MX2008007225A

MX2008007225A - Metodos y composiciones para actuar sobre la poliubiquitina

Info

Publication number: MX2008007225A
Application number: MXMX/A/2008/007225A
Authority: MX
Inventors: Sarah Hymowitz; Nathaniel C Gordon; Robert F Kelley; Anh Pham
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2008-10-03

Abstract

Se ofrecen anticuerpos monoclonales antipoliubiquitina y métodos para el uso de los anticuerpos.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA ACTUAR SOBRE LA POLIUBIQUITINA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de los anticuerpos antipoliubiquitina y, más concretamente, los anticuerpos antipoliubiquitina que no se unen específicamente a la monoubiquitina y que permiten distinguir entre poliubiquitinas con diferentes enlaces isopeptídicos.

ANTECEDENTES La ubiquitina es una pequeña proteína que desempaña importantes funciones reguladoras en una amplia variedad de vías celulares. La que más se conoce es la función de la ubiquitina en la degradación de las proteínas, donde la anexión covalente de la ubiquitina a una proteína diana facilita que la proteína diana sea reconocida y destruida por el proteasoma 26S (véase Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol. 11(3): 141-148 (2000)). También se ha establecido una correspondencia entre la regulación mediante la proteína cinasa de varías vías de señalización y la ubiquitinización (véase Sun and Chen, Curr. Opin. Cell Biol. 16: 119-126 (2004)). Por ejemplo, la fosforilación del ??? por la cinasa ??? permite la ubiquitinación del ??? y las subsiguiente degradación por el proteasoma 26S; como el ??? es un inhibidor del NFKB, la degradación del ??? activa el NFKB (Ghosh and Karin, Cell 109 (Suppl.): S81-S96 (2002); Palombella et al., Cell 78: 773-785 (1994)). La ubiquitinación también media la reparación del ADN (véase Sun and Chen, Curr. Opin. Cell Biol. 16: 119-126 (2004)). Una vez dañado el ADN, la monoubiquitinación del antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) activa las polimerasas tolerantes a daño que pueden sintetizar ADN a pesar de lesiones en el ADN (Stelter and Ulrich, Nature 425: 188-191 (2003). Otros procesos fisiológicos en los que se sabe que interviene la ubiquitinización incluyen la división celular, el crecimiento celular, el movimiento celular y la apoptosis/muerte celular (Johnson, Nat. Cell Biol. 4:E295-E298 (2002); Pickart, Mol. Cell. 8: 499-504 (2001)). La anexión covalente de la ubiquitina, una proteína de 76 aminoácidos, a una proteína diana es un proceso enzimático en tres pasos (Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70: 503-533 (2001)). En primer lugar, la enzima activadora de la ubiquitina El forma un tioéster con ubiquitina El en una reacción dependiente de la ATP. La ubiquitina se transfiere desde el tioéster con ubiquitina El a un miembro de la familia de la enzima conjugante de la ubiquitina (E2) en el segundo paso. En el tercer paso, con la ayuda de la ubiquitina proteína ligasa (E3), se forma un enlace isopeptídico entre el extremo carboxilo de la ubiquitina y el grupo e-amino de un residuo de lisina en la proteína diana. Las enzimas denominadas deubiquitinasas eliminan las porciones de ubiquitina de las proteínas diana (Guterman and Glickman, Curr. Prot. Pep. Sci. 5: 201-210 (2004)). Al resaltar el papel de la ubiquitina como importante molécula reguladora, el genoma humano contiene muchas proteínas diferentes que participan en la ubiquitinación o desubiquitinación: hasta la fecha, se han identificado al menos 40 E2 distintas, 500 E3 diferentes y 80 desubiquitinasas (Wong et al., Drug. Discov. Today 8: 746-754 (2003)). La ubiquitina contiene siete residuos de lisina (Lys6, Lys22, Lys27, Lys33, Lys29, Lys48 y Lys63) y, de este modo, la propia ubiquitina puede actuar como proteína diana para la ubiquitinación (Peng et al., Nat. Biotechnol. 