MX2014005424A - Metodos y composiciones para neuroproteccion. - Google Patents

Abstract

Se describen en la presente métodos y kits útiles para brindar neuroprotección a neuronas en el oído interno, y a métodos para tratar enfermedades y trastornos del oído interno, incluyendo tinnitus y enfermedad de Ménière.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA NEUROPROTECC1ÓN REFERENCIA RECÍPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos No. de serie 61/554,982, presentada en Noviembre 3 de 2011 , titulada "Compositions and Methods For Treating Méniére's Disease", y de la solicitud provisional de los Estados Unidos No. de serie 61/663,627, presentada en Junio 25 de 2012, titulada "Compositions and Methods For Treating Méniére's Disease", las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia y para todos los propósitos.

REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS Esta solicitud incorpora como referencia secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos las cuales están presentes en el archivo nombrado "240_PCTI_ST25.txt", el cual tiene 33 kilobitios de tamaño, y el cual fue creado en Noviembre 1 de 2012 en el formato de máquina IBM-PCT, que tiene una compatibilidad de sistema operativo con MS-Windows.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Se provee en la presente el uso de un compuesto de ARN de doble cadena que elige como objetivo a CASP2, NOX3, CAPNS1 o RHOA, para su uso en la neuroprotección de neuronas en el oído de un sujeto y para la restauración de la función coclear y/o vestibular perdida y/o el alivio de los síntomas concomitantes. Se proveen además métodos y kits útiles para tratar a un sujeto en riesgo de o afligido con, la enfermedad de Méniére o enfermedades y trastornos similares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El oído humano comprende tres componentes estructurales principales, los oídos externo, medio e interno, los cuales funcionan en conjunto para convertir las ondas sonoras en impulsos nerviosos que viajan hacia el cerebro, en donde se perciben como sonido. El oído interno ayuda también a mantener el equilibrio.

La anatomía del oído medio y el oído interno es bien conocida por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Atlas of Sensory Organs: Functional and Clinical Analysis, Andrs Csillag, Humana Press (2005), págs. 1-82, cita incorporada en la presente como referencia). En resumen, el oído medio consiste del tímpano y una pequeña cámara llena de aire que contiene tres diminutos huesos conocidos como los osículos o huesecillos, los cuales enlazan el tímpano con el oído interno.

El oído interno (laberinto) es una estructura compleja que consiste de la cóclea, la cual es el órgano de la audición, y el sistema vestibular, el órgano del equilibrio. El sistema vestibular consiste del sáculo y el utrículo, los cuales determinan el sentido de la posición, y los canales semicirculares, los cuales ayudan a mantener el equilibrio.

La cóclea aloja al órgano de Corti, el cual consiste, en parte, de aproximadamente 20,000 células sensitivas especializadas, denominadas "células pilosas del oído interno" o "células pilosas". Estas células tienen pequeñas proyecciones de trazo fino (cilios) que se extienden en el fluido coclear. Las vibraciones de sonido transmitidas de los osículos en el oído medio hasta la ventana oval en el oído interno, hacen que el fluido y los cilios vibren. Las células pilosas en diferentes partes de la cóclea vibran en respuesta a diferentes frecuencias de sonido, y convierten las vibraciones en impulsos nerviosos los cuales son enviados hacia el cerebro para su procesamiento e interpretación. Las células pilosas del oído interno están rodeadas por células de soporte del oído interno. Las células de soporte sostienen, por lo menos parcialmente circundan, y físicamente soportan a las células pilosas sensitivas dentro del oído interno. Ejemplos representativos de células de soporte incluyen los siguientes tipos de células: bastones internos (células pilares), bastones externos (células pilares), células falángicas internas, células falángicas externas (de Deiters), células de Held, células de Hensen, células de Claudius, células de Boettcher, células interdentales y dientes auditivos (de Huschke).

El ganglio espiral es el grupo de células nerviosas que envían una representación de sonido de la cóclea al cerebro. Los cuerpos celulares de las neuronas del ganglio espiral se encuentran en la estructura espiral de la cóclea, y son parte del sistema nervioso central. Sus dendritas hacen contacto sináptico con la base de las células pilosas, y sus axones son empaquetados juntos para formar la porción auditiva del octavo nervio craneal (nervio vestibulococlear). El ganglio vestibular (conocido también como ganglio de Scarpa), es el ganglio del nervio vestibular que contiene los cuerpos celulares de las neuronas aferentes primarias bipolares cuyos procesos periféricos forman contacto sináptico con las células pilosas de los órganos terminales sensitivos vestibulares.

La solicitud de patente de los Estados Unidos publicación Nos. 20090162365 y 20110112168 están dirigidas a compuestos de ARNsi, composiciones que comprenden los mismos y a métodos de uso de los mismos para tratar enfermedades y trastornos relacionados con la expresión de genes pro-apoptóticos.

La patente de los Estados Unidos No. 7,825,099 se refiere a métodos para tratar el deterioro de la audición inhibiendo un gen pro-apoptótico.

La patente de los Estados Unidos No. 8,088,359 y la solicitud de patente de los Estados Unidos publicación No. 20120252868 se refieren a métodos para tratar la pérdida de la audición y la audición fantasma.

La solicitud de patente de los Estados Unidos publicación No. 20110142917 describe métodos no invasivos para suministrar moléculas de ARNds al oído.

La solicitud de patente de los Estados Unidos publicación No. 20110034534 se refiere, entre otras cosas, a moléculas de ARNds que eligen como objetivo a CAPNS1.

La solicitud de patente de los Estados Unidos publicación No. 20110229557 se refiere a moléculas de ARNds para varios objetivos de genes, que incluyen a CASP2, útiles en el tratamiento de enfermedades oculares.

La patente del PCT publicación No. WO2011/163436 describe ARNds que elige como objetivo a RHOA.

El tinnitus y la enfermedad de Méniére afectan a muchos individuos globalmente, y las terapias actuales no han tenido éxito para prevenir la progresión de la degeneración neuronal y la pérdida de la audición concomitante. Un tratamiento terapéutico que protegiera a las neuronas del oído interno, incluyendo las células pilosas y las células de los ganglios espiral y vestibular, del daño y la muerte celular (por ejemplo, apoptosis), y de esta manera atenuaran o previnieran la pérdida de la audición en, por ejemplo, los pacientes con la enfermedad de Méniére, sería altamente deseable. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención es proveer métodos para la neuroprotección de las neuronas en el oído de un sujeto, incluyendo sujetos humanos que sufren de tinnitus o enfermedad de Méniére o que tienen síntomas similares, usando compuestos de ARNds que previamente no se sabía tienen dicha actividad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta descripción está dirigida a métodos y kits para proveer neuroprotección a las neuronas en el oído de un sujeto, por ejemplo, a las células del ganglio espiral y las células del ganglio vestibular. En un aspecto, se describe en la presente un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds) el cual subregula la expresión de un gen CASP2, un gen NOX3, un gen CAPNS1 o un gen RHOA que codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5-6 o SEQ ID NO: 7, para su uso en la neuroprotección de una neurona en el oído de un sujeto que necesita de la misma. En varios aspectos, se provee un método que brinda neuroprotección a las neuronas en el oído, el método comprendiendo administrar al oído del sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de molécula de ARN de doble cadena (ARNds) el cual subregula la expresión de un gen CASP2, un gen NOX3, un gen CAPNS1 o un gen RHOA, para brindar de esta manera neuroprotección a una célula nerviosa en el oído del sujeto. En algunas modalidades, la neurona es un ganglio. En algunas modalidades, la neurona está comprendida dentro de un ganglio. En algunas modalidades, la neurona comprende una célula del ganglio espiral y/o una célula del ganglio vestibular. En algunas modalidades, el gen CASP2 codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3. En algunas modalidades, el gen NOX3 codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, el gen CAPNS1 codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 5-6. En algunas modalidades, el gen RHOA codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, CASP2 es el gen objetivo preferido y en modalidades preferidas, el compuesto de molécula de ARNds comprende una cadena sentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 8 y una cadena antisentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 9. En algunas modalidades, la neuroprotección comprende atenuación, prevención o reducción de la muerte celular neuronal, de preferencia muerte celular apoptótica. De conformidad con algunas modalidades, la muerte celular de la neurona está asociada con uno o más de una enfermedad o trastorno, isquemia, trauma físico/mecánico, exposición a un agente químico o un agente infeccioso, una reacción inmunológica o un desequilibrio nutricional. En algunas modalidades, la muerte celular de la neurona está asociada con isquemia. En algunas modalidades, la muerte celular de la neurona está asociada con una enfermedad o una condición. En algunas modalidades, la enfermedad es una enfermedad o trastorno genético. En varias modalidades, la enfermedad o condición se selecciona del grupo que consiste de un trastorno asociado con anormalidad patológica en los órganos auditivos y un trastorno asociado con una normalidad patológica en los órganos vestibulares. En algunas modalidades, el órgano auditivo es el órgano de Corti. El ganglio vestibular son el ganglio sensitivo de la parte vestibular de octavo nervio craneal, localizado en la parte superior del extremo lateral del meato acústico interno. En algunas modalidades, el órgano vestibular se selecciona del utrículo, sáculo, meato acústico interno y ampollas.

En algunas modalidades, el sujeto tiene o está en riesgo de que desarrolle una o más de una enfermedad o condición o un síntoma de la misma seleccionado del grupo que consiste de vértigo episódico, pérdida de la audición, tinnitus y llenura aural. En ciertas modalidades, el sujeto es afligido con o es susceptible a que desarrolle enfermedad de Méniére.

En algunas modalidades, se provee en la presente un método para tratar a un sujeto afligido con enfermedad de Méniére, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de ARNds que subregula la expresión de un gen CASP2, un gen NOX3, un gen RHOA o un gen CAPNS1 , tratando de esta manera al sujeto.

En algunas modalidades, el método comprende atenuar un síntoma de la enfermedad de Méniére en un sujeto afligido con la enfermedad de Méniére, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de ARNds que subregula la expresión de un gen CASP2, un gen N0X3, un gen RHOA o un gen CAPNS1, atenuando de esta manera un síntoma de la enfermedad de Méniére. En algunas modalidades, el síntoma comprende uno o más de tinnitus, pérdida progresiva de la audición, ELH, vértigo, náusea o llenura aural. En algunas modalidades, el método provee el alivio de uno o más de los síntomas de la enfermedad de Méniére. En algunas modalidades, el método provee la restauración parcial o restauración completa de la audición.

En algunas modalidades, los métodos y kits incluyen el rescate de un ganglio espiral y/o un ganglio vestibular de la apoptosis en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos incluyen la promoción de la supervivencia del ganglio espiral y/o el ganglio vestibular. En algunas modalidades, los métodos incluyen prevenir la muerte celular apoptótica de una célula del ganglio espiral y/o una célula del ganglio vestibular en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos incluyen brindar la neuroprotección de una célula del ganglio espiral y/o una célula del ganglio vestibular en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos incluyen la restauración de la función coclear en el sujeto. La función coclear incluye la restauración parcial o completa de la audición. En algunas modalidades, los métodos incluyen la restauración de la función vestibular en un sujeto. La función vestibular incluye la restauración parcial o completa del equilibrio.

Se proveen además kits para tratar a un sujeto afligido con la enfermedad de Méniére, que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de ARNds que subregula la expresión de un gen CASP2, un gen NOX3, un gen RHOA o un gen CAPNS1. En algunas modalidades, el kit incluye además un dispositivo para la administración del compuesto de ARNds al sujeto; y opcionalmente instrucciones para su uso. En algunas modalidades, el kit comprende un compuesto de ARNds que subregula la expresión de un gen CASP2. En modalidades preferidas, el gen CASP2 codifica para un ARNm expuesto en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3. En modalidades preferidas, el kit provee un compuesto de ARNds que comprende una cadena sentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 8 y una cadena antisentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 9.

En algunas modalidades, los métodos y kits implican el uso de compuestos de ARNds (por ejemplo, ácido nucleico de interferencia corto (siNA), ARN de interferencia corto (ARNsi), micro-ARN (ARNmi) o ARN de pasador corto (ARNsh)) que se une a una secuencia de nucleótidos (tal como una secuencia de ARNm) que codifica para un gen objetivo de humano seleccionado de CASP2, NOX3, CAPNS1 y RHOA, ejemplificado por SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5-6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente. En modalidades preferidas, los métodos y kits implican el uso de un compuesto de ARNds que se une al ARNm de CASP2 de humano expuesto en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3.

En modalidades preferidas, el compuesto de ARNds de CASP2 comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena antisentido comprende la secuencia de nucleótidos (5'>3') AGGAGUUCCACAUUCUGGC (SEQ ID NO: 9). En modalidades preferidas, el compuesto de ARNds tiene la estructura: 5' z"-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z 3' (cadena sentido, SEQ ID NO: 8) 3' z'-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5' (cadena antisentido, SEQ ID NO: 9) en donde cada A, C, U y G es un ribonucleótido no modificado, un ribonucleótido modificado o una porción no convencional, y cada ribonucleótido consecutivo o porción no convencional se une al siguiente ribonucleótido o porción no convencional mediante un enlace covalente; en donde cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente, incluye independientemente 1 a 5 nucleótidos consecutivos o porciones no de nucleótido o una combinación de los mismos unidos covalentemente en el extremo 3' de la cadena en la cual está presente; y en donde z" puede estar presente o ausente, pero si está presente, es una porción de remate (acabado) unida covalentemente en el extremo 5' de la cadena sentido. En algunas modalidades, el compuesto de ARNds comprende ribonucleótidos modificados y no modificados. En modalidades preferidas, el compuesto de ARNds comprende ribonucleótidos modificados y no modificados y por lo menos una porción no convencional.

En algunas modalidades, el ARNds comprende además por lo menos una porción no convencional. En ciertas modalidades preferidas, el ARNds de CASP2 tiene la estructura: 5' z"-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z' 3' (cadena sentido, SEQ ID NO: 24) 3' Z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5' (cadena antisentido, SEQ ID NO: 25) en donde cada uno de A, C, U y G es un ribonucleótido modificado o no modificado o una porción no convencional, y cada ribonucleótido consecutivo o porción no convencional se une al siguiente ribonucleótido o porción no convencional mediante un enlace fosfodiéster; en donde la cadena sentido comprende, contando desde el extremo 5', un ribonucleótido no modificado en las posiciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 19, una L-desoxicitidina en la posición 18; en donde la cadena antisentido comprende por lo menos cinco (5) ribonucleótidos no modificados y modificados con el azúcar 2'-O-metilo alternativos; y en donde z", Z yd Z están opcionalmente ausentes. En algunas modalidades, la cadena antisentido comprende ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'-O-metilo presentes en las posiciones (5*>3') 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 y 19, y ribonucleótidos no modificados presentes en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18; de preferencia, la cadena antisentido comprende ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'-O-metilo en las posiciones (5'>3') 2, 4, 6, 8, 11 , 13, 15, 17 y 19.

En modalidades preferidas, el compuesto de ARNds tiene la estructura: 5' iB-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z' 3 ' (cadena sentido, SEQ ID NO: 26) 3' Z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5' (cadena antisentido, SEQ ID NO: 27) en donde cada uno de A, C, U y G es un ribonucleótido no modificado, un ribonucleótido modificado o una porción no convencional, y cada ribonucleótido consecutivo o porción no convencional se une al siguiente ribonucleótido o porción no convencional mediante un enlace covalente; en donde cada uno de Z y Z' está ausente, en donde la cadena sentido comprende, contando desde el extremo 5', un ribonucleótido no modificado en las posiciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 19, una L-desoxicitidina en la posición 18, y z" está presente y comprende una porción desoxiabásica invertida; y en donde la cadena antisentido comprende, contando desde el extremo 5', un ribonucleótido modificado con el azúcar 2'-0-metilo en cada una de las posiciones 2, 4, 6, 8, 1 1 , 13, 15, 17 y 19, y un ribonucleótido no modificado en cada una de las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16 y 18.

Esta molécula se conoce también como 1007.

Los compuestos de ARNds se administran mediante cualquiera de las vías de administración convencionales, que incluyen el envolvimiento de métodos de suministro invasivos y no invasivos. Debe observarse que el compuesto de ARNds puede administrarse como el compuesto per se o como una sal farmacéuticamente aceptable, y puede administrarse solo o como un ingrediente activo en combinación con portadores, solventes, diluyentes, excipientes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables.

Los compuestos de ARNds se administran de preferencia transtimpánicamente, incluyendo tópicamente o por medio de inyección.

Pueden prepararse formas líquidas para administración. Las composiciones líquidas incluyen soluciones acuosas, con y sin co-solventes orgánicos, suspensiones acuosas u oleosas y emulsiones con aceites comestibles, así como vehículos farmacéuticos similares. En una modalidad, la administración comprende administración tópica, en particular administración tópica al conducto auditivo, administración tópica a la membrana timpánica, o una combinación de las mismas, permitiendo de esta manera que los compuestos de ARNds pasen la membrana timpánica. En algunas modalidades, los compuestos de la presente solicitud se aplican a la membrana timpánica como una gota para los oídos. En algunas modalidades preferidas, los compuestos de ARNds se administran mediante inyección transtimpánica o mediante gotas para los oídos.

En varías modalidades, en particular las modalidades en las cuales las composiciones farmacéuticas de la invención se administran tópicamente, las composiciones farmacéuticas comprenden además un intensificador de permeabilidad, conocido también como intensificador de penetración.

En varias modalidades, el intensificador de penetración se selecciona de cualquier compuesto o cualquier combinación de dos o más compuestos que intensifican la penetración de un oligonucleótido terapéutico a través de la membrana timpánica en el oído de un sujeto que sufre de enfermedad de Méniére. En ciertas modalidades, el intensificador de permeabilidad es un poliol. En algunas modalidades, el oligonucleótido está en mezcla con un poliol. En algunas modalidades, el poliol se selecciona del grupo que consiste de glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sorbitol, xilitol, maltitol, y combinaciones de los mismos.

De conformidad con una modalidad, el poliol es glicerol. En varias modalidades, el glicerol está presente a una concentración final de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 35%; aproximadamente 1% a aproximadamente 30%; aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, de preferencia aproximadamente 10% a aproximadamente 20% en volumen de la composición farmacéutica.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica se aplica al conducto auditivo cuando la cabeza del sujeto está inclinada hacia un lado y el oído tratado está mirando hacia arriba. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se aplica al oído usando un receptáculo para líquido, por ejemplo, usando un gotero de, por ejemplo, 10 a 100 microlitros por gota, o una mecha.

Una modalidad adicional de la presente invención provee del uso de cualquiera de las composiciones anteriores en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que sufre de enfermedad de Méniére. Se provee además de un compuesto que inhibe la expresión de CASP2 para brindar neuroprotección a una neurona en un oído de un sujeto que necesita del mismo.

Los métodos, materiales y ejemplos que se describirán ahora son sólo ilustrativos, y no se pretende que sean limitativos; materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente, pueden usarse en la práctica o la prueba de la invención. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.

