MXPA00004460A - Proceso para producir formulaciones de trioxido de arsenico y metodos para el tratamiento de cancer utilizando trioxido de arsenico o melarsoprol - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de compuestos de arsénico para tratar una variedad de tumores, de leucemia, linfoma y tumores sólidos. Además, los compuestos de arsénico pueden ser utilizados en combinación con otros compuestos terapéuticos, como un retinoide. La invención también proporciona un proceso para producir formulaciones de trióxido de arsénico.

Description

PROCESO PARA PRODUCIR FORMULACIONES DE TRIÓXIDO DE ARSÉNICO Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER UTILIZANDO TRIÓXIDO DE ARSÉNICO O MELARSOPROL 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los métodos y composiciones para el tratamiento de leucemia, linfo a y algunos otros cánceres. Más específicamente, la presente invención se refiere a los usos novedosos de trióxido de arsénico y un compuesto orgánico de arsénico para el tratamiento de leucemia aguda y leucemia crónica. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 2.1. CÁNCER El cáncer se caracteriza principalmente por un aumento en el número de células anormales derivadas de un tejido normal determinado, la invasión de tejidos adyacentes por estas células anormales y la propagación linfática o transportada por la sangre de células malignas a los ganglios linfáticos de regiones y sitios distantes (metástasis) . Los datos clínicos y los estudios biológicos moleculares indican que el cáncer es un proceso de múltiples pasos que comienza con cambios pre-neoplásticos menores, que bajo ciertas condiciones progresa a neoplasia.

El crecimiento de células anormales premalignas como se ejemplifica por la hiperplasia, metaplasia y displasia (para fll una revisión de estas condiciones de crecimiento anormales véase Robbins y Angelí, 1976, Basic Pathology, 2a edición, 5 . B. Saunders Co., Philadelphia, páginas 68-79) precede a la formación de una lesión neoplástica. Una lesión neoplástica puede evolucionar en una forma clonal para crecer en un tumor sólido y desarrollar cada vez mayor capacidad de invasión, crecimiento, metástasis y heterogeneidad especialmente bajo condiciones en la que las que las células neoplásticas escapan de la vigilancia inmune del hospedero (Roitt, I., Brostoff, J y Kale, D., 1993, Immunology, 3a edición., Mosby, St. Louis, pps . 17.1-17.12). La leucemia se refiera a neoplasmas malignos de los tejidos que forman la sangre. La transformación en malignidad por lo común ocurre en una célula individual a través de dos o más pasos con proliferación subsiguiente y expansión clonal. En algunas leucemias, las translocaciones cromosómicas específicas han sido identificadas con morfología de células leucémicas consistentes y características clínicas especiales (por ejemplo, las translocaciones de 9 22 en leucemia mielocítica crónica, y de 5 y 17 en leucemia promielocítica aguda) . Las leucemias agudas son poblaciones de células principalmente no diferenciadas y las leucemias crónicas formas de células más maduras. Las leucemias agudas se dividen en tipos linfoblástico fl) (ALL) y no linfoblástico (ANLL) . Estas pueden ser además ' subdivididas por su apariencia morfológica y citoquímica de acuerdo con la clasificación del French-American-Britsh (FAB) o de acuerdo con su tipo y grado de diferenciación. El uso de anticuerpos monoclonales de células B y T y de antígeno mieloide específicos son más útiles para la clasificación. El tipo ALL es predominantemente una enfermedad de la niñez que se establece por hallazgos de laboratorio y examen de médula ósea. La ANLL, también conocida como leucemia mieloblástica aguda (AML) , ocurre en todas las edades y es la leucemia agua más común entre los adultos; es la forma comúnmente asociada con irradiación como agente causal. Las leucemias crónicas se describen como siendo linfocíticas (CLL) o mielociticas (CML) . La CLL se caracteriza por la aparición de linfocitos maduros en la sangre, médula ósea y órganos linfoides. El sello distintivo de la CLL es linfocitosis sostenida, absoluta (> 5,000/µL) y un aumento de linfocitos en médula ósea. La mayoría de los pacientes con CLL también tienen expansión clonal de linfocitos con características de células B. La CLL es una enfermedad de personas mayores. En la CML, la característica es la predominancia de células granulocíticas de todas las etapas de diferenciación en la sangre, médula ósea, hígado, bazo y otros órganos. El paciente sintomático en el diagnostico, la cuenta total de total de WBC es por lo común cerca de 200,000/üL, pero puede alcanzar 1, 000, 000/µL. La CML es relativamente fácil de diagnosticar por la presencia de cromosoma de Philadelphia. La naturaleza del cáncer hematopoyético necesita el uso de quimioterapia sistémica como la modalidad de tratamiento primero. Los medicamentos seleccionados de acuerdo con las sensibilidades de las leucemias específicas por lo común se administran en combinación. La terapia de radiación puede ser utilizada como un adjunto para tratar acumulaciones locales de células leucémicas. Rara vez se indica la cirugía como una modalidad de tratamiento primario, pero puede ser utilizada en el manejo de algunas complicaciones. En ocasiones se indica transplante de médula ósea de un hermano con igual HLA. 2.2. EL ARSÉNICO Y SUS USOS MÉDICOS El arsénico ha sido considerado como un veneno y un medicamento durante largo tiempo en las prácticas médicas Occidentales y Chinas. En la última parte del siglo XIX el arsénico fue utilizado con frecuencia en intentos por tratar enfermedades de la sangre en el Oriente. En 1878, se reportó que el tratamiento de un paciente leucémico con solución de Fowler (una solución que contiene arsenito de potasio, valencia +5) redujo notablemente la cuenta de leucocitos en la sangre (Cutler y Bradford, Am. J. Med. Sci., enero 1878, 81-84) . Otros aspectos en el uso de la solución de Fowler como agente paliativo para tratar leucemia mielógena crónica (CML) se describió por Forkner y Scott en 1931 (J. Am. Med. Assoc. , 1931, iii, 97), y después se confirmo por Stephens y Lawrence en 1936 (Ann. Intern. Med. 9, 1488-1502) . No obstante, aunque el (los) ingrediente (s) químico activo de la solución de Fowler no fue determinado, su toxicidad fue bien reconocida. La solución de Fowler fue administrada estrictamente como una composición oral, y fue administrada a pacientes leucémicos como una solución hasta el nivel de deprimir los leucocitos hasta una concentración aceptable y hasta desarrollar toxicidades (como puede ser queratosis e hiperpigmentación de la piel) , mientras los pacientes disfrutaron de diferentes periodos de remisión. En los años de 1960, la solución de Fowler fue todavía utilizada ocasionalmente en intentos por tratar CML, no obstante, la mayoría de los pacientes con CML fueron tratados con otros compuestos quimioterapéuticos, como puede ser busulfan, y/o terapia de radiación (Monfardini y col., Cáncer, 1973, 31: 492-501) . Paradójicamente, uno de los efectos reconocidos durante largo tiempo de la exposición al arsénico, ya sea de fuente ambiental o médica, es el cáncer de piel (Hutchinson, 1888, Trans. Path Soc. Lond., 39: 352; Neubauer, 1947, Br. J. Cáncer, 1: 192) . Hubo datos aún epidemiológicos que sugieren que el uso de la solución de Fowler durante periodos prolongados puede originar una incidencia incrementada de cáncer en sitios internos (Cuzick y col., Br. J. Cáncer, 1982, 45: 904-911; Kaspar y col., J. Am. Med. Assoc, 1984, 252: 3407-3408). La carcinogenicidad del arsénico desde entonces ha sido demostrada por el hecho que éste puede inducir aberración cromosómica, amplificación del gen, intercambios de cromátidas hermanas y transformación celular (véase, por ejemplo, Lee y col., 1988, Science, 241: 79-81; y Germolec y col., Toxicol. Applied Pharmacol., 1996, 141: 308-318) . Debido al efecto carcinogénico conocido del arsénico, su uso solo terapéutico en humanos en la medicina occidental actual es en el tratamiento de enfermedades tropicales, como puede ser la tripanosomiasis africana (el arsenical orgánico, melarsoprol; véase Gooman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a edición, capítulo 66, 1659-0662, 1997). En la medicina China tradicional, el ácido arsenioso o la pasta de trióxido de arsénico ha sido utilizada para tratar enfermedades de la médula dental, soriasis, sífilis y reumatosis (Chen y col., 1995, en Manual of Clinical Drugs, Shanghai, China, Shanghai Institute of Science and Technology, página 830) . En la década de 1970, el trióxido arsénico ha sido aplicado experimentalmente para tratar leucemia promielocítica aguda (APL) en China (comentado por Mervis, 1996, Science, 273: 578). La eficacia clínica del trióxido de arsénico recientemente ha sido reinvestigada en 14 de 15 pacientes con APL refractaria, donde el uso de una dosis intravenosa de 10 mg/día durante 4-9 semanas fue reportado con un resultado de remisión morfológica completa sin supresión de médula ósea asociada (Shen y col., 1997, Blood, 89: 3354-3360) . También se demostró que el trióxido de arsénico indujo apoptosis (muerte de células programada) in vi tro en células NB 4, una línea de células APL, y que la apoptosis estuvo aparentemente asociada con inactivación del oncogén bcl-2, y redistribución intracelular de la proteína PML/RARa quimérica que son únicas para las células APL (Chen y col., 1996, Blood, 88: 1052-1061; Andre y col., 1996, Exp. Cell. Res. 229: 253-260) . Se ha reportado que la actividad biológica de arsénico se debe a la capacidad del arsénico para dirigir la fracción neoplásmica de PML a los cuerpos nucleares para la degradación (Zhu y col., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci., 94: 3978-3983). Aunque se conoce que el arsénico es un veneno y un compuesto carcinogénico, han habido muchos reportes concernientes al uso del arsénico en tratamiento médico. Además, a partir de la descripción anterior, debe ser evidente que hay muchos tipos diferentes de leucemias, cada una de las cuales requiere un protocolo de tratamiento único que se modifique de acuerdo con la presencia de factores que predigan algún riesgo de falla del tratamiento. Así, es extremadamente necesario el desarrollo de un amplio espectro de agente antileucemia que puedan ser utilizados solos o en combinación con otros medicamentos existentes. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN A pesar de los reportes contrarios en la técnica relacionados con los beneficios y riesgos de la administración de arsénico a pacientes, los solicitantes han descubierto que el trióxido de arsénico y el arsenical orgánico, melarsoprol, tienen amplia aplicabilidad en el tratamiento de diferentes tipos de leucemias, linfomas y tumores sólidos. La invención que se describe en la presente comprende un método de tratamiento de leucemia, linfoma o tumores sólidos consistiendo en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de trióxido de arsénico o melarsoprol a un humano en necesidad de tal tratamiento. La invención, como ya se mencionó también comprende el uso de tratamiento en combinación para tratar leucemia, especialmente leucemias que son refractarias a otras formas de tratamiento.

