MX2013004661A - Prevencion de la agregacion de biomasa en pozos de inyeccion. - Google Patents

Abstract

Se describe en la presente descripción la introducción de distintas formulaciones de soluciones nutrientes a un lugar subterráneo objetivo para evitar la formación de biopelículas y agregación de biomasa en la superficie de arena de un pozo de inyección durante los procesos de MEOR o bioremediación. Una primera formulación de solución nutriente sustenta el crecimiento de los microorganismos introducidos y una segunda formulación de solución nutriente se usa para fomentar la formación de biopelículas para permitir el taponamiento de poros y canales en el lugar subterráneo objetivo, para MEOR o bioremediación.

Description

PREVENCION DE LA AGREGACION DE BIOMASA EN POZOS DE INYECCION CAMPO DE LA INVENCION La presente descripción se relaciona con el campo de microbiología ambiental. Específicamente, se refiere al campo de recuperación microbiana mejorada de petróleo y bioremediación. Más específicamente, se refiere a la prevención de agregación microbiana y formación de biopelículas en el pozo de inyección durante la recuperación microbiana mejorada de petróleo o bioremediación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Típicamente, durante la recuperación de petróleo de los reservorios de petróleo, solamente porciones menores del petróleo original en el estrato subterráneo que contiene petróleo se recuperan por medio de métodos de recuperación primaria que usan únicamente las fuerzas naturales presentes en el reservorio de petróleo. Los métodos de recuperación secundaria tales como inyección de agua, es decir, la inyección de agua a través de pozos de inyección al reservorio de petróleo, se han usado para forzar el petróleo por los estratos subterráneos hacia los pozos de producción y, de este modo, mejorar la recuperación de petróleo .(Hyne, N.J., 2001, "Non-technical guide to petroleüm geology, exploration, drilling, and producción", 2.° edición, Pen Well Corp., Tulsa, OK, EE. UU.). Un problema comúnmente encontrado con las operaciones de REF. 239980 inyección de agua es que la heterogeneidad de los estratos subterráneos puede conducir a una reducción en la eficiencia de barrido durante la inyección de agua. En otras palabras, preferentemente, el agua encauza por los estratos más porosos del reservorio de petróleo al pasar del pozo de inyección a los pozos de producción y crea estratos invadidos por agua, y se desvía por otros estratos subterráneos que contienen petróleo que no están invadidos por agua para reducir, de ese modo, la eficiencia de recuperación de petróleo del estrato que no está invadido por agua.

Se conoce el uso de recuperación microbiana mejorada de petróleo (MEOR, por sus siglas en inglés) para ayudar en la recuperación de petróleo (Brown, L. R. , Vadie, A. A., Stephen, O. J. SPE 59306, SPE/DOE Improved Oil Recovery Symposium, Oklahoma, 3-5 - abril, 2000) . Se pueden inyectar microorganismos viables en un reservorio de petróleo donde pueden adherirse a las superficies de poros y canales en las matrices de las rocas o arena en las zonas invadidas por agua y taponarlas para evitar el encauzamiento del agua hacia zonas invadidas por agua durante la inyección de agua, que dirige el flujo de agua hacia un área más grande del estrato subterráneo que contiene petróleo que no ha sido invadido por el agua. (Ramkrishna, S., Prog. Energy com. Sci., 34: 714-724, 2008) .

Uno de los problemas asociados con la MEOR es la actividad prematura de microorganismos introducidos exógenamente, o microorganismos nativos, al añadir soluciones nutrientes a un pozo de inyección, lo que resulta en la formación prematura de biotapones y bloqueo de los poros cerca del pozo de inyección. En esta situación, los componentes introducidos al pozo de inyección no pueden moverse al estrato subterráneo que contiene petróleo para fomentar la MEOR.

La patente núm. WO 2009017810A1 describe un método para la recuperación intensificada de petróleo de una formación de rocas que contienen petróleo. El' método implica introducir un consorcio de microorganismos y una solución nutriente a un pozo de inyección. El consorcio se mantiene por una cantidad de tiempo suficiente para que el crecimiento y la colonización de los microbios en el reservorio desplacen el petróleo.

La publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos copendiente y de propiedad compartida núm. US 20100081585A1 , que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad, describe la activación del control de microorganismos en los procesos de MEOR y bioremediación y depende de formulaciones que son inhibidoras, en concentraciones aplicadas, tanto para los microbios nativos como para los introducidos cuando se aplican en el lugar. Estas formulaciones evitan el crecimiento y activación microbiana hasta que el agente inhibidor se ha disipado.

La patente de los Estados Unidos núm. 4,947,923 describe un proceso para la MEOR, que comprende inyectar bacterias a un pozo e inyectar una fuente de nutrientes para provocar que las bacterias crezcan y taponen selectivamente la formación. El nutriente usado es capaz de fluir hacia el fondo del pozo y proporcionar una fuente de nutrientes de fosfato, por ejemplo, tripolifosfato, sin precipitación al contacto con agua intersticial .

Para obtener operaciones de MEOR y bioremediación exitosas, la prevención de la formación de biotapones prematuros y bloqueo de los poros cercanos al pozo de inyección permanece un problema que debe resolverse.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la presente invención es un método para el tratamiento de un sitio subterráneo objetivo; el método comprende las etapas de, en orden: a) preparar una suspensión de biomasa que comprende una o más especies de microorganismos; b) introducir la suspensión de (a) a un pozo de inyección del lugar subterráneo objetivo; c) opcionalmente, introducir uno o más fluidos al pozo de inyección; d) introducir una primera formulación de solución nutriente al pozo de inyección en donde la primera solución nutriente sustenta el crecimiento de uno o más microorganismos de (a) en el lugar subterráneo objetivo pero no fomenta la agregación de biomasa ni la producción de biopelículas; e e) introducir una segunda formulación de solución nutriente al pozo de inyección, en donde la segunda formulación de solución nutriente fomenta el biotaponamiento de poros y canales en el lugar subterráneo objetivo.

