MX2014011341A - Vacuna contra el virus sincitial respiratorio (vsr). - Google Patents

Vacuna contra el virus sincitial respiratorio (vsr).

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Abstract

La invención proporciona una vacuna contra el virus sincitial respiratorio (VSR), que comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo (26) que comprende ácido nucleico que codifica para una proteína F del VSR o una parte inmunológicamente activa de la misma.

Description

VACUNA CONTRA EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO (VSR) La invención se relaciona con el campo de la medicina.
Más en particular, la invención se relaciona con vacunas contra el virus sincitial respiratorio (VSR).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Luego del descubrimiento del virus sincitial respiratorio (VSR), en la década de 1950, el virus se volvió pronto un patógeno reconocido, asociado con infecciones del tracto respiratorio inferior y superior en humanos. En todo el mundo, se estima que ocurren 64 millones de infecciones por VSR cada año, resultando en 160.000 muertes (WHO Acute Respiratory Infections Update Septiembre de 2009). La enfermedad más severa ocurre particularmente en infantes prematuros, en personas de edad y en individuos inmunocomprometidos. En niños menores a 2 años, el VSR es el patógeno de tracto respiratorio más común, dando cuenta de aproximadamente el 50% de las hospitalizaciones debidas a infecciones respiratorias, y el pico de hospitalizaciones ocurre entre los 2 y 4 meses de edad. Se ha informado que casi todos los niños han sido infectados por VSR a la edad de dos años. La infección repetida durante la vida se atribuye a una inmunidad natural no eficaz. El nivel de carga de enfermedad por VSR, la mortalidad y morbilidad en las personas de edad ocupan el segundo lugar después de los causados por infecciones por influenza A no pandémica.
El VSR es un paramixovirus, que pertenece a la subfamilia de pneumovirinae. Su genoma codifica para diversas proteínas, incluyendo las proteínas de membrana que se conocen como Glicoproteína de VSR (G) y proteína de fusión de VSR (F) que son los blancos antigénicos más importantes para los anticuerpos neutralizantes. El d ivaje proteolítico del precursor de la proteína de fusión (F0) rinde dos polipéptidos Fl y F2 unidos a través de un puente disulfuro. Los anticuerpos contra la parte que media la fusión de la proteína Fl pueden prevenir la captación del virus en la célula y por lo tanto tienen un efecto neutralizante. Además de ser un blanco para los anticuerpos neutralizantes, F del VSR contiene epitopes para células T citotóxicas (Pemberton y col., 1987, J. Gen . Virol . 68: 2177-2182).
Las opciones de tratamiento para infección por VSR incluyen un anticuerpo monoclonal contra la proteína F del VSR. Los altos costos asociados con dichos anticuerpos monoclonales y el requerimiento de su administración en un espacio de hospital, imposibilitan su uso para profilaxis en la población en riesgo a gran escala. Por lo tanto hay una necesidad por una vacuna para VSR, que preferentemente se pueda usar para la población pediátrica asi como también para las personas de edad.
A pesar de cincuenta años de investigación, aún no hay una vacuna certificada contra VSR. Un obstáculo importante para el desarrollo de la vacuna es el legado de enfermedad acentuada por vacuna en un ensayo clínico en la década del 1960 con una vacuna inactivada por formalina (FI) para VSR. Los niños vacunados con FI-VSR no estuvieron protegidos contra la infección natural y los niños infectados experimentaron una enfermedad más severa que los niños no vacunados, incluyendo dos muertes. Este fenómeno se denomina como "enfermedad acentuada".
Desde el ensayo con la vacuna FI para VSR, se han intentado diferentes estrategias para generar una vacuna para VSR. Los intentos incluyen las clásicas cepas vivas atenuadas pasadas por frió o los mutantes sensibles a temperatura de VSR, vacunas de subunidades (quiméricas) de proteínas, vacunas de péptidos y proteínas VSR expresadas a partir de vectores virales recombinantes. A pesar de que algunas de estas vacunas mostraron datos preclínicos promisorios, no se ha autorizado ninguna vacuna para uso humano debido a problemas de seguridad o falta de eficacia.
Los vectores de adenovirus se usan para la preparación de vacunas para una variedad de enfermedades, incluyendo enfermedad asociada con infecciones por VSR. Los siguientes párrafos proveen ejemplos de vacunas candidato para VSR a base de adenovirus que se han descrito.
En una estrategia, se ha insertado VSR.F en la región no esencial E3 de adenovirus competentes para replicación de tipo 4, 5, y 7. La inmunización en ratas algodoneras, por aplicación intranasal (i.n.) de 107 pfu, fue moderadamente inmunogénica, y protectora contra el desafio de VSR en el tracto respiratorio inferior, pero no fue protectora contra el desafio de VSR en el tracto respiratorio superior (Connors y col., 1992, Vaccine 10: 475-484; Collins, P.L., Prince, G.A., Camargo, E., Purcell, R.H., Chanock, R.M. y Murphy, B.R. Evaluation of the protective efficacy of recombinant vaccinia viruses and adenoviruses that express respiratory syncytial virus glycoproteins. En: Vaccines 90: Modern Approaches to New Vaccines including prevention of AIDS (Eds. Brown, F., Chanock, R.M., Ginsberg, H. and Lerner, R.A.) Coid Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1990, páginas 79-84). La inmunización oral subsiguiente de un chimpancé fue poco inmunogénica (Hsu y col., 1992, J Infect Dis. 66:769-775).
En otros estudios (Shao y col., 2009, Vaccine 27: 5460 -71; US2011/0014220), se fabricaron dos vectores de adenovirus 5 recombinantes incompetentes para replicación que portaban un ácido nucleico que codifica para la versión truncada transmembrana (rAd-FOATM) o de longitud completa (rAd-FO) de la proteína F de la cepa VSR-Bl, y se dieron por vía intranasal a ratones BALB/c. Se sensibilizaron los animales por vía i.n. con 107 pfu y se reforzaron 28 días más tarde con la misma dosis por vía i.n. A pesar de que los anticuerpos anti-VSR-Bl fueron neutralizantes y reaccionaron en forma cruzada con las cepas VSR-Long y VSR-A2, la inmunización con estos vectores protegió solo parcialmente contra la replicación por desafío con VSR Bl. La protección (parcial) con rAd-FOATM fue levemente superior que con rAd-FO.
En otro estudio, se observó que la inmunización por vía i.n. de ratones BALB/c con 1011 partículas virales con el adenovirus FG-Ad de replicación deficiente (basado en Ad5) que expresa la F del VSR de tipo salvaje (FG-Ad-F) redujo los títulos virales en pulmón solamente un 1,5 log 10 en comparación con el grupo de control (Fu y col., 2009, Biochem. Biophys. Res . Commun . 381: 528-532.
En aún otros estudios, se observó que el adenovector de replicación deficiente basado en Ad5 recombinante aplicado por vía intranasal que expresa el fragmento F1 soluble optimizado por codones de la proteína F del VSR A2 (aminoácido 155-524) (108 pfu) pudo reducir la replicación por desafío con VSR en los pulmones de ratones BALB/c en comparación con ratones de control, pero ratones que se inmunizaron por via intramuscular (i.m.) no exhibieron ninguna protección para el desafió (Kim y col., 2010, Vaccine 28: 3801-3808).
En otros estudios, se usaron adenovectores basados en Ad5 que portan la F del VSR (AdV-F) de longitud completa optimizada por codones o la forma soluble del gen RSF F (AdV-Fsol) para inmunizar ratones BALB/c dos veces con una dosis de lxlO10 OPU (unidades de partículas ópticas: una dosis de lxlO10 OPU corresponde a 2xl08 GTU (unidad de transducción génica)). Estos vectores redujeron fuertemente las cargas virales en los pulmones después de la inmunización por vía i.n., pero solo parcialmente después de aplicación por vía subcutánea (s.c.) o i.m. (Kohlmann y col., 2009, J Virol 83: 12601-12610; US 2010/0111989).
En aún otros estudios, se observó que el adenovector de replicación deficiente basado en Ad5 recombinante aplicado por vía intramuscular que expresa el ADNc secuenciado de la proteína F de la cepa VSR A2 (1010 unidades de partícula) pudo reducir la replicación por desafío con VSR solo parcialmente en los pulmones de ratones BALB/c en comparación con ratones de control (Krause y col., 2011, Virology Journal 8:375-386) Aparte de no ser totalmente eficaz en muchos casos, las vacunas para VSR que están bajo evaluación clínica para uso pediátrico y la mayoría de las vacunas bajo evaluación preclinica, son vacunas intranasales. Las ventajas más importantes de la estrategia intranasal son la estimulación directa de la inmunidad del tracto respiratorio local y la falta de potenciación asociada de la enfermedad. De hecho, en general la eficacia de por ejemplo las vacunas candidato contra VSR basadas en adenovirus parece mejor para la administración intranasal en comparación con la administración intramuscular. Sin embargo, la vacunación intranasal también da origen a implicaciones de seguridad en niños menores de 6 meses. Las reacciones adversas más comunes de las vacunas intranasales son secreción o congestión nasal en todas las edades. Los niños recién nacidos son respiradores nasales obligados y por consiguiente deben respirar a través de la nariz. Por lo tanto, la congestión nasal en niños de pocos meses de vida puede interferir con la lactancia, y en casos raros puede causar problemas serios de respiración.
Se han identificado adenovirus humanos de más de 50 serotipos diferentes. De ellos, los adenovirus del serotipo 5 (Ad5) han sido los más estudiados históricamente como vehículos para los genes. Los vectores adenovirales recombinantes de serotipos diferentes sin embargo pueden dar origen a resultados diferentes con respecto a la inducción de respuestas y protección inmunitarias. Por ejemplo, WO 2012/021730 describe que el vector adenoviral de simio serotipo 7 y el vector adenoviral humano serotipo 5 que codifica para la proteína F proveen mejor protección contra VSR que un vector adenoviral humano de serotipo 28. Además, se observó una inmunogenicidad diferente para los vectores a base de serotipos de adenovirus humanos o no humanos (Abbink y col., 2007, J Vírol 81: 4654-4663; Colloca y col., 2012, Sci Transí Med 4, 115ra2). Abbink y col. concluyen que todos los serotipos raros de vectores rAd humanos estudiados fueron menos potentes que los vectores rAd5 en ausencia de inmunogenicidad por anti-Ad5. Además recientemente se ha descrito que, mientras que rAd5 con un transgen de glicoproteína (gp) de Ebolavirus (EBOV) protegió al 100% a los primates no humanos, rAd35 y rAd26 con el transgen gp de EBOV proveyó una protección solo parcial y se requirió una estrategia heteróloga de sensibilización y refuerzo con estos vectores para obtener una protección completa contra el desafío con virus de ébola (Geisbert y col., 2011, J Virol 85: 4222-4233). Por consiguiente, a prior i no es posible predecir la eficacia de una vacuna adenoviral recombinante, solo en base a los datos de otros serotipo de adenovirus.
Más aún, para las vacunas para VSR, se requieren experimentos en modelos de enfermedad apropiados tales como rata algodonera para determinar si una vacuna candidato es lo suficientemente eficaz para prevenir la replicación del VSR en el tracto nasal y en los pulmones y al mismo tiempo es segura, o sea no conduce a una enfermedad acentuada. Preferentemente dichas vacunas candidato deben ser altamente eficaces en dichos modelos, incluso ante administración intramuscular.
Por lo tanto, permanece la necesidad de vacunas eficientes y métodos de vacunación contra VSR, que no conduzcan a enfermedad acentuada. La presente invención tiene el objetivo de proveer dichas vacunas y métodos de vacunación contra VSR de una forma segura y eficaz.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente los presentes inventores hallaron que los adenovirus recombinantes de serotipo 26 (Ad26) que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina F del VSR son vacunas muy eficaces contra VSR en un modelo bien establecido de rata algodonera, y que tienen mejor eficacia en comparación con los datos descritos previamente para Ad5 que la codifica para la F del VSR. Se demuestra que incluso una sola administración, incluso por via intramuscular, de Ad26 que codifica para la F del VSR es suficiente para proveer una protección completa contra una replicación por desafio con VSR.
La invención provee una vacuna contra virus sincitial respiratorio (VSR), que comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende un ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR o un fragmento de la misma.
En ciertas formas de realización, el adenovirus recombinante comprende ácido nucleico que codifica para la proteina F del VSR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En ciertas formas de realización, el ácido nucleico que codifica para la proteina F del VSR se optimiza por codones para la expresión en células humanas.
En ciertas formas de realización, el ácido nucleico que codifica para la proteina F del VSR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2.
En ciertas formas de realización, el adenovirus humano recombinante tiene una eliminación en la región El, una eliminación en la región E3, o una eliminación tanto en la región El como en la región E3 del genoma adenoviral.
En ciertas formas de realización, el adenovirus recombinante tiene un genoma que comprende en sus extremos 5' la secuencia CTATCTAT.
La invención además provee un método para vacunar a un sujeto contra VSR, en donde el método comprende administrar al sujeto una vacuna de acuerdo con la invención.
En ciertas formas de realización, la vacuna se administra por vía intramuscular.
En ciertas formas de realización, una vacuna de acuerdo con la invención se administra al sujeto más de una vez.
En ciertas formas de realización, el método para vacunar a un sujeto contra VSR además comprende administrar al sujeto una vacuna que comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 35 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR o un fragmento de la misma.
En ciertas formas de realización, el método de vacunación de un sujeto contra VSR además comprende administrar proteina F del VSR (preferentemente formulada como una composición farmacéutica, por consiguiente una vacuna proteica) al sujeto.
En ciertas formas de realización, el método de vacunación consiste en una sola administración de la vacuna al sujeto.
