MX2012015056A - Uso de antigenos recombinantes dimericos producidos en escherichia coli para determinar la cantidad de anticuerpos especificos contra virus de influenza en muestras de suero sanguineo. - Google Patents

Abstract

Se presenta la invención de un método inmunológico (tipo ELISA) para el diagnóstico de la presencia, concentarción ó título de anticuerpos anti Influenza A/H1N1/2009 en muestras de suero sanguíneo de sujetos humanos ó modelos animales tales como hurones, ratas, ratones, entre otros. El componente fundamental del método diagnóstico es una proteína, referida en la invención como dHA63-286-H1N1. Dicha proteína es un dímero del fragmento de la proteína Hemaglutinina del virus de Influenza A H1N1/2009 expresada en cepas de Escherichia coli. Adicionalmente se protege el uso de antígenos recombinantes, análogos en su construcción a la proteína dHA63-286-H1N1, tal que contengan un dímero de la región de la hemaglutinina comprendida entre los aminoácidos 63 y 286 de un virus específico de Influenza A.

Description

USO DE ANTÍ GENOS RECOMBINANTES DIMÉRICOS PRODUCIDpS EN Escherichia cotí PARA DETERMINAR LA CANTIDAD DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS CONTRA VIRUS DE INFLUENZA EN MUESTRAS DE SUERO SANGUÍNEO CAMPO TECNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al campo técnico de la Biotecnología aplicada al Í diagnóstico para aplicación en Medicina Clínica Humana y Veterinaria. Particularmente la presente invención refiere a un método inmunológico de diagnóstico ó cuantificación de la cantidad de anticuerpos específicos contra el virus de la Influenza A/H1N1/2009.

OBJETO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención tiene por objeto una proteína recombinarite (SEC ID No. 2) que es propuesta como el componente principal de dispositivos ó sistemas diagnósticos para la evaluación cuantitativa de anticuerpos específicos contra el virus de la Influenza A subtipo H1N1/2009. Otro aspecto de la presente invención tiene por sujeto a la i, familia de proteínas que, diseñadas bajo la misma racional que la proteína correspondiente a la secuencia SEC ID No. 2, puedan ser utilizadas como componentes principales de dispositivos ó sistemas diagnósticos para la evaluación cuantitativa de anticuerpos específicos contra otros virus de Influenza A estacional o pandémica. En otro aspecto de la presente invención, se presenta y protege un método diagnóstico tipo ELISA por el cual las proteínas recombinantes referidas pueden ser utilizadas para el diagnóstico de anticuerpos específicos dirigidos contra el virus de la Influenza A/H1N 1/2009 ú otros virus de Influenza A.

ANTECEDENTES La influenza, en todas sus variantes, cobra millares de vidas mundialment ie cada año. li Mundialmente, un promedio superior a 500,000 muertes fueron causadas por Influenza estacional en los pasados años. Cuantiosas pérdidas económicas en ausentismo laboral y productividad son también ocasionadas por la Influenza. Recientemente, el surgimiento de t un variante de virus de Influenza de origen porcino, transmisible entre humanos, denominado como virus de la Influenza humana A H1N1 causó alarma al convertirse en una Pandemia (primera pandemia de Nivel 6, categoría atribuida por la OMS el día 1 1 de junio de 2009). La presente invención refiere un método inmunológico para la determinación cuantitativa de anticuerpos contra el virus de la Influenza A/HlNl/2009 en muestras de sueros de humano (o animales) basada en el uso de un dímero de una proteína recombinante obtenida por cultivo de clonas de Escherichia coli. Dicha proteína, corresponde estructuralmente a un fragmento de la región inmunogénica de la Hemaglutinina del virus de la Influenza A/H 1 1 /2009.

Típicamente, la cuantifícación de anticuerpos contra Influenza se basa en la titulación de sueros sanguíneos con la cepa del virus contra el cual se desea determinar presencia de anticuerpos específicos. El ensayo opera bajo el siguiente principio. La pr teína más expuesta de la cápside de los virus de Influenza A, y por tanto la más antigénica, es la Hemaglutinina, HA en forma abreviada (ver Figura 1). Esta proteína tiene la propiedad de aglutinar eritrocitos dada su afinidad por los receptores superficiales presentes en ellos (ver Figura 2-A). Entonces, en ausencia de inhibidores de aglutinación, cantidades suficientes de virus activos o atenuados de Influenza causan la aglutinación y precipitación de eritrocitos. Estos ensayos de hemaglutinación son rutinariamente empleados, por ejemplo, para titular la cantidad de virus presente en una muestra. Para tal efecto existen protocolos estándar de ejecución de estos ensayos que incluyen recomendaciones sobre la naturaleza de los eritrocitos a emplear (regularmente eritrocitos de pollo relativamente frescos y de apropiada calidad), la cantidad de virus a utilizar y como inactivarlo, y las características geométricas de las placas donde se realiza el ensayo (regularmente placas de inmuno-ensayo de 96 pocilios con fondo cónico). Si estos ensayos de aglutinación se practican en presencia de inhibidores de aglutinación, la aglutinación se observará a mayores títulos virales dependiendo de la afinidad del inhibidor por la Hemaglutinina del virus y de la cantidad relativa del inhibidor. Siendo la hemaglutinina la proteína más antigénica de los virus de Influenza, un porcentaje significativo de los anticuerpos generados contra influenza reconocen y bloquean específicamente a la Hemaglutinina del virus correspondiente. Consecuentemente, si un ensayo de hemaglutinación se practica en presencia de anticuerpos contra influenza, el proceso de aglutinación se verá inhibido (ver Figura 2-B) dependiendo de la especificidad de estos anticuerpos contra el virus específico y de su cantidad relativa. El método de inhibición de la hemaglutinación descrito presenta ciertos inconvenientes de implementación. Particularmente el requerimiento de disponibilidad y manejo del virus limitan su implementación a laboratorio al menos medianamente tecnificados y con condiciones que aseguren la contención del virus (típicamente condiciones de Nivel de seguridad II ó III). Adicionalmente, la necesidad de suministro de eritrocitos de adecuada calidad y de placas especiales para el ensayo limita la rápida implementación de la técnica. Por otro lado, el resultado del ensayo se basa en inspección visual de la presencia/ausencia de efecto aglutinante, lo cual implica cierto grado de subjetividad. En este contexto, el método de determinación de anticuerpos específicos detallado observa ventajas significativas sobre el método de inhibición de aglutinación: (a) no requiere del uso del virus, (b) no requiere disponibilidad de eritrocitos; (c) puede efectuarse en placas convencionales; (e) para la interpretación dé resultados descansa en la evaluación de absorbancias (metodología cuantitativa ampliamente utilizada).

