MXPA00000243A

MXPA00000243A - Proteinas secretadas

Info

Publication number: MXPA00000243A
Application number: MXPA/A/2000/000243A
Authority: MX
Inventors: Kenneth Jacobs; John M Mccoy; Edward R Lavallie; Lisa A Racie; David Merberg; Maurice Treacy; Vikki Spaulding; Michael J Agostino
Original assignee: Genetics Institute Inc
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 2000-01-05
Publication date: 2001-12-04

Abstract

La presente invención se refiere a una proteína substancialmente libre de otras proteínas de mamífero, en la preparación de un medicamentoútil para producir un efecto seleccionado del grupo que consiste en la inhibición de la angiogénesis, inhibición del crecimiento o proliferación de células de endotelio vascular, inhibición del crecimiento tumoral e inhibición del crecimiento de tejido dependiente de la angiogénesis.

Description

PROTEÍNAS SECRETADAS Campo de la Imveim ómi La presente invención provee nuevas proteínas, conjuntamente con utilidades terapéuticas, de diagnóstico e investigación para estas proteínas.

Amtecedeimtes de la IimvemciÓE Esta solicitud es una continuación-en-parte de la solicitud con número de serie 08/743 ,684, presentada el 6 de noviembre de 1996, la cual es una continuación-en-paríe de la solicitud con número de serie 08/634,325, presentada el 18 de abril de 1996. La tecnología encaminada al descubrimiento de factores de proteínas (incluyendo, por ejemplo, citocinas, tales como las linfocinas, interferonas, CSFs e interleucinas) maduró rápidamente durante la década pasada. Las ahora rutinarias técnicas de clonación de hibridación y clonación de expresión clonan novedosos polinucleótidos "directamente" en ei sentido en que ellos descansan en información directamente relacionada con la proteína descubierta (esto es, secuencia parcial de ADN/aminoácido de la proteína en el caso de la clonación de hibridación; actividad de la proteína en el caso de clonación de expresión). Las técnicas de clonación "indirecta" más recientes, tales como la clonación de secuencia señal, la cual aisla secuencias de ADN en base a la presencia de un ahora bien conocido motivo de secuencia líder secretora, así como varias técnicas de clonación de hibridación basadas cn PCR o de baja astringencia, han adelantado el estado de la técnica haciendo accesible un gran número de secuencias de ADN/aminoácido s para proteínas que se conoce que tienen actividad biológica en virtud de su naturaleza secretada en el caso de clonación de secuencias líder, o en virtud de la fuente de célula o tejido en el caso de técnicas basadas en PCR. Es a estas proteínas a quien la presente invención está dirigida.

Objetivos de la Imveim óim En una modalidad la presente invención provee una composición que comprende una proleína aislada, codificada por un polinucleótido seleccionado del grupo formado por: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: i; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 14 hasta el nucleótido 400; 5 (c) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la proteína de longitud completa que codifica la secuencia de la clona AM931, depositada bajo el número de acceso ATCC 98026; (d) un polinucleótido que codifica para la proteína de longitud completa codificada por el inserto de ADNc de la clona AM931, depositada bajo el número de acceso ATCC 98026; (e) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de la proteína madura de la clona AM931, depositada bajo el número de acceso ATCC 98026; (f) un polinucleótido que codifica para la proteína madura codificada por el inserto 15 de ADNc de la clona AM931, depositada bajo el número de acceso ATCC 98026; (g) un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende la secuencia ele aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (h) un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad biológica; 20 (i) un polinucleótido que es una variante alélica de un polinucleótido de (a)-(f) anteriores; y (j) un polinucleótido que codifica para una especie homologa de la proteína de (g) o (h) anteriores. Preferiblemente, dicho polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la 25 SEQ ID NO: 1, desde el nucleótido 14 hasta el nucleótido 400; la secuencia de nucleóüclos de la secuencia de codificación de la proteína de longitud completa de la clona AM931. depositada bajo el número de acceso ATCC 98026; o la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de la proteína madura de la clona AM931, depositada bajo cl número de acceso ATCC 98026. En otras modalidades preferidas, el polinucleótido codifica 30 para la pro teína de longitud completa o madura codificada por el inserto de ADNc de la clona f. ?????* . . . . y.f,z.k ,,... ,-.-. . A . * <MÜS» «v<i#;'» . ->- -- «•WB ^ .^J^*,,^. 4 AM931, depositada bajo el número de acceso ATCC 98026. En todavía otras modalidades % preferidas, dicho polinucleótido codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 120. En todavía otras modalidades, tal polinucleótido codifica para una proteína que comprende la secuencia 5 de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 86 hasta el aminoácido 128. En otras modalidades la presente invención provee una composición que comprende una proteína, en donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: (a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. 10 (b) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 120; (c) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 86 hasta el aminoácido 128; (d) fragmentos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y 15 (e) la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc de la clona AM931 depositada bajo el número de acceso ATCC 98026, la proteína estando substancialmente libre de otras proteínas de mamífero. Preferiblemente dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 120. o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 desde el aminoácido 86 hasta el aminoácido 128. Las composiciones de las proteínas de la presente invención pueden además comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones que comprenden un anticuerpo que reacciona específicamente con dicha proteína también son proveídas por la presente invención.

También se proveen métodos para prevenir, tratar o aliviar una condición médica, los cuales comprenden la administración a un sujeto mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende una proteína de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente tales métodos comprenden el tratar un sujeto para producir un efecto seleccionado del grupo consistente en la inhibición de angiogénesis, inhibición del crecimiento o proliferación de células de endotelio vascular. s- ¿ y inhibición de crecimiento de tumores e inhibición del crecimiento de tejido dependiente de la angiogénesis.

Breve uescppcnom de líos JLP?DMJQS La Figura 1 es una autoradiografía que evidencia la expresión de la clona AM931 en células COS (la banda expresada es indicada por un punto). La Figura 2 es una gráfica que representa el efecto de la proteína de AM931 sobre angiogénesis y proliferación celular, como se describe en el Ejemplo 1.

Descripción! Detallada de las Modalidades Preferidas. Proteínas y Polinucleótidos Aislados Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, como se determinaron aquí, sc reportan más adelante para cada clona y proteína descrita en esta solicitud. La secuencia de nucleótidos de cada clona puede ser determinada fácilmente secuenciando la clona depositada de acuerdo con métodos conocidos. La secuencia de aminoácidos pronosticada (tanto de longitud completa como madura) puede por lo tanto ser determinada a partir de dicha secuencia de nucleótidos. La secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por una clona ?a-íicula-también puede ser determinada por expresión de la clona en una célula hospedera apropiada, recolectando la proteína y determinando su secuencia. Para cada proteína identificada los solicitantes han identificado lo que ellos han determinado que es el marco de lectura más susceptible de identificación con la información de secuencia disponible al tiempo de la presentación Como se emplea en la presente descripción, una proteína "secretada" es una protema que, cuando se expresa en una célula hospedera adecuada, dicha es transportada a través de una membrana, incluyendo transporte como resultado de secuencias señal en su secuencia de aminoácidos. Las proteínas "secretadas" incluyen, sin limitación, las proteínas que son secretadas totalmente (esto es, proteínas solubles) o parcialmente (esto es, receptóles) procedentes de la célula en la que ellas son expresadas. Las proteínas "secretadas" también incluyen, sin limitación, las proteínas que son transportadas a través de la membrana del retículo endoplásmico.

Proteína "AM931" Una proteína de la presente invención ha sido identificada como proteína "AM931'*.

Una clona de ADNc parcial que codifica para AM931 fue primero aislado a partir de una biblioteca de ADNc de riñon fetal humano usando métodos que son selectivos para ADNcs que codifican para proteínas secretadas. La secuencia de nucleótidos de dicho ADNc parcial fue determinada e investigada contra las bases de datos de GenBank y Geneseq usando los protocolos de búsqueda BLASTN/BLASTX y FASTA. La búsqueda reveló cuando menos algo de identidad con un EST identificado como N30331 (clona 258078 3' de ADNc de Horno sapiens yw75e04.sl), R32076 (clona 134426 5' de ADNc de Homo sapiens yh63e02.rl), AA127732 (clona 489887 5' de ADNc de Homo sapiens NbHPU de útero preñado Soares zk88bl2.rl) y AA055091 (clona 377436 5' de ADNc de Homo sapiens NbHH19W de corazón fetal Soares zfl9g07.rl). La secuencia de aminoácidos pronosticada que se describe aquí para la AM931 fue investigada contra las bases de datos de secuencias de aminoácidos de GcnPcpt y GeneSeq usando el protocolo de búsqueda BLASTX. La proteína de AM931 pronosticada demostró cuando menos alguna identidad con secuencias identificadas como Z81 130 (T23 Gi l.8 [Caenorhabditis elegans]). El programa de computadora TopPredlI pronostica un dominio de transmembrana potencial dentro de la secuencia de la proteína de AM931 centrado alrededor del aminoácido 110 de la SEQ ID NO: 2. La clona de ADNc humano correspondiente a la entrada de la base de datos de EST fue ordenada en Genoma Systems, Inc., St. Louis, Mo, un distribuidor de la biblioteca del Consorcio I.M.A.G.E. La clona recibida del distribuidor fue examinada y se determinó que era una clona de longitud completa, incluyendo una terminación 5' y 3' UTR (incluyendo una cola poli A). Esta clona de longitud completa también se refiere aquí como "AM931". Los métodos de la solicitante identificaron la clona AM931 como codificadora de una proteína secretada. La secuencia de nucleótidos de la AM931 como se determinado en la presente es reportada en la SEQ ID NO: 1. Lo que los solicitantes creen que es que el marco de lectura apropiado y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína de AM931 con-espondienle a la secuencia de nucleótidos precedente se reportan en la SEQ ID NO: 2. El fragmento de restricción de EcoRI/Notl susceptible de obtener a partir del depósito que contienen la clona AM931 deberá ser de aproximadamente 870 bp.