Se pretende que esta descripción abarque cualquiera y todas las adaptaciones o variaciones de combinación de características que se describen en las varias modalidades en la presente. Aunque modalidades específicas se han ilustrado y descrito en la presente, debe apreciarse que la invención abarca cualquier disposición de las características de estas modalidades para lograr el mismo propósito. Las combinaciones de las características anteriores, para formar modalidades no descritas específicamente en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica después de que revisen la presente descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra secciones histológicas de tejido del oído interno de tipo silvestre (paneles de la izquierda) y muíante Phexhyp Duk (paneles de la derecha). Las flechas muestran hidroplesía endolinfática (ELH). En el panel inferior izquierdo, G se refiere a neuronas del ganglio espiral, y en el panel inferior derecho, M se refiere a neuronas mutantes del ganglio espiral, de las cuales existen menos (compárese G con M) en los ratones mutantes Phexhyp"Duk. Los ratones mutantes Phexhyp"Duk desarrollan espontáneamente hidroplesía endolinfática, y se presentan de esta manera con problemas de equilibrio y el fenotipo de pérdida de la audición. Uno de los defectos primarios es la pérdida de neuronas en los ganglios del oído interno (vestibular y espiral) mediante muerte celular o apoptosis.

La figura 2 muestra el diseño experimental de la evaluación de la seguridad del ARNsi mediante el suministro de gotas para los oídos. "Px" se refiere a x días post-parto.

La figura 3 es una gráfica de barras que muestra que el tratamiento semanal con gotas para los oídos conteniendo ARNds o vehículo al oído interno, no afecta la función de la audición en los ratones de tipo silvestre.

Las figuras 4A y 4B muestran el diseño experimental que pone a prueba la eficacia de las moléculas de prueba en la preservación de la función auditiva en el modelo de enfermedad de Méniére de murino (P15, P29, P90 -days post-parto; el suministro de ARNsi antes de P 5 es imposible debido a que el conducto auditivo está cerrado; la medición de la ABR antes de P29-30 es técnicamente imposible).

Las figuras 5A a 5D muestran el análisis de la función auditiva (ABR) en el curso de tiempo en ratones control negativos (tratados con vehículo o tratados con siEGFP) o en ratones Phexhy "0uk/Y tratados con ARNsi. Los datos en las gráficas muestran los umbrales (db) de respuesta auditiva evocada por el tallo cerebral (ABR) a frecuencia de sonido de prueba especificada (kHz). La figura 5E es una gráfica de barras que muestra la mejora relativa en la ABR en P90 en animales tratados con ARNsi en comparación con animales tratados con vehículo y animales tratados con siEGFP.

Las figuras 6A a 6F muestran la evaluación histológica de las neuronas del oído interno de ratones Phexhyp"Duk/Y y la neuroprotección significativa de los ganglios espirales y vestibulares provista por siCASP2 (1007). Las flechas en las figuras 6A y 6B muestran el ganglio espiral (SG). Las figuras 6A y 6B muestran el trastorno y la muerte del SG en ratones Phexhyp"Dul7Y tratados con vehículo, y las figuras 6B y 6D muestran el rescate del SG en ratones Phex^^/Y tratados con SÍCASP2. Las figuras 6E y 6F muestran secciones histológicas separadas del ganglio vestibular en ratones Phexhyp-Dul7Y tratados con vehículo y ratones Phexhyp"Dul7Y tratados con siCASP2, respectivamente.

Las figuras 7A a 7D muestran la evaluación histológica de las neuronas del oído interno de ratones Phexhyp"Dul7Y, y la neuroprotección significativa de los ganglios espirales provista por siCAPNSI (figura 7B), siNOX3 (figura 7C) y siRHOA (figura 7D), ert comparación con animales tratados con vehículo y animales tratados con siEGFP (figura 7A).

Las figuras 8A a 8D muestran la evaluación histológica de las neuronas del oído interno de ratones Phexhyp"Dul7Y, y la neuroprotección significativa de los ganglios vestibulares provista por siCAPNSI (figura 8B), siNOX3 (figura 8C) y siRHOA (figura 8D), en comparación con animales tratados con vehículo y animales tratados con siEGFP (figura 8A).

Las figuras 9A y 9B muestran la protección de las células del ganglio espiral en P90 en oídos tratados con siCASP2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente solicitud provee de moléculas de oligonucleótidos, composiciones que comprenden las mismas, métodos de uso de las mismas, y kits para tratar la enfermedad de Méniére y para mejorar uno o más de los síntomas concomitantes, que incluyen pérdida fluctuante de la audición, vértigo episódico y/o tinnitus. La presente descripción se basa en parte en el hallazgo de la inhibición de cualquiera de los genes objetivo seleccionados de Caspasa 2 (CASP2), NADPH Oxidasa 3 (NOX3), Calpaína S1 (CAPNS1), y la familia de genes homólogos de Ras, miembro A (RHOA).

En un aspecto, se provee en la presente de un método para brindar neuroprotección de las células del ganglio espiral y/o las células del ganglio vestibular en un sujeto que necesita del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de oligonucleótido que inhibe la expresión de CASP2, para de esta manera brindar neuroprotección en las células del ganglio espiral y/o las células del ganglio vestibular. En otro aspecto, se provee en la presente un método para tratar a un sujeto afligido con la enfermedad de Méniére, que comprende administrar al sujeto una molécula de oligonucleótido que inhibe la expresión de CASP2, para tratar de esta manera al paciente. La enfermedad de Méniére, conocida también como hidropesía endolinfática idiopática (ELH), es un trastorno del oído interno que da como resultado vértigo y tinnitus, y daño neuronal final que lleva a pérdida de la audición. Se desconoce la causa exacta de la enfermedad de Méniére, pero se cree que el mecanismo subyacente es la deformación del laberinto membranoso debida a la acumulación de endolinfa. La endolinfa es producida principalmente por la estría vascular en la cóclea, y también por el plano semilunar, y las células oscuras en el laberinto vestibular (Sajjadi H, Paparella MM. Méniére disease. Lancet. 372(9636): 406-14). Puede ocurrir hidropesía endolinfática, si el flujo de endolinfa del espacio de fluido endolinfático a través del acueducto vestibular hacia el saco endolinfático es obstruido. La enfermedad de Méniére puede afectar un oído o ambos oídos de un sujeto. La morbilidad primaria asociada con la enfermedad de Méniére, es la naturaleza debilitante del vértigo y la pérdida progresiva de la audición.

En varias modalidades, los métodos incluyen atenuar la pérdida de la audición en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos incluyen prevenir la pérdida progresiva de la audición en un sujeto afligido con la enfermedad de Méniére. En algunas modalidades, los métodos incluyen la protección de las células del ganglio espiral de la muerte celular. En algunas modalidades, los métodos incluyen la protección de las células del ganglio vestibular de la muerte celular.

En una modalidad preferida, el sujeto es un mamífero, de preferencia un sujeto humano. En varias modalidades, la molécula que subregula a CASP2 es un inhibidor de Caspasa 2 tal como un oligonucleótido de ARN de doble cadena, opcionalmente un siNA, más preferiblemente una molécula de ARNds detallada en el cuadro A siguiente y en particular, un siNA que comprende la siguiente secuencia antisentido: 5' AGGAGUUCCACAUUCUGGC (conocido también como CASP2_4), y se describe el uso de este oligonucleótido en la preparación de un medicamento para su uso en la terapia de condiciones y trastornos descritos en la presente. En una modalidad, el trastorno implica muerte del ganglio espiral y muerte del ganglio vestibular. En algunas modalidades, la muerte celular comprende muerte celular apoptótica.

CUADRO A Ejemplos no limitativos de secuencias de oliqonucleótidos de Caspasa 2 para su uso en ios métodos descritos en la presente Información adicional acerca de estas moléculas de ARNds, así como moléculas de ARNds adicionales que eligen como objetivo o que subregulan a CASP2, NOX3 o RHOA, las cuales son útiles en los presentes métodos, se proveen en la publicación del PCT Nos. WO 2008/050329 y WO 2010/048352. Ejemplos no limitativos de moléculas de ARNds que eligen como objetivo o que subregulan a CAPNS1 , las cuales son útiles en los presentes métodos, se proveen en la solicitud de patente de los Estados Unidos publicación No. 20110034534.

Sin que sea limitado por la teoría, CASP2 es un gen pro-apoptótico que es expresado específicamente y activado en las células ganglionares (GC) después de una lesión axonal. El presente apoderado ha demostrado previamente que la inhibición de CASP2 en modelos de daño del nervio óptico en ratas, dio como resultado el rescate robusto de las células del ganglio retinal (RGC), de la muerte apoptótica (PMID: 21677688). En algunas modalidades, los métodos incluyen el uso de moléculas de oligonucleótídos que subregulan o inhiben la expresión de CASP2. En algunas modalidades, los métodos incluyen el uso de moléculas de oligonucleótídos que subregulan o inhiben la expresión de NOX3. En algunas modalidades, los métodos incluyen el uso de moléculas de oligonucleótídos que subregulan o inhiben la expresión de CAPNS1. En algunas modalidades, los métodos incluyen el uso de moléculas de oligonucleótídos que subregulan o inhiben la expresión de RHOA.

Definiciones Por conveniencia, ciertos términos usados en la especificación, los ejemplos y las reivindicaciones, se describen en la presente.

Se observará que, como se usa en la presente, las formas singulares "un", "una" y "la" incluyen las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

En donde los aspectos o las modalidades de la invención se describen en términos de grupos de Markush u otras agrupaciones de alternativas, los expertos en la técnica reconocerán que la invención se describe también de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo.

Un "inhibidor" es un compuesto, el cual es capaz de reducir (parcialmente o totalmente) la expresión de un gen o la actividad del producto de dicho gen a un grado suficiente para lograr un efecto biológico o fisiológico deseado. El término "inhibidor", como se usa en la presente, se refiere a un inhibidor de ARNds que incluye un inhibidor de ARNsi.

Como se usa en la presente, el término "inhibe", "subregula" o "reduce" con respecto a la expresión de un gen, significa la expresión del gen, o el nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican para una o más proteínas o subunidades de proteína (por ejemplo, ARNm), o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteína, que es reducida abajo de la observada en ausencia de un factor inhibidor (tal como una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un siNA, por ejemplo, que tiene características estructurales como se describe en la presente); por ejemplo, la expresión puede ser reducida hasta 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% o menos que la observada en ausencia de un inhibidor. En algunas modalidades de los métodos y kits descritos en la presente, la subregulación del gen objetivo da como resultado una disminución de por lo menos 10% en la muerte de células neuronales en una población de células neuronales, en comparación con una población control de células neuronales.

Un "inhibidor de ARN de doble cadena", es un compuesto el cual es capaz de reducir la expresión de un gen o la actividad del producto de dicho gen, a un grado suficiente para lograr un efecto biológico o fisiológico deseado. El término, como se usa en la presente, se refiere a uno o más de un ARNsi, ARNsh y ARNsh sintético. La inhibición puede ser referida también como subregulación o, para el ARNi, silenciamiento.

El término "inhibe", como se usa en la presente, se refiere a reducir la expresión de un gen o la actividad del producto de dicho gen, a un grado suficiente para lograr un efecto biológico o fisiológico deseado. La inhibición es completa o parcial. Por ejemplo, la "inhibición" del gen APP significa la inhibición de la expresión del gen (transcripción o traducción) o la actividad de polipéptido de una o más de las variantes de un SNP (polimorfismo de nucleótido individual) del mismo.

SEQ ID NO: 1 se refiere a la caspasa 2 de Homo sapiens, cisteína peptidasa relacionada con la apoptosis (CASP2), variante de transcrito 1 , ARNm gi|320461578|ref|NM_032982.3|.

SEQ ID NO: 2 se refiere a la caspasa 2 de Homo sapiens, cisteína peptidasa relacionada con la apoptosis (CASP2), variante de transcrito 3, ARNm gi|320461587|ref|NM_032983.3|.

SEQ ID NO: 3 se refiere a la caspasa 2 de Homo sapiens, cisteína peptidasa relacionada con la apoptosis (CASP2), variante de transcrito 2, ARNm gi|331999981 |ref|NM_001224.4|.

SEQ ID NO: 4 se refiere a la NADPH oxidasa 3 (NOX3) de Homo sapiens, ARNm gi|229331997|ref|NM_015718.2|.

SEQ ID NO: 5 se refiere a la calpaína de Homo sapiens, subunidad pequeña 1 (CAPNS1), variante de transcrito 1 , ARNm gi|51599152|ref|NM_001749.2|.

SEQ ID NO: 6 se refiere a la calpaína de Homo sapiens, subunidad pequeña 1 (CAPNS1), variante de transcrito 2, ARNm gi|51599150|ref|NM_001003962.1 |.

SEQ ID NO: 7 se refiere al miembro A de la familia de homólogos de ras (RHOA) de Homo sapiens, ARNm gi|50593005|ref|NM_001664.2|.

Un aspecto de la invención incluye la actividad "neuroprotectora" del ARNds descrita en la presente. El método de la invención provee de la protección contra la lesión, la muerte o la senescencia de neuronas, o protege o mejora la función neuronal. Como se usa en la presente, el término "neuroprotección" se refiere a la detención y/o el retardo y/o la atenuación y/o la inversión de la progresión de la neurodegeneración. Como se usa en la presente, el término "neurodegeneración" significa la pérdida progresiva de neuronas. Esta incluye, pero no está limitada a, la pérdida inmediata de neuronas seguida de la pérdida subsiguiente de neuronas de conexión o adyacentes.

Los términos "neurona", "célula neuronal", "célula nerviosa" y "célula neural" (incluyendo las células progenitoras neuronales y las células madre neurales), se usan recíprocamente para referirse a células nerviosas, es decir, células que son responsables de conducir los impulsos nerviosos de una parte del cuerpo a otra. La mayoría de las neuronas consisten de tres porciones distintas: un cuerpo celular que contiene al núcleo, y dos diferentes tipos de procesos citoplásmicos: dendritas y axones. Las dendritas, las cuales son la porción receptora de la neurona, son usualmente extensiones gruesas altamente ramificadas del cuerpo celular. El axón es típicamente un proceso delgado largo individual que está especializado para conducir los impulsos nerviosos fuera del cuerpo celular a otra neurona o tejido muscular o glandular. Los axones pueden tener ramas secundarias denominadas "ramas colaterales del axón". Las ramas colaterales del axón y los axones pueden terminar ramificándose en muchos filamentos finos denominados telodendrios. Los extremos distales de los telodendrios se denominan bulbos terminales sináptícos o terminales axonales, los cuales contienen vesículas sinápticas que almacenan neurotransmisores. Los axones pueden estar rodeados por una cubierta blanca segmentada de fosfolípidos de capas múltiples denominada la vaina de mielina, la cual se forma de células de Schwann en el sistema nervioso periférico, y de oligodendrocitos en el sistema nervioso central. Los axones que contienen dicha cubierta están "mielinados". Las neuronas incluyen neuronas sensitivas (aferentes), las cuales transmiten los impulsos de los receptores en la periferia hacia el cerebro y la médula espinal, y de los centros inferiores a superiores del sistema nervioso central. Una neurona puede ser también neuronas motoras (eferentes), las cuales transmiten los impulsos del cerebro y la médula espinal hacia los efectores en la periferia, y de los centros superiores a inferiores del sistema nervioso central. Otras neuronas son las neuronas de asociación (de conexión o interneuronas), las cuales llevan los impulsos de las neuronas sensitivas a las neuronas motoras, y se localizan dentro del sistema nervioso central. Los procesos de las neuronas aferentes y eferentes dispuestos en haces se denominan "nervios" cuando se localizan fuera del sistema nervioso central, o tractos de fibras si están dentro del sistema nervioso central.

El término "administración tópica" o "aplicación tópica" se usa para indicar una administración local de una composición, de preferencia hacia el conducto auditivo del sujeto, pero también opcionalmente hacia la membrana timpánica, en donde la administración tópica es relevante.

Los términos "ótico" y "auricular" se usan recíprocamente en la presente, y se refieren en general a tejido en y/o alrededor de un oído, incluyendo el oído externo, el oído medio y el oído interno.

El término "conducto auditivo" o "meato auditivo externo" se usa para indicar un tubo que corre del oído externo al oído medio.

La "membrana timpánica" (denominada también tímpano o mirinx) se refiere a la membrana delgada que separa el oído externo del oído medio.

Términos tales como "composición farmacéutica" o "composición farmacéutica ótica" o "composición farmacéutica ocular" o "formulación farmacéutica" o "preparación farmacéutica", se usan recíprocamente en la presente, y se refieren en general a formulaciones que están adaptadas para la administración y el suministro de uno o más compuestos activos de oligonucleótidos al oído, específicamente al tejido del oído interno en un animal o un humano.

El término "tratamiento", "trata" o "tratar", como se usa en la presente, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad o condición de un mamífero, en particular un humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad o condición ocurra en un sujeto el cual puede estar predispuesto a la enfermedad o condición, pero que no ha sido diagnosticado aún que la tiene; (b) inhibir la enfermedad o condición, es decir, atenuar o detener o retardar o posponer su desarrollo o progresión; (c) aliviar y/o mejorar la enfermedad o condición, es decir, causar la regresión de la enfermedad o condición y/o los síntomas de la misma; o (d) curar la enfermedad o condición, es decir, detener su desarrollo o progresión. La población de sujetos tratados mediante los métodos de la invención, incluye los sujetos que sufren de la condición o enfermedad no deseable, así como los sujetos en el riesgo de que desarrollen la condición o enfermedad.

Como se usa en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que los componentes, además del agente terapéutico, que comprenden la formulación, son adecuados para administración al paciente/sujeto que está siendo tratado de conformidad con la presente invención.

Un "intensificador de penetración" o "intensificador de permeabilidad", se refiere a un compuesto o una combinación de compuestos que aumenta la penetración de un oligonucleótido terapéutico a través de la membrana timpánica en el oído de un animal o un humano.

Como se usa en la presente, el término "tejido" se refiere a una agregación de células de igual manera especializadas unidas en el desempeño de una función particular.

Como se usa en la presente, los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" pueden usarse recíprocamente, y se refieren a secuencias de nucleótidos que comprenden ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Se entenderá que los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN obtenidos de análogos de nucleótidos. A lo largo de esta solicitud, se expone que las secuencias de ARNm representan los genes correspondientes.

Los términos "oligonucleótido" y "oligómero" se usan recíprocamente, y se refieren a una secuencia de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 nucleótidos. Cada nucleótido de ADN o ARN puede ser independientemente natural o sintético, y/o modificado o no modificado. Las modificaciones incluyen cambios a la porción de azúcar, la porción de base y/o los enlaces entre los nucleótidos en el oligonucleótido. Los compuestos de la presente invención abarcan moléculas que comprenden desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos modificados, ribonucleótidos modificados, porciones no convencionales, y combinaciones de los mismos. Se entiende que el oligonucleótido abarca moléculas de cadena sencilla que incluyen ARN antisentido y ARNsh, y moléculas de doble cadena que incluyen ARN de doble cadena, (ARNds), siNA, ARNsi y ARNmi.