Estas ventajas sobre el método estándar adquieren particular relevancia en algunas aplicaciones específicas. Particularmente, en el contexto de estudios epidemiológicos, el análisis de cientos ó miles de muestras de suero resulta frecuente. Contemplando el método estándar de inhibición de aglutinación, el manejo de este número de ensayos requeriría el montaje de técnicas de cultivo viral a fin de suplir de la cantidad de virus necesario. Esto a su vez implica instalaciones, protocolos y personal especializado. El método motivo de la presente invención utiliza, en lugar de partículas virales activas o atenuadas, hemaglutinina recombinante, reduciendo con ello los requerimientos de seguridad, manejo, infraestructura y personal especializado.

Además de las aplicaciones epidemiológicas ya mencionadas, el método descrito puede utilizarse en la determinación de efectividad de potenciales vacunas anti-Influenza, tanto en estudios de reconocimiento específico de anticuerpos, como en estudios de inmunogenicidad con modelos animales. Adicionalmente, la determinación de nivel de anticuerpos específicos circulantes en sangre permite establecer si una persona presenta ya algún nivel de protección contra la infección por influenza. En escenarios de escasez de de vacuna, tal información resulta de gran utilidad para mejor administrar las dosis disponibles.

En la solicitud de patente MX/a/2009/014098 con fecha de ingreso 18 de diciembre 2009, ! documentamos la invención de un método ELISA para la detección de anticuerpos anti- i Influenza A/HlNl/2009 en suero sanguíneo humano ó de animales. De acuerdo a nuestros ¡i experimentos, la proteína HA63-286-HlNl exhibe la capacidad de reconocimiento antigénico i específico. Particularmente, es reconocida selectivamente por anticuerpos próducidos por sujetos que fueron infectados por el virus de Influenza A H1N1/2009 [Solicitud MX/a/2009/014098; Alvarez et al. (2010). Specific Recognition of Influenza A/HlNl/2009 Antibodies in Human Serum: A Simple Virus-Free ELISA Method. PLoS ONE 5(4): el0176; López-Pacheco et al. (201 1) Virus-free ELISA method for the determination of influenza A/HlNl/2009 antibodies in human serum. Journal of Influenza and other Infectious Diseases,5 Suplemment 1 :135-138]. Esto implica que su estructura tridimensional mantiene un alto grado de similitud con la región más expuesta de la hemaglutinina del virus de Influenza A H1N1. Los resultados publicados por Dubois et al. (2011) corroboran esta inferencia por cristalografía de rayos X [DuBois et al. (2011). The receptor binding domain of influenza virus hemagglutinin protein produced in Escherichia coli folds into its native, immunogenic structure. Journal of Virology, 82(2): 865L872].

Por tanto, la proteína HA63.286-H1N1 es útil en la determinación de la presencia de I' anticuerpos específicos contra el virus de la Influenza A H1N1 por medio de inmunoensayos [Elizondo-Montemayor et al. (201 1). Seroprevalence of Antibodies to Influenza A/HlNl/2009 among Transmission Risk Groups during the Second Wave in México by a Virus-free ELISA method. International Journal of ¦ Infectious /seases.l5(l l):e781 -6; Elizondo-Montemayor et al. (2012). Clinical featúres of 2009 pandemic H1N1 Influenza according to seroprevalence status during the second wave in the general population in México. Respiratory Care, Vol. 57(10): 1586-1593].

En esta invención, una proteína recombinante producida en E. coli, la cual correspondía en su secuencia aminoacídoca a una región de la proteíná hemaglutinina del virus de influenza A/H1N 1/2009, era utilizada como antígeno. En esta invención, la sensibilidad del método descrito en la solicitud MX/a/2009/014098 se ve significativamente mejorada por el uso de un dímero de la misma región de la hemaglutinina del virus. La construcción» dimérica es producida en Escherichia coli, utilizando una secuencia genética que contiene la información para la expresión de una primera región globular, un ligando o "linker" de varios aminoácidos, y una segunda secuencia para la expresión de una segunda región globular. La construcción también contiene una región para la expresión de unaj etiqueta de seis histidinas que resulta conveniente para la adhesión del antígeno dimérico a superficies cargadas con anticuerpos anti-histidina u otras superficies afines por histidinas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. A. Esquema ilustrativo de la arquitectura del virus de la Influenza A H1N1. El virus está conformado por una cápside que contiene material genético, ARN por tratarse de un ARN virus. B. Esquema ilustrativo de las dos proteínas más expuestas de la cápside del virus (y por lo tanto las más inmunogénicas) son la hemaglutinina (HA) y la neuroaminidasa (NA).

Figura 2-A. Representación esquemática de la prueba tradicional de hemaglutinación. En ausencia de un inhibidor de aglutinación, la hemaglutinina de cápsides virales(l) induce la aglutinación de eritrocitos de pollo ó humanos(2).

