MX2013001087A - Proteinas de porina por a de neisseria meningitidis recombinantes. - Google Patents

Abstract

Se proveen constructos PorA de Neisseria Meningitidis que tienen una o más regiones variables interrumpidas, creadas mediante la inserción de regiones conservas completas o aminoácidos de región conservada. Las regiones variables altamente inmunogénicas de PorA son responsables para inducir respuestas inmunes específicas de la cepa que no son ampliamente protectoras, de esta manera la interrupción de las regiones variables dirige la respuesta inmune contra los epítopes de región conservada para inmunizar efectivamente contra un espectro más amplio de cepas de N. meningitidis. También se proveen ácidos nucleicos de codificación, constructos genéticos, células hospederas que expresan los constructos PorA y composiciones, equipos y métodos para la detección y tratamiento de infecciones por Neisseria Meningitidis.

Description

PROTEÍNAS DE PORINA POR A DE NEISSERIA MENINGITIDIS RECOMBINA TES CAMPO TÉCNICO Esta invención se relaciona a proteínas novedosas que constituyen formas modificadas de una proteína PorA de Neisseria meningitidis, a ácidos nucleicos que codifican tales proteínas, y al uso de estos métodos terapéuticos y profilácticos, composiciones y particularmente vacunas. Más particularmente, al interrumpir los aminoácidos no conservados en los bucles superficiales de PorA, la invención proporciona proteínas y ácidos nucleicos de codificación que pueden ser útiles en vacunas que inmunizan efectivamente contra un amplio aspecto de cepas de N. meningitidis que serian esperados de una proteína PorA de tipo silvestre correspondiente.

ANTECEDENTES La Neisseria meningitidis es una bacteria Gram-negativa y el agente causante de meningitis meningocócica y septicemia. Su hospedero bien conocido es el humano, y se puede llevar asintomáticamente por aproximadamente 10% de la población (Caugant y colaboradores, 1994, J. Clin. Microbiol. 32 323) .

La N. meningitidis puede expresar una cápsula de polisacárido, y esto permite la clasificación de las bacterias de acuerdo con la naturaleza de la cápsula expresada. Existen por lo menos doce grupos de N. meningitidis: A, B, C, 29-E, H, I, K, L, Wl 35, X, Y y Z, de los cuales los grupos A, B, y C provocan el 90% de enfermedad meningocócica (Poolman y colaboradores, 1995, Infect. Agents and Dis. 4 13) . Las vacunas dirigidas contra los grupos A y C son disponibles, pero el polisacárido capsular del serogrupo B es deficientemente inmunogénico y no induce la protección en humanos .

Otros componentes de membrana y extracelulares por lo tanto están siendo examinados por su conveniencia para la inclusión en vacunas. Los ejemplos incluyen las proteínas de membrana exterior de las clases 1, 2 y 3 (porina; codificada por los gentes por) y clases 4 (Rmp) y 5 (proteínas de pacidas; codificadas por los genes opa y opc) . Sin embargo, la N. meningitidis es muy efectiva en evadir respuestas inmunes por la variación antigénica y de fase. Por ejemplo, la proteína opc es una adesina/invasina (Virji y colaboradores., 1995, Mol Microbiol. 18 741-54) que es altamente inmunogénica ( iertz y colaboradores. , 1996, Infect Immun. 64 298-304), todavía su expresión es de fase variable (Sarkari y colaboradores. , 1994, Mol Microbiol. 13 207-17), y por diversión - generación de respuestas inmunes contra objetivos móviles hiperinmunogénicos, en particular PorA.

La PorA es altamente variable entre las cepas y genera una respuesta inmune en tanto pacientes como en portadores asintomáticos, al grado que se ha usado como un marcador para la identificación de cepas, representando el sistema de serosubtipos (McGuinness y colaboradores, 1990, J Exp Med. 171 1871-82) . El PorA es un antígeno clave, y se ha usado en formulaciones de vacuna efectiva y registradas previas y se considera un antigeno ideal para inducir anticuerpos bactericidas efectivos. Sin embargo, la variabilidad de cepa a cepa en los bucles superficiales da por resultado un objetivo variable, y las vacunas son típicamente específicas de tipo PorA. Aunque se han hecho esfuerzos para generar vacunas PorA multivalentes que cubren hasta seis tipos de PorA (van der Voort y colaboradores, 1996, Infect Immun. 64 2745-51), Este objetivo se ha evaluado para ser muy variable, y el desarrollo de vacunas actual se ha alejado de este antígeno principalmente por esa razón.

El modelo actual de la topología de monómero de PorA indica ocho bucles extracelulares (Derrick y colaboradores 1999, Infect. Immun. 67 2406-13; van der Ley y colaboradores. , 1991, Infect. Immun. 59 2963) . Los bucles más largos (1 y 4) son los más variables, por consiguiente son referidos como Región Variable 1 (VR1) y Región Variable 2 (VR2) . Se observa menos variabilidad en los bucles 5 y 6 (SVR1 y 2 semi-variables respectivamente) , sin esencialmente variabilidad en los bucles restantes. El bucle 3 se predice para formar un "tapón" en el poro formado por cada subunidad del trímero PorA. Aun dentro de VRl y VR2, la mayoría de la variabilidad se confina a los residuos predichos para formar la punta de cada bucle. De hecho, involuntarios tanto ratones como humanos inmunizados, el mapeo de epítopo mostró que la mayoría de la respuesta de anticuerpo se dirige a la "parte superior" de los bucles 1 y 4, la región que es variable entre las cepas (van der Voort, y colaboradores, 1997, FEMS Immunol. Med. Microbiol . 17 139-48), explicando presumiblemente la especificidad de la cepa de las respuestas anti-PorA.

BREVE DESCRIPCIÓN Los presentes inventores se han dado cuenta que los bucles superficiales y altamente inmunogénicos de PorA son responsables por inducir respuestas inmunes específicas de cepa que no son ampliamente protectoras, tal que las vacunas que incorporan una proteína PorA derivada de una cepa particular de N. meningitidis tienden a inmunizar preferentemente contra esa cepa particular. Como resultado, los presentes inventores han buscado producir una proteína PorA que induzca una respuesta inmune que no sea tan específica de cepa como aquella inducida por el PorA de tipo silvestre. Al dirigir la respuesta inmune principalmente contra epítopes conservados, las vacunas que comprenden la proteína aislada deben inmunizar efectivamente contra un espectro más amplio de cepas de N. meningitidis que será esperado después de la inmunización con el PorA de tipo silvestre.

En un primer aspecto, la invención proporciona una proteina aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteina PorA de Neisseria meningitidis, en donde se interrumpen uno o más aminoácidos de una región variable de la proteina PorA.

De manera adecuada, el uno o más aminoácidos de la región variable de la proteina PorA se interrumpen (por ejemplo comparado con una proteina de tipo silvestre) al comprender una o más regiones conservadas de PorA, o aminoácidos de región conservada. Preferiblemente, las regiones conservadas son, o comprende, una secuencia de aminoácidos de un bucle conservado 2, un bucle conservado 3, un bucle conservado 7 y/o un bucle conservado 8.

Adecuadamente, la región variable se selecciona del grupo que consiste de: una región VRl VR2 ; S VRl y SVR2.

De manera adecuada, la región variable se selecciona del grupo que consiste de: una región VR 1; y VR2.

Las regiones variables y las regiones conservadas pueden ser de, derivadas de, u originadas de, la misma o diferente proteina PorA.

De manera adecuada, la proteina aislada de la invención es capaz de inducir una respuesta inmune.

Preferiblemente, la respuesta inmune es menos especifica de cepa que aquella inducida por la proteina PorA de tipo silvestre correspondiente.

Más preferiblemente, la respuesta inmune proporciona protección contra una o más cepas de N. meningitidis, o aun más preferiblemente una pluralidad de cepas de N. meningitidis .

Las modalidades particulares de las proteínas aisladas de este aspecto se proporcionan en los ejemplos específicos de las proteínas aisladas de este aspecto se proporcionan en las FIGS. 1 y 2 (SEQ ID NOS: 11-22) . Preferiblemente, la proteína aislada comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 11-22.

Preferiblemente, la región variable interrumpida de la proteína aislada no consiste de una supresión de una región VRl y/o VR2, tal como se expone en SEQ ID NOS: 2-4.

La invención de acuerdo con el primer aspecto incluye homólogos, fragmentos, variantes y derivados de las proteínas aisladas de la invención.

En una modalidad particular de este aspecto, la proteína aislada está presente en una Vesícula de Proteína de Membrana Exterior (OMV) .

En un segundo aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto.

Ejemplos específicos de ácidos nucleicos aislados de este aspecto se proporcionan en la FIG. 2 (SEQ ID NOS : 23-43) . Preferiblemente, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 32-43.

La invención de acuerdo con el segundo aspecto incluye homólogos, fragmentos, variantes y derivados de los ácidos nucleicos aislados de la invención.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un constructo genético que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo con el segundo aspecto y una o más secuencias de nucleótidos adicionales.

En una forma preferida, el constructo genético es un constructo de expresión que comprende un vector de expresión y un ácido nucleico aislado de acuerdo con un segundo aspecto, en donde el ácido nucleico aislado se enlaza operablemente a uno o más ácidos nucleicos reguladores en el vector de expresión.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula hospedera que comprende un constructo genético de acuerdo con el tercer aspecto.

En una modalidad preferida, la célula hospedera es una bacteria que comprende un constructo de expresión cromosómicamente integrado.

Preferiblemente, la bacteria es Neisseria meningitidis .

En un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una proteina aislada recombinante de acuerdo con el primer aspecto, el método que comprende las etapas de: (i) cultivar una célula hospedera que contiene un vector de expresión de acuerdo con el tercer aspecto tal que el polipéptido se expresa en la célula hospedera; y (ii) aislar el polipéptido recombinante.

En un sexto aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza a, o se produce contra, una proteina aislada de la invención, fragmento, variante o derivado de la misma.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un método para detectar bacterias N. meningitidis bacteria , el método que incluye las etapas de: (i) combinar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del sexto aspecto con una muestra biológica obtenida de un mamífero; y (ii) determinar la presencia o ausencia de un complejo que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y las bacterias N. meningitidis y/o la proteína PorA de N. meningitidis en la muestra, en donde la presencia del complejo es indicativo de bacterias N. meningitidis .

En un octavo aspecto, la invención proporciona un método para detectar un anticuerpo para la proteína PorA de N, meningitidis, el método que incluye las etapas de:- (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un mamífero con la proteina aislada del primer aspecto; y (ii) determinar la presencia o ausencia de un complejo que comprende la proteína aislada y anticuerpos PorA de N. meningitidis en la muestra.

En un noveno aspecto, la invención proporciona un método para detectar u anticuerpo bactericida para N. meningitidis, el método que incluye las etapas de:- (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un mamífero inmunizado con la proteína aislada del primer aspecto con las bacterias N. meningitidis; y (ii) determinar la presencia o ausencia del anticuerpo bactericida en la muestra.

En un décimo aspecto, se proporciona un método para detectar bacterias N. meningitidis, el método que incluye la etapa de detectar una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto en una muestra biológica obtenida de un mamífero que indica la presencia de las bacterias.

Preferiblemente, el mamífero es un humano. En un onceavo aspecto, la invención proporciona un equipo para detectar una infección por N. meningitidis, el equipo que comprende: una proteína aislada de acuerdo con el primer aspecto; un ácido nucleico aislado de acuerdo con el segundo aspecto; y/o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del sexto aspecto; y opcionalmente uno o más de otros reactivos .

En un doceavo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una proteina aislada de acuerdo con el primer aspecto; un ácido nucleico aislado de acuerdo con el segundo aspecto; un constructo genético de acuerdo con el tercer aspecto; una célula hospedera de acuerdo con el cuarto aspecto; y/o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con el sexto aspecto; y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una bacteria que comprende un constructo de expresión cromosómicamente integrado.

Preferiblemente, la bacteria es Neisseria meningi tidis.

En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende la proteina aislada en una Vesícula de Proteína de Membrana Exterior (OMV) .

De manera adecuada, la composición farmacéutica es una composición inmunogénica .

Preferiblemente, la composición farmacéutica es una vacuna .

En un treceavo aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar una infección por N.

II meningitidis en un mamífero, el método que incluye la etapa de administrar una proteína aislada de acuerdo con el primer aspecto; un ácido nucleico aislado de acuerdo con el segundo aspecto; un constructo genético de acuerdo con el tercer aspecto; una célula hospedera de acuerdo con el cuarto aspecto, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con el sexto aspecto; y/o una composición farmacéutica de acuerdo con el doceavo aspecto al mamífero para prevenir o tratar en consecuencia la infección por N. meningitidis en el mamífero.

En una modalidad, el método administra una bacteria que comprende un constructo de expresión cromosómicamente integrado .

Preferiblemente, la bacteria es Neisseria meningitidis.

En otra modalidad, el método administra la proteína aislada en una Vesícula de Proteína de Membrana Exterior (OMV) .

