MX2009002933A - Metodos para incrementar la fermentabilidad de materia vegetal para producir etanol. - Google Patents

Abstract

La presente descripción provee métodos para incrementar la fermentabilidad para producir etanol a partir de materia vegetal, poniendo en contacto la materia con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar por lo menos una porción de proteínas zeína; la presente descripción provee también métodos para incrementar la digestibilidad de un co-producto de molienda poniendo en contacto una materia vegetal con una proteasa durante la molienda en seco o la molienda en húmedo.

Description

METODOS PARA INCREMENTAR LA FERMENTABILIDAD DE MATERIA VEGETAL PARA PRODUCIR ETANOL CAMPO DE LA INVENCION Esta descripción se refiere a métodos para incrementar la fermentabilidad de materia vegetal para producir etanol, así como a métodos para mejorar la calidad de productos y co-productos de molienda.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El etanol, llamado también alcohol etílico o alcohol de grano, es un líquido incoloro, volátil y flamable usado en soluciones, como un combustible, o como un solvente. El etanol es un producto de fermentación, una secuencia de reacciones ejecutadas bajo condiciones anaeróbicas. Se produce etanol a partir de almidón, un polímero de glucosa que es un azúcar de seis carbonos. El almidón es fermentado con levadura, que convierte los azúcares hasta etanol y dióxido de carbono. El etanol es entonces concentrado y destilado. Puede producirse etanol a partir de materia vegetal procesando la materia vegetal para exponer almidón, y convirtiendo el almidón hasta azúcares simples para fermentación. La materia vegetal puede ser procesada antes de la fermentación mediante molienda en húmedo o molienda en seco.

En la molienda en húmedo, la materia vegetal es sumergida en agua y ácido para separar lípidos, proteínas y almidones antes de la fermentación. En la molienda en seco, la materia vegetal entera (típicamente el grano feculento, por ejemplo, granos de maíz) es molida en harina sin que se separen las varias partes componentes antes de la fermentación. Los co-productos de la molienda en húmedo y la molienda en seco, incluyendo torta húmeda, grano de destilador desecado y harina integral de gluten, se usan generalmente como materiales de pienso para el ganado. Estos materiales de pienso para el ganado son altos en proteína y otros nutrientes, y constituyen un porcentaje significativo del pienso para el ganado vendido en los Estados Unidos. La cantidad de etanol que se produce a partir de materia vegetal puede depender de la cantidad y disponibilidad de almidón en la materia vegetal, las condiciones de molienda, el tipo de levadura usada, las condiciones de fermentación, y similares. En general, las variedades de plantas para su uso en la producción de etanol se seleccionan con base en la fermentabilidad de la variedad. De esta manera, sería deseable en la industria de producción de etanol incrementar la fermentabilidad, y de esta manera el rendimiento de etanol a partir de cualquier materia vegetal particular, o permitir una en la técnica que pronostique la fermentabilidad y/o el rendimiento de etanol a partir de una materia vegetal particular.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente descripción se refiere a métodos para incrementar el rendimiento de etanol y/o incrementar la digestibilidad de co-productos de molienda. La presente descripción se refiere además a métodos para analizar la fermentabilidad para producir etanol a partir de una materia vegetal, y procedimientos para producir etanol. En una modalidad, se provee ahora un método para incrementar la fermentabilidad y el rendimiento de etanol a partir de materia vegetal. El método comprende poner en contacto la materia vegetal con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar por lo menos una porción de las proteínas zeína en la materia vegetal. En otra modalidad, se provee también un método para incrementar la fermentabilidad y el rendimiento de etanol de maíz poco fermentable. El método comprende poner en contacto el maíz con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar proteínas zeína en el maíz. Se provee también un método para incrementar la digestibilidad de un co-producto de molienda. El método comprende poner en contacto una materia vegetal con una proteasa durante la molienda en seco o la molienda en húmedo. Se provee además un método para analizar una materia vegetal para fermentabilidad para producir etanol. El método comprende poner en contacto la materia vegetal con una cantidad efectiva de una proteasa para remover por lo menos una porción de proteínas hidrofóbicas en la materia vegetal, determinar la cantidad de proteínas zeína aún presentes en la materia vegetal, y predecir, con base en la cantidad de proteína zeína aún presente, la fermentabilidad para producir etanol a partir de la materia vegetal. Se provee además un método para producir etanol a partir de la materia vegetal. El método comprende poner en contacto la materia vegetal con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar por lo menos una porción de proteínas zeína durante la molienda en húmedo o la molienda en seco, y poner en contacto la materia vegetal con una levadura para convertir los almidones en la materia hasta etanol.