Figura 2-B. Representación esquemática de la prueba tradicional de inhibición de la hemaglutinación para determinar la cantidad de anticuerpos específicos contra variantes específicas del virus de Influenza. En presencia de anticuerpos (1) que reconozcan la hemaglutinina del virus de la Influenza(2) utilizado en ensayo, el proceso de aglutinación de eritrocitos(3) es inhibido proporcionalmente a la cantidad y la especificidad de los anticuerpos presentes.

Figura 3-A. Representación conceptual del proceso de producción de variantes sintéticas de antígenos monoméricos y diméncos de Influenza. La secuencia de ARN codificante para la región más expuesta de la HA del virus de Influenza A H1N1 (comprendida entre los aminoácidos 63 y 286 de la secuencia codificante para HA), fue seleccionada para ser traducida a una secuencia de ADN y clonada en cepas de Eschericia coli. El constructo de DNA aquí denominado "M" expresa la proteína antigénica monomérica aquí denominada HA63-286-HlNl, objeto de la solicitud de patente MX/a/2009/014098. La secuencia de ADN denominada HA63_286-H1N1 es antecedida por un promotor y precedida por una secuencia de histi dinas que facilitan la posterior recuperación de la proteína. El constructo D contiene una secuencia codificante para una etiqueta de seis histidinas (6-His), y dos secuencias para expresión de la proteína HA63-286-HlNl unidas por una serie de nucleótidos que codifican para un ligando (secuencia "linker"). La proteína resultante de la expresión de este constructo es el dímero dHA63-286-HlNl .

Figura 4-A. Representación esquemática del inmuno-ensayo para validar la | cantidad de anticuerpos específicos contra un virus particular de influenza en sueros de humano ó I. modelos animales. Adsorción de anticuerpos anti-histidina a la superficie de los pocilios de ensayo y bloqueo de espacios de superficie utilizando una solución de caseína ú otra proteína o agente de bloqueo (óvalos pequeños).

Figura 4-B. Representación esquemática del del inmuno-ensayo para validar la cantidad de anticuerpos específicos contra un virus particular de influenza en sueros de humano ó modelos animales. Adición de la proteína recombinante dHA63-286-HlNl (semicírculos unidos por un ligando) correspondiente a un virus particular de influenza. La proteína contiene una secuencia de histidinas (círculo pequeño) por medio de la cual se unirá selectivamente a los anticuerpos anti-histidina presentes en la superficie de la placa de ensayo.

Figura 4-C. Representación esquemática del del inmuno-ensayo para validar la cantidad de anticuerpos específicos contra influenza en sueros de humano ó modelos animales. Adición de muestras de suero (Y) potencialmente conteniendo anticuerpos específicos contra la proteína HA63-286-HlNl ó contra la hemaglutinina de un virus particular de influenza. Un lavado posterior permite remover los anticuerpos no fijados. El panel derecho1 ilustra un escenario con mayor concentración de anticuerpos específicos que el panel izquierdo.

Figura 4-D. Representación esquemática del del inmuno-ensayo para validar la cantidad de anticuerpos específicos contra influenza en sueros de humano ó modelos animales. Adición de un anticuerpo peroxidado anti-IgG humano (ó anti-IgG de la especie animal sujeto de estudio). Estos anticuerpos se unirán a los anticuerpos de suero retenidos por la proteína il HA63-286-HlNl . Los anticuerpos anti-IgG no unidos son removidos por sucesivos lavados con solución buffer. i' Figura 4-E. Representación esquemática del del inmuno-ensayo para validar la cantidad de anticuerpos específicos contra influenza en sueros de humano ó modelos animales. La adición de sustrato para la peroxidasa posibilitará la correspondiente reacció enzimática.

La reacción de peroxidación generará coloración. La intensidad de color desarrollada es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos retenidos.

Figura 5. Evidencia de reconocimiento específico de la proteína dHA63.286-HlNl por anticuerpos de pacientes convalecientes que fueron diagnosticados como positivos a infección por Influenza A/H1N1/2009 por métodos PCR específicos. La señal de absorbancia en los ensayos realizados a dos pacientes positivos (Positivo Ay Positivo B) es significativamente superior a aquella observada en muestras de suero de voluntarios no infectados por Influenza A/H1N1/2009 (Negativo). El umbral de positividad propuesto se ubica en el valor de absorbancia de 1.25.

