MX2011009478A - Dominio angiogenico de proteina secretada, acida, rica en cisteinas y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona composiciones y métodos los cuales explotan el descubrimiento del dominio angiogénico carboxi de Proteína Secretada, Ácida, Rica en Cisteínas (SPARC).

Description

DOMINIO ANGIOGENICO DE PROTEÍNA SECRETADA, ÁCIDA, RICA EN CISTEINAS Y METODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona composiciones y métodos los cuales explotan el descubrimiento del dominio angiogénico carboxi de Proteína Secretada, Acida, Rica en Cisteínas (SPARC, por sus siglas en inglés) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Proteína Secretada, Acida, Rica en Cisteínas (SPARC), también conocida como osteonectina , es una glicoproteína de 286 aminoácidos. La SPARC tiene la afinidad para una amplia variedad de ligandos incluyendo cationes (por ejemplo, Ca2+, Cu2+, Fe2*) , factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ) , proteínas de matriz extracelular (EC ) (por ejemplo, colágeno I-V y colágeno IX, vitronectina , y trombospondina-1 ) , células endoteliales , plaquetas, albúmina e hidroxiapatita . La expresión de SPARC se regula do manera desarrollada, y se expresa predominantemente en tejidos que se someten a remodelación durante el desarrollo normal o en respuesta a una lesión (véase, por ejemplo, Lañe y colaboradores, FASEB J, 8, 163-173 (1994)). Se expresan altos niveles de proteína SPARC en huesos y dientes en desarrollo.

La SPARC" se; regula por incremento en varios cánceres agresivos, pero está ausente de la vasta mayoría de tejidos normales (Porter y colaboradores, J Histochem. Cytochem. , 43, 791(1995) y véase a continuación). La expresión de SPARG se .induce entre una variedad de tumores (por ejemplo, vejiga, hígado, ovarios, ríñones, intestinos y mama) . En el cáncer de mama, por ejemplo, la expresión de SPARC se ha asociado con carcinoma avanzado. Los tumores de vejiga invasivos de etapa T2 o mayor han mostrado que expresan mayores niveles de SPARC que los tumores de vejiga de etapa Ti (o tumores menos superficiales) y cieñen peor prognosis (véase, por ejemplo, Y mana ka y colaboradores, J. Urology, 166, 2495-2499 (2001)). En meningiomas, la expresión de SPARC se ha asociado solamente con tumores invasivos (véase, por ejemplo, Rempel y colaboradores, Clincal Cáncer Res., 5, 237-241 (1999)). La expresión de SPARC también se ha detectado en 74.5% de lesiones de carcinoma de mama invasivo in situ (véase, por ejemplo, Bellahcene, y colaboradores, Am. J. Pathol, 146, 95-100 (1995)), y 54.2% de carcinoma ductal infiltrante de la mama (véase, por ejemplo, Kim y colaboradores, J Kor an Med. Sel, 13, 652-657 (199tí)).. La expresión de SPARC también ¦ se ha asociado con microcalcificación frecuente en cáncer de mama (véase, por ejemplo, Bellahcene y colaboradores, supra) , sugiriendo que la expresión de SPARC . puede ser responsable por la afinidad de metástasis de mama para el hueso. También se sabe que la SPARC se enlaza a la albúm.ina (véase, por '•jemplo, Schnitzer, J Biol. Chem. , 269, 6072 (1994)).

Por consiguiente, existe una necesidad por composiciones y métodos que tomen ventaja de la función en la enfermedad de la SPARC, por ejemplo, la función en algunos cánceres de la SPARC. En particular, existe una necesidad por composiciones y métodos que tomen ventaja de las actividades especificas de dominio de la SPARC, tal como el dominio angiogénico carboxi de SPARC.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, que comprende un domino angiogénico de SPARC aislado. Además, la invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde existen hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores o que son 90% idénticos a SEQ ID NO: 1 y en donde los polipéptidos SPARC aislados mutados retiene por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención también proporciona polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde existen hasta 5 cambios de aminoácidos no conservadores y en donde los polipéptidos .SPARC aislados mutados retienen por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención también proporciona métodos para estimular la angiogénesis en un animal en necesidad de angiogénesis que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido purificado que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 y/o polipéptidos aislados que comprenden una secuencia mutada de SEQ ID NO: 1, en donde existen hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores que son 90% idénticos a SEQ ID NO: 1 y en donde los polipéptidos SPARC aislados mutados retienen por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención también proporciona métodos para estimular la angiogénesis en un animal en necesidad de angiogénesis que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido purificado que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 y/o polipéptidos aislados que comprenden una secuencia mutada de SEQ ID NO: 1, en donde existen hasta 5 cambios de aminoácidos no conservadores y en donde los polipéptidos SPARC aislados mutados retienen por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden SEQ ID NO: 2, que comprende un polipéptido SPARC maduro que carecen de los aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 y polipéptidos SPARC, carboxi truncados, aislados que son el producto de una digestión enzimática de la carboxi terminal de un polipéptido SPARC. de longitud completa y que retiene no más de 5¾ de la ac i idad anqi.oqénica de SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona métodos para tratar un tumor en un animal que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera o más de los polipéptidos SPARC que carecen de actividad angiogénica, incluyendo, por ejemplo, polipéptidos SPARC, carboxi truncados, aislados que son el producto de una digestión enzimática de la carboxiterminal de un polipéptido SPARC de longitud completa y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1 dada a conocer en este documento, en particular SEQ ID NO: 2.

La invención proporciona métodos para sensibilizar un tumor en un animal que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva cualquiera o más de los polipéptidos SPARC que carecen de actividad angiogénica, incluyendo, los polipéptidos SPARC, carboxi truncados, aislados que son el producto de una digestión enzimática de la carboxiterminal de un polipéptido SPARC de longitud completa que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1 dada a conocer en este documento, en particular SEQ ID NO: 2 y una terapia sin SPARC.

La invención también proporciona métodos para identificar un inhibidor de angiogénesis que comprende: (a) administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o que comprenden formas de mutante de la secuencia de SEQ ID NO: 1 , en donde hay hasta 5 cambios dé aminoácidos conservadores o que son 90% idénticos a SEQ ID NO: 1 y en donde forman ya sea un polipéptido aislado mutado retienen por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1 a un sistema de modelo de angiogénesis; (b) administrar separadamente de manera simultánea un inhibidor de angiogénesis candidato y la composición de (a) a una composición angiogénica del sistema de modelo; (c) cuantificar la cantidad de angiogénesis producida en (a) y (b) ; y (d) si la angiogénesis se reduce en (b) en comparación con (a), identificar el inhibidor de angiogénesis candidato como un inhibidor de angiogénesis.

La invención también proporciona métodos para identificar un inhibidor de angiogénesis que comprende: (a) administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende una secuencia de SEQ . ID NO: 1 o que comprende formas mutantes de la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde existen hasta 5 cambios de aminoácidos no conservadores y en donde cualquiera forma un polipéptido aislado mutado, retienen por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1 a un sistema de modelo de angiogénesis; (b) administrar separadamente de manera simultánea un inhibidor de angiogénesis candidato y la composición de (a) a la composición angiogénica del sistema de modelo; (c) cuantificar la cantidad de angiogénesis producida en (a) y (b) ; y (d) si la angiogénesis se reduce en (b) en comparación con (a), identificar el inhibidor de angiogénesis candidato como un inhibidor de angiogénesis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 representa una representación gráfica de datos que muestra el efecto de la administración de SPARC exógeno con AbraxaneMR y SutentMR en un modelo de PC3.

La FIGURA 2 representa los resultados de un ensayo de formación del tubo en 3-D HUVEC que caracteriza la actividad angiogénica de SPARC.

La FIGURA 3 representa los resultados de un ensayo SDS-PAGE en el cual el SPARC de tipo natural se conduce a lo largo de SPARC-d (una mezcla de dos proteínas SPARC truncadas C-terminales ) .

La FIGURA 4 representa una representación gráfica de datos obtenidos del ensayo de formación del tubo en 3-D HUVEC que caracteriza el SPARC de tipo natural y SPARC-d.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente, se ha determinado que la actividad pro-angiogénica del polipéptido SPARC se localiza en los aminoácidos 233-286 (SEQ ID NO: 1) de un polipéptido SPARC maduro. Previamente esta actividad se reportó que está en la región N-terminal del SPARC (Sage H. Adv Dent Res. 1995 9(3 Suppl):5. Puesto que la región proapoptótica del SPARC es más aminoterminal , este descubrimiento sugiere que los polipéptidos SPARC que carecen del domino de angiogénesis carboxiterminal (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) pueden ser más activos contra enfermedades dependientes de SPARC, tales como, por ejemplo, tumores que los polipéptidos SPARC maduros de longitud completa. ¦ Adicionalmente, mientras que no se desee ser limitado por ninguna teoría particular, puesto que la angiogénesis es necesaria para el crecimiento tumoral, es posible que el SPARC sin el dominio angiogénico terminal (SEQ ID NO: 2) puede competir contra el SPARC de tipo natural de longitud completa y negar su actividad in vivo.

La invención proporciona polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 1 o 2 con hasta 15 aminoácidos adicionales, de manera preferente hasta 12 aminoácidos adicionales, de manera más preferente hasta 10 aminoácidos adicionales, de manera más preferente hasta 8 aminoácidos, de manera más preferente hasta 5 aminoácidos adicionales, de manera más preferente hasta 4 aminoácidos adicionales, de manera más preferente hasta 3 aminoácidos adicionales, de manera más preferente hasta 2 aminoácidos adicionales y de manera mucho más preferente un aminoácido adicional agregado a la carboxi y/o aminoterminal .

La invención proporciona polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 1 con hasta 5 . cambios de aminoácidos conservadores, de manera preferente hasta 4 cambios de aminoácidos conservadores, de manera más preferente hasta 3 cambios de aminoácidos conservadores; de manera más preferente hasta 2 cambios de aminoácidos conservadores, de manera más preferente un solo cambio de aminoácido conservador y que retienen por lo menos 60%, de manera preferente por lo menos 50%, de manera más preferente por¦ lo menos 40% y de manera mucho más preferente por lo menos 30% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención también proporciona polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 1 con hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores, de manera preferente hasta 4 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera más preferente hasta 3 cambios de aminoácidos no conservadores; de manera más preferente hasta 2 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera más preferente un solo cambio de aminoácidos no conservador y que retienen por lo menos 60%, de manera preferente por lo menos 50%, de manera más preferente por lo menos 40%, y de manera mucho más preferente por lo menos 30% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona polipéptidos aislados que son por lo menos 90% idénticos a SEQ ID NO: 1, de manera preferente que son por lo menos 85% idénticos a SEQ ID NO: 1, de manera más preferente que son por lo menos 80% idénticos a SEQ ID NO: 1, de manera más preferente que son por lo menos 75% idénticos a SEQ ID NO: 1, de. manera más preferente que son por lo menos 70% idénticos a SEQ ID NO: 1 y que retienen por lo menos 60%, de manera preferente por lo menos 50%, de manera más preferente por lo menos 40%, y de manera mucho más preferente por lo menos 30% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención incluye polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos SPARC . de la invención descritos en este documento, incluyendo SEQ ID NOS: 1 y 2 y sus mutantes dados a conocer en este documento, el vector de expresión para expresar estas secuencias de ácidos nucleicos y células transformadas que comprenden estos polinucleótidos.

La invención proporciona métodos para estimular la angiogénesis en un animal en necesidad de angiogénesis que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1. La invención proporciona métodos para tratar y prevenir enfermedades dependientes de SPARC en un animal que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 2.· La invención proporciona métodos para estimular la angiogénesis en un animal en necesidad de angiogénesis que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido purificado que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un mutante del mismo que está de acuerdo con la invención y/o o se describen en este documento. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para tratar hipoperfusión patológica tal como restenosis, aterosclerosis , e hipoperfusión límbica; también para la isquemia incluyendo, por ejemplo, en donde la isquemia es isquemia cardiaca y apoplejía.

La invención proporciona polipéptidos SPARC aislados que comprenden SEQ ID NO: 2, es decir, polipéptidos SPARC maduros que carecen de los aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1. La invención proporciona polipéptidos SPARC aislados, incluyendo polipéptidos etiquetados con epitopo, que son carboxi truncados, es decir, polipéptidos SPARC que son los productos dé una digestión enzimática de la carboxiterminal de un polipéptido SPARC de longitud completa y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera preferente no más de 3% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera mucho más preferente no más de 1¾ de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La digestión de- carboxilo se puede hacer mediante cualquier método adecuado incluyendo digestiones enzimáticas y químicas. Por ejemplo, aquellas personas de experiencia ordinaria podrían adaptar rutinariamente la serina carboxipeptidasa , carboxipeptidasa Pro-X lisosomal. carboxipeptidasa c, carboxipeptidasa D, carboxipeptidasas tipo cisteína, metaloexopeptidasas y similares para este propósito. Véase también, Nakazawa T y colaboradores Terminal proteomics: N- and C-terminal analyses for high-fidelity identification of proteins using MS., Proteomics. 2008 Feb; 8(4): 673-85 que se incorporan por este documento a manera de referencia.

