MX2013012848A - Andamio bifásico y bioabsorbible de colágeno, quitosana y ácido hialurónico. - Google Patents

Abstract

La presente invención trata de una formulación estable de un apósito de aplicación tópico para el tratamiento de las quemaduras. La formulación contiene dos capas, una fase compuesta de ácido hialúrico de bajo peso molecular en la concentración de 3.0% en peso y una segunda fase constituida de colágeno, quitosana y ácido hialurónico en concentraciones de 2.0, 3.0 y 0.18% en peso respectivamente. Mediante este apósito de aplicación tópica se permite la regenaración de tejido y una menor contracción en la cicatrización de una herida producida por una quemadura de segundo grado.

Description

ANDAMIO BIFÁSICO Y BIOABSORBIBLE DE COLAGENO, QUITOSANA Y ÁCIDO HIALURÓNICO.

DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra en el campo de los desarrollos farmacéuticos enfocados al uso de dispositivos médicos. La invención está relacionada con la formulación y aplicación de un andamio bioabsorbible desarrollado en dos capas y constituido a base de colágeno, quitosana y ácido hiarlurónico para el tratamiento de las quemaduras.

ANTECEDENTES La piel está formada por dos capas: la epidermis y la dermis. La epidermis tiene cinco estratos celulares, las células de la capa basal se reproducen constantemente y al ir envejeciendo son desplazadas hacia arriba donde al morir se transforman en escamas planas y ricas en queratina. La dermis se constituye de fibras de colágeno y elastina en una matriz de glucosaminoglucanos irrigada por vasos sanguíneos que da sostén a la epidermis.

Las quemaduras son heridas producidas por una transferencia excesiva de calor; que interrumpen la continuidad celular de la piel. Hay una destrucción de la barrera cutánea debido a la desnaturalización de las proteínas, lo que conlleva a una pérdida de líquidos, proteínas y electrolitos (incremento en la permeabilidad capilar) y a una mayor tendencia a infecciones bacterianas. Además, en respuesta al estrés ocurrido por la agresión térmica aumenta el gasto energético y hay un hipercatabolismo proteico; así como un proceso inflamatorio.

La curación de las heridas de quemaduras de segundo y tercer grado implican un proceso de epitelización y contracción (formación de cicatriz), que involucra tres fases: inflamatoria, proliferativa y de remodelación.

La fase inflamatoria ocurre dentro de los primeros tres días, después de que se ha interrumpido el epitelio es necesario recuperar la hemostasis por eso se forma un tapón de fibrina que solidifica con la incorporación de las plaquetas que llegan de la microcirculación. A este nicho son atraídos los neutrófilos que llegan a remover el tejido muerto y prevenir la infección. Al tercer día de lesión penetran los macrófagos para fagocitar patógenos y secretar factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas necesarias para la fase proliferativa.

En la fase proliferativa se reemplaza el tapón de fibrina por tejido de granulación que está constituido de macrófagos, fibroblastos y células endoteliales. La secreción de los factores TGF-B, PDGF por parte de los macrófagos induce a los fibroblastos a proliferar y sintetizar colágeno tipo III. Esto proporcionará una estructura de sostén para que las células endoteliales proliferen y den lugar a nuevos vasos sanguíneos. Además, los queratinocitos adyacentes a la herida y de los folículos pilosos pierden sus conexiones entre ellos y con la membrana basal para migrar hacia la superficie de la herida y cerrar el defecto que se produjo en la piel.

Finalmente en la fase de remodelación, cesa la formación del tejido de granulación y se elimina el existente por apoptosis. Al madurar la herida cambian los componentes de la matriz extracelular; así el colágeno tipo III depositado en la fase proliferativa es degradado y sustituido por colágeno tipo I que es más resistente y que se organiza en pequeños haces paralelos disposición que difiere del tejido sano. Los fibroblastos, también sufren modificaciones, pasan de ser profibróticos (al sintetizar colágeno) a ser miofibroblastos (semejantes a las células musculares); con este fenotipo establecen uniones célula-célula y con la matriz extracelular mediante el establecimiento de contactos con el colágeno recién sintetizado de tal manera que forman una red a través de la herida. Así, los fibroblastos estimulan la contracción de la herida con el objetivo de que haya una reducción del área hasta en un 40%.

