MX2013010850A - Aparatos y metodos para evaluar y clasificar polen y plantas. - Google Patents

Aparatos y metodos para evaluar y clasificar polen y plantas.

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Abstract

Un método para clasificar polen que contiene elementos genéticos de interés puede incluir asociar un marcador genético con semillas que definen los elementos genéticos de interés, cultivar plantas a partir de las semillas, recolectar el polen de las semillas, evaluar el polen para la presencia de los marcadores genéticos y clasificar el polen en base a la presencia o ausencia de los marcadores genéticos. Un método para determinar la viabilidad de polen puede evaluar la densidad óptica de granos de polen y comparar la densidad óptica con un umbral de densidad óptica. Además, un método para identificar plantas que definen un elemento genético de interés puede incluir asociar un marcador genético con semillas que definen el elemento genético de interés, cultivar plantas a partir de las semillas y evaluar las plantas para la presencia del marcador genético. Además, un método para identificar un genotipo de polen puede incluir evaluar polen mediante imagen espectral y/o hiperespectral y comparar el patrón de longitud de onda con un patrón de longitud de onda conocido.

Description

APARATOS Y MÉTODOS PARA EVALUAR Y CLASIFICAR POLEN Y PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Varias modalidades de la presente invención se refieren, generalmente, a métodos y aparatos para evaluar y clasificar polen y plantas. Más específicamente, las modalidades de la presente invención proporcionan métodos y aparatos para evaluar polen y plantas para determinar la presencia o ausencia de marcadores genéticos o para determinar un patrón de longitud de onda asociado con estos. Los métodos y aparatos adicionales se relacionan con la determinación de - la viabilidad de polen mediante la evaluación de la densidad óptica del polen. El polen puede clasificarse en base a esta.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Por una variedad de razones, pueden cultivarse, intencionalmente, especies vegetales. Por ejemplo, en algunas aplicaciones, las especies vegetales se cultivan, intencionalmente, para formar especies vegetales híbridas. En algunas aplicaciones, las plantas híbridas se cultivan para exhibir varios rasgos deseables. Dichos rasgos pueden incluir, por ejemplo, resistencia al calor y a la sequía, resistencia a enfermedades y a daños causados por insectos, características de rendimiento mejoradas y calidad agronómica. Generalmente, las plantas pueden tener la capacidad de autopolinización, polinización cruzada o ambas. La autopolinización describe la polinización mediante el uso de polen de una flor que se transfiere a la misma flor u otra flor de la misma planta. La polinización cruzada describe la polinización mediante el uso de polen transferido de una flor de una planta diferente de una familia o línea diferente.
Las plantas que han sido autopolinizadas y seleccionadas para muchas generaciones se convierten en homocigotas en casi todos los loci genéticos y producen una población uniforme de progenie verdadera de cultivo. Un cruce entre dos líneas homocigotas diferentes produce una población uniforme de plantas híbridas que pueden ser heterocigotas para muchos loci genéticos. Un cruce de dos plantas, cada una heterocigota, en un número de loci genéticos producirá una población de plantas heterogéneas que se diferencian, gené icamente, y no serán uniformes.
El maíz {Zea mays L.) , conocido, frecuentemente, como maíz en los Estados Unidos, puede cultivarse mediante las técnicas de autopolinización y polinización cruzada. El maíz tiene flores macho y flores hembra separadas en la misma planta. Las flores macho se ubican en la panoja y las flores hembra se ubican en la mazorca. La polinización natural ocurre en el maíz cuando el viento sopla granos de polen desde las panojas hacia los pelos del maíz que sobresalen de la parte superior de las mazorcas.
