma de este modo ahora se acepta generalmente, y ciertos componentes de la membrana que participan en procesos asimétricos también han sido identificados. Sin embargo, quedan dudas acerca de las condiciones, mecanismos y tipos de células que son capaces de recolocar los aminofosfolípidos hacia la hoja externa de la membrana, y las implicaciones biológicas de estos eventos. Informes contradictorios concernientes a la expresión de los aminofosfolípidos no se limitan a los estudios de las plaquetas. La fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina generalmente son aproximadamente el 7 por ciento y aproximadamente el 10 por ciento, respectivamente, de la composición de fosfolípidos de células endoteliales humanas cultivadas a partir de arterias humanas, vena safena y umbilical (7.1 por ciento y 10.2 por ciento, respectivamente, Murphy y colaboradores, 1992) . Sin embargo, un ejemplo importante de las contradicciones en la literatura se refiere a la capacidad de los anticuerpos anti-PS para enlazarse con células endoteliales (Lin y colaboradores, 1995) . Los anticuerpos anti-PS presentes en la pérdida recurrente de embarazo (Rote y colaboradores, 1995; Rote, 1996; Vogt y colaboradores, 1996; Vogt y colaboradores, 1997) se cree que modulan la función celular endotelial, sin evidencia de enlazarse con células endoteliales. En un intento para explicar esta discrepancia, Lin y colaboradores (1995) trataron, pero fallaron en demostrar el enlace de anticuerpo anti-PS con las células endoteliales restantes. Ellos concluyeron que los determinantes antigénicos de PS no se expresan en la superficie de las células endoteliales que quedan, aunque un determinante antigénico dependiente de PS se asoció con componentes parecidos a citoesqueléticos en células fijadas con acetona (Lin y colaboradores, 1995) . Van Heerde y colaboradores (1994) reportaron que las células endoteliales vasculares in vi tro pueden catalizar la formación de trombina mediante la expresión de sitios de enlace, en los cuales se pueden ensamblar complejos procoagulantes . En comparación con otros estudios con plaquetas activadas (Bevers y colaboradores, 1982; 1983; 1985; Maneta-Peyret y colaboradores, 1989; Schick y colaboradores, 1976; 1978) , las células endoteliales estimuladas con CEVUH no exhibieron un aumento en los sitios de enlace de PS en comparación con las células quietas (Van Heerde y colaboradores, 1994) . Se informó que la fosfatidilserina era necesaria para la formación del Factor Xa vía la ruta extrínseca, así como la ruta intrínseca (Van Heerde y colaboradores, 1994) . Sin embargo, Brinkman y colaboradores (1994) publicaron resultados contradictorios, indicando que otros constituyentes de la membrana, además de los fosfolípidos cargados negativamente participan en la activación intrínseca, mediada por células endoteliales, del factor X. Ravanat y colaboradores (1992) también estudiaron el potencial catalítico de fosfolípidos en reacciones pro- y anti-coagulantes en sistemas purificados y en la superficie de células endoteliales en cultivos después de la estimulación. Sus resultados aparentemente contradictorios se propusieron para confirmar un papel de los mecanismos dependientes de los fosfolípidos, tanto en la actividad del Factor de Tejido procoagulante como en actividades anticoagulantes (la activación de la proteína C por el complejo trombina-trombomodulina y por el Factor Xa) (Ravanat y colaboradores, 1992) . Los resultados de Ravanat y colaboradores (1992) también se dice que proporcionan evidencia de la exposición de fosfolípidos durante la activación de las células endoteliales humanas, lo cual no había sido observado por Van Heerde y colaboradores (1994) o por Brinkman y colaboradores (1994) . Sin embargo, ellos notaron que los fosfolípidos aniónicos tienen accesibilidad restringida en la vecindad del Factor de Tejido celular. La situación se complica más conforme, aún después de la inducción de Factor de Tejido, otros eventos probablemente son necesarios para la coagulación, ya que el Factor de Tejido permanece inaccesible, estando bajo la célula. Ravanat y colaboradores (1992) siguieron sugiriendo que la extensión diferente de inhibición del Factor de Tejido y las actividades de trombomodulina en células endoteliales estimuladas significa que los ambientes de cofactor difieren para la expresión óptima de estas actividades células opuestas. Sin embargo, las dificultades reconocidas para tratar de reproducir los ambientes de fosfolípidos celulares exactos (Ravanat y colaboradores, 1992) , presentaron la posibilidad de datos artifactuales a partir de estos estudios in vi tro. Sin embargo, independientemente de los datos de Ravanat y colaboradores (1992) , generalmente se reconoce que información significativa con respecto a la biología de los tumores, y particularmente la intervención terapéutica, solamente se puede vislumbrar a partir de estudios en vivo en animales que tienen tumores, tales como aquellos conducidos por los presentes inventores . Además de los desacuerdos con respecto a la expresión de aminofosfolipidos, como se discutió anteriormente, también hay informes conflictivos concernientes a la función de los aminofosfolípidos en varios tipos celulares. Aunque ahora generalmente se acepta que la expresión de PS en plaquetas activadas se relaciona con la superficie de procoagulantes, al discutir el significado fisiológico de la asimetría de fosfolípidos de membrana en las plaquetas y glóbulos rojos, Zwaal y colaboradores (1989) resaltaron otras funciones importantes. Más aún, Toti y colaboradores (1996) declararon que las implicaciones fisiológicas de una pérdida de distribución de fosfolípido asimetría es muy poco entendida en tipos celulares distintos de las células sanguíneas. Zwaal y colaboradores (1989) declararon que la asimetría de fosfolípidos de la membrana de las plaquetas y los glóbulos rojos no se deshace cuando las células son activadas de varias maneras, presumiblemente mediadas por el movimiento transbicapa aumentado de los fosfolípidos. Estos cambios, acoplados con la liberación de micropartículas albergadas, se explicó que representan un papel en las reacciones de coagulación de sangre locales. Se describió un fenómeno similar que se presenta en glóbulos rojos falciformes: las vesículas de fosfolípidos que se desprenden de las células reversiblemente falciformes contribuyen a la coagulación intravascular en la fase de crisis de la enfermedad de células falciformes (Zwaal y colaboradores, 1989) .

Tanto Zwaal y colaboradores (1989) como Williamson y Schlegel (1994) han indicado que la importancia fisiológica de los cambios de fosfolípidos en superficie no se restringe a la hemostasis. De hecho, la exposición superficial de PS por las células sanguíneas se dijo que altera significativamente su reconocimiento por el sistema retículoendotelial, y fue para representar cuando menos parte del mecanismo homeostático para la limpieza de células de sangre de la circulación (Zwaal y colaboradores, 1989) . De este modo, la PS actúa como una señal para la eliminación de plaquetas activadas después de que el sangrado se ha detenido. El reconocimiento de PS expuesto en células falciformes y en las células infectadas con malaria por fagocitos y macrófagos explica sus efectos contra-patofisiológicos (Zwaal y colaboradores, 1989) . Además, la fagocitosis dependiente de PS marca las células infectadas viralmente para la asimilación fagocítica (Solicitud Internacional WO 97/17084) . La expresión superficial de aminofosfolípidos podría también conferir "competencia de fusión" a una célula (Williamson y Schlegel, 1994) . Williamson y Schlegel (1994) también especularon que hay una razón de ser más general para la simetría de lípidos. Por ejemplo, aunque los diferentes grupos de cabeza reciben más atención, podría ser una asimetría de ácidos grasos el factor importante (Williamson y Schlegel, 1994) . Otra hipótesis es que la distribución asimétrica de los fosfolípidos de transbicapa no tiene función en sí misma, si no que es el proceso dinámico del movimiento de lípidos lo que es importante para los sistemas biológicos (Williamson y Schlegel, 1994) . Muchos grupos han reportado que las células de tumores son responsables de la actividad protrombinasa del tumor (Connor y colaboradores, 1989; Rao y colaboradores, 1992; Zacharski y colaboradores, 1993; Sugimura y colaboradores, 1994; Donati, 1995) . Esto podría haberse razonado que es debido a PS (Solicitud Internacional WO 91/07187) . Sin embargo, los resultados de Sugimura y colaboradores (1994) argumentan contra esto: ellos reportaron que aunque tanto la actividad de protrombinasa como la actividad procoagulante total de las células tumorigénicas, HepG2 y MKN-28, caen en la confluencia de alcance, los niveles de PS permanecieron constantes. En vez de soportar un papel para la PS de las células de tumores en la actividad de protrombinasa, Connor y colaboradores (1989) sugirieron que la expresión aumentada de PS en células tumorigénicas es relevante a su capacidad para ser reconocidas y enlazadas por macrófagos. Utsugi y colaboradores (1991) propusieron similarmente que la presencia de PS en la membrana externa de las células de tumores humanos explica su reconocimiento por los monocitos. Jamasbi y colaboradores (1994) sugirieron un papel totalmente diferente para los componentes lípidos en las células tumorigénicas, proponiendo que los lípidos interfirieron con la accesibilidad antigénica de los tumores. De este modo, los lípidos de células de tumores actuarían para modificar los antígenos de la superficie de la célula del tumor, protegiendo de este modo a las células de los tumores de la destrucción inmune de la hospedera (Jamasbi y colaboradores, 1994) . Esta hipótesis no es diferente de la propuesta por Qu y colaboradores (1996), en términos de células endoteliales. Estos autores mostraron que las células T se adherían a células endoteliales umbilicales humanas tratadas con trombina, en virtud del enlace con la PS (Qu y colaboradores, 1996) . De este modo se ha propuesto que la adhesión de células T mediadas por PS con células endoteliales en vivo es importante, tanto a la vigilancia inmunológica, como a los procesos de enfermedad de la ateroesclerosis (Qu y colaboradores, 1996; Moldovan y colaboradores, 1994) . Bombeli y colaboradores (1997) y Flynn y colaboradores (1997) también sugirieron que las células dentro de placas ateroescleróticas pueden contribuir al avance de la enfermedad exponiendo PS, aunque esto se basa solamente en estudios in vi tro . Qu y colaboradores (1996) y Moldovan y colaboradores, (1994) aún sugirieron en un enfoque opuesto al de la presente invención, es decir, la manipulación de interacciones de fosfatidilserina como un enfoque anticoagulante. Las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,658,877 y 5,296,467 han propuesto la anexín (ó "anexina") para su uso como anti- endotoxinas y anti-coagulantes . La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,632,986 (incorporada en la presente mediante referencia) sugiere el uso de el ligando de enlace de fosfatidilserina, anexín V, como un conjugado con un componente, tal como uroquinasa, que lisa los trombos. Toti y colaboradores (1996) sugieren que el síndrome de Scott, un desorden de hemorragias heredado, puede reflejar la supresión o mutación de una translocasa de fosfatidilserina putativa hacia afuera o "escramblasa". Aunque una noción interesante, Stout y colaboradores (1997) después aislaron una proteína de membrana de los eritrocitos de Scott que exhibían actividad escramblasa de PL normal cuando se reconstituyeron en vesículas con PLs exógenos. Se sugirió que el defecto en el síndrome de Scott se relaciona con una interacción alterada de Ca2+ con escramblasa PL sobre la superficie endofacial de la membrana celular, debido, ya sea a una restricción intrínseca sobre la proteína, evitando la interacción con Ca2+ en el sitio, o debido a un inhibidor no identificado o cofactor en la célula de Scott que se disocia mediante detergente (Stout y colaboradores, 1997) . Resultados más variables se han reportado en relación con el posible papel de la PS en la apoptosis . Williamson y Schlegel (1994) discutieron el tema de la PS como un marcador de muerte celular programada (PCD o apoptosis) . Se acepta generalmente que la muerte celular programada, cuando menos en el sistema hematopoyético, requiere el secuestro de fagocitos de las células apoptópicas antes de la pérdida de la integridad de la membrana o "ruptura". La pérdida de la asimetría de la membrana en las células apoptópicas, y particularmente la apariencia de PS en la hoja externa, fue propuesta como el disparador para su reconocimiento por los macrófagos fagocíticos (Williamson y Schlegel, 1994). Martin y colaboradores (1995) reportaron además la externalización de PS como un evento precoz y disperso durante la apoptosis de una variedad de tipos celulares murinos y humanos, independientemente del estímulo de iniciación. Ellos también indicaron que, bajo condiciones en las cuales las características morfológicas de apoptosis se evitan (inhibición de síntesis macromolecular, sobreexpresión de Bcl-2 o Abl) , la aparición de PS sobre la hoja externa de la membrana del plasma se evitó similarmente (Martin y colaboradores, 1995) . Sin embargo, otros análisis argumentan contra las propuestas de Williamson y Schlegel (1994) y Martin y colaboradores (1995) en algún grado (Vermes y colaboradores, 1995) . Aunque estos autores indican que la translocalización de la PS a la superficie de la membrana externa es un marcador de apoptosis, ellos razonan que esto no es exclusivo para la apoptosis, sino también se presenta durante la necrosis celular. La diferencia entre estas dos formas de muerte celular es que durante las etapas iniciales de la apoptosis, la membrana celular permanece intacta, mientras que en el mismo momento en que se presenta la necrosis la membrana celular pierde su integridad y se vuelve escurridiza. Por lo tanto, de acuerdo con este razonamiento, la expresión de la PS en la superficie celular no indica apoptosis, a menos que el ensayo de exclusión por tinte se ha llevado a cabo para establecer la integridad de la membrana celular (Vermes y colaboradores, 1995) . Sin embargo, el cuerpo de la literatura anterior a la presente invención sí parece indicar que la aparición de la PS en la superficie externa de una célula identifica una célula apoptótica, y señala esa ingestión de la célula (Hampton y colaboradores, 1996; Solicitud Internacional WO 95/27903) . Hampton y colaboradores (1996) concluyeron que aunque una elevación en el Ca2+ intracelular fue un disparador ineficaz de la apoptosis de las células investigadas, se requirió Ca2+ extracelular para la exposición de PS eficiente durante la apoptosis. En cambio, la propuesta de Martin y colaboradores (1995) de la activación de una translocasa de PS adentro-afuera es un evento precoz de dispersión amplia durante la apoptosis parecería requerir cuando menos algún Ca2+ intracelular (Zhou y colaboradores, 1997; Zhao y colaboradores, 1998) . Blankenberg y colaboradores (1998) muy recientemente reportaron que la anexín V, una proteína humana endógena con una alta afinidad para PS, se puede usar para concentrar en sitios de muerte celular apoptótica en vivo. El anexín V radioetiquetado localizado en sitios de la apoptosis en tres modelos, incluyendo el rechazo aloinjerto cardíaco agudo (Blankenberg y colaboradores, 1998) . El manchado de aloinjertos cardíacos para anexín V administrado exógenamente reveló miocitos en la periferia de los infiltrados mononucleares, de los cuales solamente algunos demostraron núcleos apoptóticos positivos . Finalmente, el movimiento de la transbicapa de monofosfolípidos en la membrana del plasma ha sido analizado en células de esperma de carnero, en donde la existencia de una segregación transversal de fosfolípidos ha sido implicada en el proceso de fertilización (Müller y colaboradores, 1994) . La asimetría de fosfolípidos de este modo ha estado recibiendo atención creciente, aunque un entendimiento claro de este fenómeno, o su relación con la salud o la enfermedad, no se ha realizado. Independientemente del estado de confusión de la técnica con respecto a la biología de los aminofosfolípidos, los presentes inventores descubrieron, en estudios controlados en vivo, que los aminofosfolípidos, tales como PS y PE, eran marcadores específicos de los vasos sanguíneos del tumor. Esto es sorprendente a la luz de los estudios anteriores de la función de los aminofosfolípidos, particularmente los que indican que la expresión en su superficie celular de la PS se acompaña por enlace de células circulantes, tales como células T (Qu y colaboradores, 1996) , macrófagos (Coonor y colaboradores, 1989) , monocitos (Utsugi y colaboradores, 1991) o fagocitos (Zwaal y colaboradores, 1989; Williamson y Schlegel, 1994), y es un marcador de células apoptópicas (Hampton y colaboradores, 1996; Martin y colaboradores, 1995; Zhou y colaboradores, 1997; Zhao y colaboradores, 1998) . De este modo, antes de esta invención, la posibilidad de usar aminofosfolípidos como marcadores dirigibles de cualquier enfermedad, ya sea sólo de la vasculatura de los tumores, sería muy poco probable que se contemplara, debido al enmascaramiento percibido de estas moléculas por el enlace de uno o más tipos de células. De hecho, sugerencias especulativas se han preocupado por la interrupción de las interacciones celulares-PS, tales como previniendo el enlace de leucocitos, un evento inicial en la ateroesclerosis (Qu y colaboradores, 1996) . Otros aspectos sorprendentes de este descubrimiento son evidentes en una comparación con trabajos anteriores con respecto a quitar las micropartículas procoagulantes de las membranas del plasma y la demarcación de células para la fagocitosis (WO 97/17084). Zwaal y colaboradores (1989; 1992) y Dachary-Prigent y colaboradores (1996) explicaron que la translocalización de PS a la membrana del plasma se sigue por la liberación de micropartículas, microvesículas o microesferas a partir de las células. Zwaal y colaboradores (1989) y Willamson y Schlegel (1994) indicaron que la expresión superficial de PS incita la limpieza mediante el sistema retículoendotelial . A la luz de estos hechos de las células que expresan PS, y las distintas actividades de translocasa bicapa documentadas (Julien y colaboradores, 1995; Zhou y colaboradores, 1997; Zhao y colaboradores, 1998), es sorprendente que los aminofosfolípidos superficiales de las células, tales como la PS y la PE puedan formar marcadores estáticos y suficientemente estables para permitir la localización y el enlace con anticuerpos. Antes de la presente invención, había evidencia creciente de que la PS de superficie parece como parte del proceso apoptópico, marcando células para su rápida destrucción (Hampton y colaboradores, 1996; Martin y colaboradores, 1995) . Por lo tanto, aunque razonable para su uso como un marcador de diagnóstico para ciertos estados de enfermedad, tales como rechazo de injertos (Blankenberg y colaboradores, 1998), la vida aparentemente limitada de la PS de superficie también aconsejaría en contra de su uso como un marcador viable para objetivo en la intervención terapéutica. Sin embargo, el estudio presente sin duda descubrió que los aminofosfolípidos son marcadores de las células endoteliales vasculares del tumor convenientes para ser objetivos. Después de postular que la expresión de la PS era necesaria para la acción del coaguligando VCAM, la presencia de la PS sobre los vasos sanguíneos del tumor, pero no en los vasos normales, fue demostrada en vivo. Las observaciones en vivo permitieron a los inventores explicar la seguridad y efectividad de los coaguligandos anti-VCAM. Esto se debe al requisito de la expresión coincidente de un marcador dirigido (por ejemplo, VCAM) , y la PS en el endotelio del tumor. Aún si la molécula objetivo está presente sobre el endotelio en condiciones normales o patológicas, no se dará como resultado la trombosis si falta la expresión superficial de PS . El valor de la presente invención no se limita a explicar la acción de coaguligando, ni al sorprendente desarrollo de las terapias de anticuerpos naturales (solicitudes provisionales con Números de Serie 60/092,672 y 60/110,608, cada una incorporada en la presente mediante referencia) . De hecho, los presentes descubrimientos han permitido a los inventores mostrar, por primera vez, que la translocalización de la PS en células endoteliales puede presentarse sin daño celular significativo o muerte celular (Ejemplo XIV) . En el nuevo modelo de los inventores de la biología del tumor, la translocalización de la PS a la superficie de las células endoteliales de los vasos sanguíneos del tumor se presenta, cuando menos en una parte significativa, independientemente de los mecanismos apoptópicos u otros mecanismos de muerte celular. De este modo, la expresión en superficie de la PS en el ambiente del tumor no es una consecuencia de la muerte celular, ni tampoco dispara la destrucción celular inmediata. Esto es de fundamental importancia y representa un parteaguas en el entendimiento científico de la biología de la PS, la translocalización de la membrana, y las sendas de señalización de células y apoptosis. La separación de la translocalización de la PS de la célula endotelial a partir de la apoptosis (ejemplo XIV) también es integral a los métodos de la intervención terapéutica basada en la expresión en superficie de la PS . Si la translocalización de la PS a la membrana externa en las células endoteliales vasculares del tumor se presenta solamente en células que están muriendo, o si inevitablemente disparará la muerte celular, entonces el marcador PS probablemente no estaría suficientemente disponible para servir como un objetivo para la administración de las sustancias terapéuticas. Esto no quiere decir que la expresión de la PS en ciertas células endoteliales vasculares del tumor no es transitoria, y que el vuelco y la muerte celular no se presenta en esta población de células endoteliales, sino el hallazgo de que se puede lograr la expresión de PS estable significativa sin muerte celular es un descubrimiento crucial importante en varios campos de la biología y para las nuevas terapias de objetivos descritas más adelante. D. Terapias Dirigidas a los Aminofosfolípidos Los estudios de expresión de vasculatura de tumores aminofosfolípidos en vivo además soporta el uso de coaguligandos dirigidos contra marcadores de vasculaturas de tumor previamente identificados, por ejemplo, VCAM-1 y selectina-E, como sustancias trombóticas selectivas para el tratamiento de tumores sólidos. Sin embargo, estas observaciones también conducen a los inventores a desarrollar métodos de tratamiento adicionales de tumores. Por ejemplo, los anticuerpos naturales o no conjugados contra los componentes de aminofosfolípidos se encontró sorprendentemente que son capaces de inducir específicamente la destrucción de los vasos sanguíneos del tumor y la necrosis del tumor en vivo en ausencia de fracciones efectoras adicionales. Estos usos se describen y reclaman en la primera y segunda solicitudes provisionales con Números de serie 60/092,672 (presentada el 13 de julio de 1998), y 60/110,608 (presentada el 2 de diciembre de 1998) , y en las solicitudes de patentes de los Estados Unidos presentadas en conjunto en las solicitudes de patente internacionales PCT (Expedientes Números 4001.002200, 4001.002282 y 4001.002210), cada uno específicamente incorporado a la presente mediante referencia. Los estudios de las primera y segunda solicitudes provisionales con Números de Serie 60/092,672 (presentada el 13 de julio de 1998) y 60/110,608 (presentada el 2 de diciembre de 1998) están en contraste con los recientemente reportados por Nakamura y colaboradores (1998) . Estos autores analizaron las fracciones de anticuerpos de pacientes con anticoagulante de lupus (LAC) , un desorden asociado con trombosis arterial y venosa, trombocitopenia, y pérdida fetal recurrente. El plasma con actividad anticoagulante de lupus inicialmente se reportó que induce apoptosis en células endoteliales (Nakamura y colaboradores 1994) . Las actividades apoptóticas del antisuero anticoagulante de lupus se reportó entonces que se localizaba en la fracción de anticuerpo de enlace con anexín V en 10/10 pacientes estudiados (Nakamura y colaboradores, 1998) . Como el anexín se enlaza con PS, la capacidad aparente de los anticuerpos anti-anexín para inducir la apoptosis sería lo opuesto de la capacidad de un anticuerpo anti-PS para inducir apoptosis . La capacidad de las fracciones de anticuerpo LAC para inducir apoptosis se reportó adicionalmente que es inhibida por la preincubación con anexín V (Nakamura y colaboradores, 1998) . En cambio, la remoción de anticuerpos anti-fosfolípidos de las fracciones IgG de pacientes con liposomas de fosfolípidos no abolió las actividades que inducen la apoptosis o el enlace de anexín V (Nakamura y colaboradores, 1998) . Estos resultados razonablemente implicaron que los pacientes con LAC frecuentemente tienen anticuerpos que no se enlazan con fosfolípidos y así son responsables de la inducción de apoptosis de células endoteliales (Nakamura y colaboradores, 1998) . Sin necesidad de igualar los datos de Nakamura y colaboradores (1998) de LAC con las observaciones de los inventores a partir de estudios en vivo de tumores y vasculatura de tumor, debido a la naturaleza evidentemente dispar de estas condiciones clínicas, los inventores, sin embargo, tienen ciertas teorías unificantes. Nakamura y colaboradores (1998) intentaron remover anticuerpos de fosfolípidos a partir de antisuero de pacientes usando liposomas de fosfolípidos, y observaron que esto no abolió la actividad que induce la apoptosis. Estos resultados condujeron a Nakamura y colaboradores (1998) a concluir que los anticuerpos anti-fosfolípidos no pueden ser responsables de la actividad apoptópica. Sin embargo, los presentes inventores ahora tienen el deseo de sugerir que la incubación con liposomas de fosfolípidos pueden no haber removido los anticuerpos anti-fosfolípidos antisuero, ya que los fosfolípidos son antigénicamente neutrales en forma de bicapa y liposomal, y en gran medida sólo se enlazan con anticuerpos en forma hexagonal (Rauch y colaboradores, 1986; Rauch y Janoff, 1990; Berard y colaboradores, 1993; cada una incorporada en la presente mediante referencia) , o en asociación con proteínas de membrana. De este modo, los anticuerpos de anti -fosfolípidos pueden permanecer en el antisuero LAC y pueden causar, o contribuir con, la actividad apoptópica observada. La invención descrita en la presente se dirige al uso de aminofosfolípidos como objetivos para la terapia de inmunotoxina de vasculatura anti-tumor y/ó terapia de coaguligandos. Aunque la identificación de cualquier objetivo adicional para permitir la localización de vasos de tumores específicos en las terapias dirigidas a la vasculatura es valioso, el presente descubrimiento de los aminofosfolípidos como objetivos convenientes es particularmente importante ya que da otro grupo entero de objetivos en la imagen: lípidos en vez de las proteínas anteriormente preferidas. El descubrimiento de los aminofosfolípidos también es significativo funcionalmente ya que permite que las sustancias terapéuticas sean administradas en todavía un contacto más íntimo con la membrana celular objetivo, en vez de enlazarse a un complejo de proteína más distante de la membrana. Uno de los aspectos más sorprendentes del presente descubrimiento es que la expresión de la PS en células endoteliales asociadas con tumor intactas es suficientemente estable para permitir que se use como blanco. Los presentes datos en vivo e in vi tro definitivamente muestran que la PS se expresan en células endoteliales asociadas con tumor viables con morfología normal y citoesqueletos intactos. Ya que la expresión de PS no se limita a las células que sufren muerte celular o que están a punto de entrar en una senda apoptópica, la dirección con sustancias diagnósticas y terapéuticas es tanto practicable como sorprendente (dado que la expresión de la PS se pensó que estaba asociada solamente con la destrucción celular) . Un entendimiento molecular preciso de exactamente cómo y por qué las sustancias terapéuticas dirigidas a los aminofosfolípidos son convenientes para su uso en el tratamiento del tumor no es necesario con el fin de practicar la presente invención. Dado que la administración de sustancias terapéuticas dirigidas a los aminofosfolípidos se demuestra en la presente que da como resultado ventajosamente efectos antitumor específicos en vivo, la invención se puede utilizar independientemente de los mecanismos moleculares que están por debajo de la expresión de los aminofosfolípidos en la vasculatura del tumor. Sin embargo, es interesante notar que una revisión de la literatura científica hasta la fecha revela características que argumentan contra los usos presentes sorprendentemente eficaces, y aún proponen directamente usos opuestos para distintos conjugados de sustancias de enlace con aminofosfolípidos. Por ejemplo, el anexín, una proteína que se enlaza con fosfatidilserina, se ha propuesto para su uso común anticoagulante (WO 91/07187; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,296,647; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Este uso de anexín se dice que se basa en la inhibición de la actividad procoagulante de las células de tumores (WO 91/07187) . Aún más revelador es la descripción de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 la cual, en contraste completo con la presente invención, propone el uso de anexín como un conjugado con compuestos que lisan los trombos, o precursores de estos compuestos trombolíticos. La combinación mencionada de una proteína de enlace de aminofosfolípidos, anexín, con una sustancia lítica, es, evidentemente, el opuesto de la presente invención, la cual se refiere a la combinación de anexín y de otras proteínas que se enlazan con aminofosfolípidos con sustancias que inducen trombosis, ya sea directamente o indirectamente. En la preparación tanto de inmunotoxinas como coaguligandos basados en sustancias y anticuerpos que se enlazan con aminofosfolípidos, la expresión recombinante se puede emplear para crear una proteína de fusión, como lo saben los expertos en la técnica y se describe en la presente adicionalmente. Igualmente, las inmunotoxinas y coaguligandos se pueden generar usando puentes avidina: biotina o cualquiera de las tecnologías de conjugación y reticulación químicas, la mayoría desarrolladas con referencia a los conjugados de anticuerpos. Por lo tanto, cualquiera de las proteínas y ligandos de enlace con aminofosfolípidos se puede conjugar con una toxina o un coagulante de la misma manera como se usa para conjugados de anticuerpos, descritos en la presente. DI. Proteínas de enlace con aminofosfolípidos Además de los anticuerpos (ver más adelante) , los ligandos de enlace o las proteínas de enlace de aminofosfolípidos se pueden usar en las construcciones de sustancias objetivo - sustancias terapéuticas de la presente invención. Las proteínas que se presentan naturalmente se sabe que se enlazan tanto a la fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina con especificidad. Una serie de estudios por Sugi y Mclntyre reveló que los quininógenos pueden enlazarse a la PE expuesta en la membrana, cuando menos en plaquetas (Sugi y Mclntyre 1995; 1996a; 1996b; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Los quininógenos son proteínas que se presentan naturalmente que normalmente tienen efectos antitrombóticos. Los presentes inventores proponen que quininógenos de bajo o alto peso molecular por lo tanto se pueden unir a sustancias terapéuticas y usar en la administración de terapias para fosfatidiletanolmina, recientemente descubierta que es un marcador de la vasculatura del tumor. Varios genes quininógenos de mamíferos y humanos se han clonado, y estos genes y proteínas se pueden usar en distintas modalidades recombinantes y/o químicas de la presente invención. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos completas de los genes y proteínas descritos en Nakanishi y colaboradores", 1983, se incorporan en la presente mediante referencia para estos fines. Nawa y colaboradores, (1983; incorporado en la presente mediante referencia) reportó secuencias de ADNc y de proteínas para quininógenos de bajo peso molecular bovinos. La Figura 2 de Nawa y colaboradores (1983) se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para propósitos de proporcionar estas secuencias completas de nucleótidos y aminoácidos. Kitamura y colaboradores (1983; incorporada en la presente mediante referencia) reportaron entonces que un solo gen codifica los quininógenos de alto peso molecular y de bajo peso molecular bovinos. La Figura 2 de Kitamura y colaboradores (1983) de nuevo se incorpora en la presente mediante referencia para proporcionar las secuencias de genes y de proteínas referenciados . Kitamura y colaboradores (1987) también se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para los fines de proporcionar información adicional concerniente a los quininógenos bovinos, de rata y humanos, que incluyen quininógenos de bajo peso molecular, de alto peso molecular y T-quininógenos . Los quininógenos de alto y bajo peso molecular preferidos para su uso en estos aspectos de la invención serán los genes y proteínas humanos, como se describe por Takagaki y colaboradores (1985) , Kitamura y colaboradores (1985) y Kellermann y colaboradores, (1986) , cada uno incorporado en la presente mediante referencia. Cada una de la Figura 2 y Figura 3 de Takagaki y colaboradores, (1985) se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para proporcionar las secuencias de nucleótidos y aminoácidos completas de los prequininógenos de bajo y alto peso molecular humanos, respectivamente. Las Figuras 1 y 8 del trabajo de análisis de proteínas de Kellermann y colaboradores, (1986) se incorporan similarmente en la presente. Kitamura y colaboradores (1985) también se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para los propósitos de proporcionar información adicional con respecto a la organización estructural del gen quininógeno humano, como se puede usar, por ejemplo, para diseñar construcciones de expresiones particulares para su uso con la presente. Kitamura y colaboradores (1988) se incorpora adicionalmente mediante referencia para fines de proporcionar información detallada con respecto a la clonación de ADNc y quininógenos genómicos, de manera que cualquier quininógeno deseado se puede clonar. Además de los T-quininógenos descritos por Kitamura y colaboradores (1987; incorporada en la presente mediante referencia) , Anderson y colaboradores (1989) también se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para propósitos de proporcionar las secuencias de genes y proteínas del T-quininógeno. La Figura 3 de Anderson y colaboradores (1989) se incorpora específicamente.