21 : 921-926 (2003); Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004)). La molécula producida mediante ubiquitinación de una proteína ubiquitina se denomina molécula de poliubiquitina y puede contener dos o más porciones de ubiquitina En teoría, la ubiquitinación de la ubiquitina se puede producir en cualquiera de los siete residuos de lisina (Peng et al., Nat. Biotechnol. 21 : 921-926 (2003)), de manera que existen diferentes especies de poliubiquitinas con enlaces isopeptídicos a diferentes residuos de lisina dentro de la ubiquitina. Es posible que una única molécula de poliubiquitina con más de dos porciones de ubiquitina pueda tener más de un tipo de enlace. Diversos estudios han demostrado que la enzima E2 influye en el tipo de enlace de lisina creado entre una molécula de ubiquitina y otra (Termo et al., Genes to Cells 9: 865-875 (2004); Deng et al. (2000); Hofmann and Pickart (2001)). Tanto la poliubiquitina como la ubiquitina existen como moléculas libres y en anexión covalentes con una proteína diana. Al igual que ocurre con la ubiquitina, se ha observado la presencia de poliubiquitina en muchos procesos celulares, incluido el tráfico intracelular, la endocitosis, la expresión génica/el silenciamiento génico, la proteolisis, la activación de la proteína cinasa, la traducción y la reparación del ADN (Hoege et al., Nature 419:135-141 (2002); Spence et al., Mol. Cell. Biol. 15:1265-1273 (1995); Hofmann and Pickart, Cell 96: 645-653 (1999). Sin embargo, la poliubiquitina y la poliubiquitinación pueden tener papeles fisiológicos sorprendentemente distintos a los de la monoubiquitina y la monoubiquitinación en las mismas vías. Por ejemplo, mientras que la monubiquitinación del PCNA tras el daño del ADN da lugar a la activación de las ADN polimerasas tendentes a error, la poliubiquitinación del PCNA en el mismo residuo en el que se observa la monoubiquitinación da lugar a una activación de la reparación del ADN libre de error (Stelter and Ulrich, Nature 425: 188-191 (2003); Hoege et al., Nature 419: 135-141 (2002); Spence et al., Mol. Cell. Biol. 15: 1265-1273 (1995); and Hofmann and Pickart, Cell 96: 645-653 (1999)). Incluso las poliubiquitinas con diferentes enlaces de Usina parecen desempeñar papeles fisiológicos distintos. Las dos poliubiquitinas mejor estudiadas son las enlazadas a Lys48 y a Lys63 y los estudios estructurales de las dos indican que poliubiquitinas enlazadas a Usinas diferentes pueden adoptar conformaciones marcadamente distintas, lo que permite diferentes interacciones con moléculas de enlace seleccionadas (Termo et al., Genes to Cells 9: 865-875 (2004)). La modificación covalente mediante poliubiquitina enlazada a Lys48 suele marcar a la proteína diana para su degradación proteolítica, aunque hay datos que demuestran que la poliubiquitina enlazada a Lys48 también puede regular determinadas proteínas mediante métodos no proteolíticos (Chau et al., Science 243: 1576-1583 (1989); Finley et al., Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick et al., Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004)). En cambio, las poliubiquitinas enlazadas a Lys63 se han asociado a diversas vías intracelulares no proteolíticas, incluida la reparación del ADN (las células de levadura que expresan la ubiquitina K63R presentan defectos en la reparación del ADN), la activación de la proteína cinasa, el tráfico intracelular y la traducción (Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004); Hicke and Dunn, Annu Rev. Cell Dev. Biol. 19: 141-172 (2003); Spece et al., Mol. Cell Biol. 15: 1265-1273 (1995); Ulrich, Eukaryot. Cell 1 : 1-10 (2002); Spence et al., Cell 102: 67-76 (2000); Seibenhener et al., Mol. Cell. Biol. 24(18): 8055-8068 (2004)). En un ejemplo concreto, la sinfilina-1 es ubiquitinada habitualmente con la poliubiquitina enlazada a K63 mediante Parkin de una forma independiente de proteasomas; no obstante, la sinfilina-1 también puede ser diana para destrucción mediante ubiquitinación con poliubiquitina enlazada a K48 (Lim et al., J.

Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005)). Un análisis de pacientes con enfermedad de Parkinson demostró que la poliubiquitinación K63 de la sinfilina-1 podía intervenir en la formación de inclusiones de cuerpos de Lewy asociadas a esa enfermedad (Lim et al., J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005)). Otras poliubiquitinas enlazadas a lisinas no se han estudiado en detalle, debido en gran medida a la dificultad para distinguirlas. Hasta la fecha, los estudios se han basado en células que expresan ubiquitinas mutagenizadas en las que se han eliminado una o más lisinas, en poliubiquitinas sintetizadas enzimáticamente de enlaces concretos o en técnicas como la espectrometría de masas para distinguir entre un tipo de poliubiquitina y otro. Cada uno de estos métodos no es demasiado apropiado o resulta dificultosos para el análisis del comportamiento fisiológico normal de poliubiquitinas enlazadas a lisinas concretas. Aunque hay anticuerpos que son específicos de las poliubiquitinas y distintos a los de las monoubiquitinas (Fujimoro et al., FEBS Lett. 349: 173-180 (1994)), aún no hay anticuerpos que puedan distinguir entre poliubiquitinas con distintos enlaces a lisinas. No es de sorprender, dadas sus importantes funciones en diversos procesos celulares, que la ubiquitina y las poliubiquitinas intervengan también en muchas enfermedades (véase Argües, Ubiquitin and Disease, R. G. Landes (1998)). En la pérdida de masa muscular se observa una desregulación de la ubiquitinas (Mitch and Goldberg, New Engl. J. Med. 335: 1897-905 (1996); Bodine et al., Science 294: 1704-1708 (2001)). Diversas enfermedades genéticas se han asociado a una actividad anómala de la ubiquitina, como es el caso de la fibrosis quística (Ward et al., Cell 83: 121-127 (1995)), el síndrome de Angelman (Kishino et al., Nature Genet. 15: 70-73 (1997)) y el síndrome de Liddle (Staub et al., EMBO J 16: 6325-6336 (1997)). La ubiquitina también desempeña un papel en las respuestas inmunitaria e inflamatoria; por ejemplo, se ha observado que la ubiquitina extracelular actúa como una especie de citocina, que inhibe la respuesta del TNF-a a la endotoxina en células mononucleares de la circulación periférica y que regula la hiporeactividad de la endotoxina (Majetschak et al., Blood 101 : 1882-1890 (2003); Ciechanover, EMBO J 17: 7151-7160 (1998)). Asimismo, tanto la ubiquitina como la poliubiquitina se han encontrado en el suero humano y se han observado concentraciones más altas de las dos moléculas en el suero de pacientes con enfermedades alérgicas y parasitosis (Takada et al., Clinical Chem. 43: 1188-1195 (1997)). La desregulación de varías vías mediadas por la ubiquitina también interviene en el cáncer (Spataro et al., Br. J. Cáncer 77: 448-55 (1998); Beckmann et al., Hum. Mutat. 25: 507-12 (2005)). Por ejemplo, las mutaciones en la ubiquitina ligasa heterodimérica BRCA1-BARD1 están asociadas a cáncer de mama (Hashizume et al., J. Biol. Chem. 276: 14537-40 (2001)), las mutaciones que alteran la capacidad de la vía de la ubiquitina para degradar Myc activan el potencial oncógeno de c-Myc (Salghetti et al., EMBO J. 18: 717-726 (1999)) y el v-Jun transformado no puede ser ubiquitinado y degradado porque su homólogo oncógeno, c-Jun, está ocasionando un crecimiento incontrolado (Ciechanover, EMBO J. 17: 7151-7160 (1998); Trier et al., Cell 78: 787-798 (1994)). La ubiquitina y la poliubiquitina se han estudiado sobre todo en el contexto de las enfermedades neurológicas (Chung et al., TI S 24(1 1 Suppl.) S7-S14 (2001)). Las inclusiones, cuerpos y ovillos neurofibri lares que se acumulan en la enfermedad de Huntington, la ataxia espinocerebelosa, las encefalopatías priónicas, la enfermedad de Pick, la enfermedad de los cuerpos de Lewy, la enfermedad de Parkinson y el Alzheimer muestran tinción positiva para anticuerpos de la monopoliubiquitina y/o poliubiquitina (Alves-Rodrigues et al., Trends Neurosci. 21 : 516-520 (1998); Cammarata et al., Neurosci Lett. 156: 96-98 (1993); Kalchman et al., J. Biol. Chem. 271 : 19385-94 (1996); Holmberg et al., Human Mol. Genet. 7: 913-918 (1998); Yedidia et al., EMBO J. 20: 5383-91 (2001); Morí et al., Science 235: 1641-44 (1987); Leigh et al., Acta Neuropathol. (Berl.) 79: 61-72 (1989); and Kuzuhara et al., Acta Neuropathologica 75: 345-353 (1988)). Varias formas de la enfermedad de Parkinson también se han asociado a mutaciones del gen hidrolasa Ll (UCH-L1) carboxiterminal de la ubiquitina, una desubiquitinasa (Leroy et al., Nature 395: 451-452 (1998)), mientras que otras formas de la enfermedad de Parkinson se han asociado a mutaciones desactivadoras de Parkin, una ubiquitina proteína ligasa dependiente de E2 que se sabe que interactúa con la enzima conjugante de la ubiquitina UbcH7 y que ubiquitina la sinfílina-1 (Shimura et al., Nature Genet. 