Depósito de las Clonas La clona AM931 fue depositada el 17 de abril de 1996 ante la American Type Culture Collection bajo el número de acceso ATCC 98026, a partir del cual se puede obtener la clona AM931 comprendiendo un polinucleótido particular. Cada clona ha sido transfectada dentro de células bacterianas separadas (E coli) en este depósito compuesto. La clona AM931 puede ser retirada del vector en el cual fue depositada realizando una digestión con EcoRI/Notl (sitio 5', EcoRI; sitio 3', Notl) para producir el fragmento apropiado para dicha clona. La clona AM931 fue depositada en cualquiera de los vectores pED6 o pNotS descritos en la Figura 1. En algunas instancias, la clona depositada puede tornarse "volteada"1 (esto es, en la orientación inversa) en el aislado depositado. En tales casos, el inserto de ADNc todavía puede ser aislado mediante digestión con EcoRI y Notl. Sin embargo, el Notl producirá entonces el sitio 5' y el EcoRi producirá el sitio 3' para la colocación del ADNc en la orientación apropiada para la expresión en un vector adecuado. El ADNc puede también ser expresado a partir de los vectores en los que fue depositado. Las células bacterianas que contienen una clona particular pueden ser obtenidas a partir del depósito compuesto como sigue: Una sonda o sondas de oligonucleótido deben ser diseñadas para la secuencia que se conoce para esa clona particular. Esta secuencia puede ser derivada de las secuencias proporcionadas aquí, o a partir de una combinación de esas secuencias. En las secuencias enlistandas más arriba y que incluyen una N en la posición 2, esa posición es ocupada en sondas/primarios preferidos por un residuo fosfoaramidito biotilinado más que por un nucleótido (tal como, por ejemplo, ese producido por el uso de fosfoaramidito de biotin (l-dimetoxitritiloxi-2-(N-biot il-4-ai?Ínobutil)-propil-3-O-(2-cianoelil)-(N.N-diisopropil)-fosforamadito) (Glen Research, número de catálogo 10-1953)). El diseño de la sonda de oligonucleótido debe seguir preferiblemente estos parámetros: (a) debe ser diseñada para un área de la secuencia que tenga las menos base ambiguas ("N's"), si es posible; (b) debe ser diseñada para que tenga una Tm de aproximadamente 80 °C (suponiendo 2° para cada A o T y 4 grados para cada G o C). 5 El oligonucleótido debe preferiblemente estar marcado con g-32P ATP (actividad específica de 6000 Ci/mmol) y quinasa de polinucleótido T4 usando técnicas comúnmente empleadas para marcación de oligonucleótidos. También pueden emplearse otras técnicas de marcación. Las marcas no incorporadas deben ser preferiblemente eliminadas por cromatografía de filtración cn gel u otros métodos establecidos. La cantidad de radioactividad incorporada dentro de la sonda 10 debe ser cuantificada por mediciones en un contador de centelleo. Preferentemente, la actividad específica de la sonda resultante debe ser de aproximadamente 4e+6 dpm pmol. El cultivo de bacterias conteniendo el acumulado de clonas de longitud completa debe preferiblemente ser descongelado y se usan 100 µ del patrón para inocular un frasco de cultivo estéril conteniendo 25 ml de caldo L estéril conteniendo ampicilina a 100 µg/ml. EL cultivo debe preferiblemente ser hecho crecer hasta saturación a 37 °C, y el cultivo saturado úebe preferiblemente ser diluido en caldo L fresco. Alícuotas de estas diluciones preferiblemente debe ser colocadas en placa para determinar la dilución y volumen al que se producirán aproximadamente 5000 colonias distintas y bien separadas de medio bacteriológico sólido conteniendo caldo L conteniendo ampicilina a 100 µg/ml y agar a 1.5% en una caja petri de 150 mm cuando se hace crecer durante toda la noche a 37 °C. También pueden emplearse otros métodos conocidos para obtener colonias distintas y bien separadas. Los procedimientos estándar de hibridación de colonia deben ser usados entonces pa.a transferir las colonias a filtros de nitrocelulosa y lisar, desnaturalizar y cocerlas. El filtro es entonces preferiblemente incubado a 65 °C durante 1 hora con agitación suave en 6X SSC (el patrón 20X es 175.3 g de NaCl/litro, 88.2 g de citrato de sodio/hlro. ajustado a pH 7.0 con NaOH) conteniendo 0.5% SDS, 100 µg/ml de ARN de levadura, y 100 mM EDTA (aproximadamente 10 mL por filtro de 150 mm). Preferiblemente, la sonda es agregada a la mezcla de hibridación a una concentración mayor de o igual a le+6 dpm/mL. El filtro es entonces preferiblemente incubado a 65 °C con agitación suave durante toda la noche.

El filtro es preferiblemente lavado en 300 mL de 2X SSC/05% SDS a temperatura ambiente sin ¿tu . agitación, preferiblemente seguido por 500 mL de 2X SSC/0.1% SDS a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos. Es opcional un tercer lavado con 0.1X SSC/0.5% SDS a 65 °C durante 30 minutos a 1 hora. El filtro es entonces preferiblemente secado y sometido a autoradiografía durante tiempo suficiente para visualizar los positivos sobre la película de rayos x. También pueden emplearse otros métodos conocidos de hibridación. Las colonias positivas son recolectadas, hechas crecer en medio de cultivo y aisladas en ADN de plásmido usando procedimientos estándar. Posteriormente son verificadas las clonas mediante análisis de restricción, análisis de hibridación o secuenciación de ADN. También quedan comprendidos dentro de la invención los fragmentos de las proteínas de la invención que son capaces de exhibir actividad biológica. Los fragmentos de la proteína pueden estar en forma lineal o pueden ser ciclizados usando métodos conocidos, por ejemplo. como se describe en H.U. Saragovi, et al, Bio/Technology 1_0, 773-778 (1992) y en R.S.

McDowell, et al., J. Amer.Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992), las cuales se incorporan aquí como referencia. Tales fragmentos pueden ser fusionados a moléculas portadoras tales como las inmunoglobulinas para muchos propósitos, incluyendo el incremento de valencia de sitios de unión de proteínas. Por ejemplo, fragmentos de la proteína pueden ser fusionados a través de secuencias "ligadoras" a la porción Fc de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la proteína, dicha fusión podría ser a la porción Fc de una molécula de IgG. También pueden utilizarse otros isotipos de inmunoglobulina para generar dichas fusiones. Por ejemplo. una fusión proteína-IgM generaría una forma decavalente de la proteína de la invención. La presente invención también provee formas tanto de longitud completa como madura de las proteínas descritas. La forma de longitud completa de tales proteínas es identificada en el listado de secuencia mediante traducción de la secuencia de nucleótidos de cada clona descrita. La forma madura de dicha proteína puede ser obtenida mediante expresión del polinucleótido descrito de longitud completa (preferiblemente aquellos depositados con la ATCC) en una célula de mamífero adecuada u otra célula hospedera. La secuencia de la forma madura de la proteína también puede ser susceptible de determinar a partir de la secuencia de aminoácidos de la forma de longitud completa. Cuando la proteína de la presente invención está unida a membrana (por ejemplo, es un receptor), la preseníe invención también provee formas solubles de tales proteínas. En dichas formas, parte o la totalidad de los dominios intracelular y de transmembrana de la proíeína son eliminados de manera que la proteína sea completamente secretada desde la célula en la cual es expresada. Los dominios intracelular y de transmembrana de las proteínas de la invención pueden ser identificados de acuerdo con técnicas conocidas para la determinación de tales dominios a partir de información de la secuencia. Las proteínas y fragmentos de la presente invención incluyen proteínas con longitudes de la secuencia de aminoácidos que son cuando menos 25% (más preferiblemente cuando menos 50%, y más preferiblemente cuando menos 75%) de la longitud de una proteína descrita y que tienen cuando menos identidad de secuencia del 60% (más preferiblemente, cuando menos identidad del 75%; más preferiblemente cuando menos identidad del 90% o 95%) con aquella proteína descrita, en donde la identidad de secuencia es determinada comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean a fin de maximizar el traslape e identidad en tanto que se minimizan las aberturas de secuencia. También están incluidas en la presente invención proteínas y fragmentos de proteína que contienen un segmento comprendiendo preferiblemente 8 o más (más preferiblemente 20 o más, más preferiblemente 30 o más) aminoácidos contiguos que comparten cuando menos 75% de identidad de secuencia (más preferiblemente, cuando menos identidad del 85%, más preferiblemente cuando menos 95% de identidad) con cualquiera de tales fragmentos de cualquiera de las proteínas descritas. También se provee por la presente invención especies homologas de las proteínas descritas. Las especies homologas pueden ser aisladas e identificadas preparando sondas o primarios apropiados a partir de las secuencias aquí proveídas y tamizando una fuente de ácido nucleico procedente de las especies deseadas. La invención también abarca variantes alélicas de las proteínas descritas; esto es, formas alternativas que ocurren en forma natural de las proteínas aisladas que son idénticas, homologas o relacionadas con aquella codificada por los polinucleótidos aquí descritos. La invención también incluye polinucleótidos con secuencias complementarias a aquellas de los polinucleótidos descritos aquí. El polinucleótido aislado que codifica a la proteína de la invención puede estar operativamente ligado a una secuencia de control de expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991), con el objeto de producir ré&rnbinantemente la proteína. Se conocen en la técnica muchas secuencias apropiadas de control de f expresión. También se conocen métodos generales para expresar proteínas recombinantes y se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990). Según se define aquí, "operativamente ligado" significa que el polinucleótido aislado de la invención y una secuencia de control de expresión están situadas dentro de un vector o célula, en forma tal que la proteína es expresada por una célula hospedera que ha sido transformada (transfectada) con la secuencia del polinucleótido ligado/control de expresión. Un número de tipos de células pueden actual- como células hospederas adecuadas para la expresión de la proteína. Las células hospederas de mamífero incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), células de riñon humano 293, células A431 de epidermis humana, células Colo205 humanas, células 3T3, células CV-1. otras líneas celulares transformadas de primate, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK, HL-60, U937, HaK o Jukart. Alternativamente, la proteína puede ser producida en eucariotes inferiores tales como levaduras o en procariotes tales como bacterias. Las cepas apropiadas y potenciales de levaduras incluyen a las cepas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe. Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Las cepas apropiadas y potenciales de bacteria incluyen la Escherichia coli. Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterológas. Si la proteína es hecha en levaduras o bacteria, puede ser necesario modificar la proteína producida allí, por ejemplo, mediante fosforilación o glicosilación de los sitios apropiados, con el objeto de obtener la proteína funcional. Dichos anexos covalentes pueden ser realizados usando métodos químicos o enzimáticos conocidos. La proteína también puede ser producida ligando operativamente el polinucleótido aislado de la invención a secuencias de control apropiadas en uno o más vectores de expresión de insectos y empleando un sistema de expresión de insecto. Los materiales y métodos para sistemas de expresión en báculo virus/células de insecto están comercialmente disponibles en forma de equipos en, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, California, E.U.A. (the MaxBac® kit) y tales métodos se conocen bien en la técnica, como se describe en Summers and Smiíh. Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). que se incorpora a la presente como referencia. Como se emplea aquí, una célula de insecto capaz de expresar un polinucleótido de la presente invención esta "transformado". La proteína de la presente invención puede ser preparada mediante el cultivo de células hospederas transformadas bajo condiciones de cultivo adecuadas para expresar la proleína recombinante. La proteína expresada resultante puede entonces ser purificada del medio de cultivo (esto es, del medio de cultivo o extractos celulares) usando procesos de purificación conocidos, tales como por filtración de gel y cromatografía de intercambio iónico. La purificación de la proteína también puede incluir una columna de afinidad que contenga agentes que se unirán a la proteína; una o más etapas de columna sobre tales resinas de afinidad como A-agarosa de concavalina, heparin-toyopearl® o Cibacrom blue 3Ga Sepharose®; una o más etapas que involucren cromatografía por interacción hidrofóbica usando resinas tales como éter de fenilo, éter de butilo o éter de propilo; o cromaíografía de inmunoafinidad. Alternativamente, la proteína de la invención también puede ser expresada en una forma que facilititará la purificación. Por ejemplo, puede ser expresada como una proteína de fusión, tales como aquellas de proteínas de unión de maltosa (MBP), proteínas de glutation-S-transferasa (GST) o tioredoxina (TRX). Los equipos para la expresión y purificación de tales proteínas de fusión están comercialmente disponibles en New England BioLab (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ) y en InVitrogen, respectivamente. La proteína también puede ser etiquetada con un epitope y subsecuentemente purificada usando un anticuerpo específico dirigido a dicho epitope. Uno de tales epitopes ("Flag") está comercialmente disponible en Kodak (New Haven, CT). Finalmente, para purificar adicionalmente la proteína pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de fase inversa y alto desempeño (RP-HPLC) que usen medio de RP-HPLC hidrofóbico, por ejemplo gel de sílica que tenga colgada grupos metilo u otros grupos alifáticos. También pueden emplearse algunas o la totalidad de las etapas de purificación precedentes, en varias combinaciones, para proveer una proteína recombinante aislada y substancialmente homogénea. La proteína así purificada está substancialmente libre de otras proteínas de mamífero y está definida de acuerdo con la presente invención como una "proteína aislada." La proteína de la invención también puede ser expresada como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdos 5 u ovejas transgénicas, que se caracterizan por células germinales o somáticas que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína. La proteína de la invención también puede ser producida por técnicas convencionales conocidas de síntesis química. Los métodos para construir las proteínas de la presente invención por medios sintéticos se conocen por aquellos capacitados en la técnica. Las secuencias de proteínas construidas sintéticamente, en virtud de compartir características estructurales y/o conformacionales primarias, secundarias y terciarias con proteínas pueden poseer propiedades biológicas en común con ellas, incluyendo actividad de proteína. Así, ellas pueden ser empleadas como substitutos imunológicos o biológicamente acíivos de proíeínas purificadas, naturales, en el tamizaje de compuestos terapéuticos y en procesos im?no lógicos para el desarrollo de anticuerpos. Las proteínas proveídas aquí también incluyen proteínas caracterizadas por secuencias de aminoácidos similares a aquellas de proteínas purificadas pero dentro de las cuales se proveen modificaciones en forma natural o mediante manipulación deliberada. Por ejemplo. las modificaciones en las secuencias de péptido o de ADN pueden ser hechas por aquellos capacitados en la técnica usando técnicas conocidas. Las modificaciones de interés en las secuencias de proteínas pueden incluir la alteración, substitución, el reemplazo, inserción o deleción de un residuo aminoácido seleccionado en la secuencia de codificación. Por ejemplo, uno o más de los residuos de cisteina puede ser eliminado o reemplazado con otro aminoácido para modificar la conformación de la molécula. Las técnicas para dicha alteración. substitución, reemplazo, inserción o deleción son muy conocidas por aquellos capacitados en la técnica (ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 4,518,584). Preferiblemente, dicha alteración, substitución, reemplazo, inserción o deleción retiene la actividad deseada de la proteína. Otros fragmentos y derivados de las secuencias de proteínas que se esperaría retuvieran actividad de proteína totalmente o en parte y que pueden por lo tanto ser útiles para el tamizaje !£Sü$ u otras metodologías imnunológicas también pueden fácilmente ser hechos por aquellos capacitados en la técnica y sobre la base de la presente descripción. Se cree que dichas modificaciones quedan comprendidas dentro de la presente invención.

