MXPA00005165A - Procedimiento para la medicion de la apoptosis - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la medición rápida y sencilla de la apoptosis. Las células de animales se co-transfectan con un plásmido, que codifica para una proteína fluorescente, y con un plásmido que porta un gen de interés. Después de la incubación y suave fijación en la cual el contenido de ADN de las células se determina por medio de colorantes ligantes de ADN, asícomo por medio de citometría de flujo se determina la fracción de las células transfectadas. El procedimiento puede utilizarse, para identificar substancias que modulen el efecto pro- o anti-apoptótico de los genes o productos genéticos.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA MEDICIÓN DE LA APOPTOSIS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de los métodos de prueba biológicos . La apoptosis o muerte celular programada ("programmed cell death", PCD) es un mecanismo de auto-destrucción celular genéticamente controlado para la selección selectiva de células indeseadas (1-4) . PCD es en muchos procesos biológicos incluyendo el desarrollo embrional y neuronal, la regulación del sistema inmune, la organogénesis, la homeostasis de los tejidos y la inhibición de enfermedades como crecimientos tumorales e infecciones virales, un proceso imprescindible. La apoptosis se caracteriza por la formación de ampollas en la membrana plasm tica, encogimiento de las células, condensación del núcleo, desintegración endonucleótica del ADN genómico en fragmentos de longitud internucleosomal así como formación de cuerpos apoptóticos . Los métodos existentes actualmente para estudiar la apoptosis se basan en la evaluación de las modificaciones morfológicas en el plano celular por medio de microscopio iluminado, electrónico o acelerado junco con colorantes vitales fluorescentes (38) , el uso de annexina V, por medio de la cual puede observar la perdida de la asimetría de los fosfolípidos de la membrana durante la apoptosis (7) , o REF.: 120515 consisten en ensayos para determinar la fragmentación de DN" por medio de electroforesis de gel (8) o por medio del marcado in situ de las rupturas de las tiras de ADN (""marcado del nick-end") (TÚNEL) (9) . Para estudiar el efecto de los genes que tienen un papel importante en la apoptosis, por medio de análisis de transfección transitorio sin embargo la mayoría de esos métodos son o inadecuados, o en el caso del método ÚNELf demasiado caro y expendioso. La presente invención se propuso la tarea de presentar un nuevo procedimiento para la medición de la apoptosis, gue supere las desventajas de los métodos conocidos . Esa tarea se resuelve por medio de un procedimiento para la medición de la apoptosis, el cual se caracteriza porgue A) una población de células de animales mamíferos se transfecta de manera transitoria ai) con un plásmido gue contiene una secuencia de ADN de interés, de la cual debe determinarse su el polipéptido expresado tiene un efecto pro- o anti-apoptótico, aii) o con un plásmido gue contiene una secuencia de ADN de interés, de la cual debe determinarse si o por medio de gue sustancias puede modularse su efecto pro- o anti- apoptótico o el efecto del polipéptido así expresado, b) y con un plásmido que contiene un ADN codificante a una proteína marcadora fluorescente, B) las células se incuban en un medio nutritivo, eventualmente en la presencia de una substancia de prueba, hasta que la secuencia de ADN o el polipéptido expresado de interés, haya ejercido su efecto potencial sobre la apoptosis, C) las células se cosechan y se fijan de tal forma que la proteína fluorescente permanece en las células, mientras que los fragmentos de ADN formados durante la apoptosis puede ser difundirse de las células, D) por medio de la medición del contenido de ADN se determina la fracción de células apoptóticas, E) por medio de la medición de las células con proteínas marcadoras fluorescentes se determina la fracción de células transfectadas, F) y por medio de la comparación de los valores obtenidos en las etapas D y E se determina la fracción de células apoptóticas en la subpoblación transfectada de las células. Bajo la denominación "secuencia de ADN de interés" (a continuación denominada también como "gen de prueba de apoptosis") entran muchas secuencias de ADN, gue como tales o por medio de sus productos trasladados influyen directa o indirectamente sobre la apoptósis- Ejemplos de genes estimulantes de la apoptosis son p53, bax, E1A, ejemplos de genes reductores de la apoptosis son bel-2, bcl-x, ElB 19K, en el grupo anterior se encuentran también los llamados factores de sobrevivencia como factores de crecimiento (IGF) similares a la insulina. Ese tipo de genes de apoptosis y su efecto se describen en varios artículos (por ejemplo 4, 23,24) . En el caso de los genes de prueba de apoptosis, puede tratarse de genes conocidos o desconocidos o sus fragmentos, bajo influir sobre la apoptosis se entiende también la inducción y refuerzo como también el bloqueo y debilitamiento de la apoptosis. El método de acuerdo con la invención permite una gran variabilidad, por ejemplo en referencia al marcado utilizado para la determinación de las células transfectadas o para la apoptosis, en lo gue se refiere a los plásmidos y a los métodos de transfección utilizados para la transfección de las células . Los métodos de acuerdo con la invención presenta como uno de sus elementos esenciales una proteína marcadora fluorescente, que sirve para indicar la transfección transitoria de las células . Como proteína marcadora se prefiere la proteína fluorescente verde (GFP) . Los mutantes GFP, que optimizan el análisis FACS y que son adecuados para usarse en el marco de la presente invención, son conocidos en la literatura. Un ejemplo de mutantes GFP adecuados se describe en (19) ("enhanced Green Fluorescent Protein", eGFP) ; pero sin embargo en el merco de la presente invención pueden utilizarse también otros mutantes que cumplan con la condición de que no influyan sobre el metabolismo celular, que permanezcan localizados intracelularmente y que conduzcan a una señal fluorescente mesurable, en especial que puedan ser mesurables por medio de los métodos de citometría de flujo activada por fluorescencia (Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) ) . Además de la proteína fluorescente verde (GFP) pueden también utilizarse otras proteínas marcadoras fluorescentes . Ejemplos de estas son la proteína fluorescente azul (BFP) (26) y la proteína fluorescente amarilla (YFP) (25) . Es esencial para que una proteína marcadora sea adecuada para usarse en los métodos de acuerdo con la invención son las propiedades antes mencionadas para los mutantes GFP. Las proteínas marcadoras potenciales así como el tipo y cantidad de los plásmidos codificantes a utilizar en el ensayo así como los métodos de transfección mejor adecuados, pueden pro ejemplo probarse de la siguiente manera; los plásmidos codificantes a las proteínas marcadoras se transfectan transitoriamente en células de mamíferos, ventajosamente en las mismas células y bajo las mismas condiciones, con las cuales deben realizarse los métodos de acuerdo con la invención. La adecuación de las proteínas marcadoras transfectadas se determina por series de medición, en las cuales se determina la eficiencia de transfeccíón y la eficiencia de la capacidad de medición reproducible por medio de análisis FACS. Como marcador para la apoptosis sirve un colorante ligante de ADN, por ejemplo yoduro propidio (Pl) gue en la sub-población apoptótica conduce a una reducción de la fluorescencia (14-17) . Este punto de determinación se basa en el principio de gue el ADN genómico en las células durante la apoptosis se destruye endonucleóticamente . Los pegúenos fragmentos de ADN se difunden a través de las células; la reducción del contenido de ADN a menos de el doble de las cromosomas ("sub-2N") es una característica de las células apoptótica. La reducida fluorescencia de Pl en las células sometidas a apoptosis da como resultado' la aparición de un pico de fluorescencia característico ("sub-2N-PEAK") , en la zona de la región G0/G1 del ciclo celular. En vez de yoduro de propidio pueden utilizarse también otros colorantes ligantes de ADN. Representantes de colorantes adecuados de ese tipo se encuentran en el mercado, poír ejemplo, DAPI (4 ' , 6' -diamidino'2-feniiindol) , naranja de acridino, bromuro de etidio. El colorante más adecuado puede considerarse aguel con el cual las células tienden a la apoptosis y que subsecuentemente puede determinarse por medio de análisis Facs o microscópicos si la apoptosis con los colorantes candidatos puede medirse de manera reproducible. Una de las ventajas de los métodos de acuerdo con la invención consiste en gue la medición de la fluorescencia de la proteína marcadora y del contenido de ADN puede realizarse simultáneamente, preferentemente por medio de análisis Facs, los aparatos adecuados se encuentran en el mercado. La invención puede aplicarse a todas las células de mamíferos gue puedan ser cultivadas. Para el técnico es rutinario el utilizar los aparatos Facs comerciales en diferentes tipos de células . Para la trasfección de las células con un gen marcador por un lado y por otro lado con el gen de interés, son adecuados vectores conjuntos gue en las células de mamíferos provocan la expresión de una manera eficiente y reproducible. Ejemplos de los múltiples vectores existentes y también obtenibles comercialmente, contienen secuencias reguladoras con la capacidad de alcanzar en múltiples células de mamíferos altas tasas de expresión.