El desarrollo de una variedad de maíz híbrido en un programa de producción de semillas de maíz puede involucrar tres etapas: (1) la selección de plantas a partir de varias agrupaciones de germoplasma para cruces de cultivo iniciales; (2) la autopolini-zación de plantas seleccionadas a partir de los cruces de cultivo para diversas generaciones para producir una serie de líneas endogamas, que se cultivan, individualmente, eficazmente y son altamente uniformes; y (3) cruzar una línea endogama seleccionada con una línea endogama no relacionada para producir la progenie híbrida. Después de un tiempo ..suficiente de endogamia, las generaciones filiales sucesivas servirán, simplemente, para aumentar la semilla de la planta endogámica desarrollada. Preferentemente, una línea endogama deberá comprender alelos homocigotas en aproximadamente 95 % o más de su loci.
Durante el proceso de endogamia, el vigor de la línea puede disminuir. El vigor puede restaurarse cuando dos líneas endogámicas diferentes se cruzan para producir la progenie híbrida. Una consecuencia importante de la homocigosidad y homogeneidad de las líneas endogamas es que el híbrido entre un par definido de endogámicos puede reproducirse, indefinidamente, a medida que se mantenga la homogeneidad de los padres endogamos. Cuando los endogamos que crean un híbrido superior se han identificado, un suministro continuo de la semilla híbrida puede producirse mediante el uso de padres endogamos y las plantas de maíz híbridas pueden, después, generarse a partir de este suministro de semilla híbrida.
En consecuencia, el desarrollo y la producción de semillas de maíz pueden requerir de polinización en una o más etapas. Para determinar que una planta que tiene las características genéticas deseadas se produce mediante la polinización, un muestreo de rasgos genéticos puede realizarse después de la polinización.
COMPENDIO BREVE En una modalidad, se proporciona un método para distinguir, separar y clasificar granos de polen que contienen uno o más elementos genéticos de interés de uno o más granos de polen. El método puede comprender asociar uno o más marcadores genéticos con una o más semillas que definen uno o más elementos genéticos de interés, cultivar una o más plantas a partir de una o más semillas y recolectar uno o más granos de polen de una o más plantas. Además, el método puede incluir evaluar uno o más granos de polen para la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos mediante el uso de un dispositivo de evaluación y clasificar uno o más granos de polen que definen uno o más elementos genéticos de interés en base a la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos .
En algunas modalidades, el dispositivo de evaluación puede comprender un dispositivo único de flujo de granos. El dispositivo único de flujo de granos puede seleccionarse de un grupo que consiste en un citómetro de flujo, un flurómetro, un espectroflurómetro y un procesador microfluidico. Además, evaluar uno o más granos de polen puede comprender realizar al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral o ambas. En otra modalidad, la evaluación de uno o más granos de polen puede comprender llevar a cabo un inmunoensayo .
En algunas modalidades, uno o más marcadores genéticos pueden comprender una o más proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico . La o las proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico pueden comprender una o más proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes. Además, las proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes pueden definir una pluralidad de colores diferentes que se asocian, respectivamente, con elementos genéticos diferentes de interés y la clasificación de uno o más granos de polen puede comprender la clasificación en base a colores diferentes de la o las proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes .
Además, el método puede incluir germinar una o más plantas adicionales mediante el uso de uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés. Además, el método puede comprender cultivar una pluralidad de plantas adicionales mediante la realización de embriogénesis de polen en uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés. El método puede incluir, además, dispersar uno o más granos de polen en una solución envolvente antes de evaluar uno o más granos de polen. La solución envolvente puede comprender un regulador de conservación que se configura para mantener la viabilidad de uno o más granos de polen. El método puede comprender, además, secar uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés después de clasificar el polen y germinar una o más plantas adicionales mediante el uso de uno o más granos de polen que definen a uno o más de los elementos genéticos de interés. El secado de uno o más granos de polen puede comprender el secado en frío de uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés.
