MXPA00011907A - Preteinas basbo27 y genes de moraxella catarrhalis, antigenos, anticuerpos, y usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos BASB027 y polinucléotidos que codifican polipéptidos BASB027 y métodos para producir dichos polipéptidos a través de técnicas recombinantes. También se proporcionan usos de diagnostico, profilácticos y terapéuticos .

Description

I 1 PROTEÍNAS BASB027 Y GENES DE MORAXELLA CATARRHALIS, ANTÍGENOS, ANTICUERPOS Y USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a polinucleótidos (de aquí en adelante denominados como "polinucleótido(s) BASB027"), polipéptidos codificados por los mismos (de aquí en adelante denominados como "polipéptido(s) BASB027" o "BASB027", materiales recombinantes y métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para utilizar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto más, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infecciones de ciertos patógenos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Moraxella catarrhalis (también denominada como Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram negativa frecuentemente aislada del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, la principal de estas siendo otitis media en bebés y niños, y neumonía en gente mayor. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocómicas y con menos frecuencia enfermedades invasivas. La otitis media es una enfermedad importante de la niñez tanto por el número de casos como sus secuelas potenciales. Más de 3.5 millones de casos son registrados cada año en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado por lo menos episodio de otitis antes de llegar a la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf.Dis 19:823). Si se deja sin tratar o se hace crónica, esta enfermedad puede conducir a pérdidas de la audición que pueden ser temporales (en el caso de acumulación de fluido en el oído medio) o permanentes (sí el nervio auditivo se ve dañado). En bebés, dichas pérdidas de la audición pueden ser responsables de un aprendizaje retrasado del habla. Principalmente se han aislado tres especies bacterianas del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae (NTHi) que no se puede tipificar, y M. catarrhalis. Están presentes en un 60 a 90% los casos. Una revisión de recientes estudios muestra que S. pneumoniae y NTHi representan aproximadamente el 30%, y M. catarrhalis aproximadamente el 15% de 1os casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Otras bacterias pueden ser aisladas del oído medio (H. Influenzae tipo B, S. pyogenes, etc.), pero a una frecuencia mucho menor (2% de los casos o menos). Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un pre-requisito absoluto para el desarrollo de una otitis; sin embargo, se requieren de otros también para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y otros (1988) J. Infect. Dis. 158:205, Faden, HL y otros (1991) Ann. Otorhinol.Laryngol. 100:612). Estos son importantes para activar la migración de las bacterias hacia el oído medio a través de los tubos de Eustaquio, seguido por la iniciación de un proceso inflamatorio. Estos factores son • desconocidos hasta ahora. Se ha postulado que una anomalía 5 pasajera del sistema inmune después de una infección viral, por ejemplo, puede ocasionar una incapacidad para controlar la colonización del tractor espiratorio (Faden, HL y otros (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más # 10 importante de algunos niños, quienes subsecuentemente se hacen susceptibles al desarrollo de otitis media debido a la presencia sostenida de patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). La respuesta inmune a M. catarrhalis es pobremente caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés de 0 a 2 años de edad, indica que obtienen y eliminan nuevas cepas. Esto indica que una respuesta inmune eficaz • contra esta bacteria es montada por los niños colonizados (Faden, HL y otros (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). 20 En muchos adultos probados, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y otros (1985) J. Infecí. Dis. 151:878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida en el suero; en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que aquellos que son simplemente colonizados (Hol, C . y otros (1993) Lancet 341:1281, Jordán, KL, y otros (1990) Am. J. Med. 88 (sup. 5A)-28S). La resistencia en el suero, por lo tanto, puede ser considerada como un factor virulento de la bacteria. Una actividad de opsonización ha • sido observada en los sueros de niños que se recuperan de otitis 5 media. Los antígenos activados por estas diferentes respuestas inmunes en seres humanos aún no han sido identificados, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa, cuya expresión es regulada por el hierro, y que es reconocida por los sueros de 10 pacientes con neumonía (Sethi, S. y otros (1995) Infecí. Immun. • 63:1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y otros (1999), Infecí. Immun. 67:1310). Algunas oirás proíeínas de membrana présenles sobre la superficie de M. catarrhalis han sido caracterizadas utilizando 15 métodos bioquímicos, o para su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión ver Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos evocada contra alguno de ellos (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. 20 Otro péptido (OMP CD) es altamente conservado entre las cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, la cual se ha demostrado que es eficaz contra esta bacteria en modelos de animal. La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis se ha 25 incrementado dramáticamente en las últimas décadas. Esto ha sido ha sido atribuido a la emergencia de múltiples cepas resistentes a antibióticos y a una población incrementante de gentes con sistemas inmunes débiles. Ya no es no común aislar cepas de Moraxella catarrhalis que sean resistentes a algunos o todos los anticuerpos estándares. Este fenómeno ha creado una necesidad médica que no ha sido satisfecha y demanda para nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, métodos de clasificación de fármacos, y pruebas de diagnóstico para este organismo. • 10 COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a BASB027, en particular polipéptidos BASB027 y polinucleótidos BASB027, materiales recombinantes y métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para utilizar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. En un aspecto más, la • invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con enfermedades microbianas y condiciones asociadas con dichas infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de los polinucleótidos o polipéptidos BASB027. Varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica después de leer las siguientes descripciones y de leer las otras partes de la presente descripción.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN • La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB027 como se describe con mayor detalle más adelante. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB027 de Moraxella catarrhalis, que está relacionado por la homología de secuencia de aminoácido a la proteína de membrana externa OMP85 de Neisseria meningitidis. La invención se refiere especialmente a BASB027 que tiene las secuencias de nucleótido y de aminoácido establecidas en SEC ID NO:1 ó 3 y SEC ID NO:2 ó 4, respectivamente. Se entiende que las secuencias establecidas en la lista de secuencia más adelante como "ADN" representan una ilustración de una modalidad de la invención, ya que aquellos expertos en la técnica reconocerán que dichas secuencias pueden ser útilmente empleadas en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos En un aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en la presente como "BASB027" y "polipéptidos BASB027", así como sus variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y composiciones que los comprenden. í.9 La presente invención además proporciona: (a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos un 85% de identidad, de • preferencia al menos 90% de identidad, preferiblemente al menos 95% de identidad, muy preferiblemente al menos 97-99% o una identidad exacta, a aquella de SEC ID NO:2 ó 4; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado comprendiendo una secuencia de polinucleótido que tiene por lo menos un 85% de identidad, de preferencia al menos 90% de 10 identidad, preferiblemente al menos 95% de identidad, aún muy preferiblemente por lo menos 97-99% o identidad exacta a SEC ID NO:1 ó 3, sobre toda la longitud de SEC ID NO:1 ó 3, respectivamente; o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado 15 que comprende una secuencia de polínucleótido codificada por un polipéptido que tiene por lo menos un 85% de identidad, de preferencia al menos 90% de identidad, muy preferiblemente por lo menos 95% de identidad, y de preferencia por lo menos 97-99% o identidad exacta a la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 ó 4.

Los polipéptidos BASB027 provistos en la SEC ID NO: 2 ó 4 son los polipéptidos BASB027 de las cepas de Moraxella catarrhalis cepa Mc2931 (ATCC 43617). La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB027, es decir, una porción contigua de un polipéptido BASB027 que tiene la misma actividad inmunogénica o substancialmente la misma actividad inmunogénica como el polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 ó 4. Es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un portador) es capaz de evocar una respuesta inmune, la cual reconoce el polipéptido BASB027. Dicho fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB027 careciendo de una secuencia líder N-terminal, y/o un dominio de transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de BASB027 de acuerdo con la invención comprende substancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido, el cual tiene por lo menos un 85% de identidad, de preferencia al menos 90% de identidad, preferiblemente al menos 95% de identidad, muy preferiblemente por lo menos 97-99 de identidad, a aquella de SEC ID NO:2 ó 4, sobre toda la longitud de SEC ID NO:2. Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es completamente la misma como parte pero no toda la secuencia de aminoácido de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB027 los fragmentos pueden ser "autoestables" o estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman una parte o región, muy preferiblemente como una región continua individual en un polipéptido más grande individual. Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 ó 4, variantes del mismo, tal como una serie continua de residuos que incluyen una secuencia de aminoácido amino- y/o carboxilo-terminal. También se prefieren • formas de degradación de los polipéptidos de la invención 5 producidos por o en una célula huésped. Otros preferidos son fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales, tales como fragmentos que comprenden regiones formadoras de hélice alfa y hélice alfa, lamina beta y regiones formadoras de lámina beta, giro y regiones formadoras de giro, helicoidal y regiones • 10 formadoras helicoidales, regiones hidrofilicas, regiones hidrofóbicas, regiones anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras superficiales, región de unión de substrato, y regiones con alto índice antigénico. Otros fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido de por lo menos 15, 20, 30, 40, 50 o 100 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 ó 4, o un polipéptido aislado comprendiendo una • secuencia de aminoácido teniendo por lo menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos continuos truncados o eliminados de la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 ó 4. Los fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden ser empleados para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente a través de síntesis de péptido; por lo tanto, estos fragmentos pueden ser empleados como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Particularmente preferidas son las variantes en las cuales varios 5-10, 1-5, 1-3, 1-2, o un aminoácido son substituidos, eliminados, o agregados en cualquier combinación. Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención 5 pueden estar en la forma de la proteína "madura" o puede ser una parte de una proteína más grande tal como un precursor o una proteína de fusión. Por lo general es ventajoso incluir una secuencia de aminoácido adicional que contenga secuencias de secreción o líderes, pro-secuencias, secuencias que ayuden a la purificación • 10 tales como residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, la adición del polipéptido exógeno o extremo o cola de lípido o secuencias de polinucleótido para incrementar el potencial inmunogénico de la molécula final, también es considerada. 15 En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles genéticamente diseñadas por ingeniería que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y • varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, I g E) .

Preferida como una inmunoglobulina es la parte constante de la cadena pesada de IgG humano, particularmente lgG1, en donde la fusión se presenta en la región de gozne. En una modalidad particular, la parte Fc puede ser removida simplemente a través de la incorporación de una secuencia de escisión, la cual puede ser separada con el factor de coagulación Xa.

Además, esta invención se refiere a procesos para la preparación de estas proteínas de fusión a través de ingeniería genética, y a su uso para clasificación de fármaco, diagnosis y • terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a 5 polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Ejemplos de la tecnología de proteína de fusión pueden encontrarse en la solicitudes Internacionales de patente Nos. WO94/29458 y WO94/22914. Las proteínas pueden ser químicamente conjugadas, o expresadas como proteínas de fusión recombinantes permitiendo que se produzcan niveles incrementados en un sistema de expresión según comparado con una proteína no fusionada. El patrón de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos auxiliares T (patrón de fusión inmunológico), preferiblemente epítopos auxiliares T reconocidos por seres humanos, o que ayudan a la expresión de la proteína (mejorador de expresión) a niveles más altos que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente, el patrón de fusión será tanto un patrón de fusión inmunológico como un patrón mejorador de expresión. 20 Los patrones de fusión incluyen la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Otro patrón de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente, la porción C-terminal de la molécula es utilizada. LytA se deriva de Streptococcus pneumoniae el cual sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa LytA, (codificada por el gen LytA {Gene, 43 (1986) pág. 265-272}) una autolisina que específicamente degrada ciertos enlaces en la estructura de base del péptidoglican. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina 5 tal como DEAE. Esta propiedad ha sido explotada para el desarrollo de plásmidos de expresión de E. coli C-LytA útiles para la expresión de proteínas de fusión. La purificación de proteínas híbridas conteniendo el fragmento C-LytA en su término amino ha sido descrita {Biotechnology: 10, (1992) pág. 795-798}. Es posible utilizar • 10 la porción de repetición de la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal empezando en el residuo 178, por ejemplo, los residuos 188-305. La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos antes mencionados, es decir polipéptidos que varían del informador por substituciones de aminoácido conservadoras, por lo que un residuo es substituido por otro con características similares. El aspecto típico de dichas substituciones se encuentra entre Ala, • Val, Leu y He; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o los residuos aromáticos Phe y Tyr. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser preparados en cualquier forma adecuada. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos de existencia natural aislados; polipéptidos recombinantemente producidos, polipéptidos sintéticamente producidos, o polipéptidos producidos a través de una combinación de estos métodos. En la técnica también se entienden muy bien los medios para preparar dichos polipéptidos. Es muy preferido que un polipéptido de la invención se derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, se prefiere que este se obtenga de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención también puede ser obtenido de, por ejemplo, organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos Es un objeto de la invención proporcionar polinucleótidos que codifiquen péptídos BASB027, particularmente polinucleótidos que codifiquen el polipéptido designado aquí como BASB027. En una modalidad particularmente preferida de la invención, el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos. BASB027 comprendiendo una secuencia establecida en SEC ID NO;1 ó 3, la cual incluye un gen de longitud completa, o una variante del mismo. Los polinucleótidos BASB027 provistos en SEC ID NO:1 ó 3 son los polinucleótidos de BASB027 de Moraxella catarrhalis cepa Mc2931 (ATCC 43617). Como un aspecto adicional de la invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB027, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB027 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARNs no procesado, ARNs de ribozima, ARNms, ADNcs, ADNs genómicos, B- y Z-ADNs. Otras modalidades de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y sus variantes, y • composiciones que comprenden los mismos. 5 Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo por lo menos un gen de longitud completa que codifica un polipéptido BASB027 que tiene una secuencia de aminoácido deducida de SEC ID NO:2 ó 4, y polinucleótidos estrechamente relacionados con los mismos y sus variantes. • 10 En otra modalidad particularmente preferida de la invención existe un polipéptido BASB027 de Moraxella catarrhalis que comprende o consiste de una secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 ó 4, o una variante del mismo. Utilizando la información provista aquí, tal como una secuencia de polinucleótido establecida en SEC ID NO:1 ó 3, se puede obtener un polinucleótido de la invención que codifica al polipéptido BASB027 utilizando métodos estándares de clonación y clasificación, • tales como aquellos para clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosómicos a partir de bacterias utilizando células de Moraxella catarrhalis como materia de partida, seguido por obtener un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótido de la invención, tal como una secuencia de polinucleótido dada en SEC ID NO:1 ó 3, típicamente una colección de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o algún otro huésped adecuado se le aplica una sonda con un oligonucleótido radiomarcado, preferiblemente uno de 17-mer o mayor, derivado de una secuencia parcial. Los clones que llevan ADN idéntico a aquel de la sonda entonces pueden ser distinguidos utilizando condiciones de hibridación severas. A través de la secuenciación de los clones individuales así identificados por la hibridación con iniciadores de secuenciación diseñados de la secuencia de polipéptido o polinucleótido original, entonces es posible extender la secuencia de polinucleótido en ambas direcciones para determinar una secuencia de longitud completa. Convenientemente, dicha secuenciación se realiza, por ejemplo, Utilizando ADN de estructura de cadena doble desnaturalizado preparado a partir de un clon de plásmido. Las técnicas adecuadas se describen por Maniatis, T., Fritsch, E. F., y Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2o. Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York (1989). (Ver en particular clasificación por hibridación 1.90 y plantillas de ADN de estructura de cadena doble desnaturalizadas de secuenciación 13.70). La secuenciación de ADN genómico directa también puede ser realizada para obtener una secuencia de gen de longitud completa. Ilustrativo de la invención, cada polinucleótido establecido en SEC ID NO:1 ó 3 fue descubierto en una colección de ADN derivada de Moraxella catarrhalis. Además, cada secuencia de ADN establecida en SEC ID NO.1 ó 3 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácido establecidos en SEC ID NO:2 ó 4 con un peso molecular deducido que puede ser calculado utilizando valores de peso molecular de residuo de aminoácido bien conocido por aquellos expertos en la • técnica. 5 El polinucleótido de SEC ID NO:1, entre el codón de inicio en el número 1 de nucleótido y el codón de detención que comienza en el número 2440 del nucleótido de SEC ID NO:1, codifica el polipéptido de SEC ID NO:2. El polinucleótido de SEC ID NO:3, entre el codón de inicio en el • 10 número 1 de nucleótido y el codón de detención que empieza en el número 2440 del nucleótido de SEC ID NO:3, codifica el polipéptido de SEC ID NO:4. En un aspecto más, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o consiste de: 15 (a) una secuencia de polinucleótido que tiene por lo menos un 85% de identidad, de preferencia al menos 90% de identidad, preferiblemente al menos 95% de identidad, aún muy preferiblemente por lo menos 97-99% o identidad exacta a SEC ID NO:1 ó 3 sobre toda la longitud de SEC ID NO:1 ó 3, respectivamente; o 20 (b) una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 85% de identidad, de preferencia por lo menos 90% de identidad, preferiblemente por lo menos 95% de identidad, muy preferiblemente al menos 97-99% o 100% o exacta, a la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 ó 4, sobre toda la longitud de SEC ID NO:2 ó 4, respectivamente.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies distintas a Moraxella catarrhalis, puede ser obtenido a través de un proceso que • comprende los pasos de clasificar una colección apropiada bajo 5 condiciones de hibridación severas (por ejemplo, utilizando una temperatura en la escala de 45-65°C y una concentración SDS de 0.0-1%) con una sonda marcada o detectable consistiendo de o comprendiendo la secuencia de SEC ID NO:1 ó 3, o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos • 10 conteniendo dichas secuencias de polinucleótido. La invención proporciona una secuencia de polinucleótido idéntica, sobre toda su longitud a una secuencia de codificación (marco de lectura abierto) en SEC ID NO:1 ó 3. También la presente invención proporciona una secuencia de codificación para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia de codificación para un polipéptido o fragmento maduro en el marco de lectura con otra secuencia de codificación, tal como un secuencia que codifica una secuencia líder o de secreción, una secuencia pre, o pro, o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención también puede contener por lo menos una secuencia de no codificación, incluyendo, por ejemplo, pero no limitándose a por lo menos una secuencia 5' y 3' de no codificación, tal como las secuencias transcritas pero traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión de ribosoma, secuencias de Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, mirones, y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótido también puede comprender una secuencia de codificación que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia 5 marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas modalidades de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe por Gentz y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989), una etiqueta de péptido HA (Wilson y otros, • 10 Cell 37:767 (1984), ambos pueden ser útiles para purificar la secuencia de polipéptido fusionada a los mismos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que describen un gen estructural y sus secuencias naturalmente asociadas que controlan la expresión de gen. 15 La secuencia de nucleótido que codifica al péptido BASB027 de SEC ID NO:2 ó 4 puede ser idéntica a la secuencia de codificación de péptido contenida en los nucleótidos 1 a 2439 de SEC ID NO:1 ó • 3, respectivamente. Alternativamente, puede ser una secuencia, la cual como resultado de la redundancia (de generación) del código genético, también codifica el polipéptido de SEC ID NO:2 ó 4. El término "polinucleótido que codifica un polipéptido", como se utiliza en la presente, abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de Moraxella catarrhalis, BASB027, teniendo una secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:2 ó 4. El término también abarca polinucleótidos que incluyen una región continua individual o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo polinucleótidos interrumpidos por el fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrado, una secuencia de transposón integrado, o debido a la edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias de codificación y/o de no codificación. La invención además se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos aquí que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido deducida de SEC ID NO: 2 ó 4. Se pueden utilizar fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención. Otras modalidades particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de BASB027, que tienen la secuencia de aminoácido del polipéptido BASB027 de SEC ID NO:2 ó 4 en donde varios, algunos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácido es substituido, modificado, eliminado y/o agregado, en cualquier combinación. Especialmente preferidos entre estos están las substituciones silenciosas, adiciones y eliminaciones, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB027. Otras modalidades preferidas de la invención son polinucleótidos que por lo menos son 85% idénticos sobre toda su longitud a un polinucleótido que codifica al polipéptido BASB027 teniendo una secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:2 ó • 4, y polinucleótidos que son complementarios a dichos 5 polinucleótidos. Alternativamente, son altamente preferidos los polinucleótidos que comprenden una región que es por lo menos 90% idéntica sobre toda su longitud a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASBA027 y polinucleótidos complementarios a los mismos. A este respecto, son particularmente preferidos loa • 10 polinucleótidos por lo menos 90% idénticos sobre toda su longitud a los mismos. Además, aquellos con por lo menos un 97% son altamente preferidos entre aquellos con por lo menos un 95%, y entre éstos aquellos con por lo menos un 98% y por lo menos un 99% son particular y altamente preferidos, siendo muy preferidos los que tienen por lo menos un 99%. Las modalidades preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen substancialmente la misma función biológica o actividad como el polipéptido maduro codificado por un ADN SEC ID NO:1 ó 3. 20 De acuerdo con ciertas modalidades preferidas de esta invención, se proporcionan polinucleótidos que hibridizan, particularmente bajo condiciones severas, a secuencias de polinucleótido BASB027, tales como aquellos polinucleótidos en SEC ID NO:1 ó 3. 25 La invención además se refiere a polinucleótidos que hibridizan a las secuencias de polinucleótido provistas aquí. A este respecto, la invención espacialmente se refiere a polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones severas a los polinucleótidos aquí descritos. Como se utiliza en la presente, los términos, "condiciones severas" y condiciones de hibridación severas" representan la hibridación que ocurre solamente si existe por lo menos un 95% y preferiblemente por lo menos un 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación severas es incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende: 50% de formamida, 5x SSC (150 M NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextran, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón separado, seguido por lavado del soporte de hibridación en 0.1 x SSC a aproximadamente 65°C. Las condiciones de hibridación y de lavado son bien conocidas y se ilustran en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Segundo Edición, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), particularmente Capítulo 11 del mismo. También se puede utilizar hibridación de solución con las secuencias de polinucleótido provista por la invención. La invención también proporciona un polinucleótido que consiste de o que comprende una secuencia de polinucleótido obtenida clasificando una clasificación apropiada conteniendo gen completo para una secuencia de polinucleótido establecida en SEC ID NO:1 ó 3 bajo condiciones de hibridación severas con una sonda teniendo la secuencia de dicha secuencia de polinucleótido establecida en SEC ID NO:1 ó 3, o un fragmento de la misma; y aislar dicha secuencia de polinucleótido. Los fragmentos útiles para obtener dicho polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas e iniciadores totalmente como se describe aquí en cualquier parte. Como se discute aquí con respecto a ensayos de polinucleótido de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención pueden ser utilizados como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNcs de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB027 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen alta identidad, particularmente alta identidad de secuencia, al gen BASB027. Dichas sondas generalmente comprenderán por lo menos 15 residuos de nucleótidos o pares de base. Preferiblemente, dichas sondas tendrán por lo menos 30 residuos de nucleótido o pares de base y pueden tener por lo menos 50 residuos de nucleótido o pares de base. Las sondas particularmente preferidas tendrán por lo menos 20 residuos de nucleótido o pares de base y tendrán menos de 30 residuos de nucleótido o pares de base. Una región de codificación de un gen BASB027 puede ser aislada clasificando una secuencia de ADN provista en SEC ID NO:1 ó 3 para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Un oligonucleótido marcado teniendo una secuencia complementaria a aquella de un gen de la invención entonces es utilizado para clasificar una colección de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar que miembros de la colección hibridiza la sonda.