Preferiblemente, el mamífero de los aspectos mencionados en lo anterior es un humano.

Por toda esta especificación, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende" se entenderá que significan la inclusión de un número entero establecido o grupo de números enteros pero no la explosión de ningún otro número entero o grupo de números enteros .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Alineación de la secuencia de aminoácidos de PorA de tipo silvestre comparado con las modalidades de la proteina aislada de la invención. La negrita subrayada indica bucles de modelo de van der Ley (van der Ley y colaboradores , 1991, Infect. Immun. 59 2963). La cursiva indica VR1 y VR2. -Indica la inserción de espacios para lograr alineaciones . Secuencia de aminoácidos de PorA de cepa MC58 de tipo silvestre ( SEQ ID NO.l); pP.orDELLl (SEQ ID NO: 2); pPorDELL4 (SEQ ID NO: 3); pPorDELLl -4 (SEQ ID NO: 4); pPorDELLl-4 -5 (SEQ ID NO: 5); pDELVRl (SEQ ID NO: 6) ; pDELVR2 (SEQ ID NO : 7 ) ; pDELVRl-2 (SEQ ID NO: 8); pDELVRl-2-5 (SEQ ID NO: 9); pDELVRl-2-5-6 (SEQ ID NO: 10); pVR2-7 (SEQ ID NO: 11); pVR2-8(SEQ ID NO: 12); pAVRlVR2-7 (SEQ ID NO: 13); pAVRlVR2-8 (SEQ ID NO: 14); pVRl-7VR2-8 (SEQ ID NO: 15); pVRl-7VR2-8A5 (SEQ ID -NO: 16); pPOR71nl; (SEQ ID NO: 17); pPor8in4 (SEQ ID NO: 18) y pPOR7inl, 8in4 (SEQ ID NO: 19) .

Figura 2: (A) Secuencias de aminoácidos de las modalidades de las proteínas aisladas de la invención (SEQ ID NOS: 2-18; ver FIG. 1) y secuencias de nucleótidos de codificación como sigue: pPorALl (SEQ ID NO:23); pPorAL4 (SEQ ID NO:24); pPorALl-4 (SEQ ID NO:25); pPorDELl-4-5 ( SEQ ID NO:26); pDELVRl (SEQ ID NO:27); pDELVR2 ( SEQ ID NO:28); pDELVRl-2 (SEQ ID NO:29); pDELVRl-2-5 (SEQ ID NO:30); pDELVRl-2-5-6 (SEQ ID NO: 31); pVR2-7 (SEQ ID NO: 32); pVR2-8 (SEQ ID NO: 33); pAVRlVR2-7 (SEQ ID NO: 34); PAVR1VR2-8 (SEQ ID NO: 35); pVRl-7VR2-8 (SEQ ID NO: 36); pVRl-7VR2-8A5 (SEQ ID NO: 37); pPOR7inl; (SEQ ID NO: 38); pPor8in4 (SEQ ID NO: 39) y pP0R7inl, 8in4 (SEQ ID NO: 40). La secuencia de nucleótidos de PorA de cepa C58 de tipo silvestre también se proporciona (SEQ ID NO:44). (B) Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de codificación de las modalidades adicionales de las proteínas aisladas de la invención donde las regiones VRl y/o VR2 se han suprimido y reemplazado con los aminoácidos del bucle 7 o bucle 8 conservados. AA seq pVRl-7VR2-7 (SEQ ID NO:20); VR18VR28 (SEQ ID NO:21) AA seq pVRl-8VR2-7 ( SEQ ID NO:22); DNA seq pVRl-7VR2-7 (SEQ ID NO:41); DNA seq pVRl-8VR2-8 (SEQ ID NO:42); y DNA seq pVRl-8VR2-7 (SEQ ID NO:43).

Figura 3: (A) Alineación de la secuencia de aminoácidos parcial de MC58 y otros dos tipos silvestres de PorA de diferentes secuencias en una o más de VRl, VR2, SVR1 y SVR2 (SEQ ID NOS:85-87). La negrita subrayada indica bucles del modelo de van der Ley (van der Ley y colaboradores, 1991, Infect. Immun. 59 2963) de PorA de MC58. La cursiva indica VRl y VR2 de PorA de MC58. - indica la inserción de espacios para lograr las alineaciones. * bajo las alineaciones indica residuos idénticos en las tres secuencias, donde los puntos indican aminoácidos conservados entre las secuencias. (B) Alineación de la secuencia de PorA de las cepas MC58, BZ133, BZ232,y 400 y consenso (SEQ ID NOS : 1 y 88-90) . Los bucles 1, 4, 5, 6, 7, y 8 se destacan y sori como se describe por los métodos de van der Ley y colaboradores 1991 supra, o Derrick y colaboradores 1999 supra. En la alineación, . indica las secuencia idéntica a MC58 de PorA, - indica espacio en la alineación de secuencia. En el consenso, * indica aminoácidos conservados en todas estas secuencias. : indica residuos conservados. . indica residuos semi-conservados .

Figura 4: detección de la técnica Western blotting de constructos de proteínas PorA. OMVs de Desoxicolato O Vs de N. meningitidis se separaron en geles de poliacrilamida Novex 8-12% pre-vaciados y ya sea se tiñeron con azul Coomassie (panel izquierdo) , o con la tinción de Western (panel derecho) . El PorA se detectó usando el anticuerpo policlonal anti-PorA (Santa-Cruz Biotechnology Inc.). Línea 1: marcador de peso molecular (tamaño evidente indicado a la izquierda en kDa) . Línea 2: OMV Í9, Línea 3: OMV 9-Fija, Línea 4: OMV 9-1, Línea 5: OMV 1728-2, Línea 6: 027-3, Línea 7: OMV 028-10, Línea 8: OMV 145-5. Las cepas se describen en la Tabla 5.

Figura 5: Tinción de Western de constructos de proteína PorA. Las proteínas de membrana se prepararon mediante la extracción con sarcosil de cuatro cepas de serosubtipos PorA de diferenciación y sus mutantes porA: ;tet isogénicos, y se separaron por electroforesis antes de la tinción con Coomassie (panel superior) o inmunotinción de western (panel de fondo) . Las proteínas en la tinción western se detectaron por suero acumulado de 10 ratones vacunados con OMVs de desoxicolato de la cepa 1728-2.

Figura 6: Análisis ELISA de sueros de ratones vacunados con OMV de cepas que expresan constructo PorA recombinantes : detección de la reactividad cruzada a los epítopes superficiales del por PorA heterólogo. Datos recíprocos del título medio geométrico (de cavidades triplicadas) se muestran para el Experimento 1 (A) y el Experimento 2 (B) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Se apreciará que el centro de la presente invención es la comprensión de que al interrumpir los bucles superficiales que comprenden aminoácidos no conservados en una proteína PorA de tipo silvestre, una respuesta inmune se puede inducir en la inmunización que, al dirigir la respuesta inmune contra secuencias de epítopes conservadas, proporcionarán protección contra una pluralidad de cepas heterólogas de N. meningitidis .

En un aspecto, la invención proporciona una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína PorA de Neisseria meningitidis, en donde una o más regiones variables de la proteína PorA se interrumpen de modo que la proteína PorA aislada induce una respuesta inmune contra una pluralidad de · cepas de Neisseria meningitidis . De manera adecuada, el uno o más aminoácidos de la región variable de la proteina PorA se interrumpen (por ejemplo comparado con una proteina PorA de tipo silvestre) al comprender una o más regiones conservadas de PorA, o aminoácidos de región conservada.

Para los propósitos de esta invención, por "aislado" se propone material que se ha removido de su estado natural o de otra manera se ha sometido a una manipulación humana. El material aislado puede estar sustancial o esencialmente libre del componente que lo acompañan normalmente en su estado natural, o se puede manipular para estar en un estado artificial junto con componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural. El material aislado puede estar en forma nativa o recombinante .

Por "proteína" se propone un polímero de aminoácido. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales o no naturales como se entenderá en la técnica.

Un "péptido" es una proteína que no tiene más de sesenta (60) aminoácidos.

Un polipéptido es una proteína que tiene más de sesenta (60) aminoácidos.

Por "interrumpido" en este contexto se propone que aunque la proteína aislada de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína PorA (incluyendo secuencias de aminoácidos transmembrana y/o intracelulares ) , una o más regiones variables o aminoácidos de región variable están por lo menos parcialmente, o están completamente, ausentes y se han reemplazado por uno o más aminoácidos de región conservada y/o la una o más regiones variables tienen uno o más aminoácidos de región conservada presentes o insertados - en una secuencias de aminoácidos de región variable .

De manera adecuada, la región variable se selecciona del grupo que consiste de: una región VRl; VR2 ; SVR1; y SVR2. Preferiblemente, la región variable interrumpida de la proteina aislada no consiste de una supresión de una región VRl y/o VR2, tal como se expone en SEQ ID NOS:2-4.

La Tabla 1 proporciona una comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables descritas en la presente (es decir VRl, VR2, SVRl, SVR2 ) y las regiones conservadas como se describe en la presente con bucles superficiales o extracelulares 1-8 de PorA (tao como se ejemplifica por la secuencia de aminoácidos de una proteina PorA de tipo silvestre de la cepa MC58 de N. meningitidis; SEQ ID NO:l) . La referencia también se hace a las FIGS . 3A y 3B, que muestran la diversidad en las secuencias de aminoácidos de región variable entre numerosas cepas y serotipos de N. meningitidis. La variabilidad en la VRl y VR2 se ejemplifica más completamente por referencia a http: //pubmlst. org/neisseria/PorA/yrl . shtml y http: //pubmlst . org/neisseria/PorA/yr2. shtml, y como se describe por Russell y colaboradores. , 2004, Emerg Infect Dis. 10 674-8. Por lo tanto se apreciará que la presente invención es aplicable al PorA de cualquiera cepa o serotipo de N. meningitidis .

Ejemplos específicos de proteínas aisladas de la invención se proporcionan en las FIGS. 1 y 2 (SEQ ID NOS: 5-22, o preferiblemente SEQ ID NOS.11-22).

La más variable de las regiones variables anteriores son VR1 y VR2. Las SVR1 y SVR2 son regiones semi-variables, la SVR1 que comprende más aminoácidos no conservados que SVR2. Por consiguiente, preferiblemente la región variable interrumpida es una región VRl y/o VR2. Sin embargo, en modalidades particulares la SVR1 se interrumpe, sola o además de una o más de otras regiones variables tales como VRl y/o VR2.

Como será evidente a partir de la FIG. 3 y la Tabla 1 en particular, los bucles 1, 4, 5 y 6 se correlacionan en general con regiones variables como es referido en la presente. Sin embargo, se apreciará que la VRl es una secuencia no conservada o variable del bucle 1 (por ejemplo. AQAANGGASGQVKVTVTA; SEQ ID NO: 45) y que VR2 es una subsecuencia no conservada o variable del bucle 4 (por ejemplo YYTKNTNNNLTLVP; SEQ ID NO. 6). Por consiguiente, las proteínas aisladas de la invención pueden tener, además de las interrupciones de VRl y/o VR2, una interrupción de uno o más aminoácidos de los bucles 1 y/o 4 que no son parte de VRl y VR2.

De manera similar, las proteínas aisladas de la invención pueden tener, además de las interrupciones de SVRl y/o SVR2, una interrupción de uno o más aminoácidos de los bucles 1 y/o 6 que no son parte de SVRl y/o SVR2.

Las SVRl y SVR2 se definieron originalmente en relación con el gen PorA de la cepa MC50 (no. de acceso XI 2899) en los aminoácidos 247 a 261 (SVRl) y 299 a 302 (SVR2) en Claudio y colaboradores, 1998, Clin Diagn, Lab Immunol . 5 845-855. El de van der Ley referido en la presente tiene el bucle 6 como que comprende LSENGDKAKTKNSTTE (SEQ ID NO: 52; ver la Tabla 1). Típicamente, aunque no exclusivamente, una región SVR2 puede incluir la mayoría pero no todos los aminoácidos del bucle 6, tal como ENGD TKN (SEQ ID NO: 91) en vista de la variación observada en algunos de estos y otros residuos en la alineación mostrada en la FIG. 3B.

Como será entendido a partir de lo anterior, en una modalidad amplia, . una más regiones variables de PorA completas pueden estar ausentes en una proteína aislada de la invención, o uno o una pluralidad de aminoácidos de una o más regiones variables de PorA pueden estar ausentes, en donde uno o una pluralidad de aminoácidos de PorA conservados, tales como los aminoácidos de los bucles 2, 3, 7 y/u 8, o los bucles conservados completos (tales como los bucles 2, 3, 7 y/u 8) reemplazan efectivamente los aminoácidos de región variable ausente o de región variable.

Las modalidades particulares comprenden una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 5-16 y 20-22. Las modalidades preferidas comprenden una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 11-16 y 20-22.