En otro aspecto de la invención se presenta un método para el tratamiento de un lugar subterráneo objetivo; el método comprende las etapas de, en orden: a) preparar una suspensión de biomasa que comprende una o más cepas de Pseudomonas stutzerl,-b) introducir la suspensión de (a) al pozo de inyección del lugar subterráneo objetivo; c) introducir uno o más fluidos al pozo de inyección; d) introducir una primera formulación de solución nutriente al pozo de inyección, en donde la primera solución nutriente comprende lactato y ningún acetato, en donde el lactato fomenta el crecimiento de las Pseudomonas stutzeri y mantiene las Pseudomonas stutzeri en suspensión; y e) introducir una segunda formulación de solución nutriente al pozo de inyección, en donde la segunda formulación nutriente comprende acetato, y en donde el acetato fomenta la formación de biotapones mediante la cepa Pseudomonas stutzeri de (a) .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un esquema de un pozo y de los sitios subterráneos adyacentes a este. Todos los números en negrita que están a continuación se refieren a la Figura 1. (1) es el flujo de agua por inyección al entubado del pozo (7) , (2 y 3) son capas rocosas, (4) son las perforaciones en el entubado, (5) es el agujero del pozo, (6) es la superficie de arena del pozo de inyección, (8) es el fondo del pozo en la capa rocosa (2) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los solicitantes elaboraron el siguiente depósito biológico de conformidad con los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de patentes : Información sobre la cepa depositada Los solicitantes incorporan específicamente el contenido completo de toda la bibliografía citada en esta descripción. A menos que se establezca de cualquier otra forma, todos los porcentajes, partes, relaciones, etc., se expresan en peso. Las marcas registradas se muestran en mayúsculas . Adicionalmente, cuando una cantidad, concentración, u otro valor o parámetro se da ya sea como un intervalo, intervalo preferido o una lista de valores preferibles superiores y valores preferibles inferiores, esto se entenderá específicamente al describir todos los intervalos formados de cualquier par de cualquier límite de intervalo superior o valor preferido y cualquier límite de intervalo inferior o valor preferido, sin considerar si los intervalos se describen separadamente. En los casos en que en la presente descripción se mencione un intervalo de valores numéricos, a menos que se establezca de cualquier otra forma, el intervalo pretende incluir los límites de este y todos los números enteros y fracciones comprendidos dentro del intervalo. No está previsto que el alcance de la invención esté limitado a los valores específicos mencionados al definir un intervalo.

Se presentan las siguientes definiciones para los términos especiales y abreviaciones usadas en esta solicitud: La abreviación "ATCC" se refiere a American Type Culture Collection International Depository, Manassas, VA, EE. UU. "ATCC núm." se refiere al número de registro de los cultivos en depósito con el ATCC.

El término "biopelícula" significa una película o "capa de biomasa" de microorganismos. Frecuentemente, las biopelículas están incorporadas en polímeros extracelulares que se adhieren a superficies sumergidas en, o sometidas a, entornos acuáticos. Las biopelículas consisten en una matriz de una masa compacta de microorganismos con heterogeneidad estructural, que pueden tener diversidad genética, interacciones complejas de comunidad, y una matriz extracelular de sustancias poliméricas.

El término "biopelícula de taponamiento" o "biotapón" significa una biopelícula que es capaz de alterar la permeabilidad de un material poroso y, así, retardar el movimiento de un fluido a través de un material poroso asociado con la biopelícula o biotapón.

La invención se refiere a un método para la prevención del taponamiento de la superficie de arena de un pozo de inyección, y de los poros cercanos al pozo de inyección, durante la aplicación de MEOR o bioremediación por medio de introducir fluidos y formulaciones de nutrientes seleccionados. En el método descrito, después de la introducción de la suspensión de biomasa microbiana a un pozo de inyección, opcionalmente, se añade fluido para mover la biomasa lejos del sitio de introducción. Después de esto se introduce una primera formulación de solución nutriente al pozo de inyección que proporciona nutrientes para el crecimiento de microorganismos en el lugar subterráneo objetivo sin fomentar la agregación de biomasa y la formación de biopelículas . Seguidamente, se introduce una segunda formulación de solución nutriente que fomenta la adhesión de microorganismos a los poros y canales en el lugar subterráneo objetivo y la producción de biopelículas para la formación de biotapones.

En una modalidad, la suspensión de biomasa microbiana se prepara en la primera formulación de solución nutriente, y esta preparación de suspensión se introduce al pozo de inyección. Cuando se usa la suspensión de biomasa preparada en la primera solución nutriente, se puede introducir más de la primera formulación de solución nutriente después de la introducción opcional de fluido, o esta etapa puede omitirse.

La "superficie de arena del pozo de inyección" está orientada hacia las capas rocosas (Figura 1: 2, 3) de los estratos subterráneos que están en comunicación con el pozo de inyección a través de perforaciones en el entubado del pozo (Figura 1: 4). El método presente altera la permeabilidad del sitio subterráneo objetivo y, de ese modo, ayuda en la recuperación de petróleo o bioremediación. La frase "sitio subterráneo objetivo", como se usa en la presente, se refiere a zonas debajo de la superficie de la tierra compuesta por piedra arenisca, arena no consolidada o piedra caliza, en donde se aplica la EOR o bioremediación. Como se usa en la presente, la frase "alterar la permeabilidad del sitio objetivo" se refiere a los procesos que resultan en el taponamiento de las zonas invadidas por agua y, así, redirigir el flujo de inundación de agua hacia las zonas que no han sido invadidas por agua. Estos procesos incluyen la formación de biopelículas y taponamiento de los poros de la arena y las rocas en el lugar subterráneo objetivo por microorganismos.

En otras modalidades, pueden incluirse etapas adicionales en el método. Por ejemplo, en una modalidad, después de la etapa (d) , el pozo de inyección se cierra por un periodo de tiempo. Durante este tiempo, el pozo está cerrado, de manera que no se introduce nada al pozo, y los microorganismos crecerán en su nuevo entorno. En otra modalidad, después de la etapa (d) se introducen uno o más fluidos al pozo de inyección. Este fluido se usa para mover el microorganismo más hacia el sitio subterráneo objetivo. En otra modalidad, el pozo de inyección se cierra por un periodo de tiempo después de introducir uno o más fluidos después de la etapa (d) . En otra modalidad, después de la etapa (e) , uno o más fluidos se introducen al pozo de inyección. Las torrentes de fluido se mueven a través de poros no bloqueados y canales, sacando el petróleo para recuperación de petróleo, u otras sustancias para bioremediación . En otra modalidad se introduce la segunda formulación de solución nutriente al pozo de inyección después de la etapa (e) para fomentar más formación de biopelículas. La segunda formulación de solución nutriente adicional se añade, típicamente, periódicamente, en lotes entre las introducciones de fluidos. En el presente método puede usarse cualquier combinación de estas etapas adicionales .

En la Figura 1 se ilustra un esquema de un pozo de inyección el sitio subterráneo adyacente a este. Cuando se introduce un fluido (1) al pozo de inyección, este fluye al entubado del pozo (7) que está dentro del pozo (5) perforado a través de las capas rocosas (2, 3). Existe un espacio entre el entubado del pozo (7) y la superficie de arena del pozo de inyección (6) de la capa rocosa hecha por el agujero del pozo (5) . La capa rocosa (2) representa las rocas impermeables encima y debajo de una capa de roca permeable (3) que guarda o atrapa petróleo. Cualquier fluido (1) introducido al pozo desciende por el entubado del pozo (7) y pasa a través de perforaciones en el entubado (5) y hasta las perforaciones (4) en la matriz rocosa del estrato subterráneo que contiene petróleo (3) . Después, este fluido desciende al estrato subterráneo que contiene petróleo (3) y desplaza al petróleo de estos estratos. Esta zona se extiende radialmente del pozo (5) en todas las direcciones en los estratos que contienen petróleo (3) .

