MX2008008313A - Composiciones inmunogenicas de pcv2 multivalentes y metodos de producir composiciones de este tipo - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método mejorado para recuperar la proteína expresada por el marco de lectura abierto 2 procedente del circovirus de tipo 2 porcino. Se proporciona también una proteína ORF2 recombinante de PCV2 ORF2, y composiciones inmunogénicas que comprenden proteínas ORF2 de PCV2. además de ello, se proporcionan vacunas de combinación multivalentes, que incluyen un agente inmunológico eficaz para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de la infección por PCV2, preferiblemente proteína ORF2 de PCV2, o una composición inmunogénica que comprende proteína ORF2 de PCV2 ORF2, y al menos un componente inmunogénico activo de otro organismo provocador de enfermedades en cerdos.

Description

COMPOSICIONES INMUNOGENICAS DE PCV2 MULTIVALEN ES Y MÉTODOS DE PRODUCIR COMPOSICIONES DE ESTE TIPO CAMPO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención concierne a la recuperación de una proteína expresada por el marco de lectura abierto 2 (0RF2 - siglas en inglés) de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) . Más particularmente, la proteína es una proteína recombinante expresada por un virus transfectado que contiene secuencias codificadoras recombinantes para el circovirus porcino tipo 2 , marco de lectura abierto 2. Todavía más particularmente, se permite que el virus transfectado infeste células en medios de crecimiento, y la proteína expresada por el marco de lectura abierto 2 se recupera en el sobrenadante, más que desde el interior de las células. Incluso más particularmente, el método implica las etapas de amplificar el gen del marco de lectura abierto 2 procedente del circovirus porcino tipo 2, clonar esta porción amplificada en un primer vector, escindir la porción del marco de lectura abierto 2 procedente de este primer vector y clonarla en un vector de transferencia, cotransfectar el vector de transferencia con un vector viral en células en medios de crecimiento, determinando que las células se vuelvan infestadas por el vector viral y, con ello, expresar el marco de lectura abierto 2, y recuperar la proteína recombinante expresada por el marco de lectura REF.: 193847 abierto 2 en el sobrenadante. En otro aspecto, la presente invención concierne a una composición inmunogénica eficaz para inducir una respuesta inmune contra PCV2 , y a métodos para producir esas composiciones inmunogénicas. Más particularmente, la presente invención concierne a una composición inmunológica eficaz para proporcionar una respuesta inmune que protege a un animal que recibe la composición y reduce, o disminuye la gravedad de los síntomas clínicos asociados con la infección por PCV2. Todavía más particularmente, la presente invención concierne a una composición inmunológica, basada en proteínas, que confiere una protección eficaz contra la infección por PCV2. Incluso más particularmente, la presente invención concierne a una composición inmunológica que comprende el ORF2 de PCV2, en donde la administración del ORF2 de PCV2 resulta en la protección frente a una infección por PCV2. Lo más particularmente, la presente invención concierne a una composición inmunológica eficaz para conferir una inmunidad eficaz a un cerdo que recibe la composición inmunológica, y en donde la composición comprende la proteína expresada por el 0RF2 de PCV2. En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan vacunas de combinación o vacunas multivalentes. Más particularmente, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas eficaces por inducir una respuesta inmune frente a la infección por PCV2 y al menos otro organismo que provoca enfermedad para cerdos . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El circovirus porcino tipo 2 (PCV2) es un virus de ADN pequeño (17 - 22 nm de diámetro) , icosahédrico, sin cubierta, que contiene un genoma circular de cadena sencilla. PCV2 comparte una identidad de la secuencia de aproximadamente el 80% con el circovirus porcino tipo 1 (PCVl) . Sin embargo, en contraposición con PCVl, que generalmente no es virulento, cerdos infestados con PCV2 exhiben un síndorme al que habitualmente se alude como síndrome de adelgazamiento miultisistémico post-destete (PMWS - siglas en inglés) . Clínicamente, el PMWS se caracteriza por un adelgazamiento, palidez de la piel, un desarrollo poco vigoroso, dificultad respiratoria, diarrea, icterus e íctero. En algunos cerdos afectados, resultará evidente una combinación de todos los síntomas, mientras que otros cerdos solamente tendrán uno o dos de estos síntomas. Durante la necropsia, también aparecen lesiones microscópicas y macroscópicas en múltiples tejidos y órganos, siendo los órganos linfoides el sitio más común para las lesiones . Se ha observado una fuerte correlación entre la cantidad de ácidos nucleicos o antígenos de PCV2 y la gravedad de lesiones linfoides microscópicas. Las tasas de mortalidad para cerdos infestados con PCV2 pueden aproximarse al 80%. Además del PMWS, PCV2 ha sido asociado con otras varias infecciones, incluida pseudorrabia, síndrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS - siglas en inglés) , enfermedad de Glasser, meningitis estreptocócica, salmonelosis, colibacilosis post-destete, hepatosis dietética y bronconeumonía supurativa. La proteína expresada por el marco de lectura abierto 2 (0RF2) de PCV2 , con un peso molecular aproximado de 30 kDa cuando se realiza sobre gel de SDS-PAGE, ha sido utilizada en el pasado como un componente antigénico en vacunas para PCV2. Métodos típicos de obtener ORF2 para uso en vacunas de este tipo consiste generalmente en amplificar el ADN del PCV2 que codifica ORF2, transfectar un vector viral con el ADN de 0RF2, infestar las células con el vector viral que contiene el ADN de ORF2, permitir que el virus exprese la proteína de ORF2 dentro de la célula, y extraer la proteína de 0RF2 de la célula vía lisis celular. Estos procesos duran generalmente hasta aproximadamente cuatro días después de la infección de las células por parte del vector viral. Sin embargo, estos procesos tienen una desventaja debido a que los procesos de extracción son tanto costosos como prolongados. Adicionalmente, la cantidad de ORF2 recuperada de las células no es muy alta; por consiguiente, un gran número de las células necesita ser infestado por un gran número de vectores virales con el fin de obtener cantidades suficientes de la proteína recombinante expresada para uso en vacunas y similares. Los actuales métodos para la inmunización frente a PCV2 incluyen vacunas basadas en ADN, tales como los descritos en la patente de EE.UU. na 6.703.023. Sin embargo, vacunas de este tipo han sido ineficaces para conferir inmunidad protectora frente a una infección por PCV2 y los síntomas clínicos asociados con la misma. El Síndorme Reproductor y Respiratorio Porcino (PRRS -siglas en inglés) es provocado por un virus que primero fue aislado y clasificado como un arterivirus en un año tan reciente como 1991. El síndrome de la enfermedad ha sido reconocido por vez primera en los EE.UU. a mediados de los años 1980 y se denominó "enfermedad porcina misteriosa". También se denomina enfermedad de la oreja azul. El nombre arterivirus porcino ha sido propuesto recientemente. El virus del PRRS tiene una particular afinidad por los macrófagos, particularmente los que se encuentran en los pulmones . Los macrófagos son parte de las defensas del cuerpo. Los que están presentes en los pulmones se denominan macrófagos alveolares . Éstos ingieren y eliminan bacterias y virus invasores, pero no en el caso del virus del PRRS. En su lugar, el virus se multiplica en el interior de ellos produciendo más virus y mata a los macrófagos. Una vez que ha penetrado en una piara, tiende a permanecer presente y activo indefinidamente. Hasta el 40% de los macrófagos se destruye, lo cual elimina una parte principal del mecanismo de la defensa de los cuerpos y permite que bacterias y otros virus proliferen y provoquen daño. Un ejemplo común de esto es el aumento perceptible de la gravedad de neumonía enzoótica en unidades de engorde/acabado cuando son infestadas con el virus del PRRS. Puede prolongarse hasta un año para que toda la camada, en particular en grandes piaras, sea infestada por primera vez y, aunque parece que el virus se difunde rápidamente en una piara, puede durar aproximadamente 4 - 5 meses antes de que al menos el 90% de las cerdas se vuelvan sero-positivas . Algunas cerdas siguen siendo naif . Además, no es inhabitual que piaras de cerdas contengan, 1-2 años después de la infección, menos del 20% de animales serológicos positivos. Sin embargo, esto no significa necesariamente que los animales no sigan siendo inmunes ni tampoco significa que hayan cesado en transferir la inmunidad a sus crías. Los animales adultos se desprenden de virus durante periodos de tiempo mucho más cortos (14 días) en comparación con cerdos en desarrollo que los pueden excretar durante 1-2 meses. La imagen clínica puede variar tremendamente de una piara a otra. Como guía, por cada tres piaras expuestas al PRRS por vez primera, una no mostrará ninguna enfermedad reconocible, la segunda mostraría una enfermedad suave y la tercera una enfermedad de moderada a grave. Las razones de ello no se comprenden claramente. Sin embargo, cuanto mayor sea el estado de salud de la piara, tanto menos graves serán los efectos de la enfermedad. Puede ser que el virus mute a medida que se multiplica, resultando algunas cepas que son muy virulentas y algunas que no lo son. El PRRS infesta a todos los tipos de piaras, incluidas unidades con un estado de salud elevado u ordinario, tanto de establos como al aire libre, independientemente del tamaño. Mycoplasma hyopne moniae (M hyo) es una bacteria pequeña (400-1200 nm) clasificada en la familia Mycoplasmataceae . M hyo está asociada con la Neumonía Enzoótica, una enfermedad respiratoria en cerdos que comúnmente se observa en cerdos de engorde y acabado. M hyo ataca los cilios de células epiteliales de la tráquea y los pulmones, determinando que los cilios cesen de batir (ciliostasis) y, finalmente, determinen que se aplasten zonas de los pulmones. Dependiendo del grado de la enfermedad, la ganancia de peso vivo diario de cerdos infestados se puede reducir en hasta un 17%. La Neumonía Enzoótica está ampliamente difundida en poblaciones de cerdos y está presente en casi cada una de las piaras. M hyo se considera un patógeno primario que facilita la penetración del PRRSV y otros patógenos respiratorios en los pulmones . En tres cepas separadas, 232, J y 7448, se han secuenciado sus genomas (Minion et al., J. Bacteriol. 186: 7123-33, 2004; Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187: 5568-77, 2005). La enteritis porcina proliferativa es una enfermedad diarreica común de cerdos de engorde-acabado y de crianza jóvenes, caracterizada por hiperplasia e inflamación del íleon y colon. A menudo, es suave y auto-limitante, pero a veces provoca una diarrea persistente, enteritis necrótica grave, o enteritis hemorrágica con alta mortalidad. La etiología es la bacteria intracelular, recientemente clasificada, Laweonia intracellularis . El organismo ha sido cultivado solamente en cultivos celulares, y han fracasado intentos de su propagación en medio exento de células. Los postulados de Koch se han cumplido mediante inoculación de cultivos puros de L intracellularis en cerdos de crianza convencional; se produjeron lesiones típicas de la enfermedad, y L intracellularis fue reaislado a partir de las lesiones. La forma no hemorrágica, más común, de la enfermedad afecta frecuentemente a cerdos de 18 a 36 kg y se caracteriza por una aparición repentina de la diarrea. Las heces son de acuosas a pastosas, parduzcas o tenuemente teñidas de sangre. Después de ~2 días, los cerdos pueden pasar por formaciones fibrinonecróticas amarillas que se han formado en el íleon. La mayoría de los cerdos afectados se recupera espontáneamente, pero un número significativo desarrolla enteritis necrótica crónica con emaciación progresiva. La forma hemorrágica se caracteriza por una palidez cutánea, debilidad y paso de heces alquitranadas, hemorrágicas o negras. Las cerdas jóvenes preñadas pueden abortar. Las lesiones pueden aparecer en cualquier lugar en la mitad inferior del intestino delgado, el intestino ciego o colon, pero son lo más frecuentes y obvios en el íleon. La pared del intestino se engrosa, y el mesenterio puede ser edematoso. Se amplían los nodulos linfáticos mesentéricos . La mucosa intestinal aparece engrosada y rugosa, puede estar cubierta de una membrana fibrinonecrótica parduzca o amarilla y, a veces, tiene hemorragias petequiales . Las formaciones necróticas amarillas se pueden encontrar en el íleon o atravesando el colon. Una necrosis de la mucosa difusa y completa en casos crónicos hace que el intestino se vuelva rígido, asemejándose a una manguera de jardín. Las lesiones de la mucosa proliferativas se encuentran a menudo en el colon, pero solamente se detectan mediante una inspección cuidadosa en la necropsia. En la forma profundamente hemorrágica existen heces alquitranadas rojas o negras en el colon y sangre coagulada en el íleon. El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVD - siglas en inglés) y el de la enfermedad de la Frontera son dos virus, que se encuentran en el mismo grupo de pestivirus que el virus de la fiebre porcina (peste porcina) , pero que principalmente infesta al ganado bovino y a las ovejas, respectivamente. Éstos pueden penetrar en piaras de crianza y provocar problemas reproductivos. La enfermedad no es una causa común de infertilidad en las cerdas y se consideraría baja en la lista de posibilidades desde un punto de vista diagnóstico. La leptospirosis es una enfermedad contagiosa de los animales, incluyendo el hombre, causada por diversas serovariedades leptospirales inmunológicamente distintas, la mayoría de las cuales se consideran subgrupos de Leptospira interrogans . Existen cinco serovariedades y grupos que son importantes en cerdos: pomona, australis, tarassovi , canicola, icterohaemorrhagicae y grippotyphosa . Las infecciones pueden ser asintomáticas o provocar diversos síntomas, incluidos anorexia, pirexia, apatía, íctero, abortos, partos muertos y otros problemas reproductivos vagos y muerte. Después de una infección aguda, leptospiras se localizan frecuentemente en los ríñones u órganos reproductores que consisten en pequeños focos grises diseminados de una nefritis focal intersticial, y son vertidos en la orina, a veces en grandes números durante meses o años . Dado que los organismos sobreviven en aguas superficiales durante períodos extensos, la enfermedad es a menudo de transmisión hídrica. En los Estados Unidos, la enfermedad se debe principalmente a las serovariedades Leptospira hardjo, Leptospira pomona y Leptospira grippotyphosa . El diagnóstico puede ser difícil, debido a que los títulos de anticuerpos pueden ser transitorios, durando menos de un mes . Además , Leptospira también se puede encontrar en animales sanos. L. australis serovariedad bratislava está muy comúnmente asociada con problemas reproductores . Piaras crónicamente infestadas exhiben abortos, partos muertos y cochinillos débiles.