Se apreciará que cada región VR1, VR2, SVR1 ylo SVR2 se puede manipular independientemente para ser suprimida (por ejemplo SEQ ID NOS:5-10), reemplazadas con aminoácidos de los bucles conservados 7 u 8 (por ejemplo. SEQ ID NOS: 11 -16 y 20-22) . Tales manipulaciones se pueden combinar de modo que una región variablé se puede suprimir mientras que otra región variable se reemplaza con aminoácidos de los bucles conservados 7 u 8 (por ejemplo SEQ ID NO: 13 y 14), o diferentes regiones variables ambas se pueden reemplazar por la secuencia de aminoácidos de los bucles (por ejemplo. SEQ ID NOS 15, 16 y 20-22) .

A manera de ejemplo, una pluralidad de aminoácidos de región variable pueden ser dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o veinticinco o más aminoácidos de cualquier región variable inclusive de VRl, VR2, SVR1 y SVR2. De manera adecuada, los aminoácidos son contiguos. Ejemplos específicos se proporcionan en las Tablas 2 y 3 y la FIG. 1.

También a manera de ejemplo, una pluralidad de aminoácidos conservados de los bucles 2, 3, 7 u 8 pueden ser dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más aminoácidos de cualquiera de estos bucles. De manera adecuada, los aminoácidos son contiguos. Ejemplos específicos se proporcionan en las Tablas 2 y 3 y la FIG. 1.

Preferiblemente, VRl y VR2 están completamente ausentes, o uno o una pluralidad de aminoácidos de VRl o VR2 están ausentes. En modalidades específicas, los aminoácidos del bucle 7 reemplazan una región VRl completa y/o los aminoácidos del bucle 8 reemplazan una región VR2 (SEQ ID NOS: 11-16). En otras modalidades, una región VRl está ausente y se reemplaza por una secuencia de aminoácidos de bucle 8 o bucle 7 conservada y/o una región VRl está ausente y se reemplaza por una secuencia de aminoácidos de bucle 7 o bucle 8 conservada (SEQ ID NOS:20-22).

En otras amplia modalidad, uno o una pluralidad de aminoácidos conservados (tales como aminoácidos del bucle 2, 3, 7 y/u 8), o bucles conservados completos (tales como bucles 2, 3, 7 y/u 8) se insertan en, o de otra manera están presentes en, las regiones variables de PorA inclusive de VR1, VR2, SVR1 y SVR2. De manera adecuada, los aminoácidos de la región o regiones variables están presentes, en donde los aminoácidos de bucle conservados están presentes en, o insertados en, la secuencia de aminoácidos de región variable .

Preferiblemente, los aminoácidos de bucle conservados están presentes en, o insertados en, las regiones VR1 y/o VR2 de PorA. Las modalidades particulares comprenden una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 17-19.

En una modalidad alternativa, una o más regiones variables de la proteina PorA se interrumpen (por ejemplo comparadas con una proteina PorA de tipo silvestre) sin comprender una o más regiones conservadas de PorA, o aminoácidos de región conservada. Ejemplos preferidos de esta modalidad alternativa donde una o más regiones variables están ausentes sin la inserción o presencia de una o más regiones conservadas de PorA, o aminoácidos de región conservada se proporcionan en SEQ ID NOS: 5-10.

También se entenderá que aunque la FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) y la Tabla 1 se refieran a la cepa MC58 de N. meningitidis, la invención se puede practicar en relación con cualquier cepa de N. meningitidis . Más específicamente, ' una proteína aislada de la invención puede comprender secuencias de aminoácidos de una pluralidad de diferentes cepas de N. meningitidis . A manera de ejemplo, los aminoácidos conservados de PorA de la cepa 2996 (número de acceso de Genbank X60105.1) de N. meningitidis se puede incluir en una proteina PorA que comprende una secuencia de aminoácidos que se deriva esencialmente de, o corresponde a, PorA de la cepa M1336 de N. meningitidis (número de acceso de GenBank AAF70297.1) .

Un resumen de los constructos de la proteina PorA se proporcionan en la Tabla 7.

Se apreciará que la interrupción de la una o más regiones variables dan por resultado inmunogenicidad alterada, modificada o de otra manera mejorada de las secuencias de aminoácidos conservados de la proteina aislada (relativo con una proteina PorA de tipo silvestre o no interrumpida) . De manera adecuada, la proteina aislada de la invención induce una respuesta inmune contra una pluralidad de cepas de Neisseria meningitidis .

Como se usa en la presente, "induce una respuesta inmune" se refiere a la capacidad de una proteina aislada de la invención para producir una respuesta inmune en un mamífero al cual se administra, en donde la repuesta se dirige a N. meningitidis y/o la proteína. Preferiblemente, la respuesta inmune incluye producción de anticuerpos bactericidas. Más preferible, la respuesta inmune es protectora contra la infección por N. meningitidis .

De manera adecuada, la respuesta inmune inducida es menor que la cepa especifica, o más de reacción cruzada, que aquella inducida por una proteina PorA de tipo silvestre y/o una proteina PorA sin una o más regiones variables interrumpidas.

"Específica de cepa" se usa en la presente en el contexto de una respuesta inmune que es dirigida a, o por lo menos dirigida predominantemente a, una cepa de N. meningitidis análoga.

Como se usa en la presente, "de reacción cruzada" significa una capacidad de una proteina aislada de la invención de inducir una respuesta inmune dirigida a una o más cepas de N. meningitidis heterologas.

Como se usa en la presente, "de protección cruzada" significa una capacidad de proteina aislada de la invención de inducir una respuesta inmune y proporcionar en consecuencia protección contra la infección por una o más cepas de N. meningitidis heterologas.

La invención también proporciona fragmentos, homólogos y derivados de proteínas aisladas de la invención, tal como que comprende las secuencias de aminoácidos expuestas en cualquiera de SEQ ID NOS: 2-22, o preferiblemente SEQ ID NOS.11-22.

En una modalidad, un "fragmento" de proteína incluye una secuencia de aminoácidos que constituye menor que 100%, pero por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90-99% de la proteína aislada.

En otra modalidad, un "fragmento" es un péptido, por ejemplo por lo menos 6, preferiblemente por lo menos 10, 12, 15 y más preferible por lo menos 20 o 30 aminoácidos en longitud .

En una modalidad preferida, el fragmento comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable interrumpida como se plantea en la presente. Preferiblemente, el fragmento no consiste de una supresión de una región VR1 y/o VR2, tal como se expone en SEQ ID NOS: 2-4.

Los fragmentos de péptido se pueden obtener a través de la aplicación de técnicas de ácido nucleico recombinantes estándares o sintetizados usando técnicas de síntesis de fase líguida o sólida convencionales. Por ejemplo, la referencia se puede hacer a la síntesis de solución o síntesis de fase sólida como se describe, por ejemplo, en el capítulo 9 titulado "Péptido Synthesis" por Atherton y Shephard que se incluye en una publicación titulada "Synthetic Vaccines" editada por Nicholson y publicada por Blackwell Scientific Publications . Alternativamente, los péptidos se pueden producir mediante digestión de un polipéptido de la invención con proteasas tales como endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C y estafilococo V8-proteasa. Los fragmentos digeridos se pueden purificar mediante, por ejemplo, técnicas cromatográficas liquidas de alto desempeño (HPLC) .

También se apreciará que los péptidos y polipéptidos más grandes que comprenden una pluralidad de los mismos fragmentos o diferentes se contemplan.

De manera adecuada, un fragmento de la proteina aislada de la invención comprende uno o más determinantes sobre epitopes antigénicos. Preferiblemente, los determinantes o epitopes antigénicos son capaces de inducir una respuesta inmune contra una pluralidad de cepas de N. meningitidis .

Los fragmentos inmunogénicos se pueden identificar al administrar el fragmento a un mamífero; y al detectar una respuesta inmune en el mamífero. Tal respuesta incluirá la producción de elementos que enlazan específicamente la N. meningitidis y/o la proteína aislada, variante o derivado, y o un efecto protector contra la infección N. meningitidis .

Opcionalmente, antes de someter a prueba un fragmento particular para inmunogenicidad en el método anterior, una variedad de métodos predictivos se puede usar para deducir si un fragmento particular se puede usar para obtener un anticuerpo que tiene reacción cruzada con el antígeno nativo. Los métodos predictivos se pueden basar en la secuencia aminoterminal o carboxiterminal como por ejemplo descrita en el Capítulo 11.14 de Ausubel y colaboradores, supra. Alternativamente, estos métodos predictivos se pueden basar en las predicciones de hidrofilicidad como por ejemplo descritas por Kyte & Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157 105 and Hopp & oods, 1983, Mol. Immunol . 20 483) que se incorporan a manera de referencia en la presente, o predicciones de la estructura secundario como por ejemplo descrita por Choo & Fasman, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47 251) , que se incorpora en la presente a manera de referencia.

Además, el "mapeo de epítopes" usa anticuerpos de la invención para identificar epitopes de reacción cruzada primero a someter a prueba su capacidad de proporcionar protección cruzada, seguido al identificar el epitopo reconocido por los anticuerpos. Un método ejemplar se proporciona por Coligan y colaboradores., CURRENT PROTOCOLS IN IMMÜNOLOGY, supra.

Como se usa en la presente, un "homólogo" de proteina comparte una relación de secuencias de nucleótidos o aminoácidos definible con una proteina aislada de la invención. De manera adecuada, el homólogo comprende uno o más aminoácidos de una región variable (por ejemplo VR1, VR2, SVR1 y/o SVR2) que se interrumpen comparados con una proteina PorA de tipo silvestre.

De manera adecuada, el homólogo no es una proteina PorA de tipo silvestre. Preferiblemente, la variante no consiste de una supresión de una región VR1 y/o VR2, tal como se expone en SEQ ID NOS: 2-4.

Preferiblemente, los homólogos de proteina comparten por lo menos 70% o 75%, preferiblemente por lo menos 80% u 85% o más preferible por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de la invención, incluyendo pero no limitado a las secuencias de aminoácidos expuestas en cualquiera de SEQ ID NOS: 5-22, o preferiblemente SEQ ID NOS: 11-22.

Por ejemplo, tales homólogos se contemplan por tener secuencias de aminoácidos que difieren de aquellos ejemplificados en la presente, pero que son inmunogénicos y preferiblemente proporcionan inmunidad protectora cruzada.

El término "homólogo" como se usa en la presente incluye proteínas variantes. Como se usa en la presente proteínas "variantes" de la invención tienen uno o más aminoácidos suprimidos o sustituidos por diferentes aminoácidos. Es bien entendido en la técnica que algunos aminoácidos se pueden sustituir o suprimir sin cambiar la actividad inmunogénica del polipéptido (sustituciones conservadoras) .

Cambios más sustanciales a la inmunogenicidad se pueden hacer al introducir sustituciones o supresiones que son menos conservadoras (sustituciones no conservadoras).

El término "variante" también incluye proteína aisladas de la invención producidas de, o que comprenden secuencias de aminoácidos de, variantes alélicas.

Los términos usados generalmente en la presente para describir las relaciones de secuencia entre las proteínas respectivas y los ácidos nucleicos incluyen "ventana de comparación" , "de identidad de secuencia" , "porcentaje de identidad de secuencia" y "identidad sustancial" . Debido a que los ácidos nucleicos/proteínas respectivos cada uno puede comprender (1) solamente una o más porciones de una secuencia de ácidos nucleicos/proteínas completa que son compartidos por los ácidos nucleicos/proteínas, y (2) una o más porciones que son divergentes entre los ácidos nucleicos/proteínas, las comparaciones de secuencias se llevan a cabo típicamente al comparar las secuencias sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de típicamente 6, 9 o 12 residuos contiguos que se comparan con una secuencia de referencia. La ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) de aproximadamente 20% o menos como es comparado con la secuencia de referencia para la alineación óptima de las secuencias respectiva. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se pueden conducir mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (programa Geneworks program por Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FAST A, y TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive adison, WI, EUA, incorporado en la presente a manera de referencia) o mediante inspección y la mejor alineación (es decir, dando por resultado el porcentaje de homología más alto sobre la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También se puede hacer referencia a la familia BLAST de programas como por ejemplo divulgado por Altschul y colaboradores., 1997, Nucí. Acids Res. 25 3389, que se incorpora en la presente a manera de referencia. Un planteamiento detallado del análisis de secuencia se puede encontrar en Unit 91.3 of CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds . Ausubel y colaboradores. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999) .

El término "identidad de secuencia" se usa en la presente en su sentido más amplio para incluir el número de igualaciones de nucleótidos o aminoácidos exactas que teniendo en cuenta una alineación apropiada usando un algoritmo estándar, teniendo en cuenta el grado que las secuencias son idénticas sobre una ventana de comparación. De esta manera, un "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias ópticamente alineadas sobre la ventana de comparación, al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo., A, T, C, G, I) se presenta en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) , y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Por ejemplo, "identidad de secuencia" se puede entender que propone el "porcentaje de igualación" calculado por el programa de computadora DNAS1S (Versión 2.5 para windows; disponible de Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, EUA) .

