MXPA00002092A - Uso de 5'-difosfato de uridina y analogos del mismo para el tratamiento de enfermedades de pulmon - Google Patents

Abstract

Se describen compuestos de la fórmula I:en donde:X1 y X2 son cada uno independientemente O- o S-;X3 y X4 son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H;R1 se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno;R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido;R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo;y R4 se selecciona del grupo que consiste de OR', -SR', -NR'y -NR'R'', en donde R'y R''se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R'estéausente cuando R4 tenga un enlace doble de unátomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina, los cuales se usan en métodos de hidratación de secreciones de moco de pulmón y de tratamiento de trastornos pulmonares tales como fibrosis cística, neumonía asociada con ventilador, bronquitis crónica, trastorno pulmonar obstructivo crónico y discinesia ciliar primaria;se describen también composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de la fórmula I y compuestos novedosos de la fórmula I.

Description

USO DE d'-PIFOSFATO DE URIDINA Y ANÁLOGOS DEL MISMO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DE PULMÓN SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de presentación de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/057,064, presentada el 29 de agosto de 1997, la cual está incorporada en la presente a manera de referencia en su totalidad.

APOYO DEL GOBIERNO Esta invención se hizo con el apoyo de gobierno de los Estados Unidos bajo el número de sección #2PO1 HL32322-11A1 de los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para tratar enfermedades de pulmón, y a compuestos novedosos y composiciones farmacéuticas útiles para los mismos.

ANTEDECENTES DE LA INVENCIÓN Una meta terapéutica en la fibrosis cística y otras enfermedades pulmonares en las cuales el contenido de agua del moco de pulmón es alterado, es la de hidratar las secreciones de moco del pulmón para que éstas puedan removerse después más fácilmente de los pulmones mediante acción mucociliar o tos simple. Por ejemplo, el uso de amilorida en aerosol para hidratar las secreciones de moco se describe la patente de E.U.A. No. 4,501 ,729 a Boucher y otros. La amilorida parece bloquear la reabsorción de Na+ por las células epiteliales de las vías respiratorias, y por lo tanto inhibe la absorción de agua del moco. Aunque es un avance importante en la provisión de tratamientos para la fibrosis cística, un problema potencial con la amilorida como un agente terapéutico es su duración de acción relativamente corta. En ciertas enfermedades pulmonares (por ejemplo, fibrosis cística), varias funciones de los epitelios de las vías respiratorias son anormales, y las deficiencias tanto en el transporte de CI" como la absorción de Na+ están bien documentadas. Véase, por ejemplo Knowles y otros, Science 221, 1067 (1983); Knowles y otros, J, Clin, Invest. 71, 1410 (1983). Se cree entonces que la regulación del transporte de iones tiene un beneficio terapéutico potencial en las enfermedades pulmonares caracterizadas por anormalidades en el transporte epitelial de iones. La confirmación de la presencia de receptores de P2Y2 (P2u-pupnérgico) sobre la superficie apical de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas dio origen a la posibilidad de que pudieran usarse nucleótidos en aerosol terapéuticamente para inducir la secreción de CI" en individuos con fibrosis cística u otras enfermedades de las vías respiratorias. En consecuencia, un enfoque terapéutico diferente para hidratar las secreciones de moco de los pulmones se ejemplifica por técnicas que incluyen la administración de ATP o UTP, los cuales parecen estimular la secreción de cloruro de las células epiteliales respiratorias. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No.5,292,498 a Boucher. La existencia de un receptor acoplado a proteína G que reconoce selectivamente 5'-difosfato de uridina (UDP) se estableció originalmente en estudios de un receptor expresado en forma nativa por células de glioma de rata C6-2B. E.R. Lazarowski y otros J. Biol. Chem. 269, 11830-11826 (1994). El receptor de P2Y6 se clonó recientemente por K. Chang y otros, J. Biol. Chem. 270, 26152-26158 (1995). Este receptor mostró subsecuentemente ser activado selectivamente por UDP, y ser el receptor de UDP expresado en forma nativa en células C6-2B. R.A. Nicholas y otros, Mol. Pharmacol. 50, 224,229 (1996). La falla para identificar este receptor en estudios anteriores de tejidos de mamífero ha sido posiblemente una consecuencia de la falta de disponibilidad de agonistas selectivos potentes para receptores de nucleótidos de uridina, y la baja estabilidad química y metabólica de los nucleótidos disponibles. Se reportó originalmente que UDP estimulaba la acumulación de fosfato de inositol en células epiteliales de las vías respiratorias humanas mediante una activación de baja potencia del receptor P2Y2. E.R. Lazarowski y otros Br. J Pharmacol, 116, 1619-1627 (1995); H.A. Brown y otros, Mol. Pharmacol. 40. 648-655 (1991 ). Sin embargo, se han demostrado recientemente que UDP no es de hecho un agonista en el receptor P2Y2 (Nicholas y otros, supra) y que el efecto previamente observado de UDP en receptores P2Y2 puede explicarse por la presencia de cantidades pequeñas de UTP contaminantes en soluciones de UDP y/o por la conversión de UDP en UTP por nucleósido difosfocinasa de la superficie celular. A pesar de la evidencia relacionada con el receptor P2Y6 y su relación con UDP, hasta la fecha no se ha reconocido que esta relación pudiera ser útil en el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han descubierto que el receptor P2Y6, el cual reconoce selectivamente UDP como una agonista potente, existe también en tejidos de las vías respiratorias. La asociación del receptor P2Y6 con incrementos en la secreción de CI" indica que UDP y otros fármacos selectivos para receptor que se derivan de esta molécula tienen un valor terapéutico en el tratamiento de una variedad de enfermedades de las vías respiratorias. En consecuencia, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para hidratar secreciones de moco en los pulmones de un sujeto que requiera dicho tratamiento. El método comprende administrar a los pulmones del sujeto un compuesto de la fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (en adelante llamado "compuesto activo"), en una cantidad efectiva para hidratar las secreciones de moco de los pulmones: en donde: X! y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R1 se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno (por ejemplo, diclorometileno y difluorometileno); R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo (incluyendo arilacilo) y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', NR' y NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina. El método de la presente invención puede comprender además el paso de administrar concurrentemente amilorida, benzamilo o fenamilo al sujeto en una cantidad efectiva para inhibir la reabsorción de agua de las secreciones de moco de los pulmones. El método de la presente invención es útil para tratar varios trastornos de los pulmones, incluyendo pero no limitados a, fibrosis cística, bronquitis crónica, trastorno pulmonar obstructivo crónico (COPD), discinesia ciliar primaria y neumonía asociada con ventilador (VAP). Un segundo aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que contiene los compuestos activos descritos en la presente, en una cantidad efectiva para hidratar las secreciones de moco de los pulmones, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos novedosos útiles en el tratamiento de trastornos de los pulmones son un tercer aspecto de la presente invención. Estos compuestos tienen la estructura de la fórmula I descrita arriba, con la condición de que dichos compuestos novedosos no incluyan los compuestos conocidos 5'-difosfato de uridina (o UDP), 5*-difosfato de 2-desoxiuridina (o dUDP), 5'-0-(2-tiodifosfato) de uridina (o UDP-ß-S) y 5'-difosfato de 4-mercaptouridina (o 4-mercaptoUDP). Los compuestos novedosos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, 5'-difosfato de 3'- desoxiuridina; 5'-difosfato de 5-bromouridina; 5'-d¡fosfato de 5-(1-feniletinil)-uridina; 5'-difosfato de 5-metiluridina; 5'-difosfato de 4-hexiltiouridina; 5'-difosfato de 4-metoxiuridina; 5'-difosfato de 4-(N-morfolino)uridina; 5'-difosfato de 4-hexiloxiudirina; 5'-difosfato de N,N-dimetilcitidina; 5'-difosfato de N-hexilcitidina; y 5'-difosfato de N-ciclopentilcitidina. Un cuarto aspecto de la presente invención es el uso de los compuestos activos descritos en la presente para la fabricación de un medicamento para la hidratación terapéutica de secreciones de moco en los pulmones de un sujeto que requiera dicho tratamiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra el curso de tiempo para la conversión de [3H]UTP en [3H]UDP en presencia de 10 unidades/mL de hexocinasa (HK). Los datos expresan como el porcentaje de trifosfato de [3H]uridina convertido en difosfato de [3H]uridina con círculos abiertos (O) indicando la cantidad relativa de difosfato de [3H]uridina, mientras que los círculos rellenos (•) indican la cantidad relativa de trifosfato de [3H]uridina. Los datos indican el valor promedio de un experimento que representa dos experimentos independientes llevados a cabo con muestras por duplicado que fueron diferentes por menos del 20%. La figura 2 ilustra, por medio de tres rastros de CLAR separados, el metabolismo de [3H]UTP y [3H]UDP por células epiteliales nasales humanas. Cada rastro representa los resultados de experimentos en los cuales células epiteliales de vías respiratorias humanas polarizadas y confluentes se incubaron durante 20 minutos a 37°C, en presencia de 1 µM (0.2 µCi) de [3H]UTP (FIG. 2A), [3H]UDP (FIG. 2B) y [3H]UDP combinado con 100 µm de ATP (FIG. 2C). Los rastros mostrados en las figuras 2A, 2B y 2C representan por lo menos tres experimentos independientes llevados a cabo por duplicado. En cada rastro el eje X del rastro indica el tiempo de elución en minutos, mientras que el eje Y indica la concentración de radioactividad de [3H] en unidades de cpm x 10"3. La figura 3 es una representación esquemática de los efectos de UTP y UDP en la formación de fosfato de [3H]inositol en relación con la superficie de células de mucosa o serosa. La figura 3 ilustra también los efectos de UTP y UDP en la movilización de calcio ¡ntracelular en células epiteliales nasales humanas polarizadas. Se cargaron células confluentes con [3H] 77yo-inositol y se preincubaron con LiCI (figura 3A), o con Fura-2 (figura 3B), como se describe abajo en los ejemplos 2 y 3. Las células se atacaron con 100 µM de UTP (par izquierdo de barras de datos) o UDP (par derecho de barras de datos), añadido ya sea al medio de serosa (barras abiertas) o de mucosa (barras rellenas). Los datos en las figuras 3A se muestran como la concentración de fosfato de [3H]inositol en unidades de cpm x 10"3 y representan la media (+ S.E.M.) de tres experimentos llevados a cabo por triplicado. Los datos en la figura 3B se muestran como ?Ca2+¡ en unidades de µM, y representan la media (+ S.E.M.) de catorce experimentos individuales.