En el presente método, cuando se introduce biomasá microbiana a un pozo de inyección, se sigue, opcionalmente, con la adición de uno o más fluidos para ayudar a mover los microorganismos al sitio subterráneo objetivo adyacente. Los fluidos adecuados para usar en la presente pueden incluir, por ejemplo, agua de inyección y producción que se usa durante las operaciones de MEOR. Un fluido útil en el presente método comprende agua. El agua puede suministrarse de una fuente adecuada y puede incluir, por ejemplo: agua de mar, saladar, agua de producción, agua recuperada de un acuífero subterráneo, que incluyen aquellos acuíferos en contacto con el petróleo en un sitio subterráneo, o agua superficial de una corriente, río, laguna o lago. Como se conoce en la técnica, puede que sea necesario eliminar materias particuladas que incluyen polvo, pedazos de roca o arena y subproductos de corrosión tales como herrumbre del agua antes de la inyección a uno o más pozos. Los métodos para eliminar tales materias particuladas, por ejemplo, filtración, sedimentación y centrifugación, se conocen en la técnica.

En una modalidad del método descrito, se introducen aguas de inyección o producción de reservorios de petróleo a un pozo de inyección después de la introducción de una suspensión de biomasa microbiana para mover los microorganismos introducidos al pozo de inyección más allá, hacia el sitio subterráneo objetivo adyacente.

El agua de inyección o agua de producción de tales pozos puede contener varias concentraciones de sales mezcladas que contienen, por ejemplo cloruro, sodio, potasio, bromo, magnesio, bario y calcio (de aquí en adelante, "sal") . La salinidad del agua de pozo de inyección o producción puede ser de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 partes por mil (ppt) .

Aun cuando se prepara una suspensión de biomasa bien dispersada, esta puede agregar y provocar taponamiento de la superficie de arena del pozo de inyección después de su introducción al pozo, por lo que reduce, de ese modo, la cantidad de biomasa que llega al sitio subterráneo objetivo en donde tendrá lugar la recuperación de petróleo o bioremediación, o aumenta la presión necesaria para bombear fluido al pozo y, en el peor de los casos, destaponar efectivamente el pozo. El presente método reduce la agregación de biomasa microbiana y biopelículas y la formación de biotapones en la superficie de arena del pozo de inyección por medio de introducir fluidos y formulaciones de soluciones nutrientes descritas en la presente descripción, que permiten una penetración más profunda de la biomasa al sitio subterráneo objetivo.

Formulación de soluciones nutrientes Las formulaciones de soluciones nutrientes útiles en la presente invención pueden incluir sustratos de crecimiento (compuestos que suministran masa y energía para el crecimiento celular) ; aceptores de electrones; fuentes de nitrógeno y fósforo, así como varios oligoelementos tales como vitaminas y metales que se necesitan, usualmente, para el crecimiento y actividad microbiana, además del sustrato de crecimiento y las fuentes de nitrógeno.

Las formulaciones de soluciones nutrientes útiles en la presente invención comprenden las siguientes sustancias, solas o en combinación: fuentes de carbón, añadidas en relaciones mayores que 0.01 % peso/volumen; un aceptor de electrones para crecimiento microbiano (en condiciones de crecimiento anaerobio), añadido en una relación mayor que 0.01 % p/v; una fuente de nitrógeno, añadida en una relación mayor que 0.001 % p/v; una fuente de fósforo, añadida en una relación mayor que 0.001 % p/v; una fuente de oligonutrientes , tales como vitaminas y metales, añadidos en una relación mayor que 0.0001 % p/v.

Las formulaciones de soluciones nutrientes útiles contempladas en la presente descripción incluyen aquellas que contienen por lo menos uno de los siguientes elementos: C, H, 0, P, N, S, Mg, Fe, o Ca. Los ejemplos no limitantes de radicales inorgánicos que comprenden por lo menos un elemento de los citados anteriormente incluyen, por ejemplo: P042", NH+, N02", N03", y S042". Los sustratos de crecimiento pueden incluir azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes, proteínas, polisacáridos, grasas, hidrocarburos u otros materiales orgánicos conocidos en la técnica de la microbiología para ser sometidos a descomposición microbiana. Nutrientes vitales que contienen nitrógeno y fósforo (los ejemplos no limitantes pueden incluir NaN03, K 03, NH4N03/ Na2HP04, K2HP04, NH4C1) ; vitaminas (los ejemplos no limitantes pueden incluir ácido fólico, ácido ascórbico, y riboflavina) ; oligoelementos (los ejemplos no limitantes pueden incluir B, Zn, Cu, Co, Mg, Mn, Fe, Mo, W, Ni, y Se) ; amortiguadores para controles medioambientales; catalizadores, que incluyen enzimas; y pueden incluirse aceptores de electrones naturales y artificiales (los ejemplos no limitantes pueden incluir S042", N03", Fe+3, ácido húmico, óxidos minerales, compuestos de quinona, C02, 02, y combinaciones de estos) . Pueden usarse ingredientes complejos tales como extracto de levadura para proporcionar múltiples nutrientes tales como vitaminas y aminoácidos .

En el presente método se usan formulaciones de soluciones nutrientes separadas que tienen distintos efectos sobre uno o más microorganismos durante tratamiento de un lugar subterráneo objetivo. Las formulaciones de soluciones nutrientes se introducen al pozo de inyección en un lugar subterráneo objetivo después de la introducción de una suspensión de biomasa y, opcionalmente, uno o más fluidos. La primera solución nutriente proporciona nutrientes que sustentan el crecimiento de uno o más microorganismos introducidos, pero no fomenta la agregación de biomasa y formación de biopelículas . Con la primera formulación de solución nutriente puede haber alguna formación de biopelículas, pero es reducida en comparación con la cantidad de formación de biopelículas producidas por el (los) microorganismo (s) en presencia de la segunda formulación de solución nutriente. Así, la primera formulación de solución nutriente no fomenta la formación de biopelículas. Además, la primera solución nutriente puede mantener los microorganismos en suspensión, en lugar de fomentar la agregación. De este modo, con la introducción de la primera solución nutriente, los microorganismos introducidos pueden expandirse y crecer por todo el sitio subterráneo objetivo sin bloquear la superficie de arena del pozo de inyección ni los poros cercanos al pozo.

La segunda solución nutriente, que se introduce después de la primera solución nutriente, fomenta efectos en los microorganismos que conducen al biotaponamiento de poros y canales en el lugar subterráneo objetivo. Los efectos pueden incluir agregación, adhesión y producción de biopelículas. Así, con la introducción de la segunda solución nutriente, los poros y canales en el lugar subterráneo objetivo se bloquean, lo que lleva a una recuperación mejorada de petróleo o bioremediación .

Las diferencias en la composición de la primera y segunda formulaciones de soluciones nutrientes pueden estar en cualquier componente o componentes que fomentan los diferentes efectos descritos anteriormente. Por ejemplo, puede haber diferencias en los sustratos de crecimiento. En una modalidad del presente método, la primera formulación de solución nutriente introducida después de la introducción de la suspensión de biomasa y, opcionalmente , por lo menos un fluido, contienen lactato y no contienen acetato. La concentración de lactato en la primera formulación de solución nutriente es de 25 partes por millón a aproximadamente 10,000 partes por millón. A esto le sigue la introducción de la segunda formulación de solución nutriente que contiene acetato. La concentración de acetato en la segunda formulación de solución nutriente puede ser de hasta 30 por ciento en peso. La primera y segunda formulaciones de soluciones nutrientes comprenden nitrato hasta 30 por ciento en peso.