La invención también comprende un método para la fabricación de las composiciones farmacéuticas conteniendo trióxido de arsénico. De acuerdo con la presente invención, el trióxido de arsénico o compuestos melarsoprol pueden ser utilizados solos o en combinación con otros compuestos terapéuticos (incluidos los quimioterapéuticos, radioprotectores y radioterapéuticos) o técnicas para mejorar la calidad de vida de los pacientes, o para tratar leucemia, el linfoma o tumor sólido. Los compuestos de arsénico pueden ser utilizados antes, durante o después de la administración de uno o más compuestos quimioterapéuticos conocidos, incluidos los compuestos antitumor. Además, los compuestos de arsénico pueden ser utilizados antes, durante o después del tratamiento de radiación. Las composiciones farmacéuticas de la invención son soluciones estériles adecuadas para inyección intravenosa o infusión. En otra modalidad, la invención comprende una composición adecuada para suministro oral; conteniendo trióxido de arsénico o melarsoprol y un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención también incluye composiciones adecuadas para suministro tópico o transdérmico, incluido pero no limitado a los métodos iontoforéticos. La invención también proporciona los regímenes terapéuticos específicos, las composiciones farmacéuticas y los kits para el tratamiento. Las composiciones particulares de la invención y sus usos están descritas en las secciones y subsecciones siguientes . 4. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos y composiciones para el tratamiento de leucemia, linfoma o tumores sólidos están descritos en la presente. Esta invención ofrece un método de tratamiento de leucemia aguda o crónica, linfoma o tumores sólidos en un humano, el cual consiste en administrar a un humano en necesidad de tal tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de uno o más compuestos de arsénico, como puede ser el trióxido de arsénico o melarsoprol. La invención también incluye un método de tratamiento de leucemia en un humano que se ha vuelto refractaria a otras formas de tratamiento, el cual consiste en administrar a un humano trióxido de arsénico o melarsoprol, en combinación con otro compuesto quimioterapéutico, por ejemplo, el ácido retinóico todo trans (ATRA) . La invención también se refiere a un método para la fabricación de las composiciones farmacéuticas conteniendo trióxido de arsénico. Se prefiere que las composiciones farmacéuticas de la presente invención presenten toxicidad reducida, mejor eficacia, mejor estabilidad durante el almacenamiento y uso y que la composición tenga un pH fisiológicamente aceptable. 4.1 LOS COMPUESTOS DE ARSÉNICO Como se utiliza en la presente, "compuesto de arsénico" se refiere a una forma farmacéuticamente aceptable del trióxido de arsénico (AS-9O3) o melarsoprol. El melarsoprol es un compuesto de arsénico orgánico que puede ser sintetizado acomplejando óxido de melarsen con dimercaprol o adquirido en forma comercial (Arsobal® de Rhone Poulenc Rorer, Collegevile, PA) . Dado que las materias primas no farmacéuticamente formuladas de la invención son bien conocidas, estas pueden ser preparadas a partir de las técnicas químicas bien conocidas. (Véase, por ejemplo, Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology 4a edición, volumen 3 páginas 633-655 John Wiley y Sons) . Como se utiliza en la presente, los términos "un agente terapéutico", "régimen terapéutico", "radioprotector", "quimioterapéutico" significan medicamentos tradicionales y tratamientos con medicamentos, incluidas las vacunas, para tratar cáncer, infecciones virales y otras malignidades que son conocidas por los expertos en la técnica. Los compuestos "radioterapéuticos" son bien conocidos en la técnica. De acuerdo con la presente invención, los compuestos de trióxido de arsénico o melarsoprol pueden ser utilizados solos o en combinación con otros compuestos terapéuticos conocidos (incluidos los quimioterapéuticos, radioprotectores y radioterapéuticos) o técnicas para mejorar la calidad de vida del paciente, o para tratar leucemia, linfoma o tumor sólido. Por ejemplo, los compuestos de arsénico pueden ser utilizados, antes, durante o después de la administración de uno o más compuestos antitumor conocidos incluidos, pero no limitados a compuestos de mostaza, mostaza nitrogenada, clorambusil, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, floxuridina, metotrexato, vincristina, vinblastina, taxol, etoposide, temiposide, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, nitomicina, cisplatino, carboplatino, fosfato de estramustina, hidroxiurea, BCNU, procarbazina, VM-26, interferones y ácido retinóico todo trans (ATRA) , u otros retinoides (véase, por ejemplo, the Physician Desk References 1997). Además, los compuestos de arsénico pueden ser utilizados antes, durante o después del tratamiento por radiación. En una modalidad específica, el compuesto de arsénico de la invención y ATRA pueden ser administrados como una mezcla. En los aspectos preferidos, el linfoma, leucemia o tumor sólido en el humano tratado por la combinación es refractario a los métodos de tratamiento generales, o es un caso de leucemia en recidiva. Es posible utilizar cualquier modo de administración adecuado de acuerdo con la presente invención, incluida, pero no limitada a administración parenteral como puede ser la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular e intratecal; administración oral e intranasal, e inhalación. El modo de administración variará de acuerdo con el tipo de cáncer y el estado del humano. Las composiciones farmacéuticas para ser utilizadas pueden ser en la forma de soluciones acuosas u orgánicas estériles, suspensiones coloidales, grageas, tabletas y cápsulas. 4.2. MÉTODOS DE TRATAMIENTO El término "un método para el tratamiento de leucemia" como se utiliza en la presente significa que la enfermedad y los síntomas asociados con la enfermedad se alivian, reducen, curan o se ponen en un estado de remisión. Por ejemplo, los métodos de tratamiento de la invención pueden reducir la cuenta de leucocitos o reducir la linfocitosis en un humano bajo tratamiento. El término "un método para el tratamiento de linfoma" como se utiliza en la presente significa que la enfermedad y los síntomas asociados con la enfermedad se alivian, reducen, curan o se ponen en un estado de remisión.

