MX2008007728A

MX2008007728A - Tamaño de semillas y numero de semillas aumentados a traves de la sobre expresion transgenica de un crecimiento y/o gen relacionado con el desarrollo durante el desarrollo embrionario temprano

Info

Publication number: MX2008007728A
Application number: MXMX/A/2008/007728A
Authority: MX
Inventors: Derocher Jay; Nguyen Thu
Original assignee: Derocher Jay; Nguyen Thu; Targeted Growth Inc
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2008-10-03

Abstract

La presente invención proporciona métodos y composiciones para aumentar el tamaño de semillas y/o el número de semilla en plantas. En particular, se proporcionan los métodos y composiciones para la sobre-expresión de un crecimiento vegetal y/o el gen relacionado o asociado con el desarrollo durante el desarrollo embrionario. Las plantas transgénicas transformadas con estructuras genéticas que tienen el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas bajo el control de un promotor embrionario fase-específico temprano proporcionan plantas maduras en el campo que producen semillas más grande y/o en mayor cantidad. También se proporcionan los métodos para la selección de genes asociados con el crecimiento y desarrollo que proporcionan plantas transgénicas con un fenotipo de mayor rendimiento.

Description

TAMA O DE SEMILLAS Y NUMERO DE SEMILLAS AUMENTADOS A TRAVÉS DE LA SOBRE-EXPRESIÓN TRANSGENICA DE U CRECIMIENTO Y/O GEN RELACIONADO CON EL DESARROLLO DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO TEMPRANO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para aumentar el tamaño de semillas y/o el número de semilla en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El rasgo más importante como un blanco para la mejora de cultivos es el rendimiento. Los esfuerzos para mejorar los rendimientos en cultivos al desarrollar nuevas variedades de plantas se pueden dividir en dos enfoques. Uno es reducir las pérdidas en el rendimiento de cultivos al reproducir o diseñar mediante ingeniería variedades de cosecha con resistencia aumentada a condiciones de estrés abiótica tales como, sequía, frío, o sal o a condiciones de estrés bióticas que resultan de plagas o patógenos que provocan enfermedades. Mientras que este enfoque tiene valor, no proporciona un rendimiento en cultivos fundamentalmente mejorado en ausencia de condiciones de estrés. El segundo enfoque es reproducir o diseñar mediante ingeniería nuevas variedades de cultivos en las cuales se aumente la capacidad básica de rendimiento. Los programas clásicos de reproducción inicialmente han producido granos sustanciales en rendimiento mejorado en una variedad de cultivos. Un patrón comúnmente experimentado aunque haya tenido ganancias sustanciales en el rendimiento seguido inicialmente por mejoras adicionales cada vez mayores se ha tornado más pequeño y más difícil de obtener . Más recientemente se han desarrollado procedimientos con base en tecnologías de biología molecular que en principio ofrecen el potencial de alcanzar una mejora sustancial en el rendimiento de los cultivos al alterar el tiempo ubicación o nivel de expresión de los genes vegetales que desempeñan una función en el crecimiento y/o desarrollo de plantas. Se ha producido un progreso sustancial en los últimos veinte años en la identificación de genes vegetales que tienen una función en el crecimiento y/o desarrollo de plantas. Debido a la complejidad de la regulación del crecimiento de planta y la forma en que se le relaciona al término para proporcionar rasgos, todavía no es evidente, lo cual, en su caso, de que estos genes podrían ser un candidato claro para mejorar el rendimiento en los cultivos. Mucho del trabajo que se ha realizado para identificar genes vegetales con una función de crecimiento y/o desarrollo se ha realizado en el sistema de plantas modelo Arabidopsis thaliana . Uno de estos genes, denominado REVOLUTA {REV, por sus siglas en inglés) , se identificó originalmente como una mutación para pérdida de función en Arabidopsis denominado revi (Talbert et al., Development 121:2723-2735, 1995). Esta mutación tuvo efectos pleiotrópicos en el crecimiento y morfología de plantas. Un fenotipo de la mutación revi que fue de interés tuvo semillas significativamente más grandes. Este fenotipo fue potencialmente conveniente en la agricultura aunque, desafortunadamente, estuvo acompañado por rasgos no deseables tales como, reducido número de flores y semillas, infertilidad, y morfología alterada de hojas. El mutante revi exhibe hojas, tallos, y flores más grandes, además de semillas más grandes. El gen REV, se identificó mediante un mapa con base en un procedimiento de clonación (descrito en la WO 01/33944, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) y se probó que perteneció a la familia de factores de trascripción con cierre de leucina y dominio de origen (HD-ZIP, por sus siglas en inglés) . En las plantas, los genes HD-ZIP están implicados en muchas trayectorias de desarrollo, entre las que se incluyen desarrollo de tejido vascular, desarrollo de pelo en tricomas y raíces, y respuestas reguladas por la luz. Debido a que revi probablemente tendrá una pérdida de la mutación de funciones, se han realizado esfuerzos para inactivar la función REV en Arabídopsis transgénica al expresar estructuras REV de repetición invertida (REV-IR, por sus siglas en inglés) o vía la co-supresión activada por una fuerte sobre-expresión del gen REV (WO 01/33944) . Las estructuras REV-IR proporcionan un fenotipo revi débil. El fenotipo revi que incluye semillas más grandes, más pesadas, también se observó en las lineas de sobre-expresión REV donde la fuerte expresión constitutiva del transgen REV a todo lo largo de la planta se impulsó por el promotor 35S constitutivo. De manera interesante, este efecto correlacionado con los niveles aumentados de ARNm REV que indican que esto no fue debido a la co-supresión del gen REV endógeno. El hecho de que la sobre-expresión REV y no la supresión, proporcionó un tamaño aumentado de semilla fue un hallazgo importante debido a que no se anticipó con base en el trabajo anterior con el mutante revi . La fuerte expresión constitutiva del transgen REV a todo lo largo de la planta imitó el fenotipo de semillas grandes del mutante revi, aunque también replicó fenotipos no deseables observados con el mutante revi. Mientras que la capacidad para obtener el fenotipo de tamaño de semilla más grande mediante el procedimiento técnicamente directo de la sobre-expresión constitutiva de un transgen REV mostró ser prometedora, los fenotipos no deseables significan que este procedimiento podría no ser viable para aplicaciones agrícolas comerciales. La parte agrícolamente relevante de la planta para muchas especies de cultivo es la semilla. Si se pudiera obtener el rasgo de gran semilla sin los efectos secundarios nocivos de la sobre-expresión REV constitutiva general, esto podría tener un valor agrícola potencialmente mayor. Un procedimiento imaginable para superar este problema fue limitar la sobre-expresión REV específicamente para la semilla. Mientras que muchos promotores semilla-específicos ya se conocían y caracterizó que se podrían utilizar potencialmente para impulsar la expresión del transgen REV, no existe evidencia que sugiera que, en principio, la sobre-expresión REV limitada a la semilla realmente podría dar por resultado en un tamaño aumentado de semillas. La función natural de un gen REV endógeno de plantas en la semilla se sabe que estará en la iniciación meristémica y la determinación del destino de células adaxiales (Otsuga et al., Plant J. 25:223-236, 2001; McConnell and Barton, Development 125:2935-2942 (1998); McConnell et al., Nature 411:709-713, 2001; Emery et al., Curr. Biol. 13:1768-1774, 2003) y no en el crecimiento o división celular. Además, no se sabe si el fenotipo de tamaño de semillas grandes en las plantas con sobre-expresión 35S/REV es debido a la sobre-expresión de REV en la semilla o en el desarrollo de embriones o en su lugar es debido a efectos sobre el crecimiento y desarrollo general de la planta provocado por la sobre-expresión REV a todo lo largo de los tejidos de la planta. Además de la falta de cualquier función biológica conocida para REV en la semilla que pudiera tener un efecto sobre la determinación del tamaño de la semilla, no existe información para indicar en qué parte de la semilla o durante qué etapa durante el desarrollo de la semilla podría ser mejor intentar sobre-expresar un transgen REV hasta alcanzar un aumento en el tamaño de la semilla. La presente invención proporciona la sobre-expresión embrión-específica de un gen relacionado con el crecimiento y/o desarrollo durante una etapa temprana del desarrollo embrionario que da por resultado en un aumento en el tamaño de la semilla en comparación con una planta tipo silvestre que no sobre-exprese el gen. En una modalidad particular el gen REV se sobre-expresó utilizando un promotor embrionario-específico temprano. El rasgo de tamaño aumentado de semillas se alcanzó sin los efectos secundarios nocivos observados con la sobre-expresión constitutiva de REV a todo lo largo de la planta. Además, la sobre-expresión embrionaria-específica de REV proporcionó el resultado inesperado de un aumento en el número total de semillas por planta en comparación con una planta tipo silvestre. El aumento en el número total de semillas que resultó de un aumento en el número de semillas por vaina, un aumento en el número de racimos por planta, un aumento en el número de vainas por racimo, un aumento en la velocidad de absorción de la semilla o una combinación de estos efectos. Con untamente, el tamaño aumentado de la semilla y el número aumentado de semillas que resultan de la sobre-expresión de REV en el desarrollo embrionario, condujeron a aumentos sustanciales en el rendimiento total en comparación con una planta tipo silvestre y demostró que un gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas se puede sobre-expresar en asociación con un promotor embrionario-especifico temprano para aumentar el rendimiento de las plantas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los métodos y composiciones para aumentar el tamaño de las semillas y/o el número de semillas en plantas transgénicas . En particular, la presente invención se relaciona con el uso de promotores embrionarios fase-especificos tempranos asociados operativamente con un gen asociado con un crecimiento y/o desarrollo de plantas para proporcionar la sobre-expresión del gen y/o una proteina codificada por el gen en una semilla en desarrollo de una planta transgénica. La sobre expresión del gen durante esta etapa temprana del desarrollo de la semilla en una planta transgénica proporciona una producción de semillas aumentada y/o un tamaño aumentado de la semilla en la planta transgénica en comparación con la planta tipo silvestre. En una modalidad particular de la presente invención, el gen REV se asoció operativamente con un promotor embrionario fase-especifico temprano para proporcionar la sobre-expresión de la proteina REV en una semilla en desarrollo de una planta transgénica. La sobre-expresión de REV durante esta etapa temprana del desarrollo de semillas, sorprendentemente dio por resultado en un tamaño aumentado de las semillas y una producción aumentada de semillas en la planta transgénica sin los efectos secundarios nocivos que se hablan observado cuando REV se sobre-expresó a todo lo largo de la planta. También se proporciona un método para aumentar el tamaño de semillas en una planta que comprende la sobre-expresión de un gen asociado con un crecimiento y/o desarrollo de plantas en una semilla durante el desarrollo embrionario temprano. En particular, el método comprende expresar el gen relacionado con el crecimiento y/o desarrollo en la semilla bajo el control de un promotor embrionario fase-especifico temprano. El promotor embrionario fase-especifico temprano, puede ser heterólogo u homólogo para la planta. En ciertas modalidades de la presente invención, el promotor es un promotor fase-especifico temprano asociado con un gen de aminoácido permeasa, tal como, AAP1, un gen oleato 12 hidroxilasardesaturasa, un gen 2S2 albúmina, un gen elongasa con ácido graso, tal como, FAE1, o un gen de cotiledónea en forma de hoja. Los promotores particulares útiles en la presente invención incluyen el promotor AAP1 proveniente de Arabidopsis thaliana , un promotor génico de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri (LFAH12, por sus siglas en inglés), un promotor génico 2S2 o un promotor LEC2 del gen de cotiledónea en forma de hoja proveniente de Arabidopsis thaliana . En una modalidad particular de la presente invención el gen REV, se asoció operativamente con un promotor embrionario fase-especifico temprano. En este método, el gen REV se sobre-expresó en el desarrollo temprano de la semilla y condujo a un aumento en el tamaño de la semilla y el número de semillas en comparación con una planta tipo silvestre. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para aumentar el tamaño de la semilla y/o el número de semillas en plantas que se caracterizan como una monocotiledónea o una dicotiledónea. En particular, los métodos se pueden utilizar para aumentar el tamaño de la semilla y/o el número de semillas en plantas que sean miembros de las familias Brassicacea, (Cruciferae) , Gramineae , Malvaceae, Leguminosae-Papilionoideae . Las plantas particulares de interés para utilizarse en los métodos de la presente invención incluyen cañóla, maíz, camelina, algodón, alfalfa, soya, trigo, arroz, o cebada. La presente invención también proporciona estructuras genéticas que comprenden una secuencia de ácido nucleico para un gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas vinculado operativamente con una o más secuencias control en donde una o más de las secuencias control son capaces de estimular la expresión del gen durante el desarrollo embrionario. En particular, la estructura genética de la invención comprende una secuencia control incluyendo un promotor embrionario fase-especifico temprano. Los promotores embrionarios fase-especificos tempranos pueden incluir el promotor asociado con un gen de de permeasa y aminoácidos (AAP1, por sus siglas en inglés) , un gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa, un gen de 2S2 albúmina (2S2, por sus siglas en inglés), un gen de elongasa con ácido graso (FAE1, por sus siglas en inglés) , o un gen de cotiledóneas en forma de hoja (LEC2 , por sus siglas en inglés) . Las estructuras genéticas típicas de la presente invención comprenden el promotor AAPl proveniente de Arabidopsis thaliana , el promotor de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri (LFAH12), el promotor del gen 2S2 proveniente de Arabidopsis thaliana , el promotor génico de elongasa con ácido graso proveniente de Arabidopsis thaliana, o el promotor 2 del gen de cotiledóneas en forma de hoja proveniente de Arabidopsis thaliana. Las estructuras genéticas particulares de la presente invención comprenden un promotor embrionario fase-específico temprano asociado operativamente con un gen REV proveniente de Arabidopsis . La estructura genética también puede incluir una secuencia polyA operativamente asociada. La presente invención también proporciona los métodos para la producción de una planta transgénica que tenga tamaño aumentado de semillas y/o número de semillas, los métodos comprenden: (a) introducir en la planta o en una célula vegetal, una estructura genética como se mostró anteriormente y cultivar la planta o célula vegetal que comprende la estructura genética bajo condiciones que estimulen la regeneración y el crecimiento de la planta madura. Típicamente, los métodos producen una planta transgénica que tiene tamaño de semillas y/o número de semillas aumentados en comparación con la planta tipo silvestre correspondiente. Las plantas transgénicas que comprenden las estructuras genéticas puede ser plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, en particular en donde la planta monocotiledónea es un miembro de la familia Gramineae. Las plantas provenientes de la familia Gramineae de interés particular incluyen arroz, avena, maíz, o trigo. Adicionalmente, las plantas transgénicas de la presente invención son plantas de las familias Brassicacea (Cruciferae) , Malvaceae, o Leguminosae-Papilionoideae. En particular en donde la planta transgénica es soya, algodón, camelina, alfalfa, o cañóla. La presente invención también proporciona los métodos para seleccionar un gen que aumente el rendimiento vegetal cuando se asocia funcionalmente con un promotor embrionario fase-especifico temprano; que comprende la construcción un vector de expresión que comprende un gen asociado con un crecimiento y/o desarrollo de plantas asociado funcionalmente con un promotor embrionario fase-especifico temprano, transfectar una célula vegetal con el vector de expresión para formar una planta transgénica; hacer crecer la planta transgénica y seleccionar aquellas plantas transgénicas que tengan un rendimiento aumentado. Los genes que producen una planta transgénica con rendimiento aumentado se seleccionan para desarrollo adicional de plantas transgénicas. Los genes que se pueden utilizar en el método de la presente incluyen, por ejemplo, de manera enunciativa: el gen CAP (proteína ciclasa-asociada) el gen histona deacetilasa 1 de arroz, el gen E2Fc, el gen BKI, el gen BRI1, el gen ARL (Argos-Like) , el gen BRI1 (percepción de la hormona brassinoesteroidea ) , el gen FATB, el gen de Pepino, el gen RGS (regulador de la señalización de proteína G) el gen TIP1, el gen BB (Big Brother) , el gen RHD2, el gen INCW2, el gen MN1 , el gen WAK2, el gen WAK4, el gen AP2 y lo semejante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1, representa los perfiles de expresión de los promotores embrión-específicos durante el desarrollo embrionario temprano. Las fases aproximadas en el desarrollo embrionario de Arabidopsis: globular temprano = 2 días después de la polinización (DAP, por sus siglas en inglés), corazón = 4 DAP, torpedo = 6 DAP, tallo rastrero = 7 DAP, embriones de maduración temprana = 8 DAP. La Figura 2 representa una alineación de secuencias de aminoácidos de una región de factores de trascripción de la clase HD-ZIPIII, REVOLUTA y sin REVOLUTA. Esta región de la secuencia de aminoácidos contiene una diferencia característica en la secuencia de aminoácidos que define las proteínas HD-ZIPIII ya que pertenecen a las clases de proteínas REVOLUTA o sin REVOLUTA. La porción encuadrada de las secuencias indica el ciclo de la inserción de la secuencia de aminoácidos que define las proteínas HD-ZIPIII sin REVOLUTA. Las proteínas REVOLUTA se definen por la falta de una inserción de la secuencia de aminoácidos. Athb-9 { Arabidopsis; SEQ ID NO: 2); Athb-14 {Arabidopsis; SEQ ID NO: 3); REV (Arabidopsis; SEQ ID N0:4); BnLfREV (Bassica napis; SEQ ID N0:5); OsRevl {Oryza sativa; SEQ ID N0:6); ZmRLDl {Zea mayes; SEQ ID NO : 7 ) ; 0sREV2 {Oryza sativa; SEQ ID NO:8); Athb-15 {Arabidopsis; SEQ ID NO: 9); y Athb-8 (Arabidopsis; SEQ ID NO: 10) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los métodos y composiciones útiles para producir plantas que tengan un tamaño aumentado de semillas y/o número aumentado de semillas en comparación con una planta tipo silvestre. En particular, los métodos comprenden la sobre-expresión de un gen implicado en un crecimiento y/o desarrollo de plantas en un embrión de una planta, en donde la sobre-expresión del transgen da por resultado en un aumento en el tamaño de la semilla y/o un aumento en el número de semillas en la planta. En una modalidad particular, se sobre-expresó el gen REVOLUTA (REV) . El transgen REV en los métodos de la presente invención está bajo la regulación de un promotor que inicia la expresión durante el desarrollo embrionario y en particular inicia la expresión de durante el desarrollo embrionario fase-especifico temprano. Inesperadamente, la sobre-expresión del transgen REV en el desarrollo embrionario en etapa temprana dio por resultado en semillas más grandes y mayor número. Como un primer intento para determinar si el tamaño de la semilla se podría aumentar a través de la sobre-expresión de un gen implicado en el crecimiento y/o desarrollo de plantas, el gen REV se dirigió a la semilla, se probó una estructura del transgen REV que comprende un promotor embrionario-específico para impulsar la expresión REV. La disponibilidad de un número de promotores embrionarios-específieos con los perfiles de expresión bien caracterizados durante el desarrollo embrionario de Arabidopsis hizo posible crear plantas transgénicas en las cuales la sobre-expresión REV se dirigió a diversas y diferentes fases traslapantes del desarrollo embrionario. Las estructuras del transgen REV de Arabidopsis se introdujeron en cañóla para prueba. El motivo principal para ir directamente a cañóla fue que el genoma de Arabidopsis está relacionado muy estrechamente con cañóla de tal forma que se determinaron las características de expresión conocidas de los promotores en Arabidopsis lo cual probablemente se podría llevar a cabo para cañóla y cañóla es una especie de cultivos. La demostración de un efecto sobre el tamaño de la semilla en cañóla podría tener una relevancia agrícola directa. En un segundo ejemplo, el REV de Arabidopsis En el sentido en el que se utiliza en la presente, un gen relacionado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas es un gen que desempeña una función en la determinación de la velocidad de crecimiento, tamaño total, tamaño de tejido o número de tejidos de una planta o desempeña una función en el programa para desarrollo de plantas que conduce a la determinación de la identidad y morfología de tejidos. Estos genes relacionados con el crecimiento y desarrollo se identifican cuando la modificación de su función por mutación, sobre-expresión, o supresión de la expresión da por resultado en una velocidad alterada del crecimiento de la planta, el tamaño total de la planta, el tamaño o número de tejidos, o un desarrollo alterado. La planta y los genes relacionados con el crecimiento pueden ejercer sus efectos a través de varios mecanismos, algunos de los cuales incluyen la regulación del ciclo celular, las trayectorias de síntesis/descomposición de hormonas vegetales, la sensibilidad a hormonas vegetales, la biosíntesis de la pared celular, la determinación de la identidad celular, y lo semejante.