Figura 6. Resultados de un inmuno-ensayo tipo ELISA donde los antígenos mHA63-286- H1N1 y dHA63-286-HlNl son expuestos a sueros de pacientes no infectados ó infectados con el virus de la Influenza A H1N1. En ausencia de anticuerpos de pacientes positivos, tanto en los ensayos que utilizan el antígeno mHA63_286-HlNl como en aquellos que ' i: utilizan el antígeno ???^ßß-?? ?p^??^dd-???? se observa una señal basal, aquí i normalizada al valor de una unidad de absorbancia relativa (barra blanca). Anticuerpos de sueros de pacientes positivos a Influenza A/H1N 1/2009 reconocen a los antígenos mHA63- 286-H1N1 (barra gris claro) y dHA63-286-HlNlmHA63-286-HlNl (barra gris obscuro). La señal observada en los ensayos donde el antígeno dimérico es utilizado exhiben un valor de ¡i absorbancia mayor, indicando un mayor grado de reconocimiento específico. lias barras de error fueron calculadas en base al porcentaje máximo de varianza (100 x Absorbancia promedio /desviación estándar. Se consideraron tres réplicas para cada análisis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método de evaluación de la concentración ó titulo de anticuerpos específicos contra el virus de la Influenza A H1N 1/2009 en sueros de humanos o de animales. El método se basa en el uso de un dímero de la proteína recombi!hante HA63- 286-H1N1 del virus de Influenza A/H1N1 , composición dimérica del segmento análogo al comprendido entre los residuos 63 y 286 de la secuencia de la Hemaglutinina del virus. La mencionada composición dimérica será referida como dHA 3 -286-HlNl . En i su versión recomendada, el método diagnóstico motivo de la presente invención utiliza la versión de la proteína recombinante dHA63.286-HlNl con una secuencia N-terminal de seis histidinas tal que esta pueda ser fijada a placas de ensayo mediante unión a anticuerpos anti- histidinas. La proteína dHA63-286-HlNl fijada reconoce y retiene preferentemente anticuerpos de suero de humanos ó animales dirigidos contra la Hemaglutinina del virus de Influenza A H1N1. En general, a diluciones de suero de 1 :50 en PBS, es posible diferenciar claramente entre sueros de pacientes que no han estado expuestos al virus de la Influenza A H1N1 y sueros de sujetos infectados por el virus en el periodo comprendido entre dos y cinco semanas anteriores al análisis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método inmunológico de diagnóstico tipo ELISA útil para la estimación de la concentración de anticuerpos específicos contra el virus de la Influenza A H1N1/2009 en muestras de suero sanguíneo humano ó de modelos animales. El método permite estimar la concentración de anticuerpos específicos anti Influenza A H1N1 como una relación de señales de absorbancia entre la muestra que se desea caracterizar (muestra problema) y una muestra de referencia (muestra de suero de sujetos no expuestos al virus o a sus proteínas de cápside). A diluciones de suero sanguíneo humano de 1 :50, el método permite identificar claramente a los individuos que estuvieron expuestos al virus de la Influenza A H1N1/2009 suficientemente, tal que exhiben respuesta inmune específica contra el virus. El método inmunológico se basa en la utilización de un dímero de la proteína recombinante de secuencia aminoacídica similar a la proteína Hemaglutinina del virus de la Influenza A H1N 1/2009, tal que esta sea reconocida específicamente por anticuerpos dirigidos contra el virus de Influenza A H1N1. Intuitivamente, la producción de una Hemaglutinina recombinante en células éücarióticas resultaría en una molécula ideal para ensayos inmunológicos. De hecho, existen Hemaglutininas comerciales en el mercado producidas a partir de células de levadura. Sin embargo, la utilización de bacterias como plataforma de expresión de HA, por ejemplo Escherichia coli, resultaría en un método más atractivo económicamente para fines diagnósticos. i La invención aquí descrita presenta una modificación significativa sobre el método diagnóstico presentado en la solicitud MX/a/2009/014098. Dicha solicitud describe el uso de una proteína recombinante expresable en clonas de E. coli, correspondiente a un fragmento de la HA del virus de Influenza A H1N1/2009. La secuencia de aminoácidos de esta proteína recombinante corresponde a la secuencia consenso de 224 aminoácidos comprendida entre los residuos 63 y 286 de la proteína Hemaglutinina del virus de la Influenza A H1N1/2009. Dicha proteína, referida en esta invención como HÁ63-286-HlNl, contiene los dominios inmunogénicos principales de la Hemaglutinina de virus de Influenza. En el caso particular de esta invención, este dominio inmunogénico se produce en un tándem de dos moléculas en E. coli, utilizando el mismo cassete ó cónstructo de expresión (ver Figura 2). Para tal propósito, la secuencia de ADN necesaria para la expresión de la secuencial (SEC ID No. 1.) es incluida dos veces en el mismo constructo, y una secuencia de liga es utilizada para lograr la expresión, en una misma molécula proteica, de ambos dominios inmunogénicos HA63-286-HlNl. Así, se posibilitará la expresión de la molécula dHA 3.286-HlNl (versión dimérica de la molécula HA63.286-H1N1). Por ejemplo, la secuencia 2 (SEC ID No. 2) cumple con la condición de contener dos secuencias aminoacídicas de la proteína HA63-286-HlNl separadas por un ligando de 10 aminoácidos. Alternativamente, el ligando puede estar conformado por cualesquier secuencia de aminoácidos mientras que su longitud se encuentre en el rango de 10 a 20 aminoácidos.

