MX2011013349A - Antifúnguico organico para uso agrícola y en poscosecha elaborado con extractos de resina de larrea tridentata y el biopolímero quitosán. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la utilización de mezclas, en diferentes concentraciones, de extractos hidrosolubles de la resina de gobernadora (Larrea tridentata) con quitosán, para su uso como funguicidas orgánicos ambientalmente inocuos que pueden ser empleados para prevenir o curar enfermedades poscosechas de frutas , flores, hortalizas, semillas, granos y cualquier otro producto agrícola susceptible de ser infectado . Dependiendo del producto agrícola a trata y de los hongos fitopatógenos a controlar, puede lograrse un mejor efecto funguicida con el uso de mezclas de los extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, que el obtenido al utilizar cualquiera de estos bioproductos en forma individual, e inclusive mejor que el obtenido al utilizar productos comerciales normalmente tóxicos para el medio ambiente. Las mezclas objeto dentro de la presente invención pueden utilizarse solas en forma líquida o en polvo, o como parte de una formulación a la que se pueden adicionar otros productos naturales o botánicos que se recomiendan como aceite esenciales de hojas de Fluorensia cernua, Lippia berlandieri, Agave lechuguilla, las que protegen de las pudriciones causadas por los hongos Aspergillus flavus y A. versicolor durante el almacenamiento. O bien para aplicarse de manera alternada a los funguicidas sintéticos del grupo fr los benzimidazoles o carbamatos como el Benomyl (r) o Benlate(r), Mancozeb(r) y Trecto 60 (r) que son los de mayor uso en el control de enfermedades fungosas pre y poscosecha como la antracnosis en diversos cultivos frutícolas como aguacate, mano papaya, plátano y cítricos, entre otros.

Description

ANTIFÚNGICO ORGÁNICO PARA USO AGRÍCOLA Y EN POSCOSECHA ELABORADO CON EXTRACTOS DE RESINA DE LARREA TRIDENTATA Y EL BIOPOLÍMERO QUITOSÁN DESCRIPCIÓN OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene como objetivo la utilización de extractos hidrosolubles líquidos de la resina de Larrea tridentata y sus mezclas con quitosán, para el tratamiento preventivo y curativo de enfermedades durante el ciclo de desarrollo de los cultivos; ya sea en poscosecha como durante el almacenamiento de frutas, flores, hortalizas, semillas, granos y cualquier otro producto agrícola. La combinación de las propiedades fungicidas de la resina de L. tridentata y del biopolímero quitosán, tiene un efecto sinérgico en el combate de diferentes microorganismos fitopatógenos causantes de enfermedades causadas por hongos, bacterias y levaduras. Las mezclas Larrea-quitosán son degradables, además de compatibles e inocuas para el ser humano, por lo que al ser utilizadas para tratar enfermedades fungosas durante el ciclo del cultivo, así como en poscosecha de una amplia gama de productos agrícolas, podrían evitarse los problemas ocasionados por el uso de fungicidas sintéticos, los cuales son agroquímicos muy tóxicos y peligrosos para los humanos, los animales y el medio ambiente.

ANTECEDENTES Las enfermedades de poscosecha se desarrollan durante la selección, empaque y transporte de las frutas y hortalizas a los sitios de comercialización. Estos males pueden ocasionar la pudrición parcial o total del producto. En algunos casos, la secreción de sustancias tóxicas daña el producto y ya no puede ser consumido, o bien, disminuye su valor nutricional y por lo tanto, su precio de venta [N. Agrios G. Plant Pathology, Academic Press, Inc. (2001)]. Las enfermedades ocasionadas por hongos fitopatógenos durante al proceso natural de maduración de las frutas y hortalizas después de ser cosechadas, así como de las flores, granos y semillas, durante su almacenamiento, puede ser tan severo que ocasiona cuantiosas pérdidas económicas.

El hongo Botrytis cinérea causa la enfermedad conocida como "pudrición o moho gris" [S. E. Baraes y M. W. Shaw, Plant Pathology, 51 :746-754 (2002); M. Keller et al, 2003]. Este hongo ocasiona grandes pérdidas económicas durante la poscosecha en frutas especialmente susceptibles, como es el caso de la fresa, uva, frambuesa y zarzamora [P. Boff et al., BioControl, 47: 193-206, (2002)]. También las rosas son susceptibles a la infección con B. cinérea, el cual causa manchas que parecen quemaduras sobre los pétalos de la flor. La enfermedad puede aparecer antes o después de haberse cosechado, cuando se encuentran ya almacenadas o en tránsito, lo que ocasiona graves pérdidas para su valor comercial [S. Barnes y M. W. Shaw, Plant Pathology, 51 :746-754 (2002)].

Diversos hongos del género Aspergillus, como A. flavus y A. parasiticus, pueden contaminar granos almacenados de maíz, algodón, cacahuate y sorgo, entre otros. Estos hongos, ya sea en el campo o en almacenes, producen metabolitos secundarios llamados afíatoxinas, los cuales son potentes hepatoxinas y carcinógenos. En consecuencia, además de afectar significativamente la calidad y el valor económico de los granos, pueden contaminar los productos alimenticios elaborados a partir de éstos [M. La Penna et al, Letters in Applied Microbiology, 38:257-263, (2004)]. Frutos del tipo de las almendras, los pistachos y las nueces, también se han visto amenazados por la contaminación con los metabolitos secundarios que generan los hongos A. flavus y A parasiticus [N. Mahoney y R. Molyneux, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 1882-1889 (2004)].