Ejemplos son vectores que contienen . el promotor CMV (citomegalovirus) , SV40 (virus de simios) MSV (virus de sarcoma de Maloney) y otros promotores no específicos al tipo de célula que sean fuertes. Como portadores para el gen marcador y el gen de interés, pueden utilizarse vectores idénticos o diferentes, es ventajoso dependiendo del tipo de célula, utilizar vectores con diferentes promotores, para evitar la concurrencia de los promotores durante la transcripción. En relación a los métodos de transfección, la invención no está sometida a limitaciones; principalmente pueden utilizarse los métodos conocidos para la transfección transitoria de células de animales mamíferos como por ejemplo fosfato de calcio, lípidos catiónicos comercialmente obtenibles como Lipofectamina o Transfectam, métodos a base de la endocitosis apoyada por adenovirus promovida por receptores como por ejemplo los descritos en WO 93/07283, por ejemplo por medio de polietilenimida y adenovirus psoral/inactivados con UV, como también se describe en (21) . Los métodos de transfección pueden optimizarse por medio de pruebas en serie en las cuales se varían las condiciones de transfección, el tipo celular, el medio nutritivo, etc., en los cuales se transfecta con una proteína marcadora fluorescente y la expresión de la proteína se determina por medio de análisis Facs. Las condiciones optimizadas para la proteína marcadora, se utilizan para la co-transfección con el gen de interés.