El término "un método para el tratamiento de tumor sólido" como se utiliza en la presente significa que la enfermedad y los síntomas asociados con el tumor sólido se alivian, reducen, curan o se ponen en un estado de remisión. Además, el término "un método para el tratamiento de infiltración leucémica" significa que la infiltración de las células leucémicas fuera de la circulación y hacia otros órganos y sistemas y los síntomas asociados con tal infiltración se alivian, reducen, curan o se ponen en un estado de remisión. El término "refractario" cuando se utiliza en la presente significa que la leucemia es generalmente resistente al tratamiento o curación. Como se utiliza en la presente, células "preneoplásticas" se refiere a una célula que esta en transición de una forma normal a una neoplástica; o células que no se diferencian normalmente; y la evidencia morfológica, cada vez más apoyada por estudios biológicos moleculares, indica que la preneoplasia progresa a través de etapas múltiples. En una modalidad, la invención ofrece un método para el tratamiento de leucemia en un humano, consistiendo en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de trióxido de arsénico o melarsoprol al humano. La invención también proporciona un régimen de dosificación con base en el peso, no descrito hasta ahora, que aumenta al máximo la seguridad en humanos de estos compuestos de otro modo altamente tóxicos. El trióxido de arsénico (As203) inhibe el crecimiento e induce apoptosis en células leucémicas promielocíticas agudas NB4. La leucemia promielocítica aguda (APL) esta asociada con la translocación t (15; 17), la cual genera una proteína de fusión PML/RARa entre PML, un supresor del crecimiento localizado en los cuerpos asociados con la matriz .nuclear y RARa, un receptor nuclear para ácido retinóico (RA) . La PML/RARa fue propuesta para bloquear la diferenciación mieloide a través de la inhibición de la respuesta del receptor nuclear, como un mutante de RARa negativo, dominante. Además, en células APL, la PML/RARa desplaza los antígenos PML y otros cuerpos nucleares (NB) en micro-manchas nucleares, probablemente dando origen a la pérdida de las funciones del PML y/o NB. Se ha sugerido que las altas concentraciones de trióxido de arsénico favorecen la apoptosis, mientras que las bajas concentraciones inducen diferenciación parcial en células NB4 así como en células provenientes de pacientes con APL. Se postulo que el As203 funciona a través de su capacidad para hacer específicamente que la PML-RARa en células APL sea re-localizada a los cuerpos nucleares para la degradación (Zhu y col., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 3978-3983). No obstante, estos hallazgos tienden a limitar el uso de trióxido de arsénico a un subconjunto de leucemias. Véase Konig y col., 1997, Blood, 90: 562-570. De manera inesperada, los inventores han descubierto que tanto el As203 y melarsoprol son capaces de inhibir el crecimiento de células, e inducen apoptosis en diferentes líneas de células de leucemia mieloide en una forma independiente de PML y MPL/RARa. Así, los inventores han descubierto que, contrario a los hallazgos previos, el trióxido de arsénico y melarsoprol ambos son eficaces contra una amplia gama leucemias sin importar el mecanismo molecular subyacente que cause la neoplasia. Los ejemplos de trabajo del efecto de los compuestos de arsénico en un número de líneas de célula leucémicas se proporcionan en las secciones 5.1 y 5.2 Por consiguiente, los compuestos de arsénico de la presente invención pueden ser utilizados contra una variedad de leucemias, que incluye pero no se limita a: Leucemia linfoblástica aguda (ALL) Leucemia de células B linfoblástica aguda Leucemia de células T linfoblástica aguda Leucemia mieloblástica aguda (AML) Leucemia promielocítica aguda (APL) Leucemia monoblástica aguda Leucemia eritroleucémica aguda Leucemia megacarioblástica aguda Leucemia mielomonocítica aguda Leucemia no diferenciada aguda Leucemia mielocítica crónica (CML) Leucemia linfocítica crónica (CLL) Los expertos reconocerán que otras leucemias pueden ser tratadas de acuerdo con la presente invención. En otra modalidad, la presente invención ofrece un método para el tratamiento de linfoma en un humano, que consiste en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de trióxido de arsénico o melarsoprol al humano. El linfoma puede ser tratado por los métodos de la invención que incluyen, pero no están limitados a, linfoma de grado alto, linfoma de grado intermedio, linfoma en grado bajo y las diferentes sub-clasificaciones . En todavía otra modalidad, la invención ofrece un método para el tratamiento de tumores sólidos, incluidas las metástasis, en humanos consistiendo en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de trióxido de arsénico o melarsoprol a un humano. Los tumores sólidos que pueden ser tratados por los métodos de la invención incluyen, pero no están limitados a: cáncer del aparato digestivo, esófago, hígado, estómago y colon; piel, cerebro, hueso, mama, pulmón y tejidos blandos que incluyen, pero no están limitados a los diferentes sarcomas y, de preferencia cáncer de próstata. En las diferentes modalidades, las células leucémicas o de tumor infiltran otros órganos y sistemas en un humano, por ejemplo, el sistema nervioso central. Los métodos de la invención también son aplicables para reducir el número de células preneoplásticas en un humano en el cual hay un aumento anormal en el número de células preneoplásticas. En una modalidad específica, la invención proporciona un método de tratamiento de leucemia promielolítica aguda (APL) en un humano, que consiste en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de melarsoprol al humano. Los inventores descubrieron, como se describe en la sección 5.2, que las concentraciones de melarsoprol que son citotóxicas in vi tro pueden ser alcanzadas fácilmente in vivo. En una modalidad específica, la invención ofrece un método de tratamiento de leucemia mielógena crónica (CML) en un humano, que consiste en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de trióxido de arsénico al humano. Los inventores descubrieron, como se describe en la sección 5.3, que trióxido de arsénico también puede inducir apoptosis en una línea de células CML. Los beneficios terapéuticos de las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen trióxido de arsénico son muy superiores a los de arsenito de potasio, comúnmente formulado como solución de Fowler. En todavía otra modalidad específica, la invención aporta un método de tratamiento de leucemia promielocítica aguda (APL) en un humano, en el cual la APL esta asociada con una translocación de locus RARa en el cromosoma 17 al cromosoma 11, consistiendo en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de trióxido de arsénico o melarsoprol al humano. En la mayor parte de los casos de APL, el RARa en el cromosoma 17 se transloca y fusiona con el gen de PML ubicado en el cromosoma 15, es decir, t(15; 17) . En algunos casos el RARa se transloca al cromosoma 11 donde se fusiona al gen PLZF. Los pacientes con anclaje de t(15; 17) son únicamente sensibles el tratamiento con ácido retinóico todo trans (ATRA) , produciendo índices de remisión completa de 75% a 95%. La APL asociada con el t(ll; 17) PLZF-RARa muestra un pronóstico distintamente peor con mala respuesta a la quimioterapia o poca o ninguna respuesta al tratamiento con ATRA, definiendo así un nuevo síndrome de APL. La presente invención proporciona el trióxido de arsénico o melarsoprol que pueden ser utilizados para tratar estos casos de APL. Los modelos de animales transgénicos de APL asociada con t(15; 17) y t(ll; 17) para probar los beneficios terapéuticos y las dosis de los compuestos de arsénico de la invención están descritos en la sección 5.4 más adelante. Los humanos teniendo leucemia son algunas veces refractarios a los métodos de tratamiento tradicionales por razón de haber sido sometido a terapia antileucémica (por ejemplo, quimioterapia) . Así, la invención ofrece un método de . tratamiento de leucemia en un humano que no este respondiendo al tratamiento tradicional, consistiendo en la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de una combinación de un compuesto de arsénico y otro agente quimioterapéutico, como puede ser pero no se limita a, ácido retinóico todo trans (ATRA) u otros retinoides, al humano. El compuesto de arsénico puede ser trióxido de arsénico o melarsoprol o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. La invención también comprende el tratamiento de pacientes resistentes al retinoide con un compuesto de arsénico. En las modalidades específicas, el compuesto de arsénico de la invención y el compuesto quimioterapéutico pueden ser administrados como una mezcla o en secuencia. Cuando se administran en secuencia, el compuesto de arsénico puede ser administrado antes o después del compuestos quimioterapéutico, siempre y cuando el primer compuesto administrado todavía este proporcionando actividad antileucémica en el humano cuando se administre el segundo agente. Cualquiera de los modos de administración que se describe en la presente pueden ser utilizados para suministrar la combinación. En los aspectos preferidos, la leucemia en el humano tratada por la combinación es 'refractaria a los métodos generales de tratamiento o es un caso de leucemia en recidiva. 4.3. PROCESO PARA LA FABRICACIÓN DE SOLUCIÓN ESTÉRIL DE TRIÓXIDO DE ARSÉNICO Los compuestos de arsénico de la invención pueden ser formulados en preparaciones farmacéuticas estériles para al administración a humanos para el tratamiento de leucemias, linfornas y tumores sólidos. Las composiciones conteniendo un compuesto de la invención formulado en un portador farmacéutico compatible pueden ser preparadas, empacadas, etiquetadas para el tratamiento de y utilizadas para el tratamiento de leucemia, linfoma o tumor sólido indicado. En un aspecto, la invención proporciona un método para la fabricación de una composición farmacéutica conteniendo una cantidad terapéuticamente eficaz y no letal de trióxido de arsénico (As203) . El trióxido de arsénico (materia prima) es un compuesto inorgánico sólido que esta a la disposición en el comercio en una forma muy pura. No obstante, es difícil disolver As203 en solución acuosa. Además, hasta donde los inventores conocen no existen enseñanzas publicadas sobre la manera de formular el As203 como una composición farmacéutica adecuada para inyección directamente a un humano. El arsénico esta presente en solución en el estado de valencia +5 (pentavalente) o el estado de valencia +3 (trivalente) . por ejemplo, el arsenito de potasio (KAs02; que esta presente en la solución de Fowler) y las sales del ácido arsenioso contienen arsénico pentavalente. Es sabido que una forma de arsénico es más tóxica que la otra. (Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a edición, capítulo 66, 1659-0662, 1997) . Una solución fresca de trióxido de arsénico conteniendo arsénico en el estado trivalente será gradualmente oxidada al estado pentavalente si se expone al aire durante un tiempo prolongado, y como resultado de la acumulación de arsénico pentavalente, la toxicidad relativa de una solución de As203 cambiará con el tiempo. (Id). además, se observó que la cantidad total de arsénico en solución disminuye con el tiempo. Esta pérdida de material es causada por la conversión progresiva de arsénico en la solución en arsina (AsH3) que es un compuesto gaseoso a temperatura ambiente. Esto es particularmente problemático en aplicaciones farmacéuticas si la concentración de un ingrediente activo en el material inyectado no puede ser controlada. También es no deseable permitir que la arsina escape de la solución a la atmósfera porque la arsina también es tóxica. Los inventores han experimentado y desarrollado con éxito un método para formular trióxido de arsénico que supera los problemas antes descritos de solubilidad y estabilidad. El método comprende solubilizar As203 sólido de alta pureza en una solución acuosa a pH alto, como puede ser pH mayor que 12. Por ejemplo, una solución 5 M de hidróxido de sodio puede ser utilizada. Para ayudar a la solubilización y obtener una solución transparente y homogénea, es posible aplicar agitación mecánica y/o calentamiento suave. También es posible obtener una solución de As203 disolviendo el compuesto sólido durante la noche. Por lo común, mediante este método se obtiene una solución de As203 1 M. No obstante, esta solución es demasiado básica para ser útil como composición farmacéutica. Para ajustar el pH de la solución de S2O3, primero se diluye la solución en agua, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, pH 12. La solución de AS2O3 entonces se titula en forma inversa con ácido, como puede ser ácido clorhídrico (HCl 1 M a 5 M) , con agitación constante hasta que el pH sea aproximadamente 8.0 a 8.5. El HCl altamente concentrado no es adecuado conforme provoca la precipitación en la solución de As203. La solución de As203 parcialmente neutralizada puede entonces ser esterilizada por ejemplo por filtración (por ejemplo, a través de un filtro de 0.22 µ) , y almacenada en pequeños frascos estériles.

Para preparar una composición farmacéutica que pueda ser inyectada directamente en un individuo, la composición debe ser estéril, es posible utilizar las técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica para la esterilización. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science. El pH de la solución de As203 parcialmente neutralizada puede además ser ajustado a casi el pH fisiológico por dilución (de 10 a 100 veces) con un portador farmacéutico, como puede ser una solución de dextrosa al 5%. Por ejemplo, 10 ml de una solución de As203 parcialmente neutralizada pueden ser adicionados a 500 ml de una solución de dextrosa al 5% para producir un pH final de cerca de 6.5 a 7.5. El método de la invención reduce la oxidación de arsénico en solución. Las composiciones farmacéuticas conteniendo trióxido de arsénico fabricadas por el método de la invención muestran mejor estabilidad y vida en almacenamiento prolongada. 4.4. COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA Y MODOS DE ADMINISTRACIÓN De acuerdo con la invención, los compuestos de arsénico y sus solvatos fisiológicamente aceptables pueden ser formulados para administración oral o parenteral. Para la administración oral, la preparación farmacéutica puede ser en forma líquida, por ejemplo, soluciones jarabes o suspensiones, o puede ser presentada como un producto medicamentoso para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Estas preparaciones líquidas pueden ser preparadas por los medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables como agentes suspensores (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas) , agentes emulsificadores (por ejemplo, lecitina o acacia) ; vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres oleosos o aceites vegetales fraccionados) ; y preservadores (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico) . Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables como los agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa) ; materiales de carga (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio) ; lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice) ; desintegradores (por ejemplo, almidón de papa o glicolato almidón de sodio) ; o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio) . Las tabletas pueden ser recubiertas por los métodos bien conocidos en la técnica Para la administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en la forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, tricloroflorometano, diclorotetrafloroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un inhalador o insuflador pueden ser formulados conteniendo una mezcla de polvos del compuesto y la base en polvo adecuada como puede ser lactosa o almidón. Los compuestos pueden ser formulados para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en bolo o por vía intravenosa continua. Las formulaciones para inyección pueden estar presentadas en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de dosis múltiple, con un preservador adicionado, las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. De otro modo, el ingrediente activo puede ser en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso. La invención también ofrece los equipos para realizar los regímenes de tratamiento de la invención. Estos equipos o kits contienen en uno o más recipientes cantidades terapéuticamente eficaces de los compuestos de arsénico en 'la forma farmacéuticamente aceptable. El compuesto de arsénico en un pequeño frasco de un kit de la invención puede estar en la forma de una solución farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, en combinación con salina estéril, solución de dextrosa o solución amortiguada, u otro fluido estéril farmacéuticamente aceptable. De otro modo, el complejo puede ser liofilizado o desecado; en este caso, el kit además puede contener opcionalmente en un recipiente una solución farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, salina, solución de dextrosa, etc) , de preferencia estéril para reconstituir el complejo a fin de formar una solución para propósitos de inyección. En otra modalidad, un kit de la invención además contiene una aguja o jeringa, de preferencia empacada en forma estéril para inyección del complejo y/o una almohadilla con alcohol empacado. Las instrucciones están incluidas opcionalmente para la administración de los compuestos de arsénico por un clínico o por el paciente. La magnitud de una dosis terapéutica de un compuesto de arsénico en el manejo agudo o crónico de leucemia variará con la gravedad del estado que va a ser tratado y la via de administración. La dosis, y tal vez la frecuencia de la dosis, también variará de acuerdo con la edad, peso corporal, estado y respuesta del paciente individual. En general, los rangos de dosis diaria de trióxido de arsénico para los padecimientos en la presente descritos son generalmente desde cerca de 0.05 a cerca de 5 mg por kg de peso corporal administrado en dosis divididas administradas por vía parenteral u oral o tópica. Una dosis diaria total preferida es desde cerca de 2.5 a cerca de 40 mg de trióxido de arsénico. De preferencia, la formulación de trióxido de arsénico de la invención se da diario durante un máximo de 60 días, o hasta remisión, seguido por dos a 10 ciclos adicionales, cada uno durando cerca de 25 días. Por ejemplo, dependiendo del peso corporal de un paciente con leucemia promielocítica aguda, una dosis diaria de trióxido de arsénico mayor que o menor que 10 mg puede ser administrada. De otro modo, después del régimen de dosificación, con base en el peso, es posible obtener una cantidad eficaz con una dosis diaria de trióxido de arsénico menor que 10 mg. Para el tratamiento de tumo sólido, un régimen de dosificación preferido incluye la vía intravenosa desde cerca de 0.1 a cerca de 5 mg por kg de peso corporal por día durante cinco días. Este protocolo de tratamiento de cinco días se repite una vez por mes hasta que se inhibe el crecimiento del tumor o cuando el tumor muestra signos de regresión.