USOS Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA Se espera que las proteínas de la presente invención presenten uno o más de los usos o actividades biológicas (incluyendo aquellas asociadas con ensayos citados aquí) identificadas más adelante. Los usos o actividades descritas para las proteínas de la preseníe invención pueden ser proveídas por la administración o uso de dicha proteínas o medíanle la administración o uso de polinucleótidos que codifican para dichas proteínas (tales como, por ejemplo, en terapias de genes o vectores adecuados para la introducción de ADN).

Utilidades y Usos de Investigación Las proteínas proveídas por la presente invención pueden de manera similar ser usadas en ensayos para determinar su actividad biológica, incluyendo en un panel de proteínas múltiples para tamizaje de rendimiento, para ocasionar aníicuerpos o para provocar oíra respuesta inmune; como un reactivo (incluyendo el reactivo marcado) en ensayos diseñados para determinar cuantitativamente niveles de la proteína (o su receptor) en fluidos biológicos; como marcadores para tejidos en los que la proteína correspondiente es preferiblemente expresada (ya sea constitutivamente o en un estado particular de diferenciación o desarrollo de tejido o en un estado de enfermedad); y, por supuesto, para aislar receptores o ligandos correlativos. En donde la proteína se une o potencialmente se une a otra proteína (tal como. por ejemplo, en una interacción de receptor-ligando), la proteína puede ser usada para identificar la otra proteína con la cual ocurre la unión o para identificar inhibidores de la interacción de unión. Las proteínas involucradas en estas interacciones de unión pueden íambién ser usadas para tamizar péptidos o inhibidores de moléculas pequeñas o agonistas de la interacción de unión. Cualquiera de todas estas utilidades de investigación son capaces de ser desarrolladas en grado reactivo o formato de equipo para comercialización como productos para investigación. i^j m Los métodos para realizar los usos de la lista anterior son del conocimiento general para aquellos capacitados en la técnica. Las referencias que describen tales mélodos incluyen, sin limitación, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboraíory Press, Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, y "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. and A.R. Kimmel eds., 1987.

Usos Nutricionales Las proteínas de la presente invención también pueden ser utilizadas como fuentes o suplementos nutricionales. Tales usos incluyen, sin limitación, el uso como un suplemento de aminoácidos o proteínas, el uso como fuente de carbono, el uso como fuente de nitrógeno y el uso como una fuente de carbohidratos. En tales casos la proíeína de la preseníe invención puede ser agregada a la alimentación de un organismo en particular o bien puede ser administrada como una preparación sólida o líquida separada, tal como en la forma de un polvo, pildoras, soluciones, suspensiones o cápsulas. En el caso de microorganismos, la proteína de la presente invención puede ser agregada al medio en o sobre el cual el microorganismo es cultivado.

Actividad de Citocina y de Proliferación/Diferenciación Celular Una proteína de la presente invención puede exhibir actividad de citocina. de proliferación de células (ya sea de inducción o inhibición) o de diferenciación celular (ya sea de inducción o inhibición), o puede inducir la producción de otras citocinas en cieñas poblaciones de células. Muchos factores de proteínas descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las citocinas conocidas, han presentado actividad en uno o más ensayos de proliferación de células dependientes de factor, y de aquí que los ensayos sirven como una confirmación conveniente de actividad de citocina. La actividad de una proteína de la presente invención es evidenciada por uno de un número de ensayos rutinarios de proliferación de células dependientes de faclor para líneas celulares que incluyen, sin limitación, 32D. DA2, DA1 G.

TÍO, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, TI 165, HT2, CTLL2, TF-l, Mo7e y CMK.

La acíividad de la proíeína de la invención puede, enlre oíros medios, ser medida pollos siguientes métodos: Los ensayos para proliferación de timocitos o células T incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Current Protocols in Immunology, Ed. by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Marguiles, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic sludies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al, Cellular Immunology 133:327-341. 1991; Bertagnolli, eí al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowman eí al, J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994. Los ensayos para deíerminar producción y/o proliferación de células del bazo, células del nodo linfático o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. and Shevach. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol. 1 pp. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1994; y Measurernenís of mouse and human Interferon ?, Schreiber, R.D. In Current Prolocols in Immunology, J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronío, 1994. Los ensayos para determinar la proliferación y diferenciación de células hemaíopoiéíicas y linfopoiéíicas incluyen, sin limilación, aquellos descriíos en : Measuremenl of Human and Murine Iníerleukin 2 and Interleukin 4, Botlomly, K., Davis, L.S. and Lipsky. P.E. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries eí al., J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991 ; Moreau eí al., Nature 336:690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-2938. 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6 - Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991 ; Smith et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861 , 1986; Measuremení of human Iníerleukin 11 - Bennett, F. Giannotli, J. Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Prolocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.15.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991. Measurement of mouse and human Inlerieukin 9 - Ciarlella, A. Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.13.1 , John Wiley and Sons, Toronto. 1991.

Los ensayos para deíerminar las respuestas de clonas de células T a antígenos (los cuales identificarán, entre oíros, proíeínas que afecían las interacciones de células APC-T así como los efectos de células T directas midiendo la proliferación y producción de citocina) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Currení Proíocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associaíes and Wiley-Iníerscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Chapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77:6091-6095, 1980; Weinberger eí al., Eur. J. Irnmun. 11 :405-411, 1981; Takai el al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takei el al., J. Immunol. 140:508-512, 1988.