La brucelosis es provocada por bacterias del género Brucella y se caracteriza por aborto, placenta retenida, infertilidad, orquitis en verracos y metritis grave en cerdas. En cochinillos, la enfermedad se caracteriza por parálisis posterior y cojera. La enfermedad en cerdos es provocada, casi exclusivamente, por Brucella suis biovariedades 1, 2 y 3. Un cierto número de otros mamíferos pueden portar y transmitir Brucella suis a cerdos. La infección se propaga rápidamente y causa muchos abortos en piaras no vacunadas. La transmisión ocurre principalmente mediante contacto con otro cerdo, aunque es posible una transmisión venérea. Un diagnóstico serológico puede ser difícil debido a un organismo relativamente común, Yersinia enterocoli tica 0:9 que comparte un antígeno común con Brucella y que, a menudo, determina resultados falsos positivos. Lesiones post-mortem incluyen habitualmente metritis y orquitis, y pueden incluir abscesos, a veces con focos de necrosis en el hígado. Clostridium es una bacteria gram-positiva ubicua, de la familia Clostridiaceae, que se encuentra habitualmente en la tierra, pero que también aparece de forma natural en los intestinos de la mayoría de los animales. Infecciones por C. difficile en cerdos se caracterizan por edema mesocolónico grave, diarrea y edema en otros tejidos, tal como el hidrotorax. Enteritis por Clostridium en cerdos es provocada por C. perfringens, y se caracteriza por enteritis crónica, que va acompañada de diarrea, pérdida de peso y fiebre. La infección con los tipos A, B y C de C. perfringens produce enteritis grave, disentería, toxemia y alta mortalidad en terneros jóvenes. Los tipos B y C producen ambos la toxina ß altamente necrosante y letal que es responsable del extenso daño intestinal. Esta toxina es sensible a las enzimas proteolíticas, y la enfermedad está asociada con la inhibición de proteólisis en el intestino. Se ha sugerido que el calostro de las cerdas, que contiene un inhibidor de tripsina, es un factor en la susceptibilidad de los cerdos jóvenes. La enfermedad puede provocar una muerte súbita en cochinillos de menos de una semana de edad y, lo más común, en el espacio de los 3 días del nacimiento. En cochinillos más viejos, Clostridium enteritis provoca un engrosamiento del intestino delgado, haciendo difícil la absorción de alimentos y nutrientes. Los cochinillos mueren habitualmente como resultado de una combinación de la infección y carencia de nutrientes . La muerte puede producirse en unas pocas horas , pero los casos menos graves sobreviven durante algunos días y es posible la recuperación en un período de varios días. La enteritis hemorrágica con ulceración de la mucosa es la lesión más importante en todas las especies. En términos generales, la parte afectada del intestino presenta un color azul profundo-púrpura y a simple vista parece ser un infarto asociado con torsión mesentérica. Se pueden analizar muestras de los contenidos intestinales para bacterias gram-positivas con forma de bastoncillos, y se pueden realizar filtrados para detectar toxinas y luego identificar por neutralización con antisuero específico. Se sospecha, aunque no se ha confirmado todavía, que Clostridium novyi es una causa de muerte súbita en ganado bovino y cerdos alimentados con dietas con alto contenido de granos, y en los que no se podían detectar lesiones preexistentes en el hígado. Las toxinas letales y necrosantes (principalmente toxina a) dañan el parénquima hepático, permitiendo de este modo que las bacterias se multipliquen y produzcan una cantidad letal de la toxina. Habitualmente, la muerte es súbita sin signos bien definidos. Los animales afectados tienden a quedar rezagados de la piara, asumen recumbencia esternal y mueren al cabo de unas pocas horas. La mayoría de los casos ocurre en verano y a principios del otoño, cuando la infección hepática provocada por tremátodos está en su esplendor. La enfermedad es más prevalente en ovejas de 1 a 4 años de edad y se limita a animales infectados con tremátodos hepáticos. La diferenciación de la fascioliasis aguda puede ser difícil, pero las muertes peragudas de los animales que muestran lesiones típicas en la necropsia deberían levantar sospechas de hepatitis necrótica infecciosa. Las lesiones más características son focos necróticos de color amarillo grisáceo en el hígado que a menudo siguen los rastros migratorios de los tremátodos jóvenes. Otros hallazgos comunes consisten en el pericardio agrandado relleno con un fluido de color paja, y en el exceso de fluido en las cavidades peritoneal y torácica. Usualmente, se produce una ruptura extensa de los capilares en el tejido subcutáneo, que hace que la piel adyacente se torne negra (de allí el nombre común enfermedad negra) . Clostridium septicum se halla en el suelo y los contenidos intestinales de animales (incluyendo el hombre) de todo el mundo. La infección comúnmente se produce a través de la contaminación de heridas que contienen tejido desvitalizado, suciedad o algún otro debilitante de los tejidos. Pueden infectarse las heridas causadas por accidente, castración, vacunación antihigiénica y parto. Los signos generales, tales como anorexia, intoxicación y fiebre alta, así como lesiones locales, se manifiestan al cabo de unas pocas horas o unos pocos días de la lesión predisponente. Las lesiones locales son prominencias blandas que se hunden al presionar y que se extienden rápidamente debido a la formación de grandes cantidades de exudado que infiltra el tejido conjuntivo subcutáneo e intramuscular de las áreas afectadas. Las acumulaciones de gas no son comunes . Edema maligno asociado con laceraciones se caracteriza por un edema acusado, toxemia grave y muerte en 24-48 h. La toxemia del tétanos es causada por una neurotoxina específica producida por el Clostridium tetani en el tejido necrótico. Casi todos los mamíferos, incluidos los cerdos, son susceptibles a esta enfermedad. Si bien el tétanos se distribuye por todo el mundo, hay algunas zonas, como la sección de Montañas Rocosas del Norte de los Estados Unidos, en donde el organismo es muy infrecuente en el suelo y en donde el tétanos prácticamente se desconoce. En general, la aparición de C. tetani en el suelo y la incidencia del tétanos en el hombre es mayor en zonas más cálidas de los distintos continentes. Clostridium tetani, un anaerobio con esporas esféricas terminales, se halla en el suelo y en los tractos intestinales. En la mayoría de los casos, se introduce en los tejidos a través de heridas, particularmente heridas por punción profunda, que proporcionan un entorno anaerobio adecuado. La infección con Salmonella spp puede producir diarrea en animales de todas las edades, especialmente aquellos que están estresados, amontonados o . expuestos a alimentación o suministro de agua densamente contaminado. La salmonelosis es causada por muchas especies de salmonelas y se caracteriza clínicamente por uno o más de tres síndromes principales: septicemia, enteritis aguda y enteritis crónica. La incidencia ha aumentado con la intensificación de la producción de todo tipo de ganado. A pesar de que diversos tipos de Salmonella pueden provocar infecciones en cerdos, las salmonelas clásicas encontradas en cerdos son S. choleraesuis y S. typhimurium. Sus patrones clínicos resultantes de la mayoría de salmonelas no son claros y las diferentes especies de salmonelas tienden a diferir en su epidemiología. El perfil plásmido y los patrones de resistencia a los fármacos a veces son marcadores útiles para estudios epidemiológicos. La salmonelosis septicémica está asociada, a menudo, con S choleraesuis . Los cochinillos infestados demuestran una desgana a moverse, anorexia, una fiebre alta de 40,5SC - 41,6SC, y pueden tener tos superficial. Los cochinillos también pueden encontrarse muertos con extremidades cianóticas. S choleraesuis es una de las raras enfermedades que pueden provocar tanto neumonía como diarrea y la mortalidad de cochinillos infestados es a menudo alta. La enterocolitis está generalmente asociada con la S typhimurium más común. Las infecciones se caracterizan por diarrea amarilla o acuosa que puede contener sangre o mucus a medida que progresa la infección. La mortalidad es baja y, a menudo, está asociada con deshidratación y deficiencia en potasio procedente de la diarrea. Las heces de animales infestados pueden contaminar el alimento y el agua, las carnes procesadas y frescas de mataderos, los productos vegetales y animales utilizados como fertilizantes o los piensos, forrajes y pastizales, y muchos materiales inertes. A pesar de que S choleraesuis raramente se encuentra en los alimentos. También se puede contagiar directamente a través de contacto con un animal infestado. Salmonella puede sobrevivir durante meses en zonas húmedas y calientes tales como establos de alimentación de cerdos o en cuevas de agua. Los roedores y las aves salvajes son también fuentes de infección. La prevalencia de la infección varía entre las especies y los países, y es mucho más alta que la incidencia de la enfermedad clínica, que comúnmente se precipita por situaciones estresantes tales como deprivación súbita del alimento, transporte, sequía, amontonamiento, parto y administración de algunos fármacos. Escherichia coli es una bacteria de la familia Enterbacteriaceae y es uno de los tipos principales de bacterias que aparecen de forma natural en los intestinos delgados de todos los mamíferos. A pesar de que habitualmente son inofensivas, algunas cepas de E coli pueden producir un cierto número de exotoxinas y endotoxinas que provocan infección y enfermedad. Exotoxinas térmicamente lábiles (LT -siglas en inglés) y térmicamente estables (ST - siglas en inglés) eon producidas activamente por algunas cepas y son las responsables de provocar diarrea. La variante de tipo II de toxina similar a Shigela (SLT-IIe) , Stx2e y la enfermedad de edema de verotoxina actúan sobre la pared de las arterias pequeñas, dando como resultado un edema. Endotoxinas, tal como lípido A, juegan un papel en la mastitis e infecciones del tracto urinario. La infección por E. coli se caracteriza por un cierto número de diferentes síntomas, dependiendo de la cepa particular implicada, incluida diarrea, ojos hundidos, desarrollo poco vigoroso, pérdida de peso visible, crecimiento atrofiado, depresión, edema del intestino, mastitis, cistitis, pielonefritis y muerte. E. coli se pueden clasificar y codificar por su pared celular (antígenos 0) y fimbrias (antígenos F) . Por ejemplo, la diarrea está a menudo asociada con E. coli Abbotsto n: 0147, F4, F5, mientras que el edema del intestino está asociado con fimbrias F18. Identificar correctamente el código es esencial para la selección de la vacuna correcta. Las infecciones por E. coli comprometen al sistema inmune del cerdo y las muertes son a menudo el resultado de infecciones secundarias y enfermedad. La viruela es una enfermedad que provoca lesiones de la piel, llagas, pústulas y costras Eperythrozoonosis es una enfermedad Rickettsial (hemotrófica) provocada por Eperythrozoon suis , un organismo bacteriano extracelular que se adhiere a membranas de los eritrocitos de cerdos, induciendo su deformación y lesión. La enfermedad se caracteriza por anemia e íctero (decoloración amarilla de membranas mucosas, esclera y oídos internos) . Puede conducir a bajas tasas de concepción, otros problemas de reproducción indefinidos, e incluso la muerte. La peste porcina, también conocida como Fiebre Porcina Clásica (CSF - siglas en inglés) o Fiebre Porcina Africana (ASF - siglas en inglés) es una enfermedad provocada por un virus Flaviviridae, que es un virus de ARN con cubierta o, en el caso de la ASF, un virus de ADN con cubierta que está relacionado con los virus varicela. Clínicamente, CSF y ASF son indistinguibles. Los primeros síntomas son una disminución de la actividad y somnolencia con algo de anorexia y los cerdos pueden aparecer desanimados. En el espacio de días, los cerdos presentan una fiebre acusada (41-42 grados Celsius) , que a veces va acompañada de enrojecimiento de la piel. A continuación, los cerdos desarrollan una conjuntivitis y estreñimiento que conduce a diarrea amarillenta. En las piaras, los cerdos aparecerán desanimados y, a menudo, se agruparán. Unos pocos cerdos pueden sufrir convulsiones antes de morir. Los cerdos comienzan a morir con una coloración púrpura diseminante de la piel y la muerte se produce, a menudo, en el espacio de 10-20 días post-infección. Los cerdos supervivientes se verán bastantes veces afectados por un retardo serio de su desarrollo y por lomos arqueados. En piaras establecidas, los cochinillos infestados por su madre durante el embarazo pueden resultar en aborto, momificación, malformaciones, partos muertos y cochinillos nacidos débiles. Cochinillos nacidos de madres infestadas por CSF pueden seguir siendo sanos, pero continuamente difunden la enfermedad a lo largo de sus vidas . Pneumonic pasteurellosis y estreptococos son provocados por Pasteurella mul tocida y diversas especies de estreptococos, típicamente S. euis . La infección por el agente causante representa generalmente la fase final del síndrome respiratorio post-destete. Los síntomas clínicos aparecen en tres formas, la forma aguda está asociada, lo más comúnmente, con animales P. multocida serotipo B. presentes con dispnoea, respiración forzada, latidos violentos del corazón, fiebre alta (42,2 grados Celsius), abatimiento y, finalmente, muerte. En algunos casos, el abdomen se vuelve púrpura con decoloración. Una segunda forma es una forma sub-aguda, caracterizada por pleuritis, tos y dificultad de respirar. Los cerdos pueden perder cantidades importantes de peso y pueden tener un desarrollo deficiente o ninguno, con serias consecuencias en la abundancia de cerdos . La forma crónica se presenta con tos ocasional, latidos violentos del corazón y poca o nada de fiebre. Esta forma afecta generalmente a cerdos de 10-16 semanas de edad. La meningitis estreptocócica provoca una inflamación de las meninges que son las membranas que cubren el cerebro. En el cochinillo lechal, habitualmente es provocada por Streptococcus suis, Haemophilus parasuis o, a veces, bacterias tales como E. coli y otros estreptococos. S. suis tiene muchos serotipos. En la mayoría de los países, S. suis tipo 1 es el principal en cochinillos lechales, pero esto puede no ser cierto en otros países. Por ejemplo, en Dinamarca es el tipo 7. S. suis también determina problemas colectivos, particularmente de los tipos 1 y 14. S. suis es portado durante largos periodos en las tonsilas y puede ser transmitido al cochinillo lechal por la cerda o por otros cochinillos. La cerda proporciona también un nivel variable de inmunidad en el calostro. La meningitis estreptocócica en cochinillos lechales es esporádica en cochinillos individuales. La meningitis estreptocócica puede ser peor en cochinillos lechales cuando el organismo haya sido introducido en la piara por vez primera, o en los casos en los que es secundaria a la infección con PRRS. La pseudorrabia, también conocida como virus de la rabia porcina, Suid herpes virus, en el que el agente causante es un virus herpes de ADN con cubierta. En piaras naif, los cerdos neonatos presentan un intervalo de síntomas nerviosos centrales graves de coordinación desde ajustada a grave. La posterior parálisis puede resultar en cochinillos que se sientan de una manera que se asemeja a los perros. Adicionalmente, la mortalidad es elevada. En cerdos destetados, los síntomas nerviosos centrales se pueden reducir, pero pueden venir acompañados por un aumento de síntomas respiratorios. Bastantes veces, las enfermedades respiratorias están asociadas con infecciones secundarias . Cerdos destetados pueden adelgazar y padecer un desarrollo enfermizo y, a menudo, atrofiado. En cerdos en desarrollo, los síntomas nerviosos centrales continúan reduciéndose, al tiempo que los síntomas respiratorios aumentan. El grado de enfermedad respiratoria depende de la presencia y gravedad de infecciones secundarias. En adultos, predominan los síntomas reproductores . Las cerdas pueden abortar y es probable que animales estrechamente infestados paran cochinillos nacidos muertos o débiles. En piaras establecidas, puede haber pocos síntomas clínicos. El Virus de la Influenza Porcina determina gripe porcina y pertenece al grupo del virus de la influenza de Tipo A. En piaras naif, los síntomas clínicos pueden estar presentes en brotes explosivos, enfermando la totalidad o muchos animales al mismo tiempo. Los animales pueden estar presentes con inactividad, depresión, apilamiento/inyección y anorexia. Los animales respiran a menudo por la boca y la respiración es laboriosa. Puede aparecer un acceso de tos tras el movimiento. Otros síntomas clínicos incluyen una descarga nasal y ojos hinchados con temperaturas rectales entre 40,5 - 41,5a Celsius. Las altas temperaturas en una cerda primípara puede resultar en abortos, infertilidad, producción de pequeñas camadas débiles y partos muertos incrementados. En piaras establecidas, aparece una reinfección anual. La colitis espiroquética es provocada por la bacteria Brachyspira pilosicoli . Esta infección afecta generalmente a cerdos de engorde/acabado de 10-20 semanas de edad. Se caracteriza por diarrea de extenuación no fatal de cerdos en desarrollo que resulta en un número incrementado de los días necesarios para acabar. La diarrea resulta también en la reducción de la eficacia de la alimentación y produce diarrea acuosa o heces sueltas. Aproximadamente la mitad de los cerdos muestra diarrea de verde a parduzca. de acuosa a mucoide, transitoria a persistente, sin sangre. Los síntomas clínicos son más comunes 10-14 días después de mezclar y cambiar la alimentación. La disenteria porcina es provocada por la bacteria Brachyspira hyodysentheriae. Actualmente existen doce serotipos conocidos. Síntomas clínicos en piaras establecidas incluyen diarrea, una pérdida rápida del estado en algunos cerdos, un aspecto peludo, deshidratación, abdomen doloroso y la muerte de uno o dos cerdos antes de que otros cerdos muestren cualesquiera síntomas. En un brote clave en piaras naif, todos los grupos de edad desde cochinillos lechales a cerdas adultas pueden verse afectados. La gastroenteritis transmisible es una enfermedad de los intestinos provocada por un coronavirus. Se encuentra en la misma familia que el coronavirus respiratorio porcino, virus de la diarrea epidémica y virus de encefalomielitis hemoaglutíñante. Síntomas clínicos iniciales son diarrea acuosa, vómitos y anorexia. Cochinillos menores a 21 días de edad generalmente mueren, los de destete se vuelven de desarrollo poco vigoroso, mientras que los de engorde, acabado y adultos se ven generalmente afectados ligeramente y sobrevivirán si se les proporciona agua adecuada. Parvovirus es una enfermedad caracterizada por problemas de reproducción en cerdos . El agente causante es un virus de ADN pequeño, sin cubierta. Los fetos son el único grupo afectado y el efecto sobre el feto depende de la edad a la que son infestados. A los 10-30 días de edad, la infección resulta en la muerte y reabsorción del feto. Entre 30-70 días de edad, la infección resulta en la muerte y la momificación. Y de 70 días hasta la muerte, las infecciones resultan en el nacimiento de cochinillos débiles y momificación. La enfermedad es capaz de atravesar la placenta y luego desplazarse en cada feto a lo largo del útero. En las cerdas, los síntomas clínicos son partos muertos, cochinillos momificados, muertes de embriones, infertilidad y la producción de un número significativamente reducido de descendencia nacida viva. El aborto no es un rasgo característico de infección por parvovirus. Actinobacillus pleuropneumonia, también conocida como APP y Haemophilus pleuropneumonia, es provocada por la bacteria Actinobacillus pleuopneumonia . Actualmente existen 15 serovirus descritos y la gravedad de los síntomas clínicos difiere entre los diferentes serovirus y la presencia de otros factores. Los serovirus 1, 5, 9, 10 y 11 se consideran los más virulentos. Adicionalmente, los serovirus 1, 9 y 11; 2, € y 8; y 4 y 7 pueden reaccionar cruzadamente. Son susceptibles cerdos de todas las edades. Los síntomas clínicos son una enfermedad repentina que resulta en animales que se tumban mucho y que presentan una elevada temperatura rectal de 41, 5S Celsius. Los animales son generalmente anoréxicos y no beben, sus extremidades se vuelven cianóticas y frías al tacto . La cianosis se puede difundir por todo el cuerpo y desarrollan graves dificultades respiratorias, a menudo con una respiración por la boca, antes de morir. Espuma manchada de sangre se puede observar en la boca y en las fosas nasales y la muerte se produce, generalmente, en el espacio de. 24-48 horas. Síntomas clínicos agudos incluyen un elevado porcentaje de animales en un grupo con depresiones y que se tumban, altas temperaturas rectales de 40,5 - 41a Celsius, anorexia, falta de beber, dolor respiratorio agudo, tos, respiración por la boca, cianosis, vómitos y aborto. Síntomas clínicos sub-agudos incluyen tos intermitente en un grupo de cerdos, una pérdida general del apetito y una reducción en el desarrollo. Cyrovar tipo 3 se presenta con artritis, endocarditis y abscesos. En piaras crónicamente afectadas, puede no verse afectada la ganancia diaria de peso, pero puede oirse una tos intermitente. La Enfermedad de Glásser es provocada por la bacteria Haemophilus parasuis (Hps) , de la que existen al menos quince tipos diferentes. Se encuentra por todo el mundo y los organismos están presentes incluso en piaras muy sanas. Si piaras de este tipo se organizan utilizando técnicas SPF o MEW y están exentas de Hps, puede ser devastador cuando ee contaminan por vez primera, produciendo una enfermedad similar a ántrax con una elevada mortalidad en cerdas. En la mayoría de lae piaras en las que la bacteria es endémica, las cerdas producen una fuerte inmunidad materna que normalmente persiste en su descendencia hasta las 8 a 12 semanas de edad. Como resultado, los efectos de la infección en animales destetados es habitualmente nula o mínima. Sin embargo, la enfermedad puede observarse en cerdos lechales . Los cerdos se ven habitualmente infestados sub-clínicamente cuando siguen protegidos por el anticuerpo materno y despuée eetimulan eu propia reepueeta inmunitaria. Sin embargo, ei la inmunidad materna deeaparece antee de verse infestados, pueden desarrollar una enfermedad grave. Esto se produce habitualmente en algún momento despuée del deetete. También puede actuar como un patógeno eecundario a otras enfermedades principalee, en particular neumonía enzoótica (EP - eiglae en inglée) (Mycoplasma hyopneumoniae) . Loe brotee de la enfermedad son experimentados a veces en cerdos lechales, en particular en piaras de cerdos jóvenes. Hps ataca las superficiee lieae de lae articulacionee, tegumentoe de loe inteetinoe, pulmonee, corazón y cerebro provocando neumonía, infección del eaco del corazón, peritonitie y pleurisia. Se difunde por la respiración. La enfermedad provocada por Hps es rara en cerdas, a menos que la cerda seca sea naif. Cojera o rigidez, ligeras hinchazones sobre las articulaciones y loe tendones y, raramente, meningitis, se observan ocasionalmente en cerdas jóvenee. En cochinilloe, la enfermedad aguda se presenta con cerdos rápidamente deprimidos con temperatura elevada, inapetencis y una reluctancia a crecer. Un raego característico es una tos corta de 2-3 episodios. No es inhabitual una muerte súbita en cochinillos lechales buenos. Se sabe también que Hps provoca casos individuales de artritis y cojera con fiebre e inapetencia. La enfermedad crónica se caracteriza por cerdos pálidos y de deearrollo deficiente. También puede produciree una muerte eúbita. Para cerdoe de deetete y de engorde, loe cerdoe con la enfermedad de Gláeeer ee convierten rápidamente con depresión o simplemente pueden encontrarse muertos . Otros síntomas incluyen una temperatura elevada, anorexia, una reluctancia a crecer, síntomas nerviosos tales como accesos y convulsiones incluida meningitis, y cerdos deficientes, que se extenúan y a menudo resulta la aparición de pelo. En cerdos en desarrollo jóvenes, loe eíntomae eiguientee eon los más comunes: fiebre, meningitis suave, artritis, cojera, neumonía, infección del saco del corazón, peritonitis y pleurisia. De nuevo, un rasgo característico es una tos corta de solamente 2-3 episodios. La epidermitiß exudativa es provocada por la bacteria Staphylococcus hyicus que vive normalmente eobre la piel sin provocar enfermedad. No ee sabe por qué algunas veces se expande y provoca una dermatitis la cual mana fluido grasiento. Produce toxinas que son absorbidae en el eietema y deteriora el hígado y loe riñonee . En el cochinillo lechal la enfermedad ee confina habitualmente a animalee individualee , pero puede ser un gran problema en nuevas piaras de cerdos jóvenes y cerdoe deetetadoe. Durante los días que preceden inmediatamente a la lechigada, la bacteria ee multiplica pródigamente en la vagina de lae cerdas, de modo que los cochinillos son infeetadoe durante el proceeo de nacimiento o poco deepuée . Síntomae en lae cerdae incluyen lesiones no comunes, pero localizadas que se pueden observar particularmente detrás de la cara y los ojoe. Cochinilloe gravemente afectadoe morirán. En loe cochinillos, los síntomas incluyen lesionee localizadae en los flancos y detrás de las orejas. Las leeionee comienzan habitualmente con pequeñae zonas de infección, oecurae y localizadas, en torno a la cara o sobre las patas. La piel a lo largo de los flancos de la panza y entre las patas torna a un color pardo, implicando gradualmente a la totalidad del cuerpo. La piel adquiere arrugas con formación de escamae de grandee zonas y tiene un tacto grasiento. En casos graves, la piel ee vuelve negra debido a la necroeie y los cochinillos mueren. Se observa una imagen máe localizada ei la cerda ha traneferido algo de inmunidad al cochinillo, con pequeñas lesionee circunecritas de un diámetro de aproximadamente 5-10 mm de diámetro que no se difunden. Para cerdos destetadoe y de engorde, loe eíntomas comienzan habitualmente alrededor de 3 días despuée del deetete, con zonae de infección pardae localizadas en torno a la cara o sobre las patas en donde la piel ha eido dañada. Puede ulceraree. La piel a lo largo de los flancos de la panza y entre las patas torna a un color pardo, implicando gradualmente a la totalidad del cuerpo. La piel adquiere arrugas con formación de escamae en grandee zonae y progresa a una textura grasienta oecura y, en casos graves, se vuelve negra. Casos de este tipo mueren habitualmente debido a las toxinas producidas por los organismos de estafilococos. En criaderos puede veree implicado haeta el 15% de la población y la deehidratación ee común. La erisipela porcina es provocada por una bacteria, Erysipelothrix rhusiopathiae, que ee encuentra en la mayoría, si no en todas lae granjas de cerdos. Hasta el 50% de los animales puede portarla en sus tonsilas. Siempre está presente en el cerdo o en el entorno, ya que es excretada a travée de la saliva, las heces o la orina. También se encuentra en muchas otras especies, incluidas aves y ovejas, y puede sobrevivir fuera del cerdo durante unas pocas semanae y durante más tiempo en sueloe ligeroe. Aeí, es imposible eliminarla de una piara. Las heces infeetadae son probablemente la principal fuente de infección, particularmente en pocilgae de engorde y de acabado. La bacteria eola puede provocar la enfermedad, pero infeccionee víricae concurrentee, talee como PRRS o influenza, pueden disparar los brotes . La enfermedad ee relativamente no común en cerdoe de menoe de 8-12 semanas de edad, debido a la protección proporcionada por anticuerpos maternales procedentes de la cerda a travée del caloetro. Loe animalee máe eueceptiblee eon cerdoe de engorde, cerdoe jóvenee no vacunadoe y hasta cerdas de 4a parto. El organismo ee multipilica en el cuerpo e invade el torrente eanguíneo para producir una eepticemia. La rapidez de multiplicación y el nivel de inmunidad en el cerdo determina entoncee loe eíntomae clínicos. La eperitrozoonosis (Epe) es una enfermedad provocada por una bacteria denominada Eperythrozoonoeis suis la cual ataca la superficie de glóbulos rojoe y, a vecee, loe deetruye. El cerdo puede volveree entoncee anémico y los productos que quedan deepués de la destrucción de las células puede provocar íctero. La enfermedad clínica se observa, más comúnmente, en cerdos de engorde jóvenee. Sin embargo, también puede provocar problemae de reproducción en la piara de crianza. Una cerda puede portar Epe y eeguir eetando bastante sana, pero puede atravesar la placenta, resultando cerdos débilmente pálidos cuando nacen. Epe está presente en la mayoría, si no en todas lae piarae, pero ee deeconocen loe mecanismos que permiten que se vuelva patógeno y produzca enfermedad en algunas poblaciones y no en otras . La incidencia de la enfermedad es baja. La encefalomiocarditis, o EMC, infesta y provoca enfermedad en una amplia gama de animalee vertrebadoe, pero loe cerdoe parecen eer lae especies de animales de granja más susceptibles. El virus es de alcance mundial, pero difiere en la patogenicidad y virulencia en diferentes paíees y regiones. En la mayoría de los países de Europa, particularmente aquellos en la UE, tiende a ser relativamente ligera o no patógeno y raramente se diagnostica la enfermedad en cerdoe. En Australia lae cepae parecen eer mucho máe virulentae para cerdoe que las de Nueva Zelanda. Cepas virulentas en Florida, el Caribe y, probablemente, América Central, dañan el corazón y provocan la muerte, mientras que aquellas en el Medio Oeste de EE.UU. tienden a provocar problemas reproductores. La enfermedad clínica en cerdos tiende a produciree cuando aumenta el número de las ratas hasta niveles de plaga. Loe cerdoe pueden ser infestados por ratas o por los alimentos o el agua contaminados por ratas. No parece que se difunda muy fácilmente entre los cerdos. En piaras afectadas no existen habitualmente síntomae clínicoe en cerdos destetadoe y de engorde . a enfermedad de Aujeszky, o AD (siglas en inglés) , es una enfermedad importante de los cerdos provocada por un virus herpes. El virue puede permanecer oculto en loe nervios del cerdo en un estado portador durante largos periodoe de tiempo y luego puede eer reactivado. Una vez introducido em una piara, el virue permanece habitualmente allí y puede afectar de forma continua el comportamiento reproductor a niveles variables. El virus puede sobrevivir hasta durante tree semanas fuera del cerdo. Se producen brotes agudos de la enfermedad cuando cepas virulentae del virue infeetan primero una piara susceptible, no vacunada. El virus cruza el útero y la placenta e infesta a los fetos. El cerdo es el huésped principal. Sin embargo, los perros y el ganado vacuno pueden también verse infestadoe, pueden moetrar eíntomae nervioeoe y morir. La infección por citomegalovirus porcino (PCMV - eiglae en inglée) ee provocada por una virue herpes que se encuentra en los tejidos por todo el cuerpo, incluida la nariz de cochinillos recien nacidoe en donde provoca inflamación (rinitie) . La PCMV eetá preeente por todo el mundo y existe en la mayoría si no en todas las poblaciones de cerdos, pero la mayoría de lae infecciones son enfermedades eub-clínicas y las enfermedades clínicas son raras . La serología llevada a cabo en el Reino Unido, por ejemplo, indica que más del 90% de las piaras han sido expuestae a la infección. La rinitis producida por el virue no es común y se produce principalmente en cerdos recien nacidos y no tiene relación alguna con la rinitis atrófica provocada por la bacteria Pasteurella mul tocidia productora de toxinas. Por lo tanto, en la mayoría de las piaras la infección no es significativa y, excepto en algunas ocasionee que provoca un suave estornudo, no tiene ningún efecto principal sobre la salud del cerdo. La enfermedad del ojo azul es una enfermedad viral que provoca síntomas nerviosos, fallo reproductor y opacidad o coloración de azul de la córnea. Se observa principalmente en México, pero también ha sido reseñada en otros países. No se obeerva en Europa. Síntomae incluyen falta de apetito, opacidad de la córnea - conjuntivitie, eíntomae nerviosos tales como paroxismoe y convuleionee, una tendencia a eentaree como loe perroe, fiebre, recaíadae incrementadae , intervaloe incre éntadoe de deetete a apareamiento, partoe muertoe, cochinillos momificados, alta mortalidad en cochinillos, testículos hinchados y pérdida de libido. El virus de la encefalitis B japonesa (JE - siglas en inglés) ee un virus difundido por mosquitos y solamente es importante en países en los que prevalecen loe ineectoe. La mayoría de loe animalee domésticos se ven afectados. Provoca una encefalitis en el eer humano. El cerdo es una fuente importante de infección. Síntomas incluyen cochinillos momificados o nacidoe muertoe, eíntomae nervioeoe en cochinillos tales como psroxiemoe y convuleiones, y fluido de edema en cochinillos. También puede provocar infertilidad y testículos hinchados en verracos . La diarrea epidémica porcina (PED - siglae en inglés) es provocada por un coronavirus algo similar al que provoca TGE. Este virue eetá muy difundido en Europa. El virue daña las vellosidadee del inteetino, reduciendo así la euperficie de absorción, con pérdida de fluido y deehidratación. Deepués de la introducción del virus en una piara de crianza sueceptible, ee desarrolla una fuerte inmunidad a lo largo de doe a tres eemanae . La inmunidad del caloetro protege entoncee a los cochinillos. El virus deeaparece habitualmente de forma eepontánea de piarae de crianza, particularmente lae pequeñas (< 300 cerdas) . Los brotes agudoe de diarrea ee producen cuando el virue ee introduce por primera vez en una población eueceptible. En talee caeos, hasta el 100% de las cerdas pueden verse afectadas, mostrando una diarrea de ligeros a muy acuoea. Se reconocen doe cuadroe clínicoe: la PED de tipo I eolamente afecta a cerdoe de engorde, mientrae que la PED de tipo II afecta a todas las edades, incluidos cerdos lechalee y cerdae madurae . El periodo de incubación ee de aproximadamente 2 díae y la diarrea dura de 7 a 14 díae . En cerdoe lechalee, la enfermedad puede eer leve o grave con mortalidadee de hasta el 40%. En grandes piaras de crianza, particularmente si se mantienen extensamente, no todas las hembras eon infeetadae por vez primera y puede exietir una recidiva. Eeto eólo ee produce en cochinillos que maman de cerdas sin anticuerpos maternos y, por lo tanto, es esporádica. La infección por coronavirus respiratorio porcino (PRCV -siglas en inglés) apareció por vez primera en cerdos en Europa hace unos diez años o máe. Eetá relacionada, pero ee distinta del virus de la TGE, que ee otro coronavirue . Se pienea que ee difunde entre granjas por el viento y, así, es extremadamente difícil de mantener a las piaras libres del mismo. La infección tiene a menudo lugar en el cerdo lechal a las 2 a 3 semanae de edad, pero carece de importancia. Puede tener un efecto eobre el tejido de loe pulmonee cuando eetán presentes otros agentee patógenoe reepiratorios en complejos de enfermedades respiratorias crónicas. Habitualmente, las cerdas no presentan síntomas, pero puede producirse un acceso de tos en presencia de otros agentes respiratorioe. En cochinillos puede eetar presente un acceso transitorio de tos. En cerdos de destete y de engorde, lae piaras expuestas por vez primera tienen pocos síntomas de la enfermedad, si los tienen. El síntoma más común ee un acceeo traneitorio de toe que dura eólo una pocae horae . La infección por rotavirus ee una infección vírica que está muy difundida en poblaciones de cerdoe. Eetá presente en la mayoría, si no en todas las piaras de cerdos con virtualmente un 100% de sero-convereión en la manada adulta. un rasgo epidemiológico adicional es su persietencia fuera del cerdo en donde ee reeietante a loe cambioe medioambientales y a muchos deeinfectantee. Loe anticuerpoe maternoe pereieten durante 3-6 eemanae, después de lo cual los cerdos ee vuelven eueceptiblea a la infección, pero la expoeición no deeemboca neceeariamente en una enfermedad. Se eetima que eólo el 10-15% de diarreae en loe cerdoe ee inician por una infección por rotavirue primaria. En la piara madura, la enfermedad aparece deepuée de que los cochinillos tengan 7 a 10 días de edad. Se convierte progresivamente en menos importante con la edad. Sin embargo, si están presentee cepae patógenae de E. coli , puede produciree una enfermedad grave con alta mortalidad. La rabia ee provocada por un virus y se considera una enfermedad rara en cerdos . Es invariablemente fatal en todas las eepeciee, incluido el eer humano - de ahí su importancia. La rabia está ausente del Reino Unido, pero está presente en muchos otros países por todo el mundo. La infección en cochinillos y cerdae ee rara. En cerdas, cerdos de destete y cerdos de engorde el cominezo de la enfermedad es súbito, con síntomas que incluyen un tic nervioso de los músculoe de la cara, paroxismos y convulsiones, masticación rápida, salivación, músculoe que pueden eepaemaree y puede producirse una parálisis posterior. La muerte tiene lugar habitualmente en el espacio de 3 días. La enfermedad vesicular porcina (SVD - siglas en inglés) es un virus diferente de los virus que provocan la fiebre aftosa (FMD - eiglae en inglés) . Sin embargo, produce una enfermedad en cerdos que no se puede distinguir clínicamente de la FMD. Esta enfermedad debería ser siempre considerada si aparece una repentida difusión de cojera con vesículas o blistere en el hocico, lengua y partee euperiores de las uñas. La tuberculosis afecta a mamíferoe, incluidae pereonas, aves y cerdos. El organismo causante, Mycoiacterium tuberculosis, ee eub-claeifica en tipoe, humano, bovino y aviar. Al tipo aviar ee le alude como M. avium o, más frecuentemente, como complejo aviar /intracelular, ya que no es una especie uniforme. M. avium infesta principalmente a aves, pero también se encuentra en el medio ambiente junto con M. intracellulare que es predominantemente saprofítico o de vida en libertad. Los cerdos eon raramente infeetados por los tipos humano o bovino, pero eon infeetadoe por el complejo aviar/intracélular. El complejo avia /intracelular también provoca infección eub-clínica no-progreeiva en personas sanas. La preocupación principal es que podría provocar una enfermedad más grave en personae deeprovistas del eietema inmune y en pereonae con SIDA. En la mayoría de loe paíeee, ei se encuentran leeiones en el cuello en el matadero, se desecha la cabeza entera y si se encuentran en los nodulos linfáticos mesentéricoe que drenan loe intestinos se condenan las asadurae. Si eetae leeionee eetán máe difundidae por el cuerpo, lo cual ee raro, puede condenarse o cocerse la carcasa entera. Si por parte del inspector cárnico se pasan por alto pequeñae leeionee, una cocción normal en la cocina destruye el organismo. En todos los cerdos la infección provoca pequeñoe nodulos en los nodulos linfáticos del cuello y los que drenan el intestino delgado. En la gran mayoría de caeos, las lesiones son no progresivas, no se difunden por el cuerpo, no hacen enfermar al cerdo y no se excretan. No exieten eíntomas clínicoe y no exiete diferencia en el comportamiento entre cerdoe infeetadoe y no infeetadoe. El virus de exantema vesicular de cerdos (VES - eiglae en inglée) ee diferente del que provoca la fiebre aftoea (FMD) y la enfermedad veeicular en cerdoe (SVD) , pero produce una enfermedad en cerdoe que no ee puede dietinguir clínicamente de FMD y SVD. A diferencia de FMD, eolamente afecta a cerdos. Los síntomas incluyen una mortalidad baja, pero pueden existir algunas muertes en cochinillos lechales. Otros síntomas incluyen salivación, inapetencia y vesículas en torno a la boca, nariz, lengua y pies. La estomatitis vesicular (VS - eiglae en inglée) provoca una enfermedad que ee prouduce principalmente en América del Sur y en Centroamérica, ocaeionalmente en loe EE.UU. y raramente en forma de epidemias tan al Norte como Canadá y tan al Sur como Argentina. El virus VS produce una enfermedad en cerdos que no se puede distinguir clínicamente de FMD, SVD y VES. Sin embargo, lo máe frecuentemente la infección de loe cerdos es subclínica. En todoe los cerdos la infección se caracteriza por el babeo de saliva, lesionee en loe piee y cojera, una reducción en la taea de deearrollo, un aumento de la temperatura corporal haeta 40-41°C, la aparición de veeículae (blietere) de haeta 30 mm de diámetro en la nariz, loe labioe, lae tetae y en torno a lae coronas de los cascoe que pueden hacer parecer cojoe a loe cerdos. La mortalidad es habitualmente baja y la mayoría de los cerdos se recupera en una a dos semanae . La rinitis atrófica, enfermedad progresiva y no progresiva, que provoca inflamación de la nariz y puede ser provocada por una diversidad de bacterias y suetanciae irritantee. Durante el proceso de la infección, las estructurae delicadae o las conchas nasalee en la nariz son dañadas y ee atrofian o deeaparecen. La rinitie atrófica progreeiva deecribe una enfermedad específica en la que los tejidos de la nariz ee atrofian permanentemente. Eeta rinitis es provocada por cepas de Pasteurella mul tocidia (PMt) productoras de una toxina específica. Existen dos tipos, A y D. En cerdos lechales, loe primeroe eíntomas son el estornudo, resoplidoe y una descarga naeal, pero en brotes agudos en donde hay pocos anticuerpos maternos, la rinitis puede ser tan grave hasta el punto que se produce una hemorragia de la nariz. Hacia las tres a cuatro semanae de edad y deede el destete hacia delante existe evidencia de rasgón y una malformación de la nariz asociada con un retorcimiento y un acortamiento. Los cerdos gravemente afectados pueden tener problemae al comer. Existe una ganancia de peso diaria considerablemente reducida. En brotes graves, los cerdoe no pueden deearrollaree haeta alcanzar el peeo del mercado. Loe virus de la encefalitis equina del Este (EEEV -eiglas en inglés) son miembros del género Alphavirus, familia Togaviridae. Loe EEEV pueden eer tranemitidoe a animalee equinoe y eeres humanos la picadura de un mosquito infestado. Además de caballos y seres humanos, los EEEV pueden producir una enfermedad grave en especies comunes de ganado talee como cerdoe y ganado vacuno. Loe EEEV, o anticuerpos específicoe para el virus, han sido recuperados de aves tales como pavo, faisán, codorniz, avestruz y emú, entre otras. La artritis por Mycoplasma ee provocada por una infección por Mycoplaema hyosynoviae. Esta artritis se caracteriza por la inflamación de una o más articulaciones y ee común en todos los cerdos y cerdas lechales y de engorde. Sin embargo, es rara en cochinillos. La infección en los cerdos ee también provocada por adenovirus y virus de la encefalomielitis hemoagl tíñant . Por coneiguiente, lo que ee neceeita en la técnica es un método de obtener proteína 0RF2 que no requiera de la extracción de la proteína 0RF2 del interior de células infestadas. Lo que se necesita adicionalmente son métodos de obtener proteína 0RF2 recombinante en cantidadee euficientee para preparar eficazmente compoeicionee de vacunae . Lo que eigue neceeitándoee adicionalmente son métodos para obtener proteína 0RF2 que no requieran los métodoe complicados y laboriosos requeridos por los actuales protocolos de extracción de la proteína 0RF2. Finalmente, con respecto a lae compoeiciones, lo que se necesita en la técnica es una composición inmunogénica que confiera una inmunidad protectora frente a una infección por PCV2 y que reduzca la gravedad o prevenga de los síntomae clínicoe aeociados con la miema. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La preeente invención eupera loe problemae inherentee en la técnica anterior y proporciona un avance precieo en el eetado de la técnica. Eepecíficamente, un aepecto de la preeente invención proporciona métodoe mejoradoe para producir y/o recuperar proteína recombinante 0RF2 de PCV2 , i) permitiendo la infección de célulae eueceptiblee en cultivo con un vector viral recombinante que contenga eecuenciae codificadorae de ADN de 0RF2 de PCV2, en donde la proteína 0RF2 ee expreeada por el vector viral recombinante, y ii) deepuée de ello, recuperar la 0RF2 en el eobrenadante. Inesperadamente, se ha descubierto que 0RF2 ee liberada en el eobrenadante en grandee cantidadee si se deja que la infección y subsiguiente incubación de las células infestadae progreeen hasta más allá del típico proceso de recuperación de 0RF2 de PCV2 anterior, que extrae la 0RF2 de PCV2 del interior de células. Además, se ha encontrado, sorprendentemente, que la proteína 0RF2 de PCV es robusta frente a la degradación prototípica fuera de las células de producción. Los dos hallazgos juntoe permiten una recuperación en grandes cantidades de proteína 0RF2 de PCV2 a partir del sobrenadante de cultivos celulares infestadoe con vectoree virales recombinantes que contienen un ADN de 0RF2 de PCV2 y que expresan la proteína 0RF2 de PCV2. Altas cantidades de proteína 0RF2 de PCV2 significa más de aproximadamente 20 µg/mL de sobrenadante, de preferencia más de aproximadamente 25 µg/mL, inclueo más preferiblemente más de aproximadamente 30 µg/mL, inclueo máe preferiblemente máe de aproximadamente 40 µg/mL, inclueo máe preferiblemente más de aproximadamente 50 µg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 60 µg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 80 µg/mL, incluso más preferiblemente máe de aproximadamente 100 µg/mL, inclueo máe preferiblemente máe de aproximadamente 150 µg/mL, lo más preferiblemente más de aproximadamente 190 µg/mL. Estas tasas de expresión también se pueden conseguir, por ejemplo, por los métodos según se describen en los Ejemplos 1 a 3. Cultivos de células preferidoe tienen un recuento de célulae entre aproximadamente 0,3 - 2,0 x 106 célulae/mL, más preferiblemente de aproximadamente 0,35 - 1,9 x 106 células/mL, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,4 1,8 x 106 células/mL, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,45 - 1,7 x 106 células/mL, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 - 1,5 x 106 células/mL. Lae célulae preferidas se pueden determinar por los expertos en la técnica. Células preferidae eon aquellae sueceptiblee de infección con un vector viral recombinante apropiado que contiene un ADN de 0RF2 de PCV2 y que expresa la proteína 0RF2 de PCV2. Preferiblemente, las célulae eon célulae de ineectoe y, máe preferiblemente, incluyen las células de insectos vendidas bajo la marca registrada Sf+ insect cells (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT) . Los medios de crecimiento apropiados también podrán ser determinados por loe expertoe en la técnica, eiendo un medio de crecimiento preferido medio de célulae de ineecto exento de euero, tal como Excell 420 (JRH Bioeciences, Inc., Lenexa, KS) y similares. Vectores virales preferidos incluyen baculovirus tal como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) , en particular si las células de producción eon célulae de ineectoe . A pesar de que se prefiere el sietema de expreeión de baculovirue, ee entiende por loe expertoe en la técnica que otros sistemas de expresión funcionarán para los fines de la presente invención, a saber la expresión de 0RF2 de PCV2 en el sobrenadante de un cultivo de células. Estos otros sietemae de expresión pueden requerir el uso de una secuencia señal con el fin de determinar la expreeión de 0RF2 en loe medios. Sorprendentemente, se ha descubierto que cuando 0RF2 es producida por un sistema de expresión de baculovirus, no requiere ninguna secuencia señal ni modificación ulterior para determinar la expresión de 0RF2 en el medio. Se pienea que eeta proteína puede formar, independientemente partículae similares a virus (Journal of General Virology Vol. 81, págs. 2281-2287 (2000) y puede ser secretada en el sobrenadante del cultivo. El vector viral recombinante que contiene las secuenciae de ADN de ORF2 de PCV2 tiene una multiplicidad de infección (MOI - siglas en inglés) preferida de entre aproximadamente 0,03 - 1,5, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 - 1,3, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,09 - 1,1, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1 - 1,0, cuando se utiliza para la infección de las células sueceptiblee. Preferiblemente, las MOIs arriba mencionadas se refieren a un L de fluido del cultivo celular. Preferiblemente, el método descrito en esta memoria comprende la infección de 0,35 - 1,9 x 106 células/mL, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,4 - 1,8 x 106 células/mL, inclueo más preferiblemente de aproximadamente 0,45 - 1,7 x 106 células/mL, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 - 1,5 x 106 células/mL con un vector viral recombinante que contiene un ADN de ORF2 de PCV2 y que expresa la proteína ORF de PCV2 con una MOI (multiplicidad de infección) de entre aproximadamente 0,03 - 1,5, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 - 1,3, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,09 - 1,1, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1 - 1,0. Las células infestadae ee incuban luego a lo largo de un periodo de haeta diez díae, máe preferiblemente de aproximadamente dos días a aproximadamente diez días, todavía más preferiblemente de aproximadamente cuatro días a aproximadamente nueve días, y lo más preferiblemente de aproximadamente cinco días a aproximadamente ocho días. Condicionee de incubación preferidae incluyen una temperatura entre aproximadamente 22 - 32°C, más preferiblemente de aproximadamente 24 - 30°C, todavía más preferiblemente de aproximadamente 25 - 29°C, incluso más preferiblemente de aproximadamente 26 - 28°C, y lo más preferiblemente de aproximadamente 27°C. Preferiblemente, las células Sf+ se observan despuée de la inoculación en cuanto a cambioe caracteríeticoe inducidoe por baculovirue. Una obeervación de eete tipo puede incluir la vigilancia de lae tendenciae de densidad celular y la disminución en la viabilidad durante el periodo poet-infección. Se encontró que el título pico de virus ee obeervado 3-5 días despuée de la infección y la liberación pico de ORF2 a partir de las célulae en el sobrenadante se obtiene entre los días 5 y 8, y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos de 10%.

Aeí, un aspecto de la presente invención proporciona un método mejorado para producir y/o recuperar proteína 0RF2 recombinante de PCV2, preferiblemente en cantidades descritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un cierto número de células eueceptiblee (véase arriba) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI según se define arriba, ii) expreeando la proteína 0RF2 de PCV2 por parte del vector viral recombinante, y iii) después de ello, recuperando la 0RF2 de PCV2 en el sobrenadante de células obtenido entre los días 5 y 8 después de la infección y/o la viabilidad de las células desciende a menos de 10%. Preferiblemente, el vector viral recombinante es un baculovirus recombinante que contiene secuencias codificadoras de ADN de 0RF2 de PCV2 y las células son células Sf+. Adicionalmente, ee prefiere que el cultivo sea examinado periódicamente en cuanto a la evidencia macroscópica y microecópica de contaminación o en cuanto a cambioe atípicos en la morfología de la célula durante el periodo post-infección. Debería deeecharse todo cultivo que exhiba cualquier contaminación. Preferiblemente, la proteína recombinante 0RF2 expresada ee eecretada por las células en el medio de crecimiento que las rodea que mantiene la viabilidad celular. La ORF2 se recupera luego en el sobrenadante que rodea a las células más que de lae propiae células . El proceso de recuperación comienza preferiblemente con la separación de desecho de las células de la ORF2 expresada en el medio a través de una etapa de separación. Etapas de separación preferidae incluyen filtración, centrifugación a velocidadee de haeta aproximadamente 20.000xg, centrifugación en flujo continuo, eeparación cromatográfica utilizando intercambio de iones o filtración en gel, y métodos de inmunoafinidad convencionales . Esoe métodos son conocidos por las personas expertas en la técnica, por ejemplo por (Harris y Ángel (comps.), Protein purification methods - a practical approach, IRL prese Oxford 1995) . Loe métodos de separación más preferidos incluyen centrifugación a velocidades de haeta aproximadamente 20.000xg y filtración. Métodos de filtración preferidos incluyen microfiltración de extremo muerto y filtración de flujo tangencial (o flujo cruzado) , incluida filtración de fibras huecae-microfiltración de extremo muerto. De éstas, se prefiere la microfiltración de extremo muerto. Tamañoe de poroe preferidos para la microfiltración de extremo muerto se encuentran entre aproximadamente 0,30 - 1,35 µm, más preferiblemente entre aproximadamente 0,35 - 1,25 µm, todavía más preferiblemente entre aproximadamente 0,40 - 1,10 µm, y lo máe preferiblemente entre aproximadamente 0,45 - 1,0 µm. Se pienea que cualquier membrana de filtración convencional funcionará para los fines de la presente invención, y se prefieren membranas de poliétersulfona. Cualeequiera especies de ácido nucleico de bajo peso son separadae durante la etapa de filtración.