El hongo Colletotrychum gloeosporioides, causante de la antracnosis en diversos cultivos frutícolas tropicales de México, ha sido controlado con fungicidas sintéticos del grupo de los benzimidazoles. Desafortunadamente, este hongo ha desarrollado resistencia a este tipo de fungicidas, de los cuales, el Benomyl® es el más difundido y el que mayores efectos secundarios adversos ocasiona. La capacidad de adaptación y variabilidad extraordinaria de este hongo lo convierte en una amenaza constante en el trópico mexicano [M. Ramos-Acosta, et al., Pan American Plant Disease Conferece, South Padre Island, Texas, USA, April 5-13, pp. 93 (2003)]. En los últimos diez años, C. gloeosporioides ha sido uno de los principales agentes causales de enfermedades de poscosecha del plátano, así como de otros importantes cultivos frutícolas como papaya y mango en la región del Soconusco, en Tapachula, Chis. [Ortega-Milton et al, Pan American Plant Disease Conference, South Padre Island, Texas, USA, April 5-13, pp. 71 (2003)].

La infección en frutos de aguacate de las variedades Fuerte y Hass por Glomerella cingulata, de la cual el estado conidial o imperfecto es C. gloeosporioides, tiene lugar durante el ciclo de cultivo, cuando las esporas del hongo germinan formando un apresorio que penetra alrededor de 1.5 mieras por debajo de la piel. El hongo permanece en reposo y ocasiona la antracnosis durante la etapa de poscosecha ocasionando graves pérdidas [J. F. Morton, Fruits of Warm Climate. Media Incorporated. University of Miami. USA. 506 p. (1987)].

Aunque no se cuenta con datos precisos se considera que en México y el mundo, el hongo Fusarium oxysporum causa enfermedades que ocasionan grandes pérdidas económicas en muchas especies florícolas y hortícolas. Este hongo es el causante de la pudrición seca, uno de los más graves problemas en el almacenamiento de papa, ya que los tubérculos presentan lesiones que hacen imposible su comercialización. El cultivo de la papa también es susceptible al hongo C. coccodes, causante de la enfermedad conocida como "mancha negra", la cual ocasiona la muerte prematura de la planta y disminuye la calidad del producto durante la poscosecha (J. R. Davis et al., American Journal of Potato Research, 78:291-300 (2001)].

Debido a su rapidez y eficiencia, los fungicidas sintéticos son los más utilizados para el control de hongos de poscosecha y almacén. Sin embargo, su uso indiscriminado para el control de un mismo tipo de microorganismo, ha ocasionado muchos problemas a escala mundial, entre los que destacan: a) la resistencia generada en el microorganismo que se trata de controlar; b) los daños al medio ambiente, principalmente contaminación del suelo y agua; c) los daños a la salud del trabajador agrícola que está en contacto directo con los fungicidas; y d) daños a la salud de los consumidores, debido a la permanencia del pesticida en la cadena alimenticia [Postharvest News & Information, 7(6):66N (1999)].

Esta problemática ha conducido hacia el uso de tratamientos alternativos al uso de fungicidas sintéticos [E. Bosquez-Molina. First International Congress and Exhibition of Horticulture, Mazatlán, Sin., (1999)]. Algunos métodos de biocontrol contra una amplia variedad de microorganismos como hongos, bacterias, virus y nemátodos incluyen el uso de: a) agua caliente [H. Cheah et al., Proceedings of the Australasian Postharvest Conference. Queensland, Australia (1993)]; b) radiación ultravioleta; c) inductores de resistencia; d) microorganismos antagonistas; e) benzoato de sodio [K. Sagoo S. et al., Letters in Applied Microbiology, 34:168-172 (2002)] y; f) ácido ß-Amino butírico [V. Porat R. et al, European Journal of Plant Pathology, 109:901-907 (2003)].

La Unión Europea y los Estados Unidos de Norteamérica avanzan simultáneamente en programas nacionales de agricultura orgánica que pugnan por el control de fitopatógenos con biopesticidas, productos naturales de origen animal o vegetal, con lo cual puede incrementarse la producción al mismo tiempo que se asegura la inocuidad alimentaria [B. Avendaño-Ruiz y R. Várela-Llamas, Estudios Fronterizos 11 :171-202, (2010)]. Debido a su alta biodegradabilidad, la aplicación de fungicidas preparados con base en compuestos naturales constituye una excelente alternativa al uso de pesticidas sintéticos, ya que desaparecen rápidamente después de ser aplicados en invernaderos o en el campo [I. Yamamoto, Phytoparasitica, 30:199-200 (2002)].

Las zonas áridas de México representan un gran potencial con su vegetación nativa porque guardan una riqueza basada en su especialización biológica, ya que su flora y fauna son el producto de miles de años de adaptación fisiológica para su sobrevivencia. Un caso típico de estas condiciones lo representa la gobernadora {Larrea tridentata). Este es un arbusto xerófito cuyas hojas se encuentran cubiertas por una espesa resina [M. Barbour et al., Creosote bush-biology and chemistry of Larrea in New World Deserts, p. 49-81, Stroudsburg, Pa., 1977]. Actualmente, este recurso natural no es utilizado por animales o humanos, ni se encuentra amenazado o en peligro de extinción en los ecosistemas de las zonas áridas [R.H. Lira-Saldivar et al., Fungitoxic effect of Larrea tridentata resin extracts from the Chihuahuan and Sonoran Mexican deserts on Alternaría solani, Agrochimica, 47: 54-60 (2003)].

Los metabolitos secundarios de la resina de L. tridentata son muchos, entre los que destacan, por su concentración, los fenoles, lignanos y flavonoides. Estos metabolitos funcionan como defensas bioquímicas para repeler la agresión de animales herbívoros, hongos y otros microorganismos, por lo que no se conocen plagas, enfermedades o animales que ataquen a la gobernadora en su habitat natural [K. R. Downum et al., Biochemical Systematics and Ecology, 16, 551-557 (1988)]. El ácido nordihidroguaiarético (NDGA) es un notable compuesto de la resina de gobernadora, el cual es un fuerte antioxidante que ha demostrado tener propiedades citotóxicas, antimicrobiales y como inhibidor de enzimas [F. Brinker, British Journal of Phytotherapy, 3: 10-23 (1993)].