Subsecuentemente a la transíección, las células se incuban en un medio nutritivo adecuado que ha sido ajustado al tipo de célula en cuestión. Eventualmente, las células son estimuladas a la apoptosis en especial cuando debe estudiarse el gen de prueba de apoptosis sobre la reducción de la apoptosis. Estímulos de apoptosis adecuados son conocidos en la literatura y se encuentran en el mercado, ejemplos son estaurosporina, daunomicida, etopocid. Las condiciones de incubación así como ?a ventaja de un estimulante de apoptosis, se han determinado en pruebas previas. Es esencial para la incubación, en especial para su duración, el que la apoptosis se realice en una medida que permita que se realice una modificación técnica de medición por ejemplo por medio de análisis Facs. Esencial para la realización del procedimiento de acuerdo con la invención, es el paso de fijación realizado subsecuentemente, a la incubación. Un requisito esencial para la fijación es que las condiciones se seleccionan de tal manera gue los pegúenos fragmentos subgenó icos de ADN formados durante la apoptosis (fragmentos inter-nucleosomales, esto es aguellos con un tamaño de aproximadamente 200bp y un ' múltiplo, puedan difundirse a través de las células apoptóticas pero gue simultáneamente la proteína marcadora fluorescente permanezca en la célula. Con los métodos hasta ahora conocidos, la combinación de esas medidas no era posible, porgue los requisitos par ala fijación en lo gue respecta a la medición de la proteína marcadora fluorescente por un lado y la medición del contenido de ADN en las células eran diametralmente opuestos y por lo tanto, parecían incombinables. La presente invención, hace posible por primera vez el realizar ambas mediciones en la misma población celular, con la ayuda de un paso de fijación adecuado . Para determinar las condiciones de fijación adecuadas, se procede ventajosamente de la siguiente manera: primero se determinan independientemente entre sí las condiciones de fijación óptimas por un lado para la medición de la fluorescencia de la proteína marcadora (fijación fuerte) y por otro lado para la medición del contenido de ADN de las células (fijación lo más débil posible) . A partir de las condiciones con las cuales se obtienen los máximos valores medidos se modifican las condiciones de fijación en lo gue respecta a los reactivos (reactivo de fijación, sales, amortiguador) , su concentración así como el tiempo de fijación, de tal forma que al realizar simultáneamente ambos procedimientos de medición, se influye negativamente sobre la eficiencia de la forma más reducida posible. Preferentemente, se realiza la fijación primaria con paraformaldehido y el subsecuente tratamiento (fijación secundaria/permeabilización) con etanol; esos procedimientos han demostrado ser los más adecuados en el marco de las pruebas realizadas. La prefijación se realiza por medio de 1 a 4% (p/v) , en especial 2% de parafolmaldehído, en una solución salina isotónica, amortiguada. Son adecuadas por ejemplo las soluciones estándar como NaCl lOOmM, MgCl2 3mM, sacarosa 300mM, así como amortiguadores fisiológicamente aceptables comerciales . En vez de paraformaldehido pueden utilizarse otros reactivos como los que se usan habitualmente por ejemplo en la inmunohistoquímica. Ejemplos de fijadores comunes pueden tomarse de los manuales propuestos 27 y son formaldehido o cloroformo/acetona. En vez de etanol que ha demostrado ser el más adecuado para las pruebas realizadas bajo las condiciones seleccionadas para la fijación secundaria subsecuente a la fijación primaria con formaldehido pueden básicamente utilizarse otros reactivos que posibiliten una débil permeabilización de la membrana celular, como por ejemplo detergentes.