Acíividad de Esíimulación o Supresión Inmunológica Una proíeína de la presente invención puede también exhibir actividad de estimulación inmunológica o de supresión de inmunológica, incluyendo sin limitación las actividades para las cuales se han descrito aquí ensayos. Una proteína puede ser útil en el tratamiento de vanas deficiencias y desórdenes inmunológicos (incluyendo la inmunodeficiencia combinada se era (SCID)), por ejemplo, en la regulación (hacia arriba o hacia abajo) del crecimiento y proliferación de linfocitos T y/o B, así como efectuar la actividad citolííica de células NK y otras poblaciones de células. Estas deficiencias inmunológicas pueden ser genéticas o cíe causa viral (por ejemplo, HIV) así como también por infecciones bacterianas o por hongos, o pueden resultar de desórdenes auloinmunológicos. Más específicamenle, las enfermedades infecciosas causadas por virus, bacterias, hongos u otra infección pueden ser tratadas usando una proleína de la presente invención, incluyendo infecciones por HIV, virus de hepatitis, virus de herpes. micobacterias, lesmania spp, malaria spp y diversas infecciones por hongos como la candidiasis. Por supuesto, en este sentido, una proteína de la presente invención también puede ser útil en donde generalmente fuese indicado reforzar el sistema inmunológico, por ejemplo. en el traíamienío del cáncer. Los desórdenes autoinmunológicos que pueden ser tratados usando una proteína de la presente invención incluyen, por ejemplo, enfermedad de tejido conectivo, esclerosis múltiple, lupus eritromatoso sistémico, artritis reumatoidea, inflamación pulmonar autoinmune. síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis autoinmune, diabeíes melliíus dependieníe de insulina, miasíenia gravis, enfermedad de injerto versus hospedero y enfermedad de inflamación de ojos por autoinmunidad. Dicha proteína de la présenle invención lambién pude ser útil en el tratamiento de reacciones y condiciones alérgicas, tales como el asma (particularmente asma 5 alérgica) y otros problemas respiratorios. Otras condiciones, en las que se desea supresión inmunológica (incluyendo, por ejemplo, trasplante de órganos) también pueden ser tratadas usando una proteína de la presente invención. El uso de las proteínas de la invención también puede ser posible para respuestas inmunes, en un número de formas. La hiporegulación puede estar en la forma de inhibición o 10 bloqueo de una respuesta inmune ya en curso, o puede involucrar la prevención de la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de células T activadas pueden ser inhibidas mediante la supresión de respuestas de células T o induciendo la tolerancia específica cn células T, o ambas. La inmunosupresión de respuesías de células T es generalmente un proceso activo, no antígeno-específico, el cual requiere de exposición continua de las células T al 15 agente de supresión. La tolerancia, que involucra la inducción de no-respuesta o energía en células T, es susceptible de distinción a partir de la inmunosupresión porque es generalmente específico a antígeno y persiste después de que ha terminado la exposición al agente creador de tolerancia. Operacionalmente, la tolerancia puede ser demostrada por la falta de una respuesta de célula T bajo re-exposición a un antígeno específico en la ausencia del agente creador de 20 tolerancia. La hiporegulación o prevención de una o más funciones antígenas (incluyendo sin limitación funciones de antígeno de linfocito B (íal como, por ejemplo, B7)), por ejemplo, previniendo la síntesis de linfocina de alio nivel mediante células T activadas, será útil en situaciones de transplantes de tejido, piel y órganos y en enfermedad de injerto \ ersus 25 hospedero (GVHD). Por ejemplo, el bloqueo de la función de células T debería resultar en la destrucción reducida de tejido en transplantes de tejido. Típicamente, en transplantes de tejido. el rechazo del transplante es iniciado a través del reconocimiento como extraño por las células T, seguido por una reacción inmune que destruye el transplante. La administración de una molécula que inhiba o bloquee la interacción de un antígeno de linfocilo B7 con su(s) 30 ligando(s) natural(es) en células inmunes (tales como una forma monomérica soluble de un ^;^^^^^ ^^»a^3^^^^s.^^.1 ^ , péptido que íiene acíividad B7-2 sola o en conjunto con una forma monomérica de un pépíido que tiene una actividad de oíro antígeno de linfocito B (por ejemplo, B7-1, B7-3) o aníicuerpo de bloqueo), aníes del íransplante puede conducir a la unión de la molécula al (los) ligando(s) natural(es) en las células inmunes sin la transmisión de la correspondiente señal co- 5 estimulante. El bloqueo de la función antígeno del linfocito B en este caso previene la síntesis de citocina por células inmunes, tales como células T, y así actúa como un inmunosupresor. Más aún, la falta de co-estimulación también puede ser suficiente para anergizar las células T, induciendo de esta forma tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia de larga duración por reactivos de bloqueo de antígeno de linfociío B puede evitar la necesidad de 10 administración repetida de estos reactivos de bloqueo. Para lograr suficiente inmunosupresión o tolerancia en un sujeto, puede también ser necesario bloquear la función de una combinación de antígenos de linfocito B. La eficacia de un reactivo de bloqueo particular en la prevención de un rechazo del transplante de un órgano o GVHD puede ser evaluada usando modelos animales que sean capaces de predecir la eficacia en humanos. Ejemplos de sistemas apropiados que puedan ser usados incluyen injertos cardiacos alogeneicos en ratas e injertos de células isleta, pancreáticas xenogenéicas en ratones, ambas de las cuales han sido usadas para examinar los efectos inmunosupresores de proteínas de fusión CTLA4Ig in vivo como se describe en Lenschow el al., Science 257:789-792 (1992) y Turka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 11102-1 1 105 (1992). Además, pueden usarse modelos de murino de GVHD (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-847 para determinar el efecto de bloqueo de la función antígeno de linfocito B in vivo en el desarrollo de esa enfermedad. El bloqueo de la función antígeno también puede ser terapéuticamente útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Muchos desórdenes autoinmunes son el resultado de la activación inapropiada de células T que son reactivas contra el mismo tejido y la cual promueve la producción de citocinas y auto-anticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de células T autoreactivas puede reducir o eliminar síntomas de la enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la coestimulación de células T rompiendo las interacciones receptor: ligando de los antígenos de linfocitos B, puede utilizarse para inhibir la activación de células T y de esta manera prevenir pki ?- -* X&t- A Gr . la producción de auto-anticuerpos o citocinas que se derivan de células T que pueden estar involucradas en el proceso enfermizo. De manera adicional, los reactivos de bloqueo pueden inducir la tolerancia específica al antígeno, de células T autoreactivas lo cual podría conducir al alivio de larga duración de la enfermedad. La eficacia de los reactivos de bloqueo en la prevención o mejoramiento de los desórdenes autoinmunes puede ser determinada mediante el uso de un número de modelos de animal bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Los ejemplos incluyen encefalitis autoinmune experimental de murino, eritomalosis de lupus sistémica en ratones MRL/lpr/lpr o ratones NZB híbridos, artritis de colágeno autoinmune de murino, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia gravis experimental de murino (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York. 1989, pp. 840-856). La sobreregulación de una función antígeno (preferiblemente una función antígeno de linfociío B), como un medio de sobre regular respuestas inmunes, también puede ser útil cn terapias. Las sobreregulación de respuestas inmunes puede ser en la forma de mejorar una respuesta inmune existente o provocar una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, el mejorar una respuesta inmune a través de la estimulación de la función antígeno de linfocito B puede ser útil en casos de infección viral. Además, enfermedades virales sistémicas íales como la influenza, el resfriado común y la encefalitis podrían ser aliviadas medíanle la administración sistémica de formas estimulantes de antígenos de linfocitos B. Alternativamente, las respuestas inmunes anti -virales pueden ser mejoradas en un paciente infectado mediante la remoción de células T del paciente, coestimulando las células T in vitro con APCs pulsadas de antígeno viral ya sea expresando un péptido de la presente invención o conjuntamente con una forma estimulante de un péptido soluble de la presente invención y reintroduciendo las células T activadas in vitro dentro del paciente. Otro método para mejorar las respuestas inmune anti-virales consistiría en aislar células infectadas de un paciente, transfectarlas con un ácido nucleico que codifica para una proteína de la presente invención como se describió aquí, de manera que las células expresen toda o una parle de la proteína sobre su superficie, y reintroducir las células transfecíadas dentro del paciente. Las células infectadas serían ahora capaces de entregar una señal co-estimulaníe a, y de esta forma activar, las células T in vivo.

En olra aplicación, la sobreregulación o mejoramienío de la función aníígeno (preferiblemenle función antígeno de linfocitos B) podría ser útil en la inducción de inmunidad tumoral. Las células de tumor (por ejemplo, sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, carcinoma) transfectadas con un ácido nucleico que codifica para cuando menos un péptido de la presente invención pueden ser administradas a un sujeto para superar la tolerancia especifica al tumor en el sujeto. Si se desea, las células de tumor pueden ser transfectadas para expresar una combinación de péptidos. Por ejemplo, las células de tumor obtenidas de un paciente pueden ser transfectadas ex vivo con un vector de expresión que dirige la expresión de un pépíido que tiene actividad similar a B7-2, solo o en combinación con un péptido que tiene actividad similar a B7-1 y/o actividad similar a B7-3. Las células tumorales transfectadas son regresadas al paciente para que resulte en la expresión de los péptidos sobre la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, pueden usarse técnicas de terapia de genes para señalar como objetivo una célula de tumor para transfección in vivo. La presencia del péptido de la presente invención, que tiene la actividad de un(os) antígeno(s) de linfocitos B sobre la superficie de las células de tumor provee la señal de coestimulación necesaria para que las células T induzcan una respuesta inmune mediada per células T contra las células de tumor transfectadas. Además, las células de tumor que carecen de moléculas MHC clase I o MHC clase II, o que no re-expresan suficientes cantidades de moléculas MHC clase I o MHC clase II, pueden ser transfectadas con ácido nucleico que codifica para todo o una porción de (por ejemplo, una porción truncada de dominio citoplásmica) de una proteína de cadena a de MHC clase I y proteína de microglobulina ßi o una proteína de cadena a de MHC clase II y una proteína de cadena ß de MHC clase II para expresar de esta forma proteínas MHC clase I o MHC clase II sobre la superficie de la célula. La expresión de la MHC clase I o clases II apropiada, en conjunto con un péptido que tiene la actividad de un antígeno de linfocito B (por ejemplo, B7-1, B7-2, B7-.3) induce una respuesta inmune mediada por células T contra la célula de tumor transfectada. Opcionalmente, un gene que codifica una construcción antisentido que bloquea la expresión de una proleína asociada MHC clase II, tal como la cadena constanle, íambién puede ser coíransfecíado con un ADN que codifica para un péptido que tiene la actividad de antígeno de linfocito B para promover la presentación de antígenos asociados a tumor e inducir inmunidad específica a tumor. Así, la inducción de una respuesta inmune mediada por células T en un sujeío humano puede ser suficiente para superar tolerancia específica a tumor en el sujeto. La actividad de una proíeína de la invención íambién puede, eníre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos adecuados para determinar citotoxicidad de esplenocitos o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Currení Protocols in Immunology, Editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1.-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al.. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974. 1982; Handa et al., J. Immunol. 135-1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512. 1988; Hermann et al., Proc. Nati. Acacl. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann eí al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa cí al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986: Bowman et al., J. Virology 61 :1992-1998; Takai el al., J. Immunol. 140:508-512, 1988: Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991 ; Brown et al., J. Immunol 153:3079-3092, 1994. Los ensayos para determinar las respuestas de inmunoglobulina dependiente de células T y conmulación isoíipo (las cuales ideníificarán, entre otras, a las proteínas que modulan respuestas de anticuerpos dependientes de células T y que afectan perfiles Thl/Th2) incluyen. sin limitación, aquellos descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990: y Assays for B cell function: ln vitro antibody production, Mond, J.J. and Brunswick, M In Current Prolocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994. Las pruebas mezcladas de reacción de linfocitos (MLR) (las cuales identificarán, entre otras, proteínas que generan predominantemente respuestas de Thl y CTL) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en Current Protocols in Immunology, Editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1.-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992. Ensayos dependientes de células dendrilicas (los cuales identificarán, entre otras. proteínas expresadas por células dendriticas que activan células T naturales) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995; Inaba eí al, Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; e Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990. Las pruebas para determinar la sobrevivencia/apoptosis de linfociíos (las cuales identificarán, entre otras, las proteínas que previenen la apoptosis después de la inducción superantígena y las proteínas que regulan la homeóstasis de linfocitos) incluyen, sin limitación. aquellas descritas en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993 Gorczyca et al, Cáncer Research 53:1945-1951, 1993; Itoh et al.. Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145:4037-4045, 1990; Zamai el al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1 :639-648, 1992. Las pruebas para las proteínas que influencian etapas tempranas de desarrollo y confinamiento de células T incluyen, sin limitación, aquellas descritas en Antica et al., Blood 84;111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy eí al, Blood 85:2770-2778, 1995; Toki el al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:7548-7551, 1991.

Actividad de Regulación de Hematopoiésis Una proteína de la presente invención puede ser útil en la regulación de la hematopoiesis y, en consecuencia, en el tratamiento de deficiencias de células mieloides o linfoides. Aún una actividad biológica marginal en apoyo de células formadoras de colonias o de líneas celulares dependientes de factor, indica envolvimiento en la regulación de hematopoiesis, esto es, en el soporte del crecimiento y la proliferación de células progenitoras eritroides solas o en combinación con otras citocinas, indicando utilidad de esta manera, por ejemplo, en el tratamiento de diversas anemias o para usarse en conjunto con irradiación quimioterapia para estimular la producción de precursores eritroides y/o células eritroides; en soportar el crecimiento y proliferación de células mieloides tales como los granulocitos y monocitos/macrófagos (esto es, actividad CSF tradicional) útiles, por ejemplo, en conjunto con la quimioterapia para prevenir o tralar la mielo-supresión consecuente, en soportar el crecimiento y proliferación de megacariocitos y consecuentemente de plaquetas, permitiendo de esta forma la prevención o tratamiento de diversos desordenes de plaquetas tales como la trombocilopenia, y en general para utilizarse en lugar o en forma complementaria a transfusiones de plaquetas; y/o en sostener el crecimienío y proliferación de células progenitoras hematopoiéticas, las cuales son capaces de madurar a todas y cada una de las células hematopoiéticas anteriormente mencionadas y por lo tanto encuentran utilidad terapéutica en diversos desordenes de células progenitoras (tales como aquellos usualmenle tratados con transplantes, incluyendo, sin limitación, anemia aplástica y hemoglobinaria nocturna paroxismal) así como en el repoblamiento de la división de células progenitoras que resulta de la irradiación/quimioterapia, ya sea in vivo o ex vivo (esto es, en conjunto con el transplante de médula ósea o con el transplante de células progenitoras periféricas (homologas o heterólogas)) como células normales o genéticamente manipuladas por terapia de genes. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida pollos siguientes métodos: Pruebas apropiadas para determinar la proliferación y diferenciación de varias líneas hematopoiéticas se han citado anteriormente. Las pruebas para la diferenciación de células progenitoras embrionarias (las cuales identificarán, entre otras, proteínas que influencian la hematopoiesis de la diferenciación embrionaria) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en Johansson et al. Cellular Biology 15:141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13:473-486. 1993; McClanahan eí al., Blood 81 :2903-2915, 1993. Las pruebas para determinar la sobrevivencia y diferenciación de células progenituras (las cuales identificarán, entre otras, proteínas que regulan la linfo-hematopoiésis) incluyen, sin limiíación, aquellas descritas en: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. In Culture of Hematopoietic Cells, R.I. Freshney, et al eds. Vol pp 265-268. Wiley-Liss, Inc., New York, NY 1994; Hirayama et al., Proc Nati. Acad. Sci. USA 89:5907- 5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferalive potential. McNiece, I.K. y Briddell, R.A. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 23-39, Wiley-Liss, Inc. New York, NY 1994; Neben et al., Experimental Hemaíology 22:353-359, 1994; Cobblestone área forming cell assay, Ploemacher, R.E. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol pp. 1-21, Wiley-Liss, Inc. New York, NY 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. and Alien, T. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol pp. 163-179. Wiley-Liss, Inc., New York, NY 1994; Long term culture initiating cell assay, Suíherland, H..?. In Culture of Hematopietic Cells, R.I. Freshney et al., eds. Vol pp. 139-162, Wiley-Liss, Ine New York, NY. 1994.