La invención también provee un método para recudir la infección y/o replicación de VSR en, por ejemplo el tracto nasal y los pulmones de, un sujeto, que comprende administrar al sujeto por inyección intramuscular una composición que comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR o un fragmento de la misma. Esto reducirá los efectos adversos que resultan de la infección por VSR en un sujeto, y por lo tanto contribuirá a la protección del sujeto contra dichos efectos adversos ante la administración de la vacuna. En ciertas formas de realización, esencialmente se pueden prevenir los efectos adversos de la infección por VSR, o sea reducir a dichos bajos niveles que no son clínicamente relevantes. El adenovirus recombinante puede estar en la forma de una vacuna de acuerdo con la invención, incluyendo las formas de realización que se describieron previamente.
La invención también provee una célula huésped aislada que comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteína F del VSR o un fragmento de la misma.
La invención además provee un método para hacer una vacuna contra el virus sincitial respiratorio (VSR), que comprende proveer un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteína F del VSR o un fragmento de la misma, propagar dicho adenovirus recombinante en un cultivo de células huésped, aislar y purificar el adenovirus recombinante, y formular el adenovirus recombinante en una composición farmacéuticamente aceptable. El adenovirus humano recombinante de este aspecto puede ser también cualquiera de los adenovirus que se describen en las formas de realización previas.
La invención también provee una ácido nucleico recombinante aislado que forma el genoma de un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR o un fragmento de la misma. El adenovirus también puede ser cualquiera de los adenovirus como se describieron en las formas de realización previas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la respuesta inmunitaria celular contra péptidos F que solapan los aa 1-252 de F y los péptidos F que solapan los aa 241-574 de F de ratones ante la inmunización con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 (A) y rAd35 (B) que portan el gen F del VSR a 2 y 8 semanas después de la inmunización.
La Figura 2 muestra la respuesta de anticuerpos contra VSR en ratones ante la inmunización con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a 2 y 8 semanas después de la inmunización.
La Figura 3 muestra los resultados de la proporción de la respuesta de anticuerpos IgG2a vs. IgG 1 contra VSR en ratones ente la inmunización con 1010 pv de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a 8 semanas después de la inmunización.
La Figura 4 muestra la capacidad de neutralización de virus contra VSR Long en ratones ante la inmunización con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 (A) y rAd35 (B) que portan el gen F del VSR a 2 y 8 semanas después de la inmunización.
La Figura 5 muestra la respuesta in unitaria celular contra (A) péptidos F que solapan los aa 1-252 de F y los (B) péptidos F que solapan los aa 241-574 de F de ratones ante la inmunización por sensibilización y refuerzo con vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a las 6 y 12 semanas después de la inmunización primaria.
La Figura 6 muestra la respuesta de anticuerpos contra VSR en ratones ante la inmunización por sensibilización y refuerzo con vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a diferentes puntos de tiempo después de la primera inmunización.
La Figura 7 muestra la capacidad de neutralización de virus contra VSR Long en suero de ratones ante la inmunización por sensibilización y refuerzo con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a diferentes puntos de tiempo después de la primera inmunización.
La Figura 8 muestra la capacidad de neutralización de virus contra VSR B1 en ratones ante la inmunización por sensibilización y refuerzo con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a diferentes puntos de tiempo después de la primera inmunización.
La Figura 9 muestra los A) títulos en pulmón de VSR y B) títulos de VSR en nariz en ratas algodoneras después de la inmunización por sensibilización y refuerzo con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a 5 días después del desafío.
La Figura 10 muestra la inducción de títulos neutralizantes de virus después de la inmunización por sensibilización y refuerzo con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a A) 28 días, y B) 49 días después de la primera inmunización.
La Figura 11 muestra el examen histopatológico de los pulmones de rata algodonera en el día del sacrificio después de la inmunización por sensibilización y refuerzo con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR.
La Figura 12 muestra A) los títulos de VSR en pulmón y B) los títulos de VSR en nariz en ratas algodoneras después de la inmunización por dosis simple con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a 5 dias después del desafio, administrados por diferentes vías.
La Figura 13 muestra los títulos neutralizantes de virus inducidos después de la inmunización por dosis simple con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR a 28 y 49 dias después de la primera inmunización, administrados por diferentes vías.
La Figura 14 muestra el examen histopatológico de los pulmones de rata algodonera en el día del sacrificio después de la inmunización por dosis simple (i.m.) con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 y rAd35 que portan el gen F del VSR en el día del sacrificio.
La Figura 15 muestra los mapas de plásmidos que comprenden el extremo izquierdo del genoma de Ad35 y Ad26 con la secuencia que codifica para F del VSR: A. pAdApt35BSU.VSR.F(A2)nat, y B. pAdApt26.VSR.F(A2)nat La Figura 16 muestra A) los títulos de VSR en pulmón y B) los títulos de VSR en nariz en ratas algodoneras después de la inmunización por dosis simple en el día 0 o el día 28 con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR a 5 días después del desafío. El desafío fue en el día 49.
La Figura 17 muestra la inducción de títulos neutralizantes de virus después de la inmunización por dosis simple con diferentes dosis de rAd26 que portan el gen F del VSR a 49 días después de la inmunización como se describió para la Figura 16.
La Figura 18 muestra la inducción de títulos neutralizantes de virus después de la inmunización por dosis simple con diferentes dosis de rAd26 que portan el gen F del VSR a lo largo del tiempo después de la inmunización.
La Figura 19 muestra los títulos de VNA 49 días después contra VSR Long y VSR Bwash con suero derivado de ratas algodoneras inmunizadas con 1010 de Ad-F del VSR o sin transgen (Ad-e). PB: sensibilización y refuerzo.
La Figura 20 muestra los títulos de VSR en pulmón en ratas algodoneras después de la inmunización por dosis simple en el día 0 con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR a 5 días después del desafío con VSR A2 o VSR B15/97.
La Figura 21 muestra los títulos de VSR en nariz en ratas algodoneras después de la inmunización por dosis simple en el día 0 con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR a 5 días después del desafío con VSR A2 o VSR B15/97.
La Figura 22 muestra los títulos de VNA en el suero de ratas algodoneras después de la inmunización por dosis simple en el dia 0 con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR a diferentes puntos de tiempo después de la sensibilización.
La Figura 23 muestra los títulos de VSR en pulmón en ratas algodoneras después de la inmunización por dosis simple en el día 0 con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR a 5 días después del desafío con una dosis estándar (105) o una dosis alta (5xl05) de VSR A2.
La Figura 24 muestra los títulos de VSR en nariz en ratas algodoneras después de la inmunización por dosis simple en el dia 0 con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR a 5 dias después del desafio con una dosis estándar (105) o una dosis alta (5xl05) de VSR A2.
La Figura 25 muestra los títulos de VSR en pulmón en ratas algodoneras después de la inmunización en el día 0 y 28 con diferentes dosis de inmunización simple o inmunización por sensibilización y refuerzo con vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR a 5 días después del desafío, con el desafío llevado a cabo 210 días después de la inmunización.
La FIG 26 muestra los títulos de VNA de suero de rata algodonera después de una dosis simple y de inmunización por sensibilización y refuerzo a 140 días después de la inmunización La Figura 27 muestra el examen histopatológico de los pulmones de rata algodonera de sacrificio después de la inmunización simple o inmunización por sensibilización y refuerzo con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR a 2 días después del desafío. Los puntos representan la mediana, y las extensiones el percentil o o 25 y 75.
La Figura 28 muestra el examen histopatológico de los pulmones de rata algodonera de sacrificio después de la inmunización simple o inmunización por sensibilización y refuerzo con diferentes dosis de vectores basados en rAd26 que portan el gen F del VSR at 6 días después del desafío. Los puntos representan la mediana, y las extensiones el percentil 25 y 75.
La Figura 29 muestra la inducción de títulos neutralizantes de virus después de la inmunización con rAd26 que portan el gen F del VSR (Ad26.VSR.F) seguido por refuerzo con Ad26.VSR.F o con proteína F del VSR con adyuvante (post-F).
La Figura 30 muestra la inducción de anticuerpos IgG2a y IgGl, y la proporción de los mismos, después de la inmunización con Ad26.VSR.F seguido por refuerzo con Ad26.VSR.F o por refuerzo con proteína F del VSR con adyuvante (post-F).
La Figura 31 muestra la producción de IFN-g por esplenocitos después de la inmunización con Ad26.VSR.F seguido por refuerzo con Ad26.VSR.F o con proteína F del VSR con adyuvante (post-F).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "recombinantes", tal como se lo emplea en la presente con relación a los adenovirus, hace referencia al resultado de una modificación por parte del hombre, por ejemplo, a una alteración en los extremos basada en una clonación activa y a la introducción de un gen heterólogo, es decir, no es un adenovirus salvaje que ocurra naturalmente.
En la presente, las secuencias se describen en el sentido 5' a 3', lo cual es habitual en la téenica.
El término "proteína de la cápside de un adenovirus" hace referencia a una proteína que se encuentra en la cápside de un adenovirus y que participa en la determinación del serotipo y/o el tropismo de un adenovirus particular. Las proteínas de la cápside de los adenovirus típicamente abarcan las proteínas que están relacionadas con las fibras, con las pentonas y/o con las hexonas. Un adenovirus de un serotipo determinado de acuerdo con la invención (o un adenovirus que "está basado" en dicho genotipo) típicamente comprende proteínas relacionadas con las fibras, las pentonas y/o las hexonas del serotipo en cuestión, y preferiblemente comprende proteínas relacionadas con las fibras, las pentonas y las hexonas de dicho serotipo. Estas proteínas típicamente están codificadas por el genoma de los adenovirus recombinantes. Un adenovirus recombinante de un serotipo determinado opcionalmente pueden comprender y/o codificar otras proteínas de adenovirus de otros serotipos. Por consiguiente, un ejemplo no limitante, un adenovirus recombinante que comprende hexona, pentona y fibra de Ad26 se considera un adenovirus recombinante basado en Ad26.
En la presente, se dice que un adenovirus recombinante "está basado" en un adenovirus salvaje cuando al menos una parte de la secuencia del primero deriva de la del último. Este resultado puede obtenerse sobre la base de una clonación molecular, mediante el uso del genoma salvaje o de partes de éste como material de partida. También es posible usar secuencias conocidas de genomas de adenovirus salvajes para generar nuevos genomas o partes de éstos, a través de un procedimiento de síntesis del ADN, que puede ser puesto en práctica de acuerdo con métodos de rutina, por compañías relacionadas con el área de la síntesis del DNA y/o con la clonación molecular (por ejemplo, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
Una persona con experiencia en el arte comprenderá que varios polinucleótidos y ácidos nucleicos diferentes pueden codificar para el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. También se comprenderá que las personas con experiencia en el arte pueden, usando téenicas de rutina, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten la secuencia polipeptidica que está codificada por los polinucleótidos que se describen para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el que se vayan a expresar los polipéptidos. Por lo tanto, a menos que se especifique de otra forma, una "secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas y ARN pueden incluir intrones.
En una forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica para la proteína F del VSR o un fragmento de la misma se optimiza por codones para la expresión en células de mamífero, tales como células humanas. Los métodos para optimización por codones son conocidos y se han descrito previamente (por ejemplo en WO 96/09378). Un ejemplo de una secuencia específica optimizada por codones de proteína F del VSR se describe en SEQ ID NO: 2 de EP 2102345 Bl.
En una forma de realización, la proteina F del VSR es de una cepa A2 de VSR , y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En una forma de realización particularmente preferida, el ácido nucleico que codifica para la proteina F del VSR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2. Los inventores hallaron que esta forma de realización resulta en una expresión estable y que una vacuna de acuerdo con esta forma de realización provee protección contra la replicación de VSR en el tracto nasal y en los pulmones incluso después de una dosis simple que se administró por vía intramuscular.
El término "fragmento" tal como se usa en la presente se refiere a un péptido que tiene una eliminación amino-terminal y/o carboxilo-terminal y/o interna, pero en donde la secuencia de aminoácidos remanente es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de una proteina F del VSR, por ejemplo, la secuencia de longitud completa de una proteina F del VSR. Se apreciará que para inducir una respuesta inmunitaria y en general para propósitos de vacunación, una proteina no necesita ser de longitud completa ni tener todas sus funciones de tipo salvaje, y que los fragmentos de la proteina son igualmente útiles. De hecho, se ha demostrado que fragmentos de proteina F del VSR tipo F1 o F soluble son eficaces para inducir respuestas inmunitarias como la F de longitud completa (Shao y col., 2009, Vaccine 27: 5460-71, Kohlmann y col., 2009, J Virol 83: 12601-12610). La incorporación de fragmentos de proteina F que corresponden a los aminoácidos 255 a 278 o 412 a 524 en inmunización activa induce anticuerpos neutralizantes y algo de protección contra el desafio con VSR (Sing y col., 2007, Virol . Immunol . 20, 261-275; Sing y col., 2007, Vaccine 25, 6211-6223).
Un fragmento de acuerdo con la invención es un fragmento inmunológicamente activo, y típicamente comprende al menos 15 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos, de la proteína F del VSR. En ciertas formas de realización, el mismo comprende al menos 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, o 550 aminoácidos, de la proteína F del VSR.
La persona con experiencia en el arte también apreciará que se pueden hacer cambios a una proteína, por ejemplo mediante sustituciones de aminoácido, eliminaciones, adiciones, etc., por ejemplo usando procedimientos de rutina de biología molecular. En general, se pueden aplicar sustituciones conservativas de aminoácidos sin pérdida de función o de inmunogenicidad de un polipéptido. Esto se puede verificar fácilmente de acuerdo con procedimientos de rutina bien conocidos para una persona con experiencia en el arte.