El término sustancialmente complementario se refiere a la complementariedad mayor de aproximadamente 84%, con otra secuencia. Por ejemplo, en una región de dúplex que consiste de 19 pares de bases, un no apareamiento da como resultado 94.7% de complementariedad, dos no apareamientos dan como resultado aproximadamente 89.5% de complementariedad, y tres no apareamientos dan como resultado aproximadamente 84.2% de complementariedad, que hacen que la región de dúplex sea sustancialmente complementaria. Por consiguiente, el término sustancialmente idéntica se refiere a una identidad mayor de aproximadamente 84%, con otra secuencia. En algunas modalidades preferidas, la cadena sentido y la cadena antisentido son completamente complementarias (100%). En algunas modalidades, la cadena antisentido es completamente complementaria (100%) con el ARNm objetivo. En algunas modalidades, la cadena sentido comprende un no apareamiento con el ARNm objetivo. Por ejemplo, una cadena antisentido con una A, C o G en la primera posición de la cadena antisentido se genera con una "U" en la primera posición (5'), generando de esta manera un no apareamiento entre la cadena antisentido y el ARNm objetivo.

Se entiende que el término "nucleótido" abarca desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, los cuales pueden ser naturales o sintéticos, y/o modificados o no modificados. Las modificaciones incluyen cambios a la porción de azúcar, la porción de base y/o los enlaces entre los ribonucleótidos en el oligorribonucleótido. Como se usa en la presente, el término "ribonucleótido" abarca ribonucleótidos naturales y sintéticos, no modificados y modificados. Las modificaciones incluyen cambios a la porción de azúcar, a la porción de base y/o a los enlaces entre los ribonucleótidos en el oligonucleótido.

Los nucleótidos pueden seleccionarse de bases modificadas sintéticas o de ocurrencia natural. Las bases de ocurrencia natural incluyen adenina, guanina, citosina, timina y uracilo. Las bases modificadas de nucleótidos incluyen inosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil-, 2-propil- y otras alquil- adeninas, 5-halo uracilo, 5-halo citosina, 6-aza citosina y 6-aza timina, pseudo uracilo, 4-tiouracilo, 8-halo adenina, 8-aminoadenina, 8-tiol adenina, 8-tioalquil adeninas, 8-hidroxil adenina y otras adeninas 8-sustituidas, 8-halo guaninas, 8-amino guanina, 8-tiol guanina, 8-tioalquil guaninas, 8-hidroxil guanina y otras guaninas sustituidas, otras aza y deaza adeninas, otras aza y deaza guaninas, 5-trifluorometil uracilo y 5-trifluoro citosina. En algunas modalidades, uno o más nucleótidos en un oligómero son sustituidos con inosina.

En algunas modalidades de la presente invención, el compuesto oligonucleótido inhibidor comprende nucleótidos modificados y no modificados y/o porciones no convencionales. El compuesto comprende por lo menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste de una modificación de azúcar, una modificación de base y una modificación de enlace internucleótido, y puede contener ADN, y nucleótidos modificados tales como LNA (ácido nucleico bloqueado), ENA (ácido nucleico unido por puentes de etileno), PNA (ácido nucleico peptídico), nucleótido de arabinósido, fosfonocarboxilato o fosfinocarboxilato (nucleótido de PACE), nucleótido de espejo (o especular), o nucleótidos con un azúcar de 6 carbonos.

Todos los análogos de, o modificaciones a, un nucleótido/oligonucleótido se usan con la presente invención, siempre que dicho análogo o modificación no afecte sustancialmente en forma adversa la función del nucleótido/oligonucleótido. Modificaciones aceptables incluyen modificaciones de la porción de azúcar, modificaciones de la porción de base, modificaciones en los enlaces internucleótido, y combinaciones de las mismas.

Una modificación de azúcar incluye una modificación en la porción 2' del residuo de azúcar, y abarca amino, fluoro, alcoxi, por ejemplo metoxi, alquilo, amino, fluoro, cloro, bromo, CN, CF, imidazol, carboxilato, tioato, alquilo inferior de Ci a Ci0, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo, OCF3, OCN; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino o sililo sustituido como se describe, entre otros, en las patentes europeas EP 0 586 520 B1 o EP 0 618 925 B1.

En una modalidad, el compuesto de ARN de doble cadena comprende por lo menos un ribonucleótido que comprende una modificación 2' en la porción de azúcar ("modificación de azúcar 2' "). En ciertas modalidades, el compuesto comprende 2'-O-alquilo o 2'-fluoro o 2'-O-alilo, o cualquier otra modificación 2', opcionalmente en posiciones alternas. Otras modificaciones de estabilización son también posibles (por ejemplo, modificaciones terminales). En algunas modalidades, una modificación de azúcar de 2'-O-alquilo preferida es la modificación de azúcar 2'-O-metilo (metoxi).

En algunas modalidades, la estructura de base de los oligonucleótidos es modificada y comprende entidades de fosfato-D-ribosa, pero puede contener también entidades de tiofosfato-D-ribosa, triéster, tioato, estructura de base unida por puentes 2'-5' (puede ser referida también como 5 -2'), PACE, y similares.

Como se usa en la presente, el término "análogo de nucleótido no de apareamiento" significa un análogo de nucleótido el cual comprende una porción de apareamiento no de base que incluye, pero no está limitada a, 6 des amino adenosina (Nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC o N3-Me dC. En algunas modalidades, el análogo de nucleótido de apareamiento no de base es un ribonucleótido. En otras modalidades, es un desoxirribonucleótido. Además, pueden prepararse análogos de polinucleótidos, en donde la estructura de uno o más nucleótidos es fundamentalmente alterada y mejor adecuada como reactivos terapéuticos o experimentales. Un ejemplo de un análogo de nucleótido es un ácido nucleico peptídico (PNA), en donde la estructura de base de desoxirribosa (o ribosa) en el ADN (o ARN) es reemplazada con una estructura de base de poliamida, la cual es similar a la encontrada en los péptidos. Los análogos de PNA han demostrado ser resistentes a la degradación enzimática, y tener estabilidad mejorada in vivo e in vitro. Otras modificaciones útiles en la síntesis de oligonucleótidos incluyen estructuras de base de polímero, estructuras de base cíclicas, estructuras de base acíclicas, estructuras de base de tiofosfato-D-ribosa, estructuras de base de triéster, estructuras de base de tioato, estructura de base 2'-5'-enlazada (conocida también como nucleótidos 2'5' o ribonucleótidos 2'5' [con 3??]), ácidos nucleicos artificiales, ácidos morfolinonucleicos, ácido glicol nucleico (GNA), ácido treosa nucleico (TNA), arabinósido y nucleósido de espejo (por ejemplo, beta-L-desoxirribonucleósido en lugar de beta-D-desoxirribonucleósido). Ejemplos de compuestos de ARNsi que comprenden nucleótidos de LNA se describen en Elmen et al. (NAR 2005, 33(1): 439-447).

En algunas modalidades, los compuestos de ARN de doble cadena se sintetizan usando uno o más nucleótidos invertidos, por ejemplo, timidina invertida o adenina invertida (véase, por ejemplo, Takei, et al., 2002, JBC 277(26): 23800-06).

Otras modificaciones incluyen modificaciones terminales en la parte 5' y/o 3' de los oligonucleótidos, y se conocen también como porciones de remate. Dichas modificaciones terminales se seleccionan de un nucleótido, un nucleótido modificado, un lípido, un péptido, un azúcar y una porción abásica invertida.

Lo que es referido a veces en la presente invención como un "nucleótido abásico" o "análogo de nucleótido abásico", es referido más apropiadamente como un pseudo-nucleótido o una porción no convencional.

Un nucleótido es una unidad monomérica de ácido nucleico, que consiste de un azúcar ribosa o desoxirribosa, un fosfato y una base (adenina, guanina, timina o citosina en ADN; adenina, guanina, uracilo o citosina en ARN). Un nucleótido modificado comprende una modificación en uno o más del azúcar, el fosfato y/o la base. El pseudo-nucleótido abásico carece de una base, y de esta manera no es estrictamente un nucleótido.

El término "porción de remate" (" z" "), como se usa en la presente, incluye una porción de ribosa abásica, porción de desoxirribosa abásica, porciones de ribosa abásica y desoxirríbosa abásica modificadas que incluyen modificaciones de 2' O alquilo; porciones de ribosa abásica y desoxirribosa abásica invertidas, y modificaciones de las mismas; C6-imino-Pi; un nucleótido de espejo que incluye L-ADN y L-ARN; nucleótido de 5'O-Me; y análogos de nucleótido que incluyen nucleótido de 4',5'-metileno; nucleótido de l-(P-D-eritrofuranosilo); nucleótido de 4'-tio, nucleótido carbocíclico; fosfato de 5 -amino-alquilo; fosfato de 1 ,3-diamino-2-propilo, fosfato de 3-aminopropilo; fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo; nucleótido de 1 ,5-anhidrohexitol; alfa-nucleótido; nucleótido de treo-pentofuranosilo; 3',4 -seco nucleótido acíclico; nucleótido de 3,4-dihidroxibutilo; nucleótido de 3,5-dihidroxipentilo, porción abásica 5'-5'-invertida; fosfato de 1 ,4-butanodiol; 5'-amino; y porciones de metilfosfonato y 5'-mercapto que se unen por puentes o que no se unen por puentes.

Ciertas porciones de remate preferidas son porciones de ribosa abásica o de desoxirribosa abásica; porciones de ribosa abásica o de desoxirribosa abásica invertidas; C6-amino-Pi; o un nucleótido de espejo que incluye L-ADN y L-ARN. Otra porción de remate preferida es una porción no de nucleótido C3 derivada de propanodiol.

El término "porción no convencional", como se usa en la presente, se refiere a una porción de ribosa abásica, una porción de desoxirribosa abásica, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un nucleótido de espejo, un análogo de nucleótido de apareamiento no de bases y un nucleótido enlazado a un nucleótido adyacente mediante un enlace fosfato 2 -5' internucleótido; ácidos nucleicos unidos por puentes que incluyen LNA y ácidos nucleicos unidos por puentes de etileno.

En algunas modalidades de la presente invención, una porción no convencional preferida es una porción de ribosa abásica, una porción de desoxirribosa abásica, un desoxirribonucleótido, un nucleótido de espejo y un nucleótido enlazado a un nucleótido adyacente mediante un enlace fosfato internucleótido 2'-5'.

La porción de desoxirribosa abásica incluye, por ejemplo, desoxirribosa abásica-3'-fosfato; 1 ,2-didesoxi-D-ribofuranosa-3-fosfato; y 1 ,4-anhidro-2-desoxi-D-ribitol-3-fosfato. La porción de desoxirribosa abásica invertida incluye 5'-fosfato desoxirriboabásico invertido; y 5 -fosfato desoxiabásico 3'-5'-invertido.

Un "nucleótido de espejo", es un nucleótido con quiralidad invertida respecto al nucleótido de ocurrencia natural o usado comúnmente, es decir, una imagen de espejo (L-nucleótido) del nucleótido de ocurrencia natural (D-nucleótido), referido también como L-ARN en el caso de un ribonucleótido de espejo, y "spiegelmer". El nucleótido puede ser un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido, y puede comprender además por lo menos una modificación de azúcar, base y/o estructura de base. Véase la patente de los Estados Unidos No. 6,586,238. Asimismo, la patente de los Estados Unidos No. 6,602,858 describe catalizadores de ácido nucleico que comprenden por lo menos una sustitución de L-nucleótido. Los nucleótidos de espejo incluyen, por ejemplo, L-ADN (L-desoxirriboadenosina-3'-fosfato (dA de espejo); L-desoxirribocitidina-3'-fosfato (dC de espejo); L-desoxirriboguanosina-3'-fosfato (dG de espejo); L-desoxirribotimidina-3'-fosfato (dT de imagen de espejo)) y L-ARN (L-riboadenosina-3'-fosfato (rA de espejo); L-ribocitidina-3'-fosfato (rC de espejo); L-riboguanosina-3'-fosfato (rG de espejo); y L-ribouracil-3'-fosfato (rU de espejo).

El desoxirribonucleótido modificado incluye, por ejemplo, ADN 5'OMe (5-metil-desoxirriboguanosina-3'-fosfato), el cual puede ser útil como un nucleótido en la posición 5'-terminal (número de posición 1); PACE (3 -fosfonoacetato de desoxirriboadenina, 3'-fosfonoacetato de desoxirribocitidina, 3 -fosfonoacetato de desoxirriboguanosina, 3'-fosfonoacetato de desoxirribotimidina).

Los ácidos nucleicos unidos por puentes incluyen LNA (3'-monofosfato de adenosina de ácido nucleico unido por puentes de 2'-0,4'-C-metileno, 3'-monofosfato de 5-metil-citidina de ácido nucleico unido por puentes de 2'-0,4,-C-metileno, 3 -monofosfato de guanosina de ácido nucleico unido por puentes de 2'-0,4,-C-metileno, 3'-monofosfato de 5-metil-uridina (o timidina)); y ENA (3 -monofosfato de adenosina de ácido nucleico unido por puentes de 2'-0,4-C-etileno, 3 -monofosfato de 5-metil-citidina de ácido nucleico unido por puentes de 2'-0,4'-C-etileno, 3'-monofosfato de guanosina de ácido nucleico unido por puentes de 2'-0,4'-C-metileno, y 3'-monofosfato de 5-metil-uridina (o timidina). De conformidad con un aspecto, la presente invención provee de compuestos de oligonucleótidos inhibidores que comprenden nucleótidos modificados y no modificados. El compuesto comprende por lo menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste de una modificación de azúcar, una modificación de base y una modificación de enlace de internucleótido, y puede contener ADN, y nucleótidos modificados tales como LNA (ácido nucleico bloqueado) que incluye ENA (ácido nucleico unido por puentes de etileno; PNA (ácido nucleico peptídico); arabinósido; PACE (fosfonoacetato y derivados del mismo), nucleótidos de espejo, o nucleótidos con un azúcar de seis carbonos.

Cualquiera de las modificaciones descritas en la presente puede usarse en la preparación de los oligonucleótidos que se incorporan en las composiciones de la presente invención. Esquemas de modificación preferidos se describen, por ejemplo, en la publicación del PCT Nos. WO 2006/023544, WO 2010/048352, WO2009/116037, WO 2009/147684, WO 2011/066475 y WO 2011/084193, todas asignadas al apoderado de la presente invención.

Ejemplos de la secuencia de ácido nucleico de ARNm de Caspasa2 (CASP2 de humano) se exponen en la figura 1, por ejemplo, según se enlista como SEQ ID NO: 1-3. El experto en la técnica entendería que una secuencia dada puede cambiar con el tiempo, y puede incorporar por consiguiente cualquier cambio necesario en las moléculas de ácido nucleico en la presente. Los métodos descritos en la presente abarcan además el uso de moléculas de ARNds que subregulan la expresión de NOX3, CAPNS1 (calpaína S1) y RHOA.

Interferencia de ARN y moléculas de ácido nucleico siNA La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento de genes post-transcripción específico de la secuencia en animales, mediado por moléculas de ARN de interferencia cortas (moléculas de ARNsi) (Zamore et al., 2000, Cell, 101 , 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951 ; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13: 139-141; y Strauss, 1999, Science, 286, 886). El proceso correspondiente en plantas (Heifetz et al., publicación del PCT internacional No. WO 99/61631) es referido con frecuencia como silenciamiento de genes post-transcripción (PTGS) o silenciamiento del ARN. Se piensa que el proceso de silenciamiento de genes post-transcripción es un mecanismo de defensa celular evolutivamente conservado usado para prevenir la expresión de genes extraños (Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358). Dicha protección ante la expresión de genes extraños puede haber evolucionado en respuesta a la producción de ARN de doble cadena (ARNds) derivadas de la infección viral o de la integración aleatoria de elementos transposones en el genoma de un hospedero por medio de una respuesta celular que destruye específicamente el ARN homólogo de cadena sencilla o ARN genómico viral. La presencia del ARNds en las células desencadena la respuesta del ARNi a través de un mecanismo que aún no se ha caracterizado completamente. Este mecanismo parece ser diferente de otros mecanismos conocidos que implican ribonucleasas específicas del ARN de doble cadena, tales como la respuesta del interferón que resulta de la activación de la proteína cinasa PKR y 2',5'-oligoaden¡lato sintetasa mediada por el ARNds, dando como resultado la escisión no específica del ARNm por la ribonucleasa L (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,107,094 y 5,898,031; y Clemens et al., 1997, J. Interferon & Cytokine Res., 17, 503-524; y Adah er a/., 2001 , Curr. Med. Chem., 8, 1189).

La presencia de largas moléculas de ARNds en las células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III referida como dicer (Bass, 2000, Cell, 101 , 235; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293). Dicer está implicada en el procesamiento del ARNds en piezas cortas de ARNds conocidas como ARN de interferencia corta (ARNsi) (Zamore et ai, 2000, Cell, 101 , 25-33; Bass, 2000, Cell, 101 , 235; Berstein et al., 2001 , Nature, 409, 363). Las moléculas de ARN de interferencia cortas derivadas de la actividad de dicer son típicamente de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud, e incluyen dúplex de aproximadamente 19 pares de bases (Zamore ef al., 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al., 2001 , Genes Dev., 15, 188). Dicer ha sido implicada también en la escisión de pequeñas moléculas de ARN temporales de 21 y 22 nucleótidos (moléculas de ARNst) a partir de ARN precursor de estructura conservada, que están implicadas en el control de la traducción (Hutvagner et al., 2001 , Science, 293, 834). La respuesta del ARNi describe también un complejo de endonucleasas, referido comúnmente como un complejo de silenciamiento inducido por el ARN (RISC), el cual media la escisión del ARN de cadena sencilla que tiene una secuencia complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNsi. La escisión del ARN objetivo ocurre a la mitad de la región complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNsi (Elbashir et al., 2001 , Genes Dev., 15, 188).

El ARNi se ha estudiado en una variedad de sistemas. Fire et al. (1998, Nature, 391 , 806) fueron los primeros en observar el ARNi en C. efegans. Bahramian y Zarbl (1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283) y Wianny y Goetz (1999, Nature Cell Biol, 2, 70) describen ARNi mediado por ARNds en sistemas de mamífero. Hammond et al. (2000, Nature, 404, 293) describen ARNi en células de Drosophila transfectadas con ARNds. Elbashir et al. (2001, Nature, 411 , 494) y Tuschl et al. (publicación del PCT No. WO 01/75164) describen ARNi inducido mediante la introducción de dúplex de moléculas de ARN sintéticas de 21 nucleótidos en células de mamífero cultivadas, incluyendo células de riñon embrionario humano y células HeLa. Estudios en lisados embrionarios de Drosophila (véase Elbashir ef al., 2001 , EMBO J., 20, 6877; y Tuschl et al. (publicación del PCT No. WO 01/75164)), han revelado ciertos requerimientos para la longitud, estructura, composición química y secuencia del ARNsi que son esenciales para mediar la actividad eficiente del ARNi.

Las moléculas de ácido nucleico (teniendo por ejemplo las características estructurales como se describe en la presente) pueden inhibir o subregular la expresión génica o la replicación viral mediando la interferencia del ARN "ARNi" o el silenciamiento de genes en una manera específica de la secuencia; véase, por ejemplo, Zamore et al., 2000, Cell, 101 , 25-33; Bass, 2001 , Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; y Kreutzer et ai, publicación del PCT No. WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., publicación del PCT No. WO 01/36646; Fire, publicación del PCT No. WO 99/32619; Plaetinck et al., publicación del PCT No. WO 00/01846; Mello y Fire, publicación del PCT No. WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, publicación del PCT No. WO 99/07409; y Li et al., publicación del PCT No. WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner y Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626; y Reinhart y Barrel, 2002, Science, 297, 1831).

