METODO DE CONTROL DE CALIDAD INTERNO
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el campo de ensayos biológicos donde las células se pueden clasificar y cuantificar usando citometría de flujo y otra instrumentación óptica. Más específicamente, la invención se relaciona con el campo de control de calidad de conteo de sub-población de célula sanguínea por citometría de flujo cuando las sub-poblaciones de célula sanguínea son identificadas enlazando anticuerpos etiquetados a antígenos de superficie celular. Estos resultados de "inmuno-hematología" así llamada se usan muy frecuentemente para manejar y prescribir terapia con fármaco en VIH/SIDA.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el tiempo de esta invención aproximadamente 50 millones de personas en el mundo son infectadas por VIH, muchas de las cuales están en una etapa de su enfermedad donde la terapia con fármaco anti-retroviral es médicamente indicada. La separación de etapas de enfermedad de VIH se hace contando los inmunocitos específicas en sangre varias veces al año. Estas células progresivamente disminuyen en número sobre un periodo de muchos años a un nivel donde la inmunidad es deteriorada y ocurre infección oportunista Ref.: 195348
fatal. Esta condición es conocida médicamente como SIDA. Cuando el conteo celular se usa para monitorear los inmunocitos específicas en sangre y los resultados se usan para regular la administración de terapia anti-retroviral, el procedimiento es 90% exitoso en el establecimiento de remisión que dura por varios años. Sin esta tasa de remisión es solamente aproximadamente de 20%. Es ahora un axioma no cuestionado que el conteo de células inmunes debe guiar la terapia anti-retroviral en el tratamiento de VIH. Se estima que 95% de los individuos infectados con
VIH viven en regiones donde no existe personal de laboratorio experto. Son necesarios para operar "citómetros de flujo", los cuales son los instrumentos usados para contar células inmunes. Los citómetros de flujo se clasifican como sistemas altamente complejos por la mayoría de las agencias reguladores debido a que necesitan muchas etapas manuales expertas para preparar muestras de sangre de paciente, y son mecánicamente y electrónicamente inestables, requiriendo ajuste cuidadoso durante el día. El tiempo de entrenamiento para un operador de citometría de flujo se mide en años. La velocidad a la cual la epidemia de infección de VIH ha crecido y establecido una tasa de muertes que ahora se estima que es 6,000 por día, ha vencido todos los esfuerzos de crear suficientes números de técnicos y centros de citometría de flujo en las partes del mundo menos desarrolladas.
La automatización con verificaciones de software y hardware interno, tal como aquella desarrollada para el sistema PointCare AuRICA (PointCare Technologies, Inc., Marlborough, MA USA) , ha eliminado todas las etapas manuales necesarias para preparar las muestras para análisis de citometría de flujo. Esto podría tener un mayor impacto en el nivel de entrenamiento necesario para la operación del citómetro de flujo si no fuera por dos problemas difíciles permanentes . El primero es entrenar operadores para usar los llamados materiales de control externo (muestras de sangre sustitutas o artificiales ensayadas) para verificar que el citómetro de flujo está actualmente funcionando dentro de especificación al comienzo y/o final de cada día. El segundo es que estos materiales de control externo requieren una "cadena frigorífica" no interrumpida para embarque y almacenamiento. El mantenimiento de una cadena frigorífica requiere entrenamiento y una infraestructura de refrigeración que generalmente está ausente en el mundo en desarrollo rural. La trayectoria crítica para desarrollar un citómetro de flujo que se puede usar por el personal con mínimo entrenamiento en áreas con recursos pobres se sitúa a lo largo de la eliminación de materiales de control externo. En la prueba de estado inmune, el papel primario de los materiales de control externo es asegurar que los anticuerpos, sensibles a la temperatura, inestables que se