La figura 4 consiste de rastros representativos de cambios promovidos por UDP y UTP en la concentración de Ca2+ intracelular y los potenciales de difusión de CI" en células epiteliales nasales humanas. Los rastros superiores muestran cambios en la concentración de Ca2+ intracelular en el medio de serosa (rastro izquierdo) y de mucosa (rastro derecho) después de la adición de UDP y UTP al medio de superficie de células, como se indica. Los rastros inferiores ilustran cambios de la diferencia potencial transepitelial (?TEP) en el medio de serosa (rastro izquierdo) y de mucosa (rastro derecho) después de la adición de UDP y UTP al medio de superficie de células, como se indica. Los datos representan por lo menos ocho experimentos independientes. La figura 5 es una gráfica que ilustra la relación de respuesta a concentración para la formación de fosfato de [3H]inositol estimulada por UDP y UTP de mucosa en células epiteliales nasales humanas. La concentración logarítmica de UTP (círculos rellenos, •) o UDP (cuadros rellenos, •) se indica en el eje x de la gráfica. La concentración de fosfatos de [3H]inositol en unidades de cpm x 10~3 M se indica en el eje y de la gráfica. Los datos representan el valor promedio (+ S.E.M) de tres experimentos independientes llevados a cabo con muestras por triplicado. La figura 6 es una gráfica que ilustra los efectos en el aclaramiento mucociliar en ovejas después de la administración de un control de solución salina (círculos, • ) o UDP (cuadros, •). El tiempo en minutos después de la administración del compuesto se indica en el eje x de la gráfica, mientras que la retención porcentual de moco se indica en el eje y. La figura 7 es una gráfica que ilustra los efectos en la velocidad de moco traqueal (TMV) en ovejas después de la administración de un control de solución salina (diamante abierto 0) o UDP (círculo cerrado, • ). El tiempo en minutos después de la administración del compuesto se indica en el eje x de la gráfica, mientras que la TMV medida como un porcentaje de la línea de base se indica en el eje y.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos y formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para facilitar (es decir, mejorar, acelerar, ayudar) el aclaramiento de secreciones de moco de los pulmones de un sujeto que requiera dicho tratamiento por cualquier razón, incluyendo (pero no limitado a) secreciones retenidas que se originen de enfermedades en de las vías respiratorias tales como fibrosis cística, bronquitis crónica, trastorno pulmonar obstructivo crónico (COPD), neumonía asociada con ventilador (VAP), discinesia ciliar primaria, asma, bronquiectasia, atelectasia post-operativa (taponamiento de las vías respiratorias con secreciones retenidas después de la cirugía) y síndrome de Kartagener.

