MX2011000100A - Antagonistas del acido ribonucleico que se dirigen a la proteina de choque termico 27. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos de oligómero (oligómeros), que se dirigen al ARNm de Hsp27 en una célula, llevando a una expresión reducida de la Hsp27; la reducción de la expresión de la Hsp27 es benéfica para el tratamiento de ciertos trastornos médicos, tales como cáncer; la invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los oligómeros y los métodos para modular la expresión de Hsp27 usando dichos oligómeros, incluyendo métodos de tratamiento.

Description

NTAGONISTAS DEL ÁCIDO RIBONUCLEICO QUE SE DIRIGE PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO 27 REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama el beneficio con base a 35 U.S.C la Solicitud Provisional de E.UA No. de Serie 61/077,588 prese Julio de 2008, cuya descripción se incorpora aquí para referen alidad. La presente solicitud también reclama prioridad de la EP sentada el 2 de Julio de 2008.

CAMPO TÉCNICO La invención proporciona compuestos, composiciones ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Hsp27 es una chaperona molecular que se nstitutivamente en numerosas células de mamífero, pero particula ndiciones patológicas. Además, estas proteínas comparten pr ti-apoptóticas y son tumorigénicas cuando se expresan e ncerosas. La expresión de la Hsp27 está asociada con un ficiente en virtualmente todas las formas del cáncer tales como l ncer de mama, gástrico, de hígado, y de próstata, y los osteosar presión aumentada de la Hsp27 puede también predecir la re lunos tratamientos contra el cáncer. Por ejemplo, la expresión de tá implicada en la resistencia a la quimioterapia en el cáncer d ídice una respuesta deficiente a la quimioterapia en paci cemia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un oligómero de desde nómerost tales como 10 - 30 monómeros, que comprende una s tigua (una primera región) de 10 - 50 monómeros, tales como nómeros, en donde la secuencia contigua (la primera región) nos 80% (por ejemplo, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99%) idéntico (h na región correspondiente a un gen de Hsp27 o a un ARNm de m omplemento inverso de una región diana de un ácido nucleico qu Hsp27 de mamífero, tal como un gen de Hsp27 o un ARNm de como un ácido nucleico que tiene la secuencia establecida en SE , o variantes naturales de los mismos. Así, por ejemplo, el rida a una región de una molécula de ácido nucleico monocate e la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 137. , o variantes naturales de los mismos; y en donde por lo ómero en la primera región es un nucleósido análogo en leósido análogo es un monómero de Acido Nucleico Bloqueado siglas en inglés). Asi, por ejemplo, el oligómero híbrida a una r molécula de ácido nucleico monocatenada que tiene la s trada en SEQ ID NO: 137.

La invención proporciona un conjugado que comp ómero de acuerdo con la invención, y por lo menos una porci leótido o no de polinucleótido unida covalentemente al oligómero.

La invención proporciona una composición farmacé prende el oligómero o el conjugado de acuerdo con la invenci yente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona el oligómero o el conjugado d la invención, para uso como un medicamento, tal como erproliferativo, tal como cáncer, el método comprende admin mplo una cantidad efectiva de un oligómero, un conjuga mposición farmacéutica de acuerdo con la invención a un animal usceptible a la enfermedad o trastorno (tal como un paciente q sceptible a la enfermedad o trastorno).

En una modalidad, la enfermedad o el trastorno o la tá asociada con la sobre-expresión de un gen de Hsp27 o ARNm.

La invención proporciona un método para la inhibición una célula que esté expresando la Hsp27, el método comprend ntacto a la célula con un oligómero, o un conjugado de acuer mención para afectar la inhibición de la expresión de la Hsp27 (p ra causar un efecto inhibidor en la expresión de la Hsp27) en dich La invención proporciona un oligómero de desde ómeros, que comprende una primera región de 10 - 50 m La invención proporciona composiciones farmacéu mprenden un oligómero o conjugado de la invención, y un hículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona además un oligómero de ac invención, para uso en medicina.

La invención proporciona además el uso del oligó ención para la fabricación de un medicamento para el tratamient s de las enfermedades referidas aquí, tales como una e eccionada del grupo que consiste de cáncer, miopatias y asma.

La invención proporciona además un oligómero de ac invención, para uso para el tratamiento de una o más de las enfe feridas aquí, tal como una enfermedad seleccionada del grupo qu cáncer, miopatias y asma.

También se proporcionan composiciones farmacéutic rofilácticamente efectiva de uno o más de los oligómeros, conj mposiciones farmacéuticas de la invención. Además, se pro todos de uso de los oligómeros para la inhibición de la expre p27, y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la ac Hsp27.

La invención proporciona un método para el tratamien fermedad seleccionada del grupo que consiste de: cáncer, mi ma, el método comprende administrar una cantidad efectiva de gomeros, conjugados, o composiciones farmacéuticas, a un cesidad del mismo (tal como un paciente en necesidad del mismo) La invención proporciona métodos para inhibir (por julación lentificadora) de la expresión de la Hsp27 en una célula o método comprende la etapa de poner en contacto la célula o teji n vivo, con una cantidad efectiva de uno o más oligómeros, conj Figura 2. Proliferación celular de MTS después de la tr células PC3 con los oligonucleótidos indicados.

Figura 3. Secuencia de ADNc (ARNm) de Hsp27 - ? ID NO. 137. Número de acceso de GenBank NMJD01540.

Figura 4. Determinación de IC50 de oligómeros en cél tos de QPCR de células A549 24h después de la transfecció gómeros de Hsp27 (que se pueden referir como oligos). Los dato rmalizados con la expresión del ARNm de GAPDH y son compa presión diana en el imitador (100%). Las células transfectadas n transfectadas solo con el agente de transfección (control negativ Figura 5. Determinación de IC50 de oligómeros en cél atos de QPCR de células PC3 24h después de la transfección co p27. Los datos han sido normalizados con la expresión del \PDH y son comparados a la expresión diana en el imitador (1 Figura 8. Niveles de ALT en suero sanguíneo de nes tratados con oligómeros de Hsp27.

Figura 9. Niveles de AST en suero sanguíneo de nes tratados con oligómeros de Hsp27.

Figura 10. Cultivo a largo plazo con el oligómero qu uencia establecida en SEQ ID NO: 135.

Figuras 1 1 A y 11 B. Cultivo a largo plazo con el oligó e la secuencia establecida en SEQ I que modula lentificando el ARNm de Hsp27 y la proteína.

Figura 12. Ejemplo de la combinación de efecto onucleótido basado en LNA anti-Hsp27 más un agente citotóxi la combinación con TNF en el crecimiento celular.

Figura 13. Efectos anti-tumor del oligómero que uencia establecida en SEQ ID NO: 135 en Xenoinjerto de PC3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El oligómero La invención emplea compuestos oligoméricos (refe o oligómeros), para el uso en la modulación de la funció léculas de ácido nucleico que codifican la Hsp27 de mamífero, t ido nucleico de Hsp27 mostrado en la SEQ ID NO: 137, y turales de tales moléculas de ácido nucleico que codifican la mífero. El término "oligómero" en el contexto de la invención, s a molécula formada por el enlace covalente de dos o monómeros oligonucleótido). En algunas modalidades, el oligómero com nsiste de desde 10 - 50 monómeros enlazados covalentemente, ta -30 monómeros enlazados covalentemente, tal como 10-24 m lazados covalentemente, tal como 10-18 monómeros - rnucleótido fosfato o fosforotioato, y cubre tanto nucleótidos s como ADN o ARN, y nucleótidos no naturales que co dones modificadas del azúcar y/o de las bases, que también son Í como "análogos de nucleótido". Aquí, un solo nucleótido (unidad uede referir como una unidad de monómero o de ácido nucleico.

En el campo de la bioquímica, el término "nucleósid únmente para referirse a un glicósido que comprende una porci ina porción de base, y puede por lo tanto ser usado al referi dades de "nucleótido", que están enlazadas covalentemente aces internucleótido entre los nucleótidos del oligómero. En el ca tecnología, el término "nucleótido1' se usa a menudo para referi nómero de ácido nucleico o unidad, y como tal en el contex onucleótido puede referirse a la base - tal como la "secu leótidos", se refiere típicamente a la secuencia de la nucleobase minal de un oligonucleótido (oligómero) no comprende un grupo ernuclótido 5\ aunque puede o no puede comprender un grupos 5 El término "monómero" incluye tanto nucleósid soxinucleósidos (colectivamente, "nucleósidos") de origen natu idos nucleicos y que no contienen ya sea azúcares modi icleobases modificadas, es decir, compuestos en los cuales >osa o azúcar desoxiribosa está unido covalentemente a porción icleobase de origen natural (es decir, adenina, guanina, citosina acilo heterocíclicos de purina y pirimidina) y a los "análogos del n e son nucleósidos que ya sea existen naturalmente en los ácidos io existen naturalmente en los ácidos nucleicos, en donde ya sea rción azúcar es diferente de un azúcar ribosa o desoxiribosa (t úcares bicíclicos o azúcares modificados en 2\ tales como stituidos en 2'), o se modifica la porción de base (por ej Los términos "correspondiente a" y "que correspo fieren a la comparación entre la secuencia de nucleótido/nucl cir, la secuencia de la nucleobase o de la base) del oligó cuencia contigua del nucleótido/nucleósido (una primera re cuencia contigua equivalente del nucleótido/nucleósido de una icional seleccionada de cualquiera de i) una subsecuencia del co verso de la diana del ácido nucleico, y/o ii) la sec jcleótidos/nucleósidos proporcionada aquí. Los nucleótidos/n lálogos se comparan directamente a su equiv jcleótidos/nucleósidos correspondientes. Una primera re >rresponde a una secuencia adicional bajo i) o ii) es típicamente ;a secuencia sobre la longitud de la primera región (tal como la •ntigua del nucleótido/nucleósido) o, como se describe aquí ^unas modalidades, ser por lo menos 80% homologa a una rres ondient tal c m r l nina, el "análogo correspondiente del nucleósido" contiene, po azúcar modificado enlazado a porción de base de adenina.

Los términos "oligómero", "compuesto oligo ligonucleótido" se usan intercambiablemente en el contexto de la e refieren a una molécula formada por un enlace covalente de nómeros mediante, por ejemplo, un grupo fosfato (que forma fodiéster entre los nucleósidos) o un grupo fosforotioato (que lace fosforotioato entre los nucleósidos). El oligómero consi mprende, 10 - 50 monómeros, tal como 10 - 30 monómeros, tal monómeros, tal como 10 - 18 monómeros, tal como 10 - 16 mon gómero consiste de, o comprende una primera región (una ntigua) que, por ejemplo, consiste de 9 - 30 monómeros contiguo 24 monómeros, tal como 9 -18 monómeros, tal como 9 - 16 mon En algunas modalidades, los términos "secuencia " " " monómeros son análogos de nucieósido, sobre las formas nati numerosas propiedades preferidas deseables de dichos oligóm mo la capacidad de penetrar una membrana celular, buena resist cleasas extra y/o intracelulares y a la alta afinidad y especificid na del ácido nucleico. Los monómeros de LNA son parti feridos, por ejemplo, por conferir una o más de las propieda ndonadas.

En diversas modalidades, uno o más análogos de esentes dentro del oligómero son "silenciosos" o "equivalentes" en icleósido natural correspondiente, es decir, no tienen un efecto fu manera en que funciona el oligómero para inhibir la expresión gé i embargo, dichos análogos "equivalentes" de nucieósido son úti ?mplo, son más fáciles o económicos de fabricar, o son más estab ndiciones de almacenamiento o de fabricación, o pueden inco nómero de análogo de nucleósido, tal como un monómer lesquiera otros análogos de nucleósido.