Otras proteínas de enlace de fosfatidiletanolamina se sabe que se pueden usar en estas modalidades. Numerosos estudios, particularmente por Jones y Hall, y Bernier y Jolles, se refieren a la purificación, caracterización y clonación de proteínas de enlace de fosfatidiletanolamina. Por ejemplo, Bernier y Jolles (1984; incorporada en la presente mediante referencia) reportaron primero la purificación y caracterización de una proteína citosólica básica de aproximadamente 23 kDa a partir de cerebro bovino que después fue caracterizada como una proteína de enlace con fosfatidiletanolamina (Bernier y colaboradores, 1986; incorporada en la presente mediante referencia) . Schoentgen y colaboradores (1987; incorporada en la presente mediante referencia) reportó la secuencia de aminoácidos completa de esta proteína bovina, luego mostró que tenía 21 kDa. La Figura 2 de Schoentgen y colaboradores (1987) se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para fines de proporcionar la secuencia de aminoácidos completa de esta proteína de enlace de fosfatidiletanolamina. Jones y Hall (1991; incorporada en la presente mediante referencia) después purificó y parcialmente secuenció una proteína de aproximadamente 23 kDa de membranas de plasma de esperma de rata que mostraron similaridad de secuencia y propiedades de enlace con fosfolípidos similares a la proteína citosólica del cerebro bovino de Bernier y Jolles (Bernier y Jolles, 1984; Bernier y colaboradores, 1986; Schoentgen y colaboradores, 1987) . La proteína de rata de 23 kDa de Jones y Hall (1991; incorporada en la presente mediante referencia) también mostró afinidad selectiva para la fosfatidiletanolamina (Kd = 1.6 x 10"5 M) . Perry y colaboradores (1994; incorporada en la presente mediante referencia) clonó entonces y secuenció versiones de rata y mono de la proteína de enlace de fosfatidiletanolamina de Jones y Hall (1991) . Las Figuras 4, 5 y 6 de Perry y colaboradores (1994) se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para fines de proporcionar las secuencias de ADN y de aminoácidos completas de las proteínas de enlace de fosfatidiletanolamina de rata y de mono, y la comparación con la secuencia de proteína bovina. Cualquiera de las proteínas de enlace de fosfatidiletanolamina de mamíferos anteriores, o sus contrapartes humanas, se pueden unir a sustancias terapéuticas y usar en la presente invención. Estas secuencias de mamíferos tienen los números de acceso de la base de datos de secuencias de nucleótidos números X71873 (rata) y X73137 (mono) , y cada una se incorpora en la presente mediante referencia. En contrapartida la proteína de enlace de fosfatidiletanolamina humana también ha sido clonada (Hori y colaboradores, 1994; incorporada en la presente mediante referencia) . Tanto en la Figura 1 de Hori y colaboradores (1994) como en GenBank, EMBL y DDBJ número de acceso D16111 se incorporan en la presente mediante referencia para propósito de proporcionar las secuencias de ADN y de aminoácidos completas de las proteínas de enlace de fosfatidiletanolamina humana. Las secuencias de mamíferos y humanas, como se incorporan en la presente, se pueden emplear en técnicas de expresión muy conocidas, ya sea para expresar las mismas proteínas o las fusiones de sustancias terapéuticas de las mismas . Las proteínas y genes de enlace de fosfatidiletanolamina de otras fuentes, tales como levadura, Drosophila, simios, T. Canis y O. Volvulus también se pueden emplear en estas modalidades (Gems y colaboradores, 1995; incorporada en la presente mediante referencia) . cidos nucleicos de proteínas de fusión de fosfatidiletanolamina variantes, mutantes o de segunda generación también se pueden preparar fácilmente mediante técnicas de biología molecular estándares, y opcionalmente se pueden caracterizar como hibridización de cualquiera de las secuencias de nucleótidos de proteínas de enlace de fosfatidiletanolamina presentadas en una o más de Nakanishi y colaboradores (1983); Nawa y colaboradores (1983); Kitamura y colaboradores (1983; 1985; 1987; 1988); Takagaki y colaboradores (1985) ; Kellermann y colaboradores (1986) ; Anderson y colaboradores (1989) ; Bernier y Jolles (1984) ; Bernier y colaboradores (1986) ; Schoentgen y colaboradores (1987) ; Jones y Hall (1991) ; Perry y colaboradores (1994) ; y Hori y colaboradores (1994) ; cada una incorporada en la presente mediante referencia. Las condiciones de hibridización convenientes ejemplares incluyen la hibridización en aproximadamente 7 por ciento dodecil sulfato de sodio (SDS) , aproximadamente 0.5 M NaP04, aproximadamente 1 mM AEDT a aproximadamente 50 °C; y lavado con aproximadamente 1 por ciento de SDS a aproximadamente 42 °C. Además de las proteínas de enlace de fosfatidiletanolamina anteriores o "ligandos", existen proteínas que se presentan naturalmente y que específicamente se enlazan con fosfatidilserina. Las preferidas entre estas son las anexinas (algunas veces deletreadas "anexines"), un grupo de proteínas de enlace de fosfolípidos dependientes de calcio. Cuando menos nueve miembros de la familia de anexinas se han identificado en tejidos de mamíferos (Anexín I hasta Anexín IX) . Las más preferida entre estas es la anexín V (también conocida como PAP-I) . La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,658,877, incorporada en la presente mediante referencia, describe Anexín I, cantidades efectivas de Anexín I y composiciones farmacéuticas de la misma. También se describen métodos para tratar un animal para evitar o aliviar los efectos adversos de la endotoxina en el pulmón que comprenden administrar en las vías respiratorias de un animal una cantidad segura de un fragmento de Anexín I de 33 kDa. La Anexín V contiene un grupo sulfhidrilo libre y no tiene cadenas de carbohidratos unidas. La estructura primaria de anexín V deducida de la secuencia de ADNc muestra que el anexín V comprende cuatro unidades de repetición internas (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,937,324; incorporada en la presente mediante referencia) . La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,296,467 y la Publicación Internacional WO 91/07187 también cada una se incorpora en la presente mediante referencia ya que proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden "anexina" (anexín) . Aunque se propone para su uso como anticoagulante, las anexinas de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,296,467 y la Publicación Internacional WO 91/07187 también se pueden usar como parte de los conjugados de la presente invención. La Publicación Internacional WO 91/07187 proporciona derivados sintéticos o genéticamente preparados y análogos de "anexina" (anexín) , los cuales ahora se pueden usar en conjugados de la presente invención. Anexinas particulares se proporcionan de 320 aminoácidos, que contienen aminoácidos variantes y, opcionalmente, un puente disulfuro entre el 316-Cys y el 2 -Ala. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,296,467 se incorpora en la presente mediante referencia por entero, incluyendo todas las figuras y secuencias, para propósitos de descubrir aún adicionalmente anexinas y composiciones farmacéuticas de las mismas. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,296,467 describe clonación de anexín, expresión recombinante y preparación. Agregados de dos o más anexinas, por ejemplo, enlazadas por enlaces disulfuro entre uno o más grupos cisteína en la anexina respectiva, también se describen. Todavía otro ejemplo de materiales iniciales de anexina convenientes se proporciona por la Publicación Internacional WO 95/27903 (incorporada en la presente mediante referencia) , la cual proporciona anexinas para su uso para detectar células apoptóticas . La Publicación Internacional WO 97/17084 también se incorpora en la presente mediante referencia para propósitos de describir materiales iniciales anexín para preparar construcciones de la presente invención. La Publicación Internacional WO 97/17084 particularmente se refiere al uso de Anexín V para alterar la fagocitosis dependiente de fosfatidilserina. Se dice que el bloqueo de fagocitosis dependiente de PS significa que las células que llevan PS sufren fagocitosis por otras sendas, conduciendo a respuestas inmunes mayores, de manera que el Anexín V se puede usar como un adyuvante para aumentar la inmunogenicidad de las vacunas. El tratamiento de la anemia de células en forma de hoz y malaria también se describe. La Publicación Internacional WO 97/17084 también proporciona ciertos sistemas de vectores de expresión que se pueden adaptar para su uso en la presente. Al grado en que claramente describen materiales iniciales de anexina adecuados para preparar construcciones terapéuticas de la presente invención, se incorporan específicamente en la presente mediante referencia cada uno de los enfoques de diagnóstico de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036; las Publicaciones Internacionales WO 95/19791; WO 95/27903; WO 95/34315; WO 96/17618; y WO 98/04294; todas específicamente incorporadas en la presente mediante referencia. Varios de estos documentos también se refieren a vectores de expresión recombinantes útiles para adaptación en la presente invención. Aunque totalmente contraintuitivo con lo anterior de la presente invención, la tecnología de conjugación de anexina de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 también ahora se puede adaptar para su uso en los presentes métodos de tratamiento de tumor. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 (incorporada en la presente mediante referencia) proporciona conjugados de anexina usando compuestos que lisan los trombos, o precursores de estos compuestos. Los conjugados de activador de plasminógeno anexín y conjugados de uroquinasa anexín se proporcionaron particularmente para trombolisis y para tratar desórdenes resultantes de trombosis. Cambiando los compuestos trombolíticos de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 por los compuestos tóxicos y coagulativos descritos en la presente, la tecnología de conjugados básica de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 se puede adaptar fácilmente para su uso en la presente invención. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 se proporciona así para propósitos de describir adicionalmente el aislamiento del anexín de los extractos de tejido (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,937,324; también incorporada en la presente mediante referencia) y la producción de anexín por métodos recombinantes . Cada una de las clonas y vectores de expresión de ADNc de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 se incorporan de este modo específicamente en la presente mediante referencia. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 también se incorpora en la presente específicamente mediante referencia para propósitos de describir adicionalmente mutantes y variantes de la molécula de anexín que se subdividen o alteran en uno o más residuos de aminoácidos en tanto la capacidad de enlace de fosfolípidos no se reduzca sustancialmente. Las anexinas adecuadas para su uso en la presente invención pueden de este modo ser truncadas, por ejemplo, para incluir uno o más dominios o contener menos residuos de aminoácidos que la proteína original, o pueden contener aminoácidos sustituidos. Cualquier cambio es aceptable dentro del alcance de la invención en tanto la muteína o la segunda generación de molécula de anexina no contenga sustancialmente menor afinidad por el aminofosfolípido . Esta guía también se puede aplicar a las proteínas de enlace con fosfatidiletanolamina. Los ácidos nucleicos que codifican anexina de segunda generación, variante y mutante pueden también prepararse fácilmente mediante técnicas de biología molecular estándares, y opcionalmente se pueden caracterizar como hibridizantes a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican anexina anteriores bajo condiciones de hibridización tales como las que incluyen hibridización en aproximadamente 7 por ciento de docecil sulfato de sodio (SDS), aproximadamente 0.5 M NaP04, aproximadamente 1 mM AEDT a aproximadamente 50 °C; y lavado con aproximadamente 1 por ciento SDS a aproximadamente 42 °C. La reticulación química de las anexinas y de otras sustancias también se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986, incorporada en la presente mediante referencia. Todas estas técnicas se pueden adaptar para su uso en la presente simplemente sustituyendo las sustancias trombolíticas por aquellas descritas en la presente. Las diaminas alifáticas; esteres de succinimida; reactivos de acoplamiento hétero-bifuncionales, tales como SPDP; compuestos de maleimida, enlazadores con separadores; y similares, se pueden usar de este modo. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,632,986 también se incorpora específicamente adicionalmente en la presente mediante referencia para los propósitos de describir la producción recombinante de conjugados que contienen anexín. Las secuencias de ácidos nucleicos adecuadas se unen así para producir secuencias de codificación quiméricas que, a su vez, producen proteínas quiméricas. Los vectores de expresión ejemplares se dice que son pKK233-2 { E. coli ) , DPOT (levadura) y pDSPl .1BGH (mamíferos) . Estas enseñanzas se suplementan por información adicional proporcionada en la presente. D2. Equivalentes biológicamente funcionales Los equivalentes, o aún mejoramientos, de las proteínas de enlace de aminofosfolípidos también se pueden hacer ahora, generalmente usando los materiales proporcionados anteriormente como punto de partida. Las modificaciones y cambios se pueden hacer en la estructura de una proteína de enlace de aminofosfolípido y todavía obtener una molécula que tiene características parecidas o deseables de otro modo. Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida apreciable de capacidad de enlace interactivo, tal como, enlace con los aminofosfolípidos, PE y PE. Estas consideraciones también se aplican a toxinas y coagulantes. Ya que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína la que define la actividad funcional biológica de la proteína, ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos pueden hacerse en una secuencia de proteína (o desde luego, la secuencia de ADN subyacente) y sin embargo obtener una proteína con propiedades iguales (agonista) . De este modo se contempla que se pueden hacer varios cambios en la secuencia de proteínas o péptidos de enlace de aminofosfolípidos conocidos (o las secuencias de ADN subyacentes) sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Los equivalentes biológicamente funcionales hechos de la secuencia de ADN subyacente mutada se pueden hacer usando la información de codones proporcionada en la presente en la Tabla A, y los detalles técnicos de soporte en la mutagénesis específica del sitio. Es también entendido por los expertos en la técnica que, inherente en la definición de una proteína o péptido "equivalente biológicamente funcional", está el concepto de que hay un límite al número de cambios que se pueden hacer dentro de una porción definida de la molécula y todavía dar como resultado una molécula con un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Las proteínas y péptidos biológicamente funcionalmente equivalentes de este modo se definen en la presente como aquellas proteínas y péptidos en los cuales ciertos, no la mayoría ni todos, de los aminoácidos se pueden sustituir. Desde luego, una pluralidad de proteínas/péptidos distintos con diferentes sustituciones fácilmente se pueden hacer y usar de acuerdo con la invención. Las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Un análisis del tamaño, la forma y el tipo de los sustituyentes de cadenas laterales de aminoácidos revela que la arginina, lisina e histidina todas son residuos cargados positivamente; que la alanina, glicina y serina todas tienen un tamaño similar; y que la fenilalanina, el triptofano y la tirosina todas tienen una forma generalmente similar. Por lo tanto, basándose en estas consideraciones, arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina; y fenilalanina, triptofano y tirosina; se definen en la presente como equivalentes biológicamente funcionales . Para hacer más cambios cuantitativos, el índice hidropático de los aminoácidos se puede considerar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base en sus características de hidrofobicidad y carga, estas son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (- 3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5) . La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína generalmente se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporada en la presente mediante referencia) . Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar o calificación y todavía retienen una actividad biológica similar. Al hacer cambios basándose en el índice hidropático, la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +2 se prefiere, aquellos los cuales están dentro de ±1 se prefieren particularmente, y aquellos dentro de +0.5 se prefieren aún más particularmente. De este modo se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener una proteína equivalente biológicamente. Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,554,101 (incorporada en la presente mediante referencia) , los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 + 1); glutamato (3.0 + 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 + 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptofano (-3.4). Al hacer cambios basados en los valores de hidrofilicidad, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 se prefiere, están dentro de ±1 se prefieren particularmente, y aquellos dentro de +0.5 se prefieren aún más particularmente. D3. Sustancias tóxicas y anticelulares Para ciertas aplicaciones, las sustancias terapéuticas serán sustancias citotóxicas o farmacológicas, particularmente sustancias citotóxicas, citostáticas, anticelulares o antiangiogénicas que tienen la capacidad de matar o suprimir el crecimiento de la división celular de las células endoteliales. En general, estos aspectos de la invención contemplan el uso de cualquier sustancia farmacológica que se pueda conjugar con una sustancia objetivo, y administrar en forma activa al endotelio objetivo. Las sustancias anticelulares ejemplares incluyen sustancias quimioterapéuticas, así como citotoxinas. Las sustancias quimioterapéuticas que se pueden usar incluyen: hormonas, tales como esteroides; antimetabolitos, tales como citocina arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; antraciclinas; mitomicina C; vinca alcaloides; demecolcina; etoposida; mitramicina; sustancias alquilantes antitumor, tales como clorambucilo o melfalán. Otras modalidades pueden incluir sustancias tales como . citocinas . Básicamente, cualquier sustancia anticelular se puede usar, en tanto pueda conjugarse con éxito a, o asociarse con, una sustancia objetivo y anticuerpo de una manera que permitirá su direccionamiento, internalizacion, liberación y/o presentación a los componentes de sangre en el sitio de las células endoteliales objetivos. Hay muchas circunstancias, tales como cuando el antígeno objetivo no se internaliza mediante una vía consistente con intoxicación eficiente mediante el compuesto tóxico, en donde se deseará dirigir sustancias quimioterapéuticas, tales como fármacos antitumor, citocinas, antimetabolitos, sustancias alquilantes, hormonas, y similares. Una variedad de sustancias quimioterapéuticas y otras sustancias farmacológicas ahora se han conjugado con éxito con anticuerpos si muestran que funcionan farmacológicamente, incluyendo la doxorrubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, neocarcinostatina, macromicina, trenimon y o_-amanitina. En otras circunstancias, cualquier efecto lateral potencial de la terapia basada en citotoxina se puede eliminar mediante el uso de inhibidores de síntesis de ADN, tales como daunorrubicina, doxorrubicina, adriamicina, y similares. Estas sustancias por lo tanto son ejemplos preferidos de sustancias anticelulares para su uso en la presente invención. En términos de sustancias citostáticas, estos compuestos generalmente interrumpen el ciclo natural de las células de una célula objetivo, preferiblemente de manera que la célula se sale del ciclo de la célula. Las sustancias citostáticas ejemplares se incluyen. Una variedad amplia de sustancia citotóxica se sabe que se puede conjugar con anticuerpos anti-aminofosfolípidos o ligandos de enlace. Ejemplos incluyen numerosas toxinas derivadas de plantas, hongos o bacterias, las cuales, a manera de ejemplo, incluyen varias toxinas de cadena A, particularmente cadena de ricina A; prote?na de inactivación de ribosoma, tales como saporín o gelonina; a-sarcina; aspergilina; restrictocina; ribonucleasas, tales como ribonucleasa placentaria; toxina de difteria; y exotoxina de pseudomonas, sólo por nombrar algunas. De las toxinas, se prefieren las cadenas de ricina A. La fracción de toxina más preferida para su uso con la presente es la cadena de toxina A que ha sido tratada para modificar o remover residuos de carbohidratos, denominados cadena A desglicosilada (dgA) . La cadena de ricina A desglicosilada se prefiere debido a su extrema potencia, vida media más prolongada, y debido a que es económicamente factible fabricarla a grado y escala clínico. Puede ser deseable desde un punto de vista farmacológico emplear la molécula más pequeña posible que sin embargo proporcione una respuesta biológica adecuada. Se puede desear emplear péptidos de cadena A más pequeños que proporcionarán una respuesta anticelular adecuada. Con este fin, se ha descubierto que la cadena de ricina A se puede "truncar" mediante la remoción de 30 aminoácidos N-terminales por Nagarase (Sigma) , y todavía retener una actividad de toxina adecuada. Se propone que cuando se desea, esta cadena A truncada se puede emplear en conjugados de acuerdo con la invención. De manera alternativa, se puede encontrar que la aplicación de la tecnología de ADN recombinante a la fracción de cadena A de toxina proporcionará beneficios adicionales de acuerdo con la invención. Para que la clonación y expresión de la cadena A de ricina activa biológicamente se haya logrado, ahora es posible identificar y preparar péptidos más pequeños o de otro modo variantes que sin embargo exhiben una actividad de toxina adecuada. Más aún, el hecho de que la cadena de ricina A ahora ha sido clonada permite la aplicación de mutagénesis dirigida al sitio, a través de lo cual se puede preparar fácilmente y seleccionar péptidos derivados de la cadena A y obtener fracciones útiles adicionales para su uso en relación con la presente invención.

Otras sustancias para su uso en direccionamiento de inmunoconjugado de PS expresada en la vasculatura del tumor son las angiopoyetinas . Las angiopoyetinas, como los miembros de la familia de VEGF, son factores de crecimiento muy específicos para el endotelio vascular (Davis y Yancopoulos, 1999; Holash y colaboradores, 1999; incorporadas en la presente mediante referencia) . Las angiopoyetinas primero descritas fue un agonista que se presenta naturalmente, angiopoyetina-1 (Ang-1; SEQ ID N0:1 y SEQ ID NO: 2), y un antagonista que se presenta naturalmente, angiopoyetina-2 (Ang-2; SEQ ID NO : 3 y SEQ ID NO: 4) , ambas de estas actúan mediante un receptor quinasa de tirosina de célula endotelial, Tie2. Dos nuevas angiopoyetinas, angiopoyetina-3 (ratón) y angiopoyetina-4 (humana) también se han identificado (Valenzuela y colaboradores, 1999) . La angiopoyetina-3 parece actuar como un antagonista, mientras que la angiopoyetina-4 parece funcionar como un agonista (Valenzuela y colaboradores, 1999) . Una proteína denominada angiopoyetina-3 también fue clonada a partir de corazón humano y se reportó que no tenía efectos mitogénicos sobre células endoteliales (Kim y colaboradores, 1999) . Mientras que la VEGF es necesaria para las etapas iniciales del desarrollo vascular, la angiopoyetina-1 generalmente se requiere para las etapas posteriores de la remodelación vascular. La angiopoyetina-1 de este modo es un factor de maduración o estabilización, que convierte los vasos inmaduros en vasos maduros . La angiopoyetina-1 se ha demostrado que aumenta la revascularización en tejido isquémico (Shyu y colaboradores, 1998) y que incrementa la supervivencia de redes vasculares expuestas ya sea a VEGF o una forma de aFGF (Papapetropoulos y colaboradores, 1999) . Estos autores también mostraron que la angiopoyetina-1 evita la muerte apoptótica en CEVUH disparada por el retiro de la misma forma de aFGF (Papapetropoulos y colaboradores, 1999). Estos datos son consistentes con el papel directo de la angiopoyetina-1 en las células endoteliales humanas y su interacción con otras moléculas angiogénicas para estabilizar las estructuras vasculares promoviendo la supervivencia de células endoteliales diferenciadas. De las angiopoyetinas, la angiopoyetina-2 es una sustancia preferida para su uso en una terapia dirigida a PS, particularmente en tumores con bajos niveles de VEGR y/o en combinación con la inhibición de VEGF. La angiopoyetina-2 también es un ligando para Tie2 , pero generalmente contrarresta la mutación/estabilidad de los vasos sanguíneos mediados por angiopoyetina- 1. De este modo es un antagonista de la angiopoyetina-1, y actúa para interrumpir la estructura capilar. Sin embargo, como la angiopoyetina-2 vuelve a las células endoteliales responsivas a los estímulos angiogénicos, puede iniciar la neovascularización en combinación con otras señales adecuadas, particularmente VEGF (Asahara y colaboradores, 1998; Holash y colaboradores, 1999; incorporadas en la presente mediante referencia) . En ausencia de otra señal angiogénica, la angiopoyetina-2 causa que los vasos de desestabilicen y se vuelvan inmaduros. En presencia de un estímulo, tal como VEGF la angiopoyetina-2 promueve la angiogénesis. Sin embargo, los efectos angiogénicos de varios reguladores se cree que se logran, al menos en parte, a través de la regulación de un ciclo de autocrina de la actividad de angiopoyetina-2 en células endoteliales microvasculares (Mandriota y Pepper, 1998) . La expresión de la angiopoyetina-2 en tejido de tumor se ha reportado (Tanaka y colaboradores, 1999) , en donde presumiblemente actúa en combinación con VEGF para promover la angiogénesis (Stratmann y colaboradores, 1998) . Sin embargo, ya que la angiopoyetina-2 proporciona una señal negativa cuando VEGF es baja o está ausente, la provisión de la angiopoyetina-2 puede ser un enfoque terapéutico útil. Además de formas dirigidas al tumor, la angiopoyetina-2 también se puede administrar como una proteína o terapia de gen (ver terapias de combinación descritas en la presente) . Las proteínas de fusión de las angiopoyetinas también se consideran para su uso en esta invención, tales como la proteína de fusión Ang-l-Ang-2 estable incluida en la presente como SEQ ID NO : 5.

D4. Factores de coagulación Las sustancias objetivo de anticuerpo y ligando de la invención se pueden enlazar a un componente que es capaz de estimular directamente o indirectamente la coagulación, para formar un coaguligando. Aquí, las sustancias objetivo se pueden dirigir enlazadas al coagulante o al factor de coagulación, o se pueden enlazar a una segunda región de enlace que enlaza y después libera el coagulante o el factor de coagulación. Como se usa en la presente, los términos "coagulante" y "factor de coagulación" cada uno se usa para referirse a un componente que es capaz de estimular directamente o indirectamente la coagulación bajo condiciones adecuadas, preferiblemente cuando se proporciona a un ambiente específico en vivo, tal como la vasculatura del tumor. Los factores de coagulación preferidos son las composiciones de Factor de Tejido, tales como el factor de tejido truncado (tTF), las moléculas de factor de tejido diméricas, multiméricas y mutantes. El "Factor de Tejido Truncado" (tTF) se refiere a construcciones de factor de tejido que se vuelven deficientes del enlace con la membrana por la remoción de suficientes secuencias de aminoácidos para efectuar este cambio en propiedad. Una "cantidad suficiente" en este contexto es una cantidad de secuencia de aminoácidos de transmembrana originalmente suficiente para introducir la molécula del factor de tejido en la membrana, o de otro modo mediar el enlace de la membrana funcional de la proteína del factor de tejido. La remoción de esta "cantidad suficiente de secuencia de extensión de la transmembrana" por lo tanto crea una proteína o polipéptido de Factor de Tejido deficiente en capacidad de enlace con la membrana de fosfolípidos, de manera que la proteína es sustancialmente una proteína soluble que no se enlaza significativamente a las membranas de fosfolípidos. El factor de tejido truncado de este modo sustancialmente falla en convertir el Factor VII en Factor VIla en un ensayo de factor de tejido estándar, y todavía retiene la denominada actividad catalítica que incluye la activación del Factor X en presencia del Factor Vlla. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,504,067 se incorpora específicamente en la presente mediante referencia con los propósitos de describir adicionalmente estas proteínas de Factor de Tejido truncado. Preferiblemente, los Factores de Tejido para su uso en estos aspectos de la presente invención generalmente carecen de la transmembrana y regiones citosólicas (aminoácidos 220-263) de la proteína. Sin embargo, no hay necesidad de que las moléculas del factor de tejido truncado se limiten a moléculas de la longitud exacta de 219 aminoácidos. Las composiciones de Factor de Tejido también pueden ser útiles como dímeros. Cualquiera de las construcciones de Factor de Tejido truncados, mutadas o de otros se pueden preparar en una forma dimérica para su uso en la presente invención. Como será conocido para los expertos en la técnica, estos dímeros de Factor de Tejido se pueden preparar empleando las técnicas estándares de la biología molecular y la expresión recombinante, en las cuales dos regiones de codificación se preparan dentro del marco y se expresan a partir de un vector de expresión. Igualmente, se pueden emplear varias tecnologías de conjugación química en relación con la preparación de dímeros del Factor de Tejido. Los monómeros del Factor de Tejido individuales se pueden derivar antes de la conjugación. Todas estas técnicas serían fácilmente conocidas por los expertos en la técnica. Si se desea, los dímeros o multímeros del Factor de Tejido se pueden unir vía un enlace biológicamente liberable, tal como un enlazador selectivamente - disociable o una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, los enlazadores de péptidos que incluyen un sitio de disociación para una enzima preferencialmente localizada o activa dentro de un ambiente de tumor se contemplan. Formas ejemplares de estos enlazadores de péptidos son aquellos que se disocian mediante uroquinasa, plasmina, trombina, Factor IXa, Factor Xa, o un metaloproteinasa, tal como colagenasa, gelatinasa o estromelisina. En ciertas modalidades, los dímeros del Factor de Tejido además pueden comprender una fracción de inserción de membrana hidrofóbica impedida, para alentar posteriormente la asociación funcional del Factor de Tejido con la membrana de fosfolípidos, pero solamente bajo ciertas condiciones definidas . Como se describe en el contexto de los Factores de Tejido truncados, las secuencias de asociación de membrana hidrofóbica generalmente son tramos de aminoácidos que promueven la asociación con el ambiente de fosfolípidos debido a su naturaleza hidrofóbica. Igualmente, se pueden usar ácidos grasos para proporcionar la fracción de inserción de membrana potencial. Estas secuencias de inserción de membrana se pueden localizar ya sea en el término N o el término C de la molécula de Factor de Tejido, o generalmente anexar en cualquier otro punto de la molécula en tanto su unión a la misma no impida las propiedades funcionales de la construcción del Factor de Tejido. El intento de la fracción de inserción impedida es que permanezca no funcional hasta que la construcción del Factor de Tejido se localice dentro del ambiente del tumor, y permita que la unión hidrofóbica se vuelva accesible y hasta además promueva la asociación física con la membrana. De nuevo, se contempla que los enlaces biológicamente liberables y las secuencias selectivamente disociables serán particularmente útiles con respecto a esto, con el enlace o la secuencia solamente siendo disociadas o de otro modo modificadas después de la localización dentro del ambiente del tumor y la expresión a enzimas particulares u otras moléculas bioactivas. En otras modalidades, las construcciones de Factor de Tejido truncado pueden ser multiméricas o poliméricas. En este contexto una "construcción polimérica" contiene 3 o más construcciones de Factor de Tejido. Una "construcción de Factor de Tejido multimérico o polimérico" es una construcción que comprende una primera molécula de Factor de Tej ido o un derivado operativamente unido a cuando menos una segunda y una tercera molécula de Factor de Tejido o derivada. Los multímeros pueden comprender entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20 de estas moléculas de Factor de Tejido. Las unidades individuales de Factor de Tej ido dentro de los multímeros o polímeros pueden también estar enlazadas por enlazadores de péptidos selectivamente disociables u otros enlaces biológicamente liberables como se desea. De nuevo, como con los dímeros de Factor de Tejido discutidos anteriormente, las construcciones pueden fácilmente hacerse usando ya sea manipulación recombinante y expresión o usando química sintética estándar. Todavía otras construcciones de Factor de Tejido útiles en el contexto de la presente invención son aquellos mutantes deficientes en la capacidad para activar el Factor VII. Estos "mutantes de activación de Factor VII" generalmente se definen en la presente como mutantes del Factor de Tejido que se enlazan con el Factor VlI/VIIa funcional, el Factor X proteolíticamente activo, pero están sustancialmente libres de la capacidad del Factor VII proteolíticamente activo. De acuerdo con lo anterior, estas construcciones son mutantes del Factor de Tejido que carecen de la actividad de la activación del Factor VII. La capacidad de estos mutantes de activación del Factor VII para funcionar promoviendo la coagulación específica del tumor se basa en su administración específica a la vasculatura del tumor, y la presencia del Factor VIla a niveles bajos en el plasma. Después de la administración de este conjugado de sustancia objetivo - mutante de activación de Factor VII, el mutante se localizará dentro de la vasculatura de un tumor vascularizado. Antes de la localización, el mutante de Factor de Tej ido generalmente sería incapaz de promover la coagulación en ningún otro sitio del cuerpo, con base en su incapacidad para convertir el Factor VII en Factor Vlla. Sin embargo, después de la localización y acumulación dentro de la región del tumor, el mutante encontrará entonces suficiente Factor Vlla del plasma con el fin de iniciar la senda de coagulación extrínseca, conduciendo a trombosis específica del tumor. El Factor Vlla exógeno podría también ser administrado al paciente. Uno o más de una variedad de mutantes de activación del Factor VII se pueden preparar y usar en relación con la presente invención. Hay una cantidad significativa de conocimiento científico concerniente a los sitios de reconocimiento de la molécula de Factor de Tejido para el Factor Vll/VIIa. De este modo se entenderá que la región de activación del Factor VII generalmente yace entre aproximadamente el aminoácido 157 y aproximadamente el aminoácido 167 de la molécula del Factor de Tejido. Sin embargo, se contempla que los residuos fuera de esta región también pueden demostrar ser relevantes a la actividad de activación del Factor VII, y por lo tanto se puede considerar introducir mutaciones en cualquiera o más de los residuos generalmente localizados entre aproximadamente el aminoácido 106 y aproximadamente el aminoácido 209 de la secuencia del Factor de Tejido (Publicación Internacional WO 94/07515; WO 94/28017; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Una variedad de otros factores de coagulación se pueden usar en conexión con la presente invención, como se ejemplifica por las sustancias presentadas más adelante. Trombina, Factor V/Va y derivados, Factor Vll/VIIIa y derivados, Factor IX/lXa y derivados, Factor X/Xa y derivados, Factor Xl/XIa y derivados, Factor Xll/XIIa y derivados, Factor XlII/XIIIa y derivados, Factor X activador y Factor V activador se pueden usar en la presente invención. El activador del Factor X de veneno de víbora de Russell se contempla para su uso en esta invención. Los anticuerpos monoclonales específicos para el activador del Factor X presentes en el veneno de víbora de Russell también han sido producidos, y podrían ser usados para administrar específicamente la sustancia como parte de un ligando de enlace biespecífico. El tromboxano A2 está formado de endoperóxidos mediante las acciones secuenciales de las enzimas ciclooxigenasa y tromboxano sintetasa en microsomas de plaquetas. El tromboxano A2 es generado fácilmente por las plaquetas y es un potente vasoconstrictor, en virtud de su capacidad para producir la agregación de las plaquetas . Tanto el tromboxano A2 como los análogos activos del mismo se contemplan para su uso en la presente invención. La tromboxano sintasa, y otras enzimas que sintetizan las prostaglandinas de activación de plaquetas, también se pueden usar como "coagulantes" en el presente contexto. Los anticuerpos monoclonales, y la purificación por inmunoafinidad de, la tromboxano sintasa se conocen; como también el ADNc de la tromboxano sintasa humana. La 0í2-antiplasmina, o el inhibidor de OÍ2-antiplasmina, es un inhibidor de proteinasa naturalmente presente en el plasma humano que funciona para inhibir eficientemente la lisis de los coágulos de fibrina inducidos por el activador plasminógeno. La a2-antiplasmina es un inhibidor particularmente potente, y se contempla para su uso en la presente invención. Conforme está disponible la secuencia de ADNc para la 0í2-antiplasmina, las proteínas de expresión y/o fusión recombinantes se prefieren. Los anticuerpos monoclonales contra la 0í2-antiplasmina también están disponibles que se pueden usar por las modalidades de ligando de enlace biespecífico de la invención. Estos anticuerpos podrían ser usados tanto para administrar a2-antiplasmina endógena a un sitio objetivo como para acumular 0í2-antiplasmina endógena y concentrarla dentro de la región objetivo. D5. Proteínas de fusión y expresión recombinante Las composiciones de sustancias objetivo - sustancias terapéuticas de la presente invención se pueden preparar fácilmente como proteínas de fusión usando técnicas de biología molecular. El uso de técnicas de ADN recombinante para lograr estos fines es ahora práctica normal para aquellos con experiencia en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes in vi tro, técnicas sintéticas y recombinación en vivo/recombinación genética. Se puede realizar síntesis de ADN y ARN, adicionalmente, usando sintetizadores automatizados (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y colaboradores, 1989) . La preparación de esta proteína de fusión generalmente conlleva la preparación de una primera y segunda región de codificación de ADN y la ligación funcional o unión de estas regiones, en cuadros, para preparar una sola región de codificación que codifica la proteína de fusión deseada. En el presente contexto, la secuencia de ADN de la sustancia objetivo se unirá en el marco con la secuencia de ADN que codifica una sustancia terapéutica. No se cree generalmente que sea relevante igual porción de la sustancia objetivo - sustancia terapéutica se prepare como la región terminal N o como la región terminal C. En cuanto la región de codificación deseada se ha producido, se crea un vector de expresión. Los vectores de expresión contienen uno o más promotores corriente arriba de las regiones de ADN insertadas que actúan para promover la transcripción del ADN y de este modo promueve la expresión de la proteína recombinante codificada. Este es el significado de "expresión recombinante". Para obtener una versión conocida como "recombinante" de la proteína de sustancia objetivo - sustancia terapéutica, se expresa en una célula recombinante. El diseño técnico de los segmentos del ADN para la expresión en un sistema procariótico o eucariótico se puede realizar mediante técnicas generalmente conocidas para los experto en expresión recombinante. Se cree que virtualmente cualquier sistema de expresión se puede emplear en la expresión de las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica. Estas proteínas se pueden expresar con éxito en los sistemas de expresión eucariótico, por ejemplo, células CHO, sin embargo, se considera que los sistemas de expresión bacteriana, tales "como el pQE-60 de E. coli serán particularmente útiles para la preparación a gran escala y la purificación posterior de las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica. Los ADNc también se pueden expresar como sistemas bacterianos, con las proteínas codificadas expresadas como fusiones con ß-galactosida, ubiquitina, glutationa S-transferasa de Schistosoma japonicum, y similares. Se cree que la expresión bacteriana tendrá ventajas sobre la expresión eucariótica en términos de facilidad y uso y cantidad de materiales obtenidos mediante estos . En términos de expresión microbiana, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,583,013; 5,221,619; 4,785,420; 4,704,362; y 4,366,246 se incorporan en la presente mediante referencia para los propósitos de suplementar aún más la presente descripción en relación con la expresión de genes en células huésped recombinantes. Las construcciones de sustancias objetivo sustancias terapéuticas producidas de manera recombinante se pueden purificar y formular para la administración humana. De manera alternativa, los ácidos nucleicos que codifican las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica se pueden administrar vía terapia de genes. Aunque el ADN recombinante natural o plásmidos se pueden emplear, el uso de liposomas o de vectores se prefieren. La capacidad de ciertos virus para entrar a las células vía endositosis mediada por receptor y de integrar entre el genoma de la célula hospedera y expresar genes virales establemente y eficientemente los ha hecho candidatos atractivos para la transferencia de genes extraños en células de mamíferos. Los vectores de terapéutica de genes preferidos para su uso en la presente invención generalmente serán vectores virales . Los retrovirus han prometido vectores de administración de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma de la hospedera, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando un espectro amplio de especies y de tipos celulares y empacarse en líneas celulares especiales. Otros virus, tales como los adenovirus, los virus de herpes símplex (VHS) , el citomegalovirus (CMV) , y el virus adenoasociado (VAA) , tales como los descritos por la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,139,941 (incorporada en la presente mediante referencia) , también se pueden diseñar técnicamente para servir como vectores para la transferencia de genes. Aunque algunos virus que pueden aceptar material genético extraño se limitan en el número de nucleótidos que pueden acomodar y en el rango de células que infectan, estos virus han demostrado que efectúan con éxito la expresión de genes. Sin embargo, los adenovirus no integran su material genético en el genoma de la hospedera y por lo tanto no requieren réplica de hospedera para la expresión de genes, haciéndolos idealmente adecuados para la expresión de genes rápida, eficiente, heteróloga. Las técnicas para preparar los virus infectivos defectivos de réplica son más conocidos en la técnica. En ciertas otras modalidades, el vector de terapéutica de genes será el VHS. Un factor que hace del VHS un vector atractivo es el tamaño y organización del genoma. Debido a que el VHS es grande, la incorporación de múltiples genes o los casetes de expresión es menos problemático que en otros sistemas virales más pequeños. Además, la disponibilidad de diferentes secuencias de control viral con actuación variante (por ejemplo, temporal, fuerza) hace posible controlar la expresión en un grado mayor que en otros sistemas. También es otra ventaja que el virus tenga relativamente pocos mensajes divididos, facilitando adicionalmente las manipulaciones genéticas. El VHS también es relativamente fácil de manipular y se puede cultivar a titulaciones altas. Desde luego, al usar sistemas de administración virales, se desearía purificar el virión suficientemente para volverlo esencialmente libre de contaminantes indeseables, tal como partículas virales de interferencia de defectos o endotoxinas y otros pirógenos de manera que no causen ninguna reacción en la célula, animal o individuo que recibe la construcción del vector. Un medio preferido de purificar al vector implica el uso de gradientes de densidad boyante, tal como centrifugación de gradiente de cloruro de cesio. E. Anticuerpos y conjugados anti-aminofosfolípidos El. Anticuerpos anti-aminofosfolípido policlonales Los elementos para preparar y caracterizar anticuerpos son muy conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporada en la presente mediante referencia) . Para preparar antisueros policlonales un animal se inmuniza con una composición de aminofosfolípido inmunogénica, y los antisueros recolectados de ese animal inmunizado. Un amplio rango de especies animales se puede usar para la producción de antisuero. Típicamente el animal usado para la producción de antisuero es un conejo, ratón, rata, hámster, conejillo de indias o chivo. Debido al volumen relativamente grande de los conejos, un conejo es la elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales. La cantidad de composición de inmunógeno usada en la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza del inmunógeno así como el animal usado para la inmunización. Una variedad de rutas se pueden usar para administrar el presente inmunógeno de aminofosfolípido; subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraperitoneal e intraesplénica. La producción de anticuerpos policlonales se puede monitorear muestreando sangre del animal inmunizado en varios puntos después de la inmunización. Una segunda inyección de refuerzo, también se le puede dar. El proceso de refuerzo y titulación se repite hasta que se logra una titulación conveniente. Cuando se obtiene un nivel de titulación deseado, el animal inmunizado se puede sangrar y el suero aislar y almacenar. El animal también se puede usar para generar anticuerpos monoclonales. Como es muy conocido en la técnica, la inmunogenicidad de una composición particular se puede aumentar mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes ejemplares incluyen adyuvante de Freund completo, un estimulador específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis muertas; adyuvante de Freund incompleto; y adyuvante de hidróxido de aluminio. Puede ser deseado reforzar el sistema inmunológico de la hospedera, lo que se puede lograr asociando los aminofosfolípidos con, o acoplando los aminofosfolípidos con, un portador. Los portadores ejemplares son (KLH) y albúmina de suero bovino (ASB) . Otras albúminas tales como la ovalbúmina, albúmina de suero de ratón o la albúmina de suero de conejo también se pueden usar como portadores . Como también se conoce en la técnica, una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Sin embargo, la generación de anticuerpos contra los aminofosfolípido no es particularmente difícil. Por ejemplo, los anticuerpos anti-fosfatidilserina muy específicos se cultivaron en ratones inmunizados con inyecciones intramusculares de gels de poliacrilamida que contienen fosfatidilserina y con vesículas de citocroma c de fosfatidilserina (Maneta-Peyret y colaboradores, 1988; 1989; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . El uso de implantes de acrilamida aumentó la producción de anticuerpos (Maneta-Peyret y colaboradores, 1988; 1989) . Los anticuerpos anti-fosfatidilserina cultivados de esta manera son capaces de detectar la fosfatidilserina en el sitio en plaquetas humanas (Maneta-Peyret y colaboradores, 1988) . Los grupos de Inoue, Rote y Rauch también han desarrollado anticuerpos anti-PS y anti-PE (ver más adelante) . E2. Anticuerpos anti - aminofosfolípidos monoclonales Varios métodos para generar anticuerpos monoclonales (MAbs) también son muy conocidos ahora en la técnica. Las técnicas de generación de anticuerpos monoclonales más estándares generalmente comienzan a lo largo de las mismas líneas que aquellos para preparar anticuerpos policlonales (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporada en la presente mediante referencia) . Una respuesta de anticuerpo policlonal se inicia 1.63 inmunizando un animal con una composición de aminofosfolípido inmunogénico y, cuando se obtiene un nivel de titulación deseado, el animal inmunizado se puede emplear para generar anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden ser fácilmente preparados a través del uso de técnicas muy conocidas, tales como las ejemplificadas en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,196,265, incorporada en la presente mediante referencia. Típicamente, esta técnica involucra inmunizar un animal conveniente con la composición de inmunógeno de aminofosfolípido seleccionada. La composición inmunizante se administra de una manera efectiva para estimular las células de producción de anticuerpos. Los roedores tales como ratones y ratas son los animales preferidos, sin embargo, el uso de conejos, ovejas y sapos también es posible. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986, páginas 60-61; incorporada en la presente mediante referencia) , pero se prefieren los ratones, siendo el más preferido el ratón BALB/c y éste se usa de manera más rutinaria y generalmente da un porcentaje más alto de fusiones estables. Después de la inmunización, las células somáticas con el potencial para producir anticuerpos de aminofosfolípidos, específicamente linfocitos B (células B) , se seleccionan para su uso en el protocolo para generar anticuerpos monoclonales . Estas células se pueden obtener a partir de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos, o de muestras de sangre periférica. Las células del bazo y las células de la sangre periférica se prefieren, las primeras debido a que son una fuente rica de células que producen anticuerpos que están en la etapa de plasmablasto de división, y las últimas porque la sangre periférica es fácilmente accesible. Frecuentemente, un panel de animales habrán sido inmunizados y el bazo del animal con la titulación de anticuerpos más alta será removido y se obtendrán los linfocitos del bazo homogenizando el bazo con una jeringa. Típicamente, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente 5 X 107 hasta 2 X 108 linfocitos. Los linfocitos B que producen anticuerpos anti-aminofosfolípidos a partir del animal inmunizado se fusionan entonces con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente uno de la misma especie que el animal que fue inmunizado. Las líneas de células de mieloma convenientes para su uso en procedimientos de fusión que produce hibridoma preferiblemente son los que no producen anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión, y deficiencias de enzimas que los vuelven incapaces de crecer en ciertos medios selectivos los cuales soportan el crecimiento de solamente las células fusionadas deseadas (hibridomas) . Cualquiera de un número de células de mieloma se puede usar, como se conoce por los expertos en la técnica (Goding, páginas 65-66, 1986; Campbell, páginas 75-83, 1984; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Por ejemplo, cuando un animal inmunizado es un ratón, uno puede usar PE-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, uno puede usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210 o una de las líneas celulares de ratón enlistadas anteriormente; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-L0N-HMy2 y UC729-6, todos son útiles en relación con las fusiones de células humanas. Los métodos para generar híbridos de células de bazo y de ganglios linfáticos que producen anticuerpos y de células de mieloma usualmente comprenden las células somáticas con células de mieloma en una proporción de 4:1, aunque la proporción puede variar de desde aproximadamente 20:1 hasta aproximadamente 1:1, respectivamente, en la presencia de una sustancia o sustancias (químicas o eléctricas) que promueven la fusión de las membranas celulares. Los métodos de fusión usando el virus Sendai se han descrito por Kohier y Milstein (1975; 1976; cada una incorporada en la presente mediante referencia) , y aquellos que usan polietilenglicol (PEG) , tal como 37 por ciento (volumen/volumen) de polietilenglicol, por Gefter y colaboradores, (1977; incorporada en la presente mediante referencia) . El uso de métodos de fusión inducidos eléctricamente también es adecuado (Goding páginas 71-74, 1996; incorporada en la presente mediante referencia) . Los procedimientos de fusión usualmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, aproximadamente 1 x 10~6 hasta 1 x 10"8. Sin embargo, esto no plantea un problema, ya que los híbridos viables, fusionados se diferencian de las células padres no fusionadas (particularmente las células de mieloma no fusionadas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) cultivando en un medio selectivo. El medio selectivo generalmente es uno que contiene una sustancia que bloquea la síntesis de novo de los nucleótidos en el medio de cultivo de tejido. Las sustancias ejemplares y preferidas son aminopterina, metotrexato, y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que los bloques de azaserina solamente la síntesis de purina. Cuando se usa aminopterina o metotrexato, los medios se suplementan con hipoxantina y timidina como una fuente de nucleótidos (medio HAT) . Cuando se usa azaserina, los medios se suplementan con hipoxantina. El medio de selección preferido es HAT. Solamente las células capaces de operar sendas salvajes de nucleótidos son capaces de sobrevivir en el medio HAT. Las células de mieloma carecen de enzimas claves de la senda salvaje, es decir, hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) , y no pueden sobrevivir. Las células B pueden operar esta senda, pero tienen una extensión de vida limitada en cultivo y generalmente mueren dentro de dos semanas. Por lo tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son aquellos híbridos formados a partir de las células B y mieloma. Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de la cual se seleccionan los hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza mediante el cultivo de células por dilución de clona única en placas de microtitulación seguidas por probar los sobrenadantes clónales individuales (después de aproximadamente dos a tres semanas) para la actividad anti-aminofosfolípido deseada. La prueba podría ser sensible, simple y rápida, como los radioinmunoensayos, los inmunoensayos de enzimas, los ensayos citotóxicos, los ensayos de placa, los ensayos de inmunoenlace de punto, y similares. Los hibridomas seleccionados se diluirían serialmente y clonarían en líneas celulares que producen anticuerpos anti-aminofosfolípidos individuales, cuyos clones pueden propagarse indefinidamente para proporcionar anticuerpos monoclonales. Las líneas celulares se pueden explotar a la producción de anticuerpos monoclonales en dos maneras básicas . Una muestra de hibridoma se puede inyectar (frecuentemente en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se usó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores secretando el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de célula fusionada. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitas, se pueden entonces golpear para proporcionar anticuerpos monoclonales a alta concentración. Las líneas celulares individuales podrían también ser cultivadas in vi tro, en donde los anticuerpos monoclonales se secretan naturalmente en el medio de cultivo a partir del cual pueden fácilmente obtenerse en altas concentraciones . Los anticuerpos monoclonales producidos por cualquier medio generalmente se purificarán adicionalmente, por ejemplo, usando filtrado, centrifugación y varios métodos cromatográficos, tales como cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía por afinidad, todas aquellas técnicas de purificación son muy conocidas para los expertos en la técnica. Las técnicas de purificación involucran el fraccionamiento para separar el anticuerpo deseado de otros componentes de una mezcla. Los métodos analíticos particularmente convenientes para la preparación de anticuerpos incluyen, por ejemplo, cromatografía de proteína A-Sefarosa y/o proteína G-Sefarosa. Umeda y colaboradores, (1989; incorporada en la presente mediante referencia) reportó la producción efectiva de anticuerpos monoclonales que reconocen epítopes estereoespecíficos de la fosfatidilserina. El sistema Umeda se basa en la inmunización directa de la fosfatidilserina en bazo de ratón usando una muestra de aminofosfolípido cubierto por Salmonella (Umeda y colaboradores, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . El protocolo de Umeda da una alta frecuencia de anticuerpos monoclonales anti-PS, que exhiben tres distintos perfiles de reactividad variando desde altamente específico hasta ampliamente reactivo en cruz. Umeda por lo tanto también se incorpora en la presente mediante referencia para propósitos de describir adicionalmente los ensayos de selección para identificar los anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente con PS, por ejemplo, y no se enlazan con fosfatidilcolina. Cualquiera de los 61 hibridomas generados por Umeda podrían potencialmente emplearse en las construcciones de sustancias objetivo - sustancia terapéutica de la presente invención. Los ejemplos son PSC8, PSF11, PSG3 , PSD11, PSF10, PS1B, PS3D12, PS2C11; PS3A, PSF6 , PSF7, PSB4 , PS3H1; PS4A7 y PS1G3. Los más preferidos son PS3A, PSF6, PSF7, PSB4 y PS3H1 ya que se enlazan solamente con la fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina. Los anticuerpos anti-PS preferidos son PS4A7 (IgM) y PS1G3 (IgG3) , ya que son muy específicos para PS y no exhiben reacción cruzada con otros fosfolípidos. El PS4A7 reconoce la configuración estéreo-específica del residuo serina en PS (Figura 1, Umeda y colaboradores, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . Igarashi y colaboradores, (1991; incorporada en la presente mediante referencia) también reportó la inducción efectiva de anticuerpos anti-PS del isotipo IgG mediante inmunización intraesplénica. Solamente un ligero incremento de titulación se observó cuando se inyectó de nuevo intravenosamente el antígeno. Una frecuencia alta de anticuerpos monoclonales anti-PS del isotipo IgG también se observó aún cuando se produjeron los anticuerpos monoclonales 10 días después de la inyección intraesplénica del antígeno. Estos anticuerpos también se emplearon por Schuurmans Stekhoven y colaboradores, (1994) . La otra producción de anticuerpo anti-PS significativa ha sido por Rote y colegas. Rote y colaboradores, (1993; incorporada en la presente mediante referencia) empleó particularmente micelas de PS en combinación con adyuvante completo de Freund para generar anticuerpos anti-PS específicos. Rote y colaboradores, (1993) también generaron anticuerpos monoclonales que se diferencian entre cardiolipina (CL) y PS . Rote y colaboradores, (1993) por lo tanto también se incorporan en la presente mediante referencia para propósitos de describir adicionalmente ensayos de selección para identificar los anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente con PS probando contra plaquetas en reposo y activadas por trombina usando la citometría de flujo. El anticuerpo 3SB9b producido por Rote y colaboradores, (1993) reaccionó solamente con PS, y es un anticuerpo preferido para su uso en las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica de la presente invención. BA3B5C4 también se puede usar ya que reacciona tanto con PS como con CL. Esos anticuerpos también se describen en Lin y colaboradores (1995) , Obringer y colaboradores (1995) y Katsuragawa y colaboradores (1997) . E3. Anticuerpos Anti-aminofosfolípidos a partir de Bibliotecas de Fagémidos . La tecnología recombinante ahora permite la preparación de anticuerpos que tienen la especificidad deseada a partir de genes recombinantes que codifican un rango de anticuerpos (Van Dijk y colaboradores, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . Ciertas técnicas recombinantes usan el aislamiento de genes de anticuerpos por selección inmunológica de bibliotecas de expresión de fagos de inmunoglobulina combinatoria preparadas a partir de ARN aislado del bazo de un animal inmunizado (Morrison y colaboradores, 1986; Winter y Milstein, 1991; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Para estos métodos, las bibliotecas de fagémidos de inmunoglobulina combinatoria se preparan a partir de ARN aislado a partir del bazo del animal inmunizado, y los fagémidos que expresan los anticuerpos adecuados se seleccionan por lavado en batea, usando células que expresan el antígeno de las células de control. Las ventajas de este enfoque sobre las técnicas de hibridoma convencionales son que aproximadamente 104 veces tantos anticuerpos se pueden producir y seleccionar en una sola ronda, y que se general nuevas especificidades por la combinación de la cadena H y la cadena L, lo cual aumenta adicionalmente el porcentaje de anticuerpos adecuados generados . Un método para la generación de un gran repertorio de diversas moléculas de anticuerpos en bacterias utilizan el bacteriófago lambda como el vector (Huse y colaboradores, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . La producción de anticuerpos que usan el vector lambda implica la clonación de poblaciones de cadenas pesadas y ligeras de las secuencias de ADN en vectores iniciales por separado. Los vectores se combinan posteriormente aleatoriamente para formar un solo vector que dirige la coexpresión de cadenas pesadas y ligeras para formar fragmentos de anticuerpos. Las secuencias de ADN de cadena pesada y ligera se obtienen por amplificación, preferiblemente por reacción de cadena de polimerasa (PCRMR) o una técnica de amplificación relacionada, de ARNm aislado a partir de células de bazo (ó hibridomas de las mismas) de un animal que ha sido inmunizado con un antígeno seleccionado. Las secuencias de cadena pesada y ligera típicamente se amplifican usando cebadores que incorporan sitios de restricción en los extremos del segmento de ADN amplificado para facilitar la clonación de los segmentos de cadena pesada y ligera en los vectores iniciales. Otro método para la generación y selección de bibliotecas grandes de sitios de combinación de anticuerpos enteros o parcialmente sintéticos, o paratopos, utiliza vectores de despliegue derivados de fago filamentoso, tal como M13 , fl o fd. Estos vectores de despliegue de fago filamentoso, conocidos como "fagémidos", producen grandes bibliotecas de anticuerpos monoclonales que tienen diversas y novedosas inmunoespecificidades . La tecnología usa un dominio de ancla de membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso como un medio para enlazar el producto del gen y el gen durante la etapa de ensamble de la réplica de fago filamentoso, y se ha usado para la clonación y expresión de anticuerpos a partir de bibliotecas combinatorias (Kang y colaboradores, 1991; Barbas y colaboradores, 1991) cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Esta técnica general para el despliegue de fago filamentoso se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,658,727, incorporada en la presente mediante referencia. En un sentido más general, el método proporciona un sistema para la clonación y selección simultánea de especificidades de enlace con ligando preseleccionado a partir de repertorios de genes de anticuerpos usando un solo sistema de vector. La selección de miembros aislados de la biblioteca para una capacidad de enlace de ligando preseleccionada permite la correlación de la capacidad de enlace de una molécula de anticuerpo expresada con un medio conveniente para aislar el gen que codifica al miembro de la biblioteca. El enlace de la expresión y la selección se llevan a cabo mediante la combinación de dirigirse a un polipéptido de fusión en el periplasma de una célula bacteriana para permitir el ensamble de un anticuerpo funcional, y la dirección de un polipéptido de fusión sobre el recubrimiento de una partícula de fago filamentoso durante el ensamble del fago para permitir la selección conveniente del miembro de interés de la biblioteca. La dirección periplásmica se proporciona por la presencia de un dominio de señal de secreción en un polipéptido de fusión. Tomar como blanco una partícula de fago se proporciona mediante la presencia de un dominio de ancla de membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso (es decir, un dominio de ancla de membrana derivada de cpIII o cpVIII) en un polipéptido de fusión. La diversidad de una biblioteca de anticuerpos combinatorios basados en fagos filamentosos se puede aumentar cambiando de genes de cadenas pesadas y ligeras, alterando una o más de las regiones de determinación de complementariedad de los genes de cadena pesada clonados de biblioteca, o introduciendo mutaciones aleatorias en la biblioteca mediante reacción de cadena de polimerasa propensa a error. Otros métodos para seleccionar bibliotecas de fagémidos se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,580,717; 5,427,908; 5,403,484; y 5,223,409, cada una incorporada en la presente mediante referencia. Otro método para la selección de grandes bibliotecas de anticuerpos combinatorios se ha desarrollado, utilizando la expresión de poblaciones de diversas secuencias de cadenas pesadas y ligeras en la superficie de un bacteriófago filamentoso, tal como M13, fl o fd (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,698,426; incorporada en la presente mediante referencia) . Dos poblaciones de diversas secuencias de cadenas pesada (He) y ligera (Le) se sintetizan por la reacción de cadena de polimerasa (PCRMR) . Estas poblaciones se clonan en vectores basados en M13 que contienen los elementos necesarios para la expresión. El vector de cadena pesada contiene una secuencia de proteína de recubrimiento de gen VIII (gVIII) , de manera que la traducción de la secuencia de cadena pesada produce las proteínas de fusión gVIII-Hc. Las poblaciones de dos vectores se combinan aleatoriamente, de manera que solamente las porciones del vector que contienen las secuencias He y L'c se unen en un solo vector circular. El vector combinado dirige la coexpresión tanto de las secuencias He y Le para ensamblar los dos polipéptidos y la expresión de superficie en M13 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,698,426; incorporada en la presente mediante referencia) . El paso de combinación aleatoriamente junta secuencias de codificación He y Le diferentes dentro de dos poblaciones distintas en un solo vector. Las secuencias de vectores donados de cada vector independiente son necesarias para la producción de un fago viable. También, ya que las secuencias de seudo gVIII están contenidas solamente uno de los dos vectores iniciales, la coexpresión de fragmentos de anticuerpos funcionales como proteínas de fusión gVIII-Hc asociados con Le no se puede llevar a cabo en la superficie del fago hasta que las secuencias del vector se enlace en un solo vector. La expresión superficial de la biblioteca de anticuerpos se realiza en una cepa supresora de ámbar. Un codón de detención de ámbar entre la secuencia He y la secuencia gVIII desenlaza los dos componentes en una cepa no supresora. Aislando el fago producido a partir de la cepa no supresora e infectando una cepa supresora se enlazarán las secuencias He con la secuencia gVIII durante la expresión. Cultivando la cepa supresora después de la infección se permite la coexpresión en la superficie de M13 de todas las especies de anticuerpos dentro de la biblioteca como proteínas de fusión gVIII (proteínas de fusión gVIII-Fab) . Alternativamente, el ADN se puede aislar a partir de la cepa no supresora y luego introducirse en una cepa supresora para llevar a cabo el mismo efecto. La biblioteca de expresión superficial se selecciona para determinar fragmentos específicos Fab que se enlazan con moléculas preseleccionadas mediante procedimientos de aislamiento por afinidad estándares. Estos métodos incluyen, por ejemplo, lavado con batea (Parmley y Smith, 1988; incorporada en la presente mediante referencia) , cromatografía por afinidad y procedimientos de manchado en fase sólida. El lavado con batea se prefiere, debido a que se pueden seleccionar titulaciones altas de fago fácilmente, rápidamente y en volúmenes pequeños. Además, este procedimiento puede seleccionar fragmentos menores de Fab de especies dentro de la población, lo cual de otro modo habría sido indetectable, y amplificar a poblaciones sustancialmente homogéneas. Los fragmentos Fab seleccionados se pueden caracterizar secuenciando los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos después de la amplificación de la población de fagos. Otro método para producir distintas bibliotecas de anticuerpos y seleccionar las especificidades de enlace deseables se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,667,988, y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,759,817, cada una incorporada en la presente mediante referencia. El método implica la preparación de bibliotecas de moléculas de inmunoglobulina heterodimérica en forma de bibliotecas de fagémidos que usan oligonucleótidos degenerados y reacciones de extensión de cebadores para incorporar las degeneraciones en las regiones de RDC de los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras variables de inmunoglobulina, y desplegar los polipéptidos mutagenizados en la superficie del fagémido. Después de eso, la proteína de despliegue se selecciona por su capacidad para enlazarse con un antígeno preseleccionado. El método para producir una molécula de inmunoglobulina heterodimérica generalmente implica (1) introducir un gen de codificación de región V de cadena pesada o ligera de interés en el vector de despliegue de fagémido; (2) introducir un sitio de enlace aleatorizado en el vector de proteína de despliegue de fagémido por la extensión del cebador con un oligonuleótido que contiene regiones de homología con un RDC del gen de región V de anticuerpo y que contiene regiones de regeneración para producir secuencias de codificación aleatorizadas para formar una gran población de vectores de despliegue, cada uno capaz de expresar diferentes sitios de enlace putativos desplegados sobre una proteína de despliegue de superficie de fagémido; (3) expresar la proteína de despliegue y el sitio de enlace sobre la superficie de una partícula de fago filamentoso; y (4) aislar (seleccionar) la partícula de fago expresada en la superficie usando técnicas de afinidad, tales como lavado en batea de partículas de fago contra un antígeno previamente seleccionado, aislando mediante esto una o más especies del fagémido que contiene una proteína de despliegue que contiene un sitio de enlace que se enlaza con un antígeno preseleccionado. Otra variación de este método para producir diversas bibliotecas de anticuerpos y seleccionar especificidades de enlace deseables se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,702,892, incorporada en la presente mediante referencia. En este método, solamente se emplean secuencias de cadena pesada, las secuencias de cadena pesada se aleatorizan en todas las posiciones del nucleótido, las cuales codifican, ya sea, la región hipervariable RDCI o RDCIII, y la variabilidad genética en las RDCs se genera independientemente de cualquier proceso biológico. En el método, dos bibliotecas se diseñan técnicamente para genéticamente cambiar los motivos de oligonucleótidos dentro del marco estructural de la estructura del gen de cadena pesada. En toda la mutación aleatoria, ya sea de la RDCI o RDCIII, las regiones hipervariables en el gen de cadena pesada se reconstruyeron para dar como resultado una colección de secuencias muy diversas . Las proteínas de cadena pesada codificadas por la colección de secuencias de gen mutados posee el potencial para tener todas las características de enlace de una inmunoglobulina, al mismo tiempo que requiere solamente una de las dos cadenas de inmunoglobulina. Específicamente, el método se practica en ausencia de la proteína de cadena ligera de inmunoglobulina. Una biblioteca de fago que despliega proteínas de cadena pesada modificadas se incuba con un ligando inmovilizado para seleccionar clonas que codifican proteínas recombinantes que específicamente enlazan al ligando inmovilizado. El fago unido se disocia del ligando inmovilizado y se amplifica mediante cultivo en células hospederas bacterianas. Las placas virales individuales, expresando cada una proteína recombinante diferente, se extienden, entonces las clonas individuales se pueden probar para determinar su actividad de enlace. E4. Anticuerpos Anti-aminofosfolípidos a Partir de Pacientes Humanos. Los anticuerpos contra los aminofosfolípidos, particularmente la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina, se presentan en la población humana, en donde se correlacionan con ciertos estados de enfermedades. Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos son parte de los anticuerpos anti-fosfolípido heterogéneos (aPL) , observados que tienen familias de diferentes especificidades y clases. El síndrome anti-fosfolípido primario (APS) se ha separado de otras formas de enfermedad autoinmune asociada con la producción de anticuerpos anti-fosfolípidos . Los anticuerpos anti-PS se asocian particularmente con pérdida de embarazo recurrente (Rote y colaboradores, 1995; Rote, 1996; Vogt y colaboradores, 1996; Vogt y colaboradores, 1997; incorporada en la presente mediante referencia) , y con la enfermedad autoinmune, lupus eritematoso sistémico (SLE o "lupus") (Branch y colaboradores, 1987; incorporada en la presente mediante referencia) . Los anticuerpos anti-PE también se han reportado en pacientes humanos, particularmente aquellos con enfermedades autoinmunes (Satub y colaboradores, 1989) . Branch y colaboradores (1987) reportaron que el 80 por ciento de pacientes con lupus anticoagulante (LA o LAC) tenían autoanticuerpos que reconocieron la PE; con Drouvalakis y Buchanan (1998) aumentando este número a 95 por ciento de positivos a PE a partir de suero de LAC autoinmune. Los anticuerpos anti-fosfolípidos no se deben confundir con los anticuerpos anti-células endoteliales (AECA) , aunque se pueden encontrar en el mismo paciente. La existencia de los anticuerpos anti-células endoteliales se ha documentado en una variedad de escenarios clínicos asociados con vasculitis, tales como esclerosis sistémica (SS) . Para estudiar los anticuerpos anti-células endoteliales, se obtienen anticuerpos a partir de pacientes que no tienen anticuerpos anti-fosfolípidos (suero negativo-aPL) . El papel patógeno de los anticuerpos anti-células endoteliales sigue siendo poco claro, aunque Bordron y colaboradores (1998) muy recientemente sugirieron que los anticuerpos anti-células endoteliales pueden iniciar la apoptosis en las células endoteliales, lo cual sería seguido por transferencia de PS a la cara externa de la membrana. Ellos propusieron que esto serviría para la generación posterior de los anticuerpos anti-fosfolípidos que algunas veces se ven junto con los anticuerpos anti-células endoteliales en pacientes con lesiones de la piel o con enfermedad de tejido conectivo (Bordron y colaboradores, 1998) . Sin embargo, aunque los anticuerpos anti-células endoteliales que se enlazan con el antígeno que induce la apoptosis se postuló, estos estudios no condujeron a mayor caracterización de los anticuerpos anti-células endoteliales, todavía dicen que representan una familia extremadamente heterogénea de anticuerpos que reaccionan con diferentes estructuras (no lípidas) en las células endoteliales (Bordron y colaboradores, 1998) . Los anticuerpos anti-fosfatidilserina están muy asociados con pérdida de embarazo, hipertensión inducida en el embarazo y retardo de crecimiento intrauterino. Un antígeno dependiente de la fosfatidilserina se ha mostrado que se expresa en la superficie de un modelo de coriocarcinoma (BeWo) de células de citotrofoblásticas ' de diferenciación, lo que indica que deberá ser accesible en vio a los anticuerpos anti-fosfatidilserina circulantes (Rote y colaboradores, 1995) . Sin duda, Vogt y colaboradores (1996) mostraron que el anticuerpo monoclonal 3SB9b, que reacciona con fosfatidilserina, pero no con cardiolipina, indujo una reducción significativa tanto en los pesos fetales y placentarios en un modelo de ratón para el síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido . Estos autores desarrollaron un modelo para explicar los abortos asociados con anticuerpos anti-fosfolípidos : el anticuerpo anti-fosfatidilserina revela sitios para el enlace de prstrombina en la superficie del trofoblasto, más probablemente removiendo Anexín V (Vogt y colaboradores, 1997) . La diferenciación del trofoblasto se asocia con la externalización de la fosfatidilserina a partir de la superficie interna a la externa de la membrana del plasma. Normalmente, la externalización de la fosfatidilserina es concurrente con el enlace de Anexín V, lo cual evita que la superficie rica en fosfatidilserina actúe como un sitio para la activación de la coagulación. De este modo, cuando los anticuerpos anti-fosfolípidos están presentes, evitan el enlace de Anexín V y conducen a un estado procoagulante (Vogt y colaboradores, 1997) . Los anticuerpos anti-PE frecuentemente se asocian con anticoagulantes de lupus (sueros LAC) . El papel de la PE y anti-PE en la LAC es extremadamente complejo, ver, por ejemplo, Smirnov y colaboradores (1995; incorporada en la presente mediante referencia), en donde se presentan varias hipótesis. Smirnov y colaboradores (1995) reportan que, en presencia de la proteína activada C y PE, el plasma de LAC forma coágulos más rápido que el plasma normal. Rauch y colaboradores (1986) caracterizan los anticuerpos anti-fosfolípidos de LAC como que prolongan el tiempo de coagulación en ensayos de coagulación in vi tro.