Una molécula de ácido nucleico siNA puede ensamblarse a partir de dos cadenas de polinucleótidos separadas, en donde una cadena es la cadena sentido y la otra es la cadena antisentido, en la cual las cadenas antisentido y sentido son auto-complementarias (es decir, cada cadena incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en la otra cadena); tal como en donde la cadena antisentido y la cadena sentido forman un dúplex o estructura de doble cadena que tiene cualquier longitud y estructura como se describe en la presente para moléculas de ácido nucleico como se provee, por ejemplo, en donde la región de doble cadena (región dúplex) tiene aproximadamente 15 a aproximadamente 49 (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ó 49 pares de bases); la cadena antisentido incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo (es decir, ARNm) o una porción de la misma, y la cadena sentido incluye una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, aproximadamente 17 a aproximadamente 49 o más nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico en la presente, son complementarias al ácido nucleico objetivo o una porción del mismo).

En ciertos aspectos y modalidades, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de siNA) provista en la presente puede ser una molécula de "longitud de RISC", o puede ser un substrato de Dicer como se describe en más detalle a continuación. Moléculas más grandes tales como el pre-ARNmi, pueden funcionar también en el RISC.

Una molécula de ácido nucleico siNA puede incluir secuencias o regiones sentido y antisentido separadas, en donde las regiones sentido y antisentido son enlazadas covalentemente por moléculas de enlazadores de nucleótidos o no de nucleótidos como es sabido en la técnica, o en forma alternativa, son enlazadas no covalentemente mediante interacciones iónicas, unión por enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones hidrofóbicas y/o interacciones de apilamiento. Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo. Las moléculas de ácido nucleico pueden interactuar con una secuencia de nucleótidos de un gen objetivo en una manera que cause la inhibición de la expresión del gen objetivo.

En forma alternativa, una molécula de ácido nucleico siNA es ensamblada a partir de un polinucleótido individual, en donde las regiones sentido y antisentido auto-complementarias de las moléculas de ácido nucleico son enlazadas por medio de enlazador(es) basado(s) en un ácido nucleico o no basado(s) en un ácido nucleico, es decir, la cadena antisentido y la cadena sentido forman parte de un polinucleótido individual que tiene una región antisentido y una región sentido que se pliega para formar una región de dúplex (por ejemplo, para formar una estructura de "pasador", como es bien sabido en la técnica). Dichas moléculas de ácido nucleico siNA pueden ser un polinucleótido con un dúplex, dúplex asimétrico, estructura de pasador o estructura secundaria de pasador asimétrico, que tiene regiones sentido y antisentido auto-complementarias, en donde la región antisentido incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo separada o una porción de la misma, y la región sentido tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, una secuencia de ARNm). Dichas moléculas de ácido nucleico siNA pueden ser un polinucleótido circular de cadena sencilla que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones sentido y antisentido auto-complementarias, en donde la región antisentido incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y la región sentido tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y en donde el polinucleótido circular puede ser procesado ya sea in vivo o in vitro para generar una molécula de ácido nucleico activa capaz de mediar al ARNi.

La siguiente nomenclatura se usa con frecuencia en la técnica para describir longitudes y salientes de las moléculas de siNA, y puede usarse a lo largo de la especificación y los ejemplos. Los nombres dados a los dúplex indican una longitud de los oligómeros y la presencia o ausencia de salientes. Por ejemplo, un dúplex "21+2" contiene dos cadenas de ácido nucleico las cuales tienen 21 nucleótidos de longitud, denominado también un dúplex de ARNsi de 21 elementos o un ácido nucleico de 21 elementos y que tiene una saliente 3' de 2 nucleótidos. Un diseño "21-2" se refiere a un dúplex de ácido nucleico de 21 elementos con una saliente 5' de 2 nucleótidos. Un diseño "21-0" es un dúplex de ácido nucleico de 21 elementos sin salientes (rasurado). Un diseño "21+2UU" es un dúplex de 21 elementos con una saliente 3' de 2 nucleótidos, y los 2 nucleótidos terminales en los extremos 3' son ambos residuos de U (lo cual puede dar como resultado un no apareamiento con la secuencia objetivo). La nomenclatura mencionada anteriormente puede aplicarse a moléculas de siNA de varias longitudes de cadena, dúplex y salientes (tales como 19-0, 21+2, 27+2, y similares). En una nomenclatura alternativa pero similar, un diseño "25/27" es un dúplex asimétrico que tiene una cadena sentido de 25 bases y una cadena antisentido de 27 bases con una saliente 3' de 2 nucleótidos. Un diseño "27/25" es un dúplex asimétrico que tiene una cadena sentido de 27 bases y una cadena antisentido de 25 bases.

Modificaciones químicas En ciertos aspectos y modalidades, las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ARNds que incluye moléculas de siNA) como se proveen en la presente, incluyen una o más modificaciones (o modificaciones químicas) que incluyen la presencia de una o más porciones no convencionales. En ciertas modalidades, dichas modificaciones incluyen cualquier cambio a una molécula o polinucleótido de ácido nucleico que haría que la molécula fuera diferente de un ribonucleótido o molécula de ARN estándar (es decir, que incluye porciones estándar de adenina, citosina, uracilo o guanina); el cual puede ser referido como un ribonucleótido "no modificado" o ácido ribonucleico no modificado. Las bases de ADN tradicionales y los polinucleótidos que tienen un azúcar 2'-desox¡ representado por porciones de adenina, citosina, timina o guanina, pueden ser referidos como un "desoxirribonucleótido no modificado" o "ácido desoxirribonucleico no modificado"; por consiguiente, el término "nucleótido no modificado" o "ácido nucleico no modificado", como se usa en la presente, se refiere a un "ribonucleótido no modificado" o "ácido ribonucleico no modificado", a menos que exista una clara indicación de lo contrario. Dichas modificaciones pueden ser en el azúcar del nucleótido, la base del nucleótido, el grupo fosfato del nucleótido y/o la estructura de base de fosfato de un polinucleótido, e incluyen enantiómeros de ARN y ADN.

En ciertas modalidades, las modificaciones como se describen en la presente pueden usarse para incrementar la actividad de ARNi de una molécula y/o para incrementar la estabilidad in vivo de las moléculas, en particular la estabilidad en suero, y/o para incrementar la biodisponibilidad de las moléculas. Ejemplos no limitativos de modificaciones incluyen, sin limitación, enlaces internucleótido o internucleósido; desoxirribonucleótidos o didesoxirribonucleótidos en cualquier posición y cadena de la molécula de ácido nucleico; ácido nucleico (por ejemplo, ácido ribonucleico) con una modificación en la posición 2' seleccionada de preferencia de un amino, fluoro, metoxi, alcoxi y alquilo; 2'-desoxirribonucleót¡dos, ribonucleótidos de 2 -0-metilo, ribonucleótidos de 2'-desox¡-2'-fluoro, nucleótidos de "base universal", nucleótidos "acíclicos", nucleótidos de 5-C-metilo, grupo biotina, y la incorporación de un residuo desoxiabásico invertido y/o de glicerilo terminal, moléculas estéricamente impedidas tales como moléculas fluorescentes, y similares. Otros modificadores de nucleótidos podrían incluir 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (ddl), 2',3'-didesoxi-3,-tiacitidina (3TC), 2',3,-didehidro-2')3'-didesoxitimidina (d4T) y los nucleótidos de monofosfato de 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), .S'-didesoxi-S'-tiacitidina (3TC) y Z^-didehidro-a'^*-didesoxitimidina (d4T). Más detalles sobre varias modificaciones se describen en más detalle a continuación.

Los nucleótidos modificados incluyen aquéllos que tienen una conformación Northern (por ejemplo, ciclo de pseudo-rotación Northern; véase, por ejemplo, Saenger, Principies of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Ejemplos no limitativos de nucleótidos que tienen una configuración Northern incluyen nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) (por ejemplo, nucleótidos de 2l-0,4'-C-metilen-(D-ribofuranosilo)); nucleótidos de 2 -metoxietoxi (MOE); 2 -metil-tio-etilo, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-cloro, nucleótidos de 2'-azido y nucleótidos de 2'-0-metilo. Los ácidos nucleicos bloqueados, o LNAs se describen, por ejemplo, en Elman et al., 2005; Kurreck et al., 2002; Crinelli et al., 2002; Braasch y Corey, 2001 ; Bondensgaard et al., 2000; Wahlestedt et al., 2000; y la publicación de las patentes Nos. WO 00/47599, WO 99/14226, WO 98/39352 y WO 2004/083430. En una modalidad, un LNA se incorpora en el extremo 5' de la cadena sentido.

Las modificaciones químicas incluyen también ácidos nucleicos no bloqueados, o UNAs, los cuales son análogos acíclicos no de nucleótidos, en los cuales el enlace C2'-C3' no está presente (aunque los UNAs no son realmente nucleótidos, se incluyen expresamente en el alcance de nucleótidos "modificados" o ácidos nucleicos modificados como se contempla en la presente). En modalidades particulares, las moléculas de ácido nucleico con una saliente pueden ser modificadas para que tengan UNAs en las posiciones salientes (es decir, una saliente de 2 nucleótidos). En otras modalidades, los UNAs se incluyen en los extremos 3' ó 5'. Un UNA puede localizarse en cualquier parte a lo largo de una cadena de ácido nucleico, es decir, en la posición 7. Las moléculas de ácido nucleico pueden contener uno o más UNAs. Ejemplos de UNAs se describen en Nucleic Acids Symposium Series No. 52 p. 133-134 (2008). En ciertas modalidades, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de siNA) como se describe en la presente, incluye uno o más UNAs; o un UNA. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de siNA) como se describe en la presente que tiene una saliente 3', incluye uno o dos UNAs en la saliente 3'. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de siNA) como se describe en la presente, incluye un UNA (por ejemplo, un UNA) en la cadena antisentido, por ejemplo, en la posición 6 o la posición 7 de la cadena antisentido. Las modificaciones químicas incluyen también análogos de nucleótidos de no apareamiento, por ejemplo, como se describe en la presente. Las modificaciones químicas incluyen además porciones no convencionales como se describe en la presente.

Las modificaciones químicas incluyen también modificaciones terminales en la parte 5' yfo 3' de los oligonucleótidos, y se conocen también como porciones de remate. Dichas modificaciones terminales se seleccionan de un nucleótido, un nucleótido modificado, un lípido, un péptido y un azúcar.

Las modificaciones químicas incluyen también "análogos de nucleótidos de anillo de seis miembros". Ejemplos de análogos de nucleótidos de anillo de seis miembros se describen en Allart, et al. (Nucleosides & Nucleotides, 1998, 17: 1523-1526; y en Pérez-Pérez, et al., 1996, Bioorg. and Medicinal Chem Letters 6: 1457-1460). Oligonucleótidos que incluyen análogos de nucleótidos de anillo de 6 miembros que incluyen monómeros de nucleótidos de hexitol y altritol, se describen en la solicitud de patente publicación No. WO 2006/047842.

Las modificaciones químicas incluyen también nucleótidos de "espejo", los cuales tienen una quiralidad invertida en comparación con los nucleótidos de ocurrencia natural normales; es decir, un nucleótido de espejo puede ser un análogo de "L-nucleótido" de D-nucleótido de ocurrencia natural (véase la patente de los Estados Unidos No. 6,602,858). Los nucleótidos de espejo pueden incluir además por lo menos una modificación de azúcar o de base y/o una modificación de estructura de base, por ejemplo, como se describe en la presente, tal como una porción de fosforotioato o fosfonato. La patente de los Estados Unidos No. 6,602,858 describe catalizadores de ácido nucleico que incluyen por lo menos una sustitución de L-nucleótido. Los nucleótidos de espejo incluyen, por ejemplo, L-ADN (L-desoxirriboadenosina-3 -fosfato (dA de espejo); L-desoxirribocitidina-3'-fosfato (dC de espejo); L-desoxirriboguanosina-3'-fosfato (dG de espejo); L-desoxirribotimidina-3'-fosfato (dT de imagen de espejo)) y L-ARN (L-riboadenosina-3'-fosfato (rA de espejo); L-ribocitidina-3'-fosfato (rC de espejo); L-riboguanosina-3'-fosfato (rG de espejo); y L-ribouracil-3'-fosfato (rU de espejo).

En algunas modalidades, los ribonucleótidos modificados incluyen desoxirribonucleótidos modificados, por ejemplo ADN 5'OMe (3 - fosfato de 5-metil-desoxirriboguanosina), el cual puede ser útil como un nucleótido en la posición 5'-terminal (número de posición 1); PACE (3'-fosfonoacetato de desoxirriboadenina, 3'-fosfonoacetato de desoxirribocitidina, 3'-fosfonoacetato de desoxirriboguanosina y 3'-fosfonoacetato de desoxirribotimidina.

Las modificaciones pueden estar presentes en una o más cadenas de una molécula de ácido nucleico descrita en la presente, por ejemplo, en la cadena sentido, la cadena antisentido, o ambas cadenas. En ciertas modalidades, la cadena antisentido puede incluir modificaciones, y la cadena sentido sólo puede incluir ARN no modificado.

Nucleobases Las nucleobases del ácido nucleico descrito en la presente pueden incluir ribonucleótidos no modificados (purinas y pirimidinas) tales como adenina, guanina, citosina y uridina. Las nucleobases en una cadena o en ambas cadenas pueden ser modificadas con nucleobases naturales y sintéticas tales como timina, xantina, hipoxantina, inosina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, y cualquier nucleótido de "base universal"; 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, amino, tiol, tioalquilo, hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina, deazapurinas, análogos heterocíclicos sustituidos de purinas y pirimidinas, por ejemplo, aminoetoxi fenoxazina, derivados de purinas y pirimidinas (por ejemplo, derivados de 1 -alquilo-, 1-alquenilo-, heteroaromáticos- y 1-alquinilo), y tautómeros de los mismos, 8-oxo-N6-metiladenina, 7-diazaxantina, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 5-(1-prop¡nil)uracilo, 5-(1-propinil) citosina y 4,4-etanocitosina). Otros ejemplos de bases adecuadas incluyen bases no de purinilo y no de pirimidinilo, tales como 2-aminopiridina y triazinas.

Porciones de azúcar Las porciones de azúcar en el ácido nucleico descrito en la presente pueden incluir una porción de azúcar de 2'-hidroxil-pentofuranosilo sin modificación alguna. En forma alternativa, las porciones de azúcar pueden ser modificadas, tales como una porción de azúcar de 2'-desoxi-pentofuranosilo, D-ribosa, hexosa, modificación en la posición 2' de la porción de azúcar de pentofuranosilo, tales como 2'-O-alquilo (incluyendo 2'-O-met¡lo y 2 -O-etilo), es decir, 2 -alcoxi, 2 -amino, 2'-O-alilo, 2'-S-alquilo, 2'-halógeno (incluyendo 2'-fluoro, cloro y bromo), Z-metoxietoxi, 2 -O-metoxietilo, 2 -O-2-metoxietilo, 2'-aliloxi (-OCH2CH=CH2), 2'-propargilo, 2'-propilo, etinilo, propenilo, CF, ciano, imidazol, carboxilato, tioato, alquilo inferior de Ci a Cío, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo, OCF3l OCN, O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino o sililo sustituido, entre otros, por ejemplo, como se describe en las patentes europeas EP 0 586 520 B1 Ó EP 0 618 925 B1.

El grupo alquilo incluye grupos alifáticos saturados, que incluyen grupos alquilo de cadena recta (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc.), grupos alquilo de cadena ramificada (¡sopropilo, ter-butilo, isobutilo, etc.), grupos cicloalquilo (alicíclicos) (ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En ciertas modalidades, un alquilo de cadena recta o ramificada tiene 6 o menos átomos de carbono en su estructura de base (por ejemplo, C C6 para una cadena recta, C3-C6 para una cadena ramificada), y más preferiblemente 4 o menos. Asimismo, los cicloalquilos preferidos pueden tener de 3 a 8 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferiblemente tienen 5 o 6 carbonos en su estructura de anillo. El término C1-C6 incluye grupos alquilo que contienen 1 a 6 átomos de carbono. El grupo alquilo puede ser grupo alquilo sustituido, tal como porciones alquilo que tienen sustituyentes que reemplazan un hidrógeno en uno o más carbonos de la estructura de base de hidrocarburo. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alqueniio, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquiicarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, ¡mino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfates, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo, o una porción aromática o heteroaromática.

El grupo alcoxi incluye grupos alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos y no sustituidos enlazados covalentemente a un átomo de oxígeno. Ejemplos de grupos alcoxi incluyen grupos metoxi, etoxi, isopropiloxi, propoxi, butoxi y pentoxi. Ejemplos de grupos alcoxi sustituidos incluyen grupos alcoxi halogenados. Los grupos alcoxi pueden ser sustituidos con grupos tales como alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfates, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo, o una porción aromática o heteroaromática. Ejemplos de grupos alcoxi sustituidos con halógeno incluyen, pero no están limitados a, fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, clorometoxi, diclorometoxi, triclorometoxi, etc.

En algunas modalidades, el anillo de pentafuronosilo puede ser remplazado con derivados acíclicos que carecen del enlace C2'-C3' del anillo de pentafuronosilo. Por ejemplo, los aciclonucleótidos pueden sustituir un grupo 2-hidroxietoximetilo con el azúcar 2'-desoxirribofuranosilo normalmente presente en los dNMPs.

Los halógenos incluyen flúor, bromo, cloro y yodo.

Estructura de base Las subunidades de nucleósido del ácido nucleico descrito en la presente pueden ser enlazadas entre sí mediante enlaces fosfodiéster. El enlace fosfodiéster puede ser opcionalmente sustituido con otros enlaces, por ejemplo, fosforotioato, entidades de tiofosfato-D-ribosa, triéster, tioato, estructura de base unida por puentes 2 -5' (la cual puede ser referida también como 5 -2'), PACE, 3'-(o -5')desoxi-3'-(o -5')tio-fosforotioato, fosforad itioato, fosforoselenatos, 3'-(o -5')desoxifosfinatos, boranofosfatos, 3*-(o -5')desoxi-3'-(o 5'-)aminofosforamidatos, fosfonatos de hidrógeno, fosfonatos, ésteres de boranofosfato, fosforamidatos, alquil- o aril-fosfonatos y modificaciones de fosfotriéster tales como alquilfosfotriésteres, enlaces de fósforo de fosfotriéster, 5'-etoxifosfodiéster, P-alquiloxifosfotriéster, metilfosfonato y enlaces que no contienen fósforo, por ejemplo, enlaces de carbonato, carbamato, sililo, azufre, sultanato, sulfonamida, formiacetal, tioformiacetilo, oxima, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo y metilenoximetilimino.

Las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente pueden incluir una estructura de base de ácido nucleico peptídico (PNA). La estructura de base de PNA incluye unidades de N-(2-aminoetil)-glicina repetitivas enlazadas por enlaces peptídicos. Las varias bases tales como purina, pirimidina, bases naturales y sintéticas, se enlazan a la estructura de base mediante enlaces metilencarbonilo.