La invención proporciona polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 2 con hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores, de manera' preferente hasta 4 cambios de aminoácidos conservadores, de manera más preferente hasta 3 cambios de aminoácidos conservadores; de manera más preferente hasta 2 cambios de aminoácidos conservadores, de manera más preferente un solo cambio de aminoácidos conservador y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera preferente no más de 3% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera mucho más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SÉQ ID NO: 1.

La invención también proporciona polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 2.con hasta 5 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera preferente hasta 4 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera más preferente hasta 3 cambios de aminoácidos no conservadores; de manera más preferente hasta 2 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera más preferente un solo cambio de aminoácidos no conservador y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera preferente no más de 3% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera mucho más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona polipéptidos aislados que son por lo menos 90% idénticos a SEQ ID NO: 2, de manera preferente que son por lo menos 85% idénticos a SEQ ID NO: 2, de manera más preferente que son por lo menos 80% idénticos a SEQ ID NO: 2, de manera más preferente que son por lo menos 75% idénticos a SEQ ID NO: 2, de manera más preferente que son por lo menos 70% idénticos a SEQ ID NO: 2 y que retienen no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera preferente no más de 3% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera mucho más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona métodos para tratar un tumor en un animal que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera o más de polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 2 con hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores, de manera preferente hasta 4 cambios de aminoácidos conservadores, de manera más preferente hasta 3 cambios de aminoácidos conservadores; de manera más preferente hasta 2 cambios de aminoácidos conservadores, de manera más preferente un solo cambio de aminoácido conservador . y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera preferente no más de 3% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera mucho más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona métodos para tratar un tumor en un animal que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera o más polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 2 con hasta cambios de aminoácidos no conservadores, de manera preferente hasta 4 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera más preferente hasta 3 cambios de aminoácidos no conservadores; de manera más preferente hasta 2 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera más preferente un solo cambio de aminoácidos no conservador y que ' retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera preferente no más de 3% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera mucho más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona métodos para sensibilizar un tumor en un animal que comprende la administración en una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera o más polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 2 con hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores, de manera preferente hasta 4 cambios de aminoácidos conservadores, de manera más preferente hasta 3 cambios de aminoácidos conservadores; de manera más preferente hasta 2 cambios de aminoácidos conservadores, de manera más preferente un solo cambio de aminoácido conservador y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera preferente no más de 3% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera más preferente no más . de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera mucho más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1 y una terapia sin SPARC.

La invención proporciona métodos para sensibilizar un tumor en un animal que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera o más polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 2 con hasta 5 cambios de aminoácidos no conservadores, de' manera preferente hasta 4 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera más preferente hasta 3 cambios de aminoácidos no conservadores; de manera más preferente hasta 2 cambios de aminoácidos no conservadores, de manera más preferente un solo cambio de aminoácidos no conservador y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera preferente no más de 3% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1, de manera mucho más preferente no más de 1% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1 y una terapia sin SPARC.

La invención también proporciona el tratamiento o sensibilización de enfermedades proliferativas diferentes a tumores o cánceres con cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera o más de polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 2 o mutantes de los mismos descritos en este documento. Las enfermedades proliferativas adecuadas para el tratamiento son cicatrices hipertróficas y queloides, retinopatia diabética proliferativa, artritis reumatoide, malformaciones arteriovenosas , placas ateroscleróticas , sanación retardada de heridas, articulaciones hernofilicas , fracturas no consolidadas, síndrome de Osier-Weber, psoriasis, granuloma piogénico, escleroderma , tracoma, menorragia, adhesiones vascular restenosis.

La invención proporciona métodos para tratar o sensibilizar un tumor en un animal, en donde el tumor se selecciona del grupo que consiste de tumores de la cavidad bucal, tumores faríngeos, tumores del sistema digestivo, tumores del sistema respiratorio, tumores óseos, tumores cartilaginosos, metástasis ósea, sarcomas, tumores de la piel, melanoma, tumores de mama, tumores del sistema genital, tumores del tracto urinario, tumores orbitales, tumores cerebrales y del sistema nervioso central, gliomas, tumores del sistema endocrino, tumores de tiroides, tumores esofágicos, tumores gástricos, tumores del intestino delgado, tumores colónicos, tumores rectales, tumores anales, tumores de hígado, tumores de la vesícula biliar, tumores pancreáticos, tumores laríngeos, tumores de los pulmones, tumores bronquiales, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de' pulmón de células pequeñas, tumores cervicales uterinos, tumores del cuerpo uterino, tumores ováricos, tumores de la vulva, tumores vaginales, tumores de la próstata, carcinoma prostético, tumores testiculares , tumores de pene, tumores de la vejiga urinaria, tumores del riñon, tumores de la pelvis renal, tumores de la uretra, tumores de cabeza y cuello, cáncer de paratiroides , enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide acrónica.

La invención proporciona métodos para sensibilizar un tumor en un animal, en donde la terapia sin SPARC es uno o más de un régimen de radiación o biológico, quimioterapéutico, incluyendo por ejemplo, en donde la terapia si SPARC comprende uno más de docetaxel, paclitaxel, taxanos, compuestos de platino, antifolatos, antimetabolitos , antimitóticos, agentes dañinos de ADN, proapoptóticos , agentes que inducen diferenciación, agentes anti-angiogénicos , antibióticos, hormonas, péptidos, anticuerpos y combinaciones de los mismos.

La invención proporciona métodos para identificar un inhibidor de angiogénesis que comprende: (a) administrar una cantidad efectiva de una composición de cualquiera de SEQ ID NO: 1 o mutantes de la misma a un sistema de modelo de angiogénesis; (b) administrar separadamente de manera simultánea un inhibidor de angiogénesis candidato y la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 al sistema de modelo de angiogénesis; (c) cuantificar la cantidad de angiogénesis producida en (a) y (b) ; y (d) si la angiogénesis se reduce en (b) en comparación con (a) , identificar el inhibidor de angiogénesis candidato como un inhibidor de angiogénesis actual. Cualquier sistema de modelo angiogénico adecuado se puede usar de acuerdo con la invención, incluyendo por ejemplo, en donde el sistema de modelo de angiogénesis es el ensayo de formación del tubo HUVEC.

Como se usa en este documento, un "medicamento" es una composición capaz de producir un efecto que se puede administrar a un paciente o sujeto de prueba. El efecto puede ser químico, biológico o . físico, y el paciente o sujeto de prueba puede ser humano, o un animal no humano, tal como un roedor o ratón transg'énico . La composición puede incluir moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas con distinta composición molecular hechas sintéticamente, encontradas en la naturaleza, o de origen sintético parcial. Se incluyen en este grupo nucleótidos, ácidos nucleicos, aminoácidos. Péptidos, polipéptidos , proteínas, ácidos nucleicos de péptido o complejos que comprenden por lo menos una de estas entidades. El medicamento puede estar comprendido de la composición efectiva sola, o en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Como se usa ' en este documento, un "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos, antimicrobianos o antifúngicos, agentes retardadores isotónicos y de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. El' excipiente puede ser adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal , intramuscular, intratecal u oral. El excipiente puede incluir soluciones o dispersiones- acuosas estériles para reparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de estos medios para la preparación de medicamentos en conocido en la técnica.

Como se usa en este documento, una "cantidad farmacológicamente efectiva" o "cantidad efectiva" de un medicamento se refiere a usar una cantidad de un medicamento presente en esta concentración para dar por resultado un nivel terapéutico de fármacos suministrado durante el periodo en que se usa el fármaco. Esto puede ser dependiente del modo de suministro, periodo de tiempo de la dosificación, edad, peso, salud general,' sexo y dieta del sujeto que recibe el medicamento. La determinación de que dosis es una "cantidad farmacológicamente efectiva" requiere optimización de rutina, que está dentro de las capacidades de una persona de experiencia ordinaria en la técnica.

Como se usa en este documento, los términos "cáncer" o "tumor" se refieren un desorden proliferativo causado o caracterizado por la proliferación de células que tienen susceptibilidad pérdida al control de crecimiento normal. El término cáncer como se usa en la presente solicitud, incluye tumores y cualquiera desorden proliferativo . Los cánceres del mismo tipo de tejido se originan usualmente en el mismo tejido, y se pueden dividir en diferentes subtipos con base en sus características biológicas. Cuatro categorías generales de cánceres son carcinoma (derivados de tejido epitelial), sarcoma (derivados de tejido conjuntivo o mesodermo) , leucemia (derivados de tejidos formadores de sangre) y linfoma (derivado de tejido linfático) . Se conocen más de 200 tipos diferentes de cánceres, y cada órgano y tejido del cuerpo se puede afectar. Ejemplos específicos de cánceres que no limitan la definición de cáncer pueden incluir melanoma, leucemia, astrocitoma, glioblastoma, retinoblastoma , linfoma, glioma, linfoma de Hodgkin y leucemia' de 1-infocitos crónica. Ejemplos de órganos y tejidos que se pueden afectar por varios cánceres incluyen páncreas, mama, tiroides, ovarios, útero, testículos, próstata, tiroides,- glándula pituitaria, glándula renal, ríñones, estómago, esófago, colon o recto, cabeza y cuello, huesos, sistema nervioso, piel, sangre, tejido nasofaríngeo, pulmones, tracto urinario, ' cerviz, vagina, glándulas exógenas y glándulas endocrinas. Alternativamente, un cáncer puede se multicéntrico o de sitio primario desconocido (CUPS) .

Como se usa en este documento, una "célula cancerosa" se refiere a una célula que se ha sometido a un evento de transformación y cuyo crecimiento ya no es regulado al mismo grado, como antes del evento de transformación. Un tumor se refiere una colección de células cancerosas, encontradas frecuentemente como una masa sólida o semisólida en o sobre el tejido o un paciente o sujeto de prueba.

Las enfermedades o condiciones con hipoperfusión patológica se pueden tratar de acuerdo con la invención en donde las cantidades efectivas de uno o más polipéptidos que comprenden SEQ ID NO: 1 se administran al animal, tal como humano. Las enfermedades o condiciones de hipoperfusión adecuadas para el tratamiento de la invención incluyen: isquemia cardiaca, infarto al. miocardio, diabetes, neuropatías, ALS, úlceras orales, úlceras gástricas, restenosis, apoplejía, TIAs, pre-eclampsia y similares (véase también, Carmeliet, Angiogenesis in health and disease, Nature Medicine 9, 653' - 660 (2003), que se incorpora por este documento a manera de referencia, para enfermedades y condiciones adecuadas adicionales).

Las enfermedades con angiogénesis exagerada, particularmente si es dependiente de SPARC, se puede tratar de acuerdo con la invención en donde cantidades efectivas de, por ejemplo, uno o más anticuerpos que fijan como objetivo el dominio angiogénico SPARC u otra terapia anti-SPARC se administran al animal tal como un humano. enfermedades adecuadas con angiogénesis exagerada para el tratamiento de acuerdo con la invención incluyen: cáncer, tumores, angioma, endometriosis , retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, psoriasis, artritis, granuloma piogénico, linfadenopatía angioimunoblástica, enfermedad periodontal, y similares (véase también, Carmeliet, Angiogenesis in health and disease, Nature Medicine 9, 653 - 660 (2003), que se incorpora por este documento a manera de referencia, para enfermedades y condiciones adecuadas adicionales).

Las enfermedades con sanación y remodelación de heridas exageradas particularmente si es dependiente de SPARC se pueden tratar de acuerdo con la invención en donde cantidades efectivas de uno o más anticuerpos que fijan, como objetivo el dominio angiogénico SPARC u otra terapia anti-SPARC se administran al animal, tal como un humano. Las enfermedades adecuadas con sanación y remodelación de heridas exageradas para el tratamiento de acuerdo con la invención incluyen: queloides, ' cicatrices hipertróficas, fibrosis pulmonar y similares (véase también, Carmeliet, Angiogenesis in health and disease, Nature Medicine 9, 653 - 660 (2003), que se incorpora por este documento a manera de referencia, para enfermedades y condiciones adecuadas adicionales).

Un cáncer o célula cancerosa se puede describir como "sensible a" o "resistente a" un régimen terapéutico dado o agente quimioterapéutico con base en la capacidad del régimen de exterminar células cancerosas o disminuir el tamaño del tumor, reducir el crecimiento general del cáncer (es decir a través de la reducción de la angiogénesis ) , y/o inhibir la metástasis. Las células cancerosas que son resistentes a un régimen terapéutico pueden no responder al régimen y pueden continuar proliferando . Las células cancerosas que son sensibles a un régimen terapéutico pueden responder al régimen dando por resultado la muerte celular, una reducción en el tamaño del tumor, crecimiento general reducido (carga tumoral) o inhibición de la metástasis. Por ejemplo, esta se manifiesta deseablemente en una reducción en el tamaño del tumor, crecimiento general /carga tumoral o la incidencia de metástasis de aproximadamente 10% o más, por ejemplo, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, ' aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, o más, a aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15. veces, aproximadamente 20 veces o más. La supervisión de una respuesta se puede lograr por numerosos métodos patológicos, clínicos y de formación de imágenes como se describe en este documento y son conocidos por personas de experiencia en la técnica.