El término "por lo menos uno" comprende los númer yores que o iguales a 1 , tales como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 , 15, 16, 17, 18, 19, 20 y así sucesivamente. En diversas modali o cuando se hace referencia a las dianas del ácido nucleic teina de los oligómeros de la invención, el término "por lo m luye los términos "por lo menos dos" y "por lo menos tres" y "por tro." Asimismo, en algunas modalidades, el término "por lo m prende los términos "por lo menos tres" y "por lo menos cuatro." En algunas modalidades, el oligómero comprende o c 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 2 monómeros contiguos en la primera región.

En algunas modalidades, el oligómero comprende o c - - En ciertas modalidades, el oligómero comprende o c , 1 1 , 12, 13, o 14 monómeros contiguos.

En diversas modalidades, el oligómero de acuerd ención consiste de no más de 24 monómeros, tal como no nómeros, tal como no más de 20 monómeros, tal como no nómeros, tal como 15, 16 o 17 monómeros. En algunas modal omero de la invención comprende menos de 20 monómeros.

En diversas modalidades, los oligómeros de la inv mprenden monómeros de ARN.

En diversas modalidades, los oligómeros de acuer mención son moléculas lineales o son sintetizadas lineales. El olig ;has modalidades, es una molécula monocatenada, y típica mprende regiones cortas de, por ejemplo, por lo menos 3, 4 o 5 m ntiguos, que son complementarios a otra región dentro del mismo ás regiones adicionales que consisten de por lo menos un icional. En algunas modalidades, la secuencia de la primera entificada por uns SEQ ID NO divulgada aquí.

Diseño de Gapmer Típicamente, el oligómero de la invención es un gapm Un "gapmer" es un oligómero que comprende un e ntiguo de monómeros capaces de reclutar un ARNse (por ejempl RNseH) como se describe aquí posteriormente en lo siguiente, ta jgión de por lo menos 6 o 7 monómeros de ADN, referido aq >gión B. La región B es flanqueada en ambos de sus extremos igiones referidas respectivamente como regiones A y C, cada ;giones A y C comprende o consiste de análogos de nucleósido, nálogos de nucleósido que mejoran la afinidad, tales como a cleico desbloqueado) (véase Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, orporado aquí para referencia). El UNA es ácido nucleico des icamente donde el enlace C2'-C3' (es decir, el enlace covalent rbono entre los carbonos C2' y C3') del azúcar ha sido eliminado, residuo azúcar desbloqueado".

Típicamente, el gapmer comprende regiones, de 5' a cionalmente A-B-C-D o D-A-B-C, en donde: la región A (A) con mprende por lo menos un análogo de nucleósido, tal como por lo onómero LNA, tales como análogos de nucleósido 1 -6, ta onómeros de LNA, y la región B (B) consiste de, o comprende po ico monómeros contiguos que son capaces de reclutar ARNse ( rma en un dúplex con una región diana complementaria de la m ¾N diana, tal como la diana de ARNm), tales como monómeros gión C (C) consiste de, o comprende por lo menos un a LNA, tales como análogos de nucleósido 2-5, tales como mon lA 2-5, tales como análogos de nucleósido 3 o 4, tales como mon A 3 o 4.

En ciertas modalidades, la región B consiste de, o co 7, 8, 9, 10, 1 1 o 12 monómeros contiguos (por ejemplo n secutivos) que son capaces de reclutar ARNse, tal como RNasa -9 monómeros contiguos, tales como 10 o 9 u 8 monómeros con n capaces de reclutar ARNse. En ciertas modalidades, la región !, o comprende por lo menos un monómero de ADN, tales como m s ADN 1 -12, preferiblemente monómeros de ADN 4-12, prefe Dnómeros de ADN 6-10, tales como monómeros de ADN eferiblemente monómeros de ADN 8, 9 o 10.

En diversas modalidades, la región A consiste de 3 o nucleósido, tales como monómeros de LNA, la región B consist oligómeros gapmer "shortmer". En algunas modalidades, los sentados aquí pueden ser tales gapmer shortmer.

• En ciertas modalidades, el oligómero consiste de 10, , 15 o 16 monómeros, en donde las regiones del oligómero tiene - 3'), A-B-C, u opcionalmente A-B-C-D o D-A-B-C, en donde: l nsiste de 1 , 2 o 3 análogos de nucleósido, tales como monómero región B consiste de 7, 8, 9 o 10 monómeros contiguos que son c lutar ARNse, tal como RNasaH; y la región C consiste de nómeros de análogos de nucleósido, tales como monómeros jando está presente, la región D consiste de un solo monómero d En ciertas modalidades, la región A consiste de 1 JA. En ciertas modalidades, la región A consiste de 2 monómero i ciertas modalidades, la región A consiste de 3 monómeros d ?rtas modalidades, la región C consiste de 1 monómero LNA. nómeros de ADN. En ciertas modalidades, la región B co nómeros de ADN. En ciertas modalidades, la región B compre nos un monómero LNA que está en la configuración alfa-L, tal cor 6, 7, 8, 9 o 10 monómeros de LNA en la configuración alfa-L. dalidades, la región B comprende por lo menos un monómero oxi En ciertas modalidades, todos los monómeros de LNA en la reg tán en la configuración alfa-L son unidades oxi LNA alfa-L. Ddalidades, el número de monómeros presentes en las regiones leccionan del grupo que consiste de (monómeros de an cleósido - región B - monómeros de análogos de nucleósido): 1-3-1 , 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1 , 4-8-2, 1 -8-4, 2-8-4, o; 1 -9-1 , 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1 -9-3, 3-9-1 , 3-9-3, 4-9-1 , 1 -9-4, o; 1 -10-1 , 1 -1 2-10-2, 1 -10-3, 3-10-1 , 2-10-3, 3-10-2, o 3-10-3. En ciertas moda mero de monómeros presentes en las regiones A-B-C del oligó cleósido, tales como monómeros que contienen azúcar 2'-0-? osa (2'-MOE) o monómeros que contienen un azúcar 2'-fluoro-de región B consiste de 8, 9, 10, 1 1 o 12 nucleósidos, tales como m ADN, donde las regiones A-B-C tienen monómeros 3-9-3, 3-10-3 2-4. Diseños del gapmer adicionales se divulgan en WO 2007/1 orporada aquí para referencia.

Enlaces Internucleósido Los monómeros de los oligómeros aquí descrit opiados conjuntamente vía grupos de enlace. Convenienteme )nómero está enlazado al monómero 3' adyacente vía un grupo de La persona que tiene conocimientos ordinarios en l mprenderá que, en el contexto de la presente invención, el monó extremo de un oligómero no comprende un grupo de enlace 5 ' Grupos adecuados de enlace incluyen ésos listad 2007/031091 , por ejemplo en el primer párrafo de la página 2007/031091 (incorporada aquí para referencia).

En diversas modalidades, se prefiere modificar el lace de su fosfodiéster normal a uno que sea más resistente al at leasa, tal como fosforotioato o boranofosfato - estos do ociables por la RNasa H, permitiendo así la inhibición antisentid r la RNasa de la expresión del gen diana.

En algunas modalidades, se prefieren los grupos cuados que contienen azufre (S) como se proporcionan aquí. E dalidades, se prefieren los grupos de enlace fosforotioato, partic ra la región gap (B) de los gapmer. En ciertas modalidades, se laces fosforotioato para enlazar a los monómeros conjuntamen iones de flanqueo (A y C). En diversas modalidades, se usan lo Se reconoce que la inclusión de los enlaces fosfod o uno o dos enlaces, dentro de un oligómero con una cadena orotioato, particularmente con grupos de enlace fosforotioato acentes a los monómeros de análogos de nucleosido (típicame ón A y/o C), puede modificar la biodisponibilidad y/o la bio-distri oligómero - véase la WO2008/053314, incorporada aquí para refer En algunas modalidades, tales como las modalidades eriormente, cuando sea adecuado y no específicamente indicado, pos de enlace restantes son ya sea fosfodiéster o fosforotioa zcla de los mismos.

En algunas modalidades todos los grupos de rnucleósidos son fosforotioato.

Al referirse a secuencias de oligonucleótidos especí mer, tales como ésas proporcionadas aquí, se comprenderá Acido Nucleico Diana Los términos "ácido nucleoico" y "poiinucleótido" rcambiablemente aquí, y se definen como una molécula form lace covalente de dos o monómeros, como se describió ante luyendo 2 o más monómeros, los "ácidos nucleicos" puede lquier longitud, y el término es genérico para los "oligómeros", longitudes descritas aquí. Los términos "ácido nucleico" y "polin luyen moléculas monocatenadas, bicatenadas, parcialmente bica ulares.

El término "ácido nucleico diana", como se usa aquí, N o ARN (por ejemplo, ARNm o pre-ARNm) que codifica un poli p27 de mamífero, tal como Hsp27 humana, tal como el ácido nu e la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 137, y variantes a gen natural de dichos ácidos nucleicos. En ciertas modalidades, Se reconoce que los números de acceso de GenBank d eriormente para los ácidos nucleicos se refieren a las secuencias o a las secuencias de ARNm per se. La secuencia de un ARN de ser entregada directamente de la secuencia de ADNc corres las bases timina (T) sustituidas por las bases uracilo (U).

El término "variante del mismo de origen natural" se re iantes del polipéptido Hsp27 o la secuencia de ácido nucleico q uralmente dentro del grupo taxonómico definido, tal como e puede por lo tanto ser procesada, por ejemplo por co dificaciones traslacionales, tales como disociación del pépti ociación proteolítica, glicosilación, etc.

En ciertas modalidades, los oligómeros descritos aquí a región del ácido nucleico diana (la "región diana") por cual areamiento de bases Watson-Crick, unión de hidrógenos de Ho ión inversa de hidrógenos de Hoogsteen, entre los monó gomero y los monómeros del ácido nucleico diana. Dicha unión t erida como "hibridación." A menos que se indique lo contrario, l r apareamiento de Watson-Crick de las bases complementarias enina con timinas (ADN) o uracilo (ARN), y guanina con cito gomero se une a la región diana porque la secuencia del olig ntica a, o parcialmente idéntica a, la secuencia del complemento región diana; para los propósitos de la presente, se dice que el oli " " " mejor se alinea con el complemento inverso de la secu omero especificado (o región del mismo), usando el pro eación y los parámetros descritos aquí en lo siguiente.

Al determinar el grado de "complementariedad" omeros de la invención (o de las regiones del mismo) y la región do nucleico que codifica la Hsp27 de mamífero, tales como ésos í, el grado de "complementariedad" (también, "homología" o "ide resa como el porcentaje de identidad(o porcentaje de homologí uencia del oligómero (o región del mismo eso) y la secuencia d na (o el complemento inverso de la región diana) que mejor se mismo. El porcentaje es calculado por el recuento del número eadas que son idénticas entre las 2 secuencias, dividiendo entre al de monómeros contiguos en el oligómero, y multiplicando po ha comparación, si existen espacios, es preferible que dichos pV/www.ebi.ac.uk/emboss/aliqn/index.html, Método: EMBOSS: ag pacio Abierto = 10.0, Espacio Extendido = 0.5, usando B oteina), o DNAfuIl para las secuencias de nucleótido/nucleobase.

Como será comprendido, dependiendo de con alapareamiento" se refiere a una falta de identidad en la secuen ejemplo, entre la secuencia de la nucleobase de un oligór mplemento inverso de la región diana a la cual se une; como po tre la secuencia de bases de dos ácidos nucleicos alineados qu Hsp27), o a la falta de complementariedad en la secuencia ( mplo, entre un oligómero y la región diana a la cuales se une).