usan como reactivos para enlazar a antígenos de superficie celular y clasificar células para conteo, tengan retenida su capacidad de enlace químico. No es suficiente saber que se usa la concentración debida de anticuerpo de reactivo. De hecho, tanto la concentración como la actividad de enlace se deben asegurar para este reactivo clave. Los anticuerpos son proteínas lábiles al calor que son fácilmente dañadas después de unas cuantas horas en un laboratorio sin aire acondicionado. Cuando esto sucede, los conteos de células de citometría de flujo serán incorrectos. El problema primario con los controles externos para la mayoría del mundo es que son tan sensibles a la temperatura como los anticuerpos. Necesitan ser embarcados bajo refrigeración, y raramente duran más de un mes aún bajo re-refrigeración cuidadosa una vez que el contenedor se abre. La refrigeración confiable no siempre está disponible y esto crea problemas logísticos para clínicas remotas y una necesidad de personal logístico bien entrenado en la clínica. Secundariamente, los controles externos con costosos. Algunas clínicas pequeñas necesitan gastar más dinero para procesar controles externos que procesar muestras de pacientes. En tercer lugar, la calidad solamente se asegura para muestras de pacientes procesadas durante un tiempo especificado después que una muestra de control externo se procesa. Podría ser ventajoso si la calidad puede ser asegurada para cada
muestra de paciente sin considerar cuando la muestra se procesa . El objeto de esta invención es un método y aparato que usa las células sanguíneas propias del paciente durante el proceso de muestra en vez de materiales de control externo sustitutos para verificar la concentración y actividad de los anticuerpos. Las células sanguíneas usadas como un "control interno" no son unas que disminuyen en número durante el transcurso de la progresión de la enfermedad de VIH. Las células de controles internos son una clase de célula inmune que porta los mismos sitios de enlace para anticuerpo como lo hace la clase de célula inmune cuya población es afectada por VIH. Estas células proporcionan un medio para controlar la concentración y actividad de anticuerpo que es independiente de la enfermedad y evita el costo de materiales de control externo. Adicionalmente proporciona la ventaja de proporcionar una verificación de "material de control interno" simultánea durante cada proceso de muestra de paciente; una opción que no es financieramente factible ni técnicamente factible con los materiales de control externo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las clases primarias de glóbulos blancos de circulación son linfocitos, monocitos, netrofilos, eosinófilos, y basofilos. Cada uno es participante en varios
mecanismos complejos de defensa de enfermedad; y desviaciones de una condición normal, o libre de enfermedad, la relación de números relativos entre los sub-conjuntos es altamente correlacionada con los estados de enfermedad específicos. Durante el transcurso de tiempo de progresión de VIH a SIDA desarrollado, una sub-clase de linfocitos se destruye a la larga creando un estado inmuno-comprometido donde el paciente se abre a una variedad de infecciones oportunistas y cáncer que prueban ser fatales . La sub-clase de linfocitos destruidos por infección de VIH es una que porta 94 , 000±28 , 000 receptores de superficie por célula conocido como el receptor CD4 (Bikoue, A., et al., Cytometry 1996; 26: 137). Varios nombres se han unido a esta sub-clase; los más comunes son la sub-clase "célula T Colaboradora" y la sub-clase "linfocito CD4+". En el tiempo de esta invención un paciente infectado con VIH pasa a la etapa clínica de "SIDA desarrollado" cuando el conteo de célula T Colaboradora cae a 200/µ1. Después de esto la defensa inmune del paciente es casi perdida y sobrevive a la muerte de infección oportunista irreversible (por ejemplo, tuberculosis) o cáncer (sarcoma de Kaposi) . La clase de glóbulos blancos de circulación actualmente infectados por el virus real (VIH), es, sin embargo, la de los monocitos y no la de los linfocitos. Las trayectorias de señalización intercelular, indirectas que