Varios genes vegetales se han mostrado mediante la sobre-expresión o análisis de supresión para desempeñar funciones en el crecimiento y/o desarrollo. Los ejemplos de algunos, aunque no todos, de los genes que se sabe que están implicados en el crecimiento y/o desarrollo y que se pueden utilizar o probar en los métodos de la presente invención se analizarán en la presente más adelante. El gen CAP de Arabidopsis codifica para una proteina ciclasa-asociada que está implicada en la señalización Ras-cAMP y la regulación del citoesqueleto de actina. La sobre-expresión de CAP bajo un promotor glucocorticoide inducible provoca una pérdida de los filamentos de actina y una reducción en el tamaño de las hojas debido al alargamiento reducido de células epidérmicas y de mesófilos (Barrero et al., Annals of Botany 91:599-603, 2003). La supresión de la expresión del gen de sacarosa sintasa en algodón conduce a una longitud de fibra celular reducida y células de fibra más pequeña y en menor número (Yong-Ling Rúan et al., Plant Cell 15:952-964, 2003). La sobre-expresión del gen histona deacetilasa 1 de arroz con un promotor ABA inducible en arroz transgénico, dio por resultado en plantas con un aumento en la velocidad de crecimiento y el desarrollo de brotes y tejido de raiz anormal en comparación con el tipo silvestre (In-Cheol Jang et al., Plant J. 33:531 -541, 2003) . La supresión de E2Fc mediante ARNi en Arabidopsis aumenta la actividad proliferativa en hojas, meristemas, y células periciclo. Las células en órganos fueron más pequeñas aunque más numerosas que el tipo silvestre y hubo un nivel reducido de ploidia en las hojas (del Pozo et al., Plant Cell 18:2224-2235, 2006). La supresión del gen BKI mediante ARNi dio por resultado plántulas con longitudes aumentadas de hipocótilos y la sobre-expresión de BKI proporcionó plantas enanas (Xuelu and Chory, Science 313:1118-1122, 2006). Las plantas transgénicas que expresan un receptor BRI1 esteroideo parcialmente constitutivo tuvieron hipocótilos mayores ( ang et al., Dev. Cell 8:855-865, 2005). La supresión de Argos-Like (ARL) en Arabidopsis proporcionó hipocótilos, hojas y otros órganos laterales más pequeños, mientras que la sobre-expresión proporcionó el efecto opuesto. El cambio en el tamaño de los órganos se puede atribuir al tamaño de la célula en lugar del número de células (Hu et al., Plant J. 47 : 1-9, 2006) . El análisis de plantas con mutaciones que resultan en fenotipos de crecimiento y/o desarrollo alterado tuvo un número de genes identificados que desempeña funciones en el crecimiento y desarrollo de la planta. Una mutación que afecta la percepción de la hormona brassinoesteroidea, BRI1-5, dio por resultado en una planta enana (Wang et al., Dev. Cell 8:855-865, 2005).

Una inserción de T-ADN (uno inactivo) en el gen FATB de Arabidopsis que codifica para una tioesterasa de la proteina portadora acilo-acilo conduce a una velocidad reducida de crecimiento, peso en fresco reducido y baja viabilidad de semillas (Bonaventure et al., Plant Cell 15:1020-1033, 2003). Una mutación de la pérdida de función en Pepino, una anti-fosfatasa putativa, exhibió una proliferación celular similar a tumor en el meristema apical del brote y produjo hojas anormales supernumerarias (Haberer et al., Dev. Genes Evol. 212:542-550, 2002). El gen RGS de Arabidopsis (regulador de señalización de la proteina G) tuvo la estructura de un receptor acoplado con la proteina G (GPCR, por sus siglas en inglés) y contuvo un cuadro RGS. Las proteínas RGS aceleran la desactivación de la subunidad Ga y de esta forma reducen la señalización GPCR. El mutante rgs nulo tuvo un alargamiento aumentado de células en el crecimiento de hipocótilos en la oscuridad y una producción aumentada de células en raíces que crecieron en la luz (Chen et al., Science 301:1728-1731, 2003) . El gen TIP1 de Arabidopsis desempeña una función en el desarrollo piloso de la raíz y también en crecimiento celular. El mutante tipl-2 tiene rosetas más pequeñas, altura reducida e internodos más cortos (Ryan et al., New Phytol. 138:49-58, 1998 y Hemsley et al., Plant Cell 17:2554-2563, 2005). Los mutantes (redisposición cromosómica de la inserción de T-ADN) del gen Big Brother (BB) que proporcionó muy poco o ningún ARNm Big Brother desarrollaron órganos florales más grandes, más biomasa de flores y tallos más gruesos. Por el contrario, la sobre-expresión de Big Brother condujo a órganos florales más pequeños, menor biomasa de flores, tallos más delgados y tamaño reducido de hojas. BB, se puede alterar el número de células (Disch et al., Curr. Biol. 16:272-279, 2006). El gen RHD2 que codifica para una NADPH oxidasa importante para la acumulación de especies oxigeno reactivas en vellos de la raíz y la activación posterior de canales de calcio. El mutante rhd2 tiene defecto en la expansión celular de la células de crecimiento en punta de la raiz (Foreman et al., Nature 422:442-446, 2003). La mutación en miniatura de maíz provoca una pérdida en la invertasa de pared celular, expresada en el gen INCN2. Las células del mutante mnl son más pequeñas que el tipo silvestre y los mutantes de la semilla mnl sólo tuvieron el 20% del peso endospérmico de las semillas tipo silvestre. La expansión se puede comprometer en las células de las capas periféricas del endosperma mnl y puede conducir a una actividad mitótica disminuida de estas células (Vilhar et al., Plant Physiol. 129:23-30, 2002). Un mutante para inserción de T-ADN de WAK2, wak2-l, tuvo un alargamiento disminuido en células en las raices. WAK2 puede controlar la expansión celular a través de la regulación de la actividad de invertasa vacuolar. La expresión de un antisentido inducible de WAK2 o NAK4 en plantas evita el alargamiento celular y produce plantas enanas (Wagner y Kohorn, Plant Cell 13:303-318, 2001, Lally et al., Plant Cell 13:1317-1331, 2001, y Kohorn et al., Plant J. 46:307-316, 2006). El gen AP2 de Arabidopsis desempeña una función en la identidad de los órganos florales y el establecimiento de la identidad del meristema floral. Las mutaciones para pérdida de función en AP2 proporcionan una masa aumentada de semilla en comparación con el tipo silvestre (Masa-Ohto et al., Proc. Nat'l. Acad. Sel. USA 102:3123-3128, 2005). Los mutantes teb tienen raíces cortas, hojas aserradas, y fasciación. Los mismos muestran defectos en la división celular que se pueden provocar por un defecto en la progresión del ciclo celular G2/M (Inagaki et al., Plant Cell 18:879-892, 2006). Los términos "gen de crecimiento y/o desarrollo" o "transgen de crecimiento y/o desarrollo" se utilizan en la presente para dar a entender cualquier secuencia de polinucleótidos que codifique o facilite la expresión y/o producción de un nucleótido o proteína codificados por el gen. De esta forma, los términos "gen de crecimiento y/o desarrollo" o "transgen de crecimiento y/o desarrollo" pueden incluir secuencias que flanqueen las secuencias que codifican para nucleótidos y/o proteínas. Por ejemplo, las secuencias pueden incluir aquellas secuencias de nucleótidos que sean secuencias para codificación de proteínas (exones) , secuencias interpuestas (intrones) , las regiones de flanqueo de ADN 5' y 3' que contienen las secuencias requeridas para la expresión normal del gen (es decir, el promotor y las regiones de adición de polyA, respectivamente, y cualesquiera secuencias intensificadoras ) . Los términos "proteína de crecimiento y/o desarrollo", "homólogo de crecimiento y/o desarrollo", u "ortólogo asociado con el crecimiento y/o desarrollo" se utilizan en la presente para dar a entender proteínas que tienen la capacidad de regular la velocidad de crecimiento, el tamaño total, el tamaño de tejidos o el número de tejidos de una planta o regular el programa para desarrollo de plantas que conduzca a la determinación de la identidad y morfología de tejidos (cuando se utilizan en la práctica de los métodos de la presente invención) y que tengan una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente el 70% idéntica, más típicamente al menos aproximadamente el 75% idéntica, y más típicamente al menos aproximadamente el 80% idéntica a las secuencias de aminoácidos para el gen . En el sentido en el que se utiliza en la presente, un "gen embrionario-específico" es un gen que de preferencia se expresa durante el desarrollo embrionario en una planta. Para los fines de la presente exposición, el desarrollo embrionario inicia con la primera de las divisiones celulares en el cigoto y continúa a través de la última fase del desarrollo embrionario (caracterizado por la maduración, desecación, inactividad) , y termina con la producción de una semilla madura y desecada. Los genes embrionarios-especificos se pueden clasificar adicionalmente como "específicos en fase temprana" y "específicos en fase tardía". Los genes específicos en fase temprana son aquellos expresados en embriones hasta el final de la morfogénesis embrionaria. Los en fase específica tardía son aquellos expresados desde la maduración a través de la producción de una semilla madura y desecada. Los ejemplos de genes embrionario-específieos que inician la expresión durante el desarrollo embrionario temprano y son fase-específico tempranos se presentan en la Figura 1. Una "secuencia heteróloga", es una secuencia de oligonucleótidos que se origina de una especie diferente, o, si forma la misma especie, se modifica sustancialmente desde su forma original. Por ejemplo, un promotor heterólogo vinculado operablemente a un gen estructural es de una especie diferente de aquella de la cual se deriva el gen estructural, o, si proviene de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original. El término "vector", se refiere a una porción de ADN, típicamente de doble cadena, que se puede haber insertado en su porción de ADN extraño. El vector o replicón pueden ser por ejemplo, de origen plásmido o viral. Los vectores contienen secuencias de polinucleótidos con "replicones" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula hospedera. El término "replicón" en el contexto de esta exposición también incluye las regiones de la secuencia de polinucleótidos que se dirigen o de otra manera facilitan la recombinación de las secuencias de vectores en un cromosoma hospedero. Además, mientras que el ADN extraño se puede insertar inicialmente en, por ejemplo, un vector del virus con ADN, la transformación del ADN del vector viral en una célula hospedera puede dar por resultado en la conversión del ADN viral en una molécula del vector de ARN viral. El ADN extraño se define como ADN heterólogo, el cual es un ADN no encontrado naturalmente en la célula hospedera, la cual, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica para un marcador o transgén seleccionable . El vector se utiliza para transportar el ADN extraño o heterolólogo en una célula hospedera adecuada. Una vez en la célula hospedera, el vector se puede replicar independientemente o en coincidencia con el ADN cromosómico hospedero, y se pueden generar varias copias del vector y su ADN insertado. Alternativamente, el vector puede dirigir la inserción del ADN extraño o heterólogo en un cromosoma hospedero. Además, el vector también puede contener los elementos necesarios que permitan la trascripción del ADN insertado en una molécula de ARNm o de otra manera provocar la replicación del ADN insertado en las múltiples copias de ARN . Algunos vectores de expresión adicionalmente contienen elementos de secuencia adyacentes al ADN insertado que permiten la traducción del ARNm en una molécula proteinica. Muchas moléculas del ARNm y el polipéptido codificado por el ADN insertado de esta forma se pueden sintetizar rápidamente. El término "vector transgen", se refiere a un vector que contiene un segmento insertado de ADN, el "transgen", que se transcribe en el ARNm o se replica como un ARN dentro de una célula hospedera. El término "transgen" se refiere no sólo a aquella porción de ADN insertado que se convierte en ARN, sino que también aquellas porciones del vector que son necesarios para la trascripción o r.eplicación del ARN. Además, una transgen no necesariamente comprende una secuencia de polinucleótidos que contenga un marco de lectura abierto capaz de producir una proteina. Los términos "célula hospedera transformada", "transformado" y "transformación", se refieren a la introducción de ADN en una célula. La célula se denomina una "célula hospedera", y puede ser una célula procariota o eucariota. Las células hospederas procariotas típicas incluyen diversas cepas de E. coli. Las células hospederas eucariotas típicas son células vegetales (por ejemplo, células de cañóla, algodón, camelina, alfalfa, soya, arroz, avena, trigo, cebada, o maíz, y lo semejante) , células de levadura, células de insecto, o células animales. El ADN introducido usualmente está en la forma de un vector que contiene una porción insertada de ADN. La secuencia de ADN introducida puede ser de la misma especie que la célula hospedera o de una especie diferente de la célula hospedera, o puede ser una secuencia de ADN híbrido, que contenga algún ADN extraño o algún ADN derivado de la especie hospedera. El término "planta", incluye plantas enteras, órganos de plantas, (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raíces, y lo semejante) , semillas y células vegetales (incluyendo células para cultivo de tejidos) y progenie de los mismos. La clase de plantas que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención en general es tan amplia como la clase de plantas mayores sujetas a técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, así como también ciertas plantas inferiores tales como, algas. Se incluyen plantas de una variedad de niveles de ploidia, incluyendo poliploidia, diploide y haploide. Una "secuencia heteróloga" es una que se origina de una especie extraña, o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original. Por ejemplo, un promotor heterólogo vinculado operablemente a un gen estructural proveniente de una especie diferente de las que se deriva el gen estructural, o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original. Los términos "gen REVOLUTA" o "transgen REVOLUTA", en el sentido en el que se utilizan en la presente, significan cualquier secuencia de polinucleotidos que codifica o facilita la expresión y/o producción de una proteina REVOLUTA. De esta forma, los términos "gen REVOLUTA" o "transgen REVOLUTA" pueden incluir secuencias que flanquean las secuencias que codifican para la proteina REVOLUTA. Por ejemplo, las secuencias pueden incluir aquellas secuencias de nucleótidos que son secuencias codificantes de proteínas (exones) , secuencias intermedias (intrones), las regiones de flanqueo de ADN 5' y 3' que contienen las secuencias requeridas para la expresión normal del gen REVOLUTA (es decir, el promotor y las regiones de adición polyA, respectivamente, y cualesquiera secuencias intensificadoras) .