Un tema común para un ' agente quimioterapéutico o combinación de agentes es introducir la muerte de las células cancerosas. Por ejemplo, aductos de ADN tales como nitrosoureas , busulfano, tiotepa, clorambucilo, cisplatina, mitomicina, procarbazina, o dacacarbazina disminuyen el crecimiento de la célula cancerosa al llevar la célula de replicación al reparar el ADN dañado antes ' de la fase M del ciclo celular, o pueden causar por si mismos daño suficiente para desencadenar la apoptosis de la célula cancerosa. Otros eventos tal como expresión génica o transcripción, traducción de proteínas, o metilación del ADN replicado, por ejemplo, también se pueden interferir con el arsenal variado de agentes quimioterapéuticos disponibles para el médico y ayudar a desencadenar los procesos apoptóticos dentro de las células cancerosas. Alternamente, un agente quimioterapéutico puede permitir que se extermine la célula cancerosa mediante aspectos del sistema inmune adquirido o humoral del sujeto de prueba o paciente, por ejemplo, la cascada de complemento o ataque de linfocitos.

Aunque no se desea limitarse por ninguna teoría específica, una célula cancerosa resistente a un agente quimioterapéutico o combinación de agentes puede pelear por su supervivencia al transportar activamente el fármaco fuera de la célula por ejemplo, mediante la sobreexpresión de la p-glicoproteína MDR1 transportadora ABC (FORD y colaboradores 1993. Cytotechnol. 12:171-212) o adquirir "contra-mutaciones" para contrarrestar los fármacos. Por ejemplo, las mutaciones en las enzimas reparadoras¦ de ADN que afectan la capacidad de detectar el daño ai ADN de la célula pueden permitir la replicación del ADN dañado y permitir que las células cancerosas continúen replicándose, agrandando el tumor. Conforme las mutaciones se acumulan, otros puntos reguladores actuarían de otra manera en un' cicle celular normal para cesar la función, y el ciclo de cascadas de crecimiento irregular. Otro aspecto de resistencia quimioterapéutica implica ia evitación de la apoptosis de las células tumorales. Una respuesta normal del organismo hospedero al crecimiento celular desregulado es iniciar la apoptosis y eliminar la célula defectuosa antes de que inicie la cascada en la replicación descontrolada. Sin embargo, esto se puede subvertir por una célula cancerosa, por ejemplo, mediante la interrupción de eventos de transducción de señal, pérdida de dependencia de adhesión o inhibición de contacto en la célula cancerosa, o pérdida de factores promotores de la apoptosis, considerados frecuentemente "supresores de tumor", por ejemplo p53, BRCA1 o RB. La importancia de esta sensibilidad a la apoptosis en el tratamiento de cáncer es apoyada por evidencia resiente que indica que la selectividad de la quimioterapia relativamente pocos tumores aún curados solamente por fármacos depende, aún gran grado, en su fácil susceptibilidad a someterse a la apoptosis (Johnstone y colaboradores, 2002. Cell. 108(2): 153-64).

Como se usa en este documento, ün . "régimen terapéutico" o "terapia" se refiere a la administración de por lo menos un agente que es perjudicial a células cancerosas. Los regímenes terapéuticos adecuados para el uso de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, "regímenes quimioterapéuticos , " "regímenes radioterapéuticos", "régimen terapéutico alternativo" y combinaciones de los mismos.

Como se usa en este documento, un "régimen quimioterapéutico" o "quimioterapia" se refiere a la administración de por lo menos un agente de quimioterapia que es perjudicial para destruir células cancerosas. Existe un gran número de estos agentes de quimioterapia disponibles para un médico. Los agentes de quimioterapia se pueden administrar a un sujeto en una sola dosis en bolo, o se pueden administrar en dosis más pequeñas a través del tiempo. Se puede usar un solo agente quimioterapéutico (terapia de un solo agente) o más de un agente se puede usar en combinación (terapia de combinación). La quimioterapia se puede usar sola para tratar algunos tipos de cánceres. Alternativamente, la quimioterapia se puede usar en combinación con otros tipos de tratamiento, por ejemplo, radioterapia o terapias alternativas (por ejemplo inmunoterapia ) como se describe en este documento. Adicionalmente, un quimiosensibilizador se puede administra como una terapia de combinación con un agente de quimioterapia.

Como se usa en este documento, un "agente quimioterapéutico" se refiere a un medicamento que se puede usar para tratar cáncer, y en general tiene la capacidad de exterminar células cancerosas directamente. Ejemplos de agentes quimioterap.éuticos incluyen agentes alquilantes, antimetabolitos , productos naturales, hormonas y antagonistas, y agentes diversos. Ejemplos de nombres alternos se indican en · corchetes. Ejemplos de agentes alquilantes incluyen mostazas de nitrógeno tales como mecloretamina , ciclofosfamida , ifosfamida, melfalan (L-sarcolisina) y clorambucilo; etileniminas y metilmelaminas tal como hexametilmelamina y tiotepa; sulfonatos de alquilo tal como busulfan; nitrosoureas tal como carmustina (BCNU) semustina (metilo-CCNU) , lomustina (CCNU) y estreptozocina (estreptozotocina) ;. antagonistas de síntesis de ADN tal como fosfato de estramust ina ; y triazinas tal como dacarbazina (DTIC, dimetil-triazenoimidazolecarboxamida ) y temozolomida . Ejemplos de antimetabolitos incluyen análogos de ácido fólico tal como metotrexato ( ametopterina ) ; análogos de pirimidina tal como fluorouracina ( 5-fluorouracilo, 5-FU, 5FU) , floxuridina ( fluorodeoxiuridina , FUdR) , citarabina (rabiósido de citosina) y gemcitabina ; análogos de purina tal como mercaptopurina (6-mercaptopurina, 6-MP) , tioguanina (6- tioguanina, TG) y pentostatina ( 2 ' -deoxicoformicina , desoxicoformicina ) , cladribina y fludarabina; e inhibidores de topoisomerasa tai como amsacrina. Ejemplos de productos naturales incluyen alcaloides de la vinca tal como vinblastina (VLB) y vincristina; taxanos tal como paclitaxel y docetaxel (Taxotere) ; epipodofilotoxinass tal como etoposido y teniposido; camptotecinas tal como topotecano e irinotecano; antibióticos tal como dactinomicina ( actinomicina D) , daunorubicina (daunomicina, rubidomicina) , doxorubicina, bleomicina, mitomicina (mitomicina C) , idarubicina, epirubicina; enzimas tal como L-asparaginasa ; y modificadores de respuesta biológica tal como interferón alfa e interleucina 2. Ejemplos de hormonas y antagonistas incluyen agonistas de hormonas de liberación luteinisantes tales como buserelina; adrenocorticosteroides tal como prednisona ay preparaciones relacionadas; progestinas tal como caproato de hidroxiprogesterona , acetato de medroxiprogesterona u acetato de megestrol; estrógenos tal como dietilstilbestrol y estradioi de etinilo y preparaciones relacionadas; antagonistas de estrógeno tal como tamoxifeno y anastrozol; andrógenos tal como propionato de testosterona y fluoximesterona y preparaciones relacionadas; antagonistas de andrógeno tal como ftamida y bicalutamida ; y análogos de hormonas liberadoras de gonadctropina tal como liprorido.

Ejemplos de agentes diversos incluye talidomida; complejos de coordinación de platino tal como cisplatina (cis-DDP) , oxaliplatina y carboplatina ; antracenedionas tal como mitoxantrona ; ureas sustituidos tal como hidroxiurea ; derivados de metilhidra zina como procarbazina (N-metilhidrazina, MIH) ; supresores adrenocorticales tal como mitotano (?,?'-DDD) y . aminoglutetimida ; agonistas RXR tal como bexaroteno; e inhibidores de tirosina-cinasa tal como imatinib. Nombres alternos y nombres comerciales de estos y ejemplos adicionales de agentes quimioterapéuticos , y sus métodos de uso incluyendo regímenes de dosificación y administración, serán conocidos por una persona versada en la técnica, y se puede encontrar en cualquiera referencia adecuada conocida por aquellas personas de experiencia ordinaria. En particular, los agentes quimioterapéuticos adecuados para el uso de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación, paclitaxeles enlazados a nanopartículas de albúmina .

Como se usa en este documento, el término "régimen radioterapéutico" o "radioterapia" se refiere a la administración de radiación para exterminar células cancerosas. La radiación interactúa con varias moléculas dentro de la célula, pero el objetivo primario, que da por resultado la muerte celular es el ácido desoxirribonucleico (ADN) . Sin embargo, la radioterapia también da por resultado frecuentemente daño a las membranas celulares y nucleares y otros organelos . El daño del ADN implica usualmente rompimientos de hebra individual y doble hebra en la cadena principal de azúcar-fosfato. Adicionalmente , puede haber reticulación de ADN y proteínas, que pueden interrumpir la función celular. Dependiendo del tipo de radicación, el mecanismo de daño de ADN puede variar como lo · hace la efectividad biológica relativa. Por ejemplo, las partículas pesadas (es decir protones, neutrones) dañan el ADN directamente y tienen una mayor efectividad biológica relativa. La radiación electromagnética da por resultado ionización indirecta que actúa a través de radicales libres de hidroxilo, de vida corta producidos principalmente por la ionización de agua celular. Las aplicaciones clínicas de radiación consisten de radiación de haz externa (desde una fuente exterior) y braquiterapia (usando una fuente de radiación implantada o . insertada en el paciente) . La radiación de haz externa consiste de rayos X y/o rayos gamma, mientras que la braquiterapia emplea núcleos radioactivos que desintegran y emiten partículas alfa o partículas beta junto con un rayo gamma .

La radioterapia se puede usar adicionalmente en combinación con la quimioterapia, con el agente quimioterapéutico que actúa como un radio sensibilizador. La selección específica de radioterapia adecuada para un paciente particular se puede determinar por una persona experta en el punto de cuidado, tomando en consideración el tejido y la etapa del cáncer.

Como se usa en este documento, el término "régimen terapéutico alternativo" o "terapia alternativa" puede incluye por ejemplo, modificadores de respuesta biológica (incluyendo modificadores de respuesta biológica de polipéptidos , carbohidratos y lípidos), toxinas, lectinas, agentes antiangiogénicos , inhibidores de receptor de tirosina cinasa (por ejemplo IressaMR (gefitinib) , . TarcevaMR (erlotinib) , ErbituxMR (cetuximab) , mesilato de imatinib (GleevecMR) , inhibidores de proteosoma (por ejemplo bortezomib, Velcade) ; inhibidores VEGFR2 tal como PTK787 (ZK222584), inhibidores de aurora-cinasa (por ejemplo ZM447439); inhibidores de objetivo de rapamicina en mamíferos (mTOR) , inhibidores de ciclooxigenasa-2 (COX-2), inhibidores de rapamicina . (por ejemplo sirolimus, Rapamune . TM . ) ; inhibidores de farnesil -transíerasa (por ejemplo tipifarnib, Zarnestra) ; inhibidores de metaloproteinasa de matriz (por ejemplo BAY 12-9566; tecogalano de polisacárido sulfatado) ; inhibidores de angiogénesis (por ejemplo AvastinMR (bevacizumab) ; análogos de- fumagilina tal como TNP-4; carboxiaminotriazol ; BB-94 y BB-2516; talidomida ; interleucina-12 ; linomida; fragmentos de péptido; y anticuerpos para factores de crecimiento vascular y receptores del factor de crecimiento vascular) ; inhibidores del receptor del factor de crecimiento derivados de plaquetas, inhibidores de cinasa C de proteina, inhibidores de cinasa activados con mitógeno, inhibidores de cinasa de proteina activados con mitógeno, inhibidores de oncogen transformantes del virus de sarcoma Rous (SRC) , inhibidores de histonedeacetilasa, inhibidores del factor inducible de hipoxia pequeña, inhibidores de erizo e inhibidores de señalización de . TGF-.beta. adicionalmente , un agente inmunoterapéutico también se consideraría como un régimen terapéutico alternativo. Ejemplos incluyen quimiocinas, quimiotaxinas, citocinas, interleucinas, o factor de tejido. Agentes inmunoterapéuticos adecuados también incluyen suero o globulina gamma que contiene1 anticuerpos preformados; adyuvantes inmunoestimulantes no específicos; inmunoterapias especifica activa; inmunoterapia adoptiva. Además, las terapias alternativas pueden incluir ' otras entidades químicas basadas biológicas tales como polinucleótidos, incluyendo moléculas antisentido, polipéptidos, anticuerpos, vectores de terapia génica y similares. Estos terapéuticos alternativos se pueden administrar solos o en combinación, o en combinación con otros regímenes terapéuticos descritos en este documento. Nombres alternos y nombres comerciales de estos agentes usados en regímenes terapéuticos alternativos y ejemplos adicionales · de agentes usados en regímenes terapéuticos alternativos, y sus métodos de uso incluyendo regímenes de dosificación y administración, serán conocidos por una persona versada en la técnica. Adicionalmente , los métodos de uso de agentes quimioterapéuticos y otros agentes usados en regímenes terapéuticos alternativos en terapias de combinación, incluyendo regímenes de dosificación y administración, también serán conocidos por una persona versadas en la técnica.