En algunas modalidades, uno o más elementos genéticos de interés pueden comprender un gen. En otra modalidad, uno o más elementos genéticos de interés pueden comprender loci de rasgos cuantitativos. Además, la asociación de uno o más marcadores genéticos con una o más semillas puede comprender una o más transformaciones y regeneraciones, cultivo tradicional e hibridación in situ de una o más semillas con ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico o sondas de oligonucleotidos. Además, el método puede incluir clasificar el polen en base a un tiempo de vuelo. El método puede incluir, además, clasificar el polen en base a una densidad óptica.
En una modalidad adicional, se proporciona un método para determinar la viabilidad de uno o más granos de polen. El método puede comprender evaluar una densidad óptica de uno o más granos de polen mediante el uso de un dispositivo de evaluación, comparar la densidad óptica de uno o más granos de polen con un umbral de densidad óptica y determinar la viabilidad de uno o más granos de polen en base, por lo menos en parte, a si la densidad óptica excede el umbral de densidad óptica. Además, el método puede incluir clasificar cada uno de uno o más granos de polen en base, por lo menos en parte, a si la densidad óptica excede el umbral de densidad óptica. Además, el método comprende suministrar uno o más granos de polen en una solución envolvente antes de evaluar la densidad óptica de uno o más granos de polen.
En una modalidad adicional, se proporciona un método para identificar plantas que definen un elemento genético de interés. El método puede incluir asociar uno o más marcadores genéticos con una o más semillas que definen uno o más elementos genéticos de interés, cultivar una o más plantas a partir de la o las semillas y evaluar las plantas para la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos mediante el uso de un dispositivo de evaluación. La evaluación de una o más plantas puede comprender realizar al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral o ambas.
Además, se proporciona un método para identificar un genotipo de un grano de polen. El método puede incluir recolectar un grano de polen de una planta, evaluar el grano de polen mediante la realización de al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral o ambas en el grano de polen para determinar un patrón de longitud de onda y comparar el patrón de longitud de onda con uno o más patrones de longitud de onda conocidos para determinar el genotipo del grano de polen.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LA O LAS FIGURAS Después de haber descrito la invención en términos generales, ahora se hará referencia a las figuras adjuntas, que no están, necesariamente, dibujadas a escala, y en donde : la Fig. 1 ilustra una modalidad de un método para distinguir, separar y clasificar granos de polen que contienen uno o más elementos genéticos de interés de uno o más granos de polen de conformidad con una modalidad ilustrativa de la presente invención; la Fig. 2 ilustra un citómetro de flujo de conformidad con una modalidad ilustrativa de la presente invención; la Fig. 3 ilustra una ilustración esquemática de un dispositivo de evaluación y clasificación del citómetro de flujo de la Figura 2 de conformidad con una modalidad ilustrativa de la presente invención; la Fig. 4 ilustra un método para identificar un genotipo de un grano de polen de conformidad con una modalidad ilustrativa de la presente invención; la Fig. 5 ilustra un método para determinar la viabilidad de un grano de polen de conformidad con una modalidad ilustrativa de la presente invención; la Fig. 6 ilustra granos de polen en varios estados de viabilidad de conformidad con una modalidad ilustrativa de la presente invención; y la Fig. 7 ilustra un método para identificar plantas que definen un elemento genético de interés de conformidad con una modalidad ilustrativa de la presente invención .
DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención se describirá en su totalidad de aquí en adelante con referencia a las figuras que se acompañan, en las cuales se muestran algunas, pero no la totalidad, de las modalidades de la invención. Claramente, varias modalidades de la invención se pueden representar de muchas formas diferentes y no se deben interpretar como limitadas a las modalidades que se describen en la presente descripción; sin embargo, se proporcionan estas modalidades de manera que esta descripción cumpla con los requisitos legales aplicables. Los números similares se refieren a elementos similares en todas partes.
Los inventores de la presente invención han determinado que puede ser deseable la polinización seguida por muestreo de rasgos genéticos después de la polinización. En este sentido, los inventores han determinado que puede identificarse las características genéticas del polen y la planta antes de la polinización. De esa manera, por ejemplo, la polinización puede resultar en un cruce de gametos predeterminado .