Así, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método mejorado para producir y/o recuperar proteína 0RF2 recombinante de PCV2 , preferiblemente en cantidades descritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un cierto número de células eusceptibles (véase arriba) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI según se define arriba, ii) expresando la proteína 0RF2 de PCV por parte del vector viral recombinante, iii) recuperando la 0RF2 de PCV2 en el sobrenadante de células obtenido entre los días 5 y 8 después de la infección y/o la viabilidad de las células desciende a menos de 10%, y iv) eeparando el deeecho de células de la 0RF2 de PCV2 a través de una etapa de eeparación. Preferiblemente, el vector viral recombinante es un baculovirus que contiene secuencias codificadoras de ADN de ORF2 y las células son célulae Sf+. Etapae de eeparación preferidae eon las descritas anteriormente. Lo más preferido es una microfiltración de extremo muerto utilizando una membrana con un tamaño de poros entre aproximadamente 0,30 -1,35 µm, más preferiblemente entre aproximadamente 0,35 - 1,25 µm, todavía más preferiblemente entre aproximadamente 0,40 -1,10 µm, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 0,45 -1, 0 µm. Para la recuperación de 0RF2 de PCV2 que se utilizará en una composición inmunogénica o inmunológica tal como una vacuna, se prefiere la inclusión de una etapa de inactivación con el fin de inactivar el vector viral. Una "composición inmunogénica o inmunológica" se refiere a una composición de materia que comprende al menos un antígeno que provoca una reepueeta inmunológica en el huéeped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliaree, célulae T eupreeorae y/o célulae T citotóxicae y/o célulae T yd, dirigidae eepecíficamente a un antígeno o antígenoe incluidoe en la compoeición o vacuna de interée. Preferiblemente, el huéeped exhibirá una reepuesta inmunológica terapéutica o protectora, de modo que esa resistancia a la nueva infección resultará reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad quedará reducida. Una protección de este tipo ee demoetrará por una reducción o carencia de eíntomae exhibidoe normalmente por un huésped infestado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título vírico disminuido en el huésped infestado. Así, la preeente invención también ee refiere a un método para producir y/o recuperar proteína 0RF2 recombinante de PCV2, preferiblemente en cantidadee deecritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un cierto número de células sueceptibles (véase arriba) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI según se define arriba, ii) expresando la proteína 0RF2 de PCV por parte del vector viral recombinante, iii) recuperando la 0RF2 de PCV2 en el sobrenadante de célulae obtenido entre loe díae 5 y 8 deepuée de la infección y/o la viabilidad de lae células desciende a menos de 10%, iv) separando el desecho de células de la ORF2 de PCV2 a través de una etapa de eeparación y v) inactivando el vector viral recombinante. Preferiblemente, eeta inactivación ee hace jueto antee o justo después de la etapa de filtración, siendo después de la etapa de filtración el tiempo de inactivación preferido para la inactivación. Para los fines de la presente invención se puede utilizar cualquier método de inactivación convencional. Así, la inactivación se puede efectuar mediante tratamientoe químicoe y/o fíeicos. En formas preferidas, se determina el volumen de loe fluidoe recolectados y la temperatura es llevada a un intervalo entre aproximadamente 32 - 42°C, máe preferiblemente entre aproximadamente 34 - 40°C, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 35 - 39°C. Métodos de inactivación preferidos incluyen la adición de etilenimina binaria ciclizada (BEI - siglas en inglés) , preferiblemente en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 mM, y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 mM. Por ejemplo, la inactivación incluye la adición de una solución de hidrobromuro de 2-bromoetilenamina, preferiblemente de aproximadamente 0,4 M, que se ha ciclado a etilenimina binaria (BEI) 0,2 M en NaOH 0,3 N a los fluidos para dar una concentración final de aproximadamente 5 mM de BEI . Preferiblemente, los fluidos se agitan entonces continuamente durante 72 - 96 horas y los fluidos recolectados inactivados pueden eer almacenadoe congeladoe a -40°C o menoe o entre aproximadamente 1 - 7°C. Después de haberse completado la inactivación, se añade una solución de tiosulfato de sodio, preferiblemente a 1,0 M para neutralizar toda BEI residual. Preferiblemente, el tioeulfato de eodio se añade en una cantidad equivalente en comparación con la BEI añadida antes de la inactivación. Por ejemplo, en el caso de añadir BEI hasta una concentración final de 5 mM, se añade una solución de tiosulfato de sodio 1,0 M para dar una concentración mínima final de 5 mM para neutralizar toda BEI residual. Aeí, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para producir proteína ORF2 recombinante de PCV2, preferiblemente en cantidades deecritae anteriormente, i) permitiendo la infección de un cierto número de células sueceptiblee (véase arriba) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI eegún ee define arriba, ii) expreeando la proteína 0RF2 de PCV por parte del vector viral recombinante, iii) recuperando la 0RF2 de PCV2 en el eobrenadante de célulae obtenido entre los días 5 y 8 despuée de la infección y/o la viabilidad de las células deeciende a menoe de 10%, iv) eeparando el deeecho de célulae de la 0RF2 de PCV2 a través de una etapa de separación y v) inactivando el vector viral recombinante. Preferiblemente, el vector viral recombinante es un baculovirus que contiene eecuenciae codificadorae de ADN de 0RF2 y lae célulae eon célulae Sf+. Etapae de eeparación preferidae son las arriba descritas, la más preferida ee la etapa de filtración. Etapae de inactivación preferidae eon lae deecritas anteriormente. Preferiblemente, la inactivación se efectúa entre aproximadamente 35 - 39°C y en presencia de BEI 2 a 8 M, y todavía más preferiblemente en preeencia de BEI aproximadamente 5 mM. Sorprendentemente, se ha encontrado que concentraciones superioree de BEI afectan negativamente a la proteína ORF2 de PCV2. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, el método arriba descrito incluye también una etapa de neutralización después de la etapa v) . Esta etapa vi) comprende añadir una cantidad equivalente de un agente que neutraliza al agente de inactivación en el interior de la solución. Preferiblemente, si el agente de inactivación es BEI, se prefiere la adición de tioeulfato de eodio a una cantidad equivalente. Así, de acuerdo con un aspecto adicional, la etapa vi) comprende añadir una solución de tioeulfato de eodio haeta una concentración final de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 mM, preferiblemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 mM, todavía máe preferiblemente de aproximadamente 3 haeta aproximadamente 7 mM, lo más preferiblemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI. En formas preferidaas y, eepecialmente, en formae que utilicen la proteína ORF2 recombinante de PCV2 en una compoeición inmunogénica tal como una vacuna, ee eometerá a eneayo cada lote de ORF2 recolectada para la inactivación mediante la paeada en lae célulae Sf-i- dependientee del anclaje, eusceptiblee a baculovirus. En una forma preferida de este ensayo, 150 cm2 de monocapa de cultivo celular apropiado se inoculan con 1,0 mL de fluidos de PCV2 inactivados y se mantienen a 25 - 29°C durante 14 días con al menos doe paeadae. Al final del periodo de mantenimiento, lae monocapae de células se examinan en cuanto al efecto citopatogénico (CPE - eiglas en inglés) típico de baculovirus de ORF2 de PCV2. Preferiblemente, también se utilizan controles de virus positivos. Este tipo de controlee pueden coneietir en un cultivo de célulae Sf+ inoculadae con un baculovirue de ORF2 de PCV2 de referencia no inactivado y un matraz de células Sf-i-que permanecen sin inocular. Después de la inoculación y de la pasada, la ausencia de células infestadas con virus en loe fluidos virales tratados con BEI constituirían un ensayo de inactivación satiefactorio. Lae célulae control inoculadae con el virue de referencia deberían exhibir un CPE típico de baculovirus de 0RF2 de PCV2, y el matraz no inoculado no debería mostrar evidencia alguna de un CPE de baculovirus de 0RF2 de PCV2. Alternativamente, al final del periodo de mantenimiento, lae muestras de sobrenadante se podrían recoger e inocular en una placa de 96 pocilios con Sf+, que ha sido cargada con células Sf-i-, y luego se podrían mantener a 25 -29°C durante 5 - 6 días. La placa ee fija luego y ee tiñe con anticuerpo de 0RF2 anti-PCV2 conjugado a FITC. La ausencia del CPE y la expresión de ORF2 , eegún ee detecta por microecopía IFA, en loe fluidos virales tratados con BEI constituye un ensayo de inactivación satisfactorio. Las célulae control inoculadae con el virue de referencia deberían exhibir un CPE y actividad de IFA y el matraz no inoculado no debería moetrar evidencia alguna de CPE de baculovirue de ORF2 de PCV2 ni contener actividad de IFA. Aeí, un aepecto adicional de la preeente invención ee refiere a un eneayo de inactivación para determinar la eficacia de la inactivación del vector viral de recombinación, que comprende lae etapae de: i) poner en contacto al menoe una parte del fluido del cultivo que contiene el vector viral recombinante con un agente inactivante, preferiblemente como se deecribe arriba, ii) añadir un agente de neutralización para neutralizar el agente de inactivación, preferiblemente según se describe arriba, y iii) determinar la infectividad residual mediante los eneayos según se describe arriba. Un aspecto adicional de la invención ee refiere a un método para construir un vector viral recombinante que contiene ADN de 0RF2 de PCV2 y que expresa proteína 0RF2 de PCV2 en cantidades elevadas cuando se infesta en células sueceptiblee. Sorprendentemente, ee ha encontrado que el vector viral recombinante, según se proporciona con la presente, expreea cantidades elevadas, eegún ee definen arriba, de ORF2 de PCV2 después de infestar células sueceptiblee. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método mejorado para producir y/o recuperar proteína ORF2 de PCV2, que comprende preferiblemente las etapas de: construir un vector viral recombinante que contenga ADN de ORF2 de PCV2 y que exprese proteína ORF2 de PCV2. Preferiblemente, el vector viral es un baculovirus recombinante. En lo que sigue se describen detalles del método para construir vectores virales recombinantes que contengan ADN de 0RF2 de PCV2 y que expresen proteína ORF2 de PCV2, según ee proporciona con la preeente: en formae preferidae, el vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 de PCV2 y que expreea proteína ORF2 de PCV2, utilizado para infeetar las células se genera transfectando un vector de transferencia que ha tenido un gen ORF2 clonado en él en un vector viral .

Preferiblemente, eólo la porción del vector de traneferencia que contiene el ADN de 0RF2 ee tranefectada en el vector viral. La expreeión "transfectada en un vector viral" significa, y se utiliza como sinónimo de "introducir" o "clonar" un ADN heterólogo en un vector viral tal como, por ejemplo, en un vector de baculovirus. El vector viral es preferible, pero no necesariamente un baculovirus. Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, el vector viral recombinante se genera por recombinación entre unn vector de traneferencia que contiene el ADN de ORF2 de PCV2 heterólogo y un vector viral, preferiblemente un baculovirue, inclueo máe preferiblemente un baculovirus linearizado, deficiente en la replicación (tal como ADN Báculo Gold) . Un "vector de transferencia" significa una molécula de ADN, que incluye al menoe un origen de replicación, el gen heterólogo, en el preeente caso ORF2 de PCV2, y secuenciae de ADN que permiten la clonación del gen heterólogo en el vector viral. Preferiblemente, lae eecuencias que permiten la clonación del gen heterólogo en el vector viral eetán flanqueando al gen heterólogo. Inclueo máe preferiblemente, lae eecuenciae flanqueantee eon al menoe homólogae en partes con secuencias del vector viral . La homología de secuenciae permite entoncee la recombinación de lae doe moléculae, el vector viral y el vector de traneferencia para generar un vector viral recombinante que contiene el gen heterólogo. Un vector de transferencia preferido es el vector pVLl392 (BD Biosciencee Pharmingen) , el cual eetá diseñado para la co-transfección con el ADN BaculoGold en la línea de células Sf+ preferida. Preferiblemente, el vector de transferencia comprende un ADN de 0RF2 de PCV2. La contrucción co- ransfectada ee de una longitud de aproximadamente 10.387 pares de basee . En formae máe preferidae, loe métodos de la presente invención comenzarán con el aislamiento de ADN de ORF2 de PCV2. Generalmente, éste puede ser de una cepa conocida o desconocida, ya que el ADN de ORF2 parece estar muy coneervado, con al menos una identidad de secuencia de aproximadamente el 95% entre los diferentes elementoe aislados. Para los fines de la presente invención se puede utilizar cualquier gen de ORF2 de PCV2 conocido en la técnica, ya que cada uno sería expresado en el sobrenadante. El ADN de 0RF2 de PCV se amplifica preferiblemente utilizando métodos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) , incluso más preferiblemente junto con la introducción de una secuencia coneenso de Kozak 5' flanqueante (CCGCCAUG) (SEQ ID NO 1) y/o un sitio EcoRl 3' flanqueante (GAATTC) (SEQ ID NO 2). Una introducción de este tipo de un conseneo de Kozak 5 ' eepara preferiblemente el codón de iniciación AUG de ORF2 de PCV2, que se produce en la naturaleza. El sitio 3' EcoRl se introduce preferiblemente más abajo del codón de terminación del 0RF2 de PCV2. Máe preferiblemente, ee introduce más abajo de una secuencia de terminación de la transcripción poli A, la cual, por sí misma, está eituada máe abajo del codón de terminación de 0RF2 de PCV2. Se ha encontrado que el ueo de una secuencia conseneo de Kozak, en particular según se deecribe arriba, aumenta el nivel de expresión de la subsiguiente proteína 0RF2 de PCV2. El ADN de 0RF2 de PCV2 amplificado con estas secuencias adicionales se clona en un vector. Un vector preferido para esta etapa de clonación inicial ee el vector pGEM-T-Eaey (Promega, Madieon, Wl) . El ADN de 0RF2 de PCV2 que incluye algunae eecuenciae del vector pGEM (SEQ ID NO: 7) ee eecinde preferiblemente del vector en el eitio de reetricción Notl. El ADN reeultante se clona luego en el vector de transferencia. Así, en un aepecto de la preeente invención, se proporciona un método para construir un vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 de PCV2. Este método comprende las etapas de: i) clonar una ORF2 de PCV2 recombinante en un vector de traneferencia; y ii) tranefectar la porción del vector de traneferencia que contiene la ORF2 de PCV2 recombinante en un vector viral, para generar el vector viral recombinante. Preferiblemente, el vector de traneferencia es el arriba descrito o se conetruye eegún ee describe arriba o como se mueetra de forma ejemplar en la Figura 1. Así, de acuerdo con un aspecto adicional, el vector de transferencia, utilizado para la construcción del vector viral recombinante según se describe en esta memoria, contiene la eecuencia de SEQ ID NO: 7. De acuerdo con un aepecto adicional, este método comprende, además, antes de la etapa i), la etapa siguiente: amplificar el ADN de 0RF2 de PCV2 in vi tro, en donde las secuencias flanqueantes del ADN de ORF2 de PCV2 ee modifican eegún ee deecribe arriba. Métodoe in vi tro para amplificar el ADN de 0RF2 de PCV2 y modificar lae secuencias flanqueantes, clonar in vi tro el ADN de ORF2 de PCV2 amplificado en un vector de transferencia y vectores de transferencia adecuados ee deecriben arriba, moetradoe de forma ejemplar en la Figura 1, o conocidoe por una pereona experta en la técnica. Así, de acuerdo con un aspecto adicional , la preeente invención ee refiere a un método para conetruir un vector viral recombinante que contiene ADN de 0RF2 de PCV2 y que expresa proteína 0RF2 de PCV2 , que comprende las etapas de: i) amplificar ADN de ORF2 de PCV2 in vitro, en donde se modifican las secuenciae flanqueantee del ADN de ORF2 de PCV2, ii) clonar el ADN de ORF2 de PCV2 amplificado en un vector de traneferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia o una porción del mismo que contiene el ADN de ORF2 recombinante de PCV2 en un vector viral, para generar el vector viral recombinante. Preferiblemente, la modificación de las secuencias flanqueantes del ADN de ORF2 de PCV2 se efectúa como ee deecribe arriba, p. ej . introduciendo una secuencia de Kozak 5' y/o un sitio EcoRl, preferiblemente como se describe arriba. De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un método de producir y/o recuperar proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2. El método comprende generalmente las etapae de: i) clonar una ORF2 de PCV2 recombinante en un vector de transferencia; ii) transferir la parte del vector de transferencia que contiene la ORF2 de PCV2 recombinante en un virus; iii) infestar células en medios con el virus transfectado; iv) provocar que el virue transfectado exprese la proteína recombinante a partir de 0RF2 de PCV2; v) separar células del eobrenadante; y vi) recuperar la proteína ORF2 de PCV2 expreeada a partir del eobrenadante . Arriba ee deecriben métodos de como clonar un ADN de ORF2 recombinante de PCV2 en un vector de transferencia. Preferiblemente, el vector de transferencia contiene la secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7. Sin embargo, el vector de transferencia puede contener cualquier ADN de ORF2 de PCV2, no modificado o modificado, siempre que el ADN de ORF2 de PCV2, cuando se transfecta en un vector viral recombinante, sea expresado en el cultivo celular. Preferiblemente, el vector viral recombinante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8. Además, arriba ee deecriben en detalle métodoe de como infestar células, preferiblemente como infeetar célulae con un número definido de baculovirue recombinante que contienen ADN de 0RF2 de PCV2 y que expreean proteína 0RF2 de PCV2. Ademáe de ello, también ee deecriben en detalle etapae para separar células del sobrenadante, así como etapas para recuperar la proteína 0RF2 de PCV2 expresada. Cualesquiera de estae etapas eepecíficas del procedimiento, según ee deecriben en eeta memoria, eon parte del método de producir y/o recuperar proteína recombinante expreeada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 según se describe arriba. Preferiblemente, las células eon células SF+. Todavía más preferiblemente, cultivos de célulae preferidoe tienen un recuento de célulae entre aproximadamente 0, 3 - 2,0 x 106 célulae/mL, máe preferiblemente de aproximadamente 0,35 - 1,9 x 106 célulae/mL, todavía máe preferiblemente de aproximadamente 0,4 - 1,8 x 106 célulae/mL, inclueo máe preferiblemente de aproximadamente 0,45 - 1,7 x 106 células/mL, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 -1,5 x 106 células/mL. Preferiblemente, el vector viral recombinante que contiene el ADN de ORF2 de PCV2 tiene una multiplicidad de infección (MOI) preferida de entre aproximadamente 0,03 - 1,5, máe preferiblemente de aproximadamente 0,05 - 1,3, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,09 - 1,1, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,1 - 1,0, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 cuando se utiliza para la infección de las células susceptibles. Preferiblemente, la recuperación de la proteína 0RF2 de PCV2 en el sobrenadante de células obtenido entre los díae 5 y 8 deepués de la infección y/o la viabilidad de las células dieminuye hasta menos de 10%. Preferiblemente, para producir proteína 0RF2 de PCV2, células se cultivan a 25 hasta 29°C. Preferiblemente, la etapa de separación es una etapa de centrifugación o una etapa de filtración. Opcionalmente, este método puede incluir la etapa de amplificar el ADN de 0RF2 de PCV2 procedente de una cepa de PCV2 antee de clonar el ADN de 0RF2 de PCV2 en el vector de transferencia. En formas preferidae, una secuencia de Kozak 5', un sitio EcoRl 3' y combinaciones de los mismoe también ee pueden añadir a la eecuencia amplificada, preferiblemente antes de o durante la amplificación. Una secuencia de Kozak 5' preferida comprende la SEQ ID NO: 1. Un sitio EcoRl 3' preferido comprende la SEQ ID NO: 2. ADN de 0RF2 de PCV2 preferido comprende la secuencia de nucleótidos de Genbank ns de acceso AF086834 (SEQ ID NO: 3) y SEQ ID NO: 4. Proteína ORF2 de PCV2 recombinante preferida comprende la secuencia de aminoácidoe de SEQ ID NO: 5, que ee la proteína codificada por la SEQ ID NO: 3 (Genbank na de acceeo AF086834) y SEQ ID NO: 6, que ee la proteína codificada por la SEQ ID NO: 4. Medios preferidos comprenden medios de células de ineectoe exentoe de suero, todavía más preferiblemente medio Excell 420. Cuando se efectúa la etapa opcional de amplificación, ee preferible clonar primero el marco de lectura abierto 2 amplificado en un primer, vector, eecindir el marco de lectura abierto 2 del primer vector y utilizar el marco de lectura abierto eecindido para la clonación en el vector de traneferencia. Una línea de célulae preferida para la co-transfección es la línea de células SF+. Un virus preferido para la cotransfección ee baculovirue. En formas preferidae de eete método, la porción tranefectada del vector de traneferencia comprende la SEQ ID NO: 8. Finalmente, para eete método ee prefiere recuperar la proteína del marco de lectura abierto 2 (ORF2) de PCV2 en el eobrenadante del cultivo celular, al menoe 5 díae deepuée de infestar las células con el virus. • Aeí, un aepecto adicional de la invención ee refiere a un método para producir y/o recuperar el marco de lectura abierto 2 de PCV2, que comprende lae etapae: i) amplificar el ADN de ORF2 de PCV2 in vi tro, preferiblemente añadiendo una eecuencia de Kozak 5' y/o añadiendo un eitio de reetricción EcoRl 3', ii) clonar la ORF2 amplificada de PCV2 en un vector de transferencia; iii) transfectar la porción del vector de transferencia que contiene la ORF2 de PCV2 recombinante en un virue; iv) infestar células en medioe con el virus transfectado; v) provocar que el virus transfectado exprese la proteína recombinante a partir de ORF2 de PCV2; vi) separar células del sobrenadante; y vii) recuperar la proteína ORF2 de PCV2 expresada a partir del sobrenadante. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para preparar una compoeición que comprende proteína 0RF2 de PCV2 y vector viral inactivado. Eete método comprende lae etapas de: i) clonar la 0RF2 amplificada de PCV2 en un vector de transferencia; ii) transferir la porción del vector de transferencia que contiene la 0RF2 de PCV2 recombinante en un virus; iii) infeetar célulae en medioe con el vector viral tranefectado; iv) provocar que el vector viral tranefectado expreee la proteína recombinante a partir de 0RF2 de PCV2; v) eeparar célulae del eobrenadante; vi) recuperar la proteína ORF2 de PCV2 expreeada a partir del eobrenadante; y vii) inactivar el vector viral recombinante. Preferiblemente, el vector viral recombinante ee un baculovirue que contiene eecuenciae codificadoras de ADN de ORF2 y las células son células Sf+. Etapas de separación preferidae eon las arriba descritas, la más preferida es la etapa de filtración. Etapas de inactivación preferidas son las deecritae anteriormente. Preferiblemente, la inactivación ee efectúa entre aproximadamente 35 - 39°C y en preeencia de BEI 2 a 8 mM, todavía máe preferiblemente en preeencia de BEI aproximadamente 5 mM. Sorprendentemente, se ha encontrado que concentraciones mayores de BEI afectan negativamente a la proteína ORF2 de PCV2 , y concentraciones menoree no eon eficacee para inactivar el vector viral en el eepacio de 24 a 72 horas de la inactivación. Preferiblemente, la inactivación se efectúa durante al menos 24 horae, inclueo máe preferiblemente durante 24 a 72 horae. De acuerdo con un aepecto adicional, el método para preparar una composición que comprende proteína 0RF2 de PCV2 y vector viral inactivado, según se describe arriba, también incluye una etapa de neutralización después de la etapa vii) .

Esta etapa viii) comprende añadir una cantidad equivalente de un agente que neutraliza al agente de inactivación en el interior de la solución. Preferiblemente, si el agente de inactivación es BEI, se prefiere la adición de tiosulfato de sodio a una cantidad equivalente. Así, de acuerdo con un aspecto adicional, la etapa viii) comprende añadir una eolución de tioeulfato de sodio hasta una concentración final de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 mM, preferiblemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 7 mM, lo más preferiblemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI . De acuerdo con un aspecto adicional, el método para preparar una composición que comprende proteína ORF2 de PCV2 y vector viral inactivado, según se describe arriba, comprende, antes de la i) la etapa siguiente: amplificar el ADN de ORF2 de PCV2 in vi tro, en donde lae eecuenciae flanqueantee del ADN de 0RF2 de PCV2 ee modifican eegún ee deecribe arriba. Métodoe in vi tro para amplificar el ADN de 0RF2 de PCV2 y modificar lae eecuenciae flanqueantee, clonar in vi tro el ADN de 0RF2 de PCV2 amplificado en un vector de traneferencia y vectoree de traneferencia adecuadoe ee describen arriba, mostrados de forma ejemplar en la Figura 1, o conocidos por una pereona experta en la técnica. Aeí, de acuerdo con un aspecto adicional, este método comprende las etapae de: i) amplificar ADN de 0RF2 de PCV2 in vitro, en donde se modifican las secuencias flanqueantes del ADN de 0RF2 de PCV2, ii) clonar el ADN de 0RF2 de PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) tranefectar el vector de transferencia o una porción del mismo que contiene el ADN de ORF2 recombinante de PCV2 en un vector viral para generar el vector viral recombinante, iv) infestar célulae en medioe con el virus transfectado; v) provocar que el virus transfectado exprese la proteína recombinante a partir de ORF2 de PCV2; vi) separar células del sobrenadante; vii) recuperar la proteína ORF2 de PCV2 expresada a partir del eobrenadante; viii) inactivar el vector viral recombinante, preferiblemente en preeencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM de BEI, lo más preferiblemente en presencia de aproximadamente 5 mM de BEI; y ix) añadir una cantidad equivalente de un agente que neutraliza el agente de inactivación dentro de la solución, preferiblemente añadiendo una solución de tioeulfato de sodio hasta una concentración final de aproximadamente 1 a aproximadamante 20 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar una composición, preferiblemente una composición antigénica tal como, por ejemplo, una vacuna, para crear una respuesta inmune contra PCV2. Generalmente, este método incluye las etapas de transfectar una construcción en un virus, en donde la construcción comprende i) ADN recombinante procedente de ORF2 de PCV2 , ii) infestar células en medios de crecimiento con el virus transfectado, iii) provocar que el virus exprese la proteína recombinante a partir de ORF2 de PCV2 , iv) recuperar la proteína ORF2 expresada a partir del sobrenadante, v) y preparar la composiicón al combinar la proteína recuperada con un adyuvante adecuado y/u otros soporte farmacéuticamente aceptable. "Adyuvantes", tal como ee utilizan en eeta memoria, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinae, p. ej . Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) , GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticale, Inc., Birmingham, AL) , emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite en agua. La emuleión se puede basar, en particular, en aceite de parafina líquido ligero (tipo de la Farmacopea Europea) ; aceite ieoprenoide tal como aceite eecualano o eecualeno que reeulta de la teoligomerización de alquenoe, en particular de isobuteno o deceno; éeteree de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di- (caprilato/caprato) de propilenglicol, tri- (caprilayo/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; éeteree de ácidoe graeoe ramificadoe o alcoholee, en particular éeteree de ácido isosteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Loe emulsionantes son preferiblemente tensioactivoe no iónicoe, en particular éeteree de eorbitan, de manida (p. ej . oleato de anhidromanitol) , de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, ieoeteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y copolímeros de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, en eepecial L121. véaee Hunter et al . , The Theory and Practical Application of Adjuvante (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, págs. 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Por ejemplo, es posible utilizar la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editada por M. Powell y M. Newman, Plenum Preee, 1995, y la emuleión MF59 deecrita en la página 183 de eete mismo libro. Un ejemplo adicional de un adyuvante es un compuesto elegido de los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Compuestos adyuvantes ventajosoe son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticuladoe, eepecialmente con polialquenil-éteree de azúcaree o polialcoholes . Estoe compueetoe ee conocen por el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, na 2, junio 1996). Personas expertas en la técnica también pueden aludir a la patente de EE.UU. na 2.909.462 que describe polímeros acrílicos de este tipo reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxiloe reemplazados por radicalee alifáticoe ineaturadoe que tienen al menoe 2 átomoe de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, p. ej . vinilos, alilos y otros grupoe etilénicamente ineaturados. Loe radicalee insaturados pueden contener por sí mismos otros suetituyentee tal como metilo. Loe productoe vendidoe bajo el nombre Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) eon particularmente apropiados. Están reticulados con una alil-sacarosa o con alil-pentaeritritol. Entre ellos, se pueden mencionar Carbopol 974P, 934P y 971P. Lo más preferido es el uso de Cabopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, los copolímeros EMA (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La dieolución de eetos polímeros en agua conduce a una solución acida que será neutralizada, preferiblemente hasta un pH fisiológico, con el fin de dar la solución adyuvante en la que se incorporará la propia composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna. Adyuvantee adecuadoe adicionales incluyen, pero no se limitan al sietema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), co-polímero de bloquee (CytRx, Atlanta GA) , SAF-M (Chiron, Emeryville CA) , monofosforil-lípido A, adyuvante de lípido-amina Avridina, enterotoxina térmicamente lábil procedente de E. coli (recombinante o de otro modo) , toxina cólera, IMS 1314 o dipéptido muramilo, entre muchos otros. Preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 µg hasta aproximadamente 10 mg por dosie. Incluso máe preferiblemente, el adyuvante ee añade en una cantidad de aproximadamente 100 µg haeta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 500 µg hasta aproximadamente 5 mg por dosie. Inclueo máe preferiblemente, el adyuvante ee añade en una cantidad de aproximadamente 750 µg haeta aproximadamente 2,5 mg por doeie. Lo más preferiblemente, el adyuvante ee añade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis . Así, de acuerdo con un aspecto adicional, el método para preparar una composición antigénica tal como, por ejemplo, una vacuna, para crear una respueeta inmune contra PCV2 comprende i) preparar y recuperar proteína 0RF2 de PCV2, y ii) mezclar eeto con un adyuvante adecuado. Preferiblemente, el adyuvante ee Carbopol 971P. Incluso más preferiblemente, Carbopol 971P se añade en una cantidad de aproximadamente 500 µg a aproximadamente 5 mg por dosis, incluso más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 750 µg hasta aproximadamente 2,5 mg por dosie y, lo máe preferiblemente, en una cantidad de aproximadamente 1 mg por doeie. Preferiblemente, la etapa i) del procedimiento incluye lae etapae del procedimiento eegún ee describen para la preparación y recuperación de ORF2 de PCV2. Por ejemplo, en formas preferidas de este método, la construcción que compende ADN de ORF2 de PCV2 se obtiene en un vector de transferencia. Vectores de transferencia adecuados y métodoe para prepararlos se describen arriba. Opcionalmente, el método puede incluir la etapa de amplificar la 0RF2 a partir de una cepa de PCV2 a través de PCR antes de clonar la ORF2 en el vector de transferencia. Secuencias del marco de lectura abierto, secuenciae de Kozak, secuencias del sitio EcoRl 3', secuencias de proteínas recombinantes, secuencias de construcciones transfectadas, medios, células y virus preferidos se describen en los métodos previos. Otra etapa opcional para este método incluye clonar el ADN de 0RF2 de PCV2 amplificado en un primer vector, escindir el ADN de ORF2 de eete primer vector y utilizar eete ADN de ORF2 de PCV2 eecindido para eu clonación en el vector de traneferencia. Al igual que con loe otroe métodos, se prefiere esperar al menos 5 díae deepuée de la infección de lae células por parte del baculovirus transfectado antes de recuperar la proteína 0RF2 recombinante del sobrenadante. Preferiblemente, la etapa de recuperación de eete método incluye también la etapa de eeparar loe medioe de lae célulae y el deeecho de células . Esto se puede hacer de una divereidad de manerae, pero por comodidad y conveniencia, ee prefiere filtrar lae célulae, el deeecho de célulae y loe medioe de crecimiento a travée de un filtro con poroe que oecilan en tamaño de aproximadamente 0,45 µM haeta aproximadamente 1,0 uM. Finalmente, para este método se prefiere incluir una etapa de inactivación del virue antes de combinar la proteína ORF2 de PCV2 recombinante recuperada en una composición. Esto se puede hacer de una diversidad de maneras, pero en la práctica de la presente invención se prefiere utilizar BEI. Así, de acuerdo con un aspecto adicional, este método comprende las etapas de: i) amplificar ADN de ORF2 de PCV2 in vi tro, en donde se modifican las secuenciae flanqueantee del ADN de ORF2 de PCV2, ii) clonar el ADN de ORF2 de PCV2 amplificado en un vector de traneferencia; y iii) tranefectar el vector de traneferencia o una porción del miemo que contiene el ADN de ORF2 recombinante de PCV2 en un vector viral para generar el vector viral recombinante, iv) infeetar célulae en medioe con el virus transfectado; v) provocar que el virus transfectado exprese la proteína recombinante a partir de 0RF2 de PCV2; vi) separar célulae del eobrenadante; vii) recuperar la proteína 0RF2 de PCV2 expreeada a partir del sobrenadante; viii) inactivar el vector viral recombinante, preferiblemente en presencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM de BEI, lo más preferiblemente en presencia de aproximadamente 5 mM de BEI; ix) añadir una cantidad equivalente de un agente que neutraliza al agente de inactivación en la eolución, preferiblemente añadiendo una solución de tiosulfato de eodio haeta una concentración final de aproximadamente 1 haeta aproximadamente 20 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación ee BEI, y x) añadir una cantidad adecuada de un adyuvante, preferiblemente añadiendo Carbopol, máe preferiblemente Carbopol 971P, inclueo máe preferiblemente en cantidadee eegún ee deecriben arriba (p. ej . de aproximadamente 500 µg haeta aproximadamente 5 mg por doeie, inclueo máe preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 750 µg haeta aproximadamente 2,5 mg por doeie y, lo máe preferiblemente, en una cantidad de aproximadamente 1 mg por doeis) . Adicionalmente, la composición puede incluir uno o más soportes farmacéuticamente aceptables . Tal como se emplea en esta memoria, "un soporte farmacéuticamente aceptable" incluye cualeequiera dieolventee, medioe diepereantee, recubrimientos, agentes estabilizadoree, diluyentee, coneervantee, agentee antibacterianoe y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que demoran la adsorción y eimilaree. Lo máe preferiblemente, la composición proporcionada con la presente contiene proteína 0RF2 de PCV2 recuperada del sobrenadante de células cultivadas in vi tro, en donde las células fueron infeetadas con un vector viral recombinante que contiene ADN de 0RF2 de PCV2 y que expresa proteína ORF2 de PCV2, y en donde el cultivo de células se trató con aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 mM de BEI, preferiblemente con aproximadamente 5 mM de BEI para inactivar el vector viral, y una concentración equivalente de un agente de neutralización, preferiblemente eolución de tioeulfato de eodio, haeta una concentración final de aproximadamente 2 haeta aproximadamente 8 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM, Carbopol, máe preferiblemente Carbopol 971P, preferiblemente en cantidades de aproximadamente 500 µg hasta aproximadamente 5 mg por dosis, incluso más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 750 µg hasta aproximadamente 2,5 mg por dosis y, lo más preferiblemente, en una cantidad de aproximadamente 1 mg por doeie, y eolución ealina fieiológica, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 90% (v/v) , más preferiblemente de aproximadamente 60 to 80% (v/v) , todavía más preferiblemente de aproximadamente 70% (v/v) . Así, un aspecto adicional ee refiere a un método para preparar una compoeición antigénica tal como, por ejemplo, una vacuna, para crear una reepueeta inmune contra PCV2, que comprende lae etapae de: i) amplificar ADN de ORF2 de PCV2 in vi tro, en donde se modifican las secuencias flanqueantes del ADN de ORF2 de PCV2, ii) clonar el ADN de ORF2 de PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) tranefectar el vector de traneferencia o una parte del miemo que contiene el ADN de ORF2 recombinante de PCV2 en un vector viral para generar el vector viral recombinante, iv) infeetar células en medios con el virus transfectado; v) provocar que el virus transfectado exprese la proteína recombinante a partir de ORF2 de PCV2; vi) separar células del sobrenadante; vii) recuperar la proteína ORF2 de PCV2 expresada a partir del sobrenadante; viii) inactivar el vector viral recombinante, preferiblemente en preeencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mM de BEI, lo más preferiblemente en presencia de aproximadamente 5 mM de BEI; ix) añadir una cantidad equivalente de un agente que neutraliza al agente de inactivación en la solución, preferiblemente añadiendo una solución de tiosulfato de sodio hasta una concentración final de aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 20 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación ee BEI, x) añadir una cantidad adecuada de un adyuvante, preferiblemente añadiendo Carbopol, máe preferiblemente Carbopol 971P, todavía máe preferiblemente en cantidadee eegún se describen antes (p. ej . de aproximadamente 500 µg hasta aproximadamente 5 mg por dosis, incluso más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 750 µg hasta aproximadamente 2,5 mg por dosis y, lo más preferiblemente, en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis); y xi) añadir solución ealina fieiológica, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 50 haeta aproximadamente 90% (v/v) , más preferiblemente hasta aproximadamente 60 a 80% (v/v) , todavía máe preferiblemente de aproximadamente 70% (v/v) . Opcionalmente, eete método también puede incluir la adición de un agente protector. Un agente protector, tal como ee utiliza en eeta memoria, ee refiere a un agente anti-microbiológicamente activo tal como, por ejemplo, gentamicina, mertiolato y similares. En particular, la adición de un agente protector es lo máe preferido para la preparación de una compoeición multi-doeie. Esos agentes anti-microbiológicamente activoe ee añaden en concentracionee eficaces para prevenir cualquier contaminación microbiológica de la composición de interés o para la inhibición de cualquier crecimiento microbiológico en la composición de interés. Además, eete método también puede comprender la adición de cualquier agente estabilizante tal como, por ejemplo, sacaridoe, trehalosa, manitol, sacarosa y similaree, para aumentar y/o mantener la duración de conservación del producto. Sin embargo, sorprendentemente se ha encontrado que la formulación resultante es inmunológicamente eficaz a lo largo de un periodo de al menos 24 meses, sin añadir ningún agente estabilizante adicional. Un aspecto adicional de la preeente invención ee refiere a los productoe que resultan de los métodos eegún ee deecribe arriba. En particular, la preeente invención ee refiere a una compoeición de materia que comprende proteína 0RF2 de PCV2 recombinantemente expresada. Además, la presente invención también se refiere a una composición de materia que comprende proteína 0RF2 de PCV2 recombinantemente expresada, recuperada del eobrenadante de un cultivo de células de ineectoe . Ademáe, la preeente invención también ee refiere a una compoeición de materia que comprende proteína 0RF2 de PCV2 recombinantemente expreeada, recuperada del eobrenadante de un cultivo de células de insectoe. Preferiblemente, eeta compoeición de materia también comprende un agente adecuado para la inactivación de vectores virales. Preferiblemente, el agente de inactivación es BEI. Además, la presente invención también se refiere a una composición de materia que comprende proteína 0RF2 de PCV2 recombinantemente expresada, recuperada del sobrenadante de un cultivo de células de insectoe, y comprende un agente adecuado para la inactivación de vectores viralee, preferiblemente BEI y un agente de neutralización para la neutralización del agente de inactivación. Preferiblemente, ese agente de neutralización es tiosulfato de sodio cuando BEI ee utiliza como un agente de inactivación. Todavía en otro aepecto de la preeente invención, ee proporciona una compoeición inmunogénica que induce una reepueeta inmune y, máe preferiblemente, confiere inmunidad protectora contra loe eíntomae clínicoe de una infección por PCV2. La compoeición comprende generalmente el polipéptido, o un fragmento del miemo, expreeado por el Marco de Lectura Abierto 2 (ORF2) de PCV2, en calidad del componente antigénico de la compoeición. ADN de ORF2 de PCV2 y proteína, tal como ee utilizan en eeta memoria para la preparación de lae compoeiciones y también tal como se utilizan en los procedimientos proporcionados en esta memoria, es un dominio muy conservado dentro de aislados de PCV2 y, con ello, cualquier 0RF2 de PCV2 sería eficaz como la fuente del ADN de ORF2 de PCV y/o polipéptido tal como se utiliza en esta memoria. Una proteína ORF2 de PCV2 preferida es la de SEQ ID NO. 11. Un polipéptido ORF2 de PCV preferido se proporciona en esta memoria como SEQ ID NO. 5, pero se entiende por los expertos en la técnica que esta secuencia podría variar tanto como 6-10% en la homología de la secuencia y aún conservar las característicae antigénicae que la hacen útil en compoeiciones inmunogénicas. Las características antigénicas de una composición inmunológica se puede, por ejemplo, estimar por el experimento de evaluación según se proporciona por el Ejemplo 4. Además, todavía ee coneerva la característica antigénica de un antígeno modificado, cuando el antígeno modificado confiere al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90% de la inmunidad protectora eegún se compara con la proteína ORF2 de PCV2, codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Una "composición inmunogénica", tal como se utiliza en esta memoria, significa una proteína ORF2 de PCV2 que provoca una "respuesta inmunológica" en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la proteína ORF2 de PCV2. Preferiblemente, esta composición inmunogénica ee capaz de conferir inmunidad protectora contra una infección por PCV2 y loe eíntomae clínicoe aeociadoe con la miema. En algunae formas, se utilizan porciones inmunogénicas de proteína ORF2 de PCV2 en calidad del componente antigénico en la composición. La expreeión "porción inmunogénica", tal como ee utiliza en eeta memoria, ee refiere a formae truncadae y/o eustituidas, o a fragmentoe de proteína ORF2 de PCV2 y/o a polinucleótido, respectivamente. Preferiblemente, tales formas truncadas y/o euetituidas, o fragmentos comprenderán al menos 6 aminoácidoe contiguoe procedentee del polipéptido de ORF2 de longitud completa. Máe preferiblemente, lae formas truncadas o sustituidae, o fragmentos tendrán al menos 10, más preferiblemente al menoe 15, y aún máe preferiblemente al menos 19 aminoácidos contiguos procedentes del polipéptido de ORF2 de longitud completa. Dos secuencias preferidas a este respecto se proporcionan en esta memoria como SEQ ID NOs. 9 y 10. Se entiende, además, que eete tipo de secuencias pueden ser parte de fragmentoe o formae truncadas mayores . Un polipéptido de ORF2 de PCV2 preferido, proporcionado en eeta memoria, ee codificado por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Pero se entiende por los expertos en la técnica que esta secuencia podría variar tanto como 6-20% en la homología de la secuencia y aún conservar las característicae antigénicas que la hacen útil en compoeicionee inmunogénicae . En algunae formas, como componente antigénico en la composición se utiliza una forma truncada o sustituida, o fragmento de ORF2. Preferiblemente, formas truncadas o suetituidae de este tipo, o fragmentos comprenderán al menos 18 mícleótidos contiguoe procedentee de la eecuencia de nucleótidos de ORF2 de longitud completa, p. ej . de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Más preferiblemente, las formas truncadas o sustituidas, o fragmentos tendrán al menos 30, más preferiblemente al menos 45, y aún más preferiblemente al menos 57 nucleótidos contiguos procedentee del nucleótido de ORF2 de longitud completa, p. ej . de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO: 4. 0 "Identidad de la secuencia", tal como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre doe o máe eecuenciae de polipéptidoe o doe o máe eecuenciae de polinucleótidos, a saber una eecuencia de referencia y una eecuencia dada a comparar con la eecuencia de referencia. La identidad de la eecuencia ee determina comparando la eecuencia dada con la secuencia de referencia despuée de haber alineado óptimamente las secuencias para producir el grado más alto de similitud de secuencia, según se determina por el apareamiento entre las hebras de secuencias de este tipo. Trae el alineamiento, la identidad de la secuencia se constata sobre una base de poeición-por-poeición, p. ej . lae eecuencias son "idénticae" en una poeición particular si en esa posición los residuoe de nucleótidoe o aminoácidoe son idénticos . El número total de identidades de posición de eete tipo ee divide luego por el número total de nucleótidos o residuoe en la secuencia de referencia para dar el % de identidad de la secuencia. La identidad de la secuencia se puede calcular fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., comp., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., comp., Academic Preee, Nueva York (1993); Computer Analyeie of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H. G., comps . , Humana Prese, Nueva Jereey (1994) ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G. , Academic Prese (1987); Sequence Analyeis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., comps., M. Stockton Prese, Nueva York (1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cuyae enseñanzas se incorporan en esta memoria como referencia. Métodos preferidos para determinar la identidad de la secuencia ee dieeñan para dar el apareamiento mayor entre lae eecuenciae sometidas a ensayo. Métodos para determinar la identidad de la secuencia eon codificados en programas de ordenador públicamente disponiblee que determinan la identidad de secuencia entre secuenciae dadae. Ejemploe de este tipo de programas incluyen, pero no se limitan al paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1) :387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J.

Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa BLASTX eetá públicamente dieponible de NCBI y de otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), cuyas enseñanzae ee incorporan en eeta memoria como referencia) . De forma óptima, eetos programas alinean secuenciae utilizando peeoe de huecoe por defecto con el fin de producir el nivel máe alto de la identidad de eecuencia entre lae secuencias dada y de referencia. Como ilustración, por un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que tenga al menos, por ejemplo, un 85%, preferiblemente un 90%, incluso máe preferiblemente un 95% de "identidad de eecuencia" con una eecuencia de nucelótidos de referencia, se pretende dar a entender que la secuencia de nucleótidoe del polinucleótido dado ee idéntica a la eecuencia de referencia, excepto que la eecuencia de polinucleótidos dada puede incluir hasta 15, preferiblemente hasta 10, incluso más preferiblemente hasta 5 mutaciones puntualee por cada 100 nucleótidoe de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabrae, en un polinucleótido que tenga una eecuencia de nµcleótidoe que tenga al menoe un 85%, preferiblemente un 90%, inclueo máe preferiblemente un 95% de identidad con relación a la eecuencia de nucleótidoe de referencia, haeta el 15%, preferiblemente el 10%, inclueo máe preferiblemente el 5% de loe nucleótidos en la secuencia de referencia puede estar euprimido o sustituido con otro nucleótido, o un cierto número de nucleótidos de haeta el 15%, preferiblemente el 10%, inclueo máe preferiblemente el 5% de loe nucleótidos totales en la eecuencia de referencia puede eetar ineertado en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en lae poeiciones terminalee 5 ' ó 3 ' de la eecuencia de nucleótidoe de referencia o en cualquier parte entre eeae posiciones terminales, entremezcladas individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la eecuencia de referencia. Análogamente, por un polipéptido con una eecuencia de aminoácidoe dada que tenga al menoe, por ejemplo, un 85%, preferiblemente un 90%, inclueo más preferiblemente un 95% de identidad de eecuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, se pretende que la secuencia de aminoácidoe del polipéptido dado sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polipéptidos dada puede incluir hasta 15, preferiblemente hasta 10, incluso más preferiblemente haeta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabrae, para obtener una secuencia de polipéptidos dada que tenga al menos un 85%, preferiblemente un 90%, incluso más preferiblemente un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 15%, preferiblemente hasta el 10%, incluso más preferiblemente hasta el 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia de referencia puede estar suprimido o sustituido con otro aminoácido, o un cierto número de aminoácidos de hasta el 15%, preferiblemente hasta el 10%, incluso más preferiblemente hasta el 5% del número total de reeiduos aminoácidos en la secuencia de referencia puede estar insertado en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la eecuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidoe de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, entremezcladae individualmente entre reeiduos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferiblemente, las posicionee de loe reeiduoe que no eon idénticae difieren por la sustituciones conservativae de aminoácidoe. Sin embargo, las sustituciones conservativas no están incluidas como un apareamiento cuando se determina la identidad de secuencia. "Homología de la eecuencia", tal como ee utiliza en esta memoria, se refiere a un método para determinar el grado de relación de dos secuencias . Para determinar la homología de la secuencia, doe o máe eecuenciae ee alinean óptimamente alineadae y, ei es necesario, se introducen huecos. Sin embargo, en contraposición con la "identidad de la secuencia", euetitucionee coneervativae de aminoácidoe ee cuentan como un apareamiento cuando ee determina la homología de la eecuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido con un 95% de homología de la secuencia con una eecuencia de referencia, el 85%, preferiblemente el 90%, incluso más preferiblemente el 95% de los residuos aminoácidos o nucleótidos en la eecuencia de referencia debe aparearse o comprender una suetitución coneervativa con otro aminoácido o nucleótido, o un cierto número de aminoácidoe o nucleótidoe haeta el 15%, preferiblemente haeta el 10%, inclueo máe preferiblemente haeta el 5% de loe reeiduoe totalee de aminoácidos o nucleótidos, que no incluyen suetitucionee coneervativae, en la eecuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Preferiblemente, la eecuencia homologa comprende al menoe un tramo de 50, inclueo máe preferiblemente 100, inclueo máe preferiblemente 250, inclueo máe preferiblemente 500 nucleótidoe. Una "sustitución conservativa" ee refiere a la euetitución de un reeiduo aminoácido o nucleótido con otro residuo aminoácido o nucleótido con característicae o propiedadee similares, incluido el tamaño, la hidrofobicidad, etc., de modo que la funcionalidad global no cambia significativamente . "Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" deede eu eetado natural, ee decir ei ee produce en la naturaleza, ha eido cambiado o eeparado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se presenta de forma natural en un organiemo vivo no está "aislado", pero el miemo polinucleótido o polipéptido eeparado de los materiales coexistentee de eu eetado natural eetá "aielado", eegún se emplea el término en esta memoria. Así, un aspecto adicional de la presente invención ee refiere a una compoeición inmunogénica, eficaz para reducir la gravedad de eíntomas clínicos asociadoe con la infección por PCV2 que comprende proteína ORF2 de PCV2. Preferiblemente, la proteína ORF2 de PCV2 ee una cualquiera de lae arriba deecritae. Preferiblemente, la proteína ORF2 de PCV2 ee i) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 O SEQ ID NO: 11, ii) cualquier polipéptido que es al menos un 80% homólogo con el polipéptido de i), iii) cualquier porción inmunogénica de los polipéptidos de i) y/o ii) , iv) la porción inmunogénica de iii) , que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos incluidos en las secuencias de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11, v) un polipéptido que es codificado por un ADN que comprende la eecuencia de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. vi) cualquier polipéptido que ee codificado por un polinucleótido que ee al menos un 80% homólogo con el polinucléotido de v) , vi ) cualquier porción inmunogénica de los polipéptidos codificados por el polinucleótido de v) y/o vi) , viii) la porción inmunogénica de vii) , en donde el polinucleótido que codifica la porción inmunogénica comprende al menoe 30 nucleótidoe contiguos incluidoe en las secuencias de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO : 4. Preferiblemente cualquiera de esas porciones inmunogénicas tendrán las característicae inmunogénicas de la proteína 0RF2 de PCV2 que ee codificada por la eecuencia de SEQ ID NO: 3 O SEQ ID NO : 4. De acuerdo con un aepecto adicional, la proteína ORF2 de PCV2 ee proporciona en la compoeición inmunológica a un nivel de inclusión de antígenos eficaz para inducir la respueeta inmune deeeada, a eaber reducir la incidencia de o dieminuir la gravedad de eíntomae clínicoe que reeultan de la infección por PCV2. Preferiblemente, el nivel de inclusión de la proteína 0RF2 de PCV2 es al menoe 0,2 µg de antígeno / ml de la compoeición inmunogénica final (µg/ml) , máe preferiblemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 400 µg/ml, aún máe preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 200 µg/ml, inclueo máe preferiblemente de aproximadamente 0,35 a aproximadamente 100 µg/ml, aún máe preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 50 µg/ml, aún máe preferiblemente de aproximadamente 0,45 a aproximadamente 30 µg/ml, aún máe preferiblemente de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 15 µg /ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 8 µg/ml, incluso máe preferiblemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 6 µg/ml, aún más preferiblemente de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 3,0 µg/ml, incluso máe preferiblemente de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2 , 5 µg/ml , inclueo máe preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,0 µg/ml, y lo máe preferiblemente de aproximadamente 1,6 µg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional, el nivel de inclusión del antígeno 0RF2 ee al menoe 0,2 µg de proteína ORF2 de PCV2, según se describe antee, por doeis de la composición antigénica final (µg/dosis) , más preferiblemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 400 µg/dosie, aún más preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 200 µg/dosie, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,35 a aproximadamente 100 µg/dosis, aún más preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 50 µg/dosis, aún más preferiblemente de aproximadamente 0,45 a aproximadamente 30 µg/dosie, aún máe preferiblemente de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 15 µg /doeie, inclueo máe preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 8 µg/doeie, inclueo máe preferiblemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 6 µg/doeie, aún máe preferiblemente de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 3,0 µg/doeie, inclueo máe preferiblemente de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 µg/doeie, inclueo más preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,0 µg/dosie, y lo más preferiblemente de aproximadamente 1,6 µg/doeie. El polipéptido ORF2 de PCV2 utilizado en una compoeición inmunogénica de acuerdo con la preeente invención ee puede derivar de cualquier modo, incluido aislamiento y purificación de ORF2 de PCV2, síntesis estándar de proteínas, y metodología recombinante. Métodos preferidoe para obtener polipéptido ORF2 de PCV2 ee deecriben arriba en eeta memoria y también ee proporcionan en la eolicitud de patente de EE.UU. ns de eerie 11/034.797, cuyos enseñanzas y contenido se incorporan con ello como referencia. En sínteeie, célulae eueceptible eon infeetadae con un vector viral recombinante que contiene eecuenciae codificadorae de ADN de 0RF2 de PCV2, el polipéptido ORF2 de PCV2 ee expreeado por el virue recombinante, y el polipéptido ORF2 de PCV2 expreeado ee recupera del eobrenadante mediante filtración y se inactiva por cualquier método convencional, preferiblemente utilizando etilenimina binaria, que luego se neutraliza para detener el proceso de inactivación. Así, de acuerdo con un aspecto adicional, la composición inmunogénica comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 de PCV2 deecritae arriba, preferiblemente en concentracionee deecritae arriba, y ii) al menoe una parte del vector viral que expreea la proteína ORF2 de PCV2, preferiblemente de un baculovirue recombinante. Además, de acuerdo con un aepecto adicional, la compoeición inmunogénica comprende i) cualquiera de lae proteínas ORF2 de PCV2 descritae arriba, preferiblemente en concentraciones descritae arriba, ii) al menos una parte del vector viral que expresa la proteína ORF2 de PCV2, preferiblemente de un baculovirus recombinante, y iii) una parte del sobrenadante del cultivo de células. De acuerdo con una realización específica del procedimiento de producción y recuperación de la proteína 0RF2 de PCV2, el eobrenadante del cultivo de célulae ee filtra a travée de una membrana con un tamaño de poroe preferiblemente entre aproximadamente 0,45 y 1 µm. Aeí, un aepecto adicional ee refiere a una compoeición inmunogénica que comprende i) cualquiera de lae proteínae ORF2 de PCV2 deecritae arriba, preferiblemente en concentracionee deecritas arriba, ii) al menos una porción del vector viral que expresa la proteína ORF2 de PCV2, preferiblemente de un baculovirus recombinante, y iii) una porción del sobrenadante del cultivo de células, en donde aproximadamente el 90% de los componentes tienen un tamaño menor que 1 µm. De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una compoeición inmunogénica que comprende i) cualquiera de lae proteínae ORF2 de PCV2 deecritae arriba, preferiblemente en concentracionee deecritas arriba, ii) al menos una porción del vector viral que expresa la proteína ORF2 de PCV2, iii) una porción del cultivo de células, iv) y agente inactivante para inactivar el vector viral recombinante, preferiblemente BEI, en donde aproximadamente el 90% de los componentee i) a iii) tienen un tamaño menor que 1 µm. Preferiblemente, BEI está presente en concentraciones eficaces para inactivar el baculovirus. Concentraciones eficaces se describen arriba. De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una compoeición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas 0RF2 de PCV2 descritas arriba, preferiblemente en concentraciones descritas arriba, ii) al menos una porción del vector viral que expresa la proteína 0RF2 de PCV2, iii) una porción del cultivo de células, iv) un agente inactivante para inactivar el vector viral recombinante, preferiblemente BEI, y v) un agente neutralizante para detener la inactivación mediada por el agente inactivante, en donde aproximadamente el 90% de loe componentee i) a iii) tienen un tamaño menor que 1 µm. Preferiblemente, ei el agente inactivante ee BEI, la composición comprende tiosulfato de eodio en cantidadee equivalentee a BEI. El polipéptido ee incorpora en una compoeición que puede ser administrada a un animal eusceptible a infección por PCV2. En formas preferidae, la composición puede incluir también componentes adicionalee conocidoe por loe expertos en la técnica (véaee también Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18a ed. Mack Publ . , Easton). Adicionalmente, la composición puede incluir uno o más soportee aceptablee en veterinaria. Tal como ee emplea en eeta memoria, "un soporte aceptable desde el punto de vieta veterinario" incluye uno y cualesquiera disolventes, medios dispereantee, recubrimientoe , adyuvantes, agentes eetabilizadoree, diluyentee, coneervantee, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentee que demoran la adeorción y eimilares. En una realización preferida, la composición inmunogénica comprende proteína 0RF2 de PCV2 eegún ee proporciona con la preeente, preferiblemente en concentracionee deecritas arriba en forma de un componente antigénico, el cual se mezcla con un adyuvante, preferiblemente Carbopol, y solución salina fisiológica. Los expertoe en la técnica entenderán que la compoeición en esta memoria puede incorporar soluciones estérilee inyectablee, fieiológicamente aceptablee, conocidae. Para preparar una dieolución lista para el ueo para inyección parenteral o infueión, eetán fácilmente disponibles soluciones isotónicas acuosas , tales como, p. ej . , solución salina o correspondientes solucionee de proteínae en el plaema. Además, las composicionee inmunogénicae y de vacuna de la preeente invención pueden incluir diluyentee, agentee ieotónicoe, eetabilizantee o adyuvantes. Los diluyentes pueden incluir agua, solución ealina, dextroea, etanol, glicerol y eimilaree. Loe agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los eetabilizantes incluyen albúmina y salee alcalinae de ácido etilendiaminotetraacético, entre otroe. Adyuvantee adecuadoe eon loe arriba descritos . Lo más preferido es el uso de Carbopol, en particular el uso de Carbopol 971P, preferiblemente en cantidadee eegún ee deecriben arriba (p. ej . de aproximadamente 500 µg haeta aproximadamente 5 mg por doeie, inclueo máe preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 750 µg haeta aproximadamente 2,5 mg por doeie y lo máe preferiblemente en µna cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis) . Así, la presente invención se refiere también a µna composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 de PCV2 descritae arriba, preferiblemente en concentracionee deecritae arriba, ii) al menoe una parte del vector viral que expreea la proteína ORF2 de PCV2, iii) una porción del cultivo de células, iv) un agente inactivante para inactivar el vector viral recombinante, preferiblemente BEI, y v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente inactivante, preferiblemente tiosulfato de sodio en cantidadees equivalentee a BEI; y vi) un adyuvante adecuado, preferiblemente Carbopol 971, en lae cantidadee descritas arriba; en donde aproximadamente el 90% de los componentes i) a iii) tienen un tamaño menor que 1 µm. De acµerdo con un aspecto adicional, esta composición inmunogénica comprende, además, una sal farmacéuticamente aceptable, preferiblemente una eal foefato en concentraciones fisiológicamente aceptables. Preferiblemente, el pH de la compoeición inmunogénica se ajusta a un pH fisiológico, lo que significa entre aproximadamente 6,5 y 7,5. Así, la presente invención también se refiere a una compoeición inmunogénica que comprende, por un ml, i) al menos 1,6 µg de proteína 0RF2 de PCV2 descrita arriba, ii) al menos una porción de baculovirus que expreea la proteína 0RF2 de PCV2, iii) una porción del cultivo de célulae, iv) aproximadamente 2 a 8 mM de BEI, v) tioeulfato de sodio en cantidades equivalentes a BEI; y vi) aproximadamente 1 mg de Carbopol 971, y vii) sal foefato en una concentración fieiológicamente aceptable; en donde aproximadamente el 90% de loe componentee i) a iii) tienen un tamaño menor que 1 µm y el H de la compoeición inmunogénica ee ajueta a aproximadamente 6,5 a 7,5. Lae compoeicionee inmunogénicae pueden ademáe incluir uno o máe de otroe agentee inmunomoduladores tales como p. e . , interleucinas, interferones u otrae citocinae. Las composiciones inmunogénicas pueden también incluir Gentamicina y Mertiolato. Si bien las cantidadee y concentracionee de los adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden determinarse fácilmente por el experto en la técnica, la preeente invención contempla compoeiciones que comprenden entre aproximadamente 50 µg y aproximadamente 2000 µg de adyuvante y preferiblemente aproximadamente 250 µg/ml de dosie de la compoeición de vacuna. En otra realización preferida, la preeente invención contempla composiciones de vacuna que comprenden entre aproximadamente 1 µg/ml y aproximadamente 60 µg/ml de antibióticos, y más preferiblemente menoe de aproximadamente 30 µg/ml de antibióticoe . Así, la presente invención se refiere también a una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 de PCV2 descritae arriba, preferiblemente en concentracionee deecritae arriba, ii) al menoe una porción del vector viral que expresa la proteína ORF2 de PCV2, iii) una porción del cultivo de células, iv) un agente inactivante para inactivar el vector viral recombinante, preferiblemente BEI, y v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente inactivante, preferiblemente tiosulfato de sodio en cantidadees equivalentes a BEI; vi) un adyuvante adecuado, preferiblemente Carbopol 971, en cantidades descritas arriba; vii) una concentración farmacéutica aceptable de un tampón salino, preferiblemente de una sal fosfato, y viii) un agente anti-microbiológico activo; en donde aproximadamente el 90% de los componentes i) a iii) tienen un tamaño menor que 1 µm. Sorprendentemente, se ha encontrado que la composición inmunogénica proporcionada con la preeente era muy eetable a lo largo de un periodo de 24 meses. Se ha encontrado también que las composicionee inmunogénicas proporcionadas con la presente, que comprenden proteína ORF2 de PCV2 recombinante, que expreea baculovirue eegún ee proporcionan con la preeente, son muy eficaces para reducir los síntomae clínicoe aeociadoe con lae infeccionee por PCV2. Sorprendentemente, se ha encontrado que lae compoeicionee inmunogénicae que comprenden la proteína 0RF2 de PCV2 recombinante, que expreea baculovirue según se proporcionan con la presente, eon máe eficacee que una compoeición inmunogénica que comprende el virue PCV2 completo en una forma inactivada, o un antígeno 0RF2 de PCV2 viral aielado. En particular, eor rendentemente ee ha encontrado que la proteína 0RF2 de PCV2 recombinante, que expreea baculovirue ee eficaz en concentraciones muy bajas, lo que significa en concentraciones de hasta 0,25 µg/dosie. Eete elevado potencial inmunogénico ineeperado de la proteína ORF2 de PCV2 ee podría incrementar adicionalmente mediante la adición de Carbopol . Un aepecto adicional ee refiere a un recipiente que comprende al menoe una doeie de la composición inmunogénica de proteína ORF2 de PCV2 según se proporciona con la preeente, en donde una doeie comprende al menoe 2 µg de proteína ORF2 de PCV2, preferiblemente 2 a 16 µg de proteína ORF2 de PCV2. El recipiente puede comprender de 1 a 250 doeis de la composición inmunogénica, contiene preferiblemente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200 ó 250 dosie de la compoeición inmunogénica de proteína ORF2 de PCV2. Preferiblemente, cada uno de loe recipientee que comprende máe de una doeie de la compoeición inmunogénica de proteína ORF2 de PCV2 comprende, ademáe, un agente anti-microbiológico activo. Eeos agentes son, por ejemplo, antibióticos, incluidoe Gentamicina y Mertiolato y eimilaree. Aeí, un aepecto de la preeente invención ee refiere a un recipiente que comprende de 1 a 250 doeis de la composición inmunogénica de proteína ORF2 de PCV2, en donde una dosie comprende al menos 2 µg de proteína ORF2 de PCV2, y Gentamicina y/o Mertiolato, preferiblemente de aproximadamente 1 µg/ml hasta aproximadamente 60 µg/ml de antibióticos, y máe preferiblemente menoe de aproximadamente 30 µg/ml. Un aepecto adicional ee refiere a un kit que comprende cualquiera de loe recipientee deecritos arriba, y un manual de instruccionee, incluida la información para la aplicación intramuscular de al menos una doeie de la compoeición inmunogénica de proteína ORF2 de PCV2 a cochinilloe para dieminuir la gravedad de loe eíntomae clínicoe aeociadoe con la infección por PCV2. Ademáe de ello, de acuerdo con un aepecto adicional, el manual de inetruccionee comprende la información de una segunda administración o de administracionee adicionalee de al menoe una doeie de la compoeición inmunogénica de proteína ORF2 de PCV2, en donde la eegunda adminietración o cualquier adminietración adicional es al menos 14 días más tarde de la administración inicial o cualquier adminietración anterior. Preferiblemente, el manual de instrucciones incluye también la información para administrar un estimulante inmune. Preferiblemente, el eetimulante inmune deberá ser dado al menoe dos veces .

Preferiblemente, al menoe 3, máe preferiblemente al menoe 5, e inclueo máe preferiblemente al menoe 7 días se encuentran entre la primera y la segunda o cualquier adminietración adicional del eetimulante inmune. Preferiblemente, el eetimulante inmune ee da al menoe 10 díae, preferiblemente 15, inclueo máe preferiblemente 20, y aún máe preferiblemente al menoe 22 días más tarde de la administración inicial de la composición inmunogénica de proteína ORF2 de PCV2. Un eetimulante inmune preferido es, por ejemplo, hemocianina de lapa bocallave (KLH -siglas en inglés) , preferiblemente emulsionada con adyuvante de Freund incompleto (KLH/ICFA -siglas en inglés) . Sin embargo, se entiende con la preeente que también ee puede uear cualquier otro eetimulante inmune conocido por una pereona experta en la técnica. "Eetimulante inmune", tal como ee utiliza en eeta memoria, eignifica cualquier agente o compoeición que puede dieparar una reepueeta inmune general, preferiblemente ein iniciar ni incrementar una reepueeta inmune eepecífica, por ejemplo la reepueeta inmune contra un agente patógeno eepecífico. Se inetruye, ademáe, adminietrar el eetimulante inmune en una doeie adecuada. Ademáe de ello, el kit también puede comprender un recipiente, que incluye al menoe una doeis del eetimulante inmune, preferiblemente una doeie de KLH, o KLH/ICFA. Ademáe de ello, sorprendentemente también se ha encontrado que el potencial inmunogénico de las composiciones inmunogénicas que comprenden proteína ORF2 de PCV2 recombinante, que expreea baculovirue, preferiblemente en combinación con Carbopol , ee pueden reforzar adicionalmente mediante la adminietración de la vacuna IngelVac PRRS MLV (véaee el Ejemplo 5) . Loe eíntomae clínicoe de PCV2 y lae manifeetacionee de la enfermedad ee magnifican grandemente cuando eetá preeente una infección por PRRS. Sin embargo, lae compoeicionee inmunogénicas y las estrategias de vacunación, tal como se proporcionan con la presente, redujeron este efecto grandemente, y en mayor medida de lo eeperado. En otrae palabrae, ee obeervó un efecto sinérgico inesperado cuando los animales, preferiblemente cerdos, eon tratadoe con cualquiera de las composiciones inmunogénicas de proteína ORF2 de PCV2, según se proporcionan con la presente, y la vacuna Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim) . Así, un aspecto adicional de la presente invención se refiere al kit según se describe arriba, que comprende la composición inmunogénica de ORF2 de PCV2, según se proporciona con la presente y el manual de instrucciones, en donde el manual de instruccionee incluye, adicionalmente, la información de administrar la composición inmunogénica de ORF2 de PCV2 junto con, o aproximadamente al mismo tiempo que con una compoeición inmunogénica que comprende antígeno PRRS, preferiblemente antígeno PRRS con adyuvante. Preferiblemente, el antígeno PRRS es IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim) . Un aepecto adicional de la preeente invención también ee refiere a un kit que comprende i) un recipiente que contiene al menoe una doeie de una composición inmunogénica de 0RF2 de PCV2, según se proporciona con la presente, y ii) un recipiente que contiene una compoeición inmunogénica que comprende antígeno PRRS, preferiblemente antígeno PRRS con adyuvante. Preferiblemente, el antígeno PRRS ee IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim) . Más preferiblemente, el kit comprende, ademáe, un manual de inetruccionee que incluye la información de adminietrar las dos composiciones farmacéuticas. Preferiblemente, contiene la información de que la composición que contiene ORF2 de PCV2 se administra temporalmente antee de la compoeición que contiene PRRS. Un aepecto adicional ee refiere al uso de cualquiera de las composiciones proporcionadas con la presente en calidad de un medicamento, preferiblemente en calidad de un medicamento veterinario, incluso más preferiblemente en calidad de una vacuna. Además de ello, la presente invención también se refiere al uso de cualquiera de lae compoeicionee descritas en esta memoria, para la preparación de un medicamento para disminuir la gravedad de síntomae clínicoe asociados con una infección por PCV2. Preferiblemente, el medicamento es para la prevención de una infección por PCV2, incluso más preferiblemente en cochinillos.

Un aepecto adicional ee refiere a un método para (i) la prevención de una infección, o re-infección con PCV2 o (ii) la reducción o eliminación de eíntomae clínicos provocados por PCV2 en un eujeto, que comprende adminietrar cualquiera de lae composiciones inmunogénicas proporcionadas con la preeente a un eujeto que lo neceeita. Preferiblemente, el sujeto ee un cerdo. Preferiblemente, la compoeición inmunogénica ee adminietra por vía intramuecular . Preferiblemente, ee adminietra/n una dosis o dos dosie de la composición inmunogénica, en donde una dosis comprende preferiblemente al menos aproximadamente 2 µg de proteína ORF2 de PCV2, inclueo máe de preferencia aproximadamente 2 haeta aproximadamente 16 µg, y al menos aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 mg de Carbopol , de preferencia aproximadamente 1 mg de Carbopol . Un aspecto adicional ee refiere al método de tratamiento eegún se describe arriba, en donde ee administra una segunda aplicación de la compoeición inmunogénica. Preferiblemente, la segunda administración se realiza con la misma composición inmunogénica, preferiblemente con la misma cantidad de proteína ORF2 de PCV2. Preferiblemente, la segunda administración se da también por vía intramuscular. Preferiblemente, la eegunda adminietración ee da al menoe 14 díae máe tarde de la adminietración inicial, inclueo máe preferiblemente al menoe 4 eemanae máe tarde de la adminietración inicial.