La presente invención se refiere principalmente al tratamiento de sujetos humanos, pero también puede emplearse para el tratamiento de otros sujetos mamíferos, tales como perros y gatos, para propósitos veterinarios. Los métodos de la presente invención incluyen la administración de compuestos de la fórmula I, mientras que las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden compuestos de la fórmula I. Según se usa en la presente, un compuesto de la fórmula I es como sigue: en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y 4 son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R-i se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno (por ejemplo, diclorometileno y difluorometileno); R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo (incluyendo arilacilo) y arilalquilo; y Rt se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', NR' y NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina. Según se usa en la presente, el término "alquilo" se refiere a cadenas hidrocarburo de C-MO inclusives, lineales, ramificadas o cíclicas, saturadas o insaturadas (es decir, alquenilo y alquinilo), incluyendo por ejemplo, grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, ter-butilo, pentilo, hexilo, octilo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, octenilo, butadienilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo y alenilo. Según se usa en la presente, el término "acilo" se refiere a un grupo de ácido orgánico en el que el -OH del grupo carboxilo ha sido reemplazado con otro sustituyente (es decir, como se representa por RCO-, en donde R es un grupo alquilo o arilo). De esta manera, el término "acilo" incluye específicamente grupos arilacilo. Ejemplos específicos de grupos acilo ¡ncluyen acetilo o benzoilo. Según se usa en la presente, el término "arilo" se refiere a anillos aromáticos de hidrocarburo y heterocíclicos de 5 y 6 miembros. Ejemplos específicos de grupos arilo incluyen pero no están limitados a ciclopentadienilo, fenilo, furano, tiofeno, pirrol, pirano, piridina, imidazol, ¡sotiazol, isoxazol, pirazol, pirazina, pirimidina y similares. El termino "alcoxilo" según se usa en la presente, se refiere a cadenas oxo-hidrocarburo de Cpo inclusives, lineales, ramificadas o cíclicas, saturadas o insaturadas, incluyendo por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, t-butoxi y pentoxi. El término "ariloxilo" según se usa en la presente, se refiere a feniloxi o hexiloxi, y alquilo, halógeno o feniloxi o hexiloxi alcoxilo sustituidos. Según se usa en la presente, los términos "alquilo sustituido" y "arilo sustituido" incluyen grupos alquilo y arilo, como los definidos en la presente, en los cuales uno o más átomos o grupos funcionales del grupo arilo o alquilo son reemplazados con otro átomo o grupo funcional, incluyendo por ejemplo, halógeno, arilo, alquilo, alcoxi, hidroxi, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato y mercapto. Los términos "halógeno" o "halogenuro", según se usan en la presente, se refieren a grupos flúor, cloro, bromo y yodo. Compuestos que ilustran los compuestos de la fórmula I anterior incluyen: 5'-difosfato de uridina (también llamado aquí UDP); 5'-O-(2-tiod ¡fosfato) de uridina (también llamado aquí UDP-ß-S); 5'-difosfato de 2-desoxiuridina (también llamado aquí dUDP); 5'difosfato de 3'-desoxiuridina (también llamado aquí 3'-desoxiUDP); 5'-difosfato de 5-bromouridina (también llamado aquí 5-BrUDP); 5'-difosfato de 5-(1-feniletinil)-uridina (también llamado aquí 5-(1-feniletinil)UDP); 5'-difosfato de 5-metiluridina (también llamado aquí 5- metilUDP); 5'-difosfato de 4-hexiltiouridina (también llamado aquí 4-hexiltioUDP); 5'-difosfato de 4-mercaptouridina (también llamado aquí 4-mercaptoUDP); 5'-difosfato de 4-metoxiu ridina (también llamado aquí 4-metoxiUDP); 5'-difosfato de 4-(N-morfolino)uridina (también llamado aquí 4-(N-morfolino)UDP; 5'-difosfato de 4-hexiloxiuridina (también llamado aquí 4-hexiloxiUDP); 5'-difosfato de N,N-dimetilcitidina (también llamado aquí N,N-dimetilCDP); 5'-difosfato de N-hexilcitidina (también llamado aquí N-hexilCDP) y 5'-difosfato de N-ciclopentilcitidina (también llamado aquí N-ciclopentilCDP). Ciertos compuestos de la fórmula I (por ejemplo, UDP, dUDP, UDP-ß-S y 4-mercaptoUDP) se conocen y pueden hacerse de acuerdo con procedimientos conocidos o variantes de los mismos, los cuales serán aparentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la identificación y preparación de ciertos análogos de tiofosfato de difosfatos de nucleósido (tales como UTP-ß-S) se describen en la patente de E.U.A. No. 3,846,402 a Eckstein y otros, y en R.S. Goody y F. Eckstein, J. Am. Chem. Soc. 93, 6252-6257 (1971 ). Como alternativa, UDP, dUDP y otros análogos de los mismos también están disponibles comercialmente de proveedores tales como Sigma (San Luís, MO) y Pharmacia (Uppsala, Suecia). Otros compuestos de la fórmula I útiles en la presente invención (por ejemplo, 5-(1-feniletinil)UDP; 3'-desoxiUDP, 5-metilUDP; 4-hexiltioUDP; 4-metoxiUDP; 4-hexiloxiUDP; 4-(N-morfolino)UDP; N,N-dimetilCDP; N-hexilCDP y N-ciclopentilCDP) son compuestos novedosos descritos por primera vez en la presente, y como tal se reclaman en consecuencia en las reivindicaciones anexas. Por motivos de simplicidad, la fórmula I de la presente ilustra compuestos activos de difosfato de uridina en la configuración D que ocurre naturalmente, pero la presente invención abarca también compuestos en la configuración L y mezclas de los compuestos en las configuraciones D y L, a menos que se indique lo contrario. Se prefiere la configuración D que ocurre naturalmente. Los compuestos activos de la fórmula I pueden administrarse como tales o en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, una sal de metal alcalino tal como sodio o potasio, una sal de metal alcalino terreo, o una sal de amonio y tetraalquilamonio, NX + (en donde X es un grupo alquilo de C-?_ ). Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no imparten efectos toxicológicos no deseados. Los compuestos activos de la presente invención pueden administrarse opcionalmente en conjunto con otros compuestos útiles en la hidratación de secreciones de moco del pulmón o útiles en la facilitación de la remoción de las secreciones de moco del pulmón. Dichos compuestos (en adelante referidos como "compuestos complementarios") incluyen, pero no están limitados a, benzamilo, fenamilo y amilorida. La amilorida (también conocida como 3,5,-diamino-6-cloro-N-(diaminometilen)pirazinocarboxamida), benzamilo (también conocido como 3,5-diamino-6-cloro-N- (bencilaminoaminometileno)pirazinocarboxamida) y fenamilo (también conocido como 3,5-diamino-6-cloro-N-(fenilaminoaminometilen)-pirazinocarboxamida) son compuestos conocidos y se describen en la patente de E.U.A. No. 3,313,813 a E. Cragoe. Los términos "amilorida", "bezamilo" y "fenamilo", según se usan en la presente, incluyen las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, tales como (pero no limitadas a) clorhidrato de amilorida, clorhidrato de benzamilo o clorhidrato de fenamilo. Amilorida, benzamilo o fenamilo usados para preparar las composiciones de la presente invención pueden estar alternativamente en forma de una base libre farmacéuticamente aceptable de amilorida, benzamilo o fenamilo. En otra modalidad de la invención, el compuesto complementario se administra concurrentemente con el compuesto o compuestos activos de la presente invención. Según se usa en la presente, la palabra "concurrentemente" significa lo suficientemente cerca en tiempo como para producir un efecto combinado (por ejemplo, aditivo o sinergístico). En otras palabras, concurrentemente puede definirse como simultáneamente, o puede definirse como dos o más eventos que ocurran durante un corto periodo de tiempo antes o después uno de otro. Los compuestos activos y complementarios descritos en la presente pueden administrarse a los pulmones de un paciente mediante cualquier medio adecuado, pero se administran de preferencia administrando una suspensión en aerosol de partículas respirables que comprenden el compuesto activo, y que el sujeto inhala. El compuesto activo puede aerosolizarse en una variedad de formas, tales como, pero no limitadas a, inhalantes de polvo seco, inhalantes de dosis medida o líquido/suspensiones líquidas. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. La cantidad de compuesto activo incluida puede ser una cantidad suficiente como para lograr concentraciones disueltas de compuesto activo en las superficies de las vías respiratorias del sujeto de aproximadamente 10"9 a aproximadamente 10~1 moles/litro, y muy preferiblemente alrededor de 10~6 a aproximadamente 10"4 moles/litro. La composición farmacéutica en partículas puede combinarse opcionalmente con un vehículo para ayudar a su dispersión o transporte. Un vehículo adecuado tal como un azúcar (es decir, lactosa, sacarosa, trehalogenosa, manitol) puede mezclarse con el compuesto o compuestos activos en una relación adecuada (por ejemplo, una relación en peso 1 a 1 ). Las formas en partículas sólidas o líquidas del compuesto activo preparadas para llevar a la práctica la presente invención deben incluir partículas de tamaño respirable: es decir, partículas de un tamaño lo suficientemente pequeño como para pasar a través de la boca y laringe después de su inhalación y al interior de los bronquios y alvéolos de los pulmones. En general, las partículas que varían de aproximadamente 1 a 10 mieras en tamaño están dentro de la escala respirable. Las partículas de tamaño no respirable que se incluyen en el aerosol tienden a ser depositadas en la garganta o ser tragadas, y la cantidad de partículas no respirables en el aerosol es preferiblemente reducida al mínimo.

Las dosis de compuesto activo variará dependiendo de la condición que esté siendo tratada y del estado del sujeto, pero generalmente puede ser una cantidad suficiente como para lograr concentraciones disueltas de compuesto activo sobre las superficies de las vías respiratorias del sujeto de aproximadamente 10~9 a aproximadamente 10~1 moles/litro, y muy preferiblemente alrededor de 10"6 a aproximadamente 10"4 moles/litro. Dependiendo de la solubilidad de la formulación particular de compuesto activo administrada, la dosis diaria puede dividirse entre una o varias administraciones de dosis unitaria. La dosis diaria en peso dependerá de la edad y condición del sujeto. Dicha dosis diaria puede ser tan baja como 1 mg al día, bajo ciertas circunstancias puede ser tan baja como de 0.5 mg al día, e incluso puede ser tan baja como de 0.1 mg/día. La dosis diaria de los compuestos activos también puede ser tan alta como de 200 mg/día, bajo ciertas condiciones puede ser tan alta como de 500 mg/día e incluso puede llegar a ser de hasta 1000 mg/día. Las dosis de los compuestos activos pueden proveerse como una o varias unidades preempacadas. En la fabricación de una formulación de acuerdo con la invención, los compuestos activos de la presente invención o las sales farmacéuticamente aceptable o bases libres de los mismos se mezclan típicamente con, entre otros, un vehículo aceptable. Por supuesto, el vehículo debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro ingrediente en la formulación y no debe ser dañino para el paciente. El vehículo puede ser un sólido, un líquido o ambos, y se formula preferiblemente con el compuesto como una formulación de dosis unitaria que puede contener de 0.5% a 99% en peso del compuesto activo. Pueden incorporarse uno o más compuestos activos en las formulaciones de la invención, las cuales pueden prepararse mediante cualquiera de las técnicas de farmacología bien conocidas que consista esencialmente de mezclar los componentes. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden el compuesto activo pueden producirse mediante cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador de aerosol impulsado por presión o un nebulizador ultrasónico. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,501 ,729. Los nebulizadores son dispositivos disponibles comercialmente que transforman soluciones o suspensiones del ingrediente activo en un rocío de aerosol terapéutico por medio de la aceleración de gas comprimido, típicamente aire u oxígeno, a través de un orificio de venturi angosto o por medio de agitación ultrasónica. Las formulaciones adecuadas para usarse en nebulizadores consisten del ingrediente activo en un vehículo líquido, el ingrediente activo comprendiendo hasta 40% p/p de la formulación, pero preferiblemente menos de 20% p/p. El vehículo es típicamente agua (y muy preferiblemente agua estéril y libre de pirógenos) o una solución alcohólica acuosa diluida, hecha preferiblemente isotónica pero puede ser hipertónica con fluidos del cuerpo mediante la adición de, por ejemplo, cloruro de sodio. Los aditivos opcionales incluyen conservadores si la formulación no se hace estéril, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, agentes saborizantes, aceites volátiles, agentes reguladores de pH y agentes tensioactivos. Los aerosoles de partículas sólidas que comprenden el compuesto activo pueden igualmente producirse con cualquier generador de aerosol de medicamento en partículas sólidas. Los generadores de aerosol para administrar medicamentos en partículas sólidas a un sujeto producen partículas que son respirables, como se explicó anteriormente, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de un medicamento a una cantidad adecuada para la administración humana. Un tipo ilustrativo de generador de aerosol en partículas sólidas es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para la administración por insuflación incluyen polvos finamente pulverizados que puedan proveerse por medio de un insuflador o introducirse en la cavidad nasal en la manera de una aspiración por la nariz. En el insuflador, el polvo (por ejemplo, una dosis medida del mismo efectiva para llevar a cabo los tratamientos descritos en la presente) está contenido en cápsulas o cartuchos, hechos típicamente de gelatina o plástico, los cuales son perforados o abiertos en el lugar y el polvo suministrado por el aire extraído a través del dispositivo después de la inhalación o por medio de una bomba manualmente operada. El polvo empleado en el insuflador consiste ya sea únicamente del ingrediente activo o de una mezcla en polvo que comprenda el ingrediente activo, un diluyente en polvo adecuado, tal como lactosa, y un agente tensioactivo opcional. El ingrediente activo comprende típicamente de 0.1 a 100 p/p de la formulación.

Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador de dosis medida. Los inhaladores de dosis medida son despachadores de aerosol presurizados, que contienen típicamente una formulación en suspensión o solución del ingrediente activo en un propelente líquidificado. Durante el uso estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para proveer un volumen medido, típicamente de 10 a 200 µl, para producir un rocío de partículas finas que contenga el ingrediente activo. Dichos propelentes ¡ncluyen ciertos compuestos de clorofluorocarburo, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoro-etano y mezclas de los mismos. La formulación puede contener además uno o más co-solventes, por ejemplo, etanol, agentes tensioactivos tales como ácido oleico o trioleato de sorbitán, antioxidantes y agentes saborizantes adecuados. Se puede usar cualquier propelente para llevar a cabo la presente invención, incluyendo tanto propelentes que contengan clorofluorocarburos como propelentes que no contengan clorofluorocarburos. De esta manera, los propelentes de aerosol de fluorocarburo que pueden emplearse para llevar a cabo la presente invención incluyen propelentes de fluorocarburo en los cuales todos los hidrógenos son reemplazados con flúor, propelentes de clorofluorocarburo en los cuales todos los hidrógenos son reemplazados con cloro y por lo menos un flúor, propelentes de fluorocarburo que contienen hidrógeno y propelentes de clorofuorocarburo que contienen hidrógeno. Ejemplos de dichos propelentes incluyen, pero no están limitados a: CF3-CHF-CF2H; CF3-CH2-CF2H; CF3-CHF-CF3; CF3-CH2-CF3; CF3-CHCI-CF2CI; CF3-CHCI-CF3; cy-C(CF2)3-CHCI; CF3-CHCL-CH2CI; CF3-CHF-CF2CI; CF3-CHCI-CFHCI; CF3-CFCI-CFHCI; CF3-CF2-CF2H; CF3-CF2-CH3; CF2H-CF2-CFH2; CF3-CF2-CFH2; CF3-CF2-CH2CI; CF2H-CF2-CH3; CF2H-CF2-CH2CI; CF3-CF2-CH2CI; CF3-CF2-CF2-CH3; CF3-CF2-CF2-CF2H; CF3-CHF-CHF-CF3; CF3-0-CF3; CF3-O-CF2H; CF2H-H-O-CF2H; CF2H-0-CFH2;CF3-0-CH3; CF3-0-CF2-CF2H; CF3-O-CF2-O-CF3; cy-CF2-CF2-O-CF2-; cy-CHF-CF2-0-CF2-; cy-CH2-CF2-0-CF2-; cy-CF2-0-CF2-0-CF2-; CF3-0-CF2-Br; CF2H-0-CF2-Br y mezclas de los mismos, en donde "cy" denota un compuesto cíclico en el cual los enlaces covalentes terminales extremos de las estructuras mostradas son los mismos para que los grupos terminales extremos se unan covalentemente entre sí. Se prefieren particularmente los hidrofluoroalcanos tales como 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano (propelente 134a) y heptafluoropropano (propelente 227). Un estabilizador tal como un fluoropolímero puede incluirse opcionalmente en las formulaciones de propelentes de fluorocarburo, tal como se describe en la patente E.U.A. No. 5,376,359 a Johnson. Las composiciones que contiengan partículas secas respirables de compuesto activo micronizado de la presente invención pueden prepararse pulverizando el compuesto activo seco con, por ejemplo, un mortero o mano u otro dispositivo de pulverización adecuado, y después pasando la composición micronizada a través de un tamiz de 400 mallas para fragmentar o separar los aglomerados grandes.

El aerosol, ya sea que se forme a partir de partículas sólidas o líquidas, puede producirse por el generador de aerosol a una velocidad de aproximadamente 10 a 150 litros por minuto. Los aerosoles que contengan cantidades mayores de medicamento pueden administrarse más rápidamente. Típicamente, cada aerosol puede aplicarse al paciente durante un periodo de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 20 minutos, prefiriéndose un periodo de suministro de aproximadamente cinco a diez minutos. La composición en partículas que comprende el compuesto activo puede contener opcionalmente un vehículo que sirva para facilitar la formación de un aerosol. Un vehículo adecuado es lactosa, la cual puede mezclarse con el compuesto activo en cualquier relación adecuada. De nuevo, pueden incluirse también otros compuestos terapéuticos tales como amilorida, benzamilo o fenamilo. Si se desea, los compuestos activos de la presente invención pueden administrarse concurrentemente con 5'-trifosfato de uridina (UTP) o un análogo del mismo (incluyendo las sales farmacéuticamente aceptables del mismo), en una cantidad efectiva para estimular la secreción de cloruro de las células epiteliales respiratorias (y con esto hidratar más las secreciones de moco pulmonar). Las formulaciones que contienen amilorida, benzamilo o fenamilo también pueden contener UTP o un análogo del mismo en una cantidad efectiva para estimular la secreción de cloruro de las células epiteliales respiratorias. El UTP y análogos del mismo que pueden usarse para llevar a cabo esta técnica se describen en la patente de E.U.A. No. 5,292,498 a Boucher. La presente invención se explica en mayor detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos están diseñados para ser ilustrativos de la invención, y de ninguna manera deberán tomarse como limitativos de la misma. En los siguientes ejemplos, se obtuvieron UTP y ATP de Pharmacia (Uppsala, Suecia), y el UDP y hexocinasa fueron de Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN). El [3H]7)yo-inositol (120 Ci/mmol) fue de ARC (San Luís, Mo) y [3H]UTP y [3H]ATP (97% y 99% puros, respectivamente) (17-20 Ci/mmol) fueron de Amersham (Arlington Heights, IL). La cámara de perfusión en miniatura descrita en la presente fue provista amablemente por el personal de E. Larsen's laboratory (Zoophysiological Laboratory A, August Krogh Institute, Universidad de Copenhagen, Dinamarca). Las abreviaturas usadas en los siguientes ejemplos son como sigue: °C significa grados centígrados; h significa horas; min. significa minutos; seg. significa segundos, nm significa nanómetros; g significa gramos, ng significa nanogramos, mg significa miligramos, L significa litro, mL significa mililitro, mmole significa milimoles, µmol significa micromoles, Ci significa curies, µCi significa microcuries y DMEM significa Dulbecco's Modified Eagle's Médium.

EJEMPLO 1 Métodos: Cultivos de células Se cosecharon células epiteliales nasales humanas de turbinados usando proteasa XIV (Sigma, San Luís, MO) durante 24-28 h a 4°C, como se describió previamente. R.Wu, y otros, Am. Rev. Respir. Dis. 132, 311-320 (1985). Se hicieron mediciones de Ca2+ citosólico y fosfato de inositol en monocapas de células nasales colocadas sobre placas en filtros Transwell Col porosos (tamaño de poro 0.45 µm; Costar, Cambridge, MA) y se mantuvieron en medios F12 de Ham complementados con 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 3.75 ng/mL de factor de crecimiento de células endoteliales, 500 ng/mL de hidrocortisona, 5 mg/mL de insulina y 1 mM de CaC (F12 de Ham + medio 4X). Las pruebas se llevaron a cabo 7 a 10 días después del cultivo, un tiempo que coincidió con el desarrollo de la diferencia potencial transepitelial máxima de acuerdo con N. Nakahata & T. K. Harden, Biochem. J. 241 , 337-344 (1987).