De esta manera, está muy dentro de las capacidades de la persona experta preparar los homólogos de proteína y. ácido nucleico de la invención, tales como variantes como se define anteriormente en la presente, mediante tecnología de DNA recombinante . Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención se pueden mutar usando ya sea mutagénesis aleatoria por ejemplo usando mutagénesis de transposones, o mutagénesis dirigida al sitio. Los fragmentos de DNA resultantes luego se clonan en hospederos de expresión adecuados tal como E. coli.

Como se usa en la presente, las proteínas "derivadas" se han alterado, por ejemplo mediante conjugación o formación en complejo con otras porciones químicas, mediante modificación postraduccional (por ejemplo fosforilación, acetilación etc.), modificación de glicosilación (por ejemplo. Adición, remoción o alteración de glicosilación) y/o inclusión de secuencias de aminoácidos adicionales como seria entendido en la técnica.

Las secuencias de aminoácidos adicionales pueden incluir secuencias de aminoácidos asociadas de fusión que crean una proteina de fusión. A manera de ejemplo, las secuencias de aminoácidos asociadas de fusión pueden ayudar en la detección y/o purificación de la proteina de fusión aislada. Ejemplos no limitantes incluyen socios de fusión de enlace de metal (por ejemplo polihistidina) , proteina de enlace de maltosa (MBP) , Proteina A, glutationa S-transferasa (GST) , secuencias de proteina fluorescentes (por ejemplo. GFP) , etiquetas de epítopo tales como etiquetas myc, FLAG y de hemaglutinina .

Otros derivados incluyen proteínas aisladas que tienen el polipéptido que se pueden fusionar a un componente de vacuna basado en oligosacárido donde actúa como una proteína portadora.

Otros derivados contemplados por la invención incluyen, pero no se limitan a, modificación a las cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis de péptido, polipéptido o proteína y el uso de reticuladores y otros métodos que imponen limitantes conformaciones en los polipéptidos , fragmentos y variantes de la invención.

Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteina aislada de la invención, inclusive de variantes de fragmentos y derivados de la proteina aislada.

El término "ácido nucleico" como se usa en la presente designa DNU y RNA de hebra individual o doble. El DNA incluye DNA genómico y cDNA. El RNA incluye mRNA, RNA, RNAi, siRNA, cRNA y RNA autocatalitico . Los ácidos nucleicos también pueden ser híbridos de DNA-RNA. Un ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que incluye típicamente nucleótidos que comprenden una base A, G, C, T o U. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos puede incluir otras bases tales como inosina, metilicitosina, metilinosina, metiladenosina y/o tiouridina, aunque sin limitación a las mismas .

Un "polinucleótido" es un ácido nucleico que tiene ochenta (80) o más nucleótidos contiguos, mientras que un "oligonucleótido" tiene menor que ochenta (80) oligonucleótidos contiguos.

Una "sonda" puede ser un oligonucleótido o polinucleótido de hebra individual o doble, etiquetado adecuadamente para el propósito de detectar secuencias complementarias en la tinción de Northern o Southern, por ejemplo.

Un "cebador" es usualmente un oligonucleótido de hebra individual, que tiene preferiblemente 15-50 oligonucleótidos contiguos, que es capaz de recocerse a una "plantilla" de ácido nucleico complementaria y se extiende en una forma dependiente de plantilla mediante la acción de una DNA polimerasa tal como Tag polimerasa, DNA dependiente de RNA polimerasa o SequenasaMR.

Modalidades particulares de ácidos nucleicos aislados de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos expuesta en FIG. 2 (SEQ ID NOS- .26- 3) .

Preferiblemente, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS:32-43.

Otro aspecto particular de la invención proporciona un homólogo de un ácido nucleico aislado que codifica una proteína aislada de la invención.

En una modalidad, los homólogos de ácido nucleico codifican un homólogo o variante de una proteina aislada de la invención.

De manera adecuada, los homólogos, de ácido nucleico no codifican una proteina PorA de tipo silvestre de N. meningitidis . Preferiblemente, los homólogos de ácido nucleico comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una o más regiones variables interrumpidas de PorA, como se describe en la presente.

En otra modalidad, los homólogos de ácido nucleico comparten por lo menos 60% o 65%, preferiblemente por lo menos 70% o 75%, más preferible por lo menos 80% o 85%, y aun más preferible por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia de nucleótidos con un ácido nucleico aislado de la invención, tal como se ejemplifica en la FIG. 2 y/o SEQ ID NOS. -26-43, o preferiblemente SEQ ID NOS:32-43.

En todavía otra modalidad, los homólogos de ácido nucleico se hibridan a ácidos nucleicos aislados de la invención (tales como aquellos ejemplificados en la FIG. 2 y/o S EQ ID NOS : NOS:26-43, o preferiblemente SEQ ID NOS : 32-43) bajo por lo menos condiciones de severidad bajas, preferiblemente bajo por lo menos condiciones de severidad medias y más preferiblemente bajos condiciones de severidad altas.

"Híbrida e Hibridación" se usa en la presente para indicar el pareo de por lo menos secuencias de nucleótidos parcialmente complementarios para producir un híbrido de DNA-DNA , RNA-RNA o DNA-RNA . Las secuencias híbridas que comprenden secuencias de nucleótidos complementarios se presentan a través del pareo base entre las purinas complementarias y las pirimidinas como es bien conocido en la técnica .

En este aspecto, se apreciará que las purinas modificadas (por ejemplo, inosina, metilinosina y metiladenosina ) y pirimidinas modificadas (tiouridina y metilcitosina) también pueden acoplarse en el pareo base.

"Severidad" como se usa en la presente, se refiere a condiciones de temperatura y resistencia iónica, y presencia o ausencia de ciertos solventes y/o detergentes orgánicos durante la hibridación. Mientras es más alta la severidad, será más alto el nivel requerido de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos de hibridación .

"Condiciones de severidad alta" designa aquellas condiciones bajo las cuales solamente el ácido nucleico que tiene una alta frecuencia de bases de complementariedad se hibridará .

La referencia en la presente a las condiciones de severidad alta incluyen y abarcan: - (i) de por lo menos aproximadamente 31% v/v a por lo menos aproximadamente 50% v/v de formamida y de por lo menos aproximadamente 0.01 M a por lo menos aproximadamente 0.15 de sal para la hibridación a 42°C, y por lo menos aproximadamente 0.01 M a por lo menos aproximadamente 0.15 M de sal para el lavado a 42 °C; (ii) 1% de BSA, EDTA a 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), 7% de SDS para hibridación a 65°C, y (a) 0.1 x SSC, 0.1% de SDS, o (b) 0.5% de BSA, EDTA lmM, NaHP04 40 mM (pH 1.2), 1% de SDS para' el lavado en una temperatura arriba de 65°C durante aproximadamente una hora; y (iii) 0.2 x SSC, 0.1% de SDS para lavado en o arriba de 68°C durante aproximadamente 20 minutos.

En general, el lavado se lleva a cabo a Tm = 69.3 + 0.41 (G + C)% -12°C. En general, la Tm de un DNA dúplex disminuye por aproximadamente 1°C en cada de 1% en el número de bases igualadas.

No obstante lo anterior, las condiciones severos son bien conocidas en la técnica, tal como se describe en los Capítulos 2.9 y 2.10 de Ausubel y colaboradores, supra . Un destinatario experto también reconocerá que varios factores se pueden manipular para optimizar especificidad de la hibridación. La optimización de la severidad de los lavados finales puede servir para asegurar un alto grado de hibridación .

Típicamente, se identifican secuencias de nucleótidos de complementariedad mediante técnicas de tinción que incluyen una etapa mediante la cual nucleótidos se inmovilizan sobre una matriz (preferiblemente una membrana sintética tal como nitrocelulosa ) , una etapa de hibridación, y una etapa de detección, usando típicamente una sonda etiquetada u otro ácido nucleico de complementariedad. La tinción de Southern se usa para identificar una secuencia de DNA de complementariedad; la tinción de Northern se usa para identificar una secuencia de RNA de complementariedad. La tinción de puntos y la tinción de ranuras se pueden usar para identificar las secuencias del poli nucleótidos de DNA/DNA, DNA o RNA o RNA/RNA de complementariedad. Tales técnicas son bien conocidas por aquellas personas expertas en la técnica, y se han descritos por Ausubel y colaboradores, supra, en las páginas 2.9.1 a 2.9.20. De acuerdo con tales métodos, la tinción de Southern implica separar las moléculas de DNA de acuerdo con el tamaño mediante electroforesis en gel, transferir el DNA separado por tamaño a una membrana sintética, e hibridar el DNA enlazado a la membrana a una secuencia de nucleótidos de complementariedad. Una etapa de tinción alternativa se usa cuando se identifican los ácidos nucleicos de complementariedad en una biblioteca de cDNA o DNA genómico, tal como a través del proceso de hibridación de placa o colonia. Otros ejemplos típicos de este procedimiento se describen en capítulos 8-12 de Sambrook y colaboradores, supra .

Los métodos para detectar ácidos nucleicos etiquetados hibridados a un ácido nucleico inmovilizado son bien conocidos para los practicantes en la técnica. Tales métodos incluyen detección de auto-radiografía, quimioluminiscente , fluorescente y colorimétrica .

Los ácidos nucleicos también se pueden aislar, o detectar y/o someter a tecnología de DNA recombinante usando técnicas de amplificación de secuencia de ácidos nucleicos.

Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos adecuadas son bien conocidos para el destinatario experto, e incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ; amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) ; replicación de círculo rodante (RCR) ; amplificación basad en secuencia de ácido nucleico (NASBA) , amplificación de Q-ß replicase y amplificación dependiente de helicasa, aunque sin limitación a las mismas.

Como se usa en la presente, un "producto de amplificación" se refiere a un producto de ácido nucleico generado por amplificación de ácido nucleico.

Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos pueden incluir técnicas cuantitativas y semi-cuantitativas particulares tales como qPCR, PCR en tiempo real y PCR competitiva, como son bien conocidos en la técnica.

Todavía otro aspecto de la invención proporciona una construcción genético que comprende un ácido nucleico aislado de la invención y una o más secuencias nucleótidos adicionales .

De manera adecuada, el constructo genético está en la forma de, o comprende componentes genéticos de, un plásmido, un bacteriófago, un cósmido, una levadura o cromosoma artificial bacteriano como son bien entendidos en la técnica.

Los constructos genéticos pueden ser adecuados para el mantenimiento y propagación del ácido nucleico aislado en bacterias u otras células hospedadoras, para manipulación mediante tecnología de DNA recombinante y/o expresión del ácido nucleico o una proteína codificada de la invención.

Para los propósitos de la expresión de células hospederas, el constructo genético es un constructo de expresión. De manera adecuada, el constructo de expresión comprende el ácido nucleico de la invención enlazado operablemente a una o más secuencias adicionales en un vector de expresión. Ejemplos no limitantes de constructos de expresión se proporcionan en la Tabla 2 y Tabla 3.

Un "vector de expresión" puede ser ya sea un vector extracromosómico de autoreplicación tal como un plásmido, o un vector que se integra en un genoma hospedero.

Por "operablemente enlazadas" se propone que las secuencia (s) de nucleótido adicional se colocan relativa co9n el ácido nucleico de la invención preferiblemente para iniciar, regular o de otra manera controlar la transcripción.

En una modalidad, las secuencias de nucleótidos adicionales son secuencias reguladoras. Las secuencias de nucleótidos reguladoras serán generalmente apropiadas para la célula hospedera usada para la expresión. Numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas son conocidos en la técnica para una variedad de células hospederas.

Típicamente, la una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias líderes o de señal, sitios de enlace ribosómico, secuencias de inicio y terminación transcripcionales, secuencias de inicio y terminación traduccionales, y secuencias potenciadoras o activadoras.

Los promotores constitutivos o inducibles como son conocidos en la técnica se contemplan por la invención. Los promotores pueden ser ya sea promotores de origen natural, o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor.

En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos adicional es un gen marcador seleccionable para permitir la selección de las células hospederas transformadas. Los genes marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula hospedera usada.

Una modalidad particular de una secuencia de nucleótidos adicional comprende una secuencia poli-G modificada. El gen por A de tipo silvestre tiene un tracto poli-G en su promotor que es variable dentro y entre las cepas, y provoca niveles de expresión variables. Para asegurar la expresión consistente de las proteínas aisladas de la invención, el tracto poli-G se puede modificar para reducir la variación, como Gc se asocia con la expresión óptima de PorA. Para reducir los cambios en el tracto poli-G, se pueden modificar tal que se reemplaza con G5AG5.

El constructo de expresión también puede incluir una secuencia de nucleótidos adicional que codifica un socio de fusión (típicamente proporcionado por el vector de expresión) de modo que el polipéptido recombinante de la invención se expresa como una proteina de fusión, como se describe anteriormente en la presente.