Como resultado de numerosos estudios realizados bajo condiciones in vitro, se ha demostrado por diversos investigadores que los extractos de la resina de gobernadora (L. tridentata) tienen acción antifúngica en al menos 17 hongos fítopatógenos [R.H. Lira-Saldivar, Revista Mexicana de Fitopatología, 21 :214-222, (2003)]. De igual manera, se ha logrado inhibir o controlar a varios hongos bajo condiciones in vivo, mediante la incorporación en los suelos de cultivo de extractos y material vegetativo en polvo de resina de L. Tridentata [R.H. Lira-Saldivar, et al., Biological Agriculture and Horticulture, 22:21-29, (2004)].

Por otra parte, recientemente, se ha encontrado que el quitosán, biopolímero derivado del exoesqueleto de artrópodos, mantiene la calidad de las frutas y vegetales al reducir las tasas de transpiración y respiración, así como la producción de etileno [R. Bhaskara et al., Postharvest Biology and Technology, 20:39-51, (2000)]. En el trabajo realizado por S. Bautista-Baños et al., [Crop Protection, 22:1087-1092, (2003)] se reporta una mejora en la firmeza de frutos cuando fueron tratados con mezclas de quitosán y extractos acuosos de hojas y semillas de papaya. Otro importante atributo del quitosán se relaciona con sus propiedades antifúngicas hacia diversos patógenos que afectan alimentos procesados, frutas y vegetales [H. K. No, et al, Sensory and Nutritive Qualities of Food, 68: 680-685 (2003)]. Aún cuando los diferentes mecanismos asociados con la actividad inhibitoria del quitosán no han sido claramente identificados, se ha establecido que su mayor actividad antifungica se obtiene a pH's bajos [S. Roller y N. Covill, International Journal of Food Microbiology, 47: 61-67, (1999)].

Debido a la acción biocida y fungicida demostrada tanto para la resina de L. tridentata como para el quitosán, sobre numerosos hongos fitopatógenos que atacan a cultivos hortícolas, frutícolas y básicos, se extendió la investigación hacia el uso de las mezclas de ambos bioproductos para el tratamiento de enfermedades ocasionadas por hongos durante la poscosecha en frutas, flores, hortalizas, semillas, granos y cualquier otro producto agrícola susceptible, las cuales pueden ocasionar pérdidas similares o mayores a las ocasionadas por enfermedades fungosas durante el desarrollo del cultivo.

Por lo anteriormente expuesto, en la presente patente se protege el uso como fungicida contra enfermedades de poscosecha, de los extractos hidrosolubles de L. tridentata, así como preparando mezclas o formulaciones que incluyan al biopolímero quitosán en diferentes concentraciones, las cuales pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de hongos que incluyen a las órdenes de los Moniliales como Botrytis cinérea, Aspergillus flavus, A. Níger y A. Parasiticus; Melanconiales como Colletotrichum gloeosporioides, C. Coccodes y Gloesporium spp., entre muchos otros hongos. El uso de las mezclas Larrea-quitosán, permitirá el desarrollo de productos que puedan competir con pesticidas sintéticos, para su aplicación en el tratamiento de un amplio espectro de enfermedades poscosecha ocasionadas por hongos en ñutas, flores, hortalizas, semillas, granos y cualquier otro producto agrícola susceptible.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En la Figura 1 se aprecia que el crecimiento in vitro del hongo B. cinérea se volvió amorfo en comparación al crecimiento observado en las cajas Petri del tratamiento testigo que no se sometió al quitosán, lo que indica que este biopolímero afecta las membranas celulares de las hifas del hongo impidiendo un crecimiento regular y por consiguiente inhibe por completo su desarrollo, ya que en nuestros trabajos logró ser inhibido al 100% con la dosis de 12,000 ppm de quitosán; lo anterior se puede explicar por el efecto que tiene este biopolímero en la composición, morfología y ultraestructura de la pared celular de numerosos hongos. Resultados similares en los que se consigna el daño de la pared celular de hongos han sido reportados anteriormente [D. Vesetini et al., en Mycolgy Research, 111 :875-890 (2007)]. El mecanismo o modo de acción del quitosán en los hongos, parece ser que se debe a la interacción entre las moléculas del quitosán que tiene cargas electrostáticas positivas y las membranas y paredes celulares cargadas negativamente; esto tiende a provocar una falta de integridad intermembranal que ocasiona un goteo y la pérdida de material proteínico y otros constituyentes intracelulares, lo cual induce a la reducción o inhibición del crecimiento del microorganismo en cuestión.

En la Figura 2A, tomando como base los resultados obtenidos respecto a los diversos bioensayos realizados es importante señalar que los tratamientos correspondientes a las mezclas quitosán-Larrea, con extracto metanólico y que mayor efecto manifestaron, al inhibir en 100 % el crecimiento micelial del hongo B. cinérea (Figura 2 A) fueron los tratamientos que corresponden a las concentraciones 500-2,000, hasta 2,000-4,000 ppm de las mezclas quitosán-Larrea respectivamente. El tratamiento químico con Mancozeb® a 2,000 ppm, resultó ser estadísticamente igual que los tratamientos antes mencionados, ya que logró inhibir en igual proporción al hongo. No así el tratamiento con tiabendazol a 1,000 ppm, ya que este inhibió al hongo en 71.04 %, comportándose estadísticamente igual que el tratamiento correspondiente a la concentración de 500:1,000 con 70.46 % de inhibición.