El término "vacuna" se refiere a un agente o composición que contiene un componente activo que es eficaz para inducir un grado terapéutico de inmunidad en un sujeto contra un cierto patógeno o enfermedad. En la presente invención, la vacuna comprende una cantidad eficaz de un adenovirus recombinante que codifica para una proteina F del VSR, o un fragmento antigénico de la misma, que resulta en una respuesta inmunitaria contra la proteina F of VSR. La misma provee un método para prevenir la enfermedad seria de tracto respiratorio inferior que conduce a hospitalización y la disminución de la frecuencia de complicaciones tales como neumonía y bronquiolitis debidas a la infección por VSR y a la replicación en un sujeto. Por consiguiente, la invención también provee un método para prevenir o reducir una enfermedad seria de tracto respiratorio inferior, prevenir o reducir (por ejemplo acortar) la hospitalización, y/o reducir la frecuencia y/o severidad de la neumonía o bronquiolitis causada por VSR en un sujeto, que comprende administrar al sujeto por inyección intramuscular una composición que comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteína F del VSR o un fragmento de la misma. El término "vacuna" de acuerdo con la invención implica que la misma es una composición farmacéutica, y por consiguiente típicamente incluye un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La misma puede comprender o no otros ingredientes activos. En ciertas formas de realización la misma puede ser una vacuna de combinación que además comprende otros componentes que inducen una respuesta inmunitaria, por ejemplo contra otras proteínas de VSR y/o contra otros agentes infecciosos.
Los vectores de la presente invención son adenovirus recombinantes, también conocidos como vectores basados en adenovirus recombinantes. La preparación de los vectores basados en adenovirus recombinantes es bien conocida en la téenica.
En determinadas formas de realización, un vector basado en un adenovirus de acuerdo con la invención presenta una deficiencia en la función de al menos un gen esencial de la región El del genoma del adenovirus, por ejemplo, de la región Ela y/o de la región Elb, que es imprescindible para la replicación del virus. En determinadas formas de realización, un vector basado en un adenovirus de acuerdo con la invención presenta una deficiencia en al menos una parte de la región no esencial E3. En determinadas formas de realización, el vector presenta una deficiencia en la función de al menos un gen esencial de la región El y en al menos una parte de la región no esencial E3. El vector basado en un adenovirus puede presentar "deficiencias múltiples", es decir, puede presentar una deficiencia en la función de uno o más genes esenciales, que pueden estar presentes en dos o más regiones de su geno a. A modo de ejemplo, los vectores basados en adenovirus que presentan deficiencias en la región El o en las regiones El y E3 también pueden presentar deficiencias en al menos un gen esencial de la región E4 y/o al menos un gen esencial de la región E2 (por ejemplo, la región E2A y/o la región E2B).
Los vectores basados en adenovirus, los métodos para construirlos y los métodos para propagarlos son bien conocidos en la téenica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los EE. UU. N.° 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 y 6113913 y en Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", y M. S. Horwitz, "Adenovirus", capítulos 67 y 68, respectivamente, de Virology, B. N. Fields y col., editores, 3a edición., Raven Press, Ltd., Nueva (1996), así como en otras referencias que se citan en la presente. Típicamente, la construcción de los vectores basados en adenovirus está basada en el uso de técnicas de biología molecular estándar, tales como los que se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edición, Coid Spring Harbor Press, Coid Spring Harbor, NY (1989); Watson y col., Recombinant DNA, 2a edición, Scientific American Books (1992); y Ausubel y col., Current Protocole in Molecular Biology, Wilcy Interscience Publishers, NY (1995), así como en otras referencias que se citan en la presente.
De acuerdo con la invención, un adenovirus es un adenovirus humano del serotipo 26. Las vacunas de acuerdo con la invención que se basan en este serotipo así como también las que se basan en Ad35 sorprendentemente parecen más potentes que las que se describieron en el arte previo que estaban basadas en Ad5, debido a que estas últimas no lograron proveer una protección completa contra la replicación por desafío con VSR después de una administración intramuscular simple (Kim y col., 2010, Vaccine 28: 3801- 3808; Kohlmann y col·., 2009, J Virol 83: 12601-12610; Krause y col., 2011, Virology Journal 8:375). El serotipo de la invención además en general tiene una seroprevalencia baja y/o bajos títulos preexistentes de anticuerpos neutralizantes en la población humana. Los vectores adenovirales recombinantes de este serotipo y de Ad35 con diferentes transgenes se evalúan en ensayos clínicos, y además demuestran tener un perfil de seguridad excelente. La preparación de los vectores rAd26 se describe, por ejemplo, en WÓ 2007/104792 y en Abbink y col., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Pueden hallarse ejemplos de secuencias de los genomas de los vectores Ad26 en el acceso GenBank EF 153474 y en SEQ ID N° 1 de WO 2007/104792. La preparación de los vectores rAd35 se describe, por ejemplo, en la Patente de los EEUU N° 7270811, en WO 00/70071 y en Vogels y col., (2003) J. Virol., 77(15): 8263-71. Pueden hallarse ejemplos de secuencias de los genomas de los vectores Ad35 en el acceso GenBank AC_000019 y en la figura 6 de WO 00/70071.
Los adenovirus recombinantes de acuerdo con la invención pueden presentar deficiencias en la replicación o pueden ser capaces de replicarse normalmente.
En determinadas formas de realización, los adenovirus presentan deficiencias en la replicación, por ejemplo, debido a que contienen una supresión en la región El del genoma. Aquellos versados en la téenica han de saber en el caso de la supresión de las regiones esenciales del genoma de un adenovirus, las funciones que son codificadas por las regiones en cuestión, han de ser proporcionadas en trans, preferiblemente por la célula que se emplea para la producción, es decir, cuando se elimina una parte o la totalidad de las regiones El, E2 y/o E4 de los adenovirus, es imprescindible que éstas estén presentes en la célula que se emplee para la producción, por ejemplo, que estén integradas en su genoma o que tomen la forma de adenovirus asistentes o plásmidos asistentes. Los adenovirus también pueden presentar una supresión en la región E3, que es prescindible para la replicación, por lo que no es necesario complementar una supresión de este tipo.
En la presente, para la producción podrá usarse cualquier célula (que podrá conocerse como "célula de envasado", "célula huésped" o "célula complementaria") en la que pueda propagarse el adenovirus deseado. Por ejemplo, los vectores basados en adenovirus recombinantes podrán propagarse en células que sean apropiadas para complementar las deficiencias que puedan presentar los adenovirus. En el genoma de las células que se empleen para la producción, preferiblemente habrá al menos una secuencia propia de los adenovirus El, con lo que se posibilitará la complementación de aquellos adenovirus recombinantes que presenten una supresión en la región El. Para poner en práctica la producción, podrá usarse cualquier célula que sea apropiada para complementar una supresión en la región El, por ejemplo, una célula de retina humana inmortalizada que comprenda la región El, como es el caso de las células 911 o PER.C6 (véase la Patente de los EE. UU. N.° 5994128), un aminocito que haya sido transformado con la región El (véase la Patente EP 1230354), una célula A549 que haya sido transformada con la región El (véanse, por ejemplo, WO 98/39411 y la Patente de los EE. UU. N. ° 5891690), una célula GH329:HeLa (Gao y col., 2000, Human Gene Therapy, 11: 213-219), 293 o una célula semejante. En determinadas formas de realización, las células que se empleen para la producción podrán ser, por ejemplo, células HEK293, células PER.C6, células 911, células IT293SF o células semejantes.
Para los adenovirus deficientes que no son del subgrupo C El tales como el Ad35 (subgrupo B) o Ad26 (subgrupo D), se prefiere intercambiar la secuencia codificante de E4-orf6 de estos adenovirus que no son del subgrupo C por la E4-orf6 de un adenovirus del subgrupo C tal como Ad5. De esta manera, los adenovirus podrán propagarse de acuerdo con métodos conocidos, en lineas de células complementarias donde se expresen genes que codifiquen la región El de los adenovirus Ad5, como es el caso de, por ejemplo, las células 293 o las células PER.C6 (véanse, por ejemplo, Havenga y col., 2006, J. Gen. Virol., 87: 2135-2143, y WO 03/104467, que se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad). En ciertas formas de realización, un adenovirus que se puede usar es un adenovirus humano de serotipo 35, con una eliminación en la región El en la cual se ha clonado el ácido nucleico que codifica para el antigeno de proteina F del VSR, y con una región E4 orf6 de Ad5. En ciertas formas de realización, el adenovirus en la composición de vacuna de la invención es un adenovirus humano de serotipo 26, con una eliminación en la región El en la cual se ha clonado el ácido nucleico que codifica para el antigeno de la proteina F del VSR, y con una región E4 orf6 de Ad5.
En formas de realización alternativas, no será necesario introducir una región heteróloga orf6 de la región E4 (por ejemplo, Ad5) en el vector basado en un adenovirus. En lugar de esto, el vector que presente una deficiencia en la región El y que no esté relacionado con el subgrupo C se propaga en una linea de células en las que se expresa tanto la región El como un orf6 de la región E4 que sea compatible, por ejemplo, en la linea de células 293-ORF6, en las que se expresa la región El y el orf6 de la región E4 de los adenovirus Ad5 (véanse, por ejemplo, Brough y col., 1996, J. Virol., 70: 6497-501, donde se describe la generación de las células 293-ORF6; Abrahamsen y col., 1997, J. Virol., 71: 8946-51; y Nan y col., 2003, Gene Therapy 10: 326-36, donde se describe la generación de vectores basados en adenovirus que no pertenecen al subgrupo C de los que se ha eliminado la región El a partir de la linea de células que se ha mencionado).
Como alternativa, podrá usarse una linea de células complementarias en las que se exprese una región El que sea propia del serotipo que se desee propagar (véanse, por ejemplo, WO 00/70071 y WO 02/40665).
En el caso de los adenovirus del subgrupo B, como es el caso de Ad35, que comprenden una supresión en la región El, resulta preferible que se retenga el extremo 3' del marco abierto de lectura de E1B 55K, por ejemplo, los 166 pares de bases que se encuentran justo antes del marco abierto de lectura de pIX, o bien que se retenga un fragmento que los comprenda, que podrá ser un fragmento de 243 pares de bases que se encuentre justo antes del codón de inicio de pIX (marcado en el extremo 5' por un sitio de restricción para Bsu36I en el geno a de Ad35), con el propósito de que se incremente su estabilidad, ya que el promotor del gen pIX reside en parte en el área que se ha mencionado (véanse, por ejemplo, Havenga y col., 2006, J. Gen. Virol., 87: 2135-2143, y WO 2004/001032, que se incorporan en la presente a modo de referencia).
El término "ácido nucleico heterólogo" (que es sinónimo del término "transgen"), aplicado a un adenovirus de acuerdo con la invención, hace referencia a un ácido nucleico que no está presente de manera natural en el adenovirus. Se lo introduce en el adenovirus, por ejemplo, sobre la base de téenicas convencionales de biología molecular. En la presente invención, el ácido nucleico heterólogo codifica para una proteína F del VSR o un fragmento de la misma. A modo de ejemplo, es posible clonarlo en la localización en la que se ha eliminado la región El o E3 de un vector basado en un adenovirus. Un transgen generalmente está unido operativamente a secuencias que son apropiadas para controlar la expresión, lo que puede ser el resultado de la colocación de un ácido nucleico que codifica uno o más transgenes bajo el control de un promotor. Es posible agregar más secuencias reguladoras. Para expresar los transgenes, pueden usarse numerosos promotores conocidos por aquellos versados en la téenica. Un ejemplo no limitativo de un promotor apropiado para llevar a cabo la expresión en las células eucariotas es el promotor del CMV (US 5385839), que por ejemplo, puede ser el promotor inmediato temprano del CMV, que, por ejemplo, puede comprender los nucleótidos -735 a +95 del potenciador/promotor inmediato temprano del gen correspondiente del CMV. Detrás de los transgenes, puede haber presente una señal de poliadenilación, por ejemplo, la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (US 5122458).
En ciertas formas de realización, los vectores Ad26 recombinantes de la invención comprenden como nucleótidos 5' terminales la secuencia de nucleótidos: CTATCTAT . Estas formas de realización son ventajosas debido a que dichos vectores muestran mejor replicación en procesos de producción, lo que resulta en lotes de adenovirus con mejor homogeneidad, en comparación con vectores que tienen las secuencias 5' terminales originales (en general CATCATCA) (también véanse las solicitudes de patente nos. PCT/EP2013/054846 y US 13/794,318, tituladas 'Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends' presentada el 12 de marzo de 2012 a nombre de Crucell Holland B.V.), que se incorpora en su totalidad como referencia a la presente. La invención por consiguiente también provee lotes de adenovirus recombinante que codifican para la proteina F del VSR o para una parte de la misma, en donde el adenovirus es un adenovirus humano serotipo 26, y en donde esencialmente todo (por ejemplo al menos 90%) el adenovirus en el lote comprende un geno a con secuencia de nucleótidos terminal CTATCTAT.
De acuerdo con la invención, la proteina F del VSR puede derivar de cualquier cepa de VSR de origen natural o recombinante, preferentemente de cepas de VSR humano, tal como A2, Long, o cepas B. En otras formas de realización, la secuencia puede ser una secuencia consenso basada en una pluralidad de secuencias de aminoácidos de proteina F del VSR. En un ejemplo de la invención, la cepa de VSR es la cepa VSR-A2.
De acuerdo con la invención, la proteina F del VSR puede ser la proteina F del VSR de longitud completa, o un fragmento de la misma. En una forma de realización de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina F del VSR codifica para la proteina F del VSR de longitud completa (F0), tal como la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En un ejemplo de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina F del VSR tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Como alternativa, la secuencia que codifica para la proteina F del VSR puede ser cualquier secuencia que sea al menos aproximadamente 80%, preferentemente más de aproximadamente 90%, más preferentemente al menos aproximadamente 95%, idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. En otras formas de realización, se pueden usar secuencias optimizadas por codones tales como por ejemplo las que se proveen en SEQ ID NO: 2, 4, 5 o 6 de WO 2012/021730.