Los términos "proteína REVOLUTA", "homólogo REVOLUTA" o "ortólogo REVOLUTA", en el sentido en el que se utilizan en la presente, significan una proteína que tienen la capacidad de regular la división celular de plantas (cuando se utiliza en la práctica de los métodos de la presente invención) y que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70% idéntica, más típicamente al menos aproximadamente el 75% idéntica, y más típicamente al menos aproximadamente el 80% idéntica a las secuencias de aminoácidos para REVOLUTA descritas en WO 01/33944 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . Alternativamente, los términos "proteína REVOLUTA" "homólogo REVOLUTA", u ortólogo REVOLUTA" se utilizan en la presente para dar a entender proteínas REVOLTA que se identifican como distintas de los miembros sin REVOLUTA de la clase HD-ZIPIII de factores para trascripción de plantas. Los miembros REVOLUTA de la clase HD-ZIPIII de proteínas se caracterizan por la falta o ausencia de una inserción de las secuencias de aminoácidos característica que está presente en proteínas HD-ZIPIII sin REVOLUTA entre los residuos del aminoácido 146 y 147 de la secuencia de aminoácidos REVOLUTA descrita en la WO 01/33944 y como se muestra en la Figura 2. En la Figura 2, los factores de trascripción Homeobox provenientes de Arabidopsis thaliana designados athb-8, athb-9, athb-14 y athb-15 son proteínas HD-ZIPIII sin REVOLUTA y todas tienen una inserción de secuencias de aminoácidos característica entre los aminoácidos 146 y 147 de la secuencia de aminoácidos REVOLUTA. Las cinco secuencias REVOLUTA de la Figura 2, todas carecen de una inserción de aminoácidos en su ubicación en la secuencia de aminoácidos REVOLUTA. La falta de esta inserción de la secuencia de aminoácidos es una característica distintiva y determinativa de las proteínas REVOLUTA. El término "identidad porcentual", significa el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que ocupan la misma posición relativa cuando dos secuencias de aminoácidos, o dos secuencias de ácido nucleico se alinean lado a lado utilizando un programa de computadora tal como, uno identificado más adelante. El término "similitud porcentual", es una medición estadística del grado de conexidad de dos secuencias proteínicas comparadas. La similitud porcentual se calcula mediante un programa de computadora que asigna un valor numérico a cada par comparado de aminoácidos con base en la similitud química (por ejemplo, ya sea que los aminoácidos comparados sean ácidos, básicos, hidrofílicos, aromáticos, y lo semejante) y/o la distancia de evolución como se mide por el número mínimo de cambios de pares de base que se podrían requerir para convertir un codon que codifica para un miembro de un par de aminoácidos comparados para un codon que codifica para el otro miembro del par. Los cálculos se realizan después de una mejor alineación de ajustes de las dos secuencias que se haya hecho empíricamente mediante comparación iterativa de todas las alineaciones posibles. (Véase por ejemplo, Henikoff et al., Proc. Nati. Acad. Scí. USA 89:10915 - 10919, 1992). El término "identidad sustancial", de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia, típicamente al menos el 70%, más típicamente al menos el 80% y más típicamente al menos el 90%, en comparación con una secuencia de referencia que utiliza los programas descritos más adelante utilizando parámetros estándar. Alguien con experiencia reconocerá que estos valores se pueden ajustar adecuadamente para determinar la identidad de proteínas correspondiente codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y lo semej ante . La identidad de la de secuencia de aminoácidos se puede determinar, por ejemplo, de la siguiente forma. La porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo, por ejemplo, REVOLUTA, se puede utilizar para buscar una base de datos de secuencias de ácido nucleico, tal como la base de datos GenBank®, utilizando el programa BLASTP versión 2.0.9 (Atschul et al., Nucí. Acid. Res. 25:3389-3402, 1997). Las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos se realizan típicamente al comparar las secuencias de las dos secuencias sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de la similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, usualmente entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200, más usualmente entre aproximadamente 100 hasta aproximadamente 150 en el cual se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinearon óptimamente las dos secuencias. La alineación óptima de la secuencia para comparación se puede conducir mediante identidad local o algoritmos de similitud tales como aquellos descritos en Smith et al., Adv. Appl . Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970, mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en la isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), o mediante inspección visual. Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones por pares, progresivas, para mostrar la relación e identidad de secuencia porcentual. También se gráfica un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng et al. J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987. El método utilizado es similar al método descrito por Higgins et al., CABIOS 5:151-153, 1989. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5,000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento para alineación múltiple inicia con la alineación por pares de las secuencias más relacionadas. Este agrupamiento luego se alinea a la siguiente secuencia más relacionada o al agrupamiento de secuencias alineadas. Dos agrupamientos de secuencias se alinean mediante una simple extensión de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se alcanza mediante una serie de alineaciones por pares progresivas. El programa se corre al designar secuencias especificas y sus coordinados de nucleótidos o aminoácidos para regiones de comparación de secuencias y al designar los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia se puede comparar con otras secuencias de prueba para determinar la relación de la identidad de secuencias porcentuales utilizando los siguientes parámetros: ponderación de separación por omisión (3.00), ponderación de longitud de separación por omisión (0.10), y separaciones finales ponderaciones. Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencias porcentuales y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. El software para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del sitio web National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencia con marca alta (HSP, por sus siglas en inglés) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrelación, lo cual ya sea coincide o satisface algún umbral valuado positivo marca T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. t, se denomina como el umbral de marca de palabra de proximidad (Altschul et al., supra) . Estos aciertos de palabras de proximidad iniciables actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSP más largos que las contienen. Los aciertos de palabras luego se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para que se pueda aumentar la marca de alineación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la marca de alineación acumulativa se desprende por la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la marca acumulativa va a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo con marca negativa; o al final de cualquier secuencia alcanzada. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como omisiones una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de marca BLOSUM62 (véase, Henikoff et al,. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992) las alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Además de calcular la identidad de secuencia porcentual, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993). Una medición de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)) que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual podría presentarse por oportunidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una prueba de comparación es menor a aproximadamente 0.1, de mayor preferencia menor a aproximadamente 0.01, y con la máxima preferencia menor a aproximadamente 0.001. Son bien conocidos por los expertos, los métodos adicionales y algoritmos para la alineación de secuencias y el análisis de la similitud de secuencias. En el caso donde la secuencia de polinucleótidos insertada se transcriba y traduzca para producir un polipéptido funcional, alguien con experiencia reconocerá que debido a la degeneración de codones varias de las secuencias de polinucleótidos codificarán para el mismo polipéptido. Estas variantes se cubren específicamente por los términos "gen de crecimiento y/o desarrollo" y "transgen de crecimiento y/o desarrollo", y específicamente "gen REVOLUTA" y "transgen REVOLUTA". Además, estos términos incluyen específicamente aquellas secuencias de longitud total prácticamente idénticas con una secuencia de genes y que codifica para una proteína que conserva la función del producto génico, por ejemplo, REVOLUTA. Dos secuencias de ácido nucleico o polinucleótidos se dice que serán "idénticos" si las secuencias de nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia como se describió anteriormente. El término "complementario a", en el sentido en el que se utiliza en la presente, significa que la secuencia complementaria es idéntica a la totalidad o una porción de la secuencia del polinucleótido de referencia. Variaciones y alteraciones en la secuencia de aminoácidos del gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo y la proteina asociada con el crecimiento y/o desarrollo, por ejemplo, el gen REVOLUTA y la secuencia de la proteina REVOLUTA se describe en la WO 01/33944, incorporada en la presente como referencia. El gen de interés, tal como, el gen REVOLUTA, la secuencia de polinucleótidos o polinucleótidos se puede aislar u obtener de cualquier especie vegetal. En una modalidad particular de la presente invención la secuencia de genes REVOLUTA utilizada es aquella de Arabidopsis thaliana , aunque también se puede utilizar el gen REVOLUTA proveniente de otras especies de interés. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos para REVOLUTA proveniente de maíz (Zea mays) se describe en la WO 2004/063379 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . Los términos "actividad biológica", "biológicamente activo", "actividad", "activo", "función biológica", "actividad biológica REV", y "funcionalmente activo", se refiere a la capacidad de la proteina de interés, tal como, las proteínas REVOLUTA para dimerizarse (o de otra manera ensamblarse en oligómeros proteínicos ) , o la capacidad para modularse o de otra manera llevar a cabo la dimerización de la proteína REVOLUTA tipo silvestre natural (por ejemplo, endógena) . Sin embargo, los términos también pretenden abarcar la capacidad de una proteína de interés, tal como la proteína REVOLUTA, para unirse y/o interactuar con otras moléculas, incluyendo por ejemplo, de manera enunciativa: las secuencias de nucleótidos específicos que contienen ADN en las regiones promotoras reconocidas por la proteína, por ejemplo, la proteína REVOLUTA, y las cuales mediante casos de unión y/o interacción proporcionan una división celular en las plantas y por último confieren un fenotipo, o la capacidad de modular o de otra manera llevar a cabo la unión y/o interacción de otras moléculas con la proteína tipo silvestre natural y que con los casos de unión y/o interacción proporcionan una división celular en las plantas y por último confieren un fenotipo asociado con el gen de interés. El fenotipo REV, en el sentido en el que se utiliza en la presente, pretende hacer referencia a un fenotipo conferido por un ácido nucleico REV o proteina y en particular abarca la característica en donde se exhibe el tamaño de la semilla o número de semilla. Típicamente, un fenotipo REV se determina mediante el examen de un REV que sobre-expresa en plantas durante el desarrollo embrionario fase-específico temprano en donde el número y tamaño de semillas proveniente de las plantas se puede comparar con el número y tamaño de semillas en los tejidos correspondientes de una planta original o tipo silvestre. Las plantas que tienen el fenotipo REV tienen un cambio estadísticamente significativo en el número y/o tamaño de las semillas dentro de un número representativo de una población de plantas. Un promotor adecuado para ser vinculado operativamente a un gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas y expresado utilizando los métodos descritos de la presente invención, típicamente tiene una mayor expresión en los embriones y una menor o ninguna expresión en otros tejidos vegetales. De particular interés son aquellas secuencias de promotores que inician la expresión en el desarrollo embrionario fase-específico temprano. Un promotor fase-específico temprano es un promotor que inicia la expresión de una proteina antes del dia 7 después de la polinización (tallo rastrero) en Arabidopsis o una etapa equivalente en otra especie de planta. Los ejemplos de secuencias promotoras de particular interés incluyen un promotor para el gen de permeasa con aminoácidos (AAP1) (por ejemplo, el promotor AAP1 de Arabidopsis thaliana) (Hirner et al., Plant J. 14:535-544, 1998), un promotor para el gen oleato 12-hidroxilasa : desaturasa (por ejemplo, el promotor designado LFAH12 de Lesquerella fendleri) (Broun et al., Plant J. 13:201-210, 1998), un promotor para el gen 2S2 albúmina {por ejemplo, el promotor 2S2 proveniente de Arabidopsis thaliana) (Guerche et al., Plant cell 2:469-478, 1990), un promotor del gen de elongasa con ácido graso (FAE1) (por ejemplo, el promotor FAE1 proveniente de Arabidopsis thaliana) (Rossak et al., Plant Mol. Biol. 46:717-715, 2001) , y el promotor génico de cotiledónea con forma de hoja (LEC2) (por ejemplo, el promotor LEC2 proveniente de Arabidopsis thaliana) (Kroj et al. Development 130:6065-6073, 2003) . Otros promotores embrionario-especificos tempranos de interés incluyen, de manera enunciativa: Seedstick (Pinyopich et al., Nature 424:85-88, 2003), Fbp7 y Fbpl 1 (Petunia Seedstick) (Colombo et al., Plant Cell. 9:703-715, 1997), Banyuls (Devic et al., Plant J. 19:387-398, 1999), agl-15 y agl-18 (Lehti-Shiu et al., Plant Mol.