El constructo de expresión también puede incluir una o más secuencias de nucleótidos adicionales que facilitan la recombinación homologa del ácido nucleico aislado presente en el constructo de expresión en el genoma bacteriano. A manera de ejemplo, el gen por A endógeno de N. meningitidis se puede reemplaza con una secuencia de nucleótidos exógena (por ejemplo, el cásete LacZ-kanr de pLK6; Szabo y colaboradores, 1 1992, J. Bacteriol 174 7245-7252) o el cásete sacB-kanr-Tefr de pJJ260 (Neil y colaboradores, 2009, Infect Immun.77 2285-2293.) que permite la selección de transformantes y recombinación homologa con una constructo de expresión que comprende un ácido nucleico aislado de la invención y una secuencia de nucleótidos adicional (por ejemplo, cásete LacZ-kanr de pLK6 o el cásete sacB- anr-Ter de pJJ260) . Otros procedimientos de recombinación homologa son bien conocidos por aquello personas de experiencia en la técnica .

Para el propósito particular de la purificación de polipéptido de fusión mediante cromatografía por afinidad, las matrices relevantes para la cromatografía' por afinidad son resinas conjugadas con glutationa, amilosa y níquel o cobalto respectivamente. Muchos de tales matrices son disponibles en la forma de "equipo" tal como el sistema QIAexpressMR (Qiagen) útil con socios de fusión (HIS6) y el sistema de purificación Farmacia GST.

Preferiblemente, los socios de fusión también tienen sitios de escisión de proteasa, tal como para el Factor Xa o la trombina, que permiten que la proteasa relevante digiera parcialmente el polipéptido de fusión de la invención y libere en consecuencia el polipéptido recombinante de la invención del mismo. El polipéptido liberado luego se puede aislar del socio de fusión mediante separación cromatográfica subsecuente.

Proteínas aisladas de la invención (inclusive de fragmentos, derivados y homólogos) se pueden preparar mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por aquellas personas de experiencia en la técnica. Preferiblemente, la proteína aislada es una proteína recombinante .

A manera de ejemplo solamente, una proteína aislada recombinante de la invención se puede ser producir por un método que incluye las etapas de; (i) preparar un constructo de expresión que comprende un ácido nucleico aislado de la invención, enlazado operablemente a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras; (ii) transfectar o transformar una célula hospedera adecuada con el constructo de expresión; (iii) expresar una proteina recombinante en la célula hospedera; y (iv) aislar la proteina recombinante de la célula hospedera.

Células hospederas adecuadas para la expresión pueden ser procariotas o eucariotas. Por ejemplo, las células hospederas adecuadas pueden ser células de mamífero, células de plata, células de levadura, células de insecto o células bacterianas. Una célula hospedadora preferida para la expresión de una proteina aislada de acuerdo con la invención es una bacteria. La bacteria usada puede ser Escherichia coli o N. meningitidis .

En una modalidad preferida, la célula hospedera es N. meningitidis . Preferiblemente, la célula hospedera de N. meningitidis se ha modificado para no expresar el PorA, endógeno, Opa, Opc o el polisacárido capsular y expresa un fenotipo de lipopolisacárido deseado.

La introducción de constructos genéticos en las células hospederas (ya sea procariota o eucariota) es bien conocida en la técnica, como por ejemplo descrita en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds . Ausubel y colaboradores, (John iley & Sons, Inc. 1995-2009), en particular capítulos 9 y 16. En relación con la transformación de N. meningitidis, tales métodos son bien conocidos en la técnica. También se apreciará que la N. meningitidis es "naturalmente" transformable .

La proteína recombinante se puede preparar convenientemente por una persona experta en la técnica usando protocolos estándar como se describe por ejemplo en Sambrook, y colaboradores, MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) , en particular Secciones 16 y 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel y colaboradores, (John Wiley & Sons, Inc. 1995-2009) , en particular capítulos 10 y 16, y CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan y colaboradores, (John Wiley & Sons, Inc. 1995-2009), en particular capítulos 1, 5 y 6.

También se proporcionan anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo producido contra y que se enlazan a las proteínas aisladas, fragmentos, homólogos y derivados divulgados en la presente. De manera adecuada, los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos no se enlazan a una proteína PorA de . tipo silvestre. Preferiblemente, los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos se enlazan específicamente a una región variable de PorA interrumpido (por ejemplo, región VR1, VR2, SVRl o SVR2) y no se enlaza a una región variable de PorA de tipo silvestre (por ejemplo, región VR1, VR2, SVRl o SVR2).

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, nativos o recombinante . Los protocolos bien conocidos aplicables en la producción de anticuerpos, purificación y uso se pueden encontrar, por ejemplo, en el Capítulo 2 de Coligan y colaboradores, CURRENT PROTOCOLS IN IM UNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994) y Harlow, E. & Lañe, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, que ambas se incorporan en la presente a manera de referencia.

Generalmente, los anticuerpos de la invención se enlazan a o se conjugan con una proteína, fragmento, homólogo o derivado aislado de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales. Tales anticuerpos se pueden preparar por ejemplo al inyectar una proteína aislada, fragmento, variante o derivado de la invención en una especie de producción, que pueden incluir ratones o conejos, para obtener antisueros policlonales. Los métodos para producir anticuerpos policlonales son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Protocolos ejemplares que se pueden usar se describen por ejemplo en Coligan y colaboradores, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra, y en Harlow & Lañe, 1988, supra.

Anticuerpos monoclonales se pueden producir Usando el método estándar como por ejemplo, descrito en el articulo por KOhler & Milstein, 1975, Nature 256, 495, que se incorpora en la presente a manera de referencia, o por modificaciones más recientes de los mismos como por ejemplo, descritos por Coligan y colaboradores., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra tal inmortalizar el bazo u otras células productoras de anticuerpos derivadas de una especie de producción que ha inoculado con una o más de las proteínas, fragmentos, variantes o derivados aislados de la invención.

La invención también incluye dentro de su alcance fragmentos de anticuerpo, tal como fragmentos Fe, Fab o F(ab)2 de los anticuerpos policlonales o monoclonales referidos en lo anterior. Alternativamente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden comprender anticuerpos Fv de cadena individual (scFv) contra los péptidos de la invención. Tales scFv se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos respectivamente en la Patente Norteamericana No 5,091,513, Patente Europea No 239,400 o el artículo inter & Milstein, 1991, Nature 349 293.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden usar para inmunización pasiva contra la infección por N. meningitidis . Preferiblemente, tales anticuerpos son bactericidas.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden usar para el mapeo de epítopes, como se describe anteriormente en la presente.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden usar para cromatografía por afinidad. Por ejemplo se puede hacer referencia a los procedimientos cromatográficos de inmunoafinidad descritos en el Capítulo 9.5 de Coligan y colaboradores, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden usar para detección de bacterias N. meningitidis y/o proteína PorA de N. meningitidis .

En un aspecto, un método para detectar las bacterias de N. meningitidis en un mamífero que incluye las etapas de: (i) combinar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención con una muestra biológica obtenida de un mamífero; y (ii) determinar la presencia o ausencia de un complejo que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y bacterias N. meningitidis y/o proteína PorA de N. meningitidis en la muestra, en donde la presencia del complejo es indicativa de las bacterias N. meningitidis .

La presencia o ausencia de bacterias N. meningitidis en la muestra biológica se puede determinar al obtener la muestra biológica de un mamífero, mezclar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en lo anterior con la muestra biológica, ' y detectar el anticuerpo específicamente enlazado o fragmento de anticuerpo que indica la presencia de bacterias N. meningitidis en la muestra. Típicamente, el anticuerpo específicamente enlazado o fragmento de anticuerpo forma un complejo con la proteína PorA de N. meningitidis en la muestra biológica.

De manera adecuada, la proteína PorA de N. meningitidis se deriva de o se origina de bacterias de N. meningitidis que infectan el mamífero.

El término "muestra biológica" como se usa como se refiere a una muestra que se puede extraer, no tratar, tratar, diluir o concentrar de un individuo, tal como un paciente. De manera adecuada, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre entera, suero, plasma, saliva, orina, sudor, fluido ascítico, fluido peritoneal, fluido sinovial, fluido amniótico, fluido cefalorraquídeo, biopsia de la piel y similares.

En otro aspecto, un método para detectar un anticuerpo para la proteína PorA de N. meningitidis en una muestra biológica incluye las etapas de: (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un mamífero con la proteína aislada de la invención (tal como de acuerdo, con SEQ ID NOS: 2-22 o preferiblemente SEQ ID NOS: 11-22); y (ii) determinar la presencia o ausencia de un complejo que comprende la proteína aislada y los anticuerpos PorA anti-W. meningitidis en la muestra.

De manera adecuada, los anticuerpos PorA anti-N. meningitidis son anticuerpos endógenos inducidos en respuesta a la infección del mamífero por las bacterias N. meningitidis .

Cualquier técnica adecuada para la detección de proteínas se puede usar incluyendo inmunoensayos, arreglos de proteínas (inclusive de arreglos in situ de proteínas, arreglos de DNA proteínas y arreglos programables de ácido nucleico y perfilado de expresión bidimensional (2D) ) , aunque sin limitación a los mismos. Los inmunoensayos pueden incluir, pero no se limitan a inmunotinción, tinción de Western y tinción de Puntos, radioinmunoensayos (RIAs), ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISAs) y técnicas inmunocromatográficas (ICTs) que son bien conocidas por aquellas personas de experiencia en la técnica. Por ejemplo, la referencia se puede hacer al Capítulo 7 de Coligan y colaboradores, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra que divulga una variedad de inmunoensayos que se pueden usarse de acuerdo con la presente invención. Los inmunoensayos pueden incluir ensayos competitivos como es entendido en la técnica.

En una modalidad preferida, la detección se efectúa al modificar la proteina, fragmento, homólogo o derivado aislado, o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo con una etiqueta. Una modalidad usa la proteina etiquetada, fragmento, homólogo o derivado en un inmunoensayo para detectar los anticuerpos específicos de N. meningitidis . Otra modalidad usa el anticuerpo etiquetado o fragmento de anticuerpo en un inmunoensayo para detectar la proteína PorA.

Con respecto a los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, la etiqueta puede incluir lo siguiente: (A) unión directa de la etiqueta al anticuerpo o fragmento de anticuerpo; (B) unión indirecta de la etiqueta al anticuerpo o fragmento de anticuerpo, es decir, unión de la etiqueta a otro reactivo (tal como un anticuerpo secundario) que se enlaza subsecuentemente al anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y (C) unirse a un producto de reacción subsecuente del anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

La etiqueta se puede seleccionar de un grupo que incluye un cromógeno, un catalizador, una enzima, un fluoróforo, una molécula quimioluminiscente, un ión de lantánido tal como europio (Eu34), un radioisótopo y una etiqueta visual directa. En el caso de una etiqueta visual directa, se puede hacer uso de una partícula metálica o no metálica coloidal, una partícula de tinción, una enzima o un sustrato, un polímero orgánico, una partícula de látex, un liposoma, u otra vesícula que contenga una sustancia productora de señal y similar.

Ejemplos no limitantes de las etiquetas de enzimas útiles en la presente invención incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, luciferasa, ß-galactosidasa, glucosa oxidasa, lisozima, malato deshidrogenasa y similares. La etiqueta de enzima se puede ser sola o en combinación con una segunda enzima en solución.

Ejemplos no limitantes de fluoróforos incluyen isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC), derivados de fluoresceína tales como FAM y ROX, Rojo Texas, isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITL) , R-Ficoeritrina (RPE) , fluoróforos de Alexa y Bodipy, aunque sin limitación a los mismos.

También se proporciona un método para la detección de anticuerpos anti-W. meningitidis (por ejemplo, anticuerpos bactericidas) en una muestra biológica.

En un aspecto, se proporciona un método para detectar un anticuerpo bactericida para N. meningitidis que incluye las etapas de: (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un mamífero inmunizado con la proteína aislada de la invención (tal como de acuerdo, SEQ ID NOS: 2-22 o preferiblemente SEQ ID NOS: 11-22) con las bacterias N. meningitidis; y (ii) determinar la presencia o ausencia del anticuerpo bactericida en la muestra.

Típicamente, el anticuerpo bactericida se induce en respuesta a la inmunización con la proteína aislada. Un ejemplo de un ensayo bactericida que detecta anticuerpos bactericidas se proporciona a partir de ahora en los Ejemplos .

En otro amplio aspecto, la invención proporciona métodos de detección basados en ácidos nucleicos.

En una modalidad, un método para detectar bacterias N. meningitidis en una muestra biológica incluye las etapas de aislar la muestra biológica de un paciente y usar un ácido nucleico aislado de la invención para detectar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína PorA en la muestra. La detección del ácido nucleico se puede llevar a cabo usando cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, un ácido nucleico etiquetado de acuerdo con la invención se puede usar como una sonda en una tinción de Southern de un extracto de ácido nucleico obtenido de un paciente como es bien conocido en la técnica.