En particular, los regímenes terapéuticos alternativos adecuados 'incluyen, sin limitación, anticuerpos a moléculas sobre la superficie de células cancerosas tales como anticuerpos a Her2 (por ejemplo, Trastuzumab) , EGF o Receptores de EGF,' VEGF (por ejemplo, Bevacizumab) o Receptores de VEGF, CD20, y similares. El agente terapéutico puede comprender además un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que media una o más de la activación de complemento, citotoxicidad mediada por células, induce la apoptosis, induce la muerte celular y la opsinizacicn . Por ejemplo, este fragmento de anticuerpo puede ser un dominio Fe completo o parcial.

Por "anticuerpos" se propone sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales , dimeros, multímeros, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) . Los anticuerpos pueden ser de murino, humano, humanizados, quiméricos, o derivados de otras especies. Un anticuerpo es una proteina generada por el sistema inmune que es capaz de reconocer y enlazarse a un antigeno especifico. Un antigeno objetivo tiene en general numerosos sitios de enlace, también llamados epitopos, reconocidos por CDRs en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se enlaza específicamente en un epítopo tiene una diferente estructura. De esta manera, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente.

Un anticuerpo' incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de enlace al antígeno que enlaza inmunoespecíficamente un antígeno de un objetivo de interés o parte del mismo. Los objetivos incluyen, células cancerosas u otras células que producen anticuerpos anti-inmunes asociados con una enfermedad autoinmune.

Las inmunoglobulinas dadas a conocer en este documento pueden ser de cualquier ciase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA) o subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) de molécula de inmunoglobulina . Las inmunoglobul inas se pueden derivar de cualquier especie.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa que mantiene la actividad biológica deseada. "Fragmentos de anticuerpo" son en general el antígeno que se enlaza a una región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab' , F(ab')2, y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) , CDR (región de determinación de complementariedad) , y fragmentos de enlace a epitopo de cualquiera de lo anterior que se enlaza y monoespecífreamente a antigenos de células cancerosas, antigenos virales y antigenos microbianos, moléculas de anticuerpo de cadena individual; y anticuerpos multiespecificos formados de fragmentos de anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales referenciades en este documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica cen su homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico con su homologa a secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como también fragmentos de estos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (Patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los anticuerpos quiméricos de interés en este documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de enlace al antigeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, ¦ Mono del Viejo Mundo o Simio) y secuencias de región constante humana.

"Citotoxicidad mediadas por células dependientes de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en /la cual la célula citotóxica no especifica que expresan receptores Fe (FcRsj (por ejemplo, células Exterminadoras Naturales ' (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado sobre una célula objetiva y causan subsecuentemente la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fe .. gamma .. RUI solamente, mientras que los monocitos expresan Fe. gamma. RI, Fe . gamma . RI I y Fe . gamma . RUI . Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro (Patente de E.U.A. No. 5,003,621; Patente de E.U.A. No. 5,821,337). Las células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Exterminadoras Naturales (NK) . Alternativa, o adicionalmente , la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como aquel dado a conocer por Clynes y colaboradores PNAS (EUA) , 95:652-656 (1998).

Un anticuerpo que "induce la muerte celular" es uno que causa que una célula viable se vuelva no viable. La muerte celular in vitro se puede determinar en ausencia de complemento y células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . De esta manera, el ensayo para la muerte celular se puede realizar usando suero inactivado con calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular, pérdida de la integridad de membrana como se evalúa por la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano o 7AAD se puede evaluar relativo con las células no tratadas. Los anticuerpos inductores de muerte celular son aquellos que inducen la captación de PI en el ensayo de captación de PI en células BT474.

Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada como es determinado por el enlace de una anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular, y/o formación de vesículas de la membrana (llamadas anticuerpos apoptóticos ) .

Como se usa en este documento, un "quimiosensibilizador" o "sensibilizador" es un medicamento que puede aumentar el efecto terapéutico de un agente quimioterapéutico, tratamiento de radioterapia o régimen terapéutico alternativo, y mejora. por lo tanto la eficacia de este tratamiento o agente. La sensibilidad o resistencia de un tumor o célula cancerosa al tratamiento también se puede medir en un animal, tal como un humano o roedor, al, por ejemplo, medir el tamaño del tumor, carga tumoral o incidencia de metástasis durante un período de tiempo. Por ejemplo, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 o aproximadamente 6 meses para un humano y aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, o aproximadamente 4-6 semanas para un ratón. Una composición o un método de tratamiento puede sensibilizar un tumor o respuesta de la célula cancerosa a un tratamiento terapéutico si el incremento en la sensibilidad del tratamiento o la reducción en la resistencia es de aproximadamente 10% o más, por ejemplo, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, o más,' a aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces o más, comparado con la sensibilidad o resistencia del tratamiento en ausencia de esta composición o método. La determinación de sensibilidad o resistencia a un tratamiento terapéutico es rutina en la técnica y dentro de la experiencia de una persona versada en la técnica.

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se pueden usar intercambiablemente, y se refieren a un compuesto comprendido de- por lo menos dos residuos de aminoácidos enlazados covalentemente por enlaces de péptido o enlaces de péptido modificados, por ejemplo isoésteres de péptido (enlaces de péptido modificados) que pueden proporcionar propiedades deseadas adicionales al péptido, tal como vida media incrementada. Un péptido puede comprender por lo menos dos aminoácidos . Los aminoácidos que comprenden un péptido o proteína .descritos en este documento también se pueden modificar ya sea por procesos naturales, tal como procesamiento postraduccional , o por técnicas de modificación química que son bien · conocidas en el campo. Las modificaciones pueden llevarse a cabo en cualquier lugar en un péptido, incluyendo la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y las terminales aminc o carboxilo. Se entiende que el mismo tipo de modificación puede estar presentes en el mismo o grados variantes en varios sitios en un péptido proporcionado.

Ejemplos de modificaciones a péptidos pueden incluir pegilación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lipido o derivado de lipido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolitico, fosforilación, fenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como argmilación, y ubiqui tinación . Véase, por ejemplo, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2.sup.nd ed., T. E. Creighton, W H. Freeman and Company, Nueva York, 1993 and old F, Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, páginas 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter y colaboradores, Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646 y Rattan y colaboradores (1992), Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging," Ann NY Acad Sci 663: 48-62.

Una secuencia sustancialmente similar es una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de una secuencia de referencia solo por una o más sustituciones conservadoras como se plantea en este documento. Esta secuencia puede, por ejemplo, se funcionalmente homologa a otras secuencias sustancialmente similar. Se apreciará por una persona de experiencia en la técnica que se pueden sustituir los aspectos de los aminoácidos individuales en un péptido de la invención.

La similitud o identidad de secuencia de aminoácidos se puede computar al, por ejemplo, usar los programas BLASTP y TBLASTN que emplean el algoritmo 2.0 BLAST (herramienta de investigación de alineación local básica). Las técnicas para computar la similitud o identidad de secuencia de aminoácidos son bien conocidas por aquellas personas expertas en el campo, y el uso del algoritmo BLAST se describe por ALTSCHUL y colaboradores 1990, J Mol. Biol . 215: 403-410 y ALTSCHUL y colaboradores (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

Las secuencias en las cuales se realiza una alineación se pueden recolectar de numerosas bases de datos. Ejemplos de bases de datos de proteínas incluyen SWISS-PROT, que también proporciona un alto nivel de anotación que se relaciona con la función de la proteína, sus estructuras de dominios, modificaciones postraduccionales , variantes (Bairoch A. and Apweiler R. (2000) Nucleic Acids Res. 28 (1) : 45-48 ; Bairoch A. and Apweiler R. (1997) J. Mol Med . 75 (5) : 312-316; Junker V. L. y colaboradores ( 1999 ) Bioinformatics 15 (12) : 1066-1007) , TrEMBL un suplemento anotado por computadora de SWISS-PROT que contiene todas las traducciones de las entradas de la secuencia de nucleótidos EMBL (Bairoch A. y Apweiler R. (2000) Nucleic Acids Res. 28 ( .1 ) : 45- 8 ) y la base de datos nr compara todas las traducciones CDS de GenBank no redundantes más las secuencias de proteínas de otras bases de datos tales como PDB, SwissProt, PIR y PRF.

Las alineaciones de las secuencias de proteínas se pueden conducir usando algoritmos existentes para buscar las bases de datos para secuencias similares a una secuencia e consulta. Un método de alineación es el algoritmo Smith-Waterman (Smith, T. F. and Waterman, M. S. 1981. Journal of Molecular Biology 147 ( 1 ): 195-19 ) , que es útil en determinar como una alineación óptima entre la secuencia de consulta y una secuencia de base de datos se pueden producir. Esta alineación se obtiene al determinar que transformaciones la secuencia de consulta ¦ necesitaría someter para igualar la secuencia de base de datos. Las transformaciones incluyen la sustitución de un carácter por otro y la inserción o supresión de una cadena de caracteres. Una puntuación es asignada para puntuaciones positivas de comparación de carácter a carácter para igualaciones exactas y algunas sustituciones, puntuaciones negativas para otras sustituciones e inserciones/supresiones. Las puntuaciones se obtienen de matrices . de puntuación estadísticamente derivadas. La combinación de transformaciones que da por resultado la puntuación más alta se usa para generar una alineación entre la secuencia de consulta y la secuencia de base de datos. El algoritmo de Needleman-Wunsch . (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. 1970. Journal of Molecular Biology 48 (3) : 443-453) es similar al algoritmo de Smith-Waterman, pero las comparaciones de secuencias son globales, no locales. Las comparaciones globales hacen una alineación de la secuencia de consulta completa contra la secuencia de base de datos completa. Mientras que las alineaciones locales siempre comienzan y terminan con una igualación, las alineaciones globales 'pueden comenzar o terminar con una inserción o supresión (indel). Para una secuencia de consulta y secuencia de base de datos proporcionados, una puntuación global será menor que o igual a una puntuación local debido a indeles en los extremos. Como una alternativa a los algoritmos anteriores, una investigación de modelos ocultos de Markov (HMM) (Eddy, S. R. 1996. Current Opinión in Structural Biology 6 ( 3 ) : 361-365 ) se podrían usar para generar alineaciones de secuencia de proteínas. La puntuación HMM pondera la probabilidad de una igualación que es seguida por inserciones/supresiones o viceversa. Además, los HMMs permiten la inserción para suprimir transiciones (y viceversa) y la puntuación de inicio y final establece controlar ya sea una investigación que se, desplaza global o localmente .

Uno o más de los algoritmos anteriores se puede usar en un programa de alineación para generar alineaciones de secuencia de proteínas. Una persona e'xperta en la técnica tiene numerosos programas de alineación para seleccionar, que incorporan una variedad de diferentes algoritmos. Un ejemplo de un programa de alineación es BLASTP (Altschul, S. F. , y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res. 25 ( 17 ) : 3389-3402 ) . Otros programas de alineación son CLUSTAL W y PILEUP. La salida estándar de una corrida BLASTP contiene suficiente información para conducir el análisis indel adicional como se describe posteriormente.

Los aminoácidos se pueden describir, por ejemplo, polares, no polares, ácidos, básicos, aromáticos o neutros. Un aminoácido polar es un aminoácido que puede interactuar con agua mediante el enlace de hidrógeno en pH biológico o casi neutro. La polaridad de un aminoácido es un indicador del grado de enlace de hidrógeno en pH biológico o casi neutro. Ejemplos de aminoácidos polares incluyen serina, prolina, treonina, cisteina, asparagina, glutamina, lisina, histidina, arginina, aspartato, tirosina y glutamato. Ejemplos de aminoácidos no polares incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isóleucina, metionina, fenilalanina, y triptófano. Los aminoácidos ácidos tienen una carga negativa neta en un pH neutro. Ejemplos de aminoácidos ácidos incluyen aspartato y glutamato. Aminoácidos básicos tienen una carga positiva neta en un pH neutro. Ejemplos de aminoácidos básicos incluyen arginina, lisina e histidina. Aminoácidos aromáticos son en general no polares, y pueden participar en interacciones hidrofóbicas . Ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen fenilalanina , tirosina y triptófano. La tirosina también puede participar en el enlace de hidrógeno a través del grupo hidroxilo en la cadena lateral aromática. Los aminoácidos alifáticos, neutros son en general no polares e hidrofóbices . Ejemplos de aminoácidos neutros incluyen 4d alanina, valina, leucina, isoleucina y metionina. Un aminoácido . se puede describir por más de una categoría descriptiva. Los aminoácidos que comparten una categoría descriptiva común pueden ser adecuados para cada uno en un péptido.