En algunas modalidades, los oligómeros de acuer ención son capaces de inhibir (tal como, por regulación lentifi presión de uno o más genes diana de la Hsp27 en una célula presando, o que es capaz de expresar (es decir, al aliviar la repre omero (o conjugado) de la invención puede efectuar la inhibi p27, típicamente en una célula de mamífero, tal como una célula ciertas modalidades, los oligómeros de la invención, o conjugad mos, se unen al ácido nucleico diana y afectan la inhibición de la I ARNm de Hsp27 de por lo menos 10% o 20% en comparación c expresión en la ausencia del oligómero(s) o conjugado feriblemente de por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 % en comparación con el nivel de expresión de la Hsp27 en la au ómero(s) o conjugado(s). En algunas modalidades, tal inhi erva al usar de aproximadamente 0.04 nM a aproximadamente o de aproximadamente 0.8 nM a aproximadamente 20 nM del oli jugado. Según lo ilustrado aquí el tipo de células es, en alidades, una célula humana, tal como una célula cancerosa, a célula de cáncer de pulmón humana o una célula humana de - uerida para obtener la regulación lentificadora de la diana es ti re 1 y 25 µ?, tal como 5 µ?.

En diversas modalidades, la inhibición de la expresión menor que 100% (es decir, menor que la inhibición compl resión), tal como menor que 98% de inhibición, menor que ibición, menor que 90% de inhibición, menor que 80% de inhibici 70% de inhibición. En diversas modalidades, la modulaci resión génica puede determinarse al medir los niveles de pro mplo por métodos tales como SDS-PAGE seguido por tra stern usnado anticuerpos adecuados cultivados contra la proteí ernativamente, la modulación de los niveles de expresió terminarse midiendo niveles de ARNm, por ejemplo, por tra rthern o RT-PCR cuantitativo. Cuando se mide vía los niveles de e\ de regulación lentificadora cuando se usa una dosificación apr ibir la expresión de la proteína Hsp27 y/o el ARNm en nvenientemente la célula es una célula de mamífero, tal como mana. El contacto con puede ocurrir, en algunas modalidades, i tacto puede ocurrir, en algunas modalidades, in vivo.

Secuencias del oliqómero En algunas modalidades, los oligómeros de la invenc cuencias que son idénticas a una secuencia seleccionada del nsiste de las SEQ ID NO: 1 a 128.

Además se proporcionan ácidos nucleicos diana (po o ARNm que codifica a Hsp27) que contienen regiones dian mpleta o perfectamente) complementarias o parcialmente compl uno o más de los oligómeros de la invención. En ciertas modali gomeros se unen a las variantes de las regiones diana de Hs : 137. Por lo tanto, en otras modalidades, los oligómeros de la nen secuencias que difieren en 1 , 2 o 3 bases cuando se comp cuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO icamente, un oligómero de la invención que se une a una varia ión diana de Hsp27 es capaz de inhibir (por ejemplo, por tificaora) la Hsp27.

En otras modalidades, los oligómeros de la inve gomeros LNA, por ejemplo, esos oligómeros tienen las s stradas en las SEQ ID NO: 129-136. En diversas modalid gomeros de la invención son inhibidores potentes de la expresión Hsp27 y de la proteína. En algunas modalidades, la frase itente" se refiere a un oligómero con un IC50 menor que 5nM ¡terminado por el ensayo de la transfección del lipofectamina del i algunas modalidades, el IC50 es menor que 4nM, tal como omero comprende o consiste de una primera región que t uencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1 En ciertas modalidades, el oligómero comprende o c primera región que tiene una secuencia de bases que es comp plementaria (perfectamente complementaria) a la secuencia de u na de un ácido nucleico que codifiqua una Hsp27 de mamífero.

No obstante, en algunas modalidades, el oligómero in o 4 (o más) malapareamientos en comparación con la región di eada de un ácido nucleico diana de Hsp27, y aún se une suficien egión diana para efectuar la inhibición de la expresión del ARNm e la proteína. El efecto de desestabilización del malapareamiento idos a hidrógeno de Watson-Crick puede, por ejemplo, ser compe longitud aumentada del oligómero y/o un número aumentado de nucleósido, tales como monómeros de LNA, presentes d En diversas modalidades, la secuencia de bases del la invención, o de una primera región del mismo, es preferibleme nos 80% idéntica a una secuencia de bases seleccionada del siste de las SEQ ID NO: 1 -15 y 121 , 16-30 y 122, 31 -45 y 12 4, 61 -75 y 125, 76-90 y 126, 91 -105, y 127, y 106-120 y 128, tal c nos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91 %, por lo menos 9 nos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 9 nos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% idéntico, tal co ntico.

En ciertas modalidades, la secuencia de bases del olig invención o de una primera región del mismo es por lo menos 80 la secuencia de bases del complemento inverso de una reg asente en la SEQ ID NO: 137, tal como por lo menos 85%, por %, por lo menos 91 %, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por mplementario, por lo menos 99% complementario, tal co mplementario (perfectamente complementario).

En algunas modalidades el oligómero (o una primera ismo) tiene una secuencia de bases seleccionada del grupo que c SEQ ID NO: 1 , 16, 31 , 46, 61 , 76, 91 , y 106, o se selecciona del nsiste de por lo menos 9 o 10 monómeros contiguos de las SEQ , 31 , 46, 61 , 76, 91 , y 106. En otras modalidades, la sec gómero de la invención o una primera región del mismo compr s, o tres porciones de bases que difieren (por eje alaparemientos) de ésos en los oligómeros que tienen las sec =Q ID NO: 1 , 16, 31 , 46, 61 , 76, 91 , y 106, o las secuencias de po o 10 monómeros contiguos del mismo, cuando está alineado >tima con la secuencia seleccionada o la región de la misma.

En algunas modalidades, el término "primera región omero (o una primera región del mismo) comprende una, d rciones de bases que difieren de ésas en los oligómeros que uencias SEQ ID NO: 121 -128, o las secuencias de por lo men nómeros contiguos del mismo, cuando está alineado de mane la secuencia seleccionada o la región de la misma.

En diversas modalidades, los oligómeros comprende u 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 16 monómeros contiguos, tales com e tienen una secuencia de bases idénticamente presente en una eccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1 , 16, 31 , 4 , y 106. En otras modalidades, los oligómeros incluye una r prende una, dos, o tres porciones de bases que difieran de és omeros que tienen las secuencias SEQ ID , 31 , 46, 61 , 76, 91 , y 106.

En algunas modalidades la primera región consiste de diversas modalidades, el oligómero de la invención compr mera región que es complementaria a la diana, que está flanqu 3' por monómeros adicionales que son complementarios a la re algunas modalidades los monómeros 5' o 3' adicionales son nu es como monómeros de ADN o de ARN. En diversas modali nómeros 5' o 3' representan la región D según lo mencionado ntexto de los oligómeros del gapmer.

En algunas modalidades el oligómero de acuerd ención consiste de, o comprende monómeros contiguos (un ión) que tiene una secuencia de la nucleobase de acuerdo con : 121 , o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo tales , 12, 13, 14, 15 o 16 monómeros contiguos del mismo, tal como l D. 1 -15.

En algunas modalidades el oligómero de acuerd 13, 14, 15 o 16 monómeros contiguos del mismo, tales como la : 31 -45.

En algunas modalidades el oligómero de acuerd ención consiste de, o comprende monómeros contiguos (un ión) que tiene una secuencia de la nucleobase de acuerdo con l : 124, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo tales 12, 13, 14, 15 o 16 monómeros contiguos del mismo, tales com NO: 46-60.

En algunas modalidades el oligómero de acuerd ención consiste de, o comprende monómeros contiguos (un lión) que tiene una secuencia de la nucleobase de acuerdo con l ): 125, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo tal co 13, 14, 15 o 16 monómeros contiguos del mismo, tales como la K 61 -75. : 127, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo tales , 12, 13, 14, 15 o 16 monómeros contiguos del mismo, tales com NO: 91-105.

En algunas modalidades el oligómero de acuerd ención consiste de, o comprende monómeros contiguos (un ión) que tiene una secuencia de la nucleobase de acuerdo con I : 128, o por lo menos 9 monómeros contiguos del mismo tales , 12, 13, 14, 15 o 16 monómeros contiguos del mismo, tales com NO: 106-120.

Nucleósidos y Análogos de Nucleósidos En algunas modalidades, los términos "análogo de nu lálogo de nucleótido" son usados intercambiablemente.

En diversas modalidades, por lo menos uno de los m En algunas modalidades, el enlace entre por lo nomeros contiguos del oligómero es diferente de un enlace fosfo En ciertas modalidades, el oligómero incluye por lo nómero que tiene una base modificada, por lo menos un monór eda ser el mismo monómero) que tiene un azúcar modificado nos un enlace inter-monómero que no es de origen natural- Ejemplos específicos de los análogos de nucle scriben por ejemplo por Freier y Altmann; Nucí. Acid Res. , 1997, 43 y Uhlmann; Curr. Opinión in Drug Deveíopment, 2000, 3(2), el Esquema 1 (en el cual algunos análogos de nucleósido se mo nucleótidos) UNA CeNA PNA 2'-(3-hidroxi)propilo venientemente la afinidad del oligómero para la región diana cleico diana.

Ejemplos de análogos de nucleósido adecuados y pre scriben en la WO2007/031091 , o son referenciados en la misma.

En algunas modalidades, el análogo de nucleósido c a porción de azúcar modificada para proporcionar un grupo sustit tales como azúcares 2' -O-alquil-ribosa, azúcares 2'-amino-deso úcares 2'-fluoro-desoxiribosa.

En algunas modalidades, el análogo de nucleósido c azúcar bicíclico (LNA), que mejora la afinidad de la unión y pued oporcionar una cierta resistencia aumentada a la nucleasa. E Ddalidades, el monómero LNA se selecciona de oxi-LNA (tal co i-LNA, y alfa-L-oxi-LNA), y/o amino-LNA (tai como beta-D-amino-L amino-LNA) y/o tio-LNA (tal como beta-D-tio-LNA y alfa-L-tio-LNA años del oligómero, y también reduce el tamaño del oligómero q pecíficamente a una región diana de una secuencia diana.

En algunas modalidades, el oligómero comprende por análogo de nucleósido. En algunas modalidades, el oligómero c r lo menos 2 análogos de nucleósido. En algunas modalidades, el mprende de 3-8 análogos de nucleósido, por ejemplo 6 o 7 an cleósido. En diversas modalidades, por lo menos uno de los an cleósido es un monómero de ácido nucleico bloqueado (LNA); p r lo menos 3 o por lo menos 4, o por lo menos 5, o por lo menos anos 7t u 8, análogos de nucleósido son monómeros de LNA. E Calidades, todos los análogos de nucleósido son monómeros de Se reconocerá que cuando se referiré a una secuencia aterida del oligómero, en ciertas modalidades, los oligómeros co análogo de nucleósido correspondiente, tal como un monó ión D según se refiere aquí, y/o en las regiones que consist nómeros de ADN, y/o en las regiones que son 5' o 3' a la r omero que es complementaria a la región diana.

En algunas modalidades los análogos de nucleósido tro del oligómero de la invención (tales como en las region ncionadas aquí) se selección independientemente de, por nómeros que contienen azúcares 2,-Oalquilribosa, monóm ntienen azúcares 2'-amino-desoxiribosa, monómeros que úcares 2'-fluoro-desoxiribosa, monómeros de LNA, monóm ntienen azúcares arabinosa ("monómeros ANA"), monóm ntienen azúcares 2'-fluoro-arabinosa, monómeros que contienen arabino-hexitol ("monómeros HNA"), monómeros de intercalación finen en Christensen (2002) Nucí. Acid Res. 30: 4918-4925, incor ra referencia, y azúcares 2'-0-metoxietil-ribosa (2'MOE). E úcares de 2'-MOE-ribosa. En algunas modalidades, por lo r álogo de nucleósido contiene un azúcar 2'-fluoro-desoxiribosat t 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 análogos de nucleósido que contienen az cleótido de 2'-fluoro-ADN.