Sin embargo, el proceso de cicatrización en ocasiones no resulta en un tejido funcional y puede llevar a cicatrices queloides o hipertróficas que en el caso de los niños desencadenan en cirugías recurrentes para permitir el crecimiento de la piel a la par del desarrollo del infante, de aquí surge la necesidad de tratamientos que permitan manipular la formación de la cicatriz.

El tratamiento para las quemaduras puede ser local y sistémico. En el caso de los tratamientos tópicos se busca que limiten la colonización de microorganismos y eviten una infección posterior además de que permitan la epitelización, no sean tóxicos y tengan un efecto analgésico. Dentro de este tipo se encuentran los apósitos, cremas y geles. Los apósitos ideales deben conservar un grado relativo de humedad en la herida, absorber el exceso de líquidos sin resecar y ser fáciles de retirar. Se pueden dividir en biológicos y sintéticos. Actualmente existen apósitos hidrocoloides (constituidos de diversos materiales como gelatina, pectina y carboximetil celulosa; estos forman un gel sobre la herida que facilita la debridación), láminas de poliuretano (son permeables al vapor de agua, oxígeno y CO2 pero no a las bacterias), de hidrogel (son de geles con alto contenido de agua que tienen polímeros insolubles como carboximetil celulosa modificada, absorben líquidos, ayudan a debridar y a mantener la humedad de la herida), de nylon con silicona (su estructura en malla permite el drenado de la lesión y al ser no adhesivo reducen el daño por cambio de parche), antimicrobianos (reducen el riesgo de infección porque pueden contener plata y iodo), de fibra (formados de alginato de calcio son absorbentes y biodegradables mantienen un ambiente húmedo y reducen la contaminación bacteriana) y biosintéticos sustitutos de la piel (constituidos de materiales que imitan la función de la piel por lo que permiten su reepitelización, intercambio de gases y líquidos, protegen contra bacterias).

Sin embargo, a pesar de la amplia gama de apósitos disponibles actualmente la mayoría tienden a pegarse a la superficie de epitelización y la necesidad de recambio frecuente hace que se dañe el tejido recién generado, lo que retrasa la curación. Por otro lado los apósitos biológicos de pieles sintéticas se consideran efectivos pero son de un costo elevado. Aunque, de acuerdo con el estudio de Wasiak, Cleland, Campbell and Spinks del 2013 no hubo diferencias en el tiempo de curación entre los apósitos de hidrogeles, antimicrobianos, de silicona con los apósitos de piel sintética; por lo que no suponen una ventaja significativa a pesar de estar constituidos de células.

La patente europea 88420194.8 y la patente estadounidense 5,166,187 plantean un procedimiento para la elaboración de un sustituto dérmico formado por la mezcla de colágeno, quitosana y glucosaminoglucanos, en un porcentaje de 10 a 20% de quitosana, 4 a 10% de condroitin sulfato, estos porcentajes con respecto al peso del colágeno. El colágeno empleado se disuelve en ácido acético 0.05 M y queda a una concentración final de 0.3 a 1% dependiendo del grado de rigidez que se le quiera dar a la membrana. Sin embargo, el sustituto dérmico obtenido es de baja resistencia una vez que se somete a los lavados con solución salina previos a su aplicación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la invención es proporcionar una formulación para el desarrollo de un apósito que comprende dos capas, una fase conformada de ácido hialurónico de bajo peso molecular y una segunda fase constituida de colágeno, quitosana y ácido hialurónico. Este andamio tiene las propiedades de ser biodegradable debido a que los elementos que lo constituyen son componentes naturales de la matriz extracelular de la piel humana y de otros seres vivos. Y es útil en el tratamiento de las quemaduras de segundo grado; al promover la regeneración tisular.

Una ventaja de la presente invención es aprovechar las propiedades del ácido hialurónico como son favorecer la regeneración y reparación de tejidos, promover la estimulación inmunológica, ser un anestésico natural y carecer de antigenicidad para utilizarlo en la formulación de un apósito para el tratamiento de las quemaduras. Además de complementar el andamio con dos componentes que ya se han probado que intervienen en el proceso de cicatrización como son el colágeno y la quitosana.

La formulación de la presente invención forma una estructura elástica y resistente que puede durar en el sitio de la herida hasta dos semanas sin necesidad de remoción debido a que se absorbe en el tejido. La estructura elástica está dada por el ácido hialurónico cuando entra en contacto con el medio acuoso ácido de la segunda fase del andamio.