La expresión transitoria de genes que modulan la apoptosis por ejemplo miembros de la familia Bsl o componentes de la trasducción del señal de factor de sobrevivencia y los subsecuentes análisis cuantitativos de la apoptosis por medio de los métodos de acuerdo con la invención, permiten probar si los compuestos químicos están en la posición de influir específicamente sobre la función de los genes moduladores de la apoptosis. Los métodos de acuerdo con la invención, pueden automatizarse por medio del ajuste de los aparatos, por ejemplo par la preparación de muestras y para los análisis Facs, lo que es adecuado para mediciones en gran escala por ejemplo en Screening- Methoden. Los métodos de esta forma tienen aplicación en la identificación de substancias farmacéuticamente efectivas que pueden modular la apoptosis dependiendo de la expresión de ciertos genes (genes de prueba de apoptosis) . Aquí el gen cuyo efecto sobre la apoptosis debe ser modulada por medio de la substancia de prueba se transfecta transitoriamente en células de prueba y las células de prueba se incuban con una substancia de prueba de una serie de substancias, el efecto modulador de una substancia de prueba sobre la actividad del gen de prueba se determina directamente por técnicas de medición. Esos métodos pueden utilizarse para los siguientes métodos de selección: a) búsqueda de inhibidores de los factores de sobrevivencia y su transducción de señales, así como inhibidores de productos genéticos anti-apoptosis, en células de tumores; b) búsqueda de substancias químicas que en las células de tumores sinergísticamente con la quimioterapia inhiben ciertos factores de supervivencia y su transducción de señal; c) búsqueda de quimioterapeúticos que actúen sinergísticamente con la inhibición de factores de sobrevivencia. En una forma de realización, se utiliza el método de acuerdo con la invención, en un procedimiento de selección para estudiar el efecto de los factores de sobrevivencia propios de las células de tumores, (ligantes de receptores como IGF-l-IGF-II-FGFs (Fibroblast Growth Factors) , PDGSs (Platelet Derived Growth Factors) , sobre la apoptosis, determinada por la activación de los receptores correspondientes a través de esos factores y la subsecuente cascada de señales . El procedimiento de ensayo puede utilizarse en una selección para modular el efecto de los factores de sobrevivencia naturales, conocidos o eventualmente aun no identificados en vista de una terapia para los tumores que como consecuencia debe reforzar la apoptosis de las células de tumores. El objetivo de un procedimiento de este tipo, es sobre todo identificar substancias que en lo que respecta a la apoptosis tienen un efecto sinergístico- con la inhibición de factores de sobrevivencia específicos para los tumores. Para determinar la sinergia de efecto, puede procederse de la siguiente forma: A partir de células de tumores se producen células de prueba en las cuales se inhibe la función del factor de sobrevivencia, con lo cual en las células, se introduce y expresa el ADN que codifica a versiones dominantes negativas de receptores de los factores de sobrevivencia o para moléculas de transferencia de señales dominantes negativas de esos receptores. Ejemplos de esos receptores son el receptor IGF-1 (29) , los receptores FGF (30) , los receptores PDGF (31) , los receptores de los factores de crecimiento EGF (32), el receptor EGF Her-2/neu/ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4) . Ejemplos de estas moléculas de transferencia de señales, son Ras, Raf, Fosfoinositol (3), quinasa (= API (3) -quinasa) guinasas map, guinasas de proteína tipo B y C, fosfolipasa C, además moléculas adaptadoras como Shc, Grb-2 (33, 34, 35, 36 y 37) . Los mutantes receptores adecuados están caracterizados porque los dominios funcionales del receptor están modificados de tal forma que ciertamente en receptor se liga a los ligandos, pero ese enlace ya no da como resultado la activación de la cascada de señales. En el caso del IGF-R, se trata durante la modificación de una ausencia completa de los* dominios de quinasa del receptor o de una mutación de los puntos de enlace ATP (28) . Las moléculas de transmisión de señales pueden modificarse al ser inactivados por mutación los dominios necesarios para la transferencia de" la señal, por ejemplo los dominios catalíticos de una enzima o los puntos de enlace de proteínas de una molécula adaptadora. Los mutantes provistos para usarse en una selección se optimizan en pruebas previas sobre su efecto inductor o amplificador de la apoptosis en células de prueba, por ejemplo linajes celulares de fibroblastos que por medio de la transfección con el receptor tipo nativo en cuestión, se han hecho dependientes de factor) , por medio de métodos habituales en pruebas en serie en las cuales los mutantes se transfectan en las células de prueba y se mide la extensión de la apoptosis de las células de prueba por medio de los métodos de acuerdo con la invención. Los dominios funcionales de los mutantes, en caso de requerirse se modifican posteriormente por medio de métodos de biología molecular habituales hasta que se obtiene una inhibición óptima de receptor tipo nativo y su subsecuente transmisión de señal, y con esto una extensión máxima de la apoptosis en las células de prueba. En la selección, las células de prueba se incuban con quimioterapeúticos conocidos o con substancias de una fuente que deben ser estudiadas en lo que respecta a su potencial efecto quimioterapeútico y se estudia el efecto sobre la apoptosis con los métodos de acuerdo con la invención. En especial es tarea de una selección de ese tipo, el determinar el efecto sinergístico entre la inhibición, esto es la falta de la función del factor de sobrevivencia en las células de tumores y los gumioterapeúticos o las substancias potencialmente efectivas como guimioterapeúticos . Para encontrar con el procedimiento de selección substancias que presenten la sinergia con la inhibición e la función del factor de sobrevivencia específica para ciertos tipos de tumores, pueden utilizarse en una selección paralela, células de prueba que se hayan derivado de diferentes tipos de tumores bajo condiciones experimentales por lo demás idénticas . Como células de control para la especificidad del efecto sinergístico entre la ausencia de la función del factor de sobrevivencia y la quimioterapia, se utilizan células a las cuales de manera natural les falta aquella función del factor de sobrevivencia cuya inhibición debe ser determinada en el ensayo.