Los efectos de las distintas formulaciones de soluciones nutrientes sobre los distintos microorganismos también pueden variar en presencia de distintas concentraciones de sales. Por ejemplo, puede ocurrir una mayor diferencia en la formación de biopelículas entre formulaciones de soluciones nutrientes que contienen lactato o acetato en presencia de sal alta en comparación con sal baja. La concentración alta de sal puede ser al menos aproximadamente 30 ppt, 35 ppt, 40 ppt, 45 ppt, 50 ppt, 55 ppt, 60 ppt, 65 ppt, 70 ppt, o 75 ppt, o mayor.

En el presente método, después de la introducción de una suspensión de biomasa que contiene microorganismos, la combinación de la primera y segunda solución nutriente con lactato y acetato, respectivamente, puede usarse con cualquier microorganismo que tenga mayor biotaponamiento en un medio que contiene acetato, a diferencia de un medio que contiene lactato .

Los microorganismos pueden identificarse por tener diferentes propiedades en diferentes formulaciones de soluciones nutrientes por medio de pruebas en ensayos de biopelícula, tal como se describe en los Métodos generales en la presente. Por ejemplo, en la presente descripción se mostró que las cepas BR5311 (ATCC núm. PTA-11283) y LH4 : 15 (ATCC núm. PTA-8823) de Pseudomonao stutzeri forman biotapones más efectivos en solución nutriente que contiene acetato que en solución nutriente que contiene lactato. La respuesta del biotapón puede variar con la salinidad de la solución nutriente usada; una persona con experiencia en la técnica puede evaluar la respuesta fácilmente por medio del uso de ensayos descritos en la presente descripción.

En otra modalidad, pueden usarse otros microorganismos para taponamiento que podrían necesitar otros nutrientes específicos para la formación de biopelículas y taponamiento. Las composiciones necesarias para la primera y segunda solución nutriente pueden determinarse fácilmente por una persona con experiencia en la técnica en base a las respuestas de taponamiento del (los) microorganismo (s) a introducirse en la suspensión de biomasa por medio del uso de ensayos descritos en los Métodos generales de la presente descripción. Biomasa La suspensión de biomasa útil para el método descrito en la presente, para formar biopelículas y taponar los poros del lugar subterráneo objetivo, puede comprender clases de anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y desnitrificantes. Varias especies de microorganismos (bacteria y hongos) que se usan para la formación de biopelículas y agregación para mejorar la eficiencia de barrido y mejorar la recuperación de petróleo pueden incluir, pero no se limitan a, los géneros: Pseudomonas, Bacillus, Actinomycetes, Acinetobacter, Arthrobacter, Schizomycetes, Corynebacteria, Achromobacteria, Arcobacter, Enterobacteria, Nocardia, Saccharomycetes, Schizosaccharomyces, Vibrio, Shewanella, Thauera, Petrotoga, Microbulbifer, Marinobacteria, Fusibacteria, y Rhodotorula . Los términos "género" y "géneros", como se usa en la presente descripción, se refieren a la categoría de microorganismos que se clasifican debajo de una "familia" y por encima de una especie en la jerarquía de la clasificación taxonómica de los microorganismos. "Especies", como se usa en la presente descripción, se refiere a un grupo de microorganismos que comparten un alto grado de similitudes fenotípicas, bioquímicas y genotípicas .

La suspensión de biomasa puede comprender una única especie, dos o más especies de los mismos géneros, una combinación de géneros diferentes, o una combinación de múltiples especies de múltiples géneros de microorganismos. En una modalidad, la suspensión de biomasa para la práctica del presente método se obtiene por medio del uso de Pseudomonas stutzeri LH4:15 (ATCC NO: PTA-8823) descrito en la publicación de la solicitud de patente copendiente y de propiedad compartida núm. : 20090263887, cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. En otra modalidad, la suspensión de biomasa para la práctica del presente método se obtiene por medio del uso de la cepa B 5311 (ATCC núm. PTA-11283) de Pseudomonas stutzeri, que se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos copendiente y de propiedad compartida núm. 61/408734, que se incorpora en la presente como referencia. En otra modalidad adicional, la suspensión de biomasa contiene ambas cepas .

La suspensión de biomasa, fluidos y soluciones de nutrientes pueden introducirse al pozo por varios medios tales como una bomba centrífuga, una bomba de pistón, bomba de engranajes o cualquier otro dispositivo o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

Preparación de biomasa La suspensión de biomasa útil para el presente método se prepara por medio de cultivar uno o más microorganismos preferidos en un medio apropiado. Una persona con experiencia en la técnica estará familiarizada con cualquier medio adecuado que puede usarse para la preparación de biomasa de los microorganismos deseados . Cuando se usa la cepa Pseudomonas stutzeri , el medio adecuado puede contener lactato que no sustenta la formación de biotapones. La biomasa puede concentrarse por filtración o centrifugación. La biomasa puede prepararse según se requiera para su inmediata introducción al pozo de inyección sin almacenamiento. Alternativamente, la biomasa puede prepararse con anticipación y puede almacenarse congelada como una pasta. La preparación de biomasa de una biomasa congelada requiere atención especial y, probablemente, la aplicación de uno o más tipos de mezcladoras para asegurar la completa resuspensión de la biomasa y la ausencia de cualquier agregado celular. Por ejemplo, un método para obtener una población de biomasa que incluye fluir por un dispositivo dispersador de biomasa, se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20110244554, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

El método descrito puede usarse, además, para la bioremediación de sitios contaminados.

EJEMPLOS La presente invención se define más detalladamente a través de los siguientes ejemplos. Debe entenderse que si bien estos ejemplos indican modalidades preferidas de la invención, estos se proporcionan con fines ilustrativos únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.

Métodos Generales Crecimiento de biomasa Las técnicas para crecimiento y mantenimiento de microorganismos anaerobios son bien conocidas en la técnica.

El crecimiento anaerobio se mide por la reducción de nitrato de la solución nutriente de crecimiento en el tiempo y la acumulación de nitrito.

La biomasa puede cultivarse y almacenarse tal como se describe en la publicación de la solicitud de patente copendiente núm. : 20090263887, cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad como referencia.

El medio PPGAS contenía: 20 milimoles (mM) de NH4C1, 20 mM de KC1, 120 mM de Tris-Cl, 1.6 mM de MgS04, 1 % de peptona, 0.5 % de glucosa, pH 7.5.