Fosfatos terminales Pueden hacerse modificaciones en los grupos fosfato terminales. Ejemplos no limitativos de diferentes químicas de estabilización pueden usarse, por ejemplo, para estabilizar el extremo 3' de las secuencias de ácido nucleico, incluyendo (1) [3-3']-desoxirribosa invertida; (2) desoxirribonucleótido; (3) [5'-3']-3'-desoxirribonucleót¡do; (4) [5'-3']-ribonucleótido; (5) [5'-3']-3'-0-metil ribonucleótido; (6) 3'-glicerilo; (7) ?'-d'?-ß'-desoxirribonucleótido; (8) [3'-3']-desoxirribonucle0tido; (9) [5'-2']-desoxirribonucleótido; y (10) [5-3']-didesoxirribonucleótido. Además de la estructura de base no modificada, las químicas pueden combinarse con una o más modificaciones diferentes de la estructura de base descritas en la presente.

Ejemplos de grupos fosfato terminales químicamente modificados, incluyen los mostrados a continuación: ido nte de vanadilo con cualquier combinación de otras modificaciones en el mismo En un aspecto, se proveen moléculas de ácido nucleico de doble cadena para su uso en la neuroprotección de neuronas en el oído de un sujeto, que tienen la estructura (A1): 5' (N)x-Z 3' (cadena antisentido) (A1) 3* Z'-ÍN'íy-z" 5' (cadena sentido) en donde cada uno de N y N' es un nucleótido, el cual puede ser no modificado o modificado, o una porción no convencional; en donde cada uno de (N)x y (N')y es un oligonucleótido en el cual cada N o N' consecutivo se une al siguiente N o N' mediante un enlace covalente; en donde cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente independientemente, incluye 1 a 5 nucleótidos consecutivos o porciones no de Rucleotido o una combinación de los mismos unidos covalentemente en el extremo 3' de la cadena en la cual está presente; en donde z" puede estar presente o ausente, pero si está presente, es una porción de remate unida covalentemente en el extremo 5' de (N')y; cada uno de x y y es independientemente un entero de 18 a 40; en donde la secuencia de (N')y tiene complementariedad con la secuencia de (N)x; y en donde (N)x incluye una secuencia antisentido respecto al ARNm objetivo, en donde el ARNm objetivo comprende una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5-6 o SEQ ID NO: 7.

En algunas modalidades x = y, y cada uno de x y y es 19, 20, 21 , 22 ó 23. En varias modalidades, x = y = 19. En algunas modalidades, las cadenas sentido y antisentido forman un dúplex mediante apareamiento de bases. En algunas modalidades, (N)x y (N')y son pares de oligonucleótidos provistos en la patente del PCT publicación Nos. WO 2008/050329, WO 2009/044392, WO 2008/106102, WO 2009/001359 y WO/2009/090639, incorporadas en su totalidad en la presente como referencia.

En algunas modalidades, x = y, y cada uno de x y y es 19, 20, 21 , 22 ó 23. En varias modalidades, x = y = 19. En algunas modalidades, las cadenas sentido y antisentido forman un dúplex mediante apareamiento de bases.

De conformidad con una modalidad, se proveen moléculas de ácido nucleico modificadas para su uso en la neuroprotección de neuronas en el oído de un sujeto, que tienen una estructura (A2) expuesta a continuación: 5' N1-(N)x-Z 3' (cadena antisentido) (A2) 3" Z'-N2-(N')y-z" 5' (cadena sentido) en donde cada uno de N2, N y N' es independientemente un nucleótido no modificado o modificado, o una porción no convencional; en donde cada uno de (N)x y (N')y es un oligonucleótido en el cual cada N o N' constitutivo se une al N o N' adyacente mediante un enlace covalente; en donde cada uno de x y y es independientemente un entero de 17 a 39; en donde la secuencia de (N')y tiene complementariedad con la secuencia de (N)x, y (N)x tiene complementariedad con una secuencia consecutiva en un ARNm objetivo; en donde N1 se une covalentemente a (N)x, y es no apareado con el ARNm objetivo, en donde el ARNm objetivo se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5-6 o SEQ ID NO: 7; en donde N1 es una porción seleccionada del grupo que consiste de uridina, uridina modificada, ribotimidina, ribotimidina modificada, desoxirribotimidina, desoxirribotimidina modificada, riboadenina, riboadenina modificada, desoxirriboadenina o desoxirriboadenina modificada; en donde N1 y N2 forman un par de bases; en donde cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente, es independientemente 1 a 5 nucleótidos consecutivos o porciones no de nucleótido o una combinación de los mismos unidos covalentemente en el extremo 3' de la cadena en la cual está presente; y en donde z" puede estar presente o ausente, pero si está presente, es una porción de remate unida covalentemente en el extremo 5' de (N')y- En algunas modalidades, el enlace covalente que se une a cada N o N' consecutivo, es un enlace fosfodiéster.

En algunas modalidades, Z y Z' están ausentes. En otras modalidades, uno de Z o Z' está presente y comprende porciones salientes no de nucleótido como se describe en la patente del PCT publicación No. WO/2011/085056, incorporada en su totalidad en la presente como referencia.

En modalidades específicas de estructura A1 x = y = 19, y Z comprende por lo menos una saliente de alquilo de C3. En modalidades específicas de estructura A2 x = y = 18, y Z comprende por lo menos una saliente de alquilo de C3. En algunas modalidades, la saliente de C3-C3 está unida covalentemente al extremo 3' de (N)x o (N')y por medio de un enlace covalente, de preferencia un enlace fosfodiéster. En algunas modalidades, el enlace entre un primer C3 y un segundo C3 es un enlace fosfodiéster. En algunas modalidades, la saliente no de nucleótido 3' es C3Pi-C3Pi. En algunas modalidades, la saliente no de nucleótido 3' es C3Pi-C3Ps. En algunas modalidades, la saliente no de nucleótido 3' es C3PÍ-C30H (en donde OH es hidroxi). En algunas modalidades, la saliente no de nucleótido 3' es C3PÍ-C30H.

En varias modalidades, la porción alquilo comprende un derivado de alquilo que incluye una porción alquilo de C3, alquilo de C4, alquilo de C5 o alquilo de C6 que comprende un grupo hidroxilo terminal, un grupo amino terminal o un grupo fosfato terminal. En algunas modalidades, la porción alquilo es una porción alquilo de C3 o una porción de derivado de alquilo de C3. En algunas modalidades, la porción alquilo de C3 comprende propanol, propilfosfato, propilfosforotioato, o una combinación de los mismos. La porción alquilo de C3 está enlazada covalentemente al extremo 3' de (N')y y/o al extremo 3' de (N)x, por medio de un enlace fosfodiéster. En algunas modalidades, la porción alquilo comprende propanol, propilfosfato o propilfosforotioato. En algunas modalidades, cada uno de Z y 71 se selecciona independientemente de propanol, propilfosfato o propilfosforotioato, combinaciones de los mismos o múltiplos de los mismos, en particular 2 ó 3 de propanol enlazado covalentemente, propilfosfato, propilfosforotioato, o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, cada uno de Z y 71 se selecciona independientemente de propilfosfato, propilfosforotioato, propil fosfo-propanol; propil fosfo-propil fosforotioato; propilfosfo-propil fosfato; (propil fosfato)3, (propil fosfato)2-propanol o (propil fosfato)2- propil fosforotioato. Cualquier porción conjugada con propano o propanol puede incluirse en Z o Z'.

Las estructuras de ejemplos de porciones no de nucleótido 3'-terminales, son las siguientes: En algunas modalidades, el nucleótido 5'-terminal de la cadena antisentido (posición 1 de la cadena antisentido) es no apareado con el ARNm objetivo. En algunas modalidades, el nucleótido 5'-terminal de la cadena antisentido es una riboadenosina modificada o una ribouridina modificada.

En algunas modalidades, cada uno de (N)x y (N')y es independientemente fosforilado o no fosforilado en los extremos 3' y 5'.

A menos que se indique de otra manera, en modalidades preferidas de las estructuras discutidas en la presente, el enlace covalente entre cada N y N' consecutivo es un enlace fosfodiéster.

Un enlace covalente se refiere a un enlace internucleótido que enlaza un monómero de nucleótido con un monómero de nucleótido adyacente. Un enlace covalente incluye, por ejemplo, un enlace fosfodiéster, un enlace fosforotioato, un enlace P-alcoxi, un enlace P-carboxi, y similares. El enlace internucleósido normal del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'. En ciertas modalidades preferidas, un enlace covalente es un enlace fosfodiéster. El enlace covalente abarca enlaces internucleósido que no contienen fósforo, tales como los descritos en el documento WO 2004/041924, entre otros. A menos que se indique de otra manera, en modalidades preferidas de las estructuras discutidas en la presente, el enlace covalente entre cada N y N' consecutivo es un enlace fosfodiéster.

Para todas las estructuras anteriores, en algunas modalidades, la secuencia de oligonucleótidos de (N)x es completamente complementaria a la secuencia de oligonucleótidos de (N')y. En otras modalidades, (N)x y (N')y son sustancialmente complementarios. En ciertas modalidades, (N)x es completamente complementario a 18 a 40 nucleótidos consecutivos en un ARNm objetivo. En otras modalidades, (N)x es sustancialmente complementario a 18 a 40 nucleótidos consecutivos en un ARNm objetivo.

En algunas modalidades, ni (N)x ni (N')y son fosforilados en los extremos 3' y 5'. En otras modalidades, cualquiera de (N)x y (N')y, o ambos, son fosforilados en los extremos 3' (3' Pi). En otra modalidad, cualquiera de (N)x y (N')y, o ambos, son fosforilados en los extremos 3' con grupos fosfato no escindibles. En otra modalidad, cualquiera de (N)x y (N')y, o ambos, son fosforilados en la posición 2' terminal usando grupos fosfato escindibles o no escindibles. Además, las moléculas de ácido nucleico inhibidoras de la presente invención pueden comprender uno o más espacios intermedios y/o una o más muescas y/o uno o más no apareamientos. Sin que se desee que sea limitado por la teoría, los espacios intermedios, muescas y no apareamientos tienen la ventaja de que desestabilizan parcialmente al ácido nucleico/ARNsi, de modo que pueden ser procesados más fácilmente por la maquinaria celular endógena tal como DICER, DROSHA o RISC en sus componentes inhibidores.

Síntesis de compuestos de ARN de doble cadena Los compuestos de ARN de doble cadena útiles en la preparación de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se sintetizan mediante cualquiera de los métodos que son bien conocidos en la técnica para la síntesis de oligonucleótidos ribonucleicos (o desoxirribonucleicos). Dicha síntesis se describe, entre otras referencias, en Beaucage e lyer, Tetrahedron 1992; 48: 2223-2311 ; Beaucage e lyer, Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194, y Caruthers, et. al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313; la síntesis de tioatos se describe, en otras referencias, en Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402; la síntesis de moléculas de ARN se describe en Sproat, en Humana Press 2005 editado por Herdewijn P., cap. 2: 17-31 ; y procedimientos hacia el extremo 3' respectivos se describen, entre otras referencias, en Pingoud et al., en IRL Press 1989 editado por Oliver R.W.A.; cap. 7: 183-208.

Otros procedimientos de síntesis se conocen en la técnica; por ejemplo, los procedimientos descritos en Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe et al., 1990, NAR., 18, 5433; Wincott et al., 1995, NAR. 23, 2677-2684; y Wincott er a/., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, pueden hacer uso de grupos de acoplamiento o protectores comunes del ácido nucleico, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5', y fosforam ¡ditas en el extremo 3'. Los nucleótidos modificados (por ejemplo, 2'-O-metilados) y los nucleótidos no modificados son incorporados según se desee.

Los oligonucleótidos útiles en la preparación de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden sintetizarse por separado y pueden ser unidos juntos post-síntesis, por ejemplo, mediante ligación (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., publicación de patente No. WO 93/23569; Shabarova er a/., 1991, NAR 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), o mediante hibridación después de síntesis y/o desprotección.

Se observa que puede usarse una máquina disponible comercialmente (disponible, entre otros, de Applied Biosystems); los oligonucleótidos se preparan de acuerdo con las secuencias descritas en la presente. Pares traslapantes de fragmentos químicamente sintetizados pueden ser ligados usando métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6,121,426). Las cadenas se sintetizan por separado, y entonces se unen entre sí en el tubo. Entonces, las moléculas de ARNsi de doble cadena se separan de los oligonucleótidos de cadena sencilla que no fueron unidos (por ejemplo, debido al exceso de uno de ellos) mediante CLAR. Con relación a las moléculas de ARNsi o los fragmentos de ARNsi de la presente invención, dos o más de dichas secuencias pueden sintetizarse y enlazarse en conjunto para su uso en la presente invención.

Los compuestos de ARN de doble cadena útiles en la preparación de las composiciones farmacéuticas de la invención pueden sintetizarse también por medio de la metodología de síntesis en tándem como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos publicación No. US 2004/0019001 , en donde ambas cadenas del ARNsi se sintetizan como un fragmento de olígonucleótido contiguo individual o cadena separada por un enlazador escindible el cual es escindido posteriormente para proveer de fragmentos de ARNsi separados o cadenas que hibridan y permiten la purificación del dúplex de ARNsi. El enlazador se selecciona de un enlazador de polinucleótidos o un enlazador no de nucleótidos.

Las composiciones de la presente invención comprenden de preferencia dos o más oligonucleótidos, y estos oligonucleótidos pueden sintetizarse por separado y pueden mezclarse juntos o (covalentemente o no covalentemente) pueden unirse juntos post-síntesis, o pueden sintetizarse juntos de acuerdo con los procedimientos detallados anteriormente.

Composiciones farmacéuticas Mientras que es posible que los compuestos de oligonucleótidos de la presente invención se administren como la materia prima química, es preferible presentarlos como una composición farmacéutica. En algunas modalidades, los compuestos de oligorribonucleótidos se producen mediante complejos intracelulares endógenos.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se preparan usando cualquier compuesto de oligonucleótido de ARN de doble cadena químicamente modificado o no modificado. ARNsi que sea substrato de Dicer o ARNsi asimétrico, puede usarse con la invención. Los compuestos de oligonucleótidos de ARN de doble cadena usados en la presente invención abarcan cualquier sal, éster o sal de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto el cual, tras la administración a un mamífero, incluyendo un humano, sea capaz de tratar las enfermedades, trastornos y lesión del oído. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención se preparan usando compuestos de ARN de doble cadena que sean químicamente y/o estructuralmente modificados de acuerdo con una de las siguientes modificaciones expuestas en las estructuras descritas en la presente, o como ARNsi en tándem o ARNstar (véase el documento WO 2007/091269). Ciertas moléculas preferidas son moléculas de ARNds químicamente sintetizadas y modificadas que eligen como objetivo a CASP2, NOX3, CAPNS1 o RHOA. Una cierta molécula preferida es un ARNds que usa la secuencia de oligonucleótidos de CASP2_4.

La invención provee además de una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos de oligonucleótidos inhibidores; un intensificador de permeabilidad y un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la composición comprende una mezcla de dos o más oligonucleótidos/compuestos de ARNsi diferentes.

Los compuestos pueden administrarse oralmente, subcutáneamente o parenteralmente, incluyendo la administración intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intranasal o transtimpánica, así como técnicas intratecales y de infusión. Implantes de los compuestos son también útiles. El modo de administración preferible es el transtimpánico. Pueden prepararse formas líquidas para inyección, el término incluyendo inyección subcutánea, transdérmica, intravenosa, intramuscular, intratecal o transtimpánica, y otras vías de administración parenterales. Las composiciones líquidas incluyen soluciones acuosas, con y sin co-solventes orgánicos, suspensiones acuosas u oleosas, emulsiones con aceites comestibles, así como vehículos farmacéuticos similares. En una modalidad, la administración comprende la administración intravenosa. En modalidades preferidas, la administración comprende la administración tópica, en particular la administración tópica al conducto auditivo, la administración tópica a la membrana timpánica, o una combinación de las mismas. En algunas modalidades, los compuestos de la presente solicitud se aplican a la membrana timpánica como una gota para los oídos. En algunas modalidades preferidas, las moléculas de ARNds se administran mediante inyección transtimpánica o mediante gotas para los oídos.

En varias modalidades, en particular las modalidades en las cuales las composiciones farmacéuticas de la invención se administran tópicamente, las composiciones farmacéuticas comprenden además un intensificador de permeabilidad, conocido también como intensificador de penetración. En varias modalidades, el intensificador de penetración se selecciona de cualquier compuesto o cualquier combinación de dos o más compuestos que intensifiquen la penetración de un oligonucleótido terapéutico a través de la piel y/o la membrana timpánica en el oído de un sujeto que sufre de o que está en riesgo de una enfermedad, un trastorno o una lesión del oído interno, de preferencia la enfermedad de Méniére. En algunas modalidades, el intensificador de penetración/permeabilidad se selecciona de, sin que sea limitado a, polietilenglicol (PEG), glicerol (glicerina), maltitol, sorbitol etc.; éter monoetílico de dietilenglicol, azona, cloruro de benzalconio (ADBAC), cloruro de cetilperidio, bromuro de cetilmetilamonio, sulfato de dextrán, ácido láurico, mentol, metoxisalicilato, ácido oleico, fosfatidilcolina, polioxietileno, polisorbato 80, glicolato de sodio, lauril sulfato de sodio, salicilato de sodio, taurocolato de sodio, taurodesoxicolato de sodio, sulfóxidos, desoxicolato de sodio, glicodesoxicolato de sodio, taurocolato de sodio, y agentes tensoactivos tales como lauril sulfato de sodio, laureth-9, cloruro de cetilpiridinio y éteres monoalquílicos de polioxietileno, ácidos benzoicos tales como salicilato de sodio y metoxi salicilato, ácidos grasos tales como ácido láurico, ácido oleico, acido undecanoico y oleato de metilo, alcoholes grasos tales como octanol y nonanol, laurocaprama, ciclodextrinas, timol, limoneno, urea, quitosán y otros polímeros naturales y sintéticos.

En ciertas modalidades, el intensificador de permeabilidad es un poliol. En algunas modalidades, el oligonucleótido está en mezcla con un poliol. Polioles adecuados para inclusión en las soluciones de la invención incluyen glicerol y alcoholes de azúcar tales como sorbitol, manitol o xilitol, polietilenglicol, y derivados de los mismos.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen también uno o más de varios otros ingredientes farmacéuticamente aceptables tales como, sin que sean limitados a, uno o más de agente regulador de pH, conservador, agente tensoactivo, portador, solvente, diluyente, co-solvente, agente intensificador/formador de viscosidad, excipiente, adyuvante y vehículo. En ciertas modalidades, los conservadores aceptados tales como cloruro de benzalconio y edetato disódico (EDTA) se incluyen en las composiciones de la invención en concentraciones suficientes para acción antimicrobiana efectiva, de aproximadamente 0.0001 a 0.1%, con base en el peso de la composición.

De conformidad con una modalidad, el poliol es glicerol. En varias modalidades, el glicerol está presente a una concentración final de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 35%; aproximadamente 1% a aproximadamente 30%; aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, de preferencia aproximadamente 10% a aproximadamente 20% en volumen de la composición farmacéutica. En algunas modalidades, la concentración final de glicerol en la composición farmacéutica es aproximadamente 2%, 2.5%, 5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 22.5%, 25%, 27.5% o aproximadamente 30% en volumen de la composición farmacéutica. En una modalidad, la concentración final de glicerol en la composición farmacéutica es aproximadamente 2% en volumen de la composición farmacéutica. En otra modalidad, la concentración final de glicerol en la composición farmacéutica es aproximadamente 5% o aproximadamente 10% en volumen de la composición farmacéutica. En otra modalidad, la concentración final de glicerol en la composición farmacéutica es aproximadamente 20% en volumen de la composición farmacéutica. En algunas modalidades, la composición farmacéutica es llevada hasta aproximadamente la temperatura corporal del sujeto, la cual es aproximadamente 30°C a aproximadamente 38°C, antes de la aplicación. Ciertos métodos para tratar trastornos óticos se describen en la patente del PCT publicación No. WO 2011/072091, incorporada en su totalidad en la presente como referencia.