En otra forma de realización de la invención, la secuencia de nucleótidos como alternativa puede codificar para un fragmento de la proteina F del VSR. El fragmento puede ser el resultado tanto de una eliminación amino-terminal como carboxilo-ter inal o ambas. La extensión de la eliminación se puede determinar por parte de una persona con experiencia en el arte para, por ejemplo, conseguir mejor rendimiento del adenovirus recombinante. El fragmento se elegirá para que comprenda un fragmento inmunológicamente activo de la proteina F, o sea una parte que origine una respuesta inmunitaria en un sujeto. Esto se puede determinar fácilmente usando métodos in silico, in vitro y/o in vivo, todos de rutina para una persona con experiencia en el arte. En una forma de realización de la presente invención, el fragmento es una proteina F del VSR truncada en la región codificante de transmembrana (FOATM, véase por ejemplo US 20110014220). Los fragmentos de proteina F también pueden ser el dominio Fl o el dominio F2 de la proteina F. Los fragmentos de F también pueden ser fragmentos que contienen epitopes de neutralización y epitopes de células T (Sing y col., 2007, Virol . Immunol . 20, 261-275; Sing y col., 2007, Vaccine 25, 6211-6223).
El término "aproximadamente" para valores numéricos como se usa en la presente divulgación significa un valor de ± 10%.
En ciertas formas de realización, la invención provee métodos para hacer una vacuna contra el virus sincitial respiratorio (VSR), que comprenden proveer un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR o un fragmento de la misma, propagar dicho adenovirus recombinante en un cultivo de células huésped, aislar y purificar el adenovirus recombinante, y colocar el adenovirus recombinante en una composición farmacéuticamente aceptable.
Los adenovirus recombinantes se pueden preparar y propagar en células huésped, de acuerdo con métodos bien conocidos, que incluyen el cultivo celular de las células huéspedes que están infectadas con el adenovirus. El cultivo celular puede ser cualquier tipo de cultivo celular, incluyendo cultivo de células adherentes, por ejemplo células que están unidas a la superficie de un recipiente de cultivo o a microvehículos, asi como también cultivo en suspensión.
La mayoría de los cultivos en suspensión a gran escala se operan como procesos en lotes individuales o consecutivos, que son los más sencillos y adaptables a cualquier escala. En la actualidad, se están tornando más comunes los procesos continuos que están basados en el principio de la perfusión, y también pueden resultar apropiados en el contexto de la presente invención (véanse, por ejemplo, WO 2010/060719 y WO 2011/098592, que se incorporan en la presente a modo de referencia, donde se describen métodos apropiados para obtener y purificar grandes cantidades de adenovirus recombinantes).
Las células que se emplean para la producción se cultivan para incrementar su cantidad, y, la cantidad y/o la titulación de los virus. Las células se cultivan para posibilitar el metabolismo y/o el crecimiento y/o la división y/o la generación de los virus de interés de acuerdo con la invención. Esto puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos que han de resultar conocidos para aquellos versados en la téenica, y puede abarcar, sin limitación, el suministro de nutrientes para las células, por ejemplo, a través de un medio de cultivo apropiado. Los medios de cultivo apropiados han de resultar bien conocidos para aquellos versados en la técnica, y generalmente pueden obtenerse en grandes cantidades a partir de proveedores comerciales o pueden elaborarse a medida, de acuerdo con protocolos convencionales. El cultivo puede llevarse a cabo, por ejemplo, en placas, en botellas agitadas o en biorreactores, mediante el uso de sistemas en lotes individuales o consecutivos, sistemas continuos o sistemas semejantes. Las condiciones apropiadas para cultivar las células han de resultar conocidas (véanse, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973); y R.I. Freshncy, Culture of animal cells: A manual of basic technique, cuarta edición (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471- 34889-9).
Típicamente, el adenovirus será expuesto a las células que sean apropiadas para llevar a cabo la producción, que se encontrarán en un cultivo, de manera tal que éstas puedan captarlo. Usualmente, la agitación óptima es de aproximadamente entre 50 y 300 rpm, típicamente es de aproximadamente 100-200 rpm, y por ejemplo, puede ser de aproximadamente 150 rpm. La DO típica es de 20-60%, por ejemplo, puede ser de 40%. El pH óptimo es de entre 6,7 y 7,7. La temperatura óptima es de entre 30°C y 39°C, por ejemplo, puede ser de 34-37°C. La MOI óptima es de entre 5 y 1000, por ejemplo, puede ser de aproximadamente 50-300. Típicamente, los adenovirus infectan las células que se emplean para la producción de manera espontánea, y usualmente el contacto entre dichas células y las partículas de los rAd es suficiente para que tenga lugar la infección. En general, se le agrega una solución madre que comprende los adenovirus al cultivo para iniciar la infección, y posteriormente, los adenovirus se propagan en las células que se emplean para la producción. Todos estos procedimientos son de uso habitual y han de resultar conocidos para aquellos versados en la téenica.
Una vez que tiene lugar la infección con un adenovirus, el virus se replica en la célula, con lo cual puede incrementarse su cantidad. Este proceso se conoce en la presente como la propagación de los adenovirus. Eventualmente, la infección de las células con el adenovirus da como resultado su lisis. Sobre la base de las características líticas del adenovirus, pueden ponerse en práctica dos modalidades de elaboración diferentes. La primera modalidad está basada en la cosecha del virus antes de la lisis de las células, y comprende el uso de factores externos para efectuar dicha lisis. La segunda modalidad está basada en la cosecha del sobrenadante que comprende el virus después de la lisis (prácticamente) completa de las células por parte del virus producido (véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU 6485958, donde se describe la cosecha de adenovirus sin la lisis de las células huésped mediante el uso de un factor externo). Resulta preferible emplear factores externos para lisar de manera activa las células y cosechar el adenovirus.
Aquellos versados en la téenica han de conocer diversos métodos para lisar las células de manera activa. Se los describe, por ejemplo, en WO 98/22588, p.28-35. Los métodos útiles en este contexto incluyen, por ejemplo, los ciclos de congelación-descongelación, la agitación en una fase sólida, la lisis hipertónica y/o hipotónica, la agitación en una fase liquida, la sonicación, la extrusión a presión elevada, la lisis con detergentes, las combinaciones de estos métodos y los métodos semejantes. En una forma de realización de la invención, las células se lisan usando al menos un detergente. El uso de un detergente para la lisis resulta ventajoso, ya que se trata de un método sencillo, cuya escala puede modificarse con facilidad.
Los detergentes que pueden emplearse y la modalidad de su uso han de resultar conocidos en general para aquellos versados en la téenica. A modo de ejemplo, puede consultarse WO 98/22588, p. 29-33. Los detergentes pueden ser aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos o no iónicos. La concentración de los detergentes puede variar, y por ejemplo, puede hallarse en el rango aproximado de 0,l%-5% (p/p). En una forma de realización, el detergente que se emplea es Tritón X-100.
Pueden emplearse nucleasas para remover ácidos nucleicos contaminantes, es decir, principalmente de la célula que se emplea para la producción. Los ejemplos de nucleasas que son apropiadas para usar en la presente invención incluyen Benzonase®, Pulmozyme® y cualquier otra ADNasa y/o ARNasa de uso habitual en la técnica. En formas de realización preferidas, la nucleasa es Benzonase®, que hidroliza rápidamente los ácidos nucleicos al hidrolizar los enlaces de fosfodiéster internos entre nucleótidos específicos, con lo que se reduce la viscosidad del U sado celular. Benzonase® puede obtenerse del proveedor comercial Merck KGaA (código W214950). La concentración en la cual puede emplearse la nucleasa preferiblemente se encuentra en el rango de 1-100 unidades/ml. Como alternativa a un tratamiento con una nucleasa, o adicionalmente, es posible separar el ADN de la célula huésped durante la purificación de los adenovirus, sobre la base de una precipitación selectiva, para lo se emplean agentes de precipitación selectivos como el bromuro de domifeno (véanse, por ejemplo, US 7326555, Goerke y col., 2005, Biotechnology and bioengineering, Vol. 91: 12-21, WO 2011/045378 y WO 2011/045381).
Los métodos para cosechar el adenovirus a partir de los cultivos que comprenden las células que se emplean para la producción se describen en detalle en WO 2005/080556.
En determinadas formas de realización, el adenovirus cosechado también se somete a una purificación adicional. La purificación del adenovirus puede llevarse a cabo en varios pasos, que pueden abarcar una depuración, una ultrafiltración, una diafiltración o una separación sobre la base de una cromatografía, tal como se describe, por ejemplo, en WO 05/080556, que se incorpora en la presente a modo de referencia. La depuración puede basarse en un paso de filtración, en el que pueden eliminarse los residuos celulares y otras impurezas del lisado celular. La ultrafiltración se emplea para concentrar la solución que comprende el virus. La diafiltración o un intercambio de amortiguadores utilizando dispositivos de ultrafiltración, es un método apropiado para remover e intercambiar las sales, los azúcares y otros elementos semejantes. Aquellos versados en la téenica han de saber cómo determinar las condiciones óptimas para cada paso de purificación. En WO 98/22588, que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad, se describen métodos para producir y purificar vectores basados en adenovirus. Estos métodos comprenden cultivar las células huésped, infectarlas con adenovirus, cosecharlas y U sarlas, concentrar el U sado en bruto, cambiar el amortiguador en dicho lisado, tratarlo con una nucleasa y someter el virus a una purificación adicional a través de una cromatografía.
Preferiblemente, en la purificación se emplea al menos un paso de cromatografía, tal como se describe, por ejemplo, en WO 98/22588, p.61-70. Se han descripto numerosos procesos para llevar a cabo el paso de purificación adicional de los adenovirus, que suelen comprender procedimientos de cromatografía. Aquellos versados en la téenica han de conocer estos procesos y han de poder realizar modificaciones en los procedimientos de cromatografía para optimizarlos. A modo de ejemplo, es posible purificar los adenovirus a través de diversos pasos basados en procedimientos de cromatografía de intercambio aniónico, según se describe, por ejemplo, en WO 2005/080556 y en Konz y col., 2005, Hum Gene Ther 16: 1346-1353. Se ha descripto una cantidad significativa de métodos diferentes para purificar los adenovirus, que han de resultar conocidos para aquellos versados en la técnica. Se describen otros métodos para producir y purificar los adenovirus, por ejemplo, en WO 00/32754, WO 04/020971, US 5837520, US 6261823, WO 2006/108707; Konz y col., 2008, Methods Mol Biol 434: 13-23; Altaras y col·., 2005, Adv Biochem Eng Biotechnol 99: 193-260), que se incorporan en la presente a modo de referencia.
En el contexto de la administración en los seres humanos, en la presente invención pueden emplearse composiciones farmacéuticas que comprenden un rAd y un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptable. En este contexto, el término "farmacéuticamente aceptable" denota que el vehículo o el excipiente, en las dosis y las concentraciones que se emplean, no darán como resultado efectos indeseables o dañinos en los sujetos a los que se los administra. Dichos vehículos y los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la téenica (véanse Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. R. Gennaro, editor, Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, editores, Taylor y Francis (2000); y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, editor, Pharmaceutical Press (2000)). El rAd purificado preferiblemente se formula y se administra en forma de una solución estéril, aunque también es posible emplear preparaciones liofilizadas. Las soluciones estériles se elaboran sobre la base de una filtración bajo condiciones estériles o con otros métodos conocidos en la téenica. Posteriormente, las soluciones se liofilizan o se colocan en recipientes apropiados para envasar dosis farmacéuticas. El pH de estas soluciones generalmente se halla en el rango de entre 3,0 y 9,5, por ejemplo, entre 5,0 y 7,5. El rAd típicamente se encuentra en una solución que comprende un amortiguador apropiado farmacéuticamente- aceptable, y que también puede contener una sal. Opcionalmente, puede haber presente un agente estabilizador, tal como la albúmina. En determinadas formas de realización, se agrega un detergente. En determinadas formas de realización, el rAd puede formularse en una preparación inyectable. Las formulaciones de este tipo contienen cantidades eficaces del rAd, típicamente son soluciones líquidas, suspensiones líquidas o versiones liofilizadas estériles, y opcionalmente pueden contener estabilizadores o excipientes. Una vacuna basada en adenovirus también puede administrarse por vía intranasal, en forma de aerosol (véase, por ejemplo, WO 2009/117134).
A modo de ejemplo, el adenovirus puede almacenarse en el mismo amortiguador que se emplea para almacenar las referencias mundiales de adenovirus (Hoganson y col., Development of a stable vector adenoviral formulation, Bioprocessing, Marzo de 2002, p. 43-48), que comprende Tris 20 mM, pH 8, NaCl 25 mM y 2,5% de glicerol. La formulación de otro amortiguador que es útil para administrárselo a los seres humanos comprende Tris 20 mM, 2 MgCl2 mM, NaCl 25 mM, 10% p/v de sacarosa y 0,02% p/v de polisorbato-80. Evidentemente, ha de ser posible emplear otros amortiguadores, y pueden hallarse diversos ejemplos de formulaciones apropiadas para almacenar preparaciones de (adeno)virus purificados y para llevar a cabo su administración farmacéutica en la Patente Europea N° 0853660, en la Patente de los EEUU 6225289 y en las solicitudes de patentes internacionales WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763, WO 03/078592 y WO 03/061708.