En consecuencia, algunas modalidades de la presente invención se refieren a métodos para distinguir, separar y/o clasificar granos de polen que contienen un elemento genético de interés a partir de uno o más granos de polen. Como se ilustra en la Figura 1, una realización de un método ilustrativo puede incluir asociar uno o más marcadores genéticos con una o más semillas que definen uno o más elementos genéticos de interés en la operación 100. Por ejemplo, los marcadores genéticos pueden comprender una o más proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico (ADN) . Particularmente, en una modalidad ilustrativa que se describe en detalle en la presente descripción, las proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico pueden comprender proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes. De esta manera, las proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes pueden definir una pluralidad de colores diferentes que pueden asociarse, respectivamente, con aquellos diferentes a los elementos genéticos de interés. Un elemento genético de interés puede comprender un gen o un locus de rasgos cuantitativos (QTL, por sus siglas en inglés) en varias modalidades. Por ejemplo, ciertos genes y/o loci de rasgos cuantitativos pueden corresponder a rasgos deseables, tales como resistencia a la sequía y, por consiguiente, los marcadores genéticos pueden asociarse con eso.
Una variedad de métodos y aparatos pueden usarse para asociar los marcadores genéticos con semillas que definen elementos genéticos de interés en la operación 100. Por ejemplo, asociar los marcadores genéticos con la operación 100 puede comprender transformación y regeneración y/o cultivo tradicional. Además, asociar los marcadores genéticos con la operación 100 puede incluir hibridación in situ de una o más semillas con ADN, ácido ribonucleico (ARN) o sondas de oligonucleótidos . Además, puede usarse diversos métodos diferentes para asociar marcadores genéticos con elementos genéticos como puéde ser comprensible para una persona con experiencia en la materia, tal como varias modalidades de inserción de secuencia genética.
El método puede comprender, además, cultivar una o más plantas a partir de una o más semillas en la operación 102. Además, el método puede incluir recolectar uno o más granos de polen a partir de una o más plantas en la operación 104. Recolectar los granos de polen en la operación 104 podría involucrar recolectar los granos de polen con bolsas de polinización en algunas modalidades, aunque otros métodos pueden usarse tal como a través del uso de trampas para polen. El método puede incluir, además, evaluar uno o más granos de polen para la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos mediante el uso de un dispositivo de evaluación en la operación 106. En consecuencia, puede identificarse los granos de polen que incluyen el elemento genético de interés. Además, el método puede incluir clasificar uno o más granos de polen que definen uno o más elementos genéticos de interés en base a la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos en la operación 108. De esta manera, los granos de polen que definen uno o más elementos genéticos de interés pueden separarse de los granos de polen que no definen uno de los elementos genéticos de interés.
En algunas modalidades, el método descrito anteriormente puede comprender, adicionalmente, o, alternativamente, otras operaciones que incluyen aquellas operaciones ilustradas en lineas punteadas en la Figura 1. Por ejemplo, el método puede incluir dispersar uno o más granos de polen en una solución envolvente en la operación 110. Como se describió, dispersar uno o más granos de polen en una solución envolvente en la operación 110 puede realizarse antes de evaluar el o los granos de polen en la operación 106. La solución envolvente puede comprender un regulador de conservación tal como un regulador isotónico en algunas modalidades, que puede configurarse para mantener la viabilidad de los granos de polen. Además, como se describirá más abajo, la solución envolvente puede funcionar para transportar los granos de polen durante una o más de las operaciones realizadas para desarrollar el método.
Con respecto a la evaluación de granos de polen en la operación 106, la operación puede comprender realizar un inmunoensayo en la operación 112 y/o realizar al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral o ambas en la operación 114. De este modo, por ejemplo, el dispositivo de evaluación puede comprender un dispositivo único de flujo de granos en algunas modalidades. En forma de ejemplo adicional, el dispositivo único de flujo de granos puede comprender un citómetro de flujo, un flurómetro, un espectroflurómetro o un procesador microfluidico .