Alternativamente, un ácido nucleico etiquetado de acuerdo con la invención se puede usar como una sonda en una tinción de Northern de un ARN o extracto de cDNA del paciente. Preferiblemente, un extracto de ácido nucleico del paciente se usa en relación con los cebadores de oligonucleótidos que corresponden a las secuencias de sentido y antisentido de una secuencia de ácido nucleico de la invención, con una técnica de amplificación de ácido nucleico tal como PCR, para producir en consecuencia a un producto de amplificación. El producto de amplificación se puede detectar por cualquier variedad de técnicas, tales como por hibridación por sonda como se describe anteriormente en la presente.

Una variedad de técnicas de detección de fase sólida automatizada también son apropiadas para detectar de ácidos nucleicos. Estos incluyen arreglos de cebadores inmovilizados de muy gran escala (VLSIPS™) , captura basada en cuencas magnéticas de productos de amplificación de PCR y arreglos de ácidos nucleicos, como ha sido entendido en la técnica .

La presente invención también proporciona equipos para la detección de una infección por N. meningitidis . El equipo puede comprender uno o más agentes de detección para detectar bacterias N. meningitidis, proteina PorA de N. meningitidis endógena por ácido nucleico de codificación, o anticuerpos en una muestra biológica. El equipo contendrá uno o más agentes de detección particulares descritos en lo anterior dependiendo de la naturaleza del método de prueba empleado. En este aspecto, los equipos pueden incluir una o más de una proteína aislada, fragmento, homólogo, derivado, anticuerpo, fragmento de anticuerpo o ácido nucleico (por ejemplo, cebadores o sondas) de acuerdo con la invención. Cualquiera de uno o más de estos se pueden etiquetar, como se describe anteriormente en la presente. Los equipos también pueden incluir opcionalmente uno o más de otros reactivos tales como reactivos de detección, tales como anticuerpos secundarios etiquetados, enzimas y/o sustratos para detección colorimétrica o bioluminiscente, controles positivos y/o negativos, soluciones de lavado, soluciones amortiguadoras de dilución, marcadores de tamaño de proteínas o ácidos nucleicos, DNA polimerasa, DNA ligasa, Taq polimerasa etcétera dependiendo del método de detección empleado.

Aspectos adicionales de la invención proporcionan métodos profilácticos y terapéuticos y/o composiciones farmacéuticas para tratar una infección de por N. meningitidis en un mamífero.

En un aspecto particular,, un método para prevenir o tratar una infección por N. meningitidis en un mamífero incluye la etapa de administrar al mamífero un agente inmunogénico seleccionado del grupo que consiste de: (i) una proteína aislada de la invención (tal como de acuerpo con SEQ ID NOS: 2-22 o preferiblemente SEQ ID NOS: 11-22, inclusive de homólogos, derivados y fragmentos de los mismos; (ii) un ácido nucleico de la invención (tal como de acuerpo con SEQ ID NOS: 23-43 o preferiblemente SEQ ID NOS : 32-43) , inclusive de homólogos, derivados y fragmentos de los mismos; (iii) un constructo de expresión que codifica el ácido nucleico aislado de (ii); (iv) una célula hospedera que comprende el constructo de expresión de (iii) ; (v) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza a una proteina aislada de la invención, y/o (vi) una composición farmacéutica que comprende uno o más de (i)-(v) para prevenir o tratar en consecuencia la infección de por N. meningitidis en mamífero.

De manera adecuada, el agente inmunogénico induce una respuesta inmune en el mamífero que es menos específica de cepa, o reacción más cruzada, que aquella inducida por una proteína PorA de tipo silvestre y/o una proteína PorA sin una o más de regiones variables interrumpidas. Preferiblemente, la respuesta inmune inducida es una respuesta inmune protectora .

Preferiblemente, el mamífero es un humano. En una modalidad preferida particular, la proteína aislada de la invención, inclusive de homólogos, derivados y fragmentos de la misma, está presente en una OMV.

Existen muchos métodos bien conocidos para la preparación de vacunas OMV, por ejemplo como se describe en Frasch, C, L. van Alphen, y colaboradores . (2001) . Outer membrane Protein Vesicle for Meningococcal Disease. Meningococcal Vaccmes: Methods and Protocols . A. Pollard and M. Maiden, eds, Humana Press. 66: 81-107.

En otra modalidad preferida particular, la proteina aislada de la invención, inclusive of homólogos, derivados y fragmentos de los mismos, se expresa por una bacteria que comprende un constructo de expresión cromosómicamente integrado. Preferiblemente, la bacteria es N. meningitidis .

De manera adecuada, la composición farmacéutica comprende un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por "portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" se propone un rellenador sólido o liquido, diluyente o sustancia encapsulante que se puede usar con seguridad en la administración sistémica. Dependiendo de la via de administración particular, una variedad de portadores, bien conocidos en la técnica se pueden usar. Esos portadores se pueden seleccionar de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones amortiguadas con fosfato, emulsificantes, solución salina isotónica y sales tales como sales ácidas minerales incluyendo clorhidratos, bromuros y sulfatos, ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos y malonatos y aguas sin pirógeno.

Una referencia útil que describe portadores, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991) que se incorpora en la presente a manera de referencia .

Cualquier vía de administración segura se puede emplear para administrar los agentes inmunogénicos de la invención. Por ejemplo, se pueden emplear en forma oral, rectal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intra-articular, intra-muscular, intra-dermal , subcutánea, inhalación, intraocular, intraperitoneal , intracerebroventricular, transdérmica y similares. La inyección intramuscular y subcutánea es apropiada, por ejemplo, para la administración de composiciones inmunogénicas, vacunas y vacunas de DNA.

Las formas de dosificación incluyen tabletas, dispersiones, suspensiones, inyecciones, soluciones, jarabes, trociscos, cápsulas, supositorios, aerosoles, parches transdérmicos y similares. Esas formas de dosificación también pueden incluir dispositivos de liberación controlada de inyección o implantación diseñados específicamente para este propósito y otras formas de implantes modificadas para actuar adicionalmente en esta forma. La liberación controlada del agente terapéutico se puede efectuar al recubrir el mismo, por ejemplo, con polímeros hidrofóbicos incluyendo resinas acrílicas, ceras, alcoholes alifáticos superiores, ácidos polilácticos y poliglicólicos y ciertos derivados de celulosa tal como hidroxipropilmetil celulosa. Además, la liberación controlada se puede efectuar al usar otras matrices, liposomas y/o microesferas de polímero.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para la administración oral o parenteral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas, bolsitas o tabletas que contienen cada una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos de la invención, como un polvo o gránulos o como una solución o suspensión en un líquido acuoso, un líquido no acuoso, una emulsión de aceite en agua o una emulsión líquida en agua en aceite. Tales composiciones se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos de farmacia pero todos los métodos incluyen la etapa de llevar en asociación uno o más agentes inmunogénicos como se describe en lo anterior con el portador que constituye uno o más ingredientes necesarios. En general, las composiciones se preparan al mezclar uniforme e íntimamente los agentes inmunogénicos de la invención con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, conformar el producto en la presentación deseada.

Las composiciones anteriores se pueden administrar en una manera compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad como es inmunogénicamente efectiva para proteger pacientes de infección por N. meningitidis, o tratar una infección existente. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para efectuar una respuesta benéfica en un paciente a través del tiempo tal como una reducción en el nivel de N. meningitidis, o de inhibir la infección por N. meningitidis . La cantidad del agente (s) inmunogénico que se administra puede depender del sujeto que se trata inclusive de la edad, sexo, peso y condición de salud general del mismo. En este aspecto, las cantidades precisas del agente (s) inmunogénicos requerido para ser administrado dependerán de la evaluación del profesional.

En la determinación de la cantidad efectiva del agente inmunogénico que se administra en el tratamiento de profilaxis contra N. meningitidis, el médico puede evaluar los niveles de plasma circulantes, progresión de la enfermedad, y la producción de los anticuerpos anti-N. meningitidis . En cualquier caso, las dosificaciones adecuadas de los agentes inmunogénicos de la invención se pueden determinar fácilmente por aquellas personas de experiencia en la técnica. Tales dosificaciones pueden estar en el orden de nanogramos a miligramos de los dos agentes inmunogénicos de la invención.

En modalidades particulares, los agentes inmunogénicos de la invención se pueden administrar como una vacuna terapéutica o profiláctica. Por consiguiente, la invención se extiende a la producción de vacunas que contienen activos como uno o más de los agentes inmunogénicos de la invención. Una variedad de procedimientos aplicables son contemplados para producir tales vacunas. Los procedimientos ejemplares incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en NEW GENERATION VACCINES (1997, Levine y colaboradores, Marcel Dekker, Inc. New York, Basel Hong Kong) que se incorpora en la presente a manera de referencia.

Un agente inmunogénico de acuerdo con la invención se puede mezclar, conjugar o fusionar con otros antigenos, incluyendo epitopes de células B o T de otros antigenos. Además, se puede conjugar a un portador como se describe posteriormente .

Cuando un péptido hapténico de la invención se usa (es decir, un péptido que reacciona con anticuerpos cognados, pero no puede inducir una respuesta inmune) , se puede conjugar con un portador inmunogénico. Portadores útiles son bien conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo: tiroglobulina ; albúminas tales como albúmina de suero humano; toxinas, toxoides o cualquier material de reacción cruzada mutante (CRM) de la toxina de tétano, difteria, pertusis, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus , y Streptococcus ; poliaminoácidos tales como poli (lisina : ácido glutámico) ; influenza; Rotavirus VP6, Parvovirus VP1 y VP2; proteina del núcleo del virus de hepatitis B; vacuna recombinante del virus de hepatitis B y similares. Alternativamente, un fragmento o epitopo de una proteina portadora u otra proteina inmunogénica se puede usar. Por ejemplo, un péptido hapténico de la invención se puede acoplar a un epitopo de células T de una toxina bacteriana, toxoide o CRM. En este aspecto, se puede hacer referencia a la patente norteamericana No 5, 785, 973.

Los agentes inmunogénicos de la invención se pueden administrar como vacunas de subunidad multivalentes en combinación con antigenos de N. meningitidis, o antigenos de otros organismos inclusive de las bacterias patogénicas H. influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae, etc. Alternativa o adicionalmente, se pueden administrar en conjunto con componentes de oligosacáridos o polisacáridos de N. meningitidis.

Las vacunas y otras composiciones inmunogénicas pueden incluir un adyuvante como es bien conocido en la técnica. Los adyuvantes contemplados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a: sustancias activas superficiales tales como hexadecilamina, octadecilamina , ésteres del ácido octadecil amino, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N, N-dicoctadecil-N ' ,N'bis (2-hidroxietil-propanodiamina) , metoxihexadecilglicerol , y polioles plurónicos; poliaminas tales como pirano, dextranosulfato, poli IC carbopol; péptidos tales como dipéptido muramilo y derivados, dimetilglicin, tuftsina; emulsiones de aceite; y geles minerales tales como fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre; linfocinas, QuilA y complejos estimulantes inmunes (ISCOMS) . En modalidades que se relacionan con el suministro de OMV, estas vesículas se pueden producir con o sin adyuvantes, tales como sales de aluminio.

Con respecto a los ejemplos de adyuvantes, la referencia también se hace a la publicación internacional W099/36544 incorporada en la presente a manera de referencia.

En modalidades particulares, las composiciones y métodos para tratar infecciones por N. meningitidis, inclusive de vacunas y métodos de inmunización, pueden incluir constructos de expresión de DNA que codifican proteínas aisladas de la invención.

Por ejemplo, los agentes inmunogénicos de la invención se pueden expresar por hospederos virales atenuados. Por "hospederos vírales atenuados" se proponen vectores virales que son ya sea naturales o se han vuelto, sustancialmente avirulentos. Un virus se puede volver sustancialmente avirulento mediante cualquier medio físico o químico adecuado (por ejemplo, tratamiento con calor) (por ejemplo, tratamiento con formaldehído) . Por "sustancialmente avirulento" se propone un virus cuya infectividad se ha destruido. Idealmente, la infectividad del virus se destruye sin afectar las proteínas que llevan la inmunogenicidad del virus. A partir de lo anterior, se apreciará que los hospederos virales atenuados pueden comprender virus vivos o virus inactivos .

Los hospederos virales atenuados que pueden ser útiles en una vacuna de acuerdo con la invención puede comprender vectores virales inclusive de adenovirus, citomegalovirus y preferiblemente pox virus tales como vaccinia (por ejemplo, patente norteamericana No. 4,603,112) y cepas de Salmonella atenuada (por ejemplo, como se describe en la patente norteamericana No. 4,550,081). Las vacunas vivas son particularmente ventajosas debido a que conducen a un estímulo prolongado que pueden conferir sustancialmente inmunidad de larga duración. Otra referencia que describe una variedad de vectores virales potencialmente adecuados para inmunización que usan proteínas de Neisseria, y métodos de suministro, es la publicación internacional W099/36544 incorporada en la presente a manera de referencia.