Biol. 58:89-107, 2005), Phel (Kohler et al . , Genes Develop. 17:1540-1553, 2003), Perl (Haslekas et al . , Plant Mol. Biol. 36:833-845, 1998; Haslekas et al., Plant Mol. Biol. 53:313-326, 2003), embl75 (Cushing et al., Planta 221:424-436, 2005), Lll (Kwong et al., Plant Cell 15:5-18, 2003), Lecl (Lotan et al., Cell 93:1195-1205, 1998), Fusca3 (Kroj et al., Development 130:6065-6073, 2003), ttl2 (Debeaujon et al., Plant Cell 13:853-871, 2001), ttl6 (Nesi et al., Plant Cell 14:2463-2479, 2002), A-RZf (Zou and Taylor, Gene 196:291-295, 1997), TtGl (Walker et al., Plant Cell 11:1337-1350, 1999; Tsuchiya et al., Plant J. 37:73-81, 2004), Ttl (Sagasser et al., Genes Dev. 16:138-149, 2002), TT8 (Nesi et al., Plant Cell 12:1863-1878, 2000), Gea-8 (carrot) (Lin and Zimmerman, J. Exp. Botany 50:1139-1147, 1999), Knox (rice) ( Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39:257-271, 1999), Oleosin (Plant et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205, 1994; Keddie et al., Plant Mol. Biol. 24:327-340, 1994), ABI3 (Ng et al., Plant Mol. Biol. 54:25-38, 2004; Parcy et al., Plant Cell 6:1567-1582, 1994), y lo semejante. Los promotores adecuados para utilizarse en la presente invención se pueden utilizar ya sea a partir de la misma especie de planta que será transformada pueden ser de una especies heteróloga. Además, el promotor puede provenir de la misma especies que el transgen REV que se utilizará o puede provenir de una especie heterologa. Los promotores para utilizarse en los métodos de la presente invención también pueden comprender un promotor quimérico que puede incluir una combinación de promotores que tengan un perfil de expresión en común con uno o más de aquellos descritos anteriormente. En una modalidad de la presente invención, el promotor del gen AAP1 proveniente de Arabidopsis thaliana se combinó con el gen REV de Arabidopsis thaliana que se utilizó para construir cañóla transgénica (Brassica napus) . Además, en una modalidad adicional de la presente invención, el promotor LFAH12 del gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri se vinculó operativamente con el gen REV de Arabidopsis thaliana y se utilizó para construir la cañóla transgénica {Brassica napus) . Cada una de las plantas transgénicas anteriores demostró el fenotipo REV característico de los métodos de la presente invención en donde REV se sobre-expresa en el desarrollo embrionario temprano dando por resultado en tamaño aumentado de semillas y/o número de semillas. Se debe observar que los promotores fase-específicos tempranos descritos anteriormente son sólo promotores representativos que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención. Los métodos para identificar y caracterizar regiones promotoras en ADN genómico de plantas son bien conocidos por los expertos e incluye, por ejemplo, aquellos descritos por Jordano et al., Plant Cell 1:855-866, 1989; Bustos et al, Plant Cell 1:839-854, 1989; Green et al, EMBO J. 7:4035-4044, 1988; Meier et al., Plant Cell 3:309-316, 1991; y Zhang et al, Plant Physiol. 110:1069-1079, 1996. Las plantas transgénicas que sobre-expresan REV en embriones en fase temprana se pueden obtener, por ejemplo, al transferir vectores transgénicos (por ejemplo, plásmidos, virus, y lo semejante) que codifiquen para un promotor embrionario fase-especifico temprano vinculado operativamente con un gen que codifica para REVOLUTA en una planta. Típicamente, cuando el vector es un plásmido, el vector también incluye un gen marcador seleccionable, por ejemplo, el gen de kanamicina que codifica para resistencia a kanamicina. El método más común para la transformación de plantas se realiza al clonar un transgen blanco en un vector para transformación de plantas que luego se transforma en Agrobacterium tumifaciens que contiene un plásmido Ti auxiliar como se describe en Hoeckeme et al., {Nature 303:179-181, 1983). Métodos adicionales se describen por ejemplo en, Maloney et al., Plant Cell Report 8:238, 1989. Las células de Agrobacterium que contienen el vector transgénico se pueden incubar con trozos de hojas de la planta que será transformada como se describe por An et al., (Plant Physiol. 81:301-305, 1986; Hooykaas, Plant Mol. Biol. 13:327-336, 1989). La transformación de células hospederas de plantas cultivadas típicamente se lleva a cabo a través de Agrobacterium tumifaciens, como se describió anteriormente. Los cultivos de células hospederas que no tienen barreras de membrana celular rígida usualmente se transforman utilizando el método de fosfato de calcio como se describió originalmente por Graham et al., {Virology 52:546, 1978) y se modificaron como se describe en Sambrook et al,. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY) . Sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos para introducir ADN en células tales como, Polybrene (Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 4:1172, 1984), fusión de protoplastos (Schaffner, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:2163, 1980), electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1:841, 1982), y microinyección directa en núcleos (Capecchi, Cell 22:479, 1980). Los callos de plantas transformadas se pueden seleccionar a través del marcador seleccionable al hacer crecer las células en un medio que contiene, por ejemplo, kanamicina, y cantidades adecuadas de fitohormonas tales como, ácido acético con naftaleno y benciladenina para inducción de callos y raíces. Las células vegetales entonces se pueden regenerar y las plantas resultantes se pueden transferir al suelo, utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en este campo. Además de los métodos descritos anteriormente, una gran cantidad de métodos son bien conocidos en la técnica para transferir ADN clonado en una amplia variedad de especies vegetales, incluyendo gimnoespermas, angioespermas , monocotiledóneas y dicotiledóneas (véase, por ejemplo, Glick and Thompson, eds . , Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Ratón, Florida, 1993; Vasil, Plant Mol. Biol, 25 :925- 937 , 1994; y Komai et al., Current Opinions Plant Biol. 1:161-165, 1998 (revisión general); Loopstra et al., Plant Mol. Biol. 15:1-9, 1990; y Brasileiro et al., Plant Mol. Biol. 17:441-452, 1990 (transformación de árboles); Eimert et al., Plant Mol. Biol. 19:485-490, 1992 (transformación de Brassica) ; Hiei et al, Plant J. 6:271- 282, 1994; Hiei et al., Plant Mol, Biol. 35:205-218, 1997; Chan et al., Plant Mol. Biol. 22:491-506, 1993; las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,516,668 y 5,824,857 (transformación de arroz); y las patente de los Estados Unidos Nos. 5,955,362 (transformación de trigo); 5,969,213 (transformación monocotiledónea) ; 5,780,798 (transformación de maíz); 5,959,179 y 5,914,451 (transformación de soya). Los ejemplos representativos incluyen absorción de ADN facilitada por electroporación mediante protoplastos (Rhodes et al., Science 240:204-207, 1988; Bates, Meth. Mol. Biol. 111:359-366, 1999; D'Halluin et al., Meth. Mol. Biol. 111:367-373, 1999; patente de los Estados Unidos No. 5,914,451); tratamiento de protoplastos con polietilenglicol (Lyznik et al., Plant Mol. Biol. 13:151-161, 1989; Datta et al., Meth. MoL Biol., 111:335-334, 1999) ; y bombardeo de células con microproyectiles cargados con ADN (Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444, 1989; Boynton et al., Science 240:1534-1538, 1988; Register et al., Plant Mol. Biol. 25:951-961, 1994; Barcelo et al., Plant J. 5:583-592, 1994; Vasil et al., Meth. Mol. Biol. 111:349-358, 1999; Christou, Plant Mol. Biol. 35:197-203, 1997; Finer et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:59-80, 1999) . Adicionalmente, las estrategias y técnicas para transformación de plantas se revisan en Birch, Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 48:297, 1997; Forester et al., Exp. Agrie. 33:15-33, 1997. Variaciones menores hacen que estas tecnologías sean aplicables a una amplia gama de especies de vegetales. En el caso de transformación de monocotiledóneas, el bombardeo de partículas típicamente es el método de elección. Sin embargo, las monocotiledóneas tales como, maíz también se pueden transformar al utilizar métodos para transformación de Agrobacterium como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,591,616. Otro método para llevar a cabo la transformación de monocotiledóneas, por ejemplo, maíz, mezclas de células provenientes de cultivos en suspensión embriogénica con una suspensión de fibras (5% p/v, filamentos Silar SC-9) y ADN de plásmido (1 µg/ul) y que luego se coloca ya sea vertical en un cabezal para muestras múltiples en una mezcladora de agitación rotacional Vórtex GENIE II (Scientific, Industries, Inc., Bohemia, NY, USA) u horizontalmente en el soporte de una mezcladora para amalgamas dentales MIXOMAT (Degussa Canadá Ltd., Burlington, Ontario, Canadá). La transformación entonces se puede llevar a cabo al mezclar a velocidad total durante aproximadamente 60 segundos (por ejemplo, con un Vortex GENIE II) o al agitar vigorosamente a una velocidad fija durante 1 segundo (MIXOMAT) . Este proceso da por resultado en la producción de poblaciones celulares de las cuales se pueden seleccionar transformantes estables. Las plantas se regeneran a partir de los callos transformados estables y estas plantas y sus progenies se puede mostrar que mediante análisis de hibridación Southern que son transgénicas . Las ventajas principales del procedimiento son su simplicidad y bajo costo. A diferencia del bombardeo con partículas, no se requiere equipo y suministros costosos. El uso de filamentos para la transformación de células vegetales, en particular maíz, se describe por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,464,765. La patente de los Estados Unidos No. 5,968,830 describe los métodos para transformar y regenerar soya. La patente de los Estados Unidos No. 5,969,215 describe las técnicas de transformación para la producción de plantas Beta vulgaris transformadas, tales como, remolacha. Cada una de las técnicas de transformación anteriores tiene ventajas y desventajas. En cada una de las técnicas, el ADN proveniente de un plásmido se diseña mediante ingeniería genética de tal forma que contenga no sólo el gen de interés, sino que también los genes marcadores seleccionables y clasificables . Un gen marcador seleccionable se utiliza para seleccionar sólo aquellas células que tengan copias integradas del plásmido (la estructura es tal que el gen de interés y los genes seleccionables y clasificables se transfieren como una unidad) . El gen clasificable proporciona otra verificación para el cultivo exitoso de sólo aquellas células que portan los genes de interés. La transformación tradicional de Agrobacterium con marcadores seleccionables con resistencia a antibióticos puede ser problemática debido a la oposición pública de que estas plantas poseen un riesgo indebido de diseminación de la tolerancia de antibióticos a animales y seres humanos. Estos marcadores de antibióticos se pueden eliminar de las plantas mediante la transformación de plantas utilizando las técnicas de Agrobacterium similares a aquellas descritas en la patente de los Estados Unidos No. 5,731,179. Los problemas de resistencia a antibióticos también se pueden evitar efectivamente mediante el uso de secuencias de codificación en barras o paleta, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Número 5,712,135. Estos ADN marcadores preferidos codifican para segundas proteínas o polipéptidos que inhiben o neutralizan la acción de herbicidas con el inhibidor de glutamina sintasa fosfinotricina (glufosinato) y sal de glufosinato anunonio (Basta, Ignite) . El plásmido que contiene uno o más de estos genes se introduce ya sea en los protoplastos de la planta o las células callosas mediante cualquiera de las técnicas mencionadas anteriormente. Si el gen marcador es un gen seleccionable, sólo aquellas células que tienen incorporado el paquete de ADN sobreviven bajo la selección con el agente fitotóxico adecuado. Una vez que se identifican y se propagan las células adecuadas, las plantas se regeneran. La progenie de las plantas transformadas se debe probar para asegurar que el paquete de ADN se haya integrado exitosamente en el genoma de la planta. Existen muchos factores que influyen en el éxito de la transformación. El diseño y construcción de la estructura del gen exógeno y sus elementos reguladores influye en la integración de la secuencia exógena en el ADN cromosómico del núcleo de la planta y la capacidad del transgen para que se exprese por la célula. Un método adecuado para introducir la estructura del gen exógeno en el núcleo de la celular vegetal de una forma no letal es esencial. De manera importante, el tipo de célula en el cual se introduce la estructura, si se recuperarán plantas enteras, debe ser de un tipo que sea receptiva para la regeneración, dado un protocolo de regeneración adecuado. También se pueden utilizar procariotas como células hospederas para los pasos de clonación iniciales de la presente invención. Los métodos, vectores, plásmidos y sistemas de células hospederas son bien conocidos por los expertos, los cuales se pueden utilizar para estos pasos de clonación y expansión y no se describirán en la presente. En otra modalidad de la presente invención, un promotor embrionario fase-especifico temprano, se puede insertar para que se vincule operativamente a un gen que codifica para un gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas, este REV, en la planta que será transformada utilizando métodos bien conocidos por el experto. La inserción del promotor permitirá la expresión embrionaria temprana del gen, por ejemplo, REV, en las semillas en desarrollo de la planta transgénica.

Las plantas transgénicas de particular interés en los métodos de la presente invención, incluyen de manera enunciativa: monocotiledóneas y dicotiledóneas en particular provenientes de las familias Brassicacea (Cruciferae) , Gramineae, Malvaceae, o Leguminosae-Papilionoideae. Las plantas de particular interés dentro de estas familias incluyen, de manera enunciativa: cañóla, maíz, camelina, algodón, trigo, arroz, soya, cebada y otras plantas productoras de semillas, asi como también otras plantas entre las que se incluyen de manera enunciativa: alfalfa, y lo semejante, de interés agrícola que comprenden en una modalidad particular de la presente invención, un transgen REV bajo el control de un promotor embrionario fase-específico temprano. El transgen puede provenir de la misma especie que la planta transgénica, o el transgen puede provenir de una planta heteróloga. De particular interés es una planta transgénica que comprende el transgen REV proveniente de Arabidopsis . El promotor embrionario fase-específico temprano también puede provenir de la misma especie de la planta transgénica, o de una planta heteróloga. Por ejemplo, un promotor embrionario fase-específico temprano, puede provenir de la misma especie de planta que el transgen REV o incluso de otra especie de planta. De particular interés son los promotores embrionarios fase-específicos tempranos provenientes de Arabidopsis o Lesquerella fendleri , aunque el promotor fase-especifico temprano se puede obtener de otra especie de planta. Las combinaciones específicas del promotor fase-específico temprano y el transgen REV que se hayan encontrado serán adecuadas para los métodos de la presente invención e incluyen de manera enunciativa: (a) promotor LFAH 12 de Lesquerella fendleri/ REV de Arabidopsis; (b) promotor AAP1 de Arabidopsis/REV de Arabidopsis; (c) promotor LEC2 de Arabidopsis/REV de Arabidopsis; y (d) promotor 2S2 de Arabidopsis/REV de Arabidopsis . En una modalidad particular de la presente invención, estas estructuras transgénicas se han utilizado para transformar cañóla, aunque se pueden utilizar para transformar otras especies de plantas. En particular, se pueden utilizar para producir plantas transgénicas que tengan tamaño aumentado de semillas y/o número de semillas en soya, maíz, algodón, camelina, arroz, trigo, cebada, alfalfa, y otros cultivos de interés agrícola. La presente invención también proporciona los métodos para seleccionar un gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo que aumente el rendimiento de plantas. En el método, el gen de interés se asocia funcionalmente con un promotor embrionario fase-específico temprano en un plásmido o vector de expresión. El plásmido o vector de expresión que comprende el gen de interés se transfecta en una célula vegetal utilizando un método conocido en la técnica para formar una célula transgénica. La célula que comprende el transgen se hace crecer y se regenera en una planta transgénica mediante métodos conocidos, entre los que se incluyen aquellos expuestos anteriormente hasta que se obtengan plantas transgénicas . Las plantas transgénicas se observan para rendimiento aumentado en comparación con una planta tipo silvestre y aquellos genes asociados con el crecimiento y/o desarrollo que se utilizaron para obtener las plantas transgénicas con rendimiento aumentado se seleccionaron para desarrollo adicional. Las plantas transgénicas que comprenden el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo seleccionado se pueden desarrollar adicionalmente para proporcionar plantas de importancia agrícola con un mayor rendimiento que las plantas tipo silvestre. Los siguientes ejemplos se proporcionan simplemente como ilustrativos de los diversos aspectos de la invención y no se deben interpretar como limitantes de la invención de ninguna forma.

Ejemplos El siguiente ejemplo describe la construcción de diversos vectores de expresión que comprenden, un promotor embrionario fase-específico temprano y un gen con una función en el crecimiento y/o desarrollo de plantas. En particular, los promotores embrionarios específicos (a) LFAH12 de Lesquerella fendleri; (b) AAP1 de Arabidopsis; (c) LEC2 de Arabidopsis; (d) 2S2 de Arabidopsis, y (e) FAE1 de Arabidopsis se asociaron operativamente con el gen REVOLUTA (REV) de Arabidopsis y se utilizaron para producir plantas de cañóla transgénicas .

Ejemplo 1. Plantas de cañóla transgénicas que expresan estructuras transgénicas diseñadas para conferir la expresión embrionaria-especi ica de REVOLUTA La sobre-expresión constitutiva del gen REV de Arabidopsis en plantas de Arabidopsis trasngénicas dio por resultado en un tamaño aumentado de semillas con relación a las plantas de Arabidopsis tipo silvestre no trasngénicas, aunque este rasgo se acompaña por efectos pleiotrópicos negativos. Estos efectos incluyen morfología de hojas alteradas y formación reducida de brotes axilares en Arabidopsis . La morfología de hojas alteradas y el crecimiento impedido general de plantas son efectos negativos observados en cañóla transgénica que sobre- expresa el gen REV a niveles bastante constitutivos a todo lo largo de la planta. Para obtener el rasgo de tamaño aumentado de semillas mientras que se evitan los efectos no deseados en tejidos sin semilla, se puede llevar a cabo una estrategia para dirigir la sobre-expresión del transgen REV específicamente al desarrollo embrionario en la semilla. Esto se puede llevar a cabo utilizando una estructura de expresión transgénica en la cual un promotor embrionario-específico dirige la expresión del gen REV. La sobre-expresión constitutiva de otros genes vegetales similares a REV implicados en los procesos de desarrollo y crecimiento de plantas también se puede esperar razonablemente que tengan efectos pleiotrópicos negativos sobre la planta transgénica. El uso de promotores embrionarios-específieos para evaluar los genes vegetales que tienen funciones en el desarrollo y crecimiento como posibles genes para intensificar el rendimiento, ofrece un procedimiento general para evaluar estos genes vegetales para la eficacia en aumentar el rendimiento de cultivos. Se seleccionaron cinco promotores que confieren la expresión embrionaria-específica para utilizarse en las estructuras de expresión diseñadas para proporcionar la expresión transgénica de REV en embriones de cañóla {Brassica napus) durante el desarrollo embrionario temprano. Estos promotores incluyen AAP1 (gen de permeasa y aminoácido proveniente de Arabidopsis thaliana) (HimGr et al., Plant J. 14:535-544, 1998), GGTTGCATCT TTGAATACCT TTTTCTCATT TAGGCATAAC AATATAATAA TTTGTTTTTT GTTTTCATTT TCTTTTGGTG TCATCTTCAA AAATCTGTAA ACCCAAAAGT TTGTATAACT TGTTTATTAA GATATTTTTA ATTAAATTTT TTTTTTTGAC ATTTTTAAAA AATTATAAAG TGTTTTATGA ATTTAAGGAG TAAATAATAT TTATTTAGAA CACTATAAAT TAGTTTTACA AGTTCTTAGA AATGTATCTG TAAATTTCAA AAAGGAAAAA TATAGCATTT AATTTTGAAG ATTTTTTTCT ACATTATATA TATGATAAAA ATATTGTATT TTGTACTTTG TAGTTACAAA AAGTCATTAT ATCAACAAAT CTAAATATAA AATATTTTTC TATATATTAC TCCAAATTAA CTGTCAGAAT AAAAAAGAAG AATAATTATT ACAGAATCTG AACATTAAAA TCGTCCCTCC ATATGTGGTC TCTGTCTAGT CCAAAAGCAA TTTACACATC CCAAGCCGAA ACTATATTAA ATAAACATTT TTTTTTCTTT AACTAAAACA TTTATAACAT TTAACAATAA AAGTTAAAAA TCGAACACGT ATAACGTATT TTTTTACGTA TACGTCTTGT TGGCATATAT GCTTAAAAAC TTCATTACAT ACATATACAA GTATGTCTAT ATATATGATA TTATGCAAAC ACAAATCTGT TGACTATAAT TAGACTTCTT CATTTACTCT CTCTCTGACT TAAAACATTT ATTTTATCTT CTTCTTGTTC TCTCTTTCTC TTTCTCTCA (SEQ ID NO: 11); LFAH12 (gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri) (Broun et al., Plant J. 13:201-210, 1998), TCAGGAAGAT TAAGTCTTTG CTTGTTGTCT GATTTTCTTT AAATACATTA AGAAATCGGT TATGAAGCTT CGTTTTTTGT GTTTTGGGAT TATGAAGCTG TCTTTGGATA TTAGTTGCGG TTATTAGCAT GCTTCTCTTT TGTGTTTTGG GGATGATGAA GCAGGGTCTC TCTATGTAAT GCATTTTGTT TGAAAACTCA GCTAATGCTA ATGCAATTTC TTTTGAAACC TTTGTTATGT TTTCAAAAAT ATTGAATAGG TTCTGTTATG GATTTATTTG CAAAAGCCAT TGATTAAATC AAACCATTAC ATAAGAACAA CATTCATTAT TAACTAATTA GAGATGCAAA ACACAACATT ACATACAACA TCAGTGACTA ATTATTGAGA CAAAACAACA TCACAGACAC AAACATTCAT CTCATACATC ACTTAGAGAG ACACAAAAAG CAACCAAACA CAACTATTCC GCCAACAACA ATTAGCTTCA TACGTTTTGC TTCTCCTTTC AAGCCTTCAA TCATCTTCTC ACAGCCACGA ATCTGAGCCT TCAATAATAA CATTTCTTCA TCGTGACACT TCTCACGGTT ATGAATGCAA GCCTTTATGT CCTCTACTTC TTCTACTAAA GACACATCGG TCCACTTCCA GGTGTGGAAT CCTCCTCTTT TGAAATTTTT CTCACAGGTA TGGAATAATC TACCTGGGTT TTTTGGAGTT CTTGAGGTTC TGATCACAAC ACGGCATCCA CATCGACAGG TCTTAGGAAA ACCACGAAGG TTATGATCTT CAAGCTCACT GTCAAAAGAT AAAAACGAGT TTGAAGAAGA AGAAGGCATT ATCAATTTCA GAGAATTTTG GAGAATTTTG AGAGATTGAG AATTGGGAAA TAAGAACCCT AATCCCCAAT TTATGAGATT GAAAATATAT CCGTTAGAGA AGAAACATAA TGTTGTGCGT TTTAATTAGA AAAAATAGAG ATGGGCTTTA TCTTTTGTTA AGAGTTTTGG GCTTGGGCTT GGGTTTTTGA TAAAAAAATT AATTAAACCA AAACGACGTC GTTTGGTTTA ATTGTTGTTA AAAAAAAATT AAAACACCAA AACGACGTCG TTTTGGTGTT ATTAACGGCC TTAAAACGGA TTAAATCCAT AATCCGTCAG TCAACTAGGG TTACGGATGG TCAACGGCGT TTTTGCATAA CGGAGGCACA GTTCAGGCTT AACGGAGTGG ACGGAATGGC TTTTTAGGAA GTTTGTAACC GGGGTCTTTT GTTTATGATG TATTTGTCCC CGTCGGCTAT TGTTCAGGCC GTTTAGGCCT TTTTCCTATA TACTGGAAAT AACTATTGTC CAGACGAGTT ACTTCTCCAA CATATCAAGA AGTGTTACAA AGATGTGTTA CGAAGCCATA AAACTCAAAA CCCTAAGCCT AAACCCTAGA ACTTTCTAGC ACGTTTATAC CTTCTCCTTT CTTTAGTTTC CTTTAAAGGC CTTCGTATCA TAAGTTTTAT TTTTGCTTAA TACTAACACT AGAAAAAAAC AATAATCAAC ATAAACTAGG TTAAGTCGTG GATCTAATTT TATTGTGAAA ATGTAATTGC TTCTCTTAAG AAAAGATTCA TAGCAAAATA TTCGCATCTT TCTTGTGAAT CATCTTTTGT TTTTGGGGCT ATTAAAGAAA AATTGAACTC ATGAAATGGT GACAACTTTA TTCTAGAGGT AACAGAACAA AAATATAGGA ACAACACGTG TTGTTCATAA ACTACACGTA TAATACTCAA GAAGATGAAT CTTTATAAGA ATTTAGTTTT CTCATGAAAA CATAAAAAGT TTTGTCAATT GAAAGTGACA GTTGAAGCAA AGGAACAAAA GGATGGTTGG TGATGATGCT GAAATGAAAA TGTGTCATTC ATCAAATACT AAATACTACA TTACTTGTCA CTGCCTACTT CTCCTCTTTC CTCCGCCACC CATTTTGGAC CCACGAGCCT TCCATTTAAA CCCTCTCTCG TGCTATTCAC CAGAATAGAA GCCAAGAGAG AGAGAGAGAT TGTGCTGAGG ATCATTGTCT TCTTCATCGT TATTAACGTA AGTTTTTTTT TGACCACTTA TATCTAAAAT CTAGTACATG CAATAGATTA ATGACTGTTC CTTCTTTTGA TATTTTCAGC ( EQ ID NO: 1 ) ; 2S2 (gen de 2S2 albúmina proveniente de Arabidopsis thaliana) (GuerchG et al., Plant Cell 2:469-478, 1990), FAE1 (gen de elongasa con ácido graso proveniente de Arabidopsis thaliana) (Rossak et al., Plant Mol. Biol. 46:717-725, 2001), y LEC2 (gen de cotiledóneas con forma de hoja proveniente de Arabidopsis thaliana) (Kxoj et al., Development 130:6065-6073, 2003).