En este sentido, la Figura 2 ilustra un citómetro de flujo 200 que puede usarse para realizar métodos provistos en la presente invención. En una modalidad, el citómetro de flujo 200 puede comprender un citómetro de flujo comercializado bajo el nombre COPAS por UNION BIOMETRICA, Inc. de Holliston, Massachusetts , aunque puede usarse varias modalidades diferentes de citómetros de flujo. El citómetro de flujo 200 puede comprender un contenedor fuente 202 que se configura para recibir uno o más granos de polen. Particularmente, el citómetro de flujo puede configurarse para recibir uno o más granos de polen dispersados en una solución envolvente. El citómetro de flujo puede comprender, además, un dispositivo de evaluación y clasificación 204 que se configura para evaluar y clasificar los granos de polen.
En este sentido, la Figura 3 ilustra una ilustración esquemática del dispositivo de evaluación y clasificación 204. Como se describió, el dispositivo de evaluación y clasificación 200 puede separar y dirigir cada grano de polen 206 a lo largo del canal de flujo 208 a través de una celda de flujo 210 ocasionada por un flujo envolvente 212 de la solución envolvente. En consecuencia, cada grano de polen 206 se puede dirigir próximo al primer láser 214 y segundo láser 216 de tal manera que el primer 218 y segundo 220 rayos láser son incidentes después. Una pluralidad de detectores 222 puede configurarse, de este modo, para detectar la fluorescencia de cada grano de polen 206 ocasionada por excitación láser. Por ejemplo, un primer detector 222' puede detectar fluorescencia roja, un segundo detector 222" puede detectar fluorescencia verde y un tercer detector 222''' puede detectar fluorescencia amarilla. De esta manera, las proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes pueden identificarse en forma de imagen espectral de fluorescencia ocasionada por excitación láser. En este sentido, como se ilustra en la Figura 1, clasificar uno o más granos de polen en la operación 108 puede comprender clasificar en base a colores diferentes de una o más proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes en la operación 116.
Con relación a la Figura 3, en algunas modalidades solo el primer láser 214 puede usarse para evaluar la presencia o ausencia de marcadores genéticos (como se indica por fluorescencia) . Por ejemplo, el primer láser 214 puede configurarse para emitir el primer rayo láser 218 en forma de un rayo láser azul/verde para excitar los marcadores genéticos fluorescentes. El segundo láser 216 puede, en cambio, emitir el segundo rayo láser 220 en forma de un rayo rojo. De esta manera, el segundo láser 216 puede usarse para determinar el tiempo de vuelo de cada grano de polen 206 y densidad óptica (extinción) de cada grano de polen. El tiempo de luz puede ser un indicador del tamaño de cada grano de polen 206. Además, los inventores han determinado que la densidad óptica puede estar relacionada con la viabilidad de los granos de polen 206, como se describirá más abajo. En consecuencia, como se ilustra en la Figura 1, el método puede comprender, además, clasificar el polen en base a un tiempo de vuelo en la operación 118 y/o clasificar el polen en base a una densidad óptica en la operación 120.
Además, con relación a la clasificación de polen, el dispositivo de evaluación y clasificación 204 del citómetro de flujo 200 puede comprender un derivador 224. El derivador 224 puede configurarse para expulsar un soplo de aire 226 para desviar los granos de polen 206 cuando se desea. Por ejemplo, el derivador 224 puede separar los granos de polen indeseables 206' que no exhiben fluorescencia o que tienen el tamaño o densidad óptica incorrectos a un lugar de eliminación. Sin embargo, el derivador 224 puede permitir que los granos de polen 206" deseables, los cuales pueden tener el marcador genético, se desplacen a un contenedor 228. Los granos de polen deseables. 206" pueden almacenarse en un contenedor para materiales a granel o almacenarse en compartimentos 230 separados, como se ilustra. En algunas modalidades, la solución envolvente se puede dirigir, además, en el contenedor 228 para mantener la viabilidad de los granos de polen deseados .206" después de la clasificación.