25: 302-305 (2000), Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 97: 13354-13359 (2000); Lim et al., J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005)). Los dos tipos de mutaciones ocasionan un proceso proteolítico anómalo y la agregación incorrecta de proteínas (véase McNaught et al., Nature Rev. Neurosci. 2: 589-594 (2001)). Se ha identificado una forma muíante de la ubiquitina en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer, que se incorpora con gran eficacia a las cadenas de poliubiquitina, pero es resistente a la desubiquitinación una vez formada, lo que puede llevar a la inhibición dominante del sistema de procesos proteolíticos celulares normales (Lam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 97: 9902-9906 (2000)). Es evidente que sería beneficioso no solo disponer de composiciones y métodos que pudieran distinguir entre poliubiquitinas con distintos enlaces a Usinas, sino también de composiciones y métodos que sean eficaces para actuar sobre las vías mediadas por la ubiquitina y la poliubiquitina y modularlas. La invención de la presente memoria descriptiva ofrece dichas composiciones y métodos. Todas las referencias citadas en la misma, incluidas las solicitudes de patentes y publicaciones, quedan incorporadas a modo de referencia únicamente.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN La invención ofrece novedosos anticuerpos capaces de unirse y/o regular actividades biológicas asociadas a la poliubiquitina. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a una primera poliubiquitina que comprende un primer enlace a lisina, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a una segunda poliubiquitina que comprenda un segundo enlace a lisina y en la que el primer enlace a lisina es distinto del segundo enlace a lisina. En un aspecto, el anticuerpo se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 6, poliubiquitina enlazada a lisina 11, poliubiquitina enlazada a lisina 27, poliubiquitina enlazada a lisina 29, poliubiquitina enlazada a lisina 33, poliubiquitina enlazada a lisina 48 o poliubiquitina enlazada a lisina 63. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a una primera poliubiquitina enlazada a K48, en la que el anticuerpo no se une específicamente a una segunda poliubiquitina que comprenda una forma distinta de poliubiquitina enlazada a lisina (es decir, no una poliubiquitina enlazada a K48). En una forma de realización, la segunda poliubiquitina es poliubiquitina enlazada a K-63. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a una primera poliubiquitina enlazada a K63, en la que el anticuerpo no se une específicamente a una segunda poliubiquitina que comprenda una forma distinta de poliubiquitina enlazada a lisina (es decir, no una poliubiquitina enlazada a K63). En una forma de realización, la segunda poliubiquitina es poliubiquitina enlazada a K-48. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente tanto a una primera poliubiquitina que comprende un primer enlace a lisina como una segunda poliubiquitina que comprende un segundo enlace a lisina, en la cual el primer enlace a lisina es diferente del segundo enlace a lisina, el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina y el anticuerpo se une a la segunda poliubiquitina con una afinidad de unión sustancialmente menor que la afinidad de unión del anticuerpo para la primera poliubiquitina. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 48, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina. En una forma de realización, el anticuerpo comprende además al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada entre HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3 y HVR-L3 de cualquiera de los identificadores de secuencia núms: 1-25, 151-175, 265-279, 392-459 y 695-704; identificadores de secuencia núms: 27-51, 177-201, 281-295, 461-528 y 706-715; identificadores de secuencia núms: 53-77, 203-227, 297-311, 530-597 y 717-726; e identificadores de secuencia núms: 313-327 y 728-737, respectivamente. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, al menos una secuencia seleccionada entre HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-H1 comprende la secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d se selecciona entre valina, fenilalanina, leucina e isoleucina; el aminoácido e se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido f es tirosina, el aminoácido g se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido h se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x z a', en la que el aminoácido k es serina, el aminoácido 1 es isoleucina, el aminoácido m se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido n se selecciona entre prolina y serina, el aminoácido o es tirosina, el aminoácido p es tirosina, el aminoácido q se selecciona entre serina y glicina, el aminoácido r se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido s es treonina, el aminoácido t se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido u es tirosina, el aminoácido v es alanina, el aminoácido w es ácido aspártico, el aminoácido x es serina, el aminoácido y es valina, el aminoácido z es lisina y el aminoácido a' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica b' c' d' e' f g' h' i' j' k' G, en la que el aminoácido b' se selecciona entre ácido gutámico, serina, glicina y tirosina; el aminoácido c' se selecciona entre glicina, tirosina, serina y asparagina; el aminoácido d' se selecciona entre tirosina, serina, lisina, fenilalanina y ácido glutámico; el aminoácido e' se selecciona entre serina, tirosina, glicina y triptofanon; el aminoácido f se selecciona entre glutamina, tirosina, serina y glicina; el aminoácido g' se selecciona entre glicina, serina, tirosina, metionina y alanina; el aminoácido h' se selecciona entre glicina, alanina, prolina e isoleucina; el aminoácido i' se selecciona entre fenilalanina, isoleucina, metionina, alanina y leucina o no está presente; el aminoácido j' es fenilalanina o no está presente; el aminoácido k' es ácido aspártico; y el aminoácido G es tirosina. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, las secuencias HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3 correspondientes a las expuestas para los clones apuOl, apu02, apu03, apu04, apu05, apu06, apu07, apu08, apu09, apulO, apul l, apul2, apul3, apul4 o apul 5 en las Figuras lOA y 10 B. En una forma de realización, el anticuerpo comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-Hl comprende la secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d es isoleucina; el aminoácido e se selecciona entre serina y fenilalanina; el aminoácido f es tirosina, el aminoácido g se selecciona entre serina y glicina, el aminoácido h se selecciona entre serina y glicina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x z a', en la que el aminoácido k es serina, el aminoácido 1 es isoleucina, el aminoácido m es tirosina, el aminoácido n es serina, el aminoácido o es tirosina, el aminoácido p es tirosina, el aminoácido q es serina, el aminoácido r se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido s es treonina, el aminoácido t es serina, el aminoácido u es tirosina, el aminoácido v es alanina, el aminoácido w es ácido aspártico, el aminoácido x es serina, el aminoácido y es valina, el aminoácido z es Usina y el aminoácido a' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica b' c' d' e' f g' h' i' j' k', en la que el aminoácido b' se selecciona entre serina y glicina; el aminoácido c' es tirosina; el aminoácido d' es serina; el aminoácido e' se selecciona entre tirosina y triptofanon; el aminoácido f se selecciona entre serina, tirosina, arginina, fenilalanina e histidina; el aminoácido g' se selecciona entre ácido glutámico, serina, leucina, fenilalanina, metionina, asparagina y valina; el aminoácido h' se selecciona entre alanina y glicina; el aminoácido i' se selecciona entre leucina, metionina, fenilalanina e isoleucina; el aminoácido j' es ácido aspártico; y el aminoácido k' es tirosina. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, las secuencias HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3 que corresponde a las expuestas para los clones apu2.01, apu2.02, apu2.03, apu2.04, apu2.05, apu2.06, apu2.07, apu2.08, apu2.09 o apu2.10 en la Figura 16A. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia aminoacídica m' n' o' p' q' r' s' t' u' v' w', en la que el aminoácido m' es glutamina; el aminoácido n' es glutamina; el aminoácido o' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido p' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido q' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido r' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido s1 se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido t' se selecciona entre leucina, serina, prolina y tirosina; el aminoácido u' es prolina o no está presente; el aminoácido v' se selecciona entre fenilalanina, isoleucina, valina y leucina; y el aminoácido w' es treonina. En una forma de realización el anticuerpo comprende además una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 correspondiente a la secuencia HVR-L3 expuesta para los clones apuOl, apu02, apu03, apu04, apu05, apu06, apu07, apu08, apu09, apulO, apul 1, apul2, apul3, apul4 o apul5 en la Figura 10C. En una forma de representación, el anticuerpo comprende, además, una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia aminoacídica Q-Q-S-S-Y-S-S-L-I-T (identificador de secuencia n°: 728). En una forma de realización el anticuerpo comprende además una secuencia HVR-Ll del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 que corresponde a la secuencia HVR-L3 expuesta para los clones apu2.01, apu2.02, apu2.03, apu2.04, apu2.05, apu2.06, apu2.07, apu2.08, apu2.09 o apu2.10 en la Figura 16B. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 48, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina y el anticuerpo comprende una secuencia HVR-Hl de identifícador de secuencia n°: 269, una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 285, una secuencia HVR-H3 del identifícador de secuencia n°: 301, una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 317. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 48, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina y el anticuerpo comprende una secuencia HVR-Hl de identifícador de secuencia n°: 701, una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 712, una secuencia HVR-H3 del identifícador de secuencia n°: 723; una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 734. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 48, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina y el anticuerpo comprende una secuencia HVR-Hl de identifícador de secuencia n°: 701 , una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 712, una secuencia HVR-H3 del identificador de secuencia n°: 723 y una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79 y una secuencia HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identificador de secuencia n°: 734. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 63, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina. En una forma de realización, el anticuerpo comprende además al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada entre HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3 y HVR-L3 de cualquiera de los identificadores de secuencia núms: 81-89, 229-239, 329-336, 599-629 y 739-748; identificadores de secuencia núms: 91-99, 241-251, 338-345, 631-661 y 750-759; identificadores de secuencia núms: 101-109, 253-263, 347-354, 663-693 y 761-770; e identificadores de secuencia núms: 356-363 y 772-781, respectivamente. En una forma de realización, el anticuerpo comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-H1 comprende la secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d se selecciona entre valina, isoleucina y fenilalanina, el aminoácido e se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido f se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido g se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido h se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x y z a', en la que el aminoácido k se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido 1 es isoleucina; el aminoácido m se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido n se selecciona entre prolina y serina; el aminoácido o se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido p se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido q se selecciona entre serina y glicina; el aminoácido r se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido s es treonina; el aminoácido t se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido u es tirosina; el aminoácido v es alanina; el aminoácido w es ácido aspártico; el aminoácido x es serina; el aminoácido y es valina; el aminoácido z es Usina; y el aminoácido a' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica b' c' d' e' f g' h' i' j' k' G m' n' o' p' q' r' s' t' u' v', en la que el aminoácido b' se selecciona entre serina, ácido glutámico, glicina y triptofanon; el aminoácido c' se selecciona entre glicina, tirosina, isoleucina, glutamina y serina; el aminoácido d' se selecciona entre tirosina, metionina, glicina e isoleucina; el aminoácido e' se selecciona entre tirosina, arginina, fenilalanina, triptofanon, alanina y prolina; el aminoácido f se selecciona entre tirosina, triptofanon, serina y glicina; el aminoácido g' se selecciona entre glutamina, tirosina, serina, fenilalanina y valina; el aminoácido h' se selecciona entre glicina, treonina, triptofanon, lisina y prolina; el aminoácido i' se selecciona entre tirosina, alanina, triptofanon, ácido glutámico, prolina y serina; el aminoácido j' se selecciona entre triptofanon, isoleucina, tirosina