En la Figura 2 B se muestra el efecto inhibidor en el crecimiento del hongo B. cinérea por tres concentraciones (500, 1000 y 2000 ppm) del biopolímero quitosán.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la utilización de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y sus mezclas con quitosán, para el tratamiento preventivo y curativo contra enfermedades durante el ciclo del cultivo, en poscosecha y almacenamiento de frutas, flores, hortalizas, semillas, granos y cualquier otro producto agrícola susceptible. Los extractos de gobernadora solos y sus mezclas con quitosán, objeto de la presente invención son biodegradables, además son compatibles e inocuas para el ser humano. Al utilizarse para tratar enfermedades en una amplia gama de productos agrícolas, podrían evitarse los problemas ocasionados por el uso de fungicidas sintéticos, los cuales son agroquímicos muy tóxicos y peligrosos para los humanos, los animales y el medio ambiente.

El poder fungicida de la resina de L. tridentata y del quitosán ya ha sido reportado, sin embargo, en ocasiones son menos eficaces que ciertos fungicidas sintéticos. La novedad de la presente invención radica en el aprovechamiento del efecto de sinergia que se logra al combinar diferentes concentraciones de los extractos hidrosolubles de L. tridentata y del quitosán. La eficiencia de las mezclas de ambos bioproductos al ser utilizadas como fungicida contra hongos que ocasionan enfermedades de poscosecha, es comparable o inclusive superior, a la obtenida con el uso de los fungicidas sintéticos convencionalmente utilizados. En el presente documento se presentan resultados experimentales y evidencias que así lo demuestran.

Los extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata, al igual que el quitosán, pueden utilizarse en forma de soluciones acuosas o polvos para preparar las mezclas objeto de la presente invención. Por otra parte, dichas mezclas pueden utilizarse solas o bien de manera combinada, formando parte de una formulación en la que pueden incluirse productos naturales o botánicos como aceites esenciales de hojas de Citrus medica, Melanleuca leucadendriim y Ocimum canum, las que protegen de las pudriciones de poscosecha causadas por los hongos Aspergillus flavus y A. versicolor durante el almacenamiento. O bien para aplicarse de manera alternada con los fungicidas sintéticos del grupo de los benzimidazoles o carbamatos, como el Benomyl o Benlate, Mancozeb y Tecto 60, que son los de mayor uso en el control de enfermedades fungosas, cuyo ingrediente activo es el carbendazim. En este grupo se encuentran los fungicidas de mayor uso para el control de enfermedades de pre y poscosecha en diversos cultivos hortícolas, y de poscosecha como la antracnosis en cultivos frutícolas como aguacate, mango, papaya, plátano y cítricos, entre otros. Es importante señalar que la adición de cualquier agroquímico diferente de los extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y del biopolímero quitosán, puede tener un efecto sinérgico, antagónico o meramente aditivo.

Las mezclas Larrea-quitosán pueden ser utilizadas en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones o pastas. Las formas de aplicación, así como las concentraciones utilizadas, dependen enteramente de los productos que se vayan a tratar, los tipos de hongos fitopatógenos que se pretendan combatir y de los resultados que se deseen obtener. También pueden ser aplicadas en los productos agrícolas, ya sea que estos se comercialicen sin un procesamiento adicional para su uso o consumo, o que se comercialicen para su utilización como materia prima en la obtención de productos alimenticios procesados o productos para uso industrial. Las dosis a emplear pueden variar dependiendo del contenido de cada uno de los bioproductos (L. tridentata o quitosán) en las mezclas que se preparen, así como de las cantidades de los otros ingredientes que pudieran formar parte de la formulación. Por otra parte, las dosis a emplear dependerán del tipo de producto, a tratar o del tipo de fitopatógeno que se pretenda controlar. Por regla general, las formulaciones utilizadas para proteger a los diferentes productos agrícolas de enfermedades fungosas de poscosecha, pueden prepararse utilizando de 500 a 20,000 ppm de la mezcla Larrea-quitosán, en la cual el porcentaje de los extractos hidrosolubles de resina de L. tridentata podrá variar desde el 1 al 99% con respecto al peso total de la mezcla.

La formulación que incluye la mezcla Larrea-quitosán puede aplicarse a razón desde 1 a 20 litros por tonelada de semilla o granos, dependiendo del tipo de microorganismo fitopatógeno, la especie de planta, las condiciones ambientales de almacenamiento (temperatura, luminosidad, humedad relativa, carga microbiana, etc.). Para el caso de algunas frutas es recomendable utilizar la técnica del baño o inmersión de los productos a tratar en la formulación que contiene la mezcla Larrea-quitosán. Este método favorece la impregnación y penetración de los bioproductos a través de la corteza o piel de los productos tratados. Para incrementar la efectividad del tratamiento fungicida siguiendo el método de inmersión, es aconsejable realizar un prelavado de los frutos. Cuando la mezcla Larrea-quitosán se aplique directamente al producto, se sugiere el uso de un contenedor con agujeros en el fondo, de esa manera se facilita la salida del excedente de la formulación y los frutos estarán secos para su posterior manejo.

El método empleado para la aplicación de las mezclas Larrea-quitosán, con el propósito de inhibir enfermedades fungosas de poscosecha o almacén en diferentes productos agrícolas, podría ser cualquiera de los utilizados para la aplicación de fungicidas convencionales. Por regla general, las mezclas Larrea-quitosán se aplicarán por aspersión con aspersora de mochila o de cualquier otro tipo, procurando cubrir uniformemente el producto agrícola con la formulación. La aplicación de las mezclas Larrea-quitosán en granos y semillas podrá hacerse por el método semihúmedo o "slurry", o también se puede utilizar una máquina de tambor con eje excéntrico para tratamiento continuo de semillas.