En diversas modalidades, el oligómero de acuerd ención comprende por lo menos un monómero de ácido queado (LNA), tal como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 monómeros de mo 3 - 7 o 4 a 8 monómeros de LNA, o 3, 4, 5, 6 o 7 monómero diversas modalidades, todos los análogos del nucleósido son m LNA. En ciertas modalidades, el oligómero comprende ambos m beta-D-oxi-LNA, y uno o más de los siguientes monómeros nómeros de tio-LNA, monómeros de amino-LNA, monómeros d monómeros de ENA en cualquiera de las configuraciones betas-combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades, lass po N, más preferiblemente monómeros de ADN) opcionalmente con lace modificados tales como fosforotioato.

En diversas modalidades, por lo menos uno de los a cleósido presentes en el oligómero tiene bases modificadas sele l grupo que consiste de 5-metilcitosina, isocitostna, pseudoisoc omouracilo, 5-propiniluracil, 6-aminopurina, 2-aminopurina, minopurina, y 2-cloro-6-aminopurina.

LNA El término "LNA" o "monómero de LNA" se refiere a u Í nucleósido bicíclico", conocido como "Acido Nucleico Bloqueado i usa en el contexto de un "oligonucleótido de LNA", LNA se re gonucleótido que contiene uno o más de dichos análogos de :íclicos. Los nucleósidos de LNA se caracterizan por la presen ' ' Fórmula 1 en donde para todos los centros quirales, los grupos a eden ser encontrados en cualquier orientación R o S; en donde X se selecciona - O-, - S-, - N(RN ) y - C(R6 eferiblemente - O-; B se selecciona de hidrógeno, alcoxi de Ci_4 opci istituido, alquilo de C1 -4 opcionalmente sustituido, aciloxi icionalmente sustituido, las nucleobases incluyendo las de orige P* designa a un enlace internucleósido a un yacente, o a un grupo 3'-terminal; R4* y R conjuntamente forman un grupo enlazante biv mo, por ejemplo, un biradical que consiste de 1 - 4 grupos/átomos leccionado independientemente de - C(RaRb)-. -C(Ra)=C(Rb)-, -, -Si(Ra)2-, -S-, -S02l -N(Ra)-, y >C=Z, en donde Z se selecciona d -N(Ra)-, y Ra y Rb cada uno se selecciona independiente Jrógeno, alquilo de Ci_i2 opcionalmente sustituido, alquenilo cionalmente sustituido, alquinilo de C2-12 opcionalmente sustituid ;oxi de CM2 opcionalmente sustituido, alcoxialquilo de C2-12, alqu .12, carboxi, alcoxicarbonilo de CM2, alquilcarbonilo de C1.12, for loxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi teroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono y di(alquilo de rbamoilo, mono y di(alquilo de C!^amino-carbonilo, amino-alquil upos asimétricos pueden ser encontrados en cualquiera de la ori s, y; cada uno de los sustituyentes Rr, R2, R3, R5, R5*, lecciona independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-12 opci stituido, alquenilo de C2-12 opcionalmente sustituido, alquinil cionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi de C1-12, alcoxialquilo queniloxi de C2-12, carboxi, alcoxicarbonilo de C1-12, alquilcarbonil rmilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, h 3rbonilo, heteroariioxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono y di(alquil niño, carbamoilo, mono y di(alquilo de C eJ-arnino-carbonilo, a ? C i-6-aminocarbonilo, mono y di(alquilo de Ci.6)amino-alquil ninocarbonilo, alquilo de Ci-6-carbonilamino, carbamido, alcanloil ilfono, alquilsulfoniloxi de C1.6, nitro, azido, sulfanilo, alquilti Hógeno, intercaladores de ADN , grupos fotoquímicamente activ Cuando las definiciones utilizadas aquí se refieren a sustituido, a alquilo de Ci.6 sustituido, a alquilo de CM 2 SU uenilo de C2-12 sustituido, a alquenilo de C2_6 sustituido, a alquini stituido, a alquinilo de C2-6 sustituido, a alcoxi de CM2 sustituido, a -6 sustituido, a alcoxi de CH sustituido, a aciloxi de sustitui stituido, a heteroarilo sustituido, a metileno sustituido, a acilo s inoalquilo de sustituido o a la amida sustituida, los su ecuados incluyen preferiblemente uno o más grupos R9, en dond ; selecciona independientemente de halógeno, alquilo de Ci_6, alq stituido, alquenilo de C2.6t alquenilo de C2.6 sustituido, alquinil ^uinilo de C2.6 sustituido, CN, OJ1, SJ1 t NJ^, N3, COOJi f donde X es O o S; y cada J1 y J2 se selecciona independientem ^uilo de C1.6, alquilo de Ci.6 sustituido, alquenilo de C2.6, alquen ition (John Wiley & Sons, 1999). En algunas modalidades, R4' y ma un grupo enlazante seleccionado de C(RaRb)-C(RaRb)-, C RaRb)-NRa-, C(RaRb)-S-, and C(RaRb)-C(RaRb)-0-, en donde Ra mo se definió anteriormente. En algunas modalidades, cada uno selecciona independientemente de hidrógeno y alquilo de C^, y o preferiblemente seleccionados independientemente de hidró 3tilo.

En algunas modalidades, cada uno de Rr, R2, R3, lecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo |uilo de C1-6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2.6 luinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de Ci-6, alco stituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquillo de Ci.6, y aminoalqu stituido. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos p contrados en la orientación R o S. r 2 3 5 En algunas modalidades preferidas, Rr, R2, R3 drógeno.

En algunas modalidades, R5 y R5* son cada uno se dependientemente de H, -CH3l -CH2-CH3,- CH2-0-CH3, y eferiblemente, en algunas modalidades, cualquiera de R5 drógeno, y el otro grupo (R5 o R5* respectivamente) se seleccion C1.5, alquenilo de C2.6, alquinilo de C2.6, alquilo de C1-6 sustituid 5 C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, y acilo sustituido (-Dnde cada grupo sustituido está mono o poli-sustituido c jstituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alqu quilo de Ci_6 sustituido, alquenilo de C2_6, alquenilo de C2.6 quinilo de C2.6) alquinilo de C2.6 sustituido, OJ1 , SJ1 ( NJ^, N3, C y N(H)C(=X)N(H)J2 en donde X ida J1 y J2 se selecciona independientemente de H, alquilo de algunas modalidades cualquiera de R5 o R5* es metilo. E dalidades cualquiera de R5 o R5 es etilenilo. En algunas m alquiera de R5 o R5 es acilo sustituido. En algunas modalidades R5 o R5* es C(=0)NJ1J2. Para todos los centros quirales, l imétricos pueden ser encontrados en la orientación R o S. Ej hos nucleótidos bicíclicos modificados en 5' se divulgan 107/134181 , que se incorpora así para referencia en su totalidad.

En algunas modalidades B es una nucleobase, i álogos de la nucleobase y las nucleobases de origen natural, t a purina o pirimidina, o una purina sustituida o pirimidina sustitu cleobase seleccionada de adenina, citosina, timina, adenina, u a nucleobase modificada o sustituida, tal como 5-tiazolo-ura acilo, 5-propinil-uracilo, 2'-tio-timina, 5-metil-citosina, 5-tiazolo-c )pinil-cirosina y 2,6-diaminopurina. 4* 2* rboxi, alcoxicarbonilo de Ci_i2l alquilcarbonilo de C M2, formilo, ar rbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi teroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono y di(alquilo de C rbamoilo, mono y di(alquilo de amino-alqui inocarbonilo, mono y di(alquilo de Ci.6)amino-alquilo inocarbonilo, alquilo de Ci.6-carbonilamino, carbamido, alcanloilo lfono, alquilsulfoniloxi de Ci.6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio lógeno, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activ moquímicamente activos, grupos quelantes, grupos reporteros, nde cada arilo y heteroarilo puede estar opcionalmente sustituid s sustituyentes Ra y Rb germinales juntos pueden designa icionalmente sustituido (=CH2). Para todos los centros quirales, l imétricos pueden ser encontrados en la orientación R o S.

En algunas modalidades R4* y R2* juntos designan stituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinil uinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de C1.6, alcoxi de Ci_6 sustituido, stituido, aminoalquillo de Ci_6, y aminoalquilo de Ci_6 sustit feriblemente Ra y Rb son hidrógeno, y; en donde Rc se sele rógeno, halógeno, alquilo de Ci_6, alquilo de C1-6 sustituido, al .6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-6 oxi de C^, alcoxi de Ci.6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amino .6l y aminoalquilo de sustituido, y más preferiblemente Rc es h En algunas modalidades, R4* y R2" juntos forman lazante C(RaRb)-0-C(RcRd)-0-, en donde cada uno de Ra, Rb, R lecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo juilo de C .Q sustituido, alquenilo de C2.6, alquenilo de C2-6 luinilo de C2.6, alquinilo de C2.6 sustituido, alcoxi de Ci.6, alco stituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquillo de Ci_6, y aminoalqui a b c d y CN, en donde cada uno de Jl f J ependientemente, H o alquilo de Ci.6, y X es O, S o N^ . E dalidades Z es alquilo de C^, o alquilo de d.6 sustituido. E dalidades Z es metilo. En algunas modalidades Z es alquil stituido. En algunas modalidades dicho grupo sustituyente es alco algunas modalidades Z es CH3OCH2-. Para todos los centros q pos asimétricos pueden ser encontrados en la orientación R o S. ? dichos nucleótidos bicíclicos se divulgan en la US 7,399,84 :orpora así para referencia en su totalidad. En algunas modalidad R5, R5* son todos hidrógeno. En algunas modalidades, Rr, R Jrógeno, y uno o ambos de R5, R5* puede ser diferente de hidróg referido anteriormente y en la WO 2007/134181.

En algunas modalidades, R4" y R2* juntos forma lazante que comprende un grupo amino sustituido, por ejemplo, ependientemente de halógeno, OJ1 , SJ L NJ ^, COOJ ( =0)NJ1J2I N(H)C(=NH)N JiJ2 y N(H)C(=X=N(H)J2 en donde X es da uno de Ji y J2 se selecciona independientemente de H, alquil uenilo de C2_6, alquinilo de C2-6, aminoalquilo de C1-6 y un grupo ra todos los centros quirales, los grupos asimétricos pu contrados en la orientación R o S. Ejemplos de dichos n íclicos se divulgan en la WO2008/150729 que se incorpora erencia en su totalidad. En algunas modalidades, cada uno de R ', R5* se selecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, -6, alquilo de ^ .Q sustituido, alquenilo de C2_6, alquenilo de C2_6 ^uinilo de C2.6, alquinilo de C2_6 sustituido, alcoxi de Ci.6) alco stituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquillo de C1-6, y aminoalqu stituido. En algunas modalidades, R , R2, R3, R5, R5* son todos i algunas modalidades, R , R2, R3 son todos hidrógeno y uno o 5 uilo de C1-12 o alquilo de C1.12 sustituido; cada grupo sustit pendientemente, mono o poli-sustituido con los grupos sus eccionados independientemente de halógeno, alquilo de C^, 6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinil uinilo de C2_6 sustituido, OJ1 , SJi, NJ1J2, N3, CN, , C( 0)Ji , cada u is se selecciona independientemente del alquílico H, alquilo de Ci C1-6 sustituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-6 sustituido, al 6? alquinilo de C2-6 sustituido, aminoalquilo de C1-6, aminoalquil tituido y un grupo protector. Dichos compuestos se divulg 2009/006478, incorporada así en su totalidad para referencia.