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una superposición del análisis de espectros de masa de proteínas zeína totales de muestras de maíz diluidas cinco veces con solución de matriz como se describe en el ejemplo 1. Pueden distinguirse híbridos de alto rendimiento de etanol y de bajo rendimiento de etanol por la altura de los picos, en donde los híbridos de bajo rendimiento de etanol muestran picos más altos en cada uno de los marcadores de proteína zeína indicados. La figura 2 es una superposición de cromatogramas de RP-HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase invertida) que analizan proteínas zeína en híbridos de maíz de alto rendimiento de etanol y de bajo rendimiento de etanoi, como se describe en el ejemplo 1 . El híbrido de bajo rendimiento de etanoi demuestra áreas de picos más grandes a 66.7 minutos que el híbrido de alto rendimiento de etanoi. La figura 3 es una gráfica que muestra los resultados del rendimiento de etanoi de la adición de termolisina a muestras de maíz altamente fermentables como se describe en el ejemplo 2. La figura 4 es una gráfica que muestra los resultados del rendimiento de etanoi de la adición de termolisina a muestras de maíz poco fermentables como se describe en el ejemplo 2. La figura 5 es una gráfica que muestra el rendimiento de etanoi con la adición de niveles crecientes de proteínas zeína a muestras de maíz altamente fermentables como se describe en el ejemplo 3. La figura 6 es una gráfica que muestra el rendimiento de etanoi con la adición de proteínas zeína a muestras de maíz poco fermentables como se describe en el ejemplo 3. La figura 7 es una gráfica que muestra el rendimiento de etanoi después de la adición de 5 g de termolisina antes de la gelatinización de muestras de maíz poco fermentables como se describe en el ejemplo 4.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los métodos de la presente descripción pueden usarse para incrementar la producción de etanoi a partir de materia vegetal, y para mejorar la calidad de co-productos generados en la producción de etanol a partir de materia vegetal. Por consiguiente, en una modalidad, se provee ahora un método para incrementar la fermentabilidad para producir etanol a partir de materia vegetal. El método comprende poner en contacto la materia vegetal con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar por lo menos una porción de proteínas zeína. Como se describió anteriormente, el etanol es un producto de fermentación, una secuencia de reacciones ejecutadas bajo condiciones anaeróbicas. Se produce etanol a partir de almidón, un polímero de glucosa que es un azúcar de seis carbonos. Para producir etanol a partir de materia vegetal, la materia es procesada de modo que la porción de almidón es expuesta, y entonces el almidón es convertido hasta azúcares simples. Se añade levadura y, durante el procedimiento de fermentación de azúcar, los azúcares son convertidos hasta etanol y dióxido de carbono. El etanol es entonces concentrado y destilado. La cantidad de etanol producida puede depender de la cantidad y disponibilidad de almidón en la materia vegetal, las condiciones de molienda, la cepa de levadura usada, las condiciones de fermentación, etc. Como se usa en la presente, el término materia vegetal se refiere a materia de una planta individual, más que una planta, una variedad de planta, una clase de cultivo o una variedad de cultivo. Típicamente, dichas plantas comprenden variedades de cereales tales como, por ejemplo, maíz, trigo, cebada, arroz, centeno, avena, sorgo, milo o soya. La planta puede ser también caña de azúcar, remolacha, etc. La materia vegetal puede ser cualquier parte o porción de una planta que contiene almidón que pueda fermentarse a través de métodos convencionales de producción de etanol. Por ejemplo, pueden fermentarse partes de plantas tales como hojas, tallos, mazorcas, semillas y otra biomasa. La materia vegetal incluye también, pero no está limitada a, semillas y/o harina producida a partir de una planta. De manera Ilustrativa, granos de maíz pueden ser molidos hasta harina durante la molienda en seco antes de que sufran fermentación. De conformidad con la presente descripción, los solicitantes han descubierto que el nivel relativo de digestibilidad y/o fermentabilidad para producir etanol a partir de una variedad de planta individual, depende del grado de asociación entre la proteína y el almidón en la planta. En particular, se ha encontrado que una matriz de proteína altamente organizada característica que consiste de numerosos cuerpos de proteína fuertemente empacados, presionados contra amiloplastos, está presente en las células del endospermo de plantas de bajo rendimiento de etanol y baja digestibilidad. Las plantas con dichas características tienen células que son más difíciles de separar y de liberar su contenido, como granos de almidón individuales libres de proteína. Mientras que no es limitado por la teoría, se cree que la capacidad para resistir a la separación, o un mayor grado de asociación entre la proteína y el almidón, puede ser una limitación mayor sobre la digestibilidad y la producción económica de etanol a partir de fuentes vegetales, puesto que la disponibilidad de