En general, pueden ser tratados con una formulación que contenga la mezcla Larrea-quitosán, todos los productos agrícolas susceptibles al ataque por hongos fitopatógenos en la etapa de almacenamiento o poscosecha, sobre todo cuando las condiciones climáticas de los lugares de transporte o almacenamiento sean favorables para el desarrollo y diseminación de las enfermedades o, inmediatamente después de que sean detectados los primeros síntomas de alguna enfermedad.

Es importante señalar que los fitopatógenos que acompañan a los productos agrícolas desde los sitios de cultivo, ingresan a los sitios de almacenamiento y contaminan rápidamente toda la superficie de trabajo. Los organismos causantes de enfermedades pueden permanecer por meses en las superficies de paredes de tanques, cintas de empaque y cepillos, entre otros lugares. Es necesario eliminar restos de productos agrícolas descompuestos o podridos, además de lavar y desinfectar cuidadosamente los equipos utilizados para empacar, así como todos los sitios y materiales que estarán en contacto con los productos agrícolas durante la etapa de almacén o poscosecha.

MEJOR MÉTODO PARA REALIZAR EL PROCESO DE LA INVENCIÓN A continuación se presentan los resultados experimentales realizados con el propósito de evaluar el efecto antifúngico contra hongos causantes de enfermedades poscosecha, de una serie de concentraciones de extractos alcohólicos de resina de gobernadora con base en etanol y metanol; así como mezclas preparadas con soluciones de quitosán de diferentes concentraciones. En todos los experimentos se evaluó también el efecto de ambos bioproductos sin mezclar, con la finalidad de conocer su efecto fungicida contra una determinada especie de hongo y con base en los resultados obtenidos comprobar la existencia del efecto de sinergia al utilizar las mezclas. La actividad antifúngica de los bioproductos, solos y mezclados entre sí, se evaluó mediante la comparación del crecimiento micelial al utilizar un testigo absoluto (agua destilada) y dos fungicidas sintéticos comerciales (Tecto 60® y Mancozeb®), debido a que estos son algunos de los productos más ampliamente utilizados para el combate de numerosas enfermedades causadas por un amplio rango de microorganismos fitopatógenos, aunque ambos resultan ser dañinos para la salud de los humanos y los ecosistemas.

Para determinar la eficiencia esperada al utilizar las mezclas con diferentes concentraciones de cada uno de los bioproductos, se utilizó la siguiente ecuación propuesta por Limpel [M. Lorito, et al, Phytopathology 83:721-728 (1994)]: Ee = El + E2 - E1E2 / 100 (1) Donde: El es la eficiencia del producto 1 utilizado en forma individual E2 es la eficiencia del producto 2 utilizado en forma individual Ee es la eficiencia esperada al utilizar los dos productos mezclados Para determinar si al utilizar la mezcla Larrea-quitosán se había logrado un efecto de sinergia, se calculó la eficiencia esperada según la ecuación (1), Ee, y se comparó con la obtenida experimentalmente (Ex). De acuerdo al concepto propuesto por Limpel, si Ex es mayor que Ee existe un efecto sinérgico. Para visualizar más fácilmente este efecto se definió una relación Rs igual a Ex/Ee. Así, en los casos en los cuales Rs es mayor que 1, se podía concluir que efectivamente existía un efecto de potenciación o sinergia con el uso de la mezcla.

El crecimiento micelial se midió de la siguiente manera. Se sembraron explantes de diversos hongos, aislados de porciones de tejido vegetativo enfermo, en cajas petri que contenían 20 mL del medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA). Los hongos fueron previamente sometidos a un período de incubación a 25°C, cuya duración varió dependiendo de la especie (7 a 15 días). Para seguir el desarrollo del hongo en el PDA se midió diariamente el crecimiento radial de la masa micelial, hasta que ésta alcanzó la orilla de las cajas Petri. Las mediciones se hicieron en milímetros utilizando para ello un vernier digital; posteriormente la lectura obtenida se transformó en el porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo mediante el uso de una ecuación matemática.

El extracto hidrosoluble de la resina de L. tridentata se preparó de la siguiente manera: las hojas secas de L. tridentata fueron sumergidas en metanol o etanol en cantidad suficiente para que quedaran completamente inmersas en el solvente durante 24 h a temperatura ambiente de 23 a 25°C ± 2°C. La solución así obtenida fue filtrada y después sometida a evaporación durante 12 a 16 horas para eliminar el solvente remanente. Después de este proceso, el producto sólido recuperado fue tratado con una solución acuosa de hidróxido de sodio al 3 % en peso. El producto obtenido en lo sucesivo denominaremos extracto metanólico o etanólico de L. tridentata [R. Gamboa et al., PHYTON International Journal of Experimental Botany, 119-126 (2003)].

Por su parte, el quitosán utilizado para preparar las mezclas Larrea-quitosán, fue de bajo peso molecular (20,000 cps) y se adquirió en polvo de la compañía Sigma-Aldrich. Para solubilizarlo en agua, el quitosán en cantidad de 10 g se trató con ácido acético glacial, por lo que se agregaron 10.1 mL del mismo con una concentración de 99.9% a 90 mL de agua destilada desionizada, para así obtener una concentración del 10%, esto con la finalidad de facilitar la dilución del quitosán y debido al bajo grado de solubilidad que presenta este biopolímero en agua. Posteriormente se agregaron los gramos necesarios de quitosán, dependiendo de la concentración requerida tomando en cuenta que 1 mg es equivalente a 1 ppm, lo anterior diluido en 1000 mL de agua pura. Después se sometió cada solución por separado a agitación constante a 500-600 rpm durante 24 horas, luego se aforó a un volumen de 1000 mL para tenerlo diluido en ácido acético glacial al 1%. Finalmente, las soluciones acuosas de quitosán se esterilizaron a 121 °C durante 20 min ± 2 min y se les adicionó una solución de hidróxido de sodio para llevar su pH hasta 5.6.