En algunas modalidades, R4* and R2* forman un grupo en donde Q es C(qi)(q2)C(q3)(q4). C(q1)=C(q3), C[=C(qi)(q2)]- cada uno de q f q2, q3, q4 se s irales, los grupos asimétricos pueden ser encontrados en la orien Ejemplos de dichos nucleótidos bicíclicos se divulga 2008/154401 que es así incorporada para referencia en su tot unas modalidades, cada uno de R1 , R2, R3, R5, R5" se ependientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo de Ci_6, alqui stituido, alquenilo de C2-6, alquenilo de C2-e sustituido, alquinil uinilo de C2-6 sustituido, alcoxi de C1-6, alcoxi de Ci.6 sustituido, stituido, aminoalquillo de C^, y aminoalquilo de Ci.6 sustituido. E dalidades, Rr, R2, R3, R5, R5* son todos los hidrógenos. E dalidades, Rr, R2, R3 son todos hidrógeno y uno o ambos de R5, tar diferente de hidrógeno según lo referido anteriormente y 107/134181 o WO2009/067647 (análogos de ácidos nucleic íclicos).

En algunas modalidades preferentes el monómero en donde Y se selecciona de -O-, -CH2CK -S-, -NH-, 2-; cada uno de Z y Z* se selecciona independientemente de ernucleósido, de RH, un grupo terminal y un grupo protector; B a porción de bases de nucleótidos de origen natural o n cleobase), y RH se selecciona de hidrógeno y alquilo de ca b e d y e se se|eccjona independientemente de hidrógeno, .12 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-12 opcionalmente u¡nilo de C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi oxialquilo de C2-12, alqueniloxi de C2-12, carboxi, alcoxicarbonilo ^uilcarbonilo de C1.12, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, aril teroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonil Dno y di(alquilo de Ci.6)-amino, carbamoilo, mono y di(alquilo de Ci rbonilo, amino-alquilo de Ci.6-aminocarbonilo, mono y di(alqui imino-alquilo de Ci-6-aminocarbonilo, alquilo de Ci-6-carb irales, los grupos asimétricos pueden ser encontrados en cualqu entación R o S, por ejemplo, dos isómeros estereoquímicos d luyen las isoformas beta-D y alfa-L, que pueden ser ilustradas co Unidades LNA de especificas de ejemplo se muest uiente (en el Esquema 2): ESQUEMA 2 El término "tio-LNA" comprende un nucleósido bloque l Y en la fórmula general anterior se selecciona de S o -CH2-S-. de estar tanto en la configuración beta-D como en la alfa-L.

El término amino-LNA" comprende un nucleósido bloq ual Y en la fórmula general anterior se selecciona de -N(H)-( N( )-, y -CH2-N(R)- donde R se selecciona de hidrógeno y alquilo d ino-LNA puede estar tanto en la configuración beta-D como en la El término "oxi-LNA" comprende un nucleósido bloque l Y en la fórmula general anterior representa - O-. El oxi-LNA pu to en la configuración beta-D como en la alfa-L.

El término ???" comprende un nucleósido bloqueado n la fórmula general anterior es -CH2-0- (en donde el átomo de o 2-O- se una a la posición 2' con relación a la base B). Re es hi tilo. o más enzimas o complejos del ARNse, tales como endo-rib asa), tal como RNasa H.

Típicamente, el oligómero, comprende una región nos 6, tal como por lo menos 7 monómeros contiguos, tal co nos 8 o por lo menos 9 monómeros contiguos, incluyendo 7, 8, , 13, 14, 15 o 16 monómeros contiguos, que, al formar un dúpl ión diana del ARN diana, es capaz de reclutar RNasa. La r omero que es capaz de reclutar ARNse puede ser la región B, ce referencia en el contexto de un gapmer como se describe unas modalidades, la región del oligómero que es capaz d Nse, tal como la región B, consiste de 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 1 o 20 monómeros.

La EP 1 222 309 proporciona métodos in vitro para dét tividad de RNasaH, que puede ser utilizada determinar la capaci ociología proporcionada por los Ejemplos 91 - 95 de EP 1 orporada aquí para referencia.

En algunas modalidades, un oligómero se juzga esen apaz de reclutar RNasaH si, cuando es contactado con la reg plementaria de la diana de ARN, y de RNasaH, la velocidad asaH, medida en pmoles/l/min, es menor que 1 %, tal como meno como menor que 10% o menor que 20% de la velocidad inicial dé ando un oligonucleotido que tiene la misma secuencia de ba iteniendo solamente monómeros de ADN, sin sustituciones 2 ipos de enlace de fosforotioato entre todos los monómer jonucleótido, usando la metodología proporcionada por los Eje de la EP 1 222 309.

En otras modalidades, un oligómero se juzga capaz d asaH si, cuando es contactado con la región diana complement Típicamente, la región del oligómero que forma el dú gión diana complementaria del ARN diana y es capaz de reclu ntiene monómeros de ADN y opcionalmente monómeros de LAN dúplex similar a ADN/ARN con la región diana. Los monómer tán preferiblemente en la configuración alfa-L, siendo parti eferida la alfa-L-oxi-LNA.

En diversas modalidades, el oligómero de la mprende tanto nucleósidos como análogos de nucleósido, y rma de un gapmer, un headmer o un mixmer.

Un "headmer" es definido como un oligómero que \a región X y una región Y que es contigua a la misma, con el ás 5' de la región Y enlazado al monómero más 3' de la región X comprende un estiramiento contiguo de análogos de nucl clutamiento no de RNasa y la región Y comprende un estiramient estiramiento contiguo de análogos de nucleósido de reclutami asa.

Otros oligómeros "quiméricos", llamados "mixmers", c a composición alternada de (i) monómeros de ADN o mon álogos de nucleósido reconocibles y disociables por la RNas onómeros de análogos de nucleósido de reclutamiento no de RNa En algunas modalidades, además de mejorar la a igómero para la región diana, algunos análogos de nucleósid edian la unión y disociación de la RNasa (por ejemplo, RNasaH). onómeros -L-LNA reclutan la actividad de la RNasaH hasta ciert junas modalidades, las regiones de espacio (por ejemplo, Is regi referido aquí) de los oligómeros que contienen monómero insiste de menos monómeros reconocibles y disociables por la introduce más flexibilidad en la construcción del mixmer. r anticuerpos para una proteína diana. Los polímeros típicos p lietilenglicol.

Por consiguiente, aquí se proporcionan conjug mprenden un oligómero como se describe aquí, y por lo menos u njugada que no es un ácido nucleico o un monómero, unido coval icho oligómero. Por lo tanto, en ciertas modalidades donde el oli invención consiste de monómeros contiguos que tienen una pecificada de bases, según lo divulgado aquí, el conjugado pued mprender por lo menos una porción de conjugado que e valentemente al oligómero.

En diversas modalidades de la invención, el oligó njugado a porción que aumenta la absorción celular de c goméricos. La WO2007/031091 proporciona los ligandos y c arciones) adecuados, la cual se incorpora así para referencia. lietilenglicol, un ácido acético de adamantano, una porción de pal adecilamina o una porción de hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

En ciertas modalidades, los oligómeros de la invenc jugados a sustancias de fármaco activo, por ejemplo, a a profeno, a un fármaco de sulfa, a un anti-diabético, a un antibact antibiótico.

En ciertas modalidades la porción conjugada es un mo colesterol.

En diversas modalidades, la porción conjugada co nsiste de un polímero positivamente cargado, tal como u sitivamente cargado, por ejemplo de 1 -50, tal como de 2 - 20, ta 10 residuos de aminoácidos en longitud, y/o óxido de polialquilen lietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol - véase la WO 200 orporada así para referencia. Convenientemente el polímero posi r d J_. 5 -OLIGÓME 5'-OLIGÓMERO-3' Oliqómeros activados El término "oligómero activado," como se usa aquí, se oligómero de la invención que está enlazado covalentemente ( ionalizado) a por lo menos una porción funcional que permite alenté del oligómero a una o más porciones conjugadas, iones que no son en sí mismas ácidos nucleicos o monóme ar los conjugados descritos aquí. Típicamente, una porción renderá un ru uímico u s c hn Wiley & Sons, 1999). Ejemplos de grupos protectores de cuados incluyen ésteres tales como éster de acetato, grupos s como bencilo, difenilmetilo, o trifenilmetilo, y tetrahidropiranilo. grupos protectores de amino adecuados incluyen bencilo, alfa-m nilmetilo, trifenilmetilo, benciloxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, y l los tales como tricloroacetilo o trifluoroacetilo.

En algunas modalidades, la porción funcional es auto- otras modalidades, la porción funcional es biodegradables. mplo, la Patente de E.U.A. No. 7,087,229, que se incorporada erencia en su totalidad.

En algunas modalidades, los oligómeros de la invenc ivados (es decir, funcionalizados) en el extremo 5' para permiti alente de la porción conjugada al extremo 5' del oligómero. )dalidades, los oligómeros de la invención pueden estar funcional extremo 3'. En aún otras modalidades los oli ómeros de la dalidades, los oligómeros activados de la invención son sinteti nómeros que no han sido funcionalizados, y el oligómero es func n la terminación de la síntesis.

En algunas modalidades, los oligómeros están funci n un éster impedido que contiene un enlazador de aminoalquilo, porción alquilo tiene la fórmula (CH2)W, en donde W es un entero 1 a 10, preferiblemente aproximadamente 6, en donde la porción upo alquilamino puede ser una cadena lineal o una cadena ramifi nde el grupo funcional está unido al oligómero vía un grupo éster H2)WNH).

En otras modalidades, los oligómeros están funcionali i éster impedido que contiene un enlazador (CH2)w-sulfhidrilo, en i un entero que varía de 1 a 10, preferiblemente aproximadam >nde la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser una cade blícación del PCT No. WO 2008/034122 y los ejemplos en la mis incorpora aquí para referencia en su totalidad.

Los oligómeros activados enlazados covalentement eños una porción funcional pueden sear sintetizados por cualqui nocido en la técnica, y particularmente, por los métodos divulg blicación de Patente de E.U.A. No. 2004/0235773, la cual se inco ra referencia en su totalidad, y en Zhao et al., (2007) J. Controlle 9: 143-152; y Zhao et al., (2005) Bioconjugate Chem. 16:758-766.

En aún otras modalidades, los oligómeros de la inv ncionalizados introduciendo grupos sulfhidrilo, amino o hidro gómero por medio de un reactivo de functionalización substa mo se descrita en la Patente de E.U.A. No. 4,962,029 y 4,914,21 reactivo substancialmente lineal que tiene una fosforamidita en lazado a través de una cadena separadora hidrofílica al extrem ención es funcionalizado con más de uno de los rea ctionalización como se describe en las Patentes de E.UA No. 4, 14,210, incorporadas aquí para referencia en su totalidad. Los tesis de dichos reactivos de functionalización y de incorporaci ismos dentro de monómeros u oligómeros se divulga en las P UA No. 4,962,029 y 4,914,210.

En algunas modalidades, el extremo 5' de un oligóme a fase sólida es funcionalizado con un derivado de dienil fos guido por la conjugación del oligómero desprotegido con, por ej ninoácido o un péptido vía una reacción de cicloadición de Diels-A En diversas modalidades, la incorporación de los je contienen modificaciones de 2'-azúcar, tales como una azúcar >n 2'-carbamato o una azúcar 2'-(0-pentil-N-ftalimido)-desoxirib gomero facilita la unión covalente de las porciones conjuga anina, o en las posiciones N4 o 5 de la citosina. En diversas mo ha funcionalización puede ser conseguida usando una reactivo e ya está funcionalizado en la síntesis del oligómero.

Algunas porciones funcionales están disponibles en el r ejemplo, porciones enlazantes heterobifuncionales y homobif tán disponibles de Pierce Co. (Rockford, III.). Otros grupos rea ponibles comercialmente son los reactivos C6 modificador de odificador de 3'-amino, ambos disponibles de Glen Research terling, Va). El C6 modificador de S'-amino está también disponi Applied Biosystems Inc., Foster City, California) como Aminoü odificador de 3'-amino también está disponible de Clontech Labor 'alo Alto, Calif).

Composiciones bién es así incorporada para referencia. Los detalles de las téc formulación y la administración también pueden ser encontra ima edición de "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE blishing Co., Easton Pa.).