Existen varios métodos disponibles y bien conocidos por aquellos expertos en la técnica para obtener ADNs de longitud completa, o ADNs de extensión corta, por ejemplo, aquellos con base en el método de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE), (ver, por ejemplo, Forman y otros, PNAS USA 85: 8998-9002). Recientes modificaciones de la técnica, ilustradas por la tecnología de Maratón™ (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda para ADNcs más largos. En la tecnología de Maratón™, se han preparado ADNcs del ARNm extraído de un tejido seleccionado y una secuencia "adaptadora" ligada sobre cada extremo. Después se realizó la amplificación de pacido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "faltante" del ADN utilizando una combinación de iniciadores de oligonucleótidos específicos en el gen y específicos en el adaptador. La reacción de PCR después es repetida utilizando iniciadores (anidados), es decir, iniciadores diseñados para calentar y enfriar rápidamente dentro del producto amplificado (típicamente un iniciador específico adaptador que calienta y enfría rápidamente al extremo 3' en la secuencia adaptadora y un iniciador específico de gen que calienta y enfría rápidamente al extremo 5' en la secuencia de gen seleccionado). Los productos de esta reacción entonces pueden ser analizados a través de secuencíación de ADN y un ADN de longitud completa construido ya sea uniendo el producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o realizando una PCR de longitud completa separada utilizando la nueva información de secuencia para el diseño del iniciador 57 Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden ser empleados, por ejemplo, como reactivos de búsqueda y materiales • para descubrir tratamientos y diagnóstico para enfermedades, particularmente enfermedades de seres humanos, como se discutió en la presente con relación a ensayos de polinucleótido. Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de SEC ID NO:1 ó 3, pueden ser utilizados en los procesos de la presente como se describe, pero • 10 preferiblemente para PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en la presente en total o en parte son o no transcritos en bacterias en tejidos infectados. Se reconoce que dichas secuencias también tendrán utilizada en el diagnóstico de la etapa de infección y tipo de infección que el patógeno ha obtenido. 15 La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino-o carboxil-terminales, o aminoácidos interiores al • polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptido, por ejemplo). Dichas secuencias pueden jugar un papel importante en el procesamiento de una proteína a partir de un precursor a una forma madura, puede permitir el transporte de proteína, pueden alargar o reducir la vida media de la proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para el ensayo o producción, entre otras cosas. Como generalmente es el caso in vivo, aminoácidos adicionales pueden ser procesados a partir de la proteína madura a través de enzimas celulares. Para cada uno y todos los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario al mismo. Se prefiere • que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido con el cual son complementarios. Una proteína precursora, teniendo una forma madura del polipéptido fusionado a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se remueven prosecuencias, • 10 dichos precursores inactivos generalmente son activados. Algunas o todas las prosecuencias pueden ser removidas antes de la activación. En general, dichos precursores son denominados proproteínas. Además de las representaciones A, G, C, T/U estándares para nucleótidos, el término "N" también puede ser utilizado para descubrir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer • en dicha posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto si se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótido adyacentes, cuando se lee en un marco de lectura correcto, pueda tener el efecto de generar un codón de terminación prematuro en dicho marco de lectura. En resumen, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (la cual puede ser denominada como una preproteína), un precursor de una proteína madura teniendo una o más prosecuencias que no son las secuencias líderes de una preproteína, o una preproteína, la cual sea un precursor a una proproteína, teniendo una secuencia líder y una o más prosecuencias, la cuales generalmente son removidas durante los pasos de procesamiento que producen formas activas inmaduras del polipéptido. De acuerdo con el aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética. El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética preferiblemente empleará un método de suministro adecuado tal como inyección directa de ADN de plásmido en los músculos (Wolf y otros, Hum. Mol. Genet (1992) 1:363, Manthorpe y otros, Hum. Gene Ther. (1983) 4:419, suministro de ADN en complejo con portadores de proteína específicos (Wu y otros, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985), co-precipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenistry & Reshef. PNAS USA, (1986) 83:9551), encapsulación de ADN en varias formas de liposomas (kaneda y otros, Science (1989) 243:375), particle bombardment (Tang y otros, Nature (1992) 356:152, Eisenbraun y otros, DNA Cell Biol (1993) 12:791), e infección in vivo utilizando vectores retrovirales clonados (Seeger y otros, PNAS USA (1984) 81:5849).

Vectores. Células Huésped. Sistemas de Expresión La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células huésped que son genéticamente diseñadas por ingeniería con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención a través de técnicas recombinantes. También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células para producir dichas proteínas utilizando ARNs derivados de las construcciones de ADN de la invención. Los péptidos recombinantes de la presente invención pueden ser preparados a través de procesos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica a partir de células huésped genéticamente diseñadas por ingeniería comprendiendo sistemas de expresión. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que son genéticamente diseñadas por ingeniería con dichos sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención a través de técnicas recombinantes. Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células huésped pueden ser genéticamente diseñadas por ingeniería para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido a la célula huésped puede ser efectuada a través de métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis, y otros, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2o. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, N. Y. (1989), tal como, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextran, transvección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, carga de raspado, introducción balística e infección. Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococo, estafilococo, enterococo, E. coli, streptomyces, cianobacteria, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células de levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomicete, Candida albicans y Aspergillus, células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animal tales como CHO, COS. HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de planta tales como células de gimnosperma o angiosperma. Una gran variedad de sistemas de expresión puede ser utilizada para producir los polipéptidos de la invención. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de virus, cromosómicos, episómicos, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófago, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papopavirus, tales como Sv40, virus de vacuna, adenovirus, virus de pustulación avícola, virus de pseudorabia, piconavirus, retrovirus, y alfavirus, y vectores derivados de sus combinaciones, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmido de bacteriófago, tales como cósmidos y fagémicos. Las construcciones • de sistema de expresión pueden contener regiones de control que 5 regulan así como fomentan la expresión. En general, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un huésped puede ser utilizado para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiado puede ser insertada en el sistema de expresión a través • 10 de cualquier variedad de técnicas bien conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, aquellas establecidas en Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, (supra). En sistema de expresión recombinantes en eucariotes, para la secreción de una proteína traducida al lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular, se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser recuperados y purificados de cultivos de célula recombinante a través de métodos bien conocidos incluyendo precipitación de sulfato de sodio o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de anión o catión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Muy preferiblemente, se emplea para la purificación la cromatografía de afinidad de ion metálico IMAC). Las técnicas bien conocidas para replegar proteínas pueden ser empleadas para generar conformación activa cuando el • polipéptido es desnaturalizado durante síntesis intracelular, 5 aislamiento y/o purificación. El sistema de expresión también puede ser un microorgamisno bio-recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés puede ser insertado en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación e infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo del antígeno y la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias utilizados para este propósito son, por ejemplo: poxivirus (por ejemplo vacuna, pustulación avícola, pustulación de canario), alfavirus (virus de Sindbis, virus de Semliki Forest, virus de encefalitis equina Venezolano), Adenovirus, virus adenoasociado, picornavirus (poliovirus, rinovirus), virus de herpes (virus zoster de varicela, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o atenuados en varias formas con el fin de tener vacunas vivas. Dichas vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de Diagnóstico. Pronóstico. Serotipificación y Mutación Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB027 de la invención para utilizarse como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB027 en un eucariote, particularmente un mamífero, y en especial un ser humano, proporcionará un método de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad, etapa de la enfermedad o • respuesta de un organismo infeccioso a los fármacos. Los 5 eucariotes, particularmente mamíferos, y en especial seres humanos, particularmente aquellos infectados o con sospecha de ser infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB027, pueden ser detectados a nivel de ácido nucleico o de aminoácido a través de una variedad de técnicas bien conocidas, así como también a través de métodos provistos en la presente. Los polipéptidos y polinucleótidos para la prognosis, diagnóstico u otros análisis pueden ser obtenidos a partir de un material corporal del individuo putativamente infectado y/o infectado. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, pueden ser utilizados directamente para la detección pueden ser amplificados enzimáticamente utilizando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. También se puede utilizar en las mismas formas ARN, en particular ARNm, ADNc y ADN genómico. Utilizando la amplificación, se puede hacer la caracterización de las especies y cepa de organismo infeccioso o residente presente en un individuo, a través de un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Se pueden detectar eliminaciones e inserciones a través de un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada de un organismo seleccionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Se pueden identificar mutaciones de punto hibridizando ADN amplificado a • secuencias de polinucleótido BASB027 marcadas. Se pueden 5 distinguir secuencias perfecta o significativamente coincidentes a partir de dúplex imperfectos o más significativamente no coincidentes a través de digestión de DNase o RNase, para ADN o ARN respectivamente, o detectando diferencias en las temperaturas de fusión o cinética de renaturalización. También se pueden detectar • 10 diferencias de secuencia de polinucleótido a través de alteraciones en la movilidad electroforética de fragmento de polinucleótido en geles según comparado con una secuencia de referencia. Esto puede ser realizado con o sin agentes desnaturalizantes. También se pueden detectar diferencias de polinucleótido a través de secuenciación de ADN o ARN. Ver, por ejemplo, Myers y otros, Science, 230:1242 (1985). Los cambios de secuencia en ubicaciones específicas también pueden ser revelados a través de ensayos de • protección de nucleasa, tales como RNase, ensayo de protección de VI y S1 o un método de escisión química. Ver, por ejemplo, Cotton y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401 (1985). En otra modalidad, una disposición de sondas de oligonucleótidos comprendiendo la secuencia de nucleótido BASB027 o sus fragmentos, puede ser construida para conducir una clasificación eficiente de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los métodos de tecnología de disposición son bien conocidos y tienen una a plicabil idad general y pueden ser utilizados para dirigir una variedad de cuestiones en genética molecular incluyendo expresión de gen, enlace genético, y variabilidad genética (ver, por ejemplo, Science, 274:610 (1996)). De esta manera, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un equipo de diagnóstico que comprende: (a) un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótido SEC ID NO:1 ó 3, o un fragmento del mismo; (b) una secuencia de nucleótido complementaria a aquella de (a); (c) un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de SEC ID NO:2 ó 4, o un fragmento del mismo; o (d) un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, preferiblemente para el polipéptido de SEC ID NO:2 ó 4.

Se apreciará que en cualquier equipo, (a), (b), (c) o (d) pueden comprender un componente substancial. Dicho equipo será de uso para el diagnóstico de una enfermedad o susceptibilidad a enfermedad, entre otros. Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente SEC ID NO:1 ó 3, que está asociado con una enfermedad o patogenicidad, se proporcionará una herramienta de diagnóstico que pueda ser agregada a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, una prognosis del curso de una enfermedad, una determinación de la etapa de una enfermedad, o una susceptibilidad a una enfermedad, lo cual resulta de la subexpresión, sobre-expresión o expresión alterada de polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que llevan mutaciones en dicho polinucleótido pueden ser detectados al nivel de polinucleótido a través de una variedad de técnicas, tales como aquellas descritas en la presente. Las células de un organismo que lleva mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención también pueden ser detectadas al nivel del polinucleótido o polipéptido a través de una variedad de técnicas, para permitir la serotipificación, por ejemplo. Por ejemplo, se puede utilizar RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Es particularmente preferido utilizar RT-PCR junto con sistemas de detección automáticos, tales como, por ejemplo, GeneScan. También se puede utilizar ARN, ADNc o ADN genómico para el mismo propósito, PCR. Como un ejemplo, los iniciadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB027 pueden ser utilizados para identificar y analizar mutaciones. La invención además proporciona iniciadores con 1, 2, 3 o 4 nucleótidos removidos del extremo 5' y/o 37 Estos iniciadores pueden ser utilizados, entre otras cosas, para amplificar el ADN de BASB027 y/o ARN aislado de una muestra derivada de un individuo, tal como un material del cuerpo. Los iniciadores pueden ser utilizados para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido después puede ser 5 sometido a varias técnicas para producir la secuencia de polinucleótido. De esta manera, se pueden detectar y utilizar mutaciones en la secuencia del polinucleótido para diagnosticar y/o predecir la infección o su etapa o curso, para el serotipo y/o clasificar el agente infeccioso. • 10 La invención además proporciona un proceso para el diagnóstico, enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, muy preferiblemente infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, que comprende determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material del cuerpo, un nivel incrementado de expresión del polínucleótido teniendo una secuencia de SEC ID NO:1 ó 3. La expresión elevada o reducida de un polinucleótido BASB027 puede ser medida utilizando cualquiera de los métodos bien • conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tal como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de RNase, tinción Northern, espectrometría y otros métodos de hibridación. Además, un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar sobre expresión del polipéptido BASB027 comparado con muestras de tejido de control normales puede ser utilizado para detectar la presencia de una invención, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden ser utilizadas para determinar los niveles de un polipéptido BASB027 en una muestra derivada de un huésped, tal como un material del cuerpo, son bien conocidas por aquellos • expertos en la técnica. Dichos métodos de ensayo incluyen radio 5 inmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de tinción Western, ensayos de emparedado de anticuerpo, detección de anticuerpo y ensayos de ELISA. Los polinucleótidos de la invención pueden ser utilizados como componentes de disposiciones de polinucleótido, preferiblemente disposiciones o rejas de alta densidad. Estas disposiciones de alta densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, un grupo de puntos cada uno comprendiendo un diferente gen, y además comprendiendo un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, puede ser utilizado para aplicar una sonda, tal como utilizando hibridación o amplificación de ácido nucleico, utilizando sondas obtenidas o derivadas de una muestra del cuerpo, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótido particular o secuencia relacionada con un individuo. Dicha presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil para el diagnóstico y/o pronostico de una enfermedad o curso de una enfermedad. Una reja comprendiendo un número de variantes de la secuencia de polinucleótido de SEC ID NO:1 ó 3, es preferida. También se prefiere un número de variantes de una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de polipéptido de SEC ID NO:2 ó 4.