SECIDNo.1: 1-20 GlyValAlaProLeuHisLeuGlyLysCysAsnlleAlaGlyTrpIleLeuGlyAsnPro 21-40 GluCysGluSerLeuSerThrAlaSerSerTrpSerTyrlleValGluThrSerSerSer 1-60 AspAsnGlyThrCysTyrProGlyAspPhelleAspTyrGluGluLeuArgGluGlnLeu 61-80 81-100 HisAspSerAsnLysGlyValThrAlaAlaCysProHisAlaGlyAlaLysSerPheTyr 101-120 LysAsnLeuIleTrpLeuValLysLysGlyAsnSerTyrProLysLeuSerLysSerTyr 121-140 IleAsnAspLysGlyLysGluValLeuValLeuTrpGlylleHisHisProSerThrSer 1 1-160 AlaAspGlnGlnSerLeuTyrGlnAsnAlaAspAlaTyrValPheValGlySerSerArg 161-180 TyrSerLysLysPheLysProGluIleAlalleArgProLysValArgAspGlnGluGly 181-200 Arg etAsnTyrTyrTrpThrLeuValGluProGlyAspLysIleThrPheGluAlaThr 201-220 GlyAsnLeuValValProArgTyrAlaPheAlaMetGluArgAsnAlaGlySerGlylle 221-224 IlelleSerAsp SEC ID No. 2: 1-20 HisHisHisHisHisHisGlyValAlaProLeuHisLeuGlyLysCysAsnileAlaGly li 21-40 TrpIleLeuGlyAsnProGluCysGluSerLeuSerThrAlaSerSerTrpSerTyrlle 1-60 ValGluThrSerSerSerAspAsnGlyThrCysTyrProGlyAspPhelleAspTyrGlu 61-80 GluLeuArgGluGlnLeuSerSerValSerSerPheGluArgPheGluIlePheProLys 81-100 ThrSerSerTrpProAsnHisAspSerAsnLysGlyValThrAlaAlaCysProHisAla 101-120 GlyAlaLysSerPheTyrLysAsnLeuIleTrpLeuValLysLysGlyAsnSérTyrPro 121-140 LysLeuSerLysSerTyrlleAsnAspLysGlyLysGluValLeuValLeuTrpGlylle 141-160 HisHisProSerThrSerAlaAspGlnGlnSerLeuTyrGlnAsnAlaAspAlaTyrVal 161-180 PheValGlySerSerArgTyrSerLysLysPheLysProGluIleAlalleArgProLys 181-200 ValArgAspGlnGluGlyArgMetAsnTyrTyrTrpThrLeuValGluProGlyAspLys ii 201-220 IleThrPheGluAlaThrGlyAsnLeuValValProArgTyrAlaPheAlaMetGluArg 221-240 AsnAlaGlySerGlyllellelleSerAspGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer 241- 260 GlyValAlaProLeuHisLeuGlyLysCysAsnlleAlaGlyTrpIleLeuGlyAsnPro 261- 280 GluCysGluSerLeuSerThrAlaSerSerTrpSerTyrlleValGluThrSerSerSer 281-•300 AspAsnGlyThrCysTyrProGlyAspPhelleAspTyrGluGluLeuArgGluGlnLeu r 301-¦320 SerSerValSerSerPheGluArgPheGluIlePheProLysThrSerSerTrpProAsn 321-•340 HisAspSerAsnLysGlyValThrAlaAlaCysProHisAlaGlyAlaLysSerPheTyr il 341-¦360 LysAsnLeuIleTrpLeuValLysLysGlyAsnSerTyrProLysLeuSerLysSerTyr i 361-¦380 IleAsnAspLysGlyLysGluValLeuValLeuTrpGlylleHisHisProSerThrSer 381-¦400 AlaAspGlnGlnSerLeuTyrGlnAsnAlaAspAlaTyrValPheValGlySerSerArg i 401-¦420 TyrSerLysLysPheLysProGluIleAlalleArgProLysValArgAspGlnGluGly 421--440 ArgMetAsnTyrTyrTrpThrLeuValGluProGlyAspLysIleThrPheGluAlaThr 441--460 GlyAsnLeuValValProArgTyrAlaPheAlaMetGluArgAsnAlaGlySerGlylle 461--464 IlelleSerAsp Adicionalmente, la secuencia de la proteína objeto de esta invención debe también contener il una secuencia de 6 histidinas (6-His). La adición de la secuencia N-terminal de histidinas, es de crucial importancia para simplificar el proceso de purificación de la próteína y por tanto su producción masiva. Adicionalmente, esta secuencia de histidinas facilita la unión y adecuada orientación de la proteína en superficies tratadas con anticuerpos ariti-histidina (opción preferente) ó con iones Co+2 ó Ni+2 (alternativamente). La proteína recombinante HA63-286-HlNl puede ser producida en cepas de E. coli tales como Rosetta gami ó preferentemente la variante C41 de la cepa BL21 (DE3) pLysS tal como se describe en la Sánchez- Arreóla, 2012. [Sánchez- Arreóla P. Tesis de Maestría. Tecnológico de Monterrey, Monterrey, N.L. México].

II I En su forma preferente, la presente invención consiste en un método de diagnóstico cuantitativo tipo ELISA de la concentración relativa de anticuerpos anti-Influenza A H1N1 1 en muestras de suero sanguíneo que puede ser conducido en placas comerciales para microensayos, por ejemplo placas de 96 pozos. Para tal efecto, una solución de anticuerpos I anti-histidinas deben ser incubada en la placa de microensayos a fin de fijar los anticuerpos anti-histidinas, a la superficie de fondo de los pozos. La superficie aún expuesta debe ser bloqueada con una proteína ó un agente bloqueador, ilustrativa más no limitativamente caseína (Figura 4-A). La posterior adición de 200 µ? de una solución de 5 a 10 µ&/p?1 de la proteína dHA63-286-HlNl sobre la superficie de cada pocilio y un periodo de incubación por al menos 20 minutos permitirá la unión específica de la proteína a los anticuerpos anti-histidina través de sus secuencias terminales de histidina (Figura 4-B). Un lavado posterior con una solución amortiguadora, por ejemplo con solución amortiguadora de fosfatos (PBS) permite la remoción de exceso de proteína no unida y habilita la placa para su uso diagnóstico. En cada pocilio podrán vertirse de 1500 a 250 µ? de suero sanguíneo (preferentemente 200 µ?). El suero preferentemente deberá diluirse en una solución i amortiguadora, por ejemplo solución PBS. Nuestros experimentos sugieren que diluciones en el rango 1 :10 a 1 :200 pueden ser utilizadas. Diluciones 1 :50 resultan adecuadas para una adecuada señal de reconocimiento. Dada la afinidad de la proteína dHA63-286-H|lNl por los anticuerpos específicos contra el virus de Influenza A H1N1, mayor número de anticuerpos será capturado en las superficies de las placas cuando el suero provenga) de sujetos expuestos al virus ó inmunizados contra el virus que cuando provenga de sujetos no expuestos (Figura 4-C). Para determinar la cantidad de anticuerpos retenidos en cada pocilio, diversos procedimientos pueden ser implementados. Por ejemplo, una solución de I, anticuerpo anti-IgG peroxidado (con peroxidasa de rábano unida covalentemente) puede I. ser adicionada a cada pocilio. La posterior adición de sustrato permitirá que la reacción de peroxidación tenga verificativo (Figura 4-D). En los pocilios con mayor concentración de I; anticuerpos de suero retenido, y por tanto con mayor concentración de peroxidasa, la reacción se llevará a cabo más eficientemente. El grado de cumplimiento de la reacción puede ser estimado por la intensidad de la coloración amarilla en cada pocilio, dado que el sustrato incoloro, al peroxidarse, genera coloración amarilla (Figura 4-E). Esta intensidad de color se puede evaluar midiendo la señal de absorbancia a 580 nm en Cada pocilio, ilustrativa más no limitativamente, utilizando un instrumento lector de microplatos. Consecuentemente, en su versión recomendada, el protocolo propuesto consiste en, al menos, las siguientes etapas: A. Fijación de la un anticuerpo anti-histidinas a la superficie del dispositivo de diagnóstico.