En algunas modalidades, un oligómero de la inve lazado covalentemente a una porción conjugada para ayu ministro del oligómero a través de las membranas celulares. Un e a porción conjugada que ayudas en el suministro del oligómero a membranas celulares es una porción lipofílica, tal como cole ersas modalidades, un oligómero de la invención se formul mulaciones de lípido que forman liposomas, tales como Lipofecta Lipofectamine RNAiMAX, ambos disponibles comercialmente de I i algunas modalidades, los oligómeros de la invención se formula zcla de una o más moléculas pequeñas de origen no natural s " " Como se usa aquí, el término "sales farmacé eptables" se refiere a las sales que retienen la actividad biológic los oligómeros aquí identificados y exhiben niveles aceptables icos indeseados. Ejemplos no limitativos de dichas sales puede n aminoácidos orgánicos y sales de adición básicas formadas co tálicos tales como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, alumi balto, níquel, cadmio, sodio, potasio, y similares, o con un catió amonio, ?,?-dibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetil lendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b); por ejemplo, una sal zinc o similares.

En ciertas modalidades, las composiciones farmac uerdo con la invención comprenden otros ingredientes activos a oligómero o conjugado de la invención, incluyendo agentes act ra el tratamiento de cáncer, miopatías y/o asma.

La invención también proporciona un kit de partes en mera parte comprende por lo menos un oligómero, conjuga mposición farmacéutica de acuerdo con la invención y otra parte o o más agentes activos (por ejemplo docetaxel) útiles para el t cáncer, miopatias y/o asma. Por lo tanto se concibe que el kit ede ser usado en un método de tratamiento, según lo referido a método comprende administrar tanto la primera parte com licional, simultáneamente o una después de la otra.

Aplicaciones El término "tratamiento" como se usa aquí se refier itamiento de una enfermedad existente (por ejemplo, una enferm istorno según lo referido en lo siguiente), como a la prevenci fermedad, es decir, profilaxis. Por lo tanto será reconocido que, " " ímales experimentales, facilitando así el análisis funcional de la di oración de su utilidad como una diana para la intervención terapé En ciertas modalidades, los oligómeros pueden ser util diagnóstico detectar y/o cuantificar la expresión de la Hsp27 en dos por transferencia Northern, hibridación "in-situ" o técnicas sim En diversas modalidades terapéuticas, un animal no humano sospechoso de tener una enfermedad o un trastorno q tratado al modular la expresión de Hsp27, es tratado al admin ntidad efectiva de un oligómero de acuerdo con esta inve porcionan además métodos para tratar a un mamífero, tal como n humano, sospechoso de tener o de ser propenso a una enfe ndición, asociada con la expresión de Hsp27, al administrar un apéutica o profilácticamente efectiva de uno o más de los ol njugados o composiciones de la invención. imposición farmacéutica de acuerdo con la invención a un cesidad del mismo (tal como un paciente en necesidad del mismo Indicaciones Médicas En ciertas modalidades terapéuticas, el trastorno que un trastorno hiperproliferativo (por ejemplo, cáncer), tal como óstata, cáncer de pulmón, leucemia, cáncer gástrico, cáncer incer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer pancreátic últiple, tumores del cerebro, osteosarcomas del fibrosarcoma y gado. En diversas modalidades, el tratamiento de dicha enfe ?ndición de acuerdo con la invención se puede combinar con uno ros tratamientos contra el cáncer, tales como radioterapia, quimi riunoterapia.

En ciertas otras modalidades, el trastorno que se trat El término "anormal" como se usa aquí se refiere a presión (por ejemplo la para regulación aceleradora) del gen de a célula en comparación al nivel de expresión en una célula de e no tiene una enfermedad, un trastorno o una condición me u\.

En algunas modalidades, un oligómero, un conjug mposición de acuerdo con la invención puede ser usado para el t ? condiciones asociadas con la sobre-expresión (por ejemplo una ;eleradora) del gen de Hsp27.

En otras modalidades, la enfermedad o el trast Ociado con niveles anormales de una forma mutada de la Hsp27.

Los términos "mutación" y "forma mutada" como se us fieren a una variante del ácido nucleico de Hsp27 mostrada en 3: 137. Dicha variante puede estar asociada con una enfer stituidos y/o nucleótidos suprimidos; tal como no más que 15 n icionales y/o nucleótidos sustituidos y/o nucleótidos suprimido al de SEQ ID NO: 137.

La Hsp27 es una pareja de unión de numerosos polip p27 puede actuar como una chaperona al unir las proteínas de ra traficar en cualquier vía de repliegue o vías de degradaci emplos de polipéptidos cuyas Hsp27 se pueden unir a, incluyen <\XX, F-actin, citocromo c, caspase-3, Akt1 , AR, ???a, FAS y tersas modalidades, la invención se refiere a los métodos para presión de un gen que codifica un polipéptido capaz de unirse a i otras modalidades, la invención se refiere a los métodos para tividad de un polipéptido capaz de unirse a la Hsp27. E Ddalidades, la unión de la Hsp27 a un polipéptido resulta en la exp tividad aumentada del gen que codifica el polipéptido al cual En diversas modalidades, la invención se dirige a un amiento de un mamífero que sufre o que es susceptible a una ciada con niveles anormales de ARNm de Hsp27 o de prot prende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente e oligómero de la invención, o un conjugado del mismo, que compr ás monómeros de LNA.

Un aspecto interesante de la invención está dirigido al omero (compuesto) como se define aquí o de un conjugado ine aquí para la preparación de un medicamento para el tratamien dición según lo divulgado aquí anteriormente.

En diversas modalidades, la invención abarca un mé veir o tratar una enfermedad que comprende administrar una péuticamente efectiva de un oligómero de acuerdo con la inven jugado del mismo, a un animal no humano o a un humano en En diversas modalidades, la invención está dirigida a ra tratar niveles anormales de la Hsp27, el método comprende oligómero de la invención, o un conjugado o una composición far l mismo, a un animal (tal como un paciente) en necesidad tamiento, y comprende además opcionalmente la administraci ente quimioterapéutico. En algunas modalidades, el limioterapéuttco está conjugado al oligómero, está presen imposición farmacéutica, o se administra en una formulación sepa La invención también se refiere a un oligómer imposición o a un conjugado según se define aquí para uso sdicamento.

La invención se refiere además al uso de un mposición, o conjugado según se define aquí para la fabricac ^dicamento para el tratamiento de niveles anormales de Hsp2 En ciertas modalidades, los métodos de la invención s a el tratamiento o la profilaxis contra las enfermedades causad eles anormales de Hsp27.

En algunas modalidades, la invención se dirige a un mé tar niveles anormales de Hsp27, dicho método comprende admi omero de la invención, o a un conjugado de la invención posición farmacéutica de la invención a un animal (tal como un necesidad del mismo.

Más aún, la invención se refiere a un método para imal (tal como un humano) que sufre de una enfermedad dición tal como ésas referidas aquí.

Un animal (tal como un paciente) que está nece tamiento es un animal (tal como un paciente) que sufre o es pro rirá la enfermedad o el trastorno. apéuticos, formulaciones de pro-fármacos, adecuadas, ta porcionan en la WO2007/031091 - la cual se incorpora asi para r La invención también proporciona una composición far e comprende un oligómero o un conjugado como se describe uyente, portador o adyuvante farmacéuticamente acept 2007/031091 proporciona diluyentes, portadores y a macéuticamente aceptables adecuados y preferidos - la cual se i para referencia.

Modalidades Las siguientes modalidades de la invención pueden se mjuntamente con las otras modalidades descritas aquí. 1. Un oligómero de entre 10 - 30 nucleótidos en lo emprende una secuencia de nucleótidos contigua de un total de en 3. El oligómero de acuerdo con la modalidad 1 o 2, e cuencia de nucleótidos contigua no comprende malapareami mero o no más de uno o dos malapareamientos con el co erso de la región correspondiente de 137. 4. El oligómero de acuerdo con cualquiera de las mod 3, en donde la secuencia de nucleótidos del oligómero cons cuencia de nucleótidos contigua. 5. El oligómero de acuerdo con cualquiera de las mod 4, en donde la secuencia de nucleótidos contigua está entr jcleótidos de longitud. 6. El oligómero de acuerdo con cualquiera de las mod 5, en donde la secuencia de nucleótidos contigua comprende a icleótido. 7. El oligómero de acuerdo con la modalidad 6, en 10. El oligómero de acuerdo con cualquier de las mod , que inhibe la expresión del gen deHsp27 o del ARNm en una é expresando el gen de Hsp27 o el ARNm. 1 1. El oligómero de acuerdo con cualquiera de las mod 0 que se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 29, 2, 133, 134, 135 y 136. 12. Un conjugado que comprende el oligómero de ac alquiera de las modalidades 1 a 11 , y por lo menos una porc cleótido o no de polinucleótido unida covalentemente a dicho oligó 13. Una composición farmacéutica que comprende el acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 10, o el conj uerdo con la modalidad 12, y un diluyente, portador, sal o macéuticamente aceptable. 14. El oligómero de acuerdo con cualquiera de las mod posición farmacéutica de acuerdo con la modalidad 13, a un pac re de, o que es probable que sufra de cáncer, miopatías y asma. 17. Un método para la inhibición de la Hsp27 en una c á expresando la Hsp27, dicho método comprende administrar un acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 11 , o un conj erdo con la modalidad 12 a dicha célula para inhibir la Hsp27 la.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis del Monómero Los bloques y los derivados de construcción del mon EJEMPLO 2 Síntesis de oliqonucleótidos Los oligonucleótidos (oligómeros) fueron sintetizados n el procedimiento descrito en WO07/031081. El Cuadro mplos de motifs del oligonucleótido antisentido y de la invención.