Vlachoyiannopoulos y colaboradores (1993; incorporada en la presente mediante referencia) probó el suero SLE y APS mediante Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada (EISEE) para anticuerpos para fosfatidiletanolamina y cardiolipina, en comparación con donadores de sangre sanos. Tanto los pacientes de SLE como de APS reportaron que presentaban una titulación alta de anticuerpos anti-PE IgM que los sujetos normales, mientras que la reactividad de IgG e IgA anti-PE reportó que no difería. Se sugirió que los anticuerpos IgA e IgG anti-PE pueden presentarse en titulaciones bajas como autoanticuerpos naturales en sujetos normales (Vlachoyiannopoulos y colaboradores (1993; incorporada en la presente mediante referencia) . Rauch y colaboradores 1986; incorporada en la presente mediante referencia) produjo hibridomas fusionando linfocitos a partir de 13 pacientes con lupus eritematoso sistémico con una línea de linfoblastoide . Ellos demostraron que los anticuerpos que prolongaban el tiempo de coagulación se enlazaban con fosfolípidos en fase hexagonal, incluyendo formas naturales y sintéticas de fosfatidiletanolamina (Rauch y colaboradores, 1986; incorporada en la presente mediante referencia) . En cambio, los fosfolípidos laminares, tales como la fosfatidilcolina y las formas laminares sintéticas de la fosfatidiletanolamina, no tuvieron efecto en la actividad anticoagulante (Rauch y colaboradores, 1986) .

Rauch y Janoff (1990; incorporada en la presente mediante referencia) quisieron mostrar que la inmunización de ratones con fosfatidiletanolamina en la fase hexagonal II, pero no en la fase de bicapa, daba como resultado la inducción de anticuerpos anti-fosfolípidos. Estos anticuerpos fueron muy reactivos con la fosfatidiletanolamina y tuvieron actividad anticoagulante de lupus funcional característica de los anticuerpos de pacientes con enfermedad autoinmune (Rauch y Janoff, 1990) . La forma hexagonal fase II de los aminofosfolípidos deberá entonces usarse ventajosamente para generar anticuerpos para su uso en la presente invención. Sin duda, Trudell reportó que los anticuerpos cultivados contra los aductos de proteína TFA- ( trilfuoroacetil - ) se enlazan con TFA-fosfatidiletanolamina en las micelas de fosfolípido en fase hexagonal, pero no en liposomas laminares (Trudell y colaboradores, 1991a; incorporada en la presente mediante referencia) . Los autores sugieren que los aductos de TFA-fosfatidiletanolamina que residen en dominios no laminares en la superficie del hepatocito podrían ser sitios de reconocimiento para anticuerpos de aducto anti-TFA, y potencialmente participar en la hepatotoxicidad de halotano mediada inmune (Trudell y colaboradores, 1991a) . Después se demostró que estos mismos anticuerpos reaccionan en forma cruzada con TFA-dioleoilfosfatidiletanolamina cuando este aducto se incorpora en la superficie de los hepatocitos (Trudell y colaboradores, 1991b; incorporada en la presente mediante referencia), soportando de este modo esta hipótesis. Berard además explicó que la forma en fase II hexagonal de los aminofosfolípidos, tales como PE (Berard y colaboradores, 1993; incorporada en la presente mediante referencia) . En las bicapas, los fosfolípidos generalmente adoptan una estructura de gel, retícula cristalina ó fase laminar (Berard y colaboradores, 1993) . Sin embargo, dependiendo del contenido de colesterol, los ambientes de proteína e iónicos, los fosfolípidos fácilmente cambian fases, adoptando una fase hexagonal II (Berard y colaboradores, 1993; incorporada en la presente mediante referencia) . Es esta fase hexagonal II de los aminofosfolípidos la que se cree que es inmunogénica, como se propuso inicialmente para la generación de autoanticuerpos en situaciones de enfermedad (Berard y colaboradores, 1993; incorporada en la presente mediante referencia) . Qamar y colaboradores (1990) ; incorporada en la presente mediante referencia) han desarrollado una variación del tema de reconocimiento de aminofosfolípidos hexagonales. Usando las fosfatidiletanolamina como un modelo, estos autores reportaron que los anticuerpos anti-PE a partir de suero SLE positivo para aPL no se enlaza con PE, pero de hecho se dirigen a la lisofosfatidiletanolamina (IPE) , un producto de degradación de PE natural y un probable contaminante de la mayoría de las preparaciones de PE (Qamar y colaboradores, 1990; incorporada en la presente mediante referencia). Otros datos recientes en que la mayoría de los anticuerpos anti-fosfolípidos reconocen el fosfolípido en el contexto de las proteínas cercanas (Rote, 1996; Chamley y colaboradores, 1991) . En membranas de plasma, la mayoría del fosfolípido parece estar naturalmente en una forma bilaminar no antigénica (Rote, 1996) . Las moléculas accesorias pueden ayudar a facilitar la transición a formas antigénicas hexagonales y estabilizar su expresión (Galli y colaboradores 1993) . Por ejemplo, los anticuerpos anti-fosfolípidos que se presentan naturalmente primero se reportó que reconocen complejos de cardiolipina o fosfatidilserina con ß2-glicoproteína I (ß2-GPI o apolipoproteína H, apoH) (Galli y colaboradores, 1990; 1993) .

Se cree que ß2-GPI estabiliza los fosfolípidos en la conformación antigénica que no existe en los fosfolípidos puros (McNeil y colaboradores, 1990; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,344,758; Chamley y colaboradores, 1991; Matsuura y colaboradores, 1994) . La protrombina también ha estado implicada en el proceso de estabilización de fosfolípidos (Bevers y colaboradores, 1991) . Las proteínas de plasma que se enlazan con fosfolípidos también son generalmente necesarias para el reconocimiento de anticuerpos de el fosfolípido eléctricamente neutro o zwitteriónico, fosfatidiletanolamina. Sugi y Mclntyre (1995; incorporada en la presente mediante referencia) identificaron dos proteínas de plasma de enlace con PE prominentes como kininógeno de alto peso molecular (HMWK o HK) , y kininógeno de bajo peso molecular (LMWK o LK) . Los anticuerpos anti-PE de pacientes con SLE y/ó abortos espontáneos recurrentes se mostró que no reconocen PE, HMWK o LMWK cuando fueron presentados independientemente como antígenos únicos en placas de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada (Sugi y Mclntyre, 1995) . Otros sueros positivos anti-PE que no reaccionaron con PE-HMWK o PE-LMWK se sugirió que reconocen el factor XI o precalicreína, la cual normalmente se enlaza con HMWK (Sugi y Mclntyre, 1995; incorporada en la presente mediante referencia) . La validez de estos resultados fue confirmada mostrando que la HMWK intacta se enlaza con varios fosfolípidos, tales como cardiolipina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina; pero que los anticuerpos anti-PE reconocen solamente un complejo kininógeno-PE, y no reconocen quininógenos presentados con otros sustratos de fosfolípidos (Sugi y Mclntyre; 1996a; incorporada en la presente mediante referencia) . Esto indica que PE induce cambios de conformación antigénicos únicos en los quininógenos que no son inducidos con los quininógenos enlazados con otros fosfolípidos (Sugi y Mclntyre, 1996a) .

Se ha demostrado además que los quininógenos pueden enlazarse con las plaquetas en virtud de la PE expuesta en la membrana de la plaqueta (Sugi y Mclntyre, 1996b; incorporada en la presente mediante referencia) . Se mostró que anti-PE dependiente de quininógeno añadido exógenamente aumenta la agregación de plaquetas inducida por trombina in vi tro, pero no altera la agregación inducida de ADP (Sugi y Mclntyre, 1996b; incorporada en la presente mediante referencia) . En cambio, anti-PE independiente de kininógeno, que reconoce a PE en sí, se reportó que no aumentan la agregación de plaquetas inducida por trombina. De este modo se propuso que el anti-PE dependiente de kininógeno puede interrumpir los efectos anti-trombóticos normales del kininógeno (Sugi y Mclntyre, 1996b; incorporada en la presente mediante referencia) . Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos de pacientes humanos por lo tanto son una mezcla de anticuerpos que generalmente reconocen los aminofosfolípidos estabilizados por interacciones de proteína (Rote, 1996) . Los anticuerpos se pueden enlazar con epítopes de fosfolípido estabilizados, o se pueden enlazar con un epítope formado a partir de la interacción del fosfolípido y los aminoácidos en la proteína estabilizante (Rote, 1996) . De cualquier modo, estos anticuerpos claramente reconocen los aminofosfolípidos en membranas naturales en el cuerpo humano, probablemente asociadas con proteínas del plasma (McNeil y colaboradores, 1990; Bevers y colaboradores, 1991). Estos anticuerpos serían adecuados como materiales iniciales para generar un anticuerpo para su uso en las construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas de la presente invención. Para preparar un anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de un paciente humano, simplemente se obtendrían linfocitos humanos a partir de un individuo que tenga anticuerpos anti-aminofosfolípidos, por ejemplo, a partir de la sangre periférica humana, el bazo, los ganglios linfáticos, las amígdalas o similares, utilizando técnicas que son muy conocidas para los expertos en la técnica. El uso de linfocitos de la sangre periférica frecuentemente se prefiere. Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden obtener a partir de los linfocitos humanos que producen los anticuerpos anti-aminofosfolípidos deseados inmortalizando los linfocitos humanos, generalmente de la misma manera que se describe anteriormente para generar cualquier anticuerpo monoclonal. Las reactividades de los anticuerpos en los sobrenadantes de los cultivos generalmente se verifican primero, empleando uno o más antígenos de aminofosfolípido seleccionados, y los linfocitos que exhiben alta reactividad se cultivan. Los linfocitos resultantes se fusionan con una línea padre de origen humano o de ratón, y mayor selección da las clonas óptimas. La recuperación de los anticuerpos monoclonales a partir de las células inmortalizadas se puede lograr mediante cualquier método generalmente empleado en la producción de anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal deseado se puede obtener clonando el linfocito inmortalizado mediante el método de dilución limitante o similar, seleccionando la célula que produce el anticuerpo deseado, cultivando las células seleccionadas en un medio o en la cavidad abdominal de un animal, y recuperando el anticuerpo monoclonal deseado a partir del sobrenadante del cultivo o ascites . Esas técnicas se han usado, por ejemplo, para aislar anticuerpos monoclonales humanos para epítopes de Pseudomonas aeuriginosa (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,196,337 y 5,252,480, cada una incorporada en la presente mediante referencia) ; polisacáridos capsulares de fosfato de polirribosilrribitol (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,954,449, incorporada en la presente mediante referencia); antígeno Rh(D) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,665,356, incorporada en la presente mediante referencia) ; y virus, tales como el virus de inmunodeficiencia humana, el virus sincicial respiratorio, virus de herpes símplex, virus de varicela zóster y citomegalovirus (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,652,138; 5,762,905 y 4,950,595, cada una incorporada en la presente mediante referencia) .