Los resultados que a continuación se presentan tienen la finalidad de ilustrar la novedad y la utilidad de la presente invención, pero no con la intención de limitar indebidamente la misma. Estos resultados demuestran el efecto inhibitorio contra el hongo B. cinérea y Colletotrichum gloeosporioides cuando se aplican solos los extractos etanólico y metanólico de L. tridentata, y luego el efecto sinérgico protector logrado al mezclar los extractos de L. tridentata con quitosán, para controlar el crecimiento micelial de hongos fitopatogénicos causantes de severas enfermedades en frutos durante el desarrollo de los cultivos, así como durante la fase de almacenamiento o comercialización en poscosecha.

Ejemplo 1 : Cuadro 1. Comparación de medias de inhibición (%) del hongo Botrytis cinérea Pers. sometido a diferentes concentraciones del extracto metanólico (EM) de Larrea tridentata.

Tratamiento Concentración (ppm) Inhibición micelial (%) EM 12,000 100.0 a EM 16,000 100.0 a Mancozeb® 2,000 100.0 a EM 7,000 90.3 b Tiabendazol® 1,000 71.0 c EM 5,000 68.2 d EM 4,000 48.4 e EM 2,000 41.1 f EM 1,000 37.4 g EM 500 19.4 h Testigo absoluto O i *Nivel de significancia = 0.01; DMS= 2.944.

Por lo que respecta al efecto aislado del extracto metanólico de gobernadora se destaca que los tratamientos con mayor efecto al inhibir significativamente en 100% el crecimiento micelial de B. cinérea, fueron los tratamientos que corresponden a las concentraciones de 8,000, 12,000 y 16,000 ppm, comportándose igual que el fungicida sintético Mancozeb® a 2,000 ppm (Cuadro 1). Otro dato importante a señalar es la eficacia a 7,000 ppm, que se ubica por debajo de los anteriores, con 90.3% de inhibición y se comporta mejor que el fungicida sintético Tiabendazol®, el que a 1,000 ppm inhibe el crecimiento del patógeno en sólo 71.0%.

Ejemplo 2: Otros resultados obtenidos muestran que los tratamientos que mayor efecto manifestaron al inhibir totalmente (100%) el crecimiento micelial de B. cinérea corresponden a las concentraciones de 8,000, 12,000 y 16,000 ppm del extracto etanólico de L. tridentata; los mismos resultados se originaron con el fungicida sintético Mancozeb® a 2,000 ppm (Cuadro 2). Debemos señalar que los pesticidas del grupo de los Ditiocarbamatos son fungicidas muy utilizados en el control de enfermedades fitopatogénicas en general, los cuales son derivados del ácido ditiocarbámico, que en su forma libre es inestable, pero sus sales son estables. El problema principal que presentan estos fungicidas es su descomposición en presencia de humedad y altas temperaturas que ocasionan la producción de etilentiourea. Este compuesto presenta el inconveniente de tener efectos carcinogénicos y teratogénicos [A.E. Bayoumi et al, Citotoxicidad del fungicida mancozeb en cultivos de CHO-K1, Revista de Toxicología, 19: 29-34, (2002)].

Cuadro 2. Comparación de medias de la inhibición (%) de Botrytis cinérea Pers. sometido a diferentes concentraciones del extracto etanólico (EE) de Larrea tridentata.

Tratamiento Concentración (ppm) Inhibición micelial (%) EE 8000 100 a EE 12,000 100 a EE 16,000 100 a Mancozeb 2,000 100 a EE 4,000 90.3 b EE 2,000 81.4 c EE 1000 88.9 c Tiabendazol 1,000 71.0 c EE 5,00 24.2 e EE 250 15.8 f Testigo absoluto 0 g Nivel de significancia = 0.01; DMS= 2.9440 Ejemplo 3: En el Cuadro 3 se muestran los resultados obtenidos al comparar el efecto antifúngico del quitosán y del extracto metanólico de L. tridentata, así como el efecto obtenido al utilizar ambos bioproductos mezclados en diferentes concentraciones, lo cual tuvo el propósito de identificar la existencia de un efecto de sinergia. También se presentan los resultados emanados al utilizar los fungicidas sintéticos Mancozeb® y Tecto 60®, los cuales sirvieron como blanco o testigo.

Cuadro 3. Comparación de medias de inhibición (%) de Botrytis cinérea Pers. sometido a diferentes mezclas quitosán-L n-ea (Extracto metanólico).

Tratamientos Concentración (ppm) Inhibición micelial (%) Q-L 500-4,000 100.0 a Q-L 1,000-2,000 100.0 a Q-L 1,000-4,000 100.0 a Q-L 2,000-2,000 100.0 a Q-L 2,000-4,000 100.0 a Mancozeb® 2,000 100.0 a Tiabendazol® 1,000 71.0 b Q-L 500-1,000 70.5 b Q-L 500-500 57.7 c Testigo absoluto O d *Nivel de significancia = 0.01; DMS= 2.5194 Con relación a las mezclas utilizadas de quitosán-Larrea (Q-L), los resultados emanados de acuerdo con la ecuación de Limpel muestran un efecto sinérgico a partir de las concentraciones combinadas de 500-2,000 ppm de quitosán mas el extracto metanólico de Larrea, donde el efecto esperado entre los productos aplicados por separado, fue menor al efecto observado que resultó de la mezcla, tal como se aprecia en el Cuadro 4 y se remarca en la columna de proporción de sinergismo o antagonismo entre los productos. Este mismo efecto inhibitorio se logró con quitosán mas el extracto etanólico de L. tridentata.