actúan entre los monocitos infectados y las células T Colaboradoras causan la destrucción de las células T Colaboradoras (Fantuzzi, L., Leuk. Biol . 2003; 74:719). Mientras que los monocitos pueden hospedar el virus, sus números no son afectados por el virus . Dos hechos son importantes para la presente invención. Primero, todos los monocitos portan el mismo receptor de superficie CD4 como lo hacen las células T Colaboradoras . Un hecho dependiente es que el número de receptores CD4 en monocitos es 34 , 000±10 , 000 por célula (Bikoue, A., et al, Cytometry 1996; 26: 137) el cual es inferior que aquel de linfocitos. Segundo, el número de monocitos permanece esencialmente constante y el número de receptores CD4 en los monocitos también permanece esencialmente constante en todo el transcurso de la infección de VIH. La presente invención involucra la reacción de un inmuno-conjugado CD4 con una muestra de sangre entera de paciente. El inmuno-conjugado CD4 consiste de uno o más anticuerpos con especificidad para el receptor de superficie CD4 acoplado a una porción de señal, o "etiqueta", que es detectable por un citómetro de flujo. Tales etiquetas pueden generar una señal por tales medios como propiedades de fluorescencia, propiedades de dispersión de luz, propiedades electrónicas, o propiedades magnéticas. El inmuno-conjugado
CD4 enlaza tanto a los linfocitos CD4 positivo (células T Colaboradoras) y todos los monocitos. Los medios de detección diferencial se emplean para contar células T Colaboradoras etiquetadass con inmuno-conjugado . La presente invención se distingue por si misma midiendo simultáneamente el nivel de señal de los monocitos como un medio para verificar la actividad suficiente del anticuerpo anti-CD4.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A indica la muestra de sangre con glóbulos rojos se removió por lisis. Se muestran los grupos Linfocito (F) , Monocito (M) , y Granulocito (G) . No se usa conjugado inmunooro . La figura IB indica la misma muestra de sangre como la figura 1A, pero usando conjugado de inmunooro para etiquetar el receptor de superficie de célula CD4. El grupo de linfocito se divide en linfocito CD4- y CD4+. El grupo de monocito completo es etiquetado y se desplaza a la derecha (flecha) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Puesto que las entidades de inmuno-conjugado individuales (anticuerpos mas etiqueta) se seleccionan de la mezcla de reacción por un proceso de difusión, se enlazan aleatoriamente a linfocitos o monocitos. Esto significa que no existe objetivo de enlace preferido, y un muestreo de la
eficacia de enlace de anticuerpo a monocitos se puede usar como un indicador no desviado para inferir en la eficacia de enlace de anticuerpo a linfocitos cuando ambas trayectorias de enlace ocurren simultáneamente en la misma mezcla de reacción. Un ejemplo de este método se ilustra en las figuras 1A-1B. Un citómetro de flujo de búsqueda estándar (Beckman Coulter Epics) se estableción y uso como sigue. Los detectores de dispersión de luz fueron habilitados para detectar la dispersión a un ángulo delantero bajo (cono estrecho de luz centrada a ~2 grados fuera de eje) y a sustancialmente un ángulo recto (cono ancho de luz centrada a 90 grados fuera de eje) . Un visualizador de datos de "gráfico de puntos" de citometria de flujo de dos parámetros estándar se utilizó para la interpretación y análisis de datos (figuras 1A-1B) . La intensidad de señal de difusor delantero (FS) de cada célula se registró en el eje Y de las figuras 1A-1B y la intensidad de señal de difusor de ángulo recto (SS) de cada célula se registró en el eje X. Los puntos en el gráfico son las coordenadas X-Y de la intensidad de señal de cada célula. El ejemplo en las figuras 1A-1B utilizó una muestra de sangre entera de un donador humano saludable. En las figuras 1A-1B, los glóbulos rojos se removieron por lisis y la muestra se proceso sin un inmuno-conjugado . La siguiente