Anticuerpos • Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o sus 5 variantes, o células que expresan los mismo pueden utilizados como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para dichos polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente. En ciertas modalidades preferidas de la invención, se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos • 10 BASB027. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención pueden ser obtenidos administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que llevan epítopo de cualquiera o de ambos, análogos de cualquiera o de ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal preferiblemente uno que no es ser humano, utilizando protocolos de rutina. Par la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica conocida en el campo que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de línea de célula continua. Los ejemplos incluyen varias técnicas, tales como aquellas de Kohier, G. Y Milstein, C, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor y otros, Immunology Today 4:72 (1983); Colé y otros, pág. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÁNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985). 25 Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena individual (patente de E. U. A. No. 4,946,778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena individual a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También, se pueden utilizar • ratones transgénicos, u otros organismo o animales, tales como otros 5 mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos a los polipéptidos o polinucleótidos de la invención. Alternativamente, se puede utilizar tecnología de exhibición de fago para seleccionar genes de anticuerpo con actividad de unión 10 hacia un polipéptido de la invención ya sea de los repertorios de • genes v amplificados mediante PCR de linfocitos de seres humanos clasificados por poseer anti-BASB027 o de colecciones naturales (McCafferty y otros, (1990), Nature 348, 552-554; Marks y otros, (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos 15 también puede ser mejorada, por ejemplo, a través de la entremezcla de cadena mejorada (Claxon y otros, (1991) Nature 352:628). Los anticuerpos anteriormente descritos pueden ser empleados • para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o 20 polinucleótidos, por ejemplo, a través de cromatografía de afinidad. De esta manera, entre otros, se pueden emplear anticuerpos contra el polipéptido BASB027 o polinucleótido BASB027 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas. Las variantes de polipéptido incluyen variantes antigénica, 25 epitópica o inmunlógicamente equivalentes que forman un aspecto particular de esta invención. Preferiblemente, el anticuerpo o su variante es modificado para hacer que sea menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es un ser humano, el anticuerpo muy preferiblemente debe ser "humanizado", en donde la región o regiones de determinación de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma ha sido transplantada a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, como se describe por Jones y otros (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest y otros, (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y Agonistas - Ensayos y Moléculas También se pueden utilizar polipéptidos y polinucleótidos de la invención para determinar la unión de pequeños substratos de molécula ligandos en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, colecciones químicas y mezclas de producto natural. Estos substratos y ligandos pueden ser substratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Ver, por ejemplo, Coligan y otros, Current Protocols in Immunology 1(2): Capítulo 5 (1991). Los métodos de clasificación simplemente pueden medir la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido a través de una marca directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Alternativamente, el método de clasificación puede involucrar la competencia con un competidos marcado. Además, estos métodos de clasificación pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por la activación o inhibición del • polipéptido o polinucleótido, utilizando sistemas de detección 5 apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de la activación son generalmente analizados en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto en la activación por el agonista a través de la presencia del compuesto candidato. Se pueden emplear polipéptidos • 10 constitutivamente activos y/o polipéptidos y polinucleótidos constitutivamente expresados para clasificar métodos para agonistas o inhibidores inversos, en ausencia de un agonista o inhibidor, probando si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de activación del polipéptido o polinucleótido, cualquiera que sea el caso. Además, los métodos de clasificación simplemente pueden comprender los pasos de mezclar un compuesto candidato con una solución conteniendo un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB027 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB027 de la mezcla con un estándar. Las proteínas de fusión, tales como aquellas hechas a partir de la porción Fc y del polipéptido BASB027, como se describió anteriormente, también pueden ser utilizadas para ensayos de clasificación de alta producción para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como polipéptidos filigenética y/o funcionalmente relacionados (ver, D. Bennett y otros, J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1995); y K. Johanson y otros, J. Biol. Chem. 270/16):9459-9471 (1995)). • Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a 5 y/o interactúan con un polipéptido de la presente invención también pueden ser configurados para configurar métodos de clasificación para detectar el efecto de compuestos agregados en la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo de ELISA para medir los niveles asociados de célula o secretados del polipéptido utilizando anticuerpos monoclonales y • policlonales a través de métodos estándares conocidos en la técnica. Esto puede ser utilizado para descubrir agentes que pueden inhibir o mejorar la producción del polipéptido (también denominada antagonista o agonista, respectivamente) de células o tejidos adecuadamente manipulados. La invención también proporciona un método para clasificar compuestos para identificar aquellos que mejoran (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de los polipéptidos o polinucleótidos BASB027, particularmente aquellos que son bacterioestáticos y/o bactericidas. El método para clasificar puede involucrar técnicas de alta producción. Por ejemplo, para clasificar agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción sintética, un componente celular, tal como una membrana, una cubierta celular o pared celular o una preparación de cualquiera de éstos, comprendiendo el polipéptido BASB027 y un substrato ligando marcado de dicho polipéptido es incubado en ausencia o presencia de una molécula candidato que puede ser un agonista o antagonista BASB027. La habilidad de la molécula candidato para agonizar o • antanogizar el polipéptido BASB027 se ve reflejada en el enlace 5 reducido del ligando marcado o producción reducida del producto a partir del substrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB027 es muy probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, según sea el caso, elevan la velocidad de producción del producto a partir del substrato, incrementa la traducción de señal, o incrementan la actividad del canal químico, son agonistas. La detección del régimen o nivel de, según sea el caso, producción del producto a partir del substrato, transducción de señal, o actividad de canal químico puede ser mejorada utilizando un sistema de reporte.

Los sistemas de reporte que pueden ser útiles a este respecto incluye, pero no se limitan a, colorimétrico, substrato marcado convertido a un producto, un gen de reporte que es sensible a los cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB027, y ensayos de unión conocidos en la técnica. 20 Otro ejemplo de un ensayo para agonistas BASB027 es un ensayo competitivo que combina BASB027 y un agonista potencial con moléculas de unión BASB027, moléculas de unión BASB027 recombinantes, y substratos o ligandos naturales, o miméticos de substrato o ligando, bajo condiciones apropiados para un ensayo de inhibición competitivo. BASB027 puede ser marcado, tal como a través de radioactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número de moléculas de BASB027 unidas a una molécula de unión o convertidas a I producto, puede ser determinado con • exactitud para determinar la efectividad del agonista potencial. 5 Los agonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas pequeñas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y de esta manera inhiben o extinguen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas pequeñas orgánicas, un péptido, un polipéptido, tal como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionado que une los mismos sitios den una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB027, evitando así la acción o expresión de los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB027 excluyendo polipéptidos y/o polinucleótidos BASB027 de la unión. Los antagonistas potenciales incluyen una pequeña molécula que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido, evitando así la unión a moléculas de unión celulares, de manera que se evita la actividad biológica normal. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas anti-sentido (ver, Okano, J. Neurochem 56:560 (1991); OLIGODEXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB027. En un aspecto más, la presente invención se refiere a proteínas • de fusión solubles genéticamente diseñadas por ingeniería, que 5 comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina de varias subclases (IgG, IgM, IgA, I g E) . La preferida como una inmunoglobulina es la parte constante de la cadena pesada de IgG humano, particularmente • 10 I g G 1 , en donde la fusión se presenta en la región de gozne. En una modalidad particular, la parte Fc puede ser removida simplemente a través de la incorporación de una secuencia de escisión, la cual puede ser separada con el factor de coagulación Xa. Además, esta invención se refiere a procesos para la preparación de estas proteínas de fusión a través de ingeniería genética, y a el uso de las mismas para clasificación de fármaco, diagnóstico y terapia. Un aspecto más de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Ejemplos de la tecnología de proteína de fusión pueden encontrarse en las solicitudes de patente internacionales Nos. WO94/2958 y WO94/22914. Cada una de las secuencias de polinucleótido aquí provista puede ser utilizada en el descubrimiento y el desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, después de expresión, puede ser utilizada como un blanco para la clasificación de fármacos antibacterianos. Además, las secuencias de polinucleótido que codifican las regiones aminoterminales de la proteína codificada o Shine-Delgarno u otra traducción que facilita las secuencias del ARNm respectivo, también pueden ser utilizadas para construir secuencias anti-sentido para controlar la expresión de 5 la secuencia de codificación de interés. La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un eucariótico, preferiblemente un mamífero, huésped responsable de • 10 las secuelas de infección. En particular, las moléculas de la invención pueden ser utilizadas: para evitar la adhesión de bacterias, en particular bacterias gram positivas y/o gram negativas, a proteínas de matriz extracelular eucarióticas, preferiblemente de mamífero, o en dispositivos alojados o en proteínas de matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelulares eucarióticas, preferiblemente de mamífero y proteínas BASB027 bacterianas que median en daño de • tejido y/o bloquean la progresión normal de patogénesis en infecciones iniciadas en forma diferente a través de la implantación de dispositivos alojados o a través de técnicas quirúrgicas. De acuerdo con otro aspecto más de la invención existen agonistas y antagonistas BASB027, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas. Los antagonistas y agonistas de la invención pueden ser 25 empleados, por ejemplo para evitar, inhibir y/o tratar enfermedades.

En una aspecto más, la presente invención se refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia de péptido, suficientemente similar al péptido nativo • (secuencial o estructuralmente), el cual es capaz de ser reconocido 5 por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de desarrollar anticuerpos que reconozcan el péptido nativo cuando se acoplan a un portador adecuado. Los mimotopos de péptido pueden ser diseñados para un propósito particular a través de la adición, eliminación o substitución • 10 de aminoácidos elegidos. De esta manera, los péptidos pueden ser modificados para los propósitos de facilitar la conjugación a un portador de proteína. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos métodos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además, puede ser deseable para péptidos conjugados a un portador de proteína que incluyan un término hidrofóbíco lejos del término conjugado del péptido, de manera que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado con la superficie de la proteína • portadora. De esta manera se presenta el péptido en un conformación que muy probablemente se asemeja a aquella del péptido encontrado en contexto de la molécula nativa entera. Por ejemplo, los péptidos pueden ser alterados para tener una cisteína N-terminal y un extremo o cola amidado hidrofóbico C-terminal. Alternativamente, La adición o substitución de una forma de D- estereoisómero de uno o más de los aminoácidos puede ser realizada para crear un derivado benéfico, por ejemplo, para mejorar la estabilidad del péptido. Alternativamente, los mimotopos del péptido pueden ser identificados utilizando anticuerpos que son capaces por sí mismos • de unirse a los polipéptidos de la presente invención utilizando técnicas tales como tecnología de despliegue de fago (EP 0 552 267 B1). Esta técnica, genera un gran número de secuencias de péptido que se asemejan a la estructura de los péptidos nativos y, por lo tanto, son capaces de unirse a anticuerpos de péptido anti-nativos, pero no necesariamente por sí mismos pueden compartir homología de secuencia importante con el polipéptido nativo.

Vacunas Otro aspecto de la invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, de preferencia seres humanos, el cual comprende inocular al individuo con el polinucleótido y/o polipéptido BASB027, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir el anticuerpo y/o una respuesta inmune de célula T para proteger a dicho individuo de infección, particularmente infección bacteriana y más particularmente infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan métodos mediante los cuales dicha respuesta inmunológica reduce la replicación bacteriana. En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, el cual comprende suministrar a dicho individuo un vector de ácido nucleico, secuencia o ribosoma para dirigir la expresión del polinucleótido y/o polipéptido BASB027, o un fragmento o variante del mismo, para expresar el polinucleótido y/o polipéptido BASB027, o un fragmento o variante del mismo in vivo • con el fin de inducir una respuesta inmunológica, tal como, para 5 producir el anticuerpo y/o una respuesta inmune de célula T, incluyendo, por ejemplo, células T de producción de citocina o células T de células citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de una enfermedad, si esa enfermedad ya está establecida dentro del individuo o no. Un ejemplo para administrar el gen es acelerándolo hacia las células • deseadas como una cubierta sobre partículas u otra cosa. Dicho vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, un ribosoma, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo de ADN-proteína o un complejo de ARN-proteína. 15 Un aspecto más de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce a un individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de poder inducir dentro de él • una respuesta inmunológica, induce a una respuesta inmunológica en dicho individuo a un polinucleótido y/o polipéptido BASB027 codificados del mismo, en donde la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB027 recombinante codificado del mismo y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno del polinucleótido, polipéptido BASB027 codificado del mismo, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede ser utilizada terapéutica o profilácticamente y puede tener la forma de inmunidad de anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de células T CTL o CD4 + . Un polipéptido BASB027 o un fragmento del mismo puede ser • fusionado con una co-proteína o porción química, la cual puede o no por sí misma producir anticuerpos, pero es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada, la cual tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y de preferencia propiedades protectoras. De esta manera, la proteína recombinante fusionada, preferiblemente además comprende una co- 10 proteína antigénica, tal como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, glutationa-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra co-proteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la co-proteína puede actuar como un auxiliar en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La co-proteína puede ser unida ya sea al término amino o carboxi de la primera proteína. A través de esta invención se proporcionan composiciones, particularmente composiciones de vacuna, y métodos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimulantes, tales como aquellas descritas por Sato, y otros, Science 273:352 (1996). También, esta invención proporcionan métodos que utilizan el polinucleótido descrito o sus fragmentos particulares, los cuales se ha mostrado que codifican regiones no variables de proteínas superficiales de célula bacteriana, en construcciones de polinucleótido utilizadas en dichos experimentos de inmunización genética en modelos de animal de infección con Moraxella • catarrhalis. Dichos experimentos serán particularmente útiles para 5 identificar epítopos de proteína capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este aspecto permitirá la preparación subsecuente de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados del órgano requisito del animal que exitosamente resiste o elimina la infección, para el desarrollo de • 10 agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres humanos. La invención también incluye una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ya que los polipéptidos y polinucleótidos pueden ser separados en el estómago, • cada uno preferiblemente es administrado en forma parenteral, incluyendo, por ejemplo, administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con el fluido del cuerpo, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden ser presentadas en recipientes de una sola dosis o de dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas y frascos sellados y pueden ser almacenadas en una condición secada por congelación que requiere solamente de la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de uso. La formulación de vacuna de la invención también puede incluir sistemas auxiliares para mejorar la inmunogeneicidad de la formulación. Preferiblemente, el sistema auxiliar evoca preferencialmente un tipo TH1 de respuesta. Una respuesta inmune puede ser ampliamente distinguida en dos categorías extremas, siendo una humoral o respuestas inmunes mediadas por célula (tradicionalmente caracterizadas por mecanismo efectores de anticuerpo y celulares de protección, respectivamente). Estas categorías de respuesta han sido denominadas respuestas de tipo TH-1 (respuesta mediada por célula) y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral). Las respuestas inmunes de tipo TH1 extremas puede ser caracterizadas por la generación del linfocitos T citotóxicos restringidos en haplotipo, de antígeno específico, y respuestas de célula aniquiladora natural. En respuestas de tipo TH1 de ratones estas por lo general se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo lgG2a, mientras que en el ser humano estas corresponden a anticuerpos de tipo I g G 1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia escala de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en ratones IgG 1 , IgA, e IgM. Se puede considerar que la fuerza impulsora por atrás del • desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son citosinas. 5 Altos niveles de citosinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por célula para el antígeno dado, mientras que altos niveles de citosinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales para el antígeno. 10 La distinción de respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es • absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmune que sea descrita como siendo predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, por lo general es conveniente considerar a las familias de citosinas en términos de aquellas descritas en clones de célula T CD4 +ve de murino por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 y TH2 cells. different patterns of lymphokine secretion lead to different functional • properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173. Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 son asociadas con la producción de las citosinas INF-? y I L-2 a través de linfocitos T. otras citosinas por lo general directamente asociadas con la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no son producidas por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas de tipo TH2 son asociadas con la secreción de II-4, I L-5 , IL-6 e IL-13. 25 Se sabe que ciertos auxiliares de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citosina de tipo ya sea TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio de TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una • vacunación o infección incluye la medición directa de la producción 5 de citosinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno, y/o la medición de la relación de lgG1:lgG2 a de las respuestas de anticuerpo de antígeno específico. De esta manera, un auxiliar de tipo TH1 es uno que preferencialmente estimula poblaciones de células T aisladas para • 10 producir altos niveles de citosina de tipo TH1 cuando se vuelven a estimular con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuesta de inmunoglobulina de antígeno específico asociadas con el isotipo de tipo TH1. Los auxiliares que son capaces de la estimulación preferencial 15 de la respuesta de célula TH1 se describen en la solicitud de Patente Internacional No. WO 94/00153 y WO 95/17209. El lípido A de monofosforilo 3-Des-O-asilado (3D-MPL) es uno de estos auxiliares. Es conocido de GB 2220211 (Ribi). Químicamente, es una mezcla de lípido de A de monofosforilo 3-Des- 20 O-acilado con 4,5 o 6 cadenas asiladas y es fabricado por Ribi Inmmunochem., Montana. Una forma preferida del lípido A de monofosforilo 3-Des-O-asilado se describe en la solicitud de Patente Europea 0 689454 B1 (SmithKIine Beecham Biologicals SA). Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son lo 25 suficientemente pequeñas para ser filtradas en forma estéril a través de una membrana de 0.22 mieras (No. de Patente Europea 0 689 454). El 3D-MPL estará presente en la escala de 10µg-100µg, de preferencia de 25-50µg por dosis, en donde el antígeno típicamente estará presente en una escala de 2-50µg por dosis. Otro auxiliar preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada mediante Hplc derivado de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, esto puede ser mezclado con lípido A de monofosforilo 3-Des-O-asilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo. El método de producción de QS21 se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,057,540. Previamente, se han descrito (WO 96/33739) formulaciones de auxiliar no reactogénicas conteniendo QS21. Dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han mostrado ser auxiliares estimulantes de TH1 exitosos cuando se formulan junto con un antígeno. Otros auxiliares que son estimulantes preferenciales de la respuesta de célula TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias de CpG no metiladas como se describe en WO 96/025555. Las combinaciones de diferentes auxiliares estimulantes TH1, tales como aquellos mencionados anteriormente, también se contemplan para proporcionar un auxiliar que sea un estimulante preferencial de la respuesta de célula TH1. Por ejemplo, QS21 puede ser formulado junto con 3D-MPL. La relación de QS21:3D-MPL típicamente será del orden de 1:10 a 10:1; de preferencia de 1:5 a 5:1 y substancialmente de 1:1. La escala preferida para sinergia óptima es de 2.5:1 a 1:1 3D-MPL:QS21. Preferiblemente, un vehículo también está presente en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio. Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna de acuerdo con la invención son combinados con QS21 y 3D-MPL en dicha emulsión. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina. Típicamente, para administración a seres humanos, QS21 y 3D- MPL estarán presentes en una vacuna en la escala de 1µg-200µg, tal como, 10-100µg, de preferencia 10µg-50µg por dosis. Típicamente, la emulsión de aceite en agua comprenderá de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol y de 0.3 a 3% de Tween 80. Preferiblemente la relación de escualeno: alfa tocoferol es igual o menor que 1 ya que proporciona una emulsión más estable. Span 85 también puede estar presente a un nivel de 1%. En algunos casos, puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención además puedan contener un estabilizador. Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas preferiblemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulsificante, por ejemplo, Tween 80 en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, salina regulada en su pH con fosfato. Una formulación auxiliar particularmente potente que implica QS21.3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210. La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cáncer, enfermedades autoinmunes y condiciones relacionadas. Dicha composición de vacuna polivalente puede incluir un auxiliar de inducción de TH-1 como se describió anteriormente. Aunque la invención ha sido descrita con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB027, se debe entender que esta cubre fragmentos de polipéptidos y polinucleótidos de existencia natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, eliminaciones o substituciones que no afectan substancialmente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, equipos y administración En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido BASB027 y/o un polipéptido BASB027 para administrarse a una célula o a un organismo multicelular. La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido, aquí descrito, o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden ser empleados en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para utilizarse con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Dichas composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo de medios o una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, salina, salina regulada en su pH, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. La formulación debe adecuarse al modo de administración. La invención además se refiere a paquetes y equipos de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones antes mencionadas de la invención. Se pueden emplear polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención solos o en conjunto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos. Las composiciones terapéuticas pueden ser administradas en una forma efectiva, conveniente incluyendo, por ejemplo, administración a través de rutas tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, ¡ntranasal, o intradérmica, entre otras. En terapia o como un profiláctico, el agente activo puede ser • administrado a un individuo como una composición inyectable, por 5 ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica. En un aspecto más, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido, tal • 10 como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o compuesto de molécula pequeña, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos incluyen, pero no se limitan a, salina, salina regulada en su pH, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. La invención además se refiere a paquetes y equipos farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones antes mencionadas de la invención. Se pueden emplear polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos. La composición será adaptada a la ruta de administración, por ejemplo, a través de una ruta sistémica o una ruta oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen, inyección, típicamente a través de inyección intravenosa. Otras rutas de inyección, tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal, pueden ser utilizadas. Los medios alternativos para administración sistémica incluyen administración de transmucosa y transdérmica utilizando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u 5 otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden ser formulados en una formulación entérica o encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en la forma de bálsamos, pastas, geles, ^ 10 lociones, polvos y similares. Para administrarse a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosis diario del agente activo será de 0.01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosis real que será la más 15 adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosis anteriores son ilustrativas del caso promedio. Claro que, pueden existir casos individuales en donde se t ameriten escalas de dosis más altas o más bajas, y estas dentro del alcance de esta invención. 20 La escala de dosis preferida depende de la elección del péptido, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la condición del sujeto, y el juicio del médico que atiende. Sin embargo, las dosis adecuadas están en la escala de 0.1- 1 OOµg/kg del sujeto. 25 Una composición de vacuna convenientemente está en forma inyectable. Se pueden emplear auxiliares convencionales para mejorar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación es de 0.5-5 microgramos/kg del antígeno, y dicha dosis de preferencia es administrada 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con la escala de dosis indicada, no se observará ningún efecto toxicológico adverso con los compuestos de la invención que podrían evitar su administración a individuos adecuados. Sin embargo, se espera que amplias variaciones en la dosis necesaria en vista de la variedad de compuestos estén disponibles y las diferentes eficiencias de varias rutas de administración. Por ejemplo, la administración oral puede esperarse que requiera de dosis más altas que la administración a través de inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosis pueden ser ajustadas utilizando rutinas empíricas estándares para optimización, como es bien conocido en la técnica.