granos de almidón es reducida. Los inventores han descubierto que las propiedades químicas de las plantas, evaluadas usando análisis cromatográficos, muestran perfiles de elución de proteínas claramente diferentes para líneas de plantas altamente fermentables y poco fermentables. En particular, por ejemplo, como se muestra en las figuras 1 y 2, la microscopía ha revelado que proteínas específicas de las plantas tales como las zeínas, son altamente más abundantes en líneas de maíz poco fermentables en comparación con líneas de maíz altamente fermentables. Las proteínas zeína son hidrofóbicas y se encuentran unidas al almidón a través de la formación de enlaces no covalentes e interacciones hidrofóbicas. Por consiguiente, un mayor contenido de zeína puede desempeñar una función importante en el procedimiento de rendimiento de fermentación, tal como inhibir el procedimiento de fermentación limitando la disponibilidad de almidón. Las proteínas zeína contienen mayores cantidades de tioles y disulfuros respecto a otras proteínas; de esta manera, en una modalidad, la cuantificación de tioles y disulfuros en una muestra de proteína es un indicador de la cantidad de proteína zeína. La fermentabilidad puede depender de la cantidad de almidón expuesta en la materia vegetal para conversión enzimática. Los inventores han determinado que proteínas específicas de las plantas pueden desempeñar una función en la cantidad de almidón disponible para conversión. En particular, por ejemplo, proteínas vegetales tales como las proteínas zeína (incluyendo proteínas a-zeína, d-zeína y ?-zeína), son abundantes en los granos de maíz. Las proteínas zeína son hidrofóbicas y se unen al almidón a través de la formación de enlaces no covalentes e interacciones hidrofóbicas. Las proteínas zeína contienen también mayores cantidades de tioles y disulfuros respecto a otras proteínas. De esta manera, sin que sea limitado por una teoría en particular, se cree que las proteínas zeína previenen la disociación del almidón de las proteínas vegetales, resultando en menos almidón expuesto para conversión enzimática. Por consiguiente, los inventores han descubierto que puede incrementarse la fermentabilidad y puede mejorarse el rendimiento de etanol, hidrolizando por lo menos una porción de las proteínas hidrofóbicas de la materia vegetal. Por lo tanto, en una modalidad, el método de la presente descripción comprende poner en contacto materia vegetal con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar por lo menos una porción de proteínas zeína. Puede usarse cualquier proteasa adecuada para hidrolizar una proteína hidrofóbica. Por ejemplo, proteasas adecuadas incluyen aquellas seleccionadas del grupo que consiste de termolisina, Neutrase, SP709, Spezyme FAN, Alcalase, Savinase, Everlase, Esperase y Kannase. En una modalidad particular, la proteasa es termolisina. La termolisina es una endopeptidasa termoestable que hidroliza proteínas en interfases de proteína-membrana y proteína-carbohidrato. La termolisina hidroliza selectivamente los residuos de aminoácido hidrofóbicos, y de esta manera es ideal para la hidrólisis de las proteínas zeína. Sin embargo, otras proteasas o combinaciones de proteasas pueden usarse de conformidad con los métodos y procedimientos de la presente descripción. La proteasa puede usarse para remover proteínas zeína localizadas en la superficie y proteínas zeína asociadas con gránulos internos. En algunas modalidades, la remoción de por lo menos una porción de proteínas zeína localizadas en la superficie incrementa la fermentabilidad. Las proteínas zeína localizadas en la superficie, son aquellas proteínas zeína encontradas sobre la superficie de un gránulo de almidón. En otras modalidades, la remoción de por lo menos una porción de proteínas zeína asociadas con gránulos internos incrementa la fermentabilidad. Las proteínas zeína asociadas con gránulos internos son aquellas proteínas zeína encontradas dispersas por todo el gránulo de almidón. En otras modalidades, la remoción de por lo menos una porción de proteínas zeína localizadas en la superficie y proteínas zeína asociadas con gránulos internos, incrementa la fermentabilidad. Sustancialmente cualquier cantidad de proteínas zeína removidas de una materia vegetal, puede incrementar la fermentabilidad. El punto en el procedimiento en el cual la materia vegetal es puesta en contacto con la proteasa puede variar, dependiendo de la materia vegetal usada y la proteasa usada. En algunas modalidades, la materia es puesta en contacto con la proteasa durante la molienda, por ejemplo, molienda en húmedo o molienda en seco. En forma ilustrativa, la puesta en contacto puede ocurrir en uno o más pasos en la molienda en seco tal como, por ejemplo, moliendo la materia vegetal en harina o harina integral, formando un amasijo añadiendo agua a la harina integral, añadiendo enzimas al amasijo para convertir el almidón hasta azúcar, cociendo el amasijo a altas temperaturas (procesamiento), y/o fermentando los azúcares para formar etanol. En una modalidad, la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de la fermentación. En la molienda en húmedo, la puesta en contacto puede ocurrir en uno o más de los siguientes pasos: remojo de la materia vegetal en agua y ácido sulfuroso