Además, con relación al método de la Figura 1, el método puede comprender, adicionalmente, una o más plantas adicionales mediante la realización de embriogénesis de polen en uno o. más granos de polen que definen uno o más elementos genéticos de interés en la operación 122. Alternativamente, o adicionalmente, el método puede incluir germinar una o más plantas adicionales mediante el uso de uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés en la operación 124. Como se indicó anteriormente, en algunas modalidades los granos de polen 206 que definen uno o más elementos genéticos de interés (como puede indicarse mediante uno o más marcadores genéticos) pueden clasificarse en un contenedor 228 junto con la solución envolvente.
Además, el método puede comprender secar una o más granos de polen que definen uno o más elementos genéticos en la operación 126. Esta operación puede realizarse después de la operación 108 de clasificación del polen y, de ese modo, secar el polen en la operación 126 puede involucrar retirar la solución envolvente de los granos de polen. En una modalidad, secar los granos de polen en la operación 126 puede comprender secar en frío uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés en la operación 128.
En consecuencia, el citómetro 200 u otros aparatos pueden usarse para evaluar y clasificar polen en base a la presencia o ausencia de marcadores genéticos, como se describió anteriormente. Sin embargo, en una modalidad alternativa el genotipo de un grano de polen puede identificarse sin asociar un marcador genético con semillas. En este sentido, los inventores han determinado que los genotipos de granos de polen pueden determinarse a través de técnicas de imagen.
Por ejemplo, la Figura 4 ilustra una modalidad de un método para identificar un genotipo de un grano de polen. El método puede comprender recolectar un grano de polen a partir de una planta en la operación 300. Además, el método puede incluir evaluar el grano de polen mediante la realización de al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral o ambas en el grano de polen para determinar un patrón de longitud de onda en la operación 302. Además, el •método puede comprender comparar el patrón de longitud de onda con uno o más patrones de longitud de ondas conocidos para determinar el genotipo del grano de polen en la operación 304. En este sentido, cada genotipo de granos de polen puede definir un patrón de longitud de onda único que puede observarse mediante imagen hiperespectral y/o espectral. De esta manera, puede ser posible asociar el patrón de longitud de onda observado para granos de polen con un patrón de longitud de ondas conocido para determinar los genotipos de los granos de polen. En consecuencia, en algunas modalidades de la presente invención los granos de polen pueden identificarse sin asociar los marcadores genéticos después .
Sin importar el método empleado para identificar (o evaluar) los granos de polen, pueden usarse métodos adicionales que pueden ayudar, además, a completar polinizaciones exitosas. En este sentido, la Figura 5 ilustra un método para determinar la viabilidad de uno o más granos de polen. Como se describe, el método puede incluir evaluar una densidad óptica de uno o más granos de polen mediante el uso de un dispositivo de evaluación en la operación 400. En algunas modalidades, el dispositivo de evaluación puede comprender el citómetro de flujo 200 descrito anteriormente. Particularmente, el segundo láser 216 puede usarse para determinar la densidad óptica de cada grano de polen 206.
El método puede incluir, además, comparar la densidad óptica de uno o más granos de polen con un umbral de densidad óptica en la operación 402. Además, el método puede incluir determinar la viabilidad de uno o más granos de polen en base, por lo menos en parte, a si la densidad óptica excede el umbral de densidad óptica en la operación 404. En este sentido, los inventores han determinado que los granos de polen que han experimentado lisis y, por consiguiente tienen menos probabilidad de ser viables, tienen una densidad óptica menor que los granos de polen viables. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 6, un grano de polen 500 viable puede tener una mayor densidad óptica' que un grano de polen parcialmente Usado 502 y un grano de polen completamente lisado 504.