Al igual que para melarsoprol, los rangos de dosificación diaria total para los padecimientos aquí descritos son generalmente desde cerca de 0.1 a cerca de 5 mg/kg de peso corporal administrado en dosis divididas administradas por vía parenteral, oral o tópica. La dosis diaria total preferida es desde cerca de 0.5 a cerca de 4 mg de melarsoprol por kg de peso corporal. El efecto del tratamiento con trióxido de arsénico o melarsoprol en el desarrollo y progreso de cáncer puede ser supervisado por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, que incluye pero no se limita a la determinación de: los niveles de antígenos específicos del tumor y biomarcadores putativos, por ejemplo, antígenos carcinoembriónicos (CEA) , alfa-fetoproteína; y cambios en la morfología y/o tamaño utilizando barrido tomográfico computarizado y/o sonogramas. Es posible mantener los niveles en sangre deseados mediante una administración por vía intravenosa continua de un compuesto de arsénico como se determine por los niveles en plasma. Se debe señalar que el médico asistente sabrá como y cuando terminar, interrumpir o ajustar el tratamiento a dosis más bajas debido a la toxicidad, o disfunciones de la médula ósea, hígado o riñon. Por el contrario, el médico asistente también debe saber como y cuando ajustar el tratamiento a concentraciones mayores si la respuesta clínica no es adecuada (evitando los efectos colaterales tóxicos) . Nuevamente, cualquier vía de administración adecuada puede ser empleada para proporcionar al paciente una dosificación eficaz de un compuesto de arsénico. Por ejemplo, es posible emplear las vías oral, transdérmica, iontoforética, parenteral (subcutánea, intramuscular, intratecal y similares) . Las fórmulas de dosificación incluyen tabletas, trociscos, cápsulas, dispersiones, suspensiones, soluciones, cápsulas, parches y similares, (véase Remington's Pharmaceutical Sciences). Las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen un compuestos de arsénico como el ingrediente activo, las sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y pueden también contener un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos, por ejemplo, el ácido retinóico todo trans. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales preparadas a partir de los ácidos y bases farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, incluidos los ácidos y bases inorgánicos y orgánicos. Las composiciones farmacéuticas incluyen las composiciones adecuadas para las vías oral, mucosa, transdérmica, iontoforética, parenteral (incluida subcutánea, intramuscular, intratecal e intravenosa) , aunque la vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá de la naturaleza y gravedad del estado de que se trate. En el caso donde se emplea una composición para inyección intravenosa o por infusión, un intervalo de dosificación conveniente para el uso es, por ejemplo, desde cerca de 1 a cerca de 40 mg de trióxido de arsénico diario total; cerca de 0.001 a cerca de 10 mg de trióxido de arsénico por kg de peso corporal total diario, o cerca de 0.1 a cerca de 10 mg de melarsoprol por kg de peso corporal total diario. Además, el portador de arsénico puede ser suministrado por matrices con carga y sin carga utilizadas como dispositivos de suministro del medicamento como pueden ser las membranas de acetato de celulosa, también a través de sistemas de suministro dirigido como pueden ser los liposomas fusogénicos unidos a anticuerpos o antígenos específicos. En el uso práctico, un compuesto de arsénico puede estar combinado como ingrediente activo en mezcla íntima con un portador farmacéutico de acuerdo con las técnicas de composición farmacéutica convencionales. El portador puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración, por ejemplo, oral o parenteral (incluidas las tabletas, cápsulas, polvos, inyecciones intravenosas o infusiones) . En la preparación de las composiciones para la forma de dosificación oral es posible emplear cualquiera de los medios farmacéuticos normales, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, preservadores, agentes colorantes y similares; en el caso de preparaciones líquidas orales, por ejemplo, suspensiones, soluciones, elíxires, liposomas y aerosoles; almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes granuladores, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegradores y similares en el caso de preparaciones sólidas orales como por ejemplo polvos, cápsulas y tabletas. En la preparación de las composiciones para la forma de dosificación parenteral, como pueden ser por inyección intravenosa o infusión, es posible emplear el medio farmacéutico similar, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, soluciones amortiguadoras, azúcar, preservadores y similares conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de estas composiciones parenterales incluyen, pero no están limitadas a, dextrosa al 5% p/v, salina normal u otras soluciones. La dosis total del compuesto de arsénico puede ser administrada en un pequeño frasco de fluido intravenoso, por ejemplo, en el intervalo desde cerca de 2 ml a cerca de 2000 ml . El volumen del fluido para dilución variará de acuerdo con la dosis total administrada. Por ejemplo, el trióxido de arsénico suministrado como 10 ml de solución acuosa en una concentración de 1 mg/ml se diluye en 10 a 500 ml de solución de dextrosa al 5%, y se utiliza para infusión intravenosa durante un periodo de tiempo en el intervalo de cerca de 10 minutos a cerca de cuatro horas. Un régimen de tratamiento ejemplar de un paciente con leucemia, linfoma o cáncer sólido puede incluir la administración diaria por infusión o vía intravenosa de trióxido de arsénico en solución acuosa en una dosis diaria de cerca de 0.01 a 1 mg de trióxido de arsénico por kg de peso corporal del paciente. De preferencia, se utiliza cerca de 0.15 mg de trióxido de arsénico por kg de peso corporal por día. El curso del tratamiento puede continuar hasta que se observe la remisión de la médula ósea o cuando se vuelvan serios los efectos colaterales. El curso de tratamiento puede ser repetido durante hasta 10 veces durante aproximadamente 10 meses con una separación de cerca de tres a seis semanas entre tratamientos. El curso del tratamiento posterior a la remisión incluye la administración por vía intravenosa de trióxido de arsénico en una dosis diaria de cerca de 0.15 mg por kg de peso corporal del paciente diario o solo los días hábiles durante un total acumulativo de 25 días.

. EJEMPLOS En adelante se describen los ejemplos de los usos de los compuestos de arsénico de la invención en el tratamiento de los diferentes tipos de leucemia. Mediante estos y otros experimentos la formulación de trióxido de arsénico de la invención se encontró bien tolerada en humanos. Por ejemplo, a tres pacientes con APL se les proporcionó 10 mg de la formulación de trióxido de arsénico de la dosis intravenosa una vez al día (dosis fija) de la invención. .1. TRIÓXIDO DE ARSÉNICO Y MELARSOPROL INDUCEN APOPTOSIS EN LÍNEAS DE CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELOIDE La actividad de AS2O3 y melarsoprol contra líneas de células de leucemia mieloide, incluida la línea de células de APL NB4-306 (una línea de células resistente al ácido retinóico proveniente de NB4 que ya no expresa la proteína de fusión intacta PML-RARa, HL60, KG-1, y la línea de células mielomonocíticas U937 fue investigada. Para examinar la actividad de la PML en la mediación de la actividad arsenical, los inventores también revisaron estos compuestos utilizando fibroblastos embriónicos de murino (MEF) y progenitores de médula ósea (BM) en los cuales el gen de PML había sido inactivado por recombinación homologa. De manera inesperada se encontró que ambos compuestos inhibieron el crecimiento celular e indujeron apoptosis en todas las líneas de células revisadas. El melarsoprol fue más potente de As203 en concentraciones equimolares en el intervalo de 10~7 a 105 mol/L. El As203 reubicó la PML y PML-RARa en los cuerpos nucleares, lo cual fue seguido por la degradación de la PML en las líneas de células NB4 así como en HL60 y U937. Aunque melarsoprol fue más potente inhibiendo el crecimiento e induciendo apoptosis, éste no afectó la localización nuclear de PML y/o PML-RARa. Además, el AS2O3 y melarsoprol inhibieron de manera comparable el crecimiento e indujeron apoptosis de PML+/+ y PML-/-MEF, e inhibieron la formación de la unidad formadora de colonias-eritroide (CFU-E) y CFU granulocito-monocito en cultivos de BM de los progenitores PML+/+ y PML-/+. Una descripción detallada de los métodos, materiales y resultados de estos experimentos se proporciona en Wang y col., Blood, 1998, 92: 1497-1504. Los resultados de los experimentos muestran que el efecto citotóxico de los arsenicales en estas líneas de células no es mediado por los mecanismos que dependen de la expresión de PML o PML-RARa. En la mayor parte de las líneas, el melarsoprol fue algo más potente en comparación con As203 en la inhibición del crecimiento e inducción de apoptosis, y los efectos de ambos medicamentos dependieron de la dosis. Como se reportó anteriormente, se confirma que el AS2O3 reubicó a la proteína PML en los cuerpos nucleares e indujo la degradación de PML y PML-RARa en células NB4 activando al mismo tiempo la spoptosis [sic]. No obstante, también se observaron efectos similares en células HL60 y U937 que no anclaron el gen de fusión PML/RARa. Además, el melarsoprol indujo apoptosis en todas las líneas de células revisadas sin alterar la PML y/o PML/RARa. La acción diferenciadora de AS2O3 y melarsoprol, apareció insignificante in vitro, y no apareció dependiente de la expresión y/o modulación de PML y/o PML/RARa. De hecho, el efecto pequeño observado por los inventores en cultivos de largo plazo (hasta dos semanas) , fue comparable en todas las líneas de células probadas con ambos compuestos. También se encontró que la inactivación de bcl-2, que había sido anteriormente vinculada a los efectos antileucémicos de S2O3 en APL, tampoco fue dependiente de la expresión de la proteína PML-RARa, porque ocurrió en el subclon 306 de NB4 en el cual la proteina intacta no es detectable. Por último, para probar si la expresión de PML fue esencial para los efectos antileucémicos de los arsenicales, ambos compuestos fueron probados en fibroblastos embriónicos de ratón y en células de BM de animales en donde la PML tipo silvestre había sido eliminada por recombinación homologa. En estas células completamente carentes de expresión de la PML, tanto el AS2O3 como melarsoprol fueron igualmente eficaces en la inhibición del crecimiento e inducción de apoptosis, y ambos tuvieron efectos similares en formación de colonias CFU-E y CFU-GM. Además, no se observaron diferencias entre células tipo silvestre y PML-/-. Sin estar apegado a ninguna teoría, estos datos reunidos apoyan fuertemente la teoría que los efectos antileucémicos de estos arsenicales ocurren independientemente de la expresión de PML y PML-RARa. Estos resultados están de acuerdo con la historia medicinal de los arsenicales para enfermedades que no se caracterizan por alteraciones en la proteína PML como puede ser, por ejemplo, la leucemia mielocítica crónica. Los resultados indican que el AS2O3 y melarsoprol son ampliamente activos como compuestos antileucémicos en enfermedades mieloides y linfoides. En conclusión, los datos indican que la actividad citotóxica no esta mediada por la proteína PML y por tanto no se limita a enfermedades que están asociadas con alteraciones en la expresión de la PML. Así, los compuestos de arsénico de la invención tienen una actividad terapéutica potencialmente más amplia que no esta confinada a la APL. .2 ESTUDIO CLÍNICO DE MELARSOPROL EN PACIENTES CON LEUCEMIA AVANZADA El melarsoprol, un arsenical orgánico sintetizado por el acomplej amiento del óxido de melarsen con dimercaprol, ha sido utilizado principalmente para el tratamiento de tripanosiomiasis africana. Los efectos de melarsoprol en la inducción de apoptosis en líneas de células representativas de anomalías linfoproliferativas de células B crónicas han sido investigados, y los resultados se describe a continuación. El melarsoprol (suministrado como arsobal [36 mg/ml] por Rhone Poulenc Rorer, Collegeville, PA) fue diluido en propilen glicol a una concentración patrón de 10 ml/1 y almacenado a temperatura ambiente. El AS2O3 (Sigma, St.