El apósito contiene una fase de ácido hialurónico en un 3.0 % en peso/volumen y una segunda fase conformada por la mezcla de colágeno, quitosana y ácido hialurónico en las concentraciones de 2.0, 3.0 y 0.18% en peso/volumen.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona la formulación de un andamio o apósito de aplicación tópica constituida de dos fases con el objetivo de imitar a la piel, una capa inferior formada de un glucosaminoglucano como el ácido hialurónico y una fase superior obtenida de la combinación de colágeno, quitosana y ácido hialurónico que ofrece una solución al tratamiento de las quemaduras y que está elaborada a partir de biomateriales que se desintegran en su totalidad dentro del tejido; debido a que imitan a la matriz extracelular.

La fase inferior del andamio contiene ácido hialurónico de bajo peso molecular a una concentración de 3.0%, porcentaje en peso. Esta capa de hialuronato de sodio proporciona estabilidad a la membrana al formar una estructura elástica y resistente. El porcentaje empleado permite que se emule a la epidermis de la piel; al formar una malla firme de menor grosor que constituye una capa de menor penetrabilidad (Figura 1). Además, la capa de ácido hialurónico ofrece otras ventajas al apósito dadas las características propias de este glucosaminoglucano particularmente el empleado en la formulación que es de bajo peso molecular entre el rango de 1.30 a 1.50 MDa.

El ácido hialurónico es el componente principal de la matriz extracelular y es el glucosaminoglucano más abundante de la dermis humana. A través de sus propiedades estructurales y biológicas regula la señalización celular, morfogénesis, organización de la matriz e interviene en la reparación y regeneración de lesiones tisulares. Promueve la activación y modulación de la respuesta inmune al favorecer la maduración de las células dendríticas, la liberación de citocinas que intervienen en la migración y proliferación celular; esta propiedad de estimular el sistema inmunológico se aprovechó en el apósito con el objetivo de prevenir infecciones en el sitio de lesión.

Asimismo, el ácido hialurónico de bajo peso molecular favorece la regeneración tisular al estimular la síntesis de colágeno tipo I y promover la proliferación de los fibroblastos; los cuales a su vez tienen la capacidad de producir ácido hialurónico con lo cual hay una retroalimentación positiva. Además, este glucosaminoglucano interviene en la cicatrización de las heridas al favorecer la proliferación, migración y adhesión de células con lo que se potencia la reepitelización, al mismo tiempo promueve la angiogénesis que es clave en la fase proliferativa de la curación de una lesión.

Se considera un material inerte, con lo que se puede aplicar en el organismo sin riesgo de generar reacciones alergicas; ya que es una molécula carente de antigenicidad debido a que su estructura se encuentra altamente conservada a través de las especies.

El ácido hialurónico permite un equilibrio en la conservación de la humedad de la herida absorbiendo líquidos y al mismo tiempo evitando la pérdida de agua en la lesión gracias a su capacidad de absorber agua hasta 2000 veces su peso, y a la propiedad que tiene de estimular la síntesis de ocludinas que son proteínas de unión entre células.

Por otro lado las propiedades analgésicas del ácido hialurónico permiten que se module el dolor ocasionado por la quemadura a través de dos mecanismos: por la inhibición de los nociceptores y mediante la sustancia P.

La capa superior de la membrana está constituida por una mezcla de colágeno, quitosana y ácido hialurónico a una concentración de 2.0%, 3.0% y 0.18% respectivamente.

El colágeno es el componente proteico mayoritario de la piel humana; forma parte de la matriz extracelular que constituye la dermis, en donde funciona como un elemento de soporte y estructural que proporciona fuerza y flexibilidad al tejido. Particularmente el colágeno tipo I, empleado en la formulación del andamio, proporciona la elasticidad a la piel. Su inclusión dentro de la formulación permite que su presencia acelere el proceso regenerativo al proporcionar a las células un sostén con una conformación similar a la de la piel sana a través del cual los fibroblastos y queratinocitos migrarán para regenerar el tejido; de tal manera que se limite la formación de colágeno de haces cortos por parte de las células aledañas a la herida y de esta manera prevenir la contracción de la herida.