La composición de la formulación de solución nutriente de sales mínimas que se usan en los ejemplos a continuación se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 Composición de la formulación de solución nutriente de sales mínimas g/i Sustancia química 1.0 NH4C1 0.5 KH2PO4 0.4 MgCl2.6H20 0.2 CaCL2.2H20 10 NaCl 0.69 NaH2P04 2.5 NaHC03 0.073 KSO4 1000X g/1 Elementos de Traza 1.5 FeCl2.4H20 0.002 CuCl2.2H20 0.1 MnCL2.4H20 0.19 CoCl2.6H20 0.07 ZnCl2 0.006 H3BO3 0.036 Na2Mo04.2H20 0.024 NiCl2.6H20 0.277 HC1 1000X g/1 Selenio/tungstato 0.006 Na2Se03.5H20 g/i Sustancia química 0.277 HC1 1000X g/1 Selenio/tungstato 0.006 Na2Se03.5H20 0.008 Na2W04.2H20 0.5 NaOH 1000X mg/1 Mezcla de vitaminas 100 Vitamina B12 80 Ácido p-aminobenzoico 20 D (+) -biotina 200 Ácido nicotinico 100 Pantotenato calcico 300 Hidrocloruro de piridoxina 200 Tiamina-HCL.2H20 50 Ácido alfa-lipoico El pH del medio se ajustó a 7.3.

Formulación de solución nutriente comprada Se compró un medio de crecimiento Millers LB (MediTech, Iric, Manassas, VA) .

Muestras de agua de inyección Se sacaron muestras de agua de inyección de dos campos separados, ubicados en dos campos distintos de producción dé petróleo. El pozo núm. 1 está ubicado en el campo Senlac en la frontera de las provincias de Saskatc ewan y Alberta, Canadá.

Este pozo tiene una salinidad entre 30-35 partes por mil (ppt) en las aguas de producción e inyección. El pozo núm. 2 está en el campo Wainwright en la provincia de Alberta, Canadá. Este pozo tiene una salinidad de aproximadamente el doble del agua de mar, que está en el intervalo de 65 ppt.

Muestras de agua de producción e inyección del reservorio de petróleo.

Se obtuvieron muestras de agua de pozos de producción y de inyección (pozo núm. 1 y pozo núm. 2) como líquidos de mezcla de petróleo/agua en frascos de vidrio marrón de 1.0 litros (1) , llenos hasta el borde, tapados y sellados con cinta para evitar la fuga de gas . El gas producido durante los procesos anaerobios inherentes fue suficiente para mantener las condiciones anaerobias durante el envío. Los frascos se enviaron en enfriadores grandes de plástico llenos de bloques de hielo a las instalaciones de pruebas dentro de las 48 horas del muestreo. Medición del total de sales disueltas (salinidad) El total de sal disuelta se midió con un refractómetro portátil (Modelo RHS 10ATC,. Huake Instrument Co. , Ltd, Shenzhen, China) .

Formación de biopelículas en filtros de vidrio sinterizado Se desarrolló un ensayo para evaluar microorganismos por su habilidad para formar biopelículas sobre superficies de sílice y evitar el flujo de agua a través de espacios porosos de -10 micrones (taponamiento) con el uso de filtros de vidrio sinterizado. Se pegaron filtros de gas sinterizado de 25 milímetros (mm) de granulosidad media (inventario núm. 15254, Adams and Chittenden Scientific Glass, Berkeley CA) a la base de soportes de plástico diseñados para filtración por membranas . Después del curado, las unidades de filtro se esterilizaron mediante autoclave. Se puso cada filtro, en soportes, en placas Petri esterilizadas y la formulación de solución nutriente, que contenía inoculo de cultivos de varias cepas durante la noche, se añadió encima de los filtros de vidrio. La formulación de solución de nutrientes en este ensayo de formación de biopelículas/taponamiento fue un medio de sales mínimas (Tabla 1) o muestras de agua de inyección o producción, suplementada con nitrógeno, fosfato, elementos de traza, vitaminas, fuente de carbono y nitrato como aceptor de electrones . Las placas Petri se cubrieron e incubaron a temperatura ambiente bajo condiciones anaerobias por una o dos semanas . Los filtros se retiraron de lá ; formulación de solución nutriente y la parte superior del ' soporte plástico se ajustó en su sitio. Un tubo de diez centímetros de largo se adjuntó al puerto de entrada del soporte del filtro y se llenó con agua. Se midió el tiempo (en segundos) para drenar el agua en el tubo. Los filtros de control sin ningún microorganismo tomaron alrededor de 10 segundos pará drenar. Los filtros que tomaron más de 10 segundos para drenar se consideraron "taponados".

En un ensayo alternativo de taponamiento, los filtros de vidrio sinterizado se infiltraron con fluido antes de usar, se cribaron para determinar el régimen de flujo antes de la adición de microorganismos, y el porcentaje de cambio en el régimen de flujo pos-incubación se determinó al final del experimento .

Ejemplo 1 Habilidad de Pseudomonas stutzeri (LH4:15) para formar biopelículas en superficies de sílice Para evaluar la habilidad de la cepa LH4:15 (ATCC núm. PTA-8823) de Pseudomonas stutzeri para producir biopelículas estables en superficies de sílice, se colocaron cuentas de vidrio esterilizadas (3 mm, núm. 11-312A, Fisher Scientific, Hampton, NH) en los pocilios de una placa de micrqtitulación de 24 pocilios (núm. 353047, BD Biosciences) y se añadió una alícuota (1.0 mi) de agua de inyección o el medio PPGAS . Después, se añadió acetato al 0.6 % acetato o lactato al. 0.6 % a cada pocilio seguido de 10 µ? de un cultivo de la cepa LH4 : 15 que creció aerobiamente durante la noche en un medio PPGAS mientras se agitó a 200 revoluciones por minuto (rpm) y a temperatura ambiente. Las placas se incubaron a temperatura ambiente por una semana. Se evaluó la formación de biopelículas mediante inspección visual.

Los resultados indicaron que diferentes tipos de biopelículas se formaron en las cuentas de vidrio. En los pocilios que contenían el agua de inyección, la mayor parte de la biopelícula se formó en las cuentas de vidrio, mientras que únicamente pequeñas cantidades de biopelícula se observaron en los lados y el fondo del pocilio. Sin embargo, cuando se usó el medio PPGAS como la formulación de solución nutriente, se formó una biopelícula por todo el pocilio. En los pocilios que contenían acetato como la fuente de carbono adicional, la biopelícula formada fue más granular, mientras que en los pocilios que contenían lactato, la biopelícula formada era más lisa. Estos resultados indicaron que la cepa LH4:15 de Pseudomonas stutzeri tenía la habilidad para formar biopelículas en superficies de sílice fácilmente y para producir distintos tipos de biopelículas dependiendo de la fuente de carbono disponible .

Ejemplo 2 Efecto de la fuente de carbono sobre la habilidad de la cepa BR5311 de Pseudomonas stutzeri para formar biopelículas En este ejemplo se examinó el efecto de la fuente de carbono en la formulación de solución nutriente sobre la formación de biopelículas por la cepa BR5311 (ATCC núm. PTA-11283) de Pseudomonas stutzeri. La cepa BR5311 se aisló como un microorganismo capaz de crecer en interfaces de agua/petróleo bajo condiciones desnitrificantes del agua de inyección del pozo núm. 1 que está ubicado en el campo Senlac en la frontera de las provincias de Saskatchewan y Alberta en Canadá central. Fue identificada como una cepa de Pseudomonas stutzeri mediante análisis de rDNA 16S, que se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 61/408734.