Louis, MO) fue disuelto en hidróxido de sodio (NaOH) 1.65 _3 mol/L a una solución patrón de 10 mol/1. La dilución en serie (10 —6 a 10—9 mol/1) se realizó en medio RPMI 1640. Como objetivos se utilizaron líneas de células B-prolinfocíticas transformadas por el virus Epstein-Barr (EBV) (JVM-2), una línea de células de leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) transformadas en EBV (I83CLL), y una línea de células B-CLL no transformadas en EBV (WSU-CLL) . Los experimentos de dosis-respuesta con melarsoprol (no legible) fueron realizados durante 96 horas. De manera inesperada, los inventores encontraron que melarsoprol causó una inhibición dependiente de la dosis y del tiempo de la supervivencia y crecimiento en todas las tres líneas de células. Por el contrario, el AS2O3 en concentraciones similares no tuvo efecto en la viabilidad ni el crecimiento. Después de 24 horas, las tres líneas de células tratadas con melarsoprol (no legible) presentaron características morfológicas de apoptosis. Se observó una inhibición prominente dependiente de la concentración del mRNA de bcl-2 después de 24 horas de exposición a melarsoprol en células WSU-CLL, 183 CLL y JVM-2. También se Observo disminución de la expresión de la proteína bcl -2 en todas las tres líneas de células, mientras que el AS2O3 no tuvo efecto en este parámetro. Dado que los datos in vi tro anteriores han mostrado inesperadamente amplia actividad antileucémica para melarsoprol contra células mieloides y linfoides, y generalmente a concentraciones inferiores que las de AS2O3, se inicio un estudio para evaluar la farmacocinética, seguridad y eficacia potencial de melarsoprol en pacientes humanos con leucemia recurrente o refractaria. Los pacientes elegibles fueron tratados con una inyección IV breve, diaria durante tres días, se repitió semanalmente durante tres semanas con un curso adicional de tres semanas en los pacientes respondentes. La dosis inicial de 1 mg/kg en el día 1, 2 mg/kg en el día 2 y 3.6 mg/kg el día 3 y todos los días subsiguientes. Estudios paralelos in vitro incluyeron sensibilidad del cultivo de células leucémicas frescas a melarsoprol y As203, junto con estudios citométricos de flujo en serie de la expresión del antígeno superficial, apoptosis y expresión de bcl-2. Tres pacientes con AML y un con CML entraron en el estudio. Utilizando un método basado en la cromatografía líquida de alta resolución que es sensible a aproximadamente 10 mg/ml, los datos farmacocinéticos preliminares muestran que las concentraciones pico del medicamento en plasma fueron obtenidas inmediatamente después de la inyección con una Cmax que fue en el intervalo de 1.2 mg/ml el día 1 a 2.4 mg/ml el día 3. Aunque fue rápida la fase de distribución inicial, una Tl/2? prolongado ha sugerido liberación de un compartimiento profundo. Las áreas bajo la curva (AUC) de la concentración en plasma por tiempo fueron proporcionales a la dosis administrada, en el intervalo desde 0.48 ng-h/ml en el día 1 a 1.48 ng-h/ml en el día 3. Concentraciones detectables del medicamento fueron encontradas en plasma una semana después de la dosificación inicial. El medicamento había sido relativamente bien tolerado. Los efectos adversos han incluido dolor transitorio en el sitio de la inyección y nausea leve. No se han observado signos de "encefalopatía reactiva" (ocasionalmente observada durante tratamiento de tripanosomiasis de CNS) . Los resultados de estos estudios sugieren que melarsoprol puede tener actividad más amplia que el AS2O3 inorgánico, y que las concentraciones que son citotóxicas para las células leucémicas in vitro, y de esta manera terapéuticas, se alcanzan fácilmente in vivo. .3. EL TRIÓXIDO DE ARSÉNICO INDUCE APOPTOSIS EN CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELÓGENA CRÓNICA K562 (CML) Para determinar si trióxido de arsénico (AS2O3) favorece la apoptosis en CML, se utilizó una línea de células de CML K562 positiva para el cromosoma Philadelphia. Los cultivos de células en suspensión, en fase logarítmica fueron expuestos a S2O3 en concentraciones de 1 x 10" M, 5 x 10 y 1 x 10 —8 M. Las alícuotas de las células fueron analizadas en diferentes puntos del tiempo durante el transcurso de 72 horas para valorar la viabilidad y apoptosis. La viabilidad fue medida utilizando exclusión con azul de trípano; al mismo tiempo, la apoptosis fue detectada por morfología, citometría de flujo y electroforesis en gel del DNA. El trióxido de arsénico en una concentración de 1 x 10 M no tuvo efecto sobre el crecimiento o viabilidad de las células K562. El mayor efecto sobre el crecimiento y supervivencia de las células ser observó con AS2O3 1 x 10" M. Los datos del crecimiento y viabilidad de las células K562 después de 72 horas de exposición a AS2O3 se registran en la Tabla 1: de daño en el crecimiento % de viabilidad Valor p de las células Control 0 92.1 ± 0.9 5 x 10"6 M As203 63.0 78.8 ± 0.5 0.0001 1 x 10"5 M As203 75.3 61.9 ± 2.9 0.0223 Se analizó la evidencia que esta disminución inducida por arsénico en la viabilidad representó apoptosis. Las características morfológicas de la apoptosis incluida la formación de ámpulas en la membrana y condensación nuclear fueron evidentes en cytospins teñidos de células K562 incubados con AS2O3 10" M durante 72 horas. Esto se correlaciona con la evidencia del daño inter-nucleosomal del DNA observado por la electroforesis en gel del DNA extraído de células K562 expuestas a AS2O3 10 M. La valoración cuantitativa de la apoptosis, medida por el método TÚNEL demostró que 75.6% ± 8.6 (As203 1 x 10"5 M) de células presentó apoptosis en comparación con 6.3% ± 3.0 (control) de las células en 72 horas. El tratamiento de las células K562 con AS2O3 10" M dio origen a la activación del p21 mRNA, como se detectó por el análisis Northern, sugiriendo una suspensión de las células en la fase Gl del ciclo celular. Estos datos indican al trióxido de arsénico como un compuestos terapéutico para CML. .4. ESTUDIOS TERAPÉUTICOS CON ACIDO RETINOICO Y TRIÓXIDO DE ARSÉNICO (As203) EN RATONES TRANSGÉNICOS PML-RARa Y PLZF-RARa La leucemia promielocitica aguda (APL) se asocia con translocaciones cromosómicas que invariablemente incluyen la translocación del locus del receptor a del ácido retinóico (RARa) en el cromosoma 17 a otros loci en el genoma, como puede ser en la mayor parte de los casos de APL, el gen de la PML ubicado en el cromosoma 15 y en algunos casos del gen de PLZF en el cromosoma 11. Los pacientes con anclaje de t(15; 17) son sensibles al tratamiento con ácido retinóico todos trans (ATRA) , produciendo tasas de remisión completa de 75% a 95%. La APL asociada con el t(ll; 17) (PLZF-RARa) muestran una deficiente respuesta a ATRA. Para probar la eficacia de AS2O3 en el tratamiento de APL, se crearon modelos de la enfermedad en ratones transgénicos. Los ratones transgénicos fueron generados por las técnicas estándar en la que la expresión de las proteínas de fusión PML-RARa ó PLZF-RARa se coloca bajo el control de un minigen catepsin-G humano (hCG) mieloide-promielocítico específico. Ambos ratones transgénicos hCG/PML/RARa y hCG-PLZF-RARa desarrollan leucemia mieloide con características de APL similares a las de humanos. Se iniciaron los estudios terapéuticos en estos ratones leucémicos con los siguientes regímenes: 1) ATRA: 1.5 µg por gramo de peso corporal por día administrado por vía oral; y 2) ATRA: 6 µg por gramo de peso corporal por día administrado por vía intraperitoneal. Los ratones fueron sangrados una vez a la semana para evaluar la respuesta. Las leucemias de PML/RARa respondieron bien a ATRA con altos Índices de remisión (80% con el régimen 1) . De manera sorpresiva, in vi tro, ATRA indujo diferenciación e inhibió el crecimiento de células leucémicas así como de formación de colonias leucémicas en ensayos de progenitores en médula ósea y bazo en leucemias PML-RARa y PLZF-RARa. Además, en experimentos ex vivo, las células leucémicas de ratones PLZF-RARa perdieron su capacidad tumorigénica cuando fueron transplantadas en ratones desnudos recipientes con preincubación con ATRA, mientras las células no tratadas fueron tumorigénicas. No obstante, in vivo, las leucemias PLZF-RARa respondieron en forma deficiente a ATRA (28% con el régimen 1) , mientras dosis mayores de ATRA parecieron más eficaces (50% con el régimen 2) . En conclusión, las leucemias en ratones transgénicos PLZF-RARa son sensibles al tratamiento con ATRA, pero pueden requerir regímenes terapéuticos con dosis altas de ATRA. Estos hallazgos tienen implicaciones directas en el tratamiento de pacientes con APL con t (11; 17) . En ambas leucemias PML-RARa y PLZF-RARa, el ATRA prolongo la supervivencia, pero las leucemias fueron recurrentes en breve después de que se alcanzo la remisión, y fueron refractarias para otro tratamiento con ATRA. Los dos modelos de ratones transgénicos también se utilizan para probar la eficacia y dosis del S2O3 y de ATRA más AS2O3 en combinación para tratamiento de pacientes con APL resistentes a ATRA, y en APL asociada con el t(ll; 17). Un régimen de AS2O3 a 6 µg por día o una combinación de AS2O3 a 6 µg y ATRA a 1.6 ó 6 µg por gramo de peso corporal por día se administran por vía intraperitoneal. Los ratones se 'sangran cada semana para evaluar la remisión de la APL. .5. FABRICACIÓN Y ESTABILIDAD DE FORMULACIONES FARMACÉUTICAS El trióxido de arsénico ultra puro, sólido (AS2O3) fue solubilizado en una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 5 M. La suspensión fue agitada a temperatura ambiente durante 5 minutos lo cual produjo una solución homogénea, transparente. La solución de AS2O3 (2 ml, 1.0 M) fue adicionada a 393.6 ml de H20 en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, lo cual produjo una concentración de AS2O3 de 1 mg/ml a pH = 12. Se preparo una solución de HCl 5.0 M por dilución de HCl (49.26 ml, 37% p/p, 10/15 M) , con H20 (50.74 ml) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml . La solución de HCl fue después transferida por jeringa a un recipiente vacío de 1000 ml . La solución de AS2O3 fue titulada por titulación inversa con HCl (0.725 ml, 5.0 M) a pH 8.0. Aproximadamente 10 ml de la solución de AS2O3 retrotitulada fueron filtrados a través de una unidad de filtro Millex-GS de 0.22 µ y fueron adicionados a cada uno de aproximadamente 30 pequeños frascos estériles vacíos. Para preparar la composición farmacéutica que se inyectaría por vía intravenosa en pacientes, 10 ml de esta solución fueron retirados de dos de los pequeños frascos y fueron adicionados a 500 ml de una solución de dextrosa al 5% lo cual produjo un pH final de 6.5. La alta pureza del material inicial a granel fue confirmada (véase la Tabla 1) por absorción atómica. Las muestras duplicadas de cuatro soluciones intermedias o del paso final fueron ensayadas para el contenido total de arsénico. El ensayo del polvo a granel confirmo la pureza extremadamente alta del material inicial. Los datos para el contenido de arsénico de las soluciones del producto intermedio y acabado se presentan en la Tabla 2 siguiente. Los datos siguientes muestran que las soluciones son estables y que no parece haber ningún indicio de pérdida de peso del arsénico durante el tiempo.