Bases de Datos de Secuencias. Secuencias en un Medio Tangible y Algoritmos Las secuencias de polinucleótido y polipéptido forman un recurso de información valioso con el cual se determinan sus estructuras bi y tridimensionales así como identifican secuencias adicionales de homología similar. Estos aspectos son más facilitados almacenando la secuencia en un medio legible por computadora y después utilizando los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar una base de datos de secuencias utilizando herramientas buscadoras bien conocidas, tal como el paquete de programa GCG. También la presente invención proporciona métodos para el análisis de secuencias o tiras de carácter, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteína codificadas. Los métodos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, métodos de análisis de homología de secuencia, tal como análisis de identidad y similitud, ADN, ARN y análisis de estructura de proteína, ensamble de secuencia, análisis cladístico, análisis de motivo de secuencia, determinación de marco de lectura abierto, llamado de base de ácido nucleico, análisis de uso de codón, clasificación de base de ácido nucleico y análisis pico de cromatograma de secuenciación. Se proporciona un método a base de computadora para realizar la identificación de homología. Este método comprende los pasos de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótido comprendiendo la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por computadora; y comparar dicha secuencia de polinucleótido con por lo menos una segunda secuencia de polinucleótido o polipéptido para identificar la homología. También se proporciona un método a base de computadora para realizar identificación de homología, dicho método comprende los pasos de: proporcionar una primera secuencia de polipéptido comprendiendo la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible por computadora; y comparar la primera secuencia de polipéptido con por lo menos una segunda secuencia de polinucleótido o polipéptido para identificar la homología. Todas las publicaciones y referencias, incluyendo, pero no • limitándose a patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia en su totalidad, como si cada publicación o referencia individual fuera específica e individualmente indicada como incorporada por referencia aquí como se establece totalmente. Cualquier solicitud de patente a la cual esta solicitud reclame prioridad, también está incorporada aquí por • 10 referencia en su totalidad en la forma descrita anteriormente para publicaciones y referencias.

DEFINICIONES "Identidad", como es conocido en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, según sea el caso, puede ser determinada conservando la secuencia. En la técnica "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de polipéptido o polinucleótido, según sea el caso, según sea determinado por la coincidencia entre las tiras de dichas secuencias. La "identidad" puede ser fácilmente calculada a través de métodos conocidos, incluyendo, pero no limitándose a aquellos descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis • Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New 5 York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad están diseñados para dar la coincidencia más grande entre las secuencias probadas. Además, los métodos para determinar la identidad son codificados en programas de computadora públicamente disponibles.

Los métodos de programa de computadora para determinar la • identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el paquete de programa CGC (Devereux, J., y otros, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y otros, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). La familia BLAST de programas está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y otros, NCBI NLM • NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y otros, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Para determinar la identidad también se puede utilizar el algoritmo de Smith Waterman bien conocido. Los parámetros para la comparación de secuencia de polipéptido incluyen lo siguiente: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de Comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc.

Nati. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992).

Penalidad de Hueco: 8 Penalidad de Longitud de Hueco: 2 Un programa útil con estos parámetros está públicamente • disponible como el programa de "gap" de Genetics Computer Group, Madison Wl. Los parámetros antes mencionados son los parámetros por omisión para comparaciones de péptido (sin ninguna penalidad para huecos extremos). Los parámetros para la comparación de polinucleótido incluyen los siguientes: • 10 Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de Comparación: aspectos coincidentes = +10, no coincidentes = 0 Penalidad de Hueco: 50 Penalidad de Longitud de Hueco: 3 15 Disponible como: el programa de "gap" de Genetics Computer Group, Madison Wl. Estos son los parámetros por omisión para comparaciones de ácido nucleico. Un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos, y polipéptidos, según sea el caso, se provee en (1) y (2) a 20 continuación. (1) Las modalidades de polinucleótido además incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido teniendo por lo menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% de identidad a la secuencia de referencia SEC ID NO:1, en donde dicha secuencia de polinucleótido puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID NO:1, o puede incluir hasta cierto número entero de alteraciones de nucleótido según comparado con la secuencia de referencia, en donde dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste de por lo menos una eliminación, substitución de nucleótido, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones 5' o 3'-terminal de la secuencia de nucleótido de referencia o cualquiera entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos continuos dentro de la secuencia de referencia, y en donde dicho número de alteraciones de nucleótido es determinado multiplicando el número total de nucleótidos en SEC ID NO:1 por el entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y después substrayendo ese producto del número total de nucleótidos en SEC ID NO:1 o: nn=xn-(xn«y), en donde nn es el número de alteraciones de nucleótido, xn es el número total de nucleótidos en SEC ID NO:1 y es 0.50 para 50%, 0.60 para 60%, 0.70 para 70%, 0.80 para 80%, 0.85 para 85%, 0.90 para 90%, 0.95 para 95%, 0.97 para 97% o 1.00 para 100%, y • es el símbolo para el operador de multiplicación, y en donde cualquier producto no entero de xn e y es redondeado hacia abajo al entero más cercano antes de substraerlo de xn. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótido que codifica el péptido SEC ID NO:2 pueden crear mutaciones de no sentido, sin sentido o de desplazamiento de marcos en esta codificación, y de esta manera afectan el polipéptido codificado por el polinucleótido siguiendo tales alteraciones. A manera de ejemplo, una secuencia de polinucleótido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID NO:1, es decir, puede ser 100% idéntica o puede incluir hasta cierto número entero de alteraciones de ácido nucleico según comparado con la secuencia de referencia, de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de identidad. Dichas alteraciones son seleccionadas del grupo que consiste de por lo menos una eliminación, substitución, incluyendo transición y transversión, o inserción, de ácido nucleico, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones 5' o 3'-terminal de la secuencia de polinucleótido de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácido nucleico para un porcentaje dado de identidad es determinado multiplicando el número total de ácidos nucleicos en SEC ID NO:1 por el entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y después substrayendo ese producto del número total de ácidos nucleicos en SEC ID NO:1, o: nn<xn-(xn«y), en donde nn es el número de alteraciones de ácido nucleico, xn es el número total de ácidos nucleicos en SEC ID NO:1, y es, por ejemplo, 0.70 para 70%, 0.80 para 80%, 0.85 para 85%, etc., y • es el símbolo para el operador de multiplicación, y en donde cualquier producto no entero de xn e y es redondeado hacia abajo al entero más cercano antes de substraerlo de xn. (2) Las modalidades del polipéptido además incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene por lo menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% de identidad con una secuencia de referencia de polipéptido de SEC ID NO:2, en donde dicha secuencia de polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de referencia SEC ID NO:2 o puede incluir hasta cierto número entero de alteraciones de aminoácido según comparado con la secuencia de referencia, en donde las alteraciones son seleccionadas del grupo que consiste de por lo menos una eliminación, substitución, incluyendo substitución conservadora y no conservadora, o inserción, de aminoácido, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino- o carboxi-terminal de la secuencia de polipéptido de referencia o cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos continuos dentro de la secuencia de referencia, y en donde el número de alteraciones de aminoácido es determinado multiplicando el número total de aminoácidos en SEC ID NO:2 por el entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y después substrayendo ese producto del número total de aminoácidos en SEC ID NO:2, o: • na=xa-(xa.y), en donde na es el número de alteraciones de aminoácido, xa es el número total de aminoácidos en SEC ID NO:2 y es 0.50 para 50%, 0.60 para 60%, 0.70 para 70%, 0.80 para 80%, 0.85 para 85%, 0.90 10 para 90%, 0.95 para 95%, 0.97 para 97% o 1.00 para 100%, y • es el símbolo para el operador de multiplicación, y en donde cualquier producto no entero de xa e y es redondeado hacia abajo al entero más cercano antes de substraerlo de xa. A manera de ejemplo, una secuencia de polipéptido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID NO:2, es decir, puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta cierto número entero de alteraciones de aminoácido según comparado con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de identidad. Dichas 20 alteraciones se seleccionan del grupo que consiste de por lo menos una eliminación, substitución, incluyendo substitución conservadora y no conservadora, o inserción de aminoácido, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino- o carboxi- terminal de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier 25 parte entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácido para un • porcentaje dado de identidad es determinado multiplicando el número total de aminoácidos en SEC ID NO:2 por el entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y después substrayendo ese producto del número total de aminoácidos en SEC ID NO:2, o: na<xa-(xa«y), 10 • en donde na es el número de alteraciones de aminoácido, xa es el número total de aminoácidos en SEC ID NO:2, y es, por ejemplo, 0.70 para 70%, 0.80 para 80%, 0.85 para 85%, etc., y • es el símbolo para el operador de multiplicación, y en donde cualquier producto no entero de xa e y es redondeado hacia abajo al entero más cercano antes de substraerlo de xa. Los "individuos", cuando se utiliza en la presente con referencia a un organismo, representa un eucariote multicelular, incluyendo, pero no limitándose a un metazoario, mamífero, un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano. "Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si existe por naturaleza, ha sido cambiado o removido de su ambiente original o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido naturalmente presente en un organismo viviente no es "aislado" sino que el mismo polinucleótido o polipéptido es separado de los materiales coexistentes de su estado natural y es "aislado", como el término es empleado en la presente. Además, un polinucleótido o polipéptido que es introducido en un • organismo a través de transformación, manipulación genética o a 5 través de otro método recombinante es "aislado" a un si sigue presente en dicho organismo, dicho organismo puede ser vivo o no vivo. "Polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, el cual puede ser • 10 ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado incluyendo regiones de estructura de cadena individual y doble. "Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero retiene las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en secuencia de nucleótido de otra, polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótido de la variante pueden o no pueden alterar la secuencia de aminoácido de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótido pueden dar como resultado substituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos de aminoácido en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en secuencia de aminoácido de otra, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas de manera que las secuencias de polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares en forma total y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y polipéptido de referencia pueden diferir en secuencia de aminoácido por una o más substituciones, adiciones, • eliminaciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido 5 substituido o insertado puede o no puede ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser uno de existencia natural tal como una variante alélica o puede ser una variante que sea que no se sepa que ocurra en forma natural. Las variantes de existencia no natural de polinucleótidos y • 10 polipéptidos pueden hacerse a través de mutagénesis o a través de síntesis directa. "Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad causada por o relacionada con una infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en bebés y niños, neumonía en gente de edad avanzada, sinusitis, infecciones nosocómicas y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de la audición, acumulación de fluido en el oído medio, daño del nervio auditivo, • aprendizaje retrasado del habla, infección del tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio. 20 EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se llevaron a cabo utilizando técnicas estándares, las cuales son bien conocidas y de rutina por aquellos expertos en la técnica, excepto en donde se describa otra cosa con detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Eiemplo 1 Descubrimiento y secuencia de ADN de confirmación del gen BASB027 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis • El gen BASB027 de SEC ID NO:1 primero fue descubierto en la base de datos Incyte PanthoSeq conteniendo secuencias de ADN genómico no terminadas de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (también denominada como la cepa Mc2931). La traducción de secuencia de polinucleótido BASB027, mostrada en SEC ID NO:2, mostró una similitud importante (32% de identidad en un traslape de 817 aminoácidos) con la proteína de membrana externa OMP85 de Neisseria meningitidis. La secuencia del gen de BASB027 primero fue confirmada experimentalmente. Para este propósito, se extrajo ADN genómico de 1010 células de las células de M. catarrhalis (cepa ATCC 43617) utilizando el equipo de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen Gmbh), y 1µg de este material fue sometido a amplificación de ADN de reacción de cadena de polimerasa utilizando los iniciadores E515515 (5'-ACT-ATA-GGG-CAC-GCG-TG-3') [SEC ID NO:5] y E515528: (5'-CCT-GCG-TTT-GTT-TGA-TTG-AG-3') (SEC ID NO:6]. Este producto de PCR se purificó en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) y se sometió a secuenciación de ADN utilizando el equipo de secuenciación de ciclo Big Dye (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 377/PRISM. La secuenciación de ADN se realizó en ambas estructuras con una redundancia de 2 y la secuencia de longitud completa se ensambló utilizando el programa SeqMan del paquete de software DNASTAR Lasergene. La secuencia de ADN y la secuencia de polipéptido deducida resultante son como se muestra en SEC ID NO:3 y SEC ID NO:4, respectivamente. Cuatro diferencias de nucleótido distinguen a SEC ID NO:3 de SEC ID NO:1. Utilizando el programa MEGALIGN del paquete de software DNASTAR Lasergene, se realizó una alineación de la secuencia de polinucleótido de SEC ID NO:1 y 3, y se presenta en la Figura 2; su nivel de identidad fue calculado como 99.8%. Utilizando el mismo programa, se realizó una alineación de las secuencias de polipéptido de SEC ID NO:2 y 4, y se presenta en la Figura 4; su nivel de identidad se calculó como 99.8%.