De acuerdo con un aepecto adicional, el método de tratamiento comprende también la adminietración de un eetimulante inmune. Preferiblemente, el eetimulante inmune se administra al menos dos vecee. Preferiblemente, al menoe 3, máe preferiblemente al menoe 5 díae, inclueo máe preferiblemente al menoe 7 díae tranecurren entre la primera y la eegunda adminietración del eetimulante inmune. Preferiblemente, el eetimulante inmune se administra al menos 10 díae, preferiblemente 15, inclueo más preferiblemente 20, aún más preferiblemente al menoe 22 días más tarde de la administración inicial de la compoeición inmunogénica de proteína ORF2 de PCV2. Un eetimulante inmune preferido ee, por ejemplo, hemocianina de lapa bocallave (KLH) , aún preferiblemente emuleionada con adyuvante de Freund incompleto (KLH/ICFA) . Sin embargo, ee entiende con la preeente que también ee puede uear cualquier otro estimulante inmune conocido por una persona experta en la técnica. Está dentro del conocimiento general de una persona experta en la técnica para administrar el estimulante inmune en una dosis adecuada. De acuerdo con un aspecto adicional, el método de tratamiento deecrito arriba comprende también la adminietración de un antígeno PRRS. Preferiblemente, el antígeno PRRS ee IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim) . Preferiblemente, el antígeno PRRS ee adminietra temporalmente deepuée de la adminietración de la composición inmunogénica de la proteína ORF2 de PCV2. De acuerdo con un aepecto adicional, la presente invención proporciona una vacuna de combinación multivalente que incluye un agente inmunológico eficaz para reducir la incidencia de o disminuir la gravedad de una infección por PCV2 , y al menos un componente inmunogénico activo contra otro organismo provocador de la enfermedad en cerdos . En particular, el agente inmunológico, eficaz para reducir la incidencis de o disminuir la gravedad de una infección por PCV2 es un antígeno de PCV2. Preferiblemente, el antígeno de PCV2 ee una proteína ORF2 de PCV2 eegún ee proporciona con la preeente, o cualquier compoeición inmunogénica eegún se describe arriba, que comprende proteína ORF2 de PCV2. Sin embargo, se entiende con la preeente que un antígeno de PCV2 se refiere también a cualquier composición de materia que comprende al menos un antígeno que puede inducir, estimular o reforzar la respueeta inmune contra una infección por PCV2 cuando se administra a un cerdo. Preferiblemente, el antígeno de PCV2 es el virue PCV2 completo, preferiblemente en una forma inactivada, un virue PCV2 vivo modificado o atenuado, un virus quimérico que comprende al menos una secuencia de aminoácidoe inmunogénica de PCV2, cualquier otro polipéptido o componente que comprende al menoe una eecuencia de aminoácidoe inmunogénica de PCV2. Las expresionee "proteína inmunogénica", "polipéptido inmunogénico" o "secuencia de aminoácidos inmunogénica", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que provoca una respueeta inmune en un huéeped contra un agente patógeno que comprende la proteína inmunogénica, polipéptido inmunogénico o eecuencia de aminoácidoe inmunogénica. Una "proteína inmunogénica", "polipéptido inmunogénico" o "secuencia de aminoácidos inmunogénica", tal como se utiliza en esta memoria, incluye la secuencia de longitud completa de cualesquiera proteínas, sus análogos, o sue fragmentoe inmunogénicoe . Por "fragmento inmunogénico" se quiere dar a entender un fragmento de una proteína que incluye uno o máe epítopoe y, aeí, provoca la reepueeta inmunológica contra el agente patógeno relevante. Fragmentos de este tipo se pueden identificar utilizando cualquier número de técnicas de representación en mapa de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, p. ej . , Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (C-lenn E. Morris, Ed. , 1996) Humana Preee, Totowa, Nueva Jereey. Por ejemplo, epítopos lineales se pueden determinar, p. ej . , sintetizando concurrentemente grandes númeroe de péptidoe eobre eoportee eólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos, a la vez que los péptidos eiguen eetando fijados a los soportee. Técnicas de eete tipo eon conocidae en la técnica y se describen, p. ej . , en la patente de EE.UU. ns 4.708.871; Geyeen et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geyeen et al. (1986) Molec. Immunol . 23:709-715. De manera eimilar, epítopoe conformacionalee se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidoe talee como, p. ej . , crietalografía por rayoe x y reeonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, p. ej . , Epitope Mapping Protocols, supra. También se incluyen dentro de la definición antígenos sintéticos, por ejemplo poliepítopos, epítopos flanqueantes y otros antígenos recombinantes o derivados de forma sintética. Véase, p. ej . , Berg ann et al. (1993) Eur. J. Immunol . 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol . 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12a Conferencia Mundial del SIDA, Ginebra, Suiza, 28 de junio - 3 de julio de 1998. De acuerdo con una realización adicional, el antígeno de PCV-2 es CircoFLEX®, (Boehringer Ingelheim Vetmedica Ine, St Joeeph, MO, EE.UU.), CircoVac® (Merial SAS, Lyon, Francia), CircoVent (Intervet Inc., Milleboro, DE, EE.UU), o Suvaxyn PCV-2 One Doee® (Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, EE.UU) . Una "respuesta inmunológica o inmune" a una composición o vacuna ee el deearrollo en el huésped de una respueeta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interée. Habitualmente, una "respuesta inmune" incluye, pero no se ' limita a uno o máe de loe eiguientee efectoe: la producción o activación de anticuerpoe, célulae B, células T auxiliares, células T supreeorae y/o célulae T citotóxicas y/o células T yd, dirigidae eepecíficamente a un antígeno o antígenoe incluidos en la composición o vacuna de interés . Preferiblemente, el huésped exhibirá una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de modo que esa resistancia a la nueva infección resultará reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad quedará reducida. Una protección de este tipo quedará demoetrada por una reducción o carencia de loe eíntomae aeociadoe con infeccionee del huéeped eegún ee deecribe arriba. Preferiblemente, el otro organiemo en cerdoe provocador de la enfermedad ee eelecciona del grupo que coneiete en: Actinobacillus pleuropneumonia (1); Adenovirus (2); Alfavirus tal como virus de la encefalomielitie equina del Este (3); Bordetella bronchiseptica (4); Brachyepira epp. (5), preferiblemente B. hyodyentheriae (6); B. piosicoli (7), Brucella suie, preferiblemente biovaree 1, 2 y 3 (8); virus de la fiebre porcina clásica (9); Clostridium spp. (10), preferiblemente Cl. difficile (11), Cl . perfringens tipoe A, B y C (12), Cl. novyi (13), Cl.eepticum (14), Cl . tetani (15); Coronavirue (16), preferiblemente Coronavirue respiratorio porcino (17); Eperythrozoonosis suis (18); Erysipelothrix rheiopathiae (19) Eecherichia coli (20); Haemophilue parasuis, preferiblemente eubtipoe 1, 7 y 14 (21); virue de la encefalomielitie hemoaglutinante (22); virus de la encefalitis japonesa (23); Lawsonia intracellularie (24); Leptoepira epp. (25), preferiblemente Leptospira australie (26); Leptoepira canicola (27); Leptospira grippotyphosa (28); Leptospira icterohaemorrhagicae (29); y Leptospira interrogans (30); Leptoepira pomona (31); Leptoepira taraeeovi (32); Mycobacterium epp. (33) preferiblemente M. avium (34), M. intracellulare (35) y M.bovie (36); Mycoplaema hyopneumoniae (M hyo) (37); Paeteurella multocida (38); citomegalovirue porcino (39); parvovirue porcino (40); virue del eíndrome reproductor y reepiratorio porcino (PRRS) (41); virue peeudorrabia (42); rotavirue (43); Salmonella epp. (44), preferiblemente S. thyphimurium (45) y S. choleraesuie (46); Staph. hyicue (47); Staphylococcue spp. (48) preferiblemente Streptococcus spp. (49) , preferiblemente Strep. suie (50) virus herpes porcino (51); virue de la influenza porcina (52) virue varicela porcina (53); virue varicela porcina (54) virue de la eetomatitie veeicular (55); virue de exantema veeicular de cerdoe (56); Leptospira Hardjo (57); y/o Mycoplasma hyoeynoviae (58) . Cualquier referencia hecha en relación con un agente patógeno porcino en lo que sigue se puede hacer nombrando el agente patógeno, por ejemplo M.hyo, o haciendo referencia al número entre () a continuación del agente patógeno, que ee encuentra arriba. Por ejemplo, la referencia a M. hyo ee puede hacer por M. hyo o por (37) . Aeí, la preeente invención ee refiere a una vacuna de combinación para el tratamiento y/o la profilaxis de cerdos, que incluye un agente inmunológico eficaz para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de una infección por PCV2, preferiblemente un antígeno de PCV2 y, además, un componente inmunológico activo eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infeccionee provocadae por cualquiera de los agentes patógenos porcinos (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (45), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53), (54), (55), (56), (57) y/o (58) , o es un componente inmunológico activo del o loe agentee patógenos porcinoe. [combo 1] . Un "componente activo inmunológico", tal como ee uea en eeta memoria, eignifica un componente que induce o eetimula la reepueeta inmunitaria en un animal al que ee le adminietra el componente. De acuerdo con una realización preferida, la reepueeta inmunitaria se dirige a el componente o a un microorganismo que comprendel componente. De acuerdo con una realización preferida adicional, el componente activo inmunológico ee un microorganismo atenuado, incluido un virus vivo modificado (WM) , un microorganiemo inactivado o por lo menoe una parte activa inmunológica de un microorganiemo. "Parte activa inmunológica de un microorganiemo", tal como ee usa en esta memoria, significa una fracción que contiene una proteína, azúcar y/o glicoproteína que contiene una fracción de un microorganismo que comprende por lo menos un antígeno que induce o estimula la reepueeta inmune en un animal al que ee le adminietra el componente. De acuerdo con una realización preferida, la reepueeta inmune se dirige a la parte activa inmunológica de un microorganismo o a un microorganiemo que comprende la parte activa inmunológica. Preferiblemente, el componente inmunológico activo de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por el agente patógeno porcino (41) o ee un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (41) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por el agente patógeno porcino (37) o es un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (37) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por el agente patógeno porcino (1) o ee un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (1) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por el agente patógeno porcino (7) o ee un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (7) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infecciones provocadas por el agente patógeno porcino (24) o ee un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (24) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por el agente patógeno porcino (38) o ee un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (38) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por el agente patógeno porcino (21) o es un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (21) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infeccionee provocadae por el agente patógeno porcino (40) o es un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (40) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por el agente patógeno porcino (2) o ee un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (2) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por el agente patógeno porcino (44) o es un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (44) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infeccionee provocadae por el agente patógeno porcino (50) o ee un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (50) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por el agente patógeno porcino (19), preferiblemente (20) y/ó (21) o es un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (19), preferiblemente (20) y/ó (21). De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadas por el agente patógeno porcino (22) o es un componente inmunológico activo del agente patógeno porcino (22) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por los agentes patógenos porcinos (41) y (37) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenoe porcinoe (41) y (37) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infeccionee provocadae por los agentes patógenos porcinos (1) y (41) o es un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinoe (1) y (41) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por loe agentee patógenoe porcinoe (1) y (37) o ee un componente inmunológico activo de loe agentes patógenoe porcinoe (1) y (37) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por loe agentee patógenos porcinos (1), (41) y (37) o ee un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinoe (1) , (41) y (37) . En una forma preferida, eeta combinación ee adyuvante con Carbopol .

De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por los agentes patógenos porcinos (1) y (21) o es un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinoe (1) y (21) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por loe agentes patógenos porcinos (21) y (41) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenos porcinos (21) y (41) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infeccionee provocadae por loe agentes patógenos porcinos (21) y (37) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenos porcinos (21) y (37) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por los agentes patógenoe porcinoe (21) y (38) o ee un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinoe (21) y (38) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por loe agentes patógenos porcinos (7) y (19) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenos porcinos (7) y (19) .

De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por los agentes patógenos porcinos (38) y (33), preferiblemente (34), (35) y/ó (36) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenoe porcinoe (38) y (33), preferiblemente (34), (35) y/ó (36) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadae por loe agentee patógenoe porcinoe (49), preferiblemente (50) y (21) o ee un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinos (49), preferiblemente (50) y (21). De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por los agentes patógenos porcinoe (49), preferiblemente (50), (20) y (21) o ee un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinos (49), preferiblemente (50), (20) y (21). De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadas por los agentee patógenoe porcinos (49), preferiblemente (50), (20) y (21) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenos porcinos (49), preferiblemente (50), (20) y (21).

De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por los agentes patógenos porcinos (49), preferiblemente (50), (20), (38) y (21) o es un componente inmunológico activo de loe agentee patógenos porcinos (49), preferiblemente (50), (20), (38) y (21) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por los agentes patógenos porcinos (49), preferiblemente (50), (20), (33) y (21) o ee un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinoe (49), preferiblemente (50), (20), (33) y (21) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadas por los agentee patógenoe porcinos (49), preferiblemente (50), (20), (38), (33) y (21) o es un componente inmunológico activo de loe agentes patógenos porcinos (49), preferiblemente (50), (20), (38), (33) y (21) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadas por los agentes patógenos porcinos (40), (41) y (19) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenos porcinos (40) , (41) y (19) . De acuerdo con otro aspecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadae por los agentes patógenos porcinoe (38), (4) y (19) o ee un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinoe (38) , (4) y (19) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por loe agentee patógenoe porcinoe (38), (4), (21) y (19) o ee un componente inmunológico activo de loe agentee patógenoe porcinoe (38), (4), (21) y (19) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por loe agentee patógenos porcinos (20), preferiblemente (20) (31) y (38) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenos porcinoe (20), (31) y (38). De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infeccionee provocadas por los agentee patógenoe porcinoe (5) , preferiblemente (5) y (24) o ee un componente inmunológico activo de loe agentes patógenos porcinoe (5) y (24) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infeccionee provocadae por loe agentes patógenos porcinoe (1), preferiblemente (1) y (5) o ee un componente inmunológico activo de los agentes patógenoe porcinoe (1) y (5) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de infecciones provocadas por los agentes patógenos porcinos (41), preferiblemente (40), (27), (28), (29), (31), (19) y ( 59) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenos porcinoe (41) , (40) , (27) , (28) , (29), (31), (19) y (57) . De acuerdo con otro aepecto, el componente inmunológico activo adicional de [combo 1] ee eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones provocadas por los agentes patógenos porcinos (6) , preferiblemente (6) , (19) y (58) o es un componente inmunológico activo de los agentes patógenos porcinos (1) y (5) . De acuerdo con otro aepécto, el componente inmunológico activo adicional de la vacuna de combinación ee eelecciona del grupo que coneiete en Enterieol® Ileitis, Enterisol® Ileitis FF, Enterisol® SC-54, Enterisol® SC-54 FF, Enterisol® ERY-ALC, Ingelvac® APP ALC, Ingelvac® AR4, Ingelvac® HP-1, Ingelvac® HPE-1, Ingelvac® M. hyo, Ingelvac® PRRS MLV, Ingelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRV-Gl, Reprocyc® PRRS PLE, Reprocyc® PLE, Tetguard™, Toxivac® AD+E, Toxivac® Plus Parsius, (todoe de Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, EE.UU.); Circovent, Porcilie Coli, Porcilis ERY + PARVO, Porcilis Ery, Porcilis Glasser, Porcilis Parvo, Porcilie Porcoli DF, Porcilie APP, Porcilie AR-T, Porcilie AR-T DF, Porcilie Porcoli, Porcilie Porcoli Diluvac forte, Porcilie PRRS, Porcilie Porcol 5, Porcilie Aujeezky, Porcilie Begonia Diluvac, Porcilie Begonia I.D.A.L., Porcilie Begonia Unieole, Porcilie M. hyo, .Porcilie Atrinord, Myco Silencer® BPM, Myco Silencer® BPME, Myco Silencer® ME, Myco Silencer® M, Myco Silencer® Once, Myco Silencer® MEH, Rhinogen® BPE, Rhinogen® CTE 5000, Rhinogen® CTSE, Score, Sow Bac® E II, Sow Bac® CE ??, Sow Bac® TREC, ProSystem® CE, ProSystem® RCE, ProSystem® TREC, ProSystem® Pillmune, ProSystem® Rotamune® con Imugan® II, ProSystem® Rota, ProSystem® Rotamune KV, ProSystem® TG-Emune® Rota con Imugan® II, ProSystem® TGE/Rota, ProSyetem® TG-Emune® con Imugen®, ProSystem® TGE, MaGESTIC 7, MaGESTIC 8, MaGESTic™ con Spur®, MaGESTic® 7 con Spur®, MaGESTic® 8 con Spur®, End-FLUence® con Imugen® 11, End-FLUence® 2, PRRomiSE®, PRV-Begonia con Dlluvac Forte®, Argus® SC/ST, Strep Bac, Strep Bac® con Imugen® II, Colieorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Eryeorb Parvo, (todoe de Intervet Inc., Millsboro, DE, EE.UU.); Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progreeeis, Viraflu, Akipor 6.3, Jespur gl-, Jeeflu gl- (todoe de Merial LTD, Duluth, GA) ; ER BAC® PLUS, ER BAC®, ER BAC® PLUS/LEPTOFERM-5®' ER BAC® Leptoferm-5®, Farroweure®, Farroweure® B, FARROWSURE® PLUS B, FARROWSURE® PLUS, FARROWSURE® PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE™, FLUSURE™ RTU, FLUSURE™/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/ER BAC PLue®, FLUSURE™/RESPISURE®, FLUSURE™/RESPISURE® RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE®/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/ReepiSure 1 ONE®/ER BAC Plus®, FLUSURE™/RESPISURE ONE®, FLUSURE™/RESPISURE 1 ONE®, FLUSURE/Farroweure Plue, FLUSURE/Farroweure Plue B, LITTERGUARD® LT-C, LITTERGUARD® LT, PleuroGuard® 4, Pneumosuis III, Stellamune One, Stellamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Mycoplaema, Respieure One, Reepieure®, Reepisure 1 ONE®, Respieure 1 One®/ER Bac Plus®, Enduracell T, Zylexis (antiguamente conocido como Baypamune) , Atrobac® 3, BratiVac®, BratiVac®-B, Leptoferm-5™™ .. Parvo-Vac®/Leptoferm-5®, PR-Vac®-Killed, PR-Vac®, PR-Vac Plue™.. (todoe de Pfizer Inc., New York, NY, EE.UU.); Suvaxyn MH One, Suvaxyn ReepiFend® MH, Suvaxyn Mycoplaema, Suvaxyn Aujeezky Bartha + Diluyente, Suvaxyn Aujeezky Bartha + a/a, Suvaxyn Aujeezky-Flu, Suvaxyn Aujeezky 783 + a/a, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-One, Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend® APP, Suvaxyn ReepiFend® HPS, Suvaxyn ReepiFend® MH/HPS, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn® AR/T/E, Suvaxyn® EC-4, Suvaxyn® E, Suvaxyn®-E, Suvaxyn® E-oral, Suvaxyn® PLE, Suvaxyn® PLE/PrV gpl-, Suvaxyn® LE+B, Suvaxyn® PLE + B, Suvaxyn® PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn® SIV, Suvaxyn® SIV/Mh-one, Suvaxyn® P, Suvaxyn® PrV gpl-, Suvaxyn® PCV-2 One Shot (todos de Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, EE.UU. (Wyeth) ; SCOURMUNE®, SCOURMUNE®-C, SCOURMUNE®-CR, AR-PAC®-PD+ER, AR-PARAPAC®+ER, M+ Rhusigen®, M+PAC®, MaxiVac Excell®3, MaxiVac® HlNl, MaxiVac® H3N2, Ma?iVac®-FLU, MaxiVac®-M+, MaxiVac Excell®, MaxiVac Excell 3, PARAPAC®, PNEU PAC®, PNEU PAC®-ER, PNEU PAC®+ER, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®-MaxiVac® FLU, Rhueigen™, Gletvax 6, Covexin 8, M + PAC, Gletvax plue, M-ParapacD..SS PAC® (todoe de Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, EE.UU.); AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLÁSSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (todoe de Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona, España); Cloetricol, Coliporc Plue, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART + EP, RESPIPORC FLU, Reepiporc M. HYO 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35 (todos de IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Alemania) ; Mypravac Suis, (Albrecht GmbH, Alemania) ; Haemo Shield® P, Parapleuro Shield® P, Parapleuro Shield® P+BE, Rhinicell® FD, Rhini ShieldD TX4, Prefarrow Shield® 9, Prefarrow Strep Shield®, Clostratox® BCD, Cloetratox® C, Cloetratox® Ultra C 1300, Porcine Ecolizer® 3 + C, Porcine Pili Shield ™.+C, Porcine Pili Shield ™...Porcine Ecolizer® 3, Ery Serum™ ..Ery Shield™.. Ery Vac Oral, Ery Shield™ +L5, PanSTAR™ Ery, ErycellD ..Parvo Shield® E, Parvo Shield® L5E, Parvo Shield® L5, Parvo Shield®, Para Shield®, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR™ Myco, Lepto Shield™ 5, Myco Shield™ .. Salmo Shield® 2, Salmo Shield® Live, Amitox Tet™ ..C. Perfingene Type A Toxoid (todos de Novartis Animal Health, Basel, Suiza) ; Nitro-Sal (Akro) ; o cualquier antígeno que eeté incluido en lae compoeicionee antee deecritae. Alternativamente, cuando el antígeno PCV2 ya eetá preeente en cualquiera de eeae vacunas, (i) antígeno PCV2, según ee deecribe en eeta memoria, se añade a cualquiera de esae compoeicionee/antígenoe, o (ii) el antígeno PCV2 presente en cualquiera de esae vacunas es reemplazado por el antígeno PCV2, según ee deecribe en eeta memoria.

Formulacionee Un aepecto importante de la preeente invención ee la preparación de la vacuna o vacunas de combinación. La persona experta conoce componentes adicionales que pueden estar contenidos en la composición (véase también Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18a ed. Mack Publ., Easton).

El experto puede utilizar solucionee estériles inyectables, fisiológicamente aceptablee conocidae . Para preparar una eolución lieta para el ueo para inyección parenteral o infueión, eetán fácilmente disponibles soluciones isotónicae acuoeae, talee como, p. ej . , eolución ealina o correepondientee eolucionee de proteínae en el plaema. Lae compoeicionee farmacéuticae pueden eetar preeentee en forma de liofilizadoe o preparacionee secas , las cuales ee pueden reconetituir con una eolución inyectable conocida, directamente antee del ueo bajo condicionee eetérilee, p. ej . en forma de un kit de partee . Ademáe, lae compoeiciones inmunogénicas y de vacuna de la preeente invención pueden incluir uno o máe soportes aceptables desde el punto de vista veterinario. Tal como ee usa en esta memoria, "un soporte aceptable desde el punto de vista veterinario" incluye todos y cada uno de disolventes, medios dispereantee, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que demoran la adsorción y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, eolución ealina, dextroea, etanol, glicerol y similaree. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetraacético, entre otroe . Adyuvantee preferidoe eon loe deecritoe anteriormente. Lae compoeicionee inmunogénicae pueden además incluir uno o más de otros agentes inmunomoduladores tales como p. ej . , interleucinas, interferones u otrae citocinae. Lae compoeicionee inmunogénicae pueden también incluir Gentamicina y Mertiolato. Si bien lae cantidadee y concentracionee de loe adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la preeente invención pueden determinaree fácilmente por el experto en la técnica, la presente invención contempla composicionee que comprenden de aproximadamente 50 µg a aproximadamente 2000 µg de adyuvante y de preferencia aproximadamente 250 µg/ml de dosie de la compoeición de vacuna. En otra realización preferida, la preeente invención contempla compoeiciones de vacuna que comprenden de aproximadamente 1 µg/ml a aproximadamente 60 . µg/ml de antibióticos, y más preferiblemente menos de aproximadamente 30 µg/ml de antibióticos . Según una realización adicional, la vacuna combinada primero se deshidrata. Si la compoeición ee liofiliza o deehidrata primero por otroe métodoe, entoncee, antee de la vacunación, la compoeición ee rehidrata en eolucionee acuoeae (p. ej . eolución salina, STP (solución salina tamponada con fosfato)) o no acuosas (p. ej . emulsión en aceite (aceite mineral, o basado en aceite aceite vegetal/metabolizable/basado en emuleión eencilla o doble) , baeado en aluminio, adyuvante basado en carbómero) .

Dosificación y administración De acuerdo con la presente invención, una cantidad eficaz de una vacuna de combinación, administrada a cerdos, proporciona una inmunidad eficaz contra infecciones microbiológicas provocadas por PCV2 y al menos un agente patógeno adicional según se lista arriba. Combinacionee preferidae de antígenoe para el tratamiento y la profilaxie de enfermedadee biológicae en cerdos se listan arriba. De acuerdo con una realización adicional, la vacuna de combinación ee adminietrada a cerdos en una o dos doeie con un intervalo de aproximadamente 2 a 4 semanas. Por ejemplo, la primera administración se realiza cuando el animal tiene aproximadamente 2 a 3 semanas haeta aproximadamente 8 eemanae de edad. La segunda administración se realiza aproximadamente 1 a aproximadamente 4 semanae de la primera adminietración de la primera vacunación. De acuerdo con una realización adicional, la revacunación ee realiza en un intervalo de 3 a 12 meses despuée de la adminietración de la eegunda dosis. La administración de las doeie eubsiguientes de la vacuna preferiblemente ee realiza eegún una baee eemeetral o anual. En otra realización preferida, debería volveree a vacunar animalee vacunadoe de la edad de aproximadamente 2 a 3 semanae. La administración de las dosie subsiguientee de la vacuna preferiblemente ee realiza eegún una baee anual. La cantidad de la vacuna de combinación que ee eficaz depende de los ingredientes de la vacuna y del catálogo de administración. Típicamente, cuando se utilice una preparación con un virus inactivado o un virus vivo modificado en la vacuna de combinación, se utilizará una cantidad de la vacuna que contenga aproximadamente 102 a aproximadamente 109 DICT50 por dosis, de preferencia aproximadamente 103 a aproximadamente 108 DICT50 por dosie, máe preferiblemente, aproximadamente 104 a aproximadamente 108 DICT50 por dosis. En general, el antígeno inactivado normalmente se utiliza en cantidades mayores que el virus modificado vivo. Típicamente, cuando ee utiliza el antígeno bacteriano en la vacuna de combinación, conteniendo la vacuna una cantidad de aproximadamente 103 a aproximadamente 109 unidades formadoras de coloniae (UFC) por dosis, preferiblemente, aproximadamente 104 a aproximadamente 108 (UFC) por dosis, más preferiblemente aproximadamente 105 a aproximadamente 106 (UFC) por dosie. Vacunae eub-unidad son administradas normalmente con un nivel de inclusión de antígenoe de al menoe 0,2 µg de antígeno por dosis, preferiblemente con aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 400 µg/dosis, todavía más preferiblemente con aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 200 µg/doeie, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0,35 hasta aproximadamente 100 µg/doeie, aún máe preferiblemente con aproximadamente 0,4 haeta aproximadamente 50 µg/dosis, aún más preferiblemente con aproximadamente 0,45 hasta aproximadamente 30 µg/dosis, aún más preferiblemente con aproximadamente 0,6 hasta aproximadamente 15 µg/dosie, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0,75 hasta aproximadamente 8 µg/dosie, inclueo máe preferiblemente con aproximadamente 1,0 haeta aproximadamente 6 µg/doeie, y aún más preferiblemente con aproximadamente 1,3 hasta aproximadamente 3,0 µg/dosis. Por ejemplo, el nivel de inclusión de antígenos del antígeno ORF2 de PCV, preferiblemente de la proteína ORF2 de PCV2, según ee proporciona con la preeente, contiene aproximadamente 2 µg haeta aproximadamente 150 µg, de preferencia aproximadamente 2 µg haeta aproximadamente 60 µg, inclueo con máe preferencia aproximadamente 2 µg haeta aproximadamente 50 µg, inclueo con más preferencia aproximadamente 2 µg hasta aproximadamente 40 µg, incluso con máe preferencia aproximadamente 2 µg haeta aproximadamente 30 µg, incluso con más preferencia aproximadamente 2 µg hasta aproximadamente 25 µg, incluso con más preferencia aproximadamente 2 µg haeta aproximadamente 20 µg, incluso con más preferencia aproximadamente 4 µg haeta aproximadamente 20 µg, e incluso con máe preferencia aproximadamente 4 µg haeta aproximadamente 16 µg. En el caeo de vacunas de combinación que incluyen (37), ee prefiere utilizar al menoe 1 a 10 logs, más preferiblemente 5-10 logs y, lo más preferiblemente, 6-8 logs. En el caso de vacunas de combinación que incluyen (41) , ee prefiere utilizar al menoe 1 a 10 logs, más preferiblemente 3-10 logs y, lo más preferiblemente, 5-6 logs. La compoeición de acuerdo con la invención ee puede aplicar por vía intradérmica, intratraqueal o intravaginal. Preferiblemente, la composición se puede aplicar por vía intramuscular o intranasal. En un cuerpo animal, se puede manifestar ventajoso aplicar las composiciones farmacéuticas, según se describe antes, a tejidos diana a través de una inyección intravenosa o por inyección directa. Para la aplicación sietémica, ee prefieren las víae intravenoea, intravascular, intramuscular, intranasal, intraarterial, intraperitoneal, oral o intratecal. Se puede efectuar una aplicación más local por vía subcutánea, intradermal, intracutánea, intracardial, intralobal, intramedular, intrapulmonar, o directamente en o cerca del tejido a tratar (tejido conjuntivo, óeeo, muecular, nervioeo, epitelial) . Dependiendo de la duración y eficacia de tratamiento deeeadoe, lae compoeicionee de acuerdo con la invención ee pueden adminietrar una o varias veces, también de forma intermitente, por ejemplo sobre una base diaria durante varios días, semanae o mesee y en diferentes dosificaciones.

Métodos para tratamiento Incluso otra realización importante de la invención consiste en un método para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades provocadas por PCV2, y uno o máe microorganiemos patógenos de cerdos, en donde el antígeno de PCV2, preferiblemente una proteína 0RF2 de PCV2, eegún ee proporciona con la preeente, y componentes activos inmunológicoe adicionales, eficaces para el tratamiento y/o la profilaxis de la infección provocada por el otro microorganismo patógeno de cerdos se administran a un animal que lo necesita en una doeie adecuada. De acuerdo con un aepecto adicional, la proteína 0RF2 de PCV2 ee parte de una compoeición antigénica, eegún ee describe arriba. Así, todavía otro aspecto de la preeente invención ee refiere a una vacuna de combinación que comprende una cualquiera de lae compoeicionee proporcionadae con la preeente y que comprende proteína ORF2 de PCV2, y otro componente inmunológico activo eficaz para el tratamiento y/o la profilaxie de una infección provocada por el otro microorganismo patogénico de cerdoe . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ee un diagrama de flujo esquemático de una construcción preferida de baculovirus recombinante de 0RF2 de PCV2; y Las Fige. 2a y 2b eon, cada una, un diagrama de flujo eequemático de cómo producir una compoeición de acuerdo con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Loe eiguientee ejemplos recogen materiales preferidos y procedimientoe de acuerdo con la preeente invención. Ha de entenderse, sin embargo, que estoe ejemploe ee proporcionan a modo de ilustración solamente, y nada en ellos debe consideraree una limitación trae el alcance global de la invención.

EJEMPLO 1 Eete ejemplo compara loe rendimientos relativos de ORF2 utilizando métodoe de la preeente invención con métodoe que eon conocidoe en la técnica anterior. Cuatro matracee de centrifugación de 1000 mL ee eembraron cada uno con aproximadamente 1,0 x 106 célulae Sf+/ml en 300 mL de medioe exentos de suero de insectoe, Excell 420 (JRH Bioeciences, Inc., Lenexa, KS) . El cultivo celular patrón se identifica como SF+ ( Spodoptera frugiperda) Master Cell Stock, paeaje 19, Lote n2 N112-095W. Las célulae utilizadas para generar el SF+ Maeter Cell Stock ee obtuvieron de Protein Sciences Corporation, Inc., Meriden, CT. La línea de células SF+ para este ejemplo fue confinada entre los pasajes 19 y 59. Otros pasajes funcionarán para los fines de la presente invención, pero con el fin de aumentar la escala del procedimiento para una producción a gran escala, serán necesarios, probablemente, al menos 19 pasajee, y paeajee máe allá de 59 pueden tener un efecto sobre la expresión, aunque esto no se investigó. Con mayor detalle, los cultivos iniciales de células SF+ procedentes de almacenamiento en nitrógeno líquido se hicieron crecer en medio Excell 420 en euepeneión en matracee de centrifugación eetérilee con conetante agitación. Loe cultivos ee hicieron crecer en matracee de centrifugación de 100 mL a 250 mL con 25 a 150 mL de medio exento de suero Excell 420. Cuando lae células se habían multiplicado hasta una densidad de células de 1,0 - 8,0 x 106 células/mL, éstas se dividieron en nuevos recipientes con una densidad de eiembra de 0,5 - 1,5 x 106 célulae/mL. Loe cultivoe por expansión subeiguientee ee hicieron crecer en matracee de centrifugación de haeta 36 litroe de capacidad o en biorreactores de acero inoxidable de hasta 300 litros durante un periodo de 2-7 días a 25 - 29°C. Después de la siembra los matraces se incubaron a 27°C durante cuatro horas. Subsiguientemente, cada uno de los matraces se sembró con un baculovirus recombinante que contenía el gen ORF2 de PCV2 (SEQ ID NO: 4) . El baculovirus recombinante que contenía el gen ORF2 de PCV2 se generó como sigue: el gen ORF2 de PCV2 procedente de una cepa de Norte América de PCV2 se amplificó por PCR para que contuviera una secuencia 5' Kozak (SEQ ID NO: 1) y un sitio 3' EcoRl (SEQ ID NO: 2), clonado en el vector pGEM-T-Easy (Promega, Madison, Wl) . Luego se escindió subsiguientemente y se subclonó en el vector de transferencia pVLl392 (BD Biosciencee Pharmingen, San Diego, CA) . La porción subclonada ee representa en esta memoria como SEQ ID NO: 7. El plásmido pVLl392 que contenía el gen 0RF2 de PCV2 ee designó N47-064Y y luego se co-transfectó con ADN de baculovirus BaculoGold® (BD Bioeciencee Pharmingen) en célulae de insecto Sf+ (Protein Sciences, Meriden, CT) para generar el baculovirus recombinante que contenía el gen 0RF2 de PCV2. La nueva construcción se proporciona en esta memoria como SEQ ID NO: 8. El baculovirus recombinante que contenía el gen 0RF2 de PCV2 se purificó en placa y el virus de la Cepa Madre (Master Seed Virus - MSV) se propagó en la línea de células SF+, ee tomaron partee alícuotae y ee almacenó a -70SC. El MSV ee identificó poeitivamente como baculovirue ORF2 de PCV2 mediante PCR-RFLP utilizando cebadoree eepecíficoe de baculovirue. Lae célulae de ineectoe ee infeetaron con baculovirue ORF2 de PCV2 para generar MSV o virue de la Cepa de Trabajo (Working Seed Virue) expresan antígeno ORF2 de PCV2, según se detecta por euero policlonal o anticuerpoe monoclonalee en un eneayo de anticuerpoe fluoreecentee indirecto. Adicionalmente, la identidad del baculovirue ORF2 de PCV2 fue confirmada por la eecuenciación de aminoácidoe N-terminal. El baculovirue ORF2 de PCV2 MSV también ee eometió a eneayo en cuanto a la pureza de acuerdo con 9 C.F.R. 113.27 (c) , 113.28 y 113.55. Cada baculovirue recombinante sembrado en los matracee de centrifugación tenía multiplicidadee de infección (MOIs) variables. El matraz 1 fue eembrado con 7,52 mL de eiembra 0,088 MOI; el matraz 2 fue eembrado con 3,01 mL de eiembra 0,36 MOI; el matraz 3 fue eembrado con 1,5 mL de eiembra 0,18 MOI; y el matraz 4 fue eembrado con 0,75 mL de eiembra 0,09 MOI. Un diagrama de flujo eequemático que iluetra lae etapae báeicae utilizadae para construir un baculovirus recombinante ORF2 de PCV2 se proporciona en esta memoria como Figura 1. Despuée de ser sembradoe con el baculovirue, loe matracee ee incubaron luego a 27 ± 2°C durante 7 días y se agitaron también a 100 rpm durante ese tiempo. Los matraces utilizaban taponee ventiladoe para permitir el flujo de aire. De cada uno de loe matracee ee tomaron mueetrae cada 24 horae durante los siguientee 7 díae. Deepuée de la extracción, cada una de lae muestrae se centrifugó y tanto el sedimento como el eobrenadante ee eepararon y luego ee microfiltraron a travée de una membrana con un tamaño de poros de 0,45-1,0 µm. Las muestrae resultantes tenían la cantidad de ORF2 presente en ellas, cuantificada a través de un ensayo ELISA. El ensayo ELISA se efectuó con anticuerpo de captura Pab igG Prot. G anti-PCV2 porcino purificado (diluido a razón de 1:250 en PBS), diluido a razón de 1:6000 en tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6). 100 µL del anticuerpo ee diepueieron luego en loe pocilloe de la placa de microtitulación, se sellaron e incubaron durante una noche a 37°C. La placa ee lavó deepuée tree vecee con una eolución de lavado que comprendía 0,5 mL de Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO) , 100 mL de 10X D-PBS (Gibco Invitrogen, Carlebad, CA) y 899,5 mL de agua deetilada. Subeiguientemente, ee añadieron a cada uno de loe pocilloe 250 µL de una eolución de bloqueo (5 g de leche en polvo no graea Carnation (Nestle, Glendale, CA) en 10 mL de D-PBS QS hasta 100 mL con agua destilada) . La etapa siguiente era lavar la placa de ensayo y luego añadir antígeno pre-diluido. El antígeno pre-diluido se produjo añadiendo 200 µL de solµción diluyente (0,5 mL de Tween 20 en 999,5 mL de D-PBS) a cada uno de loe pocilloe en una placa de dilución. La mueetra ee diluyó luego a una relación de 1:240 y a una relación de 1:480, y 100 µL de cada una de eetae mueetra diluidae se añadieron despuée a uno de loe pocilios superiores en la placa de dilución (es decir, un pocilio superior recibió 100 µL de la dilución de 1:240 y el otro recibió 100 µL de la dilución de 1:480). Después se hicieron diluciones en serie para el resto de la placa separando 100 µL de cada uno de los pocilios sucesivos y transfiriéndoloe al pocilio siguiente de la placa. Cada pocilio se mezcló antes de realizar la siguiente traneferencia. El lavado de la placa de eneayo incluía el lavado de la placa durante tree vecee con el tampón de lavado. La placa ee eelló deepuée y ee incubó durante una hora a 37°C antes de lavarla tres veces más con el tampón de lavado. El anticuerpo de detección utilizado era anticuerpo monoclonal contra ORF2 de PCV. Se diluyó a razón de 1:300 en solución diluyente y deepués se añadieron a los pocilios 100 µL del anticuerpo de detección diluido. La placa se selló después y se incubó durante una hora a 37°C antee de lavarla tres veces con el tampón de lavado. Luego se preparó diluyente conjugado añadiendo suero normal de conejo (Jackeon Immunoreeearch, Weet Grove, PA) a la eolución diluyente haeta una concentración del 1%. Anticuerpo conjugado anti-ratón de cabra (H+D-HRP (Jackeon Immunoreeearch) ee diluyó en el diluyente de conjugado haeta 1:10.000. 100 µL del anticuerpo conjugado diluido ee añadieron entoncee a cada uno de loe pocilloe. La placa ee eelló deepuée y se incubó durante 45 minutos a 37°C antes de lavarla tres veces con el tampón de lavado. 100 µL de sustrato (Sustrato TMB Peroxidasa, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL) , Gaithersberg, MD) , mezclados con un volumen igual de Sustrato Peroxidaea B (KPL) ee añadieron a cada uno de loe pocilloe. La placa ee incubó a temperatura ambiente durante 15 minutoe. 100 µL de eolución de HCl 1 N ee añadieron luego a todoe loe pocilloe para detener la reacción. La placa ee hizo pasar luego a través de un lector ELISA. Los resultados de este ensayo se proporcionan en la Tabla 1 que o figura a continuación: Tabla 1: Estos resultadoe indican que cuando se prolonga el tiempo de incubación, la expresión de 0RF2 en el sobrenadante de las células centrifugadas y los medios ee mayor que la expreeión en el sedimento de las células centrifugadas y los medios. Por consiguiente, al permitir que la expresión de 0RF2 prosiga durante al menos 5 días y que se recupere en el sobrenadante más que permitir que la expresión prosiga durante menos de 5 días y recuperar 0RF2 de las célulae, proporciona un gran aumento en los rendimientos de 0RF2 y una mejora significativa frente a los métodos anterioree .