B. Bloqueo de la superficie no cubierta con el anticuerpo anti-histidina con algún agente bloqueador, por ejemplo, caseína.

C. Fijación de la proteína dHA83.286-HlNl al anticuerpo anti-histidinas a través de sus secuencias n-terminales de histidinas y posterior lavado para remover el exceso de proteína no adherida.

D. Adición de muestras de suero sanguíneo diluidas, preferentemente a dilución 1 :50 en solución amortiguadora de fosfatos (PBS) y posterior lavado de lá superficie para remover suero y anticuerpos no retenidos.

E. Adición de anticuerpos anti-IgG con peroxidasa unida covalentemente a fin de reconocer y marcar los anticuerpos de suero retenidos.

F. Lavado para remover anticuerpos peroxidados no unidos y posterior adición de sustrato para la reacción enzimática de peroxidación.

G. Evaluación del grado de ocurrencia de la reacción por lectura de absorbancia a 580 nm.

? La metodología de evaluación de la concentración de anticuerpos específicos contra Influenza A HIN 1/2009 presentada en la presente invención puede ser generalizada para cualquier otra variante de Influenza A. Por ejemplo, la expresión en Escherichia coli de la región comprendida entre el residuo 83 y el 286 de la hemaglutinina de un virus de Influenza A H5N1 (virus de Influenza aviar), utilizando la metodología de construcción génica y el proceso de producción y recuperación aquí descritos, conduce a una proteína que específicamente reconoce anticuerpos contra el virus de Influenza A H5N1. Por tanto, esta invención presenta también una estrategia general de diagnóstico de la concentración relativa de anticuerpos contra variantes de virus de la Influenza A.

EJEMPLO 1. RECONOCIMIENTO ESPECÍFICO ANTIGENO-ANTICUERPO DE LA PROTEÍNA dHA83-286-HlNl POR ANTICUEPOS DE PACIENTE H1N1(+). El presente ejemplo presenta resultados que ilustran el reconocimiento específico de la proteína dHA83-286-HlNl por anticuerpos presentes en pacientes convalecientes de una infección por Influenza A HIN 1/2009 y por tanto cuyo suero sanguíneo se presupondría contendría anticuerpos anti-HlNl/2009. En las figuras 4-A a 4-E se presenta^ en forma i¡ esquemática, la técnica inmunológica utilizada para este realizar este ensayo. ¡Una solución de anticuerpo anti-histidina fue fijada en la superficie de micro-placas de 96 pocilios para inmunoensayo. La superficie de los pocilios fue bloqueada utilizando amortiguador de bloqueo a base de caseína (figura 4- A). Un volumen de 200 µ? de solución de proteína recombinante HA50-274-H1N1 con una concentración de 5 µg/ml fue adicionada e incubada a 37 °C por 30 minutos en cada pocilio.

Posterior a un lavado para remover la proteína no retenida, muestras de suero sanguíneo de dos pacientes convalecientes (positivo A y positivo B) infectados con el ¡ virus de la Influenza A HI 1/2009 (tomada durante la cuarta semana posterior al diagnóstico de la infección), y una muestra de suero sanguíneo de un sujeto no infectado, (columna en negro de la Figura 5) fueron depositadas (por triplicado) en diferentes pocilios. Para este ensayo, las muestras de suero fueron evaluadas a una dilución 1 :50. El diagnóstico positivo de los pacientes fue realizado utilizando el protocolo CDC (del Centro para el Diagnóstico y Control de Enfermedades de Atlanta, USA) de diagnóstico molecular por RT-PCR tiempo real reconocido por la Organización Mundial de Salud. Conceptualmente, de haber reconocimiento selectivo de los anticuerpos del suero correspondiente al sujeto infectado, la proteína ??63-286-?1?1 deberá reconocer y capturar, preferentemente, los anticuerpos suero del sujeto infectado (ver Figura 4-C). Posterior a un lavado para remover los anticuerpos de suero no capturados por la proteína, una solución de anticuerrjo anti-IgG humano, marcado con una enzima peroxidasa (Figura 4-D) y destinado a< reconocer selectivamente los anticuerpos retenidos, es dispensado a los pocilios. Posterior a un segundo lavado para remover el anticuerpo anti-IgG no acoplado a los anticuerpos de suero, los ensayos fueron adicionados con una solución de sustrato de la enzima peroxidasa e incubados a 37 °C por 30 minutos. La presencia del conjugado proteína retenida-anticuerpo con peroxidasa es evidenciada por un cambio en la intensidad del color de la solución que evidencia el grado en que la reacción catalizada por la peroxidasa ha ocurrido (figura 4-E). Este cambio en la intensidad de la solución fue detectado en términos de absorbancia, leída a 580 nm en un aparato lector de microplatos Biotek, USA. Presumiblemente, la proteína dHA63-286-HlNl debería ser reconocida preferentemente por los anticuerpos del suero de pacientes infectados, dada su similitud en estructura tridimensional con la HA del virus de Influenza A HlNl . Los resultados presentados en la Figura 5 demuestran que este reconocimiento selectivo existe a diluciones de suero de 1 :50 en solución PBS (dilución recomendada para muestras de suero humano.