CTTTGTTTTG TAGAGTGTTC TATGGGTTAT GATTTCGAAA AGAAAAAAAA TTGTGAGACA CTTAATAAAA TTATTTCGAC AAAAAAAGTA GCTTGTATAA AAAAATCAGA TTTTAATTTA TGTAAGAACA AATTCCAATA TCCAATAGTT AAAAATAATT ATTTGTTCCG ATTAATCGAG TTTTGCAAAA TATGCACAAA ATCTATCAT GTACCATTTC TAAGACTATA TATTTGGTTA TATATTTTAT GCCGTGTGTT CTGATTCCAA TAAATTTTAG CGCATAGTAA ATTTTCTAAA AAGCAAAATT TTCTCAAAAG TGTACTAATG ACAATTAATT GAGTTTCTAC AAAATAAGAA TAACTATTGA CTCGATTTTC ACAAAACTAG TATGCTAAAT ATCACATTAC TTTTAAAATT AAATGGAATT ATCTTTTTCA ATATTGGATA CGAATAATTT TTACACTAAA GTTATTTTAA TAAAATAACC GTTTATTCAA AATATGTAAA GACGACAAAA ATATATATTA AATGGAAAAA CGACTAACTT AGTTTTTGCA AAATTAAATG GATTTGTCCT TTTCAATGTT TGAATACAAA AAAAAATCTA TAATAAGTTT ATTATATTAA AATAACCCGT TTTTTCAGAA TACGCAAAAA CGACAAAAAA ATATTAATTA CAAAGAAATT TAGTTTATA CAAAAATATG AATGGCTATT AATGGTGTTT ACTCTAAATT TAATTATTAT GCATTTATGC TAAATCTTTC TAAAGGTACA AAGATTCGTT TTTTCAATG TTTGAACTGC ATATTAAGGT ATAGATTTGG ACCTTAACAG AGTTAATATA TAAGGAAGAG AGCCAAGGAA CTCCAAAATA AAATAAAGAG CCTTCTCTCT CTCTCTCTGA GAAAAAACAC ATATAGCCAA TGACCTTCTC GTGGTCTTCT GTGCCATAAA AGCCATTATA TACATTCAAA CACAATCTGG CGCCACATAT ACACATGTAC TAGTGTATGT ATATGTCCTA ACCTCTGTAT TCATATCTCT CTCCTTGTCT GAGTGGTGCG ATGGGTATCC CCATAAGCTG CAAACATTGA ACCATCTGCA ACATTTTGAC TCGTTTTCTT TTGTGTTTTT CCAACATCTG TCTCTTCTTC ACTCGCTCTC TCCTAATCAA TCTCCCCAAC GACCTCTCTT TTTTTTTGTT TCTTCACTCA GATCTCTCTC CCTCTCTCTC TCTCTCTCTC CGGGAAAA (SEQ ID NO: 13) Los cinco promotores proporcionaron una expresión embrionaria temprana en Arabidopsís . Los perfiles de expresión de los cinco promotores durante el desarrollo embrionario temprano se representan esquemáticamente en la Figura 1. Los promotores AAP1, LFAH12, 2S2, y FAE1 se inactivan en la primera etapa del desarrollo embrionario. Se hacen transcripcionalmente activos en etapas posteriores progresivamente al inicio del desarrollo con AAPl seguido por LFAH12, 2S2, y luego FAE1. Los cuatro promotores luego permanecen activos a través de las últimas etapas de desarrollo embriónico. El promotor LEC2, tiene un perfil de expresión inversa, se activa en el desarrollo embrionario muy temprano y luego declina en la actividad gradualmente a través de las últimas etapas. Los promotores AAPl , LFAH12, 2S2, FAE1, y LEC2 se combinan con cualquiera de las dos configuraciones de la secuencia de la región codificante REV en las estructuras de expresión del transgen REV. Los promotores AAPl, LFAH12, 2S2, FAE1, y LEC2 se combinan con la secuencia de codificación del gen REV incluyendo todos los intrones que estén presentes en el gen REV. Los promotores AAPl y LFAH12 también se combinan con una secuencia de la región codificante REV derivada de uno de los intrones que carecen de ADNc de REV.

ADNc de REV de Arabidopsis thaliana REV (AtRev) ATGGAGATGG CGGTGGCTAA CCACCGTGAG AGAAGCAGTG ACAGTATGAA TAGACATTTA GATAGTAGCG GTAAGTACGT TAGGTACACA GCTGAGCAAG TCGAGGCTCT TGAGCGTGTC TACGCTGAGT GTCCTAAGCC TAGCTCTCTC CGTCGACAAC AATTGATCCG TGAATGTTCC ATTTTGGCCA ATATTGAGCC TAAGCAGATC AAAGTCTGGT TTCAGAACCG CAGGTGTCGA GATAAGCAGA GGAAAGAGGC GTCGAGGCTC CAGAGCGTAA ACCGGAAGCT CTCTGCGATG AATAAACTGT TGATGGAGGA GAATGATAGG TTGCAGAAGC AGGTTTCTCA GCTTGTCTGC GAAAATGGAT ATATGAAACA GCAGCTAACT ACTGTTGTTA ACGATCCAAG CTGTGAATCT GTGGTCACAA CTCCTCAGCA TTCGCTTAGA GATGCGAATA GTCCTGCTGG ATTGCTCTCA ATCGCAGAGG AGACTTTGGC AGAGTTCCTA TCCAAGGCTA CAGGAACTGC TGTTGATTG GGTTCAGATG CCTGGGATGA AGCCTGGTCC GGATTCGGTT GGCATCTTTG CCATTTCGCA AAGATGCAAT GGAGTGGCAG CTCGAGCCTG TGGTCTTGTT AGCTTAGAAC CTATGAAGAT TGCAGAGATC CTCAAAGATC GGCCATCTTG GTTCCGTGAC TGTAGGAGCC TTGAAGTTTT CACTATGTTC CCGGCTGGTA ATGGTGGCAC AATCGAGCTT GTTTATATGC AGACGTATGC ACCAACGACT CTGGCTCCTG CCCGCGATTT CTGGACCCTG AGATACACAA CGAGCCTCGA CAATGGGAGT TTTGTGGTTT GTGAGAGGTC GCTATCTGGC TCTGGAGCTG GGCCTAATGC TGCTTCAGCT TCTCAGTTTG TGAGAGCAGA AATGCTTTCT AGTGGGTATT TAATAAGGCC TTGTGATGGT GGTGGTTCTA TTATTCACAT TGTCGATCAC CTTAATCTTG AGGCTTGGAG TGTTCCGGAT GTGCTTCGAC CCCTTTATGA GTCATCCAAA GTCGTTGCAC AAAAAATGAC CATTTCCGCG TTGCGGTATA TCAGGCAATT AGCCCAAGAG TCTAATGGTG AAGTAGTGTA TGGATTAGGA AGGCAGCCTG CTGTTCTTAG AACCTTTAGC CAAAGATTAA GCAGGGGCTT CAATGATGCG GTTAATGGGT TTGGTGACGA CGGGTGGTCT ACGATGCATT GTGATGGAGC GGAAGATATT ATCGTTGCTA TTAACTCTAC AAAGCATTTG AATAATATTT CTAATTCTCT TTCGTTCCTT GGAGGCGTGC TCTGTGCCAA GGCTTCAATG CTTCTCCAAA ATGTTCCTCC TGCGGTTTTG ATCCGGTTCC TTAGAGAGCA TCGATCTGAG TGGGCTGATT TCAATGTTGA TGCATATTCC GCTGCTACAC TTAAAGCTGG TAGCTTTGCT TATCCGGGAA TGAGACCAAC AAGATTCACT GGGAGTCAGA TCATAATGCC ACTAGGACAT ACAATTGAAC ACGAAGAAAT GCTAGAAGTT GTTAGACTGG AAGGTCATTC TCTTGCTCAA GAAGATGCAT TTATGTCACG GGATGTCCAT CTCCTTCAGA TTTGTACCGG GATTGACGAG AATGCCGTTG GAGCTTGTTC TGAACTGATA TTTGCTCCGA TTAATGAGAT GTTCCCGGAT GATGCTCCAC TTGTTCCCTC TGGATTCCGA GTCATACCCG TTGATGCTAA AACGGGAGAT GTACAAGATC TGTTAACCGC TAATCACCGT ACACTAGACT TAACTTCTAG CCTTGAAGTCG GTCCATCACC TGAGAATGCT TCTGGAAACT CTTTTTCTAG CTCAAGCTCG AGATGTATTC TCACTATCGC GTTTCAATTC CCTTTTGAAA ACAACTTGCA AGAAAATGTT GCTGGTATGG CTTGTCAGTA TGTGAGGAGC GTGATCTCAT CAGTTCAACG TGTTGCAATG GCGATCTCAC CGTCTGGGAT AAGCCCGAGT CTGGGCTCCA AATTGTCCCC AGGATCTCCT GAAGCTGTTA CTCTTGCTCA GTGGATCTCT CAAAGTTAC AGTCATCACT TAGGCTCGGA GTTGCTGACG ATTGATTCAC TTGGAAGCGA CGACTCGGTA CTAAAACTTC TATGGGATCA CCAAGATGCC ATCCTGTGTT GCTCATTAAA GCCACAGCCA GTGTTCATGT TTGCGAACCA AGCTGGTCTA GACATGCTAG AGACAACACT TGTAGCCTTA CAAGATATAA CACTCGAAAA GATATTCGAT' GAATCGGGTC GTAAGGCTAT CTGTTCGGAC TTCGCCAAGC TAATGCAACA GGGATTTGCT TGCTTGCCTT CAGGAATCTG TGTGTCAACG ATGGGAAGAC ATGTGAGTTA TGAACAAGCT GTTGCTTGGA AAGTGTTTGC TGCATCTGAA GAAAACAAC AACAATCTGC ATTGTCTTGC CTTCTCCTTT GTAAACTGGT CTTTTGTGTG A (SEQ ID NO: 1).