Actividad de Crecimiento de Tejido Una proteína de la presente invención también puede tener utilidad en composiciones usadas para el crecimiento o regeneración de tejido óseo, de cartílago, de tendón, de ligamento y/o de nervio, así como para curar heridas y reparación o reemplazo de tejido, y en el tratamienío de quemaduras, incisiones y úlceras. Una proíeína de la presente invención, la cual induce el crecimiento de cartílago y/o hueso en circunstancias en las que normalmente no hay hueso formado, tiene aplicación en la curación de fracturas óseas y daños o defectos a cartílago en humanos y otros animales. Dicha preparación empleando una proteína de la invención puede tener uso profiláctico en la reducción tanto de fracturas cerradas como abiertas y también en la fijación mejorada de uniones artificiales. La formación de hueso nuevo inducida por agentes osteogénicos contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumatismo, o inducidos por resección oncológica, y también es útil en cirugía plástica cosmética. Una proteína de esta invención también puede ser útil en el tratamiento de enfermedad periodental y en oíros procesos de reparación de dieníes. Tales agentes pueden proveer un ambiente para atraer células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. Una proteína de la invención también puede ser útil en el tratamienío de osteoporosis u osteoartritis , tal como a través de la estimulación de la reparación de hueso y/o cartílago o mediante el bloqueo de la inflamación o procesos de destrucción de tejido (actividad 5 colagenasa, actividad osteoclástica, ele.) mediada por procesos inflamatorios. Otra categoría de actividad de regeneración de tejido que puede ser atribuible a la proteína de la presente invención es la formación de tendón/ligamento. Una proteína de la presente invención, la cual induce tejido similar a tendón/ligamento u otra formación de tejido en circunstancias en las que dicho tejido no es normalmente formado, tiene aplicación en la curación de desgarres de tendón o ligamento, deformaciones y otros defectos de tendón o ligamento en humanos y otros animales. Dicha preparación empleando una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento puede tener uso profiláctico en la prevención de daños a tejido de tendón o ligamento, así como en el uso para fijación mejorada de tendón o ligamenío a hueso u otros tejidos, y en la reparación de defectos de tejido de tendón o ligamento La formación de tejido nuevo de tendón/similar a ligamento, inducida por una composición de la presente invención contribuye a la reparación de defectos de tendón o ligamenío congénilos. inducidos por traumatismo o de otro origen, y también es útil en cirugía plástica cosmética para la fijación o reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones de la presente invención pueden proveer un ambiente para atraer células formadoras de tendón o ligamento, estimular el crecimiento de células formadoras de tendón o ligamento, inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de tendón o ligamenío, o inducir el crecimiento células o progenitores de tendón/ligamento ex vivo para retorno in vivo para efectuar la reparación de tejido. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento de tendonitis, síndrome de túnel carpiano y otros defectos de tendón o ligamento. Las composiciones también pueden incluir una matriz apropiada y/o un agente secuestrante como un portador como se conoce bien en la técnica. La proteína de la presente invención también pude ser útil para la proliferación de células nerviosas y para la regeneración de tejido nervioso y del cerebro, esto es, para el tratamiento de enfermedades y neuropatías del sistema nervioso central o periférico, así corno de desordenes mecánicos y traumáticos que involucren la degeneración, muerte o lesiones a j g^g ^ bsa£2&sa &¿ células nerviosas o al tejido nervioso. Más específicamente, una proteína puede ser empleada en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso periférico, tales como daños al nervio periférico, neuropatía periférica y neuropatías localizadas, y enfermedades del sistema nervioso central, tales como la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington, esclerosis lateral amiotrópica y el síndrome de Shy-Drager. Condiciones adicionales que pueden ser tratadas de acuerdo con la presente invención incluyen desordenes mecánicos y traumáticos, tales como desordenes de la médula espinal, lesiones de la cabeza y enfermedades cerebrovasculares tales como ataque apopléjico. También pueden ser tratables usando una proteína de la presente invención neuropatías periféricas que resultan de quimioterapia u otras terapias médicas. Las proteínas de la presente invención también pueden ser útiles para promover el mejor y más rápido cierre de heridas sin sanar, incluyendo sin limitación, úlceras por presión. úlceras asociadas con insuficiencia vascular, heridas por traumatismo y por cirugía, y similares. Se espera que una proteína de la presente invención también puede exhibir actividad para la generación o regeneración de otros tejidos tales como tejidos de órganos (incluyendo. por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñon, piel, endotelio), de músculo (suave, esquelético o cardiaco) y vascular (incluyendo endotelio vascular), o para promover el crecimiento de células que comprenden dichos tejidos. Parte de los efectos deseados puede ser mediante la inhibición o modulación de la cicaírización fibriótica para permitir que cl tejido normal se regenere. Una proteína de la invención íambién pude presentar actividad angiogénica. Una proteína de la presente invención también puede ser útil para la protección o regeneración del intestino y para el tratamiento de la fibrosis de pulmón o hígado, daño por reperfusión en varios tejidos y condiciones resultantes de daño sistémico de citocina. Una proteína de la presente invención también puede ser útil para promover o inhibir la diferenciación de tejidos descritos anteriormente de tejidos o células precursoras; o para inhibir el crecimiento de los tejidos descritos anteriormente. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por os siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad de generación de tejido incluyen, sin limitación, aquellos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO95/ 16035 (hueso, cartílago, tendón); Publicación de Patente Internacional No. WO95/05846 (nervio, nervioso); Publicación de Patente Internacional No. WO91/07491 (piel, endotelio). Los ensayos para determinar actividad de curación de heridas incluyen, sin limitación. aquellos descritos en: Winter, Epidermal Wound Healing, pps. 71-112 (Maibach, HÍ and Rovee, DT, eds.) Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, según fue modificado por Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol. 71 :382-84 (1978).

Acíividad de Acíivina/Inhibina Una proteína de la presente invención también puede exhibir actividades relacionadas con adivina o inhibina. Las inhibinas se caracterizan por su capacidad de inhibir la liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH), mientras que las adivinas están caracterizadas por su capacidad de estimular la liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH). Por lo tanto, una proteína de la presente invención, sola o en heterodímeros con un miembro de la familia alfa de inhibinas, puede ser útil como un anticonceptivo basado en la capacidad de inhibir o disminuir la fertilidad en mamíferos hembras y disminuir la espermatogénesis en mamíferos machos. La administración de cantidades suficientes de otras inhibinas puede inducir la infertilidad en estos mamíferos. Alternativamente, la proteína de la invención, como un homodímero o como un heterodímero con otras subunidades de proteína del grupo de inhibinas beta, puede ser útil como un terapéutico inductor de la fertilidad, basado en la capacidad de las moléculas de adivina en la estimulación de la liberación de FSH de células de la pituitaria anterior. Ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 4.798.885. Una proteína de la presente invención íambién puede ser útil para adelantar el comienzo de la fertilidad en mamíferos sexualmente inmaduros, con el propósito de incrementar el ciclo de desempeño productivo de animales domésticos tales como vacas, ovejas y cerdos. La actividad de la proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida pollos siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad de activina/inhibina incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Vale et al., Endocrinology 91 :562-572, 1972; Ling et al, Nalure 321 :779-782, 1986; Vale et al., Nature 321 :776-779, 1986; Masón et al., Nature, 318:659-663. 1985; Forage et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:3091-3095, 1986.

Actividad Quimioíáclica Quimiocinética Una proteína de la presente invención puede tener actividad qumiocinética o quimiotáctica (por ejemplo, actuar como una quimiocina) para células de mamífero. incluyendo, por ejemplo, monociíos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células masí, eosinófilas, epiteliales y/o endoteliales. Las proteínas quimiocinéticas y quimiotácticas pueden utilizarse para movilizar o atraer una población de células deseadas a un sitio de acción deseado. Las proteínas quimiotáclicas o quimiocinéticas proveen ventajas particulares en el tratamiento de heridas y otras lesiones de tejidos, así como en el tratamiento de infecciones localizadas. Por ejemplo, la atracción de linfocitos, monocitos o neutrófilos hacia tumores o sitios de infección puede resultar en respuestas inmunes mejoradas contra el tumor o agente infeccioso. Una proteína o pépíido tiene actividad quimiotáctica para una población celular particular sí ésta puede estimular, directa o indirectamente, la orientación o movimiento de dicha población celular. Preferiblemeníe, la proteína o péptido tiene la capacidad de estimular directamente el movimiento dirigido de células. El que una proteína particular tenga actividad quimiotácíica para una población de células puede ser fácilmente determinado empleando dicha proteína o péptido en cualquier ensayo conocido para quimiotaxis celular. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida pollos siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad quimiotáctica (que identificarán proteínas que inducen o previenen la quimiotaxis) consisten en ensayos que miden la capacidad de una proteína para inducir la migración de células a través de una membrana así como también la capacidad de una proteína para inducir la adhesión de una población de células a otra población de células. Los ensayos apropiados para determinar el movimiento y adhesión incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Current Protocols in Immunology, Editado por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Publicado por Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 6.12, Measuremení of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.28; Taub et al., J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al, APMIS 103:140-146, 1995; Muller et al., Eur J. Immunol. 25; 1744-1748; Gruber eí al, J. Of Immunol. 152:5860-5867, 1994; Johnson et al., J. of Immunol. 153:1762-1768, 1994.

Actividad Hemostática y Trombolítica Una proteína de la invención también puede presentar actividad hemostática o trombolííica. Como resultado de esto, se espera que dicha proteína sea útil en el tratamiento de diversos desordenes de la coagulación (incluyendo desordenes hereditarios, tales corno hemofilias) o para mejorar la coagulación y otros eventos hemostálicos en el tratamiento de heridas resultantes de traumas, cirugías u otras causas. Una proteína de la invención también puede ser útil para disolver o inhibir la formación de trombosis y para el tratamienío y prevención de condiciones resulíantes de ella (lales como, por ejemplo, infarto de los vasos del sistema nervioso central o cardiaco (e. g., ataque). La actividad de una proteína de la presente invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Los ensayos para determinar la actividad hemostática y trombolítica incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Linel et al., J. Clin. Pharmacol. 26:131-140, 1986; Burdick eí al., Thrombosis Res. 45:413-419, 1987; Humphrey et al., Fibrinolysis 5:71-79 (1991); Schaub, Prostaglandins 35:467-474, 1988.