Tabla 2 Contenido de arsénico (ppm) de la formulación intermedia y la solución del producto acabado de trióxido de arsénico. identidad de los códigos de la muestra: A-01: Solución del producto intermedio después de solubilización inicial en NaOH. A-02: Solución del producto intermedio antes de la titulación con HCl. A-03: Producto intermedio antes de la filtración por Millex. A-04: Producto acabado a partir del pequeño frasco rellenado con 10 ml estériles inmediatamente después de la fabricación. A-05: Producto acabado de los frascos tapados dos meses después de la fabricación. 6. EJEMPLOS: ENSAYOS CLÍNICOS EN PACIENTES CON APL El trióxido de arsénico fue evaluado en pacientes con APL para determinar si este agente induce citodiferenciación o apoptosis. 12 pacientes que habían recaído de tratamiento previo intenso fueron tratados con trióxido de arsénico en dosis en el intervalo desde 0.06 a 0.2 mg/kg por día hasta que se obtuvo remisión en médula ósea. Las células mononucleares de médula ósea fueron monitoreadas en serie por citometría de flujo para inmunofenotipo, hibridación in situ por fluorescencia (FISH) , el ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa para transcripción inversa (RT-PCR) para la expresión de PML/RARa y la expresión por Western blot de las proteínas asociadas con apoptosis, caspases [sic] 1, 2 y 3. los resultados mostraron que las dosis bajas de trióxido de arsénico son altamente eficaces para inducir remisión completa en pacientes recurrentes con APL. La respuesta clínica se asocia con citodiferenciación incompleta e inducción de apoptosis con activación de caspasa [sic] en células leucémicas. 6.1. MÉTODOS Protocolo clínico: Los requisitos de elegibilidad incluyeron un diagnostico de APL confirmado por citogenética o fluorescencia en análisis de hibridación in situ (FISH) para una translocación t(15; 17) o por el ensayo de la reacción de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para PML/RARa. Los pacientes deben haber recaído del tratamiento normal que debió incluir ácido retinóico todo trans más una combinación de medicamentos citotóxicos. Se requirió del consentimiento informado, firmado, y el protocolo fue revisado y aprobado por el consejo de revisión institucional de este centro.

Tratamiento de trióxido de arsénico: El trióxido de arsénico fue suministrado como una solución acuosa en pequeños frascos de 10 ml conteniendo 1 mg/ml del medicamento. El medicamento fue además diluido en 500 ml de solución de dextrosa al 5% y administrado por vía intravenosa durante 2 a 4 horas una vez al día. Aunque el cohorte de paciente inicial recibió 10 o 15 mg 10 ó 15 mg/día como una dosis fija, la referencia de dos niños impulso a la invención de un régimen basado en el peso (0.15 mg/kg/día que hasta ahora era desconocido. El medicamento fue administrado diario hasta que se observó remisión de la médula ósea. Los pacientes que alcanzaron remisión completa fueron elegibles para tratamiento con cursos adicionales de tratamiento de tres a seis semanas después del curso precedente. Los cursos subsiguientes generalmente fueron administrados a una dosis de 0.15 mg/kg/día durante un total acumulativo de 25 días, administrados diario o en un programa de solo los días hábiles, durante un máximo total de seis cursos durante aproximadamente 10 meses.

Supervisión durante el estudio: Los pacientes con coagulopatía fueron transfundidos con plaquetas y plasma congelado, fresco para mantener la cuenta de plaquetas y fibrinógeno en concentraciones objetivo > 50,000 células/cu mm [sic] y > 100 mg/Dl, respectivamente. Se obtuvieron en serie las cuentas sanguíneas, estudios de coagulación, los perfiles de química en suero, análisis de orina y electrocardiogramas. Se realizo aspiración y/o biopsia de médula ósea como dato base y después periódicamente hasta que se documentó la remisión. Se observaron los criterios de respuesta tradicionales, que incluyeron la recuperación de la médula ósea a < 5% de los blastos, leucocitos de sangre periférica > 3,000 células/cu mm, [sic] y plaquetas > 100,000 células/cu mm.

Estudios de inmunofenotipo celular: se recolectaron muestras de médula ósea o sangre heparinizadas y las células mononucleares fueron aisladas por centrifugación con Ficoll-Hypaque. Los antígenos de membrana superficiales fueron detectados por tinción de inmunofluorescencia directa utilizando isetiocianato de fluoresceína (FITC) ó anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina: CD16 (Leu lia), CDllb, CD33 (Leu M9) , HLA-DR, CD45, y CD14, adquiridas de Becton-Dickinson (Mountainview, CA) o de Inmunotech Immunology (Marsella, Francia) . Se realizó tinción de color doble incubando las células en forma simultánea con dos anticuerpos monoclonales, incluidos CD33-PE/CDllb-FITC y CD33-PE/CD16-FITC. Al mismo tiempo se analizaron los controles negativos utilizando inmunoglobulinas monoclonales y relevantes del mismo isotipo. Se realizaron análisis citométricos de flujo en un citómetro de flujo EPICS Profile II (Coulter Electronics) equipado con un láser de argón de 488 nm. Los parámetros de las células del dispersor delantero y lateral fueron medidos y combinados con tinción CD45/CD14 para identificar las poblaciones de interés y para excluir los monocitos de la compuerta de análisis. Se utilizó un Multiparameter Data Acquisition and Display Sistem (MDADS, Coulter Electronics) para tomar y analizar los datos.

La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) : Muestras seleccionadas que habían sido sometidas a tinción por inmunofluorescencia para CD33 y CDllb fueron clasificadas para células que co-expresan ambos antígenos utilizando un clasificador de células FACStar Plus (Becton-Dickinson) . Las células separadas fueron incubadas en medio de cultivos a 37 °C durante una hora, fueron tratadas con solución hipotónica de KCl 0.075 M durante cinco minutos, fijadas en metanol: ácido acético fijativo 3:1 y secadas al aire. Se realizó la FISH de la interfase utilizando una sonda de doble color para la translocación PML/RARa específica (Vysis; Downer; Grove, IL) . En breve, el DNA de las células de la interfase fue desnaturalizado sumergiendo portaobjetos en una solución de 50% formamida/2xSSC a 73°C durante cinco minutos; los porta objetos fueron luego deshidratados en alcohol y secados al aire. Una mezcla de la sonda en la mezcla de hibridación fue aplicada, cubierta con un cubreobjetos y sellada con cemento de caucho. La hibridación se realizó a 37 °C en una cámara de humedad durante aproximadamente 12 a 16 horas. Después de la hibridación, la sonda no unida fue removida lavando los portaobjetos a 45°C en una solución de formamida al 50%/2xSSC, tres veces durante 10 minutos cada vez, seguido por un lavado en solución 2xSSC/0.1 nmp-40 a 45°C durante cinco minutos. Los portaobjetos fueron luego secados al aire y contra teñido con 4' , 6-diamidino-2-feniliridol y cubierto con un cubreobjetos de vidrio. El análisis de las células de la interfase para las señales fluorescentes fue realizado con una cámara Photometrics Sensys adaptada a un axioscopio Zeiss. Un mínimo de 300 células fue estudiado para cada muestra.