En varias modalidades, las composiciones de oligonucleótidos se formulan para administración tópica mediante cualquier modo de administración adecuado. Modos de administración adecuados de las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen modos de administración invasivos y no invasivos tales como, sin que sean limitados a, instilación (por ejemplo, de una solución de gotas para los oídos), inyección (de formulación inyectable), deposición (de formulación sólida o semisólida, por ejemplo, ungüento, gel), infusión o atomización. En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención se administran tópicamente. El suministro puede efectuarse mediante cualquier medio (por ejemplo, gotas, aerosol), usando cualquier instrumento efectivo para poner la composición dentro del oído interno o para inyectar la composición (por ejemplo, a través de la membrana timpánica).

La presente invención provee también de un procedimiento para preparar una composición farmacéutica de la invención, de acuerdo con técnicas de formulación conocidas por los expertos en la técnica. En algunas modalidades, el procedimiento para preparar una composición farmacéutica de la invención comprende combinar, en cualquier orden adecuado, una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un compuesto de oligonucleótido, uno o más intensificadores de permeabilidad y por lo menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, o mezclas de los mismos, dicha composición teniendo de preferencia estabilidad química y/o física extendida, como se describe en la presente. En algunas modalidades, el procedimiento para preparar una composición farmacéutica de la invención comprende combinar, en cualquier orden adecuado, una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un compuesto de oligonucleótido, uno o más intensificadores de permeabilidad, por lo menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, o mezclas de los mismos, y un agente antibacteriano y/o conservador. En algunas modalidades, la composición farmacéutica incluye un agente tensoactivo farmacológicamente aceptable que ayuda en la disolución del compuesto de ARN de doble cadena. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica de la invención comprende además un agente terapéuticamente activo adicional, dichas composiciones siendo útiles en terapias de combinación como se describe en la presente. En algunas modalidades de la invención, el agente farmacéuticamente activo adicional se selecciona de, sin que sea limitado a, fármacos antiinflamatorios no esteroidales, corticosteroides, antimicóticos, antibióticos, y similares.

En otro aspecto, la presente invención provee de una composición farmacéutica de conformidad con la presente invención para el tratamiento de la enfermedad de Méniére, para atenuar uno o más de los síntomas seleccionados del grupo que consiste de tinnítus, EHL, vértigo episódico y pérdida de la audición; para atenuar la pérdida progresiva de la audición, para brindar neuroprotección a las células del ganglio espiral, para brindar neuroprotección a las células del ganglio vestibular, para prevenir la muerte celular apoptótica en las células del ganglio espiral, y para prevenir la muerte celular apoptótica en las células del ganglio vestibular.

Las composiciones para el suministro mejorado de las moléculas descritas en la presente incluyen la conjugación de moléculas de ARN de doble cadena con una molécula elegida como objetivo. El conjugado se forma usualmente a través de una unión covalente de la molécula elegida como objetivo con la cadena sentido del ARN de doble cadena, para no interrumpir la actividad de silenciamiento. Las moléculas elegidas como objetivo potenciales útiles en la presente invención, incluyen proteínas, péptidos y aptámeros, así como compuestos naturales tales como, por ejemplo, colesterol. Para anticuerpos elegidos como objetivo, se ha usado la conjugación con una proteína de fusión de protamina (véase, por ejemplo, Song et al., Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nat Biotechnol. 2005. 23(6): 709-17).

Se provee también de kits, contenedores y formulaciones que incluyen una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de siNA) como se provee en la presente, para reducir la expresión de CASP2, NOX3 o CAPNS1 para administrar o distribuir la molécula de ácido nucleico a un paciente. Un kit puede incluir por lo menos un contenedor y por lo menos una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los contenedores pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio, metal o plástico. Los kits pueden incluir además indicaciones y/o instrucciones asociadas; pueden incluirse también reactivos y otras composiciones o herramientas usadas para dicho propósito.

El contenedor puede contener en forma alternativa una composición que sea efectiva para tratar, diagnosticar, pronosticar o tratar profilácticamente una condición, y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón horadable por una aguja de inyección hipodérmica). Los agentes activos en la composición pueden ser una molécula de ácido nucleico capaz de unirse y/o de modular específicamente la función de CASP2, NOX3 y CAPNS1.

Un kit puede incluir además un segundo contenedor que incluya un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina regulada en su pH con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros reguladores de pH, diluyentes, filtros, agitadores, agujas, jeringas y/o inserciones del empaque con indicaciones y/o instrucciones para su uso.

Las ampolletas de dosificación unitaria o los contenedores de dosis múltiples, en los cuales las moléculas de ácido nucleico son empacadas antes de su uso, pueden incluir un contenedor herméticamente sellado que encierra una cantidad de ARNds o solución que contiene un ARNds adecuado para una dosis farmacéuticamente aceptable del mismo, o múltiplos de una dosis efectiva. El ARNds es empacado como una formulación estéril, y el contenedor herméticamente sellado es diseñado para preservar la esterilidad de la formulación hasta su uso.

El contenedor en el cual el ARNds que incluye una secuencia que codifica para un elemento de respuesta inmune celular o fragmento del mismo puede incluir un empaque que es etiquetado, y la etiqueta puede llevar una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental, por ejemplo, la Food and Drug Administration (FDA, Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos), cuya nota refleje la aprobación por la agencia bajo ley federal, o la fabricación, el uso o la venta del material de polinucleótido en la misma, para administración a humanos.

La ley federal requiere que el uso de las composiciones farmacéuticas en la terapia de humanos, sea aprobado por una agencia del gobierno federal. En los Estados Unidos, la ejecución es responsabilidad de la Food and Drug Administration, que emite regulaciones apropiadas para asegurar dicha aprobación, detallada en 21 U.S.C. § 301-392. La regulación para material biológico, incluyendo productos hechos de los tejidos de animales, se provee bajo 42 U.S.C. § 262. Una aprobación similar es requerida por la mayoría de los países extranjeros. Las regulaciones varían de país a país, pero los procedimientos individuales son bien conocidos por los expertos en la técnica, y las composiciones y métodos provistos en la presente cumplen de preferencia por consiguiente.

Administración Los métodos descritos en la presente incluyen la administración y dosificación de moléculas de acuerdo con la buena práctica médica, tomando en cuenta la condición clínica del paciente individual, la enfermedad que se va a tratar, el sitio y el método de administración, la planeación de la administración, y la edad, el sexo, el peso corporal y otros factores del paciente conocidos por los profesionales médicos.

Una "dosis terapéuticamente efectiva" o una "cantidad terapéuticamente efectiva", se refiere a una cantidad de una composición o compuesto farmacéutico la cual es efectiva para lograr una mejora en un sujeto o sus sistemas fisiológicos que incluyen, pero no están limitados a, tasa de supervivencia mejorada, recuperación más rápida, progreso suprimido de la enfermedad, o mejora o eliminación de los síntomas, y otros indicadores seleccionados como apropiados que determinan medidas por los expertos en la técnica.

Una "dosis terapéuticamente efectiva" o una "cantidad terapéuticamente efectiva" para propósitos en la presente, se determina de esta manera mediante dichas consideraciones como es bien sabido en la técnica. La dosis debe ser efectiva para lograr la mejora que incluye, pero no está limitada a, tasa de supervivencia mejorada o recuperación más rápida, o mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores que son seleccionados como medidas apropiadas por los expertos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en una dosis individual o en dosis múltiples.

La dosificación se determina, entre otras cosas, por la actividad del oligonucleótido, la indicación y la severidad del trastorno, y comprende administrar una dosis de aproximadamente 0.1 ng a aproximadamente 10 mg, aproximadamente 1 ng a aproximadamente 1 mg o aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 mg de oligonucleótido total, en un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. La concentración del compuesto de ARN de doble cadena en la composición está entre 0.1 mg/ml y 100 mg/ml, de preferencia entre 1 mg/ml y 100 mg/ml, y más preferiblemente entre 5 mg/ml y 20 mg/ml.

En algunas modalidades, la dosis activa del compuesto de oligonucleótido para humanos está en la escala de 1 ng/kg a aproximadamente 20-100 mg/kg de peso corporal por día, de preferencia de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 2-10 mg/kg de peso corporal por día, en un régimen de una sola dosis o dosis múltiples administradas en una dosis por día o dos veces o tres o más veces por día, por un período de 1 a 4 semanas o más tiempo, o incluso durante la vida del sujeto.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran al sujeto mediante cualquier modo de administración adecuado. Los modos de administración adecuados de las composiciones de oligonucleótidos de la invención, incluyen el modo de administración invasivo y no invasivo tal como, sin que sea limitado a, instilación (de gotas para los oídos), inyección, deposición o atomización en el oído. En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención se administran tópicamente en el conducto auditivo como gotas para los oídos, o se inyectan a través de una cánula en el conducto auditivo, o se inyectan a través de la membrana timpánica (inyección transtimpánica). En muchos casos, el modo de administración puede depender de muchos factores que incluyen, sin que sean limitados a, la naturaleza del oído afectado y la severidad de la enfermedad o condición o lesión que está siendo tratada, así como otras condiciones clínicas del sujeto individual.

En varias modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en una cantidad efectiva para proveer de un efecto protector o terapéutico. Ejemplos de efectos protectores o terapéuticos incluyen la inhibición de la expresión de la proteína objetivo o la expresión suprimida de por lo menos un gen objetivo. En ciertas modalidades, la expresión de por lo menos un gen objetivo que está siendo inhibida confiere en las células y/o tejidos propiedades neuroprotectoras.

Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en cualquier forma que permita que el/los ingrediente(s) activo(s) (es decir, por lo menos un compuesto de oligonucleótido) prevengan, supriman, mejoren o de otra manera traten las enfermedades y condiciones descritas en la presente. A manera de ejemplo no limitativo, las composiciones farmacéuticas pueden formularse como una crema, espuma, pasta, ungüento, emulsión, solución líquida, gel, rociadura, suspensión, microemulsión, microesferas, microcápsulas, nanoesferas, nanopartículas, vesículas de lípidos, liposomas, vesículas poliméricas, parches, inserciones biológicas, aerosol, material polimérico o tipo polimérico y/o cualquier otra forma conocida en la técnica, incluyendo cualquier forma adecuada para sistemas o dispositivos de suministro farmacéutico conocidos o novedosos, tales como un implante removible y/o absorbible, disoluble y/o degradable. Composiciones, soluciones o suspensiones farmacéuticas líquidas estériles pueden usarse invasivamente, por ejemplo, mediante inyección ¡ntravítrea o transtimpánica; o tópicamente, por ejemplo, mediante gota para los oídos, espuma para los oídos, rociadura, gel, crema o ungüento. Las composiciones líquidas incluyen soluciones acuosas, con y sin co-solventes orgánicos, suspensiones acuosas u oleosas, emulsiones, por ejemplo, con aceites comestibles, así como vehículos farmacéuticos similares.

Enfermedades v trastornos del oído Se describen en la presente métodos y kits útiles para la neuroprotección de las neuronas en el oído de un sujeto. Los métodos y kits son útiles para brindar neuroprotección a los ganglios espirales, atenuando o previniendo de esta manera disfunciones cocleares que incluyen pérdida progresiva de la audición y tinnitus. Las neuronas pueden ser protegidas de varios ataques que incluyen lesión o daño causado por trauma, isquemia, un agente químico (por ejemplo, una ototoxina), un agente infeccioso, una reacción inmunológica o un desequilibrio nutricional. En algunas modalidades, se provee en la presente de un método para reducir la pérdida de neuronas en un ganglio espiral y/o un ganglio vestibular de un sujeto que sufre de una enfermedad asociada con anormalidades o cambios patológicos en los tejidos del sistema auditivo y/o el sistema vestibular, que comprende administrar al oído del sujeto una dosis de un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds) que subregule la expresión de un gen CASP2, un gen NOX3, un gen CAPNS1 o un gen RHOA, para brindar de esta manera neuroprotección a las células del ganglio espiral y/o las células del ganglio vestibular en el oído del sujeto. En algunas modalidades, dicha administración da como resultado por lo menos 10% de disminución en la muerte de las células nerviosas en una población de células nerviosas, en comparación con una población control de células nerviosas. En varias modalidades, las anormalidades o cambios están particularmente asociados con las anormalidades/cambios patológicos de los tejidos del órgano auditivo, y/o las anormalidades/cambios patológicos de los tejidos de los órganos vestibulares, dichos cambios siendo, por ejemplo, degradación neuronal o muerte celular neuronal. En algunas modalidades, el compuesto de ARNds subregula el gen CASP2, y comprende una cadena sentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 8 y una cadena antisentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 9, de preferencia una cadena sentido expuesta en SEQ ID NO: 24 ó 26 y una cadena antisentido expuesta en SEQ ID NO: 25 ó 27.

En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente incluyen la prevención, el tratamiento o el alivio de los efectos de una enfermedad ótica asociada con las anormalidades/cambios patológicos en los tejidos del sistema auditivo y/o el sistema vestibular en un sujeto, que comprenden administrar al oído del sujeto una dosis de un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds), el cual subregula la expresión de un gen CASP2, un gen NOX3, un gen CAPNS1 o un gen RHOA, para brindar de esta manera neuroprotección a las células del ganglio espiral y/o las células del ganglio vestibular en el oído del sujeto. En algunas modalidades, dicha administración da como resultado por lo menos 10% de disminución en la muerte de las células nerviosas en una población de células nerviosas, en comparación con una población control de células nerviosas. En varias modalidades, las anormalidades o los cambios están particularmente asociados con las anormalidades/cambios patológicos de los tejidos del órgano auditivo y/o las anormalidades/cambios patológicos de los tejidos de los órganos vestibulares, dichos cambios siendo, por ejemplo, degradación neuronal o muerte celular neuronal. En algunas modalidades, el compuesto de ARNds subregula el gen CASP2, y comprende una cadena sentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 8 y una cadena antisentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 9, de preferencia una cadena sentido expuesta en SEQ ID NO: 24 ó 26 y una cadena antisentido expuesta en SEQ ID NO: 25 ó 27.

Por "ototoxina" en el contexto descrito en la presente, se entiende una sustancia que a través de su acción química lesiona, deteriora o inhibe la actividad de las neuronas relacionadas con la audición o el equilibrio, lo cual a su vez deteriora la audición y/o el equilibrio. Las ototoxinas incluyen fármacos terapéuticos que incluyen agentes antineoplásicos, salicilatos, diuréticos de asa, quininas y antibióticos de aminoglucósido, contaminantes en alimentos o medicinas, y contaminantes ambientales o industriales.

Por consiguiente, en un aspecto, se provee de métodos y kits para brindar neuroprotección a una neurona en el oído de un sujeto, de esta manera para prevenir, reducir o tratar un deterioro, trastorno o desequilibrio de la audición, por ejemplo, un deterioro, trastorno o desequilibrio de la audición inducido por una ototoxina, administrando al sujeto un ARNds como se describe en la presente.

Los antibióticos de aminoglucósido ototóxicos incluyen, pero no están limitados a, neomicina, paromomicina, ribostamicina, lividomicina, kanamicina, amikacina, tobramicina, viomicina, gentamicina, sisomicina, netilmicina, estreptomicina, dibekacina, fortimicina y dihidroestreptomicina, o combinaciones de los mismos. Antibióticos particulares incluyen neomicina B, kanamicina A, kanamicina B, gentamicina C1 , gentamicina C1a y gentamicina C2 y similares, que son conocidos por tener toxicidad seria, en particular ototoxicidad y nefrotoxicidad, los cuales reducen la utilidad de dichos agentes antimicrobianos.

La ototoxicidad es también un efecto secundario serio limitativo de la dosis para los agentes anti-cáncer. Agentes neoplásicos ototóxicos incluyen, pero no están limitados a, vincristina, vinblastina, cisplatino y compuestos tipo cisplatino y taxol y compuestos tipo taxol. Los compuestos tipo cisplatino incluyen carboplatino (Paraplatin ®), tetraplatino, oxaliplatino, aroplatino y transplatino, entre otros, y son agentes quimioterapéuticos basados en platino.

Los diuréticos con efecto secundario ototóxico conocido, en particular los diuréticos de "asa" incluyen, sin que estén limitados a, furosemida, ácido etacrílico y mercuriales.

Las quininas ototóxicas incluyen, pero no están limitadas a, sustitutos sintéticos de quinina que se usan típicamente en el tratamiento de la malaria. En algunas modalidades, el trastorno de la audición es un efecto secundario de los inhibidores de tipo 5-fosfodiesterasa (PDE-5), incluyendo sildenafil (Viagra®), vardenafil (Levitra®) y tadalafil (Cialis).

Los salicilatos, tales como la aspirina, tienen efectos secundarios ototóxicos que incluyen tinnitus ("zumbido en los oídos") y pérdida temporal de la audición. Además, si el fármaco se usa a altas dosis por un tiempo prolongado, el deterioro de la audición puede volverse persistente e irreversible.

Además, en la presente se describen métodos y kits útiles para brindar neuroprotección a las neuronas del oído, en donde las neuronas son dañadas por trauma mecánico o físico.

En varias modalidades, se provee en la presente un método para la neuroprotección de un ganglio vestibular en el oído de un sujeto. Los métodos y kits son útiles para brindar neuroprotección a los ganglios vestibulares, atenuando o previniendo de esta manera disfunciones vestibulares que incluyen, pero no están limitadas a, náusea, pérdida del equilibrio o vértigo. El sistema sensitivo vestibular en la mayoría de los mamíferos, incluyendo humanos, contribuye al equilibrio, y a un sentido de orientación espacial y estabilidad.

Enfermedad de Méniére La enfermedad de Méniére, conocida también como hidroplesía endolinfática idiopática (ELH), es un trastorno del oído interno que da como resultado vértigo y tinnitus, y daño neuronal final que lleva a pérdida de la audición. La causa de la enfermedad de Méniére continúa siendo incierta. Se caracteriza por disfunción cocleovestibular y por hidroplesía endolinfática (examen post-mortem). Los signos primarios y síntomas de la enfermedad de Méniére son: a) Vértigo episódico. Los episodios de vértigo ocurren típicamente sin aviso, y usualmente duran de aproximadamente 20 minutos a dos horas o más, hasta 24 horas. El vértigo severo puede causar náusea y vómito. b) Pérdida de la audición. La pérdida de la audición en la enfermedad de Méniére puede fluctuar, en particular tempranamente en el curso de la enfermedad. Finalmente, la mayoría de las personas experimentan cierto grado de pérdida de la audición permanente. La pérdida de la audición puede ser unilateral o bilateral. c) Tinnitus. El tinnitus es la percepción de un sonido de tintineo, zumbido, rugido, silbido o siseo en el oído. Con la enfermedad de Méniére, el tinnitus es con frecuencia de tono grave. d) Llenura aural. La llenura aural es la sensación de llenura o presión en el oído.