La nomenclatura usada para describir los compuestos de péptido de la presente invención sigue la práctica convencional donde el grupo amino es presentado a la izquierda y el grupo carboxi a la derecha de cada residuos de aminoácido. En las secuencias que representan modalidades específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos amino y carboxi terminal, aunque no específicamente mostrados, se entenderán que están en la forma que asumirían en los valores de pH fisiológico, a menos que se especifique de otra manera. En las fórmulas de estructura de aminoácidos, cada residuo se puede representar en general por una designación de una letra . o tres letras, que corresponde al nombre trivial del aminoácido.

El índice de' hidropatía de un aminoácido es una escala que indica la tendencia de un aminoácido para buscar un ambiente acuoso (valor negativo) o un ambiente hidrofóbico (valor positivo) (Kyte & Doolittle 1982. J Mol Biol 157:105-132). Los índices de hidropatía de les aminoácidos estándares incluyen alanina (1.8), arginina (-4.5), asparagina (-3.5), 4.9 ácido aspártico (-3.5), cisteína (2.5), glutamina (-3.5), ácido glutámico (-3.5), glicina (-0.4), histidina (-3.2), isoleucina (4.5), leucina (3.8), lisina (-3.9), metionina (1.9), fenilalanina (2.8), prolina (-1.6), serina (-0.8), treonina (-0.7), triptófano (-0.9), tirosina (-1.3), y valina (4.2). Los aminoácidos con índices de hidropatía similares pueden ser adecuados entre si en un péptido.

Los aminoácidos que comprenden los péptidos descritos en este documento se entenderá que están en la configuració L o D. En¦ péptidos o peptidomiméticos de la presente invención, los D-aminoácidos pueden ser sustituibles para L-aminoácidos .

Los aminoácidos contenidos dentro de los péptidos de la presente invención, y particularmente en la carboxi o aminoterminal , se pueden modificar mediante metilación, amidación, acetilación o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar adversamente su actividad biológica. Adicionalmente , un enlace de disulfuro puede estar presente o ausente en los péptidos de la invención.

Los aminoácidos no estándares pueden ser de origen natural, y pueden o no ser codificados genéticamente. Ejemplos de aminoácidos no estándares genéticamente codificados incluyen se.l enocistina , algunas veces incorporada en algunas proteínas en un codón UGA, que puede ser normalmente un codón de detección, o pirrolisina, algunas veces incorporadas en algunas proteínas en un codón UAG, que puede ser normalmente un codón de detección. Algunos aminoácidos no estándares que no se codifican genéticamente pueden resultar de la modificación de aminoácidos estándares ya incorporados en un péptido, o pueden ser intermediarios o precursores metabólicos, por ejemplo. Ejemplos de aminoácidos no estándares incluyen 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina , 6-N-metillisina, gamma-carboxiglutamato, desmosina, selenocisteína , ornitina, citrulina, lantionina, ácido 1-aminociclopropano-l-carboxílico, ácido gamma-aminobutírico, carnitina, sarcosina, o N-formilmetionina . Las variantes sintéticos de estándares y no estándares también son conocidos y pueden incluir aminoácidos químicamente derivatizados, aminoácidos etiquetados para la identificación o rastreo, o aminoácidos con una variedad de grupos laterales en el carbono alfa. Ejemplos de estos grupos laterales son conocidos en la técnica y pueden incluir alifáticos, aromáticos individuales, aromáticos policíclicos , heterocíclicos , heteronuclea res , a ino, alquilamino, carboxilo, carboxamida, éster de carboxilo, guanidina, amidina, hidroxilo, alcoxi, inercapto- , alquilmercapto-, u otras cadenas latearles que contienen heterátomos. Otros aminoácidos sintéticos pueden incluir alfa-iminoácidos , aminoácidos no alfa tales como beta-aminoácidos, des-carboxi o des-aminoácidos. Variantes sintéticas de aminoácidos se pueden sintetizar usando métodos generales conocidos en la técnica, o se pueden adquirir de proveedores comerciales, por ejemplo RSP Aminoácidos LLC (Shirley, Mass.).

A fin de . ejemplificar adiciona Imente lo que se propone por una sustitución de aminoácidos conservadora, los grupos A-F se listan a continuación. El reemplazo de un miembro de los siguientes · grupos por otro miembro del mismo grupo es considerado que es una sustitución conservadora.

El grupo A incluye isoleucina, valina, metionina, fenilalanina , serina, cisteina, treonina, y aminoácido modificados que tienen las siguientes cadenas laterales: etilo, iso-butilo, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -CH2CHOHCH3 y CH2SCH3.

El grupo B incluye glicina, alanina, valina, serina, cisteina, treonina, y un aminoácido modificado que tiene una cadena lateral de etilo.

El grupo C incluye fenilalanina, fenilglicina, tirosina, triptófano, ciclohexilmetilo, y residuos de amino modificados que tienen cadenas laterales de bencilo o fenilo sustituidas .

El grupo D incluye ácido glutámico, ácido aspártico, un alifático sustituido o insustituido, éster aromático o bencílico de ácido glutámico o aspártico (por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, ciclohexilo, bencilo, o bencilo sustituido), glutamina, asparagina, glutamina o asparagina alquilada con CO— H (por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo y iso-propilo) , y aminoácidos modificados que tienen la cadena lateral — (CH2)3COOH, un éster de la misma (éster alifático, aromático y bencílicos sustituido o insustituido) , una amida del mismo, y una amida N-alquiladas sustituida o insustituida del mismo.

El grupo E incluye histidina, lisina, arginina, N-nitroarginina , p-cicloarginina , g-hidroxiarginina, N-amidinocitrulina, ácido 2-amino-guanidinobutanoico, homólogos de lisina, homólgos de arginina, y ornitina.

El grupo F incluye serina, treonina, cisteína, y aminoácidos modificados que tienen cadenas laterales de alquilo rectas o ramificadas de C1-C5 sustituidas con -OH o -SH.

Los grupos A-F son ejemplares y no se proponen para limitar la invención.

Un péptido mimético es un compuesto que comprende elementos estructurales no peptídicos que imitan la acción biológica de un péptido precursor. Un péptido mimético puede no tener características de péptido clásicas tal como un enlace peptídico enzimáticamente escindible. Un péptido precursor puede ser inicialmente identificado como una secuencia de enlace o sitio de fosforilación sobre una proteina. de interés, o puede ser un péptido de origen natural, por ejemplo una hormona de péptido. Ensayos para identificar peptidomiméticos pueden incluir un péptido precursor como un control positivo para propósitos de comparación, al clasificar una biblioteca, tal como una biblioteca peptidomimética . Una biblioteca peptidomimética es una biblioteca de compuestos que puede tener actividad biológica similar a aquella dé un péptido precursor.

Como se usa en este documento, el término "polinucleótido" incluye ARN, cADN, ADN genómico, formas sintéticas, y polímeros mezclados, hebras tanto de sentido como de antisentido, y se pueden modificar química y bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivadas, como será apreciado fácilmente por aquellas personas expertas en la técnica. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural o un análogo modificaciones de internucleótidos tales como enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos , carbamatos, etcétera), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos, etcétera), porciones pendientes (por ejemplo, polipéptidos ) , y enlaces modificados (por ejemplo, polinucleótidos anoméricos alfa, etcétera). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan los polinucleótidos en su capacidad de enlazarse a una secuencia designada a través de un enlace de hidrógeno y otras interacciones químicas. "Ácidos nucleicos de péptidos" (PNA, por sus siglas en inglés) como 'se usa en este documento se refieren a ácidos nucleicos modificados en los cuales el esqueleto de azúcar-fosfato de un ácido nucleico se ha convertido a un esqueleto de N-(2- aminoetil ) -glicina . Aunque los esqueletos de azúcar-fosfato de ADN/ARN se someten a una carga negativa bajo condiciones neutras que dan por resultado la repulsión electrostática entre las cadenas de complementariedad, la estructura de cadena principal de PNA no tiene inherentemente una carga. Por lo tanto, .no existe repulsión electrostática. En consecuencia, el PNA tiene una mayor capacidad de formar hebras dobles como es' comparado con los ácidos nucleicos convencionales, y tiene una alta capacidad de reconocer secuencias base. Adicionalmente , los PNAs son en general más robustos que los ácidos nucleicos. Los PNAs también se pueden usar en ensayos y en otras reacciones de hibridación u otras reacciones como se describe en lo anterior y en este documento para los oligonucleótidos.

Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a un compuesto de polinucleótido usado para introducir un polinucleótido. exógeno o endógeno en células hospederas. Un vector comprende una secuencia de nucleótidos, que puede codificar una o más moléculas de polipéptido. Los plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos, en un. estado natural o que se han sometido a ingeniería recombinante , no son ejemplos limitantes de vectores comúnmente usados para proporcionar vectores recombinantes que comprenden por lo menos una molécula de poli ido aislada deseada.

Como se usa en este documento, un "supresor de tumor" es un gen o producto de gen que tiene una función biológica normal de restringir el crecimiento no regulado de una célula. Si la función de un supresor de tumor es la pérdida, surge el crecimiento celular no regulados. La contraparte funcional a un supresor de tumor es un oncogen-genes que promueven el crecimiento celular normal pueden ser conocidos como "protooncogenes" . Una mutación que activa este gen o producto de gen lo- convierte a demás a un "oncogen", que continúa la actividad de crecimiento celular, pero de una manera desregulada. Ejemplos de genes supresores de tumor y productos de genes son bien conocidos en la literatura y pueden incluir PTC, B CA'i , BRCA2 , ??ß, APC, RP>, WT1, EXT1, p53, NF1 , TSC2 , NF2, VHL o SPARC.

La invención proporciona además constructos de ácido nucleico que comprenden elementos de control y una molécula de ácido nucleico descrita en este documento enlazada operativamente a los elementos de control (por ejemplo, un promotor adecuado) para la expresión de un polipéptido o un polipéptido descrito en este documento. La expresión de proteínas es dependiente en el nivel de transcripción de ARN, el cual a su vez es regulado por las señales de ADN. De manera similar, la traducción de mARN, en el último momento, un codón de iniciación AUG, el cual se localiza usualmente dentro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos del extremo 5' del mensaje. Las secuencias que flanquean el codón iniciador AUG se ha mostrado que afectan su reconocimiento por ribosomas eucarióticos, con conformidad a una secuencia consenso Kozak perfecta dando por resultado una traducción óptima (véase, por ejemplo, Kozak, J. Mplec. Bi'ol. 196: 947-950 (1987)). También, la expresión exitosa de un ácido nucleico exógeno en una célula puede requerir modificación postraduccional de una proteína resultante. Por consiguiente, la invención proporciona plásmidos que codifican polipéptidos en donde el vector es, por ejemplo, pCADN3.1 o un derivado del mismo.

Las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento comprenden de manera preferente una región de codificación enlazada operativamente a un promotor adecuado, el promotor que es de manera preferente funcional en células eucarióticas . Los promotores virales tales como, sin limitación, el promotor RSV y el promotor tardía principal de adenovirus se puede usar en la invención. Promotores no virales adecuados incluyen, pero no se limitan a, el promotor de fosfoglicerocinasa (PGK) y el promotor l.alfa de factor de alargamiento. Los promotores no virales son deseablemente promotores humanos. Los elementos genéticos adecuados adicionales muchos de los cuales son conocidos en la técnica, también se pueden ligar a, unir a, o insertar en el ácido nucleico inventivo y los constructos para proporcionar funciones adicionales,' nivel de expresión, o patrón de expresión. Los promotores nativos para la expresión de los genes de la familia SPARC también se pueden usar, en el evento en que no se usan de manera preferente en el cromosoma que los codifican naturalmente a menos que se modifiquen por un proceso que cambia sustanciaimente ese cromosoma. Estos cromosomas sustanciaimente cambiados pueden incluir cromosomas transferidos y alterados por un vector retroviral o proceso similar. Alternativamente, estos cromosomas sustanciaimente cambiados pueden comprender un cromosoma artificial tal corno un HAC, YAC, o BAC.

Además, las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento se pueden enlazar eficientemente a potenciadores para facilitar ' la transcripción. Los potenciadores, son elementos de acción cis de ADN que estimulan la transcripción de genes adyacentes. Ejemplos de potenciadores que confieren un alto nivel de transcripción o genes enlazados en una variedad de diferentes tipos de células de muchas especies incluyen, sin limitación, los potenciadores de SV40 y el RSV-LTR. Estos potenciadores se pueden combinar con otro potenciadores que tienen efectos específicos tipo célula, .o cualquier potenciador se puede usar solo.