Ejemplo 4: Una vez demostrado el efecto antifúngico de los extractos solos de L. tridentata contra B. cinérea, se analizó el efecto de mezclas con diferentes concentraciones del extracto metanólico hidrosoluble de L. tridentata y de quitosán, contra este mismo hongo causante de graves problemas a follaje y frutos durante numerosos cultivos hortoflorícolas durante el ciclo del cultivo y en poscosecha. En el Cuadro 4 se consignan los resultados obtenidos y en donde se aprecia el efecto sinérgico antifúngico de las mezclas de ambos productos orgánicos.

Cuadro 4. Efecto de las mezclas quitosán-Larrea en la inhibición del crecimiento micelial, en el efecto esperado y en la proporción de sinergismo o antagonismo de ambos bioproductos contra el hong< o Botrytis cinérea Pers.

Mezcla Concentración Inhibición (%) Efecto Inhibición de Proporción Quitosán y (ppm) Quitosán-Extracto Esperado la mezcla de Larrea (%) (%) sinergismo o antagonismo 500-500 56.7 19.0 64.9 57.8 0.9 500-1,000 56.7 37.4 72.8 70.5 0.9 Quitosán 500-2,000 56.7 41.1 74.4 100 1.3 + 500-4,000 56.7 48.5 77.7 100 1.3 Extracto 1,000-2,000 61.0 41.1 77.0 100 1.3 metanólico 1,000-4,000 61.0 48.5 79.9 100 1.2 2,000-2,000 65.5 41.1 79.6 100 1.2 2,000-4,000 65.5 48.5 82.6 100 1.2 Ejemplo 5: Con la intención de fortalecer las evidencias del efecto antifúngico de los extractos de L. tridentata solos y mezclados con el biopolímero quitosán, se realizaron diversos trabajos para comprobar su eficacia y el posible efecto sinérgico contra cinco cepas fitopatogénicas del hongo Colletotrichum gloeosporioides, las cuales se aislaron de material vegetativo de mango (Mangífera indica L.) visiblemente dañado con esta enfermedad; este hongo ataca e este fruto durante poscosecha, así como durante el crecimiento y desarrollo en el campo.

Las cepas usadas fueron catalogadas con la siguiente nomenclatura: Cepas 372; 264; 322; 2CH6-8 y CFG-4.

C. gloeosporioides es un patógeno que ocasiona una de las enfermedades más importantes del mango y provoca grandes pérdidas económicas por el daño que causa en los frutos (Ploetz, R.C., y Prakash, O. 2000). También ocasiona la antracnosis de la papaya (Carica papaya L.), considerada como la enfermedad poscosecha de mayor importancia en países como Hawai, México e India, además de muchas otras regiones tropicales afectando a los frutos en su estado de madurez, ya que daña los frutos en la etapa de madurez [M. B. Dickman, Plant Disease, 67:748-750, (1983)].

La infección en frutos de aguacate de las variedades Fuerte y Hass por Glomerella cingulata, de la cual el estado conidial o imperfecto del hongo es C. gloeosporioides, tiene lugar durante el ciclo de cultivo, cuando las esporas del hongo germinan formando un apresorio que penetra alrededor de 1.5 mieras por debajo de la piel. El hongo permanece en reposo y ocasiona la antracnosis durante la etapa de poscosecha ocasionando graves pérdidas [J. F. Morton, Fruits of Warm Climate. Media Incorporated. University of Miami. USA. 506 p. (1987)].

Los datos contenidos en el Cuadro 5 corresponden a la media estadística, puesto que se realizaron cinco repeticiones para cada tratamiento. En todos los casos, se observó que el efecto antifúngico del extracto etanólico de L. tridentata fue más eficiente que el del quitosán. Al comparar el efecto de la gobernadora contra los fungicidas sintéticos a la concentración de 2000 ppm, se observó que L. tridentata fue más eficiente que Tecto 60® en todos los casos evaluados y similar a Mancozeb® en tres de las cepas tratadas. En general, las cepas 264 y la CFG-4 fueron las más resistentes, por lo que se requirió una concentración más alta de L. tridentata (8000 ppm) para lograr el 100 % de inhibición micelial.

El efecto sinérgico derivado del uso de las mezclas Larrea-Quitosán fue notorio en el caso de las cepas 372 y 2CH6-8, ya que en la mayoría de los casos se logró el 100% de inhibición micelial con la utilización de dosis más pequeñas de L. tridentata. También es notorio el efecto de sinergia en las cepas 264 y 322, aunque en este caso se requirieron dosis de L. tridentata un poco mayores (1000 ppm). La cepa más resistente fue la CFG-4, ya que no se observó una inhibición marcada del hongo a bajas concentraciones de L. tridentata, aunque el efecto de sinergia se observa claramente cuando se utilizó la concentración de L. tridentata de 2000 ppm.

Cuadro 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de cinco cepas del hongo C. gloeosporioides después de haber sido tratadas con extracto etanólico hidrosoluble de la resina de L. tridentata (L), quitosán (Q) y mezclas Larrea- Quitosán (L-Q).