EJEMPLO 2 Métodos: Medición de fosfatos de inositol Células epiteliales nasales humanas confluentes como las descritas en el ejemplo 1 se marcaron durante 18 horas en DMEM libre de inositol que contenía 4.5 g/L de glucosa y 5 µCi/mL de [3H]myo-inositol. Estas células se preincubaron con 10 mM de LiCI y se atacaron con agonistas durante 10 minutos adicionales. No se hicieron cambios de medio después de la adición del [3H]myo-inositol para evitar la liberación de ATP endógeno de las células estresadas. E.R. Lazarowski y otros, Br. J. Pharmacol. 116, 1619-1627 (1995). Las incubaciones concluyeron con la adición de 5% de ácido tricloroacético enfriado en hielo y los fosfatos de [3H]inositol resultantes se separaron en columnas Dowex AG1-X8 como se describe en A. M. Paradiso y otros, Nature 377, 643-646 (1995).

EJEMPLO 3 Métodos: Mediciones combinadas de Ca2+ citosólico y bioeléctrico Las células nasales cultivadas sobre filtros Transwell Col fijadas a abrazaderas se mantuvieron en medio F12 + 4X y se estudiaron 7-10 después de la colocación de las células en placas como se describió arriba. Para las mediciones de Ca2+b las células se cargaron con Fura-2 y se montaron en una cámara Ussing en miniatura sobre el portaobjetos de un microscopio (Zeiss) acoplado a un microfluorímetro, y se cuantificaron los niveles de Ca2+i citósolico como se describió previamente en Paradiso y otros, supra. La la relación de intensidad de fluorescencia (excitación 340/380; emisión ? 450 nm) se reunió de un campo de 30-40 células nasales sobre monocapas y se convirtió en Ca2+ como se describió previamente en E. H. Larsen y otros, J. Physiol. 424, 109-131 (1990). Para las mediciones simultáneas de la secreción de CI", se midió la diferencia potencial transepitelial (TEP) por un Voltage-Champ/Pulse Generator (Modelo VCC600, Physiologic Instruments, San Diego, CA) y se registró en una grabadora de dos canales (Linsesis Modelo L200S). Para calcular los cambios en la corriente secretora de CI" (?lcí ), un pulso de corriente definido de 1 seg. se proveyó a través de la monocapa cada 10 seg. El tejido nasal se convirtió de su estado absorbente Na+ nativo en su estado secretor de CI" exponiendo las monocapas a un medio luminal que contenía 0 Na+bajo CI" y a un medio basolateral de solución de Ringer de bicarbonato de Krebs.

EJEMPLO 4 Métodos: Hidrólisis de T3H1UTP Y r3H1UDP Se cultivaron monocapas nasales hasta confluencia en 6.5 mm de Transweils (Costar) como se indicó arriba. Las células se lavaron dos veces y se preincubaron con 300 µl de medio DMEM regulado en pH con HEPES (pH, 7.4) durante por lo menos una hora antes de la adición de los [3H]-nucleótidos para asegurar que cualquier ATP endógenamente liberado fuera degradado. Las incubaciones se iniciaron con la adición de 2 µM de [3H]UTP o [3H]UDP (0.5 µCi cada uno) a cada superficie de células. Las incubaciones concluyeron en los tiempos indicados transfiriendo el medio a un tubo que contenía 30 µl 50 mM de EDTA y sometiendo a ebullición durante 2 minutos.

EJEMPLO 5 Métodos: Prueba de nucleósido difosfocinasa (NDPK) Para probar la presencia de actividad ecto-NDPK, se incubaron células con [3H]UDP como se detalló arriba y se incluypo ATP (100 µM) en el medio de incubación. La conversión dependiente de ATP de [3H]UDP en [3H]UTP se cuantificó como se describió previamente en E. R. Lazarowski y otros., Br. J. Pharmacol. 117, 203-209 (1995).

EJEMPLO 6 Métodos: Análisis de CLAR Los nucleótidos se separaron mediante CLAR (Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Columbia, MD) por medio de una columna de intercambio aniónico fuerte (Rainin Instrument Co., Emeryville, CA) usando un sistema de dos solventes que consistía de regulador de pH A (45 mM de formiato de amonio, pH 4.6) y regulador de pH B (250 mM de fosfato de sodio, pH 2.7). Se desarrolló un gradiente lineal a partir de 100% de regulador de pH A a 100% B durante los primeros 25 minutos. La columna se eluyó después con 100% de regulador de pH B durante los siguientes 15 minutos y con 100% de regulador de pH A durante 15 minutos adicionales de 45 a 60 minutos. La absorbancia a 260 nm se monitoreó con un detector UV LSA (Shimadzu) y la radioactividad se monitoreó en línea con un detector Flo-One (Packard Instrument Co., Meridien, CT). Se cuantificaron [3H]nucleótidos y [3H]nucleósidos como se describió previamente. Id.

EJEMPLO 7 Métodos: Conversión enzimática de UTP en UDP El delineado preciso de las selectividades farmacológicas de receptores de nucleótido se ve obstaculizado por impurezas presentes frecuentemente en soluciones de nucleótidos y por una interconversión potencial catalizada por ecto-enzima entre trifosfo- y difosfonucleótidos. Las preparaciones comerciales de UDP contenían hasta 2% de UTP. Los experimentos se llevaron a cabo para evaluar la eficacia de hexocinasa en convertir UTP en UDP. Se sabe que en presencia de glucosa, la hexocinasa transfiere el ?-fosfato de ATP a glucosa, dandooADP y 6-fosfato de glucosa como productos. E.A. Barnard, Meth. Enzymol. 42, 6-20 (1975). Aunque ATP es el substrato que se prefiere para hexocinasa, también sirven otros trifosfatos de nucleósido como donadores de ?-fosfato aunque a velocidades de reacción más lentas. Id. Se determinó que la incubación de 1 mM de UTP con 10 U/mL de hexocinasa da como resultado una conversión cuantitativa de UTP en UDP. Las incubaciones se llevaron a cabo a 37°C en 1 mL de medio DMEM regulado en pH con HEPES (pH 7.4) que contenía 25 mM de glucosa y 1 mM (0.5 µCi) de [3H]ATP o [3H]UTP. En los tiempos indicados, se añadió 5 mM de EDTA a las muestras, seguido por ebullición. Los resultados se expresan como la conversión porcentual de trifosfato de [3H]nucleótido en difosfato de [3H]nucleótido. Los datos indican el valor promedio de un experimento que representa dos experimentos independientes llevados a cabo con muestras duplicadas que fueron diferentes en menos del 20%. En vista de estos resultados, y para asegurar que ningún UTP contaminara UDP, soluciones de UDP (1mM) se pre-incubaron rutinariamente con 10 U/mL de hexocinasa y 25 mM de glucosa durante 1 hora antes de las pruebas.

EJEMPLO 8 Métodos: Síntesis de f3H1UDP Se preparó [3H]UDP incubando [3H]UTP con hexocinasa y glucosa seguida por ebullición durante 2 minutos como se indicó arriba.