El ensayo de formación de biopelículas se realizó tal como se describe en los Métodos generales . El medio que se usó fue el medio de sales mínimas indicado en la Tabla 1 y se complementó con acetato o lactato como la única fuente de carbono y nitrato como el aceptor de electrones, como se indica en la Tabla 2. La mezcla se hizo anaerobia por medio de colocarla en una cámara plástica que contiene un sistema de restregado por oxígeno de ascorbato (Becton, Dickinson Co, Sparks, Maryland) . La formulación de solución nutriente que se usó en el ensayo contenía acetato o lactato como la única fuente de carbono y nitrato como el aceptor de electrones, como se muestra en la Tabla 2.

Agua de inyección de sal alta del pozo núm. 2 (67 ppt) se esterilizó mediante filtro y se añadieron los siguientes nutrientes adicionales: 0.5 g/1 de NH4C1; 0.69 g/1 de NaH2P04; 1.4 g/1 de KH2P04; vitaminas y oligometales como en la Tabla 1. Se añadió nitrato sódico y acetato sódico o lactato sódico para ensayar las muestras para dar las relaciones de electrones de donador/aceptor disponibles mostradas en la columna e de la Tabla 2. Se añadieron 25 mi de la formulación de solución nutriente anterior y 1.0 mi microorganismos cultivados durante la noche (preparados tal como se describe en el Ejemplo 1) a cada soporte de filtro de vidrio. Después de una semana de incubación en una incubadora/agitador a 28 °C y 100 rpm en cajas anerobias, los filtros se retiraron y se ensayaron para determinar el taponamiento, tal como se describe en los Métodos generales . Cada filtro se midió tres veces. Los resultados de los tiempos de flujo de cada muestra de ensayo se dan en la Tabla 2.

Tabla 2 Fuentes de carbono añadidas a la formulación de solución nutriente de la cepa BR5311 de Pseudomonas stutzeri para la formación de biopelículas y tiempos de flujo relacionados Como se evidencia en la Tabla 2, se observó un taponamiento significativo cuando se usó acetato como fuente de carbono (pruebas núm. 1 y núm. 3) independientemente de la relación de carbono a nitrato. Se observó un taponamiento mínimo en este medio de sal alta (67 ppt) de las aguas con lactato del pocilio núm. 2 con una relación donador/aceptor de electrones de Ejemplo 3 Formación de biopelículas en sal baja con acetato o lactato con Pseudomonas stutzeri BR5311 La cepa BR5311 de Pseudomonas stutzeri se ensayó para determinar su habilidad para formar biopelículas de filtros de vidrio sinterizado en sal baja, tal como se describe en los Métodos generales. La cepa BR5311 se cultivó durante la noche en medio de cultivo Millers LB a 30 °C con agitación de 200 rpm. Para iniciar el experimento, se añadió 1.0 mi de microorganismos cultivados durante la noche a 25 mi de la formulación de solución nutriente descrita a continuación en triplicado y se añadió a un soporte de filtro de vidrio. Estos cultivos se cultivaron anaerobiamente en una incubadora/agitador a 28 °C/100 rpm por dos semanas. Además, se realizaron controles no inoculados triplicados con la misma formulación de solución nutriente, pero sin el inoculo de la cepa, en paralelo con los tratamientos de las pruebas inoculadas.

Composición de la formulación de solución nutriente de sal baja: NaCl, 10 g/1, NaHO¾, 0.25 g/1, NaN(¾, 2 g/1, solución vitamínica, 1 ml/1, B12, 100 mg/1, ácido p-aminobenzoico, 80 mg/1, D(+) -biotina, 20 mg/1, ácido nicotínico, 200 mg/1, pantotenato cálcico, 100 mg/1, clorhidrato de piridoxina, 300 mg/1, tiaitiina-HCl. 2 H20, 200 mg/1, ácido alfa-lipoico, 50 mg/1] , solución de selenita/tungstato, 1 ml/1 [NaOH, 0.5 g/1, Na2Se(¾.5H20, 6.0 mg/1, Na2W04.2H20, 8.0 mg/1], oligometales SL-10, 1 ml/1 [25 % HC1, 10 ml/1, FeCl2.4 H20, 1.5 g/1, ZnCl2, 70 mg/1, MnCl2.4 H20, 100 mg/1, H3BO3, 6 mg/1, CoCl2.6 H20,. 190 mg/1, CuCl2.2 H20, 2 mg/1, NiCl2.6 H20, 24 mg/1, Na2Mo04.2 H20, 36 mg/1] , KH2P04, 0.02 g/1, H4CI, 0.1 g/1, MgS04.7H20, 0.1 g/1, extracto de levadura 0.1 g/1.

La fuente de carbono en la formulación de solución nutriente fue acetato sódico o lactato sódico (a 1.0 g/1) . La salinidad fue 20 ppt.

Después de dos semanas, los regímenes de flujo se comprobaron tal como se describe en los Métodos generales. El tiempo para el paso del agua se anotó para cada prueba y cada filtro de control, y cada filtro se ensayó tres veces. Se calcularon los regímenes de flujo y se compararon los valores de posincubación con los valores de preincubación para cada filtro. Los resultados en la Tabla 3 muestran que la cepa BR 5311 de Pseudomonas stutzeri provocó una considerable disminución en el régimen de flujo contra los tratamientos de control después de dos semanas de incubación. En ambos tratamientos de control de acetato y de lactato, los regímenes de flujo aumentaron. El aumento en el régimen de flujo fue resultado de una mejor saturación de agua de los poros del filtro después de dos semanas de incubación sumergida. Los tratamientos de prueba que contenían el inoculo de la cepa BR 5311 de Pseudomonas stutzeri mostraron descenso en el régimen de flujo. En el tratamiento de prueba de acetato, el régimen de flujo disminuyó aproximadamente 42 %, y en el tratamiento de prueba de lactato, el régimen de flujo disminuyó aproximadamente 27 % en condiciones de sal baja.