En determinadas formas de realización, una composición que comprende el adenovirus también comprende uno o más adyuvantes. Se sabe que los adyuvantes son útiles para incrementar aún más la respuesta inmunitaria contra el determinante antigénico que se administra. A modo de ejemplo, en WO 2007/110409, que se incorpora en la presente a modo de referencia, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden adenovirus y adyuvantes apropiados. Los términos "adyuvante" y "estimulante inmunitario" se usan indistintamente en la presente, y abarcan aquellas sustancias que son útiles para estimular el sistema inmunitario. En este contexto, se emplea un adyuvante para incrementar la respuesta inmunitaria que se genera con los vectores basados en adenovirus de acuerdo con la invención. Los ejemplos de coadyuvantes apropiados incluyen las sales de aluminio, tales como el hidróxido de aluminio y/o el fosfato de aluminio, las emulsiones oleosas (las emulsiones de aceite en agua), que pueden ser emulsiones de escualeno y agua, tales como, por ejemplo, MF59 (véase, por ejemplo, WO 90/14837), las formulaciones a base de saponina, tales como, por ejemplo, QS21, los complejos inmunoestimulantes (ISCOMS); (véanse, por ejemplo, US 5057540, WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762 y WO 2005/002620), los derivados de bacterias o de microbios, tales como el monofosforil lipido A (MPL), el MPL 3-O-desacilado (3dMPL), los oligonucleótidos que contienen motivos CpG, las toxinas bacterianas que pueden ribosilar el ADP o las mutantes de éstas, como es el caso de la enterotoxina LT de E. coli lábil ante el calor o la toxina CT del cólera, y semejantes. También es posible usar coadyuvantes codificados por vectores, por ejemplo, mediante el uso de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fusión entre el dominio de oligomerización de la proteina que puede unirse a C4 (C4bp) y el antigeno de interés (véase, por ejemplo, Solabomi y col., 2008, Infect. Imun., 76: 3817-23).
En determinadas formas de realización, las composiciones de acuerdo con la invención comprenden aluminio como coadyuvante, por ejemplo, en forma de hidróxido de aluminio, de fosfato de aluminio, de fosfato de aluminio y potasio o de una combinación de éstos, en una concentración de entre 0,05 y 5 mg por dosis, por ejemplo, de entre 0,075 y 1,0 mg por dosis.
En otras formas de realización, las composiciones no comprenden coadyuvantes.
También es posible de acuerdo con la invención administrar otros componentes activos, en combinación con las vacunas de acuerdo con la invención. Dichos otros componentes activos pueden comprender por ejemplo otros antigenos de VSR o vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican para estos. Dichos vectores pueden ser no adenovirales o adenovirales, de los cuales los últimos pueden ser de cualquier serotipo. Un ejemplo de otros antigenos de VSR incluyen la proteina G de VSR o partes inmunológicamente activas de la misma. Por ejemplo, el adenovector recombinante rAd/3xG de replicación deficiente basado en Ad5 aplicado por via intranasal, que expresa el dominio de núcleo soluble de la glicoproteina G (aminoácidos 130 a 230) fue protector en un modelo murino (Yu y col., 2008, J Virol 82: 2350-2357), y a pesar de que no fue protector cuando se aplicó por via intramuscular, es claro a partir de estos datos que la proteina G de VSR es un antígeno adecuado para inducir respuestas protectoras. Otros componentes activos también pueden comprender antigenos no VSR, por ejemplo de otros patógenos tales como virus, bacterias, parásitos, y similares. La administración de otros componentes activos por ejemplo se puede hacer mediante la administración separada o mediante la administración de productos de combinación de las vacunas de la invención y los otros componentes activos. En ciertas formas de realización, puede haber otros antigenos no adenovirales (además de VSR.F), codificados en los vectores de la invención. En ciertas formas de realización, por consiguiente se puede desear expresar más de una proteina a partir de un adenovirus individual, y en dichos casos se pueden conectar más secuencias codificantes por ejemplo para formar un transcripto individual a partir de un casete de expresión individual o los mismos pueden estar presentes en dos casetes de expresión separados que se clonan en diferentes partes del genoma adenoviral.
Las composiciones de adenovirus pueden administrarse a sujetos, por ejemplo, sujetos humanos. La dosis total de los adenovirus que se les administra a los sujetos en cada administración puede variar, lo cual ha de resultar evidente para aquellos versados en la téenica. En general, la dosis es de entre 1 x 107 partículas virales (pv) y 1 x 1012 pv, preferiblemente es de entre 1 x 108 pv y 1 x 1011 pv, y por ejemplo, puede ser de entre 3 x 108 y 5 x 1010 pv, tal como entre 109 y 3 x 1010 pv.
La administración de las composiciones de adenovirus puede llevarse a cabo a través de vías convencionales. Las formas de realización no limitativas abarcan la administración parenteral, por ejemplo, por medio de una inyección, la cual puede aplicarse por via intradérmica, intramuscular, entre otras, a través de una via subcutánea, una via transcutánea o una via a través de una mucosa, tal como las vías intranasal u oral, entre otras. La administración intranasal en general se ha visto como una via preferida para las vacunas contra VSR. La ventaja más importante de la estrategia viva intranasal es la estimulación directa de la inmunidad local del tracto respiratorio y la falta de potenciación asociada de la enfermedad. Las únicas vacunas bajo evaluación clínica para uso pediátrico en el presente son vacunas vivas intranasales (Collins and Murphy. Vaccines against human respiratory syncytial virus). En: Perspectives in Medical Virology 14: Respiratory Syncytial Virus (Ed. Cañe, P.), Elsevier, Amsterdam, Países Bajos, pp233-277) . La administración intranasal es una via preferida adecuada de acuerdo con la presente invención también. Sin embargo, se prefiere particularmente de acuerdo con la presente invención administrar la vacuna por via intramuscular, debido a que sorprendentemente se halló que la administración intramuscular de la vacuna de acuerdo con la invención resultó en protección contra la replicación de VSR en nariz y pulmones de ratas algodoneras, en contraste con las vacunes intramusculares informadas previamente para VSR en base a otros serotipos de adenovirus. La ventaja de la administración intramuscular es que la misma es simple y bien establecida, y que no acarrea problemas de seguridad para la aplicación intranasal en niños menores a 6 meses. En una forma de realización, una composición se administra por medio de una inyección intramuscular, por ejemplo, en el músculo deltoides del brazo o en el músculo vastus lateralis del muslo. Aquellos versados en la téenica han de conocer las diversas modalidades posibles para administrar una composición, por ejemplo, una vacuna, con el propósito de inducir una respuesta inmunitaria contra el o los antigenos que comprende.
Un sujeto tal como se usa en la presente preferentemente es un mamífero, por ejemplo un roedor, por ejemplo un ratón, una rata algodonera, o un primate no humano, o un humano. Preferentemente, el sujeto es un sujeto humano. El sujeto puede ser de cualquier edad, por ejemplo entre aproximadamente 1 mes y 100 años de edad, por ejemplo entre aproximadamente 2 meses y aproximadamente 80 años de edad, por ejemplo entre aproximadamente 1 mes y aproximadamente 3 años de edad, entre aproximadamente 3 años y aproximadamente 50 años de edad, entre aproximadamente 50 años y aproximadamente 75 años de edad, etc.
También es posible realizar una o más administraciones de refuerzo con una o más vacunas de la invención basadas en adenovirus. Si se recurre a una vacunación de refuerzo, típicamente se la administra al mismo sujeto entre una semana y un año, preferiblemente entre dos semanas y cuatro meses, después de la primera administración de la composición (que en estos casos se conoce como la "vacunación inicial"). En regímenes de refuerzo alternativos, a los sujetos también pueden administrárseles diversos vectores, por ejemplo, uno o más adenovirus de serotipos diferentes, o bien otros vectores, que pueden comprender MVA, ADN o proteína, como vacunaciones de sensibilización. Por ejemplo es posible administrar al sujeto un vector adenoviral recombinante de acuerdo con la invención como sensibilización, y hacer el refuerzo con una composición que comprende la proteína F del VSR.
En ciertas formas de realización, la administración comprende una sensibilización y al menos una administración de refuerzo. En ciertas formas de realización de las misma, la administración de sensibilización es con un ácido nucleico que comprende rAd35 que codifica para la proteina F del VSR o un fragmento de la misma ('rAd35-VSR.F') y la administración de refuerzo es con un ácido nucleico que comprende rAd26 que codifica para la proteina F del VSR de acuerdo con la invención ('rAd26-VSR.F'). En otras formas de realización de la misma, la administración de sensibilización es con rAd26-VSR.F y la administración de refuerzo es con rAd35-VSR.F. En otras formas de realización, tanto la administración de sensibilización como la de refuerzo son con rAd26.VSR.F. En ciertas formas de realización, la administración de sensibilización es con rAd26-VSR.F y la administración de refuerzo es con la proteina F del VSR. En todas estas formas de realización, es posible proveer una administración adicional de refuerzos con el mismo o con otros vectores o proteínas. Las formas de realización en donde el refuerzo con proteína F del VSR puede ser particularmente beneficioso incluyen por ejemplo sujetos de edad en grupos de riesgo (por ejemplo que tienen COPD o asma) de 50 años o mayores, o por ejemplo en sujetos sanos de 60 años o mayores o de 65 años o mayores.
En ciertas formas de realización, la administración comprende una administración simple de un adenovirus recombinante de acuerdo con la invención, sin otras administraciones (de refuerzo). Dichas formas de realización son ventajosas en vista de la menor complejidad y costos de un régimen de administración simple en comparación con un régimen de sensibilización y refuerzo. La protección completa ya se observa después de la administración simple de los vectores adenovirales recombinantes de la invención sin administración de refuerzos en el modelo de rata algodonera en los ejemplos de la presente.
La invención se describe con mayor detalle en los siguientes ejemplos, que no tienen por objeto limitar la invención, sino que solamente se proveen para facilitar su comprensión.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Preparación de vectores adenovirales Clonado del gen de F del VSR en la región El de Ad35 y Ad26: El gen VSR.F(A2)nat, que codifica para la proteina de fusión (F) de VSR nativa de la cepa A2 (Genbank ACO83301.1), se optimizó génica ente para expresión en humanos y se sintetizó en Geneart. Se incluyó una secuencia de Kozak (5' GCCACC 3') directamente en el frente del codón de inicio ATG, y se agregaron dos codones de finalización (5' TGA TAA 3') al final de la secuencia codificante de VSR.F(A2)nat. Se insertó el gen VSR.F(A2)nat en el plásmido pAdApt35BSU y en el plásmido pAdApt26 mediante los sitios HindIII y Xbal. Los plásmidos resultantes, pAdApt35BSU.VSR.F(A2)nat y pAdApt26.VSR.F(A2)nat se muestran en la Figura 15. La secuencia de aminoácidos de la proteina F, y la secuencia optimizada por codones que codifica para la secuencia de aminoácidos, se proveen en la Tabla 1 como SEQ. ID. NOs: 1 y 2, respectivamente.
Cultivo celular: Se mantuvieron células PER.C6 (Fallaux y col., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-1917) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS), suplementado con MgCl210 mM.
Generación de adenovirus, infecciones y pasaje: Se generaron todos los adenovirus en células PER.C6 mediante recombinación homologa simple y se produjeron como se describió previamente (para rAd35: Havenga y col., 2006, J. Gen . Virol . 87: 2135-2143; para rAd26: Abbink y col., 2007, J. Virol. 81: 4654-4663). Brevemente, se transíectaron células PER.C6 con plásmidos de vectores Ad, usando Lipofectamine de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante (Life Technologies). Para el rescate de los vectores Ad35 que portan el casete de expresión del transgen VSR.F(A2)nat, se usaron el plásmido pAdApt35BSU.VSR.F(A2)nat y el cósmido pWE/Ad35.pIX-rITR.dE3.5orf6, mientras que para los vectores Ad26 que portan el casete de expresión del transgen VSR. F(A2)nat, se usaron el plásmido pAdApt26.VSR.F(A2)nat y el cósmido pWE.Ad26.dE3.5orf6. Se cosecharon las células un dia después de la CPE completa, se congelaron y descongelaron, se centrifugaron durante 5 minutos a 3.000 rpm, y se almacenaron a -20°C. Luego los virus se purificaron por placa y se amplificaron en PER.C6 cultivadas en un pocilio individual de una placa de cultivo de tejidos de 24 multipocillos. Se llevó a cabo una amplificación adicional en PER.C6 cultivadas usando un frasco de cultivo tisular T25 y un frasco de cultivo tisular T175. Del U sado crudo de la T175, se usaron entre 3 y 5 mi para inocular 20 frascos de cultivo tisular de capa triple T175 con 70% de capas confluentes de células PER.C6. Se purificó el virus usando un método de purificación de dos pasos en CsCl. Finalmente, se almacenó el virus en alícuotas a -85°C. Ejemplo 2. Inducción de inmunidad contra F del VSR usando adenovirus recombinantes de serotipo 26 y 35 in vivo.
Este es un experimento para investigar la capacidad del adenovirus recombinante serotipo (Ad26) y del adenovirus recombinante serotipo 35 (Ad35) para inducir inmunidad contra el antígeno de glicoproteína de F del VSR en ratones BALB/c.
En este estudio se distribuyeron los animales en grupos experimentales de 5 ratones. Se inmunizaron los animales con una dosis simple de Ad26 o Ad35 portando el gen de F del VSR de longitud completa (Ad26-VSR.F o Ad35- VSR.F) o sin transgen (Ad26e o Ad35e). Se dieron tres diluciones seriadas al décimo de rAd en el rango entre 1010 y 108 partículas de virus (pv) por vía intramuscular. Como controles, un grupo de 3 animales recibió el vector vacío Ad26e y un grupo recibió el vector vacío Ad35e.