EJEMPLO 9 Metabolismo de Í3H1UDP y f3H1UTP por superficies de células epiteliales de vías respiratorias humanas Se incubaron células polarizadas confluentes durante 20 minutos a 37°C en presencia de 1 µM (0.2 µCi) de [3H]UTP, [3H]UDP o [3H]UDP combinado con 100 µM de ATP. Todas las adiciones fueron al baño de mucosa (volumen final de 300 µl). Las incubaciones concluyeron transfiriendo el medio de mucosa a un tubo Eppendorf que contenía 30 µl 50 mM de EDTA, seguido por ebullición. Las especies [3H] se separaron mediante CLAR como se indicó en el ejemplo 6. Los resultados de este experimento se ilustran en los rastros de CLAR de la figura 2A (incubación con [3H]UTP), Fig. 2B (incubación con [3H]UDP) y Fig. 2C (incubación con [3H]UDP combinado con 100 µM de ATP). Cada rastro es representativo de por lo menos tres experimentos independientes llevados a cabo por duplicado. La incubación de 1µM de [3H]UTP durante 20 minutos sobre la superficie de mucosa dio como resultado 73 ± 16% de hidrólisis, indicando la presencia de ecto-nucleotidasas y/o fosfatasas. El [3H]UDP se acumuló como el principal producto de degradación de [3H]UTP, como se muestra en la fig. 2A. También se hidrolizo [3H]UDP (1 µM) de mucosa, aunque en un menor grado que [3H]UTP, como se muestra en la fig. 2B. Los experimentos de curso de tiempo indicaron que los valores de vida media (ti/2) para [3H]UTP y [3]UDP de mucosa fueron 14 ± 2 min y 27 ± 3 min, respectivamente (no mostrados). La hidrólisis de [3H]UTP y [3H]UDP sobre la superficie de células epiteliales nasales humanas se determinó en ambas superficies de células mediante los siguientes procedimientos: cultivos primarios de células HNE se cultivaron hasta confluencia sobre Transweils de 6.5 mm como un epitelio polarizado. Las células se lavaron dos veces con medio DMEM-HEPES precalentado (pH 7.4), y se preincubaron durante 1 hora a 37°C con 0.5 mL de medio añadido sobre cada lado. Las incubaciones se iniciaron con la adición de 50 µl de 10 µM (0.5 µCi) [3H]UTP o [3H]UDP sobre la superficie de células indicada. Se recogieron muestras de medio durante un periodo de incubación de 20 min. y se analizaron mediante CLAR como se describió en el ejemplo 6. Los resultados de estos experimentos se resumen en el siguiente cuadro 1. Los valores representan el promedio (escala + de la media) de dos experimentos llevados a cabo con muestras por duplicado. Hidrólisis de nucleótido DE MUCOSA DE SEROSA [3H]UTP 17±22 98±11 [3H]UDP 87±6 70+9 La nucleósido difosfocinasa cataliza la transferencia del ?-fosfato de trifosfatos de nucleósido a difosfatos de nucleósido. Se ha observado previamente que la presencia de una actividad nucleósido difosfocinasa sobre la superficie de células de astrocitoma humano 1321 N1 convierte UDP (y ADP) en UTP (o ATP), y confunde los análisis de los efectos farmacológicos de difosfonucleótidos. Para examinar la presencia potencial de actividad ecto-nucleósido difosfocinasa en células epiteliales de vías respiratorias, se añadió [3H]UDP a la superficie de mucosa en combinación con ATP. Estos resultados se muestran en la figura 2C. [3H]UTP se formó rápidamente bajo estas condiciones, y se obtuvieron resultados similares con 0.1 µM o 100 µM de [3H]UDP. También se obtuvieron resultados comparables en experimentos examinando la actividad nucleósido difosfocinasa sobre el lado de serosa. Ya que la liberación de ATP potencial de células epiteliales durante las manipulaciones de tejido y la fosforilación consecuente de UDP en UTP por nucleósido difosfocinasa pueden complicar el estudio de las acciones de UDP, se incluyeron hexocinasa (2 U/mL) y glucosa en todas las pruebas subsecuentes examinando los efectos de UDP, como se explicó arriba. No ocurrió acumulación alguna de [3H]UTP bajo estas condiciones de incubación.

EJEMPLO 10 Actividad de UDP en superficie de células epiteliales nasales humanas Se ha establecido que cultivos primarios de células epiteliales de vías respiratorias humanas polarizadas expresan receptores P2Y2 sobre ambas superficies de células. S. J. Masón y otros, Br. J. Pharmacol. 103, 1649-1656 (1991 ). Se ha reportado también que la expresión funcional del receptor P2Y2 en células epiteliales nasales humanas polarizadas es asimétrica y que el receptor aparentemente se acopla más eficazmente a su fosfolipasa C efectora sobre la superficie de serosa (basolateral) que sobre la superficie de mucosa (apical). Paradiso y otros, supra. Consistente con este estudio anterior, UTP (100 µM) promovió mayores respuestas de fosfato de [3H]inositol y calcio cuando se aplicó al baño basolateral de células epiteliales nasales humanas primarias polarizadas, que cuando se aplicó al baño de mucosa, como se muestra en las figuras 3A y 3B. Los resultados de las figuras 3A y 3B se obtuvieron después de que células confluentes se cargaran con [3H]myo-¡nositol y se preincubaran con LiCI (Fig. 3A) o con Fura-2 (Fig. 3B), como se describió anteriormente en los ejemplos 2 y 3. Las células se atacaron con 100 µM del nucleótido indicado, añadido al medio de serosa o mucosa. Las respuestas secretoras de CI" (?lcQ después de la adición de 100 µM de UTP al baño de mucosa o serosa fueron 74±11 µA/cm2 y 34±3 µA/cm2, respectivamente. La aplicación de UDP al baño de serosa tuvo un efecto insignificante en la acumulación de fosfato de inositol. En contraste, UDP de mucosa (100 µM) promovió una marcada acumulación de fosfatos de [3H]inositol y movilización de calcio, y los efectos máximos de UDP fueron aproximadamente la mitad de la magnitud de las respuestas observadas con UTP de mucosa, como se muestra en las figuras 3 y 4. Similarmente, el UDP de mucosa pero no de serosa estimuló la secreción de Cl" (?ICI"=16±3 µA»cm2 para 3 µM de UDP de mucosa; ?ICI"=0±0 Aµ«cm2 para 3 µM de UDP de serosa) y la magnitud de esta respuesta fue de aproximadamente la mitad de la respuesta de UTP de mucosa (mostrado en la figura 4). Los efectos de la aplicación en mucosa de UDP no pueden explicarse por la activación de receptores P2Y2 ya que UDP libre de UTP es esencialmente inactivo en el receptor P2Y2 (Nicholas y otros, supra), y ya que UDP causó muy poco o ningún efecto cuando se aplicó al lado de serosa que expresa receptor P2Y2 de las monocapas de células (figuras 3 y 4). Los resultados de la figura 4 se obtuvieron después de que cultivos primarios de células epiteliales nasales humanas fueron montados sobre cámaras Ussing modificadas como se detalló arriba en el ejemplo 3. Los cambios en la concentración de Ca2+ (rastros superiores) o en la asociación de CI" (rastros inferiores) se registraron simultáneamente después de la adición al medio basolateral de 100 µM de UDP seguido por 100 µM de UTP (de serosa), o después de dos adiciones consecutivas de 3 µM de UDP y después de 10µM de UDP al medio apical seguidas por la adición ipsilateral de 10 µM de UTP (de mucosa). El mayor efecto de UDP en mucosa contra el efecto en serosa constrasta con los efectos predominantemente basolaterales de UTP (figura 3) y ATP. Véase, por ejemplo, Paradiso y otros, supra. De esta manera, la acción de UDP en células epiteliales de vías respiratorias polarizadas no coincidieron con la observada o con los agonistas del receptor P2Y2. Aunque UDP de mucosa fue menos eficaz que UTP de mucosa en estimular la formación de fostato de inositol en el epitelio nasal humano, UDP (EC50= 190±27 nM) y UTP (EC50=280±35 nM) exhibieron potencias similares, como se muestra en la figura 5. Los resultados de la figura 5 se obtuvieron después de marcar células confluentes con [3H]r77yo-inositol, preincubadas con LiCI como se describió arriba, y atacadas subsecuentemente durante 10 minutos con la concentración indicada de UDP o UTP añadida al medio de mucosa. Se llevaron a cabo experimentos de desensibilización cruzada para resolver mejor la hipótesis de que el UDP promueve respuestas de señalización en células de vías respiratorias a través de un receptor diferente al receptor P2Y2. La adición de 3 µM de UDP al baño de mucosa promovió la movilización de calcio intracelular con un ?Ca2+ de 66 ± 12 nM, y cambios en las respuestas secretoras de CI" (?ICI ) de -16.3 ± 3 µA/cm2 (n = 8). La adición subsecuente de 3 µM de UDP seguida por 10 µM de UDP no dio como resultado la elevación de Ca++ (?Ca2+ = 0) intracelular o en la secreción de CI" (?ICI" = 0), lo cual sugiere la ocurrencia de desensibilización inducida por UDP (véase figura 4). En contraste, se mantuvieron las respuestas a UTP (células de control, ?Ca2+=374±24 nM [n=19]; ?ICI"=-74±11 µA/cm2 [n=12]; células tratadas con UDP, ?Ca2+=310±35 mM [n=8]; ?CI"=-61±10 nM [n=8]). Las respuestas ATP también se mantuvieron después de adiciones múltiples de UDP.

EJEMPLO 11 Resultados de la prueba de análisis de UDP Los resultados presentados arriba ilustran que aunque UDP no es un agonista del receptor P2Y2, no obstante es un potente agonista en la superficie de células epiteliales de vías respiratorias humanas. Los efectos de UDP no podrían atribuirse a la contaminación con UTP. Soluciones de UDP se pre-incubaron con hexocinasa y glucosa para eliminar cualquier rastro de UTP, y hexocinasa y glucosa se incluyeron en estudios de células epiteliales para evitar la conversión metabólica de UDP en UTP por nucleósido difosfocinasas de superficie de célula y ATP liberado endógenamente. El análisis por CLAR de soluciones de UDP antes y después de la incubación con células indicó la ausencia de UTP. La potencia casi igual de UDP y UTP en las células de vías respiratorias contrasta notablemente con la actividad aparente baja de UDP en receptores P2Y2. La asimetría del efecto de UDP en epitelio polarizado, con una actividad de mucosa contra serosa preferida, contrasta también con el efecto en serosa predominante de UTP (y ATP) en células de vías respiratorias. Ya que UDP no activa el receptor P2Y2 de células epiteliales, la explicación para el efecto estimulador de este difosfato es la existencia de un receptor de vías respiratorias novedoso que reconoce selectivamente UDP. Las implicaciones potenciales de estos resultados son dobles.