diluido, molienda para separar el germen de maíz, separación del almidón de la fibra y gluten, conversión del almidón hasta azúcar, y/o fermentación de los azúcares para formar etanol. En una modalidad, la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de y/o durante la fermentación. Los pasos de la molienda se realizan a temperaturas variables. Por ejemplo, en la molienda en seco, puede realizarse la cocción a temperaturas de aproximadamente 120°C a aproximadamente 150°C. En la molienda en húmedo, puede realizarse el remojo a temperaturas de aproximadamente 45°C a aproximadamente 55°C. Otros pasos pueden realizarse a mayores o menores temperaturas. Algunas proteasas usadas de conformidad con los métodos y procedimientos de la presente, son estables a altas temperaturas. La termolisina, por ejemplo, es térmicamente estable con temperaturas de reacción óptimas entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 70°C. Otras proteasas no son térmicamente estables. De esta manera, la proteasa adecuada puede seleccionarse para la hidrólisis de proteínas, dependiendo del paso de molienda en el cual la proteasa es puesta en contacto con la materia vegetal. La gelatinización del almidón es el hinchamiento y la ruptura de los granos de almidón por calentamiento en presencia de agua. Las temperaturas de gelatinización varían dependiendo de la fuente de almidón, pero puede comenzar a aproximadamente 60°C. El paso de cocción de la molienda en seco calienta el almidón a las temperaturas de gelatinización. En algunas modalidades, la materia vegetal es puesta en contacto con la proteasa a temperaturas abajo de la temperatura de gelatinización de un almidón de una materia vegetal de interés. Por ejemplo, materia vegetal tal como harina de maíz puede ser puesta en contacto con la proteasa a temperaturas abajo de la temperatura de gelatinización del almidón del maíz. Estas temperaturas pueden alcanzarse, por ejemplo, antes de la cocción (procesamiento) del amasijo. En modalidades particulares, el método comprende poner en contacto harina de maíz con termolisina antes de y/o durante la fermentación, a temperaturas abajo de la temperatura de gelatinización del almidón. La gelatinización se lleva a cabo normalmente con alfa-amilasa a aproximadamente 85°C. Sin embargo, 85°C es una temperatura demasiado alta para la levadura. Los solicitantes han descubierto además que el procedimiento de la presente descripción puede incrementar benéficamente la calidad de los co-productos de molienda. Como se mencionó anteriormente, los productos de la molienda incluyen no sólo etanol, sino también varios co-productos de pienso.

Por ejemplo, durante la fermentación después de la molienda en seco, las proteínas de la materia vegetal actúan como una fuente de nitrógeno absorbido por la levadura, mientras que las grasas y la fibra se concentran conforme el almidón y los azúcares son convertidos hasta etanol. Después de la fermentación, el etanol es removido por destilación de los residuos de elaboración enteros (agua, proteína, grasa y fibra). La centrifugación separa los sólidos (es decir, la torta húmeda) del líquido, y los líquidos pueden ser concentrados además para formar solubles de destilador condensados (CDS). La torta húmeda y los solubles condensados pueden ser combinados y desecados para formar granos de destilador desecados con solubles (DDGS). Mientras que los CDS se añaden generalmente a los DDGS, pueden usarse también como un ingrediente de pienso líquido. Los CDS son altamente apetitosos para el ganado, pero la calidad nutricional de los CDS puede ser variable, dependiendo de la matena vegetal original usada, las condiciones de procesamiento y los procedimientos de evaporación. Típicamente, sobre una base de materia seca, los CDS consisten de aproximadamente 29% de proteína, aproximadamente 9% de grasa y aproximadamente 4% de fibra. En la molienda en húmedo, se produce una variedad de co-productos que puede usarse como pienso para el ganado. Durante la molienda en húmedo, la materia vegetal es cocida o remojada para ablandar la materia y liberar nutrientes solubles en el agua. El agua es evaporada entonces para concentrar los nutrientes y producir extractos fermentados condensados (CFE). Después del remojo, se remueve el germen de la materia vegetal ablandada, y se procesa adicionalmente para recuperar aceite del germen, mientras que la porción restante del germen, o harina integral de germen, se colecta para pienso. La materia vegetal residual de la cual el germen se ha extraído, sufre cribado para remover salvado. El salvado se combina con otros co-productos para producir pienso de gluten. Por último, el almidón y la proteína del gluten se separan por centrifugación, y la proteína del gluten es concentrada y desecada para formar harina integral de gluten. Los CFE son un ingrediente del pienso líquido de alta energía con un contenido de proteína de aproximadamente 25% sobre una base de 50% de sólidos. Los CFE pueden combinarse con pienso de gluten, o pueden usarse como un aglutinante de pellas. La harina integral de germen es principalmente gluten, la porción del grano de alto contenido de proteína, y contiene aproximadamente 20% de proteína. El pienso de gluten contiene aproximadamente 21 % de proteína, mientras que