EJEMPLO 2 Eete ejemplo proporciona datoe en cuanto a la eficacia de la invención reivindicada en eeta memoria. Un matraz de centrifugación de 1000 mL ee eembró con aproximadamente l,0xl06 células Sf+/ml en 300 mL de medio Excell 420. El matraz se incubó luego a 27°C y ee agitó a 100 rpm.

Subsiguientemente, el matraz se sembró con 10 mL de siembra de virus ORF2 de PCV2/Bac p+6 (el baculovirus recombinante que contiene el gen ORF2 de PCV2 ORF2 pasó 6 veces adicionales en las células de ineectoe Sf9) con 0,1 MOI después de 24 horas de incubación. El matraz se incubó despuée a 27°C durante un total de 6 días. Después de la incubación, el matraz se centrifugó deepuée y ee recogieron e inactivaron tres muestrae del eobrenadante reeultante. El eobrenadante ee inactivo haciendo que su temperatura alcanzara 37 ± 2°C. A la primera muestra, una eolución 0,4 M de hidrobromuro de 2-bromoetilenamina que había eido ciclada a etilenimina binaria (EBI) 0,2 M en NaOH 0,3 N ee añade al eobrenadante para dar una concentración final de BEI de 5 mM. A la eegunda mueetra, 10 mM de BEI ee añadieron al sobrenadante. A la tercera mueetra no ee añadió BEI al eobrenadante. Lae mueetrae ee agitaron luego continuamente durante 48 h. Se añadió una eolución de tioeulfato de eodio 1,0 M para dar una concentración mínima final de 5 mM para neutralizar toda BEI reeidual. La cantidad de ORF2 en cada mueetra ee cuantificó deepuée utilizando el mismo proceso de ensayo ELISA que el descrito en el Ejemplo 1. Los resultados de este ensayo ee pueden ver en la Tabla 2 que figura a continuación: Tabla 2: Eete ejemplo demueetra que la neutralización con BEI no eepara ni degrada cantidadee importantes del producto proteína ORF2 de PCV2 recombinante. Esto ee evidencia por el hecho de que no hay una gran pérdida de 0RF2 en el sobrenadante procedente de la BEI o temperaturas elevadas . Los expertos en la técnica reconocerán que el 0RF2 recuperado es un producto proteínico estable.

EJEMPLO 3 Eete ejemplo demuestra que la presente invención puede ser realizada a escala desde una producción a pequeña eecala de 0RF2 de PCV2 recombinante a una producción a gran eecala de ORF2 de PCV2 recombinante. 5,0 x 105 célulae/ml de células SF+ /ml en 7000 mL de medio ExCell 420 se eembraron en un Biorreactor Applikon de 20000 mL. Loe medioe y lae célulae ee incubaron luego a 27°C y se agitaron a 100 RPM durante las siguientee 68 horae. A la 68" hora, 41,3 mL de Baculovirue MSV+3 ORF2 de PCV2 se añadieron a 7000 mL de medio ExCell 420. La mezcla resultante se añadió luego al biorreactor. Durante los siguientee eiete días, la mezcla se incubó a 27°C y se agitó a 100 RPM. Muestras procedentes del biorreactor se extrajeron cada 24 horas, comenzando el día 4, post-infección, y cada muestra se centrifugó. Los eobrenadantes de las muestrae ee conservaron y la cantidad de ORF2 se cuantificó luego utilizando una densitometría por SDS-PAGE. Los resultados de esto se pueden ver en la Tabla 3 que figura a continuación: Tabla 3: EJEMPLO 4 Eete ejemplo somete a ensayo la eficacia de eiete vacunae candidatae de PCV2 y define, ademáe, parámetros de eficacia después de la exposición a una cepa virulenta de PCV2. Ciento ocho (108) cochinilloe deeprovietoe de caloetro derivado de la ceeárea (CDCD - eiglae en inglée) , de 9-14 días de edad, se dividieron al azar en 9 grupos de igual tamaño. La Tabla 4 recoge el Diseño de Estudio General para este Ejemplo.

Tabla 4. Diseño de Estudio General vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virue de célulae completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado Siete de los grupos (Grupos 1 - 7) recibieron dosis de polipéptido ORF2 de PCV2 , uno de los grupos actuó como control de enfrentamiento y no recibió ORF2 de PCV2 y otro grupo actuó como el grupo control negativo eetricto y tampoco recibió ORF2 de PCV2. El Día 0 , los Grupos 1 a 7 fueron tratados con vacunae aeignadae. A loe cochinilloe del Grupo 7 ee lee dio un tratamiento de refuerzo el Día 14. Los cochinillos fueron observadoe en cuanto a sucesos adversoe y lae reaccionee del sitio de inyección después de la vacunación, y el Día 19, los cochinillos ee trasladaron al segundo sitio de estudio. En el segundo sitio de estudio, los Grupos 1-8 fueron alojados en grupo en un edificio, mientras que el Grupo 9 fue alojado en un edificio eeparado. Todoe loe cerdoe recibieron hemocianina de lapa bocallave (KLH) /adyuvante incompleto de Freund (ICFA -eiglae en inglés) los Días 21 y 27 y el Día 24, a loe Grupos 1-8 ee lee enfrentó con un PCV2 virulento. Antee y deepuée del enfrentamiento ee tomaron mueetrae de eangre para la eerología del PCV2. Deepués del enfrentamiento se recogieron datos del peso corporal para la determinación de la ganancia de peso media diaria (ADWG - siglae en inglée) ,y los síntomas clínicos, así como muestras de torunda nasal para determinar la secreción nasal de PCV2. El Día 49, se practicó necropsia a todos los cerdos supervivientee, ee anotaron los pulmones en cuanto a lesionee, y loe tejidoe eeleccionados se conservaron en formalina para el ensayo de Inmunohistoquímica (IHC - siglae en inglée) para una fecha posterior.

Materiales y Métodos: Este era un estudio de capacidad de enfrentamiento frente a la vacunación parcialmente ciego realizado en cerdos CDCD, de 9 a 14 días de edad el Día 0. Para ser incluidos en el estudio, los títulos IFA de PCV2 de cerdas eran = 1:1000. Adicionalmente, el estado serológico de cerdas procedía de una piara PRRS-negativa conocida. Se sometió a ensayo a ventiocho (28) cerdas en cuanto al eetado eerológico de PCV2. Catorce (14) cerdae tenían un título de PCV2 de = 1000 y fueron traneferidae al primer sitio de estudio. Ciento diez (110) cochinillos fueron proporcionadoe mediante cirugía por eección ceeárea y estaban disponibles para este estudio el Día -4. El Día -3 se pesaron 108 cerdos CDCD en el primer sitio de estudio, ee identificaron con etiquetae de oreja, ee bloquearon por el peeo y ee aeignaron al azar a 1 de 9 grupoe, eegún se recoge antes en la tabla 4. Si cualquier animal de ensayo que cumplía los criterios de inclusión fue enrolado en el estudio y poeteriormente fue excluido por cualquier motivo, el Inveetigador y Monitor coneultó con el fin de determinar el ueo de datoe recogidoe del animal en el análieie final. Se documentó la fecha en la que ee excluyó a los cerdos enroladoe y el motivo de la exclueión. Inicialmente no ee excluyó a ninguna cerda. Un total de 108 de 110 cerdos disponibles fue asignado a uno de 9 grupos el Día -3. Los dos cerdos más pequeños (nas 17 y 19) no fueron aeignados a un grupo y estaban disponiblee como extras, en caeo necesario. Durante el transcureo del eetudio, ee retiró a varios animales. Cada uno de Cerdo na 82 (Grupo 9) el Día -1, Cerdo ns 56 (Grupo 6) el Día 3, Cerdo na 53 (Grupo 9) el Día 4, Cerdo na 28 (Grupo 8) el Día 8, Cerdo na 69 (Grupo 8) el Día 7 y Cerdo ns 93 (Grupo 4) el Día 9, fue encontrado muerto antes del enfrentamiento. Estoe eeie cerdoe no fueron incluidoe en loe reeultadoe del eetudio final. El cerdo na 17 (uno de los cerdos extra) fue asignado al Grupo 9. El restante cerdo na 19 extra fue excluido del eetudio. Lae formulacionee dadae a cada uno de los grupos eran como sigue: el Grupo 1 fue dieeñado para adminietrar 1 ml de 0RF2 viral (vORF2) que contenía 16 µg de 0RF2/ml. Eeto ee hizo mezclando 10,24 ml de ORF2 viral (256 µg/25 µg/ml = 10,24 ml de vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 2,56 ml de eolución ealina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 16 ml de formulación para el grupo 1. El Grupo 2 fue diseñado para administrar 1 ml de vORF2 que contenía 8 µg de vORF2/ml. Esto se hizo mezclando 5,12 ml de vORF2 (128 µg/25 µg/ml = 5,12 ml de vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 7,68 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 16 ml de formulación para el grupo 2. El Grupo 3 fue dieeñado para administrar 1 ml de vORF2 que contenía 4 µg de vORF2/ml. Esto se hizo mezclando 2,56 ml de vORF2 (64 µg/25 µg/ml = 2,56 ml de vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 10,24 ml de solución ealina tamponada con foefato a un pH de 7,4. Eeto produjo 16 ml de formulación para el grupo 3. El Grupo 4 fue dieeñado para adminietrar 1 ml de ORF2 recombinante (rORF2) que contenía 16 µg de rORF2/ml. Eeto ee hizo mezclando 2,23 ml de rORF2 (512 µg/230 µg/ml = 2,23 ml de rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 23,37 ml de eolución ealina tamponada con foefato a un pH de 7,4. Eeto 1 produjo 32 ml de formulación para el grupo 4. El Grupo 5 fue diseñado para administrar 1 ml de rORF2 que contenía 8 µg de rORF2/ml. Eeto ee hizo mezclando 1,11 ml de rORF2 (256 µg/230 µg/ml = 1,11 ml de rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 24,49 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 32 ml de formulación para el grupo 5. El Grupo 6 fue dieeñado para adminietrar 1 ml de rORF2 que contenía 8 µg de rORF2/ml. Eeto ee hizo mezclando 0,56 ml de rORF2 (128 µg/230 µg/ml = 0,56 ml de rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 25,04 ml de eolución ealina tamponada con foefato a un pH de 7,4. Eeto produjo 32 ml de formulación para el grupo 6. El Grupo 7 fue dieeñado para adminietrar 2 ml de vacuna de célulae enterae muertae contra PCV2 (PCV2 KV -eiglae en inglée) que contenían la MAX PCV2 KV. Eeto ee hizo mezclando 56 ml de PCV2 KV con 14 ml de Carbopol al 0,5%. Esto produjo 70 ml de formulación para el grupo 7. Finalmente, el grupo 8 fue diseñado para administrar KLH a razón de 0,5 µg/ml ó 1,0 µg/ml por cada 2 ml de dosie. Eeto se hizo mezclando 40,71 ml de KLH (7,0 µg de proteína/ml a 0,5 µg/ml = 570 ml (7,0 µg/ml) (x) = (0,5) (570 ml)), 244,29 ml de eolución ealina tamponada con foefato a un pH de 7,4, y 285 ml de adyuvante de Freund. La Tabla 5 deecribe loe intervalos de tiempo para las actividades clave de eete Ejemplo.

Tabla 5. Actividades de Estudio Después de completarse la fase en vivo del estudio, tejidos fijados con formalina fueron examinados por inmunohistoquímica (IHC) para la detección de antígeno de PCV2 por parte de un patólogo, las muestrae de eangre ee evaluaron en cuanto a la eerología de PCV2, lae mueetrae de torunda naeal fueron evaluadae en cuanto a la secreción de PCV2 , y la ganancia de peso media diaria (ADWG) fue determinada desde el Día 24 al Día 49. Los animales fueron alojados en el primer sitio de 1 estudio en jaulas individuales en cinco recintos desde el nacimiento hasta aproximadamente 11 días de edad (aproximadamente el Día 0 del estudio) . Cada recinto era idéntico en su distribución y consistía en jaulas de acero inoxidable individuales apiladas, siendo suministrado aire calentado y filtrado por separado a cada una de las unidades de aislamiento. Cada recinto disponía de calor y ventilación separados, proporcionando con ello una contaminación cruzada de aire entre los recintos. Los animales fueron alojados en dos edificios diferentes en el segundo sitio de estudio. El Grupo 9 (el grupo control estricto negativo) fue alojado por separado en un edificio de acabado convertido y los Grupos 1-8 fueron alojados en un edificio de crianza convertido. Cada grupo fue alojado en un redil separado (11-12 cerdos por redil) y cada redil proporcionaba aproximadamente 1 metro cuadrado por cerdo. Cada redil ee encontraba sobre una cubierta elevada con pisos de lamas de plástico. Un foso debajo de los rediles servía como depósito de excrementos y desechos . Cada edificio tenía sus sietemae calefactoree y de ventilación eeparados, con escasa probabilidad de contaminación cruzada de aire entre los edificios. En el primer sitio de estudio, los cochinillos fueron alimentados con una ración de leche especialmente formulada desde el nacimiento hasta aproximadamente 3 semanas de edad. Todos los cochinilloe coneumían una ración sólida, especial mezclada el Día 19 (aproximadamente 4 V2 semanae de edad) . En el eegundo eitio de eetudio, ee alimentó a todos los cerdos con una ración mixta comercial habitual, no medicada, en cuanto a eu edad y peso, ad libi tum. También se disponía ad libi tum de agua en los dos sitioe de eetudio. Todoe loe cerdoe de ensayo fueron tratados con vitamina E el Día -2, con inyecciones de hierro el Día -1 y con NAXCEL® (1,0 L, IM, en jamonee alternantee) loe Díae 16, 17, 18 y 19.

Además, el Cerdo na 52 (Grupo 9) fue tratado con una inyección de hierro el Día 3, el Cerdo 45 (Grupo 6) fue tratado con una inyección de hierro el Día 11, el Cerdo na 69 (Grupo 8) fue tratado con NAXCEL® el Día 6, el Cerdo na 74 (Grupo 3) fue tratado con dexametazona y penicilina el Día 14, y el Cerdo na 51 (Grupo 1) fue tratado con dexametazona y penicilina el Día 13 y con NAXCEL® el Día 14 por diversoe motivoe de ealud. Mientrae ee encontraban en loe doe eitioe de eetudio, loe cerdos se encontraban bajo cuidado veterinario. Exámenes de la salud de los animalee ee realizaron el Día 0 y se registraron en el Formulario de Registro del Examen de Salud. Todos loe animales gozaba de buen estado de salud y nutricional antee de la vacunación, según se determina por observación el Día 0. Se observó que todos los animales de ensayo gozaba de buen estado de salud y nutricional antes del enfrentamiento. Las carcasae y loe tejidoe fueron deeechadoe mediante vertido. La dieposición final de los animales de estudio fue registrada en el Regietro de Disposición Animal ( Animal Dispoeition Record) . El Día 0, loe cerdoe aeignadoe a loe Grupoe 1-6, recibieron 1,0 mL de vacunae 1-6 contra PCV2, respectivamente, IM en la zona izquierda del cuello utilizando una jeringa Luer-lock estéril de 3,0 mL y una aguja eetéril de 20g x " . Los cerdos asignadoe al Grupo 7 recibieron 2,0 mL de vacuna ns 7 de PCV2, IM en la zona izquierda del cuello utilizando una jeringa Luer-lock estéril de 3,0 mL y una aguja estéril de 20g x y2" . El Día 14, los cerdoe asignados al Grupo 7 recibieron 2,0 mL de vacuna na 7 de PCV2, IM en la zona izquierda del cuello utilizando una jeringa Luer-lock estéril de 3,0 mL y una aguja eetéril de 20g x %" . El Día 21 todoe loe cerdoe de eneayo recibieron 2,0 mL de KLH/ICFA IM en la zona del jamón derecho utilizando una jeringa Luer-lock eetéril de 3,0 mL y una aguja eetéril de 20g xl". El Día 27 todos los cerdoe de eneayo recibieron 2,0 mL de KLH/ICFA IM en la zona del jamón izquierdo utilizando una jeringa Luer-lock eetéril de 3,0 mL y una aguja eetéril de 20g ?l •• . El Día 24, loe cerdoe aeignadoe a los Grupos 1-8 recibieron 1,0 mL de material de enfrentamiento ISUVDL de PCV2 (5,11 logio TCID50/mL) , IM en la zona izquierda del cuello utilizando una jeringa Luer-lock estéril de 3,0 mL y una aguja eetéril de 20g x 1". Se adminietró 1,0 mL adicional del miemo material, IN a cada cerdo (0,5 mL por fosa nasal) utilizando una jeringa Luer-lock eetéril de 3 , 0 mL y una cánula naeal. Loe cerdoe de eneayo fueron obeervadoe diariamente en cuanto a la ealud general y eucesos adversoe el Día -4 y deede el Día 0 al Día 19. Lae obeervacionee ee regietraron en el Regietro de Obeervación Clínica. Todoe loe cerdoe de eneayo fueron obeervadoe deede el Día 0 haeta el Día 7, y el Grupo 7 fue obeervado adicionalmente deede el Día 14 haeta el 21, en cuanto a lae reacciones del sitio de inyección. La ganancia de peso media diaria ee determinó peeando a cada cerdo eobre una eecala calibrada loe Díae -3, 24 y 49, o el día en que ee encontró muerto a un cerdo deepuée del enfrentamiento. Loe peeoe corporalee se registraron en el Formulario de Peeo Corporal. Loe peeoe corporalee del Día -3 ee utilizaron para bloquear a loe cerdos antes del reparto aleatorio. Los datos de peeo del Día 24 y del Día 49 ee utilizaron para determinar la ganancia de peeo media diaria (ADWG) para cada cerdo durante estoe momentos. Para los .cerdos que murieron después del enfrentamiento y antes del Día 49, la ADWG ee ajuetó para repreeentar la ADWG deede el Día 24 haeta el día de su muerte.

Con el fin de determinar la serología de PCV2, eangre entera venoea se recogió de cada cochinillo del seno venoso orbital loe Díae -3 y 14. Para cada cochinillo, la eangre ee tomó del eeno venoeo orbital insertando un tubo capilar estéril en el canto medial de uno de loe ojos y drenando aproximadamente 3,0 mL de eangre entera en un Tubo Separador de Suero (SST - eiglae en inglés) de 4,0 mL. Los Días 24, 31 y 49 ee tomó eangre entera venoea de cada cerdo de la vena cava anterior utilizando una aguja estéril 18g x 1 ¡" Vacutainer (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jereey) , un eoporte de aguja Vacutainer y un SST de 13 mL. Lae tomae de eangre en cada inetante ee regietraron en el Registro de Toma de Muestrae. Se dejó que ee coagulara la eangre en cada SST, cada SST fue centrifugado y se recolectó el suero. El suero recolectado fue transferido a un tubo con tapón de cierre rápido estéril y se almacenó a -70± 10° C hasta que se sometió a ensayo con posterioridad. Lae mueetras de suero fueron sometidas a eneayo en cuanto a la preeencia de anticuerpos de PCV2 por parte del personal de BIVI-R&D. Loe cerdoe fueron obeervadoe una vez al día deede el Día al Día 49 en cuanto a eíntomas clínicos y las observaciones clínicas se registraron en el Registro de Observación Clínica.

Con el fin de someter a ensayo la secreción naeal de PCV2 , loe Días 24, 25, y después cada otro día de estudio impar haste e incluido el Día 49, se insertó una torunada eetéril de dacron por vía intranaeal en la foea nasal izquierda o derecha de cada uno de los cerdos (una torunda por cerdo) de la forma más aséptica posible, ee eacudió deepuée de unoe pocoe eegundoe y luego ee retiró. Cada torunda ee dispuso luego en un tubo con tapón de cierre rápido estéril sencillo que contenía 1,0 mL de medio EMEM con IFBS al 2%, 500 unidadee/mL de penicilina, 500 µg/mL de estreptomicina y 2,5 µg/mL de Fµngizona. La torunda se partió en el tubo, y el tubo con tapón de cierre rápido se cerró herméticamente y ee marcó apropiadamente con un número de animal, número de eetudio, fecha de recogida, día de eetudio y "torunda naeal". Loe tuboe con tapón de cierre rápido cerradoe herméticamente ee almacenaron a -40 ± 10° C haeta eu traneporte durante una noche en hielo a BIVI-St. Joeeph. Lae recogidae de torundae naealee ee regietraron en el Formulario de Recogida de Muestras de Torundas Nasales. BIVI-R&D realizó un ensayo de aislamiento de virus (VI - siglas en inglés) cuantitativo en cuanto a PCV2 en mueetras de torundas nasalee. Loe reeultadoe ee expreearon en valores logio- Un valor de 1,3 logs o menor fue considerado negativo, y cualquier valor mayor que 1,3 loge fue coneiderado poeitivo. Se realizó una necropeia a loe cerdoe que murieron (n2s 28, 52, 56, 69, 82 y 93) en el primer sitio de estudio hasta un nivel necesario para determinar un diagnóstico. Se registraron las lesionee burdae y no ee guardó ningún tejido procedente de eetoe cerdoe. En el segundo sitio de estudio, se realizó una necropeia a los cerdos que murieron antes del Día 49 (nae 45, 23, 58, 35), a loe cerdos a los que se encontró muertoe el Día 49 antee de la eutanaeia (nae 2, 43) y a loe cerdoe eometidos a eutanasia el Día 49. Se anotaron cualesquiera lesionee burdae y loe porcentajee de lóbuloe pulmonares con lesiones se registraron en el Formulario de Informe de la Necropsia. De cada uno de los 103 cerdos a los que se realizó una necropsia en el segundo eitio de eetudio, una mueetra de tejido de lae toneilae, pulmonee, corazón, hígado, nodulo linfático meeentérico, riñon y nodulo linfático inguinal ee diepuso en un solo recipiente con formalina al 10% tamponada; mientrae que otra mueetra de tejido procedente de loe miemoe órganoe antee mencionadoe ee diepueo en un Whirl-pak (M-Tech Diagnoetice Ltd., Thelwall, Reino Unido) y cada Whirl-pak ee diepueo en hielo. Cada recipiente ee etiquetó apropiadamente. Lae recogidae de mueetrae ee registraron en el Formulario de Informe de la Necropsia. Despuée de ello, muestras de tejido fijado con formalina y el Formulario de Petición de Diagnóstico ee euminietraron para el ensayo de IHC. El ensayo de IHC se efectuó de acuerdo con procesoe de laboratorio estándares ISU para muestras de recepción, preparación de muestras y portaobjetos y técnicas de tinción. Tejidos recientes en Whirl-pake fueron transportados con paquetes de hielo al Monitor del Estudio para el almacenamiento (-70° ± 10° C) y posible uso futuro. Loe tejidoe fijadoe con formalina fueron examinadoe por un patólogo en cuanto a la detección de PCV2 mediante IHC y ee evaluaron utilizando el eiguiente eietema de anotación: 0 = ninguno; 1 = tinción eecaea positiva, pocoe eitioe; 2 = tinción moderada poeitiva, múltiplee eitioe; y 3 = abundante tinción poeitiva, difuea por todo el tejido. Debido al hecho de que el patólogo no podía diferenciar poeitivamente loe NL inguinales de los NL mesentéricoe, loe reeultadoe para eetoe tejidoe fueron etiquetadoe eímplemente como Nodulos Linfáticos y la puntuación daba la puntuación más alta para cada uno de los dos tejidos por animal .

Resultadoe Se dan eeguidamente loe reeultadoe para eete ejemplo. Se señala que un cerdo del Grupo 9 murió antes del Día 0, y 5 cerdos más murireron post-vacunación (1 cerdo del Grupo 4; 1 cerdo del Grupo 6; 2 cerdoe del Grupo 8; y 1 cerdo del Grupo 9) . El exmaen poet-mortem indicaba que todos los seie murieron debido a infecciones subyacentes que no estaban aeociadas con la vacunación ni con PMWS. Adicionalmente, en ninguno de los grupos se observaron sucesos adversos ni reacciones en el sitio de la inyección. Los reeultados de la ganancia de peso media diaria (ADWG) ee presentan a continuación en la Tabla 6. El Grupo 9 , el grupo control estricto negativo, tenía la ADWG más alta (0,48 ± 0,09 kg/día) , seguido del Grupo 5 (0,43 ± 0,10 kg/día) , que recibieron una dosie de 8 µg de rORF2. El Grupo 3, que recibió una dosis de 4 µg de vORF2, tenía la ADWG más baja (0,22 ± 0,09 kg/día), seguido del Grupo 7 (0,23 ± 0,07 kg/día), que recibieron 2 dosie de vacuna matada.

Tabla 6. Sumario de la Ganancia de Peso Media Diaria (ADWG) vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado Loe resultados de la serología de PCV2 se presentan a continuación en la Tabla 7. Todos los nueve grupoe eran eeronegativoe para PCV2 el Día -3. El Día 14, los Grupos que recibieron vacunas de vORF2 tenían los títulos más elevadoe, que oecilaban entre 187,5 y 529,2. Loe cerdoe que recibieron vacunae viralee matadae tenían loe títuloe eiguientes más altos, eeguidos de loe grupoe que recibían vacunae de rORF2. Loe Grupos 8 y 9 permanecieron seronegativos en este momento. El Dia 24 y el Día 31 los cerdos que recibieron vacunas de vORF2 continuaban demoetrando una fuerte respuesta serológica, eeguida de cerca del grupo que recibía doe dosis de una vacuna viral matada. Los cerdos que recibían vacunas de rORF2 reepondían eerológicamente máe lentamente y loe Grupoe 8 y 9 continuaban siendo seronegativos. El Día 49, los cerdos que recibían vacuna de vORF2, 2 dosie de la vacuna viral matada y la doeie máe baja de rORF2 demostraron las reepuestas eerológicae máe fuertee. Loe cerdos que recibieron 16 µg y 8 µg de vacunas de rORF2 tenían títulos IFA ligeramente máe altoe que los controles de enfrentamiento. El Grupo 9 el Día 49 mostró una fuerte reepueeta eerológica.

Tabla 7. Sumario del Grupo de Títulos IFA de PCV2 TÍTULO IFA MEDIO baculovirus recombinante; mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado *Para fines de cálculo, un título IFA =IOO ee deeignó como -un título de "50"; un título IFA = 6400 ee deeignó como un título de "12.800" . **Día de Enfrentamiento ***Día de la Necropeia Loe reeultadoe de las observacionee clínicae poet-enfrenta iento se presentan a continuación en la Tabla 8. Este sumario de resultadoe incluye obeervacionee del Comportamiento Anormal, Respiración Anormal, Tos y Diarrea. La Tabla 9 incluye los resultadoe del Sumario de Incidencia de loe Síntomae Clínicoe Globalee del Grupo y la Tabla 10 incluye loe resultadoe del Sumario de Taeae de Mortalidad del Grupo Poet-enfrentamiento. El síntoma clínico máe común eeñalado en este estudio era el comportamiento anormal, el cual ee claeificó como letargía de euave a grave. Loe cerdoe que recibían lae 2 doeie máe bajae de vORF2, loe cerdos que recibían 16 µg de rORF2 y los cerdos que recibían 2 dosie de vacuna KV tenían tasas de incidencia de = 27,3%. Los cerdos que recibían 8 µg de rORF2 y el grupo control estricto negativo no tenían un comportamiento anormal. Ninguno de los cerdos en este estudio mostró respiración anormal. El acceso de toe ee obeervó con frecuencia en todoe loe grupoe (0 a 25%) , al igual que la diarrea (0-20%) . Ninguno de loe eíntomas clínicos señalados era patonómico para PMWS. La incidencia global de los síntomae clínicos varió entre grupos. Loe grupoe que recibían cualquiera de lae vacunas de vORF2, el grupo que recibía 16 µg de rORF2, el grupo que recibía 2 dosie de vacuna KV y el grupo control de enfrentamiento tenían la incidencia máe alta de síntomas clínicos globalee (= 36,4%). El grupo control estricto negativo, el grupo que recibía 8 µg de rORF2 y el grµpo que recibía 4 µg de rORF2 tenían tasae de incidencia globalee de eíntomae clínicoe de 0%, 8,3% y 9,1%, reepectivamente. También variaba lae taeas de mortalidad global entre grupos. El grupo que recibía 2 doeie de vacuna de KV tenía la tasa de mortalidad más alta (16,7%); mientras que loe grupoe que recibían 4 µg de vORF2 , 16 µg de rORF2 µ 8 µg de rORF2 y el grupo control estricto negativo tenían todoe taeas de mortalidad del 0%.

Tabla 8. Sumario de Observaciones del Grupo para el Comportamiento Anormal, Respiración Anormal, Tos y Diarrea v0RF2 = 0RF2 viral aislado; r0RF2 = 0RF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virus de célulae completoe = virue PCV2 deearrollado en un cultivo celular adecuado húmero total de cerdoe en cada grupo que moetró algún comportamiento anormal durante al menoe un día 2Numero total de cerdoe en cada grupo que moetró alguna reepiración anormal durante al menoe un día 3Número total de cerdoe en cada grupo que moetró tos durante al menos un día 4Número total de cerdos en cada grupo que mostró diarrea durante al menos un día Tabla 9. Sumario de la Incidencia Global del Grupo de Síntomas Clínicos Grupo Tratamiento N Incidencia de Taea de cerdoe con Incidencia Síntomas Clínicoe1 1 vORF2 - 16 µg (i 12 5 41,7 % dosis) 2 vORF2 - 8 µg (i 12 5 41,7 % dosis) 3 VORF2 - 4 µg (1 12 8 66,7 % dosie) 4 rORF2 - 16 µg (1 11 4 36,4 % doeie) vORF2 = ORF2 viral aielado; rORF2 = ORF2 expreeado en baculovirue recombinante; mató virue de célulae completoe = virue PCV2 deearrollado en un cultivo celular adecuado húmero total de cerdoe en cada grupo que moetró cualquier síntoma clínico durante al menos un día Tabla 10. Sumario de las Tasas de Mortalidad del Grupo Post-enfrentamiento Grupo Tratamiento N Muertee Poet- Tasa de enfrentamiento Mortalidad 1 vORF2 - 16 µg (1 12 1 8,3 % dosie) 2 VORF2 - 8 µg (i 12 1 8,3 % doeis) 3 vORF2 - 4 µg (i 12 0 0 % dosie) vORF2 = ORF2 viral aielado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virue de células completos = virue PCV2 deearrollado en un cultivo celular adecuado Loe reeultados de la secreción nasal de PCV2 se presentan a continuación en la Tabla 11. Despuée del enfrentamiento el Día 24, 1 cerdo en el Grupo 7 comenzó a secretar PCV2 el Día 27. Ninguno de loe otroe grupoe experimentó la eecreción haeta el Día 33. La cuantía de eecreción naeal ee anotó deede el Día 35 al Día 45. Grupoe que recibían cualquiera de lae tree vacunae de vORF2 y grupos que recibían 4 u 8 µg de rORF2 tenían la incidencia más baja de secreción nasal de PCV2 (= 9, 1%) . El grupo control de enfrentamiento (Grupo 8) tenía la tasa de secreción más alta (80%) , seguido del grupo control estricto negativo (Grupo 9 ) , que tenía una tasa de incidencia de 63 , 6% .

Tabla 11. Sumario de la Incidencia de Secreción Nasal de PCV2 en el Grupo vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virus de células completos = virus PCV2 deearrollado en un cultivo celular adecuado El Sumario de la Incidencia de íctero del Grupo, la Incidencia de Úlceras Gástricae en el Grupo, lae Anotacionee de Leeionee Pulmonaree Medias del Grupo y la Incidencia de Lesionee Pulmonaree en el Grupo se muestran a continuación en la Tabla 12. Seis cerdos murieron en el primer sitio de ensayo durante la fase de post-vacunación del estudio (Grupo 4, N = 1; Grupo 6, N = 1; Grupo 8, N = 2; Grupo 9, N = 2) . Cuatro de seis cerdos tenían lesiones fibrosas en una o más cavidades corporales, un cerdo (Grupo 6) tenía lesionee coneietente con una enfermedad cloetridial, y un cerdo (Grupo 9) no tenía leeionee burdas . Ninguno de los cerdos que murieron durante la fase post-vacunación del estudio tenía leeiones consistentes con PMWS. Se realizó una necropsia a cerdos que murieron post-enf rentamiento y a cerdoe eometidoe a eutanaeia el Día 49 . En la necropeia , no eetaban presentes en ningún grupo íctero ni úlceras gástricae . Con respecto a % medio • en lae lesionee pulmonaree , el Grupo 9 tenía el % medio más baj o en las lesionee pulmonaree ( 0% ) , seguido del Grupo 1 con 0 , 40 ± 0 , 50% y del Grupo 5 con 0 , 68 ± 1 , 15% . Los Grupos 2 , 3 , 7 y 8 tenían el % medio más alto en las lesionee pulmonaree ( = 7 , 27% ) . Cada uno de eetoe cuatro grupos contenía un cerdo con un % de leeionee pulmonares = 71 , 5% , que seegó máe altos los resultadoe para eetoe cuatro grupoe . Con la excepción del Grupo 9 con un 0% de leeionee pulmonaree obeervadae , los restantes 8 grupos tenía un = 36% de lesiones pulmonares . Casi todas la lesiones pulmonares observadas se describieron como rojas/púrpura y se consolidaron.