Se usa el ensayo de ELISPOT para determinar el número relativo de células T que secretan IFNy específico de proteína F en el bazo, y se hace esencialmente como se describe en Radosevic y col. (Clin Vaccine Immunol. 2010;17(11):1687-94.). Para la estimulación de los esplenocitos en el ensayo de ELISPOT, se usaron dos grupos de péptidos que consisten en péptidos de 15 aminoácidos que se solapan en 11 aminoácidos que abarcan la secuencia completa de la proteína F del VSR (A2). Se calcularon los números de las unidades formadores de puntos (SFU) por cada 106 células.
Para la determinación de los títulos de anticuerpo se usó un ensayo de ELISA. Para esto, se recubrieron placas de ELISA (Thermo Scientific) con 25 mg/ml de antígeno inactivado completo VSR Long (Virion Serion, # de catálogo BA113VS). Se agregaron muestras de suero diluidas a las placas, y se determinaron los anticuerpos IgG contra VSR usando IgG anti ratón marcado con biotina (DAKO, # de catálogo E0413), usando detección mediante estreptavidina (SA) conjugada con peroxidasa de rábano (PO). Se calcularon los títulos mediante interpolación lineal, usando la 1.5 x de la señal de DO del suero virgen diluido 50x como corte. Se determinaron los títulos de anticuerpos específicos VSR IgGl y IgG2a en el suero de ratón usando anticuerpo anti-IgGl de ratón marcado con PO y anticuerpo anti-IgG2a de ratón marcado con PO (Southern Biotechnology Associates, # de catálogo 1070-05 y 1080-05) para cuantificar las subclases.
Se determinó la actividad neutralizante de virus (VNA) de los anticuerpos por ensayo de microneutralización, hecho esencialmente como se describe en Johnson y col. (J Infect Dis. 1999 Jul;180 (1):35-40.). Se sembraron células VERO susceptibles a VSR en placas de cultivo de células de 96 pocilios un día antes de la infección. En el día de la infección, se mezclaron los sueros y controles en dilución seriada con 1200 pfu de VSR (Long o Bl) y se incubaron 1 hora a 37°C. Subsiguientemente, se transfirieron las mezclas de virus/anticuerpo a placas de 96 pocilios con monocapas de células VERO. Tres días después se fijaron las monocapas con 80% de acetona enfriada en hielo y se determinó el antígeno VSR con un anticuerpo monoclonal anti-F. El título neutralizante se expresa como la dilución de suero (log2) que causa el 50% de reducción en la OD450 comparados con los pocilios de control de solo virus (IC5o).
A la semana 2 y la semana 8 se sacrificaron animales después de la sensibilización y se monitorearon las respuestas celular y humoral como se describió previamente.
La Figura 1 muestra que todas las dosis de Ad26-VSR.F (Figura 1A) y de Ad35-VSR.F (Figura IB) fueron eficaces para inducir una buena respuesta inmunitaria celular y que las respuestas fueron estables en el tiempo. No se observaron diferencias significativas con la dosis de vector en la respuesta de células T ya sea con Ad26-VSR.F o bien con Ad35-VSR.F.
La Figura 2 muestra los títulos de anticuerpo en el mismo experimento como se describió previamente. Ambos vectores indujeron un incremento muy claramente dependiente del tiempo y de la dosis en los títulos de ELISA (Figura 2). Los títulos anti-F se incrementaron claramente entre 2 y 8 semanas, lo que fue significativo para la dosis de 1010. A las 8 semanas no hubo diferencia en los títulos entre los vectores Ad26-VSR.F o Ad35-VSR.F.
La distribución de subclases (IgGl vs IgG2a) de IgG específica para F se determinó para evaluar el balance de la respuesta Thl vs Th2. Una respuesta sesgada Th2/Thl predispone a los animales a desarrollar una enfermedad por VSR potenciada por vacuna como se vio con el VSR inactivado por formalina. Como se muestra en la Figura 3, la proporción IgG2a/IgGl tanto para Ad26-VSR.F como para Ad35-VSR.F es mayor que 1. Esto es una fuerte indicación de que los adenovectores Ad26-VSR.F y Ad35-VSR.F exhiben una respuesta más de tipo Thl que de tipo Th2.
La Figura 4 muestra los títulos neutralizantes de virus (VNA) de los mismos sueros que se usaron para los títulos de anticuerpo. La inmunización con Ad26-VSR.F y rAd35-VSR.F condujo a la inducción de títulos neutralizantes de anticuerpo. Los títulos de VNA se incrementaron fuertemente entre las dos y ocho semanas después de la sensibilización en ratones que recibieron 1010 pv. A las ocho semanas no hubo diferencia en los títulos entre los vectores Ad26-VSR.F y Ad35-VSR.F en ratones que recibieron 1010 pv.
A partir de estos experimentos de inmunización es evidente que los vectores Ad35 y Ad26 que portan el transgen VSR.F inducen una fuerte respuesta celular y humoral contra VSR.F.
Ejemplo 3. Inmunidad contra VSR. F después de sensibilización y refuerzo heterólogo usando vectores adenovirales recombinantes que codifican para VSR. F.
Este estudio se diseñó para investigar la capacidad de los regímenes de sensibilización y refuerzo en base a vectores adenovirales derivados de dos serotipos diferentes para inducir inmunidad contra VSR.F.
Este estudio involucró ratones BALB/c que . se distribuyeron en grupos experimentales de 8 ratones. Se inmunizaron los animales por inyección intramuscular con 1010 pv portando la secuencia de tipo salvaje del gen VSR.F basado en/derivado de VSR A2 (Ad-VSR.F o Ad35-VSR.F) o sin transgen (Ad26e o Ad35e). Un grupo de animales se sensibilizó en la semana con Ad26-VSR.F y se reforzó en la semana 4 con Ad35-VSR.F o Ad35e. Otro grupo de animales se sensibilizó con Ad35-VSR.F y se reforzó en la semana 4 con Ad26-VSR.F o Ad26e. Un grupo de control de ratones se sensibilizó con Ad35e y se reforzó en la semana 4 con Ad26e. En la semana 6 y la semana 12 después de la sensibilización se sacrificaron 8 animales en cada punto de tiempo y se monitorearon las respuestas celular y humoral con ensayos inmunológicos bien conocidos para las personas con experiencia en la téenica y como se describieron previamente.
La Figura 5 muestra la respuesta celular a las 6 y 12 semanas después de la primera inmunización. A las 6 semanas después de la sensibilización (y 2 semanas después del refuerzo), se midió un efecto de refuerzo significativo tanto por Ad26-VSR.F como por Ad35-VSR.F sobre las respuestas de células T, y la magnitud de la respuesta de células T fue independiente del orden de inmunización con Ad26-VSR.F o con Ad35-VSR.F en la sensibilización y el refuerzo. A las 12 semanas después de la sensibilización (8 semanas después del refuerzo), los ratones sensibilizados con Ad26-VSR.F hablan mantenido altos niveles de células T especificas de F ya sea en animales solo sensibilizados o bien en animales sensibilizados y reforzados, en comparación con los animales sensibilizados con rAd35-VSR.F. En conjunto, los números de linfocitos específicos para F (SFU) fueron altos y estables durante al menos 12 semanas en todos los animales inmunizados o bien con rAd26-VSR.F o con rAd35-VSR.F (sensibilización/o sensibilización y refuerzo).
La Figura 6 muestra la respuesta humoral a diferentes puntos de tiempo después de vacunación por sensibilización y refuerzo con los vectores adenovirales . Ad35.VSR.F y Ad26.VSR.F sensibilizan igualmente bien, y se mostró un efecto de refuerzo significativo inducido ya sea por Ad26.VSR.F o bien por rAd35.VSR.F sobre las respuestas de células B. Más aún, la magnitud de las respuestas de células B mediante sensibilización y refuerzo heterólogo fue independiente del orden de inmunización con Ad35.VSR.F y Ad26.VSR.F, y después del refuerzo los títulos de ELISA se mantuvieron estables durante 12 semanas.
La Figura 7 muestra los títulos de anticuerpo neutralizantes de virus a diferentes puntos de tiempo después de la inmunización por sensibilización y refuerzo. Tanto los vectores Ad35.VSR.F como Ad26.VSR.F sensibilizaron igualmente bien para conseguir claros títulos de VNA, según lo observado por los títulos de ELISA. También, el incremento de los títulos de VNA después de sensibilización y refuerzo heterólogo fue independiente del orden de inmunización con Ad35.VSR.F y Ad26.VSR.F. El efecto del refuerzo con cualquiera de Ad26.VSR.F o Ad35.VSR.F sobre los títulos de VNA fue significativo en ambos puntos de tiempo y fue máximo ya a las 6 semanas. Los grupos que solo se sensibilizaron con Ad.VSR.F tuvieron mayores títulos de VNA a las 12 semanas en comparación con 6 semanas. La secuencia de F del VSR en los constructos del vector adenoviral deriva del aislado de VSR A2. El ensayo neutralizante que se describió en esta solicitud se basa en la cepa VSR Long, que pertenece a VSR subgrupo A, lo que demuestra que los anticuerpos inducidos por F (A2) son capaces de neutralizar en forma cruzada un subtipo de cepa diferente de VSR A.
Debido a que la proteína F del VSR está bien conservada entre los aislados VSR, se probó si el suero de animales inmunizados con vectores Ad-VSR.F eran capaces de neutralizar en forma cruzada un aislado prototípico de la cepa VSR B, VSR Bl. Como se muestra en la Figura 8, los sueros de ratones inmunizados también fueron capaces de neutralizar en forma cruzada la cepa Bl. La capacidad para neutralizar en forma cruzada VSR Bl no fue dependiente del vector usado en los grupos de solo sensibilización, o del orden de inmunización por sensibilización y refuerzo con los vectores Ad26.VSR.F y Ad35.VSR.F.
Colectivamente, estos datos muestran que en un régimen de sensibilización y refuerzo, las inmunizaciones consecutivas con Ad26.VSR.F y Ad35.VSR.F inducen respuestas humorales y celulares fuertes, y que la respuesta inmunitaria humoral incluye la capacidad para neutralizar aislados tanto de los subtipos A como B de VSR.
Ejemplo 4. Inducción de la protección contra la infección por VSR usando vectores adenovirales recombinantes in vivo en un modelo de rata algodonera . Este experimento se llevó a cabo para investigar la capacidad de los regímenes de sensibilización y refuerzo en base a vectores adenovirales que derivan de dos serotipos diferentes para inducir protección contra la replicación por desafio con VSR en la rata algodonera. Las ratas algodoneras ( Sigmodon hispidus) son susceptibles a infección del tracto respiratorio tanto superior como inferior con VSR y se halló que son al menos 50 veces más permisivos que las cepas de ratón (Niewiesk y col., 2002, Lab. Anim. 36(4):357-72). Más aún, la rata algodonera ha sido el modelo primario para evaluar la eficacia y seguridad de vacunas candidatas, antivirales y anticuerpos de VSR. Los datos preclinicos generados en el modelo de rata algodonera avanzaron el desarrollo de dos formulaciones de anticuerpo (RespiGam® y Synagis®) a ensayos clínicos sin la necesidad de estudios intermedios en primates no humanos.
El estudio incluyó ratas algodoneras en grupos experimentales de 8 ratas algodoneras cada uno. Se inmunizaron los animales por inyecciones intramusculares de 109 partículas de virus (pv) o 1010 pv de vectores adenovirales portando el gen de longitud completa de F del VSR (A2) (Ad26.VSR.F o Ad35.VSR.F) o sin transgen (Ad26e o Ad35e). Se reforzaron los animales 28 días más tarde con la misma dosis de pv, ya sea con el mismo vector (sensibilización y refuerzo homólogo) o bien con otro serotipo adenoviral (sensibilización y refuerzo heterólogo); los grupos de control se inmunizaron de acuerdo con vectores Ad-e, excepto que solo se aplicó una dosis (1010). Los grupos control consistieron en 6 animales. Se usaron animales infectados por vía intranasal con VSR A2 (104 unidades formadoras de placa (pfu)) como control positivo para la protección contra la replicación por desafío, ya que se sabe que la infección primaria con virus VSR protege contra la replicación por desafio secundario (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). Más aún, se usó como control VSR inactivado por formalina (FI-VSR) para enfermedad histopatológica potenciada por vacuna. Tres semanas después de la segunda inmunización (refuerzo), se desafiaron las ratas algodoneras por vía intranasal con lxlO5 pfu de VSR A2 purificados por placa. Como controles, no se inmunizó un grupo de ratas algodoneras pero recibió desafio con virus, y otro grupo de control no se inmunizó ni se desafió. Las ratas algodoneras se sacrificaron 5 dias después de la infección, un punto de tiempo en el cual el virus del desafio con VSR alcanza los títulos pico (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), y se determinaron los títulos de VSR en pulmón y nariz por titulación de virus en placa (Prince y col. 1978, Am J Pathology 93,711-791).
La Figura 9 muestra gue se observaron altos títulos de virus VSR en pulmones y nariz en controles no inmunizados así como también en los animales gue recibieron vectores adenovirales sin transgen, respectivamente 5,3 +/- 0,13 logio pfu/gramo y 5,4 +/- 0,35 logio pfu. Por el contrario, no se pudo detectar virus de desafío en tejido de pulmón y nariz de los animales gue recibieron inmunización por sensibilización y refuerzo con vectores Ad26.VSR.F y/o Ad35.VSR.F, independientemente de la dosis o del régimen.
Estos datos demuestran claramente que los vectores basados tanto en Ad35 como en Ad26 dan una protección completa contra replicación por desafío con VSR en el modelo de rata algodonera. Esto fue sorprendente, ya que se sabia que los vectores adenovirales basados en Ad5 que codifican para F del VSR no eran capaces de inducir una protección completa en modelos animales después de la administración intramuscular.