Eiemplo 2 Análisis de variabilidad del gen BASB027 entre varias cepas de Moraxella catarrhalis 2A: Análisis de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP. según sus siglas en inglés. Se extrajo ADN genómico de 16 cepas de M. catarrhalis (presentadas en el Cuadro 1) como se describe más adelante. Se rayó M. catarrhalis para colonias individuales sobre placas de agar de BHI y se hicieron crecer durante la noche a 37°C. Se recogieron y se utilizaron 3 o 4 colonias individuales para inocular un cultivo de semilla de caldo de BHI (infusión cerebro-corazón) de aproximadamente 1.5 ml, el cual se hizo crecer durante la noche en un incubador de agitación, aproximadamente 300 rpm, a 37°C. Se inoculó un matraz de erlenmeyer de 500 ml conteniendo aproximadamente 150 ml del caldo BHI con el cultivo de semilla y se hizo crecer durante aproximadamente 12-16 horas a 37°C en un incubador de agitación, a aproximadamente 175 rpm, para generar una masa de células para aislamiento de ADN. Las células se recogieron a través de centrifugación en un rotor de Sorvall GSA a aproximadamente 2000 X g durante 15 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se removió y la pella de células se suspendió en aproximadamente 5.0 ml de agua estéril. Un volumen igual de regulador de pH de lisis (200 mM NaCI, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5% (p/v) SDS, 0.5% (v/v) 2- mercaptoetanol, y 250 µg/ml de proteína K) se agregó y las células se suspendieron a través de agitación moderada y titulación. La suspensión de células después se incubó a aproximadamente 12 horas a 50°C para Usar las bacterias y liberar el ADN cromosómico. El material proteináceo se precipitó a través de la adición de 5.0 ml de NaCI saturado (aproximadamente 6.0 M en agua estéril) y centrifugación a aproximadamente 5,500 xg en un rotor de Sorvall SS34 a temperatura ambiente. El ADN cromosómico se precipitó del sobrenadante claro a través de la adición de 2 volúmenes de etanol al 100%. El ADN agregado se recogió y se lavó utilizando agitación moderada en un volumen pequeño de una solución de etanol al 70%. El ADN cromosómico purificado se suspendió en agua estéril y se dejó disolver/gastar durante la noche a 4°C a través de oscilamiento moderado. La concentración del ADN disuelto se determinó espectrofotométricamente a 260 nm utilizando un coeficiente de extinción de 1.0 O. D. unidades, aproximadamente 50 µg/ml. Este material después fue sometido a amplificación de PCR utilizando los oligonucleótidos MC-D15-BamF (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ACÁ GGA CTA CAG CGA GTG ACC ATT GAA AGC TTA C-3') [SEC ID NO:7] y MC-D15-SalR (AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AAT CTG GAA CTG TAC CGT ATC G-3') [SEC ID NO:8]. Los amplicones del gen BASB027 correspondientes después fueron sometidos independientemente a hidrólisis utilizando enzimas de restricción (Acil, Hindlll, Maelll, Nlalll, Rsal, Sau3AI) y los productos de restricción fueron separados a través de electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida utilizando procedimientos de biología moleculares estándares como se describe en "Molecular Cloning a Laboratory Manual Segunda Edición, Eds: Sambrook; Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989". Las fotografías de los geles de electroforesis resultantes se presentan en la Figura 1. Para cada cepa, los patrones de RFLP correspondiendo a las 6 enzimas de restricción, fueron calculados y combinados. Los grupos de cepas que comparten combinación idéntica de patrones RFLP después fueron definidos. Utilizando esta metodología, las cepas probadas en este estudio cayeron en cuatro grupos genómicos Grupol: Mc2906, Mc2908, Mc2912, Mc2926; Grupo 2: Mc2905, Mc2907, Mc2909, Mc2911, Mc2913, Mc2960, Mc2975; Grupo 3: Mc2910, Mc2912, Mc2956, Mc2969; Grupo 4: Mc2931). Estos datos apoyan que la población de Moraxella catarrhalis utilizada en este estudio exhibe una diversidad de secuencia de nucleótido limitada para el gen • BASB027.

Cuadro 1 Características de las cepas de Moraxella catarrhalis utilizadas en este estudio.

• Eiemplo 3 Construcción de Plásmido para Expresar BASB027 Recombinante A: Clonación de BASB027. Los sitios de restricción BamHl y Salí diseñados por ingeniería en iniciadores de amplificación anteriores ([SEC ID NO:7]) y complementarios inversos ([SEC ID NO:8]), respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto de PCR de aproximadamente 2,500 bp en el plásmido de expresión de E. coli comercialmente disponible pQE30 (QiaGen, resistente a ampicilina) de manera que se puede expresar una proteína madura de BASB027 como una proteína de fusión conteniendo una etiqueta de cromatografía de afinidad (His)6 en el término N. el producto de PCR, BASB027, se purificó a partir de la reacción de amplificación utilizando columnas de rotación a base de gel de sílice (QiaGen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Para producir los términos BamHl y Salí requeridos necesarios para la clonación, el producto de PCR purificado fue secuencialmente digerido para completarse con las enzimas de restricción BamHl y Salí según recomendado por el fabricante (Life Technologies). Después de la primera digestión de restricción, el producto de PCR fue purificado a través de la columna de rotación como se hizo anteriormente para remover las sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda digestión de enzima. El fragmento de ADN digerido otra vez fue purificado utilizando columnas de rotación a base de gel de sílice antes de la ligación con el plásmido pQE30.

B: Producción del Vector de Expresión. Para preparar el plásmido de expresión pQE30 para ligación, este fue similarmente digerido para completarse tanto con BamHl como Salí, y después fue tratado con fosfatasa intestinal de bovino (CIP, aproximadamente 0.02 unidades / pmoles del extremo 4 Life Technologies) según dirigido por el fabricante para evitar la autoligación. Un exceso molar de aproximadamente 5 veces del fragmento digerido para el vector preparado fue utilizado para • programar la reacción de ligación. Se realizó una reacción de 5 ligación de aproximadamente 20 µl estándar (aproximadamente 16°C, alrededor de 16 horas, utilizando métodos bien conocidos en la técnica, usando ligasa de ADN T4 (aproximadamente 2.0 unidades/reacción, Life Technologies). Se utilizó una alícuota de la ligación (aproximadamente 5 µl) para transformar las células M15 (pREP4) electro-competentes de acuerdo con los métodos bien • conocidos en la técnica. Después de un período de crecimiento de aproximadamente 2-3 horas a 37°C en aproximadamente 1.0 ml del caldo LB las células transformadas fueron colocadas en placas sobre placas de agar de LB conteniendo canamicina (50 µg/ml) y ampicilina (100 µg/ml). Ambos antibióticos fueron incluidos en los medios de selección para asegurar que todas las células transformadas llevaran tanto el plásmido pREP4 (KnR), el cual lleva el gen laclq necesario • para la represión de la expresión para la expresión capaz de inducción mediante IPTG de las proteínas en pQE30, como el plásmido pQE30-BASB027 (ApR). Las placas fueron incubadas durante la noche a 37°C durante aproximadamente 16 horas. Las colonias individuales de KnR / ApR fueron recogidas con palillos de dientes estériles y se utilizaron como "parches" para inocular placas LB KnR / ApR frescas así como un cultivo de caldo de aproximadamente 1.0 ml de LB KnR / ApR. Tanto las placas con parche como el cultivo de caldo se incubaron durante la noche a 37°C ya sea en un incubador estándar (placa) o en un baño de agua de agitación. Se empleó un análisis de PCR basado en célula entera para 5 verificar que los transformantes contuvieron el inserto de ADN de BASB027. Aquí, el cultivo del caldo de aproximadamente 1.0 ml de LB Kn / Ap nocturno fue transferido a un tubo de polipropileno de 1.5 ml y las células se recogieron mediante centrifugación en una microcentrífuga de Beckmann (aproximadamente 3 minutos, a fl 10 temperatura ambiente, aproximadamente 12,000 X g). La pella de célula se suspendió en aproximadamente 200 µl de agua estéril y una alícuota de aproximadamente 10 µl utilizada para programar una reacción de PCR de volumen final de aproximadamente 50 µl, conteniendo tanto iniciadores de amplificación anteriores e inversos de BASB027. Las concentraciones finales de los componentes de reacción de PCR fueron esencialmente iguales a aquellas especificadas en el Ejemplo 2, excepto que se utilizaron • aproximadamente 5.0 unidades de polimerasa Taq. El paso de desnaturalización 95°C inicial se incrementó a 3 minutos para asegurar una interrupción térmica de las células bacterianas y la liberación del ADN de plásmido. Se utilizaron un ciclizador térmico modelo 9700 ABI y un perfil de amplificación térmica de 3 pasos de 32 ciclos, es decir, 95°C, 45 segundos; 55-58°C, 45 segundos, 72°C, 1 minuto, para amplificar el fragmento de PCR de BASB027 a partir de las muestras de transformante lisado. Después de la amplificación térmica, se analizó una alícuota de aproximadamente 20 µl de la reacción a través de electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 0.8% en un regulador de pH de tris-acetato-EDTA (TAE). Los • fragmentos de ADN fueron visualizados a través de iluminación 5 mediante UV después de la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Un estándar de tamaño molecular de ADN (escalera de 1 Kb, Life Technologies) fue electroforeado en paralelo con las muestras de prueba y se utilizó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los transformantes que produjeron el producto de • 10 PCR esperado de aproximadamente 2,500 bp fueron identificados como cepas conteniendo una construcción de expresión de BASB027. Las cepas conteniendo el plásmido de expresión después fueron analizadas para la expresión capaz de inducción de BASB027 recombinante. 15 C: Análisis de Expresión de Transformantes Positivos a PCR. Para cada transformante positivo en PCR identificado • anteriormente, se inocularon aproximadamente 5.0 ml del caldo de LB conteniendo canamicina (50 µg/ml) y ampicilina (100 µg/ml) con células de la placa de parche y se hicieron crecer durante la noche a 37°C con agitación (aproximadamente 250 rpm). Una alícuota del cultivo de semilla nocturno (aproximadamente 1.0 ml) fue inoculada en un matraz de erlenmeyer de 125 ml conteniendo aproximadamente 25 ml del caldo de LB Kn / Ap y se hizo crecer a 37°C con agitación (aproximadamente 250 rpm) hasta que la turbiedad del cultivo alcanzó un O. D. 600 de aproximadamente 0.5, es decir, una fase de registro medio (usualmente alrededor de 1.5-2.0 horas). En ese momento aproximadamente la mitad del cultivo (aproximadamente • 12.5 ml) fue transferido a un segundo matraz de 125 ml y la 5 expresión de la proteína de BASB027 recombinante se indujo a través de la adición de IPTG (material de abastecimiento de 1.0 M preparado en agua estéril, Sigma) a una concentración final de 1.0 mM. La incubación tanto de los cultivos inducidos con IPTG como no inducidos continuó durante aproximadamente 4 horas adicionales a 37°C con agitación. Se removieron las muestras (aproximadamente • 1.0 ml) tanto de los cultivos inducidos como los no inducidos después del período de inducción y las células fueron recogidas a través de centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 minutos. Las pellas de células individuales fueron suspendidas en aproximadamente 50 µl de agua estéril, después se mezclaron con un volumen igual de regulador de pH de muestra 2X Laemellí SDS-PAGE conteniendo 2- • mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua en ebullición durante aproximadamente 3 minutos para desnaturalizar la proteína. 20 Se cargaron volúmenes iguales (aproximadamente 15 µl) tanto de los lisatos de célula inducidos mediante IPTG como no inducidos, crudos, por duplicado en Tris al 12%/gel de glicina-poliacrilamida (espesor de 1 mm Mini-gels, Novex). Las muestras de lisato inducidas y no inducidas fueron electroforeadas conjuntamente con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) bajo condiciones convencionales utilizando un regulador de pH de corrido estándar de SDS-/Tris/glicina (BioRad). Después de la electroforesis, un gel fue teñido con azul brillante Commassie R250 (BioRad) y • después se decoloró para visualizar la proteína inducida por IPTG, BASB027, novedosa. El segundo gel fue electroteñido en una membrana de PVDF (tamaño de poro de 0.45 mieras, Novex) durante aproximadamente 2 horas a 4°C utilizando un aparato de tinción BioRad Mini-Protean II y regulador de pH de transferencia de metanol Towbin (20%). El bloqueo de la membrana y las incubaciones del anticuerpo se realizaron de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo anti-RGS (His)3 monoclonal seguido por un segundo anticuerpo de anti-ratón de conejo conjugado a HRP (QiaGen), fue utilizado para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante BASB027. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se logró utilizando ya sea un substrato ¡nsoluble ABT utilizando una hiperpelícula con el sistema de quimíoluminiscencia de Amersham ECL.

D: Confirmación de Secuencia. Para verificar adicionalmente que la proteína BASB027 recombinante inducida mediante IPTG siendo expresada está en el marco de lectura abierto correcto y no una molécula espuria que surge de un artefacto de clonación (es decir, un desplazamiento de marco), se determinó la secuencia de ADN del inserto clonado. La secuencia de ADN para el gen BASB027 de M. catarrhalis fue obtenida de una estructura de cadena utilizando metodologías de secuenciación de ciclo de PCR asimétricas convencionales (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing Perkin-Elmer). Las 5 reacciones de secuenciación fueron programadas con el ADN de plásmido de expresión no digerido (aproximadamente 0.5 µg/rxn) como una plantilla e iniciadores de secuenciación apropiados específicos para el vector pQE30 y específicos para ORF (aproximadamente 3.5 pmol/rxn). Además de la plantilla y el iniciador • 10 de secuenciación, cada reacción de secuenciación (aproximadamente 20 µl) contuvo los cuatro diferentes dNTPs (es decir, A, G, C y T) y los cuatro nucleótidos terminadores correspondientes ddNTPs (es decir, ddA, ddG, ddC, y ddT); cada terminador estando conjugado a uno de los cuatro colorantes fluorescentes, Joe, Tam, Rox, o Fam. 15 Los productos de elongación de secuenciación de estructura de cadena individual fueron terminados en posiciones aleatorias a lo largo de la plantilla a través de la incorporación de los terminadores • ddNTP marcados con colorante. Los productos de terminación marcados con colorante fluorescente fueron purificados utilizando columnas de cromatografía de exclusión de tamaño de microcentrífuga (Princeton Genetics), se secaron bajo vacío, se suspendieron en un regulador de pH de resuspensión de plantilla (Perkin-Elmer) para electroforesis capilar o formamida desionizada para PAGE, desnaturalizada a 95°C durante aproximadamente 5 minutos, y se analizó a través de electroforesis capilar de alta resolución (ABI 310 Automated DNASequemator, Perkin-Elmer) o PAGE de alta resolución (ABI 377 Automated DNA Sequenator), según recomendado por el fabricante. Los datos de secuencia de ADN producidos a partir de reacciones individuales fueron recolectados y las intensidades pico fluorescentes relativas se analizaron automáticamente en una computadora PowerMAC utilizando el Software ABI Sequence Analysis (Perkin-Elmer). Las secuencias de ADN individualmente autoanalizadas fueron editadas manualmente para exactitud antes de ser introducidas en una "tira" de secuencia de estructura de cadena individual de consenso • 10 utilizando el software Auto-Assembler (Perkin-Elmer). La secuenciación determinó que el plásmido de expresión contuvo la secuencia correcta en el marco de lectura abierto correcto.

Eiemplo 4 Producción de BASB027 Recombinante • Cepa Bacteriana Una cepa de expresión recombinante de E. coli M15 (pREP4), conteniendo un plásmido (pQE30) que codifica BASB027 de M. catarrhalis, se utilizó para producir masa de células para purificación de proteína recombinante. La cepa de expresión se cultivó sobre placas de agar de LB conteniendo 50 µg/ml de canamicina ("Kn") y 100 µg/ml de ampicilina ("Ap") para asegurar tanto el plásmido de control pREP4 laclq como la construcción de expresión pQE30- BASB027, que ambos fueran mantenidos. Para la crioconservación a -80°C, la cepa fue propagada en caldo de LB conteniendo la misma concentración de antibióticos, después se mezcló con un volumen f igual de caldo de LB conteniendo glicerol al 30% (p/v).

Medio El medio de fermentación utilizado para la producción de la proteína recombinante consistió de caldo 2X YT (Difco) conteniendo 50 µg/ml Kn y 100 µg/ml Ap. Se agregó antiespumante al medio para el fermentador a 0.25 ml/L (Antifoam 204, Sigma). Para inducir la • expresión de la proteína recombinante de BASB027, se agregó IPTG (ß-D-tiogalactopiranosida de isopropilo) al fermentador (1 mM, final).

Fermentación 15 Un matraz de siembra de erlenmeyer de 500 ml, conteniendo un volumen de trabajo de 50 ml, fue inoculado con 0.3 ml de un cultivo congelado, rápidamente descongelado, o varias colonias de un cultivo de placa de agar selectivo, y se incubaron durante aproximadamente 12 horas a 37 +_ 1°C en una plataforma de agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este cultivo de siembra después fue utilizado para inocular un fermentador de volumen de trabajo de 5 litros conteniendo el caldo 2X YT y los antibióticos tanto Kn como Ap. El fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific se operó a 37 +_ 1°C, 0.2-0.4 VVM de aspersión de aire, 250 rpm en impulsores de Rushton. El pH no se controló ni en el cultivo de siembra de matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el valor de pH varió de 6.5 a 7.2 en el fermentador. Se agregó IPTG (material de abastecimiento de 1.0 M, preparado en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó un registro medio de crecimiento (aproximadamente 0.7 O. D. 600 unidades). Las células fueron inducidas durante 2-4 horas, después se cosecharon mediante centrifugación utilizando ya sea una centrífuga de 28RS Heraeus (Sepatech), o una centrífuga de supervelocidad RC5C (Sorvall Instruments). La pasta de célula se almacenó a -20°C hasta que se procesó.