EJEMPLO 3 Diseño de los oligonucleótidos De acuerdo con la invención, una serie de oligo ligómeros) fue diseñada para dirigirse a diferentes regiones de >p27 humano usando la secuencia publicada, número de snBank NM_001540, presentadas aquí como SEQ ID NO: 137 (Fi SEQ ID NO: 4 GAGATGTAGCCATG SEQ ID NO: 5 AGATGTAGCCATGC SEQ ID NO: 6 GATGTAGCCATGCT SEQ ID NO: 7 GAGATGTAGCCAT SEQ ID NO: 8 AGATGTAGCCATG SEQ ID NO: 9 GATGTAGCCATGC SEQ ID NO: 10 ATGTAGCCATGCT SEQ ID NO: 1 1 GAGATGTAGCCA SEQ ID NO: 12 AGATGTAGCCAT SEQ ID NO: 13 GATGTAGCCATG SEQ ID NO: 14 ATGTAGCCATGC SEQ ID NO: 15 TGTAGCCATGCT SEQ ID NO: 16 ACGGTCAGTGTGCCCT SEQ ID NO: 17 ACGGTCAGTGTGCCC SEQ ID NO: 18 CGGTCAGTGTGCCCT SEQ ID NO: 19 ACGGTCAGTGTGCC SEQ ID NO: 20 CGGTCAGTGTGCCC SEQ ID NO: 21 GGTCAGTGTGCCCT SEQ ID NO: 29 1 GTCAGTGTGCCC SEQ ID NO: 30 TCAGTGTGCCCT 1 SEQ ID NO: 31 CGTGTATTTCCGCGTG i SEQ ID NO: 32 1 CGTGTATTTCCGCGT SEQ ID NO: 33 1 GTGTATTTCCGCGTG SEQ ID NO: 34 1 CGTGTATTTCCGCG SEQ ID NO: 35 1 GTGTATTTCCGCGT SEQ ID NO: 36 1 TGTATTTCCGCGTG SEQ ID NO: 37 1 CGTGTATTTCCGC SEQ ID NO: 38 1 GTGTATTTCCGCG SEQ ID NO: 39 TGTATTTCCGCGT 1 SEQ ID NO: 40 1 GTATTTCCGCGTG SEQ ID NO: 41 CGTGTATTTCCG 1 SEQ ID NO: 42 1 GTGTATTTCCGC SEQ ID NO: 43 1 TGTATTTCCGCG SEQ ID NO: 44 GTATTTCCGCGT 1 SEQ ID NO: 45 1 TATTTCCGCGTG SEQ ID NO: 53 GCGTGGCTAGCTT SEQ ID NO: 54 CGTGGCTAGCTTG SEQ ID NO: 55 GTGGCTAGCTTGG SEQ ID NO: 56 TGCGTGGCTAGC SEQ ID NO: 57 GCGTGGCTAGCT SEQ ID NO: 58 CGTGGCTAGCTT SEQ ID NO: 59 GTGGCTAGCTTG SEQ ID NO: 60 TGGCTAGCTTGG SEQ ID NO: 61 ATGGTGATCTCGTTGG SEQ ID NO: 62 ATGGTGATCTCGTTG SEQ ID NO: 63 TGGTGATCTCGTTGG SEQ ID NO: 64 ATGGTGATCTCGTT SEQ ID NO: 65 TGGTGATCTCGTTG SEQ ID NO: 66 GGTGATCTCGTTGG SEQ ID NO: 67 ATGGTGATCTCGT SEQ ID NO: 68 TGGTGATCTCGTT SEQ ID NO: 69 GGTGATCTCGTTG SEQ ID NO: 78 TTTTGCAGCTTCTGG SEQ ID NO: 79 ATTTTGCAGCTTCT SEQ ID NO: 80 TTTTGCAGCTTCTG SEQ ID NO: 81 TTTGCAGCTTCTGG SEQ ID NO: 82 ATTTTG C AG C TTC SEQ ID NO: 83 TTTTGCAGCTTCT SEQ ID NO: 84 TTTGCAGCTTCTG SEQ ID NO: 85 TTGCAGCTTCTGG SEQ ID NO: 86 ATTTTGCAGCTT SEQ ID NO: 87 TTTTGCAGCTTC SEQ ID NO: 88 TTTGCAGCTTCT SEQ ID NO: 89 TTGCAGCTTCTG SEQ ID NO: 90 TGCAGCTTCTGG SEQ ID NO: 91 GGCACAGCCAGTGGCG SEQ ID NO: 92 GGCACAGCCAGTGGC SEQ ID NO: 93 GCACAGCCAGTGGCG SEQ ID NO: 94 GGCACAGCCAGTGG SEQ ID NO: 103 CACAGCCAGTGG SEQ ID NO. 104 ACAGCCAGTGGC SEQ ID NO: 105 CAGCCAGTGGCG SEQ ID NO: 106 TATCAAAAGAACACAC SEQ ID NO. 107 TATCAAAAGAACACA SEQ ID NO: 108 ATCAAAAGAACACAC SEQ ID NO: 109 TATCAAAAGAACAC SEQ ID NO: 1 10 ATCAAAAGAACACA SEQ ID NO: 11 1 TCAAAAGAACACAC SEQ ID NO: 112 TATCAAAAGAACA SEQ ID NO: 113 ATCAAAAGAACAC SEQ ID NO: 114 TCAAAAGAACACA SEQ ID NO: 115 CAAAAGAACACAC SEQ ID NO: 116 TATCAAAAGAAC SEQ ID NO: 1 17 ATCAAAAGAACA SEQ ID NO: 1 18 TCAAAAGAACAC SEQ ID NO: 119 CAAAAGAACACA CUADRO 2 Motifs de Secuencia de 24 mere Cuadro 3: Diseños del oliqonucleótido de la invención En la SEQ ID NO: 129-136, las letras mayúsculas i Dnómeros análogos de nucleótido (nucleosido) (por ejemplo mon D-oxi-LNA) y el subíndice "s" representa los grupos de CUADRO 3 Diseños de Oligómeros EJEMPLO 4 Modelo in vitro: Cultivo celular El efecto de los oligonucleótidos antisentido en la ex ana se exprese en el tipo de células elegido. Las células fueron el medio apropiado como se describe en lo siguiente y manteni 95-98% de humendad y 5% de C02. Las células fueron ruti sadas 2-3 veces por semana.

A549 La línea celular A549 de cáncer de pulmón humano fu DMEM (sigma) + 10% se suero bovino fetal (FBS) + Glutamax sntamicina (25 µg/ml).

PC3 La línea celular PC3 de cáncer de próstata humano fu ? DMEM (sigma) + 10% de suero bovino fetal (FBS) + Glutama ?ntamicina (25 µg/ml). s 16 nM de concentración final. La formulación de los co gonucleótido-lípido fue realizada esencialmente como se descri ricante usando OptiMEM sin suero (Gibco) y una concentració ido de 5 9/??? LipofectAMINE 2000. Las células fueron incubad r 4 horas y el tratamiento fue detenido por eliminación del medio e contenía el oligonucleótido. Las células fueron lavadas y se añ e contenia suero. Después del tratamiento con el oligonucl rmitió a las células recuperarse por 20 horas antes de ser cosech análisis de ARN.

EJEMPLO 6 Modelo in vitro: Extracción de ARN y síntesis de ADNc Para el aislamiento de ARN de las líneas celulares, lo. Después de enfriar las muestras en hielo, se añadieron a cad l 10x de Amortiguador RT, 1 µ? de Transcriptasa Inversa MMLV ( .25 µ? -de inhibidor de RNasa (10 U/µ?), seguido por incubación a min, inactivación por calor de la enzima a 95°C por 10 minutos y uestra fue enfriada a 4°C.

EJEMPLO 7 odelo in vitro: Análisis de la inhibición por el oligonucleótid expresión de Hsp27 por PCR en Tiempo Real La modulación antisentido de la expresión del ARNm de ser ensayada en una variedad de formas conocidas en la té mplo, los niveles del ARNm de Hsp27 pueden ser cuantificado mplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de p Análisis PCR Cuantitativo en Tiempo Real de los Nm de Hsp27 El contenido de ÁRNm de Hsp27 humano en las mu antificado usando el Reactivo de Ensayo TaqMan Pre-Desarrolla 1 humano de Hsp27 (Applied Biosystem cat. no. Hs03044 uerdo con las instrucciones del fabricante.

Se uso una cantidad de ARNm de la gliceraldehído shidrogenasa (GAPDH) como control endógeno para normaliza riación en la preparación de muestras. El contenido en la m ¾Nm de GAPDH humano fue cuantificado usando el Reactivo iqMan Pre-Desarrollado Prisma GAPDH ABI (Applied Biosyste 0884E) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El PCR cuantitativo en tiempo real es una técnica bie la técnica y se enseña, por ejemplo, en Heid et al., Real Time q - e analizada por triplicado. Se generaron curvas patrón al ensayar 2 veces de un ADNc que había sido preparado de material purific ea celular que expresaba el ARN de interés. Se usó H20 estéril Nc para el control no de molde. Programa de PCR: 95°C por 30 guido por 40 ciclos de 95°C, 3 segundos, 60°Ct 30 segu ntidades relativas de la secuencia del ARNm diana fueron deter ío de Umbral calculado usando el software Fast System S 3.1.21 de Applied Biosystems.

EJEMPLO 8 nálisis in vitro: Inhibición antisentido de la expresión de Hsp2 por los oligonucleótidos Los oligonucleótidos presentados en el Cuadro lu sina en los monómeros de LNA son 5-metilcitosina. El subi resenta el enlace de fosforotioato.

CUADRO 4 Q ID del SEQ ID (% mpuesto No: del Secuencia (S'-Z9) de pecífico oligómero m Q ID SEQ ID : 138 NO: 129 GsAsGsasts9stsas9scscsastsGscsT 78 Q ID SEQ ID : 139 NO: 130 AscsGs9stscsas9sts9sts9scsCscsT 79 Q ID SEQ ID : 140 NO: 131 csGsTs9stsastststscscs9scsGsTsG 78 Q ID SEQ ID : 141 NO: 1 32 TsGsCs9sts9s9scstsas9scstsTsGsG 93 Q ID SEQ ID : 142 NO: 133 AsTsGs9sts9sastscsts9scstsTsGsG 79 Q ID SEQ ID : 143 NO: 134 AsTsTststs9scsas9scststscsTsGsG 79 onucleótido antisentido ilustradas, por ejemplo variando la lon ta o más larga) y/o el contenido de la nucleobase (por ejemplo el porción de las unidades análogas), que también proporcionan ibición de la expresión del ARNm de Hsp27.

EJEMPLO 9 Medición de las células viables proliferadas Las células PC3 fueron sembradas a una densidad d lulas por pozo en una placa de 6 pozos en 2ml de medio DME 671 ) + Glutamax I 2mM (Gibco 35050-038) + 10% FBS 93575010) + 25 µg/µl de gentamicina (sigma G 397 50 mg/ml) el la transfección. El día siguiente las células fueron transfectada scribe en el Ejemplo 5. Las concentraciones finales del oligo rna; MTS] y una reactivo de acoplamiento de electrón (etos azina; PES) (Ensayo de Proliferación Celular Ce!ITiter96® AQ ution, Promega). Las células viables fueron medidas a 490 n erwave (Biotek Instruments). El OD490 nm fue trazado contra ase la Figura 2).

EJEMPLO 10 eparación de un conjugado de las SEQ ID NO: 129, 130, 131 , 1 134, 135 y 136 y polietilenqlicol Un oligómero está funcionalizado en el extremo 5' po aminoalquilo, tal como hexan-1 -amina bloqueada con un queo tal como Fmoc al grupo S'-fosfato del oligómero usando q foramidita de rutina, oxidando el compuesto resultante, desprote Una solución de PEG activado, tal como la que se mue en donde la porción PEG tiene un peso molecular pr ,000, y el compuesto de fórmula (I) en el amortiguador PBS s peratura ambiente por 12 horas. La solución de reacción es ext es con cloruro de metileno y las capas orgánicas combinadas s re sulfato de magnesio y se filtraron extraídos y el solvente s o presión reducida. El residuo se disolvió en agua doblemente d cargó sobre una columna de intercambio aniónico. El enlazado 5 -OLIGÓMER (III) en donde el oligómero (por ejemplo, SEQ ID NO: 129, 2, 133, 134, 135 y 136) está unido a un polímero PEG que tien lecular promedio de 12,000 vía un enlazador liberable.

EJEMPLO 11: Determinación de la ICso El procedimiento experimental usado es como se teriormente en los Ejemplos 4, 5, 6 y 7. Los seis oligómeros Hsp Dbados tienen una IC50 < 4 nM en ambas líneas celulares A549 ( h cuando se incubó con plasma de ratón a 37°C h. Para los oligó 132, una banda más débil apareció después de 24-48 h, que li pecialmente prominente después de 120 h. Metodología: Plasm asma de heparina de litio de BomTac: ratones NMRI, recolectad , Taconic Europe) fue descongelado y tomado en alícuotas en tub de plasma/tubo. Después, 5 µ? de oligómero (200 µ?) fue añadid de plasma a una concentración final de 20 µ?. Después d rfectamente, las muestras fueron incubadas a 37°C por 0-120 erentes puntos de tiempo (Oh, 24ht 48h y 120h) las muestr colectadas y la reacción fue templada por congelación ultrarápi jestras en nitrógeno liquido. Para el análisis, las muestras fueron amortiguador de carga y analizadas por electroforesis en cuenciación PAGE bajo condiciones de desnaturalización. Los muestran en la Figura 6.

TA a 0.2 nM, NaP 20 mM, pH 7.0). La formación del dúplex fue el calentamiento de las muestras a 95°C por 3 min seg riamiento a temperatura ambiente por 30 min. Los valor peratura de fusión (Tm) fueron medidos en un espectrómetro d UV/VIS (Perkin Elmer) y los datos fueron recolectados y a ndo el software TempLab (Perkin Elmer). El instrumento fue pr a calentar la muestra del dúplex de oligómero de 20-95°C y luego estra a 25°C. Durante este procedimiento fue registrada la abso nm. Las curvas de la fusión fueron utilizadas para calcular los v La Tm de los oligómeros contra el ARN fue determinado (Cuad Q ID 129, 130, 131 , 132 y 135 tienen una Tm de aproximadame SEQ ID NO 136 tiene una Tm de 44.4X.