Para optimizar la producción de polipéptidos la molécula de ácido nucleico inventiva puede comprender además un' sitio de pol iadenilación después de la región de codificación de la molécula de ácido nucleico. También, de manera preferente todas las señales de transcripción apropiadas (y señales de traducción, donde sea apropiado) se arreglarán correctamente tal que el ácido nucleico exógeno se expresará apropiadamente en las · células en las cuales se introduce. Si se desea, el ácido nucleico exógeno también puede incorporar sitios de empalme (es decir, aceptor de empalme y sitios donadores de empalme) para facilitar la producción de MARN mientras que mantiene un transcripto de longitud completa, dentro del marco. Por otra parte, las moléculas1 de ácido nucleico inventivas pueden comprender además las secuencias apropiadas para procesamiento, secreción, localización intracelular y similares.

Las moléculas de ácido nucleico se pueden insertar en cualquier vector adecuado. Los vectores adecuados incluyen, sin limitación, vectores virales. Los vectores virales adecuados incluyen, sin limitación, vectores retrovirales, alfavirales, vacunales, adenovirales , virales adenoasociados , virales de herpes y vectores virales de viruela aviar. Los vectores tienen de manera preferente una capacidad nativa o diseñada para transformar células eucarióticas, por ejemplo, células CHO-K1. Adicionalmente , los vectores útiles en el contexto de la invención pueden ser vectores de ácido nucleico "desnudos" (es decir, vectores que tienen poco o nada de proteínas, azúcares y/o lípidos que los encapsulan) tales como plásmidos o episomas, o los vectores se pueden formar en complejo con otras moléculas. Otras moléculas que se pueden combinar adecuadamente con los ácidos nucleicos inventivos incluyen sin limitación cubiertas virales, lípidos catiónicos, iiposomas, poliaminas, partículas de oro, y porciones objetivo tales como ligandos, receptores, o anticuerpos que fijan como objetivo moléculas celulares .

Los polipéptidos SPARC de acuerdo con la invención se pueden expresar y purificar de una célula hospedera recombinante . Células hospederas recombinantes pueden ser procarióticas o eucarióticas , incluyendo pero no limitado a bacterias tales como E. coli, células fúngicas tales como levadura, células de insectos incluyendo pero, no limitado a, lineas de células derivadas de drosophila y gusano de cera y células y lineas de células de mamífero. Al expresar los polipéptidos SPARC de acuerdo con la invención en una célula, por ejemplo, una célula humana, ya sea, in vitro o in vivo, los codones seleccionados de este polinucleótido que codifica el Q3 SPARC se puede optimizar para un tipo de célula proporcionado (es decir, especies). Muchas técnicas para la optimización de codones son conocidas en el campo (véase, por ejemplo, Jayaraj y colaboradores, Nucleic Acids Res. 33(9):3011-6 (2005); Fuglsang y colaboradores, Protein Expr . Purif. 31(2):247-9 (2003);r . Wu y colaboradores, "The Synthetic Gene Designer: a Flexible Web Platform to Explore Sequence Space of Synthetic Genes for Heterologous Expression", csbw, 2005 IEEE Computational Systems Bioinformatics Conference-Workshops (CSBW'05), pp . 258-259 (2005)).

En ciertas modalidades, al expresar y purificar un polipéptido SPARC, se pueden emplear técnicas para mejorar la solubilidad de la proteína para prevenir la formación de cuerpos de inclusión (que son fracciones insolubles), y po-r lo tanto se obtienen grandes cantidades del polipéptido. El SPARC acumulado en los cuerpos de inclusión es frecuentemente un SPARC de tipo inactivo que no retiene sus actividades fisiológicas.

La solubilidad de un polipéptido SPARC purificado se puede mejorar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la solubilidad también se puede mejorar al expresar un fragmento funcional, pero no el polipéptido de longitud completa. Además, para incrementar la solubilidad de una proteina expresada (por ¦ ejemplo, en E. coli), se puede reducir la velocidad de la síntesis de proteína al disminuir la temperatura de crecimiento, usando un promotor más débil, usando un plásmido de número de copias inferior, disminuir la concentración inductora, cambiar el medio de crecimiento como se describe por Georgiou & Valax (Current Opinión Biotechnol. 7:190-197 (1996)). Esto disminuye la velocidad de la síntesis de proteínas y usualmente se obtienen una roteina más soluble. También se pueden agregar grupos prostéticos o cofactores que son esenciales para el plegamiento apropiado o para la estabilidad de la proteina, o agregar una solución amortiguadora para controlar la fluctuación de pH en el medio durante el crecimiento, o agregar 1% de glucosa para reprimir la inducción del promotor lac por la lactosa, que está presente en medios más ricos (tales como LB, 2xYT) . Los polioles (por ejemplo, sorbitol) y sacarosa también se pueden agregar al medio debido a que el incremento en la presión osmótica causada por estas adiciones conduce a la acumulación de osmoprotectores en la célula, que estabilizan la estructura de la proteína nativa. El etanol, tioles de peso molecular bajo y disulfuros, y NaCl se pueden agregar. Además, los chaperones y/o foldasas se pueden co-expresar con el polipéptido deseado. Los chaperones moleculares promueven a isomerización apropiada y el objetivo celular al interactuar transcientemente con los intermediarios de plegamiento. Los sistemas de chaperones de E. coli incluyen, pero no se limitan a: GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE, CIpB.

Las foldasas aceleran las etapas limitantes de velocidad a lo largo de la ruta de plegamiento. Tres tipos de foldasas desempeñan una función importante: peptidil-prolil cis/trans-isomerasas (PPFs), disulfuro oxidoreductasa (DsbA) y disulfuro isomerasa (DsbC),' disulfuro proteínico isomerasa (PDI) que es una próteína eucariótica que cataliza tanto la oxidación de cisteína de proteína como la isomerización de enlace de disulfuro. La co-expresión de una o más de estas proteínas con la proteína objetivo podría conducir a mayores niveles de proteína objetive soluble.

Un polipéptido SPARC se puede producir como una proteina de fusión a fin de . mejorar su solubilidad y producción. La proteina de fusión comprende un polipéptido SPARC y un segundo polipéptido fusionado conjuntamente dentro del marco. El segundo polipéptido puede ser un socio de fusión conocido en la técnica para mejorar la solubilidad del polipéptido al cual se fusiona, por ejemplo, NusA, bacterioferritina (BFR) , GrpE, tioredoxina (TRX) y glutationa-S-transferasa (GST) . Novagen Inc. (Madison, Wis.) proporciona la serie de vecror pET 43.1 que permite la formación de una fusión objetivo de NusA. El DsbA y DsbC también muestran efectos positivos en los niveles de expresión cuando se usan como un socio de fusión, por lo tanto puede ser usado para fusionarse con un polipéptido SPARC para lograr mayor solubilidad.

En una moda]idad, el polipéptido SPARC se produce como un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido mutante de supresión Q3 SPARC y una tioredoxina, asociada de fusión, como se describe en la Patente de E.U.A. No. 6,387,664, incorporada por este documento a manera de referencia en su totalidad. La fusión de tioredoxina-SPARC se puede producir en E. coli como una proteina soluble, fácil de formular en una gran cantidad sin perder las actividades fisiológicas. Aunque la patente de Patente de E.U.A. No. 6,387,664 proporciona una proteina SPARC de fusión con SPARC fusionado a la C-terminal de la tioredoxina, se entiende, para el propósito de la presente invención, un polipéptido SPARC se puede fusionar ya sea a la N-terminal o la C-terminal de un segundo polipéptido, siempre y cuando se retenga su función de sensibilización.

Los polipéptidos de la invención también se pueden sintetizar in vitro, por ejemplo, usando cualquier sistema de traducción in vitro adecuado, por ejemplo, TNTMR Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega, Madison, WI), Usados de reticulocitos de conejo, extractos de germen de trigo y similares. Alternativamente, los polipéptidos hechos de acuerdo con la invención se pueden sintetizar químicamente mediante cualquiera de los protocolos de fase sólida o fase líquida adecuados incluyendo, por ejemplo, procedimientos de síntesis de péptidos litográficos , de fase sólida Fmoc y de fase sólida t-Boc.

Por aislado o purificado se propone que constituye por lo menos 75%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% del polipéptido o polinucleótido presente. Los polinucleótidos de acuerdo con la invención se pueden purificar mediante cualquier medio adecuado. Los polipéptidos de la invención se pueden purificar mediante cualquier método adecuado conocido por aquellas personas de experiencia ordinaria, incluyendo, por ejemplo, los métodos dados a conocer en Sage: Purification of SPARC/osteonectin, Curr. Protoccls Cell Biol. 2003 Feb; Capitulo 10: Unidad 10.11, la cual se incorpora por este documento a manera de referencia en su totalidad. Alternativamente, la cromatografía o precipitación por afinidad que usa cualquier método adecuado, etiquetas de epítopo que incluyen, por ejemplo, myc, gfp, V5, FITC, HA, S-tag, T7, y similares u otros sistemas de afinidad adecuados se pueden usar, incluyendo, por ejemplo, biotina/avidina, polihistidina/Míquel , GST y similares.

Una medida de "correspondencia" de ácidos nucleicos, péptidos o proteínas para el uso en este documento con referencia a los ácidos nucleicos descritos anteriormente y las proteínas es "identidad" relativa entre las secuencias. En el caso de péptidos o proteínas, o en el caso de ácidos nucleicos definidos de acuerdo con una correspondencia de péptido o proteína codificados incluye un péptido que tiene por lo menos aproximadamente 50% de identidad, alternativamente por lo menos aproximadamente 70% de identidad, alternativamente por lo menos aproximadamente 90% de identidad, o aún aproximadamente 95% y también pueden ser por lo menos aproximadamente 98-99% de identidad a un péptido o proteína especificado. Las medidas preferidas de identidad como entre los ácidos nucleicos es la misma como la especificada anteriormente, para péptidos con por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 98-99% de identidad que es más preferida.

El término "identidad" como se usa en este documento se refiere a la medida de la identidad de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácidos nucleicos. La identidad se puede determinar .al comparar una posición en cada secuencia que puede ser una linea para propósitos de comparación. Dos secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se consideran sustancialmente idénticas si comparten por lo menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia, de manera preferente por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia y de manera aún más preferente por lo menos 95% de identidad de secuencia y de manera mucho más preferente por lo menos aproximadamente 98-99% de identidad.

La identidad de secuencias se puede determinar por el algoritmo BLAST que actualmente está en uso y que se describió originalmente por Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El algoritmo BLAST se puede usar con ajustes por omisión publicados. Cuando una posición en la secuencia comparada es ocupada por la misma base o aminoácido, las moléculas son consideradas que tienen identidad compartida en esa posición. El grado de identidad entre secuencias es una función de número de posiciones de igualación compartidas per las secuencias.

Una medida alterna de identidad de las secuencias de ácidos nucleicos es determinar si dos secuencias se hibridan entre si bajo rigor bajo, y de manera preferente condiciones de rigor alto. Estas secuencias son sustancialmente idénticas cuando se hibridarán bajo condiciones de rigor- alto. La hibridación para las secuencias enlazadas con filtro bajo condiciones de bajo rigor pueden, por ejemplo, ser realizada en NaHP04 0.5 M, dodecil-sulfato de sodio al 7% (SDS), EDTA' 1 mM a 65°C, y lavado en 0.2 veces en SSC/0.1 de SDS a 42°C (véase Ausubel y colaboradores (eds.) 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & sons, Inc., Nueva York, en la página 2.10.3). Alternativamente, la hibridación a las secuencias enlazadas a filtro bajo condiciones de alto rigor, pueden por ejemplo ser realizadas en NaHP04 0.5 M, 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0.2 veces en SSC/0.i% de SDS a 68 °C (véase Ausubel y colaboradores (eds.) 1989, supra) . Las condiciones de hibridación se pueden modificar de acuerdo con los métodos conocidos dependiendo de la secuencia de interés (véase Tijssen, 1993, Laborator.y Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capitulo 2 "Overview of Principies i Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Probé Assays", Elsevier, N.Y.). En general, las condiciones rigorosas se seleccionan para ser de aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmico para la secuencia especifica en una resistencia iónica definida y pH.

Se apreciará por una persona de experiencia en la técnica que las designaciones numéricas de las posiciones de mutaciones dentro de una secuencia son relativas a la secuencia especifica. También las mismas posiciones pueden ser designaciones numéricas diferentes designadas dependiendo de la forma en la cual la secuencia se numera y la secuencia seleccionada. Adicionalmente, las variaciones de secuencia tales como inserciones o supresiones, pueden cambiar la posición relativa y subsecuentemente las designaciones numéricas de nucleótidos . particulares en y alrededor de un sitio mutacional.