Purificación Productos Químicos y Materiales El imidazol, clorhidrato de guanidina, tris(hidroximetilo) y EDTA (ácido etileno diaminotetraacético), de grado de biotecnología o mejor, todos se obtuvieron de Ameresco Chemical, Solón, Ohio. El Tritón X-100 (t-octilfenoxipolietoxi-etanol), fosfato de sodio, monobásico, y urea fueron de grado reactivo o mejor y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. El ácido acético glacial y el ácido clorhídrico se obtuvieron de Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, New Jersey. El metano se obtuvo de Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey. El PefablocTSC (4-(2-aminoetil)-bencensulfonilfluoruro), tabletas de cóctel de inhibidor de proteasa completas y PMSF (sulfonílfluoruro de fenilmetilo) se obtuvieron de Roche Diagnostics Corporation Indianapolis, Indiana. La pepstatina, Pepstatina A y el inhibidor de proteasa E-64 se obtuvieron de Calbiochem, LaJolla, California. La salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (1xPBS) se obtuvo de Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland. La salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (10x PBS) se obtuvo de BioWhittaker Walkersville, Maryland. El anticuerpo penta-His, libre de BSA se obtuvo de QiaGen, Valencia, California. El IgG de anti-ratón de cabra AffiniPure conjugado con peroxidasa de obtuvo de Jackson Immuno Research West Grove, Penn. La solución individual de AEC se obtuvo de Zymed, South San Francisco, California. Todos los otros químicos fueron de grado reactivo o mejor. La resina de superflujo Ni-NTA se obtuvo de QiaGen Inc., Valencia, California. Los geles precolados de Tris-glicina al 4-20% y de poliacrilamida al 10-20%, todos los reguladores de pH de operación, estándares preteñidos See-Blue, estándares de colores múltiples de marcas múltiples y membranas de transferencia de PVDF se obtuvieron de Novex, San Diego, California. Los equipos de tinción de plata SDS-PAGE se obtuvieron de Daiichi Puré Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. La solución de tinción de Coomassie se obtuvo de Bio-Rad Laboratories, Hercules California. Los filtros de jeringa de 0.2 m Acrodisc® PF se obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Los filtros de jeringas desechables de GD/X de 25 mm se obtuvieron de Whatman Inc., Clifton, New Jersey. La tubería de diálisis 8,000 MWCO se obtuvo de BioDesign Inc. Od New York, Carmal New York. Los reactivos de ensayo de proteína BCA y la tubería de diálisis de piel de víbora 3,500 MWCO se obtuvieron de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

Protocolo de Extracción La pasta de célula se descongeló a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. De 5 a 6 gramos del material se cargaron en un tubo de centrífuga desechable de 50 ml. A esto se agregaron 5 ml/gramo de regulador de pH de clorhidrato de guanidina (Gu-HCI) (6 M clorhidrato de guanidina, 100 mM fosfato de sodio, monobásico, 10 • 10 mM Tris y tritón X-100 al 0.05%, pH 8.0). La pasta de célula se volvió a suspender utilizando un homogeneizador procientífico PRO300D, a una energía de 3/4 durante 1 minuto. La mezcla de extracción después se colocó a temperatura ambiente con agitación moderada durante 60 a 90 minutos. Después de 60 a 90 minutos, la mezcla de extracción se centrifugó a 15,800 xg durante 15 minutos (centrífuga de Sorvall RC5C, 11,500 rpm). El sobrenadante (S1) se decantó y se guardó para purificación adicional. La pella (P1) se # guardó para análisis.

Unión de BASB027 a Resina de Níguel-NTA A S1, se agregaron de 3 a 4 mililitros de la resina Ni-NTA. Esto después se colocó a temperatura ambiente con agitación moderada durante 1 hora. Después de 1 hora, el S1/NÍ-NTA se empacó en una columna de XK 16 Pharmacia. La columna después se lavó con 1 M de regulador de pH Gu-HCI (1 M clorhidrato de guanidina, 100 mM fosfato de sodio, monobásico, 10 mM de Tris y tritón X-100 al 0.05%, pH 8-0). Esto después fue seguido por un lavado con regulador de pH de fosfato (100 mM fosfato de sodio, monobásico, 10 mM Tris y tritón X-100 al 0.05%, pH 6.3). La proteína después se eluyó a partir de la columna con un regulador de pH de 250 mM imidazol (250 mM imidazol, 100 mM fosfato de sodio, monobásico, 10 mM Tris y tritón X-100 al 0.05%, pH 5.9).

Formulación Final 10 El BASB027 se formuló a través de diálisis durante la noche • contra tres cambios de tritón X-100 al 0.1% y 1xPBS, pH 7.4, para remover el Gu-HCI residual e imidazol. La proteína purificada se caracterizó y se utilizó para producir anticuerpos como se describe más adelante. 15 Caracterizaciones Bioguímicas SDS-PAGE y Análisis de Tinción Western • La proteína purificada recombinante se resolvió en geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirió electroforéticamente a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora como se describió previamente (Thebaine y otros, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). Las membranas de PVDF después fueron pretratadas con 25 ml de salina regulada en pH con fosfato de Dulbecco conteniendo leche seca sin grasa al 5%. Todas las incubaciones subsecuentes se realizaron utilizando este regulador de pH de pretratamiento. Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución de 1:500 de suero preinmune o suero inmune anti-His de • conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas de 5 PVDF después se lavaron dos veces con regulador de pH de lavado (20 mM regulador de pH Tris, pH 7.5, conteniendo 150 mM cloruro de sodio y Tween 20 al 0.05%). Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución de 1:5000 de IgG de anti-conejo de cabra marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 10 West Grove, PA), durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas de PVDF después se lavaron 4 veces con regulador de pH de lavado, y se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea según suministrado por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada uno. 15 Los resultados de un análisis SDS-PAGE (Figura 4) muestran una proteína de aproximadamente 95 kDa que es reactiva a un anticuerpo anti-RGS(His) a través de tinciones Western (Figura 5) de SDS-PAGE.

Secuenciación de Proteína La secuenciación de aminoácido terminal amino de la proteína purificada se realizó para confirmar la producción de la proteína recombinante correcta utilizando protocolos químicos bien definidos en un secuenciador de Hewlett-Packard modelo G1000A con un modelo 1090 LC y un secuenciador de Hewlett-Packard modelo 241 con un modelo 1100 LC.

Eiemplo 5 Producción de Antisueros para BASB027 Recombinante Se generaron antisueros polivalentes dirigidos contra la proteína BASB027 vacunando dos conejos con la proteína BASB027 recombinante, purificada. A cada animal se le dio un total de 3 inmunizaciones intramuscularmente (i.m.) de aproximadamente 20 µg de proteína BASB027 por inyección (empezando con auxiliar de • Freund completo y seguido con auxiliar de Freund incompleto) a intervalos de aproximadamente 21 días. Los animales fueron sangrados antes de la primera inmunización ("presangrados") y en los días 35 y 57. 15 Se midieron las titulaciones de la proteína anti-BASB027 a través de un ensayo de ELISA utilizando la proteína BASB027 recombinante purificada (0.5 µg/cavidad). La titulación es definida • como la dilución más alta igual a o mayor que 0.1 según calculado con la siguiente ecuación: OD promedio de dos muestras de prueba de antisuero-el OD promedio de dos muestras de prueba de regulador de pH. Los antisueros fueron utilizados como el primer anticuerpo para identificar la proteína en una tinción Western como se describe en el Ejemplo 4 anterior. La tinción Western muestra la presencia del anticuerpo anti-BASB027 en los sueros de animales inmunizados (Figura 6).

Eiemplo 6 Caracterización Inmunológica Análisis de Tinción Western Se desarrollaron varias cepas de M. catarrhalis sobre placas de agar de chocolate durante 48 horas a 35°C en CO2 al 5%. Se utilizaron varias colonias para inocular 25 ml del caldo de Muller Hinton en un matraz de 250 ml. Se hicieron crecer los cultivos durante la noche y se recogieron mediante centrifugación. Después, las células fueron solubilizadas suspendiendo 30 µg de células en 150 µl de regulador de pH de muestra PAGE (360 mm de regulador de pH Tris, pH 8.8, conteniendo dodecilsulfato de sodio al 4% y glicerol al 20%), e incubando la suspensión a 100°C durante 5 minutos. Las células solubilizadas fueron resueltas en geles de poliacrilamida al 4-20% y las proteínas separadas fueron electroforéticamente transferidas a membranas de PVDF a 100 P durante 1 horas como se describió previamente (Thebaine y otros, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). Las membranas de PVDF después fueron pretratadas con 25 ml de salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco conteniendo leche seca sin grasa al 5%. Todas las incubaciones subsecuentes se realizaron utilizando este regulador de pH de pretratamiento. Se incubaron membranas PVDF con 25 ml de una dilución de 1:500 de suero preinmune o suero inmune de conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas de PVDF después se lavaron dos veces con regulador de pH de lavado (regulador de pH de 20 mm Tris, pH 20.5, conteniendo 150 mM cloruro de sodio y Tween-20 al 0.05%). Las membranas de PVDF fueron incubadas con 25 ml de una • dilución de 1:5000 de IgG de anti-conejo de cabra marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas de PVDF después se lavaron 4 veces con regulador de pH de lavado, y se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea como se suministró por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada uno. Una proteína de aproximadamente 95 kDa (correspondiendo al peso molecular esperado de BASB027) que es reactiva con el antisuero se detectó en todas las cepas de Moraxella (Figura 7).

Actividad Bactericida Se examinó la actividad citotóxica mediada por complemento de anticuerpos anti-BASB027 para determinar la vacuna potencial del polipéptido BASB027. Se preparó antisuero como se describió anteriormente. Las actividades del suero preinmune y el antisuero anti-BASB027 para mediar la aniquilación de complemento de M. catarrhalis se examinaron utilizando la "Prueba Bactericida de Suero" descrita por Zollinger y otros (Immune Responses to Neisseria meningitis, in Manual of Clinícal Laboratory Immunology, 3o. edición, pág. 347-349), excepto que se utilizaron células de cepas o cultivos de M. catarrhalis en lugar de células de Neisseria Meningitis. La titulación bactericida del antisuero de conejo (50% de aniquilación de la cepa homologa) fue <1:8 (pre-ínmune) y > 1 : 128 • (inmune).

Eiemplo 7 Presencia del Anticuerpo para BASB027 en Sueros Convalecientes Humanos Se realizaron el análisis de tinción Western de BASB027 recombinante purificado como se describió en el Ejemplo 4 y 6 anteriores, excepto que se utilizó una combinación de sueros humanos de niños infectados por M. catarrhalis como la primera preparación de anticuerpos. Los resultados muestran que los antisueros de individuos naturalmente infectados reaccionan al recombinante purificado.

Eiemplo 8 Producción de Péptidos BASB027, Antisueros y Reactividad de 20 los Mismos Se produjeron 2 péptidos específicos de BASB027 de aminoácido cortos, teniendo las secuencias de CYAKPLNKKQNDQTDT (SEC ID NO:9) y YLTARRGQQTTLGEVVC (SEC ID NO:10), en el laboratorio utilizando métodos generalmente conocidos. Estos péptidos acoplados a KLH fueron utilizados para producir anticuerpos en conejos hembra de Nueva Zelanda libres de patógenos específicos de 12 semanas de edad. Los conejos recibieron 4 inyecciones a intervalos de aproximadamente 2 semanas de 200 µg del péptido-KLH en auxiliar de Freund completo (1o. inyección) o incompleto (2o., 3o. y 4o. inyecciones). Los animales fueron sangrados antes de la primera inmunización y un mes después de la cuarta inyección. Se midieron las titulaciones de punto medio de antipéptido a través del ensayo de ELISA utilizando péptidos libres. Las titulaciones de punto medio de antipéptido 1 mes después de la cuarta inmunización fueron superiores a 15,000. Las tinciones Western de BASB027 recombinante purificado, utilizando los anticuerpos anti-péptido como el primer anticuerpo, se prepararon como se describió en los Ejemplos 4 y 6. Los resultados están presentados en la Figura 8.