La aplicabilidad de las técnicas anteriores para la generación de anticuerpos anti-aminofosfolípidos humanos es clara. Rauch y colaboradores (1986; incorporada en la presente mediante referencia) generalmente usó estos métodos para producir hibridomas fusionando los linfocitos de pacientes de SLE con una línea de linfoblastoide . Esto produjo anticuerpos humanos que se enlazan con fosfolípidos en fase hexagonal, incluyendo formas naturales y sintéticas de la fosfatidiletanolamina (Rauch y colaboradores 1986; incorporada en la presente mediante referencia) . Adicionalmente, los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,648,077 (incorporada en la presente mediante referencia) se pueden usar para formar un trioma o un cuadroma que produce un anticuerpo humano contra un aminofosfolípido seleccionado. En un sentido general, una línea celular de hibridoma que comprende una célula inmortalizante de roedor padre, tal como una célula de mieloma murino, por ejemplo, SP-2, se fusiona con una célula compañera humana, dando como resultado una célula de hibridoma xenogénico inmortalizante. Esta célula de hibridoma xenogénico se fusiona con una célula capaz de producir un anticuerpo humano anti-aminofosfolípido, dando como resultado una línea de célula de trioma capaz de generar anticuerpo humano efectivo contra ese antígeno en un humano. Alternativamente, cuando se desea mucha estabilidad, se hace una línea celular de trioma, la cual preferiblemente ya no tiene la capacidad de producir su propio anticuerpo, y este trioma se fusiona entonces con otra célula capaz de producir un anticuerpo útil contra el antígeno de aminofosfolípido para obtener un hibridoma todavía más estable (cuadroma) que produce anticuerpo contra el antígeno. E5. Anticuerpos Anti-aminofosfolípidos a Partir de Linfocitos Humanos. La inmunización in vi tro, o la estimulación de antígeno, también se puede usar para generar un anticuerpo anti-aminofosfolípido humano. Estas técnicas se pueden usar para estimular los linfocitos de sangre periférica, tanto de pacientes humanos que producen anticuerpos anti-aminofosfolípidos, y también de sujetos sanos, normales. Sin duda, Vlachoyiannopoulos y colaboradores (1993; incorporada en la presente mediante referencia) reportaron que anticuerpos anti-aminofosfolípidos de baja titulación se presentan en sujetos normales. Aun si esto no fuera el caso, los anticuerpos anti-aminofosfolípidos se pueden preparar a partir de sujetos humanos sanos, simplemente estimulando las células que producen anticuerpos con aminofosfolípidos in vi tro. Esta "inmunización in vi tro" implica la activación específica de antígeno de linfocitos B no inmunizados, generalmente dentro de una población mezclada de linfocitos (cultivos de linfocitos mezclados, MLC) . Las inmunizaciones in vi tro también se pueden soportar por el cultivo de células B y el factor de diferenciación y las linfocinas. Los anticuerpos producidos por estos métodos frecuentemente son anticuerpos IgM (Borrebaeck y colaboradores, 1986; incorporada en la presente mediante referencia) . Otro método se ha descrito (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,681,729, incorporada en la presente mediante referencia) , en donde los linfocitos humanos que principalmente producen anticuerpos IgG (ó IgA) se pueden obtener. El método implica, en un sentido general, trasplantar linfocitos humanos a un animal inmunodeficiente, de manera que los linfocitos humanos "toman" en el cuerpo del animal; inmunizar el animal con un antígeno deseado, de manera que genere linfocitos humanos que produzcan un anticuerpo específico al antígeno; y recuperar los linfocitos humanos produciendo el anticuerpo a partir del animal. Los linfocitos humanos así producidos se pueden usar para producir un anticuerpo monoclonal inmortalizando los linfocitos humanos que producen el anticuerpo, clonando los linfocitos originados humanos inmortalizados obtenidos que producen el anticuerpo, y recuperando un anticuerpo monoclonal específico al antígeno deseado a partir de los linfocitos originados humanos inmortalizados clonados. Los animales inmunodeficientes que se pueden emplear en esta técnica son aquellos que no exhiben rechazo cuando los linfocitos humanos se trasplantan a los animales. Estos animales se pueden preparar artificialmente mediante tratamientos físicos, químicos o biológicos. Se puede emplear cualquier animal inmunodeficiente . Los linfocitos humanos se pueden obtener a partir de sangre periférica humana, bazo, ganglios linfáticos, amígdalas o similares. La "toma" de los linfocitos humanos trasplantados en los animales se puede alcanzar únicamente adminis rando los linfocitos humanos a los animales. La ruta de administración no se restringe y puede ser, por ejemplo, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal. La dosis de linfocitos humanos no se restringe, y usualmente puede ser 106 hasta 108 linfocitos por animal. El animal inmunodeficiente se inmuniza entonces con el antígeno de aminofosfolípido deseado. Después de la inmunización, los linfocitos humanos se recuperan de la sangre, el bazo, los ganglios linfáticos u otros tejidos linfáticos mediante cualquier método convencional. Por ejemplo, las células mononucleares se pueden separar mediante el método de centrifugación Ficoll-Hypaque (gravedad específica: 1.077), y los monocitos recuperados por el método de adsorción de plato de plástico. Las células contaminantes que se originan del animal inmunodeficiente se pueden remover usando un antisuero específico a las células del animal. El antisuero se puede obtener, por ejemplo, inmunizando un segundo animal distinto con las células del bazo del animal inmunodeficiente, y recuperando el suero del animal inmunizado distinto. El tratamiento con el antisuero se pude llevar a cabo en cualquier etapa. Los linfocitos humanos también se pueden recuperar mediante un método inmunológico empleando una inmunoglobulina humana expresada en la superficie de la célula como un marcador. Mediante estos métodos, se pueden obtener linfocitos humanos que principalmente producen anticuerpos IgG e IgA específicos a uno o más aminofosfolípidos seleccionados. Los anticuerpos monoclonales se obtienen entonces a partir de linfocitos humanos mediante inmortalización, selección, crecimiento celular y producción de anticuerpos. E6. Ratones Transgénicos que Contienen Bibliotecas de Anticuerpos Humanos . La tecnología recombinante ahora está disponible para la preparación de anticuerpos. Además de las bibliotecas de expresión de fagos de inmunoglobulina combinatorias descritas anteriormente, otro enfoque de clonación molecular es preparar anticuerpos a partir de ratones transgénicos que contienen bibliotecas de anticuerpos humanos. Estas técnicas se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,545,807, incorporada en la presente mediante referencia. En un sentido más general, estos métodos implican la producción de un animal transgénico que ha insertado en su línea germinal de material genético que codifica para cuando menos parte de una inmunoglobulina de origen humano, o que puede rearreglar para codificar un repertorio de inmunoglobulinas. El material genético insertado se puede producir a partir de una fuente humana, o se puede producir sintéticamente. El material puede codificar cuando menos parte de una inmunoglobulina conocida, o puede modificarse para codificar cuando menos parte de una inmunoglobulina alterada. El material genético insertado se expresa en el animal transgénico, dando como resultado la producción de una inmunoglobulina derivada cuando menos en parte del material genético de inmunoglobulina humana insertado. Se encuentra que el material genético se reacomoda en el animal transgénico, de manera que un repertorio de inmunoglobulinas con parte o partes derivadas del material genético insertado se puede producir, aun si el material genético insertado se incorpora en la línea germinal en la posición incorrecta, o con la geometría incorrecta. El material genético insertado puede estar en forma de ADN clonado en vectores procarióticos, tales como plásmidos y/ó cósmidos . Los fragmentos de ADN más grandes se insertan usando vectores de cromosoma artificial de levadura (Burke y colaboradores, 1987; incorporada en la presente mediante referencia) , o mediante la introducción de fragmentos de cromosomas (Richer y Lo, 1989; incorporada en la presente mediante referencia) . El material genético insertado se puede introducir a la hospedera de manera convencional, por ejemplo, mediante la inyección u otros procedimientos en huevos fertilizados o en células de tallo embriónico. En aspectos preferidos, un animal hospedero que inicialmente no lleva el material genético que codifica regiones constantes de inmunoglobulina se utiliza, de manera que el animal transgénico resultante usará solamente el material genético humano insertado cuando produce inmunoglobulinas. Esto se puede lograr, ya sea, usando un hospedero mutante que se presente naturalmente, que carece del material genético relevante, o haciendo artificialmente mutantes, por ejemplo, en líneas celulares finalmente para crear un hospedero, a partir del cual el material genético relevante se ha removido. Cuando el animal huésped lleva material genético que codifica regiones constantes de inmunoglobulina, el animal transgénico llevará el material genético que se presenta naturalmente y el material genético insertado, y producirá inmunoglobulinas derivadas del material genético que se presenta naturalmente, el material genético insertado, y mezclas de ambos tipos de material genético. En este caso, la inmunoglobulina deseada se puede obtener seleccionado hibridomas derivados del animal transgénico, por ejemplo, explotando el fenómeno de la exclusión alélica de la expresión del gen de anticuerpo o la pérdida de cromosoma diferencial. En cuanto se ha preparado un animal transgénico conveniente, el animal simplemente se inmuniza con el inmunógeno deseado. Dependiendo de la naturaleza del material insertado, el animal puede producir una inmunoglobulina quimérica, por ejemplo, de origen de ratón/humano mezclados, en donde el material genético de origen extraño codifica solamente parte de la inmunoglobulina; o el animal puede producir una inmunoglobulina completamente extraña, por ejemplo, de origen completamente humano, en donde el material genético del origen extraño codifica una inmunoglobulina entera. Se puede producir antisuero policlonal a partir del animal transgénico después de la inmunización. Las células que producen inmunoglobulina se pueden remover del animal para producir la inmunoglobulina de interés. Preferiblemente, se producen anticuerpos monoclonales a partir del animal transgénico, por ejemplo, fusionando células del bazo a partir del animal con células de mieloma y seleccionando los hibridomas resultantes para elegir aquellos que producen el anticuerpo deseado. En la presente se describen técnicas adecuadas para estos procesos . En un enfoque alternativo, el material genético se puede incorporar en el animal, de manera que el anticuerpo deseado se produce en los fluidos corporales, tales como suero o secreciones externas del animal, tales como leche, calostro o saliva. Por ejemplo, insertando material genético in vi tro que codifica cuando menos parte de una inmunoglobulina humana en un gen de codificación de un mamífero para una proteína de la leche y luego introducir el gen a un huevo fertilizado del mamífero, por ejemplo, mediante inyección, el huevo puede desarrollarse en un mamífero hembra adulto que produce leche que contiene inmunoglobulina derivada cuando menos en parte del material genético de inmunoglobulina humana insertada. El anticuerpo deseado se puede cosechar a partir de la leche. Las técnicas convenientes para llevar a cabo estos procesos se conocen por los expertos en la técnica. Los animales transgénicos anteriores usualmente se emplean para producir anticuerpos humanos de un solo isotipo, más específicamente un isotipo que es esencial para la maduración de las células B, tales como IgM y posiblemente IgD. Otro método preferido para producir anticuerpos anti-aminofosfolípido humanos es usar la tecnología descrita en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 y 5,770,429; cada una incorporada en la presente mediante referencia, en donde se describen animales transgénicos que son capaces de cambiar de un isotipo necesario para el desarrollo de las células B a otros isotipos. En el desarrollo de un linfocito B, la célula inicialmente produce IgM con una especificidad de enlace determinado por las regiones productivamente rearregladas VH y VL. Posteriormente, cada célula B y sus células de progenie sintetizan anticuerpos con las mismas regiones V de cadenas L y H, pero pueden cambiar el isotipo de la cadena H. El uso de regiones constantes mu o delta está muy determinado por separación alterna, permitiendo que se coexpresen IgM e IgD en una sola célula. Los otros isotipos de cadena pesada (gamma, alfa y epsilón) solamente se expresan originalmente después de que el evento de rearreglo del gen borra los exones mu C y delta C. Este proceso de rearreglo de genes, denominado cambio de isotipo, típicamente se presenta por la recombinación entre los llamados segmentos de cambio localizado inmediatamente corriente arriba de cada gen de cadena pesada (excepto delta) . Los segmentos de cambio individuales tienen entre 2 y 10 kb de longitud, y consisten principalmente en secuencias repetidas cortas . Por estas razones, es preferible que los transgenes incorporen secuencias reguladoras de transcripción dentro de aproximadamente 1-2 kb corriente arriba de cada región de cambio que se va a utilizar para el cambio de isotipo. Estas secuencias reguladoras de transcripción preferiblemente incluyen un promotor y un elemento mejorador, y más preferiblemente incluyen la región de flanqueo 5' (es decir, corriente arriba) que se asocia naturalmente (es decir, se presenta en la configuración de línea germinal) con una región de cambio. Aunque una secuencia de franqueo 5' a partir de una región de cambio se puede enlazar operablemente a una región de cambio diferente para la construcción del transgén, en algunas modalidades se prefiere que cada región de cambio incorporada en la construcción de transgén tenga una región de flanqueo 5 ' que se presenta inmediatamente corriente arriba en la configuración de línea germinal que se presenta naturalmente. La información de secuencia relacionada con la secuencias de regiones de cambio de inmunoglobulina se conocen (Mills y colaboradores, 1990; Síderas y colaboradores, 1989; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . En el método descrito en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 y 5,770,429, los transgenes de inmunoglobulinas humanas contenidos dentro del animal transgénico funcionan correctamente a través de la senda del desarrollo de célula B, conduciendo al cambio de isotipos. De conformidad con lo anterior, en este método, estos transgenes se construyen para producir cambio de isotipo y uno o más de lo siguiente: (1) nivel alto de expresión específica de tipo de célula, (2) rearreglo de gen funcional, (3) activación de y respuesta a la exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señal, (6) hipermutación somática, y (7) dominio de lugar de anticuerpo de transgén durante la respuesta inmune . Un requisito importante para la función de transgén es la generación de un repertorio de anticuerpos primario que sea suficientemente diverso para disparar una segunda respuesta inmune para un rango amplio de antígenos. El gen de cadena pesada rearreglado consiste en un exón de péptido de señal, un exón de región variable y un arreglo en línea de regiones de regiones constantes de dominios múltiples, cada una de las cuales se codifica por o varios exones. Cada uno de los genes de región constante codifica la porción constante de una clase diferente de inmunoglobulinas. Durante el desarrollo de las células B, las regiones constante proximales a la región V se borran conduciendo la expresión de nuevas clases de cadenas pesadas. Para cada clase de cadena pesada, patrones alternativos de separación de ARN dan lugar tanto a transmembrana como a inmunoglobulinas secretadas. El lugar de cadena pesado humano consiste en aproximadamente 200 segmentos de gen V que se extienden 2 Mb, aproximadamente 30 segmentos de gen D que se extienden aproximadamente 40 kb, seis segmentos J en ramificación con una extensión de 3 kb, y nueve segmentos de gen de región constante esparcidos sobre aproximadamente 300 kb. El lugar entero se extiende aproximadamente 2.5 Mb de la porción distal del brazo largo del cromosoma 14. Los fragmentos de transgén de cadena pesada que contienen miembros de los seis de las familias VH conocidas, los segmentos de gen D y J, así como las regiones constantes mu, delta, gamma 3, gamma 1 y alfa 1 se conocen (Berman y colaboradores 1988; incorporada en la presente mediante referencia) . Los fragmentos genómicos que contienen todos los segmentos de gen necesarios y las secuencias reguladoras a partir de un lugar de cadena ligera humana se construyen similarmente. La expresión de transgenes pesados y ligeros de inmunoglobulina rearreglados con éxito usualmente tiene un efecto dominante suprimiendo el rearreglo de los genes de inmunoglobulina endógenos en el animal no humano transgénico. Sin embargo, en ciertas modalidades, es deseable efectuar La inactivación completa de los lugares Ig endógenos, de manera que las cadenas de inmunoglobulina híbrida que comprenden una región variable humana y una región constante no humana (por ejemplo, murina) no se pueden formar, por ejemplo, mediante el trans-cambio entre el transgén y las secuencias de Ig endógenas. Usando tecnología de célula de tallo embriónico y recombinación homologa, el repertorio de inmunoglobulinas endógenas se puede eliminar fácilmente. Además, la supresión de los genes de inmunoglobulina endógena se puede llevar a cabo usando una variedad de técnicas, tales como tecnología antisentido. En otros aspectos de la invención, puede ser deseable producir una inmunoglobulina trans-cambiada . Los anticuerpos que comprenden estas inmunoglobulinas trans-cambiadas quiméricas se pueden usar para una variedad de aplicaciones en donde es deseable tener una región constante no humana (por ejemplo, murina), por ejemplo, para la retención de funciones efectoras en la hospedera. La presencia de una región constante murina puede presentar ventajas sobre una región constante humana, por ejemplo, para proporcionar funciones efectoras murinas (por ejemplo, fijación de complemento murino, CCDA) , de manera que este anticuerpo quimérico se puede probar en un modelo de enfermedad de ratón. Después de probar el animal, la secuencia de codificación de la región variable humana se puede aislar, por ejemplo, mediante amplificación de reacción de cadena de polimerasa o clonación de ADNc a partir de la fuente (clona de hibridoma) , y separar en una secuencia que codifica una región constante humana deseada para codificar un anticuerpo de secuencia humana más conveniente para uso terapéutico humano. E7. Anticuerpos Anti-aminofosfolípidos Humanizados Los anticuerpos humanos generalmente tienen cuando menos tres ventajas potenciales para su uso en la terapia humana. Primero, debido a que la porción efectora es humana, puede interactuar mejor con las otras partes del sistema inmune humano, por ejemplo, para destruir células objetivo más eficientemente por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (CCDA) . Segundo, el sistema inmune humano no deberá reconocer el anticuerpo como extraño. Tercero, la vida media en la circulación humana será similar a los anticuerpos humanos que se presentan naturalmente, permitiendo que se den dosis más pequeñas y menos frecuentes . Varios métodos para preparar anti-aminofosfolípidos se proporciona en la presente. Además de los anticuerpos humanos, los anticuerpos "humanizados" tienen muchas ventajas. Los anticuerpos "humanizados" generalmente son anticuerpos monoclonales quiméricos o mutantes de ratón, rata, hámster, conejo u otras especies, que llevan dominios de regiones variables y/ó constantes humanas o cambios específicos. Las técnicas para generar un anticuerpo anti-aminofosfolípido denominado "humanizado" son muy conocidas para los expertos en la técnica. Los anticuerpos humanizados también comparten las siguientes ventajas. Primero, la porción efectora todavía es humana. Segundo, el sistema inmune humano no deberá reconocer la estructura o región constante como extraña, y po_ lo tanto, la respuesta de anticuerpo contra este anticuerpo inyectado deberá ser menor que contra un anticuerpo de ratón extraño totalmente. Tercero, los anticuerpos humanizados inyectados, en oposición con los anticuerpos de ratón inyectados, presumiblemente tendrán una vida media más similar a los anticuerpos humanos que se presentan naturalmente, permitiendo también dosis más pequeñas y menos frecuentes. Varios métodos se han descrito parei producir anticuerpos humanizados. El rearreglo controlado de dominios de anticuerpos unidos a través de enlaces de disulfuro de proteínas para formar moléculas de proteínas nuevas, artificiales, o anticuerpos "quiméricos" se pueden utilizar (Konieczny y colaboradores, 1981; incorporada en la presente mediante referencia) . La tecnología de ADN recombinante también se puede usar para construir fusiones de genes entre las secuencias de ADN que codifican dominios de cadenas ligeras y pesadas variables de anticuerpos de ratón y dominios constantes de cadenas y ligeras de pesadas de anticuerpos humanos (Morrison y colaboradores, 1984; incorporada en la presente mediante referencia) . Las secuencias de ADN que codifican las porciones de enlace de antígeno o las regiones de determinación de complementariedad (RDC) de los anticuerpos monoclonales murinos se pueden injertar mediante medios moleculares en las secuencias de ADN que codifican las estructuras de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos humanos (Jones y colaboradores 1986; Riechmann y colaboradores, 1988; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Los productos recombinantes expresados se denominan anticuerpos humanizados o "reformados", y comprenden la estructura de una cadena ligera o pesada de anticuerpos humanos y las porciones de reconocimiento de antígenos, RDC, de un anticuerpo monoclonal murino. Otro método para producir anticuerpos humanizados se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,639,641, incorporada en la presente mediante referencia. El método proporciona, vía renovar la superficie, anticuerpos de roedores humanizados que tienen eficacia terapéutica mejorada debido a la presentación de una superficie humana en la región variable. En el método: (1) alineaciones de posiciones de un depósito de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos se genera para dar un conjunto de porciones expuestas de superficie de estructura de región variable de cadena pesada y ligera, en donde las posiciones de alineación para todas las regiones variables son cuando menos 98 por ciento aproximadamente idénticas; (2) un conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie de estructura de región variable de cadena pesada y ligera se define para un anticuerpo de roedor (ó fragmento del mismo) ; (3) un conjunto de residuos _ de aminoácidos expuestos en superficie de la estructura de la región variable de cadena pesada y ligera que es casi idéntica al conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie del roedor se identifica; (4) el conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie de la estructura de la región variable de cadena pesada y ligera definidos en el paso (2) se sustituye con el conjunto de residuos de aminoácidos expuestos en superficie de la estructura de la región variable de cadena pesada y ligera identificada en el paso (3), excepto para los residuos de o aminoácidos que están dentro de 5A de cualquier átomo de cualquier residuo en las regiones de determinación complementarias del anticuerpo de roedor; y (5) el anticuerpo de roedor humanizado que tiene especificidad de enlace se produce. Un método similar para la producción de anticuerpos humanizados se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 y 5,530,101, cada una incorporada en la presente mediante referencia. Estos métodos implican producir inmunoglobulinas humanizadas que tienen una o más regiones de determinación de complementariedad (RDC) y aminoácidos adicionales posibles a partir de una inmunoglobulina de donador y una región de estructura a partir de una inmunoglobulina humana de aceptación. Cada cadena de inmunoglobulina humanizada usualmente comprende, además de la región de determinación de complementariedad, aminoácidos de la estructura de inmunoglobulina de donador que son capaces de interactuar con las regiones de determinación de complementariedad para efectuar afinidad de enlace, tales como uno o más aminoácidos que están inmediatamente adyacentes a una región de determinación de complementariedad en la inmunoglobulina donadora o aquéllas dentro de aproximadamente 3A predichas por modelación molecular. Las cadenas pesada y ligera se pueden diseñar usando cualquiera, o cualquier combinación, o todos los criterios de posición distintos descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 y 5,530,101, cada una incorporada en la presente mediante referencia. Cuando se combina en un anticuerpo intacto, las inmunoglobulinas humanizadas son sustancialmente no inmunogénicas en humanos y retienen sustancialmente la misma afinidad que la inmunoglobulina donadora al antígeno original. Un método adicional para producir anticuerpos humanizados se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,565,332 y 5,733,743, cada una incorporada en la presente mediante referencia. Este método combina el concepto de anticuerpos humanizantes con las bibliotecas de fagémidos también descritas en detalle en la presente. En un sentido general, el método utiliza secuencias del sitio de enlace de antígenos de un anticuerpo o población de anticuerpos dirigidos contra un antígeno de interés. De este modo para un solo anticuerpo de roedor, las secuencias que comprenden parte del sitio de enlace del antígeno del anticuerpo se pueden combinar con diversos repertorios de secuencias de anticuerpos humanos que pueden, en combinación, crear un sitio de enlace de antígeno completo. Los sitios de enlace de antígeno creados por este proceso difieren de los creados por injerto en región de determinación de complementariedad, porque solamente la porción de secuencias del anticuerpo de roedor original es probable que haga contactos con el antígeno de una manera similar. Las secuencias humanas seleccionadas probablemente difieren en secuencia y hacen contactos alternativos con el antígeno de aquellos del sitio de enlace original. Sin embargo, las restricciones impuestas por el enlace de la porción de la secuencia original al antígeno y las formas del antígeno y sus sitios de enlace de antígeno, probablemente conduzcan a nuevos contactos de las secuencias humanas con la misma región o epítope del antígeno. Este proceso por lo tanto se ha denominado "selección impresa de epítope" (SIE) . Iniciando con un anticuerpo animal, un proceso da resultado en la selección de anticuerpos que son parcialmente anticuerpos humanos. Estos anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos que se van a usar directamente en terapia o después de la alteración de algunos estudios claves. Las diferencias de secuencia entre el componente roedor del anticuerpo seleccionado con las secuencias humanas podría minimizarse reemplazando aquellos residuos que difieren con los residuos de secuencias humanas, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio de residuos individuales, o por injerto en región de determinación de complementariedad de ciclos enteros. Sin embargo, los anticuerpos con secuencias enteramente humanas también se pueden crear. La selección impresa de epítopes por lo tanto ofrece un método para hacer anticuerpos parcialmente humanos o enteramente humanos que se enlazan al mismo epítope que él animal o al mismo epítope que los anticuerpos . animales o parcialmente humanos, respectivamente. En la selección impresa de epítope, los repertorios de fragmentos de anticuerpos se pueden desplegar en la superficie de la fase filamentos y los genes que codifican fragmentos con actividades de enlace' de antígenos seleccionados por el enlace del fago al antigeno. Métodos adicionales para humanizar anticuerpos contemplados para su uso en la presente invención se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,750,078; 5,502,167; 5,705,154; 5,770,403; 5,698,417; 5,693,493; 5,558,864; 4,935,496 y 4,816,567, cada una incorporada en la presente mediante referencia. E8. Mutagénesis por Reacción de Cadena de Polimerasa La mutagénesis específica del sitio es una técnica útil en la preparación de anticuerpos individuales a través de mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica además proporciona una capacidad lista para preparar y variantes de secuencia de prueba, que incorporan una o más de las siguientes consideraciones, ya sea humanizando o no, introduciendo uno o más cambios de secuencias de nucleótidos en el ADN. Aunque muchos métodos son convenientes para su uso en mutagénesis, el uso de la reacción de cadena de polimerasa (PCRMR) se prefiere generalmente. Esta tecnología ofrece un método rápido y eficiente para introducir las mutaciones deseadas en una secuencia de ADN dada. El siguiente texto particularmente describe el uso de reacción de cadena de polimerasa para introducir mutaciones puntuales en una secuencia, como se puede usar para cambiar el aminoácido codificado por la secuencia dada. Las adaptaciones de este método también son convenientes para introducir sitios de enzimas de restricción en una molécula de ADN. En este método, los oligonucleótidos sintéticos se diseñan para incorporar una mutación puntual en un extremo de un segmento amplificado. Después de la reacción de cadena de polimerasa, los fragmentos amplificados se les achata el extremo tratándolos con fragmentos de Klenow, y los fragmentos con extremo achatado se ligan y subclonan en un vector para facilitar el análisis de la secuencia. Para preparar el ADN en plantilla que se desea mutagenizar, el ADN se subclona en un vector de alto número de copias, tal como pUC19, usando sitios de restricción que flanquean las áreas que se van a mutar. El ADN en plantillas se prepara usando una minipreparación de plásmido. Los cebadores de oligonucleótidos adecuados que se basan en la secuencia padre, pero que contienen la mutación puntual deseada y que están flanqueados en el extremo 5 ' por un sitio de enzima de restricción, se sintetizan usando un sintetizador automatizado. Generalmente se requiere que el cebador sea homólogo al ADN en plantilla por aproximadamente 15 bases o algo así. Los cebadores se pueden purificar mediante electroforesis de gel de poliacrilamida desnaturalizante, aunque esto no es absolutamente necesario para su uso en la reacción de cadena de polimerasa. El extremo 5' de los oligonucleótidos deberán entonces ser fosforilados. El ADN en plantilla deberá ser amplificado por reacción de cadena de polimerasa, usando los cebadores de oligonucleótidos que contienen las mutaciones puntuales deseadas. La concentración de MgCl2 en el regulador de amplificación generalmente será de aproximadamente 15 mM. Generalmente aproximadamente 20-25 ciclos de reacción de cadena de polimerasa deberá llevarse a cabo como sigue: desnaturalización, 35 segundos a 95°C; hibridización, 2 minutos a 50°C; y extensión, 2 minutos a 72°C. La reacción de cadena de polimerasa generalmente incluirá un último ciclo de extensión de aproximadamente 10 minutos a 72 °C. Después del paso de extensión final, aproximadamente 5 unidades de fragmentos de Klenow deberán añadirse a la mezcla de la reacción e incubarse durante otros 15 minutos a aproximadamente 30°C. La actividad exonucleasa de los fragmentos de Klenow se requiere para hacer que los extremos se laven y conveniente para clonación de extremo romo . La mezcla de la reacción resultante generalmente deberá ser analizada por electroforesis en gel de acrilamida o agarosa no desnaturalizante para verificar que la amplificación ha producido el producto predicho. Luego se procesaría la mezcla de la reacción removiendo la mayoría de los aceites minerales, extrayendo con cloroformo para remover el aceite restante', extrayendo con fenol regulado y luego concentrando mediante precipitación con 100 por ciento de etanol. Enseguida, se digeriría aproximadamente la mitad de los fragmentos amplificados con una enzima de~ restricción que corta en las secuencias de flanqueo usadas en los oligonucleótidos. Los fragmentos digeridos se purifican en un gel de agarosa de baja gelificación/fusión. Para subclonar los fragmentos y verificar la mutación puntual, se subclonarían los dos fragmentos amplificados en un vector adecuadamente digerido por ligación de extremo romo. Esto se usaría para transformar E. coli , a partir de la cual el ADN del plásmido subsecuentemente podría prepararse usando una minipreparación. La porción amplificada del ADN de plásmido se analizaría entonces mediante secuenciamiento de ADN para confirmar que se generó la mutación puntual correcta. Esto es importante, ya que la polimerasa de ADN Taq puede introducir mutaciones adicionales en los fragmentos de ADN. La introducción de una mutación puntual también se puede efectuar usando pasos secuenciales de reacción de cadena de polimerasa. En este procedimiento, los dos fragmentos que abarcan la mutación se recuecen entre sí y se extienden mediante síntomas cebadora mutua. Este fragmento se amplifica luego mediante un segundo paso de reacción de cadena de polimerasa, evitando mediante esto la ligación de extremo romo requerida en el protocolo anterior. En este método, la preparación del ADN en plantilla, la generación de los cebadores de oligonucleótidos y la primera amplificación de reacción de cadena de polimerasa se realizan como se describió anteriormente. Sin embargo, en este proceso los oligonucleófidos elegidos deberán ser homólogos al ADN de plantilla para un tramo de aproximadamente entre 15 y 20 bases, y deberá también traslaparse entre sí en aproximadamente 10 bases o más . En la segunda amplificación por reacción de cadena de polimerasa, se usaría cada fragmento amplificado y cada cebador de secuencia de flanqueo y llevaría reacción de cadena de polimerasa durante aproximadamente 20 y aproximadamente 25 ciclos, usando las condiciones que se describieron anteriormente. De nuevo se subclonarían los fragmentos y verificarla que la mutación puntual fue correcta usando los pasos delineados anteriormente. Al usar cualquiera de los métodos anteriores, se prefiere generalmente introducir la mutación amplificando un fragmento tan pequeño como sea posible. Desde luego, los parámetros tales como la temperatura de fusión del oligonucleótido, como generalmente será influenciado por el contenido de GC y la longitud del oligo, deberá considerarse cuidadosamente. La ejecución de estos métodos, y su optimización, si es necesario, será conocido para los expertos en la técnica, y se describirá adicionalmente en distintas publicaciones, tales como Current Protocols in Molecular Biology, 1995, incorporada en la presente mediante referencia. Cuando se realiza mutagénesis específica del sitio, se puede emplear la Tabla A como una referencia.

TABLA A Aminoácidos Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Acido aspártico Asp D GAC GAU Acido glutámico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina lie I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACÁ ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptófano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU E9. Fragmentos de anticuerpos Independientemente de la fuente del anticuerpo anti-aminofosfolípido original, ya sea el anticuerpo intacto, multímeros del anticuerpo, o cualquiera de una variedad de regiones de enlace de antígeno funcionales del anticuerpo se puede usar en la presente invención. Las regiones funcionales ejemplares incluyen fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab y F(ab')2 de los anticuerpos anti-aminofosfolípidos. Las técnicas para preparar estas construcciones son muy conocidas para los expertos en la técnica y se ejemplifican adicionalmente en la presente. La elección de construcción de anticuerpo puede estar influenciada por varios factores. Por ejemplo, la vida media prolongada puede ser resultado de la readsorción activa de anticuerpos intactos dentro del riñon, una propiedad de la pieza Fc de la inmunoglobulina. Los anticuerpos basados en IgG, porlo tanto, se espera que exhiban aclaramiento de sangre más pequeño que sus contrapartes Fab' . Sin embargo, las composiciones basadas en fragmentos Fab' generalmente exhibirán una capacidad mejor de penetración de tejido. Los fragmentos Fab se pueden obtener mediante la proteolisis de la inmunoglobulina entera mediante la tiol prot'easa no específica, papaína. La papaína primero se debe activar reduciendo el grupo sulfhidrilo en el sitio activo con cisteína, 2 -mercaptoetanoi o ditiotreitol. Los metales pesados en la encima de material podrían removerse mediante quelación con AEDT (2 mM) para asegurar la máxima actividad de enzima. La enzima y el sustrato normalmente se mezclan entre sí en una proporción de 1:100 en peso. Después de la incubación, la reacción se puede detener mediante alquilación irreversible del grupo tiol con yodoacetamida o simplemente mediante diálisis. Deberá supervisarse la finalización de la digestión mediante SDS-PAGE y las fracciones distintas separarse mediante cromatografía por intercambio de iones o proteína A Sefarosa. El procedimiento usual para la preparación de fragmentos F(ab')2 a partir de IgG de origen de conejo y humano se limita a la proteólisis mediante la enzima pepsina. Las condiciones, 100 veces exceso de anticuerpo peso/peso en regulador de acetato con pH 4.5, 37°C, sugiere que el anticuerpo se disocia en el lado de la terminal C del enlace disulfuro de la cadena interpesada. Las tasas de digestión de la IgG de ratón pueden variar con la subclase y puede ser difícil obtener producciones altas de fragmentos F(ab')2 activos sin alguna IgG sin digerir o completamente degradada. En particular, IgG2b es muy susceptible a la degradación completa. Las otras subclases requieren diferentes condiciones de incubación para producir resultados óptimos, todo lo cual se conoce en la técnica. La digestión de IgG de rata por pepsina requiere condiciones que incluyen diálisis en 0.1 M de regulador de acetato, pH 4.5, y luego incubación durante cuatro horas con 1 por ciento peso/peso de pepsina; la digestión de IgGx e IgG2a se mejora si primero se dializa contra 0.1 M de regulador de formato, pH 2.8, a 4°C, durante 16 horas seguido de regulador de acetato. IgG2b da resultados más consistentes con la incubación en proteasa V8 de estafilococos (3 por ciento peso/peso) en 0.1 M de regulador de fosfato de sodio, pH 7.8, durante cuatro horas a 37°C. Las siguientes patentes y solicitudes de patentes se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para los fines de suplementar aún adicionalmente las presentes enseñanzas con respecto a la preparación y uso de regiones de enlace de antígeno, funcionales de anticuerpos, incluyendo los fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab y F(ab')2 de los anticuerpos anti-aminofosfolípidos: Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,855,866; 5,877,289; 5,965,132; 6,004,555; y 6,093,399.

E10. Conjugados de anticuerpos Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos se pueden conjugar con sustancias anticelulares o citotóxicas, para preparar "inmunotoxinas"; o asociarse operativamente con componentes que son capaces de estimular directamente o indirectamente la coagulación, formando de este modo un "coagulígando" . En los coaguligandos, las sustancias objetivo se pueden enlazar directamente con un factor de coagulación directo o indirecto, o se pueden enlazar con una segunda región de enlace que enlaza éstas y luego libera un factor de coagulación directo o indirecto.

El enfoque del "segunda región de enlace" generalmente utiliza un anticuerpo de enlace de coagulante como una segunda región de enlace, dando como resultado de este modo una construcción de anticuerpo biespecífico. La preparación y uso de anticuerpos biespecíficos en general es muy conocida en la técnica, y se describe adicionalmente en la presente. En la preparación de inmunotoxinas, coaguligandos y anticuerpos biespecíficos, se puede emplear la expresión recombinante. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la sustancia objetivo basada en anticuerpo elegida se unen, en cuadro, a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la toxina, coagulante, o segunda región de enlace elegidos para crear una unidad de expresión o vector. La expresión recombinante da como resultado la traducción de un nuevo ácido nucleico, para producir el producto de proteína deseado. Aunque se emplean ácidos nucleicos que codifican anticuerpos, en vez de ligandos que enlazan proteínas, el enfoque recombinante esencialmente es el mismo que el descrito más adelante en la presente. Volviendo a la tecnología de conjugados, la preparación de inmunotoxinas generalmente es muy conocida en la técnica. Sin embargo, se pueden lograr ciertas ventajas a través de la aplicación de cierta tecnología preferida, tanto en la preparación de las inmunotoxinas como en su purificación para la administración clínica posterior. Por ejemplo, aunque las inmunotoxinas basadas en IgG típicamente exhibirán mejor capacidad de enlace y aclaración de sangre más lenta que sus contrapartes Fab', las inmunotoxinas basadas en fragmento Fab' generalmente exhiben mejor capacidad de penetración de tejido en comparación con las inmunotoxinas basadas en IgG. Adicionalmente, aunque numerosos tipos de enlazadores que contienen enlaces disulfuro se conocen que pueden emplearse con éxito para conjugar la fracción de toxina a la sustancia objetivo, ciertos enlazadores generalmente se preferirán sobre estos enlazadores, basándose en las características y capacidades farmacológicas diferentes. Por ejemplo, los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está estéricamente "impedido" se preferirán, debido a su mayor estabilidad en vivo, evitando de este modo la liberación de la fracción de toxina antes del enlace en el sitio de acción. Una variedad amplia de sustancias citotóxicas se conocen que se pueden conjugar con anticuerpos anti-aminofosfolípidos, incluyendo toxinas derivadas de plantas, hongos, y bacterias, tales como la cadena de ricina A o cadena A desglicosilada. La reticulación de una cadena A de toxina con una sustancia objetivo, en ciertos casos, requiere un reticulador que presente funciones de disulfuro. La razón para esto no es clara, pero probablemente se debe a una necesidad de ciertas fracciones de toxina de ser fácilmente liberable de la sustancia objetivo en cuanto la sustancia ha "entregado" la toxina a las células objetivo. Cada tipo de reticulador, así como de qué manera se realiz;a la reticulación, tenderá a variar la farmacodinámica del conjugado resultante. Finalmente, en casos en donde se contempla toxina liberable, se desea tener un conjugado que permanezca intacto bajo condiciones encontradas en cualquier parte del cuerpo excepto en el sitio de acción pretendido, en este punto es deseable que el conjugado tenga buenas características de "liberación". Por lo tanto, el esquema de reticulación particular, incluye en particular el reactivo de reticulación particular usado en las estructuras que se reticulan, tendrá alguna importancia. Dependiendo del compuesto de toxina específico usado como parte de la proteína de fusión, puede ser necesario proporcionar un separador de péptido operativamente uniendo la sustancia objetivo y el compuesto de toxina que sea capaz de doblarse en una estructura de sitio de enlace disulfuro. La disociación proteolítica dentro del sitio volvería entonces un polipéptido heterodimérico en donde la sustancia objetivo y el compuesto de toxinas se enlazan mediante solamente un solo enlace disulfuro. Un ejemplo de esta toxina es la toxina de cadena de ricina A. Cuando se utilizan otros compuestos de toxina, se puede proporcionar un separador de péptido no disociable para unir operativamente la sustancia objetivo y el compuesto de toxina de la proteína de fusión. Las toxinas que se pueden usar junto con los separadores de péptidos no disociables son aquellos los cuales pueden, en sí mismos, convertirse mediante disociación proteolítica, en forma de un disulfuro-enlazado citotóxico. Un ejemplo de este compuesto de toxina es un compuesto de exotoxina de Pseudonomas . Puede haber circunstancias, tales como cuando el antígeno objetivo no internaliza mediante una ruta consistente con la intoxicación eficiente dirigiendo compuestos de sustancia/toxina, tales como inmunotoxinas, en donde se deseará dirigir sustancias quimioterapéuticas tales como fármacos antitumor, otras citocinas, antimetabolitos, sustancias alquilantes, hormonas, y similares. Una variedad de sustancias quimioterapéuticas y otras sustancias farmacológicas se han conjugado ahora con éxito a los anticuerpos y mostrado que funcionan farmacológicamente. Las sustancias antineoplásicas ejemplares" que se han investigado incluyen doxorrubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, y varias otras. Más aún, la unión de otras sustancias tales como neocarcinostatina, macromicina, trenimón y oí-amanitina se han descrito. Cuando se usan factores de coagulación en relación con la presente invención, cualquier enlace covalente al anticuerpo o sustancia objetivo deberá hacerse en el sitio distinto de su sitio de coagulación funcional. Las composiciones de este modo se "enlazan" de cualquier manera operativa que permita que cada región realice su función pretendida sin deterioro significativo. De este modo, las sustancias objetivo se enlazan con los aminofosfolípidos, y el factor de coagulación promueve la formación de coágulos de sangre . Eli. Reticuladores bioquímicos - Además de la información general proporcionada anteriormente, los anticuerpos anti-aminofosfolípidos se pueden conjugar en sustancias anticelulares o citotóxicas usando ciertos reticuladores bioquímicos preferidos. Los reactivos de reticulación se usan para formar puentes moleculares que atan entre sí grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para enlazar dos proteínas diferentes de una manera escalonada, se pueden usar reticuladores hetero-bifuncionales que eliminan la formación de homopolímeros no deseada. Los reticuladores hetero-bifuncionales ejemplares se presentan en la Tabla B.