Primero, demuestran que en presencia del receptor P2Y2 aparentemente más abundante, pueden establecerse condiciones de prueba que permitan la resolución de un receptor que sea activado selectivamente por UDP. Específicamente, hexocinasa y glucosa pueden utilizarse para estudiar los efectos de UDP en tejidos cuando los efectos UDP-selectivos sean enmascarados de otra manera por un receptor P2Y2 prominente. Segundo, la simetría de los efectos de UDP y UTP en células epiteliales polarizadas indica funciones reguladoras diferentes para los receptores que reconocen estos dos nucleótidos. Los activadores de receptores sobre la superficie de serosa pueden liberarse en lugares distantes y tener acceso a los receptores a través del torrente sanguíneo, mientras que UDP, el cual actúa exclusivamente sobre el lado de mucosa de células epiteliales de vías respiratorias, puede generarse localmente. Sin embargo, UTP de mucosa es hidrolizado a una velocidad 2 a 3 veces más rápida que UDP de mucosa, y en consecuencia, UDP se acumula posiblemente sobre la superficie apical después de la degradación de UTP. De esta manera, el UTP liberado podría ser una fuente importante de UDP extracelular, que a su vez sirva potencialmente como una molécula de señalización fisiológicamente importante en el tejido de vías respiratorias humanas EJEMPLO 12 Efecto de UDP en la aclaración mucociliar en ovejas A ovejas adultas saludables se les administró albúmina de suero marcada con 99mTc (99mTc-HCA) mediante un aerosol nebulizado. La (99mTc-HCA) (20 mCi) se administro durante 5 minutos a través de un tubo nasotraqueal inducido bajo anestesia local y con lidocaína al 2%. Después de la administración de 99mTc-HCA, a los animales se les administró el compuesto de prueba UDP. El compuesto de prueba se administró mediante nebulización en un volumen de 4 mL durante un periodo de 10-12 min. El compuesto de pruebas se administró a una dosis de 400 µmol. Después de la administración del compuesto de prueba los animales fueron extubados. El aclaramiento de las partículas marcadas radioactivamente se monitoreó con una cámara de rayos gamma. Las mediciones se hicieron a 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105 y 120 minutos. Los resultados de este estudio (n=7) han mostrado que el compuesto de prueba promueve el aclaramiento de partículas marcadas radioactivamente cuando se comparan con los del control de solución salina. El efecto máximo para 400 µmol de UDP fue de 33.6 ± 1.6% de aclaramiento. La respuesta a UDP fue máxima a 60 minutos y se mantuvo durante la segunda hora del estudio. Los resultados de ese experimento se ilustran gráficamente en la figura 6.

EJEMPLO 13 Efecto de UDP en la velocidad de moco traqueal en ovejas Para medir el efecto de UDP en la velocidad de moco traqueal (TMV), los conductos nasales de ovejas adultas consientes se anestesiaron con una solución de lidocaína al 2%. Después de producir la anestesia local, se colocó un tubo endotraqueal modificado (7.5 mm) de manera tal que la bocamanga quedara justo abajo de las cuerdas vocales (como se verifica por fluoroscopía). El aire inspirado se calentó y humidificó. La bocamanga sobre el tubo endotraqueal se infló únicamente durante la administración del compuesto de prueba para reducir al mínimo el posible deterioro de la TMV por la bocamanga. Los compuestos de prueba se administraron mediante nebulización en un volumen de 4 mL durante un periodo de 10-12 minutos. La TMV se midió mediante fluoroscopía. Diez a veinte discos radiopacos (teflón/trióxido de bismuto; 1 mm de diámetro; 8 mm de grosor, que pesaban 1.8 mg) se introdujeron en la traquea a través de un catéter de succión modificado con un cojinete de aire comprimido (3-4 L/min). Las velocidades de los discos individuales se grabaron en forma de cinta de video en una unidad intensificadora de imagen portátil. Las velocidades de discos individuales se calcularon midiendo la distancia recorrida por cada disco durante un periodo de observación de un minuto. Los valores reportados son las medias de las velocidades de disco individual. Las ovejas usaban collares, los cuales se usaron como un parámetro para corregir errores de ampliación inherentes en el fluoroscopio. UDP (400 µmol; 4 mL de un 10"1 M) produjo efectos significativos en la velocidad de moco traqueal. El UDP produjo un efecto máximo de 121 ±8& de línea de base (error estándar promedio, n=6). El UDP produjo sus efectos máximos 15 minutos después de la administración. Sin embargo, cuando se hicieron comparaciones por pares, sólo el punto de tiempo inmediatamente después de la dosificación (t=0) fue significativamente diferente del grupo de tratamiento con solución salina. Los resultados de este experimento se ilustran gráficamente en la figura 7.

EJEMPLO 14 Síntesis de análogos de UDP y de la actividad en P2Y^de análogos El siguiente método se usó para medir la acumulación de fosfato de inositol de los análogos de UDP descritos en este ejemplo como fármacos. Células de astrocitoma 1321 N1 , que sobreexpresaban establemente el receptor P2Y6 humano (Nicholas, y otros, Mol. Pharmacol. 50, 224-229 (1996)), se cultivaron en placas de 96 cavidades (7500 células/cavidad) en DMEM-H complementado con 10% de FCS. Después de 48 horas, el medio de cultivo se reemplazó con DMEM-H libre de inositol complementado con 2.5% de FCS dializado y ["3H]-inositol (0.2 uCi/cavidad) para marcar radioactivamente grupos de fosfolípidos responsivos a hormona. Las células se estimularon 48 horas después. En el momento de la prueba, los medios de cultivo se complementaron con 25 mM de HEPES (pH 7.4) y 10 mM de LiCI2 para evitar la hidrólisis de fosfatos de [~3H]-inositol. Además, se añadió hexocinasa (0.3 U/cavidad) y glucosa (concentración final de 50 mM) a los cultivos para proveer un mecanismo enzimático para el agotamiento de trifosfatos de nucleósido que contaminaban soluciones de fármaco o liberados de células antes o durante las reacciones de estimulación de células. Los fármacos se diluyeron en solución salina regulada en pH con fosfato que contenía hexocinasa/glucosa y se incubaron a 37°C durante 30 minutos antes de la adición a las células. Las reacciones concluyeron 60 minutos después mediante la aspiración rápida de medios seguida por la adición de EDTA enfriado con hielo (1.0 mM) y la incubación sobre hielo durante por lo menos 15 minutos antes de la resolución de fosfatos de ["3H] mediante cromatografía de intercambio iónico como la descrita (Brown y otros, supra). Los fármacos usados en la prueba descrita arriba se sintetizaron como sigue: (Compuesto A) 5'-difosfato de 5-metiluridina 5'-Trifosfato de 5-metiluridina (0.0047 g, 0.009 mMol) se disolvió en 0.7 mL de regulador de pH Tris 1 M (pH 8.5 que contenía MgCI2 1 M), después se añadieron 0.3 mL de una solución de glucosa 0.25M en regulador de pH Tris 1 M (pH 8.5 que contenía MgCI2 1 M). Se tomó un punto de tiempo To mediante CLAR de intercambio aniónico de fase inversa. Hexocinasa (EC 2.7.1.1 , Broehringer Mannheim, de sobreproductor de levadura), 75 unidades en suspensión de sulfato de amonio 3.2M, se añadió a la reacción que se incubó a 25°C. Se tomó una CLAR a 66 horas indicando una conversión completa a difosfato sin que permaneciera trifosfato alguno. Retención de trifosfato: 17.5 minutos; retención de difosfato: 10.3 minutos. Se prepararon los siguientes 5'-difosfatos de nucleósido mediante el mismo procedimiento que el anterior, con las modificaciones indicadas.

(Compuesto B) 5'-difosfato de 4-hexiloxiuridina Incubación durante 21 días, retención de difosfato: 13.5 minutos.

(Compuesto C) 5'-difosfato de N.N-dimetilcitidina Incubación durante 30 días, retención de difosfato: 11.62 minutos.

(Compuesto D) 5'-difosfato de 4-metoxiuridina Incubación durante 20 días, retención de difosfato: 10.76 minutos.

(Compuesto E) 5'-difosfato de N-hexilcitidina Incubación durante 12 días, retención de difosfato: 11.56 minutos.