Materiales Depositados Un depósito conteniendo una cepa de Moraxella catarrhalis Catlin fue depositado en American Type Culture Collection (en la presente "ATCC") el 21 de junio de 1997 y se le asignó el número de depósito 43617. el depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosh y Kolle) y es una colección de inserto de 1.5-2.9 kb secada por congelación construida a partir del aislado M. catarrhalis obtenido de una aspiración transtraqueal de un minero de un carbono con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother 21:506-508 (1982). El depósito de la cepa Moraxella catarrhalis es denominado en • la presente como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa 5 depositada". La cepa depositada contiene un gen BASB027 de longitud completa. Un depósito del vector pMC-D15 consistiendo del ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 fue depositado en 10 American Type Culture Collection (ATCC), el 12 de febrero de 1999 y se le asignó el número de depósito 207105. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa/clon depositado, así como la secuencia de aminoácido de cualquier polipéptido codificado por la misma, se controlan en el caso de 15 cualquier conflicto con la descripción se secuencias de la presente. El depósito de la cepas depositadas se ha hecho bajo los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimiento de Patentes. Las cepas depositadas serán irrevocablemente y sin 20 restricción o condición liberadas al público después de la emisión de una patente. Las cepas depositadas están provistas meramente como conveniencia para aquellos expertos en la técnica y no como una admisión a ese depósito requerido para habilitación, tal como es requerido de acuerdo con 35 U. S. C. § 112. 25 LISTA DE S EC U E NCIAS < 1 1 0> S m ith KI i ne Beech a m Bi o l og i ca l s < 1 20> Co m puestos N oved osos • < 1 30> B M45324 < 1 60> 1 0 <170> FastSEC para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 2442 • 10 <212> ADN <213> Bacteria <400> 1 atgcgcaatt catat ttaa aggtt ttcag gccagtgcaa tgacaatggc tgtcatgatc 60 gtaatgtcaa ctcatgcaca agcggcggat tttatggcaa atgacattac catcacagga 120 ctacagcgag tgaccattga aagcctacaa agcgtgctgc cgtttcgctt gggtcaagtg 180 gtgagcgaaa accagtcggc tgatggtgtc aaagcacttt atgcaacagg caatttttca 240 ga egtgcaag tctatcatca agaagggcgt atcatctatc aggtaaccga aaggc gtta 300 accgctgaga ttaattttga gggcaatcgc ttaattccaa aagaaggtct acaagaagsg 360 ccaaaaaatg ctggcttagc tgtgggtcaa ccactaaaac aagccacagt acagatgatc 420 gaaacogagc tcaccaatca atatatacca caaggctatt ataataccga aattactg-c 480 aaacagacga tgcttgatgg taatcgtgtc aagcttgata tgacctttgc tgaaggtaaa 540 cctgcacggg tggttgatac taatatcatt ggcaatcagc attttagcga tgcagatttg 600 attgatgtgc ttgcgattaa ggataataaa atcaatccac tgtctaaagc tgaccgttat 660 actcaagaaa agctggtgac cagtttagag aatttgcgtg ctaaatatct caatgcaggg 720 tctgtgcgtt ttgagattaa agatgctaag cttaatatta atgaagataa aaaccgtatc 780 tttgctgaga tttcattgca tgaaggtgag caatatcgct ttggacagac acagtttttg 840 ggcaatttaa cttatactca agcagaactt gaggcactgc ttaaattcaa agcagaagaa 900 gggtcttcac aagccatgct tgagcaaaca acaaacaata tcagtaccaa atttggtgac 960 gatggctatt attatgctca aatccgtccc gtaacacgca ttaatgatga aagtcgtacg 1020 gttgatgtgg aatattatat tgaccctgta caccctgtct atgtacgccg tattaatttt 1080 acaggtaact ttaagaccca agatgaagta ccccgtcgtg agatgcgaca acttgaaggt 1140 gcgttggcat ctaatcaaaa aatccagctg tctcgtgcac gcttgatgcg gactgggttt 1200 tttaaacatg ttaccgttga tactcgtcca gtacccaact cacctgatca ggttgatgta 1260 aattttgtgg ttgaagaaca accttcagga tcatcaacca tcgcagcagg ctactctcaa 1320 agtggtggtg taacttttca atttgatgtc tctcaaaata actttatggg tacaggtaag 1380 cacstcaatg cttcgttttc tcgctccgag acccgtgagg tgtacagttt gggtatgacc 1440 aacccatact ttaccstaaa tggcgtctcg caaagcttga gtggctacta tcgtaaaacc 1500 aagtatgata acaagaacat tag aatta. gtacttgatt cttatggtgg ctcattaagc 1560 tatggatatc caattgatga aaatcaacgc ataagctttg gtctgaatgc tgacaatacc 1620 aagcttcatg gcggtcgttt tatgggcatc agtaatgtca agcagctgat ggcagatggt 1680 ggcaaaactc aagtggataa taatggcatt cctgatttta agcatgatta cacaacctac 1740 aatgccattt tggggtggaa ttattcaage ctagatcgcc ctgtatttcc aacccaaggc 1800 atgagtcatt ctgtagattt gacggttggt tttggtgata aaactcatca aaaagtggtt 1860 tatcaaggca atatctatcg cccatttatc aaaaaatcag tcctgcgtgg atacgccaag 1920 ttaggctatg gcaataattt accattttat gaaaatttct atgcaggcgg ctatggttcg 1980 gttcgtggct atgatcaatc ctctttgggc ccacgctcac aagcctattt gacagctcgt 2040 cgtggtcaac aaaccacact aggagaggt gttggtggta atgctttggc aactttcggc 2100 agtgagctga ttttaccttt gccatttaaa ggtgattgga tagatcaggt gcgtccagtg 2160 atattcattg agggcggtca ggtttttgat acaacaggta tggataaaca aaccattgat 2220 • ctaacccaat ttaaagaccc acaagcaaca gctgaacaaa atgcaaaagc agccaatcgc 2280 ccgctactaa cccaagataa acagtegcgt tatagtgctg gtgttggtgc aacttggtat 2340 acgcccattg gtcctttatc tattagctat gccaagccat tgaataaaaa acaaaatga: 24CC cagaccgata cggtacagct ccagattggt agtgt tttt aa 2441 <210> 2 <211> 813 <212> PRT <213> Bacteria <400> 2 Met Arg Asn Ser Tyr Phe Lys Gly Phe Gln Val Ser Ala Met Thr Met i 5 1C 15 Ala Val Met Mee Val Me. Ser Thr His Ala Gin Ala Ala Asp Phe Mee 20 25 3C* Ala Asr. Asp lie Thr lie Thr Gly Leu Glr. Arg Val Thr lie Giu Ser 35 c 5 e1» G.r. Ser Val Leu Pro Phe Arg Leu Gly Gin Val Val Ser Glu Asr. 50 55 60 Glr. Leu Ala Asp Gly Val Lys Ala Leu Tyr Ala Tnr Gly Asn Phe Ser 65 70 75 80 Asp Val Glr. Val Tyr Kis Glr. Glu Gly Arg He lie Tyr Gln Val Thr 85 90 95 Giu Arg Pro Leu lie Ala Glu lie Asn Phe Giu Giy Asr. Arg Leu He i 00 105 11C Pro Lys Glu Giy Leu Gin Glu Gly Leu Lys Asn Ala Gly Leu Ala Val • -15 120 125 Giy Glr. Pro Leu Lys Gin Ala Thr Val Gln Met He Giu Thr Glu Leu 130 135 140 Thr Asn Gin Tyr He Ser Gln Gly Tyr Tyr Asn Thr Glu He Thr Val 145 150 155 160 Lys Gln Tnr Met Leu Asp Gly Asn Arg Val Lys Leu Asp Met Thr Phe 165 170 175 Ala Glu Gly Lys Pro Ala Arg Val Val Asp He Asn He He Gly Asn 180 185 190 Gln Kis Phe Ser Asp Ala Asp Leu He Asp Val Leu Ala He Lys Asp 195 200 205 Asn Lys He Asn Pro Leu Ser Lys Ala Asp Arg Tyr Thr Gln Glu Lys 210 215 220 Leu Val Thr Ser Leu Glu Asn Leu Arg Ala Lys Tyr Leu Asn Ala Gly 225 230 235 240 10 Phe Val Arg Phe Glu He Lys Asp Ala Lys Leu Asn He Asn Glu Asp 245 250 255 Lys Asn Ara He Phe Val Glu He Ser Leu His Giu Gly Glu Gln Tyr 260 265 270 Arg Phe Gly Glr. Thr Gln Phe Leu Gly Asn Leu Thr Tyr Thr Gln Ala 275 280 285 Glu Leu Glu Ala Leu Leu Lys Phe Lys Ala Glu Glu Giy Phe Ser Gln 290 295 300 Ala Met Leu Giu Gln Thr Thr Asn Asn He Ser Thr Lys Phe Gly Asp 305 310 315 320 Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ala Gln He Arg Pro Val Thr Arg He Asn Asp 325 330 335 Glu Ser Arg Thr Val Asp Val Glu Tyr Tyr He Asp Pro Val His Pro 340 345 350 Val Tyr Val Arg Arg He Asn Phe Thr Gly Asn Phe Lys Thr Gln Asp 35S 360 365 Glu Val Leu Arg Arg Giu Met Arg Gln Leu Glu Gly Ala Leu Ala Ser 370 375 380 Asn Gln Lys He Gln Leu Ser Arg Ala Arg Leu Met Arg Thr Gly Phe 385 39: 395 C - Phe Lys His Val Tnr Val Acc Tr.r Arg Pro Val Pro Asr. Ser ?r? Aso 4 C = 410 Gln Val Asp Val Asr. r.e Val Val Giu Glu Gin Pro Ser Gly 420 425 45: Thr lie Ala Ala Gly Tyr Ser Gln Ser Gly G.V Val Thr Pr.e 435 440 445 Asp Val Ser Gln Asn Asr. Pne Met Gly Thr Giy Lys Kis Val Ai; 450 455 460 Ser Phe Ser Arg Ser Gl i Tr.r Arg Giu Val Tyr Ser Leu G y He: 465 4 : 475 4SC Asr. Pro Tyr Phe Thr Val Asn Gly Val Ser Gin Ser Leu Ser 1%' Tyr 4S? 490 495 Tyr Arg Lys Thr Lys Tyr Asp Asr. Lys Asn He Ser Asn T"r .'a Leu SOC 505 51C Asp Ser Tyr Giy Gly Ser Leu Ser Tyr Giy Tyr Pro He .Ase Giu Asn 515 520 525 Glr. Arg lie Ser Pne Gly Leu Asn Ala Asp Asn Thr Lys Lea HI3 Giy 530 535 540 Gly Arg Phe Met Gly He Ser Asr. Val Lys Gln Leu Met Ala Asp Gly 545 550 555 560 Gly Lys He Gln Val Asp Asn Asn Gly He Pro Asp Phe Lys His Asp 565 570 5 5 Tyr Thr Thr Tyr Asn Ala He Leu Gly Trp Asn Tyr Ser Ser L Asp 5SC 585 59C Arg Pro Val Phe Pro Thr Gin Giy Met Ser HiS Ser Val Asp Leu Thr 595 600 605 Val Gly Phe Gly Asp Lys Thr His Glr. Lys Val Val Tyr Gin Gly Asn 610 615 620 He Tyr Arg Pro Phe He Lys Lys Ser Val Leu Arg Gly Tyr Ala Lys 625 630 635 640 Leu Gly Tyr Gly Asn Asr. Leu Pro Phe Tyr Glu Asn Phe Tyr Ala Gly 645 650 655 Gly Tyr Gly Ser Val Arg Gly Tyr Asp Gln Ser Ser Leu Giy Pro Ars 660 665 670 Ser Gln Ala Tyr Leu Thr Ala Arg Arg Gly Gln Gln Thr Thr Leu Glv 675 680 685 Glu Vai Val Gly Gly Asn Ala Leu Ala Thr Phe Gly Ser Glu Leu He 690 695 700 He Phe He Glu Giy Gly Gln Val Phe Asp Thr Thr Giy Met Asp Lys 725 730 735 Gln Thr He Aep Leu T.nr Gln Phe Lys Asp Pro Gln Ala Thr Ala Glu 740 745 750 Gln Asn Ala Lys Ala Ala Asn Arg Pro Leu Leu Thr Gln Asp Lys Gln 755 760 765 Leu Arg Tyr Ser Ala Gly Val Gly Ala Thr Trp Tyr Thr Prc He Gly 770 775 780 Pro Leu Ser He Ser Tyr Ala Lys Pro Leu Asn Lys Lys Gln Asp Asp 785 790 795 800 Gln Thr Asp Tnr Val Glr. Pr.e Gln He Gly Ser Val Phe 805 810 <210> 3 <211> 2442 <212> ADN <213> Bacteria <400> 3 atgcgtaa ; catattttaa aggttttcag rcagtgcaa cgacaatggc tgccatgatg -1 gcaatgccaa ctcatgcaca agcggcggat tt atggcaa atgacatt~ catcacagga 12. ceacag gag rgaccactga aagcttacaa agrgtgccg; gtttcgcct gggtcaagtg 1 ^ " gcgagcgaag cacagtcggc tgatggtgtc aaagcacttt atgcaacagg caactttcca 1 gatgtgcaag tctatcatca agaagggcgt atcatctatc aggtaaccga aaggccgtta 3."" atcgrtgaga ttaattttga gggcaaecg ttaattccaa aagaaggtct acaagaaggg 3C ctaaaaaatg ccggcttagc tgtgggtcaa cca taaaa aagc acage acagataa:; 1 gaaa cgagr eeaccaatca atatatatca caagg tate ataataccga aattactgtr -.6 aaacagatga tgcttgatgg taatcgtgtt aagtttaat; tqacctccgc tgaaggtaaa 51 cctg acggg tggttgatat taacatcatt ggcaaccagc attttagcga tgcagatttg í Z atcgat cg: ttgcgattaa ggataataaa atcaat::s: tgtctaaag tgaccgtca: Z- a:ccaaga.a agctggtgac cagtttagag aartzgcgeg eaaatac t caatgcaggg "1" ttcgcgcgt ttgagattaa agatgctaag ctcaatatta atgaagataa aaaccgtatc ~ = : ttcgtrgaga tttcattgca tgaaggtgag caatatcgct tggacagac acagtt ttg 5?. ggtaat taa cctatactca agcagaactt gaggca tgc ttaaattcaa agcagaagaa 90. gggttttcac aagccatgct tgagcaaaca acaaacaata tcagtaccaa acttggtgac 96. gatggctart atcatgctca aatccgtcct gtaacacgca ttaatgatga aagtcgtacg 102 ~ gttgatgtgg aatatcatat tgaccctgca caccctgtct atgtacgccg tattaatttt 105. acaggtaact ttaagaccca agatgaagta ctccgtcgcg agatgcgaca acttgaaggt 114: gcgttggca ctaatcaaaa aatccagctg tctcgtgcac gcttgatgcg gactgggtte 1201 t taaacatg ttaccgttga tactcgtcca gtacccaace cacctgatca ggttgatgta 126. aattttgtsg ttgaagaaca accttcagga tcatcaacca tcgcagcagg ctactctcaa 132C agtggtggtg taacttttca atttgatgtt tctcaaaata actttatggg tacaggtaag 13SC cacgtcaacg cttcgttttc tcgctctgag acccgtgagg tgtatagttt gggtatgacc 1440 aacccatact ttaccgtaaa tggcgcctcg caaagcttga gtggctacta tcgtaaaacc 150C aagtatgata acaagaacat tagtaattat gtacttgatt cttatggtgg ctcattaagc 1560 tatggatatc caattgatga aaatcaacgc ataagctttg gtctgaatgc tgacaatacc 1620 aagcttcatg gcggtcgttt tatgggcatt agtaatgtca agcagctgat ggcagatggt 16SC ggcaaaattc aagtggataa taatggcatt cctgatttta agcatgatta cacaacctac 1^40 aatgccatt tggggtggaa ttattcaagt ctagatcgcc ctgtatttcc aacccaaggc 18C0 atgagtcatt ctgtagattt gacggttggt tttggtgata aaactcatca aaaagtggtt 1860 tatcaaggca atatctatcg cccatttatc aaaaaatcag tcttgcgtgg atacgccaag 1920 ttaggctatg gcaataattt accattttat gaaaatttct atgcaggcgg ctatggttcg 1980 • gttcgtggct atgatcaatc ctctttgggt ccacgctcac aagcctattt gacagctcgt 204C cgtggtcaac aaaccacact aggagaggt gttggtggta atgctttggc aactttcggc 210C agtgagctga ttttaccttt gccatttaaa ggtgattgga tagatcaggt gcgtccagtg 2160 atattcattg agggcggtca ggttcttgat acaacaggta tggataaaca aaccattgat 2220 ctaacccaat ttaaagaccc acaagcaaca gctgaacaaa atgcaaaagc agccaatcgc 22 SO ccgctactaa cccaagataa acagttgcgt tatagtgctg gegttggtgc aacttggtat 234C acgcccat g gtcctttatc tattagctat gccaagccat tgaataaaaa acaaaatgat 2400 cagaccgata cggtacagtt ccagactggt agtgtctttt aa 2442 <21 0> 4 < 21 1 > 81 3 • <21 2> P RT <21 3> Bacteria <400 > 4 Met Arg Asn Ser Tyr Phe Lys Gly Phe Gln Val Ser Ala Met Thr Met 5 10 15 Ala Val Met Mee Val Mee Ser Thr His Ala Glr. Ala Ala Asp Phe Met 20 25 30 Ala Asn Asp H- Ala He Thr Gly Leu Gin Arg Val Thr He Glu Ser 35 40 45 Leu Gin Ser Val Leu Pro Phe Arg Leu Gly Glr. Val Val Ser Glu Ala 50 55 6C Gln Leu Ala Asp Giy Val Lys Ala Leu Tyr Ala Tr.r Gly Asn ?r.e Ser 65 7 C 75 = : Asp Vai Glp Val Tyr Kis Gir. Giu Gly Arg He He Tvr Glr. Val Tr.r 85 90 9? Glu Arg Pro Leu He Ala Giu He Asn Phe Glu Gly Asr. Arg Le,- He 100 105 11C Pro Lys Glu Gly Leu Gln Glu Gly Leu Lys Asn Ala Gly Le_ Ala Val 115 12C 125 Gly Gln Pro Leu Lys Gir. Ala Tr.r Val Gln Met He Giu Thr Glu e_ 130 135 140 Thr Asn Gln Tyr He Ser Gln Gly Tyr Tyr Asn Thr Glu He Tr.r ia". 145 150 155 1£0 Lye Gir. Tr.r Met Leu Asp Gly Asr. Arg Val Lys Leu Asp Mee Tr.r ?ne 165 170 175 Ala Glu Gly Lys Pro Ala Arg Val Val Asp He Asp He lie Giy Asr. 180 185 190 Gln Kis Phe Ser Asp Ala Asp Leu He Asp Val Leu Ala He Lys Ase 195 200 205 Asn Lys He Asn Pro Leu Ser Lys Ala Asp Arg Tyr Thr Gln Glu Lys 210 215 220 Leu Val Thr Ser Leu Giu Asn Leu Arg Ala Lys Tyr Leu Asn Ala Giy 225 230 235 .. I Pr.e Val Arg Phe Giu He Lys Asp Ala Lys Leu Asn He Asn Glu Asp 245 25C 255 Lys Asn Arg He Phe Val Glu He Ser Leu His Giu Gly Gln Tyr 260 265 270 Arg Phe Gly Gln Thr Gln Phe Leu Gly Asn Leu Thr Tyr Tr.r Gin Ala • 275 280 285 Giu Leu Giu Ala Leu Leu Lys Phe Lys Ala Glu Glu Gly Phe Ser Gln 290 295 300 Ala Met Leu Glu Gln Thr Thr Asn Asn He Ser Thr Lys Phe Giy ASp 305 310 315 320 Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ala Glr. He Arg Pro Val Thr Arg He Asn Asp 325 330 335 Glu Ser Arg Thr Val Asp Val Giu Tyr Tyr He Asp Pro Val Hl? Pro 340 345 350 Val Tyr Val Arg Arg He Asn Phe Thr Gly Asn Phe Lys Thr Gln Asp 355 360 365 Giu Val Leu Arg Arg Giu Met Arg Gln Leu Glu Gly Ala Leu Ala Ser 370 375 380 Asn Gln Lys He Gln Leu Ser Arg Ala Arg Leu Met Arg Thr Gly Phe 385 390 395 400 • Phe Lys His Val Thr Val Asp Thr Arg Pro Val Pro Asn Ser Pro Asp 405 410 415 Gin Val Asp Val Asn Phe Val Val Glu Glu Gln Pro Ser Giy Ser Ser 420 425 430 Thr He Ala Ala Gly Tyr Ser Gln Ser Gly Gly Val Thr Phe Gin Phe 435 440 445 Asp Val Ser Gln Asn Asn Phe Met Gly Thr Gly Lys HlS Val Asn Ala 450 455 460 Ser Phe Ser Arg Ser Giu Thr Arg Glu Val Tyr Ser Leu Giy Met Tnr 465 470 475 480 Asr. Pro Tyr Phe Thr Val Asn Gly Val Ser Glp Ser Leu Ser G i y Tyr 485 490 495 Tyr Arg Lys Thr Lys Tyr Asp Asr. Lys Asn He Ser Asn Tyr Val Leu 500 505 510 Asp Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Ser Ty Gly Tyr Pro He Asp Glu Asn. 515 52C 525 Glr. Arg He Ser Pr.e Gly Leu Asn Ala Asp Asr. Tnr Lys Leu H s Giy 530 535 540 Gly Arg Phe Met Gly He Ser Asn Val Lys Gir. Leu Met Ala Asp Giy 545 550 555 560 Giy Lye He Gln Val Asp Asr. Asn Gly He Pro Asp Phe Lys His Asp 565 57C 575 Tyr Thr Thr Tyr Asn Ala He Leu Gly Trp Asn Tyr Ser Ser Leu Asp 530 585 590 Arg Pro Val Phe Pro Thr Gln Giy Met Ser H s Ser Vai Asp Leu Thr 595 600 605 Val Gly Phe Giy Asp Lys Thr His Gln Lye Val Val Tyr Gln Gly Asr. €10 615 620 He Tyr Arg Pro Phe He Lys Lys Ser Val Leu Arg Gly Tyr Ala Lys 625 630 635 640 Leu Giy Tyr Giy Asr. Asn Leu Pro Phe Tyr Giu Asn Phe Tyr Ala Gly 645 650 655 Giy Tyr Giy Ser Vai Arg Gly Tyr Asp Gln Ser Ser Leu Gly Pro Arg 660 665 670 Ser Gln Ala Tyr Leu Thr Ala Arg Arg Gly Gln Gir. Thr Leu Gly 675 680 685 Glu Val Val Giy Giy Asn Ala Leu Ala Thr Phe Gly Ser Glu Leu He 690 695 700 Leu Prc Leu rc Phe Lys Giy Asp Trp He Asp Glr. Val Arg Pro Vai 705 710 715 720 He Phe He Glu Giy Gly Glr. Val Phe Asp Thr Tnr Gly Met Asp Lys • 725 730 735 Gln Thr He Asp Leu Thr Gin Phe Lys Asp Pro Gln Ala Thr Ala Glu 740 745 750 Gln Asn Ala Lys Ala Ala Asn Arg Pro Leu Leu Thr Gln Asp Lys Gln 755 760 765 Leu Arg Tyr Ser Ala Gly Val Gly Ala Thr Trp Tyr Thr Pro He Gly 770 775 780 Pro Leu Ser He Ser Tyr Ala Lys Pro Leu Asn Lys Lys Gln Asn Asp 785 790 795 800 Gln Thr Asp Thr Val Gln Phe Gln He Gly Ser Val Phe 805 810 <210> 5 • <211> 17 5 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Iniciador <400> 5 10 actatagggc acgcgtg 17 <210> 6 <211> 20 <212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Iniciador <400>6 cctgcgtttg tttgattgag 20 <210> 7 <211> 61 <212> ADN • <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 7 aagggcccaa ttacgcagag gggatccaca ggactacagc gagtgaccat tgaaagctta 60 c 61 <210> 8 <211> 67 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 15 <220> <223> Oligonucleótido <400> 8 aagggcccaa ttacgcagag ggtcgactta ttaaaagaca ctaccaatct ggaactgtac 60 cgtatcg 67 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial 25 <220> <223> Oligopéptido <400> 9 Cys Tyr Ala Lys Pro Leu Asn Lys Lys Gln Asn Asp Gln Thr Asp Thr 1 5 10 15 • <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> JÉ 10 <223> Oligopéptido <400> 10 Tyr Leu Thr Ala Arg Arg Gly Gln Thr Thr Leu Gly Glu Val Val 1 5 10 15 Cys 15 INFORMACIÓN DE SECUENCIA Secuencias de Polinucleótido y Polipéptido BASB027 SEC ID NO: 1 Secuencia de polinucleótido BASB027 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC 43617 ATGCGTAATTCATATTTTAAAGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATG GTAATGTCAACTCATGCACAAGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTACCATCACAGGA CTACAGCGAGTGACCATTGAAAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTtCGCTTGGGTCAAGTG GTGAGCGAAAACCAGTTGGCTGATGGTGTCAAAGCACTTTATGCAACAGGCAATTTTTCA GATGTGCAAGTCTATCATCAAGAAGGGCGTATCATCTATCAGGTAACCGAAAGGCCGTTA ATCGCTGAGATTAATTTTGAGGGCAATCGCTTAATTCCAAAAGAAGGTCTACAAGAAGGG CTAAAAAATGCTGGCTTAGCTGTGGGTCAACCACTAAAACAAGCCACAGTACAGATGATC GAAACCGAGCTTACCAATCAATATATATCACAAGGCTATTATAATACCGAAATTACTGTC AAACAGACGATGCTTGATGGTAATCGTGTTAAGCTTGATATGACCTTTGCTGAAGGTAAA CCTGCACGGGTGGTTGATATTAATATCATTGGCAATCAGCATTTTAGCGATGCAGATTTG ATTGATGTGCTTGCGATTAAGGATAATAAAATCAATCCACTGTCTAAAGCTGACCGTTAT • ACTCAAGAAAAGCTGGTGACCAGTTTAGAGAATTTGCGTGCTAAATATCTCAATGCAGGG TTTGTGCGTTTTGAGATTAAAGATGCTAAGCTTAATATTAATGAAGATAAAAACCGTATC TTTGTTGAGATTTCATTGCATGAAGGTGAGCAATATCGCTTTGGACAGACACAGTTTTTG GGTAATTTAACTTATACTCAAGCAGAACTTGAGGCACTGCTTAAATTCAAAGCAGAAGAA GGGTTTTCACAAGCCATGCTTGAGCAAACAACAAACAATATCAGTACCAAATTTGGTGAC GATGGCTATTATTATGCTCAAATCCGTCCTGTAACACGCATTAATGATGAAAGTCGTACG GTTGATGTGGAATATTATATTGACCCTGTACACCCTGTCTATGTACGCCGTATTAATTTT ACAGGTAACTTTAAGACCCAAGATGAAGTACTCCGTCGTGAGATGCGACAACTTGAAGGT GCGTTGGCATCTAATCAAAAAATCCAGCTGTCTCGTGCACGCTTGATGCGGACTGGGTTT TTTAAACATGTTACCGTTGATACTCGTCCAGTACCCAACTCACCTGATCAGGTTGATGTA AATTTTGTGGTTGAAGAACAACCTTCAGGATCATCAACCATCGCAGCAGGCTACTCTCAA AGTGGTGGTGTAACTTTTCAATTTGATGTTTCTCAAAATAACTTTATGGGTACAGGTAAG • CACGTCAATGCTTCGTTTTCTCGCTCTGAGACCCGTGAGGTGTATAGTTTGGGTATGACC AACCCATACTTTACCGTAAATGGCGTCTCGCAAAGCTTGAGTGGCTACTATCGTAAAACC AAGTATGATAACAAGAACATTAGTAATTATGTACTTGATTCTTATGGTGGCTCATTAAGC TATGGATATCCAATTGATGAAAATCAACGCATAAGCTTTGGTCTGAATGCTGACAATACC AAGCTTCATGGCGGTCGTTTTATGGGCATTAGTAATGTCAAGCAGCTGATGGCAGATGGT GGCAAAATTCAAGTGGATAATAATGGCATTCCTGATTTTAAGCATGATTACACAACCTAC AATGCCATTTTGGGGTGGAATTATTCAAGTCTAGATCGCCCTGTATTTCCAACCCAAGGC ATGAGTCATTCTGTAGATTTGACGGTTGGTTTTGGTGATAAAACTCATCAAAAAGTGGTT TATCAAGGCAATATCTATCGCCCATTTATCAAAAAATCAGTCTTGCGTGGATACGCCAA*G TTAGGCTATGGCAATAATTTACCATTTTATGAAAATTTCTATGCAGGCGGCTATGGTTCG GTTCGTGGCTATGATCAATCCTCTTTGGGTCCACGCTCACAAGCCTATTTGACAGCTCGT CGTGGTCAACAAACCACACTAGGAGAGGTTGTTGGTGGTAATGCTTTGGCAACTTTCGGC AGTGAGCTGATTTTACCTTTGCCATTTAAAGGTGATTGGATAGATCAGGTGCGTCCAGTG ATATTCATTGAGGGCGGTCAGGTTTTTGATACAACAGGTATGGATAAACAAACCATTGAT TTAACCCAATTTAAAGACCCACAAGCAACAGCTGAACAAAATGCAAAAGCAGCCAATCGC CCGCTACTAACCCAAGATAAACAGTTGCGTTATAGTGCTGGTGTTGGTGCAACTTGGTAT ACGCCCATTGGTCCTTTATCTATTAGCTATGCCAAGCCATTGAATAAAAAACAAAATGAT CAGACCGATACGGTACAGTTCCAGATTGGTAGTGTCTTTTAA S EC I D N O : 2 5 Secue n ci a de pol i pé pti d o BAS B027 d e Moraxella catarrh alis ded u ci d a de l a se cue n ci a d e po l i n u cl eóti do de S EC I D N O : 1 MRNSYFKGFQVSAMTMAVMMVMSTHAQAADFMANDITITGLQRVTIES QSV PFR GQV VS?NV JADGVKALYATGNFSDVQVYHQEGRIIYQVTERPLIAEINFEGNR IPK?GLQ?G L MAG AVGQPLKQATVQMIETELTNQYISQGYYNTEITVKQTM DGNRVKIIDMTFAEGK FARVV'DIKIIGNQHFSDADLIDV AIKDNKINPLSKADRYTQEK VTS EN RA:-:YLNAG FVRF?IKDAKLNINEDK RIFVEISLHEGEQYRFGQTQFLGNLTYTQAELEAL KFKAE? GFSQA!-: ?2TTN ISTKFGDDGYYYAQIRPVTRINDESRTVDVEYYIDPVKPVIVRRINF TGNF TQDEVLRREMRQLEGALASNQKIQLSRARLMRTGFFKHVTVDTRPVPNSPDQVDV • NFV- EE PSGSSTIAAGYSQSGGVTFQFDVSQNNFMGTGKHVNASFSRSETREVYSLGMT NPYFTVKGV5QSLSGYYRKTKYDNKNISNYVLDSYGGSLSYGYPIDENQRISFG NADNT KGGRFMGIS VKQLMADGGKIQVD NGIPDFKHDYTTYNAILGWNYSSLDRFVFPTQG MSHSVD TVGFGDKTHQKWYQGNIYRPFIKKSVLRGYAKLGYGNNLPFYENFYAGGYGS VRGYDQSS GPRSQAYLTARRGQQTTLGEWGGNALATFGSELILP PFKGDWIDQVRPV IFIEGGQVFDTTGMDKQTID TQFKDPQATAEQNAKAA RP LTQDKQLRYSAGVGATWY TPIGP SISYAKP NKKQNDQTDTVQFQIGSVF SEC ID NO: 3 • Secuencia de polinucleótido BASB027 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC 43617 ATGCGTAATTCATATTTTAAAGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATG GTAATGTCAACTCATGCACAAGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTACCATCACAGGA CTACAGCGAGTGACCATTGAAAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTG GTGAGCGAAAACCAGTTGGCTGATGGTGTCAAAGCACTTTATGCAACAGGCAATTTTTCA GATGTGCAAGTCTATCATCAAGAAGGGCGTATCATCTATCAGGTAACCGAAAGGCCGTTA ATCGCTGAGATTAATTTTG GGGCAATCGCTTAATTCCAAAAGAAGGTCTACAAGAAGGG CTAAAAAATGCTGGCTTAGCTGTGGGTCAACCACTAAAACAAGCCACAGTACAGATGATC GAAACCGAGCTTACCAATCAATATATATCACAAGGCTATTATAATACCGAAATTACTGTC • AAACAGACGATGCTTGATGGTAATCGTGTTAAGCTTGATATGACCTTTGCTGAAGGTAAA ATTGATGTGCTTGCGATTAAGGATAATAAAATCAATCCACTGTCTAAAGCTGACCGTTAT ACTCAAGAAAAGCTGGTGACCAGTTTAGAGAATTTGCGTGCTAAATATCTCAATGCAGGG TTTGTGCGTTTTGAGATTAAAGATGC AAGCTTAATATTAATGAAGATAAAAACCGTATC TTTGTTGAGATTTCATTGCATGAAGGTGAGCAATATCGCTTTGGACAGACACAGTTTTTG GGTAATTTAACTTATACTCAAGCAGAACTTGAGGCACTGCTTAAATTCAAAGCAGAAGAA GGGTTTTCACAAGCCATGCTTGAGCAAACAACAAACAATATCAGTACCAAATT GGTGAC GATGGCTATTATTATGCTCAAATCCGTCCTGTAACACGCATTAATGATGAAAGTCGTACG GTTGATGTGGAATATTATATTGAC CTGTACACCCTGTCTATGTACGCCGTATTAATTTT ACAGGTAACTTTAAGACCCAAGATGAAGTACTCCGTCGTGAGAT3CGACAACTTGAAGGT GCGTTGGCATCTAATCAAAAAATC3AGCTGTCTCGTGCACGCTTGATG3GGACTGGGTTT TTTAAACATGTTACCGTTGATACTCGTCCAGTACCCAACTCACCTGATCAG3TTGATGTA AATTTTGTGGTTGAAGAACAACCTTCAGGATCATCAACCATCGCAGCAGG3TACTCTCAA AGTGGTGGTGTAACT TTCAATTTGATGTTTCTCAAAATAACTTTAT3GGTACAGGTAAG CACGTCAATGCTTCGTTTTCTCGCTCTGAGACCCGTGAGGTGTATAGTTTGGGTATGACC AACCCATACTTTACCGTAAATGGCGTCTCGCAAAGCTTGAGTGGCTACTATCGTAAAACC AAGTATGATAACAAGAACATTAGTAATTATGTACTTGATTCTTATGGTGG3TCATTAAGC TATGGATATCCAATTGATGAAAATCAACGCATAAGCTTTGGTCTGAATGCTGACAATACC AAGCTTCATGGCGGTCGTTTTATGGGCATTAGTAATGTCAAGCAGCTGATGGCAGATGGT GGCAAAATTCAAGTGGATAATAATGGCATTCCTGATTTTAAGCATGATTACACAACCTAC • AATGCCATTTTGGGGTGGAATTATTCAAGTCTAGATCGCCCTGTATTTCCAACCCAAGGC ATGAGTCATTCTGTAGATTTGACGGTTGGTTTTGGTGATAAAACTCATCAAAAAGTGGTT TATCAAGGCAATATCTATCGCCCATTTATCAAAAAATCAGTCTTGCGTGGATACGCCAAG TTAGGCTATGGCAATAATTTACCATTTTATGAAAATTTCTATGCAGGCGGCTATGGTTCG GTTCGTGGCTATGATCAATCCTCTTTGGGTCCACGCTCACAAGCCTATTTGACAGCTCGT CGTGGTCAACAAACCACACTAGGAGAGGTTGTTGGTGGTAATGCTTTGGCAACTTTCGGC AGTGAGCTGATTTTACCTTTGCCATTTAAAGGTGATTGGATAGATCAGGTGCGTCCAGTG ATATTCATTGAGGGCGGTCAGGTTTTTGATACAACAGGTATGGATAAACAAACCATTGAT TTAACCCAATTTAAAGACCCACAAGCAACAGCTGAACAAAATGCAAAAGCAGCCAATCGC CCGCTACTAACCCAAGATAAACAGTTGCGTTATAGTGCTGGTGTTGGTGCAACTTGGTAT ACGCCCATTGGTCCTTTATCTATTAGCTATGCCAAGCCATTGAATAAAAAACAAAATGAT CAGACCGATACGGTACAGTTCCAGATTGGTAGTGTCTTTTAA • SEC ID NO: 4 Secuencia de poli péptido BAS B027 de Moraxella catarrhalis ded ucida 5 de la secuencia de pol inucleótido de SEC I D NO : 3 MRNSYFKGFQVSAMTMAVMMVM?THAQAADFMANDITITGLQRVTIESLQSVLPFRLGQV VSENQLADGVKALYATGNFSDVQVYHQEGRIIYQVTERPLIAEINFEGNR IPK?GLQEG LKNAGLAVGQP KQATVQMIETE TNQYISQGYYNTEITVKQTM DGNRVK DMTFAEGK PARWDINIIGNQHFSDADLIDVLAIKDNKINPLSKADRYTQEKLVTSLENLRAKYLNAG FVRFEIKDAKLNINEDKNRIFVEISLHEGEQYRFGQTQFLGN TYTQAE EALLKFKAEE GFSQAMLEQTTN ISTKFGDDGYYYAQIRPVTRINDESRTVDVEYYIDPVHPVYVRRINF TGNFKTQDEV RREMRQL?GALASNQKIQLSRARL RTGFFKHVTVDTRPVPNSPDQVDV NFWEEQPSGSSTIAAGYSQSGGVTFQFDVSQNNFMGTGKHVNASFSRSETREVYSLGMT NPYFTVNGVSQ?LSGYYRKTKYDNKNISNYV DSYGGSLSYGYPIDENQRI3FG NADNT HGGRFMGISNVKQLMADGGKIQVDNNGIPDFKHDYTTYNAILG NYSS DRPVFPTQG MSHSVDLTVGFGD THQKV.'YQGNIYRPFIKKSV RGYAKLGYGNNLPFYENFYAGGYGS VRGYDQSS GPRSQAYLTARRGQQTTLGEWGGNALATFGSELI P PFKGD IDQVRPV IFIEGGQVFDTTGMDKQTIDLTQFKDPQATAEQNAKAA RPL TQDKQLRYSAGVGATWY TPIGP SISYAKPLNKKQNDQTDTVQFQIGSVF SEC ID NO:5 ACT ATA GGG CAC GCG TG • SEC ID NO:6 5 CCT GCG TTT GTT TGA TTG AG SEC ID NO:7 AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ACÁ GGA CTA CAG CGA GTG ACC ATT GAA AGC TTA C 10 * SEC ID NO:8 AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AAT CTG GAA CTG TAC CGT ATC G SEC ID NO:9 CYAKPLNKKQNDQTDT • SEC ID NO:10 YLTARRGQQTTLGEVVC 20