Tabla 12. Sumario de la Incidencia de íctero en el Grupo, incidencia de Úlceras Gástricas en el Grupo, % Medio de Anotaciones de Lesiones Pulmonares en el Grupo e Incidencia de Lesiones Pulmonares en el Grupo Anotados vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = 0RF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virue de células completos = virus PCV2 deearrollado en un cultivo celular adecuado El Sumario de loe Resultados de la Incidencia IHC Positiva en el Grupo ee mueetran en la Tabla 13. El Grupo 1 (vORF2 - 16 µg) y el Grupo 5 (rORF2 - 8 µg) tenían la taea máe baja de loe resultados IHC positivos (16,7%). El Grupo 8 (Controles de Enfrentamiento) y el Grupo 9 (Controles Estrictoe Negativoe) tenían la taea máe alta de loe reeultados IHC positivos, 90% y 90,9%, respectivamente.

Tabla 13. Sumario de la Tasa de Incidencia IHC Positiva en el Grupo Grupo Tratamiento N Na de cerdoe que Taea de tenían al menos Incidencia un tej ido positivo para PCV2 1 VORF2 - 16 µg (1 12 2 16,7 % doeie) 2 vORF2 - 8 µg (1 12 3 25,0 % doeie) 3 vORF2 - 4 µg (1 12 8 66,7 % doeie) 4 rORF2 - 16 µg (i 11 4 36,3 % doeie) 5 rORF2 - 8 µg (1 12 2 16,7 % doeie) 6 rORF2 - 4 µg (1 11 4 36,4 % doeie) vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = 0RF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado Post-enfrentamiento, el Grupo 5, que recibió una doeie de 8 µg de antígeno rORF2, euperó a los otros 6 grupos de vacuna. El Grupo 5 tenía la ADWG más alta (0,43 ± 0,10 kg/día), la incidencia máe baja de comportamiento anormal (0%) , la eegunda incidencia máe baja de toe (8,3%), la incidencia máe baja de eíntomae clínicoe globales (8,3%), la tasa de mortalidad más baja (0%), la tasa máe baja de eecreción nasal de PCV2 (8,3%), la segunda tasa más baja del % medio de leeionee pulmonaree (0,68 ± 1,15%) y la taea de incidencia máe baja para tejidoe poeitivoe (16,7%). Grupoe que recibían divereos niveles de antígeno rORF2 superó globalmente a grupos que recibían diversoe niveles de vORF2 y el grupo que recibía 2 doeis de vacuna contra PCV2 de células enteras matadae se manifestó el peor. Las Tablas 14 y 15 contienen eumarioe de datos poet-enfrentamiento del grupo.

Tabla 14. Sumario de Datos Post-Enfrentamiento en el Grupo -Parte 1 V0RF2 = 0RF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de célulae completoe = virue PCV2 deearrollado en un cultivo celular adecuado Tabla 15. Sumario de Datos Post-Enfrentamiento en el Grupo -Parte 2 vORF2 = 0RF2 viral aielado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado Los resultadoe de eete estudio indican que todos los esfuerzos adicionales de vacunas deberían dirigirse a una vacuna de rORF2. En general, la secreción nasal de PCV2 fue detectada post-enfrentamiento y la vacunación con una vacuna contra PCV2 dio como resultado una reducción de la secreción. La inmunohistoquímica de tejidos linfoides seleccionadoe servía también como un buen parámetro de la eficacia de la vacuna, mientras que grandee diferenciae en la ADWG, loe síntomas clínicos y las grandes leeionee no ee detectaron entre grupoe. Eete eetudio se complicó por el hecho de que PCV2 extraño ee introdujo en el mismo punto durante el estudio, según se evidencia por la eecreción naeal de PCV2, eeroconvereión de PCV2 y tejidoe IHC positivos en el Grupo 9, el grupo control estricto negativo.

Discueión Siete vacunae contra PCV2 fueron evaluadae en este estudio, que incluía tres niveles de doeie diferentee de antígeno vORF2 adminietrada una vez al Día 0, tres niveles de doeie diferentee de antígeno rORF2 adminietradoe una vez el Día 0 y un nivel de doeie de vacuna contra PCV2 de células enteras matadas, administrada el Día 0 y el Día 14. En general, el Grupo 5, que recibía 1 dosie de vacuna que contenía 8 µg de antígeno rORF2, tenía loe mejores resultados. El Grupo 5 tenía la ADWG más alta, la incidencia más baja de comportamiento anormal, la incidencia más baja de respiración anormal, la eegunda incidencia más baja de tos, la incidencia más baja de eíntomas clínicoe globalee, la taea de mortalidad más baja, la tasa más baja de eecreción nasal de PCV2, la segunda tasa más baja del % medio de leeionee pulmonaree y la taea de incidencia más baja para tejidos IHC positivoe. De manera intereeante, el Grupo 4, que recibió una doeie máe alta de antígeno rORF2 que el Grupo 5, no ee comportó tan bien ni mejor que el Grupo 5. El Grupo 4 tenía una ADWG ligera menor, una mayor incidencie de comportamiento anormal, una mayor incidencia de eíntomae clínicos globales, una mayor tasa de secreción nasal de PCV2, un mayor % medio de lesionee pulmonares y una mayor tasa de tejidos IHC positivos que el Grupo 5. Los análisie estadíeticos, que pueden indicar que lae diferencias entre estoe doe grupos no eran estadíeticamente eignificativae, no ee realizaron en eetoe datoe, pero exietía una tendencia obeervada de que el Grupo 4 no ee comportaba tan bien como el Grupo 5. Poet-vacunación, 6 cerdos murieron en el primer sitio de eetudio. Cuatro de loe seis cerdos procedían del Grupo 8 o del Grupo 9, que no recibieron ninguna vacuna. Ninguno de los seie cerdos mostró lesiones consietentee con PMWS, no se informó de sucesoe advereoe y, en general, lae eiete vacunae parecían ser segurae cuando se administraban a cerdos de aproximadamente 11 días de edad. Durante la fase de post-vacunación del estudio, los cerdoe recibieron tres niveles de dosie de vacuna vORF2 o la vacuna de células enteras matadas tenía los niveles IFAT más altos, mientras que el Grupo 5 tenía los niveles IFAT más bajos jueto antee del enfrentamiento de los grupos de vacuna.

A peear de que no ee ha demoetrado formalmente, se piensa que la vía predominante de tranemieión de PCV2 a cerdoe jóvenee poco deepuée del deetete es por contacto oronasal directo y una vacuna eficaz que reduce la secreción nasal de PCV2 en un ajuete de producción ayudaría a controlar la difueión de la infección. Grupoe que recibían uno de loe tres niveles de antígeno de vORF2 y el grupo que recibía 8 µg de rORF2 tenía la tasa de incidencia más baja de secreción nasal de PCV2 (8,3%). De manera esperada, el grµpo control de enfrentamiento tenía la tasa de incidencia más alta de secreción nasal (80%) . Lesionee burdas en cerdos con PMWS secundaria a la infección por PCV2 coneietía típicamente en linfoadenopatía generalizada en combinación con uno o máe de lo eiguiente: (1) neumonía intersticial con edema interlobular, (2) palidez cutánea o íctero, (3) hígados atrofíeos moteados, (4) úlceras gástricae y (5) nefritie. En la necropeia, no se observaron íctero, hepatitie, nefritie y úlcerae gáetricae en ninguno de loe grupoe y no ee examinó eepecíficamente la linfoadenopatía. El % medio de puntuacionee de lesiones pulmonares variaba entre grupos. El grupo que recibía 16 µg de antígeno vORF2 tenía el % medio máe bajo de puntuacionee de leeionee pulmonaree (0,40 ± 0,50%), eeguido del grupo que recibía 8 µg de rORF2 (0,68 ± 1,15%). Como era de eeperar, el grupo control de enfrentameinto tenía el % medio más alto de puntuacionee de leeionee pulmonaree (9,88 ± 29,2%). En los cuatro grupos, el % medio de puntuaciones de lesionee pulmonaree ee elevó debido a un cerdo en cada uno de eetoe grupoe que tenía puntuacionee muy altae de leeionee pulmonaree. La mayor parte de las lesionee pulmonaree ee deecribieron como rojae/púrpura y ee coneolidaron. Típicamente, lae leeionee pulmonaree aeociadae con PMWS ee deecriben como de color canela y no colapeables con edema interlobular. Las lesiones pulmonares anotadas en este estudio no ee aeociaron con una infección por PCV2 o puede eetar presente un segundo agente infeccioso pulmonar.

Dentro del contexto de este estudio, el % de puntuación de lesionee pulmonaree no refleja, probablemente, una medida verdadera de la cantidad de infección pulmonar debida a PCV2.

Otroe inveetigadoree han demoetrado una correlación directa entre la preeencia de antígeno de PCV2 por IHC e hietopatología. No ee realizó con este estudio la histopatología en tejidoe eeleccionadoe . El Grupo 1 (16 µg de vORF2) y el Grupo 5 (8 µg de rORF2) tenían la taea de incidencia máe baja de cerdoe poeitivoe en cuanto al antígeno de PCV2 (8,3%), mientrae que el Grupo 9 (el grupo control eetricto negativo - 90,9%) y el Grupo 8 (el grupo control de enfrentamiento - 90,0%) tenía lae taeae de incidencia máe altas de cerdos positivos en cuanto al antígeno de PCV2. Debido a la naturaleza no subjetiva de este ensayo, los resultadoe de IHC son, probablemente, uno de los mejores parámetroe para juzgar la eficacia de la vacuna. Aeí, en un aepecto de la preeente invención, ee determinó la Doeificación Protectora Mínima (MPD - eiglae en inglée) de una doeie de 1 ml/1 de doeie de producto recombinante con antígeno de 0RF2 de PCV2 (rORF2) extraído en el modelo de cerdoe CDCD en la cara de un enfrentamiento de PCV2. De loe tree grupoe que recibían nivelee variablee de antígeno rORF2 , el Grupo 5 (8 µg de antígeno rORF2) tenían claramente el nivel de protección máe alto. El Grupo 5 tenía loe mejores resultadoe o empataba con loe reeultados más favorables con relación a todos loe parámetroe examinadoe . Cuando el Grupo 5 ee comparó con los otros seis grupos de vacuna post-enfriamiento, el Grupo 5 tenía la ADWG máe alta (0,43 ± 0,10 kg/día), la incidencia máe baja de comportamiento anormal (0%) , la eegunda incidencia máe baja de toe (8,3%), la incidencia máe baja de eíntomas clínicos globales (8,3%), la tasa de mortalidad más baja (0%), la taea máe baja de eecreción naeal de PCV2 (8,3%), la segunda taea máe baja del % medio de lesiones pulmonares (0,68 ± 1,15%) y la tasa de incidencia máe baja para tejidoe IHC poeitivoe (16,7%) . En otro aepecto de la preeente invención, se determinó la MPD de 1 ml/1 de dosie de producto convencional que ee antígeno de ORF2 de PCV2 (vORF2) parcialmente purificado en el modelo de cerdoe CDCD en la cara de un enfrentamiento con PCV2. De los tres grupos que recibían niveles variables de antígeno vORF2, el Grupo 1 (16 µg de antígeno vORF2) tenían claramente el nivel de protección máe alto. El Grupo 1 euperó a loe Grupoe 2 y 3 con reepecto a la ADWG, el % medio de leeiones pulmonares e IHC. Loe Grupoe 1 y 2 (8 µg de antígeno vORF2) ee comportaron de manera igual con reepecto a la incidencia global de eíntomae clínicos, el Grupo 3 (4 µg de antígeno v0RF2) tenía la tasa de mortalidad más baja, y los tres grupos ee comportaron de igual manera con reepecto a la eecreción naeal. En general, vacunas de vORF no ee comportaban tan bien como lae vacunas de rORF. Todavía en otro aspecto de la presente invención, se determinó la eficacia de una dosis máxima de 2 ml/2 dosie de vacuna convencional PCV2 matada en el modelo de cerdoe CDCD en la cara de un enfrentamiento con PCV2. De lae eiete vacunae evaluadae en eete eetudio, ee comportaba de la peor manera la vacuna contra PCV2 de células enteras matadas. Cochinillos que recibían dos doeie de vacuna contra PCV2 de célulae enterae matadae tenían la ADWG máe baja, la eegunda taea máe alta de comportamiento anormal (58,3%), la eegunda incidencia global máe alta de eíntomae clínicoe (58,3%), la tasa de mortalidad más alta (16,7%), la segunda incidencia más alta de secreción nasal (41,7%), el % medio máe alto de leeionee pulmonaree (9,88 ± 29,2%), una alta incidencia de lesiones pulmonares anotada (75%) y una tasa moderada de incidencia de IHC en tejidos (41,7%). Sin embargo, eeguía eiendo eficaz para crear una reepueeta inmune. Todavía en otro aepecto de la preeente invención, la eecreción naeal de PCV2 ee verificó como un parámetro de eficacia y ee re-confirmaron a partir de eetudioe previoe loe parámetroe de eficacia contra PCV2 previos. Los resultadoe de este estudio indican que la secreción nasal de PCV2 ee produce tras un enfrentamiento intranasal y que lae vacunas contra PCV2 reducen la secreción nasal de PCV2 post-enfrentamiento. Ademáe, loe reeultadoe de eete eetudio y los informee en la bibliografía indican que debería continuar IHC para eer evaluado también en futuroe eneayos de la vacuna contra PCV2.

Algunas conclusionee adicionalee que eurgen de eete eetudio eon que la linfoadenopatía ee un dietintivo de PMWS. Otro de loe dietintivos de PMWS es el agotamiento linfoide e histiocitoe multinucleadoe/gigantee . Adicionalmente, no ee observaron sucesoe advereoe ni reaccionee en el sitio de inyección para ninguna de las 7 vacunas contra PCV2, y las 7 vacunas contra PCV2 parecían ser seguras cuando se administraban a cerdoe jóvenes.

EJEMPLO 5 Este ejemplo somete a ensayo la eficacia de ocho vacunas candidatas contra PCV2 y reconfirma loe parámetroe de enfrentamiento a PCV2 de eetudioe de enfrentamiento anterioree deepuée de la expoeición a una cepa virulenta de PCV2. Ciento cincuenta (150) cochinillos desprovietoe de caloetro derivado de la ceeárea (CDCD) , de 6-16 días de edad, se bloquearon en peeo y ee dividieron al azar en 10 grupoe de igual tamaño. La Tabla 16 recoge el Dieeño de Estudio General para este Ejemplo.

Tabla 16. Diseño de Estudio General vORF2 = ORF2 viral aielado; rORF2 = ORF2 expreeado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado La formulación de vacuna dada a cada uno de los grupoe era como sigue. La vacuna na 1 contra PCV2, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al Grupo 1, era una dosis elevada (16 µg/2 ml de dosie) de antígeno ORF2 recombinante inactivado con adyuvante IMS 1314 (16 µg de rORF2 - IMS 1314) . La vacµna ns 2 contra PCV2, adminietrada a una doeie de 1 x 2 ml al Grupo 2, era una doeie elevada (16 µg/2 ml de doeis) de un antígeno ORF2 de PCV2 generado por VIDO R-1 y parcialmente purificado adyuvado con Carbopol (16 µg de vORF2 - Carbopol) . La vacuna ns 3 contra PCV2, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al Grupo 3, era una dosie elevada (16 µg/2 ml de doeie) de antígeno ORF2 recombinante inactivado con adyuvante Carbopol (16 µg de rORF2 - Carbopol). La vacuna na 4 contra PCV2, adminietrada a una dosis de 1 x 1 ml al Grupo 4, era una dosis elevada (16 µg/l ml de dosis) de un antígeno ORF2 de PCV2 generado por VIDO R-1 y parcialmente purificado adyuvado con Carbopol (16 µg de vORF2 - Carbopol) . La vacuna na 5 contra PCV2, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al Grupo 5, era una dosis elevada 4 µg/2 ml de dosie de un antígeno ORF2 recombinante inactivado con adyuvante Carbopol (4 µg de rORF2 - Carbopol). La vacuna na 6 contra PCV2, adminietrada a una doeie de 1 x 2 ml al Grupo 6, era una dosis elevada 1 µg/2 ml de dosis de un antígeno 0RF2 recombinante inactivado con adyuvante Carbopol (1 µg de rORF2 - Carbopol) . La vacuna na 7 contra PCV2, administrada a una dosie de 1 x 2 ml al Grupo 7, era una dosis baja (0,25 µg/2 ml de dosis) de antígeno ORF2 recombinante inactivado con adyuvante Carbopol (0,25 µg de rORF2 - Carbopol) . La vacuna na 8 contra PCV2, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al- Grupo 8, era una dosis elevada (título de pre-inactivación > 8,0 log/2 ml de dosie) de un antígeno Struve de PCV2 generado por VIDO R-1 inactivado convencional adyuvado con Carbopol (>8,0 log KV - Carbopol). El Día 0, los Grupos 1 - 8 fueron tratados con sus vacunas asignadae. Loe Grupoe 1-3 y 5-8 recibieron refuerzoe de sus vacunas reepectivae de nuevo el Día 14. La eficacia de una doeie única de 16 µg de vORF2 - Carbopol ee eometió a eneayo en el Grupo 4 que no recibió un refuerzo el Día 14. Los cochinillos fueron obeervadoe en cuanto a euceeos adversoe y las reacciones del eitio de inyección deepuée de lae doe vacunacionee . El Día 21 loe cochinillos fueron trasladadoe a un eegundo sitio de estudio en donde los Grupos 1-9 fueron alojados agrupados en un edificio y el Grupo 10 fue alojado en un edificio separado. Todos los cerdos recibieron hemocianina de lapa bocallave emulsionada con adyuvante de Freund incompleto (KLH/ICFA) los Días 22 y 28. El Día 25, los Grupos 1-9 fueron enfrentados con aproximadamente 4 logs de virus PCV2 virulento. Hacia el Día 46 se habían producido muy pocae muertee en el grupo control de enfrentamiento. En un intento de inmunoeetimular loe cerdoe y de aumentar la virulencia del material de enfrentamiento de PCV2 , todos los Grupos fueron tratados con INGELVAC® PRRSV MLV (Vacuna Reproductora y Respiratoria Porcina, Virus Vivo Modificado) el Día 46. Antes y deepuée del enfrentamiento ee tomaron muestras de sangre para la serología del PCV2. Poet-enfrentamiento, ee recogieron loe datos de peso corporal para la determinación de la ganancia de peso media diaria (ADWG) y observaciones de síntomae clínicoe. El Día 50, ee realizó una necropeia a todoe ios cerdos supervivientes, se registraron lesiones burdas, se puntuó a los pulmones en cuanto a la patología, y tejidos seleccionadoe fueron coneervados en formalina para su examen por inmunohistoquímica (IHC) para la detección posterior de antígeno de PCV2. Materialee y Métodoe : Eete era un eetudio de capacidad de enfrentamiento frente a la vacunación parcialmente ciego realizado en cerdoe CDCD, de 6 a 16 días de edad el Día 0. Para ser incluidos en el eetudio, loe títuloe IFA de PCV2 de cerdas eran = 1:1000. Adicionalmente, el estado serológico de cerdae procedía de una piara PRRS-negativa conocida. Se eometió a eneayo a diecieeie (16) cerdae en cuanto al estado serológico de PCV2 y las dieciseie (16) tenían un título de PCV2 de = 1000 y fueron traneferidae al primer eitio de eetudio. Ciento cincuenta (150) cochinilloe fueron proporcionadoe mediante cirugía por eección ceeárea y estaban disponiblee para este estudio el Día -3. El Día -3, se pesaron 150 cerdos CDCD en el primer sitio de estudio, ee identificaron con etiquetae de oreja, ee bloquearon por el peeo y ee aeignaron al azar a 1 de 10 grupos, según se recoge antee en la tabla 16. Mueetrae de eangre fueron tomadae de todos los cerdos . Si cualquier animal de ensayo que cumplía los criterioe de inclueión fue enrolado en el eetudio y poeteriormente fue excluido por cualquier motivo, el Inveetigador y Monitor coneultó con el fin de determinar el ueo de datoe recogidoe del animal en el análieie final. Se documentó la fecha en la que se excluyó a los cerdos enrolados y el motivo de la exclusión. No ee excluyeron cerdas que cumplían con los criterioe de inclueión, eeleccionadas para el eetudio y fueron traneportadas al primer sitio de estudio. No se excluyeron cochinillos del estudio, y antes de terminar no se retiró del estudio a ningún animal de ensayo. La Tabla 17 describe los intervalos de tiempo para las actividades clave de este Ejemplo.

Tabla 17. Actividades de Estudio Deepuée de completaree la faee en vivo del eetudio, tejidos fijados con formalina fueron examinados por inmunohistoquímica (IHC) para la detección de antígeno de PCV2 por parte de un patólogo, las mueetrae de sangre se evaluaron en cuanto a la serología de PCV2 y la ganancia de peso media diaria (ADWG) fue determinada deede el Día 25 al Día 50. Loe animales fueron alojados en el primer sitio de estudio en jaulas individuales en eiete recintoe deede el nacimiento haeta aproximadamente 11 díae de edad (aproximadamente el Día 0 del estudio) . Cada recinto era idéntico en su dietribución y consistía en jaulas de acero inoxidable individuales apiladae, eiendo euminietrado aire calentado y filtrado por eeparado a cada una de las unidades de aislamiento. Cada recinto disponía de calor y ventilación separados, proporcionando con ello una contaminación cruzada de aire entre los recintoe. Loe animalee fueron alojados en dos edificioe diferentee en el eegundo eitio de eetudio. El Grupo 10 (el grupo control eetricto negativo) fue alojado por eeparado en un edificio de acabado convertido y loe Grupoe 1-9 fueron alojadoe en un edificio de parto convertido. Cada grupo fue alojado en un redil eeparado (14-15 cerdoe por redil) y cada redil proporcionaba aproximadamente 1 metro cuadrado por cerdo. Loe Grupoe 2, 4 y 8 fueron alojados en tres rediles adyacentes en un lado del paeadizo y loe Grupoe 1, 3, 5, 6, 7 y 9 fueron alojados en seis rediles adyacentes en el otro lado del pasadizo. La eeparación de loe Grupoe era debida a la preocupación del Monitor del Eetudio de que vacunas adminietradas a los Grupos 2, 4 y 8 no habían eido inactivadae por completo. Cada redil se encontraba eobre una cubierta elevada con pieoe de lamas de plástico. Un foso debajo de los redilee servía como depósito de excrementoe y desechos. Cada edificio tenía sus sistemas calefactores y de ventilación eeparadoe, con eecaea probabilidad de contaminación cruzada de aire entre loe edificios. En el primer sitio de estudio, los cochinillos fueron alimentados con una ración de leche especialmente formulada desde el nacimiento haeta aproximadamente 3 eemanae de edad. Todoe loe cochinilloe coneumían una ración eólida, eepecial mixta el Día 21 (aproximadamente 4 Vi eemanae de edad) . En el eegundo eitio de eetudio, ee alimentó a todoe loe cerdoe con una ración mixta comercial habitual, no medicada, en cuanto a eu edad y peeo, ad libi tum. También ee dieponía ad libi tum de agua en loe doe eitioe de eetudio. Todos los cerdoe fueron tratadoe con 1,0 mL de NAXCEL®, IM, en jamonee alternantee loe Díae 19, 20 y 21. Ademáe, el Cerdo na 11 (Grupo 1) fue tratado con 0,5 mL de NAXCEL® el Día 10, el Cerdo na 13 (Grupo 10) fue tratado con 1 mL de penicilina y 1 mL de PREDEF® 2X el Día 10, el Cerdo na 4 (Grupo 9) fue tratado con 1,0 mL de NAXCEL® IM el Día 11, y loe Cerdoe 1 (Grupo 1) , 4 y 11 fueron tratadoe cada uno con 1,0 mL de NAXCEL® el Día 14 por divereoe motivoe de ealud. Mientrae ee encontraban en loe doe eitioe de estudio, los cerdos ee encontraban bajo cuidado veterinario. Todoe loe animalee gozaba de buen eetado de ealud y nutricional antee de la vacunación, según se determina por obeervación el Día 0. Se obeervó que todoe loe animales de ensayo gozaba de buen estado de salud y nutricional antes del enfrentamiento. Las carcasae y loe tejidoe fueron deeechadoe mediante vertido. La disposición final de los animales de estudio se registró en el Registro de Dispoeición de los Animales. Loe Díae 0 y 14, loe cerdoe aeignadoe a loe Grupoe 1-3 y 5-8 recibieron 2,0 mL de vacunas 1-4 de PCV2, respectivamente, IM en lae zonas derecha e izquierda del cuello, respectivamente, utilizando una jeringa Luer-lock eetéril de 3,0 mL y una aguja eetéril de 20g x Vi". Loe cerdos asignados al Grupo 4 recibieron 1,0 mL de vacuna na 2 de PCV2, IM en la zona derecha del cuello, utilizando una jeringa Luer-lock estéril de 3,0 mL y una aguja estéril de 20g x hn el Día 0 solamente. El Día 22 todos loe cerdos de ensayo recibieron 2,0 mL de KLH/ICFA IM en la zona izquierda del cuello utilizando una jeringa Luer-lock eetéril de 3 , 0 mL y una aguja eetéril de 20g xl". El Día 28 todoe loe cerdoe de ensayo recibieron 2,0 mL de KLH/ICFA IM en la zona del jamón derecho utilizando una jeringa Luer-lock estéril de 3,0 mL y una aguja estéril de 20g xl" . El Día 25, loe cerdoe aeignadoe a loe Grupos 1-9, recibieron 1,0 mL de material de enfrentamiento ISUVDL de PCV2 (3,98 logio TCID50/mL) , IM en la zona derecha del cuello utilizando una jeringa Luer-lock estéril de 3,0 mL y una aguja estéril de 20g x 1". Se administró 1,0 mL adicional del mismo material, IN a cada cerdo (0,5 mL por fosa nasal) utilizando una jeringa Luer-lock eetéril de 3,0 mL y una cánula naeal. El Día 46 todoe los cerdos de ensayo recibieron 2,0 mL de INGELVAC® PRRS MLV, IM, en la zona derecha del cuello utilizando una jeringa Luer-lock estéril de 3,0 mL y una aguja eetéril de 20g xl". El PRRSV MLV fue adminietrado en un intento de aumentar la virulencia del material de enfrentamiento a PCV2. Los cerdos de ensayo fueron observados diariamente en cuanto a la salud general y suceeoe advereoe el Día -3 y desde el Día 0 al Día 21. Cada uno de los cerdoe fue puntuado en cuanto a comportamiento normal o anormal, reepiración o tos. Las observaciones se regietraron en el Regietro de Obeervación Clínica. Todoe los cerdos de eneayo fueron obeervadoe deede el Día 0 haeta el Día 7, y el Grupo 7 fue obeervado adicionalmente desde el Día 14 hasta el 21, en cuanto a las reacciones del sitio de inyección. La ganancia de peso media diaria se determinó pesando a cada cerdo sobre una eecala calibrada loe Díae -3, 25 y 50, o el día en que ee encontró muerto a un cerdo deepuée del enfrentamiento. Loe peeoe corporalee ee regietraron en el Formulario de Peeo Corporal . Loe pesos corporales del Día -3 se utilizaron para bloquear a los cerdos antes del reparto aleatorio. Los datos de peso del Día 25 y del Día 50 ee utilizó para determinar la ganancia de peeo media diaria (ADWG) para cada cerdo durante estos momentos . Para los cerdos que murieron despuée del enfrentamiento y antes del Día 50, la ADWG se ajustó para representar la ADWG desde el Día 25 hasta el día de eu muerte. Con el fin de determinar la serología de PCV2, sangre entera venosa se recogió de cada cochinillo del seno venoso orbital los Días -3 y 14. Para cada cochinillo, la eangre ee tomó del eeno venoeo orbital ineertando un tubo capilar eetéril en el canto medial de uno de loe ojoe y drenando aproximadamente 3,0 mL de sangre entera en un Tubo Separador de Suero (SST - siglas en inglés) de 4,0 mL. Loe Díae 25, 32 y 50 ee tomó eangre entera venoea de cada cerdo de la vena cava anterior utilizando una aguja estéril 20g x 1 %" Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey) , un eoporte de aguja Vacutainer® y un SST de 13 mL. Lae tomas de sangre en cada instante ee regietraron en el Regietro de Toma de Mueetrae. Se dejó que ee coagulara la eangre en cada SST, cada SST fue centrifugado y se recolectó el suero. El suero recolectado fue transferido a un tubo con tapón de cierre rápido estéril y se almacenó a -70± 10° C haeta que se sometió a ensayo con poeterioridad. Lae mueetrae de suero fueron sometidae a eneayo en cuanto a la preeencia de anticuerpoe de PCV2 por parte del pereonal de BIVI-R&D. Loe cerdoe fueron obeervadoe una vez al día deede el Día 22 al Día 50 en cuanto a eíntomae clínicoe y fueron puntuados en cuanto al comportamiento normal o anormal, la respiración o toe. Lae observaciones clínicas se registraron en el Registro de Observación Clínica. Los cerdoe nas 46 (Grupo 1) y 98 (Grupos 9) murieron en el primer eitio de eetudio. Eetae doe muertee fueron catalogadae como muertes por hemorragia y no ee realizaron necropeiae en estos dos cerdoe. En el eegundo eitio de eetudio, ee realizó una necropeia a loe cerdoe que morían deepuée del enfrentamiento y antee del Día 50, y a loe cerdoe eometidoe a eutanaeia el Día 50. Se anotaron cualesquiera lesiones burdas y los porcentajes de lóbulos pulmonares con lesionee se registraron en el Formulario de Informe de la Necropsia. De cada uno de loe cerdos a los que ee realizó una necropeia en el eegundo eitio de eetudio, una mueetra de tejido de lae toneilae, pulmonee, corazón, hígado, nodulo linfático meeentérico se dispueo en un solo recipiente con formalina al 10% tamponada; mientras que otra muestra de tejido procedente de de los miemos órganos antes mencionados se dispueo en un Whirl-pak® (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Reino Unido) y cada Whirl-pak® se dispuso en hielo. Cada recipiente se etiquetó apropiadamente. Las recogidas de muestras se registraron en el Formulario de Informe de la Necropsia. Después de ello, muestrae de tejido fijado con formalina y el Formulario de Petición de Diagnóstico se suministraron para el ensayo de IHC. El ensayo de IHC se efectuó de acuerdo con procesoe de laboratorio estándares para mueetrae de recepción, preparación de mueetrae y portaobjetos y técnicas de tinción. Tejidos recientes en Whirl-pake® fueron traneportadoe con paquetee de hielo al Monitor del Eetudio para el almacenamiento (-70° ± 10° C) y posible uso futuro. Los tejidos fijados con formalina fueron examinadoe por un patólogo en cuanto a la detección de PCV2 mediante IHC y se evaluaron utilizando el siguiente sistema de anotación: 0 = ninguno; 1 = tinción escaea poeitiva, pocoe eitioe; 2 = tinción moderada positiva, múltiples sitioe; y 3 = abundante tinción poeitiva, difuea por todo el tejido. Para finee analíticos, una puntuación de 0 se consideró "negativa," y una puntuación mayor que 0 se consideró "poeitiva." Reeultados Se dan seguidamente loe reeultadoe para eete ejemplo. Se anota que los Cerdos na 46 y 98 murieron los días 14 y 25, respectivamente. Estas muertes fueron catalogadae como muertes por hemorragia. El Cerdo na 11 (Grupo 1) resollaba con rápida respiración el Día 15. Por lo demás, todos los cerdos eran normales en cuanto al comportamiento, la respiración y la toe durante eete periodo de obeervación y no se señalaron euceeoe advereoe eietémicos con ninguno de los grupos . No se señalaron reacciones en el sitio de inyección después de la vacunación el Día 0. Después de la vacunación el Día 14, siete (7) de catorce (14) cerdos del Grupo 1 (50,0%) tenía una hinchazón con una puntuación de "2" el Día 15. Cuatro (4) de catorce (14) cerdos del Grupo 1 (28,6%) seguía teniendo una hinchazón de "2" el Día 16. Ninguno de estoe otros grupos experimentó reacciones en el sitio de inyección deepués de cualquier vacunación. Los resultados de la ganancia de peso media diaria (ADWG) ee preeentan a continuación en la Tabla 18. De los reeultadoe del grupo ee excluyó a loe Cerdoe nae 46 y 98 que murieron de hemorragia. El Grupo 4, que recibía una doeie de 16 µg de vORF2 - Carbopol, tenía la ADWG más alta (0,52 ± 0,12 kg/día), seguido de loe Grupos 1, 2, 3, 5, 6 y 10 que tenían ADWGs que oscilaban entre 0,48 ± 0,10 kg/día a 0,50 ± 0,12 kg/día. El Grupo 9 tenía la ADWG máe baja (0,40 ± 0,13 kg/día), eeguido de loe Grupoe 8 y 7, que tenían ADWGs de 0,42 ± 0,14 kg/día y 0,41 ± 0,19 kg/día, respectivamente.

Tabla 18. Sumario de las Ganancias de Peso Medias Diarias (ADWG) Grupo Tratamiento N ADWG kg/día (Día 25 a Día 50) o ajustada para cerdos muertos antes del Día 50 1 r0RF2 - 16 µg - IMS 1314 2 14 0,48 ± 0,14 kg/día dosis 2 V0RF2 - 16 µg -- Carbopol 2 15 0,50 ± 0,07 kg/día dosis 3 r0RF2 - 16 µg -- Carbopol 2 15 0,48 + 0,09 kg/día dosis 4 V0RF2 - 16 µg -- Carbopol 1 15 0,52 ± 0,12 kg/día dosis 5 r0RF2 - 4 µg -- Carbopol 1 15 0,48 ± 0,12 kg/día dosis vORF2 = 0RF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de célulae completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado Los resultadoe de la eerología de PCV2 ee preeentan a continuación en la Tabla 19. Todoe loe diez (10) grupoe eran eeronegativoe para PCV2 el Día -3. El Día 14, loe títuloe de PCV2 seguían bajos para los diez (10) grupos (intervalo de 50-113) . El Día 25, el Grupo 8, que recibía la vacuna de virue matado de célulae completae tenía el título de PCV2 máe alto (4617), eeguido del Grupo 2, que recibía 16 µg de vORF2 -Carbopol, el Grupo 4, que recibía como dosis única 16 µg de vORF2 - Carbopol, y el Grupo 3, que recibía 16 µg de rORF2 -Carbopol, que tenían títuloe de 2507, 1920 y 1503, reepectivamente. El Día 32 (una eemana poet enfrentamiento) , loe títuloe para los Grupos 1-6 y el Grupo 8 oscilaban entre 2360 y 7619; mientras que los Grupos 7 (0,25 µg de rORF2 -Carbopol) , 9 {Control de Enfrentamiento) y 10 (control estricto negativo) tenía títulos de 382, 129 y 78, respectivamente. El Día 50 (día de la necropsia) , los diez (10) grupoe moetró altos títulos de PCV2 (= 1257) . Los Días 25, 32 y 50, el Grupo 3, que recibía dos dosis de 16 µg de rORF2 - Carbopol tenía títulos de anticuerpos mayores que el Grupo 1, que recibía dos dosis de 16 µg de rORF2 - IMS 1314. Los Días 25, 32 y 50, Grupo 2, que recibía dos dosis de 16 µg de vORF2 tenía títulos mayoree que el Grupo 4, que recibía eolamente una doeie de la miema vacuna. Loe Grupoe 3 , 5 , 6 , 7 , que recibían niveles decrecientes de rORF2 - Carbopol, de 16, 4, 1 y 0,25 µg, reepectivamente, mostró títulos de anticuerpos correepondientemente decrecientee los Días 25 y 32.