Sin embargo, también es posible buscar substancias que aumenten el efecto de las moléculas inductoras o amplificadoras de la apaptosis. Ejemplos de esto, son los miembros de la familia de receptores TNF (receptores TNF, Fas) , y moléculas de sus vías de transmisión de señales (caspasen) . El principio de prueba es idéntico al de los factores de sobrevivencia reductores de la apoptosis, con la diferencia de que en las células de tumores se expresan las versiones tipo nativo o constructivamente activas de esas moléculas de apoptosis. El punto difícil del uso en el procedimiento de selección, es por lo tanto la búsqueda de sinergias que conduzcan a una amplificación de la apoptosis de las células de tumores . Así se produce la provisión para terapias en las cuales con simultánea inhibición de la función de sobrevivencia de las células de tumores, puede reducirse de manera significante la dosis de quimioterapeúticos sin que se perjudique el resultado de la terapia. La reducción de la dosis quimioterapéutica da a los pacientes ventajas decisivas, ya que con esto pueden reducirse ampliamente las reacciones secundarias tóxicas de la quimioterapia. En el marco de la presente invención, se estudió con la ayuda de los métodos de acuerdo con la invención, si la señal producida por el factor de sobrevivencia IGF-II, que produce la sobrevivencia de las células tumorales ß, es producida por el receptor IGF. Para este fin, el ADN codificante a una versión dominante negativa del receptor IGF-1 humano (dn IGF-IR) que presenta una sustitución aminoácida en el punto de unión ATP (28) , se transfecta transitoriamente en células tumorales ß tipo nativo con un plásmido que porta la proteína de- fluorescencia verde (eGFP) . Las células se incubaron con estímulos apoptoticos y/o factores de crecimiento, se cultivaron, se fijaron y se tiñeron con yoduro de propilio para determinar el contenido de ADN. Por medio de análisis facs, se determinaron células individuales transfectadas que expresan eGFP y en esa población se identificaron las células apoptóticas por medio de su contenido de ADN menor a 2N. Se mostró que la transíección con plásmidos gue codifican a dnIGF-lR tiene por consecuencia un aumento dramático de la apoptosis, tanto en células tumorales ß tipo nativo sin tratar como también en las tratadas con daunomicina o eutoposin. Se determinó gue dnIGF-lR amplifica la apoptosis en las células tumorales ß casi con la misma eficiencia gue la proteína E1A, uno de los productos genéticos inductores de apoptosis más potente. Así, con la ayuda de los métodos de ensayo de acuerdo con la invención, pudo mostrarse gue las células tumorales reaccionan de manera sensible a los estímulos apsptoticos cuando la transmisión de señal IGF-1R está interrumpida y que similarmente a las células tumorales deficientes de IGF-II, presentan una mayor sensibilidad frente a los quimioterapeúticos . Aclemás, con los métodos de acuerdo con la invención, pudo determinarse si los genes conocidos modulan la apoptosis en diferentes tipos de células y en que medida. Otro uso de los métodos de acuerdo con la invención, es la clonación de expresión de genes que modulan la apoptosis. Para esto se transfecta en las células una librería de expresión cADN completa de manera transitoria. El método de acuerdo con la invención está en la posición de medir la influencia de la expresión genética en el transcurso de 24 a 48 horas, también es posible analizar células y aislarlas todavía vivas . Para estas aplicaciones se realiza una modificación del método, en la cual las células individuales que se derivan de una base de apsptosis determinada se aislan por medio de distribución Facs. Los plásmidos transfectados en esas células se aislan, amplifican y en rondas posteriores de transfección se seleccionan. Los plásmidos que contienen un gen modulador de la apoptosis, se aislan de esa manera. Los genes correspondientes se caracterizan entonces por medio de secuenciación y estudios posteriores de expresión y función.