Estructuras del transgen REV 3' UTR del gen-rev LFAH12-At Una región de 2170 pares de bases (bp, por sus siglas en inglés) del promotor LFAH12, se amplificó a partir del ADN genómico de Lesquerella fendleri con cebadores £co. I-LFAH12 (GAATTCTCAGGAAGATTAAGTCTTTGCTTG; SEQ ID NO: 14) y Sacl-LFAH12 (GAGCTCGCTGAAAATATCAAAAGAAGGAACA; SEQ ID NO: 15) . Estos cebadores tuvieron 24 nucleótidos de inicio y 15 nucleótidos en los extremos 5' y 3' , respectivamente, de la secuencia LFAH12 publicada ((designaciones GenBank® AF016103.1 o GI.3452128) (Broun et al., Plant J. 13:201-210 (1998)). Se clonaron diversas reacciones PCR independientes en pCR-Blunt (Invitrogen) y se secuenciaron . Las secuencias de todo, fueron idénticas entre si (SEQ ID NO: 12) y 97% idénticas a la secuencia LFAH12 publicada. Las diferencias podrían ser debido al acceso especifico de L. fendleri utilizado para la recuperación del promotor. LFAH12 se movió al plásmido pBluescript con EcoRI y la orientación del promotor en pBluescript se determinó para Kpnl en el extremo 5' del promotor y Spel en el extremo 3' del promotor (pTG143) . El cásete 3' UTR del gen-rev At REV se tomó como un fragmento Spel-Kpnl de pTG95 (3' UTR del gen-rev 35S-At REV en pCGN1547, patente WO 01/33944A1) y junto con el promotor LFAH12 (fragmento Kpnl-Spel de pTG143), se ligó en el vector binario de pCGN1547 (McBride et al., Plante Mol. Biol. 14:269-276, 1990) que ya se había cortado con Kpnl en una ligación de tres vías para crear 3' UTR del gen-rev At REV del promotor LFAH12 en una orientación cola a cola con el cásete de expresión NPTII de la planta. 3' UTR del ge-rev AAPl-At REV Una región de 809 pares de bases (bp) del promotor AAPl, se amplificó a partir del ADN genómico de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) con cebadores £co#I-AAPl (GAATTCGGTTGCATCTTTGAATACCTTTTT; SEQ ID NO: 16) y SacI-AAPl (GAGCTCTGAGAGAAAGAGAAAGAGAGAACAA; SEQ ID NO: 17). El cebador SacI-AAPl comenzó en 6 nucleótidos del extremo 3' de la secuencia AAPl publicada (designación de depósito GenBank® X95622.1; GI.1566687) (Hirner et al., Plant J. 14:535-544, 1998). Las secuencias de todos los productos PCR se identificaron entre sí, 98% idéntico a la secuencia AAPl del ecotipo C24 publicado y 100% idéntico a la secuencia AAPl del ecotipo Col anotado (designación GenBank® AC008051.3; GI.7462019) (SEQ ID NO:ll). AAPl se movió al plásmido pBluescript con EcoRI y la orientación del promotor en pBluescript se determinó para ser Kpnl en el extremo 5' del promotor y Spel en el extremo 3' del promotor (pTG145) . El cásete 3' UTR del gen-rev At REV se tomó como un fragmento Spel-Kpnl proveniente de pTG95 (3' UTR del gen-rev At REV en pCGN1547, Véase la O 01/33944A1) y junto con el promotor AAP1 (fragmento Kpnl-Spel proveniente de pTG145) , se ligó en el vector binario PCGN1547 (McBride et al., Plant Mol. Biol . 14:269-276, 1990) que se había cortado con Kpnl en una ligación de tres vías para crear un 3' UTR del gen-rev At REV del promotor AAP1 en una orientación cabeza a cola con el cásete de expresión NPTII de la planta. 3' UTR de ADNc-rev LFAH12-At REV El ADNc At REV se amplificó a partir de ADNc sintetizado proveniente de ARN total aislado de hojas de Arabidopsis del ecotipo Columbia. Los cebadores utilizados incorporaron un sitio ?/coI en el ATG y un sitio BamHI en el codon de paro: NcoI-ATG REV CCATGGAGATGGCGGTGGC TAAC (SEQ ID NO: 18) y BamtfI-TGA REV GGATCCTCACACAAAAGACCAGTTTAC AAAGGA (SEQ ID NO: 19) . El producto PCR con ADNc de At REV resultante se clonó en el plásmido pCR-Blunt y se secuenció (pTG230) . Utilizando pTG95 como el molde, 3'UTR de REV se amplificó con los cebadores que incorporaran un sitio EcoRV en el extremo 5' y Notl/Kpnl en el extremo 3' : #£VUTR de EcoRV GATATCTTCGATTGACAGAAAAAG (SEQ ID NO:20) y REVÜTR de Not/Kpn GCGGCCGCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAACCA (SEQ ID N0:21). El 3'UTR At REV resultante se clonó en el plásmido pCR-Blunt y se secuenció. El 3' UTR REV se movió al plásmido pBluescript con los sitios .EcoRV y Noti (pTG234). El 3'UTR REV, luego se extrajo de pTG234 y se ligó en pTG230 con los sitios EcoRV y Notl (pTG239) . El cásete 3' UTR de ADNc-rev At REV se extrajo como un fragmento Spel-Kpnl proveniente de pTG239 y junto con el promotor LFAH12 (fragmento Kpnl-Spel proveniente de pTG143) , se ligó en el vector binario pCGN1547 en una ligación de tres vias para crear el 3'UTR del ADNc-rev LFAH12-At REV en una orientación cabeza a cola con el cásete para expresión NPTII de plantas (pTG241). 3'UTR de ADNc-rev AAPl-At REV El cásete 3'UTR de ADNc-rev At REV se extrajo como un fragmento Spel-Kpnl proveniente de pTG239 y junto con el promotor AAP1 (fragmento Kpnl-Spel proveniente de pTG145), se ligó en el vector binario pCGN1547 en una ligación de tres vias para crear el 3'UR de ADNc-rev AAPl-At REV en una orientación de cabeza a cola con el cásete de expresión NPTII de plantas (pTG242) . 3'UTR del gen-rev FAEl-At REV El promotor FAE1 de 933 bp se amplificó a partir de un vector CD con los sitios Kpnl y Spel, se clonó en el plássmido pCR-Blunt, y se secuenció (pTG238). El promotor FAE1 luego se movió en el plásmido pBluescript con EcoRI (pTG243) . El cásete 3'UTR del gen-rev At REV se extrajo como un fragmento Spel-Kpnl proveniente de pTG95 y junto con el promotor FAE1 (fragmento Kpnl-Spel a partir de pTG243), se ligó en el vector binario pCGN1547 (McBride et al., Plant Mol. Biol. 14:269-276, 1990) que se había cortado con K nl en una ligación de tres vías para crear el 3'UTR del gen-rev At REV del promotor FAE1 en una orientación cabeza a cola con el cásete de expresión NPTII de la planta (pTG248). 3'UTR del gen-rev 2S2-At REV El promotor 2S2 de 1379 bp, se extirpó del plásmido CD p4163 (fragmento de 2S2-At REV SwaI y se ligó en pBluescript en el sitio EcoRV . La orientación del promotor en pBluescript se determinó para ser Kpnl en el extremo 5' del promotor y BamHI en el extremo 3' del promotor (pTG251). El cásete 3'UTR del gen-rev At REV se extrajo como un fragmento BamHI-Kpnl proveniente del pTG138 (3'UTR del gen-rev 35S-At REV en TOPO) y junto con el promotor 2S2 (fragmento Kpnl-BamHI proveniente de pTG251), se ligó en el vector binario pCGN1547 (McBride et al., Plant Mol. Biol. 14:269-276, 1990) que se había cortado con Kpnl con una ligación de tres vías para crear el 3'UTR del gen-rev At REV del promotor 2S2 en una orientación cabeza a cola con el cásete de expresión NPTII de la planta. 3'UTR del gen-rev LEC2-At REV El promotor LEC2 de 1256 bp se extirpó del plásmido CD con Apal y PstI y se clonó en el plásmido pBluescript en los mismos sitios (pTG252). El promotor luego se extrajo como un fragmento Kpnl-BamHI en pTG112 (gen At REV en el plásmido pCR-Blunt) linealizado en los mismos sitios para proporcionar pTG280 que es el gen LEC2-At REV en el plásmido pCR-Blunt. Utilizando pTG234 como el molde, 3'UTR REV se amplificó con cebadores que incorporaron un sitio Notl en el extrmo 5' y Notl/Kpnl en el extremo 3' : Not REV UTR inicia GCGGCCGCTTCGATTGACAGAAAAAG (SEQ ID NO: 22) y NotKpn REV UTR GCGGCCGCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAACCA (SEQ ID NO:23). El 3'UTR de At REV resultante se clonó en el plásmido pCR-Blunt y se secuenció (pTG281). El 3'UTR REV luego se movió a pTG280 utilizando los sitios Notl y se clasificó para una orientación adecuada. El plásmido resultante fue el 3'UTR del gen-rev LEC2-At REV en el plásmido pCR-Blunt (pTG283) . El 3'UTR del gen-rev LEC2-At REV se movió como un fragmento de Kpnl a un plásmido pCGN1547 linealizado con Kpnl y se clasificó para una orientación cabeza a cola con el cásete de expresión NPTII de la planta (pTG288).

Transformación de cañóla {Brassica napus) La variedad de cañóla doble haploide DH 12075 se trasformó con las estructuras de expresión del transgen REV utilizando un método de transformación proporcionada por Agrobacterium con base en el de Maloney et al. (Maloney et al., Plant Cell Reports 8:238, 1989). Se hicieron germinar semillas esterilizadas en medio 2 MS (Murashige & Skoog) con 1% de sacarosa en discos Petri de 15 x 60 mm durante 5 días con aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60 semillas por disco. Para cada estructura de transformación se hicieron germinar un total de aproximadamente 1500 semillas. Las semillas no se sumergieron totalmente en el medio de germinación. Las plántulas germinadas se hicieron crecer en un cultivo de tejidos a temperatura de 25°C, en un ciclo de 16 horas de luz/8 de hora oscuridad. Las cotiledóneas se cortaron justo por encima del meristema apical sin obtener ninguno de los tejido meristémicos . Esto se realizó al apretar suavemente los dos peciolos con tenazas inmediatamente por encima de la región meristémica apical. Se debe tener cuidado de no triturar los pecíolos con las tenazas. Utilizando las puntas de las tenazas como una guía, los pecíolos se cortaron utilizando un escalpelo con una cuchilla afilada No. 12. Las cotiledóneas se liberaron sobre una placa de 15 mm x 100 mm de medio de co-cultivo. Las cotiledóneas cortadas adecuadamente se separaron fácilmente. Si no es así, hubo una muy buena oportunidad de que ese tejido meristemático se hubiera obtenido y estas cotiledóneas no se utilizaron. Cada placa contuvo aproximadamente 20 cotiledóneas. Los tejidos extirpados y mantenidos en cultivo de cotiledóneas se inocularon con Agrobacterium después de que unas cuantas placas que se prepararon para evitar el marchitamiento que podría tener un impacto negativo sobre las siguientes etapas del protocolo. Las estructuras de transformación REV se introdujeron en Agrobacterium turnefaciens mediante electroporación . Agrobacterium que alberga la estructura de transformación REV se hizo crecer en medio AB con antibióticos adecuados durante dos días con agitación vigorosa a 28°C. Para inocular los tejidos extirpados ya mantenidos en cultivo de cotiledóneas, se agregó un pequeño volumen del cultivo de Agrobacterium a un disco Petri de 10 mm x 35 mm. El pecíolo de cada tejido extirpado y mantenido en cultivo se sumergió en cultivo con Agrobacterium y el extremo cortado se colocó en medio de co-cultivo en un disco Petri. Las placas se sellaron y se colocaron en un cultivo de tejidos a temperatura de 25°C, 16 hora de luz/8 de hora oscuridad durante 3 días. Después de los 3 días, los tejidos extirpados se transfirieron en conjuntos de diez a discos Petri de 25 mm x 100 mm recién preparados que contuvieron medio para inducción de brotes. Este medio contuvo un agente de selección (20 mg/1 de Kanamicina) y hormonas (4.5 mg/1 un brassinoesteroide (BA) ) . Sólo se transfirieron los tejidos extirpados y mantenidos en cultivo con apariencia sana. Los tejidos extirpados se mantuvieron en medio para inducción de brotes durante 14 hasta 21 días. En este momento, se podrían haber observado callos verdes y posiblemente algún desarrollo de brotes y algunos brotes sin transformar. Los brotes no transformados se reconocieron fácilmente por su color blanco y púrpura. Los brotes sensibles a kanamicina se retiraron al cultivarlos lejos y todos los callos con apariencia sana se transfirieron a placas recién preparadas con medio de inducción de brotes. Los tejidos extirpados se mantuvieron en estas placas durante otros 14 hasta 21 días. Después de 2 hasta 3 semanas, los brotes que tuvieron un color verde oscuro se transfirieron a placas que contuvieron medios para alargamiento de brotes. Este medio contuvo un agente de selección (20 mg/1 de Kanamicina) aunque no contuvo ninguna de las hormonas. Se transfirieron cinco brotes a cada placa. Las placas se sellaron y se regresaron al cuarto para cultivo de tejidos. Los brotes transformados que parecieron vitreos se transfirieron a un medio para alargamiento de brotes que contuvo floroglucinol (150 mg/1). Los brotes que se tornaron sanos y verdes se regresaron a las placas con el medio parar alargamiento de brotes. Se requirieron transferencias repetidas de brotes vitreos a placas recién preparadas en algunos casos para obtener brotes con apariencia normal. Los brotes con morfología normal se transfirieron a tarros de alimento para bebe de 113.4 gramos (4 onzas) con medio para enraizar que contuvo 0.5 mg/1 de ácido indolbutírico . Cualquier exceso de callos se cortó cuando se transfirieron los brotes a los tarros. Los brotes se pueden mantener en tarros indefinidamente al transferirlos a tarros recién preparados que contuvieron 0.2 mg/1 de ácido indolbutírico aproximadamente cada 6 semanas. Una vez que se formó un buen sistema de raíces, los brotes de generación T0 se retiraron de los tarros, el agar se retiró de las raíces, y las plantas se transfirieron a tierra para macetas. Cada planta T0 independiente representó una ocurrencia independiente de inserción del transgen en el genoma de cañóla y se denominó como un caso. Se colocó una copa transparente sobre la planta durante unos cuantos días, permitiendo que la planta se aclimatara al nuevo ambiente. Una vez que la planta se había endurecido, la copa se retiró. Los casos transgénicos T0 luego se hicieron crecer hasta la madurez en el invernadero y se recolectaron las semillas Ti.

Caracterización del caso Tp El número de locus en el sitio de inserción de transgenes se determinó en cada caso mediante análisis Southern. La expresión de transgenes REV en los casos T0 se verificó mediante análisis Norther o al punto final de RT-PCR. Los datos para la expresión REV se obtuvieron para un solo punto de tiempo en el desarrollo embrionario, 19 días después de la polinización (DAP) . A partir de estos datos se concluyó que, en este punto de tiempo del desarrollo, los promotores de la albúmina LFAH12 y 2S2 se impulsaron mayores niveles de producción de ARN de REV que el promotor AAP1. Las estructuras 2S2/REV proporcionaron una expresión a nivel moderado a alto en muchos casos. Los datos de expresión demostraron que los cinco promotores fueron funcionales para impulsar la expresión del transgen REV en plantas de cañóla transgénicas . Las plantas o se generaron exitosamente para las siete estructuras del transgen REV. Las estructuras probadas incluyeron (a) gen AAP1/REV; (b) ADNc de AAP1/REV; (c) gen LFAH12/REV; (d) ADNc de LFAH 12/REV; (e) gen 2S2/REV; (f) gen FAE1/REV; y (g) gen LEC2/REV.

Ejemplo 2. Evaluación del efecto de la expresión del transgen REV durante el desarrollo embrionario sobre el rendimiento de cañóla en ensayos de campo replicados En este ejemplo, las plantas de cañóla transgénicas que comprenden el transgen REV de Arabidopsis bajo el control de diversos promotores embrionario-especificos se probaron en ensayos de campo.

Avance de los casos REV transgénico para ensayos de campo Los casos To se seleccionaron para avanzar a los ensayos de campo con base en una combinación de la expresión de transgenes y el número de locus de la inserción de transgenes. Los casos con expresión de transgenes verificada y un solo locus de inserción de transgenes se les asignaron la mayor prioridad que se llevará a cabo hacia la prueba de campo. En algunos casos, se seleccionaron los eventos con múltiples locus de inserción en presencia de múltiples genes proporcionados a un alto nivel de expresión de transgen total debido a la dosificación de genes. Las semillas Ti, provenientes de eventos seleccionados se hicieron crecer como poblaciones ?? segregantes en lotes de campo. Cada evento se plantó como un lote de veinticuatro plantas de dos filas. Para eventos con un solo locus de inserción de transgenes, la segregación del transgen entre las veinticuatro plantas Ti podría producir una distribución de aproximadamente seis plantas nulas que carecen del transgen, doce plantas de heterocigoto, y seis plantas de homocigoto. Cada planta Ti se ató individualmente antes de florecer para evitar la cruza. Las semillas T2 provenientes de cada veinticuatro plantas Ti se cosecharon por separado. Se utilizaron existencias de semillas T2 para identificar cuáles de las veinticuatro plantas Ti originales fueron nulas, heterocigotas , u homocigotas. Aproximadamente treinta semillas T2 provenientes de cada planta Ti se hicieron germinar en papel filtro en discos Petri con una solución que contuvo el antibiótico G418, un análogo de kanamicina. Debido a que las plantas se co-transformaron con el gen de resistencia a nptll como un marcador seleccionable, sólo aquellas semillas que portan el transgen podrían germinar y seguir creciendo. Si todas las semillas en la placa probaron ser sensibles a G418, entonces la original Ti se identificó como una línea nula.

Si todas las semillas en una placa fueron resistentes a G418, entonces la original Ti se identificó como una línea homocigota. Si aproximadamente un cuarto de las semillas en una placa fueron sensibles y el resto resistentes, la original Ti se identificó como una línea heterocigota . La semilla T2 proveniente de las originales Ti homocigotas provenientes del mismo evento de transformación se dilataron para generar existencias de semillas homocigotas para una prueba de ensayo de campo. Las semillas T2 provenientes de originales Ti nulas provenientes del mismo evento de transformación se dilataron para generar existencias de semillas hermanas nulas para la prueba de ensayo de campo.

Diseño de ensayo de campo El uso de promotores embrionario-específieos para evaluar el potencial del transgen REV como un gen para mejora de rendimiento se probó en las líneas de cañóla transgénica al comparar cada línea transgénica directamente con su hermana nula en el campo en ensayos replicados a gran escala. Debido a que la hermana nula surge de la segregación del transgen en la generación Ti, las hermanas nulas y homocigotas son casi idénticas genéticamente. La única diferencia significativa es la presencia o ausencia del transgen REV. La identidad casi genética hace de la hermana nula el control óptimo para evaluación del efecto del transgen REV. Ya que el principal objetivo del ensayo fue la comparación de la linea transgénica proveniente de un evento a su segregante nulo, se seleccionó un diseño de lote de separación. Este diseño proporciona un alto nivel de evaluación para la interacción entre las sub-entradas transgénicas y no transgénicas y las diferencias entre los sublotes transgénicos entre los eventos (la interacción del subióte y lote principal) y un menor nivel de evaluación de las diferencias entre los eventos totales o el lote principal . Los ensayos de campos se condujeron a múltiples ubicaciones a través de entornos de llanura para valorar los fenotipos de rendimiento bajo la variación de las condiciones ambientales a las cuales se hace crece típicamente cañóla. En todas las ubicaciones, cada evento transgénico se pareó físicamente con su hermana nula en lotes adyacentes. Cada par de lotes de hermanas homocigotas y nulas se replicó cuatro veces en cada ubicación del ensayo. Las ubicaciones de los cuatro pares de lotes por replicado en cada ensayo se distribuyeron aleatoriamente en cada ubicación del ensayo. Los lotes fueron de 1.6 m por 6 m y se plantaron a una densidad de aproximadamente 142 semillas por metro cuadrado. Las plantas se hicieron crecer hasta la madurez utilizando prácticas agrónomas estándar típicas para la producción comercial de cañóla.