CUADRO 5 EJEMPLO 14 nálisis in vivo: Regulación lentificadora de HSP27 de ratón e después de la administración in vivo (i.v.) de los oligonucleót HSP27 Ratones hembra NMRI recibieron inyección i.v. gonucleótidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 129, 130 135 en tres días consecutivos a una dosificación de 25mg/kg. Lo ron sacrificados 24h después de la última dosis. El hígado fue al solución estabilizadora de RNA/ater hasta su uso. El ARN total fu l tejido del hígado y los niveles de ARNm de Hsp27 fueron anali qPCR (PCR cuantitativo). Los datos fueron comparados a la ex >p27 en animales de control tratados con solución salina. Los res jestran en la Figura 7. ron determinados en el suero sanguíneo, libre de glóbulos rojos, los ratones al momento del sacrificio. La actividad de la inotransferasa (ALT) y del aspartato-aminotransferasa (AST) en ón fue determinada usando un ensayo enzimático ALT (AB 1A01627 (ALT) o A1 1 A01629 (AST), Horiba ABX Diagnostics, F uerdo con la instrucción del fabricante pero ajustada al form zos. En breve, las muestras de suero fueron diluidas 2.5 veces sayadas por duplicado. Después de la adición de 50 µ? muestra ándar (multical de ABX Pentra, A1 A01652) a cada pozo, 200 µ? zcla de reactivo ALT fue añadida a cada pozo. Las mediciones ron realizadas a 340nm y 37°C por 5 minutos con un intervalo d tos fueron correlacionados a la curva patrón diluida 2 veces y los ron presentados como actividad ALT en U/L. Los resultados se las figuras 8 y 9. tándar con un intervalo de dosis, es decir, 0, 0.32, 0.63, 1.25, 2. micromolar, para los oligonucleótidos por un periodo de 1 a dio típico y el método de ensayo de la proliferación celular se de Ejemplo 9. En la ausencia de lipofección, las siguientes lineas ce mostraron una inhibición significativa a cualquier concentr onucleótido: 15PC3 (línea celular de cáncer de próstata), La ea celular humana de cáncer de próstata), A549 (una línea celul cáncer de pulmón), DLD-1 (una línea celular humana de cáncer 480 (una línea celular humana de adenocarcinoma de colon), 5 ea celular de melanoma humano), Calu-6 (una línea celular h rcinoma de pulmón), 22RV1 (una línea celular humana de car istata), y Hep3B (una línea celular humana de hepatoma). Las eas celulares exhibieron una inhibición de 20% a 70% de la pr lular concentraciones micromolares de 2.5 a 20 de SEQ ID NO: 1 ular humana de fibrosarcoma), Jimt (una línea celular hu rcinoma de mama), MB231 (una línea celular humana de adeno mama), HCC827R (derivado de la línea celular HCC827 de lmón), y 786-0 (una línea celular humana de cáncer de célul manas). Datos de ejemplo después de 7 días de cultivo celular se la Figura 10. Los cultivos de la célula de control que no fueron ex gomero que tenía la SEQ ID NO: 135 corresponden al 100% de e lular. Se aprecia que ambas líneas de cáncer de colon ens pondieron mientras que las tres lineas celulares de cáncer sayadas respondieron a la inhibición del crecimiento. Ex icinales de valoración con células HT1080 y las SEQ ID NO: ¡mostraron valores de IC50 para la inhibición del crecimiento de 2 ira los oligómeros que tenían la secuencia establecida en SEQ ID 3 micromolar para la SEQ ID NO: 131. En conclusión, el oligómero secuencia SE ID N d m i i i EJEMPLO 17 ultivo a largo plazo con el oligómero teniendo la secuencia d NO; 135 de modulación lentificadora del ARNm de HSP27 y p Se examinaron los efectos biológicos de la incu onucleótidos antisentido en el medio de cultivo celular, centraciones mayores del oligonucleótido (micromolares) com métodos de lipofección (nanomolar), se evaluó el tratamien lulas con estos compuestos con respecto a la modulación le na midiendo los niveles relativos del ARNm de HSP27 dian todos cuantitativos de la reacción en cadena de polimerasa en ti tándar incluyendo la medición de los genes de mantenimiento t PD para normalizar los datos. Las líneas celulares fueron cult cas de 6 pozos usando el medio comercial recomendado (A /ersas dosis de oli onucleótidos. El análisis RT-PCR fu con u ra la capacidad de los oligonucleótidos anti-HSP27 de la r tificadora de los niveles de ARNm y de proteína diana bajo cond ubación a largo plazo en la ausencia de lipofección o de otros a nsfección como se describe en el Ejemplo 15. Después de 1 a ltivo celular con el oligómero teniendo la secuencia de SEQ ID N intervalo de dosificación micromolar de 0 a 5, se midieron los Nm de HSP27 por PCR en tiempo real cuantitativo como se des mplo 7. La proteína HSP27 fue medida por inmunoen msferencia Western usando conjugados de peroxidasa de rába ; anticuerpo comercial contra HSP27 o proteínas de control incl i a-tubulina. La evaluación de la especificidad de la modulación le íl HSP27 por el oligómero teniendo la secuencia de SEQ ID N aliza evaluando los efectos de los oligonucleótidos me alapareados.

Las Fi uras 1 1A 1 1 B muestran la modulación l ARNm de HSP27 pareció ser específico ya que un antisentido R3 faltó al desmontar el ARNm de HSP27. En conclusión, la inc gonucleótidos antisentido a base de LNA en cultivos celulares ulares de tumor, puede exhibir una reducción dependiente d pecífica de secuencia en los niveles del ARNm de HSP27 y proteí EJEMPLO 18 fectos de la combinación de los oliqonucleótidos a base de L HSP27 más TNFa en el crecimiento celular Se investigaron numerosas líneas celulares para la ca oligonucleótidos anti-HSP27 de inhibir el crecimiento celular mbinaron con otros agentes citotóxicos bajo condiciones de inc go plazo en la ausencia de lipofección u otros agentes de transfec tuvieron resultados similares cuando las células fueron tratadas \ oligómero teniendo la secuencia de SEQ ID NO: 135 simultánea ías. Se reportó que la HSP27 participó en las vías de señali eptor de muerte y estos resultados soportan la función propu P27 en la modulación de esta vía.

Por lo tanto, los oligonucleótidos anti-HSP27 pu lizados terapéuticamente en combinación con una variedad de nvencionales - ejemplos son TRAIL, 5-fluoruracilo, vincristina, do camptotecina. Otras combinaciones pueden incluir el gonucleótidos anti-HSP27 como un sensibilizador de la radia mbinación con diversos anticuerpos anticáncer o moléculas irticularmente donde ha ocurrido resistencia a estos agentes. En c > funciones de la HSP27 chaperona pueden juegar un pa sistencia a la actividad citotóxica de muchas terapias y las EJEMPLO 19 Efectos Anti-tumor de los oligonucleótidos anti-HSP27 en m animales Dos modelos de tumor humano, PC3 (una linea celul cáncer de próstata) y DU-145 (una línea celular humana de stata), fueron investigados para la capacidad de los oligonucle P27 de demostrar la inhibición del crecimiento tumoral (TGI) en e noinjertos en ratones. En el primer estudio, fueron establecido bcutáneos de PC3 en ratones desnudos atímicos y después or alcanzó un volumen de aproximadamente 100 mm3, se admi ones cualquiera de 3, 10, 30, o 100 mg/kg de dosis intravenosas eo oligonucleótidos, SEQ ID NO: 129, 130, 131 , 132, y 135. El r sificación fue cada tercer día para cuatro dosis totales. L observó un 40% de TGI en el día 29 con base en el volumen io (6 ratones por grupo) que sin embargo no consiguió sig dística en este estudio.

EJEMPLO 20 smontaje diana en Tumores por los oligonucleótidos anti-HS modelos animales Se investigó el modelo de tumor humano de PC3 ( lar humana de cáncer de próstata) para la capacidad onucleótidos anti-HSP27 de demostrar el desmontaje del AR teína diana en estudios de xenoinjerto en ratones. En este es ores subcutáneos de PC3 fueron establecidos en ratones icos y después de que el volumen del tumor alcanzó aproxim 3 R de tiempo real cuantitativo fue realizado como se describió en y la cuantificación de la proteína por inmunoensayos fue realizad scribió en el Ejemplo 17.

El ARNm de HSP27 en el tejido tumoral fue mod tificación por los oligómeros que tenían las secuencias establ Q ID NO: 131 y SEQ ID NO: 135 a la dosis tolerada máxima ( da compuesto, ya sea a 30 mg/kg o 100 mg/kg para el oligómer secuencias SEQ ID NO: 131 y SEQ ID NO: 135, respectivament ura 14). También se observó la modulación lentificadora de l P27 por ambos oligómeros (teniendo las secuencias estableci Q ID NO: 131 y SEQ ID NO: 135) con un desmontaje prom teína HSP27 en muestras múltiples del tumor de aproximada ces de reducción. El desmontaje del ARNm con el oligómero t cuencia de SEQ ID NO: 135 fue aproximadamente de 10 veces dalidades específicas preferidas, debe ser comprendido que la mo se reclama no debe ser indebidamente limitada a dichas m pecíficas. De hecho, diversas modificaciones de los modos des lizar la invención que son obvios para ésos expertos en bio logia molecular o campos relacionados pretenden estar dentro d las reivindicaciones siguientes.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1. - Un oligómero de entre 10 - 30 monómeros en Io mprende una primera región de secuencia contigua de un total de monómeros, en donde dicha secuencia contigua es por lo m éntica a una región que corresponde a un gen de Hsp27 de ma mplemento inverso de una región diana de un ácido nucleico q a Hsp27 de mamífero, tal como un gen de Hsp27 o un ARNm de I como un ácido nucleico que tiene la secuencia establecida en S 37, o una variante de origen natural del mismo. 2. - El oligómero de conformidad con la reivind aracterizado además porque la secuencia contigua es por lo m eferiblemente por lo menos 90%, homologa a una región corresp 4. - El oligómero de conformidad con cualquier vindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque la secuenci tá entre 10 - 18 monómeros en longitud. 5. - El oligómero de conformidad con cualquier vindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque la secuenci mprende análogos de nucleósido. 6. - El oligómero de conformidad con la reivindi racterizado además porque los análogos de nucleósido son n Ddificados en el azúcar, tales como nucleósidos modificados en leccionados del grupo que consiste de: Unidades de Acido Dqueadas (LNA); unidades 2'-0-alquil-ARN, unidades 2'-idades 2'-amino-ADN, y unidades 2'-fluoro-ADN; preferible álogos de nucleósido son LNA. 7. - El oligómero de conformidad con la reivindicaci racterizado además porque es un gapmer. 10. - Un conjugado que comprende el oligómero de cua reivindicaciones 1 a 9, y por lo menos una porción no de núcle polinucleótido unida covalentemente a dicho oligómero. 1 1. - Una composición farmacéutica que comprende el cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el conjugado de la reiv , y un diluyente, portador, sal o adyuvante farmacéuticamente ace 12. - El oligómero de cualquiera de las reivindicaciones njugado de la reivindicación 10, para usarse como un medica mo para el tratamiento de cáncer, miopatías y asma. 3. - El uso de un oligómero de cualquiera de las reivin a 9, o un conjugado como se definió en la reivindicación 1 Dricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, m ma. 14. - El uso de un oligómero de cualquiera de las reivin a 9, o un conjugado de la reivindicación 10, o una composición far