En el curso del experimento, se tomaron muestras de sangre antes de la inmunización (día 0), antes de la inmunización de refuerzo (día 28), en el día del desafío (día 49) y en el día del sacrificio (día 54). Se probaron los sueros en un ensayo de neutralización de virus basado en ensayo en placa (VNA) para la inducción de anticuerpos neutralizantes específicos para VSR sistémicos como se describe en Prince (Prince y col. 1978, Am J Pathology 93,711-791). El título neutralizante se expresa como la dilución de suero (log2) que causa 50% de reducción de placas en comparación con los pocilios de control de solo virus (IC50)- La Figura 10 muestra que los animales de control no tienen anticuerpos neutralizantes de virus en el día 28 y el día 49, mientras que se inducen altos títulos de VNA después de que los animales se sensibilizaron con los vectores Ad26.VSR.F o Ad35.VSR.F. Se observa un incremento moderado del título de VNA después de las inmunizaciones de refuerzo. La infección primaria con virus VSR A2 resultó en títulos más bien moderados de VNA que se incrementaron gradualmente en el tiempo.
Para evaluar si la vacuna de Ad26.VSR.F o Ad35.VSR.F puede exacerbar la enfermedad después de un desafío con VSR A2, se llevaron a cabo análisis histopatológicos de los pulmones 5 días después de la inyección. Se extrajeron los pulmones, se perfundieron con formalina, se seccionaron, y se tiñeron con hematoxilina y eosina para el examen histopatológíco. La calificación histopatológica fue a doble ciego, de acuerdo con los criterios publicados por Prince (Prince y col. Lab Inves t 1999, 79:1385-1392), y se calificó para los siguientes parámetros: peribronquiolitis, perivasculitis, neumonitis intersticial, y alveolitis. La Figura 11 muestra la calificación de la patología de pulmón para este experimento. Después del desafío con VSR, los animales inmunizados con FI-VSR mostraron una histopatología elevada en todos los parámetros histopatológicos que se examinaron, en comparación con animales desafiados inmunizados con simulación, lo cual era esperado según los estudios publicados previamente (Prince y col. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). Las calificaciones de histopatología en los animales inmunizados con Ad26.VSR.F y Ad35.VSR.F en comparación con los animales inmunizados con rAd-e o simulación, fueron similares, a pesar de que la perivasculitis en los animales inmunizados con rAd-VSR.F pareció levemente inferior. Por consiguiente, las vacunas de Ad26.VSR.F y Ad35.VSR.F no resultaron en enfermedad acentuada, contrariamente a las vacunas de FI-VSR.
Todas las estrategias de vacunación resultaron en una protección completa contra la replicación por desafío con VSR, indujeron fuertes anticuerpos neutralizantes de virus, y no se observó patología potenciada.
Ejemplo 5. Eficacia protectora de los vectores rAd usando diferentes vías de administración después de la inmunización simple Este estudio es para investigar la influencia de las vías de administración sobre la eficacia protectora inducida por vectores Ad26 o Ad35 que codifican para VSR.F. La vacuna se administró ya sea por vía intramuscular o por vía intranasal.
Se desafió a ratas algodoneras que habían recibido una inmunización simple con lxlO9 o lxlO10 partículas de virus (pv) de Ad26 o Ad35 portando o bien la F del VSR o un transgen (Ad26.VSR.F o Ad35.VSR.F) o sin transgen (Ad26-e o Ad35-e) en el día 0, se desafiaron en el día 49 con 105 VSR pfu y se sacrificaron en el día 54.
La Figura 12 muestra los resultados de los experimentos en donde se determinaron los virus de desafio pulmonar y nasal. Se detectaron altos títulos de virus VSR en pulmones y narices de ratas que no estaban inmunizadas o estaban inmunizadas con vectores adenovirales sin un transgen, respectivamente 4,9 +/- 0,22 logi0 pfu/gramo y 5,4 +/- 0,16 logio pfu. Por el contrario, los pulmones y narices de los animales que recibieron ya sea Ad35-VSR.F o bien Ad26-VSR.F estuvieron desprovistos de virus de desafío en replicación, independientemente de la vía de administración y de la dosis.
Estos datos sorprendentemente demuestran que cada uno de los vectores basados en Ad26 y Ad35 que codifican para la proteína F del VSR provee protección completa en experimentos de desafío en rata algodonera, independientemente de la vía de administración de los vectores. Esto fue inesperado, debido a que ninguno de las vacunas publicadas basadas en adenovirus para VSR, que estaban basadas en otros serotipos, había demostrado protección completa después de vacunación intramuscular.
Durante el experimento, se tomaron muestras de sangre antes de la inmunización (día 0), 4 semanas después de la inmunización (día 28), y en el día del desafío (día 49). Se probaron los sueros en una prueba de neutralización para la inducción de anticuerpos específicos de VSR (Figura 13). Antes de la inmunización no se detectaron anticuerpos neutralizantes de virus en ninguna rata algodonera. Todas las estrategias de inmunización con vector adenoviral, independientemente de la via de administración, indujeron claramente altos títulos de VNA, los que permanecieron estables en el tiempo. Estos datos sorprendentemente demuestran que cada uno de los vectores basados en Ad26 y Ad35 que codifican para la proteína F del VSR proveen altos títulos de anticuerpos neutralizantes de virus en experimentos de inmunización en rata algodonera, independientemente de la via de administración de los vectores.
Para evaluar si una inmunización simple de vacuna de Ad26.VSR.F o Ad35.VSR.F puede causar enfermedad acentuada por vacuna después del desafío con VSR A2, se llevaron a cabo análisis histopatológicos de los pulmones 5 días después de la infección (Figura 14). La inmunización simple con rAd26.VSR.F o rAd35.VSR.F resultó en calificaciones de histopatología similares en animales inmunizados con rAd26.VSR.F o rAd35.VSR.F en comparación con animales inmunizados con rAd-e o simulación, como se observó en los experimentos de inmunización por sensibilización y refuerzo que se describieron previamente. Claramente, no se observó enfermedad exacerbada, en contraste con los animales que se sensibilizaron con FI-VSR. Las calificaciones de histopatologia de los animales inmunizados con vectores rAd fueron equivalentes a las de los animales infectados por simulación.
En conclusión, todas las estrategias de vacunación con dosis simple resultaron en una protección completa contra replicación por desafio con VSR, indujeron fuertes anticuerpos neutralizantes de virus y no mostraron patología potenciada.
Ejemplo 6. Los vectores con variantes tales como fragmentos de F del VSR o con promotores alternativos mostraron una inmunogenicidad similar Los ejemplos previos se llevaron a cabo con vectores que expresan la F del VSR de tipo salvaje. Se han construido otras formas truncadas o modificadas de F en rAd35, proveyendo formas de realización de fragmentos de F del VSR en vectores adenovirales. Estas formas truncadas o modificadas de F incluyen una forma truncada de VSR-F en donde el dominio citoplasmático y la región transmembrana estaban ausentes (o sea solo permaneció el fragmento de ectodominio), y una forma de fragmento de VSR-F con truncado del dominio citoplasmático y región transmembrana y una eliminación interna adicional en el ectodominio y el agregado de un dominio de trimerización. Estos vectores no mejoraron las respuestas por sobre rAd35.VSR.F con proteína F de longitud completa.
Además, se han construido otros vectores de rAd35 con diferentes promotores alternativos que conducen la expresión de F del VSR de tipo salvaje.
Se comparó la inmunogenicidad de las formas modificadas de VSR. F y las variantes de promotor en el modelo de ratón y en comparación con Ad35.VSR.F que expresa F de tipo salvaje. Todos los vectores de Ad35 que portan estas variantes de F o variantes de promotor mostraron respuestas en el mismo orden de magnitud que las de Ad35.VSR.F.
Ejemplo 7. Protección a corto plazo contra infección por VSR despues de la inmunización con vectores adenovirales recombinantes ín vivo en un modelo de rata algodonera .
Este experimento determina el potencial de inicio rápido de protección por vectores adenovirales que expresan la proteína F del VSR en el modelo de rata algodonera. Para este fin, se inmunizaron ratas algodoneras con una inyección i.m. simple de 107, 108 o 109 partículas de virus (pv) de vectores adenovirales portando el gen de longitud completa de F del VSR (A2) (Ad26.VSR.F) o sin transgen (Ad26e) en el día 0 o en el día 21. Se usaron animales infectados por vía intranasal con VSR A2 (104 unidades formadoras de placa (pfu)) como control positivo para la protección contra replicación por desafio, ya que se sabe que la infección primaria con virus VSR protege contra la replicación por desafío secundaria (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). En el dia 49, siete o cuatro semanas después de la inmunización, se desafiaron las ratas algodoneras por via intranasal con lxlO5 pfu de VSR A2 purificados por placa. Las ratas algodoneras se sacrificaron 5 dias después de la infección, un punto de tiempo en el cual el virus del desafio con VSR alcanza los títulos pico (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), y se determinaron los títulos de VSR en pulmón y nariz por titulación de virus en placa (Prince y col. 1978, Am J Pathology 93,711-791). La Figura 16A y la Figura 16B muestran que se observaron altos títulos de virus VSR en pulmones y nariz en los animales que recibieron vectores adenovirales sin transgen, respectivamente 4,8 +/- 0,11 logio pfu/gramo y 5,1 +/- 0,32 logio pfu'/gramo. Por el contrario, no se pudo detectar virus de desafío en tejido de pulmón y nariz de los animales que recibieron inmunización con vectores Ad26.VSR.F, independientemente del tiempo entre la inmunización y el desafío. Este experimento indica claramente el inicio rápido de la protección contra la replicación de virus de desafío por parte del Ad26 que expresa VSR-F. Se tomaron muestras de sangre de ratas algodoneras inmunizadas en el día 0, en el día 28 y en el día del desafío (día 49). Se probaron los sueros en una prueba de neutralización para la inducción de anticuerpos específicos de VSR (Figura 17). La inmunización con vectores adenovirales indujo títulos de VNA dependientes de la dosis. La Figura 18 muestra que los animales de control no tienen anticuerpos neutralizantes de virus en el día 28 y el día 49, mientras que se inducen altos títulos de VNA en los animales 28 o 49 días después de la inmunización con entre 107 y 109 pv de Ad26.VSR.F. La infección primaria con virus VSR A2 resultó en títulos de VNA más bien moderados que se incrementaron gradualmente con el tiempo. Este experimento indica claramente el inicio rápido de la protección contra la replicación de virus de desafío por parte del Ad26 que expresa VSR-F.
Ejemplo 8. Protección contra infección por VSR subgrupo A y subgrupo B después de la inmunización con vectores adenovirales recombinantes in vivo en un modelo de rata algodonera .
Las cepas de VSR se pueden dividir en dos subgrupos, los subgrupos A y B. Esta subtipificación se debe a diferencias en la antigenicidad de la glicoproteína G altamente variable. La secuencia de la proteína F está altamente conservada pero también se puede clasificar en los mismos subgrupos A y B. El Ejemplo 3 describió que los sueros de ratones inmunizados con vectores Ad-VSR.F también fueron capaces de neutralizar en forma cruzada la cepa B1 in vitro. La Figura 19 muestra claramente que el suero de rata algodonera que deriva de ratas algodoneras inmunizadas con Ad26.VSR-FA2 muestra altos títulos de VNA en el día 49 después de la inmunización contra VSR-A Long (subgrupo A) y Bwash (subgrupo B, ATCC #1540). Por lo tanto, se determinó la protección in vivo contra el desafío ya sea con subgrupo A o bien con B en la rata algodonera usando dosis bajas de vector adenoviral en un rango entre 106 y 108 pv. Para este fin se dividieron ratas algodoneras en grupos experimentales de 8 ratas algodoneras cada uno. Se inmunizaron los animales en el día 0 mediante inyecciones intramusculares de 106, 107, o 108 partículas de virus (pv) de vectores adenovirales portando el gen de longitud completa de F del VSR (A2) (Ad26.VSR.F) o sin transgen (Ad26e) en el día 0. En el día 49 se desafiaron los animales por vía i.n. con 10L5 pfu ya sea de VSR-A2 (cepa VSR-A) o bien de VSR-B 15/97 (cepa VSR-B). La Figura 20 muestra que se observaron altos títulos de virus VSR en pulmones y nariz en los animales que recibieron vectores adenovirales sin transgen. Por el contrario, se pudo detectar virus de desafío limitado o nulo en tejido de pulmón y nariz de los animales que recibieron inmunización con Ad26.VSR.F.
Se observaron solo diferencias pequeñas en la protección en el desafio con VSR-A2 o bien con VSR-B 15/97. Ad26.VSR.FA2 mostró protección completa contra replicación de desafio en pulmón usando 108 y 107vp dosis, y excepcionalmente dispersión limitada a 106 pv de Ad26.VSR.FA2. Se vio una tendencia similar para la protección contra replicación de virus de desafio en nariz, a pesar de que se observó una dispersión parcial para todos los animales a 106 y 107 pv de Ad26.VSR.FA2, aunque menor que en los grupos control (Figura 21). Durante el experimento, se tomaron muestras de sangre en el dia del desafio (día 49). Se probaron los sueros en una prueba de neutralización para la inducción de anticuerpos específicos de VSR (Figura 22). Este ejemplo demuestra que los vectores adenovirales a dosis bajas de entre 106y 108 pv de Ad26.VSR mostraron una'respuesta a dosis de los títulos de VNA contra VSR A2. Antes de la inmunización no se detectaron anticuerpos neutralizantes de virus en ninguna rata algodonera .
Se probó que Ad26.VSR.F es algo mejor que Ad35.VSR.F, debido a que este último mostró algo de dispersión en nariz en experimentos de desafío a una dosis de 108 pv.
Ejemplo 9. Protección contra una dosis alta de desafío de VSR-A2 despues de la inmunización con vectores adenovirales recombinantes in vivo en un modelo de rata algodonera .