Para validar los métodos de acuerdo con la invención, se utilizaron en el ejemplo 1, primero linajes celulares de tumores estabilizadas que por un lado habían sido transfectadas con un plásmido GFP y por otro lado con un plásmido que contenía una secuencia genética pro-apoptotica o anti-apoptotica, o con un plásmido de control. Subsecuentemente a la transfección, se trataron las células después de un período de reposo, con un estimulo de apoptosis (las células de control no fueron tratadas) . A continuación, se recolectaron las células disueltas y se purificaron, lavaron y fijaron con células adherentes tripsinadas. Después del subsecuente lavado se dividieron las células para permitir una comparación del método de acuerdo con la invención, con el método TÚNEL habitual que utiliza Cy5-dCTP fluorescente (5-amino-propargil-2 ' -desoxisitidina 5' -trifosfato acoplado a un colorante fluorescente Cy5) . Se mostró que el método de acuerdo con la invención, determina de manera confiable el efecto esperado pro-anti-apoptosis del producto genético y que la adición del estimulo de apoptosis amplifica el efecto observado, también cuando la sensibilidad del método de acuerdo con la invención bajo ciertas condiciones era algo menor que el método TÚNEL, el valor de apoptosis normalizado, expresado como la proporción del valor de apoptosis máximo obtenido con el gen pro-apoptosis del ensayo en cuestión, casi era idéntico. Frente al método TÚNEL, el método de acuerdo con la invención presenta la ventaja de la rapidez, sencillez y economía . La amplia aplicación así como la confianza de los métodos de acuerdo con la invención, se comprueba utilizando un linaje celular de fibroblastos de rata no transformados, que reaccionan menos a los estímulos de apoptosis que las linajes celulares tumorales estabilizadas. El método de acuerdo con la invención permite, el determinar de manera rápida, efectiva y reproducible, el papel potencial de un producto genético en la apoptosis. La invención se refiere en otro aspecto a un equipo para la realización fácil y rutinaria del procedimiento . Un equipo de ese tipo, presenta ventajosamente en varios recipientes separados los siguientes componentes : a) uno o varios componentes requeridos para la transfección; b) un plásmido gue contiene la secuencia codificante a la proteína marcadora fluorescente; c) un vector vacío para insertar la secuencia de ADN de interés así como para las mediciones de control; d) la solución de fijación primaria, por ejemplo solución de paraformaldehido; e) la solución de psst-fijación/permeabilización, por ejemplo 70% de etanol; f) soluciones de lavado; g) un colorante que se ligue al ADN. Preferentemente el equipo contiene como componentes de transfección adenovirus inactivados con polietilenimida y psoral en/UV. Ejemplo 1 Para este ejemplo se utilizaron linajes celulares tumorales estabilizados (ßTC y ßHC) , derivados de tumores de célula ß (15) de ratones transgénicos, en los cuales la región reguladora del gen de insulina (Rip) inducen específicamente la expresión de los grandes antígenos T de los virus de simios 40 (Tag) en las células ß de islas pancreáticas (16) . Aproximadamente 80000 células se colocaron en una cavidad de 6 cm de una placa de cultivo con 6 cavidades y cultivaron en DMEM, complementado con 10% FCS (v/v) , 2 mM glutamina, 100 unidades internacionales de penicilina y 100 µg/ml estreptomicina, hasta una confluencia del 70%. Las células se transfectaron con 1 µg de un plásmido gue codifica a eGFP ("enhanced GFP"; pEGFP-Cl; Clontech) junto con 1 µg de un plásmido de control (pMEX; (22) ) , un plásmido pCMV gue contiene el gen de adenovirus pro-apoptosis E1A o un plásmido pCMV, gue contiene el gen de adenovirus- anti-apoptótico E1B-19 (17,18) utilizando 10 µl de lipofectAMINE (GIBCO-BRL) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante- Después de la transfección se dejaron reposar las células durante 16 horas en u medio completo, a continuación las células se dejaron sin tratar o se trataron con un estimulo apoptótico (800 ng/ml de estauporina; Sigma) (19,20) durante otras 16 horas. 32 horas después de la transfección se triptisinaron las células disueltas, las células adherentes se purificaron, se lavaron dos veces con 4 ml de PBS y se fijaron a la temperatura ambiente durante 30 minutos (2% parformaldehido, NaCl 100 mM, sacarosa 300 mM, MgCl2 3 mM, EGTA 1 mM (ácido etilenglicol-bis- (2-aminoetil) -tetraacético) , PIPES lO M (ácido piperazina-N^-bis [z-etansulfónico] ) ph 6.8). Entonces se lavo dos veces con 4 ml de PBS y se fijo posteriormente durante 14 horas en 70% EtOH helado. Después de la fijación se lavaron las células dos veces con 4 ml de PBS y se dividieron. Una mitad de la muestra se trató con RNasa A (Sigma, St. Louis, US) (50 µg/ml) en PBS durante 30 minutos, se lavo dos veces con PBS y 30 minutos antes del análisis FACS se tiñó con yoduro de propidio en PBS (Pl; 50 µg/ml; Sigma, St . Louis, US). La otra mitad de la muestra se incubó con 50 µl de mezcla de reacción TdT (desoxinucleoitidiltransferasa terminal; Boehringer Mannheim; cacodilats de potasio 200 mM; Tris-HCl mM pH 6.6, 0.25 mg/ml de albúmina de suero de res, l mM CoCl2; 0.25 