la harina integral de gluten contiene aproximadamente 60% de proteína. El valor biológico de una proteína, es el porcentaje de proteína digestible en un pienso para el ganado. Por consiguiente, los solicitantes han descubierto que la digestibilidad de un co-producto de molienda puede mejorarse poniendo en contacto una materia vegetal con una proteasa durante la molienda en seco o la molienda en húmedo. Sin que sea limitado por la teoría, se cree que la reducción del contenido de almidón en un material de pienso para el ganado incrementa la digestibilidad de la proteína disponible. De esta manera, la puesta en contacto de una materia vegetal con una proteasa, exponiendo de esta manera más almidón para conversión enzimática hasta azúcar antes de la fermentación, deja menos almidón que queda en el co-producto que produce un material de pienso más digestible. Asimismo, la hidrólisis de proteínas por proteasas puede incrementar la digestibilidad de los péptidos resultantes. El incremento de la digestibilidad de un co-producto de molienda puede aumentar la calidad del co-producto. De esta manera, en algunas modalidades, un método para incrementar la digestibilidad de un co-producto de molienda, comprende poner en contacto la materia con una proteasa durante la molienda en seco para producir co-productos que incluyen torta húmeda, solubles de destilador condensados, granos de destilador desecados con solubles, o mezclas de los mismos. En otras modalidades, un método para incrementar la digestibilidad de un co-producto de molienda, comprende poner en contacto la materia con una proteasa durante la molienda en húmedo para producir co-productos que incluyen extractos fermentados condensados, harina integral de germen, pienso de gluten, harina integran de gluten, o mezclas de los mismos. Modalidades variantes e ilustrativas del presente método para incrementar la digestibilidad, por ejemplo, tipos de materia vegetal, oportunidad de contacto con la proteasa, proteasas adecuadas, zeínas hidrolizadas, etc., son como se describieron anteriormente con respecto al incremento de la fermentabilidad para producir etanol. Se provee también un método para analizar una materia vegetal para predecir la fermentabilidad relativa de la materia vegetal para producir etanol. El método comprende poner en contacto la materia vegetal con una cantidad efectiva de una proteasa para remover por lo menos una porción de proteínas zeína, analizar la materia vegetal para determinar la cantidad de proteínas zeína que quedan en la materia después del contacto con la proteasa; y predecir la fermentabilidad relativa de la materia vegetal para producir etanol con base en la cantidad de las proteínas zeína que quedan en la materia vegetal. El paso de poner en contacto la materia vegetal con una cantidad efectiva de una proteasa para remover por lo menos una porción de proteínas zeína, puede comprender cualquier acto de poner en proximidad la proteasa con la materia vegetal, de modo que por lo menos una porción de las proteínas zeína en la materia vegetal sea hidrolizada. Por ejemplo, una proteasa puede añadirse a la materia vegetal en cualquiera de uno o más de los pasos descritos anteriormente en los procedimientos de molienda en húmedo o molienda en seco. Una cantidad efectiva es cualquier cantidad de proteasa que produzca la hidrólisis de apenas suficientes proteínas zeína que resulte en un incremento mensurable en el rendimiento de etanol. El paso de determinar la cantidad de proteínas zeína que quedan en la materia vegetal después del contacto con la proteasa, puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido de determinación de proteínas. En forma ilustrativa, dichos métodos incluyen HPLC, MS MALDI-TOF, electroforesis capilar, RP-HPLC, MS en línea, electroforesls en gel, análisis Western blot, inmunoprecipitación, y combinaciones de los mismos. Otros métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de formación de imágenes usadas en conjunto con anticuerpos dirigidos contra las proteínas zeína, tales como microscopía de fluorescencia, microscopía de epi-fluorescencla o microscopía confocal. Otras técnicas usadas de conformidad con la presente descripción incluyen, pero no están limitadas a, lector de placa fluorescente, fluorímetro, citómetro de flujo y espectrofotómetro. La cantidad de proteínas zeína puede determinarse por cuantificación de puntos fluorescentes, determinación de la intensidad de fluorescencia o determinación del área de fluorescencia. La cuantificación puede automatizarse con ayuda de un dispositivo de cómputo o software, o combinación de dispositivo de cómputo y software. Con base en la cantidad de proteína zeína aún presente en la materia vegetal, puede predecirse la fermentabilidad para producir etanol. Por ejemplo, si la cantidad de proteínas zeína en una materia vegetal se mantiene sustancialmente sin cambio respecto a una contraparte sin tratar, entonces la fermentabilldad para producir etanol no será cambiada. Si la cantidad de proteínas zeína ha disminuido respecto a una contraparte sin tratar, entonces la fermentabilidad será asimismo incrementada. Y, si las proteínas zeína son casi inexistentes, entonces la fermentabilidad será incrementada considerablemente respecto a una contraparte sin tratar.