TABLA B RETICULADORES HETERO-BIFUNCIONALES Enlazador Reactivo hacia Ventajas y Longitud Aplicaciones de Separación después de Reticulación SMPT Aminas Estabilidad mayor 11.2 A primarias sulfhidrilos SPDP Aminas Tiolación 6.8 A primarias Reticulación sulfhidrilos disociable LC-SPDP Aminas Separador extendido 15.6 A primarias sulfhidrilos Sulfo-LC- Aminas Separador extendido 15.6 A "SPDP primarias Soluble en agua sulfhidrilos SMCC Aminas Grupo reactivo 11.6 A primarias maleimida estable sulfhidrilos conjugación enzima- anticuerpo Conjugación proteína Hapten- portador Sulfo-SMCC Aminas Grupo reactivo 11.6 A primarias maleimida estable sulfhidrilos Soluble en agua Conjugación enzima- anticuerpo MBS Aminas Conjugación enzima- 9.9 A primarias anticuerpo sulfhidrilos Conjugación proteína Hapten- portador Sulfo-MBS Aminas Soluble en agua 9.9 A primarias sulfhidrilos SIAB Aminas Conjugación enzima- 10.6 A primarias anticuerpo sulfhidrilos Sulfo-SIAB Aminas Soluble en agua 10.6 A primarias sulfhidrilos SMPB Aminas Separador extendido 14.5 A primarias Conjugación enzima- sulfhidrilos anticuerpo Sulfo-SMPB Aminas Separador extendido 14.5 A primarias Soluble en agua sulfhidrilos EDC/Sulfo- Aminas Conjugación Hapten- 0 NHS primarias Portador grupos carboxilo ABH Carbohidratos Reacciona con 11.9 A no selectivos grupos azúcar Los reticuladores hetero-bifuncionales contienen dos grupos reactivos: uno generalmente reacciona con un grupo amino primario (por ejemplo, N-hidroxi succinimida) y el otro generalmente reacciona con un grupo tiol (por ejemplo, disulfuro de piridilo, maleimidas, halógenos, etcétera, ) . A través del grupo reactivo amina primario, el reticulador puede actuar con el o los residuos de lisina de una proteína (por ejemplo, el anticuerpo o fragmento seleccionado) y a través del grupo reactivo tiol, el reticulador, ya unido a la primera proteína, reacciona con el residuo cisteína (grupo sulfhidrilo libre) de la otra proteína (por ejemplo, el coagulante) . Las composiciones por lo tanto generalmente tienen, o se derivan para tener, un grupo funcional disponible para propósitos de reticulación. Este requisito no se considera que es limitante porque una amplia variedad de grupo se puede usar de esta manera. Por ejemplo, grupos amina primarios o secundarios, grupos hidrazida o hidrazina, alcohol carboxílico, fosfato, o grupos alquilantes se pueden usar para enlazar o reticular. El separador entre dos grupos reactivos de reticuladores puede tener varias longitudes y composiciones químicas. Un separador más largo permite una flexibilidad mejor de los componentes del conjugado aunque algunos componentes particulares en el puente (por ejemplo, grupo benceno) pueden prestar estabilidad extraordinaria al grupo reactivo o una resistencia aumentada del enlace químico a la acción en varios aspectos (por ejemplo, enlace disulfuro resistente a la sustancia reductora) . El uso de separadores péptidos, tales como L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala, también se contempla. Se prefiere que un reticulador que tenga una estabilidad razonable en la sangre se empleará. Numerosos tipos de enlaces disulfuro que contienen enlazadores se conocen que pueden emplearse con éxito para conjugar sustancias objetivo y tóxicos o coagulantes. Los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que esté estéricamente impedido pueden demostrar tener mayor estabilidad en vivo, evitando la liberación de la sustancia antes del enlace en el sitio de acción. Estos enlazadores de este modo son un grupo preferido de las sustancias de enlace. Uno de los reactivos de reticulación más preferidos para su uso en inmunotoxinas es el SMPT, el cual es un reticulador bifuncional que contiene un enlace disulfuro que está "estéricamente impedido" por un anillo benceno adyacente y grupos metilo. Se cree que el impedimento estérico del enlace disulfuro sirve como una función de protección en enlace del ataque de aniones tiolados tales como glutationa que puede estar presente en tejidos y sangre, y mediante esto ayuda a evitar el desacoplamiento del conjugado antes de la administración de la sustancia unida al sitio del tumor. Se contempla que la sustancia SMPT también se puede usar en relación con los ligandos biespecíficos de esta invención. El reactivo de reticulación SMPT, como con muchos otros reactivos de reticulación conocidos, presta la habilidad de reticular grupos funcionales tales como el SH de la cisteína o de las aminas primarias (por ejemplo, el grupo amino epsilon de la lisina) . Otro tipo posible de reticulador incluye las fenilazidas fotorreactivas hetero-bifuncionales que contienen un enlace disulfuro disociable tal como el etil-1,3'-ditiopropionato de sulfosuccinimidil-2- (p-azido salicilamido) . El grupo N-hidroxi-succinimidilo reacciona con grupos amino primarios y el fenilazida (después de la fotolisis) reacciona no selectivamente con cualquier residuo de aminoácido. Además de los reticuladores impedidos, también se pueden emplear enlazadores no impedidos de acuerdo con la presente". Otros reticuladores útiles, no consideran contener o generar un disulfuro protegido, incluyen SATA, SPDP y 2- iminotiolano. El uso de estos reticuladores está bien entendido en la técnica. En cuanto se conjugan, el conjugado se separa de las sustancias objetivo y terapéutica no conjugados y de los otros contaminantes. Un gran número de técnicas de purificación están disponibles para su uso para proporcionar conjugados con un grado suficiente de pureza para volverlos clínicamente útiles. Los métodos de purificación basados en la separación por tamaños, tales como la filtración en gel, la permeación en gel o la cromatografía líquida de alto rendimiento, generalmente será de mayor uso. Otras técnicas cromatográficas tales como" la separación de Sefarosa Azul, también se pueden usar. E12. Anticuerpos biespecíficos * Los anticuerpos biespecíficos son particularmente útiles en los aspectos de coaguligandos de la presente invención. Sin embargo, los anticuerpos biespecíficos en general se pueden emplear, en tanto un brazo se enlace con un aminofosfolípido y el anticuerpo biespecífico se una a una sustancia terapéutica, generalmente en un sitio distinto de los sitios de unión de antígenos. Los anticuerpos biespecíficos que se enlazan tanto a PS como a PE también se pueden usar. En general, la preparación de anticuerpos biespecíficos también es muy conocida en la técnica. Un método implica la preparación por separado de anticuerpos que tengan especificidad para el antígeno objetivo, por un lado, y (como en la presente) una sustancia coagulante en por el otro. Los fragmentos pépticos F(ab'?)2 se preparan a partir de dos anticuerpos elegidos, seguidos por la reducción de cada uno para proporcionar fragmentos Fab'?SH. Los grupos SH en uno de los dos compañeros que se van a acoplar se alquilan con un reactivo de reticulación tal como o-fenilenodimaleimida para proporcionar grupos maleimida libres sobre el otro compañero. Este compañero se puede conjugar entonces con el otro por medio de un enlace tioéter, para dar el heteroconjugado deseado F(ab'?)2. Otras técnicas se conocen en donde la reticulación con SPDP o la proteína A se lleva a cabo, o se prepara una construcción triespecífica. Otro método para producir anticuerpos biespecíficos es mediante la fusión de dos hibridomas para formar un cuadroma. Como se usa en la presente, el término "cuadroma" se usa para describir la fusión productiva de dos hibridomas de células B. Usando ahora técnicas estándares, dos hibridomas que producen anticuerpos se fusionan para dar células hijas, y estas células que han mantenido la expresión de ambos conjuntos de genes de inmunoglobulina de clonotipo se seleccionan. Un método preferido para generar un cuadroma involucra la selección de un mutante deficiente de enzima de cuando menos uno de los hibridomas padres. Esta primera línea celular de hibridoma mutante se fusiona con células de un segundo hibridoma que ha sido expuesto letalmente, por ejemplo, a yodoacetamida, evitando su supervivencia continuada. La fusión celular permite el rescate del primer hibridoma adquiriendo el gen de su deficiencia de enzima del hibridoma tratado letalmente, y el rescato del segundo hibridoma a través de la fusión con el primer hibridoma. Se prefiere, pero no se requiere, la fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de una subclase diferente. Un anticuerpo de subclases mezclados permite el uso de un ensayo alternativo del aislamiento de un cuadroma preferido. En mayor detalle, un método de desarrollo de cuadroma y de selección implica obtener una línea de hibridoma que secreta el primer anticuerpo monoclonal elegido y hacer éste deficiente de la enzima metabólica esencial, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) . Para obtener mutantes deficientes del hibridoma, se cultivan células en presencia de concentraciones crecientes de 8-azaguanina (1 x 10" 7 M hasta 1 x 10~5 M) . Los mutantes se subclonan limitando la dilución y probando su sensibilidad a la hipoxantina/ aminopterina/ timidina (HAT) . El medio de cultivo puede consistir en, por ejemplo, MEMD suplementado con 10 por ciento de SBF, 2 mM L-Glutamina y 1 mM dc penicilina-estreptomicina. Una línea celular de hibridoma complementaria que produce el segundo anticuerpo monoclonal deseado se usa para generar los cuadromas mediante cécnicas de fusión celular estándares. En resumen, 4.5 x 107 primeras células sensibles a HAT se mezclan con 2.8 x 107 segundas células resistentes al HAT que previamente han sido tratadas con dosis letal de inhibidor bioquímico irreversible yodoacetamida (5 mM en solución salina regulada de fosfato) durante 30 minutos en hielo antes de la fusión. La fusión celular se induce usando polietilenglicol (PEG) y las células se plaquean en placas de microcultivo de 96 pozos. Los cuadromas se seleccionan usando medio que contiene HAT. Los cultivos que contienen anticuerpo biespecífico se identifican usando, por ejemplo, un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada específico del isotipo de fase sólida, y manchado inmunofluorescente específico para el isotipo . En una modalidad de identificación para identificar el anticuerpo biespecífico, los pozos de las placas de microtitulación (Falcon, Becton Dickinson Labware) se cubren con reactivo que específicamente interactúa con uno de los anticuerpos de hibridoma padres y que carece de reactividad cruzada con ambos anticuerpos. Las placas se lavan, bloquean y los sobrenadantes (SN) que se van a probar se añaden a cada pozo. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, los sobrenadantes se descartan, las placas se lavan, y se añaden conjugado de fosfatasa alcalina-anti-anticuerpo durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan y un sustrato de fosfatasa, por ejemplo, P-Nitrofenil fosfato (Sigma, San Luis) se añade a cada pozo. Las placas se incuban, se añade 3N de NaOH a cada pozo para detener la reacción, y se determinan los valores OD410 usando un lector de Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada. En otra modalidad de identificación, placas de microtitulación tratadas previamente con poli-L-lisina se usan para enlazar una de las células objetivo a cada pozo, las células se fijan, por ejemplo, usando 1 por ciento de glutaraldehído, y los anticuerpos biespecíficos se prueban para determinar su capacidad de enlace con la célula intacta. Además, FACS, manchado por inmunofluorescencia, anticuerpos específicos de idiotipo, ensayos de competición de enlace de antígeno, y otros métodos comunes en la técnica de caracterización de anticuerpo se pueden usar junto con la presente invención para identificar los cuadromas preferidos. Después del aislamiento del cuadroma, los anticuerpos biespecíficos se purifican de otros productos celulares. Esto se puede llevar a cabo mediante una variedad de procedimiento de aislamiento de proteínas, conocidos por los expertos en la técnica de la purificación de inmunoglobulinas. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son muy conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988) . Por ejemplo, los sobrenadantes de cuadromas seleccionados se pasan sobre columnas de sefarosa G de proteína A o proteína G para enlazar IgG (dependiendo del isotipo) . Los anticuerpos de enlace se eluyen con por ejemplo, un regulador de citrato pH 5.0. Las fracciones eluídas que contienen los anticuerpos biespecíficos, se dializan contra un regulador isotónico. De manera alternativa, el eluído también se pasa sobre una columna de sefarosa anti-inmunoglobulina . El anticuerpo biespecífico se eluye entonces con 3.5 M de cloruro de magnesio. Los anticuerpos biespecíficos purificados de esta manera se prueban para determinar su actividad de enlace mediante, por ejemplo, un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada específico de isotipo y ensayo de manchado de inmunofluorescencia de las células objetivo, como se describió anteriormente . Los anticuerpos biespecíficos purificados y los anticuerpos padres también se pueden caracterizar y aislar mediante electroforesis SDS-PAGE, seguido por manchado con plata o Coomassie. Esto es posible cuando uno de los anticuerpos padres tiene un peso molecular más alto que el otro. En donde la banda del anticuerpo biespecífico migra a medio camino entre los dos anticuerpos padres, la reducción de las muestras verifica la presencia de cadenas pesadas con dos pesos moleculares aparentes diferentes. F. Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas más básicas de la presente invención generalmente comprenderán una cantidad efectiva de cuando menos una construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica, disuelta o dispersa en un portador farmacéuticamente aceptable o medio acuoso. Terapéuticas combinadas también se contemplan, con el mismo tipo de composiciones farmacéuticas subyacentes se pueden emplear tanto para medicamentos solos como combinados . Las frases "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro modo cuando se administra a un animal, o a un humano, según sea lo adecuado. Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, sustancias antibacterianas y antihongos, sustancias retardadoras isotónicas y de absorción y similares. El uso de estos medios y sustancias para sustancias activas farmacéuticas es muy conocido en la técnica. Excepto algún medio convencional o sustancia sea incompatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas se contempla. Para la administración humana, las preparaciones deberán cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza que se requieren por la Oficina de Estándares Biológicos de la FDA. Los ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones. Fl. Formulaciones parenterales Las construcciones de sustancias objetivo sustancias terapéuticas de la présente invención frecuentemente se formularán para la administración parenteral, por ejemplo, formuladas para inyección vía las rutas intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, u otras rutas, incluyendo la administración peristáltica y la instilación directa en un tumor o sitio de enfermedad (administración intracavidad) . La preparación de una composición acuosa que contiene una construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica como un ingrediente activo será conocida para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Típicamente, estas composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensión; las formas sólidas convenientes para su uso para preparar soluciones o suspensiones después de la adición de un líquido antes de la inyección también se pueden preparar; y las preparaciones también se pueden emulsificar. Las formas farmacéuticas convenientes para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones; formulaciones que incluyen aceite de ajonjolí, aceite de cacahuate o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma deberá ser estéril y fluida al grado de que salga de la jeringa. Deberá ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y deberá preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos . Las composiciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica se pueden formular en una composición acuosa estéril en una forma neutra o de sal. Las soluciones de las sustancias objetivo - sustancias terapéuticas como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua convenientemente mezclada con un tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición acida (formadas con los grupos amino libres de la proteína) , y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, trifluoroacético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares . Los portadores convenientes incluyen solventes y medios de dispersión que contienen, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares) , mezclas convenientes de los mismos, y aceites vegetales. En muchos casos, será preferible incluir sustancias isotónicas, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula en el caso de dispersión y/o por el uso de tensoactivos. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, todas estas preparaciones deberán contener un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos. La prevención de la acción de microorganismos se puede llevar a cabo por varias sustancias antibacterianas y antihongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo mediante el uso de composiciones de sustancias que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Antes de o después de la formulación, las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica deberán dializarse extensamente para remover moléculas de peso molecular pequeñas indeseables, y/o liofilizar para la formulación más fácil en el vehículo deseado, cuando sea apropiado. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando las sustancias objetivo - sustancias terapéuticas activas en la cantidad requerida en el solvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se desee, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los distintos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente . En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacio y técnicas de secado por congelación que producen un polvo de ingrediente de sustancia objetivo - sustancia terapéutica activa, más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada estéril previamente de la misma. Las composiciones farmacéuticas convenientes de acuerdo con la invención generalmente incluirán una cantidad de la construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica mezclada con un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como solución acuosa estéril, para dar un rango de concentraciones finales, dependiendo del uso de destino.

Las técnicas de preparación generalmente son muy conocidas en -la técnica como se ejemplifica por Remington Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company, 1989, incorporada en la presente mediante referencia. Deberá apreciarse que la contaminación por endotoxinas deberá mantenerse mínimamente a un nivel seguro, por ejemplo, menor del 0.5 ng/mg de proteína. Más aún, para la administración humana, la preparación deberá satisfacer esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y estándares de pureza como se requiere por la Oficina de Estándares Biológicos de la FDA. Después de la formulación, las soluciones de sustancias objetivo - sustancias terapéuticas se administrarán de una manera compatible con la formulación de la dosis en una cantidad tal que sea efectiva terapéuticamente. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificaciones, tales como del tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se contemplan otras formas aceptables farmacéuticamente, por ejemplo, tabletas, pildoras, cápsulas u otros sólidos para administración oral, supositorios, pesarios, soluciones nasales o rociadores, aerosoles, inhalantes, formas liposomales y similares. También se pueden usar cápsulas o composiciones farmacéuticas de "liberación lenta". Las formulaciones de liberación lenta generalmente se diseñan para dar un nivel de fármaco constante durante un período extenso y se pueden usar para administrar construcciones de sustancia objetivo sustancia terapéutica de acuerdo con la presente invención. F2. Liposomas y nanocápsulas En ciertas modalidades, también se pueden emplear liposomas y/o nanopartículas con las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica. La formación y uso de los liposomas es generalmente conocido para los expertos en la técnica, como se resume más adelante. Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que están dispersos en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapa concéntrica de láminas múltiples (también denominada vesículas de láminas múltiples (MLV) ) . Las vesículas de láminas múltiples generalmente tienen diámetros de desde 25 nm hasta 4 µm. La sonificación de las vesículas de láminas múltiples da como resultado la formación de vesículas de una sola lámina pequeñas (SUV) con diámetros en el rango de 200 a 500 Á, que contienen una solución acuosa en el núcleo. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras distintos de liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar de lípido al agua. En proporciones bajas el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la fuerza iónica y de la presencia de cationes divalentes . Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas sufren una transición de fase que^ altera de manera remarcable su permeabilidad. La transición de fase involucra un cambio desde una estructura ordenada, muy empacada, conocida como estado de gel, a una estructura menos ordenada, empacada flojamente, conocida como estado fluido. Eso se presenta en una temperatura de transición de fase característica y da como resultado un incremento en la permeabilidad a los iones, azúcares y fármacos . Los liposomas interactúan con células vía cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea mediante fuerzas hidrqfóbicas o electroestáticas débiles no específicas, o mediante interacciones específicas con componentes de la superficie celular; la fusión con la membrana celular del plasma mediante la inserción de la bicapa de lípidos de liposoma en la membrana del plasma, con liberación simultánea de contenidos liposomales en el citoplasma; y mediante la transferencia de lípidos liposomales a las membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin ninguna asociación del contenido de liposoma. Variando la formulación de liposoma se puede alterar que mecanismo es operativo, aunque más de uno puede operar al mismo tiempo. Las nanocápsulas generalmente atrapan compuestos de una manera estable y reproducible . Para evitar efectos laterales debido a la sobrecarga polimérica intracelular, tal como partículas ultrafinas (con tamaños alrededor de 0.1 mieras) deberán diseñarse usando polímeros capaces de ser degradados en vivo. Las nanopartículas polialquil -cianoacrilato biodegradables que satisfacen estos requisitos se contemplan para su uso en la presente invención y estas partículas se pueden fabricar fácilmente. G. Juegos Terapéuticos Esta invención también proporciona juegos terapéuticos que comprenden construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas para su uso en los presentes métodos de tratamiento. Estos juegos generalmente contendrán; en elementos contenedores convenientes, una formulación farmacéuticamente aceptable de cuando menos una construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica. Los juegos pueden también contener otras formulaciones farmacéuticamente aceptables, ya sea para diagnóstico/formación de imágenes o terapia combinada. Por ejemplo, estos juegos pueden contener cualquiera de uno o más de un rango de fármacos quimioterapéuticos o radioterapéuticos; sustancias anti-angiogénicas; anticuerpos de células anti-tumor; y/o inmunotoxinas o coaguligandos de vasculatura anti -tumor o estroma anti-tumor. Los juegos pueden tener un solo contenedor (medio contenedor) que contiene la construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica, con o sin componentes adicionales, o pueden tener distintos contenedores para cada sustancia deseada. Cuando se proporcionan terapéuticos combinados, se puede premezclar una sola solución, ya sea en una combinación equivalente molar, o con un componente en exceso del otro. De manera alternativa, cada una de las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica y otros componentes de sustancias anticáncer del juego se pueden mantener por separado dentro de contenedores distintos antes de la administración a un paciente. Cuando los componentes del juego se proporcionan en una o más soluciones líquidas, la solución líquida preferiblemente es una solución acuosa, siendo particularmente preferida la solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del juego se pueden proporcionar como polvos secos. Cuando los reactivos o componentes se proporcionan como polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un solvente conveniente. Se considera que el solvente también puede proporcionarse en otro contenedor. Los contenedores del juego generalmente incluyen cuando menos un frasco, tubo de prueba, ampolleta, botella, jeringa u otro elemento contenedor, en el cual la construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica, y cualquier otra sustancia deseada, se puede colocar y, preferiblemente, convenientemente fraccionar. Cuando se incluyen componentes separadas, el juego también contendrá generalmente un segundo frasco u otro contenedor en el cual éstos se colocan, permitiendo la administración de dosis diseñadas por separado. Los juegos también pueden contener un segundo/tercer elemento contenedor para contener un regulador farmacéuticamente aceptable u otro diluyente. Los juegos también pueden contener un elemento mediante el cual se administra la construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica a un animal o paciente, por ejemplo, una o más agujas o jeringas, o hasta un gotero para ojos, pipeta, u otro de estos aparatos parecidos, a partir de los cuales la formulación se puede inyectar en el animal o aplicarse a una área enferma del cuerpo. Los juegos de la presente invención también típicamente incluirán un medio para contener los frascos, o cualquier otro componente, en confinamiento cerrado para venta comercial, tal como, por ejemplo, contenedores de plástico moldeados por soplado o por inyección en los cuales se colocan y retienen en los frascos y otros aparatos deseados . H. Tratamiento de Tumor El uso más importante de la presente invención está en el tratamiento de tumores malignos, vascularizados; con el tratamiento de tumores benignos, tales como la hipertrofia prostática benigna, también se contempla. La invención también se puede usar en la terapia de otras enfermedades y desórdenes que tiene, como un componente de la enfermedad, vasos sanguíneos protombóticos . Estas enfermedades asociadas con la vasculatura incluyen retinopatía diabética, degeneración macular, restenosis vascular, que incluye restenosis después de la angioplastia, malformacionas arteriovenosas (AVM) , meningioma, hemangioma, glaucoma neovascular y psoriasis; y también angiofibroma, artritis, artritis reumatoide, placas ateroscleróticas, neovascularización de injerto córneo, uniones hemofílicas, heridas hipertróficas, síndrome de osler-weber, fibrosplasia retrolental de granulama piogénico, esclerodermos, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, otras varias enfermedades y desórdenes inflamatorios, y hasta endometriosis . El tratamiento de construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica de la invención más preferiblemente se explota para el tratamiento de tumores sólidos. Estos usos pueden emplear construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica, sola o en combinación con sustancias quimioterapéuticas, radioterapéuticas, apoptópicas, anti-angiogénicas y/o inmunotoxinas o coaguligandos. Los métodos de construcción de sustancias objetivo - sustancias terapéuticas proporcionados por esta invención son ampliamente aplicables al tratamiento de cualquier tumor maligno que tiene un componente vascular. Los tumores típicamente vasculapzados son los tumores sólidos particularmente los carcinomas, los cuales requieren un componente vascular para la provisión de oxígeno y nutrientes. Los tumores sólidos ejemplares que se pueden tratar usando la invención inlcuyen, pero no se limitan a, carcinomas del pulmón, pecho, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótidas, vías biliares, colon, recto, cérvix, útero, endometrio, riñon, vejiga, próstata, tiroides, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de células pequeñas, melanomas, gliomas, neuroblastomas, y similares.

La presente invención se contempla para su uso en el tratamiento de cualquier paciente que presente un tumor sólido. Sin embargo, en lo que la invención es particularmente exitosa es en el tratamiento de tumores sólidos de tamaños moderados o grandes, los pacientes en estas categorías probablemente recibirán beneficios más significativos del tratamiento de acuerdo con los métodos y composiciones proporcionados en la presente. Por lo tanto, en general, la invención se puede usar para tratar tumores de aproximadamente 0.3-0.5 centímetros y más, aunque tiene un uso mejor de la invención para tratar tumores mayores de 0.5 centímetros de tamaño. A partir de estudios ya conducidos en modelos animales aceptables, se cree que los pacientes que presentan tumores de entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 2.0 centímetros de tamaño estarán en el grupo de tratamiento preferido de pacientes para terapia de sustancia objetivo - sustancia terapéutica, aunque los tumores hasta e incluyendo los tumores más grandes encontrados en humanos también se pueden tratar. Aunque la presente invención no se destina generalmente como tratamiento preventivo o profiláctico, el uso de la invención básicamente no se confina al tratamiento de pacientes que tienen tumores solamente de tamaños moderados o grandes. Estas son muchas razones por debajo de este aspecto de la amplitud de la invención. Por ejemplo, un paciente que presenta un tumor primario de tamaño moderado o grande también puede tener varios otros tumores metastásicos que se consideran que son de tamaño pequeño o aun en etapas tempranas de extensión de tumor metastásico. Dado que las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica o combinaciones de la invención generalmente se administran en la circulación sistémica de un paciente, naturalmente tendrían efectos sobre los tumores secundarios, más pequeños y metastásicos, aunque esto no puede ser la intención principal del tratamiento. Además, aún en situaciones en donde la masa del tumor como un todo es ün solo tumor pequeño, ciertos efectos anti-tumor benéficos serán resultado del uso de el presente tratamiento de sustancia objetivo - sustancia terapéutica. La guía proporcionada en la presente con respecto a los pacientes más convenientes para su uso en relación con la presente invención se pretende como enseñanza de que ciertos perfiles de pacientes pueden ayudar en la selección de pacientes para el tratamiento de la presente invención La pre-selección de ciertos pacientes, o categoría de pacientes, de ninguna manera niegan la utilidad básica de la presente invención en relación con el tratamiento de todos los pacientes que tengan un tumor vascularizado. Una consideración adicional es el hecho de que el asalto sobre el tumor proporcionado por la construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica de la invención puede predisponer al tumor a otro tratamiento terapéutico, de manera que el tratamiento posterior da como resultado un efecto sinérgico global o aún conduce a la remisión o cura total. No se cree que ningún tipo particular del tumor deberá excluirse del tratamiento usando la presente invención. Sin embargo, el tipo de células de tumor puede ser relevante para el uso de la invención en combinación con sustancias terapéuticas secundarias, particularmente quimioterapéuticos y las inmunotoxinas celulares anti-tumor. Como el efecto de la presente terapia es destruir la. vasculatura del tumor, y como la vasculatura es sustancialmente o enteramente la misma en todos los tumores sólidos, se entenderá que la presente metodología de sustancia objetivo - sustancia terapéutica es ampliamente o enteramente aplicable al tratamiento de todos los tumores sólidos, independientemente del genotipo particular o genotipo de las mismas células del tumor. La dosis terapéuticamente efectivas de las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica se pueden determinar fácilmente usando datos de un modelo animal, como se muestra en los estudios detallados en la presente. Los animales experimentales que tiene tumores sólidos f ecuentemente se usan para optimizar las dosis terapéuticas adecuadas antes de trasladarlas a un ambiente clínico. Estos modelos se sabe que son muy confiables para predecir estrategias anticáncer eficaces. Por ejemplo, los tumores sólidos que tienen los ratones, tales como los usados en los ejemplos, se usan ampliamente en pruebas preclínicas. Los inventores han usado estos modelos de ratón aceptados en la técnica para determinar rangos de trabajo de las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica que producen efectos anti-tumor benéficos con toxicidad mínima. Como se sabe en la técnica, estos son objetivos realistas que se pueden usar como lineamentos en relación con las pruebas preclínicas antes de proceder al tratamiento clínico. Sin embargo, debido a la seguridad demostrada en modelos aceptados, las pruebas preclínicas de la presente invención serán más un asunto de optimización, en vez de para confirmar la efectividad. De este modo las prueba preclínicas se pueden emplear para seleccionar las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica más ventajosa, dosis o combinaciones . Cualquier dosis de sustancia objetivo - sustancia terapéutica, o medicamento combinado, que de como resultado cualquier destrucción de vasculatura de tumor detectable consistente, tronbosis y efectos anti-tumor definirá todavía una invención útil. Los efectos destructivos, trombóticos y necróticos deberán observarse en entre aproximadamente el 10 por ciento y aproximadamente el 40-50 por ciento de los vasos sanguíneos del tumor y tejidos del tumor, hasta entre aproximadamente 50 por ciento y aproximadamente 99 por ciento de estos efectos. La presente invención también puede ser efectiva contra los vasos corriente abajo del tumor, es decir, dirigirse cuando menos a un subconjunto de los vasos de escurrimiento, particularmente como las citocinas liberadas del tumor estarán actuando sobre estos vasos, cambiando su perfil antigénico. Se entenderá también que aún en las circunstancias en donde los efectos anti-tumor de la dosis de sustancia objetivo - sustancia terapéutica, o terapia combinada, están hacia los extremos inferiores de este rango, puede ser que esta terapia todavía sea igual o aún más efectiva que otras terapias conocidas en el contexto de los objetivos del tumor particular. Desafortunadamente es evidente para un clínico que ciertos tumores no se pueden tratar efectivamente en el plazo intermedio o largo plazo, pero no se niega la utilidad de la presente terapia, particularmente cuando es cuando menos tan efectiva como las otras estrategias generalmente propuestas. Para diseñar dosis adecuadas de construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica o terapias combinadas, para el tratamiento de tumores vascularizados, se puede fácilmente extrapolar de estudios animales descritos en la presente con el fin de llegar a dosis adecuadas para la administración clínica. Para lograr esta conversión, se tomará en cuenta la masa de las sustancias administradas por masa unitaria del animal experimenta y, preferiblemente, se tomaría en cuenta las diferencias en el área superficial del cuerpo entre el animal experimental y el paciente humano. Todos estos cálculos son muy conocidos y de rutina para los expertos en la técnica. Por ejemplo, para tomar una dosis exitosa de construcciones de anexín-TF en los estudios de ratones, y aplicar cálculos estándares basados en la masa y área superficial, las dosis efectivas para su uso en pacientes humanos varían entre aproximadamente 1 miligramo y aproximadamente 500 miligramos de anticuerpo por paciente, o preferiblemente, entre aproximadamente 10 miligramos y aproximadamente 100 miligramos de anticuerpo por paciente. De conformidad con lo anterior, usando esta información los inventores contemplan que dosis baja útiles de construcciones de sustancias objetivo - sustancias terapéuticas para la administración humana estarán aproximadamente entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 aproximadamente 30 miligramos más o menos por paciente; y las dosis útiles altas de construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica para la administración humana serán de aproximadamente 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 aproximadamente 500 miligramos más o menos por paciente. Las dosis intermedias útiles de construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica para la administración humana se contempla que sean aproximadamente 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 o aproximadamente 225 miligramos más o menos por paciente. Cualquier rango particular que usa cualquier rango de las dosis ejemplares mencionadas anteriormente o cualquier valor intermedio entre los rangos establecidos particulares se contempla. Se entenderá también que las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica con coagulantes generalmente se pueden usar a dosis más altas que con las toxinas . En general, los rangos de dosis de entre aproximadamente 5-100 miligramos, aproximadamente 10-80 miligramos, aproximadamente 20-70 miligramos, aproximadamente 25-60 miligramos, aproximadamente 30-50 miligramos más o menos de construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica por paciente se preferirán. Independientemente de estos rangos establecidos, se entenderá que, dados los parámetros y la guía detallada presentada en la presente, otras variaciones en los rangos activos u óptimos están abarcados dentro de la presente invención. Aunque la dosis en y alrededor de aproximadamente 5 o 10 hasta aproximadamente 70, 80, 90 o 100 miligramos por paciente se prefieren actualmente, se entenderá que dosis menores pueden ser mas adecuadas en combinación con otras sustancias, y que dosis mayores también pueden ser toleradas, particularmente dada la seguridad aumentada de las construcciones coagulantes. El uso de anticuerpos humanos o humanizados o proteínas de enlace vuelve a la presente invención aún más segura para uso clínico, produciendo además las oportunidades de toxicidad significativa o efectos laterales en tejidos sanos. La intención de los regímenes terapéuticos de la presente invención generalmente es producir efectos anti-tumor significativos al mismo tiempo que todavía se mantienen las dosis por debajo de los niveles asociados con toxicidad inaceptable. Además de variar la dosis misma, el régimen de administración también se puede adaptar para optimizar la estrategia del tratamiento. Una estrategia de tratamiento actualmente preferida es administrar entre aproximadamente 1-500 miligramos, y preferiblemente entre aproximadamente 10-100 miligramos de la construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica, o cóctel terapéutico que contiene este, aproximadamente 3 veces en aproximadamente un período de 7 días. Por ejemplo, la dosis se daría en el día 1, día 3 o 4, y día 6 o 7. Para administrar las mismas dosis particulares, se preferiría proporcionar una composición farmacéuticamente aceptable (de acuerdo con los estándares de la FDA de esterilidad, pirogenicidad, pureza y seguridad general) al paciente sistémicamente . La inyección intravenosa se prefiere generalmente, y el método más preferido es emplear una infusión continua durante un período de tiempo de aproximadamente 1 o 2 horas más o menos. Aunque no se requiere determinar estos parámetros antes del tratamiento usando la presente invención, deberá notarse que los estudios detallados en la presente dan como resultado cuando menos alguna trombosis observada específicamente en los vasos sanguíneos del tumor sólido dentro de aproximadamente 12-24 horas de la inyección, y la necrosis del tumor extendida también se observa en este período . Naturalmente, antes del uso de difusión amplia, se llevarán a cabo ensayos clínicos. Los distintos elementos para llevar a cabo un ensayo clínico, incluyendo el tratamiento del paciente y supervisión, serán conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la descripción presente. La siguiente información se está presentando como un lineamento general para su uso para establecer estos ensayos. Los pacientes elegidos para los primeros estudios de tratamiento de construcción de sustancia objetivo - sustancia terapéutica han fallado en responder a cuando menos un curso de terapia convencional, y tendrán enfermedad objetivamente medible - como se determina por examen físico, técnicas de laboratorio, y/o procedimiento radiográficos. Cualquier quimioterapia deberá detenerse cuando menos dos semanas antes de entrar en el estudio. Cuando se emplean porciones de anticuerpo o anticuerpos monoclonales murinos, los pacientes deberán no tener historia de alergia a la inmunoglobulina de ratón. Se encontrarán varias ventajas en el uso de catéter venoso central interno con un puerto de lumen triple . Las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica deberán filtrarse, por ejemplo, usando un filtro de 0.22 µ , y diluirse adecuadamente, tal como mediante salina, hasta un volumen final de 100 mililitros. Antes del uso, la muestra de prueba deberá también filtrarse de manera similar, y su concentración valorarse antes y después de la filtración determinando el A280. La recuperación esperada deberá estar dentro del rango de 87 por ciento a 99 por ciento, y se pueden determinar los ajustes por pérdida de proteína. Las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica se pueden administrar durante un período de aproximadamente 2-24 horas, recibiendo cada paciente 2-4 infusiones a intervalos de 2-7 días. La administración también se puede realizar mediante una tasa estable de infusión durante un período de 7 días . La infusión dada a cualquier nivel de dosis deberá ser dependiente de cualquier toxicidad observada. Por lo tanto si se alcanza la toxicidad de grado II después de una sola infusión, en un período particular de tiempo para una infusión de tasa estable, otras dosis deberán detenerse o parar la infusión de tasa estable a menos que mejore la toxicidad. Dosis crecientes de construcciones de sustancia objetivo sustancia terapéutica deberán administrarse a grupos de pacientes hasta aproximadamente 60 por ciento de que los pacientes muestren toxicidad grado III o IV inaceptable en cualquier categoría. Las dosis que sean 2/3 de este valor se definen como dosis seguro. El examen físico, las mediciones del tumor, y las pruebas de laboratorio, deberán, desde luego, realizarse antes del tratamiento y a intervalos hasta de un mes después . Las pruebas de laboratorio deberán incluir cuentas sanguíneas completas, creatinina de suero, creatinina quinasa, electrólitos, urea, nitrógeno, SGOT, bilirrubina, albúmina y proteína de suero total . Las muestras de suero tomadas hasta 60 días después del tratamiento deberán evaluarse mediante radioinmunoensayo para detectar la presencia de las construcciones de sustancia objetivo - sustancia terapéutica administrada, y los anticuerpos contra cualquier porción de las mismas. Los análisis inmunológicos del suero, usando cualquier ensayo estándar tal como, por ejemplo, un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada o RÍA permitirá la farmcocinética y la aclaración de la sustancia terapéutica de anti-aminofosfolípido que será evaluada . Para evaluar las respuestas anti-tumor, los pacientes deberán ser examinados a 48 horas a 1 semana y después 30 días después de la última infusión. Cuando este presente enfermedad palpable, deberán medirse diariamente dos diámetros perpendiculares de todas las masas del tratamiento dentro de una semana después de completar la terapia, y a los 30 días. Para medir enfermedad no palpable, escaneos de CT en serie podrían realizarse a intervalos de 1 centímetro en todo el pecho, abdomen, y pelvis en las 48 horas y hasta 1 semana y de nuevo a los 30 días. Las muestras de tejido deberán también ser evaluadas histológicamente, y/o mediante citometría de flujo, usando biopsias de los sitios de la enfermedad o hasta de muestras de sangre o de fluido si es lo adecuado. Las respuestas clínicas se pueden definir mediante medición aceptable. Por ejemplo, una respuesta completa se puede definir por la desaparición de todo tumor medible 1 mes después del tratamiento. Mientras que una respuesta parcial se puede definir por una reducción al 50 por ciento o mayor de la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todos los nodulos de tumor evaluables 1 mes después del tratamiento, sin sitios de tumor mostrando agrandamiento . De manera similar, se puede definir una respuesta mezclada mediante una reducción del producto de diámetros perpendiculares de todas las lesiones medibles por 50 por ciento o más 1 mes después del tratamiento, con avance en uno o más sitios. A la luz de los resultados de ensayos clínicos, tales como los descritos anteriormente, se puede formular todavía un régimen de tratamiento más preciso. Aún, alguna variación en dosis posteriormente puede ser necesaria dependiendo de la condición del sujeto que se está tratando. El médico responsable de la administración, a la luz de la presente descripción, será capaz de determinar la dosis adecuada para el sujeto individual. Esta optimización y ajuste se lleva a cabo de manera rutinaria en la técnica y de ninguna manera refleja una cantidad indebida de experimentación. I . Formación de Imagen del Tumor La presente invención además proporciona tratamiento del tumor combinado con métodos de formación de imagen, basándose en ligandos de enlace anti-aminofosfolípidos. Las proteínas anticuerpos de enlace anti-aminofosfolípidos que se enlazan a una o más sustancias detectables se consideran para su uso en la formación de imagen previa del tumor, formando una imagen confiable antes del tratamiento, lo cual a su vez dirige los marcadores de aminofosfolípidos. Los ligandos anticuerpos anti-aminofosfolípidos, o los conjugados de los mismos, generalmente comprenderán un anticuerpo anti-aminofosfolípido o ligando de enlace operativamente unido, conjugado con, una etiqueta detectable. Las "etiquetas detectables" son compuestos o elementos que se pueden detectar debido a sus propiedades funcionales específicas, o características químicas, el uso de las cuales permite que el componente al cual estén unidas se detecte, y se cuantifique además si se desea. Preferiblemente, las etiquetas detectables son aquellas detectables en vivo usando métodos no invasivos . Los anticuerpos y los conjugados de proteínas de enlace para su uso como sustancia de diagnóstico generalmente caen en dos clases, aquellas para su uso en diagnósticos in vi tro, tales como una variedad de ensayos inmunológicos , y aquellas para su uso en protocolos de diagnóstico en vivo . Son los métodos de formación de imágenes en vivo los que se pretenden particularmente para su uso con esta invención. En la técnica se conocen muchas sustancias para formación de imágenes adecuadas, como son los métodos para su unión con anticuerpos y ligandos de enlace (ver, por ejemplo, las Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,021,236 y 4,472,509, ambas incorporadas en la presente mediante referencia) . Ciertos métodos de unión implican el uso de un complejo quelado de metal que emplea, por ejemplo, una sustancia quelante orgánica tal como un DTPA unido al anticuerpo (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,472,509). Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer reaccionar con un enzima en presencia de una sustancia de acoplamiento tal como un glutaraldehído o periodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en la presencia de estas sustancias de acoplamiento o mediante la reacción de un isotiocianato. Un ejemplo de etiquetas detectables son los iones paramagnéticos. En este caso, los iones convenientes incluyen cromo (III) , manganeso (II) , hierro (III) , hierro (II) , cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III) , holmio (III) , y erbio (III) , siendo particularmente preferido el gadolinio. Los iones útiles en otros contextos, tales como para formación de imágenes en rayos X, incluyen pero no se limitan a lantano (III) , oro (III) , plomo (II) , y especialmente bismuto (III) . Las etiquetas fluorescentes incluyen rodamina, fluoresceína y renografina. La rodamina y la fluoresceína frecuentemente se enlazan vía un intermediario isotiocianato. En el caso de isótopos radioactivos para aplicaciones de diagnóstico, los ejemplos convenientes incluyen "carbono, slcromo, 3Scloro, 57cobalto, 58cobalto, "cobre, 15eu, "galio, 3hidrógeno, 123yodo, 125yodo, 131yodo, 11:Lindio, 59hierro, 3fósforo, 186renio, 188renio, "selenio, 35azufre, ""tecnetio, 90itrio. El 15yodo frecuentemente es el preferido para su uso en ciertas modalidades, y el 99mtecnitio y el 11:Lindio frecuentemente también se prefieren debido a su baja energía y conveniencia para detección en rango largo. Los anticuerpos y ligandos de enlace anti-aminofosfolípidos etiquetados radioactivamente para su uso en la presente invención se pueden producir de conformidad con métodos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los grupos funcionales intermediarios que frecuentemente se usan para enlazar iones metálicos radiosiotópicos con anticuerpos son ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) y ácido etileno diaminotetracético (AEDT) .

Los anticuerpos monoclonales también se pueden yodar en contacto con sodio o con yoduro de potasio y una sustancia oxidante química tal como hipoclorito de sodio, o una sustancia oxidante enzimática tal como lactoperoxidasa . Los anticuerpos anti-aminofosfolípidos de acuerdo con la invención se pueden etiquetar con tecnetio"m mediante un proceso de intercambio de ligando, por ejemplo, reduciendo el pertecnato con solución estannosa, quelando el tecnetio reducido sobre una columna de Sefadex y aplicando el anticuerpo a esta columna; o mediante técnicas de etiquetación directas, por ejemplo, incubando pertecnato, una sustancia reductora tal como SNC12, una solución reguladora tal como solución de ftalato de sodio-potasio, y el anticuerpo. Cualquiera del tipo anterior de anticuerpos anti-aminofosfolípidos detectablemente etiquetados y ligandos de enlace de aminofosfolípidos se puede usar en los aspectos de formación de imágenes de la presente invención. Aunque no se propuso previamente para su uso en formación de imagen y tratamiento de tumores combinados, también se pueden emplear las anexinas detectablemente etiquetadas de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036; WO 95/19791; WO 95/27903; WO 95/34315; WO 96/17618; y WO 98/04294; cada una incorporada en la presente mediante referencia. La Publicación Internacional WO 95/27903 (incorporada en la presente mediante referencia) proporciona anexinas para su uso para detectar células apoptóticas. Cualquiera de los marcadores de sustancias detectables de anexín de la Publicación Internacional WO 95/27903 también se puede usar en la presente, aunque será conocido que ciertas de estas son más convenientes para usos in vi tro . La Publicación Internacional WO 95/27903 también se incorpora en la presente mediante referencia para propósitos de proporcionar juegos detectables que se puedan adaptar para uso combinado con los terapéuticos de la presente invención. Cada una de las Publicaciones Internacionales WO 95/19791; WO 95/34315; WO 96/17618; y WO 98/04294; se incorporan también mediante referencia en la presente para propósitos de describir adicionalmente conjugados de anexín radioetiquetados para formación de imágenes de diagnóstico. El intento de cada uno de los documentos anteriores es proporcionar anexinas radioetiquetadas para su uso al formar imágenes de trombosis vascular, particularmente en o cerca del corazón, tales como en trombosis de venas profundas, embolias pulmonares, infarto al miocardio, fibrilación atrial, problemas con materiales cardiovasculares prostéticos, ataque, y similares. Las anexinas radioetiquetadas también se propusieron para su uso para formar imágenes de plaquetas activadas, por ejemplo, en condiciones tales como abscesos, restenosis, inflamación de articulaciones, coágulos en arterias cerebrales, etcétera.

La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036 (incorporada en la presente mediante referencia) también generalmente se refiere a ligandos de enlace de "anexina" (anexín) para su uso para analizar fosfatidilserina de etiquetas. Se explica en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036 que los desórdenes hemostáticos, tales como trombosis arterial, coronaria y venosa, usualmente son idiopáticas, lo que hace difícil la predicción y prevención. Para reconocer estos desórdenes hemostáticos más temprano se propone la detección de plaquetas activadas. Las composiciones de anexina detectablemente etiquetadas de este modo se describen con el fin de detectar plaquetas activadas en desórdenes hemostáticos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036) . Aunque se propone un rango amplio de usos de diagnóstico, ninguna de las Publicaciones Internacionales WO 95/19791; WO 95/34315; WO 96/17618; o WO 98/04294 hace referencia a formar imágenes de la vasculatura de los tumores sólidos. Tampoco la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036 hace ninguna sugerencia. Sin embargo, las composiciones de anexín radioetiquetado y detectable descritas en sí ahora se pueden usar en provecho respecto a esto, a la luz de los sorprendentes descubrimientos descritos en la presente.