La terapia génica es una intervención médica que implica modificar el material genético de células- vivientes para pelear contra la enfermedad. La terapia génica está siendo estudiada en ensayos clínicos (estudios de investigación con humanos) para muchos tipos diferentes de cáncer y para otras e fermedades. Por consiguiente, la invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un poiipéptido SPARC adecuado para el uso en "terapia génica" (véase, por ejemplo, Patil y colaboradores, AAPS J. 7(l):E61-77 (2005)).

En general, un gen se suministra a la célula usando un "vector" tal co o aquellos dados a conocer en este documento. Los tipos más comunes de vectores usados en la terapia génica son virus. Los virus usados como vectores en la terapia génica se desactivan genéticamente; son capaces de reproducirse. La mayoría de ensayos clínicos de terapia génica depende de retrovirus de ratón para suministrar el gen deseado. Otros virus usados como vectores incluyen adenovirus, virus adenoasociados , poxvirus, y virus del herpes. Los vectores de terapia .génica virales adecuados y modos de su administración . in vivo y ex vivo son conocidos en la técnica.

La terapia génica se puede realizar tanto ex vivo como in vivo. Típicamente, en los ensayos clínicos de terapia génica ex vivo, las células de la sangre o médula ósea del paciente se remueven y se desarrollan en el laboratorio. Las células se exponen el virus que está llevando el gen deseado. El virus entra a las células, y el gen deseado se vuelve parte del ADN de las células. Las células se desarrollan en el laboratorio y luego se regresan al paciente mediante inyección en una vena, usando la terapia génica in vivo, los vectores tales, como por ejemplo, virus o liposomas se pueden usar para suministrar el gen deseado a las células dentro del cuerpo del paciente..

Aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que, debido a' la universalidad del código genético, el conocimiento de cualquier secuencia de aminoácidos proporcionada permite que aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica ideen fácilmente un número infinito de secuencias de polinucleótidos especificas que puedan codificar -un polipéptido de la secuencia de aminoácidos. Además, el artífice ordinariamente experto puede determinar fácilmente la secuencia de polinucleótidos óptima para codificar un polipéptido de la secuencia de aminoácidos para la expresión en cualquier especie proporcionada a través del proceso de "optimización de codón", que es bien conocida en el campo (véase, por ejemplo, Villalobos y colaboradores: Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments. BMC Bioinformatics . 2006 Jim. 6;7 :285) .

Como se usa -en este documento, un "portador" se refiere á cualquier sustancia adecuada como un vehículo para suministrar un Ingrediente Farmacéutico Activo (API) a un sitio in vitro o in- vivo adecuado de acción. Como tai, los portadores pueden actuar como un excipiente para la formulación de un reactivo terapéutico o experimental que contiene un API. Portadores preferidos son capaces de mantener un API en una forma que es capaz de in.teractuar con una célula T. Ejemplos de estos portadores incluyen, pero no se limitan a agua, solución salina amortiguada con fosfato, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank y otras soluciones fisiológicamente balanceadas acuosas o medio de cultivo celular. Los portadores acuosos también PUEDEN contener sustancias auxiliares adecuadas requeridas para aproximarse a las condiciones fisiológicas del recipiente, por ejemplo, aumentó de la estabilidad química e isotonicidad . Las sustancias auxiliares adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, lactato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitan, oleato e trietanolamina, y otras sustancias usadas para producir una solución amortiguadora de fosfato, solución amortiguadora de Tris y solución amortiguadora de bicarbonato.

Como se usa en este documento "vacuna anti-cáncer" significa una composición que comprende un antígeno o epítopo asociado con tumor contra los cuales se puede montar una respuesta inmunitaria.

En otra modalidad, la. invención proporciona una vacuna anti-cáncer que comprende un antígeno de péptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1; o un antígeno de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o varios aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y también que tiene actividad inmunoes.timulante . En otro aspecto, la presente invención proporciona un antigeno de péptido que comprende una porción del péptido mencionado en lo anterior de SEQ ID NO 1 y que tiene actividad inmunoestimulante . En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un antígeno de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno o varios aminoácidos con respecto a la porción mencionada en lo . anterior . del antígeno de péptido de SEQ ID NO 1, y también tiene actividad inmunitaria estimulante. Los antígenos de péptido descritos en lo anterior pueden activar de manera preferente linfocitos T citotóxicos que reconocen una proteína de antígeno de cáncer.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos o una población de inmunocitos que comprenden estas células, que son inducidas por la estimulación in vitro usando los antígenos de péptido mencionados en lo anterior, o una mezcla de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos , o una población de inmunocitos que comprenden estas células, que se introducen mediante estimulación in vitro usando los antigenos de péptido mencionados en lo anterior, o una mezcla de los mismos, y un activador inmunitario. El activador inmunitario es de manera preferente un factor de crecimiento celular o citocina.

La vacuna puede comprender de manera preferente además un adyuvante, ta.l como un adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, alumbre, Bacillus Calmette-Guerin , agonistas y modificadores de moléculas de adhesión, toxoide de tétanos, imiquinod, montanida, PL, y QS21.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para suprimir un tumor, que comprende introducir las células T auxiliares descritas en lo anterior, linfocitos T citotóxicos, o una población de inmunocitos que comprenden estas células en un cuerpo. El método descrito en lo anterior se usa de manera preferente para prevenir y/o tratar cánceres .

En otro aspecto, la presente invención proporciona una solución de cultivo celular usada para producir las células T auxiliares o linfocitos T citotóxicos de la presente invención o una población de inmunocitos que comprenden estas células ' que comprende los antígenos de péptido mencionado en lo anterior, o una mezcla de los mismos .

En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit de cultivo celular para producir las células T auxiliares o li.nfocitos T citotóxicos de la presente invención o una población de inmunocitos que comprenden estas células, que comprende la solución de cultivo celular descrita en lo anterior y un recipiente de cultivo celular.

En otro aspecto, la presente invención proporciona ADN que codifica los antigenos de péptido mencionados en lo anterior. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna de cáncer, que comprende el ADN mencionado en lo anterior de la presente invención, o un virus recombinante o bacterias recombinantes que comprenden el ADN descrito en lo anterior. La vacuna de cáncer descrita en lo anterior comprende de manera preferente además un adyuvante.

La vacuna puede comprender más de un péptido, y los múltiples péptidos pueden depender del tumor que se trata. La vacuna puede comprender además una célula que presenta antígeno, tal como una célula dendrítica, y más particularmente una célula dendrítica pulsada o cargada con el péptido y usada como una vacuna celular para estimular la inmunidad de -células T contra el péptido y por consiguiente contra el tumor.

La administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se. puede lograr a través de cualquier vía adecuada incluyendo, pero no limitada a, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , intratumoral , oral, 'rectal, vaginal, intravesical , y administración por inhalación, con administración intravenosa e intratumoral que es más preferida. La composición puede comprender además ' cualquier otro componente adecuado, especialmente para aumentar la estabilidad de la composición y/o su uso final. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de la composición de la invención. Las siguientes formulaciones y métodos son simplemente ejemplares y no son de ninguna manera limitantes.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir, si se desea, agentes terapéuticos o biológicamente activos adicionales. Por ejemplo, pueden estar presentes factores terapéuticos útiles en el tratamiento de una indicación particular. Los factores que controlan la inflamación, tal como ibuprofeno o esferoides, pueden ser parte de la composición para reducir el ¡linchamiento e inflamación asociados con la administración in vivo de la composición farmacéutica y aflicción fisiológica.

El portador será típicamente líquido pero también puede ser sólido, o una combinación de componentes líquidos y sólidos. El portador es deseablemente un portador fisiológicamente aceptable (por ejemplo, farmacéutica o farmacológicamente aceptable) (por ejemplo, excipiente o diluyente) . Portadores fisiológicamente .aceptables son bien conocidos y fácilmente disponibles. La selección del portador se determinará, por lo menos en parte, por la ubicación del tejido y/o células objetivo, y el método particular usado para administrar la composición.

Típicamente, estas composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; forma sólidas adecuadas para usar para preparar soluciones o suspensiones en la adición de un líquido antes de la inyección también se pueden preparar; y las preparaciones también se pueden emulsionar. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que contienen estabilizantes de proteínas conocidos y lioprotectores, formulaciones que incluyen aceite de ajonjolí, aceite de cacahuate o propilenglicol acuoso, y polvos estériles para la · preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos la formulación debe ser estéril y debe ser fluida al grado de que exista fácil capacidad de inyección. Debe ser estable bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento y se debe conservar contra la acción · contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un surfactante, tal como hidroxicelulosa . Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento u uso, estas preparaciones contienen un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Los péptidos de la presente invención, se pueden formular en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácidas (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y los cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o como ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y estas bases orgánicas como isopropilamina, t imetilamina , histidina, procaína y similares .

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, soluciones amortiguadoras, bacteriostatos, y solutos que vuelven la formulación isotónica con la sangre del recipiente propuesto, y suspensiones estériles acuosas- y no acuosas que pueden . incluir agentes de suspensión, solubili zantes , agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. Las formulaciones se pueden presentar en contenedores sellados de dosis unitaria o múltiples dosis, tales como ampolletas y frasquitos, y se pueden almacenar en una condición deshidratada por congelación (liofilizada) que requiere solamente la adición de un excipiente liquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones de inyecciones extemporáneas se pueden preparar de polvos estériles, gránulos, y tabletas de la- clase previamente descrita. En una modalidad preferida de la invención, el conjugado que contiene el dominio de ligando de péptido se formula para inyección (por ejemplo, administración parenteral). En ese sentido, la formulación es deseablemente adecuada para la administración intrarumoral , pero también se puede formular para inyección intravenosa, inyección peritoneal, inyección subcutánea y similares.

^ La invención también proporciona, si es deseable, modalidades en las cuales los péptidos de la presente invención se conjugan adicionalmente a polietilenglicol (PEG) . La conjugación de PEG puede incrementar la vida media circulante de estos polipéptidos, reducen la inmunogenicidad y ant igenicidad del polipéptido, y mejoran su bioactividad . Si se usa, cualquier método adecuado de conjugación PEG se puede usar, incluyendo pero no limitado a, metoxi-PEG de reacción con un grupo (s) mino disponible de péptido u otros sitios reactivos tales como, por ejemplo, histidinas o cisteinas. Además, se pueden usar procedimientos de ADN recombinante para agregar aminoácidos con grupos PEG-reactivos al conjugado -que contiene el dominio de ligando de péptido. Además, las estrategias de PEG-ilación liberables e híbridas se pueden usar de acuerdo con los aspectos de la presente invención, tal como la PEG-ilación del polipéptido, en donde las moléculas de PEG agregadas aciertos sitios en la molécula conjugada que contiene el dominio de ligando de péptido se liberan in ' vivo. Ejemplos de métodos de conjugación PEG son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Greenwald y colaboradores, Adv . Drug Dehigadoy Rev. 55:217-250 (2003).

Las formulaciones adecuadas para la administración a través de inhalación incluyen formulaciones de aerosol. Las formulaciones de aerosol se pueden colocar en propelent.es aceptables presurizados , tal como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares. También se pueden formular como preparaciones no presurizadas, para el suministro de un nebulizador o un atomizador.

Las formulaciones adecuadas para la administración anal se pueden preparar como supositorios al mezclar el ingrediente activo con una variedad de bases tales como bases emulsificantes o bases solubles en agua. Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas, o fórmulas de rocío, que contienen, además del ingrediente activo, tales como portadores como son conocidos en la técnica que es apropiada.

Además, la composición de la invención puede comprender agentes terapéuticos o biológicamente activos adicionales. Por ejemplo, pueden estar presentes factores terapéuticos útiles en el tratamiento de una indicación particular. Los factores que controlan la inflamación, tal como ibuprofeno o esferoides pueden ser parte de la composición para reducir el hinchamiento e inflamación asociados con la administración in vivo de la composición farmacéutica y la aflicción fisiológica.

En el caso de la terapia por inhalación, la composición farmacéutica de la presente invención está deseablemente en la forma de 'un aerosol. Son disponibles generadores de aerosol y rocío para administrar el agente si está en forma sólida. Estos generadores proporcionan partículas que son respirables o inhalables, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de un medicamento en una tasa adecuada para la administración humana. Ejemplos de estos generadores de aerosol y rocío incluyen inhaladores de dosis medida e insufladores conocidos en la técnica. Sí está en forma líquida, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en aerosol mediante cualquier dispositivo adecuado.