Para efectos subsecuentes, la absorbancia normalizada se define en términos de la Ecuación 1 : AN= (Abs muestra AbSblancoV (AbSpromedio de sujetos no expuestos AbSblanco) Donde AN es la absorbancia normalizada; AbSm_estra es Ia señal de absorbancia de la muestra, Absbianco es la señal de absorbancia en un ensayo donde se adiciona albúmina en lugar de muestras de suero; y Abspr0medio de sujetos no expuestos es el promedio de las señal de absorbancia de las ocho muestras de suero correspondientes a voluntarios no expuestos al virus de Influenza A HlNl . Con base en nuestros experimentos, para la dilución 1 :50 en PBS, la relación absorbancia de suero infectado/ absorbancia de suero no infectado correspondientes a voluntarios infectados, se sitúa por arriba del umbral de 1.25 unidades.

EJEMPLO 2. COMPRACIÓN DE LA SEÑAL DE RECONOCIMIENTO ll ESPECÍFICO DE ANTICUERPOS ANTI-INFLUENZA A7H1N1/2009 POR LOS ¡I ANTÍGENOS HA63-286-HlNl Y dHA63-286-HlNl.

La solicitud de patente MX/a/2009/014098 documenta el uso de la proteína recombinante HA63-286-HlNl(versión monomérica) como antígeno y su uso en inmunoensayos (ELISA) li para la determinación del título de anticuerpos contra influenza A/H1N1/2009. En la presente invención, la sensibilidad del método presentado en dicha sollicitüd se mejora li sustancialmente por el uso de la versión dimérica de la proteína HAÓ3.2S6-H1N,1 denominada i¡ d HA63-286-HlNl . Muestras de suero sanguíneo de un paciente positivo y un voluntario negativo fueron ensayadas, de acuerdo a los protocolos presentados en la solicitud MX/a/2009/014098 y en la presente invención (ver Figura 6) utilizando á la versión monomérica y dimérica de la proteína HA63-286-HlN, respectivamente mHA63-286-HlNl y dHA63 -286-HlNl. La señal normalizada de absorbancia, de acuerdo a la definición presentada en la ecuación 1 , fue significativamente superior (en promedio 22% superior) en los ensayos que utilizaron como antígeno proteína dimérica con respecto a aquellos que utilizaron proteína monomérica.

Claims (4)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas: \

1. El uso de la proteína recombinante dHA63-286-HlNl caracterizada por la secuencia SEC ID No. 2, en dispositivos ó plataformas útiles para el diagnóstico de la t presencia, concentración ó título de anticuerpos anti-Influenza A/H1N1 ó específicamente anticuerpos anti Influenza A/H1N1/2009.

2. El uso de la proteína recombinante mencionada en la reivindicación 1 caracterizada por contener dos veces la secuencia SEC ID No. 1 en dispositivos ó ( plataformas diagnósticas de la presencia, concentración ó título de anticuerpos anti Influenza A.

3. El método diagnóstico de la presencia, concentración ó título de anticuerpos anti¬ influenza A/H1N1 ó específicamente Influenza A/H1N 1/2009 caracterizado por el uso de la proteína dHA63-286-HlNl consistente con la secuencia SEC ID. No. 2 ó una variante de la secuencia SEC ID. No. 2, tal que la proteína contenga un dímero de la proteína caracterizada por la secuencia SEC ID. No. 1.