Actividad de Receptor/Ligando Una proteína de la presente invención también puede demostrar actividad como receptor, ligando de receptores o inhibidores o agonistas de interacciones de receptor/ligando. Los ejemplos de tales receptores y ligandos incluyen, sin limitación, receptores de citocinas y sus ligandos, receptores de quinasas y sus ligandos, receptores de fosfatasas y sus ligandos. receptores involucrados en interacciones de célula-célula y sus ligandos (incluyendo, sin limitación, moléculas de adhesión celular (tales como selectinas, integrinas y sus ligandos) y parejas receptor/ligando involucradas en la preseníación de antígeno, reconocimiento de antígeno y desarrollo de respuestas inmunes celulares y humorales). Los receptores y ligandos también son útiles para el tamizaje de péptido potencial o inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción importante receptor/ligando. Una proteína de la presente invención (incluyendo, sin limitación, fragmentos de receptores y ligandos) puede por ella misma ser útil como inhibidor de las interacciones de receptor/ligando. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por los siguientes métodos: Las pruebas adecuadas para determinar actividad receptor-ligando incluyen, sin limitación las de Current Protocols in Immunology, editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek. D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Inlerscience (Chapter 7.28, Measurements of Cellular Adhesión under static conditions 7.28.1-7.28.22), Takai et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1987; Bierer et al., J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988; Rosenstein et al., J. Exp. Med 169:149-160 1989; Stolíenborg eí al., J. Immunol. Melhods 175:59-68, 1994; Stitt et al., Cell 80:661-670, 1995.

Actividad Aníi-Inflamatoria Las proteínas de la presente invención también pueden presentar actividad antiinflamatoria. La actividad aníi-inflamatoria pude ser lograda proveyendo un estímulo a las células involucradas en la respuesta inflamatoria, inhibiendo o promoviendo las interacciones célula-célula (tal como, por ejemplo, la adhesión celular), inhibiendo o promoviendo la quimiotaxis de células involucradas en el proceso inflamatorio, inhibiendo o promoviendo la extravasación celular, o estimulando o suprimiendo la producción de otros factores que inhiben o promueven más directamente una respuesta inflamatoria. Las proteínas que presentan dichas actividades pueden ser utilizadas para tratar condiciones inflamatorias (incluyendo condiciones crónicas o agudas) incluyendo, sin limitación, la inflamación asociada a infecciones (tales como el choque séptico, sepsis o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)), daño por isquemia-reperfusión, mortalidad por endotoxina, artritis, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, daño pulmonar inducido por citocina o quimiocina, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o resultante de la sobre-producción de citocinas tales como el TNF o la IL-1. Las proteínas de la invención también pueden ser útiles para íratar la anafiláxis y la hipersensibilidad a una substancia o material antígeno.

Actividad de Cadherina/Supresor de Invasión Tumoral Las cadherinas son moléculas de adhesión dependientes del calcio, las cuales parecen tener roles importantes durante el desarrollo, particularmente en la definición de tipos específicos de células. La pérdida o alteración de la expresión normal de las cadherinas puede conducir a cambios en las propiedades de adhesión de las células ligadas al crecimiento de tumores y la metástasis. La malfunción de las cadherinas también está implicada en otras enfermedades humanas, tales como la pemphigus vulgaris y la pemphigus fohaceus (enfermedades autoinmunes de ampollas en la piel), la enfermedad de Crohn y algunas anormalidades durante el desarrollo. La superfamilia de las cadherinas incluye bien por arriba de los cuarenta miembios, cada uno con un patrón distinto de expresión. Todos los miembros de la superfamilia tienen en común repeticiones extracelulares conservadas (dominios cadherina), pero se han encontrado diferencias estructurales en otras partes de la molécula. Los dominios cadherina se unen a calcio para formar su estructura terciaria y por lo tanto se requiere el calcio para mediar en su adhesión. Solamente unos cuantos aminoácidos en el primer dominio cadherina provee las bases para la adhesión homofílica; la modificación de esíe sitio de reconocimiento pueae cambiar la especificidad de una cadherina de manera que en lugar de reconocer solamente así misma, la molécula muíanle también se puede ligar ahora a una cadherina diferente. Además. algunas cadherinas se acoplan en adhesión hetero fílica con otras cadherinas. La cadherina E, un miembro de la superfamilia de las cadherinas, es expresada en tipos de células epiteliales. Patológicamente, sí la expresión de la cadherina E se pierde en un tumor. las células malignas se tornarán invasoras y el cáncer sufre metástasis. La transfección de las líneas celulares cancerosas con polinucleótidos expresando las cadherina E ha revertido cambios asociados a cáncer regresando a la normalidad formas de células alteradas. restableciendo la adherencia de las células unas con otras y con sus substratos, disminuyendo la velocidad de crecimiento celular, y reduciendo drásticamente el crecimiento de células independientes del anclaje. Así, reiníroduciendo la expresión de la cadherina E se revierten los carcinomas hacia una etapa menos avanzada. Es probable que otras cadherinas tengan la misma función de supresión de invasión en carcinomas derivados de otros tipos de tejidos. Por lo tanto, pueden utilizarse para tratar cáncer las proteínas de la presente invención con actividad de cadherinas, y polinucleótidos de la presente invención que codifican para dichas proteínas. La Introducción de tales proteínas o polinucleótidos denlro de células cancerosas puede reducir o eliminar los cambios cancerosos observados en estas células al proveer la expresión normal de las cadherinas. Las células cancerosas también han estado demostrando que expresan cadherinas de un íipo de tejido diferente a su tejido original, permitiendo que estas células invadan y sufran metástasis en un tejido diferente en el cuerpo. Las proteínas de la presente invención con actividad de cadherinas, y polinucleótidos de la presente invención que codifican para tales proteínas, pueden ser sustituidas en estas células por las cadherinas expresadas inapiOpiadamente, restableciendo sus propiedades de adherencia normal y reduciendo o eliminando la tendencia de las células a sufrir metástasis. Adicionalmente, las proíeínas de la presente invención con actividad de cadherinas. \ polinucleótidos de la presente invención que codifican para tales proteínas, pueden ser usadas para generar anticuerpos que reconozcan y se unan a cadherinas. Tales anticuerpos pueden ser usados para bloquear la adhesión de cadherinas de células tumorales expresadas iiiapropiadamente, previniendo que las células formen un tumor en algún otro sitio. Dicho anticuerpo de anti-cadherina también pude ser usado como un marcador para el grado, tipo patológico y prognosis de un cáncer, esto es, mientras más avanzado sea el cáncer, menor expresión de cadherina existirá y esta disminución en la expresión de cadherina puede ser detectada mediante el uso de un anticueipo de unión de cadherina. También pueden emplearse fragmentos de proteínas de la presente invención con actividad de cadherina, preferiblemente un polipéptido que comprenda un decapéptido de un sitio de reconocimiento de cadherina, y polinucleótidos de la presente invención que codifican para dichos fragmentos de proteína, para bloquear la función cadherina mediante la unión a cadherinas y evitando que ellas se unan en formas que produzcan efecíos indeseables. Adicionalmente, pueden utilizarse para perturbar la adhesión apropiada célula-célula. fragmentos de proteínas de la presente invención con actividad de cadherina, preferiblemente fragmentos de cadherina solubles y truncos, los cuales se ha encontrado que son esíables en la circulación de pacientes cancerosos, y polinucleótidos que codifican para íales proteínas.

Las pruebas para determinar la actividad de cadherinas y de supresión de invasión incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Hortsch et al., J. Biol. Chem. 270 (32): 18809- 18817, 1995; Miyaki et al., Oncogene 11 : 2547-2552, 1995; Ozawa et al., Cell 63: 1033-1038. 1990.

Acíividad de Inhibición de Tumores Además de las actividades descritas anteriormente para el tratamienío inmunológico o de prevención de tumores, una proteína de la preseníe invención puede exhibir otras actividades anti-lumores. Una proteína puede inhibir el crecimiento de tumores directa o indirectamente (tal como, por ejemplo, vía ADCC). Una proteína puede presentar su actividad inhibitoria de tumores actuando sobre el tejido del tumor o el tejido precursor del tumor. inhibiendo la formación de los tejidos necesarios para sostener el crecimiento del tumor (íal como, por ejemplo, inhibiendo la angiogénesis), causando la producción de oíros factores. agentes o tipos de células que inhiben el crecimiento del tumor, o suprimiendo, eliminando o inhibiendo factores, agentes o tipos de células que promueven el crecimiento del tumor.

Otras Ac ividades Una pro teína de la invención también puede presentar una o más de las siguientes actividades o efectos: inhibir el crecimiento, infección o función de, o exterminar, agentes infecciosos, incluyendo, sin limitación, bacterias, virus, hongos y otros parásitos; afectar (supresión o mejoramiento) características corporales, incluyendo, sin limitación, altura, peso, color de pelo, color de ojos, piel, proporción grasa carne o pigmentación de otros tejidos, o tamaño o forma parcial del cuerpo (tal como, por ejemplo, aumento o disminución del pecho. cambios en la forma o configuración de huesos); afecíar bioriímos o ciclos o ritmos circadianos; afectar la fertilidad de sujetos machos o hembras, afecíar el metabolismo, catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización, almacenamiento o eliminación de grasa, lípidos, proteínas, carbohidratos, viíaminas, minerales, cofactores u oíros factores o componentes nutrimentales de la dieta; afectar características del comportamiento, incluyendo, sin limitación, apetito, libido, estrés, percepción (incluyendo desordenes de la percepción), depresión (incluyendo desordenes depresivos) y comportamientos violentos; provisión de -.- i.^í sÉ£ efectos analgésicos u otros efectos reductores del dolor; promoción de la diferenciación y crecimiento de células progenitoras embriónicas en linajes distiníos a los linajes hemaíopoiéíicos; actividad hormonal o endocrina; en el caso de enzimas, corregir deficiencias de las enzimas y el tratamiento de enfermedades relacionadas con las deficiencias; tratamiento de desórdenes hiperproliferativos (íales como, por ejemplo, la psoriasis); acíividad similar a inmunoglobulina (tal como, por ejemplo, la capacidad de unirse a antígenos o complementos); y la capacidad de actuar como un aníígeno en una composición de vacuna para elevar la respuesía inmune contra dichas proteínas u oíro material o eníidad que sea reacíivo de alguna forma con dicha proleína.