Las vacunas multivalentes se pueden preparar de uno o más microorganismos que expresan diferentes epitopes de N. meningitidis (por ejemplo, otras proteínas o epitopes superficiales de N. meningitidis) . Además, los epitopes de otros microorganismos patogénicos se pueden incorporar en la vacuna. Por ejemplo, esto puede implicar la construcción de un virus de vaccinia recombinante para expresar una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. En la introducción en un hospedero, el virus de vaccinia recombinante expresa el agente inmunogénico, e induce en consecuencia una respuesta de CTL hospedera. Por ejemplo, se puede hacer referencia a la patente norteamericana No 4,722,848, incorporada en la presente a manera de referencia, que describe vectores de vaccinia y métodos útiles en los protocolos de inmunización.

Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración o inmunización terapéutica con los agentes inmunogénicos de la invención serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica a partir de la presente descripción.

A fin de que la invención se pueda entender fácilmente y poner en efecto práctico, ahora se describirán modalidades preferidas particulares por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS INTRODUCCIÓN El PorA es una proteína principal de Neisseria meningitidis . El PorA es altamente variable entre las cepas y genera una respuesta inmune en tanto pacientes como portadores sintomáticos, al grado que se ha usado como un marcador para identificación de cepas, representando el sistema de serosubtipo (McGuinness y colaboradores 1990, supra) . El modelo actual de topología de monómero de PorA indica ocho bucles extracelulares . Derrick y colaboradores 1999, supra; van der Ley y colaboradores 1991, supra) . Como se resumen en la Tabla 1, los bucles más largos (1 y 4) son los más variables, se observa menos variabilidad en los bucles 5 y 6 (SVR1 y 2 semi-variable, respectivamente) , con esencialmente nada de variabilidad en los bucles restantes. El bucle 3 se predice para formar un "tapón" en el poro formado por cada subunidad del trímero PorA. Aun dentro de los bucles 1 y 4, la mayoría de la variación entre las cepas se confina a aquellos residuos predichos para formar la punta de los bucles. Estos son conocidos como región variable (VR) 1 y 2. Las secuencias de VR1 y VR2 de muchas cepas se han identificado (ver por ejemplo FIG. 3 y Tablas 3 y 4; Russell y colaboradores, 2004, Emerg. Infect. Dis. 10 674; http://neisseria. org/nm/t\ping/pora/vrl . shtml y. http; //neisseria . org/nm/typing/pora/vr2. shtml) .

Sorprendentemente existen mucha literatura científica que describe como las regiones fuera del VR1 VR2 también contribuyen a respuestas inmunes contra N. meningitidis (Jordans y colaboradores., 2004, Infect. Immun. 72 6503-10; van der Voort y colaboradores, 1996, supra; Martin y colaboradores, 2000, Vaccine 18 2476-81; Wedege y colaboradores. , 2003, Infect. Immun. 71 3775-81; Kotelnikova y colaj oradores, 2005, Bull. Exp. Biol . 139 593-5; patente norteamericana 7,238,345).

La invención proporciona dos amplias modalidades ejemplificadas en la presente: (1) supresión de regiones variables para enfocar respuestas inmunes a las regiones de PorA que se conservan entre las cepas de Neisseria meningitidis; y (2) presentación novedosa de las regiones conservadas mejora las respuestas inmunes a las regiones conservadas de Neisseria meningitidis .

EJEMPLO 1 Generación de alelos PorA con bucles o regiones variables suprimidas, y alelos PorA con marcadores seleccionables El gen porA y la secuencia de flanqueo se amplificó por PCR del DNA genómico de la cepa MC58 de Neisseria meningitidis y se clonó en pGE Teasy para generar pPorA. Este plásmido se usó como plantilla para varias reacciones de PCR inversa, o para la construcción de recombinación mediada por digestión de restricción. Los plásmidos se secuenciaron . Los plásmidos hechos en esta forma tuvieron una o más supresiones y/o interrupciones como se lista en la Tabla 2 y Tabla 3. Se construyeron plásmidos adicionales por métodos de biología molecular estándares (digestión de restricción, ligación, clonación) para generar plásmidos con el gen porA reemplazado por marcadores selecciónateles (ver Tabla 2) . Será evidente que el número de aminoácidos suprimidos puede ser más grande o más pequeño que aquellos descritos.

EJEMPLO 2 Plásmidos con regiones conservadas que reemplazan regiones variables Los plásmidos pDELVRl-2, y pPorA se usaron como plantillas para generar mediante PCR y otras técnicas de biología molecular estándares varios alelos PorA en los cuales las regiones de codificación VR1 y VR2 de porA se reemplazaron o modificaron con secuencias de bucles 7 y 8 como se describe en la Tabla 3 y la FIG. 1. Debe ser evidente que la secuencia de DNA que codifica otra secuencia de aminoácidos conservadas de PorA por ejemplo secuencia definida como "bucle 2", VSVGGGATQWGNR (SEQ ID NO: 48) o cualquier otra secuencia de péptidos PorA conservadas, se pueden incorporar en bucles 1 y/o 4 para presentación aumentada a los sistemas inmunes de humano o animal.

Una alineación de las secuencias de MC58 y PorA recombinantes descritas se presenta en la FIG. 1.

EJEMPLO 3 Reemplazo de PorA de tipo silvestre con el gen que expresa PorA recombinante Los plásmidos con secuencias de nucleótidos PorA descritos en la Tabla 2, Tabla 3 y FIG. 1 y FIG. 2 se pueden transformar en Neisseria meningitidis mediante transformación natural y recombinación homologa dan por resultado el reemplazo el PorA de tipo silvestre con la secuencia recombinante. Alternativamente, los alelos PorA recombinantes se pueden amplificar de plásmidos que abarcan los alelos porA recombinantes y estos amplimeros se pueden usar para transformar la N. meningitidis. Para facilitar la amplificación de los transformantes, se prepararon cepas de Neisseria meningitidis recipientes en los cuales el gen PortA se suprimió y se reemplazó con ya sea el cásete LacZ-Kanr de los genes pLK6, o con el cásete sacB- anr-Tetr de pJJ260 (ver Tabla 2) . La cepa c3 fue la cepa recipiente (Virji y colaboradores. , 1995, supra) . La cepa c9 (Virji y colaboradores, 1995, supra) también se transformó con las colonias pPorDel : LacZkan y azules seleccionadas después del crecimiento en el medio que contiene X-gal. Subsecuentemente el DNA de c2 : delPorASacb se transformó en c9 : delPorALacZ con la selección en n X-Gal, y colonias blancas seleccionadas para generar c9delPorASacb . Esta última cepa se usó como un recipiente para transformación con el plásmido que contiene alelos porA variantes. El crecimiento en el medio que contiene 10% de sacarosa permitió la selección de clones que habían reemplazado el alelo porA: sacB con el gen PorA variante. De esta manera, las cepas de N. meningitidis se habían generado expresando el PorA con los bucles 1, 4, y 5 suprimidos, o con VR1 y VR2 reemplazadas o modificadas con los bucles 7 y 8 respectivamente. Será evidente que un gen PorA recombinante se puede enlazar transcripcionalmente a otros promotores e insertar en el cromosoma de N. meningitidis por la recombinación homologa.

EJEMPLO 4 Modificación del tracto poli-G para mejorar la expresión bacteriana El gen porA de tipo silvestre tiene un tracto poli-G en su promotor que es variable dentro y entre las cepas, y provoca expresión variable. Para asegurar la expresión consistente del PorA y variantes, el tracto poli-G se modificó para reducir la variación, ya que el 11G se asocia con la expresión óptima del PorA. Para reducir los cambios en el tracto PoliG, se puede modificar tal que se reemplaza con G5AG5. Esta secuencia es de la misma longitud como Gn, pero cambiará en longitud menos frecuentemente que el tracto homopolimérico G . Para este fin, se sintetizo una secuencia que abarca aproximadamente 330 nucleótidos cadena arriba del porA, el cual modificó la región que incluye G5AG5 en su lugar del tracto poli-G nativo. Esta secuencia incluye los nucleótidos que codifican los primeros 38 aminoácidos de PorA, y también incorpora parte del gen de resistencia de canamicina de pJJ260. Esta secuencia se sintetizó por DNA 2.0, se clonó en un vector de plásmido. Esta se escindió con Sphl y RsrII, y se usó para reemplazar un fragmento Sphl-RsrII de pPorDel: SacB. El plásmido resultante, pPorDelSacFixG, se transformó en la sepa de N. meningitidis (Virji y colaboradores, 1995, supra) dando por resultado en la sepa Í3-Fix. Tales recipientes pueden reemplazar todo o parte de del promotor porñ. El C3-Fix (usado para transformación subsecuente) contiene Gil en el promotor. La transformación subsecuente con el DNA que abarca el porñ da por resultado el reemplazo de la región TetRSacBKan con el alelo porA variante. En esta forma, el DNA plásmido, o amplimeros de PCR (amplificados con cebadores PorAFl : 5' GTTCGGTCGTTTCCGATAA-3 ' (SEQ ID NO: 54) y OMWF 5' -GGGGT ATAATTGAAG ACGTATCGG-3 ' (SEQ ID NO:92), o DNA genómico, con selección en el medio que contiene 10% de sacarosa permitió la identificación de las sepas con la expresión de porñ recombinante . El análisis de secuencia identificó adicionalmente el número de residuos G en el promotor (ver Tabla 5) . Será evidente que un gen porñ recombinante se puede enlazar transcripcionalmente a otros promotores y se inserta en el cromosoma de N. meningitidis mediante recombinación homologa. Por ejemplo, el promotor del gen porB de N. meningitidis y un promotor del gen opa de Neisseria se amplifican del DNA genómico de N. meningitidis o N. gonorrhoeae, y el amplimero usado para reemplazar el promotor porA en cualquiera de los plásmidos descritos en la Tabla 3 antes de la transformación del alelo recombinante en N. meningitidis . Por ejemplo, los oligonucleótidos 2157459-2157528 del acceso AE002098.2 abarcan el promotor del gen porB de la sepa MC58 de N. meningitidis (5' -TAAATGC AAAGCTAAGCGGCTTGG AAAGCCCGGCCGGCTT AA ATTTCTTAACCAAAAAAGGAATACAGC A-3'; SEQ ID NO: 93). De manera similar, el promotor de opaA de la cepa MS11 de N. gonorrhoeae se puede amplificar por PCR usando cebadores como se describe por Belland y colaboradores 1997, Mol Microbiol. 23:123-35.

EJEMPLO 5 PorA recombinante induce la reactividad cruzada a los epítopes del PorA heterólogo Vesículas de membrana exterior (OMV) que contienen proteínas PorA de la invención se pueden preparar de N. meningitidis y administrar como vacuna. Existen muchos métodos bien conocidos para la preparación de vacunas OMV, y su preparación con o sin adyuvante tales como sales de aluminio, como se describe en Frasch y colaboradores. (2001), Outer Membrane Protein Vesicle Vaccines for Meningococcal Disease. Meningococcal Vaccines: Methods and Protocols. A. Pollard and M. Maiden, eds, Humana Press. 66: 81-107.

Brevemente, las proteínas OMV se aislaron por el método de desoxicolato y la concentración de proteínas se evaluó por el ensayo BCA, antes de la adsorción al gel de Hidróxido de Aluminio gel (Sigma) . Los grupos de 10 ratones BALB/c se inyectaron con 0.1-10 \iq de proteína total en los días 0, 21 y 28, seguido por la recolección de sangre de exanguinación terminal 14 días después de la administración final de la vacuna. El suero se preparó de la sangre por métodos bien conocidos. Brevemente, la sangre se coaguló a temperatura ambiente durante 1-2 horas, y se incubó a 4°C durante la noche. El suero se recolectó como sobrenadante después de 10 minutos de centrifugación a 10,000 x g 5 minutos a 4°C. El suero se diluyó en PBS y se usó en la inmunotinción de Western contra proteínas insolubles en sarcosil de cuatro cepas y sus mutantes AporAr:tet. El anticuerpo secundario fue un conjugado alcalino-fosfatasa IgG anti-ratón de cabra (Sigma), y se detectó en enlace colorimétricamente usando el NBT/BOP (Sigma) . Esto indicó que el suero de los ratones vacunados con OMVs que comprenden un proteína aislada de la cepa 1728-2 (que expresa PorA con VR1 reemplazado con el bucle 7 y VR2 reemplazado con el bucle 8; SEQ ID NO: 15) reconocida por PorA de todas las cepas (ver Tabla 5 y Figura 5) . Las cepas usadas (y su serosubtipo PorA relevante) fueron MC58 (Pl.7,16-2), BZ133 (Pl.18-1,3), BZ232 (Pl.5-2, 2-2) y 400 (Pl.19,15) .