Ejemplo 3. Expresión de un transgen REV proveniente de un promotor embrionario-especifico para aumentar el rendimiento de semillas en cañóla transgenica Todos los lotes en cada ubicación de ensayo de campo para rendimiento se cosecharon individualmente con una combinación. Los datos de rendimiento de semillas se recolectaron como el peso total de semillas ajustado para el contenido de humedad para cada lote. Para cada evento transgénico en cada ensayo, la media del rendimiento total de los cuatro lotes replicados de cada línea homocigota se comparó con la media del rendimiento total de los cuatro lotes por replicado de la línea de hijas nulas asociada. Esta comparación se utilizó para evaluar el efecto del transgen REV en el rendimiento total de semillas. Los resultados de cada una de las múltiples ubicaciones del ensayo se combinaron para proporcionar un análisis de ensayos cruzados del efecto del transgen REV sobre el rendimiento total de semillas. El análisis estadístico de varianza en cada ubicación del ensayo permitió la asignación de un umbral para significancia (P = 0.05) para las diferencias en el rendimiento total de semillas entre las líneas transgénicas homocigotas y sus hijas nulas.

Las lineas de cañóla REV transgénica que mostraron un aumento estadísticamente significativo en el rendimiento total de semillas se resumen en la Tabla 1. Las líneas trasngénicas que muestran aumentos estadísticamente significativos en el rendimiento total se identificaron para las siete estructuras del transgen promotor/REV. Estos resultados demuestran que la sobre-expresión de REV utilizando el promotor embrionario-específico da por resultado en un rendimiento aumentado de semillas. El mayor impacto sobre el rendimiento se obtuvo con el promotor LEC2, lo que sugiere que la sobre-expresión de REV puede ser la más efectiva en la primera etapa del desarrollo embrionario ya que el promotor LEC2 se activa al grado máximo muy temprano en el desarrollo con la disminución de la actividad transcripcional a través de las últimas etapas del desarrollo embrionario. Los promotores AAP1, LFAH12, y 2S2 inician la actividad transcripcional en las últimas etapas progresivamente en el desarrollo embrionario aunque también son efectivos para aumentar el rendimiento. El promotor LFAH12 fue notable para el número de eventos independientes que se recuperaron lo que mostró un rendimiento significativamente aumentado indicando un alto grado de penetración para el rasgo utilizando este promotor. Sólo un evento con un aumento moderado en el rendimiento se recuperó para el promotor FAE1 lo que sugiere posiblemente que los promotores que inician la actividad transcripcional en las primeras etapas del desarrollo embrionario proporcionan el mejor medio para aumentar el rendimiento y demostrar que la sobre-expresión embrionaria temprana de un gen se puede utilizar para evaluar si un gen implicado en el crecimiento y/o desarrollo de plantas tiene potencial para aumentar el rendimiento de cultivo en plantas transgénicas .

Cambio en el rendimiento total de semillas en planta REV homocigota con relación a sus hijas nulas. Todo los valores son estadísticamente significativos (P = 0.05) Ejemplo 4. Tamaño aumentado de semillas en cañóla transgénica que expresa REV durante el desarrollo embrionario utilizando promotores embrionario-especificos Todas las semillas recolectadas de lotes individuales en los ensayos de campo se secaron a calor bajo en un horno a un contenido uniforme de humedad. . Para cada muestra de semilla para cada lote en los ensayos de campo, se contaron mil semillas utilizando un contador de semillas Agriculex (Guelph, Ontario, Canadá) . Luego se midió el peso de cada muestra de mil semillas. La media del peso de mil semillas (TS , por sus siglas en inglés) a partir de cuatro lotes por replicado de cada linea homocigota se comparó con la media de TSW proveniente de cuatro lotes por replicado de la linea de hijas nulas asociadas. Las diferencias en los valores TSW entre las lineas REV transgénicas homocigotas y sus lineas hijas nulas se utilizaron como una medición de la diferencia en el tamaño de las semillas que se podría atribuir al transgen REV. El análisis estadístico de varianza en cada ubicación del ensayo permitió la asignación de un umbral para significancia (P = 0.05) para diferencias en TSW entre líneas transgénicas homocigotas y sus hijas nulas. Las líneas de cañóla REV transgénica que mostraron un aumento estadísticamente significativo en el tamaño de la semilla como se indica por TSW se resume en la Tabla 2. Las lineas transgénicas que muestran aumentos estadísticamente significativos en TSW se identificaron para seis de las siete estructuras del promotor/trangen REV. Los efectos de los promotores LEC2 y LFAH12 que impulsan la expresión REV sobre el tamaño de las semillas fueron consistentes con los efectos observados sobre el rendimiento total utilizando estos promotores. La estructura LEC2/REV proporcionó un aumento positivo importante en el tamaño de las semillas lo que indica que la sobre-expresión de REV en cada desarrollo embrionario temprano es efectiva. El promotor LFAH12 nuevamente mostró una penetración importante del rasgo con seis eventos independientes que muestran aumentos estadísticamente significativos en el tamaño de la semilla. Los promotores AAP1 y 2S2 que impulsan la sobre-expresión REV, también proporcionaron aumentos estadísticamente significativos en el tamaño de la semilla. Ningún de los eventos que portan la estructura del transgen FAE1/REV mostró un aumento significativo en TSW. Debido a que la actividad del promotor FAE1 inicia al final en el desarrollo embrionario de los cinco promotores probados, la falta de un efecto sugiere que los promotores que inician la actividad transcripcional en las primeras etapas del desarrollo embrionario proporcionan un medio para aumentar el rendimiento cuando se asocian con un gen que afecta con el crecimiento y desarrollo de plantas, tal como, REV.

Además, estos promotores se pueden utilizar para evaluar otros genes vegetales asociados con el desarrollo y/o crecimiento para su potencial de aumentar el rendimiento, tal como, el tamaño y/o numero de semillas, en plantas transgénicas .

Tabla 2. Cambio en el tamaño de semillas como se indica por un peso de 1000 semilla. Todo los valores son. estadísticamente significativos (P = 0.05). El valor indicado mediante un * fue significativo en una ubicación de ensayo Ejemplo 5. Tamaño y rendimiento alimentados de semillas en cañóla trasngénica que expresa REV durante el desarrollo embrionario utilizando promotores embrionario-especificos Un resultado imaginable para un fenotipo de tamaño aumentado de semillas puede ser una respuesta compensatoria por la planta que da por resultado en un número disminuido de semillas para mantener una asignación neta constante de recursos para la producción de semillas. La Tabla 3, resume seis eventos REV transgénicos independientes que demuestran tanto un tamaño aumentado de semillas estadísticamente significativo como un aumentado en el rendimiento total en ensayos de campo. Los aumentos simultáneos en el tamaño de la semilla y el rendimiento total se observaron en eventos que portan AAP1/REV, LFAH12/REV, 2S2/REV, y las estructuras del transgen LEC2/REV que indican que los cuatro promotores fueron efectivos para aumentar el tamaño de la semilla sin producir una reducción en el número de semillas como una respuesta compensatoria por la planta. La comparación de los valores TSW con los valores de rendimiento total en la Tabla 3, revelan que el tamaño aumentado de semillas no se toma en cuenta para los aumentos totales observados en el rendimiento. El tamaño aumentado de semillas fue un componente que contribuye al rendimiento total. El resto del rendimiento aumentado fue debido al número aumentado de semillas. En algunos casos, el número aumentado de semillas fue el principal componente del rendimiento aumentado total. El número aumentado de semillas podría resultar de un aumento en el número de semillas por vaina, un aumento en el número de racimos, un aumento en el número de vainas por racimo, una disminución en la velocidad de absorción de las semillas, o una combinación de estos efectos. La ausencia de eventos que portan la estructura del transgen FAE1/REV de la lista de eventos que muestran tanto un aumento en el tamaño de las semillas como un rendimiento total indica que los promotores que inician la actividad transcripcional en las primeras etapas del desarrollo embrionario proporcionan el mejor medios para evaluar los genes vegetales implicados en el desarrollo y crecimiento de plantas para su potencial de aumentar el tamaño y rendimiento de las semillas en plantas transgénicas . También parece que la mayor eficacia para aumentar el rendimiento se puede obtener con promotores que inicien la actividad transcripcional en las primeras etapas del desarrollo embrionario.

Tabla 3. Eventos REV transgénicos independientes que muestran tanto tamaño aumentado de semillas como rendimiento total. Los valores son estadísticamente significativos (P = 0.05) excepto ** que no fue estadísticamente significativo pero positivo en las cuatro ubicaciones del ensayo. Los valores marcados con * fueron significativos en una ubicación de ensayo Ejemplo 6. Plantas de soya transgénicas que expresan estructuras transgen diseñadas para conferir expresión embrionaria-especifica de .REVOLUTA Con base en el uso exitoso del promotor embrionario-específico LFAH12 para impulsar la expresión del transgen REVOLUTA en plantas de cañóla transgénicas (Tablas 1, 2, y 3) para obtener un aumento de rendimiento y tamaño de semillas, una estructura del gen LFAH12-AtREV se construyó para la transformación de soya. La soya, similar a cañóla, es una dicotiledónea y la alta conservación de los genes REVOLUTA a través de la especie de planta probablemente hace que el gen REVOLUTA de Arabidopsis podría funcionar cuando se introduce en plantas de soya transgénicas .

Estructura del transgen EV 3'UTR del qen-rev LFAH12-AtREV La región de 2170 bp del promotor LFAH12 se amplificó a partir del ADN genómico de Lesquerella fendleri con cebadores £coiI-LFAH12 (GAATTCTCAGGAAGATTAAGTCTTTGCTTG; SEQ ID NO: 14) y SacI-LFAH12 (GAGCTCGCTGAAAATATCAAAAGAAGGAACA; SEQ ID NO: 15) . Estos cebadores iniciaron con 24 nucleótidos y 15 nucleótidos en los extremos 5' y 3' respectivamente, de la secuencia LFAH12 publicada ((designaciones GenBank® AF016103.1 o GL3452128) (Broun et al., Plant J. 13:201-210 (1998)). Diversas reacciones PCR independientes se clonaron en pCR-Blunt (Invitrogen) y se secuenciaron . Las secuencias de todos fueron idénticas entre sí y 97% idénticas a la secuencia LFAH12 publicada. Las diferencias podrían ser debido al acceso específico de L . fendleri utilizado para la recuperación del promotor. LFAH12 se movió al plásmido pBluescript II con EcoRI y la orientación del promotor en pBluescript se determinó para ser Kpnl en extremo 5' del promotor y Spel en el extremo 3' del promotor (pTG143) . El cásete 3'UTR del gen-rev At REV se extrajo como un fragmento Spel-Kpnl proveniente del pTG95 (3'UTR del gen-rev 35S-At REV en pCGN1547, patente WO 01/33944A1) y junto con el promotor LFAH12 (fragmento Kpnl-Spel proveniente de pTG143), se ligó en el vector binario pCGN1547 (McBride et al., Plant Mol. Biol. 14:269-276, 1990) que se había cortado con Kpnl en un ligación de tres días para crear el 3'UTR del gen-rev At REV del promotor LFAH12 en una orientación cabeza a cola con el cásete de expresión NPTII de la planta (el pTG171). El cásete 3'UTR del gen-rev At REV LFAH12pr-At REV se extirpó de pTG171 con Kpnl, mitigado con la T4 polimerasa y clonado en pBluescript II que se había cortado con Smal para proporcionar pTG464 (TG-GM6) .

Transformación de soya La variedad de soya X5 se transformó con la estructura de expresión del transgen REV utilizando el método biolístico para introducir ADN en partículas de oro en células de soya desarrolladas en cultivo de suspensión.

El ADNc lineal que contuvo la estructura de expresión del transgén REV se co-transformó con un gen marcador seleccionable de higromicina en un fragmento de ADN lineal por separado. Para preparar el ADN para inserción en células de soya, se agregaron a partículas de oro 2.5 µ? de ADN REV y 2.5 µ? de ADN pHYGR. Se agregaron 50 µ? de CaCl2 y se agitaron rotacionalmente durante 5 segundos. Seguido por la adición de 20 µ? de espermidina y se agitaron rotacionalmente durante 5 segundos. Se dejó que el precipitado se sedimentara al fondo del tubo. El sobrenadante se retiró y el sedimento se lavó dos veces con 200 µ? de etanol al 100%. El sobrenadante se retiró y el sedimento se resuspendió en 120 µ? de etanol al 100%. Se formaron alícuotas de 8 µ? por disco para inserción. Después de la inserción biolística, las células se desarrollaron en cultivo de suspensión en matraces durante 12 días. Los cultivos luego se transíectaron a nuevos matraces que contuvieron 30 mi de azúcar al 2.4% + Luz Fina (F.L., por sus siglas en inglés) + 170 µ? de 10 µg/µl de higromicina (hyg, por sus siglas en inglés) . Para las siguientes cuatro, semanas, el medio se cambió semanalmente al transferir a un nuevo matraz con azúcar al 2.4% Azúcar + F.L. + hyg. Callos verdes transformados desarrollados en los matraces durante la quinta hasta la décima semanas. El contenido de los matraces con callos verdes se vació en discos o portaobjetos de 100 x 15 mm. Utilizando tenazas estériles, los callos verdes se desmenuzaron de células cafés y se transfirieron a placas de 26 cavidades rellenas con 1-2 mi de azúcar al 2.4% + F.L. + Hyg/cavidad. 1 callo verde (clon) /cavidad. El objetivo fue obtener 20-30 clones/matraz . Los medios se cambiaron en las placas cada 2 semanas utilizando una pipeta estéril de 10 mi y un pipeteador automático para fusionar todos los medios de todas las cavidades. El medio se reemplazó con azúcar al 2.4% + Hyg, recién preparado. Las placas se supervisaron para cultivos pro-embriogénicos adecuados. Éstos fueron verdes con diversas proyecciones pro-embriogénicas y mostraron una rápida división y crecimiento. Una vez que se identificó una masa celular adecuada mediante observación microscópica, esto se transfirió sobre una placa estéril o portaobjetos donde se retiró tanta materia de células muertas como fuera posible. La pieza restante de tejido se transfirió a un matraz regular de 30 mi de azúcar al 2.4% + Hyg. Se dejó que los clones se desarrollaran aproximadamente 3 hasta 5 semanas entre los cambios de medios. Cuando las clones se desarrollaron suficientemente, los mismos se separaron. Sólo se mantuvieron las 5 mejores piezas por clon. Estos fueron verdes con diversas proyecciones pro-embriogénicas. No se desearon colonias verdes, uniformes. Los clones se sub-cultivaron cada 3-5 semanas hasta que fueron suficientemente grandes. En este punto, los clones se transfirieron a un medio para regeneración de soya con carbón activado para eliminar 2,4-D (0 S 6AC, Simmonds and Donaldson, Plant Cell Reports 19:485-490, 2000, incorporado en la presente como referencia en su totalidad) como el primer paso de la regeneración. Los clones se desarrollaron no más de seis días en O SM6AC que contuvo el carbón activado (AC, por sus siglas en inglés) para eliminar 2,4-D del tejido. Los clones luego se transfirieron a medio de germinación para embriones de soya (OMSM6G, Simmonds and Donaldson, supra) durante tres semanas. Este medio permitió el desarrollo de embriones. Después de tres semanas, se seleccionaron los 20 mejores embriones y se transfirieron a medios para maduración de soya (OMSM6PH, Simmonds and Donaldson, supra). Los mejores embriones fueron embriones individuales (según se opone a fusionados) con 1 ó 2 cotiledóneas y un meristema visible. Los embriones se transfirieron de tal forma que el meristema fuera paralelo a la superficie de agar. Los clones se mantuvieron en OMSM6PH durante cuatro semanas durante las cuales durante cuyo tiempo los embriones regresaron a un color amarillo. Una vez amarillos, los mismos estuvieron listos para ser desecados y regenerados a plantas. Los embriones se desecaron en cajas de magenta esterilizadas 30 minutos con 3 capas de filtros Whatman saturados con H20 en el fondo. Los embriones se desecaron diez días y luego se transfirieron a medio de enraizado de soya (medio B5/2, Simmonds and Donaldson, supra) en placas durante aproximadamente 10 hasta 12 días. Las plantas estuvieron listas para ir a la Mezcladora Sunshine (extendidas) cuando los brotes crecieron o cuando las hojas se abrieron. Las plantas transgénicas se hicieron crecer extendidas hasta que la primera hoja trifoliada apareció y luego se transfirieron a macetas de 15.24 cm. (6 pulgadas) para crecer y producir semillas.