Análisis Western blot: Las células fueron usadas en una solución amortiguadora conteniendo Tris-HCl 50 mM, etilen glicol 0.5 mM [bis]-[aminoacil] [sic] tetraacético ácido, NaCl 170 mM, ditiotreitol 1 mM, NP-40 0.2%, aprotinina 0.01 U/ml, leupeptina 10 µg/ml, pepstatina 10 µg/ml y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 µM (todos de Sigma) . Los lisados fueron luego sonificados utilizando un homogeneizador ultrasónico (serie 471C, Colé Par er Instruments, Chicago IL) y centrifugados a 7500 g (Sorval Instruments, Newton, CT) . El contenido de proteína de los lisados fue determinado utilizando un kit de ensayo BioRad Protein (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a 595 nm con un estándar de BSA. Una solución amortiguadora de muestra conteniendo 10% de glicerol, 0.4% de SDS, 0.3% de azul de bromofenol, 0.2% de pironin Y en solución amortiguadora de apilamiento lx (Tris base 0.5 M, SDS 0.8%), 20% de 2-mercaptoetanol, fue adicionada a los lisados de células, los cuales fueron desnaturalizados por calor a 95°C durante tres minutos. Posteriormente, 15 µg/franja de proteína fueron cargados en un SDS-gel de poliacrilamida conteniendo poliacrilamida al 12.5% y fue fraccionado por tamaño por electroforesis. Las proteínas formaron franjas sobre el medio de transferencia Trans-Blot® (Bio-Rad) y teñidas con Ponceau-S como un control de carga interno. Se adicionaron anticuerpos monoclonales antihumano de conejo, incluidas caspasa 1, caspasa 2 (ambos de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y caspasa 3 (PharMingen, San Diego, CA) y los anticuerpos monoclonales unidos fueron detectados utilizando el sistema de detección de quimioluminiscencia ECL® (Amersham, Ariington Heights, IL) . Las bandas de proteína fueron cuantificadas por densitometría por computador.

El análisis RT-PCR para PML/RARa: se realizó RT-PCR utilizando los métodos ya descritos (Miller y col., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. 89: 2694-8; Miller y col., 1993, Blood, 82: 1689-94) . 6.2. RESULTADOS Pacientes: Fueron tratados 12 pacientes con APL en recidiva o refractaria. Todos los pacientes habían recibido un extenso tratamiento previo con retinoides y medicamentos citotóxicos (Tabla 3) . Dos pacientes habían recaído de transplante de médula ósea alogénica, uno de los cuales también había fracasado en un reinfusión de células T de donador. Un paciente se había mantenido en hemodiálisis por insuficiencia renal crónica. Eficacia clínica: 11 de los doce pacientes alcanzaron remisión completa después del tratamiento con trióxido de arsénico. El paciente que entró en hemodiálisis presentó hemorragia intracraneal en el día 1 y murió el día 5. La duración promedio del tratamiento en los pacientes con respuesta fue de 33 días (intervalo de 12 a 39 días), la dosis diaria promedio fue de 0.16 mg/kg (intervalo 0.06 a 0.2 mg/kg) y la dosis acumulativa promedio durante la inducción fue de 360 mg (intervalo 160 a 515 mg) (Tabla 3) . La remisión completa para todos los criterios se alcanzó en el tiempo promedio de 47 días (intervalo 24 a 83 dias) después del inicio del tratamiento. La remisión por criterio de médula ósea, factor determinante para descontinuar el tratamiento, se alcanzo primero, por lo común seguido en secuencia por recuperación de leucocitos de sangre periférica y plaquetas. En el intervalo de las dosis utilizadas en este estudio no fueron evidentes diferencias en la eficacia o el tiempo para la respuesta. Después de dos fl) periodos de tratamiento, 8 de los 11 pacientes revisados habían convertido sus ensayos RT-PCR para PML/RARa de positivo a negativo. Todos los 11 pacientes en remisión completa terminaron cuando menos un periodo de tratamiento posterior a la remisión con trióxido de arsénico. El paciente 4, 2 y 1 cada uno había completado un total de tres, cuatro y cinco 10 periodos de tratamiento, respectivamente. La duración promedio de la remisión es 5+ meses (intervalo de 1 a 9+ meses) . No obstante, tres de los 11 pacientes recayeron durante el segundo periodo de tratamiento; ninguno de estos pacientes había convertido sus ensayos de la RT-PCR, y cada 15 uno parecía haber adquirido rápidamente resistencia al medicamento. Dos de estas personas desde entonces habían expirado de leucemia progresiva.

Sucesos adversos: El estado clínico de los pacientes 20 en este estudio fue altamente variable, lo cual reflejó sus extensos tratamientos anteriores. El protocolo no requirió de hospitalización; tres pacientes completaron tratamiento de inducción completamente como pacientes externos, y otra persona fue hospitalizada solo para reemplazar un catéter 25 venoso. No obstante, ocho pacientes fueron hospitalizados por complicados de leucemia, cinco de los cuales requirieron transferencia a una unidad de terapia intensiva, entubación endotraqueal y ventilación asistida por complicaciones que incluyeron hemorragia pulmonar, insuficiencia renal, sepsis, enfermedad de injerto contra hospedero, infiltrados pulmonares no específicos o hipotensión. Un paciente requirió la inserción de un marcapasos permanente después de un bloqueo del corazón de segundo grado desarrollado en el establecimiento de acidosis metabólica grave, hipercalemia, hipotensión e insuficiencia renal. No obstante, el bloque del corazón se invirtió a pesar del nuevo desafío con otro tratamiento de trióxido de arsénico. El medicamento fue retirado temporalmente debido a las complicaciones médicas intercurrentes serias en cinco pacientes durante un promedio de dos días (intervalo 1 a 5 días) . Dos pacientes presentaron síntomas semejantes al del "síndrome de ácido retinóico"; ambos fueron presuntamente tratados con dexametasona y mejoraron. Solo dos pacientes no requirieron de ningún tipo de transfusiones de plaqueta; el número promedio de unidades de plaquetas transfundidas fue 61 (intervalo 0 a 586 unidades) . La cuenta total promedio de leucocitos en sangre periférica en el inicio fue de 4700 células/cu mm (intervalo 500 a 144,000 células/cu mm. Seis pacientes presentaron leucocitosis (es decir, > 20,000 células/cu mm) que estuvieron en el intervalo desde 20,800 a 144,200 células/cu mm. Ningún tratamiento adicional fue administrado a estos pacientes, y la leucocitosis se resolvió en todos los casos 'sin mayor intervención. Las reacciones adversas comunes incluyeron mareo durante la administración por vía intravenosa, fatiga, dolor músculo esquelético, e hiperglicemia leve. Tres pacientes desarrollaron disestias [sic] tal vez debido a neuropatía periférica. No obstante, dos de estos pacientes habían estado inmovilizados durante periodos prolongados durante la ventilación asistida, y el otro pacientes tenía un antecedente neuropático.

Estudios de inmunofenotipo: La APL se caracteriza por células que expresan CD33, un antígeno por lo común asociados con células mieloides primitivas. El tratamiento con trióxido de arsénico indujo una enfermedad progresiva en la proporción de las células que solamente expresaban CD33, junto con un aumento en la proporción de células que expresaban CDllb, un antígeno asociado con elementos mieloides maduros. Aunque estos cambios serían anticipados de algún agente que induzca remisión en APL, el trióxido de arsénico también induce expresión de células que al mismo tiempo expresan para ambos antígenos. En la mayoría de los casos, estas células de expresión doble dominaron la población de células mieloides, y estas persistieron durante periodos prolongados después de alcanzar remisión completa por criterios clínicos.

Análisis de hibridación in situ por fluorescencia: Células mononucleares de médula ósea tomadas de un paciente antes y después de remisión completa fueron clasificadas por citometría de flujo para co-expresión de CD33 y CDllb. Utilizando el análisis de hibridación in situ por fluorescencia (FISH) , 300 células fueron examinadas en una etapa temprana a la remisión. De la misma manera que para el control de las células APL, la mayoría de estas células produjo una señal híbrida indicando una translocación entre genes PML y RARa y su origen a partir del clon neoplástico. No obstante, cuando células del mismo paciente fueron nuevamente clasificadas utilizando estos mismos parámetros después de la remisión, solo el patrón normal de las señales de fluorescencia fue detectado, indicando su derivación de los progenitores hematopoyéticos normales.

Análisis Western blot: Extractos de proteína de células mononucleares de médula ósea fueron examinados en serie por análisis Western blot. El análisis mostró que las formas precursoras de caspasa 2 y caspasa 3 fueron activadas in vivo en respuesta al tratamiento con trióxido de arsénico. Además, este tratamiento también indujo expresión de los fragmentos desdoblados de caspasa 1, indicando activación de la enzima. También hay alguna indicación que la expresión de la forma desdoblada de caspasa 3 se incrementa. El anticuerpo utilizado en estos experimentos no reacciona con la forma desdoblada de caspasa 2. 6.3. ANÁLISIS En este estudio, con algunas excepciones, los pacientes admitidos al estudio habían sostenido múltiples recaídas y fueron resistentes a la quimioterapia tradicional, retinoides o transplante de médula ósea. En el inicio, los pacientes de este estudio sufrieron de numerosas complicaciones relacionadas con la leucemia, incluida la insuficiencia respiratoria, infección por varicelas zoster diseminada, aspergilosis cavitaria, insuficiencia renal crónica y enfermedad de injerto contra hospedero. Además, cinco de los 12 pacientes requirieron admisión en una unidad de cuidados intensivos para ventilación asistida y cuidados de soporte, pero estas complicaciones no estuvieron directamente relacionadas con el tratamiento de trióxido de arsénico. Casi todos los pacientes con diagnostico confirmado de APL lograron remisión sin la mortalidad temprana asociada con tratamiento con retinoides. Aunque se observo con menos frecuencia en comparación con el tratamiento con ácido retinóico todo trans, el trióxido de arsénico indujo leucocitosis sorprendente en algunos pacientes. Con la retención de otros medicamentos citotóxicos, la leucocitosis desapareció a medida que los pacientes llegaron a la remisión. A pesar de tres recurrencias tempranas, ocho de los 11 pacientes revisados convirtieron los ensayos de la RT-PCR para PML/RARa (un marcador molecular de enfermedad residual) a negativo, un fenómeno que no es común después de tratamiento solo con ácido retinóico todo trans. Por último, el trióxido de arsénico es activo en APL en un intervalo de dosis cuando menos triple desde 0.06 a 0.20 mg/kg. El ácido retinóico todo trans induce diferenciación "terminal" de las células APL, pero los efectos citodiferenciadores del trióxido de arsénico parecen ser incompletos. El arsénico induce a una población de células que exprese simultáneamente antígenos de superficie característicos de células maduras e inmaduras (es decir es decir, CDllb y CD33, respectivamente) . Al principio de la inducción, estas células retienen la translocación t(15; 17) que caracteriza la APL. Inesperadamente, estas células persistieron en la médula ósea a pesar de la obtención de una remisión completa desde el punto de vista clínico; no obstante, después de la remisión, las células coexpresantes, aunque todavía fácilmente detectables, ya no fueron positivas por hibridación in situ. La apariencia morfológica de las células leucémicas durante el tratamiento también es mucho menos distintiva que la observada durante el tratamiento con ácido retinóico todo trans. De hecho, las células leucémicas de muchos pacientes mostraron pocos cambios morfológicos durante 10 o más días, después de lo cual la proporción de las células leucémicas disminuyó progresivamente . Después de a diferenciación "no terminal" el trióxido de arsénico pareció inducir apoptosis, coincidente con expresión aumentada y conversión de cisteína proteasas (denominadas caspasas) a partir de precursores inactivos para encimas activadas. La ruta de la caspasa solo ha sido recientemente caracterizada como una vía importante de muerte celular programada. Inicialmente reconocida por la homología entre la proteína cde-3 de C. elegans y la enzima convertidora de interleucina-lß (ICE) de mamífero, la familia de las caspasas ahora comprende cuando menos 10 proteínas diferentes que desdoblan un número de polipéptidos. En las líneas de células leucémicas, la activación de la caspasa es inducible con un número de agentes citotóxicos, incluido el ácido retinóico todo trans. Dado que estas enzimas inducen proteólisis, puede concebirse que PML/RARa es un sustrato de la caspasa.