EJEMPLO 6 Proteínas PorA recombinantes inducen reactividad cruzada a los epítopes superficiales de PorA heterologo por ELISA Las bacterias de cultivo durante la noche en medios sólidos (agar BHI) se sub-cultivaron durante 4 horas antes de re-suspenderse a A600nm=0.1, exterminio con calor (56°C durante 30 minutos) antes de recubrir placas de 96 cavidades de fondo plano (Nunc immunosorp) . Los sueros se recolectaron de ratones que habían sido vacunados con 0.1-0.5 g de proteína preparada como OMVs descrita en el Ejemplo 5. Los sueros de los ratones vacunados se sometieron a prueba para su capacidad de reconocer células bacterianas en este ensayo. Los anticuerpos secundarios fueron conjugados de HRP inmunoglobulinas anti-ratón de cabra (DAKO P 0447, producidos contra inmunoglobulinas de ratón, principalmente IgG) . El título medio geométrico recíproco reportado en las FIGS. 6A y 6B y la Tabla 6 es la última dilución en la cual la lectura estuvo arriba del control negativo (definido como medio del control negativo OD más 3SD) . En cada caso, los sueros se sometieron a prueba contra las cepas de origen (400, BZ133, y BZ232) y las cepas mutantes PorA isogénicas respectivas. Sorprendentemente, la OMV de las cepas 1728-2 (que expresan PorA con la VR1 reemplazada con el bucle 7 y la VR2 reemplazada con el bucle 8; SEQ ID NO: 15) y de la cepa D145 (que expresa PorA con los bucles 1, 4, y 5 suprimidos; SEQ ID NO: 5) indujeron anticuerpos que reconocieron las tres cepas de prueba con títulos más altos que las tres cepas mutantes PorA de prueba. A la inversa, la OMV de las cepas c9 (que expresan PorA P1.7, 16-2), las cepas 027-3 (que expresa PorA de SEQ ID NO.13) y la cepa 028-10 (que expresa PorA de SEQ ID NO: 14) no indujeron consistentemente anticuerpos de murino que reconocieron las cepas de tipo silvestre mejores que las cepas mutantes PorA en este experimento.

EJEMPLO 7 Ensayo bactericida para evaluar la capacidad de las OMV con PorA variante a las cepas autólogas o heterólogas objetivo Este ensayo se llevó a cabo mediante una modificación del método descrito por Hoogerhout y colaboradores 1995 Infection and Inununity 63: 3473-3473). Brevemente, las bacterias se desarrollaron durante la noche sobre placas de BHI a 37°C en C02 al 5%. Las bacterias de este cultivo durante la noche se sub-cultivaron bajo las mismas condiciones durante 4-6 horas antes de la suspensión en 1 mL de PBS . La suspensión bacteriana se ajusta a aproximadamente 105 cfu/mL en PBS. Los sueros que se someten a prueba se inactivan con calor a 56°C durante 45 minutos. El complemento de conejo bebe se obtiene del proveedor comercial (por ejemplo. PelFreez) . El ensayo se lleva a cabo en placa de microtítulo de 96 cavidades de fondo redondo de poliestireno estéril. El volumen total en cada cavidad es de 24 L, que incluye: 12 L de suero diluido en serie dos veces en PBS y 6 pL de suspensión bacteriana (que contiene entre 300-900 bacterias). Los sueros y las bacterias se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos ante de la adición de 6 pL de 80% de complemento en PBS (concent ación final de 20% vol/vol) . Los controles son a) PBS, bacterias y complemento, b) PBS, bacterias y suero. Después de la adición de todos los componentes y el mezclado, 7 pL de una alícuota de cada cavidad de control se transfiere a una placa de agar de BHI. La placa de microtítulo se incuba a 37 °C en C02 al 5% durante 60 minutos. Después de esta incubación, 7 pL de una alícuota de cada cavidad se transfiere a las placas de agar de BHI. Todas las placas de BHI se incuban durante 14-18 horas a 37 °C en CO2 al 5% y las colonias bacterianas se cuentan. El exterminio bactericida en suero se reporta como la dilución recíproca más alta en la cual por lo menos 90% de las bacterias se exterminan. En cada caso, los sueros de ratón individuales o acumulados se someten a prueba contra C58, MC58por::tet y contra las cepas que expresan PorA heterólogo o sus mutantes PorA (MC58 PorA es Pl.7,16.2, mientras que las cepas 2996 y M990 por ejemplo son Pl.5.1,2-2 y Pl.18,25 respectivamente; ver FIG. 3A) .

Por toda la especificación el objetivo ha sido describir las modalidades preferidas de la invención sin limitar la invención a ninguna modalidad o recolección especifica de características. Por lo tanto se apreciará por aquellas personas de experiencia en la técnica que, en vista de la presente descripción, varias modificaciones y cambios se pueden hacer en las modalidades particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance de la presente invención .

Todos los programas de computadora, algoritmos, literatura de patente y científica referidos en la presente se incorporan en este documento a manera de referencia.

Tabla 1. Secuencias de bucles de C58 PorA (P1.7, 16, número de acceso AF226344). La negrita indica residuos idénticos o conservados entre los serosubtipos . La extensión de los bucles sigue el precedente del modelo PorA propuesto por van der Ley y colaboradores, 1991, supra, o Derrick y colaboradores. , 1999, supra.

Bucle Secuencia 1 (VRl) VEGRNYQLQLTEAQAANGGASGQVKVTKVT AKRKSRIRTKI (SEQ ID NO:47) 2 VSV-GGGATQWGNR (SEQ ID NO: 48) 3 ASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDD (SEQ ID NO: 49) 4 (VR2) PIQNSKSAYTPAYYTKNTNNNLTLVPAVVGKPGS (SEQ ID NO: 50) 5 (SVR1) RHANVGRDAFELFLLGSGSDQAKGTDPLKHH (SEQ ID NO: 51) 6 (SVR2) LSE GDK—TKNSTTE (SEQ ID NO: 52) 7 PDLIERGKKGENTS (SEQ ID NO: 53) 8 KRHTGIGNYTQIN (SEQ ID NO: 54) O O •Tabla 2 Constructos de expresión para la expresión bacteriana de SEQ ID NOS: 1 o o aminoácido aminoácid S 38-63 os 187- suprimidos 211 suprimidos <-« © Ln Tabla 3: Constructos de expresión para expresión bacteriana de SEQ ID NOS: 11-19 O Tabla 4. Derivación de las cepas recombinantes de meningitidis Tabla 5. Cepas recombinantes de N. meningitidis usadas para estudios de vacunas Tabla 6. Datos tabulados a partir del Experimento 2 del Ejemplo 6. Los sueros acumulados de 10 ratones vacunados con 0.1-0.5 de OMV de desoxicolato se usaron como diluciones de dos veces en serie de anticuerpos primarios contra bacterias exterminadas con calor de las cepas listadas ("cepas sometidas a prueba") en un ensayo ELISA. En esta tabla, P-indica cepa con el gen porA interrumpido.

Inmunógeno : (9 P- 1728-2 D145 027-3 028-10 Sepa sometida a prueba 400 16000 32000 406375 256000 3177 15996 400P- 12699 64000 40317 64000 7998 31989 BZ133 8000 64000 203187 128000 5035 50816 BZ133P- 8000 64000 50797 64000 7998 15996 BZ232 6350 32000 161270 80635 12706 15996 BZ232P- 6350 40317 64000 40317 50816 40272 Tabla 7. Resumen de los constructos de proteínas.

Claims (44)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína PorA de Neisseria meningitidis, en donde una o más regiones variables de la proteína PorA se interrumpen al comprender una o más regiones conservadas de PorA, o aminoácidos de región conservada.

2. La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la una o más regiones variables se seleccionan del grupo que consiste de: una región VR1; una región VR2 una región SVR1; y una región SVR2.

3. La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la una o más regiones variables se seleccionan del grupo que consiste de: una región VR1; y una región VR2.

4. La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la región conservada de porA es, o comprende, una secuencia de aminoácidos de bucle 2, bucle 3, bucle 7 y/o bucle 8.

5. La proteína aislada de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la una o más regiones variables, o uno o más aminoácidos de las mismas, están ausentes.

6. La proteína aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la una o más regiones variables comprende una o más regiones conservadas de PorA o aminoácidos de región conservada, insertados en las mismas.

7. La proteina aislada de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 5-22.

8. La proteina aislada de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 11-22.

9. Una proteina aislada que es una variante de la proteina aislada de conformidad con cualquier reivindicación precedente que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a la misma, caracterizada porque la proteina aislada no es una proteina PorA de tipo silvestre.

10. Una proteina aislada, caracterizada porque es un derivado de la proteina aislada de conformidad con cualquier reivindicación precedente.

11. Una proteina aislada, que es, o comprende un fragmento, caracterizada porque comprende por lo menos veinte (20) aminoácidos contiguos de la proteina de aislada de conformidad con cualquier reivindicación precedente.

12. La proteina aislada de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque es capaz de inducir una respuesta inmune que es menos especifica de cepa que aquella inducida por la proteina PorA de tipo silvestre correspondiente.

13. La proteina aislada de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la respuesta inmune proporciona protección contra una pluralidad de cepas de N. meningitidis .

14. Una Vesícula de Proteína de Membrana Exterior (OMV) , caracterizada porque comprende la proteína aislada de conformidad con cualquier reivindicación precedente.

15. Un ácido nucleico aislado, caracterizada porque que codifica una proteína aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

16. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS:26-43.

17. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS .32-43.

18. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-17.

19. Un constructo genético, caracterizado porque comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18; y una o más secuencias de nucleótidos adicionales.

20. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el constructo genético de la reivindicación 19.

21. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque es una bacteria.

22. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque es N. meningitidis .

23. Un método para producir una proteina recombinante, el método caracterizado porque comprende las etapas de: (i) cultivar una célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-22 tal que la proteina recombinante se expresa en la célula hospedera; y (ii) aislar la proteina recombinante.

24. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, caracterizado porque se enlaza a, o se produce contra, una proteina aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

25. Un método para detectar bacterias N. meningitidis en un mamífero, el método caracterizado porque incluye las etapas de:- (i) combinar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24 con una muestra biológica obtenida de un mamífero; y (ii) determinar la presencia o ausencia de un complejo que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y bacterias N. meningitidis y/o proteína PorA en la muestra, en donde la presencia del complejo es indicativo de las bacterias N. meningitidis .

26. Un método para detectar un anticuerpo para la proteína PorA de N. meningitidis, el método caracterizado porque incluye las etapas de:- (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un mamífero con la proteína aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13; y (ii) determinar la presencia o ausencia de un complejo que comprende la proteína aislada y los anticuerpos PorA de N. meningitidis en la muestra.

27. Un método para detectar un anticuerpo bactericida para N. meningitidis, el método caracterizado porque incluye las etapas de:- (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un mamífero inmunizado con la proteína aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 con bacterias N. meningitidis; y (ii) determinar la presencia o ausencia del anticuerpo bactericida en la muestra.

28. Un método para detectar bacterias N. meningitidis, el método caracterizado porque incluye la etapa de usar el ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-18 para detectar una secuencia de ácidos nucleicos en una muestra biológica obtenida de un mamífero que indica la presencia de las bacterias N. meningitidis .

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-28, caracterizado porque la muestra biológica es obtenible de un humano.

30. Un equipo para detectar una infección por N. meningitidis, el equipo caracterizado porque comprende: una proteína aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13; el ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-18; y/o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 24; y opcionalmente uno o más de otros reactivos.

31. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: una proteína aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13; la vesícula de membrana exterior (OMV) de la reivindicación 14; el ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-18; el constructo genético de la reivindicación 19; la célula hospedera de cualquiera de las reivindicaciones 20-22; el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 24; y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

32. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque es una vacuna.

33. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31 o reivindicación 32, caracterizada porque comprende la proteina aislada en una Vesícula de Proteína de Membrana Exterior (OMV) .

34. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 32 o reivindicación 33, caracterizada porque comprende una bacteria que comprende un constructo genético cromosómicamente integrado.

35. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la bacteria es Neisseria meningitidis .

36. Un método para prevenir o tratar una infección por N. meningitidis en un mamífero, el método caracterizado porque incluye la etapa de administrar una proteína aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13; la vesícula de membrana exterior de la reivindicación 14; el ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-18; el constructo genético de la reivindicación 19; la célula hospedera de cualquiera de las reivindicaciones 20-22; el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 24; y/o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31-35 al mamífero para prevenir o tratar en consecuencia la infección por N. meningitidis en el mamífero.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la célula hospedera es una bacteria que comprende un constructo genético cromosómicamente .integrado .

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la bacteria es Neisseria meningitidis .

39. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la proteína aislada está en una Vesícula de Proteína de Membrana Exterior (OMV) .

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36-39, caracterizado porque el mamífero es un humano .

41. El aislado de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1-13; la vesícula de membrana exterior de la reivindicación 14; el ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-18; el constructo genético de la reivindicación 19; la célula hospedera de cualquiera de las reivindicaciones 20-22; el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 24; caracterizado porque es para el uso en la prevención o tratamiento de una infección por N. meningitidis en un mamífero .

42. La célula hospedera para el uso de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque es una bacteria que comprende un constructo genético cromosómicamente integrado.

43. La célula hospedera para el uso de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque la bacteria es Neisseria meningitidis.

44. La proteína aislada para el uso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque está en la Vesícula de Proteína de Membrana Exterior (OMV) .