Dosis Inhibición del crecimiento micelial de C. gloeosporioides empleadas (%) (PPm) Cepa Cepa Cepa Cepa Cepa 372 264 322 2CH6-8 CFG-4 Testigo (PDA*) 0 0 0 0 0 Mancozeb® 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 Tecto 60® 76.8 85.2 86.6 88.5 92.7 L 250 93.3 72.2 88.7 89.6 68.1 L 500 100.0 78.6 92.0 91.5 79.3 L 1000 100.0 81.0 95.4 100.0 83.7 L 2000 100.0 82.2 100.0 100.0 85.9 L 8000 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 Q 1000 9.9 4.5 10.8 20.5 20.9 Q 2000 12.9 1.1 39.1 42.0 18.9 Q 4000 14.9 4.9 45.1 44.2 20.5 Q 6000 18.5 8.6 51.4 45.66 22.1 Q 8000 23.4 9.9 56.6 49.2 25.5 L-Q 250-1000 100.0 30.6 86.3 100.0 53.4 L-Q 250-2000 100.0 88.8 43.5 100.0 64.6 L-Q 500-1000 100.0 37.5 100.0 100.0 60.2 L-Q 500-2000 100.0 100.0 63.9 100.0 68.6 L-Q 1000-1000 100.0 100.0 100.0 100.0 75.7 L-Q 1000-2000 100.0 100.0 100.0 100.0 77.6 L-Q 2000-1000 100.0 100.0 100.0 100.0 85.7 L-Q 2000-2000 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 *E1 testigo o blanco utilizado fue PDA o papa dextrosa agar con agua destilada.

Claims (12)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. - Antifúngico orgánico para uso agrícola y en poscosecha caracterizado por que se trata de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y sus mezclas con el biopolímero quitosán.

2. El uso de mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las formulaciones preparadas para proteger a diferentes productos agrícolas de enfermedades fungosas antes y durante poscosecha, pueden contener de 50 a 50,000 ppm o más, de la mezcla de bioproductos, en la cual el porcentaje de los extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata podrá variar desde 1 a 99% con respecto al peso total de la mezcla. Las dosis a emplear dependerán de los productos agrícolas a tratar, de los tipos de hongos fitopatógenos que se pretenden controlar o de los resultados que se desean obtener.

3. El uso de mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, de conformidad con las reivindicaciones ly 2, caracterizado porque las mezclas pueden utilizarse en forma de polvo, soluciones, suspensiones, emulsiones, miniemulsiones, microemulsiones o pastas. Aunque por regla general se aplicarán en forma de soluciones acuosas.

4. El uso de mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 y 3, se caracterizan porque se pueden utilizar para controlar hongos fitoparasíticos que pueden contaminar y enfermar a una amplia variedad de productos agrícolas durante el ciclo vegetativo o en la etapa de poscosecha. Los hongos fitopatógenos de poscosecha que pueden ser prevenidos y controlados incluyen, pero no se limitan, a: Botrytis spp., Colletotrichum spp, Aspergillus spp., Alternaría spp., Fusarium spp. y Penicillium spp., entre muchos otros más.

5. El uso de mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 y 4, caracterizado porque se aplica para controlar hongos fitopatógenos que afectan productos agrícolas que incluyen, pero no se limitan, a frutas como papaya, fresa, uvas, plátano, cítricos, mango y hortalizas como jitomate, tomatillo, chile y papa; granos como el frijol y el maíz; y en una amplia variedad de plantas de ornato como las rosas.

6. El uso de mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 y 5, caracterizado porque las mezclas pueden utilizarse solas o como parte de una formulación a la que se pueden adicionar otros productos naturales o botánicos como pueden ser los extractos y aceites esenciales de hojas de Flourensia cernua, Lippia berlandieri, Agave lecheguüla, los cuales protegen de las pudriciones de poscosecha ocasionadas por los hongos Aspergillus flavus y A. versicolor. Es importante señalar que la adición a la formulación de cualquier agroquímico diferente de los extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y del biopolímero quitosán, puede tener un efecto sinérgico, antagónico o meramente aditivo.

7. El uso de mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 y 6, caracterizado porque pueden aplicarse de manera alternada a los fungicidas sintéticos del grupo de los benzimidazoles o carbamatos como el Benomyl® o Benlate®; Mancozeb® y Tecto 60®, que son los de mayor uso en el control de enfermedades fungosas de pre y poscosecha como la antracnosis en cultivos frutícolas como aguacate, mango, papaya, plátano y cítricos, entre otros.

8. Un método para controlar hongos fitopatógenos presentes en productos agrícolas durante la etapa de poscosecha, utilizando mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, preparadas de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, caracterizado porque la formulación que contiene la mezcla se aplicará por aspersión con una aspersora de mochila o de cualquier otro tipo, procurando cubrir uniformemente el producto a tratar.

9. Un método para controlar hongos fitopatógenos presentes en semillas durante la etapa de poscosecha, utilizando mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, preparadas de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, caracterizado porque la formulación que contiene la mezcla se aplicará con una máquina de tambor con eje excéntrico.

10. Un método para controlar hongos fitopatógenos presentes en frutas y hortalizas durante la etapa de poscosecha, utilizando mezclas de extractos hidrosolubles de la resina de L. tridentata y quitosán, preparadas de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, caracterizado porque los productos a tratar serán inmersos en la formulación que contiene la mezcla.

11. Para el caso prevenir el ataque de microorganismos fitopatógenos durante el períodos de almacenamiento de granos y semillas en ambientes cerrados, la formulación Larrea-quitosán se deberán aplicar en forma de aspersión o nebulización, sólo o mezclado con algún otro producto agroquímico utilizado para los mismos propósitos; debiendo siempre cubrir uniformemente el producto a almacenar. La cantidad por aplicar será desde 1.0 a 20 litros o más por tonelada de semilla o grano, dependiendo esta cantidad de las condiciones ambientales de almacenamiento, así como del tipo de producto agrícola; ya sean frutas u hortalizas frescas, así como semillas o granos secos o con un bajo porcentaje de humedad interno.

12. El uso de mezclas de extractos bidrosolubles de la resina de L. tridentata y el biopolímero quitosán, en diferentes concentraciones, los cuales actúan como fungicidas orgánicos ambientalmente inocuos y pueden ser empleados para prevenir o curar enfermedades de precosecha, poscosecha y almacén en frutas, flores, hortalizas, semillas, granos, y cualquier otro producto agrícola susceptible de ser infectado por hongos fitopatogénicos .