Tabla 19. Sumario del Grupo de Títulos IFA de PCV2 vORF2 = 0RF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de célulae completoe = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado *Para fines de cálculo, un título IFA =IOO se deeignó como un título de "50"; un título IFA = 6400 ee deeignó como un título de "12.800" . **Día de Enfrentamiento ***Día de la Necropeia Loe reeultadoe de lae observaciones clínicas post-enfrentamiento ee preeentan a continuación. La Tabla 20 incluye observaciones para el Comportamiento Anormal, Respiración Anormal, Tos y Diarrea. La Tabla 21 incluye los resultados del Sumario de Incidencia de los Síntomas Clínicoe Globalee del Grupo y la Tabla 22 incluye loe reeultadoe del Sumario de Tasas de Mortalidad del Grupo Post-enfrentamiento. La incidencia del comportamiento anormal, respiración anormal y toe post-enfrentamiento era baja en cerdos que recibían 16 µg de rORF2-IMS 1314 (Grupo 1) , 16 µg de rORF2-Carbopol (Grupo 3), 1 µg de rORF2-Carbopol (Grupo 6), 0,25 µg de rORF2-Carbopol (Grupo 7), y en cerdos en el Grupo Control de Enfrentamiento (Grupo 9) . La incidencia del comportamiento anormal, respiración anormal y tos poet-enfrentamiento era cero en cerdoe que recibían 16 µg de vORF2-Carbopol (Grupo 2), una doeie única de 16 µg de vORF2-Carbopol (Crupo 4) , 4 µg de rORF2-Carbopol (Grupo 5) , >8 log de KV-Carbopol (Grupo 8) , y en cerdoe en el Grupo Control Eetricto Negativo (Grupo 10) . La incidencia global de loe eíntomae clínicoe varió entre grupos. Los cerdos que recibían de 16 µg de vORF2-Carbopol (Grupo 2), una doeie única de 16 µg de vORF2-Carbopol (Grupo 4) , y los cerdos en el grupo control estricto negativo (Grupo 10) tenía tasas de incidencia de 0%; cerdos que recibían 16 µg de rORF2-Carbopol (Grupo 3), y 1 µg de rORF2-Carbopol (Grupo 6) tenía taeae de incidencia de 6,7%; cerdoe que recibían 16 µg de rORF2-lMS 1314 (Grupo 1) tenían una tasa de incidencia global de 7,1%; cerdoe que recibían 4 µg de rORF2-Carbopol (Grupo 5), 0,25 µg de rORF2-Carbopol (Grupo 7) y vacuna KV >8 log tenía tasas de incidencia de 13,3%; y cerdos en el Grupo Control de Enfrentamiento (Grupo 9) tenía una taea de incidencia de 14,3%. También variaban las tasas de mortalidad global entre grupos. El grupo 8, que recibía 2 dosie de vacuna de KV tenía la tasa de mortalidad más alta de 20,0%; seguido del Grupo 9, el grupo control de enfrentamiento, y el Grupo 7, que recibía 0,25 µg de rORF2-Carbopol y tenía taeae de mortalidad de 14,3% y 13,3%, reepectivamente. El Grupo 4, que recibía una dosis de 16 µg de vORF2-Carbopol tenía una tasa de mortalidad de 6,7%. Todos los otros Grupos 1, 2, 3, 5, 6 y 10 tenía una tasa de mortalidad del 0%.

Tabla 20. Sumario de Observaciones del Grupo para el Comportamiento Anormal, Respiración Anormal y Tos Poßt- Enfriamiento húmero total de cerdos en cada grupo que mostró algún comportamiento anormal durante al menos un día 2Número total de cerdos en cada grupo que mostró alguna reepiración anormal durante al menoe un día 3Número total de cerdoe en cada grupo que moetró tos durante al menos un día Tabla 21. Sumario de la Incidencia Global del Grupo de Síntomas Clínicos Post-Enfrentamiento vORF2 = ORF2 viral aielado; rORF2 = ORF2 expreeado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células completoe = virue PCV2 deearrollado en un cultivo celular adecuado húmero total de cerdoe en cada grupo que moetró cualquier síntoma clínico durante al menos un día Tabla 22. Sumario de las Tasas de Mortalidad del Grupo Post-enfrentamiento vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado El Sumario del Porcentaje Medio de Lesiones Pulmonares y la Diagnoeie Tentativa ee da a continuación en la Tabla 23. El Grupo 9, el grupo control de enfrentamiento, tenía el porcentaje máe alto de leeionee pulmonaree con una media de 10,81 ± 23,27%, seguido del Grupo 7, que recibía 0,25 µg de rORF2-Carbopol y tenía una media de 6,57 ± 24,74%, el Grupo 5, que recibía 4 µg de rORF2-Carbopol y tenía una media de 2,88 ± 8,88%, y el Grupo 8, que recibía la vacuna de KV y tenía una media de 2,01 ± 4,98%. Los restantes seis (6) grupos tenían un porcentaje medio de lesiones pulmonares que oscilaba entre 0,11 ± 0,38% y 0,90 ± 0, 15%. El diagnóstico tentativo de neumonía variaba entre los grupos. El Grupo 3, que recibía dos dosie de 16 µg de rORF2-Carbopol , tenía el diagnóstico tentativo de neumonía máe bajo, con 13,3%. El Grupo 9, el grupo control de enfrentamiento, tenía al 50% del grupo diagnoeticado tentativamente de neumonía, eeguido del Grupo 10, el grupo control estricto negativo y el Grupo 2, que recibieron dos dosis de 16 µg de vORF2-Carbopol, con 46,7% de 40%, respectivamente, diagnoeticado tentativamente de neumonía. Loe Grupoe 1, 2, 3, 5, 9 y 10 tenían el 0% del grupo diagnoeticado tentativamente como infestado con PCV2 ; mientras que el Grupo 8, que recibía dos dosis de vacuna KV, tenía la más alta taea en el grupo del diagnóetico tentativo de infección por PCV2 , con el 20%. El Grupo 7, que recibía dos dosie de 0,25 µg de rORF2-Carbopol , y el Grupo 4, que recibía una dosis de 16 µg de vORF2-Carbopol tenían diagnósticos de grupo tentativos de infección por PCV2 en el 13,3% y 6,7% de cada grupo, respectivamente. Úlceras gástricas fueron sólo diagnosticadas en un cerdo en el Grupo 7 (6,7%); mientras que loe otros 9 grupos permanecieron exentos de úlceras gástricas.

Tabla 23. Sumario del % Medio de Lesiones Pulmonares y Diagnóstico Tentativo en el Grupo vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virue de célulae completoe = virue PCV2 deearrollado en un cultivo celular adecuado El Sumario de loe Reeultadoe de la Incidencia IHC Positiva en el Grupo se muestran a continuación en la Tabla 24. El Grupo 1 (16 µg de rORF2 - IMS 1314) tenía la tasa de grupo más baja de resultadoe IHC poeitivoe con 0% de loe cerdos positivos para PCV2, seguido del Grupo 2 (16 µg de vORF2 - Carbopol) y del Grupo 4 (dosis única de 16 µg de vORF2 - Carbopol), que tenía tasae IHC del grupo de 6,7% y 13,3%, reepectivamente. El Grupo 9, el grupo control de enfrentamiento, tenía la taea de incidencia IHC poeitiva máe alta con un 100% de loe cerdoe positivos para PCV2, seguido del Grupo 10, el grupo control estricto negativo, y el Grupo 8 (vacuna de KV) , con 93,3% y 80% de los cerdos positivos para PCV2 , respectivamente.

Tabla 24. Sumario de la Tasa de Incidencia IHC Positiva en el Grupo vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado Discusión En este ejemplo ee evaluaron eiete vacunae contra PCV2, que incluían una alta doeie (16 µg) de antígeno rORF2 adyuvado con IMS 1314 adminietrado doe vecee, una alta doeie (16 µg) de antígeno vORF2 adyuvado con Carbopol administrado una vez a un grupo de cerdos y doe vecee a un eegundo grupo de cerdoe, una alta doeis (16 µg) de antígeno rORF2 adyuvado con Carbopol administrado dos veces, una dosis de 4 µg de antígeno rORF2 adyuvado con Carbopol administrado dos veces, una dosis de 1 µg de antígeno rORF2 adyuvado con Carbopol administrado dos veces, una baja dosie (0,25 µg) de antígeno rORF2 adyuvado con Carbopol adminietrado dos veces, y una alta dosis (> 8 log) de vacuna contra PCV2 de células enteras matadas, adyuvada con Carbopol. En general, el Grupo 1, que recibía dos dosie de 16 µg de rORF2 - IMS 1314, ee comportaba ligeramente mejor que loe Grupoe 2 a 7 , que recibían vacunae que contenían divereoe nivelee de antígeno vORF2 o rORF2 adyuvado con Carbopol y mucho mejor que el Grupo 8, que recibía dos dosis de vacuna contra PCV2 de células enterae matadae . El Grupo 1 tenía la tercera ADWG máe alta (0,81 ± 0,14 kg/día), la incidencia más baja de comportamiento anormal (0%) , la incidencia máe baja de reepiración anormal (0%), una incidencia baja de tos (7,1%), una baja incidencia de eíntomae clínicoe globales (7,1%), estaba empatado con otroe tres grupos en cuanto a la más baja tasa de mortalidad (0%) , la segunda tasa más baja del % medio de lesiones pulmonares (0,15 ± 0,34%), la segunda tasa más baja de neumonía (21,4%) y la tasa de incidencia más baja para tejidos IHC positivoe (0%) . Sin embargo, el Grupo 1 era el único grupo en el que ee obeervaban reaccionee en el eitio de inyección, que incluía el 50% de loe vacunados 1 día después de la eegunda vacunación. Lae otras vacunas administradae a loe Grupoe 2 a 7 ee comportaban mejor que la vacuna matada y casi tan bien como la vacuna adminietrada al Grupo 1. El Grupo 8, que recibía doe doeie de vacuna contra PCV2 matada, adyuvada con Carbopol, tenía el peor conjunto de reeultadoe para cualquier grupo de vacuna. El Grupo 8 tenía la ADWG máe baja (0,42 ± 0,15 kg/día), la eegunda taea máe alta de comportamiento anormal (6,7%), la tasa más alta de respiración anormal (6,7%), estaba empatada con otros tree grupoe en cuanto a la taea de incidencia global máe alta de eíntomas clínicos (13,3%), tenía la más alta tasa de mortalidad de todos los grupos (20%) , y tenía la tasa IHC positiva más alta (80%) de cualquier grupo de vacuna. Había preocupación que la vacuna contra PCV2 de células enterae matadae pudiera no haber sido totalmente inactivada antes de la adminietración al Grupo 8, que puede explicar loe pobree reeultadoe de este grupo. Desgraciadamente, los datos definitivos no eetaban disponibles para confirmar esta preocupación. En general, en el contexto de este ejemplo, una vacuna KV Convencional Matada no ayudaba a reducir la enfermedad asociada a PCV2. Como se ha mencionado previamente, ningún suceso adverso estaba asociado con las vacunae de ensayo, con la excepción de la vacuna adyuvada con IMS 1314. Reacciones en el sitio de inyección se notaron en el 50,0% de los cerdos 1 día después de la segunda vacunación con la vacuna formulada con IMS 1314 y en el 28,6% de los cerdos 2 días despuée de la segunda "vacunación. No se notaron reacciones en ningún cerdo que recibían vacunae adyuvadae con Carbopol . Debería continuaree con cualquier eetudio adicional que incluía cerdos vacunados con vacunas adyuvadas con IMS 1314 para vigilar eetrechamente a cerdos en cuanto a las reacciones en el sitio de inyección.

Todos loe cerdoe eran eero-negativos para PCV2 el Día -3 y sólo el Grupo 2 tenía un título superior a 100 el Día 14. El Día 25 (día del enfrentamiento) , el Grupo 8 tenía el título de anticuerpos contra PCV2 más alto (4619) , seguido del Grupo 2 (2507) . Con la excepción de los Grupos 7, 9 y 10, todoe loe grupos mostraron una fuerte respuesta a los anticuerpos hacía el Día 32. Hacia el Día 50, todoe loe grupoe, incluidoe loe Grupoe 7, 9 y 10 moetraron una fuerte respuesta a los anticuerpos . Una de las características distintivas de la infección por PCV2 en fase tardía y el subsiguiente desarrollo de PMWS es el retardo en el crecimiento de cerdos destetadoe, y en caeoe gravee , ee observa una pérdida de peso . La ganancia de peso media diaria de los grupos es un método cuantitativo de demostrar el retardo de crecimiento o la pérdida de peso. En este ejemplo no había una gran diferencia en la ADWG entre grupos. El Grupo 8 tenía la más baja ADWG de 0,40 ± 0,12 kg/día, mientras que el Grupo 4 tenía la más alta ADWG 0,53 ± 0,11 kg/día. Dentro del contexto de eete eetudio no había una diferencia euficiente entre grupoe para basar la futura eficacia de la vacuna sobre la ADWG. Además de la pérdida de peeo - diepnea, letargía, palidez de la piel y, a veces, íctero son síntomas clínicos asociadoe con PMWS. En eete ejemplo, para cada grupo se observaron, de manera no frecuente, un comportamiento anormal y una reepiración anormal y toe. Como ee evidencia en eete eetudio, este modelo de enfrentamiento y cepa de enfrentamiento no dan como resultado síntomae clínicoe abrumadoree, y este no es un parámetro fuerte en el que basar la eficacia de la vacuna. En general, las taeae de mortalidad no eran tan altae en eete ejemplo y la aueencia de una alta tasa de mortalidad en el grupo control de enfrentamiento limita este parámetro en el que baear la eficacia de la vacuna. Antee del Día 46, en cada uno de los Grupos 4 y 7 moría uno de quince cerdos, en el Grupo 9 morían dos de catorce cerdos y en el Grupo 8 morían tres de quince cerdos . Debido al hecho de que el Grupo 9 , el grupo control de enfrentamiento, no mostraba eíntomas clínicos de PCV2 y eolamente ee habían producido doe muertee en eete grupo hacia el Día 46, ee adminietró a todoe loe cerdoe la vacuna MLV del Virue del Síndrome Reepiratorio y Reproductor Porcino (PRRSV) MLV el Día 46. Estudioe anterioree habían utilizado INGELVAC® PRRS MLV como un inmunoeetimulante para exasperar la enfermedad PMWS asociada a PCV2 y las tasae de mortalidad eran máe altae en eetoe estudios anteriores. Se producían dos muertes poco después de administrar la vacuna PRRS el Día 46 - el Grupo 4 tenía una muerte el Día 46 y el Grupo 7 tenía una muerte el Día 47 - que probablemente no estaban asociadas con la administración de la vacuna PRRS. Hacia el Día 50, el Grupo 8, que recibía dos dosie de vacuna matada, tenía la máe alta taea de mortalidad (20%) , eeguido del Grupo 9 (control de enfrentamiento) y el Grupo 7 (0,25 µg de rORF2 - Carbopol), con taeae de mortalidad de 14,3% y 13,3%, reepectivamente. En general, la adminietración tardía de la vacuna PRRS al modelo de enfrentamiento en la faee de obeervación poet-enfrentamiento de eete ejemplo no aumentaba eignificativamente lae taeae de mortalidad. Leeionee burdae en cerdos con PMWS secundaria a la infección por PCV2 consietía típicamente en linfoadenopatía generalizada en combinación con uno o más de lo siguiente: (1) neumonía intersticial con edema interlobular, (2) palidez cutánea o íctero, (3) hígados atrofíeos moteados, (4) úlceras gástricas y (5) nefritis. En la necropsia (Día 50), no se observó en ninguno de los grupos íctero, hepatitis ni nefritis. Una úlcera gástrica fue observada en un cerdo del Grupo 7, pero no se examinó específicamente una linfoadenopatía. En base a la presencia de lesiones que eran consistentes con una infección por PCV2, tres grupos tenían al menos un cerdo diagnosticado tentativamente con PCV2 (PMWS) . El Grupo 8, que recibía dos dosie de vacuna matada, tenía un 20% diagnoeticado tentativamente con PCV2, mientrae que el Grupo 7 y el Grupo 4 tenían 13,3% y 6,7%, respectivamente, diagnosticado tentativamente con PCV2. El % medio de puntuaciones de lesiones pulmonares variaba entre grupos en la necropsia. Los Grupos 1, 2, 3, 4, 6 y 10 tenían un bajo % de puntuación de lesiones pulmonares que oscilaba entre 0,11 ± 0,38% y 0,90 ± 0,15%. Como era de esperar, el Grupo 9, el grupo control de enfrentameinto tenía el % medio más alto de puntuaciones de lesiones pulmonares (10,81 ± 23,27%). En los cuatro grupos, el % medio de puntuaciones de lesiones pulmonares se elevó debido a uno hasta tres cerdos en cada uno de estoe grupos que tenían puntuaciones muy altas de lesiones pulmonares. Las lesiones pulmonares eran rojas/púrpura y estaban consolidadas. Típicamente, las lesiones pulmonares asociadae con PMWS ee deecriben como de color canela y no colapeables con edema interlobular. Las lesionee pulmonares observadae en eete eetudio no ee aeociaron con una infección por PCV2 o puede estar presente un segundo agente infeccioso pulmonar. Dentro del contexto de este estudio, el % de puntuación de lesionee pulmonares no reflejan, probablemente, una medida verdadera de la cantidad de infección pulmonar debida a PCV2. De igual manera, también se puede haber sobre-utilizado un diagnóetico tentativo de neumonía. Cualquier cerdo con lesiones pulmonares, algunas tan pequeñas como del 0,10%, fueron lietadoe con un diagnóstico tentativo de neumonía. En este ejemplo no había diferencia suficiente entre grupos con respecto a lesiones burdas y el % de lesiones pulmonares en las que basar la eficacia de la vacuna. Los resultados de IHC mostraron las mayores diferencias entre grupos. El Grupo 1 (16 µg de rORF2 - IMS 1314) tenía loe resultados IHC positivos más bajos para el antígeno de PCV2 (0%) ; mientras que los Grupoe 9 y 10 tenían loe resultados IHC positivos más altos con tasae de incidencia de 100% y 93,3%, respectivamente. Los Grupos 3, 5, 6 y 7, que recibían 16, 4, 1 ó 0.25 µg de antígeno rORF2, respectivamente, adyuvados con Carbopol, tenían tasas IHC positivas de 20%, 20%, 40% y 46,7%, respectivamente. El Grupo 2, que recibía dos dosis de 16 µg de vORF2 adyuvado con Carbopol tenía una tasa IHC positiva de 6,7%, mientras que el Grupo 4, que recibía solamente una dosis de la misma vacuna, tenía una taea IHC positiva de 13,3%. Debido a la naturaleza objetiva de este ensayo y al hecho de que los resultados de IHC ee correlacionaban con los resultados esperados, el ensayo de IHC es probablemente uno de loe mejoree parámetros en los que basar la eficacia de la vacuna . Así, en un aspecto de la presente invención, se determina la Dosificación Protectora Mínima (MPD) de un antígeno de ORF2 de PCV2 adyuvado con Carbopol en el modelo de cerdoe CDCD en la cara de un enfrentamiento de PCV2. Cada uno de loe Grupoe 3, 5, 6 y 7 recibía doe doeie de antígeno rORF2 adyuvado con Carbopol, pero el nivel de antígeno rORF2 variaba para cada grupo. Cada uno de loe Grupos 3, 5, 6 y 7 recibía 16, 4, 1 ó 0,25 µg de antígeno rORF2, respectivamente. En general, la disminución del nivel de antígeno rORF2 redujo los títuloe de anticuerpoe de PCV2, y aumentó la taea de mortalidad, el % medio de leeionee pulmonaree y la incidencia de tejidoe IHC positivos. De los cuatro grupos que recibían niveles variablee de rORF2 - Carbopol, loe Grupoe 3 y 5, que recibían dos dosis de 16 ó 4 µg de antígeno rORF2, respectivamente, cada uno tenía una taea IHC poeitiva de solamente 20%, y cada uno tenía similares títulos de anticuerpos. En general, en base a los reeultados IHC poeitivoe, la doeificación protectora mínima de antígeno rORF2 adminietrada doe vecee ee de aproximadamente 4 µg. En otro aepecto de la presente invención, se evaluó la antigenicidad de antígenos de PCV2 recombinante (rORF2) y VIDO R-1 (vORF2) . El Grupo 2 recibía dos dosis de 16 µg de vORF2 y el Grupo 3 recibía dos dosie de 16 µg de rORF2. Ambae vacunae eetaban adyuvadae con Carbopol. Se encontró que las dos vacunas eran eegurae y ambae tenían una taea de mortalidad de 0%. El Grupo 2 tenía un título de anticuerpoe de PCV2 de 2507 el Día 25, mientrae que el Grupo 3 tenía un título de anticuerpos de PCV2 de 1503. El Grupo 3 tenía una menor puntuación del % medio de lesiones pulmonares que el Grupo 2 (0,11 ± 0,38% frente a 0,90 ± 0,15%), pero el Grupo 2 tenía una menor tasa de incidencia IHC poeitiva que el Grupo 3 (6,7% frente a 20%) . En general, las dos vacunas tenían una antigenicidad similar, pero vORF2 eetaba aeociada con reeultadoe IHC ligeramente mejoree. Aún en otro aepecto de la presente invención, se determinó la idoneidad de doe adyuvantee diferentee (Carbopol e IMS 1314) . Loe doe Grupoe 1 y 3 recibían doe doeie de vacuna que contenía 16 µg de antígeno rORF2, pero el Grupo 1 recibía el antígeno adyuvado con IMS 1314, mientrae que el Grupo 3 recibía el antígeno adyuvado con Carbopol . Los dos grupos tenían eeencialmente la miema ADWG, esencialmente la misma incidencia de eíntomas clínicos poet-enfrentamiento, la miema taea de mortalidad, y eeencialemente el miemo % medio de leeiones pulmonares; pero el Grupo 1 tenía una tasa IHC positiva de 0%, mientras que el Grupo 3 tenía una tasa IHC positiva de 20%. Sin embargo, el Grupo 3, que recibía la vacuna adyuvada con Carbopol, tenía mayores títulos de IFAT PCV2 los Días 25, 32 y 50 que el Grupo 1, que recibía la vacuna adyuvada con IMS 1314. En general, a pesar de que la vacuna contra PCV2 adyuvada con IMS 1314 proporcionaba mejores resultadoe IHC, no proporcionaba una protección abrumadoramente mejor frente a una infección por PCV2 ni inducía una reacción del eitio de inyección. Mientrae que la vacuna contra PCV2 adyuvada con Carbopol ee comportaba caei tan bien como la vacuna adyuvada con IMS 1314, pero no eetaba aeociada a ningún suceso adverso. Aún en otro aepecto de la preeente invención, se determinó la idoneidad de ORF2 de PCV2 como 1 ml, 1 dosie de producto. Loe Grupoe 2 y 4 recibían amboe 16 µg de vacuna vORF2 adyuvada con Carbopol el Día 0, pero el Grupo 2 recibía una eegunda doeie el Día 14. El Grupo 4 tenía una ADWG ligeramente máe alta y un menor % medio de leeionee pulmonares que el Grupo 2, pero el Grupo 2 tenía títulos IFAT PCV2 más altos los Días 25, 32 y 50, y una tasa de incidencia ligeramente menor de tejidos IHC positivoe. Todos los otros resultados para estos dos grupoe eran eimilaree. En general, una doeie de vORF2 adyuvado con Carbopol ee comportaba de manera eimilar a doe dosis de la misma vacuna. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (6)

1. 5 REIVINDICACIONES Habiéndoee deecrito la invención como antecede ee reclama como propiedad lo contenido en lae eiguientee reivindicaciones : 1. Una vacuna de combinación multivalente, caracterizada porque comprende un agente inmunológico eficaz para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de infecciones por circovirue porcino tipo 2 y al menoe un componente inmunogénico activo contra otro organismo provocador de la enfermedad en cerdos.
2. 2. La vacuna de combinación multivalente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente inmunológico eficaz para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de infecciones por circovirus porcino tipo 2 ee un antígeno de circovirue porcino tipo 2. 3. La vacuna de combinación multivalente de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el antígeno de circovirue porcino tipo 2 ee antígeno de circovirue porcino tipo 2 inactivado, un circovirue porcino tipo 2 vivo modificado o atenuado, un virue quimérico que comprende al menoe una eecuencia de aminoácidoe inmunogénica de circovirue porcino tipo 2, o cualquier otro polipéptido o componente que comprende al menos una secuencia de aminoácidos inmunogénica de circovirus porcino tipo 2. 4. La vacuna de combinación multivalente de conformidad con cualquiera de lae reivindicacionee 1 a 3 , caracterizada porque el antígeno de circovirus porcino tipo 2 es una proteína codificada por una eecuencia de ADN que tiene al menoe un 80% de identidad de la eecuencia con ORF2 de un circovirue porcino tipo 2. 5. La vacuna de combinación multivalente de conformidad con cualquiera de lae reivindicacionee 1 a 4, caracterizada porque el antígeno de circovirue porcino tipo 2 ee antígeno ORF2 expreeado en baculovirue . 6. La vacuna de combinación multivalente de conformidad con cualquiera de lae reivindicacionee 1 a 4, caracterizada porque el componente inmunogénico activo, eficaz contra otro organismo provocador de enfermedades en cerdos, se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de: Actinobacillus pleuropneumonia ; Adenovirus; Alfavirus tal como virus de la encefalomielitie equina del Eete ; Bordetella bronchieeptica ; Brachyspira spp., preferiblemente B. hyodyentheriae; B. piosicoli , Brucella euie, preferiblemente biovares 1, 2 y 3 ; virus de la fiebre porcina clásica ; Clostridium spp., preferiblemente Cl . difficile, Cl . perfringens tipoe A, B y C, Cl . novyi, Cl.septicum, Cl. tetani; Coronavirus, preferiblemente Coronavirus reepiratorio porcino; Eperythrozoonoeie euie; Eryeipelothrix rhsiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, preferiblemente subtipos 1, 7 y 14; virus de la encefalomielitis hemoaglutinante; virue de la encefalitie japonesa; Lawsonia intracellularis; Leptospira spp., preferiblemente Leptospira australie; Leptoepira canicola; Leptoepira grippotyphoea; Leptoepira icterohaemorrhagicae; y Leptoepira interrogane; Leptospira pomona; Leptospira tarassovi; Mycobacterium spp., preferiblemente M. avium, M. intracellulare y M.bovis; Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo) ; Pasteurella multocida; citomegalovirus porcino; parvovirus porcino; Virue del Síndrome Reproductor y Reepiratorio Porcino (PRRS) ; virue peeudorrabia; Rotavirue; Salmonella epp., preferiblemente S. thyphimurium y S. choleraesuis; Staph. hyicus; Staphylococcus spp./ preferiblemente Streptococcus spp., preferiblemente Strep. euie; virue herpee porcino; virue de la influenza porcino; virue varicela porcina; virus varicela porcina; virus de la estomatitie veeicular; y virue de exantema veeicular de cerdos . 7. La vacuna de combinación multivalente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , caracterizada porque el componente inmunogénico activo, eficaz contra otro organismo provocador de enfermedades en cerdos, se selecciona del grupo que consiste en cualquier antígeno contenido en Enterisol® Ileitie, Enterieol® Ileitie FF, Enterisol® SC-54, Enterisol® SC-54 FF, Enterieol® ERY-ALC, Ingelvac® APP ALC, Ingelvac® AR4, Ingelvac® HP-1, Ingelvac® HPE-1, Ingelvac® M. hyo, Ingelvac® PRRS MLV, Ingelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRV-G1, Reprocyc® PRRS PLE, Reprocyc® PLE, Tetguard™, Toxivac® AD+E, Toxivac® Plue Parsius, (todos de Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, EE.UU.); Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY + PARVO, Porcilie Ery, Porcilie Glaeser, Porcilis Parvo, Porcilis Porcoli DF, Porcilie APP, Porcilie AR-T, Porcilie AR-T DF, Porcilie Porcoli, Porcilie Porcoli Diluvac forte, Porcilie PRRS, Porcilie Porcol 5, Porcilie Aujeezky, Porcilie Begonia Diluvac, Porcilie Begonia I.D.A.L., Porcilie Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilie Atrinord, Myco Silencer® BPM, Myco Silencer® BPME, Myco Silencer® ME, Myco Silencer® M, Myco Silencer® Once, Myco Silencer® MEH, Rhinogen® BPE, Rhinogen® CTE 5000, Rhinogen® CTSE, Score, Sow Bac® E II, Sow Bac® CE II, Sow Bac® TREC, ProSystem® CE, ProSystem® RCE, ProSystem® TREC, ProSyetem® Pillmune, ProSyetem® Rotamune® con Imugan® II, ProSyetem® Rota, ProSystem® Rotamune KV, ProSystem® TG-Emune® Rota con Imugan® II, ProSystem® TGE/Rota, ProSystem® TG-Emune® con Imugen®, ProSystem® TGE, MaGESTIC 7, MaGESTIC 8, MaGESTic™ con Spur®, MaGESTic® 7 con Spur®, MaGESTic® 8 con Spur®, End-FLUence® con Imugen® II, End-FLUence® 2, PRRomiSE®, PRV-Begonia con Dlluvac Forte®, Argus® SC/ST, Strep Bac, Strep Bac® con Imugen® II, Colisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plue, Erysorb Parvo, (todos de Intervet Inc., Millsboro, DE, EE.UU.); Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progreseie, Viraflu, Akipor 6.
3. 3, Jespur gl-, Jeeflu gl- (todoe de Merial LTD, Duluth, GA) ; ER BAC® PLUS, ER BAC®, ER BAC® PLUS/LEPTOFERM-5®' ER BAC® Leptoferm-5®, Farroweure®, Farroweure® B, FARROWSURE® PLUS B, FARROWSURE® PLUS, FARROWSURE® PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE™, FLUSURE™ RTU, FLUSURE™/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/ER BAC PLue®, FLUSURE™/RESPISURE®, FLUSURE™/RESPISURE® RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE®/ER BAC® PLUS, FLUSURE™/Re8piSure 1 ONE®/ER BAC Plue®, FLUSURE™/RESPISURE ONE®, FLUSURE/RESPISURE™ 1 ONE®, FLUSURE/Farroweure Plus, FLUSURE/Farroweure Plus B, LITTERGUARD® LT-C, LITTERGUARD® LT, PleuroGuard® 4, Pneumosuie III, Stellamune One, Stellamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Mycoplaema, Reepieure One, Reepieure®, Reepieure 1 ONE®, Reepieure 1 One®/ER Bac Plue®, Enduracell T, Zylexie (antiguamente conocido como Baypamune) , Atrobac® 3, BratiVac®, BratiVac®-B, Leptoferm-5™, Parvo- Vac®/Leptoferm-5®, PR-Vac®-Killed, PR-Vac®, PR-Vac Plue™. (todoe de Pfizer Inc., New York, NY, EE.UU.); Suvaxyn MH One, Suvaxyn ReepiFend® MH, Suvaxyn Mycoplaema, Suvaxyn Aujeezky Bartha + Diluyente, Suvaxyn Aujeezky Bartha + a/a, Suvaxyn Aujeezky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783 + a/a, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-One, Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn ReepiFend® APP, Suvaxyn RespiFend® HPS, Suvaxyn RespiFend® MH/HPS, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn® AR/T/E, Suvaxyn® EC-4, Suvaxyn® E, Suvaxyn®-E, Suvaxyn® E-oral, Suvaxyn® PLE, Suvaxyn® PLE/PrV gpl-, Suvaxyn® LE+B, Suvaxyn® PLE + B, Suvaxyn® PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn® SIV, Suvaxyn® SIV/Mh-one, Suvaxyn® P, Suvaxyn® PrV gpl-, Suvaxyn® PCV-2 One Shot (todos de Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, EE.UU. (Wyeth) ; SCOURMUNE®, SCOURMUNE®-C, SCOURMUNE®-CR, AR-PAC®-PD+ER, AR-PARAPAC®+ER, M+ Rhusigen®, M+PAC®, MaxiVac Excell®3, MaxiVac® HlNl, MaxiVac® H3N2, MaxiVac®-FLU, MaxiVac®-M+, MaxiVac Excell®, MaxiVac Excell 3, PARAPAC®, PNEU PAC®, PNEU PAC®-ER, PNEU PAC®+ER, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®-MaxiVac® FLU, Rhusigen™, Gletvax 6, Covexin 8, M + PAC, Gletvax plue, M-Parapac™..SS PAC® (todoe de Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, EE.UU.); AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLÁSSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (todos de Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona, España); Clostricol, Coliporc Plue, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART + EP, RESPIPORC FLU, Reepiporc M. HYO 1 SHOT, Rhueiovac, Rotlauf-Lebendimpfetoff, Salmoporc, Suiealoral, AK-vac MK35 (todoe de IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Alemania) ; Mypravac Suie, (Albrecht GmbH, Alemania); Haemo Shield® P, Parapleuro Shield® P, Parapleuro Shield® P+BE, Rhinicell® FD, Rhini Shield™ TX
4. 4, Prefarrow Shield® 9, Prefarrow Strep Shield®, Clostratox® BCD, Cloetratox® C, Cloetratox® Ultra C 1300, Porcine Ecolizer® 3 + C, Porcine Pili Shield ™.+C, Porcine Pili Shield ™. ..Porcine Ecolizer® 3, Ery Serum™.. Ery Shield™.. Ery Vac Oral, Ery Shield™ +L5, PanSTAR™ Ery, Erycell™ .. Parvo Shield® E, Parvo Shield® L5E, Parvo Shield® L5, Parvo Shield®, Para Shield®, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR™ Myco, Lepto Shield™
5. 5, Myco Shield™ ..Salmo Shield® 2, Salmo Shield® Live, A itox Tet™ .. C . Toxoide Perfingene Tipo A (todos de Novartis Animal Health, Basel, Suiza) ; Nitro-Sal (Akro) ; o combinaciones de los mismos.