ADMIMSTRACIÓN Y DOSIFICACIÓN Una proteína de la presente invención (procedente de cualquier fuente que haya sido obtenida, incluyendo sin limitación, de fuentes recombinantes y no recombinantes) puede ser utilizada en una composición farmacéutica cuando se combina con un ponador farmacéuticamente aceptable. Dicha composición puede contener también (además de una proteína y un portador) diluyentes, rellenadores, sales, reguladores, estabilizadores. solubilizadores, y otros materiales que se conocen bien en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del(los) ingredienle(s) acíivo(s). Las características del portador dependerán de la ruta de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener citocinas, linfocinas, u otros factores hematopoiéticos íales como M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11. IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IFN, TNFO, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, trombopoietina, factor de células progeniíoras y eritropoietina. La composición farmacéuíica puede contener además otros agentes que, ya sea, mejoren la actividad de la proteína o complementen su actividad o uso en el traíamienío. Dichos factores y/o agentes adicionales pueden ser incluidos en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergísíico con la proíeína de la invención, o para minimizar los efectos laterales. A la inversa, la proteína de la preseníe invención puede ser incluida en formulaciones de la ciíocina particular, linfocina, oíro factor hematopoiético, factor trombolítico o anti-írombóíico, o agente anti-inflamatorio para minimizar efectos laterales de la citocina, linfocina, otro facíor hematopoiéíico, factor trombolítico o anti-trombótico, o agente anti-inflamatorio. Una proteína de la presente invención puede estar activa en multímeros (por ejemplo, heterodímeros u homodímeros) o complejos con si mismos u otras proteínas. Como resultado, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una proteína de la invención en dicha forma multimérica o compleja. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un complejo de proteína(s) de la invención conjuntamente con antígenos de proteína o péptido. El antígeno de proteína y/o pépíido liberará una señal estimulante tanto a los linfocitos B como T. Los linfocitos B responderán al antígeno a través de sus receptores de inmunoglobulina de superficie. Los linfocitos T responderán al antígeno a través del receptor de células T (TCR) enseguida a la presentación del antígeno por las proteínas MHC. Las proteínas MHC y proteínas relacionadas estrucíuralmeníe incluyendo aquellas codificadas por los genes de MHC clase I y clase II en células hospederas servirán para presentar el(los) antígeno(s) de péptido para linfocitos T. Los componentes de antígeno podrían también ser suministrados como complejos purificados de MHC-péptido solos o con moléculas co-esíimulaníes que pueden señalar direcíameníe células T. Alternativamente, aníicuerpos capaces de unir inmunoglobulina superficial y oirás moléculas en células B, así como aníicuerpos capaces de unir el TCR y otras moléculas en células T pueden estar combinadas con la composición farmacéutica de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un liposoma en el que la proteína de la presente invención esté combinada, además de otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes amfipáticos tales como lípidos que existan cn forma agregada como miscelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, o capas laminares que estén en solución acuosa. Lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponinas. ácidos biliares, y similares. La preparación de lales formulaciones liposomales está dentro de los conocimientos de la técnica, como se describe, por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. No. 4,235,871; Patente de los E.U.A. No. 4,501,728; Patente de los E.U.A. No. 4,837,028 y Patente de los E.U.A. No. 4,737, 323; la totalidad de las cuales se incorpora aquí como referencia. Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamenle efectiva" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo al paciente, esto es, tratamiento, curación, prevención o mejoría de la condición médica relevante, o un incremento en la velocidad dei tratamiento, curación, prevención o mejoramiento de dichas condiciones. Cuando se aplica ingredieníe acíivo a un individuo, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica una combinación, el íérmino se refiere a caníidades combinadas de los ingredientes activos que resultan en el efecto terapéutico, sea que se administre en combinación, serialmente o simultáneamente. En la práctica del método de tratamiento o uso de la presente invención, una caníidad terapéuticamente efectiva de la proteína de la presente invención se administra a un mamífero que tiene una condición a ser tratada. La proteína de la presente invención puede ser administrada de acuerdo con el método de la invención, ya sea sola o en combinación con otras terapias tales como tratamientos que emplean citocinas, linfocinas u otros factores hematopoiéíicos. Cuando se co-administra con una o más citocinas, linfocinas, u otros factores hematopoiéticos, la proteína de la presente invención puede ser administrada ya sea simultáneamente con citocina(s), linfocina(s), otro(s) factor(es) hematopoiéíico(s), factores trombolíticos o aníi-trombóticos, o secuencialmente. Sí se administra secuencialmente, el médico que atiende decidirá sobre la secuencia apropiada de administración de la proteína de la presente invención en combinación con citocina(s), linfocina(s), otro(s) factor(es) hematopoiéíico(s), factores trombolíticos o anti-trombóticos. La administración de la proteína de la presente invención usada en la composición farmacéutica o para llevar a la práctica el método de la presente invención puede ser llevada a cabo en una variedad de formas convencionales, tales como la ingestión oral, inhalación, aplicación tópica o inyección cutánea, subcutánea o intravenosa: La administración intravenosa al paciente es la que más se prefiere. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de la preseníe invención es adminisírada oralmente, la proíeína de la preseníe invención estará en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elíxir. Cuando se administra en forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención puede adicionalmente contener un portador sólido tal como gelatina o un adjutor. La íableta, cápsula y polvo contiene desde aproximadamenle 5 a 95% de la proteína de la presente invención y preferiblemente desde aproximadamente 25 a 5 90% de proleína de la presente invención. Cuando se administra en forma líquida, puede agregarse un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tal como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soja, aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede además contener solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol. 10 propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de desde aproximadamente 0.5 a 90% en peso de la proteína de la presente invención y preferiblemenle de desde aproximadamente 1 a 50% de proteína de la presente invención. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de la presente invención es administrada mediante inyección intravenosa, cutánea u subcutánea, la proteína de la presente invención estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable y libre de pirógenos. Está dentro de los conocimientos de la técnica la preparación de dichas soluciones de proteína parenteralmente aceptables, teniendo debida consideración respecto al pH, isotonicidad, estabilidad y similares. Una composición farmacéuticamente preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, además de la proteína de la presente invención, un vehículo isotónico tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer con Lactato, u otro vehículo como se conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizadores, conservadores, reguladores, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por aquellos capacitados en la técnica. La cantidad de la proteína de la presente invención en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que esíé siendo tratada, y de la naturaleza de tralamientos previos que el paciente haya tenido. Finalmente, el médico que atiende decidirá la cantidad de la proteína de la presente invención con la que tratará a cada paciente individual. Inicialmente, el médico que atiende administrará dosis bajas de la proteína de la presente invención y observará la respuesta del paciente. Dosis mayores de proteína de la presente invención pueden ser administradas hasta que el efecto terapéutico óptimo se obtenga para el paciente particular, y en ese punto generalmente la dosis no se incrementará adicionalmente. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas utilizadas en la práctica del método de la presente invención deberán contener aproximadamente 0.01 µg a aproximadamente 100 mg (de preferencia desde aproximadamente 0.1 µg a aproximadamente 10 mg, más preferiblemente desde aproximadamente 0.1 µg a aproximadamente 1 mg) de proíeína de la presente invención por kilogramo de peso corporal. La duración de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la presente invención variará dependiendo de la severidad de la enfermedad que está siendo tratada y la condición y respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente individual Se contempla que la duración de cada aplicación de la proleína de la presente invención estará en el intervalo de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. Finalmente el medico que atiende decidirá acerca de la duración apropiada de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención. La proteína de la presente invención puede también ser usada para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen específicamente con la proteína. Tales anticuerpos pueden ser obtenidos usando ya sea la proteína completa o fragmentos de ella como un inmunógeno. Los inmunógenos de péptido adicionalmente pueden contener un residuo de cisteina en la terminación carboxilo, y estar conjugados a un hapteno tal como hemocianina de lapa keyhole (KLH). Los métodos para sintetizar tales péptidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, como en R.P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); J.L. Krstenansky, et al. FEBS Lett. 211, 10 (1987). Los anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína de la presente invención también pueden ser agentes de diagnóstico útiles para la inmunodelección de la proteína. Los anticuerpos monoclonales de neutralización que se unen a la proteína también pueden ser terapéuticos útiles lanto paia condiciones asociadas con la pro teína como también en el traíamiento de algunas fom as de cáncer en donde la expresión anormal de la proteína está involucrada. En el caso de células cancerosas o células de leucemia, los anticuerpos monoclonales de neutralización contra la proteína puede ser útiles en la detección y prevención de la dispersión metastásica de las células cancerosas, lo cual puede ser mediado por la proteína. Para las composiciones de la presente invención que son útiles para la regeneración de hueso, cartílago, tendón o ligamento, el método terapéutico incluye la administración de la composición tópicamente, sistemáticamente o localmente como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para usarse en esta invención esíá, por supuesto, en una forma fisiológicamente aceptable y libre de pirógenos. Además, la composición puede estar deseablemente encapsulada o inyectada en una forma viscosa para liberarla al sitio del daño en hueso, cartílago o tejido. La administración tópica puede seradecuada para curar heridas y reparar tejido. Los agentes terapéuticamente útiles diferentes a la proteína de la presente invención y que también pueden ser opcionalmente incluidos en la composición como fue descrito anteriormente, pueden alternativa o adicionalmente, ser administrados simultánea o secuencialmente con la composición en los métodos de la invención. Preferiblemente para la formación de hueso y/o cartílago, la composición incluiría una matriz capaz de liberar la composición que contiene proteína al sitio del daño en hueso y/o cartílago, proporcionando una estructura para el desa?tollo de hueso y cartílago: y óptimamente capaz de ser reabsorbida por el cuerpo. Dichas matrices pueden ser formadas de materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas de implante. La elección del material de la matriz está basada en la biocompatibilidad. biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades de interfase. La aplicación particular de la composición definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser de sulfato de calcio, fosfato tricálcico. hidroxiapatita, ácido polilácíico, ácido poliglicólico y polianhídridos biodegradables y químicamente bien definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tales como colágeno óseo o dérmico. Matrices adicionales están compuestas de proteínas puras o componentes de matriz extracelular. Oirás matrices potenciales son no biodegradables y químicamente definidas, tal como la hidroxiapatita sinterizada, biocrisíal, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden estar compuestas de combinaciones de cualquiera de los tipos de materiales arriba mencionados, tal como ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágeno y fosfato tricálcico. Las biocerámicas pueden estar ^^ tf^M alteradas en su composición, tal como en calcio-aluminato-fosfato y procesadas para modificar su tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de partícula y biodegradabilidad. Actualmente se prefiere un copolímero 50:50 (peso mol) de ácido láctico y ácido glicólico en la forma de partículas porosas con diámetros que varían de 150 a 800 micrones. En algunas aplicaciones será útil el emplear un agente secuestrante, tal como carboximetil celulosa o coágulos de sangre autólogos, para evitar que las composiciones de proteínas se disocien de la matriz. Una familia preferida de agentes secuestrantes es la de los materiales celulósicos tales como las alquilcelulosas (incluyendo hidroxialquilcelulosas), incluyendo metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa, las más preferidas siendo las sales catiónicas de carboximetilcelulosa (CMC). Otros agentes secuestrantes preferidos incluyen el ácido hialurónico, alginato de sodio, poli(glicol de etileno), óxido de polioxietileno, polímero de carboxivinilo y poli(alcohol de vinilo). La cantidad de agente secuestrante úíil aquí es de 0.5-20% en peso, preferiblemente 1-10%) en peso sobre la base del peso total de la formulación, lo cual representa la cantidad necesaria para evitar la desorción de la proteína de la matriz polimérica y para proveer un manejo apropiado de la composición de la invención, y aún así no tanta como para que se evite que las células progenitoras se infiltren dentro de la matriz, dándole de esía manera a la proteína la oportunidad de ayudar a que se desarrolle la actividad osteogénica de las células progenituras. En composiciones adicionales, las proteínas de la invención pueden ser combinadas con oíros agentes benéficos para el tratamiento del defecto de hueso y/o cartílago, herida o tejido en cuestión. Estos agentes incluyen varios factores de crecimiento lales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de transformación (TGF-a y TGF-ß) y factor de crecimiento similar a insulina (IGF). Las composiciones terapéuticas también se» actualmeníe valiosas para aplicaciones veterinarias. Particularmente los animales domésticos y los caballos purasangre, además de los humanos, son los pacientes deseables para tales tratamientos con proteínas de la presente invención.