En particular, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036 (incorporada en la presente mediante referencia) describe anexinas detectablemente etiquetadas con isotiocianato de fluoresceína; radioisótopos de halógenos, tecnetio, plomo, mercurio, talio o indio; y sustancias de contraste paramagnéticas. La Publicación Internacional WO 95/19791 (incorporada en la presente mediante referencia) proporciona conjugados de anexín unidos a un quelado N2S2 que se puede radioetiquetar complejando un radionuclida alquelado. La Publicación Internacional WO 95/34315 (incorporada en la presente mediante referencia) proporciona conjugados de anexín que comprenden uno o más residuos de galactosa con el quelado N2S2. La fracción galactosa se dice que facilita la eliminación rápida del conjugado radioetiquetado a partir de la circulación, reduciendo el daño de radiación a tejidos no objetivos y el "ruido" de fondo. La Publicación Internacional WO 96/17618 (incorporada en la presente mediante referencia) a su vez proporciona conjugados de anexín convenientes para radioetiquetar con sustancias de formación de imagen de diagnóstico que comprenden un anexín con un ramillete de residuos de galactosa y un quelado N2S2. Estos se reporta que tienen una vida media circulante más corta y una afinidad de enlace más alta para sitios objeto que los conjugados de anexín - galactosa radioetiquetados anteriores. Todavía otros conjugados de anexín radioetiquetados son proporcionados por la Publicación Internacional WO 98/04294 (incorporada en la presente mediante referencia) . Estos conjugados comprenden un anexín que se modifica para proporcionar un grupo sulfhidrilo accesible conjugado con una fracción hexosa que se reconoce por un receptor de hígado de mamífero. Los conjugados de multímeros de anexín y compuestos quelantes vía enlaces sensibles a esterasa también se proporcionan. Cada una de las Publicaciones Internacionales WO 95/19791; WO 95/34315; WO 96/17618; y WO 98/04294; específicamente se incorporan en la presente mediante referencia para propósitos de proporcionar componentes conjugados de anexín para radioetiquetar que son dóciles para empacarlos en "juegos fríos", es decir, en donde los componentes se proporcionan en frascos separados . La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036 similarmente proporciona juegos que comprenden un portador que está por compartimientos para recibir anexinas detectablemente etiquetadas que se pueden adaptar para su uso en las mismas. Aunque conveniente para su uso en diagnósticos in vi tro, los presente métodos de detección de aminofosfolípidos se destinan más para formar una imagen de la vasculatura de tumor de un paciente antes del tratamiento con construcciones de sustancia objeto - sustancia terapéutica. El diagnóstico en vivo o los métodos de formación de imagen generalmente comprenden administrar a un paciente una cantidad diagnósticamente efectiva de un anticuerpo anti-aminofosfolípido o ligando de enlace que se conjuga con un marcador que es detectable mediante métodos no invasivos. El conjugado marcador ligando de enlace o anticuerpo se deja suficiente tiempo para localizar y enlazarse con el aminofosfolípido expresado en la superficie luminal de la vasculatura del tumor. El paciente se expone entonces a un dispositivo de detección para identificar el marcador detectable, formando de este modo una imagen de la vasculatura del tumor . Los isótopos de resonancia de giro magnético nuclear, tales como el gadolinio, se detectan usando un dispositivo de formación de imagen magnética nuclear; y sustancias radioactivas, tales como tecnitio99m o indio111, se detectan usando una cámara detector de escintilación gama. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036 también se incorpora específicamente en la presente mediante referencia para propósitos de proporcionar .todavía guía adicional con respecto a la seguridad y la introducción efectiva de estas construcciones detectablemente etiquetadas en la sangre de un individuo, y medios para determinar la distribución de el anexín etiquetado extracorporalmente, por ejemplo, usando una cámara de escintilación gama o mediante medición por resonancia magnética. Las dosificaciones para modalidades de formación de imagen generalmente son menores que para terapia, pero también dependen de la edad y el peso del paciente. Una dosis de una vez de entre 0.1, 0.5 o aproximadamente 1 miligramo y aproximadamente 9 o 10 miligramos, o mas preferiblemente de entre aproximadamente 1 miligramo y aproximadamente 5-10 miligramos de anticuerpo anti-aminofosfolípido o conjugado de ligando de enlace aminofosfolípido por paciente se contempla que es útil. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,627,036; y la Publicación Internacional WO 95/19791, cada una incorporada en la presente mediante referencia, también son instructivas con respecto a las dosis de las anexinas detectablemente etiquetadas. J. Terapias de Combinación Los métodos de tratamiento de sustancias objeto -sustancias terapéuticas de la presente invención se pueden combinar con cualquier otro método generalmente empleado en el tratamiento del tumor particular, enfermedad o desorden que exhibe el paciente. En tanto no se sepa que el enfoque terapéutico particular es perjudicial a la condición del paciente en sí, y no contrarreste significativamente el tratamiento de la sustancia objeto - sustancia terapéutica, se considera su combinación con la presente invención.

En relación con el tratamiento del tumor sólido, la presente invención se puede usar en combinación con enfoques clásicos, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia, y similares. La invención por lo tanto proporciona terapias combinadas en las cuales se usan las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica simultáneamente con, antes, o después de la cirugía o tratamiento por radiación; o se administran a pacientes con, antes de, o después de sustancias quimioterapéuticas, radioterapéuticas o anti-angiogénicas convencionales, o inmunotoxinas o coaguligandos dirigidos . La terapia de combinación para otras enfermedades vasculares también se contempla. Un ejemplo particular de esto es la hiperplasia prostática benigna (BPH) , la cual se puede tratar con construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas en combinación con otros tratamientos actualmente practicados en la técnica. Por ejemplo, la dirección de inmunotoxinas a marcadores localizados dentro de la hiperplasia prostática benigna, tales como PSA. Cuando se usan una o más sustancias en combinación con la terapia de sustancia objetivo-sustancia terapéutica, no hay requisito para que los resultados combinados sean aditivos de los efectos observados cuando se conduce cada tratamiento por separado. Aunque cuando menos efectos aditivos generalmente son deseables, cualquier efecto anti-tumor aumentado por encima de una de las terapias solas será benéfica. También, no hay requisito particular para que el tratamiento combinado exhiba efectos sinérgicos, aunque ciertamente esto es posible y ventajoso. Para practicar la terapia anti-tumor combinada, simplemente se administrarían a un animal una construcción de sustancia obj etivo-sustancia terapéutica en combinación con otra sustancia anticáncer de una manera efectiva para dar como resultado acciones anti-tumor combinadas dentro del animal. Las sustancias por lo tanto se proporcionarían en cantidades efectivas y por períodos de tiempo efectivas para dar como resultado la presencia combinada dentro de la vasculatura del tumor y sus acciones combinadas en el ambiente del tumor. Para lograr esta meta, las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica y las sustancias anticáncer se pueden administrar al animal simultáneamente, ya sea en una sola composición, o como dos composiciones distintas usando diferentes rutas de administración. De manera alternativa, el tratamiento de sustancia objetivo-sustancia terapéutica puede preceder, o seguir, al tratamiento de sustancia anticáncer en, por ejemplo, intervalos que varían de minutos a semanas. En ciertas modalidades en donde la sustancia anticáncer y la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica se aplican por separado al animal, aseguraría que no expiró un período de tiempo significativo entre el tiempo de cada administración, de manera que la combinación de sustancia anticáncer y sustancia objetivo-sustancia terapéutica todavía sería capaz de ejercer un efecto combinado ventajoso en el tumor. En estos casos, se contempla que se podría en contacto el tumor con ambos agentes dentro de aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente una semana uno del otro, y más preferiblemente, dentro de aproximadamente 12-72 horas uno del otro, con un tiempo de retardo de solamente aproximadamente 12-48 horas, siendo lo más preferido. Las sustancias anticáncer ejemplares que se darían antes de la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica son sustancias que inducen la expresión de aminofosfolípidos dentro de la vasculatura del tumor. Por ejemplo, las sustancias que estimulan la producción de calcio localizado y/ó que induce la apoptosis generalmente darían como resultado la expresión de PS aumentada, lo cual se puede dirigir usando una construcción de sustancia-sustancia terapéutica anti-PS posterior. Las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica se administrarían primero en otras situaciones para causar la destrucción del tumor, siguiendo por, por ejemplo, terapias anti-angiogénicas o terapias dirigidas para dar al blanco en células del tumor necróticas . El uso general de combinaciones de sustancias en el tratamiento del cáncer es muy conocido. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,710,134 (incorporada en la presente mediante referencia) describe componentes que inducen necrosis en tumores en combinación con sustancias no tóxicas o "profármacos". Las enzimas que quedan libres por los procesos necróticos disocian el "profármaco" tóxico en "fármaco" tóxico, lo cual conduce a la muerte celular del tumor. También, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,747,469 (incorporada en la presente mediante referencia) describe el uso combinado de vectores virales que codifican sustancias que dañan p53 y ADN. Cualquiera de estos enfoques similares se puede usar con la presente invención. En algunas situaciones, puede un ser deseable extender el período de tiempo para el tratamiento de manera significativa, en donde varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) , varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) , o aún varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas. Esto sería ventajoso en circunstancias en donde un tratamiento se destinó para destruir sustancialmente el tumor, tal como el tratamiento de sustancia objetivo y en sustancia terapéutica, y otro tratamiento se destinó a evitar la micrometástasis o recrecimiento de tumor, tal como la administración de sustancia anti-angiogénica. El anticuerpo EN 7/44 de Hagemeier y colaboradores (1986) no se cree que sea una sustancia anti-angiogénica efectiva, que carece de enlace con un antígeno accesible de superficie, entre otras deficiencias. También se considera que más de una administración de, ya sea la construcción de sustancia objetivo-sustancia terapéutica o la sustancia anticáncer" se utilizará. Las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica y sustancias anticáncer se pueden administrar intercambiablemente, o en días o semanas alternados; o una secuencia de tratamiento de sustancia obj etivo- sustancia terapéutica se puede dar, seguida por una secuencia de terapia de sustancia anticáncer. En cualquier caso, para lograr la regresión del tumor usando una terapia combinada, todo lo que se requiere es administrar ambas sustancias en una cantidad combinada efectiva para ejercer un efecto anti-tumor, independientemente de los tiempos para la administración. En términos de cirugía, cualquier intervención quirúrgica se puede practicar en combinación con la presente invención. En relación con radioterapia, cualquier mecanismo para inducir daño de ADN localmente dentro de las células del tumor está contemplado, tal como irradiación ?, rayos X, irradiación ultravioleta, microondas y hasta emisiones electrónicas y similares. La administración dirigida de radioisótopos a las células del tumor también se contempla, y esto se puede usar en relación con un anticuerpo objetivo u otros elementos objetivos.

La terapia de citocinas ha demostrado también ser un compañero efectivo para los regímenes de terapias combinadas. Se pueden emplear varias citocinas en estos enfoques combinados. Ejemplos de citocinas incluyen IL-la IL-lß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-ß, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNFa, TNFß, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-Oí, IFN-ß, IFN-?. Las citocinas se administran de conformidad con regímenes estándares, consistentes con indicaciones clínicas, tales como la condición del paciente y la toxicidad relativa de la citocina. También se usan uteroglobinas para evitar o inhibir la metástasis (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,696,092; incorporada en la presente mediante referencia) . Jl . Quimioterapéuticos En ciertas modalidades, las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica de la presente invención se puede administrar en combinación con una sustancia quimioterapéutica. Los fármacos quimioterapéuticos pueden matar células de tumor proliferantes, aumentando las áreas necróticas creadas por el tratamiento global . Los fármacos pueden de esta manera aumentar la acción trombótica de las construcciones de sustancias objetivo-sustancias terapéuticas. Induciendo la formación de trombos en los vasos del tumor, las construcciones de sustancia objetivo-sustancia terapéutica pueden aumentar la acción de los quimioterapéuticos reteniendo o atrapando los fármacos dentro del tumor. Los quimioterapéuticos se retienen en sí dentro del tumor, al mismo tiempo que el resto del fármaco se aclara del cuerpo. Las células del tumor se exponen de este modo a una concentración más alta de fármaco durante un período de tiempo más largo. Este atrapamiento de fármaco dentro del tumor hace posible reducir la dosis del fármaco, haciendo el tratamiento más seguro, así como más efectivo. Independientemente de los mecanismos subyacentes, se puede usar una variedad de sustancias quimioterapéuticas en los métodos de tratamiento combinados descritos en la presente. Las sustancias quimioterapéuticas contempladas como ejemplares incluyen, por ejemplo, tamosifén, taxol, vincristina, vinblastina, etoposida (VP-16), adriamicina, 5-fluorouracilo (5FU) , camptotecina, actinomicín-D, mitomicín-C, cisplatín (CDDP) , combretastatina (s) y derivados y profármacos de los mismos . Como se entenderá por los expertos en la técnica, las dosis adecuadas de sustancias quimioterapéuticas generalmente estarán alrededor de las ya empleadas en terapias clínicas, en donde se administran las sustancias quimioterapéuticas solas o en combinación con otras sustancias quimioterapéuticas. A manera de ejemplo solamente, sustancias tales como cisplatina, y otros alquilantes de ADN se pueden usar. La cisplatina se ha usado ampliamente para tratar el cáncer, con dosis eficaces usadas en aplicaciones clínicas de 20 miligramos/m2 por 5 días cada tres semanas durante un total de tres cursos . La cisplatina no se absorbe oralmente, y por lo tanto se debe administrar vía inyección intravenosamente, subcutáneamente, intratumoralmente o intraperitonealmente. Otras sustancias útiles incluyen compuestos que interfieren con la réplica de ADN, mitosis y segregación cromosonal . Estos compuestos quimioterapéuticos incluyen adiamicina, también conocida como doxorrubicina, etoposida, verapamil, podofilotoxina, y similares. De uso muy amplio en el escenario clínico para el tratamiento de neoplasmas, estos compuestos se administran a través de inyecciones de bolo intravenosamente a dosis que varían desde 25-75 miligramos/m2 a intervalos de 21 días para la adriamicina, hasta 35-50 miligramos/m2 intravenosamente para etoposida o el doble de la dosis intravenosa oralmente. Las sustancias que interrumpen la síntesis y la fidelidad de precursores de polinucleótidos también se pueden usar. Particularmente útiles son sustancias que han sufrido pruebas extensas y están fácilmente disponibles. Como tales, las sustancias como el 5-fluorouracilo (5 -FU) se usan preferencialmente por tejido neoplásico, haciendo esta sustancia particularmente útil para dirigirse a células neoplásicas. Aunque algo tóxico, el 5 -FU, es aplicable en un amplio rango de vehículos, incluyendo tópicos, sin embargo, la administración intravenosa con dosis que varían de 3 a 15 miligramos/kg/día se usan comúnmente. Las sustancias quimioterapéuticas ejemplares que son útiles en relación con la terapia combinada se enlistan en la Tabla C. Cada una de las sustancias enlistadas en la presente son ejemplares y de ninguna manera limitantes. El técnico experto se dirige a "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, capítulo 33, en particular las páginas 624-652. Cualquier variación en la dosis necesariamente se presentará dependiendo"de la condición del sujeto que se está tratando. El médico responsable para la administración será capaz de determinar la dosis adecuada para el sujeto individual. 230 TABLA C Sustancias Quimioterapéuticas Útiles en Enfermedad Neoplásica Alquilsul- Busulfan Leucemia granulo- fonatos cítica crónica.

Carmustine Enfermedad de (BCNU) Hodgkin, linfornas no de Hodgkin, tumores de cerebro primarios, mieloma múltiple, melanoma maligno . Nitroso- ureas Lomustine Enfermedad de (CCNU) Hodgkin, linfornas no de Hodgkin, tumores de cerebro primario, pulmón de célula pequeña .

Semustine Tumores de cerebro (methyl - primario, estómago, CCNU) colon.

Streptozo- Insulinoma cin (strep- pancreática maligna, tozotocin) carcinoide maligno.

Dacarbazine Melanoma maligno, (DTIC; enfermedad de Triazinas dimethyl- Hodgkin, sarcomas de triazenoimi tejido blando. dazolecarbo xamide) . Análogos de Methotre- Leucemia linfocítica Acido xate (ame- aguda, coriocarci- Fólico thopterin) noma, micosis fungoides, pecho, Antimetacabeza y cuello, bolitos pulmón, sarcoma osteogénico.

J2. Anti-Angiogénicos El término "angiogénesis" se refiere a la generación de nuevos vasos sanguíneos, generalmente en un tejido u órgano. En condiciones fisiológicas normales, los humanos y los animales sufren angiogénesis solamente en situaciones restringidas muy específicas. Por ejemplo, la angiogénesis normalmente se observa en la cicatrización de heridas, el desarrollo fetal y embriónico y en la formación del corpus luteum, endometrio y placenta. La angiogénesis no controlada (persistente y/ó no regulada) se relaciona con varios estados de enfermedad, y se presenta durante el crecimiento y metástasis de tumores . Tanto la angiogénesis controlada como la no controlada se piensa que proceden de manera similar. Las células y pericitos endoteliales, rodeados por una membrana de base, forman los vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis comienza con la erosión de lá membrana de base por las enzimas liberadas por las células endoteliales y los leucocitos. Las células endoteliales, cuya línea del lumen de vasos sanguíneos, sobresalen a través de la membrana de base. Los estimulantes angiogénicos inducen que las células ehdoteliales migren a través de la membrana de base erosionada. Las células migrantes forman un "pico" fuera del vaso sanguíneo padre, en donde las células endoteliales sufren mitosis y proliferan. Los picos endoteliales surgen uno con otro para formar ciclos capilares, creando el nuevo vaso sanguíneo. Conforme se presenta angiogénesis persistente, no regulada durante el desarrollo del tumor y la metástasis, los métodos del tratamiento de esta invención se pueden usar en combinación con cualquiera o más en terapias "anti-angiogénicas". Las sustancias anti-angiogénicas ejemplares que son útiles en relación con la terapia combinada se enlistan en la Tabla D. Cada una de las sustancias enlistadas en la misma y de ninguna manera limitante.

TABLA D Inhibidores y Reguladores Negativos de Angiogénesis Un componente preferido para su uso para inhibir la angiogénesis es una proteína llamada "angiostatina" . Este componente se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,776,704; 5,639,725 y 5,733,876, cada una incorporada a la presente como referencia. La angiostatina es una proteína que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 38 kD y aproximadamente 45 kD, determinado reduciendo la electroforesis en gel de poliacrilamida, que contiene aproximadamente regiones 1 a 4 de Kringle de una molécula de plasminógeno. La angiostatina generalmente tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente similar a la de un fragmento de plasminógeno murino que comienza en el aminoácido número 98 de una molécula de plasminógeno murino intacto. La secuencia de aminoácidos de la angiostatina varía ligeramente entre las especies. Por ejemplo, en la angiostatina humana, la secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a la secuencia del fragmento de plasminógeno murino descrito anteriormente, aunque una secuencia de angiosgatina humana activa puede comenzar en cualquier aminoácido múmero 97 o 99 de una secuencia de aminoácidos de plasminógeno humano intacta. Además, el plasminógeno humano se puede usar, ya que tiene actividad anti-angiogénica similar, como se muestra en un modelo de tumor de ratón. Ciertas terapias anti-angiogénicas se" ha mostrado ya que causan regresiones de tumor, y la angiostatina es una de estas sustancias. La endostatina, un fragmento terminal COOH de 20 kDa de colágeno XVIII, el polisacárido bacteriano CM101, y el anticuerpo LM609 también tienen actividad angiostática. Sin embargo, a la luz de otras propiedades, se conocen como terapias antivasculares o toxinas de vasos de tumor, ya que no sólo inhiben la angiogénesis, sino también inician la destrucción de los vasos del tumor a través de mecanismos en su mayor parte no definidos. Su combinación con la presente invención se considera claramente. La angiostatina y la endostatina se han vuelto el foco de estudios intensos, ya que son los primeros inhibidores de la angiogénesis que han demostrado la capacidad de no sólo inhibir el crecimiento del tumor, sino también causar regresiones de tumor en ratones. Hay múltiples proteasas que han mostrado producir angiostatina a partir del plasminógeno que incluye elastasa, el macrófago metaloelastasa (MME) , matrilisina (MMP-7) , y gelatinasa B/colagenasa tipo IV (MMP-9) de 92 kDA. La MME puede producir angiostatina a partir de plasminógeno en tumores y el factor estimulante de colonia de macrófagos de granulocitos (GMCSF) regula hacia arriba la expresión del MME mediante macrófagos que inducen la producción de angiostatina. El papel de la MME en la generación de angiostatina es soportado por el hallazgo de que la MME está de hecho expresada en muestras técnicas de carcinomas hepatocelulares de pacientes . Otra proteasa que se piensa que es capaz de producir angiostatina es la estromelisina-1 (MMP-3) . La MMP-3 ha demostrado producir fragmentos parecidos a angiostatina a partir de plasminógeno in vitro. Los mecanismos de la acción de la angiostatina actualmente no es claro, se hace la hipótesis de que se enlaza con un receptor superficial de la célula no identificado o sobre células endoteliales que inducen que la célula endotelial sufra muerte celular programada, o detención mitótica. La endostatina parece ser una sustancia aún más poderosa angi-angiogénesis y anti-tumor, aunque su biología es mucho menos clara. La endostatina es efectiva causando regresiones en varios modelos de tumores en ratones . Los tumores no desarrollan resistencia a la endostatina y, después de múltiples ciclos de tratamiento, los tumores entran en un estado latente, durante el cual no aumentan el volumen. En este estado latente, el porcentaje de células de tumor que sufren apoptosis aumentó, produciendo una población que esencialmente permanece del mismo tamaño. La endostatina se piensa también que se enlaza con un receptor superficial de células endoteliales no identificado que media su efecto. La CM101 es un polisacárido bacteriano que se ha caracterizado bien por su capacidad para inducir inflamación neovascular en tumores. El CM101 se enlaza con, y se reticulan receptores expresados en endotelio desdiferenciado que estimula la activación del sistema de complemento. También inicia una respuesta inflamatoria conducida por citocina que selectivamente se dirige al tumor. Es una sustancia antipatoangiogénica exclusiva que regula hacia abajo la expresión del VEGF y sus receptores. El CM101 actualmente en ensayos clínicos está como un fármaco anticáncer, y se puede usar en combinación con la presente. La tromboespondina (TSP-1) y el factor de plaqueta 4 (PF4) también se pueden usar en combinación con la presente invención. Ambos son inhibidores de angiogénesis que se asocian con heparina y se encuenran en alfa-gránulos de plaquetas. La TSP-1 es una glicoproteína de dominios múltiples grande de 450 kDa que es constituyente de la matriz extracelular. La TSP-1 se enlaza con muchas de las moléculas de proteoglicanos encontrados en la matriz extracelular que incluyen, HSPGs, fibronectina, laminina, y diferentes tipos de colágeno. La TSP-1 inhibe la migración de las células endoteliales y la proliferación in vi tro y angiogénesis en vivo. La TSP-1 también suprime el genotipo maligno y la tumorígenesis de células endoteliales transformadas. El gen supresor de tumor p53 se ha demostrado que regula directamente la expresión de la TSP-1, de manera que, la pérdida de la actividad de p53 causa una reducción dramática en la producción de la TSP-1 y un aumento concomitante en la angiogénesis iniciada por tumor. La PF4 es una proteína 7Oaa que es miembro de la familia CXC ELR de quimiocinas que es capaz de inhibir potentemente la proliferación de células endoteliales in vi tro, y la angiogénesis en vivo. La PF4 administrada intratumoralmente o administrada mediante vector adenoviral es capaz de causar una inhibición del crecimiento del tumor. Los interferones y los inhibidores de metaloproteinasas son dos clases de inhibidores angiogénicos quese presentan naturalmente que se pueden combinar con la presente invención. La actividad anti-endotelial de las intefferonas se ha conocido ya desde principios de la década de los 80, sin embargo, el mecanismo de inhibición todavía no es claro. Se sabe que puede inhibir la migración de las células endoteliales y que tiene alguna actividad anti-angiogénica en vivo que posiblemente es mediada por una capacidad para inhibir la producción de promotores angiogénicos por las células del tumor. Los tumores vasculares en particular son sensibles a la interferona, por ejemplo, los hemangiomas proliferantes se pueden tratar con éxito con IFNa. Los inhibidores de tejido de las metaloproteinasas (TIMPs) son una familia de inhibidores que se presentan naturalmente de metaloproteasas de matriz (MMPs) que también pueden inhibir la angiogénesis y se pueden usar en protocolos de tratamiento combinados con la presente invención. Las MMPs representan un papel clave en el proceso angiogénico, ya que degradan la matriz a través de la cual las células endoteliales y los fibrolastos migran cuando se extienden o remodelan la red vascular. De hecho, un miembro de las MMPs, MMP-2 se ha demostado que se asocia con el endotelio activado a través de la integrina avß3 , presumiblemente con este fin. Si esta interacción se interrumpe por un fragmento de MMP-2, entonces la angiogénesis se regula hacia abajo y se inhibe el crecimiento de los tumores. Hay varias sustancias farmacológicas que inhiben la angiogénesis, una o más de las cuales se pueden usar en combinación con la presente invención. Estas incluyen AGM-1470/TNP-470, talidomia, y carboxiamidotriazol (CAÍ). La fumagilina se ha encontrado que es un potente inhibidor de la angiogénesis en 1990, y desde entonces se han desarrollado los análogos sintéticos de la fumagilina, AGM-1470 y TNP-470. Estos fármacos inhiben la proliferación de células endoteliales in vi tro y la angiogénesis en vivo. La TNP-470 se ha estudiado extensamente en ensayos clínicos humanos con datos que sugieren que la administración a largo plazo es óptima. La talidomina originalmente se usó como un sedante, pero se encontró que es un potente teratógeno y se descontinuó. En 1994 se encontró que la talidomina es un inhibidor de la angiogénesis. La talidomina actualmente está en ensayos clínicos como una sustancia anticáncer, así como un tratamiento de enfermedades vasculares del ojo. El CAÍ es un inhibidor sintético de bajo peso molecular de la angiogénesis que actúa como un bloqueador de canal de calcio que evita la reorganización de la actina, la migración de las células endoteliales y la dispersión sobre colágeno IV. El CAÍ inhibie la neovascularización en concentraciones alcanzables fisiológicas y es muy tolerado oralmente por los pacientes de cáncer. Los ensayos clínicos con CAÍ han producido estabilización de enfermedad en el 49 por ciento de los pacientes de cáncer que tienen enfermedad progresiva antes del tratamiento. La cortisona en presencia de la heparina o fragmentos de heparina ha demostrado inhibir el crecimiento de tumores en ratones bloqueando la poliferación de células endoteliales. El mecanismo involucrado en el efecto inhibitorio aditivo del esteroide y la heparina no es claro, aunque se piensa que la heparina puede incrementar la asimilación del esteroide por las células endoteliales. La mezcla ha demostrado aumentar la disolución de la membrana de base que está por debajo de los capilares recientemente formados, y esto también es una posible explicación del efecto angiostático aditivo. Los conjugados de heparina-cortisol también tienen efectos potentes angiostático y anti-tumor de actividad en vivo. Otros inhibidores de angiogénesis específicos, incluyendo, pero no se limitan a, Factor Ant-invasivo, ácidos rétinoicos y paclitaxel (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,716,981; incorporada en la presente mediante referencia); AGM-1470 (Ingber y colaboradores, 1990; incorporada en la presente mediante referencia) ; extracto de cartílago de tiburón (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,618,925; incorporada en la presente mediante referencia) ; poliamida aniónica o oligómeros de poliurea (Patente de los Estados Unidos_de Norteamérica Número 5,593,664; incorporada en la presente mediante referencia) ; derivados de oxindol (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,576,330; incorporada en la presente mediante referencia) derivados de estradiol (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,504,074; incorporada en la presente mediante referencia) ; y derivados de tiazolpirimidina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,599,813; incorporada en la presente mediante referencia) también se contemplan para su uso como composiciones anti-angiogénicas para los usos combinados de la presente invención. Las composiciones que comprenden un antagonista de avß3 integrina también se pueden usar para inhibir la angiogénesis en combinación con la presente invención. Como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,766,591 (incorporada en la presente mediante referencia) , los polipéptidos que contienen RGD y sales de los mismos, que incluyen polipéptidos cíclicos, son ejemplos convenientes de antagonistas de integrina avß3. El anticuerpo LM609 contra la integrina avß3 también induce regresiones de tumores. Los antagonistas de integrina vß3, tales como LM609, inducen la apoptosis de las células endoteliales angiogénicas dejando los vasos sanguíneos quietos no afectados. La LM609 u otros antagonistas de avß3 también pueden trabajar inhibiendo la interacción de vß3 y MMP-2, una enzima proteolítica que se piensa que representa un papel imporante en la migración de células endoteliales y fibroblastos . La apoptosis del endotelio angiogénico en este caso puede tener un efecto de cascada sobre el resto de la red vascular. Al inhibir la red vascular del tumor de responder completamente a la señal del tumor para extenderse se puede, de hecho, iniciar el colapso parcial o completo de la red, dando como resultado la muerte celular del tumor y pérdida del volumen del tumor. Es posible que la endostatina y la angiostatina funcionen e una manera similar. El hecho de que la LM609 no afecta a los vasos quietos, pero es capaz de causar regresiones de tumor sugiere en gran medida que no todos los vasos sanguíneos en el tumor necesitan ser usados como blanco para el tratamiento, con el fin de obtener un efecto antitumor. Las angiopoyetinas no dirigidas, tales como la angioppoyetina-2 , también se pueden usar en combinación con la presente invención. Como se describe anteriormente en el contexto de administración dirigida, los efectos angiogénicos de varios reguladores implican un ciclo de autocrina conectado con la angiopoyetina-2. El uso de angiopoyetina-2 , angiopoyetina-1, angiopoyetina-3 y angiopoyetina-4 , se contempla entonces junto con la presente invención. Otros métodos de intervención terapéutica basada en las señales de alteración a través del receptor Tie2 también se pueden usar en combinación con la presente, tal como usando un receptor soluble Tie2 capaz de bloquear la activación de Tie2 (Lin y colaboradores, 1998) . La administración de esta construcción usando terapia de genes adenovirales recombinantes se puede mostrar que es efectiva para tratar cáncer y reducir metástasis (Lin y colaboradores, 1998) .

J3. Sustancias que Inducen la Apoptosis El tratamiento de sustancia objetivo-sustancia terapéutica también se pueden combinar con métodos de tratamiento que inducen la apoptosis en las células dentro del tumor, incluyendo las células del tumor y las células endotelíales vasculares del tumor. Aunque muchas sustancias anticáncer pueden tener, como parte de su mecanismo de acción, un efecto que induce la apoptosis, ciertas sustancias se han descubierto, diseñadas o seleccionadas con esto como un mecanismo primario, como se describe más adelante. Varios oncógenos se han descrito que inhiben la apoptosís, o la muerte celular programada. Los oncógenos ejemplares en esta categoría incluyen, pero no se limitan a bcr-abl, bcl-2 (distinto de bcl-1, ciclín DI; número de acceso del GenBank M14745, X06487; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,650,491 y 5,539,094; cada una incorporada en la presente mediante referencia) , y miembros de la familia que incluyen Bcl-xl, Mcl-1, Bak, Al, A20. La sobreexpresión de bcl-2 se descubrió primero en linfomas de células T. El bcl-2 funciona como un oncógeno enlazando e inactivando Bax, una proteína en la senda apoptótica. La inhibición de la función de bcl-2 previene la inactivación de Bax, y permite que continúe la senda ápoptótica. De este modo, la inhibición en esta clase de oncógenos, por ejemplo, usando secuencias de nucleótido antisentido, se contempla para su uso en la presente invención en aspectos en donde el aumento de la apoptosis se desea (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,650,491; 5,539,094 y 5,583,034; cada una incorporada en la presente mediante referencia) . Muchas formas de cáncer tienen reportes de mutación en los genes supresores de tumores, tales como p53. La inactivación de p53 da como resultado una falla para promover la apoptosis. Con esta falla, las células del cáncer progresan en la tumorigénesis, en vez de volverse destinadas para la muerte celular. De este modo, la provisión de los supresores del tumor también se contempla para su uso en la presente invención para estimular la muerte celular. Los supresores de tumor ejemplares incluyen, pero no se limitan a, p53, el gen del Retinoblastoma (Rb) , tumor de Wilm (WT1) , bax alfa, enzima que convierte interleucina Ib y familia, el gen MEN-1, neurofibromatosis, tipo 1 (NF1) , inhibidor cdk pl6, gen de cáncer colorrectal (DCC) , gen de poliposis adenmatosis familia! (FAP) , en supresor de tumor múltiple (MTS-1) , BRCAl y BRCA2. Se prefieren para su uso el p53 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,757,469; 5,6771,78 y 5,756,455; cada una incorporada a la presente mediante referencia) , Retinoblastoma, BRCAl (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,750,400; 5,654,155; 5,710,001; 5,756,294; 5,709,999; 5,693,473; 5,753,441; 5,622,829 y 5,747,282; cada una incorporada a la presente mediante referencia) , MEN-1 (número de acceso GenBank U93236) y adenovirus E1A (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,776,743; incorporada a la presente mediante referencia) . Otras composiciones que se pueden usar incluyen genes que codifican el factor de necrosis de tumor relacionado con apoptosis que induce ligandos denominados TRAIL, y el polipéptido TRAIL (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,763,223; incorporada a la presente mediante referencia) ; la proteasa asociada con apoptosis de 24 kD de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,605,836 (incorporada en la presente mediante referencia); el factor asociado Fas 1, FAF1 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,750,653; incorporada a la presente mediante referencia) . También se contempla para su uso en estos aspectos de la presente invención la provisión de la enzima que se convierte en interleucina-lß y los miembros de la familia, los cuales se reporta también que estimula la apoptosis. Los compuestos tales como derivados de carbostirilo (Patente de los Estados Unidos Número 5,672,603; y 5,464,833; cada una incorporada a la presente mediante referencia) ; los péptidos apogénicos ramificados (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,591,717; incorporada en la presente mediante referencia) ; inhibidores de fosfotirosina y análogos de fosfotirosina no hidrolizables (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,565,491; y 5,693,627; cada una incorporada en la presente mediante referencia) ; agonistas de receptores de retinoide RXR (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,399,586; incorporada en la presente mediante referencia) ; y hasta antioxidantes (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,571,523; incorporada en la presente mediante referencia) también se pueden usar. Los inhibidores de tirosinaquinasa, tales como genisteína, también se pueden enlazar a ligandos que se dirigen a un receptor superficial de la célula (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,587,459; incorporada en la presente mediante referencia) . J4. Inmunotoxinas y Coaguligandos Los métodos de tratamiento basados en conjugado anti-aminofosfolípido de la invención se pueden usar en combinación con otras inmunotoxinas y/ó coaguligandos, en donde la porción objetivo de la misma, por ejemplo, el anticuerpo o ligando, se dirige a un marcador relativamente específico de células del tumor, la vasculatura del tumor o el estroma del tumor. En común con las sustancias quimioterapéutica y anti-angiogénicas discutidas anteriormente, el uso combinado de toxinas objetivo distintas o coagulantes generalmente dará como resultado, resultados anti-tumor aditivo, notablemente mayores que aditivos o hasta sinérgicos. Hablando en general, los anticuerpos o ligandos para su uso en estos aspectos adicionales de la invención preferiblemente reconocerán antígenos accesibles al tumor que preferencialmente, o específicamente, se expresan en el sitio del tumor. Los anticuerpos o ligandos también preferiblemente exhibirán propiedades de alta afinidad; y los anticuerpos, ligandos o conjugados de los mismos, no ejercerán efectos laterales en vivo significativos contra tejidos normales que sostienen la vida, tales como uno o más tejidos seleccionados del corazón, riñon, cerebro, hígado, médula ósea, colon, pecho, próstata, tiroide, vesícula biliar, pulmón, adrenales, músculos, fibras nerviosas, páncreas, piel, o los órganos que sostienen la vida o tej ido en el cuerpo humano . El término "efectos laterales significativos", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo, ligando o conjugado de anticuerpo, que, cuando se administra en vivo, producirá solamente efectos laterales despreciables o clínicamente manejables, tales como los normalmente encontrados durante la quimioterapia . Cuando menos una región de enlace de estos segundas sustancias anticáncer empleadas en combinación con la invención será un componente que sea capaz de administrar una toxina o factor de coagulación a la región del tumor, es decir, capaz de localizarse dentro del sitio del tumor. Estas sustancias objetivo se pueden dirigir contra un componente de una célula de tumor, vasculatura de tumor o estroma de tumor. Las sustancias objetivo generalmente se enlazan a un componente localizado en superficie, accesible en superficie o expresado en superficie de una célula de tumor, vasculatura de tumor o estroma de tumor. Sin embargo, en cuanto comienza la destrucción de la vasculatura del tumor y la célula del tumor, los componentes internos se liberarán, permitiendo la dirección adicional de virtualmente todo componente del tumor. Muchos antígenos de células de tumor se han descrito, cualquiera de los cuales podría emplearse como objetivo en relación con los aspectos combinados de la presente invención. Los antígenos de células de tumor adecuados para dirigir el blanco de inmunotoxinas y coaguligandos adicionales incluyen aquellos reconocidos mediante los anticuerpos B3 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,242,813; incorporada en la presente mediante referencia) ; ATCC HB 10573) ; KSI/4 Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,975,369; incorporada en la presente mediante referencia; obtenido de una célula que comprende los vectores NRRL B-18356 y/ó NRRL B-18357) ; 260F9 (ATCC HB 8488) ; y D612 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,183,756; incorporada en la presente mediante referencia; ATCC HB 9796) . También se puede consultar el Catálogo de ATCC de cualquier año posterior para identificar otras líneas celulares adecuadas que producen anticuerpos de células anti-tumor. Para dirigirse a la vasculatura del tumor, el anticuerpo objetivo o ligando frecuentemente enlazará a un marcador expresado por, absorbido por, inducido en, o de otro modo localizado en los vasos sanguíneos intratumorales del tumor vascularizado. Las moléculas objetivo expresadas adecuadas incluyen, por ejemplo, endoglina, E-selectina, P-selectina, VCAM-1, ICAM-1, PSMA (Liu y colaboradores, 1997) , un TIE, un ligando reactivo con LAM-1, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, integrina avß3, pleyotropina y endosialina. Los objetivos adsorbidos convenientes son aquellos tales como VEGF, FGF, TGFß, HGF, PF4 , PDGF, TIMP, un ligando que se enlaza con un TIE y las isoformas de fibronectina asociadas con tumores. Los antígenos naturalmente y artificialmente inducibles por citocinas y coagulantes también se pueden usar como blanco, tales como ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, un ligando reactivo con LAM-1, endoglina, y hasta MHC Clase II (inducible por citocina, por ejemplo, mediante IL-1, TNF-a, IFN-?, IL-4 y/ó TNF-ß; y E-selectina, P-selectina, PDGF e ICAM-1 (inducible por coagulante, por ejemplo, mediante trombina, Factor IX/IXa, Factor X/Xa y/ó plasmina) . Las siguientes patentes y solicitudes de patentes se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para los fines de suplementar aún más las presentes enseñanzas con respecto a la preparación y uso de las inmunotoxinas dirigidas contra marcadores expresados, adsorbidos, inducidos o localizados de la vasculatura del tumor: Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,855,866; 5,776,427; ,863,538; 5,660,827; 5,877,289; 6,004,555; 5,965,132; 6,051,230 y 6,093,399 y la Solicitud de Patente con Número de Serie 07/846,349. Los objetivos estromales de tumor convenientes incluyen componentes de la matriz o estroma extracelular del tumor, o componentes que se enlazan en la misma; incluyendo los marcadorse de membrana base, colágeno tipo IV, laminina, sulfato de heparán, proteoglicano, fibronectinas, plaquetas activadas, LIBS y tenascina. Un objetivo preferido para estos usos es RIBS. Las siguientes patentes y solicitudes de patente se incorporan específicamente en la presente mediante referencia para los propósitos de suplementar adiciionalmente las presentes enseñanzas con respecto a la preparación y uso de sustancias objetivo del estroma del tumor: Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,877,289; 6,004,555; 6,036,955 y 6,093,399. Las segundas sustancias terapéuticas anticáncer se pueden unir operativamente a cualquiera de las sustancias citotóxicas o anticelulares de otro modo descritas en la presente para su uso en las inmunotoxinas anti-aminofosfolípidos. Sin embargo, las sustancias anticelulares convenientes también incluyen radioisótopos. Las fracciones de toxina se preferirán, tales como la cadena de ricina A y la cadena A desglicosilada (dgA) o hasta la gelonina. Cualquiera de una o más de las angiopoyetinas, o fusiones de las mismas, también se puede usar como parte de un segundo inmunoconjugado para la terapia combinada. La segunda sustancia objetivo para uso opcional con la invención puede comprender un componente dirigido que sea capaz de promover la coagulación, es decir, un coaguligando. Aquí, el anticuerpo objetivo o ligando se puede directamente o indirectamente, por ejemplo, vía otro anticuerpo, enlazar con cualquier factor que directamente o indirectamente estimule la coagulación, incluyendo cualquiera de los descritos en la presente para su uso en los coaguligandos anti-aminofosfolípidos. Los factores de coagulación preferidos para estos usos son el Factor de Tejido (TF) y derivados del" Factor de Tejido, tales cmo el Factor de Tejido truncado (tTF), Factor de Tejido dimérico y multimérico, y Factor de Tejido mutante deficiente de la capacidad para activar el Factor VII. Las dosis efectivas de las inmunotoxinas y coaguligandos para su uso combinado en el tratamiento de cáncer estará entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 2 mg/kg, y preferiblemente, de entre aproximadamente 0.8 mg/kg hasta aproximadamente 1.2 mg/kg, cuando se administra vía la ruta intravenosa a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana'. Alguna variación en dosificación necesariamente se presentará dependiendo de la condición del sujeto que se está tratando. El médico responsable de la administración determinará la dosis adecuada para el sujeto individual. ic -k -k Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Deberá apreciarse por los expertos en la técnica, que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y de este modo se pueden considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos con experiencia en la técnica deberán, a la luz de la presente descripción, apreciar que muchos cambios se pueden hacer en las modalidades específicas que se describen, y todavía obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO I Expresión de VCAM-1 en el Tumor y en Vasos Sanguíneos Normales A. Materiales y Métodos 1. Materiales Se obtuvo Na125I de Amersham (Arlingon Heights, IL) . Medio de cultivo de tejido de Dulbecco de Eagle modificado (MEMD) y solución regulada de sulfato (SRF) de Dulbecco que contenía Ca2+ y Mg2+ se obtuvieron de Gibco (Grand Island, NY) . El suero de becerro fetal se obtuvo de Hyclone (Logan, Utah) . El 0-fenilendiamina, peróxido de hidrógeno, 3-aminopropiltrietoxi-silano y solución salina, sin endotoxina, estéril (0.9 por ciento NaCl en 100 mililitros de agua) fueron de sigma (St. Louis, MO) . SMPT fue de Pierce (Rockford, IL) . Proplex T que contenía Factor VII (74 IU/ml) , factor X y factor IX (17 IU/ml) se compró en Baxter Diagnostic Inc. (McGraw Park, IL) . Sustrato cromogénico, S-2765, para medir el factor Xa de la actividad proteolítica se obtuvo de Chromogenix (Franklin, OH) . Factor purificado Xa se compró en American Diagnostica (Greenwich, CT) . Se obtuvieron placas de microtitulación con fondo plano de 96 y 48 de Falcon (Bector Dickinson y Co., Lmcoln Park, NJ) . Cuentas de sefarosa-Proteína G y Superdex S200 se compraron en Pharmacia (Piscataway, NJ) . IL-la murina recombinante se compró en R&D Systems (Minneápolis , MN) . 2. Anticuerpos El hibridoma MK2.7, que secreta un anticuerpo IgGl de rata contra VCMA-1 murino, se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD; ATCC CRL 1909) . La caracterización de este anticuerpo anti-VCAM-1 fue reportada por Miyake y colaboradores (1991, incorporada en la presente mediante referencia) . El hibridoma R187, que secreta un anticuerpo IgGl de rata contra la proteína viral murina p30 gag, también se obtuvo de la ATCC, y se usó como un control apareado de isotipos para el anticuerpo anti-VCAM-1. El anticuerpo monoclonal de ratón, 10H10, contra factor de tej ido humano se preparó como se describe en Morrissey y colaboradores (1988) , y en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 08/482,369, cada una incorporada a la presente mediante referencia. MECA 32, un anticuerpo de célula endotelial vascular anti-ratón, se preparó como se describe por Leppink y colaboradores (1989, incorporada en la presente mediante referencia) . MJ 7/18 IgG de rata, reactivo con endoglina murina, se preparó como se describe por Ge y Butcher (1994, incorporada en la presente mediante referencia) . Los anticuerpos MECA 32 y MJ 7/18 sirvieron como controles positivos para estudios inmunohistoquímicos . Los anticuerpos secundarios de conejo anti-rata y de rata anti-ratón se conjugaron con peroxidasa de rábano (HRP) se compraron de Dako (Carpintería, CA) . 3. Purificación de Anticuerpos El hibridoma anti-VCAM-1, MK 2.7, y el hibridoma de control irrelevante R187, se cultivaron en biorreactores (heraeus, Inc., Alemania) durante 12 días. Los sobrenadantes se centrifugaron, filtraron a través de filtro de 0.22 µm y se cargaron en columnas de Sefarosa-Proteína G. Se eluyó el IgG con regulador de ácido cítrico, pH 3.5, se dializó en SRF y se almacenó después de eso a 4°C en la misma solución reguladora. La pureza se estimó mediante SDS-PAGE y rutinariamente fue mayor del 90 por ciento. La capacidad de enlace del anticuerpo anti-VCAM-1 purificado se valoró inmunohistoquímicamente sobre secciones congeladas de tumor L540 y mediante Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada basada en células, usando células bEnd.3 estimuladas con IL-la, como se describe más adelante en la presente. 4. Ratones que Tienen Tumor e Inmunohistoquímica Ratones machos CB17 SCID (Charles River, Wilmington, MA) que pesaban aproximadamente 25 gramos se inyectaron con 1 x 107 L540 células de linfoma de Hodgkin subcutáneamente en el flanco derecho. Los tumores se dejaron crecer hasta un tamaño de 0.4-0.7 cm3. Los animales se anestesiaron con metafano y la circulación de la sangre se perfusó con salina heparinizada como se describe por Burrows y colaboradores (1992, incorporada en la presente mediante referencia) . El tumor y los órganos principales se removieron y se congelaron en nitrógeno líquido.