(Compuesto F) 5'-difosfato de 4-(N-morfolino) uridina Incubación durante 21 días, retención de difosfato: 10.78 minutos.

(Compuesto G) 5'-difosfato de 5-(fenilet¡n¡Puridina Incubación durante 48 horas, retención de difosfato: 13.91 minutos.

(Compuesto H) 5'-difosfato de 3-desoxiuridina Incubación durante 35 días, retención de difosfato: 8.0 minutos.

(Compuesto I) 5'-difosfato de N-ciclopentilcitidina Incubación durante 6 días, retención de difosfato: 12.24 minutos.

(Compuesto J) 5'-difosfato de 4-hexiltiouridina Incubación durante 4 días, retención de difosfato: 7.51 minutos. Se midió la actividad en P2Y6 como se describió anteriormente, con los siguientes resultados: Actividad en P2Yg (ECm en uMol) Compuesto A: 0.5 Compuesto B: 3.0 Compuesto C: 41.7 Compuesto D: 4.7 Compuesto E: 25.5 Compuesto F: 55.1 Compuesto G: 0.02 Compuesto H: 2.1 Compuesto I: 8.6 Compuesto J: 1.8 Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención y de ninguna manera deberán considerarse limitativos de la misma. En consecuencia, la invención se define por las siguientes reivindicaciones, con equivalentes de las reivindicaciones incluidos en la presente.

Claims (45)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un compuesto de la fórmula I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X4 son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R1 se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R4 tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina, en la fabricación de un medicamento para hidratar secreciones de moco de pulmón en los pulmones de un sujeto.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto de la fórmula I se administra suministrando una suspensión en aerosol de partículas respirables que comprenden un compuesto de la fórmula I a los pulmones de dicho sujeto.

3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde dichas partículas se seleccionan del grupo que consiste de partículas sólidas y partículas líquidas.

4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde dicho aerosol comprende partículas en la escala respirable.

5.- El uso de un compuesto de la fórmula I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R-i se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R4 tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina, en la fabricación de un medicamento para tratar fibrosis cística en un sujeto humano.

6.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho compuesto de la fórmula I se administra mediante la inhalación de una suspensión en aerosol de partículas respirables hacia los pulmones del paciente.

7 '.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde dichas partículas se seleccionan del grupo que consiste de partículas sólidas y partículas líquidas.

8.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde dicho aerosol comprende partículas que tienen un tamaño de partícula en la escala respirable.

9.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, que comprende además administrar concurrentemente a dicho sujeto un compuesto seleccionado del grupo que consiste de amilorida, benzamilo y fenamilo.

10.- El uso de un compuesto de la fórmula I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X4 son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R-i se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R4 tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina, en la fabricación de un medicamento para tratar discinesia ciliar primaria en un sujeto humano.

11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde dicho compuesto de la fórmula I se administra mediante la inhalación de una suspensión en aerosol de partículas respirables hacia los pulmones del paciente.

12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde dichas partículas se seleccionan del grupo que consiste de partículas sólidas y partículas líquidas.

13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde dicho aerosol comprende partículas que tienen un tamaño de partícula en la escala respirable.

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, que comprende además administrar concurrentemente a dicho sujeto un compuesto seleccionado del grupo que consiste de amilorida, benzamilo y fenamilo.

15.- El uso de un compuesto de la fórmula I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X4 son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R-i se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina, en la fabricación de un medicamento para tratar trastorno pulmonar obstructivo crónico en un sujeto humano.

16.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde dicho compuesto de la fórmula I se administra mediante la inhalación de una suspensión en aerosol de partículas respirables hacia los pulmones del dicho sujeto.

17.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde dichas partículas se seleccionan del grupo que consiste de partículas sólidas y partículas líquidas.

18.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde dicho aerosol comprende partículas que tienen un tamaño de partícula en la escala respirable.

19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, que comprende además administrar concurrentemente a dicho sujeto un compuesto seleccionado del grupo que consiste de amilorida, benzamilo y fenamilo.

20.- El uso de un compuesto de la fórmula I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X4 son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X no sean simultáneamente -H; Ri se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R4 tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina, en la fabricación de un medicamento para tratar neumonía asociada con ventilador en un sujeto humano.

21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde dicho compuesto de la fórmula I se administra mediante la inhalación de una suspensión en aerosol de partículas respirables hacia los pulmones de dicho sujeto.

22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde dichas partículas se seleccionan del grupo que consiste de partículas sólidas y partículas líquidas.

23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde dicho aerosol comprende partículas que tienen un tamaño de partícula en la escala respirable.

24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, que comprende además administrar concurrentemente a dicho sujeto un compuesto seleccionado del grupo que consiste de amilorida, benzamilo y fenamilo.

25.- El uso de un compuesto de la fórmula I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y ? son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R-i se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R4 tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina, en la fabricación de un medicamento para tratar bronquitis crónica en un sujeto humano.

26.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho compuesto de la fórmula I se administra mediante la inhalación de una suspensión en aerosol de partículas respirables hacia los pulmones de dicho sujeto.

27.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dichas partículas se seleccionan del grupo que consiste de partículas sólidas y partículas líquidas.

28.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 27, en donde dicho aerosol comprende partículas que tienen un tamaño de partícula en la escala respirable.

29.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, que comprende además administrar concurrentemente a dicho sujeto un compuesto seleccionado del grupo que consiste de amilorida, benzamilo y fenamilo.

30.- Una composición farmacéutica que comprende, juntos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, un compuesto de la fórmula I:

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X4 son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; Ri se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R4 tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad efectiva para hidratar secreciones de moco de los pulmones.

31.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque dicho vehículo se selecciona del grupo que consiste de vehículos sólidos y vehículos líquidos.

32.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque dicho compuesto de la fórmula I se selecciona del grupo que consiste de 5'-difosfato de uridina; 5'-0- (2-tiod ¡fosfato) de uridina; 5'-difosfato de 2-desoxiuridina y 5'-difosfato de 4-mercaptouridina, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

33.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque dicho compuesto de la fórmula I se selecciona del grupo que consiste de 5'difosfato de 3'-desoxiuridina; 5'-difosfato de 5-(1-feniletinil)-uridina; 5'-difosfato de 5-metiluridina; 5'-difosfato de 4-hexiltiouridina; 5'-difosfato de 4-mercaptouridina; 5'-difosfato de 4-metoxiuridina; 5'-difosfato de 4-hexiloxiuridina; 5'-difosfato de N,N-dimetilcitidina; 5'-difosfato de N-hexilcitidina, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

34.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque dicha composición comprende además un propelente.

35.- Un compuesto de acuerdo con la fórmula I:

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X4 son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R1 se selecciona del grupo que consiste de O, ¡mido, metileno y dihalogenometileno; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina; y con la condición de que dicho compuesto de la fórmula I no sea un compuesto seleccionado del grupo que consiste de 5'-difosfato de uridina; 5'- difosfato de 2-desoxiuridina; 5'-0-(2-tiod ¡fosfato) de uridina y 5'-d¡fosfato de 4-mercaptouridina.

36.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'difosfato de 3'-desoxiuridina.

37.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-difosfato de 5-(1-feniletinil)-uridina.

38.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-d¡fosfato de 5-metiluridina.

39.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-difosfato de 4-hexiltiouridina.

40.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-difosfato de 4-mercaptouridina.

41.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-difosfato de 4-metoxiuridina.

42.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-difosfato de 4-hexiloxiuridina.

43.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-difosfato de N,N-dimetilcitidina. 44.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-d¡fosfato de N-hexilcitidina. 45.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho compuesto de la fórmula I es 5'-difosfato de N-ciclopentilcitidina.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Se describen compuestos de la fórmula I:

en donde: Xi y X2 son cada uno independientemente O" o S"; X3 y X son cada uno independientemente -H o -OH, con la condición de que X3 y X4 no sean simultáneamente -H; R-i se selecciona del grupo que consiste de O, imido, metileno y dihalogenometileno; R se selecciona del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo, acilo, arilo y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste de -OR', -SR', -NR' y -NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxi, y con la condición de que R' esté ausente cuando R4 tenga un enlace doble de un átomo de oxígeno o azufre al carbono en la posición 4 del anillo de pirimidina, los cuales se usan en métodos de hidratación de secreciones de moco de pulmón y de tratamiento de trastornos pulmonares tales como fibrosis cística, neumonía asociada con ventilador, bronquitis crónica, trastorno pulmonar obstructivo crónico y discinesia ciliar primaria; se describen también composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de la fórmula I y compuestos novedosos de la fórmula I.

JN/jtc*ald*sll*eos*yac* P99/1768F