interpretación es bien conocida en la técnica (Shapiro, H.; Practical Flow Cytometry, Ed. 4, Wiley-Liss, p 483). Tres grupos de puntos (señales de célula) se ven. El grupo ovalado aproximadamente vertical a la izquierda inferior contiene solamente linfocitos. El grupo difuso y menos denso a la derecha superior de los linfocitos contiene solamente monocitos. El grupo ovalado aproximadamente horizontal contiene solamente granulocitos . En la figura IB, la misma muestra se procesó de nuevo, pero esta vez después de la reacción con un conjugado "inmunooro". Este conjugado consiste de partículas de oro coloidal de aproximadamente 80 nm de diámetro revestidas por anticuerpos monoclonales de ratón específicos para el receptor CD4. La Solicitud de Patente de Estados Unidos Número 20040246480 describe el uso de estos conjugados para la detección y conteo de identificación y conteo de célula T Colaboradora. Como se explicó en esta solicitud de patente, un segundo grupo ovalado es creado por aquellos linfocitos que han unido el conjugado inmunooro a la superficie celular. Tal enlace crea dispersión de ángulo recto (SS) sustancialmente incrementada y un cambio menor en la dispersión hacia delante (FS) . Además con referencia a la figura IB, es evidente que todos los monocitos también tiene unido el conjugado inmunooro como se evidenció por el hecho que el grupo de
monocito completo se ha desplazado a la derecha a lo largo del eje SS. La posición de eje X original del grupo de monocito no etiquetado fue X = 260, y la posición desplazada fue X = 450. La relación de posiciones X fue por lo tanto (450/260) = 1.73. Por comparación el grupo de linfocito se desplazó de X = 108 a X = 248. La relación de las posiciones X fue por lo tanto (428/108) = 3.96. Finalmente, nótese que la relación del desplazamiento de monocito al desplazamiento de linfocito la cual es (1.73/3.96) = 0.44 compara favorablemente a la relación de receptores CD4 en monocitos a linfocitos (34,000/94,000) = 0.36 ± 0.15 (El error estándar en esta relación fue computado propagando los errores independientes en las mediciones reportadas anteriormente de números de antígeno CD4 para linfocitos y monocitos en la literatura) . Esto indica que el grado de desplazamiento está relacionado con el número de sitios de enlace de antígeno en estas dos poblaciones de células. Este ejemplo ilustra el desplazamiento en el grupo de monocito causado por el enlace de conjugados de anticuerpo anti-CD4. Adicionalmente la magnitud del desplazamiento de grupo de monocito con relación al desplazamiento de linfocito se compara bien con la relación del número de conjugados inmunooro estimado de la literatura para ser unido a
monocitos y linfocitos respectivamente. También es posible usar la posición relativa (antes que la posición absoluta) del grupo de monocito con respecto a otros grupos como un medio para monitorear enlace de anticuerpo anti-CD4 a monocitos. En el ejemplo anterior y con referencia a las figuras 1A-1B, la posición del grupo de monocito con relación al grupo de granulocito (neutrófilo) cambia cuando los anticuerpos anti-CD4 enlazan a los monocitos. La posición del grupo de granulocito es por si misma no afectada por la presencia de anticuerpo anti-CD4. Esto es debido a que virtualmente ninguno de los granulocitos (neutrófilos ) porta el receptor CD4. Por lo tanto, la referencia para grupo de monocito puede ser el grupo de granulocito invariante el cual hace obvio la necesidad de una medición de referencia sin anticuerpo anti-CD4. Este modo preferido ahorra tiempo para producir un resultado de paciente . Es importante señalar que estas observaciones se pueden emplear para monitorear la calidad de enlace de anticuerpo en un porcentaje muy alto de muestras de paciente aún cuando las células T Colaboradoras se han eliminado completamente de la circulación en SIDA avanzado. Los monocitos y granulocitos (neutrófilos ) continúan circulando en todo el transcurso del SIDA y la ilustración anterior es un ejemplo de cómo se pueden usar como "sensores" para
actividad de inmuno-reactivo de CD4. El ejemplo anterior ilustra que el desplazamiento de grupo de monocito con relación a una referencia se puede usar como un control interno a ningún costo agregado y sin agregar entrenamiento para verificar la actividad de conjugado de anticuerpo anti-CD4 en virtualmente cada muestra de paciente que es procesada. Esto es un mejoramiento significativo sobre el uso de materiales de control externo que son convencionalmente procesados solamente una vez por día. Los materiales de control externo son costosos, y procesándolos más frecuentemente que una vez por día es financieramente prohibitivo en instalaciones de recurso pobre (y recurso rico) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.