4. El método diagnóstico consistente con la reivindicación 1,2 ó 3 caracterizado por comprender mínimamente las siguientes etapas ó variantes de las siguientes etapas: A. Fijación de un anticuerpo anti-histidinas a la superficie del dispositivo de diagnóstico. B. Bloqueo de la superficie no cubierta con el anticuerpo anti-histidina con algún agente bloqueador, por ejemplo, caseína. C. Fijación de la proteína dHA63-286-HlNl al anticuerpo anti-histidinas a través de !l sus secuencias n-terminales de histidinas y posterior lavado para remover el exceso de proteína no adherida. D. Adición de muestras de suero sanguíneo diluidas, preferentemente a dilución i 1 :50 en solución amortiguadora de fosfatos (PBS) y posterior lavado de la superficie para remover suero y anticuerpos no retenidos. E. Adición de anticuerpos anti-IgG con peroxidasa unida covalenteménte a fin de reconocer y marcar los anticuerpos de suero retenidos. F. Lavado para remover anticuerpos peroxidados no unidos y posterior adición de sustrato para la reacción enzimática de peroxidación. G. Evaluación del grado de ocurrencia de la reacción por lectura de absorbencia a 580 nm. El uso como antígeno (en dispositivos ó plataformas útiles para el diagnóstico de la í presencia, concentración ó título de anticuerpos anti Influenza A) de una proteína recombinante dimérica, análoga en su construcción a la proteína dHA63.286-HlNl, caracterizada por contener en su secuencia dos segmentos aminoacídicos que comprendan la región entre los aminoácidos 63 y 286 de una variante dé la proteína hemaglutinina de un virus de Influenza A. RESUMEN Se presenta la invención de un método inmunológico (tipo ELISA) para el diagnóstico de la presencia, concentarción ó título de anticuerpos anti Influenza A/HÍN1/2009 en muestras de suero sanguíneo de sujetos humanos ó modelos animales tales cómo hurones, ratas, ratones, entre otros. El componente fundamental del método diagnóstico es una proteína, referida en la invención como dHA63-286-HlNl . Dicha proteína es un dímero del fragmento de la pro teína Hemaglutinina del virus de Influenza A H1N 1/2009 expresada en cepas de Escherichia coli. Adicionalmente se protege el uso de antígenos recombinantes, análogos en su construcción a la proteína dHA63-286-HlNl, tal que contengan ún dímero de la región de la hemaglutinina comprendida entre los aminoácidos 63 y 286 de un virus específico de Influenza A. LISTA DE SECUENCIAS DE AMINOACIDOS A. INFORMACION PARA LA SEC ID N° 1 Secuencia de aminoácidos de la proteína HA63-2 6-HlNl (fragmento de la proteína HA del virus de Influenza A H1N1 responsable del brote epidémico 2009. Características de la secuencia i) Longitud: 224 residuos de aminoácido ii) Tipo: proteína iii) Tipo de Hebra: sencilla iv) Tipo de molécula: proteína v) Descripción de la secuencia: SEC ID N° 1 1-20 GlyValAlaProLeuHisLeuGlyLysCysAsnlleAlaGlyTrpIleLeuGlyAsnPro 21-40 GluCysGluSerLeuSerThrAlaSerSerTrpSerTyrlleValGluThrS'erSerSer 1-60 AspAsnGlyThrCysTyrProGlyAspPhelleAspTyrGluGluLeuArgGluGlnLeu 61-80 SerSerValSerSerPheGluArgPheGluIlePheProLysThrSerSerTrpProAsn 81-100 HisAspSerAsnLysGlyValThrAlaAlaCysProHisAlaGlyAlaLysSérPheTyr 101-120 LysAsnLeulleTrpLeuValLysLysGlyAsnSerTyrProLysLeuSerLysSerTyr 121-140 IleAsnAspLysGlyLysGluValLeuValLeuTrpGlylleHisHisProSerThrSer 1 1-160 AlaAspGlnGlnSerLeuTyrGlnAsnAlaAspAlaTyrValPheValGlySerSerArg 161-180 TyrSerLysLysPheLysProGluIleAlalleArgProLysValArgAspGlnGluGly 181-200 ArgMetAsnTyrTyrTrpThrLeuValGluProGlyAspLysIleThrPheGluAlaThr 201-220 GlyAsnLeuValValProArgTyrAlaPheAlaMetGluArgAsnAlaGlySerGlylle 221-224 IlelleSerAsp B. INFORMACION PARA LA SEC ID N° 2 Secuencia de aminoácidos de un dímero del fragmento de la proteína HA del virus de ¡I Influenza A H1N1 (denominado dHA63-286-HlNl) que incluye una secuencia que i contiene 6 histidinas dispuestas en posición N-terminal para facilitar la posterior purificación y anclaje de la proteína. La secuencia incluye un ligando de 10 aminoácidos para espaciar ambos fragmentos HA63-286-H1N1. Características de la secuencia i) Longitud: 464 aminoácidos ii) Tipo: proteína iii) Tipo de hebra: sencilla iv) Tipo de molécula: proteína con secuencia de histidinas N-terminaí. v) Descripción de la secuencia SEC ID N° 2: 20 HisHisHisHisHisHisGlyValAlaProLeuHisLeuGlyLysCysAsnlleAlaGly -40 TrpIleLeuGlyAsnProGluCysGluSerLeuSerThrAlaSerSerTrpá,erTyrIle -60 ValGluThrSerSerSerAspAsnGlyThrCysTyrProGlyAspPhelleAspTyrGlu -80 GluLeuArgGluGlnLeuSerSerValSerSerPheGluArgPheGluIlePheProLys -100 ThrSerSerTrpProAsnHisAspSerAsnLysGlyValThrAlaAlaCysProHisAla 1-120 GlyAlaLysSerPheTyrLysAsnLeuIleTrpLeuValLysLysGlyAsnSerTyrPro 1-140 LysLeuSerLysSerTyrlleAsnAspLysGlyLysGluValLeuValLeuTrpGlylle 1-160 HisHisProSerThrSerAlaAspGlnGlnSerLeuTyrGlnAsnAlaAspAlaTyrVal 1-180 PheValGlySerSerArgTyrSerLysLysPheLysProGluIleAlalleArgProLys 1-200 ValArgAspGlnGluGlyArgMetAsnTyrTyrTrpThrLeuValGluProGlyAspLys 1-220 IleThrPheGluAlaThrGlyAsnLeuValValProArgTyrAlaPheAlaMetGluArg 1-240 AsnAlaGlySerGlyllellelleSerAspGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer |? I I. -¦260 GlyValAlaProLeuHisLeuGlyLysCysAsnlleAlaGlyTrpIleLeuGlyAsnPro i, -•280 GluCysGluSerLeuSerThrAlaSerSerTrpSerTyrlleValGluThrSerSerSer -¦300 AspAsnGlyThrCysTyrProGlyAspPhelleAspTyrGluGluLeuArgGluGlnLeu -•320 SerSerValSerSerPheGluArgPheGluIlePheProLysThrSerSer rpProAsn -¦340 HisAspSerAsnLysGlyValThrAlaAlaCysProHisAlaGlyAlaLysSerPheTyr -•360 LysAsnLeuIleTrpLeuValLysLysGlyAsnSerTyrProLysLeuSerLysSerTyr -•380 IleAsnAspLysGlyLysGluValLeuValLeuTrpGlylleHisHisProSerThrSer -•400 AlaAspGlnGlnSerLeuTyrGlnAsnAlaAspAlaTyrValPheValGlySerSerArg -¦420 TyrSerLysLysPheLysProGluIleAlalleArgProLysValArgAspGlnGluGly --440 ArgMetAsnTyrTyrTrpThrLeuValGluProGlyAspLysIleThrPheGluAlaThr --460 GlyAsnLeuValValProArgTyrAlaPheAlaMetGluArgAsnAlaGlySerGlylle --464 IlelleSerAsp I. i