Sin que se desee que sea limitado por la teoría, se acepta generalmente que las células pilosas cocleares y las células pilosas vestibulares mueren en los pacientes con enfermedad de Méniére, causando de esta manera pérdida de la audición. Las células pilosas son los receptores sensitivos localizados dentro del oído interno. Las células pilosas auditivas se localizan en el órgano de Corti de la cóclea, y están implicadas en la detección de sonidos y la conversión del sonido en señales eléctricas que son enviadas por medio de fibras nerviosas hacia el cerebro. Las células pilosas vestibulares se localizan en los órganos vestibulares (del equilibrio) del oído interno (utrículo, sáculo, ampollas). Detectan cambios en la posición de la cabeza y envían señales hacia el cerebro para ayudar a mantener la postura del cuerpo, la posición de los ojos y el equilibrio. En ausencia de células pilosas auditivas o vestibulares, la energía derivada de las ondas sonoras o la gravedad no es convertida en señales neurales, y sobrevienen deficiencias de la audición o el equilibrio.

En modalidades preferidas, el sujeto que está siendo tratado es un animal de sangre caliente, y en particular un mamífero, y de preferencia un humano.

El término "tratar a un sujeto" se refiere a administrar al sujeto una sustancia terapéutica efectiva para aliviar o atenuar los síntomas asociados con una enfermedad o condición, para retardar el inicio de la enfermedad, para retardar la progresión de la enfermedad, para disminuir la severidad o curar la enfermedad, o para prevenir que ocurra la enfermedad. El término "tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir un trastorno, retardar el progreso de una enfermedad o reducir los síntomas de un trastorno. Quienes necesitan de tratamiento, incluyen a aquéllos que experimentan ya la enfermedad o condición, aquéllos en riesgo de o propensos a que tengan la enfermedad o condición, y aquéllos en los cuales la enfermedad o condición va a ser prevenida. Las composiciones de la invención se administran antes, durante o después del inicio de la enfermedad de Méniére.

Se provee en la presente de un método para reducir la pérdida de células neuronales en un ganglio espiral y/o un ganglio vestibular de un sujeto que sufre de una enfermedad asociada con anormalidades patológicas en el sistema auditivo y/o el sistema vestibular, que comprende administrar al oído del sujeto una dosis de un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds), el cual subregula la expresión de un gen CASP2, en donde el gen codifica para un ARNm expuesto en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, para brindar de esta manera neuroprotección a las células del ganglio espiral y/o las células del ganglio vestibular en el oído del sujeto. En modalidades preferidas, el compuesto de ARNds comprende una cadena sentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y una cadena antisentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 9.

Terapia de combinación Los métodos para tratar la enfermedad de Méniére y enfermedades y trastornos relacionados como se describe en la presente, incluyen administrar un compuesto de ARN de doble cadena dirigido hacia el gen CASP2. Se describen además terapias de combinación que comprenden tratamientos conocidos para tratar a un sujeto que sufre de, es afectado por, o es susceptible a, la enfermedad de Méniére, en conjunto con las composiciones farmacéuticas novedosas, y las terapias descritas en la presente se consideran como parte de la presente invención.

Por el término "en conjunto con" o "en combinación con", se entiende que el compuesto farmacéuticamente efectivo adicional se administra antes de, al mismo tiempo que, o posteriormente a, la administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los componentes individuales de dicha combinación referidos anteriormente, por lo tanto, se administran ya sea secuencialmente o simultáneamente con las mismas formulaciones farmacéuticas o formulaciones farmacéuticas separadas. Un segundo agente terapéutico se administra mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante la administración ocular, ótica, oral, bucal, por inhalación, sublingual, rectal, vaginal, transuretral, nasal, tópica, percutánea (es decir, transdérmica) o parenteral (incluyendo intravenosa, intramuscular, subcutánea e intracoronaria).

En algunas modalidades, la molécula descrita en la presente y el segundo agente terapéutico/composición se administran mediante la misma vía, ya sea provistos en una sola composición o como dos o más composiciones farmacéuticas diferentes. Sin embargo, en otras modalidades, es posible o preferida una vía de administración diferente para las composiciones farmacéuticas novedosas de la invención y el segundo agente/composición terapéutico. Los expertos en la técnica están al tanto de los mejores modos de administración para cada agente terapéutico, ya sea solo o en combinación.

La invención se ha descrito en una manera ilustrativa, y se entenderá que se pretende que la terminología usada esté en la naturaleza de términos de descripción más que de limitación.

Muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, se entenderá que dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede ponerse en práctica de otra manera de la que se describe específicamente.

A lo largo de esta solicitud, varias publicaciones, incluyendo patentes de los Estados Unidos, son referidas por autor y año, y las patentes por número. Las descripciones de estas publicaciones y patentes y solicitudes de patente se incorporan de esta manera en su totalidad en la presente como referencia en esta solicitud, para describir más enteramente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

La presente invención se ilustra en detalle a continuación con relación a ejemplos, pero no se considerará que se limita a los mismos.

No se pretende que la cita de cualquier documento en la presente sea una admisión de que dicho documento es técnica anterior pertinente, o material considerado para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier afirmación respecto al contenido o una fecha de cualquier documento se basa en la información disponible para el solicitante al momento de la presentación, y no constituye una admisión respecto a la rectitud de dicha afirmación.

EJEMPLOS Sin más elaboración, se cree que el experto en la técnica puede utilizar, usando la descripción anterior, la presente invención hasta su grado más amplio. Las siguientes modalidades específicas preferidas se considerarán, por lo tanto, meramente como ilustrativas, y de ninguna manera limitativas de la invención reclamada.

Métodos generales - Biología molecular e inmunoensavos Los protocolos estándar de biología molecular conocidos en la técnica no descritos específicamente en la presente, se siguen generalmente esencialmente como en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New-York (1989, 1992), y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Mariland (1988), y como en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Mariland (1989) y como en Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), y como en Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York y en Birren et al. (eds.) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) y la metodología como se expone en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801 ,531 ; 5,192,659 y 5,272,057, e incorporadas en la presente como referencia. Se llevó a cabo reacción en cadena de polimerasa (PCR) como se discute en PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990). Puede usarse PCR in situ en combinación con citometría de flujo (FACS) para la detección de células que contienen secuencias específicas de ADN y ARNm (Testoni et al., Blood 1996, 87: 3822). Los métodos para llevar a cabo la qPCR y la RT-PCR, son bien conocidos en la técnica.

Los protocolos estándar de síntesis orgánica conocidos en la técnica no descritos específicamente en la presente, se siguen generalmente esencialmente como en Organic syntheses: Vol.1-79, en donde los editores varían, J. Wiley, New York, (1941 - 2003); así como en Gewert et al., Organic synthesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim (2000); y Smith y March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-lnterscience; 5a. edición (2001).

Los métodos estándar de química medicinal conocidos en la técnica no descritos específicamente en la presente, se siguen generalmente esencialmente como en la serie "Comprehensive Medicinal Chemjstry", por varios autores y editores, publicada por Pergamon Press.

En general, la ELISA es un inmunoensayo preferido. Las pruebas de ELISA son bien conocidas por los expertos en la técnica. Pueden usarse anticuerpos tanto monoclonales como policlonales en las pruebas. En donde sea apropiado, pueden usarse otros inmunoensayos tales como los radioinmunoensayos (RIA), como son conocidos por los expertos en la técnica. Los inmunoensayos disponibles se describen extensivamente en la literatura científica y de patentes. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 3,791 ,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901 ,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011 ,771 y 5,281 ,521 , así como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, New York, 1989.

Actividad de ARNsi Las secuencias sentido y antisentido útiles para generar ARNds activo y terapéuticamente útil, se generan usando un algoritmo patentado o un algoritmo conocido en la técnica.

En general, aproximadamente 1.5-2x105 células puestas a prueba (células HeLa y/o células 293T para ARNsi que eligen como objetivo genes humanos y células NRK52 (células de los túbulos proximales de riñon de rata normales) y/o células NMuMG (línea de células epiteliales mamarias de ratón) para ARNsi que elige como objetivo al gen de rata/ratón)), se siembran por cavidad en placas de 6 cavidades (70 a 80% confluentes).

Aproximadamente 24 horas después, las células son transfectadas con compuestos de ARNsi usando el reactivo Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) a concentraciones finales de 5 nM ó 20 nM. Las células se incuban a 37°C en una incubadora de C02 por 72 horas.

Como control positivo para la transfeccion, se usan compuestos de ARNsi marcados con PTEN-Cy3. Varios compuestos de ARNsi químicamente modificados se ponen a prueba para actividad. Compuestos de ARNsi de GFP se usan como control negativo para la actividad del ARNsi.

A 72 horas después de la transfeccion, las células se cosechan, y se extrae el ARN de las mismas. La eficiencia de la transfeccion se pone a prueba mediante microscopía fluorescente.

El porcentaje de inhibición de la expresión génica usando estructuras de ARNsi preferidas específicas, se determina usando el análisis qPCR del gen Casp2 en células que expresan el gen endógeno.

En general, las moléculas de ARNsi que tienen secuencias específicas que se seleccionan para la prueba in vitro son específicas para la especie humana y una segunda especie tal como genes de primate no humano, rata o conejo.

Experimentos de estabilidad en suero Los compuestos de ARNsi químicamente modificados de conformidad con la presente invención se ponen a prueba para estabilidad del dúplex en suero humano, como sigue: Moléculas de ARNsi a una concentración final de 7 µ? se incuban a 37°C en suero humano a 100% (Sigma, No. de catálogo H4522) (provisión de ARNsi 100 µ? diluido en suero humano a una relación de 1 :14.29).

Se añaden 5 µ? a 15 µ? de 1.5x regulador de pH de carga de TBE en diferentes puntos de tiempo (0, 30 min, 1h, 3h, 6h, 8h, 10h, 16h y 24h). Las muestras se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido y se mantienen a -20°C.

Cada muestra se carga sobre un gel de acrilamida a 20% no desnaturalizante, preparado de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Los oligómeros se visualizan con bromuro de etidio bajo luz UV.

EJEMPLO 1 Expresión de CASP2 en el oído interno de ratón El modelo genético de murino Phexhyp"Duk imita los síntomas de la enfermedad de Méniére en humanos, incluyendo la hidroplesía endolinfática (ELH) y la pérdida progresiva de la audición. Este modelo se detalla en Megerian et al. ("A mouse model with postnatal endolymphatic hydrops and hearing loss", Hearing Res 2008; 237(1-2): 90-105), cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia. Inmediatamente después del nacimiento, los ratones mutantes desarrollan espontáneamente ELH acompañada de deterioro de la función vestibular, seguida de apoptosis de las neuronas en los ganglios vestibulares y espirales. Por último, las células sensitivas en los compartimientos vestibular y coclear se degeneran, y ocurre pérdida progresiva de la audición y deterioro del equilibrio.

La expresión de CASP2 en el oído interno de ratón se evaluó en ratones Phexhyp~Duk y de tipo silvestre. El nivel de la proteína Casp2 se evaluó cualitativamente en dos experimentos individuales que incluyeron ratones machos mutantes Phexhyp"Duk y de tipo silvestre de tres semanas, dos meses y tres meses. Los oídos internos de los ratones fueron disectados, fijados, incluidos en parafina y seccionados para obtener cortes con representación del compartimiento auditivo y vestibular, así como del ganglio espiral. Los cortes se usaron para evaluación histológica. Tres cortes por oído se usaron para el análisis de la hibridación in situ de la distribución del ARNds en el oído interno. Se evaluó la expresión de la proteína Casp2 mediante la inmunohistoquímica de los cortes usando el anticuerpo de Casp2 (Santa Cruz, SC-623), y las señales de HRP se amplificaron con el sistema de amplificación Tyramid (TSA™, PerkinElmer).

Células positivas para Casp2 se observaron en todas las muestras, específicamente con la tinción del órgano de Corti (OC) en las células pilosas, el ganglio espiral (SG), el nervio coclear y el epitelio sensitivo vestibular (mácula). Además, en algunas muestras ocurrió tinción no específica en las lagunas óseas (probablemente la médula ósea) y en los vasos sanguíneos (células endoteliales). No se observaron diferencias entre el mutante y el tipo silvestre en los niveles de la proteína precursora de Casp2, a las edades puestas a prueba. Los resultados de la tinción se dan en la presente a continuación en el cuadro 1.

CUADRO 1 Patrón de expresión de CASP2 en los oídos internos de ratones EJEMPLO 2 Evaluación del suministro de ARNsi hacia el oído interno de ratón y eficacia de cuatro moléculas de ARNsi en los ratones Phexhyp"Duk/Y. un modelo de enfermedad de Méniére Objetivo: Un modelo de ratón de enfermedad de Méniére (MD), se usó para evaluar la seguridad y los efectos terapéuticos potenciales de varias moléculas de ARNds para el silenciamiento de cuatro genes objetivo.

El modelo genético de murino Phexhyp"Duk imita los síntomas de la enfermedad de Méniére en humanos, incluyendo la hidroplesía endolinfática (ELH) y la pérdida progresiva de la audición. Este modelo se detalla en Megerian et al. ("A mouse model with postnatal endolymphatic hydrops and hearing loss", Hearing Res 2008; 237(1-2): 90-105), cita incorporada de esta manera en su totalidad en la presente como referencia.

La evaluación de la seguridad y los efectos terapéuticos del ARNds en el oído interno, se llevó a cabo mediante los siguientes aspectos: - Evaluación del estado de desempeño ecográfico.

- Evaluación de secciones histológicas del oído interno.

- Evaluación de la función (bilateral) del oído interno.

- Pruebas de audición no invasivas.

- Respuesta auditiva evocada por el tallo cerebral (ABR) al clic, 8, 16 y 32 Hz.

- Emisiones otoacústicas de distorsión del producto (DPOAE) -amplitudes a 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 kHz.

- Pruebas no invasivas de la función vestibular.

- Potencial miogénico vestibular evocado.

El estudio se llevó a cabo en dos etapas: Estudio 1. Estudio piloto de seguridad y de suministro de ARNds hacia el oído interno en ratones normales de tipo silvestre.

Estudio 2. Evaluación del efecto terapéutico de moléculas de ARNds que eligen como objetivo cuatro genes diferentes en ratones Phexhyp" Dul7Y machos.

Objetivos de estudio 1: Suministro no invasivo al oído interno usando gotas para los oídos y evaluación de la seguridad de administraciones múltiples de ARNDs al oído interno en ratones.

Estudio 1: El diseño del estudio se muestra en el cuadro 2 y en la figura 2.

CUADRO 2 Diseño del estudio 1 *P = días postnatales, es decir, P15 se refiere a 15 días postnatales.

ARNds o vehículo se suministró sobre una base semanal a 7 grupos de 3 ratones cada uno partiendo de P15. Se llevaron a cabo pruebas funcionales en el día antes de la última administración del artículo de prueba o control y antes de su administración. La administración de las moléculas de ARNds requiere de la inmovilización del animal (anestesia) por 40 a 60 minutos. Por lo tanto, se llevó a cabo la optimización del plan de desempeño de las pruebas funcionales que requieren anestesia. Las pruebas funcionales en ratones no tratados intactos de la misma edad, sirvieron como control en la línea de base.

La figura 3 muestra que el tratamiento semanal con gotas para los oídos de vehículo o ARNds al oído interno de los ratones de tipo silvestre no afecta la función auditiva, según se evalúa mediante los umbrales de la ABR. Para cada medición en KHz, los resultados para los animales tratados con ARNsi están a la izquierda, para los animales no tratados están al centro, y para los animales tratados con vehículo están a la derecha.

Estudio 2: Efecto terapéutico de la evaluación piloto de cuatro moléculas de ARNds que eligen como objetivo cuatro genes diferentes, CASP2, NOX3, CAPNS1 y RHOA, en ratones Phexhyp"Duk/Y machos.

Objetivos de estudio: Evaluación de la eficacia de las moléculas de prueba de ARNds en el modelo genético de ratón de la enfermedad de Méniére usando una evaluación funcional e histológica.

Estudio 2: El diseño del estudio se muestra en el cuadro 3 y en las figuras 4A y 4B. La figura 4A muestra la línea de tiempo aproximada de eventos en el oído interno de ratones Phexhyp"Duk/Y. La línea de puntos indica el inicio del fenotipo, es decir, pérdida leve de la audición (HL), signos de hidroplesía endolinfática (ELH), degeneración de las células del ganglio espiral (SGC) o degeneración de las células pilosas, con cierta variabilidad entre los animales al inicio, en la apariencia y la severidad. La línea continua que sigue a la línea de puntos indica que el fenotipo se establece con la edad (de Hear Res., marzo de 2008; 237(1-2): 90-105).

CUADRO 3 Diseño dei estudio 2 Se suministró ARNds o vehículo sobre una base semanal a 6 grupos de 12 ratones cada uno partiendo de P15 y hasta P63. Se llevaron a cabo pruebas funcionales semanalmente en el día de prueba o la administración de artículos control y antes de su administración. La administración del ARNds requiere la inmovilización del animal (anestesia) por 40 a 60 minutos. Se llevó a cabo la optimización del plan de desempeño de la prueba funcional que requiere anestesia. Las pruebas funcionales en los ratones no tratados intactos de la misma edad, sirvieron como control en la línea de base.

Se agregaron animales a los grupos de estudio en incrementos en el curso de la expansión de la colonia.

Se llevaron a cabo análisis estadísticos para comparar los resultados de las pruebas auditivas, vestibulares y conductuales, entre los ratones PhexHyp Dul7Y control y tratados de igual edad. Se consideró a P<0.05 como una diferencia significativa.

Tras la terminación, los oídos internos de los ratones fueron disectados, fijados, incluidos en parafina y seccionados para tener una representación del compartimiento auditivo y vestibular, así como del ganglio espiral. Los cortes se usaron para la evaluación histológica de la morfología del oído interno. El compuesto de ARNds CASP2 (ARNsi CASP2, designado como SÍCASP2, QPI1007 ó 1007) que se usó en la preparación de la composición farmacéutica usada en este estudio, es un dúplex de extremos rasurados de 19 nucleótidos que tiene dos cadenas separadas, con una cadena antisentido (AS, cadena guía) que comprende ribonucleótidos no modificados en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras mayúsculas), y ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11 , 13, 15, 17 y 19 (letras minúsculas); y una cadena sentido (SEN, cadena pasajera) que comprende ribonucleótidos no modificados y un L-desoxirribonucleótido en la posición 18 (en negritas, subrayado), y una porción desoxirriboabásica invertida (iB) en el extremo 5', según se muestra a continuación: SEN 5' iB-GCCAGAAUGUGGAACUCCU 3' (SEQ ID NO: 26) AS 3' cGgUcUuAcACcUuGaGgA 5' (SEQ ID NO: 27) El compuesto de ARNds NOX3 (siNOX3_4) es un dúplex de extremos rasurados de 19 nucleótidos (humano, ratón, especie cruzada de rata) que tiene dos cadenas separadas, con una cadena antisentido (AS, cadena guía) que comprende ribonucleótidos no modificados en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras mayúsculas), y ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 (letras minúsculas); y una cadena sentido (SS, cadena pasajera) que comprende ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras minúsculas), y ribonucleótidos no modificados en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 y 19 (letras mayúsculas). El extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 3' de la cadena antisentido, están no fosforilados.