Una similitud final compartida por trióxido de arsénico y el ácido retinóico todo trans es el rápido desarrollo de resistencia clínica en algunas personas. Las células 'leucémicas tomadas de dos pacientes que recayeron mantuvieron su sensibilidad in vitro sobre intervalos de concentraciones desde 10 -4 M a 10-7 M. La resistencia relativa del arsénico debida disminución en el transporte intracelular ha sido descrita en asociación con la inactivación de los transportadores de membrana codificados por el operon ars en células bacterianas. La resistencia en células de mamífero esta menos bien caracterizada, pero las alteraciones en el transporte de membrana o la efusión son probablemente factores importantes. En resumen, el trióxido de arsénico induce remisión completa en pacientes con APL que han recaído de tratamientos anteriores extensos. Este medicamento provoca citodiferenciación parcial pero incompleta de las células leucémicas, seguida por la activación de la caspasa e inyección de apoptosis.

Tabla 3: Características clínicas y resultados de tratamiento de inducción de pacientes con leucemia promielocítica aguda tratados con trióxido de arsénico.

Todos los pacientes habían recibido anteriormente uno o más tratamientos con ácido retinóico todo trans más un antibiótico antraciclína más arabinósido citosina. * denota persona que demostraron resistencia al retinoide (es decir, falta de respuesta durante la reinducción o recaída mientras se encontraban en mantenimiento con retinoide) ; t define pacientes que murieron antes. Otro tratamiento: mitoxantrone/etoposide; transplante alogénico de médula ósea; c metotrexato/vincristina/6-mercaptopurina; d ácido retinóico 9-cis más M195 (anticuerpo monoclonal anti-CD33) . 7. EJEMPLOS: USO CLÍNICO EN LINFOMA Con base en el descubrimiento inicial de los efectos antitumor de trióxido de arsénico in vi tro contra líneas de linfocitos de células B, los inventores trataron un paciente con linfoma de células grandes, grado intermedio, que había recaído de formas múltiples de tratamientos tradicionales, incluido el transplante de médula ósea autólogo. A pesar del rápido progreso de su enfermedad antes de iniciar el tratamiento con trióxido de arsénico, el tratamiento con trióxido de arsénico efectuó un encogimiento importante (> 50%) en el tamaño de sus ganglios linfáticos cancerosos y bazo, que también fue asociado con un mejoramiento importante en su calidad de vida. 8. EJEMPLOS: USO CLÍNICO EN CÁNCER NO HEMATOPOYETICO También se utilizó trióxido de arsénico para tratar cáncer de colon. En una prueba preliminar, un paciente con cáncer de colon que recibió un tratamiento con trióxido de arsénico mostró una reducción importante en su concentración de CEA (antígeno carcinoembriónico) en suero. El paciente recibió administración por vía intravenosa diaria de 0.1-5 mg de trióxido de arsénico por kg de peso corporal por día durante cinco días. Se observó un cambio en la concentración de CEA de 19,901 ng/ml a 15,266 ng/ml, una reducción de 23%. Es bien sabido que la reducción en concentración de CEA en suero esta asociada con la respuesta antitumor. Los datos clínicos confirman que el trióxido de arsénico también puede ser utilizado para tratar otros cánceres no hematopoyéticos, como puede ser el cáncer de colon. 9. EJEMPLOS: ESTUDIOS FARMOCINÉTICOS Algunos estudios de intervalo de la dosis fueron realizados para examinar la farmacocinética (PK) y los efectos biológicos de AS2O3 en pacientes con APL y en pacientes con otras enfermedades hematológicas. En pacientes con APL, las células mononucleares de médula fueron supervisadas en serie por citometría de flujo para inmunofenotipo, hibridación in situ por fluorescencia (FISH) , y expresión por Western blot de las proteínas asociadas con apoptosis, caspasas 1, 2 y 3. Las células que co-expresaron CDllb y CD33, y que por análisis FISH realizaron la translocación t(15; 17) aumentaron progresivamente durante el tratamiento y persistieron la principio en la remisión completa. El AS2O3 también indujo expresión in vivo de las pro-enzimas de caspasa 2 y caspasa 3, y activación de ambas caspasas 1 y caspasa 3. El análisis de PK de sangre y orina para contenido de arsénico elemental (As) mostró que el As estaba distribuido en las fracciones plasma y eritrocitos de la sangre completa. Las curvas de eliminación paralelas sugieren que estos dos compartimientos fueron libremente intercambiables, y decayeron de los valores pico con vidas medias iniciales de cerca de 60 minutos. La AUC promedio en el dia 1 fue cerca de 400 ng por h/ml. Aproximadamente 20% de la dosis administrada fue recuperada en orina dentro de las primeras 24 horas. Después iniciamos un estudio de intervalo de la dosis en pacientes con enfermedades diferentes de APL utilizando un programa de dosificación intravenosa diaria para un total acumulativo de 25 días por tratamiento cada 3-5 semanas en concentraciones de dosis de 0.1 y 0.15 mg por kg de peso corporal por día. A la fecha, 10 pacientes han sido recibidos, incluidos pacientes con CLL (dos pacientes), AML (tres pacientes) , linfoma (cuatro pacientes) y CML (un paciente) . Cinco pacientes fueron retirados del estudio al principio debido al rápido progreso, y cinco completaron el periodo de 25 días planeado. Sobre este intervalo de dosis, el medicamento ha demostrado ser bien tolerado; los efectos adversos han incluido salpullido, mareo durante la administración, fatiga y prolongación de la QTc en el EKG. Los resultados de este estudio muestran que el uso clínico de AS2O3 induce diferenciación parcial y apoptosis en APL, pero que los efectos terapéuticos de este compuesto no están confinados a este trastorno. La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades específicas aquí descritas. En realidad, diversas modificaciones de la invención además de las descritas en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción antes mencionada. Estas modificaciones se sugieren para estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Diversas publicaciones se citan en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en sus enterezas.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratamiento de leucemia mielógena 'aguda en un humano, consiste en administrar a un humano con leucemia mielógena aguda una cantidad terapéuticamente eficaz de trióxido de arsénico.

2. Un método para tratar leucemia mielógena crónica en un humano consiste en administrar a un humano con leucemia mielógena crónica una cantidad terapéuticamente eficaz de trióxido de arsénico.

3. Un método para el tratamiento de cáncer sólido en un humano consiste en administrar un humano con un cáncer sólido una cantidad terapéuticamente eficaz de trióxido de arsénico.

4. El método de la reivindicación 3, en el cual el cáncer sólido es cáncer del aparato digestivo, tejidos blandos, esófago, higado, estómago, colon, pulmón, piel cerebro, hueso, glándula mamaria o próstata.

5. Un método para tratar leucemia resistente al tratamiento con retinoides en un humano, consiste en administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de trióxido de arsénico o melarsoprol.

6. Un método para tratar leucemia, linfoma o tumores sólidos en un humano, consiste en administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de melarsoprol .

7. El método de la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, en donde aproximadamente 2.5 a 4.5 mg de trióxido de arsénico se administra por vía.

8. El método de la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, en donde cerca de 0.15 mg de trióxido de arsénico por kg de peso corporal del humano se administra por día.

9. El método de la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, en donde el trióxido de arsénico se administra por vía intravenosa.

10. El método de la reivindicación 1, 2 ó 5, en donde la administración de trióxido de arsénico se repite diario hasta que se observa remisión en médula ósea en el humano.

11. El método de la reivindicación 10 además comprende repetir de una a diez veces los pasos de suspender el tratamiento durante tres a seis semanas y reanudar la administración diaria de trióxido de arsénico de cinco a siete veces a la semana durante un total acumulativo de 25 días.

12. El método de la reivindicación 1, 2, ó 5, en donde el ácido retinóico todo trans también se administra al humano.

13. El método de la reivindicación 3 ó 4, en donde la administración de trióxido de arsénico se repite diario durante cinco días.

14. El método de la reivindicación 13 el cual se repite una vez al mes.

15. El método de la reivindicación 6, en donde cerca de 0.5 a 5 mg de melarsoprol por kg del peso corporal del humano se administra por vía.

16. Un método para la fabricación de una composición farmacéutica estéril adecuada para administración a los humanos que contiene trióxido de arsénico, el método comprende : (a) solubilizar trióxido de arsénico en una solución acuosa a pH mayor que 12; (b) neutralizar la solución de trióxido de arsénico con ácido clorhídrico a pH cerca de 8.5; (c) diluir la solución de trióxido de arsénico del paso (b) en un portador farmacéutico que estabilice y reduzca el pH a cerca de 7; y (d) esterilizar la composición farmacéutica.

17. Una composición farmacéutica estéril adecuada para inyección en humanos que contiene trióxido de arsénico y dextrosa en un portador farmacéuticamente aceptable.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 17 contiene 1 mg/ml de trióxido de arsénico.