La quitosana utilizada en el apósito es de mediano peso molecular, se obtiene a partir de la desacetilación de la quitina que forma el exoesqueleto de crustáceos. Dentro del apósito se aprovecha la capacidad de la quitosana de ser un adhesivo natural dada su carga positiva tiene una afinidad por ligarse a las superficies cargadas negativamente de tal manera que se utilizó para que se entrecruce con las fibras de colágeno lo que permite que se formen poros dentro de la membrana; esta porosidad permite la filtración y migración de las células a la matriz o andamio favoreciendo y acelerando el proceso de la cicatrización, el tamaño promedio de los poros del andamio desarrollado es de 117.63 mm (Figura 2). Además al ser un material biodegradable y biocompatible, permite. que la membrana sea absorbida por el cuerpo sin generar reacción alérgica. Su actividad hemostática y antiinfecciosa permite que se favorezca la curación de las heridas al participar en la primera etapa de cicatrización y al evitar la colonización de microorganismos.

Las características microscópicas del apósito de la invención analizadas con un microscopio electrónico de barrido Jeol JSM-5900LV describen un material de aspecto esponjoso, rico en microporos, asimétrico, que se compone por al menos dos fases claramente diferenciadles, a aproximadamente 75% (327 pm), de una fase de microporos pequeños y subsecuentemente abundantes, que constituyen la mayor parte de la muestra y se encuentran en la parte inferior de la misma, con una distribución aparentemente homogénea, y una fase de microporos de mucho mayor tamaño, correspondiente a aproximadamente 25% de la muestra (144 pm), los cuales presentan una distribución mayormente heterogénea con interconexiones constantes entre los microporos. A mayores aumentos, es posible distinguir una estructura laminar de superficie sumamente lisa, con escasos agregados en su superficie, en la que es difícil apreciar la longitud del ancho de la misma, y en la que se forman conexiones entre los grandes microporos del material. Estadísticamente, al considerar tanto el tamaño de los microporos como el de las interconexiones del material encontramos una longitud en su diámetro mayor de 21 mm a 376 pm (rango 355 pm) con una media de 117.63 pm (error estándar de 7.63, desviación estándar de 71.88 pm) (Figura 2).

La formulación de la presente invención fue evaluada mediante dos modelos experimentales de quemadura, un modelo animal en cerdo Yorkshire y un segundo modelo en rata Wistar. En ambas especies animales se indujo una quemadura con calor seco de segundo grado. Durante todo el procedimiento los animales estuvieron anestesiados y durante los 21 días que duró el experimento se mantuvieron con analgésicos. Los apósitos desarrollados se aplicaron inmediatamente de producida la quemadura y se conservaron en el animal durante 21 días, cada semana se analizó la evolución de la cicatrización de la herida. En el modelo en cerdo se utilizó un recambio de apósito a los 14 días y en el modelo en rata se colocó un andamio cada semana Se observó que se produjo una menor contracción de la lesión en aquellas quemaduras tratadas con el apósito a diferencia de las heridas que no recibieron tratamiento o que tuvieron apósito de hidrogel (Figura 3). A nivel histológico se identificó un mayor crecimiento de nuevos vasos sanguíneos así como la presencia de células del sistema ¡nmunólogico dentro del sitio de lesión en aquellas heridas tratadas con el andamio desarrollado en esta invención, además de que no hubo infección.

Con estos resultados se observa que el andamio formulado en la invención con los componentes previamente mencionados genera un microambiente artificial dentro de la lesión que potencia y favorece el efecto natural de regeneración tisular dejando de lado las secuelas adversas de la contracción.

Preparación del apósito Se prepara la solución de hialuronato de sodio al 3.0% a 4.0% en peso/volumen en agua destilada con ayuda de un homogenizador hasta lograr la incorporación total del hialuronato, se obtiene un gel transparente. Este gel se utiliza para formar una capa delgada menor a un milímetro de espesor en el recipiente donde se dará forma al apósito.

El colágeno tipo I empleado en la formulación es soluble en agua destilada, se prepara a una concentración de 1.0 a 2.0% en peso/volumen, se mezcla con ayuda de un agitador hasta obtener una solución homogénea.

En un recipiente independiente se prepara la solución de quitosana al 2.0 a 3.0% en peso/volumen disuelto en ácido acético 0.05 M con ayuda de un homogenizador para lograr que la molécula se incorpore totalmente. La agitación debe ser máximo de 100 rpm para evitar la generación de burbujas de aire en la solución.