En consecuencia, la viabilidad de los granos de polen puede determinarse en base a si la densidad óptica de cada grano de polen excede un umbral de densidad óptica en la operación 404. En una modalidad, el umbral de densidad óptica puede determinarse empíricamente por medio de registrar la densidad óptica de una pluralidad de granos de polen viables. Sin embargo, varias modalidades diferentes de métodos pueden usarse para seleccionar el umbral de densidad óptica, como podrá entender una persona con experiencia en la materia.
En algunas modalidades, el método descrito anteriormente puede comprender, adicionalmente , o, alternativamente, otras operaciones que incluyen aquellas operaciones ilustradas en líneas punteadas en la Figura 5. Por ejemplo, el método puede incluir clasificar cada uno de uno o más granos de polen en base, por lo menos en parte, a si la densidad óptica excede el umbral de densidad óptica en la operación 406. Como se indicó anteriormente, el dispositivo de evaluación puede comprender el citómetro 200 descrito previamente. En consecuencia, el método puede comprender, además, suministrar uno o más granos de polen en una solución envolvente en la operación 408 antes de evaluar la densidad óptica de uno o más granos de polen en la operación 400. Como se describió anteriormente, la solución envolvente puede ayudar a mantener la viabilidad del polen y puede actuar, además, como un fluido motor para mover los granos de polen.
De esta manera, los métodos descritos anteriormente pueden proporcionar la identificación del genotipo de granos de polen (ver, p. ej . , la Figura 4) y/o la evaluación para la presencia o ausencia de marcadores genéticos asociados con elementos genéticos de interés (ver, p. ej . , la Figura 1) . Además, la viabilidad de granos de polen puede determinarse en base a la densidad óptica (ver, p. ej . , la Figura 5) . Estos métodos pueden usarse, por ejemplo, para preparar polen para la fertilización de plantas.
Se proporciona, además, un método para identificar plantas que definen un elemento genético de interés. Como se ilustra en la Figura 7, el método puede incluir asociar uno o más marcadores genéticos con una o más semillas que definen uno o más elementos genéticos de interés en la operación 600. Además, el método puede incluir cultivar una o más plantas a partir de una o más semillas en la operación 602. Además, el método puede comprender evaluar las plantas para la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos mediante el uso de un dispositivo de evaluación en la operación 604. En algunas modalidades, el método puede comprender, adicionalmente, o, alternativamente, otras operaciones que incluyen la operación ilustrada en lineas punteadas en la Figura 7. Por ejemplo, la evaluación de una o más plantas en la operación 604 puede comprender realizar al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral o ambas en la operación 606.
De esta manera, por ejemplo, las plantas pueden escanearse en una o más longitudes de onda para evaluar las plantas para la presencia o ausencia del marcador genético y, por consiguiente, los elementos genéticos de interés. En una modalidad, la plántula que crece puede evaluarse y solo aquellas plántulas que se determinan que tienen un elemento genético de interés (como se indica por uno o más marcadores genéticos) pueden trasplantarse y cultivarse. De esta manera, por ejemplo, las plantas hembra conocidas pueden cultivarse y, después, polinizarse mediante el uso de polen conocido como se estipula por los métodos descritos anteriormente. En consecuencia, la polinización controlada puede resultar para plantas deseadas producidas.
Aquellos experimentados en la materia a la cual esta invención pertenece podrán contemplar muchas modificaciones y otras modalidades de la invención descrita en la presente, con el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y las figuras asociadas. Por lo tanto, se debe comprender que la presente invención no debe limitarse a las modalidades especificas descritas y que las modificaciones y otras modalidades están incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque en la presente descripción se usa términos específicos, estos se usan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no con propósitos de limitación.