Este ejemplo determina la protección contra una dosis alta de desafio de 5 xlO5 pfu en comparación con la dosis estándar de 1 xlO5 pfu de VSR-A2. El estudio incluyó ratas algodoneras en grupos experimentales de 8 ratas algodoneras cada uno. Se inmunizaron los animales mediante inyecciones intramusculares simples de 107 o 108 partículas de virus (pv) de vectores adenovirales portando el gen de longitud completa de F del VSR (A2) (Ad26.VSR.F) o sin transgen (Ad26e) en el día 0. Se usaron animales infectados por vía intranasal con VSR A2 (104 unidades formadoras de placa (pfu) como control positivo para la protección contra la replicación por desafío. Las ratas algodoneras se sacrificaron 5 días después de la infección, y se determinaron los títulos de VSR en pulmón y nariz por titulación de virus en placa. La Figura 23 muestra que una dosis de desafío mayor induce una carga viral más alta en pulmón en los animales que recibieron vectores adenovirales sin transgen que con la dosis de desafío estándar. Los animales que recibieron inmunización con 107 o 108 pv de vectores Ad26.VSR.F estuvieron completamente protegidos contra títulos de desafío de VSR altos o estándares en los pulmones. La Figura 24 muestra que los animales que recibieron inmunización con 108 pv de vectores Ad26.VSR.F estuvieron completamente protegidos contra títulos de desafío de VSR altos o estándares en la nariz, mientras que los animales que recibieron inmunización con 107 pv de vectores Ad26.VSR.F estuvieron parcialmente protegidos contra títulos de desafío de VSR altos o estándares.
Ejemplo 10. Protección a largo plazo contra VSR-A2 y VSR-B15/97 despues de la inmunización con vectores adenovirales recombinantes in vivo en un modelo de rata algodonera .
Este ejemplo determina la durabilidad de la protección contra VSR-A2 y VSR-B15/97 después de la inmunización con vectores adenovirales recombinantes in vivo en un modelo de rata algodonera. El estudio incluyó ratas algodoneras en grupos experimentales de 6 ratas algodoneras cada uno. Se inmunizaron los animales mediante inyecciones intramusculares de 108 partículas de virus (pv) o 1010 pv de vectores adenovirales portando el gen de longitud completa de F del VSR (A2) (Ad26.VSR.F) o sin transgen (Ad26e o Ad35e). Se reforzaron los animales 28 días más tarde con la misma dosis de pv, ya sea con el mismo vector (Ad26.VSR.F) (sensibilización y refuerzo homólogo) o con vector adenoviral Ad35.VSR.F (sensibilización y refuerzo heterólogo); los grupos control se inmunizaron por consiguiente con vectores Ad-e, excepto que solo se aplicó una dosis (1010). Algunos grupos no recibieron una inmunización de refuerzo. Los grupos control consistieron en 6 animales. Se usaron animales infectados por vía intranasal con VSR A2 y B15/97 (104 unidades formadoras de placa (pfu) como control positivo para la protección contra la replicación por desafio. El desafio fue a los 210 dias después de la primera inmunización.
La Figura 25 muestra que se observaron altos títulos de virus VSR en pulmones y nariz en los animales que recibieron vectores adenovirales sin transgen. Por el contrario, no se pudo detectar virus de desafío en tejido pulmonar de los animales que recibieron inmunización con Ad26.VSR.F y/o Ad35.VSR.F. No se pudo detectar virus de desafío con VSR-A2 en el tejido nasal de los animales que recibieron inmunización con Ad26.VSR.F y/o Ad35.VSR.F. El desafío con VSR-B15/97 indujo una replicación viral limitada en los tejidos nasales de los animales que recibieron inmunización con Ad26.VSR.F y/o Ad35.VSR.F, excepto para los animales que recibieron una sensibilización con Ad26.VSR.F seguida por un refuerzo con Ad35.VSR.F con 1010 pv. La Figura 26 muestra los títulos neutralizantes de virus de anticuerpo a los 140 días después de la inmunización. La inmunización con vector adenoviral solo por sensibilización o por sensibilización y refuerzo con las dosis de 108y 1010pv mostraron una respuesta dependiente de la dosis de los títulos de VNA que fue durable durante al menos 4,5 meses después de la inmunización. Más aún, los títulos observados fueron más altos que los títulos neutralizantes que se generaron por inmunización por vía i.n. primaria. Se observó un claro efecto del refuerzo ya sea por Ad26.VSR.F o bien por Ad35.VSR.F sobre los títulos de VNA.
En conclusión, este ejemplo muestra títulos de VNA de larga duración después de la inmunización con dosis simple o doble de Ad26.VSR.F o Ad35.VSR.F, y protección completa a largo plazo en pulmón y nariz contra el desafío viral homólogo combinada con protección completa a largo plazo en pulmón y protección parcial en nariz contra desafío viral heterólogo.
Ejemplo 11. Ausencia de inmunopatología potenciada por vacuna después de la inmunización con vectores adenovirales recombinantes in vivo en un modelo de rata algodonera Para evaluar si la vacuna con Ad26.VSR.F puede exacerbar la enfermedad después de un desafío con VSR A2, se llevaron a cabo análisis histopatológicos de los pulmones 2 y 6 días después de la infección. Dos días después del desafío, la respuesta inmediata (incluyendo infiltración de neutrófilos pulmonares) está en un pico, mientras que los cambios subagudos tales como infiltración de linfocitos hacen un pico en el día 6 después de la infección (Prince y col., J Virol, 1986, 57:721-728). El estudio incluyó ratas algodoneras en grupos experimentales de 12 ratas algodoneras cada uno. Se inmunizaron los animales mediante inyecciones intramusculares de 108 partículas de virus (pv) o 1010 pv de vectores adenovirales portando el gen de longitud completa de F del VSR (A2) (Ad26.VSR.F) o sin transgen (Ad26e). Algunos grupos se reforzaron 28 dias más tarde con la misma dosis de pv con el mismo vector (Ad26.VSR.F) (sensibilización y refuerzo homólogo); los grupos control se inmunizaron por consiguiente con vectores Ad-e, excepto gue solo se aplicó una dosis (1010). Los grupos control consistieron en 12 animales. Se usaron animales infectados por vía intranasal con VSR A2 (104 unidades formadoras de placa (pfu)) como control positivo para la protección contra la replicación por desafio. Se usaron animales inmunizados con FI-VSR como controles para enfermedad acentuada. Se extrajeron los pulmones, se perfundieron con formalina, se seccionaron, y se tiñeron con hematoxilina y eosina para el examen histológico. La calificación histopatológica fue a doble ciego, de acuerdo con los criterios publicados por Prince (Prince y col. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), y se calificó para los siguientes parámetros: peribronquiolitis, perivasculitis, neumonitis intersticial, y alveolitis. La calificación de la patología pulmonar de este experimento se muestra en la Figura 27 para el día 2 y en la Figura 28 para el día 6. Después del desafío con VSR, los animales inmunizados con FI-VSR mostraron en el día 2 y el día 6 histopatología elevada en todos los parámetros histopatológicos que se examinaron, en comparación con los animales inmunizados por simulación y desafiados, lo cual era esperable en base a estudios publicados previamente. Las calificaciones de histopatologia en todos los grupos inmunizados con vectores Ad26.VSR.F fueron equivalentes a los animales inmunizados por simulación en el día 2 y tuvieron siempre una calificación en el día 6 después del desafio menor que los animales inmunizados por simulación y desafiados (Ad26.e). Por consiguiente, las vacunas de Ad26.VSR.F no resultaron en enfermedad acentuada, contrariamente a las vacunas de FI-VSR.
Ejemplo 12. La sensibilización y refuerzo con Ad26. VSR. F con proteína F recombinante resulta en una respuesta con sesgo Thl en un modelo de ratón .
En este ejemplo se investigó si la respuesta inmunitaria ante sensibilización con Ad26.VSR.F se puede potenciar mediante refuerzo con proteina F del VSR recombinante con adyuvante. Para este fin se dividieron ratones en grupos experimentales de 7 ratones cada uno. Se inmunizaron los animales en el día 0 mediante inyecciones intramusculares de 1010 partículas de virus (pv) de vectores adenovirales portando el gen de longitud completa de F del VSR (A2) (Ad26.VSR.F) o PBS. En el día 28 se reforzaron los animales por vía i.m. ya sea con el mismo vector en la misma dosis, o con proteína F del VSR con adyuvante (longitud completa; conformación de post fusión: post-F) (en 2 dosis: 5 mg y 0,5 pg). La Figura 29 muestra claramente que el suero derivado de los ratones que se inmunizaron con Ad26.VSR-FA2 y se reforzaron con F del VSR con adyuvante muestra altos títulos de VNA a las 12 semanas después de la inmunización contra VSR-A Long (subgrupo A). La Figura 30 muestra la proporción IgG2a/IgGl en el suero de ratones inmunizados con Ad26.VSR-FA2 y reforzados con proteina F del VSR con adyuvante. Una proporción alta es indicativa de respuestas Thl balanceadas, mientras que una proporción baja indica una respuesta con sesgo Th2. Claramente, los animales que se inmunizaron con Ad26.VSR.F, y se reforzaron ya sea con Ad26.VSR.F o bien con proteína F del VSR resultan en una alta proporción de IgG2a/IgGl, mientras que los ratones de control que se inmunizaron con FI-VSR o con proteína F del VSR (sin el contexto de los vectores adenovirales) inducen una proporción baja. Debido a que se desea fuertemente una respuesta con sesgo Thl en una vacuna para VSR para evitar enfermedad acentuada ante el desafío y para inducir una fuerte memoria de células T, la respuesta con sesgo Th2 de una inmunización con proteína puede dirigirse a una respuesta Thl cuando se aplica una sensibilización con Ad26.VSR.F. La Figura 31 muestra las respuestas celulares en bazos derivados de ratones que se inmunizaron con Ad26.VSR-FA2 y se reforzaron con proteina F del VSR con adyuvante. Claramente se puede observar que el refuerzo con proteína F del VSR con adyuvante incrementará fuertemente también la respuesta celular.
Tabla 1. secuencias SEQ ID NO: 1: proteína de fusión VSR (Genbank ACO83301.1) secuencia de aminoácidos: MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSV ITIELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNY TLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAV VSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSV NAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV VQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQ SNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKC TASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVF PSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAV GLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN SEQ ID NO: 2: gen VSR.F(A2)nat optimizado por codones que codifica para la proteína de fusión de VSR ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGAC CTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCC GTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGCGGACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCG AGCTGAGCAACATCAAAAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAAATCAAGCTGATCAA GCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACC CCCGCCACCAACAACCGGGCCAGACGGGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACA ACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCT GCTGGGCGTGGGCAGCGCCATTGCTAGCGGAGTGGCTGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAA GGCGAAGTGAACAAGATCAAGTCCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGA GCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCA GCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACAGTGATCGAG TTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCG TGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGA CATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAG CAGAGCTACTCCATCATGTCCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGC CCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCAC CAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTACTGCGAT AATGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGG TGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGA CATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCTCCAAGACCGACGTGTCCAGCTCC GTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCA ACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGG CGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGC CTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACG AGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAG AAAGAGCGACGAGCTGCTGCACAATGTGAATGCCGTGAAGTCCACCACCAATATCATGATC ACCACAATCATCATCGTGATCATCGTCATCCTGCTGTCCCTGATCGCCGTGGGCCTGCTGC TGTACTGCAAGGCCCGGTCCACCCCTGTGACCCTGTCCAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAA CAATATCGCCTTCTCCAAC

Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una vacuna contra el virus sincitial respiratorio (VSR), CARACTERIZADA POR QUE comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR.
2. Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADA POR QUE el adenovirus recombinante comprende ácido nucleico que codifica para la proteina F del VSR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
3. Una vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADA POR QUE el ácido nucleico que codifica para la proteina F del VSR se optimiza por codones para la expresión en células humanas.
4. Una vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADA POR QUE el ácido nucleico que codifica para la proteina F del VSR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2.
5. Una vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADA POR QUE el adenovirus humano recombinante tiene una eliminación en la región El, una eliminación en la región E3, o una eliminación tanto en la región El como en la región E3 del genoma adenoviral.
6. Una vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADA POR QUE el adenovirus recombinante tiene un genoma que comprende en sus extremos 5' la secuencia CTATCTAT.
7. Un método para vacunar a un sujeto contra VSR, CARACTERIZADO POR QUE el método comprende administrar al sujeto una vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
8. Un método de acuerdo a la reivindicación 7, CARACTERIZADO POR QUE la vacuna se administra por vía intramuscular.
9. Un método de acuerdo a la reivindicación 7 u 8, CARACTERIZADO POR QUE una vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 se administra al sujeto más de una vez.
10. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, CARACTERIZADO POR QUE además comprende administrar al sujeto una vacuna que comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 35 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR.
11. Un método de acuerdo a la reivindicación 7 u 8, CARACTERIZADO POR QUE consiste en una administración simple de la vacuna al sujeto.
12. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, CARACTERIZADO POR QUE además comprende administrar proteina F del VSR al sujeto.
13. Un método para reducir la infección y/o replicación de VSR en un sujeto, CARACTERIZADO POR QUE comprende administrar al sujeto por inyección intramuscular una composición que comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR.
14. Una célula huésped aislada CARACTERIZADA POR QUE comprende un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR.
15. Un método para hacer una vacuna contra el virus sincitial respiratorio (VSR), CARACTERIZADO POR QUE comprende proveer un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR, propagar dicho adenovirus recombinante en un cultivo de células huésped, aislar y purificar el adenovirus recombinante, y formular el adenovirus recombinante en una composición farmacéuticamente aceptable.
16. Un ácido nucleico recombinante aislado CARACTERIZADO POR QUE forma el genoma de un adenovirus humano recombinante de serotipo 26 que comprende ácido nucleico que codifica para una proteina F del VSR.
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