nmol fluoroLink Cy5AP3-dCTP [Amersham], 12.5 unidades TdT) , durante 1 hora a 37°C, se lavo dos veces con 4 ml de PBS, se trató con RNasa en PBS (50 µg/ml) durante 30 minutos, se lavo dos veces con 4 ml de HBS ( a partir de este paso se utilizo HBS , porgue DAPI en PBS tiende a provocar microprecipitados) , con DAPI en HBS (10 µg/ml; Sigma) teñido durante 20 minutos y se analizo en un aparato FACS Vantage de Becton Dickinson. Los análisis FACS de las células teñidas con Pl se realizó en un aparato FACScan de Becton Dickinson, gue estaba eguipado con el llamado "doublet discriminatión module", con el cual los agregados celulares son discriminador por medio de la longitud de pulso. El resultado de las pruebas se representa en la figura 1 . L figura 1A muestra el numero de células de tumores apoptóticas SHC 13T (%apoptosis) en toda la población celular eGFP-positiva. Las barras negras muestran la determinación del contenido de sub-2N ADN (GFP/PI) ; las barras blancas la formación de Cy5AP3-dCTP durante la reacción TdT (GFP/TUNEL) . La adición de estaurosporina se da. Se utilizó una longitud de onda de exitación de 488 nm para eGCP y Pl, un longitud de onda de exitación de 647 nm para Cy5 y UV en una rango de longitud de onda de 51-364 nm para DAPI . La fluorescencia de emisión se recolectó bajo el uso de un filtro de banda angosta de 530/20 nm para eGFP, un filtro de blogueo de 610 nm para Pl, un filtro de banda angosta de 675/20 nm para Cy5 y un filtro de banda angosta de 424/44 para DAPI . Las dupletas se excluyeron por medio de procesamiento de pulsos. Las células gue expresaban eGFP se seleccionaron y se analizaron por fluorescencia Cy5 o Pl . Los datos se analizaron con la ayuda del Software CELLQuest (Becton Dickinson) . Cada barra representa el promedio de 3 transfecciones, las desviaciones estándar se muestran por medio de barras de error. Cada medición abarcó 40,000 resultados totales, seleccionados de acuerdo con el tamaño y las células individuales. La eficiencia de transfección fue de 20-30%. La figura IB muestra el porcentaje normalizado de la apoptosis para diferentes construcciones. El índice de apoptssis se normalizo utilizando la siguiente función: (% apoptosis en x/% apoptosis en eGFP/Cl/ElA) x 100. El índice apoptótico se normalizo para cada método de determinación utilizado y para cada post-tratamiento de transfección (+/-estaurosporina) . Ejemplo 2 En este ejemplo se utilizo'' un linaje células de fibroblastos de rata no transformado de la denominación RatlA. Las células se transfectaron transitoriamente, con lo cual se utilizaron, como se describe en el ejemplo 1, ya sea LipofectAMINE o complejos pslietilenimin(PEl 2000) -ADN- adenovirus (WO 93/07283) . Por lo demás se procedió exactamente igual como se describe en el ejemplo l, en lo gue se refiere al tratamiento de las células y la determinación de la apoptosis por medio del procedimiento de acuerdo con la invención por un lado y por otro lado por medio del método TÚNEL. La comparación de los diferentes métodos de transfección y los métodos de medición de apoptosis se representa en la tabla. Cada valor representa le promedio de 3 transfecciones; la desviación estándar se da (d.e.) . La eficiencia en los métodos de transfección fue de 25-30%. Ejemplo 3 En este ejemplo se utilizaron células tumorales ß tipo nativo (15) . La construcción receptora IGF-1 dominante negativa, gue se encuentra bajo el control del promotor CMV y en la cual el codón 1003 en la posición de enlace ATP está mutado de lisina a alanina, fue descrita por (28) . Como se describe en los ejemplos anteriores, se colocaron células tumorales ß tipo nativo a una densidad de 80,000 células por triplicado en placas de cultivo con 6 cavidades. 24 horas después se co-transíectaron las células con pEGGFP-Cl y un plásmido de control (figura 2; pMEX/ctr) o con pEGFO-Ci y un plásmido de expresión gue codifica ya sea al adenovirus E1A (figura 2; E1A) , adenovirus E1B-19K (figura 2: E1B-19K) o el IGF-1R dominante negativo. 36 horas después de la transfección se agrego daunomicina (figura 2: barras rayadas) o etoposid (figura 2; barras blancas) al medio de cultivo con una concentración de 1 µM o 19 µM. Las células transfectadas pero sin tratamiento se representan en la figura 2 por medio de barras negras. 12 horas después del tratamiento con daunomicina o etoposid, las células fueron cultivadas, fijadas y tratadas con yoduro de propidio, como se describe en los ejemplos anteriores. La determinación de las células apopticas se realizó igualmente con los métodos antes descritos . Para cada medición se colectaron 40,000 eventos; la eficiencia de trasfección fue de 25-30%. La desviación estándar se muestra por medio de las barras de error. Tabla 2S Literatura Kbrsmeyer, S. ". (1995) Trends Genet, 11 (3), 101-105. Chinnaiyan, A. M. and Dixit, V. M. (1996) Current Biology, 6 (5), 555-562. Vaux, D. L. and Strasser, A. (1996) Proc Nati Acad Sci U.S. ., 93 (6), 2239-2244. White, E. (1996) Genes Dev, 10 (1), 1-15. Kerr, J. F. R., Gobe, G. C . , Winterford, C. M. and Harmon, B. V. (1995) In Schwartz, L. M., and Osborne, B. A. (eds.), Cell Death. 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Claims (10)