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un método para distinguir, separar y clasificar granos de polen que contienen uno o más elementos genéticos de interés de uno o más granos de polen; el método comprende: evaluar uno o más granos de polen con respecto a la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos mediante el uso de un dispositivo de evaluación; y clasificar uno o más granos de polen que definen uno o más elementos genéticos de interés en base a la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el dispositivo de evaluación comprende un dispositivo único de flujo de granos.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el dispositivo único de flujo de granos se selecciona de un grupo que consiste en: un citómetro de flujo; un flurómetro; un espectroflurómetro; y un procesador microfluidico .
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la evaluación de uno o más granos de polen comprende realizar al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral o ambas.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la evaluación de uno o más granos de polen comprende realizar un inmunoensayo.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde uno o más marcadores genéticos comprenden una o más proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico .
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde una o más proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico comprenden una o más proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde las proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes definen una pluralidad de colores diferentes que se asocian, respectivamente, con diferentes elementos genéticos de interés, y en donde la clasificación de uno o más granos de polen comprende clasificar en base a los diferentes colores de una o más proteínas de enlace a ácido desoxirribonucleico fluorescentes .
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende, además, germinar una o más plantas adicionales mediante el uso de uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende, además, cultivar una pluralidad de plantas adicionales mediante la realización de embriogénesis de polen en uno o más granos de polen que definen uno o más de · los elementos genéticos de interés.
11. El método de conformidad con la reivindicación I, que comprende, además, dispersar uno o más granos de polen en una solución envolvente antes de evaluar uno o más granos de polen.
12. El método de conformidad con la reivindicación II, en donde la solución envolvente comprende un regulador de conservación configurado para mantener la viabilidad de uno o más granos de polen.
13. El método de conformidad con la reivindicación 11, que comprende, además, secar uno o más granos de polen que definen uno o más elementos genéticos de interés después de clasificar el polen; y germinar una o más plantas adicionales mediante el uso de uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el secado de uno o más granos de polen comprende secar en frió uno o más granos de polen que definen uno o más de los elementos genéticos de interés.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde uno o más elementos genéticos de interés comprenden un gen.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde uno o más elementos genéticos de interés comprenden un locus de rasgos cuantitativos.
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde asociar uno o más marcadores genéticos con una o más semillas comprende uno o más de: transformación y regeneración, cultivo tradicional e hibridación in situ de una o más semillas con ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico o sondas de oligonucleótidos .
18. El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende, además, clasificar el polen en base a un tiempo de vuelo.
19. El método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende, además, clasificar el polen en base a una densidad óptica.
20. Un método para determinar la viabilidad de uno o más granos de polen; el método comprende: evaluar una densidad óptica de uno o más granos de polen mediante el uso de un dispositivo de evaluación; comparar la densidad óptica de uno o más granos de polen con un umbral de densidad óptica; y determinar la viabilidad de uno o más granos de polen en base, por lo menos en parte, a si la densidad óptica excede el umbral de densidad óptica .
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, que comprende, además, clasificar uno o más granos de polen en base, por lo menos en parte, a si la densidad óptica excede el umbral de densidad óptica.
22. El método de conformidad con la reivindicación 20, que comprende, además, dispersar uno o más granos de polen en una solución envolvente antes de evaluar la densidad óptica de uno o más granos de polen.
23. Un método para identificar plantas que definen un elemento genético de interés; el método comprende: asociar uno o más marcadores genéticos con una o más semillas que definen uno o más elementos genéticos de interés; cultivar una o más plantas a partir de una o más semillas; y evaluar las plantas con respecto a la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos mediante el uso de un dispositivo de evaluación.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde la evaluación de uno o más plantas comprende realizar al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral o ambas.
25. Un método para identificar un genotipo de un grano de polen; el método comprende: recolectar un grano de polen de una planta; evaluar el grano de polen mediante la realización de al menos una imagen espectral o imagen hiperespectral en el grano de polen para determinar un patrón de longitud de onda; y comparar el patrón de longitud de onda con uno o más patrones de longitud de onda conocidos para determinar el genotipo del grano de polen.
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