Tabla 3 Cambios en el régimen de flujo a través de filtros de vidrio de porosidad media después de la incubación de dos semanas 5 * 3 mediciones/réplicas sucesivas. 1 calculado como ((medio posincubación, ml/s/preincubación, ml/s)"1) x 100 Ejemplo 4 Ensayo de taponamiento en sal alta con acetato, con el uso de la cepa BR5311 de Pseuodomonas stutzeri La cepa BR5311 de Pseudomonas stutzeri se ensayó para determinar su habilidad para formar biopelículas en filtros de vidrio sinterizado tal como se describe en los Métodos generales, con un medio de sal alta. La salinidad de la formulación de solución nutriente fue 70 ppt. La cepa BR5311 se cultivó anaerobiamente en una formulación de solución nutriente con la siguiente composición: NaCl, 40.5 g/1, NH4C1, 0.1 g/1, KH2P04, 0.02 g/l, Na2S04, 0.1 g/1, solución de selenita-tungstato [NaOH, 0.5 g/1, Na2Se03.5H20, 6.0 mg/1, Na2W04.2H20, 8.0 mg/1], 1 ml/1, NaHC03 , 0.2 g/1, solución de vitaminas [vitamina B12, 100 mg/1, ácido p-aminobenzoico, 80 mg/1, D (+) -biotina, 20 mg/1, ácido nicotínico, 200 mg/1, pantotenato cálcico, 100 mg/1, clorhidrato de piridoxina, 300 mg/1, tiamina-HCl. 2 H20, 200 mg/1, ácido alfa- lipoico, 50 mg/1 ] , 1 ml/1, solución de oligometales SL-10 [25 % HCl, 10 ml/1, FeCl2.4 H20, 1.50 g/1, ZnCl2, 70 mg/1, MnCl2.4 H20, 100 mg/1, H3B03, 6 mg/1, CoCl2.6 H20, 190 mg/1, CuCl2.2 H20, 2 mg/1, NiCl2.6 H20, 24 mg/1, Na2Mo04.2 H20, 36 mg/1], 1 ml/1, CaCl2.2H20, 8.8 g/1, extracto de levadura, 0.025 g/1, NaN03, 2.4 g/1, acetato sódico, 1.2 g/1, KC1, 0.86 g/1, MgCl2.6H20, 6.4 g/1, solución de azul de bromotimol , 0.4 , 3 mi.

El experimento y las pruebas de régimen de flujo después de dos semanas de incubación se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 3. Mientras que el régimen de flujo aumentó en los controles como en el Ejemplo 3, la cepa BR5311 provocó una disminución significativa en el régimen de flujo (Tabla 4) . Los regímenes de flujo en los tratamientos de control aumentaron en un promedio de 20 %. Los tratamientos de prueba que contenían el inoculo de la cepa BR5311 mostraron un promedio de disminución de 55 % en el régimen de flujo, lo que pone en evidencia la habilidad de la cepa BR5311 de Pseudomonas stutzeri para taponar los poros en una formulación de solución nutriente de sal alta y que contiene acetato.

Tabla 4 Cambios en el régimen de flujo a través de filtros de porosidad media después de dos semanas incubación. 5 10 * 3 mediciones sucesivas 1 calculado como ((medio posincubación, mL/s/preincubación, mL/s)-l) x 100.

Ejemplo 5 (esperado) Preparación de un inóculo que no forma biopelículas de Pseudomonas stutzeri (cepa LH4:15) con el uso de lactato Se prepara una biomasa de Pseudomonas stutzeri (cepa LH4:15), cultivada durante la noche, tal como se describió anteriormente. Esta biomasa se añade a un termentador de 200 litros de capacidad para preparar mayores cantidades de biomasa. La biomasa cultivada se filtra y almacena a -80 °C hasta que se la necesite.

Se usa un camión tanque de 9,000 litros (1) de capacidad que contiene 6,000 1 de una primera formulación de solución nutriente con lactato; la formulación contiene: cloruro sódico: 10,000 ppm; lactato sódico: 1,000 ppm; nitrato sódico: 2,000 ppm; extracto de levadura: 100 ppm; cloruro amónico: 100 ppm; hidrogeno fosfato sódico: 20 ppm; pH (ajustado con NaOH o HC1 según se necesite) a 6.5 hasta 7.0. Los ingredientes de la primera formulación de solución nutriente se mezclan al hacer circular el contenido del tanque. Si es necesario, el camión puede estacionarse en un garaje calentado mientras se hace circular el contenido del tanque, para ayudar a que el tanque se caliente a la temperatura deseada .

Se añade un bloque de caldo congelado de Pseudomonas stutzeri (cepa LH4:15) al tanque. Se continúa la circulación del contenido del tanque para que se mezcle con la primera formulación de solución nutriente alrededor y sobre el bloque congelado para acelerar el proceso de descongelación. Se determina si el proceso de descongelación ha terminado por observación visual del bloque, si está flotando, o por monitoreo de la turbidez de la suspensión en densidad óptica (OD6oo nanómetros, nm) . La suspensión de Pse domonas stutzeri (cepa LH4:15) obtenida de esta manera se usa inmediatamente o se almacena por un tiempo.

El camión tanque que contiene la suspensión de la Pseudomonas stutzeri (cepa LH4:15) en la primera formulación de solución nutriente se lleva al pozo de inyección. Para inocular el pozo, el tanque se conecta directamente o a través de un aparato de filtración, diseñado para evitar que pasen fragmentos grandes de biomasa (tales como un dispositivo dispersador de biomasa descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20110244554), a una bomba de inyección de alta presión. La bomba de alta presión se usa para transferir la biomasa del tanque al pozo de inyección para depositarla en el sitio subterráneo objetivo. La velocidad de inyección se determina por la máxima presión de inyección permitida al reservorio. Esta presión de inyección debe permanecer debajo de la presión de fractura de los estratos rocosos que contienen el petróleo.

Ejemplo 6 (esperado) Activación de la formación de biopelículas mediante Pseudomonas stutzeri (cepa LH4:15) con el uso de acetato Después de la inyección de la biomasa al pozo de inyección tal como se describe en el Ejemplo 5, la biomasa se empuja hacia el fondo a los estratos subterráneos por medio de inyectar agua o la primera formulación de solución nutriente que contiene lactato, tal como se especifica en el Ejemplo 5. Esta etapa se sigue con la inyección de 1,000 a 6,000 1 de una segunda formulación de solución nutriente que contiene 1,000 ppm de acetato y que incluye: cloruro sódico: 10,000 ppm; nitrato sódico: 2,000 ppm; extracto de levadura: 100 ppm; cloruro amónico: 100 ppm; hidrogeno fosfato sódico: 20 ppm; pH (ajustado con NaOH o HCl según se necesite) de 6.5 a 7.0. Cuando la segunda formulación de solución nutriente añadida alcanza el lugar subterráneo en donde están depositadas las Pseudomonas stutzeri , las células Pseudomonas comienzan a crecer y consumir el acetato de la segunda formulación de solución nutriente, y producen las biopelículas y biotapones en los poros del lugar subterráneo objetivo, para alterar, de ese modo, la permeabilidad del sitio objetivo.

Ejemplo 7 Preparación de un inoculo que no forma biopeliculas de Pseudomonas stutzeri (cepa BR5311) con el uso de lactato Biomasa de la cepa BR5311 (ATCC núm. ???t11283) de Pseudomonas stutzeri se cultivó durante la noche y se preparó tal como se describió anteriormente . Esta biomasa se añadió a un termentador de 200 litros de capacidad para preparar una cantidad mayor de biomasa. La biomasa cultivada se filtró y concentró ~5X y se almacenó a -80 °C hasta que se la necesite.

Se preparó un camión tanque de 9,000 litros (1) de capacidad con 6,000 1 de una formulación de solución nutriente con lactato; la formulación contiene: cloruro sódico: 10,000 ppm; lactato sódico: 1,000 ppm; nitrato sódico: 2,000 ppm; extracto de levadura: 100 ppm; cloruro amónico: 100 ppm; hidrogeno fosfato sódico: 20 ppm; pH (ajustado con NaOH o HC1 según se necesite) 6.5 a 7.0. Los ingredientes se mezclaron al hacer circular el contenido del tanque, y se obtuvo una primera formulación de solución nutriente.