El régimen de dosificación de una composición farmacéutica que contenga proteína, a ser utilizada en la regeneración de tejido será determinado por el médico que atiende y en consideración a varios factores que modificarán la acción de las proteínas, por ejemplo, la cantidad de peso de tejido que se desea que se forme, el sitio del daño, la condición del tejido 5 dañado, el tamaño de la herida, el tipo del tejido dañado (por ejemplo, hueso), la edad, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. La dosis puede variar con el tipo de maíriz usada en la reconstitución y con la inclusión de otras proteínas en la composición farmacéutica. Por ejemplo también puede afectar la dosis la adición de otros factores de crecimiento conocidos, tales como IGFI (factor I 0 de crecimiento similar a insulina), a la composición final. El progreso puede ser monitoreado por evaluaciones periódicas del crecimiento y/o reparación de tejido/hueso, por ejemplo. mediante determinaciones por rayos X, determinaciones histomorfométricas y marcado con tetraciclina. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser utilizados para terapia 5 de genes. Dichos polinucleótidos pueden ser introducidos ya sea in vivo o ex vivo dente de células para la expresión en un sujeto mamífero. Los polinucleótidos de la invención también pueden ser administrados mediante otros métodos conocidos para la introducción de ácido nucleico dentro de una célula u organismo (incluyendo, sin limitación, en la forma de vectores virales o ADN desnudo). Las células también pueden ser cultivadas ex vivo en la presencia de proteínas de la presente invención con el objeto de hacer proliferar o producir un efecto deseado o acíividad en dichas células. Las células tratadas pueden ser entonces introducidas in vivo para propósitos terapéuticos.

Ejemplo 1 : Inhibición de Angiogénesis y Proliferación de Células Endoteliales por Proteína de AM931 La actividad angiostática (inhibición de angiogénesis) de la proteína de AM931 fue examinada en un ensayo de proliferación de células HUVC endoteliales, un ensayo para determinar actividad angiostática. EL ensayo fue realizado en un plato de 96 pozos. Células umbilicales humanas primarias (HUVECs) fueron sembradas a 3x10J células por pozo en medio EGM (Clonetics)/20% FCS (suero de bovino fetal) e incubadas a 37 °C durante 24 horas. Las células fueron cosechadas en medio M199 (GIBCO BRL) conteniendo 0.5% de FCS (M199-0.5% FCS) durante 48 horas a 37 °C. Medio acondicionado o fracciones de membrana derivadas de células COS-1 transfectadas de AM931 fueron diluidas a 1 :5, 1 :25. 1 :125 y 1 :625 en medio al 0.5% de FCS de M199 conteniendo 100 ng/ml de FGF. Las diluciones de AM931 fueron agregadas a las células cosechadas e incubadas durante 72 horas a 37 °C. Posteriormente las células fueron radiomarcadas con [3H]-timidina por 6 horas. Las células radiomarcadas fueron lavadas con PBS y tripsinizadas para conteo por centelleo en líquido. Los resultados fueron graficados usando el programa de computación Kaleidograph (Abelbeck Software). Los efectos de varias preparaciones en proliferación de HUVC son mostrados en las Figuras 2A y 2B. En las Figuras 2A y 2B, "pED" es el falso de control derivado de las células COS-1 transfectadas con vector de expresión solo. "AM931 CM(1) y AM931 CM(2)"' son medios acondicionados procedentes de dos transfecciones independientes de células COS- i . "AM931 MF" es la fracción de membrana procedente de la segunda transfección de COS- 3 Los resultados demuestran actividad de proteína de AM931 en la inhibición de angiogencsis (angiosíasis) e inhibición de la proliferación de endotelio vascular. Las referencias de patentes y de literatura citada aquí se incorporan a la presente como referencias como si éstas hubiesen sido establecidas en forma compleía.

?-Si^ -_^..,-_£,--?-..-__-_-M^ LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Jacobs, Kenneth McCoy, John M. Racie, Lisa A. LaVallie, Edward R. Merberg, David Treacy, Maurice Spaulding, Vikki Agostino, Michael (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteinas secretadas (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) REMITENTE: GENETICS INSTITUTE, INC. (B) CALLE: 87 CAMBRIDGEPARK DRIVE (C) CIUDAD: CAMBRIDGE (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 02140 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Sprunger, Suzanne A. (B) NÚMERO DE REGISTRO: P-41,323 (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES: (A) TELÉFONO: (617) 498-8224 (B) TELEFAX: (617) 876-5851 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 817 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal <^m ^b^^juís^jü (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO :1: CCAGAAACAG ACCATGCTGG AGAGTCTCAG CACAGAAAAG AACTCCCTGG TCTTTCAACT 60 GGAGCGCCTC GAACAGCAGA TGAACTCCGC CTCTGGAAGT AGTAGTAATG GGTCTTCGAT 120 TAATATGTCT GGAATTGACA ATGGTGAAGG CACTCGTCTG CGAAATGTTC CTGTTCTTTT 180 TAATGACACA GAAACTAATC TGGCAGGAAT GTACGGAAAA GTTCGCAAAG CTGCTAGTTC 240 AATTGATCAG TTTAGTATTC GCCTGGGAAT TTTTCTCCGA AGATACCCCA TAGCGCGAGT 3Ó0 TTTTGTAATT ATATATATGG CTTTGCTTCA CCTCTGGGTC ATGATTGTTC TGTTGACTTA 360 CACACCAGAA ATGCACCACG ACCAACCATA TGGCAAATGA ACCAAGCCCA GTTGTTGCAG 420 TGATTGGTTG TCTTTTTCTA GACTTGGGAT CTGCAAGAAG GCCAATTGCC TAAAATTTCT 480 GAGAACAGTG CACAAGATTA TTTTATCACT ACAAGCTTTT AAACTTTTTA AGTTATTGTA 340 CAAGTATTCT ACCTAAATCT TCCAATTTCC TTTAAATGGT AAGAGTTTCT AAAACAGACA 60C ATAATTTAAC AAGCTCAGCT YTGSTTTATY TGRGKTTAGK GGTCCTAAWA WA AWGTAGA 660 GAAAGATGGK GGGGTTKTTY ACCTYTGTAC AGACCATYTG TATGTTAGGK GAMAWTGATT 720 ATGGGKTATA ATYAGGGRAA MTAATTGTAT TTAGTGACMA AAATAAAAAG mmrpmrprpmr rnrp ''80 TWTWAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 817 [ 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 128 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido ( C ) CADENA : (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Leu Glu Ser Leu Ser Thr Glu Lys Asn Ser Leu Val Phe Gln Leu 1 5 10 15 Glu Arg Leu Glu Gln Gln Met Asn Ser Ala Ser Gly Ser Ser Ser Asn 20 25 30 Gly Ser Ser lie Asn Met Ser Gly lie Asp Asn Gly Glu Gly Thr Arg Leu Arg Asn Val Pro Val Leu Phe Asn Asp Thr Glu Thr Asn Leu Ala 50 55 60 Gly Met Tyr Gly Lys Val Arg Lys Ala Ala Ser Ser lie Asp Gln Pne 65 70 75 80 Ser lie Arg Leu Gly lie Phe Leu Arg Arg Tyr Pro lie Ala Arg Val 85 90 95 Phe Val lie lie Tyr Met Ala Leu Leu His Leu Trp Val Met He Val 100 105 110 Leu Leu Thr Tyr Thr Pro Glu Met His His Asp Gln Pro Tyr Gly Lys 115 120 125 ¡4 ?. gj^gg^^ g|

Claims

Novedad de fla Imvera óim 1. Una composición que comprende una proteína aislada codificada por un polinucleóíido seleccionado del grupo consistente en: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ; (b) un polinucleóíido que comprende la secuencia de nucleóíidos de SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 14 hasta el nucleótido 400; (c) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la proteína de longitud completa que codifica la secuencia de la clona AM931, depositada bajo el número de acceso ATCC 98026; (d) un polinucleótido que codifica para la proteína de longitud completa codificada por el inserto de ADNC de la clona AM931, depositada bajo el número de acceso ATCC 98026; (e) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de la proteína madura de la clona AM931, deposiíada bajo el número de acceso
ATCC 98026; (f) un polinucleóíido que codifica para la proíeína madura codificada por el inserto de ADNc de la clona AM931, deposiíada bajo el número de acceso ATCC 98026; (g) un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (h) un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad biológica; (i) un polinucleólido que es una valuante alélica de un polinucleóíido de (a)-(f) anteriores; y (j) un polinucleótido que codifica para una especie homologa de la proteína de (g) o (h) anteriores. 2. La composición de la reivindicación 1, comprendiendo además un portador farmacéuticamente aceptable.
3. Un método para prevenir, tratar o mejorar una condición médica, eí cual comprende la administración a un sujeto mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la reivindicación 2.
4. Una composición que comprende una proteína, en donde dicha pro teína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: (a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (b) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 120; (c) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 86 hasía el aminoácido 128; (d) fragmentos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y (e) la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc de la clona AM931 depositada bajo el número de acceso ATCC 98026, La proíeína estando substancialmente libre de otras proteínas de mamífero.
5. La composición de la reivindicación 4, en donde dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
6. La composición de la reivindicación 4, en donde dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 120.
7. La composición de la reivindicación 4, en donde dicha proteína compiendc la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, desde el aminoácido 86 hasta el aminoácido 128.
8. La composición de la reivindicación 4, comprendiendo además un portador farmacéuticamente aceptable.
9. Un método para prevenir, tratar o mejorar una condición médica, el cual comprende la administración a un sujeto mamífero una caníidad terapéuticamente efectiva de una composición de la reivindicación 8.
10. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.
11. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleólido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, desde el nucleótido 14 hasta el nucleóíido 400.
12. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de nucleólidos de la secuencia de codificación de la proteína de longitud completa de la clona AM931 deposilada bajo el número de acceso ATCC 98026.
13. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleólido comprende un polinucleótido que codifica para la proteína de longitud completa codificada por el inserto de ADNc de la clona AM931 depositada bajo el número de acceso ATCC 98026.
14. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleóíido comprende la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de la proteína madura de la clona AM931 depositada bajo el número de acceso ATCC 98026.
15. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleólido comprende un polinucleótido que codifica para la proteína madura codificada por el inserlo de ADNc de la clona AM931 deposilada bajo el número de acceso ATCC 98026.
16. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
17. La composición de la reivindicación 4, en donde dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc de la clona AM931 depositada bajo el número de acceso ATCC 98026.
18. El método de la reivindicación 9, en donde dicho sujeto es tratado para producir un efecto seleccionado del grupo consistente en la inhibición de angiogénesis, inhibición del crecimiento o proliferación de células de endotelio vascular, inhibición de crecimiento de tumor e inhibición de crecimiento de tejido dependiente de angiogénesis. Res?mmerpi de la Imvemcióm La présenle invención tiene que ver con ADNc que ha sido aislado usando métodos selectivos para ADNc que codifica para proteínas secreíadas. También se describen composiciones y méíodos para usar las proteínas de los ADNcs descritos. jgjí