La solución de ácido hialurónico que se coloca en la capa superior del andamio queda a una concentración de 0.1 a 0.2 % en peso/volumen, prefiriéndose la concentración de 0.18%. El hialuronato se disuelve en agua destilada con agitación constante hasta obtener una solución homogénea y transparente.

Una vez disueltas las tres soluciones; colágeno, quitosana y ácido hialurónico, se forma la mezcla que dará lugar a la capa superior del andamio. La solución de quitosana se agrega a la solución de colágeno y se mantiene una agitación constante evitando la formación de burbujas en la solución. Se forma una solución amarilla espesa, una vez que estén perfectamente integradas ambas sustancias, se continúa con la agitación y se añade poco a poco el ácido hialurónico permitiendo que se incorporen todos los componentes de la formulación. Esta solución tiene un pH ácido aproximadamente de 5.0 que debe ajustarse a 6.5-7.0 con ayuda de un buffer elaborado con tris y EDTA a pH de 8.2.

La solución de colágeno, quitosana y ácido hialurónico se vacía sobre la capa de hialuronato de sodio al 3.0-4.0% hasta alcanzar una altura total de máximo dos milímetros. Al momento de entrar en contacto el ácido hialurónico de la base con el ácido acetico presente en la mezcla de la capa superior de la membrana se forma una interfaz elástica y resistente que le permite al andamio conservar su forma y tener mayor durabilidad una vez que se hidrata para su aplicación.

Los apósitos se conservan en congelación a -80°C hasta que se sometan al proceso de liofilización. Se liofiliza en un ciclo de 48 horas y se obtienen apósitos esponjosos de color blanco. Estos se someten a un proceso de esterilización por rayos gamma.

En este proceso de elaboración del andamio de la presente invención se utiliza colágeno soluble por lo que se obtiene una solución final con un menor contenido de ácido acético, a diferencia de otros apósitos biosintéticos que emplean colágeno insoluble y requieren de un medio ácido para su solubilización, con lo anterior se busca que el andamio no produzca irritación en la piel.

El apósito puede ser humedecido previo a su aplicación con solución salina fisiológica. El ácido hialurónico se hidrata y se forma un gel en la base del andamio que al momento de aplicarse sobre la herida debe quedar en la parte superficial de tal manera que el gel de hialuronato selle y permita que el apósito se una a los límites de la lesión favoreciendo la cicatrización.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Imagen de microscopía electrónica de barrido del apósito desarrollado en la presente invención en donde se observan las dos fases que lo constituyen; en la parte inferior se observa una capa de tamaño de poro mayor con un promedio de 350 mieras que corresponde a la de ácido hialurónico 3.0% y en la parte superior se visualiza una capa con poros de menor tamaño con un promedio de 117 mieras que pertenece a la mezcla de colágeno, quitosana y ácido hialurónico.

Figura 2. Se observa la imagen de microscopía electrónica de barrido de la capa superior del apósito que está formada de colágeno, quitosana y ácido hialurónico en donde se observan poros del tamaño de mieras.

Figura 3. Imagen de rata Wistar utilizada en el modelo experimental de quemadura, en el cual se produjeron dos heridas por rata y en cada lesión se evaluó un tratamiento diferente. Del lado izquierdo se aplicó un apósito comercial a base de hidrogel y del lado derecho se colocó el apósito de la invención. Se observa una menor contracción de la herida en el sitio correspondiente al andamio de la invención comparado con el apósito comercial.

Claims (3)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente la invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. Una formulación de apósito caracterizada porque comprende dos fases, una primera fase compuesta de ácido hialurónico de bajo peso molecular y una segunda fase constituida de la mezcla de colágeno tipo I, quitosana y ácido hialurónico.

2. El apósito de uso tópico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por su contenido de ácido hialurónico en la primera capa es de 3.0 a 4.0% y el contenido de los componentes de la segunda capa es de colágeno 1.0 a 2.0%, quitosana 2.0 a 3.0% y ácido hialurónico 0.18% porcentajes en peso.

3. El uso de ácido hialurónico de bajo peso molecular para fabricar un dispositivo medico indicado en el tratamiento de las quemaduras de segundo grado.