SÍNOX3-4 5' UcCuGgAaCuUcAcAuGaA 3' SS (SEQ ID NO: 10) 3' aGgAcCuügAaGuGuAcUu 5' AS (SEQ ID NO: 11) El compuesto de ARNds CAPNS1 (s¡CAPNS1_ 3) es un dúplex de extremos rasurados de 19 nucleótidos que tiene dos cadenas separadas, con una cadena antisentido (AS, cadena guía) que comprende ribonucleótidos no modificados en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras mayúsculas), y ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17 y 19 (letras minúsculas); y una cadena sentido (SS, cadena pasajera) que comprende ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras minúsculas), y ribonucleótidos no modificados en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 y 19 (letras mayúsculas). siCAPNS1_13 5' GcUaCaGaAcUcAuGaAuA 3' SS (SEQ ID NO: 12) 3' cGaUgUcUuGaGuAcüuAu 5' AS (SEQ ID NO: 13) El compuesto de ARNds RHOA (s¡RHOA_4) es un dúplex de extremos rasurados de 19 nucleótidos que tiene dos cadenas separadas, con una cadena antisentido (AS, cadena guía) que comprende ribonucleótidos no modificados en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras mayúsculas), y ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 y 19 (letras minúsculas); y una cadena sentido (SS, cadena pasajera) que comprende ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras minúsculas), y ribonucleótidos no modificados en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 y 19 (letras mayúsculas). siRHOA_4 5' GcCaCuUaAuGuAuGuüaC 3' SS (SEQ ID NO: 14) 3' cGgügAaüuAcAuAcAaUg 5' AS (SEQ ID NO: 15) El compuesto de ARNds control de EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) (siEGFP_5) es un dúplex de extremos rasurados de 19 nucleótidos que tiene dos cadenas separadas, con una cadena antisentido (AS, cadena guía) que comprende ribonucleótidos no modificados en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras mayúsculas), y ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 (letras minúsculas); y una cadena sentido (SS, cadena pasajera) que comprende ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMe en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 (letras minúsculas), y ribonucleótidos no modificados en las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 y 19 (letras mayúsculas). siEGFP_5 5' GgCuAcGuCcAgGaGcGcAcC 3' SS (SEQ ID NO: 16) 3' cCgAuGcAgGuCcUcGcGuGg 5' AS (SEQ ID NO: 17) Resultados y conclusiones Resultados de la prueba funcional de la ABR: Los ratones Phexhyp"Dul7Y exhiben pérdida significativa de la audición a todas las frecuencias. La mayor pérdida de la función auditiva ocurre antes de P29, cuando las mediciones sistemáticas comenzaron y hubo una tendencia para más deterioro en los grupos control negativos, pero no en los grupos tratados con ARNsi. Ya en P29, la función auditiva en los ratones tratados con ARNsi (2 tratamientos en P15 y P22) parece ser significativamente mejor que en los ratones tratados con vehículo a todas las frecuencias, y esta diferencia a favor de los ratones tratados con ARNsi se hizo más profunda con el tiempo. Partiendo de P70, la función auditiva a 16 a 32 kHz llegó a ser significativamente mejor en todos los grupos tratados con ARNsi, en comparación con los animales tratados con siEGFP. Los resultados de la ABR en el día P90 se muestran en la figura 5E. En todas las figuras 5A a 5D, una línea de puntos con cuadros claros representa el vehículo; la línea de trazos cortos con triángulos claros representa a los animales tratados con SÍCASP2; la línea de trazos medios con el signo más ("+") representa a los animales tratados con siEGFP; la línea de trazos medios con círculos oscuros representa a los animales tratados con siEGFP; la línea de trazos largos con estrellas representa a los animales tratados con siRHOA; y una línea continua con círculos claros representa a los animales tratados con siCAPNSL El eje x provee de días de prueba semanales de P29 a P90, y el eje y provee de lecturas de dB de la prueba de la ABR. El eje y está a una escala diferente en las cuatro pruebas. El clic es -75-87.5 dB, 8 KHz es -60-80, 16 KHz es -40-70, y 32 KHz es -55-75.

La figura 5E muestra la mejora en la ABR en el día P90 en los animales tratados con los compuestos de prueba. No existe diferencia estadísticamente significativa entre el vehículo y siEGFP. ABR para los ratones normales al clic: 55dB; a 8 kHz: 40 dB; 16 kHz: 35 dB, a 32 kHz 40 dB.

Conclusiones: Los ratones Phexh p"Duk/Y mostraron protección de la función auditiva en los grupos tratados con SÍCASP2, siCAPNSI , siNOX3 siRHOA. La histología verificó la neuroprotección de las neuronas de los ganglios espirales y los ganglios vestibulares.

Resultados de la tinción histológica: El análisis histológico de las secciones del oído interno preparadas de todos los ratones a la terminación del estudio, demostró preservación sustancial y significativa de las células de los ganglios espiral y vestibular en los ratones tratados con ARNsi, en comparación con los controles. El fenotipo de ELH (hidroplesía endolinfática), típico para este modelo, no fue influenciado por el tratamiento con ARNsi. Como era de esperarse, en esta etapa de la enfermedad (P90), no se observaron cambios en los epitelios sensitivos en todos los grupos de estudio. Las células del ganglio espiral y las células del ganglio vestibular mostraron protección significativa ante la muerte apoptótica en los oídos de los ratones Phexhyp'Duk/Y tratados con ARNds, en comparación con el grupo tratado con vehículo. Compárense las figuras 6B con 6A, 6D con 6C y 6F con 6E. El color negro (tejido deformado) muestra regiones de muerte celular de los ganglios en la figura 6A, y regiones de ganglios densos en la figura 6B. Las células pilosas cocleares y las células pilosas vestibulares parecen ser no afectadas en el modelo, y el tratamiento con SÍCASP2 no produjo efectos adicionales en comparación con el control. Se obtuvieron resultados similares con los animales tratados con siCAPNSI , siNOX3 y siRHOA. La figura 7A muestra células de los ganglios en el ápice coclear de los ratones mutantes Phexhyp"Duk tratados con vehículo (panel de la izquierda) o tratados con siEGFP (panel de la derecha). Las figuras 7B, 7C y 7D muestran células de los ganglios en el ápice coclear de los animales tratados con siCAPNSI , s¡NOX3 y siRHOA, respectivamente. Todos los aumentos son a 63x. La figura 8A muestra células de los ganglios vestibulares de los ratones machos mutantes Phexhy "Duk tratados con vehículo (panel de la izquierda) o tratados con siEGFP (panel de la derecha). Las figuras 8B, 8C y 8D muestran células de los ganglios vestibulares en los animales tratados con siCAPNSI , siNOX3 y siRHOA, respectivamente. Todos los aumentos son a 63x. La supervivencia de las células de los ganglios espirales es un factor crítico en la preservación de la audición.

El suministro de ARNds en este estudio, en ratones, se logró mediante la aplicación de gotas para los oídos. En un ambiente clínico, la inyección transtimpánica de fármacos es clínicamente de rutina, y el uso de gotas para los oídos para el suministro de ARNds es posible. Además, el ARNds usado en los estudios descritos en la presente son meramente ejemplos no limitativos de ARNds que subregula a CASP2, NOX3, CAPNS1 y RHOA, y las especies de ARNds que tienen diferentes secuencias y estructuras que son activas en la subregulación de sus genes respectivos, son útiles en la práctica de los métodos y kits descritos en la presente.

La invención se ha descrito ampliamente y genéricamente en la presente. Cada una de las especies y agrupaciones subgenéricas más estrechas que están dentro de la descripción genérica, forman también parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que remueve cualquier materia en cuestión del género, sin tener en cuenta de si el material removido se cita específicamente en la presente o no. Otras modalidades están dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims (71)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds), el cual subregula la expresión de un gen CASP2 que codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, para su uso en la neuroprotección de una neurona en el oído de un sujeto que necesita del mismo.

2.- Un método para brindar neuroprotección a una neurona en el oído de un sujeto que necesita del mismo, que comprende administrar al oído del sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds) el cual subregula la expresión de un gen CASP2, en donde el gen CASP2 codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, para brindar de esta manera neuroprotección a la neurona en el oído del sujeto.

3.- El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque el compuesto de ARNds comprende una cadena sentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y una cadena antisentido con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 9.

4. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque la neurona es, o está comprendida dentro de, un ganglio.

5. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el ganglio es un ganglio espiral o un ganglio vestibular.

6. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la neuroprotección comprende proteger a la neurona de la muerte celular.

7.- El uso o el método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona comprende muerte celular apoptótica.

8. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona está asociada con uno o más de una enfermedad o trastorno, isquemia, trauma físico/mecánico, un agente químico, un agente infeccioso, una reacción inmunológica y un desequilibrio nutricional.

9. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona está asociada con una enfermedad o trastorno.

10. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque el sujeto tiene o está en riesgo de que desarrolle una o más de una enfermedad o condición asociada con anormalidades patológicas de un órgano auditivo o de un órgano vestibular.

11. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la enfermedad o condición está asociada con un síntoma seleccionado del grupo que consiste de vértigo episódico, pérdida de la audición, tinnitus y llenura aural.

12. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el sujeto es afligido con o es susceptible a, la enfermedad de Méniére.

13. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque la neuroprotección comprende restauración de la función coclear y/o de la función vestibular.

14. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado además porque el compuesto de ARNds subregula la expresión de CASP2 en una célula en el oído interno del sujeto.

15. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque el compuesto de ARNds tiene la estructura: 5' z"-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z' 3' (cadena sentido, SEQ ID NO: 24) 3' Z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5' (cadena antisentido, SEQ ID NO: 25) en donde cada uno de A, C, U y G es un ribonucleótido modificado o no modificado o una porción no convencional, y cada ribonucleótido consecutivo o porción no convencional se une al siguiente ribonucleótido o porción no convencional mediante un enlace fosfodiéster; en donde la cadena sentido comprende, contando desde el extremo 5', un ribonucleótido no modificado en las posiciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 19, una L-desoxicitidina en la posición 18; en donde la cadena antisentido comprende por lo menos cinco ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'-0-metilo y no modificados alternativos; y en donde z", Z y Z' son opcionales.

16. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el enlace covalente es un enlace fosfodiéster; en donde cada uno de Z y Z' está ausente, en donde la cadena sentido comprende, contando desde el extremo 5', un ribonucleótido no modificado en las posiciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 19, una L-desoxicitidina en la posición 18 (expuesta en SEQ ID NO: 24); y en donde la cadena antisentido comprende, contando desde el extremo 5', un ribonucleótido modificado con el azúcar 2'O-metilo en cada una de las posiciones 2, 4, 6, 8, 11 , 3, 15, 17 y 19 y un ribonucleótido no modificado en cada una de las posiciones 1 , 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16 y 18 (expuesta en SEQ ID NO: 25).

17. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque z" está unido covalentemente al extremo 5' de la cadena sentido (SEQ ID NO. 26), y comprende una porción desoxiabásica invertida.

18. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado además porque la molécula de ARNds se formula para administración transtimpánica.

19. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la molécula de ARNds se formula como gotas para los oídos.

20. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque el sujeto es un mamífero.

21.- El uso o el método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el sujeto es un humano.

22. - Un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds), el cual subregula la expresión de un gen CAPNS1 que codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 5-6, para su uso en la neuroprotección de una neurona en el oído de un sujeto que necesita del mismo.

23. - Un método para brindar neuroprotección a una neurona en el oído de un sujeto que necesita del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de ARN de doble cadena (ARNds) el cual subregula la expresión de un gen CAPNS1 , en donde el gen CAPNS1 codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 5-6, para brindar de esta manera neuroprotección a la neurona en el oído del sujeto.

24. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizado además porque la neurona es, o está comprendida dentro de, un ganglio.

25. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el ganglio es un ganglio espiral o un ganglio vestibular.

26. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizado además porque la neuroprotección comprende proteger a la neurona de la muerte celular.

27.- El uso o el método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona comprende muerte celular apoptótica.

28. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 26 ó 27, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona está asociada con uno o más de una enfermedad o trastorno, isquemia, trauma físico/mecánico, un agente químico, un agente infeccioso, una reacción inmunológica y un desequilibrio nutricional.

29. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona está asociada con una enfermedad o trastorno.

30. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizado además porque el sujeto tiene o está en riesgo de que desarrolle, una o más de una enfermedad o condición asociada con anormalidades patológicas de un órgano auditivo o de un órgano vestibular.

31. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la enfermedad o condición está asociada con un síntoma seleccionado del grupo que consiste de vértigo episódico, pérdida de la audición, tinnitus y llenura aural.

32. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el sujeto es afligido con o es susceptible a, la enfermedad de Méniére.

33.- El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizado además porque la neuroprotección comprende la restauración parcial o completa de la función coclear y/o de la función vestibular.

34. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 33, caracterizado además porque el compuesto de ARNds subregula la expresión de CAPNS1 en una célula en el oído interno del sujeto.

35. - Un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds), el cual subregula la expresión de un gen NOX3 que codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 4, para su uso en la neuroprotección de una neurona en el oído de un sujeto que necesita del mismo.

36. - Un método para brindar neuroprotección a una neurona en el oído de un sujeto que necesita del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de ARN de doble cadena (ARNds) el cual subregula la expresión de un gen NOX3, en donde el gen NOX3 codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 4, para brindar de esta manera neuroprotección a la neurona en el oído del sujeto.

37. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizado además porque la neurona es, o está comprendida dentro de, un ganglio.

38. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el ganglio es un ganglio espiral o un ganglio vestibular.

39. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado además porque la neuroprotección comprende proteger a la neurona de la muerte celular.

40.- El uso o el método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona comprende muerte celular apoptótica.

41.- El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 39 ó 40, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona está asociada con uno o más de una enfermedad o trastorno, isquemia, trauma físico/mecánico, un agente químico, un agente infeccioso, una reacción inmunológica y un desequilibrio nutricional.

42. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la muerte celular de la neurona está asociada con una enfermedad o trastorno.

43. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizado además porque el sujeto tiene o está en riesgo de que desarrolle, una o más de una enfermedad o condición asociada con anormalidades patológicas de un órgano auditivo o de un órgano vestibular.

44. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque la enfermedad o condición está asociada con un síntoma seleccionado del grupo que consiste de vértigo episódico, pérdida de la audición, tinnitus y llenura aural.

45. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque el sujeto es afligido con o es susceptible a, la enfermedad de Méniére.

46.- El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizado además porque la neuroprotección comprende la restauración parcial o completa de la función coclear y/o de la función vestibular.

47.- El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 46, caracterizado además porque el compuesto de ARNds subregula la expresión de NOX3 en una célula en el oído interno del sujeto.

48.- Un compuesto de ARN de doble cadena (ARNds), el cual subregula la expresión de un gen RHOA que codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7, para su uso en la neuroprotección de una neurona en el oído de un sujeto que necesita del mismo.

49.- Un método para brindar neuroprotección a una neurona en el oído de un sujeto que necesita del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de ARN de doble cadena (ARNds) el cual subregula la expresión de un gen RHOA, en donde el gen RHOA codifica para un ARNm que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7, para brindar de esta manera neuroprotección a la neurona en el oído del sujeto.

50.- El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 48 ó 49, caracterizado además porque la neurona es, o está comprendida dentro de, un ganglio.

51.- El uso o el método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el ganglio es un ganglio espiral o un ganglio vestibular.

52. - El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 51 , caracterizado además porque la neuroprotección comprende proteger a la neurona de la muerte celular.

53. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona comprende muerte celular apoptótica.

54. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 52 ó 53, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona está asociada con uno o más de una enfermedad o trastorno, isquemia, trauma físico/mecánico, un agente químico, un agente infeccioso, una reacción inmunológica y un desequilibrio nutricional.

55. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque la muerte celular de la neurona está asociada con una enfermedad o trastorno.

56. - El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 48 ó 49, caracterizado además porque el sujeto tiene o está en riesgo de que desarrolle, una o más de una enfermedad o condición asociada con anormalidades patológicas de un órgano auditivo o de un órgano vestibular.

57. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque la enfermedad o condición está asociada con un síntoma seleccionado del grupo que consiste de vértigo episódico, pérdida de la audición, tinnitus y llenura aural.

58. - El uso o el método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el sujeto es afligido con o es susceptible a, la enfermedad de Méniére.

59.- El uso o el método de conformidad con las reivindicaciones 48 ó 49, caracterizado además porque la neuroprotección comprende la restauración parcial o completa de la función coclear y/o de la función vestibular.

60.- El uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 59, caracterizado además porque el compuesto de ARNds subregula la expresión de RHOA en una célula en el oído interno del sujeto.

61.- Un kit para brindar neuroprotección a una neurona en un oído de un sujeto que necesita del mismo, que comprende un compuesto de ARNds el cual subregula la expresión de CASP2, NOX3, CAPNS1 o RHOA en el sujeto.

62. - El kit de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado además porque el compuesto de ARNds subregula la expresión de CASP2.

63. - El kit de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado además porque el compuesto de ARNds subregula la expresión de NOX3.

64. - El kit de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado además porque el compuesto de ARNds subregula la expresión de CAPNS1.

65.- El kit de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado además porque el compuesto de ARNds subregula la expresión de RHOA.

66.- El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 65, caracterizado además porque la neurona es, o está comprendida dentro de, un ganglio.

67.- El kit de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado además porque el ganglio es un ganglio espiral o un ganglio vestibular.

68. - El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 , 62, 66 ó 67, caracterizado además porque el compuesto de ARNds tiene la estructura de doble cadena: 5' z"-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z 3' (cadena sentido, SEQ ID NO: 8) 3' z'-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5' (cadena antisentido, SEQ ID NO: 9) en donde cada A, C, U y G es un ribonucleótido no modificado, un ribonucleótido modificado o una porción no convencional, y cada ribonucleótido consecutivo o porción no convencional se une al siguiente ribonucleótido o porción no convencional mediante un enlace covalente; en donde cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente, incluye independientemente 1 a 5 nucleótidos consecutivos o porciones no de nucleótido o una combinación de los mismos unidos covalentemente en el extremo 3' de la cadena en la cual está presente; y en donde z" puede estar presente o ausente, pero si está presente, es una porción de remate unida covalentemente en el extremo 5' de la cadena sentido.

69. - El kit de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque el enlace covalente es un enlace fosfodiéster; en donde cada Z y Z' está ausente, en donde la cadena sentido comprende, contando desde el extremo 5', un ribonucleótido no modificado en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 19, una L-desoxicitidina en la posición 18, una porción desoxiabásica invertida unida covalentemente al extremo 5' (expuesta en SEQ ID NO: 26); y en donde la cadena antisentido comprende, contando desde el extremo 5', un ribonucleótido modificado con el azúcar 2'0-metilo en cada una de las posiciones 2, 4, 6, 8, 11 , 13, 15, 17 y 19, y un ribonucleótido no modificado en cada una de las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16 y 18 (expuesta en SEQ ID NO: 27).

70.- El kit de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque z" está presente y comprende una porción desoxiabásica invertida.

71.- El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 70, caracterizado además porque comprende adicionalmente un dispositivo para la administración transtimpánica del compuesto de ARNds al sujeto.