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1.- Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de

• aminoácido, la cual tiene por lo menos 85% de identidad con la

5 secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO:2 y SEC ID NO: 4, sobre toda la longitud de SEC ID NO:2 o SEC ID NO:4, respectivamente. 2.- Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácido tiene por lo menos un 95% de

• 10 identidad con la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO:2 y SEC ID NO:4, sobre toda la longitud de SEC ID NO:4, respectivamente. 3.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que 15 consiste de SEC ID NO:2 y SEC ID NO:4. 4.- Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO:2 o

• SEC ID NO NO:4. 5.- Un fragmento inmunogénico del polipéptido de acuerdo

20 con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el fragmento inmunogénico es capaz de evocar una respuesta inmune (si es necesario cuando se acopla con un vehículo), que reconoce el polipéptido de SEC ID NO:2 o SEC ID NO:4. 6.- Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho polipéptido es parte de una

proteína de fusión más grande. 7.- Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. • 8.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia

5 de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 o 4 sobre toda la longitud de SEC ID NO:2 o 4, respectivamente; o una secuencia de nucleótido complementaria al polinucleótido aislado. 9.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia

10 de nucleótido que tiene por lo menos un 85% de identidad con una

• secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID NO:2 ó 4 sobre toda la región de codificación; o una secuencia de nucleótido complementaria al polinucleótido aislado. 10.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia

15 de nucleótido que tiene por lo menos un 85% de identidad a aquella de SEC ID NO:1 ó 3 sobre toda la longitud de SEC ID NO:1 ó 3, respectivamente; o una secuencia de nucleótido complementaria al

• polinucleótido aislado. 11.- El polinucleótido aislado de acuerdo con cualquiera de las 20 reivindicaciones 7 a 10, en donde la identidad es por lo menos 95% para SEC ID NO:1 ó 3. 12.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID NO:2 o SEC ID NO:4. 25 13.- Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido

de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:3.

14.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 que se puede obtener clasificando una colección apropiada bajo condiciones de hibridación severas con una sonda marcada teniendo la secuencia de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:3, o un fragmento de la misma.

15.- Un vector de expresión o un microorganismo vivo que comprende un polinucleótido recombinante aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-14.

16.- Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 15, expresando un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO:2 y SEC ID NO:4, o una membrana de una célula huésped que comprende el polipéptido expresado.

17.- Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 16 bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

18.- Un proceso para expresar un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-14, que comprende transformar una célula huésped con el vector de expresión comprendiendo por lo menos uno de los polinucleótidos y cultivar la

célula huésped bajo condiciones suficientes para la expresión de cualquiera de los polinucleótidos.

19.- Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20.- Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21.- La composición de vacuna de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 ó 20, en donde dicha composición comprende por lo menos otro antígeno de Neisseria meningitidis.

22.- Un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido o fragmento inmunológico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

23.- Un método para diagnosticar una infección por Neisseria meningitidis, que comprende identificar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido, presente dentro de una muestra biológica de un animal con sospecha de tener dicha infección.

24.- El uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un medicamento para utilizarse en la generación de una respuesta inmune en un animal.

25.- El uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-14 en la preparación de un

• medicamento para usarse en la generación de una respuesta inmune en un animal. 26.- Una composición terapéutica útil para tratar seres humanos con Neisseria meningitidis, que comprende por lo menos un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéutico adecuado.

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