-• -REGTNDICACIT ES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1.- Procedimiento para la medición de la apoptosis, caracterizado porque: A) una población de células de animales mamíferos se transfecta de manera transitoria ai) con un plásmids que contiene una secuencia de ADN de interés, de la cual debe determinarse si el polipéptido expresado tiene un efecto pro- o anti-apoptótico, aii) o con un plásmido que contiene una secuencia de ADN de interés, de la cual debe determinarse si o por medio de gue sustancias puede modularse su efecto pro- o anti- apoptótico o el efecto del polipéptido así expresado, b) y con un plásmido gue contiene un ADN codificante a una proteína marcadora fluorescente, B) las células se incuban en un medio nutritivo, eventualmente en la presencia de una substancia de prueba, hasta que la secuencia de ADN o el polipéptido expresado de interés, haya ejercido su efecto potencial sobre la apoptosis, C) las células se cosechan y se fijan de tal forma gue la proteína fluorescente permanece en las células, mientras gue los fragmentos de ADN formados durante la apoptosis pueden difundirse de las células,

D) por- medio del medición del contenido de ADN se determina la fracción de células apoptóticas, E) por medio de la medición de las células con proteínas marcadoras fluorescentes se determina la fracción de células transfectadas, F) y por medio de la comparación de los valores obtenidos en las etapas" D y E se determina la fracción de células apoptóticas en la subpoblación transfectada de las células. 2.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación l, caracterizado porgue la transfección de las células se realiza con polietilenimina y adenovirus inactivadas.

3.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porgue el polipéptido fluorescente definido en A b) es la proteína fluorescente verde .

4.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porgue se mide el contenido de ADN con un colorante ligante de ADN.

5.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porgue el colorante es yoduro de propidio.

6. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porgue, se realiza la incubación de acuerdo con la etapa B) en la presencia de una substancia de prueba.

7.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porgue se realiza la incubación en la presencia de una substancia gue estimula la apoptosis.

8. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por la fijación primaria en la etapa C con paraformaldehido y una fijación secundaria/permeabilización de las células con etanol.

9. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones l a 8, caracterizado porque en las etapas D y E se realizan mediciones en una etapa por medio de análisis de citometría de flujo activada fluorescentemente.

10.- Equipo para la realización del procedimiento de acuerdo con la reivindicación l, caracterizado porgue contiene en varios recipientes diferentes los siguientes componentes : a) uno o varios componentes requeridos para la transfección; b) un plásmido que contiene la secuencia codificante a la proteína marcadora fluorescente ; c) un vector vacío para insertar la secuencia de ADN de interés así como para las mediciones de control; d) la solución de fijación primaria, por ejemplo solución de paraformaldehido; e) la solución de post-fijación/ permeabilización, f) soluciones de lavado; g) un colorante que se ligue al ADN. 11 * " Hj-dpo efe acuaxb con la reivij?- carhi?i 10, caracbadz-riD perqué contiene como componente a) polietilenimina y adenovirus psoral/inactivado con UV. 12 * " Tr tirr> de acuarb con la reivip?caric ID, caracterizacb porque contiene como componente b) un plásmido codificante a la proteína fluorescente verde. 13 • " Bjripo efe aa-Erdb con la reivi?x-ti-3a?? 10, caracterizada perqué contiene como componente d) una solución a aproximadamente el 2% de paraformaldehido y como componente a) etanol a aproximadamente el 70%, 14. - Uso de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para la identificación de substancias las cuales modulan el efecto por- o anti-apoptótico de los genes o los productos genéticos . 15. - Uso de acuerdo con la reivindicación 14 para la identificación de substancias terapéuticamente efectivas que presentan un efecto sinergístico con la inhibición o la falta de la función del factor de sobrevivencia de las células tumorales, caracterizado porque, las células son células tumorales, porque la secuencia ADN de acuerdo con aii) codifica a una versión dominante negativa de un receptor para un factor de sobrevivencia propio de la célula tumoral o una molécula de transferencia de señales de un receptor de ese tipo y porque las células se incuban en la presencia de la substancia de prueba. 16.- Uso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia de ADN de acuerdo aii) codifica a una versión dominante-nega iva del receptor IGF- 1. 17.- Uso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia de ADN de acuerdo con aii) codifica a una versión dominante-negativa de un receptor FGF. 18.- Uso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia de ADN de acuerdo con aii) codifica a una versión dominante-negativa de un receptor PDGF.