Las secciones de criostatos del tejido se cortaron, incubaron con el anticuerpo anti-VCAM- 1 y se mancharon inmunohistoquímicamente para detectar VCAM-1. La IgG de rata se detectó usando IgG anti -rata de conejo conjugada con HRP seguida por el desarrollo con carbazol (Fires y colaboradores, 1993) . B. Resultados Los vasos sanguíneos de los órganos principales y de un tumor de los ratones que tenían tumores de Hodgkin humanos L540 subcutáneos se examinar inmunohistoquímicamente para la expresión de VCAM-1 usando un anticuerpo anti-VCAM-1. La expresión de VCAM-1 en los vasos sanguíneos del tumor fue más periférico que central. Sin embargo, como se demostró en el Ejemplo VI y el Ejemplo VII, el anticuerpo anti -VCAM- 1 y el coaguligando evidentemente se enlazaron con los vasos de transporte de sangre, como claramente se mostró por la capacidad del coaguligando para detener el flujo de sangre en todas las regiones del tumor y causar la destrucción de la región intratumoral . Sobre todo, la expresión del VCAM-1 se observó en 20-30 por ciento de los vasos sanguíneos del tumor total manchados por el anticuerpo anti -endoglina, MJ 7&18. El manchado de VCAM-1 de los vasos del tumor se observó en gran medida en las vénulas. La expresión VCAM-1 fue similar en tumores hasta de 1,500 mm3, pero los tumores más grandes parecieron tener un manchado reducido, con 5-10 por ciento de vasos positivos MJ 7/18 que fueron positivos para VCAM-1. La expresión vascular constitutiva del VCAM-1 se encontró en el corazón y los pulmones, tanto en animales que tenían tumor como en animales normales (Tabla 1) . En el corazón, el manchado fuerte se observó en vénulas y venas. Aproximadamente 10 por ciento de vasos positivos MECA 32 fueron positivos para VCAM-1. El manchado en el endoteliio del pulmón fue débil en comparación con el corazón y el tumor, y se confinó a unos pocos vasos sanguíneos grandes . El manchado en estroma fuerte fue observado en testículos, en donde la expresión de VCAM-1 fue estrictamente extravascular. Hallazgos similarse con respecto a la expresión de VCAM-1 constitutivos en pulmones y testículos de roedores se reportaron previamente (Fires y colaboradores, 1993) .

TABLA 1 Expresión de VCAM-1 en Endotelio en Tejidos de Ratones gue Tienen Tumores L540 y Localización de Anticuerpo Anti-VCAM-1 VCAM-1 se detectó mediante anticuerpo anti-VCAM- 1 seguido por IgG-HRP anti-rata. Localización de anticuerpo anti-VCAM-1 en vivo se determinó inyectando el anticuerpo, sangrando el ratón y manchando los tejidos con IgG-HRP anti-rata. Intensidad del manchado se comparó con marcadores pan-endoteliales MJ 7/18 y MECA 32; - sin mancha; + débil; ++ moderado; +++ fuerte. No se observó expresión vascular; sin embargo, el estroma extravascular de testículos fue manchado por anticuerpo anti-VCAM-1.

EJEMPLO II Localización de Anticuerpo Anti-VCAM-1 en vivo A. Métodos Ratones machos CB17 SCID (Charles River, Wilmington, MA) que pesaban aproximadamente 25 gramos se inyectaron con 1 x 107 L540 de células de linfoma de Hodgkin subcutáneamente en el flanco derecho. Se dejó que los tumores crecieran a un tamaño de 0.4-0.7 cm3. Los ratones se inyectaron intravenosamene con 30 µg 25 gramos de peso corporal de anticuerpo anti-VCAM-1, anticuerpo R187 o coaguligandos corespondientes en 200 microlitros de salina. Dos horas después, los animales se anestesiaron con metafeno y su circulación sanguínea se inundó con salina heparinizada como se describe (Burrows y colaboradores, 1992; incorporada en la presente mediante referencia) . El tumor y los órganos principales se removieron y se congelaron en nitrógeno líquido. Cortes criostáticos de los tej idos se cortan y luego se mancharon inmunohistoquímicamente para determinar la presencia de IgG de rata o TF. Se detectó IgG de rata usando IgG anti-rata de conejo conjugado con HRP seguido por el desarrollo con carbazol (Fires y colaboradores, 1993) . Se detectó coaguligando usando el anticuerpo 10H10 que reconoce factor de tejido humano, seguido por IgG anti-ratón etiquetado HRP. El anticuerpo 10H10 no tuvo reacción cruzada detectablemente con factor de tejido murino (Morrissey y colaboradores, 1988, incorporada en la presente mediante referencia) u otras proteínas murinas . B. Resultados Los ratones que tenían tumores L540 subcutáneos se inyectaron intravenosamente con anticuerpo anti-VCAM-1, dos horas después, los ratones fueron desangrados. El tumor y los órganos normales se removieron y secciones congeladas se prepararon y examinaron inmunohistoquímicamente para determinar la localización del anticuerpo. Cortes en serie de los tejidos se examinaron. Se detectó IgG de rata localizada mediante Ig anti-rata etiquetada con HRP; y los vasos de sangre murina se identificaron mediante anticuerpo pan-endotelial, MECA 32. Se detectó anticuerpo anti-VCAM-1 en el endotelio del tumor, corazón y pulmón (Tabla 1) . La intensidad y el número de vasos manchados fue idéntico al de las secciones en serie de los mismos tejidos manchados directamente con anticuerpo anti-VCAM-1 (Tabla 1) . El machado fue específico, ya que no se observó manchado de endotelio y en el tumor y órganos de los ratones inyectados con un anticuerpo apareado con isotipo de la especie de especificidad irrelevante, R187. No se encontró anticuerpo anti-VCAM-1 en testículos o en ningún órgano normal, el corazón y los pulmones .

EJEMPLO III Preparacón de Coaguligando Anti-VCAM-l*tTF Un conjugado anti-VCAM-l*tTF o "coaguligando" se preparó como sigue. El factor de tejido truncado (tTF), con cisteína adicional añadida se introdujo en el término N (Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/482,369, incorporada en la presente mediante referencia) , se expresó en E. coli y se purificó como se describe por Stone y colaboradores (1995, incorporada en la presente mediante referencia) . Después de la purificación, el grupo sulhidrilo de N1 -cisteína-tTF se protegió mediante la reacción con reactivo de Ellman. El derivado tTF se almacenó en volúmenes pequeños a -70°C. Para preparar el coaguligando anti-VCAM-1, 5 mililitros de IgG anticuerpo anti-VCAM-1 (2 miligramos/ mililitro) en SRF se mezclaron con 36 microlitros de SMPT (10 mM) disuelto en DMF seco y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se filtró a través de una columna de Sefadex G25 equilibrada en SRF que contenía 1 mM de AEDT. Las fracciones que contenían el anticuerpo derivado SMPT se concentraron a 4 mililitros mediante ultrafiltración en una célula Amicon equipada con 10,000 Da de filtro cortado. El derivado tTF descongelado recientemente se incubó con 30 microlitros de DTT (10 mM) en H20 durante 10 minutos a temperatura ambiente y se filtró a través de una columna de Sefadex; G25 equilibrada en SRF que contenía 1 mM de AEDT. Las fracciones eluidas que contenían tTF reducido se concentraron mediante ultrafiltración bajo nitrógeno a un volumen final de 3 mililitros. El tTF reducido se mezcló con anticuerpo derivado de SMPT y la mezcla se dejó reaccionar durante 24 horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, la mezcla de la reacción se resolvió mediante filtración en gel sobre una columna de Superdex S200 equilibrada en SRF. Fracciones que contenían anti-VCAM-l»tTF que tenían un Mr de 180,000 y que corresponden a una molécula de anticuerpo enlazado a una molécula de tTF se recolectó.

EJEMPLO IV Enlace de Coaguligando Anti-VCAM- 1 con Células Endoteliales Activadas Métodos 1. Yodación de anticuerpo 10H10 El anticuerpo factor de tejido antihumano, 10H10, se reetiquetó con 125I usando Cloramina T como se describe por Bocci (1964, incorporado en la presente mediante referencia) . La actividad específica fue aproximadamente de 10,000 cpm/µg, como se calcula a partir de las determinacione de proteína medidas mediante un ensayo de Bradford (Bradford, 1976) . 2. Células Células de Hodgkin L540 (L540 Cy) , derivadas de un paciente con enfermedad terminal, se prepararon como se describe en Diehl y colaboradores (1985, incorporada en la presente mediante referencia) , y se obtuvieron del Prof. Volker Diehl (Klinik fur Innere Medizin der Univsersitaet , Kóeln, Alemania) . Células bEnd.3 (endotelioma de cerebro murino) se prepararon como se describe en Bussolino y colaboradores (1991) y Montesano y colaboradores (1990) , cada una incorporada en la presente mediante referencia, y se obtuvieron del Prof. Werner Risau (Max Planck Institute, B d Nauheim, Alemania) . 3. Cultivo de Tejido " Las células bEnd.3 y los hibridomas se mantuvieron en MEMD suplementado con 10 por ciento de suero de becerro fetal, 2 mM L-glutamina, 2 unidades/mililitro de penicilina G y 2 µm/ml de' estreptomicina. Células L540 se mantuvieron en RPMI 1640 que contenían los mismos aditivos. Todas las células se subcultivaron una vez por semana. Se realizó tripsinización bEnd.3 usando 0.125 por ciento de tripsina en solución de SRF que contenía 0.2 por ciento AEDT. Para estudios de enlace, las células se sembraron a una densidad de 5 x 104 células/ mililitro en 0.5 mililitros de medio en placas de 48 pozos y se incubaron durante 48-96 horas. El medio se renovó 24 horas antes de cada estudio. 4. Enlace de Coaguligando con Células Endoteliales Activadas . El enlace de anticuerpo anti -VCAM- 1 y coaguligando con VCAM-1 en células bEnd.3 activadas se determinó usando un Ensayo inmunosorbente de enzima enlazada basado en células, como se describe por Hahne (1993, incorporado en la presente mediante referencia) . Las células bEnd.3 se incubaron con 10 unidades/mililitro de IL-la durante 4 horas a 37°C en placas de microtitulación de 96 pozos. Al final de esta incubación, el medio se reemplazó por SRFD que contenía 2 mM Ca2+ y Mg2+ y 0.2 por ciento (peso/volumen) gelatina como una proteína portadora. El mismo regulador se usó para la dilución de anticuerpos y para el lavado de las monocapas de células entre los pasos . Las células se incubaron con 4 µg/ml de conjugado anti-VCAM-l*tTf , anticuerpo anti-VCAM*l o reactivos de control durante 2 horas, y luego se lavaron e incubaron durante 1 hora con conjugado IgG-HRP anti-rata de conejo (dilución 1:500). Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente. Se midió la actividad HRP añadiendo O-fenilendiamina (0.5 miligramos/ mililitro) y peróxido de hidrógeno (0.03 por ciento peso/volumen) en regulador citrato-fosfato, pH de 5.5. Después de 30 minutos, 100 microlitros de sobrenadante se transfirieron a placas de 96 pozos, 100 microlitros de 0.18 M H2S04 se añadieron y se midió la absorbencia a 492 nm. Cada estudio se realizó por duplicado y se repitió cuando menos dos veces. 5. Detección de Enlace Coaguligando con Células Endoteliales. El coaguligando anti-VCAM-1 y controles adecuados se incubaron con células bEnd.3 estimulada con IL-la. en placas de microtitulación de 96 pozos, como se describió anteriormente. Los coaguligandos de enlace se detectaron identificando tanto el componente de factor de tej ido como el componente de IgG de rata enlazado con células bEnd.3. Después de remover el exceso de anticuerpo no enlazado, las células se incubaron con 100 µl/pozo de anticuerpo 10HH etiquetado con 125I (0.2 µg/ml) o Ig anti-rata de ratón etiquetado con 15I (0.2 µg/ml) en regulador de enlace. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron extensamente y se disolvieron en 0.5 M de NaOH. El volumen entero de 0.5 mililitros se transfirió a tubos de plástico y se contó en un contador y. Cada estudio se realizó por duplicado y se repitió cuando menos dos veces. B. Resultados La capacidad de un coaguligando anti-VCAM-l*tTF para enlazarse con células bEnd.3 murinas activadas con IL-la se determinó midiendo el enlace de anticuerpo anti-TF radioyodado 323 mililitro) y peróxido de hidrógeno (0.03 por ciento peso/volumen) en regulador citrato-fosfato, pH de 5.5. Después de 30 minutos, 100 microlitros de sobrenadante se transfirieron a placas de 96 pozos, 100 microlitros de 0.18 M H2S04 se añadieron y se midió la absorbencia a 492 nm. Cada estudio se realizó por duplicado y se repitió cuando menos dos veces. 5. Detección de Enlace Coaguligando con Células Endoteliales. El coaguligando anti-VCAM-1 y controles adecuados se incubaron con células bEnd.3 estimulada con IL-la en placas de microtitulación de 96 pozos, como se describió anteriormente. Los coaguligandos de enlace se detectaron identificando tanto el componente de factor de tejido como el componente de IgG de rata enlazado con células bEnd.3. Después de remover el exceso de anticuerpo no enlazado, las células se incubaron con 100 µl/pozo de anticuerpo 10HH etiquetado con 125I (0.2 µg/ml) o Ig anti-rata de ratón etiquetado con 125I (0.2 µg/ml) en regulador de enlace. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron extensamente y se disolvieron en 0.5 M de NaOH. El volumen entero de 0.5 mililitros se transfirió a tubos de plástico y se contó en un contador ? . Cada estudio se capacidad del anticuerpo para enlazarse con VCAM-1 en monocapas endoteliales intactas .

EJEMPLO V Activación del Factor X Mediante Coaguligando Enlazado con Células Endoteliales A. Métodos La actividad del coaguligando anti-VCAM-l»tTF enlazado con células bEnd.3 activadas se determinó indirectamente usando un ensayo cromogénico para detectar el factor Xa (Schorer y colaboradores, 1985; Nawroth y colaboradores, 1985; cada una incorporada en la presente mediante referencia). Las células bEnd.3 estimuladas con IL-la y no estimuladas se incubaron con coaguligandos específicos y de control en placas de microtitulación de 96 pozos como se describió anteriormente. Las células se lavaron con SRF que contenían 2 miligramos/mililitros de ASB y se incubaron con 150 microlitro/pozo de solución de Proplex T preparado recientemente diluida 1:20 en 50 mM Tris-HCl (pH de 8.1), 150 mM NaCl, 2 miligramos/mililitro de ASB (grado de cultivo de tejido, libre de endotoxinas) , y 2.5 mM de CaCl2. Después de la incubación durante 60 minutos a 37°C, 100 microlitros se retiraron de cada pozo, se transfirieron a placas de 96 pozos y se mezclaron con 100 µm del mismo regulador que contenía 12.5 mM de AEDT (ph 8.1) .

El sustrato cromogénico S2765 para medir la actividad proteolítica del factor Xa se añadió en 50 µl , dando una concentración final de 300 µM. El deterioro del sustrato se determinó leyendo la absorbancia a 405 nm durante un período de 2 horas en un lector de microplacas (Molecular Devices, Palo Alto, CA) . La producción del producto cromogénico fue completamente dependiente de la presencia de Proplex T y las células bEnd.3 preincubadas con el coaguligando específico. La hidrólisis del fondo del sustrato mediante Proplex T en ausencia de células fue aproximadamente del 10 por ciento del valor máximo y se sustrajo de cada determinación. Coaguligandos libres diluidos en solución de Proplex T fueron incapaces de generar factor Xa. La cantidad de Xa generada se calculó mediante referencia con una curva estándar construida con concentraciones conocidas de factor Xa purificado. Al final del estudio, las células se desprendieron con tripsina-AEDT y se contaron. Los resultados se expresan como la cantidad de factor Xa generado por 104 células. Cada estudio se realizó por duplicado y se repitió cuando menos 3 veces . B. Resultados 1. Activación del Factor X El coaguligando anti-VCAM-l*tTF enlazado con células bEnd.3 activadas con IL-la fue capaz de activar específicamente el factor X. La tasa de generación del factor Xa mediante células recubiertas con anti-VCAM-l«tTF fue de 3.2 ng por 104 células por hora, lo cual es de 7 a 10 veces más alta que la que se observó con células activadas tratadas con un coaguligando de control de especificidad irrelevante o con tTF solo (Figura IB) . El anti-VCAM-!•tTF en ausencia de células tuvo una actividad de activación del factor X indetectable, confirmando que el enlace de células es esencial para la actividad de coaguligando. El anti -VCAM- l*tTF enlazado con células bEnd.3 no estimuladas activaron el factor X a una tasa de 1.6 ng por 104 células por hora. Esta tasa es de aproximadamente la mitad de la observada con las células estimuladas con IL-l , de acuerdo con la cantidad más baja del 50 por ciento de coaguligando que se enlaza con no estimuladas en comparación con células estimuladas. Los resultados similares a los mostrados en la Figura IB se obtuvieron en tres estudios por separado. 2. Efecto de Permeabilización de Células Endoteliales La permeabilización de monocapas de bEnd.3 con saponina después de tratarlas con coaguligando anti-VCAM-l*tTF aumentó la capacidad del coaguligando de enlace para activar el factor X en aproximadamente 30 veces (Tabla 2) . La tasa de la generación del factor Xa por células no estimuladas tratadas con anti-VCAM-l*tTF aumentó de 1.6 a 49.2 ng por 104 células por hora después de la permeabilización, mientras que las células estimuladas con IL-la aumentó de 3.2 a 98.8 ng por 104 células por hora. La actividad de generación del factor Xa de las células permeabilizadas debido al coaguligando de enlace en vez de al factor de tejido endógeno desde las células no tratadas permeabilizadas, o células tratadas con coaguligando de control de especificidad irrelevante tuvieron una actividad de generación de factor Xa baja (2 ng por 104 células por hora) . Estos resultados indican que el coaguligando es capaz de funcionar más eficientemente en el ambiente de una célula permeabilizada . Posiblemente, la permeabilización expone los fosfolípidos cargados negativamente, a partir de los cuales la célula que acelera la formación de los complejos de iniciación de la coagulación, o aún evita la inactivación de estos complejos mediante TFPI .

TABLA 2 Generación del Factor Xa Mediante el Enlace con Anti-VCAM-1*tTF con Células bEnd.3 Intactas ó Permeabilizadas (ng por 104 Células por 60 minutos) Las células bEnd.3 estimuladas con IL-la y no estimuladas se incubaron con solución reguladora solamente o con 4 µg/ml de tTF, IgG.»tTF de control o anti-VCAM-!•tTF seguido por 60 minutos de incubación con solución Proplex T a 37°C. Las células se trataron con 0.2 por ciento de saponina 5 minutos antes de la adición de Proplex T. Se determinó la cantidad del factor Xa como se describió anteriormente. Los resultados se expresaron como ng del factor Xa generado por 104 células por 60 minutos. Los valores del promedio aritmético de los pozos por triplicado se muestran. SE fue menos de 5 por ciento de los valores promedio.

EJEMPLO VI Trombosis de Vaso Sanguíneo del Tumor Mediante Coaguligando Anti-VCAM-1 A. Métodos Los ratones CID que tenían tumores L540 (0.4-0.7 cm3) fueron inyectados intravenosamente con 40 µg (proteína total) de anti-VCAM-1»tTF o R187»tTF. Esta dosis corresponde a 32 µg de anticuerpo y 8 µg de tTF. Otros animales recibieron cantidades equivalentes de anticuerpo libre, tTF libre o una mezcla de ambos. Ambos animales se anestesiaron 4 o 24 horas después y las circulaciones de sangre fueron inundadas con solución salina heparinizada. El tumor y los órganos principales fueron removidos y se fijaron en formalina y se sumergieron en parafina o se congelaron para crioseccíonamiento . Las secciones se cortaron a través del centro del tejido o tumor. El número de vasos sanguíneos trombosados o no trombosados en 5 cortes transversales se contaron. El porcentaje de vasos trombosados se calculó. B. Resultados 1. Trombosis de Vasos Sanguíneos de Tumor Este estudio muestra que la administración intravenosa del coaguligando anti-VCAM-1*tTF induce la trombosis selectiva de los vasos sanguíneos del tumor, en oposición a los vasos en tejidos normales, en ratones que tenían tumores . El coaguligando anti-VCAM-l»tTF se administró a los ratones que tenían tumores subcutáneos L540 de 0.4 a 0.6 centímetros de diámetro. Antes de la inyección del coaguligando, los tumores estaban sanos, teniendo una morfología uniforme, careciendo de regiones de necrosis. Los tumores se vascularizaron bien y tenían una ausencia completa de vasos trombosados espontáneamente o hemorragias . Dentro de cuatro horas de inyección de coaguligando, 40-70 por ciento de vasos sanguíneos estaban trombosados, a pesar del manchado inciial de solamente 20-30 por ciento de vasos sanguíneos de tumor mostrado en el Ejemplo I. Los vasos trombosados contenían agregados de plaquetas oclusivas, eritrocitos empacados y fibrina. -En varias regiones, los vasos sanguíneos se habían roto, derramando eritrocitos en el intersticio del tumor. A las 24 horas después de la inyección de coaguligando, los vasos sanguíneos todavía estaban ocluidos y una hemorragia extensa se había extendido en todo el tumor. Las células del tumor se habían separado una de la otra, tenían núcleos picnóticos y estaban sufriendo citólisis. A las 72 horas, la necrosis avanzada era evidente en todo el tumor. La necrosis estaba claramente presente en la región intratumoral del tumor, en donde la expresión del VCAM-1 de los vasos no era originalmente prominente. El enlace de coaguligando evidentemente fue efectivo para cortar el flujo sanguíneo en todas las regiones del tumor, dando como resultado una destrucción del tumor extendida ampliamente. Además, es probable que el depósito de trombina inducida de coaguligando inicial diera como resultado una inducción creciente del antígeno objetivo VCAM-1 en los vasos centrales, amplificando de este modo la dirección y la destrucción del tumor. La acción trombótica del anti-VCAM-l»tTF en los vasos del tumor fue específica del antígeno. Ninguno de los reactivos de control administrados en cantidades equivalentes (tTF solo, anticuerpo anti-VCAM-1 solo, tTF más anticuerpo anti-VCAM-1 o el coaguligando de control de especificidad irrelevante) causaron trombosis (Tabla 3) .

TABLA 3 Trombosis Mediada por Anti-VCAM-1*tTF en Ratones que Tenían Tumores L540 Los ratones que tenían tumores L540 se inyectaron intravenosamente con uno de los siguientes reactivos : salina; 8 microgramos de tTF no conjugado; 32 microgramos de anticuerpo anti-VCAM-1 no conjugado; mezcla de 8 microgramos de tTF y 32 microgramos de anticuerpo anti-VCAM-1; 40 microgramos de coaguligando IgG*tTF de control; o 40 microgramos de coaguligando anti-VCAM-l*tTF. Los animales se sacrificaron 4 horas después de la inyección. Los tejidos se removieron y se fijaron en formalina. b La cuantificación histológica se realizó contando números de vasos sanguíneos trombosados en 5 cortes transversales de tejido. El número de vasos trombosados se expresa como un porcentaje de vasos totales. El rango de resultados de tres ratones es dado. c Ratones que tenían tumores L540 se dividieron en dos grupos (5-8 animales por grupo) que tenían tumores menores o mayores de 0.3 cm3) . 2. Falta de Trombosis de los Vasos Sanguíneos Normales Además de la trombosis de los vasos sanguíneos del tumor, este estudio también muestra que la administración intravenosa del coaguligando anti-VCAM-l*tTF no induce trombosis de vasos sanguíneos en órganos normales. A pesar de la expresión de VCAM-1 en los vasos del corazón y del pulmón de ratones que tenían tumores L540 y ratones normales (Tabla 1) , la trombosis no se presentó después de la administración del coaguligando anti-VCAM-l»tTF. No se mostraron signos de trombosis, daños de tejido o morfología alterada en 25 ratones inyectados con de 5 a 45 microgramos de coaguligando 4 o 24 horas anteriormente. Había una apariencia histológica normal del corazón y pulmón de los mismos ratones que tenían trombosis de tumor grande. Todos los demás órganos principales (cerebro, hígado, riñon, bazo, páncreas, intestino, testículos) también tenían morfología no alterada. Las secciones congeladas de órganos y tumores a partir de los ratones tratados con coaguligando dieron patrones de manchado coincidentes cuando se revelaron, ya sea con anticuerpo anti-TF, 10H10, o un anticuerpo IgG anti-rata y se confirmó que el coaguligando se había localizado en los vasos en el corazón, pulmón y el tumor. La intensidad de manchado fue igual al visto cuando el coaguligando se aplicó directamente a las secciones a altas concentraciones seguidas por un desarrollo con anti-TF o IgG anti-rata, indicando que la saturación del enlace había sido alcanzada en vivo. Estos estudios muestran que el enlace del coaguligando con VCAM-1 en vasculatura normal en el corazón y pulmón no es suficiente para inducir trombosis, y que la vasculatura del tumor proporciona factores adicionales para soportar la coagulación.

EJEMPLO VII Destrucción del Tumor en Vivo Mediante Coaguligando Anti-VCAM-1 A. Métodos Ratones machos CB17 SCID se inyectaron simultáneamente con 1 x 107 células L540 como se describió anteriormente. Cuando los tumores habían alcanzado un volumen de 0.4-0.6 cm3, los ratones fueron inyectados intravenosamente, ya sea con 20 microgramos de anti-VCAM-l*tTF, 16 microgramos de anticuerpo anti-VCAM-1, 4 microgramos de tTF, una mezcla de 16 microgramos de anticuerpo anti-VCAM-1 y 4 microgramos de tTF, 20 microgramos de IgG»tTF de control o solución salina. En algunos estudios, el tratamiento se dió 3 veces, en los días 0, 4 y 8. Un mínimo de 8 animales se trataron en cada grupo. Los animales se monitorearon diariamente para las mediciones del tumor y peso corporal . Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un diámetro de 2 cm3, o antes, si los tumores mostraron signos de necrosis o ulceración. El volumen del tumor se calculó de acuerdo con la fórmula p/6 x D x d2, en donde D es el diámetro de tumor más grande y d es el diámetro menor del tumor. Las diferencias en tasas de crecimiento del tumor se probaron para determinar su significancia estadística usando una prueba no paramétrica (prueba de suma de rango Mann-Whitney) que no hace supuestos acerca del tamaño del tumor normalmente distribuido (Gibbons, 1976) . B. Resultados La actividad anti-tumor del coaguligando anti-VCAM-l»tTF se determinó en ratones SCID que tenían tumores de 0.3-0.4 cm3 L540. El fármaco se administró intravenosamente 3 veces en intervalos de 4 días. Los resultados recopilados de 3 estudios separados se presentaron en la Figura 2 y en la Tabla 4. El volumen medio del tumor de los ratones tratados con anti-VCAM-1«tTF se redujo significativamente a los 21 días de tratamiento (P < 0.001) en comparación con todos los otros grupos. Nueve de un total de 15 ratones tratados con el coaguligando específico mostraron más del 50 por ciento de reducción en el volumen del tumor. Este efecto fue específico, ya que el tTF no conjugado, el coaguligando IgG de control y la mezcla de anticuerpo anti-VCAM-1 libre y tTF no afectó el crecimiento del tumor.

TABLA 4 Inhibición del Crecimiento del Tumor Mediante el Coaguligando Anti-VCAM-l»tTF Volumen medio del índice P ver¬ Tratamiento3 n tumor (mm3) b de cresus cimiensalinad Día 0 Día 21 to de tumor Salina 14 331 + 61 2190 + 210 6.91 TTF 13 341 + 22 2015 + 205 5.90 NS Anti -VCAM- 1 16 363 + 24 1920 + 272 5.28 NS Anti-VCAM- 1+tTF 13 349 + 42 2069 + 362 5.92 NS IgG»tTF de control 8 324 + 30 2324 + 304 7.17 NS Anti-VCAM-!•tTF 15 365 + 28 1280 + 130 3.50 < 0.001 Ratones que tenían tumores L540 se inyectaron intravenosamente con uno de los siguientes reactivos: salina; 8 microgramos de tTF no conjugado; 32 microgramos de anticuerpo anti-VCAM-1 no conjugado,- mezcla de 8 microgramos de tTF y 32 microgramos de anticuerpo anti-VCAM-1; 40 microgramos de coaguligando IgG*tTF de control; o 40 microgramos de coaguligando anti-VCAM-l»tTF. El tratamiento se repitió el día 4 y 7 después de la primera inyección. Volumen medio del tumor +. desviación estándar. El índice de crecimiento del tumor es la proporción del volumen medio del tumor en el día 21 contra el volumen medio del tumor en el día 0. Dos valores de P consecutivos son para diferencias en el volumen del tumor (día 21) para el grupo tratado contra el grupo de salina determinados mediante la prueba de la suma de rango Mann-Whitney.

EJEMPLO VIII Expresión de Fosfatidilserina en Vasos Sanguíneos del Tumor A. Métodos 1. Anticuerpos Los anticuerpos anti-fosfatidilserina (anti-PS) y anti-cardiolipina, ambos anticuerpos IgM monoclonales de ratón, se produjeron como se describe por Rote (Rote y colaboradores, 1993) . Los detalles de la caracterización de los anticuerpos anti-PS y anti-cardiolipina también se reportaron por Rote y colaboradores (1993, incorporada en la presente mediante referencia) . 2. Detección de la Expresión de PS en Endotelio Vascular Ratones que tenían tumores L540 se inyectaron intravenosamente con 20 microgramos, ya sea de anticuerpos anti-PS o anticuerpos IgM de anti-cardiolipina de ratón. Después de 10 minutos, los ratones se anestesiaron y sus circulaciones sanguíneas fueron inundadas con salina heparinizada. Los tumores y los tejidos normales se removieron y se congelaron. Las secciones en serie de órganos y tumores se mancharon, ya sea con IgM anti-ratón etiquetada con HRP para la detección o anticuerpo anti-PS o con anticuerpo anti-VCAM-1 seguido por Ig anti-rata etiquetada con HRP. Para preservar los fosfolípidos de membrana en secciones congeladas, se desarrolló el siguiente protocolo. Los animales se inundaron con SRFD que contenía 2.5 mM Ca2+ . Los tejidos se montaron en porta-objetos recubiertos con 3-amino-propiltrietoxisilano y se mancharon dentro de 24 horas. No se usaron solventes orgánicos, formaldehído ni detergentes para la fijación o lavado de los porta-objetos. Los porta-objetos se rehidrataron mediante SRFD que contenía 2.5 mM Ca2+ y 0.2 por ciento de gelatina. La misma solución se usó para lavar secciones para remover el exceso de reactivos. Las secciones se incubaron con IgM anti-ratón etiquetada con HRP durante 3.5 horas a temperatura ambiente para detectar IgM anti-PS. B. Resultados Para explicar la falta de efecto trombótico de anti-VCAM-l»tTF en la vasculatura positiva VCAM-1 en corazón y pulmones, los inventores desarrollaron un concepto de lócalización de PS diferencial entre los vasos sanguíneos normales y de tumor. Específicamente, lanzaron la hipótesis de que las células endoteliales en los tejidos normales segregan PS a la superficie interna de la bicapa de fosfolípido de la membrana de plasma, en donde es incapaz de participar en reacciones trombóticas; mientras que las células endoteliales en los tumores translocalizan PS a la superficie externa de la membrana de plasma, en donde puede soportar la acción de coagulación del coaguligando. La expresión de PS sobre la superficie de la célula permite la coagulación, debido a que permite la unión de factores de coagulación a la membrana y coordina el ensamble de los complejos de inicio de coagulación (Ortel y colaboradores, 1992) . El modelo de los inventores de la translocalización de PS en la superficie de las células endoteliales de los vasos sanguíneos del tumor, como se desarrolla en la presente, es sorprendente, porque la expresión de PS no ocurre después, y no dispara inevitablemente, la muerte celular. La expresión de PS en la superficie de la célula endotelial del tumor de este modo es suficientemente estable para permitir que PS sirva como una entidad objetivo para la intervención terapéutica. Para confirmar la hipótesis de que el endotelio del vaso sanguíneo del tumor expresa PS sobre la superficie luminal de la membrana del plasma, los inventores usaron inmunohistoquímica para determinar la distribución del anticuerpo anti-PS después de la inyección intravenosa en ratones que tenían tumores L540. El anticuerpo anti-PS localizado dentro de 10 minutos a la mayoría de los vasos sanguíneos del tumor, incluyendo los vasos en la región central del tumor que" carecen de VCAM-1. Los vasos que eran positivos para VCAM-1 también fueron positivos para PS . De este modo, hay una expresión coincidente para PS en los vasos que expresan VCAM-1 en tumores. En los estudios de localización en vivo, ninguno de los vasos en órganos normales, incluyendo la vasculatura positiva para VCAM-1 del corazón y pulmón, se mancharon, indicando que PS está ausente de la superficie externa de las células endoteliales. En cambio, cuando las secciones en tejidos normales y tumores se mancharon directamente con anticuerpo anti-PS in vi tro, no hubo diferencias visibles entre los tipos de células normales y de tumor, endoteliales o de otras, mostrando que PS está presente dentro de estas células, pero solamente se expresa en la superficie de células endoteliales en tumores.