Se añadió al tanque un bloque de caldo congelado de biomasa de la cepa BR5311 de ¾ Pseudomonas stutzeri. Se continuó la circulación del contenido del tanque para que se mezcle con la primera formulación de solución nutriente alrededor y sobre el bloque congelado para acelerar el proceso de descongelación. Se determinó si el proceso dé descongelación había terminado por observación visual del bloque, si estaba flotando, o por monitoreo de la turbidez de la suspensión en densidad óptica (OD6oo nanóraetros, nra) .

El camión tanque que contiene la suspensión de la biomasa de Pseudomonas stutzeri cepa BR5311 en la primera formulación de solución nutriente se lleva al pozo de inyección. Para inocular el pozo, el tanque se conectó directamente o a través de un aparato de filtración, diseñado para evitar que pasen fragmentos grandes de biomasa tales como un dispositivo dispersador de biomasa descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20110244554, a una bomba de inyección de alta presión. La bomba de alta presión se usó para transferir la biomasa del tanque al pozo de inyección para depositarla en el sitio subterráneo objetivo. La velocidad de inyección se determinó por la máxima presión de inyección permitida al reservorio. La presión de inyección se mantuvo debajo de la presión de fractura de los estratos rocosos que contienen el petróleo, mientras se bombeaba el inoculo. De hecho, no se observó ningún aumento en la presión de inyección al bombear el inoculo que indicara que los microbios no habían formado una biopelícula en la superficie del pozo.

Ej emplo 8 Activación de la formación de biopeliculas mediante Pseudomonas stutzeri (cepa BR5311) con el uso de acetato Después de la inyección de la biomasa al pozo de inyección, tal como se describe en el Ejemplo 7, se empujó la biomasa hacia los estratos subterráneos por medio de bombear una inyección de salmuera durante la noche al pozo de inyección por 16 horas. A esto siguió la inyección de 6 metros cúbicos de la primera formulación de solución nutriente que contiene lactato, tal como se especifica en el Ejemplo 5. Durante el bombeo de la salmuera y de la primera solución nutriente no hubo ningún aumento en la presión de inyección que indicara que los microbios todavía no habían formado biopelículas en el reservorio. El pozo de inyección se cerró por 5 días. Después de este cierre, se bombearon 1,000 1 de una segunda formulación de solución nutriente al pozo de inyección. Esta segunda solución nutriente contenía: acetato sódico: 9 % en peso; nitrato sódico: 18 % en peso; extracto de levadura: 4500 ppm; cloruro amónico: 13500 ppm; hidrogeno fosfato sódico: 500 ppm. La adición de esta segunda solución nutriente se repitió cada dos semanas por 6 meses. Después de ese tiempo, la presión de inyección del pozo había aumentado 1034.2 kPa (150 psi) . No se observó acetato o lactato en el agua de producción del pozo productor que se comunicaba con este inyector. Estos resultados mostraron claramente que las células Pseudomonas stutzeri estaban creciendo y consumiendo el acetato de la segunda formulación de solución nutriente, y produciendo biopelículas y biotapones en los poros del lugar subterráneo objetivo, alterando así la permeabilidad del sitio objetivo.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para el tratamiento de un lugar subterráneo objetivo; caracterizado porque comprende las etapas de, en orden: a) preparar una suspensión de biomasa que comprende una o más especies de microorganismos; b) introducir la suspensión de (a) a un pozo de inyección del lugar subterráneo objetivo; c) opcionalmente, introducir uno o más fluidos al pozo de inyección; d) introducir una primera formulación de solución nutriente al pozo de inyección, en donde la primera solución nutriente sustenta el crecimiento de uno o más microorganismos de (a) en el lugar subterráneo objetivo pero no fomenta la agregación de biomasa ni la producción de biopelículas; y e) introducir una segunda formulación de solución nutriente al pozo de inyección, en donde la segunda formulación de solución nutriente fomenta el biotaponamiento de poros y canales en el lugar subterráneo objetivo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno o más fluidos de (c) ayuda a mover la suspensión de uno o más microorganismos de (a) al sitio subterráneo objetivo.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende introducir uno o más fluidos al pozo de inyección después de la etapa (d) .

. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque comprende aplicar un periodo de cierre después de la etapa (d) o después de introducir uno o más fluidos al pozo de inyección después de la etapa (d) .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende introducir uno o más fluidos al pozo de inyección después de la etapa (e) .

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende introducir periódicamente una segunda formulación de solución nutriente entre la introducción de fluidos.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la suspensión de biomasa de (a) se prepara en la primera solución nutriente.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7 , caracterizado porque se omite la etapa (d) .

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una o más especies de microorganismos se seleccionan de un grupo que consiste en Pseudomonas, Bacillus, Actinomycetes, Acinetobacter, Arthrobacter, Arcobacter, Schizomycetes, Corynebacteria, Achromobacteria, Enterobacteria, Nocardia, Saccharomycetes, Schizosaccharomyces, Vibrio, Shewanella, Thauera, Petrotoga, Microbulbifer, Marinobacteria, Fusibacteria y Rhodotorula.

10. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque una o más especies de microorganismos se seleccionan de un grupo que consiste en Pseudomonas stutzeri BR5311 (ATCC núm. PTA-11283) y Pseudomonas stutzeri LH4:15 (ATCC núm. PTA-8823) .

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera formulación de solución nutriente comprende lactato y no acetato.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la concentración de lactato en la primera formulación de solución nutriente es de aproximadamente 25 partes por millón a aproximadamente 10,000 partes por millón.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera y la segunda formulaciones de soluciones nutrientes comprenden nitrato.

14. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la concentración de nitrato es de aproximadamente 20 partes por millón a aproximadamente 10,000 partes por millón.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda formulación de solución nutriente comprende acetato.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la concentración de acetato en la segunda formulación de solución nutriente es de aproximadamente 100 partes por millón a aproximadamente 10,000 partes por millón.

17. Un método para el tratamiento de un lugar subterráneo objetivo; caracterizado porque comprende las etapas de, en orden: a) preparar una suspensión de biomasa que comprende una o más cepas de Pseudomonas stutzeri; b) introducir la suspensión de (a) a un pozo de inyección del lugar subterráneo objetivo; c) opcionalmente, introducir uno o más fluidos al pozo de inyección; d) introducir una primera formulación de solución nutriente al pozo de inyección, en donde la primera solución nutriente comprende lactato y no acetato, y caracterizado porque el lactato fomenta el crecimiento de la Pseudomonas stutzeri y mantiene la Pseudomonas stutzeri en suspensión; e e) introducir una segunda formulación de solución nutriente al pozo de inyección, en donde la segunda formulación nutriente comprende acetato, y caracterizado porque el acetato fomenta la formación de biotapones mediante la cepa Pseudomonas stutzeri de (a) .