Ejemplo 7. Expresión de un transgen BEV a partir de promotor embrionario-especifico para determinar el tamaño aumentado de semillas en soya transgénica Los eventos T0 que albergan el 3'UTR del gen-rev LFAH12-AtREV (TG GM6) la estructura del transgen se seleccionaron para avanzar en la evaluación de fenotipos con base en una combinación de la expresión de transgenes y el número de locus de la inserción de transgenes. Los eventos con la expresión del transgen verificado y un locus individual de inserción de transgenes se asignaron a la mayor prioridad que será portada para la expansión de semillas y prueba de campo. En algunos casos, los eventos con múltiples locus de inserción se seleccionaron si la presencia de múltiples genes proporcionaron un alto nivel de expresión de transgen total debido a la dosificación de genes. Las semillas Ti provenientes de los eventos T0 seleccionados se hicieron crecer como poblaciones ?? segregantes en un invernadero. Las semillas se cosecharon de todas las plantas Ti individualmente. Las plantas para generación T2 para cada evento se hicieron crecer y se tipificaron mediante PCR para determinar cuáles lineas T2 fueron homocigotas, heterocigotas , o segregantes nulos para el transgen REV. Las semillas provenientes de cada linea T2, se recolectaron, contaron y pesaron. Con base en el peso total de las semillas y el número de semillas para cada linea T2, se calculó un valor de peso de mil semillas (TSW) para cada linea. El promedio TSW luego se calculó para las clases segregantes, homocigotas, heterocigotas, y nulas de semillas para cada evento. Dos eventos de transformación independiente con expresión REV impulsada por el promotor embrionario-especifico LFAH12 mostraron aumentos estadísticamente significativos en el tamaño de la semilla para las líneas tanto homocigotas como heterocigotas con relación a las líneas segregantes nulas. Los resultados resumidos en la tabla 4 demuestran la sobre-expresión de un transgen REV durante el primer desarrollo embrionario.

Tabla 4. Uso de un promotor embrionario-específico para evaluar la capacidad del transgen REV -para aumentar el tamaño de semilla en soya según se indica por el peso de 1000 semillas en plantas trangénicas homocigotas y heterocigotas con relación a sus lineas de hijas segregantes nulas Ejemplo 8. Expresión de un transgen REV proveniente de un promotor embrionario-específico para determinar el rendimiento total aumentado de semillas en soya transgénica Para probar el efecto de la expresión del transgen REV impulsada por un promotor embrionario- especifico sobre el rendimiento total de semillas, las semillas T3 provenientes de lineas fijas segregantes homocigotas y nulas se agruparon y plantaron en el campo durante la estación de crecimiento en verano. Todas las semillas recolectadas de los lotes individuales en el campo se secaron a calor bajo en un horno para contenido de humedad uniforme antes de medir los pesos de la semilla.

Un evento transgénico con la expresión REV impulsada por el promotor LFAH12 embrionario-especifico mostró tanto un rendimiento total aumentado de semilla del 22.7% como un tamaño aumentado de la semilla de 8.0% con relación a sus hijas nulas (Tabla 5) .

Tabla 5. Uso de un promotor embrionario-especifico para evaluar la capacidad del transgen REV para aumentar tanto el tamaño como el rendimiento de semillas en soya en comparación con plantas transgénicas homocigotas para planta hijas segregantes nulas Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar, pero no limitar, el alcance de las invenciones reivindicadas. Otras variantes de las invenciones serán fácilmente evidentes para aquellos con experiencia normal en la técnica y se abarcarán por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otras referencias citadas en la presente se incorporan como referencia en la misma en su totalidad.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un método para aumentar el tamaño de semilla en una planta caracterizado porque comprende sobre-expresar un gen asociado con el crecimiento y desarrollo de plantas en una semilla durante el desarrollo embrionario temprano.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión del gen relacionado con el crecimiento y/o desarrollo en la semilla está bajo el control de un promotor embrionario fase-especifico temprano.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el promotor embrionario fase-especifico temprano es heterólogo a la planta.
4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el promotor embrionario fase-especifico temprano es homólogo a la planta.
5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el promotor fase-especifico temprano es el promotor asociado con un gen de permeasa con aminoácido (AAP1), un gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa, un gen 2S2 albúmina (2S2), un gen de elongasa con ácido graso (FAE1), o un gen de cotiledónea con forma de hoja (LEC2).
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el promotor AAPl es el promotor AAPl proveniente de Arabidopsis thaliana , el promotor de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa es el promotor del gen oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri (LFAH12), el promotor del gen 2S2 proviene de Arabidopsis thaliana , el promotor del gen de elongasa con ácido graso proviene de Arabidopsis thaliana , o el promotor del gen de cotiledóneas en forma de hoja proviene de Arabidopsis thaliana. 1.
El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado porque el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas es un gen REV, un gen CAP (proteina asociada con ciclasa) , un gen de histona deacetilasa 1 de arroz, un gen E2Fc, un gen BKI, un gen BRI1, un gen ARL (Argos-Like ) , un gen bril (percepción de la hormona de brasinoesteroide) , un gen FATB, un gen de Pepino, un gen RGS (regulador de la señalización de proteina G) , un gen TIP1, un gen BB (Big Brother) , un gen RHD2, un gen INCW2, un gen MN1, un gen WAK2, un gen WAK , o un gen AP2.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo es REV.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el gen REV se deriva de Arabidopsis thaliana.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque la planta es una monocotiledóneas o una dicotiledónea.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la planta es un miembro de las familias Brassicacea (Cruciferae) , Gramineae, Malvaceae, o Leguminosae-Papilionoideae .
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la planta es cañóla, maíz, camelina, algodón, alfalfa, soya, trigo, arroz, o cebada.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la planta es cañóla o soya, el gen relacionado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas es REV, y el promotor fase-especifico temprano es el promotor asociado con un gen de permeasa con aminoácidos (AAP1), un gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa, un gen de 2S2 albúmina (2S2), un gen de elongasa con ácido graso (FAE1) , o un gen de cotiledóneas con forma de hoja (LEC2) .
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el promotor AAP1 es el promotor AAP1 proveniente de Arabidopsis thaliana, el promotor de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa es el promotor del gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri (LFAH12), el promotor del gen 2S2 proviene de Arabidopsis thaliana, el promotor del gen de elongasa con ácido graso proviene de Arabidopsis thaliana, o el promotor del gen de cotiledóneas con forma de hoja proviene de Arabidopsis thaliana.
15. Un método por aumentar el número de semillas que se puede obtener de una planta, caracterizado porque comprende sobre-expresar un gen asociado con el crecimiento y desarrollo de plantas en una semilla durante el desarrollo embrionario temprano.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la expresión del gen relacionado con el crecimiento y/o desarrollo en la semilla está bajo el control de un promotor embrionario fase-especifico temprano.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor embrionario fase-especifico temprano es heterólogo a la planta.
18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor embrionario fase-especifico temprano es homólogo a la planta.
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 hasta 18, caracterizado porque el promotor fase-especifico temprano es el promotor asociado con un gen de permeasa con aminoácido (AAPl), un gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa, un gen de 2S2 albúmina (2S2), un gen de elongasa con ácido graso (FAE1) , o un gen de cotiledóneas con forma de hoja (LEC2) .
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el promotor AAPl es el promotor AAPl proveniente de Arabidopsis thaliana , el promotor de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa es el promotor del gen oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri (LFAH12), el promotor del gen 2S2 proviene de Arabidopsis thaliana , el promotor del gen de elongasa con ácido graso proviene de Arabidopsis thaliana , o el promotor del gen de cotiledóneas con forma de hoja proviene de Arabidopsis thaliana.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 hasta 20, caracterizado porque el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas es un gen REV, un gen CAP (proteina asociada con ciclasa) , un gen de histona deacetilasa 1 de arroz, un gen E2Fc, un gen BKI, un gen BRI1, un gen ARL (Argos-Like) , un gen bril (percepción de la hormona brassinoesteroide ) , un gen FATB, un gen de Pepino, un gen RGS (regulador de la señalización de la proteína G) , un gen TIP1, un gen BB (Big Brother) , un gen de RHD2, un gen INCW2, un gen MN1, un gen NAK2, un gen WAK4, o un gen AP2.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo es REV.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el gen REV se deriva de Arabidopsis thaliana.
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 hasta 23, caracterizado porque la planta es una monocotiledóneas o una dicotiledónea.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la planta es un miembro de las familias Brassicacea (Cruciferae) , Gramineae, Malvaceae, o Leguminosae-Papilionoideae .
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la planta es cañóla, maíz, camelina, algodón, alfalfa, soya, trigo, arroz, o cebada.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la planta es cañóla o soya, el gen relacionado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas es REV, y el promotor fase-específico temprano es el promotor asociado con un gen de permeasa con aminoácido (AAP1), un gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa, un gen 2S2 de albúmina (2S2), un gen de elongasa con ácido graso (FAE1), o un gen de cotiledónea con forma de hoja (LEC2).
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el promotor AAP1 es el promotor AAP1 proveniente de Arabidopsis thalíana , el promotor de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa es el promotor del gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri (LFAH12), el promotor del gen 2S2 proviene de Arabidopsis thaliana , el promotor del gen de elongasa con ácido graso proviene de Arabidopsis thaliana , o el promotor del gen de cotiledóneas con forma de hoja proviene de Arabidopsis thaliana.
29. Una estructura genética caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas vinculado operativamente con una o más secuencias control en donde una o más de las secuencias control son capaces de estimular la expresión del gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas durante el desarrollo embrionario .
30. La estructura genética de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la secuencia control es un promotor embrionario fase-especifico temprano.
31. La estructura genética de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el promotor embrionario fase-especifico temprano es el promotor asociado con un gen de permeasa con aminoácido (AAP1) , un gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa, un gen de 2S2 albúmina (2S2), un gen de elongasa con ácido graso (FAE1) , o un gen de cotiledóneas con forma de hoja (LEC2) .
32. La estructura genética de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el promotor AAP1 es el promotor AAP1 proveniente de Arabidopsis thaliana, el promotor de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa es el promotor del gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri (LFAH12), el promotor del gen 2S2 proviene de Arabidopsis thaliana , el promotor del gen de elongasa con ácido graso proviene de Arabidopsis thaliana , ¡ o el promotor del gen de cotiledóneas con forma de hoja ! proviene de Arabidopsis thaliana.
33. Las estructuras genéticas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 hasta 32, caracterizadas porque el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas es un gen REV, un gen, un gen CAP (proteina asociada con ciclasa) , un gen de histona deacetilasa 1 de arroz, un gen E2Fc, un gen BKI, un gen BRI1, un gen ARL (Argos-Like) , un gen bril (percepción de la hormona brassinoesteroide ) , un gen FATB, un gen de Pepino, un gen RGS (regulador de la señalización de proteina G) , un gen TIP1, un gen BB (Big Brother) , un gen RHD2, un gen INCW2, un gen MNl, un gen WAK2, un gen WAK4 , o un gen AP2.
34. La estructura genética de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el gen para crecimiento y/o desarrollo de plantas es un gen REV.
35. La estructura genética de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el gen REV es un gen REV de Arabidopsis thaliana .
36. La estructura genética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 hasta 35, caracterizada porque la estructura comprende además una secuencia polyA.
37. Un método para la producción de una planta transgénica que tenga un tamaño aumentado de semilla, el método caracterizado porque comprende: (a) introducir en una planta o en una célula vegetal, una estructura genética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 hasta 36; y (b) cultivar la planta o célula vegetal que comprende la estructura genética bajo condiciones que estimulen la regeneración y crecimiento de la planta madura .
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la' planta o célula vegetal se deriva de una planta que es una monocotiledónea o una dicotiledónea.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la planta es un miembro de las familias Brassicacea (Cruciferae) , Gramineae, Malvaceae, o Leguminosae-Papilionoideae .
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la planta es cañóla, maíz, camelina, algodón, alfalfa, soya, trigo, arroz, o cebada.
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la planta es cañóla o soya.
42. Un método para la producción de una planta transgénica que tiene número aumentado de semillas, el método caracterizado porque comprende: (a) introducir en una planta o en una célula vegetal, una estructura genética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 hasta 36; y (b) cultivar la planta o célula vegetal que comprende la estructura genética bajo condiciones que estimulen la regeneración y el crecimiento de la planta madura .
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la planta o célula vegetal se deriva de una planta que es monocotiledónea o una dicotiledónea.
44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la planta es un miembro de las familias Brassicacea (Cruciferae) , Gramineae, Malvaceae, o Leguminosae-Papilionoideae .
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la planta es cañóla, maíz, camelina, algodón, alfalfa, soya, trigo, arroz, o cebada.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la planta es cañóla o soya.
47. Un método para la producción de una planta transgénica que tiene tamaño aumentado de semilla y número aumentado de semillas, el método caracterizado porque comprende: (a) introducir en una planta o en una célula vegetal, una estructura genética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 hasta 36; y (b) cultivar la planta o célula vegetal que comprende la estructura genética bajo condiciones que estimulen la regeneración y crecimiento de la planta madura.
48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la planta o célula vegetal se deriva de una planta que es una monocotiledónea o una dicotiledónea.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la planta es un miembro de las familias Brassicacea {Cruciferae) , Gramineae, Malvaceae , o Leguminosae-Papilionoideae .
50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la planta es cañóla, maíz, camelina, algodón, alfalfa, soya, trigo, arroz, o cebada.
51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la planta es cañóla o soya.
52. Una planta transgénica caracterizada porque comprende la estructura genética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 hasta 36 y que tiene un tamaño aumentado de semilla en comparación con la planta tipo silvestre correspondiente, que tiene un número aumentado de semillas en comparación con la planta tipo silvestre correspondiente o que tiene un tamaño aumentado de semilla y número de semillas en comparación con la planta tipo silvestre correspondiente.
53. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la planta o célula vegetal se deriva de una planta que es una monocotiledónea o una dicotiledónea.
54. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la planta es un miembro de las familias Brassicacea (Cruciferae) , Gramineae, Malvaceae , o Leguminosae-Papilionoideae.
55. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque la planta es cañóla, maíz, camelina, algodón, alfalfa, soya, trigo, arroz, o cebada.
56. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque la planta es cañóla o soya.
57. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la planta monocotiledónea es arroz, avena, maíz, o trigo.
58. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque la planta es un miembro de las familias Brassicacea {Cruciferae) , Malvaceae , o Leguminosae-Papilionoideae .
59. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la planta dicotiledónea es soya, algodón, camelina, alfalfa, o cañóla.
60. La planta transgénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 hasta 59, caracterizada porque la planta es de una planta entera, un órgano de planta, una semilla, una célula vegetal, o la progenie de los mismos.
61. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el órgano vegetal es una hoja, un tallo, una flor, o una raíz.
62. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la célula vegetal es una célula para cultivo de tejidos.
63. Un método para seleccionar un gen que aumente el rendimiento de plantas cuando se asocia funcionalmente con un promotor embrionario fase-especifico temprano; caracterizado porque comprende: construir un vector de expresión que comprende un gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo de plantas asociado funcionalmente con un promotor embrionario fase-especifico temprano; transfectar una célula vegetal con el vector de expresión para formar una planta transgénica; hacer crecer la planta transgénica; y seleccionar el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo en las plantas transgénicas que tienen rendimiento aumentado en comparación con la planta tipo silvestre .
64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el gen asociado con el crecimiento y/o desarrollo es un gen CAP (proteina asociada con ciclasa) , un gen de histona deacetilasa 1 de arroz, un gen E2Fc, un gen BKI, un gen BRI1, un gen ARL (Argos-Like) , un gen bril (percepción de la hormona brassinoesteroide ) , un gen FATB, un gen de Pepino, un gen RGS (regulador de la señalización de la proteina G) , un gen TIP1, un gen BB (Big Brother) , un gen RHD2, un gen INCW2, un gen MN1, un gen WAK2, un gen WAK4 , o un gen AP2.
65. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el promotor embrionario fase-especifico temprano es el promotor asociado con un gen de permeasa con aminoácido (AAPl) , un gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa, un gen de 2S2 albúmina (2S2), un gen de elongasa con ácido graso (FAE1) , o un gen de cotiledóneas con forma de hoja (LEC2).
66. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el promotor AAPl es el promotor AAPl proveniente de Arabidopsis thaliana, el promotor de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa es el promotor del gen de oleato 12-hidroxilasa : desaturasa proveniente de Lesquerella fendleri (LFAH12), el promotor del gen 2S2 proviene de Arabidopsis thaliana , el promotor del gen de elongasa con ácido graso proviene de Arabidopsis thaliana, o el promotor del gen de cotiledóneas con forma de hoja proviene de Arabidopsis thaliana .