La especificidad de la detección de PS fue confirmada por dos estudios independientes. Primero, un anticuerpo monoclonal IgM de ratón dirigido contra un lípido cargado negativamente diferente, cardiolipina, no llegó al tumor o a ningún órgano en vivo. Segundo, el pretratamiento de secciones congeladas con acetona abolió el manchado con anticuerpo anti-PS, presumiblemente debido a que extrajo los lípidos junto con el anticuerpo anti-PS de enlace.

EJEMPLO IX Activación del Coaguligando de Bloques de Anexín V del Factor X In Vi tro A. Métodos La capacidad de Anexín V para afectar la formación del Factor Xa inducida por coaguligando fue determinada por un ensayo cromogénico descrito anteriormente en el Ejemplo V.

Células bEnd.3 estimuladas con IL-la se incubaron con anti- VCAM-l»tTF y se permeabilizaron mediante saponina. Se añadió Anexín V a concentraciones variantes de 0.1 a 10 µg/ml, y las células se " incubaron durante 30 minutos antes de la adición de Proplex T diluido. La cantidad de Factor Xa generado en la presencia o ausencia de Anexín V se determinó como se describe en el Ejemplo V. Cada tratamiento se realizó por duplicado y se repitió cuando menos dos veces. B. Resultados La necesidad de* la expresión de PS en superficie en la acción de coaguligando se indica además por el hallazgo de los inventores de que el Anexín V, que se enlaza con PS con alta afinidad, bloquea la capacidad del enlace anti -VCAM- 1*tTF con las células bEnd.3 para generar el Factor Xa in vi tro . El Anexín V añadido a células permeabilizadas preincubadas con anti-VCAM- l»tTF inhibió la formación del Factor Xa de una manera dependiente de la dosis (tigura 3) . En ausencia de Anexín V, el coaguligando enlazado con célula produjo 95 ng de Factor Xa por 10,000 células por 60 minutos. La adición de cantidades crecientes de Anexín V (en el rango de microgramo por mililitro) inhibió la producción del Factor Xa. A 10 µg por mililitro, el Anexín V inhibió la producción del Factor Xa en 58 por ciento (Figura 3) . No se observó inhibición adicional aumentando la concentración de Anexín V durante el ensayo, indicando que Anexín V saturó todos los sitios de enlace disponibles a 10 microgramos por mililitro.

EJEMPLO X Actividad de Coaguligando de Bloques de Anexín V en Vivo A. Métodos La capacidad de Anexín V para inhibir la trombosis inducida por coaguligando en vivo fue examinada en ratones SCID que tenían tumores L540 de Hodgkin. Los tumores se hicieron crecer en los ratones como se describió anteriormente en el Ejemplo II. Dos ratones por grupo (tamaño de tumor 0.5 centímetros de diámetro) se inyectaron intravenosamente vía la vena de la cola con uno de los siguientes reactivos: a) salina: b) 100 microgramos de Anexín V; c) 40 microgramos de anti-VCAM-l»tTF; d) 100 microgramos de Anexín V seguido 2 horas después por 40 microgramos de anti -VCAM-l»tTF. Cuatro horas después de la última inyección, los ratones se anestesiaron y se inundaron con salina heparinizada. Los tumores se removieron, se fijaron con 4 por ciento de formalina, se sumergieron en parafina y se mancharon con hematoxileno-eosina. El número de vasos sanguíneos trombosados y no trombosados se contaron, y el porcentaje de trombosis se calculó . B. Resultados Anexín V también bloquea la actividad del coaguligando anti -VCAM- l»tTF en vivo. Grupos de ratones que tenían tumores se trataron con uno del control o reactivo de prueba, como se describe en los métodos. A los ratones se les dió (a) salina; (b) 100 microgramos de Anexín V; (c) 40 microgramos de coaguligando anti-VCAM-l»tTF; o (d) 100 microgramos de Anexín V seguido dos horas después por 40 microgramos de coaguligando anti-VCAM-l»tTF. Se obtuvieron resultados idénticos en ambos ratones por grupo. No se observó ninguna trombosis espontánea, hemorragias ni necrosis en tumores derivados de los ratones inyectados con salina. El tratamiento con Anexín V solo tampoco alteró la morfología del tumor. De acuerdo con otros datos presentados en la presente, 40 microgramos de coaguligando anti-VCAM- !•tTF causó trombosis en 70 por ciento de los vasos sanguíneos del tumor totales. La mayoría de vasos sanguíneos se ocluyeron con eritrocitos y coágulos empacados, y las células del tumor se separaron entre sí. Ambos efectos anti-tumor inducidos por coaguligando, es decir, la trombosis intravascular y los cambios en la morfología de las células del tumor, se abolieron completamente pre-tratando los ratones con Anexín V. Estos hallazgos confirman que los efectos anti-tumor de los coaguligandos son mediados a través del boqueo de la vasculatura del tumor. Estos datos también demuestran que la PS es esencial para la trombosis inducida por coaguligando en vivo.

EJEMPLO XI La Fosfatidilserina Externalizada es un Marcador Global de los Vasos Sanguíneos del Tumor A. Métodos La exposición de PS en el endotelio vascular normal y de tumor se examinó en tres modelos de tumores de animales : linfoma de Hodgkin L540y carcinoma de pulmón de célula no pequeña NCI-H358, y adenocarcinoma de colon HT 29 (ATCC) . Para cultivar los tumores en vivo, se inyectaron 2 x 106 células en el flanco derecho de los ratones SCID y se dejaron alcanzar 0.8-1.2 centímetros de diámetro. Los ratones que tenían tumores grandes (volumen de aproximadamente 800 mm3) se inyectaron intravenosamente vía la vena de la cola con 20 microgramos de, ya sea, anticuerpos anti-PS o anti-cardiolipina. El anticuerpo de anti-cardiolipina sirvió como un control para todos los estudios, ya que ambos anticuerpos se dirigen contra lípidos cargados negativamente, y pertenecen a la misma clase de inmunoglobulinas (IgM de ratón) . Una hora después de la inyección, los ratones se anestesiaron y su circulación de sangre se inundó con salina heparinizada . Los tumores y órganos normales se removieron y se congelaron. Las secciones congeladas se mancharon con conjugado de peroxidasa IgM anti-ratón (Jackson Immunoresearch Labs) seguido por el desarrollo con carbazol . B. Resultados Los anticuerpos anti-PS específicamente se alojaron en la vasculatura de los tres tumores (HT 29, L540 y NCI-H358) en vivo, como se indica por la detección del IgM de ratón. Los porcentajes promedio de los vasos manchados en los tumores fue del 80 por ciento para HT 29, 30 por ciento para L540, y 50 por ciento para NCI-H358. Los vasos en todas las regiones de los tumores se mancharon y hubo manchado tanto de capilares pequeños como de vasos grandes . No se observó manchado de vasos con anticuerpos anti-PS en ningún tejido normal. En el riñon, los túbulos se mancharon tanto con anti-PS con con anti-CL, y esto probablemente se relaciona a la secreción de IgM por este órgano (Tabla 5) . Los anticuerpos anti-cardiolipina no se detectaron en ningún tumor o tejido normal, excepto en el riñon. Estos hallazgos indican que solamente el endotelio del tumor expone PS al sitio externo de la membrana del plasma. TABLA 5 Localización de Vasos de Anticuerpos Anti-PS y Anti-Cardiolipina en Ratones con Tumor* La biodistribución en órganos normales, tanto de anticuerpos anti-PS como anti-cardiolipina fue idéntico en los tres modelos de animales de tumor. Los anticuerpos anti-PS y anti-cardiolipina se detectaron en secciones congeladas usando conjugado IgM-peroxidasa anti-ratón. - no manchado; + débil; ++ moderado; +++ fuerte, equivalente a marcador pan endotelial MECA 32. El manchado tubular se observó en los riñones tanto de receptores anti-PS y anti-CL.

Para estimar el tiempo en el cual la vasculatura del tumor pierde la capacidad para segregar PS al lado interno de la membrana, los inventores examinaron la localización de anti-PS en tumores L540 que varían en volumen de 140 a 1,600 mm3. Los ratones se dividieron en 3 grupos de acuerdo con su tamaño de tumor: 140-300, 350-800 y 800-1,600 mm3. El anticuerpo anti-PS no se detectó en tres ratones que tenían tumores pequeños L540 (hasta de 300 mm3) . En anticuerpo anti-PS localizado en 3 animales de 5 en el grupo de tumores de tamaño intermedio L540 y en todos los ratones (4 de 4) que tenían tumores grandes L540 (Tabla 6) . El porcentaje de vasos sanguíneos positivos a PS del total (identificados por el marcador pan endotelial Meca 32) fue de 10-20 por ciento en el grupo intermedio L540 y 20-40 por ciento en el grupo de tumores grandes L540 (Tabla 6) .

TABLA 6 Externalización de PS Detectado en Tumores de Tamaño Mediano y Grande Los ratones que tenían tumores Cy L540 se dividieron en tres grupos de acuerdo con el tamaño del tumor. 20 microgramos de anticuerpos anti-PS se inyectaron intravenosamente y se permitió que circularan durante 1 hora. Los anticuerpos de ratón se detectaron en secciones congeladas usando conjugado peróxidasa IgM anti-ratón. Número total de vasos sanguíneos se determinó usando anticuerpo pan endotelial Meca 32. Los vasos positivos PS y positivos Meca se contaron en 4 campos por corte transversal del tumor . En rango de porcentaje de vasos positivos PS dentro del mismo grupo se muestra.

EJEMPLO XII Efectos Anti-tumor de Anticuerpos Anti-fosfatidilserina A. Métodos * Los efectos de anticuerpos anti-PS se examinaron en modelos de tumor singeneicos y xenogeneicos. Para el modelo singeneico, se inyectaron IxlO7 células de carcinoma colorrectal murino Coló 26 (obtenido del Dr. Ian Hart, ICRF, Londres) sucutáneamente en el flanco derecho de ratones Balb/c . En el modelo xenbgeneico, un xenoinjerto de linfoma de Hodgkin humano L540 se estableció inyectando lxlO7 células subcutáneamente en el flanco derecho de ratones machos CB17 SCID. Los tumores se dejaron crecer a un tamaño de'aproximadamente 0.6-0.9 cm3 antes del tratamiento. Los ratones que tenían tumor (4 animales por grupo) se inyectaron intraperitonealmente con 20 microgramos de anticuerpo anti-PS natural (IgM), IgM de ratón de control o salina. El tratamiento se repitió 3 veces con un intervalo de 48 horas. Los animales se supervisaron diariamente para mediciones del tumor y peso corporal . El volumen del tumor se calculó como se describe en el Ejemplo VII. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 2 cm3, o antes, si los tumores mostraron signos de necrosis o ulceración. B. Resultados El crecimiento tanto de tumores singeneicos como xenogeneicos se inhibió efectivamente mediante tratamiento con anticuerpos anti-PS naturales (Figura 4A y Figura 4B) . Los anticuerpos anti-PS causaron daño vascular del tumor, acompañado por trombosis, y necrosis del tumor. La presencia de coágulos y desintegración de masas de tumor rodeándolos vasos sanguíneos bloqueados fue evidente . Cuantitativamente, el tratamiento anticuerpo anti-PS natural inhibió el crecimiento de tumor hasta en 60 por ciento del volumen del tumor de control en los ratones que tenían tumores grandes Coló 26 (Figura 4A) y L540 (Figura 4B) . No se encontró retardo del crecimiento del tumor en ratones tratados con salina o IgM de control . No se observó toxicidad en ratones tratados con anticuerpos anti-PS, con los órganos noramles preservando la morfología sin alterar, indistinguible de los ratones no tratados o tratados con salina. La regresión del tumor comenzó 24 horas después del primer tratamiento y los tumores continuaron declinando de tamaño durante los siguientes 6 días. Esto se observó tanto en modelos de tumor singeneicos como inmunocomprómetidos, indicando que el efecto fue mediado por el o los mecanismos independientes del estado inmune. Más aún, la declinación enla carga del tumor se asoció con el aumento de apariencia alerta y apariencia generalmente saludable de los animales, en comparación con los ratones de control que tenían tumores más grandes de 1,500 mm3. El recrecimiento del tumor se presentó 7-8 días después del primer tratamiento. Los resultados obtenidos con tratamiento anti-PS de tumores L540 fueron más fuertes por las siguientes razones.

Notablemente, la necrosis del tumor observada en el tratamiento del tumor L540 se presentó a pesar del hecho de que el porcentaje de vasos que se mancharon positivos para PS en los tumores L540 fue menor que en los tumores HT 29 y NCI-H358. Esto implica que aún más rápida necrosis probablemente resultaría cuando se trataron otros tipos de tumor. Además, los tumores L540 generalmente se eligieron como un modelo experimental, debido a que demostraron secciones histológicas limpias, y de hecho, se sabe que son resistentes a la necrosis.

EJEMPLO XIII Efectos Anti-tumor en Conjugados de Anexín El hallazgo sorprende de que los aminofosfolípidos son marcadores estables de la vasculatura del tumor, también significa que las construcciones de sustancia terapéutica-anticuerpo se pueden usar en el tratamiento del cáncer. Además de usar anticuerpos como sustancias objetivos, los inventores razonaron que las anexinas, y otras proteínas de enlace con aminofosfolípidos, podrían también usarse para administrar específicamente sustancias terapéuticas en la vasculatura del tumor. Los siguientes datos muestran los efectos anti-tumor que son resultado de la administración en vivo de construcciones anexín-TF. A. Métodos Un conjugado de anexín V-tTF se preparó y administró a ratones nu/nu con tumores sólidos . Los tumores se formaron de células de carcinoma colorrectal HT29 humanos que formaron tumores de cuando menos aproximadamente 1.2 cm3. El coaguligando anexín V-tTF (10 microgramos) se administró intravenosamente y se dejó circular durante 24 horas. Los ratones tratados con salina se mantuvieron por separado como animales de control . Después de un día de período de tratamiento, los ratones se sacrificaron y se desangraron y los tumores y órganos mayores se cosecharon para su análisis. B. Resultado El conjugado de Anexín V-tTF se encontró que induce coagulación de vasos sanguíneos de tumor específicos en ratones que tienen tumor HT29. Aproximadamente 55 por ciento de los vasos sanguíneos del tumor en los animales tratados con conjugado de Anexín V-tTF fueron trombosados después de una sola inyección. En cambio, hubo una evidencia mínima de trombosis en la vasculatura de tumor de los animales de control .

EJEMPLO XIV Translocalización de Fosfatidilserina en el Ambiente del Tumor El descubrimiento de PS como un marcador superficial en vivo único de las células endoteliales vasculares del tumor incitó a los inventores a investigar adicionalmente el efecto de un ambiente de tumor en la traslocalización de PS y la expresión de membrana externa. El presente ejemplo muestra que exponiendo las células endoteliales in vi tro a ciertas condiciones que imitan las de un tumor, se duplica la expresión superficial de PS observado en células viables, intactas. A. Métodos Las células endoteliales bEnd.3 de ratón se sembraron a una densidad inicial de 50,000 células por pozo. Veinticuatro horas después las células se incubaron con concentraciones crecientes de H202 (de 10 µM hasta 400 µM) durante 1 hora a 37°C o se dejaron sin tratar. Al final de la incubación, las células se lavaron tres veces con SRF que contenía 0.2 por ciento de gelatina y se fijaron con 0.25 por ciento de glutaraldehído. Se mancharon pozos idénticos ya sea con IgM anti-PS tripsinizada y se evaluaron para determinar su viabilidad mediante la prueba de exclusión de azul triptano. Para el manchado anti-PS, después de bloquearlo con 2 por ciento de gelatina' durante 10 minutos, las células se incubaron con 2 microgramos/mililitro de anticuerpo anti-PS, seguido por la detección con conjugado IgM-HRP anti-ratón. Los pozos sembrados con células endoteliales bEnd.3 de ratón también, se incubaron con diferentes efectores y se compararon con el control, con pozos no tratados después del mismo período de incubación a 37°C. El panel de efectores probado incluyó TNF, LPS, bFGF, IL-la, IL-lß y trombina. Después de la incubación, las células se lavaron y fijaron y de nuevo se mancharon ya sea con IgM anti-PS o se evaluaron para determinar su viabilidad usando la prueba de exclusión de azul triptano, como se describe anteriormente. B. Resultados 1. Inducción PS mediante H202 La exposición de células endoteliales a H202 a concentraciones mayores de 100 µM causó la traslocalización PS en aproximadamente el 90 por ciento de las células. Sin embargo, esto fue acompañado por desprendimiento de las células de sustrato y la viabilidad de las células disminuyó hasta aproximadamente 50-60 por ciento. La asociación de la expresión de PS de superficie con la viabilidad de células decreciente es entendible, aunque todavía es interesante notar que aproximadamente 90 por ciento de la translocalización de PS se observa con solamente una disminución del 50-60 por ciento en la viabilidad de las células. Usando concentraciones de H202 menores de 100 µM dio como resultado una expresión de PS significativa sin ninguna reducción apreciable en la viabilidad de las células. Por ejemplo, se detectó PS en la superficie célula de aproximadamente 50 por ciento de células en todos los pozos tratados con H202 usando H202 a concentraciones tan bajas como de 20 µM. Es importante notar que, bajo estas concentraciones bajas de H202, las células permanecieron firmemente unidas al plástico y entre sí, no mostraron cambios morfológicos y no tuvieron signos de citotoxicidad. Análisis detallados revelaron esencialmente el 100 por ciento de contacto célula-célula, retención de la forma de célula adecuada y un citoesqueleto intacto. El 50 por ciento de la expresión superficial de PS inducido por niveles bajos de H202 se observó de esta manera en poblaciones de células las cuales la viabilidad de las células fue idéntica a las células no tratadas, de control (es decir, 95 por ciento) . La expresión de PS asociada con concentraciones altas de H202 fue acompañada por daño celular, y las células positivas PS expuestas a más de 100 µM H202 fueron desprendidas, flotando y tuvieron citoesqueletos rotos. El mantenimiento de la viabilidad de las células en presencia de concentraciones bajas de H202 es consistente de datos de otros laboratorios. Por ejemplo, Schorer y colaboradores (1985) mostraron que las células endoteliales de vena umbilical humana (CEVUH) tratado con 15 µM de H202 promediaron 90 a 95 por ciento de viabilidad (reportado como daño de 5 por ciento a 10 por ciento) , mientras que aquellas expuestas a 1500 µM de H202 solamente fueron del 0 por ciento al 50 por ciento viable (dañadas del 50 por ciento al 100 por ciento) . El uso de H202 para imitar el ambiente de tumor in vi tro también es adecuado porque el ambiente del tumor es rico en células inflamatorias, tales como macrófagos, PMN y granulocitos, que producen H202 y otras especies de oxígeno reactivo. Aunque nunca antes se conectó con marcadores vasculares de tumor estables, las células inflamatorias se sabe que median el daño celular endotelial por mecanismos que implican especies de oxígeno reactivos que requieren la presencia de H202 (Weiss y colaboradores, 1981; Yamada y colaboradores, 1981; Schorer y colaboradores, 1985) . De hecho, los estudios han mostrado que la estimulación de PMN in vi tro produce concentraciones de H202 suficientes para causar daño celular endotelial subletal sin causar muerte celular (medido por ensayos de liberación de cromo) o desprendimiento celular; y que estas concentraciones de H202 son alcanzables localmente en vivo (Schorer y colaboradores, 1985) . Los datos de translocalización in vi tro presentes se correlacionan con resultados anteriores que muestran que los anticuerpos anti-PS se localizan específicamente en células endoteliales vasculares del tumor en vivo, y no se enlazan con células en tejidos normales. El hallazgo de que las concentraciones como en vivo de H202 inducen la traslocalización de PS a la superficie de células endoteliales sin interrumpir la integridad de la célula tiene implicaciones importantes además de validar los datos en vivo originales y los enfoques terapéuticos de los inventores. Las células endoteliales humanas, bovinas y murinas todas se sabe que son negativas a PS bajo condiciones normales. Cualquier expresión de PS documentada previamente siempre se ha asociado con daño celular y/o muerte celular. Esto simplemente no es el caso en los estudios presentes, en donde se mantiene la viabilidad normal. Esto muestra que la traslocalización de PS en endotelio vascular del tumor está mediado por mecanismos bioquímicos no conectados con daño celular. Se cree que es la primera demostración de la expresión superficial de PS en células endoteliales intactas morfológicamente y la primera indicación de que la expresión de PS se puede desconectar de la o las sendas de apoptosis. Volviendo a la operabilidad de la presente invención, estas observaciones de nuevo confirman que PS es un marcador sostenible, en vez de transitorio, de los vasos sanguíneos del tumor y un candidato conveniente para la intervención terapéutica. 2. Expresión de PS no se correlaciona con la activación celular La importancia de este dato in vi tro para el ambiente del tumor también es reforzado por el hecho de que otros activadores de células en general no tienen efectos sobre la traslocalización de ese en células endoteliales. Por ejemplo, los inventores probaron TNF estudios similarmente controlados y encontraron que es incapaz de inducir la expresión superficial de PS, a pesar de que los aumentos esperados en la expresión de E-selectina y VCAM. Igualmente, LPS, bFGF, IL-la e IL-lß no tuvieron efecto en la expresión de PS en estudios adecuadamente controlados . 3. Inducción de PS mediante trombina En contraste con la falta de efectos de otros activadores celulares, la trombina se observó que aumenta la expresión de PS, aunque no al mismo grado que el H202. Estos datos son parte integral del modelo de inducción de tumor de la expresión de PS desarrollada por los presentes inventores (la expresión superficial de PS inducida por trombina en tejidos normales también aumentaría la coagulación ya que la expresión de PS coordina el enlace de complejos de inicio de coagulación (Ortel y colaboradores, 1992)). El ambiente del tumor se sabe que es protrombótico, de manera que la vasculatura del tumor está predispuesta a la coagulación (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,877,289) . Como la trombina es un producto de la cascada de coagulación, está presente en la vasculatura del tumor. De hecho, la presencia de trombina induce la expresión de VCAM, contribuyendo a la capacidad de los inventores para explotar la VCAM como un marcador dirigible de la vasculatura del tumor (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,855,866; 5,877,289). Los presentes datos que muestran que la trombina también induce la expresión de PS de este modo es tanto relevante para la dirección de aminofosfolípidos hacia anticuerpos naturales como conjugados terapéuticos, y además explica los efectos benéficos del coaguligando anti-VCAM que contiene el Factor de Tejido (Ejemplo VII) . Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente se pueden hacer y ejecutar sin indebida experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de las modalidades preferidas, será aparente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente será aparente que ciertas sustancias que están tanto químicamente como fisiológicamente relacionadas se pueden sustituir por las sustancias descritas en la presente mientras se logran resultados iguales o similares. Todos estos sustitutos y modificaciones similares aparentes para los expertos en la técnica se considera que están dentro del espíritu y alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

REFERENCIAS Las siguientes referencias, hasta el grado de que proporcionan procedimiento ejemplar u otros detalles suplementarios a los presentados en la presente, se incorporan específicamente en la presente mediante referencia. Abrams y Oldham, In : Monoclonal Antibody Therapy of Human Cáncer, Foon y Morgan (Eds.), Martinus Nijhoff Publishing, pp. 103-120, 1985. Anderson, Croyle, Lingrel, "Primary structure of a gene encoding rat T-kininogen" , Gene, 81 (1) : 119 : 28 , 1989. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Asahara, Chen, Takahashi, Fujikawa, Kearney, Magner, Yancopoulos, Isner, "Tie2 receptor ligands, angiopoietin-1 and angiopoiet in-2 , modulate VEGF-induced postnatal neovascularization" Circ. Res . , 83 (3 ) : 233 -40 , 1988. Barbas, Kang, Lerner, Benkovic, "Assembly of combinatorial antibody librarles on phage surfaces: the gene III site", Proc. Nati . Acad. Sci . , USA, 88 (18) :7978-7982 , 1991. Berard, Boffa, Karmochkine, Aillaud, Juhan-Vague, Francés, Cacoub, Piette, Harle, "Plasma reactivity to hexagonal II phase phosphatidylethanolamine is more frequently associated with lupus anticoagulant than with antiphosphatidylethanolamine antibodies", ". Lab . Clin . Med. , 122 (5) : 601-605 , 1993. Ber an, Mellis, Pollock, Smith, Suh, Heinke, Kowal, Surti, Chess, Cantor, y colaboradores, "Content and organization of the human Ig VH locus: definition of three new VH families and linkage to the Ig CH locus", EMBO J. , 7(3) :727-738, 1988. Bernier y Jolles, "Purification and characterization of a basic 23 kDa cytosolic protein from bovine brain", Biochim. Biophys . Acta, 790 (2) : 174-181, 1984. Bernier, Tresca, Jolles, "Ligand-binding studies with a 23 kDa protein purified from bovine brain cytosol", Biochim. Biophys . Acta, 871 (1) : 19-23 , 1986. Bevers, Comburius, Zwaal, "The nature of the binding site for prothrombinase at the platelet surface as revealed by lipolytic enzymes", Eur. J. Biochem. , 122:81-85, 1982. Bevers, Comfurius, Zwaal, "Changes in membrane phospholipid distribution during platelet activation", Biochim . Biophys . Acta, 736:57-66 , 1983. Bevers, Rosing, Zwaal, "Development of procoagulant binding sites on the platelet surface", Adv. Exp . Med. Biol . , 192:359-371, 1985. Bevers, Galli, Barbui, Comfurius, Zwaal, "Lupus anticoagulant IgG's (LA) are not directed to phospholipids only, but to a complex of lipid-bound human prothrombin" , Thromb . Haemost . , 66 (6) : 629-632 , 1991. Bevilacqua, "Endothelial -leukocyte adhesión molecules", Ann. Rev. Immunol . , 11:767-804, 1993. Blankenberg, Katsikis, Tait, Davis, Naumovski, Ohtsuki, Kopiwoda, Abrams, Darkes, Robbins, Maecker, Strauss, " In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death", Proc . Nati . Acad. Sci . , USA, 95:6349-6354, 1998. Bocci, "Efficient labeling of serum proteins with 1311 using chloramíne T", Int . J. Appl . Radiat . Isot . , 15:449-456, 1964. Bombeli, Karsan, Tait, Harían, "Apoptotic vascular endothelial cells become procoagulant " , Blood, 89(7) : 2429-2442, 1997. Bordron, Dueymes, Levy, Jamin, Leroy, Piette, Schoenfeld, Youinou, "The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis", J". Clin . Invest . , 101 (10) :2029-2035, 1998. Bornstein, "Thrombospondins : structure and regulation of expression" , FASEB d, 6 (14 ) : 3290-3299 , 1992. Borrebaeck y Moller, " In vi tro immunization. Effect of growth and differentiation factors on antigen-specific B cell activation and production of monoclonal antibodies to autologous antigens and weak immunogens", ". Immunol . , 136 (10) :3710-3715, 1986. Bradford, "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding", Anal . Biochem . , 72:248-254, 1976. Branch, Rote, Dostal, Scott, "Association of lupus anticoagulant with antibody against phosphatidylserine" , Clin .

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Claims (75)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad y por lo tanto se declara como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un ligando de enlace que comprende una sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido operativamente unido a una sustancia terapéutica; caracterizado porque la sustancia objetivo no es un anticuerpo anti-fosfatidilserina obtenida a partir de un paciente con enfermedad autoinmune anti-fosfolípido que está conjugado con una sustancia citotóxica.
2. 2. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende un anticuerpo • anti-aminofosfolípido o fragmento de enlace de antígeno del mismo.
3. 3. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido IgG o IgM.
4. 4. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende una región de enlace de antígeno scFv, Fv, Fab', Fab o F(ab')2 de un anticuerpo anti-aminofosfolípido.
5. 5. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende un anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido, o una región de enlace de antígeno del mismo.
6. 6. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo anti-aminofosfolípido monoclonal, o el fragmento de enlace de antígeno del mismo, se prepara mediante un proceso de preparación que comprende: (a) preparar una célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido; y (b) obtener un anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido a partir de la célula que produce el anticuerpo.
7. 7. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizado porque la célula que produce el anticuerpo anti-aminofosfolípido es una célula de paciente humano, caracterizado porque el paciente tiene una enfermedad asociada con la producción de anticuerpos anti-aminofosfolípidos .
8. 8. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizado porque la célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido se obtiene mediante la estimulación in vi tro de una población mezclada de linfocitos de sangre periférica humana con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido.
9. 9. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizado porque la célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido se obtiene inmunizando un animal no humano con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido.
10. 10. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 9, caracterizado porque la célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido se obtiene inmunizando un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido.
11. 11. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizado porque el proceso preparativo comprende: (a) fusionar la célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido con una célula inmortal para preparar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido; y (b) obtener el anticuerpo monoclonal anti- aminofosfolípido a partir del hibridoma.
12. 12. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizado porque el proceso preparativo comprende: (a) inmunizar un animal no humano con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido; (b) preparar una colección de hibridomas que producen anticuerpos a partir del animal inmunizado; (c) seleccionar de la colección un hibridoma que produce un anticuerpo anti-aminofosfolípido; y (d) cultivar el hibridoma seleccionado para proporcionar el anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido .
13. 13. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 12, caracterizado porque el animal inmunizado es un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos y en donde el anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido es un anticuerpo monoclonal humano .
14. 14. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizado porque el proceso preparativo comprende: (a) obtener los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de la célula que produce anticuerpo anti-aminofosfolípido; y (b) expresar los ácidos nucleicos para obtener un anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido .
15. 15. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizado porque el proceso preparativo comprende: (a) inmunizar un animal con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido; (b) preparar una biblioteca de fagémidos de inmunoglobulina combinatoria que expresa ARN aislado del bazo del animal inmunizado; (c) seleccionar de la biblioteca de fagémidos una clona que expresa un anticuerpo anti-aminofosfolípido; y (d) expresar los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de la clona seleccionada para proporcionar un anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido recombinante.
16. 16. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 15, caracterizado porque el animal inmunizado es un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos y en donde el anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido recombinante es un anticuerpo monoclonal humano recombinante.
17. 17. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido quimérico humano, humanizado o parte humano, o una región de enlace de antígeno del mismo.
18. 18. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende una proteína de enlace de aminofosfolípido o un fragmento de enlace de aminofosfolípido de la misma.
19. 19. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende una proteína de ' enlace fosfatidilserina un fragmento de enlace fosfatidilserina de la misma.
20. 20. El ligando de enlace de conformidad con lo # reclamado en la reivindicación 19, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende un anexín o un fragmento de enlace fosfatidilserina del mismo.
21. 21. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende una proteína de enlace fosfatidiletanolamina o un fragmento de enlace fosfatidiletanolamina de la misma.
22. 22. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 21, caracterizado porque la sustancia de enlace comprende un quininógeno o un fragmento de enlace fosfatidiletanolamina del mismo.
23. 23. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo comprende dos, tres o múltiples sitios de enlace de aminofosfolípidos.
24. 24. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo es una sustancia objetivo recombinante.
25. 25. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo se enlaza con fosfatidiletanolamina .
26. 26. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo se enlaza con fosfatidilserina .
27. 27. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a una sustancia anticelular o citotóxica.
28. 28. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 27, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a un esteroide, citocina, antimetabolito, antraciclina, alcaloide vinca, antibiótico, agente alquilante, epipodofilotoxina, inhibidor de síntesis de ADN, deunorrubicina, doxorrubicina o adriamicina.
29. 29. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 27, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a una toxina derivada de planta, hongo o bacteria.
30. 30. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 29, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a una toxina de cadena A, androtoxina bacteriana, fracción de lípido A de endotoxina bacteriana, proteína que inactiva ribosoma, a-sarcina, gelonina, aspergilina, restrictocina, ribonucleasa, toxina de difteria o exotoxina Pseudomonas .
31. 31. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a una cadena de ricina A o cadena de ricina A desglicosilada.
32. 32. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a un coagulante.
33. 33. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 32, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a un factor de coagulación humano.
34. 34. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 32, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a un factor de coagulación seleccionado del grupo que consiste en Factor Il/Ila, Factor Vll/VIIa, Factor IX/lXa, Factor X/Xa, factor de coagulación dependiente de la vitamina K que carece de modificación Gla, activador de Factor X de veneno de víbora de Russell, tromboxano A2, tromboxano A2 sintasa y antiplasmina a2.
35. 35. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 32, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a un Factor de Tejido, Factor de Tejido dimérico, Factor de Tejido trimérico, Factor de Tejido polimérico, Factor de Tejido mutante, o derivado de Factor de Tej ido.
36. 36. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 35, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a un Factor de Tejido truncado.
37. 37. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a una primera y una segunda sustancia terapéutica.
38. 38. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo se une a múltiples sustancias terapéuticas.
39. 39. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia objetivo está unida directamente a una sustancia terapéutica.
40. 40. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 39, caracterizado porque la sustancia objetivo está directamente unida a una sustancia terapéutica mediante un enlace covalente directo o vía un reticulador químico.
41. 41. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 39, caracterizado porque la sustancia objetivo está unida directamente a una sustancia terapéutica expresando el ligando de enlace con una proteína de fusión recombinante.
42. 42. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 38, caracterizado porque la sustancia objetivo se une indirectamente a una sustancia terapéutica vía un anticuerpo, o una región de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con la sustancia terapéutica.
43. 43. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 42, caracterizado porque el ligando de enlace es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer anticuerpo objetivo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, operativamente unido a un segundo anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con la sustancia terapéutica.
44. 44. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia objetivo es un anticuerpo anti-fosfatidilserina, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que está directamente o indirectamente unido a un Factor de Tej ido truncado .
45. 45. Un ligando de enlace que comprende una sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido operativamente unido a una sustancia terapéutica; caracterizado porque la sustancia objetivo es un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con fosfatidiletanolamina, fosfatidalserina ó fosfatidaletanolamina; o es una proteína de enlace de aminofosfolípido o un fragmento de enlace de aminofosfolípido de la misma.
46. 46. Un ligando de enlace que comprende una sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido operativamente unido a una sustancia terapéutica; caracterizado porque la sustancia objetivo es un anticuerpo anti-aminofosfolípido preparado mediante un proceso preparativo que comprende: (a) la estimulación in vi tro de una población mezclada de linfocitos de sangre periférica humana con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido; (b) inmunizar un animal no humano con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido; (c) inmunizar un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido; (d) obtener y expresar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-aminofosfolípido; o (e) seleccionar y expresar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de una biblioteca de fagémidos de inmunoglobulinas combinatorias que expresa ARN aislado del bazo de un animal inmunizado con una cantidad efectiva de una muestra de aminofosfolípido.
47. 47. Un ligando de enlace que comprende una sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido operativamente unido a una sustancia terapéutica; caracterizado porque la sustancia objetivo se une a una sustancia terapéutica seleccionada del grupo que consiste en un coagulante, una sustancia anti-angiogénica, una sustancia quimioterapéutica y una sustancia inductora de apoptosis.
48. 48. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque está disperso en una formulación farmacéuticamente aceptable.
49. 49. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso para administrar una sustancia terapéutica a un aminofosfolípido expresado sobre la superficie luminal de los vasos sanguíneos de un tumor vascularizado después de la administración a un animal que tiene un tumor vascularizado.
50. 50. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso para eliminar células endoteliales vasculares del tumor después de la administración a un animal que tiene tumor vascularizado .
51. 51. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso para inducir la coagulación en la vasculatura del tumor después de la administración a un animal que tiene un tumor vascularizado.
52. 52. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso para destruir vasculatura del tumor después de la administración a un animal que tiene un tumor vascularizado.
53. 53. El ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso para tratar cáncer después de la administración a un animal que tiene un tumor vascularizado.
54. 54. El uso de un ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer eliminando las células endoteliales vasculares o destruyendo o induciendo la coagulación en la vasculatura de un tumor vascularizado.
55. 55. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 hasta la 53.
56. 56. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 55, caracterizada porque la composición comprende dos ligandos de enlace tales que cada uno se enlaza con un aminofosfolípido distinto.
57. 57. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 55 o 56, caracterizada porque la composición se formula para administración intravenosa.
58. 58. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 55 hasta 57, caracterizada porque la composición comprende una segunda sustancia anticáncer.
59. 59. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 58, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es una sustancia quimioterapéutica, una sustancia radioterapéutica, una sustancia anti-angiogénica o una sustancia que induce la apoptosis .
60. 60. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 58, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es una construcción de sustancia terapéutica-anticuerpo que comprende un anticuerpo objetivo, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con un componente localizado en la superficie o accesible en la superficie, o expresado en la superficie de una célula de tumor, vasculatura de tumor ó estroma de tumor, estando el anticuerpo objetivo o fragmento del mismo operativamente enlazado con una sustancia terapéutica.
61. 61. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 60, caracterizada porque el segundo anticuerpo objetivo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, se enlaza con la célula de tumor o el componente de estroma del tumor.
62. 62. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 60, caracterizada porque el segundo anticuerpo objetivo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, se enlaza con un componente inducible por coagulante o inducible de citocina, localizado en la superficie, accesible en la superficie, o expresado en la superficie de vasos sanguíneos intratumorales de un tumor vascularizado.
63. 63. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 62, caracterizada porque el segundo anticuerpo objetivo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, se enlaza con un componente expresado en la superficie de la vasculatura de intratumoral seleccionada del grupo que consiste en un aminofosfolípido, endoglina, un receptor TGFß, selectina E, selectina P, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, un TIE, integrina a.vß3, pleyotropina, endostatina y una proteína MHC Clase II.
64. 64. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 62, caracterizada porque el segundo anticuerpo objetivo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, se enlaza con un componente localizado en la superficie de la vasculatura intratumoral seleccionado del grupo que consiste en VEGF/VPF, FGF, TGFß, un ligando que se enlaza con un TIE, una isoforma de fibronectina asociada con el tumor, un factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocito (HGF) , factor de plaqueta 4 (PF4) , PDGF y TIMP .
65. 65. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 60, caracterizada porque el segundo anticuerpo objetivo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, está operativamente enlazado con una sustancia citotóxica.
66. 66. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 60, caracterizada porque el segundo anticuerpo objetivo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, está enlazado operativamente a un factor de coagulación o a un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con un factor de coagulación.
67. 67. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 58, caracterizada porque la segunda sustancia anticáncer es un anticuerpo natural, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza con un aminofosfolípido en la superficie luminal de los vasos sanguíneos del tumor vascularizado.
68. 68. La composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 55 hasta la 67, caracterizada porque la composición se destina a administración humana .
69. 69. El uso de una composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 55 hasta la 68 en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer.
70. 70. Un juego que comprende una cantidad combinada biológicamente efectiva de un ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 53, y una segunda sustancia anticáncer.
71. 71. Un juego que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un ligando de enlace de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 53 en combinación con una cantidad diagnósticamente efectiva de una construcción de sustancia objetivo - sustancia detectable que comprende una sustancia detectable operativamente unida a una segunda sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido.
72. 72. Un juego que comprende una composición farmacéutica de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones de la 55 hasta 68 en combinación con una cantidad diagnósticamente efectiva de una construcción de sustancia objetivo - sustancia detectable que comprende una sustancia detectable operativamente unida a una segunda sustancia objetivo que se enlaza con un aminofosfolípido.
73. 73. El juego de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 71 o 72, caracterizado porque la construcción de sustancia objetivo - sustancia detectable comprende el compuesto detectable por rayos X bismuto (III) , oro (III) , lantano (III) o plomo (II) .
74. 74. El juego de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 71 o 72, caracterizado porque la construcción de sustancia objetivo - sustancia detectable comprende el ion radioactivo detectable cobre69, galio67, galio68, indio111, indio113, yodo123, yodo125, yodo131, mercurio197, mercurio203, renio186, renio188, rubidio97, rubidio103, tecnetio99m o itrio90.
75. 75. El juego de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 71 o 72, caracterizado porque la construcción de sustancia objetivo - sustancia detectable comprende los isótopos de resonancia de giro magnético nuclear detectables cobalto (II) , cobre (II) , cromo (III) , disprosio (III) , erbio (III) , gadolinio (III) , holmio (III) , hierro (II) , hierro (III) , manganeso (II) , neodimio (III) , níquel (II) , samario (III) , terbio (III) , vanadio (II) o iterbio (III) .