La fermentabilidad predicha puede ser también respecto a un valor estandarizado, por ejemplo, estandarizado al valor obtenido para un híbrido de maíz de alto rendimiento de etanol sin tratamiento con proteasa. La capacidad para analizar una materia vegetal para fermentabilidad para producir etanol, tiene varias aplicaciones. Por ejemplo, la predicción de la fermentabilidad de una muestra de materia vegetal permitirá aumentar a escala las operaciones de molienda en húmedo o molienda en seco para optimizar las condiciones, dependiendo de la eficacia de la proteasa particular, la materia vegetal particular, las condiciones de fermentabilidad, etc. Se provee además un procedimiento para producir etanol a partir de materia vegetal. El procedimiento comprende poner en contacto la materia vegetal con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar por lo menos una porción de proteínas zeína durante la molienda en húmedo o la molienda en seco; y poner en contacto la materia vegetal con una levadura para convertir los almidones en la materia hasta etanol. En forma ilustrativa, cuando la materia vegetal es puesta en contacto con la proteasa durante la molienda en húmedo, el procedimiento puede comprender además: (a) remojar la materia vegetal en agua y ácido sulfuroso diluido para separar una suspensión acuosa espesa del gluten y el almidón; y (b) separar el gluten del almidón usando separadores centrífugos, de tamiz y/o hidroclónicos.

La materia puede ser puesta en contacto generalmente con la proteasa en cualquier tiempo durante el procedimiento de molienda en húmedo, dependiendo de la estabilidad térmica de la proteasa, como se discutió anteriormente. En por lo menos algunas modalidades, la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de y/o durante la fermentación. En forma alternativa, cuando la materia es puesta en contacto con la proteasa durante la molienda en seco, una modalidad del procedimiento puede comprender además: (a) moler la materia en harina; (b) añadir agua a la materia para formar un amasijo; (c) añadir enzimas a la materia para convertir el almidón hasta azúcar; y (d) cocer la materia a una alta temperatura. De nuevo, la materia puede ser puesta en contacto generalmente con la proteasa en cualquier momento durante el procedimiento de molienda en seco, dependiendo de la estabilidad térmica de la proteasa. En por lo menos algunas modalidades, la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de y/o durante la fermentación. En otras modalidades, la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de la cocción. Modalidades variantes e ilustrativas del presente procedimiento para producir etanol, por ejemplo, tipos de materia vegetal, oportunidad de contacto con la proteasa, proteasas adecuadas, zeínas hidrolizadas, etc., son como se describieron anteriormente con respecto a los métodos de la presente descripción.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son sólo ilustrativos, y de ninguna limitativos para esta descripción.

EJEMPLO 1 Este ejemplo demuestra el análisis químico de híbridos de maíz altamente fermentables y poco fermentables, usando RP-HPLC y/o MS MALDI-TOF. Se extrajo proteína de muestras de maíz, resuspendiendo harina de maíz desgrasada (50 mg) en NH4OH 25 mM, ACN a 60% y DTT 10 mM, agitando entonces a 60°C (en un baño de agua) por dos horas. El sobrenadante que contiene proteína se recuperó por centrifugación (3000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente) y se transfirió a tubos vacíos. Cada muestra se analizó por MS MALDI y RP-HPLC. Se realizó MS MALDI-TOF en muestras de proteína diluidas (diluidas 5 veces con solución de matriz JAVA, Sigma, St. Louis, MO). Se obtuvieron espectros de masa usando una bioespectrometría Voyager-DE PRO de Applied Biosystems. La figura 1 es una superposición del análisis de espectros de masa de proteínas zeína totales de muestras de maíz diluidas cinco veces con solución de matriz. Pueden distinguirse híbridos de alto rendimiento y de bajo rendimiento por la altura de los picos, en donde los híbridos de bajo rendimiento de etanol muestran picos más altos en cada uno de los marcadores de proteína zeína indicados. Se realizó RP-HPLC inyectando muestras de proteína en una columna de HPLC Vydac C18 y un gradiente lineal de acetonitrilo (de 15% a 80%). Se colectaron muestras enteras; se colectaron fracciones de muestras a 67 minutos para análisis subsiguiente por MS MALDI-TOF. La figura 2 es una superposición de cromatogramas de RP-HPLC que analizan proteínas zeína en híbridos de alto rendimiento de etanol y bajo rendimiento de etanol. El híbrido de bajo rendimiento demuestra áreas de picos más grandes a 66.7 minutos, que el híbrido de alto rendimiento.

EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra el efecto de la remoción de proteína zeína sobre la fermentabilidad y el rendimiento de etanol del maíz. El experimento comprendió moler muestras de semilla de híbridos de maíz de baja fermentabilidad y alta fermentabilidad hasta harina. Cada muestra de harina (25 g) se puso en contacto con termolisina (5 g) y agua (50 mi), y se agitó vigorosamente para mojar la muestra entera. La muestra mojada se incubó entonces a 85°C por 2 horas. Después de la incubación, se añadió HCI a 20% (650 µ?) para reducir el pH de la muestra de 4.0 a 4.4 mientras se agitaba para garantizar la distribución uniforme de ácido. Las muestras se pusieron entonces en un baño de hielo por 5 a 7 minutos hasta que la temperatura de la muestra regresara a temperatura ambiente. Después de que las muestras regresaron a temperatura ambiente, se añadieron glucoamilasa (250 µ?, Fermenzyme), proteasa (150 µ?), lactosida (100 µ?) y una solución de propagador de levadura (3 mi), las muestras se agitaron vigorosamente, y se pusieron en un baño de agua a 33°C por 24 horas mientras estaban siendo transferidas a un segundo baño de agua a 31.7°C para fermentación por otras 54 horas. Como se muestra en la figura 3, la adición de termolisina incrementó el rendimiento de etanol en la muestra de alta fermentabilidad, de 17.36% a 17.44%. La figura 4 indica el rendimiento incrementado de etanol de 16.07% a 17.66% obtenido añadiendo termolisina a la muestra de baja fermentabilidad.

EJEMPLO 3 Este ejemplo demuestra el efecto de zeínas añadidas sobre el rendimiento de etanol de híbridos de maíz de alta fermentabilidad y baja fermentabilidad. Se obtuvieron muestras de semilla de híbridos de maíz de alta fermentabilidad y baja fermentabilidad, y se molieron hasta harina. Cinco muestras de harina (de 25 g cada una) tuvieron una cantidad diferente de proteínas zeína añadidas (0 g, 0.25 g, 0.5 g, 0.75 g y 1.0 g, respectivamente) junto con agua (50 mi), y las muestras se agitaron vigorosamente para mojar la muestra entera. Se añadieron glucoamilasa (250 µ?, Fermenzyme), proteasa (150 µ?), lactosida (100 µ?) y una solución de propagador de levadura (3 mi), las muestras se agitaron vigorosamente, y se pusieron en un baño de agua a 33°C por 24 horas antes de ser transferidas a un segundo baño de agua a 31 .7°C para fermentación por otras 54 horas. Como se muestra en la figura 5, la adición de niveles gradualmente crecientes de proteínas zeína, disminuyó ampliamente el rendimiento de etanol (variando de 17.4% en la muestra sin proteínas zeína adicionales, a 16.8% de etanol en la muestra a la cual se añadió 1.0 g de proteína zeína) de muestras de híbridos de maíz de alta fermentabilidad. La figura 6 muestra que la adición de proteínas zeína a muestras de híbridos de maíz de baja fermentabilidad es menos predecible en su efecto sobre el rendimiento de etanol, indicando posiblemente que la adición de 0.50 g o más de proteína zeína bloqueó el efecto inicial de disminución del rendimiento de etanol.

EJEMPLO 4 Este ejemplo demuestra el efecto de la termolisina sobre el rendimiento de etanol de un híbrido de maíz de baja fermentabilidad. El experimento comprendió moler muestras de semilla de un híbrido de maíz de baja fermentabilidad, hasta harina. Se pusieron en contacto cinco muestras de harina (de 25 g cada una) con diferentes cantidades de termolisina (0, 5, 10, 20, 50 y 100 g, respectivamente) y agua (50 mi), y se agitaron vigorosamente para mojar la muestra entera. Las muestras mojadas se incubaron entonces a 85°C por 2 horas. Después de la incubación, se añadió HCI a 20% (650 µ?) para reducir el pH de la muestra de 4.0 a 4.4 mientras se agitaba para garantizar la distribución uniforme de ácido. Las muestras se pusieron entonces en un baño de hielo por 5 a 7 minutos, hasta que la temperatura de la muestra regresara a temperatura ambiente. Después de que las muestras regresaron a temperatura ambiente, se añadieron glucoamilasa, (250 µ?, Fermenzyme), proteasa (150 µ?), lactosida (100 µ?) y una solución de propagador de levadura (3 mi), las muestras se agitaron vigorosamente, y se pusieron en un baño de agua a 33°C por 24 horas antes de ser transferidas a un segundo baño de agua a 31.7°C para fermentación por otras 54 horas. La figura 7 muestra que la adición de 5 g de termolisina antes del procedimiento de gelatinización incrementó el rendimiento de etanol de un híbrido de maíz de baja fermentabilidad, de 15.49% a 17.16%. La adición de mayores cantidades de termolisina incrementó asimismo el rendimiento de etanol hasta sustancialmente el mismo grado. Los términos "comprende", "comprenden" y "que comprende", como se usan a lo largo de la especificación, se interpretarán inclusivamente más que exclusivamente.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para incrementar la fermentabilidad de materia vegetal para producir etanol, que comprende hidrolizar proteínas hidrofóbicas en la materia vegetal. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la materia vegetal es puesta en contacto con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar proteínas hidrofóbicas en la materia vegetal. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la proteasa se selecciona del grupo que consiste de termolisina, Neutrase, SP709, Spezyme FAN, Alcalase, Savinase, Everlase, Esperase y Kannase. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteasa es termolisina. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la materia se pone en contacto con termolisina a una temperatura menor de 35°C. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la materia vegetal es una variedad de maíz poco fermentable. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el método comprende hidrolizar proteínas zeína en la materia vegetal. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque las proteínas zeína comprenden proteínas zeína localizadas en la superficie y proteínas zeína asociadas con gránulos internos. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las proteínas hidrolizadas incluyen una o más de proteínas a-, d- y ?-zeína. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa durante la molienda en seco o la molienda en húmedo. 1 1. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa antes del procesamiento. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de y/o durante la fermentación. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la materia vegetal se obtiene de una o más plantas seleccionadas del grupo que consiste de maíz, trigo, cebada, arroz, centeno, avena, sorgo, milo, soya, caña de azúcar y remolachas. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la materia vegetal es semilla. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caractenzado además porque la materia vegetal es harina. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el método comprende poner en contacto harina de maíz con la proteasa termolisina antes de y/o durante la fermentación a temperaturas abajo de la temperatura de gelatinización del almidón. 17. - Un método para incrementar la digestibilidad de un co-producto de molienda, el método comprendiendo poner en contacto una materia vegetal con una proteasa durante la molienda en seco o la molienda en húmedo. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de y/o durante la fermentación. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la proteasa se selecciona del grupo que consiste de termolisina, Neutrase, SP709, Spezyme FAN, Alcalase, Savinase, Everlase, Esperase y Kannase. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la proteasa es termolisina. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con termolisina a temperaturas abajo de la temperatura de gelatinización del almidón. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la materia vegetal se obtiene de una o más plantas seleccionadas del grupo que consiste de maíz, trigo, cebada, arroz, centeno, avena, sorgo, milo, soya, caña de azúcar y remolachas. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la materia vegetal es semilla. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la materia vegetal es harina. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la materia vegetal es puesta en contacto con la proteasa durante la molienda en seco, y en donde el co-producto se selecciona del grupo que consiste de torta húmeda, solubles de destilador condensados, granos de destilador desecados con solubles, y mezclas de los mismos. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa durante la molienda en húmedo, y en donde el co-producto se selecciona del grupo que consiste de extractos fermentados condensados, harina integral de germen, pienso de gluten, harina integran de gluten, y mezclas de los mismos. 27. - Un método para analizar una materia vegetal para fermentabilidad para producir etanol, el método comprendiendo: poner en contacto la materia con una cantidad efectiva de una proteasa para remover por lo menos una porción de proteínas hidrofóbicas en la materia; determinar la cantidad de proteínas hidrofóbicas aún presentes en la materia; y comparar la cantidad de proteínas hidrofóbicas que quedan en la materia con un control para predecir la fermentabilidad de la materia vegetal para producir etanol; y predecir, con base en la cantidad de las proteínas hidrofóbicas que quedan en la materia, la fermentabilidad para producir etanol de la materia vegetal. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la determinación de la cantidad de proteínas zeína comprende el análisis de una muestra de proteína mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste de MS MALDI-TOF, HPLC, RP-HPLC, electroforesis en gel, electroforesis en gel bidimensional, SDS-PAGE, y combinaciones de las mismas. 29.- Un procedimiento para producir etanol a partir de materia vegetal, el procedimiento comprendiendo poner en contacto la materia con una cantidad efectiva de una proteasa para hidrolizar por lo menos una porción de proteínas zeína durante la molienda en húmedo o la molienda en seco; y fermentar la materia para producir etanol poniendo en contacto la materia con una levadura para convertir los almidones en la materia hasta etanol. 30.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa durante la molienda en húmedo, y el procedimiento comprende además: (a) remojar la materia en agua y ácido sulfuroso diluido para separar una suspensión acuosa espesa del gluten y el almidón; y (b) separar el gluten del almidón usando separadores centrífugos, de tamiz y/o hidroclónicos. 31 .- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de y/o durante la fermentación. 32. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa durante la molienda en seco, y el procedimiento comprende además: (a) moler la materia en harina; (b) poner en contacto la materia con agua para formar un amasijo; (c) poner en contacto la materia con una enzima para convertir el almidón hasta azúcar; y (d) fermentar los azúcares hasta alcohol. 33. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de y/o durante la fermentación. 34. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la materia es puesta en contacto con la proteasa antes de la cocción. 35.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la proteasa es termolisina.