Cuando se usan en relación con la administración intravenosa, intraperitoneal o intratumoral, la composición farmacéutica de la invención puede comprender soluciones de inyección acuosas y no acuosas estériles, suspensiones o emulsiones del componente activo, las preparaciones que son de manera preferente isotónicas con la sangre del recipiente propuesto. Estas preparaciones pueden contener uno o más de antioxidantes, soluciones amortiguadoras, surfactantes , co-solventes, bacterioestatos , solutos que vuelven las composiciones isotónicas cón la sangre del recipiente propuesto, y otros componentes de formulación conocidos en la técnica. Las suspensiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las composiciones pueden estar presentes en contenedores de dosis unitarias o múltiples dosis, por ejemplo, ampolletas y frasquitos sellados.

Los métodos de la presente invención también pueden ser parte de la terapia de combinación. La frase "terapia de combinación" se refiere al administrar un agente terapéutico de acuerdo con la invención junto con otra composición terapéutica en una forma secuencial o concurrente tal que los efectos benéficos¦ de .esta combinación se realizan en el mamífero que se somete a la terapia. Dosificaciones óptimas para cualquiera de las composiciones de la invención se pueden determinar mediante métodos de rutina conocidos por aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica.

EJEMPLO 1 Este ejemplo muestra la interacción de SPARC y AbraxaneMR con el agente antiangiogénico SutentMR en un modelo PC3. El volumen de tumor se midió en ratones que se tratan con AbraxaneMR solo (15 mg/kg administrarlo diariamente durante cinco días) , el Abraxaneí-íR y el SutentMR (el Sutent administrado en 30 mg/kg diariamente durante 8 semanas) , Abraxane y SPARC excgenc (el SPARC a 0.2 mg/ms administrado dos veces a la semana durante ocho semanas), y finalmente, AbraxaneMR, SutentMR y SPARC juntos.

La FIGURA 1 representa una gráfica que representa el volumen del tumor (mm3) contra el tiempo (días) para estar condiciones de prueba. Como es evidente a partir de la gráfica, la administración de AbraxaneMR da por resultado un volumen de tumor notablemente inferior, relativo al control, durante el curso del experimento. Cuando se administra AbraxaneMR con SPARC el volumen de tumor es ligeramente mayor indicando (como se mostró en el ejemplo 1) que el SPARC exógenamente administrado · desensibiliza el AbraxaneMR en este sistema. Cuando el agente antiangiogénico SutentMR se administra junto con el' SPARC y AbraxaneMR, la eficacia de la combinación de SPARC/AbraxaneMR es notablemente mejorada.

La FIGURA 1 también muestra que la administración de AbraxaneMR con el agente antiangiogénico SutentMR produce una disminución mucho mayor en el volumen del tumor que la administración de AbraxaneMR solo. Sorprendentemente, la administración del SPARC exógenc junto con el AbraxaneMR y SutentMR niega algo del efecto sinérgico del AbraxaneMR y SutentMR. Esto siguiere que el SPARC antagoniza la actividad anti-angiogénica del SutentMR.

Estos datos siguieren que el mecanismo por el cual el SPARC desensibiliza estos agentes anti-tumor particulares es a través de la actividad angiogénica.

' EJEMPLO 2 Este ejemplo muestra la caracterización del comportamiento angiogénico del SPARC.

El SPARC humano recombinante y variantes genéticamente diseñadas se expresaron y purificaron usando células HEK 293 mantenidas en bioreactores de fibra hueca. La actividad angiogénica del rhSPARC y sus variantes se evaluó usando un ensayo de formación del tubo HUVEC y un ensayo de cuentas de germinación HUVEC.

En el ensayo de formación del tubo HUVEC, el rhSPARC fue pro-angiogénico a 10 pg/mL y anti-angiogénico a 100 yg/mL. Los resultados · del ensayo de formación del tubo se pueden observar en la FIGURA 2. En el ensayo de formación de germinación, la adición de rhSPARC dio por resultado más vasos sanguíneos maduros bien soportados por' pericitos, sugiriendo una función para el SPARC más allá de la estimulación inicial.de la angiogénesis per se. Las variantes de rhSPARC adicionales con supresiones y sustituciones de aminoácidos individuales/dobles sometidos a prueba en estos ensayos incluyeron: supresión Q3 (BI02), una inversión del domino . angiogénico putativo (BI05), una sustitución K>Q doble en el dominio angiogénico propuesto (BI011), la abrasión genética de los sitios de reconocimiento de catepsina K putativa (BI08) , y un producto de degradación proteolitico del rhSPARC. El análisis final de aminoácidos terminales indicaron que la actividad angiogénica se localiza a SEQ ID NO: 1.

EJEMPLO 3 Este ejemplo representa la identificación del dominio angiogénico del SPARC.

Un producto de degradación proteolitico de SPARC se preparó y se designó SPARC-d. El SPARC-d es una mezcla que consiste de dos formas de SPARC truncado C-terminal. La FIGURA 3 representa un ensayo de SDS PAGE en el cual el SPARC-d se condujo a lo largo del SPARC de tipo natural. La forma dominante del SPARC-d, etiquetado B en el gel en la FIGURA 3, es la parte pérdida de la secuencia C-terminal que consiste de los aminoácidos 233-286 (SEQ ID NO. 2) .

La FIGURA 4 representa los resultados de- un ensayo de formación del tubo de HUVEC 3-D conducido con el SPARC de tipo natural y el SPARC-D. El comportamiento angiogénico del SPARC tipo natural, como se describe en el ejemplo anterior, se puede observar en la gráfica; el comportamiento angiogénico se incrementa conforma la concentración se aproxima a 10 ug/ml y desciende conforme se aproxima a 100 ug/ml. Los resultados para el SPARC-d, sin embargo, indican que el truncamiento del extremo C-terminal de la proteina suprime la actividad angiogénica del SPARC.

Con base en los resultados de este ensayo, es posible identificar la ubicación del dominio angiogénico del SPARC como es localizado dentro de la secuencia de 54 aminoácidos C-Terminal (SEQ ID NO 1) .

El uso de los términos "un" y "una" y "el" y "la" y referentes similares en el contexto de- describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se va a considerar que cubren tanto el singular como el plural, a .menos que se indique de otra manera en este documento o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye", y "que contiene"' se van a considerar como términos indefinidos (es decir, significan "que incluye, pero no se limita a"), a menos qué se observe de otra manera. La citación de intervalos de valores en ese documento se proponen simplemente para servir como un método de abreviación o que se refiere individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique de otra manera en este documento, y cada valor separado se incorpora en especificación como si se citarán individualmente en este documento. Todos los métodos descritos en este documentos se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra manera en este documento se contradiga claramente de otra manera por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionados en este documento, se proponen simplemente para ilustrar mejor la invención y no posee una limitación en el alcance de la invención a menos que se reclame de otra manera. Ningún lenguaje en especificación se debe considerar como que indica cualquier elemento no reclamado como esencial a la práctica de la invención.

Las modalidades preferidas de esta invención se describen en este documento, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones de aquellas modalidades preferidas pueden ser-evidentes para aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica en la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los artífices expertos empleen estas variaciones como apropiadas, y los inventores desean que la invención sea practicada de otra manera que como se describe específicamente en este documento. Por consiguiente, esta invención incluye todas las modificaciones equivalentes del tema citado en las reivindicaciones adjuntas a la misma como es permitido por la ley aplicable. Por otra parte, cualquier combinación de elementos descritos en lo anterior en todas las variaciones posibles de los mismos se incluye por la invención a menos que- se indique de otra manera en este documento o se contradiga claramente de otra manera por el contexto .

Claims (36)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene hasta 5 cambios de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

2. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende hasta 15 aminoácidos adicionales agregados a las terminales carboxi y/o amino.

3. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido tiene hasta 5 cambios de aminoácidos no conservadores de la SEQ ID NO: 1 y retiene por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

4. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia S0 idéntica a SEQ ID NO: 1 y retiene por lo menos 60% de la actividad angiogénica del polipéptido de SEQ ID NO: 1.

5. Un polinucleótido aislado, caracterizado 9C porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de los polipéptidos de conformidad con las reivindicaciones 1-4.

6. Un vector de expresión, caracterizado porque es para expresar una secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 5.

7. Una célula, transformada, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5 y que expresa cualquiera de los polipéptidos de las reivindicaciones 1-4.

8. Uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido purificado que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene hasta 5 cambios de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para la manufactura de un medicamento para estimular la angiogénesis en un animal en necesidad de angiogénesis.'

9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el polipéptido comprende además hasta 15 aminoácidos adicionales agregados a las terminales carboxi y/o amino.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el polipéptido purificado tiene hasta 5 cambios de aminoácidos no conservadores y retiene por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

11. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el polipéptido purificado comprende una secuencia 90% idéntica a SEQ ID NO: 1 y retiene al menos 60% de la actividad angiogénica del polipéptido de SEQ ID NO: 1.

12. El uso de conformidad con cualquiera de las la reivindicaciones 8-11, en donde el animal está en necesidad de angiogénesis debido a isquemia o hipoperfusión .

13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde la isquemia o hipoperfusión es isquemia cardiaca, apoplejía, TIA, hipoperfusión límbica, restenosis o aterosclerosis .

14. Un polipéptido SPARC aislado, caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene hasta 5 cambios de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

15. Un polipéptido SPARC, carboxi truncado, aislado, caracterizado porque es el producto de una digestión enzimática de la carboxiterminal de un polipéptido de SPARC de longitud completa y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

16. Un polipéptido de SPARC carboxi truncado, etiquetado con epítopo, aislado, caracterizado porque es el producto de una digestión enzimática de la. carboxi terminal de un polipéptido SPARC de longitud completa y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

17. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende hasta 15 aminoácidos adicionales aqreqados a las terminales carboxi y/o amino.

18. Un polinucleót ido- aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de conformidad con la reivindicación 14.

19. Un vector de expresión, caracterizado porque es para expresar cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 18.

20. Una célula transformada, caracterizada porque comprende cualquiera de' las secuencias de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 18.

21. Uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera c más de los polipéptidos SPARC de conformidad con la reivindicaciones 14-16 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un animal.

22. Uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera o más de los polipéptidos SPARC de conformidad con las reivindicaciones -14-16 y una terapia sin SPARC para la manufactura de un. médicamente para el tratamiento de un tumor en un animal.

23. El uso de conformidad con las reivindicaciones 21 o 22, en donde el tumor se selecciona del grupo que consiste de tumores de la cavidad bucal, tumores faríngeos, tumores del sistema digestivo, tumores del sistema respiratorio, tumores óseos, tumores cartilaginosos, metástasis ósea, sarcomas, tumores de la piel, melanoma, tumores de mama, tumores del sistema genital, tumores del tracto urinario, tumores orbitales, tumores cerebrales y del 'sistema nervioso central, gliomas, tumores del sistema endocrino, tumores de tiroides, tumores esofágicos, tumores gástricos, tumores del intestino delgado, tumores colónicos, tumores rectales, tumores anales, tumores de hígado, tumores de la vesícula biliar, tumores pancreáticos, tumores laríngeos, tumores de los pulmones, tumores bronquiales, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células pequeñas, tumores cervicales uterinos, tumores del cuerpo uterino, tumores ováricos, tumores de la vulva, tumores vaginales, tumores de la próstata, carcinoma prostético, tumores testiculares , tumores de pene, tumores de la vejiga urinaria, tumores del riñon, tumores de la pelvis renal, tumores de la uretra, tumores de cabeza y cuello, cáncer de paratiroides , enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide acrónica.

24. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, en donde la terapia sin SPARC es uno o más de un régimen quimioterapéutico, de radiación o biológico .

25. El uso de ¦ conformidad con la reivindicación 24, en donde la terapia sin SPARC comprende uno o más de docetaxel, paclitaxel, taxanos, compuesto de platino, antifolatos, antimetabolitos, antimitóticos , agentes dañinos de ADN, proapoptóticos, agentes inductores de diferenciación, agentes antiangiogénicos, antibióticos, hormonas, péptidos, anticuerpos y combinaciones de los mismos.

26. Un método para identificar un inhibidor de angiogénesis , caracterizado porque comprende a. administrar una cantidad efectiva de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 a un. sistema de modelo de angiogénesis; b. administrar separadamente de manera simultánea un inhibidor de angiogénesis candidato y la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 al sistema de modelo de angiogénesis; c. cuantificar la cantidad de angiogénesis producida en (a) y (b) ; y d. si la angiogénesis se reduce en (b) en comparación a (a) , identificar el inhibidor de angiogénesis candidato como un inhibidor de angiogénesis.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el sistema de modelo de angiogénesis es un ensayo de formación del tubo HUVEC.

28. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde el animal es un humano.

29. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido aislado tiene hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores y retiene por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

30. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el polipéptido purificado tiene hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores y retiene por lo menos 60% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

31. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido aislado tiene hasta 5 cambios de aminoácidos no conservadores y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: i.

32. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido aislado tiene hasta 5 cambios de aminoácidos conservadores y que retiene no más de 5% de la actividad angiogénica de SEQ ID NO: 1.

33. El uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde el animal es un humano.

34. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde el animal es un humano.

35. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el animal es un humano.

36. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el animal es un humano.