y alanina; el aminoácido k' se selecciona entre triptofanon, tirosina, glicina y ácido aspártico o no está presente; el aminoácido G se selecciona entre tirosina, serina, fenilalanina y triptofanon o no está presente; el aminoácido m' se selecciona entre tirosina, ácido aspártico y serina o no está presente; el aminoácido n' se selecciona entre tirosina y alanina o no está presente; el aminoácido o' se selecciona entre treonina, serina, valina, glicina y tirosina o no está presente; el aminoácido p' se selecciona entre glicina, ácido aspártico, serina, metionina y tirosina o no está presente; el aminoácido q' se selecciona entre tirosina, alanina y glicina o no está presente; el aminoácido r' se selecciona entre tirosina, leucina y glicina o no está presente; el aminoácido s' es glicina o no está presente; el aminoácido t' se selecciona entre metionina y leucina o no está presente; el aminoácido u' es ácido aspártico; y el aminoácido v' es tirosina. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, las secuencias HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3 correspondientes a las expuestas para los clones apul7, apul 8, apul9, apu20, apu21, apu22, apu23 y apu24 en las Figuras 1 1A y 11 B. En una forma de realización, el anticuerpo comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-Hl comprende al secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d se selecciona entre isoleucina, valina y leucina; el aminoácido e se selecciona entre serina, Usina y valina; el aminoácido f se selecciona entre serina, triptofanon, glicina y treonina; el aminoácido g se selecciona entre serina, asparagina y glicina; el aminoácido h se selecciona entre tirosina, isoleucina, leucina y fenilalanina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x y z a', en la que el aminoácido k se selecciona entre tirosina, fenilalanina, ácido aspártico, histidina y alanina; el aminoácido 1 es isoleucina; el aminoácido m se selecciona entre serina, alanina y glutamina; el aminoácido n es prolina; el aminoácido o es tirosina; el aminoácido p se selecciona entre leucina, tirosina y fenilalanina; el aminoácido q se selecciona entre serina y glicina; el aminoácido r se selecciona entre serina, treonina y triptofano; el aminoácido s es treonina; el aminoácido t se selecciona entre serina, asparagina, lisina e isoleucina; el aminoácido u es tirosina; el aminoácido v es alanina; el aminoácido w es ácido aspártico; el aminoácido x es serina; el aminoácido y es valina; el aminoácido z es lisina; y el aminoácido a' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica b' c' d' e' f g' h' i' j' k' G, en la que el aminoácido b' es ácido glutámico; el aminoácido c' es tirosina; el aminoácido d' es tirosina; el aminoácido e' es arginina; el aminoácido f es triptofanon; el aminoácido g' es tirosina; el aminoácido h' es treonina; el aminoácido i' es alanina; el aminoácido j' es isoleucina; el aminoácido k' es ácido aspártico; y el aminoácido G es tirosina. En una forma de realización, el anticuerpo comprende las secuencias HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3 que corresponde a las expuestas para los clones apu2.11, apu2.12, apu2.13, apu2.14, apu2.15, apu2.16, apu2.17, apu2.18, apu2.19 y apu2.20 en la Figura 17A. En una forma de realización, el anticuerpo comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-Hl comprende al secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d se selecciona entre isoleucina, valina y leucina; el aminoácido e se selecciona entre lisina y metionina; el aminoácido f se selecciona entre treonina, metionina, asparagina, arginina e isoleucina; el aminoácido g se selecciona entre glicina, valina y fenilalanina; el aminoácido h se selecciona entre tirosina, isoleucina, leucina y fenilalanina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x y z a' b', en la que el aminoácido k es alanina; el aminoácido 1 es tirosina; el aminoácido m es isoleucina; el aminoácido n se selecciona entre serina, isoleucina y treonina; el aminoácido o es prolina; el aminoácido p es tirosina; el aminoácido q se selecciona entre leucina, tirosina, ácido aspártico, serina y triptofanon; el aminoácido r es glicina; el aminoácido s se selecciona entre triptofanon, valina, serina, asparagina, arginina y tirosina; el aminoácido t es treonina; el aminoácido u se selecciona entre arginina, asparagina, valina, treonina, serina y Usina; el aminoácido v es tirosina; el aminoácido w es alanina; el aminoácido x es ácido aspártico; el aminoácido y es serina; el aminoácido z es valina; el aminoácido a' es Usina; y el aminoácido b' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica c' d' e' f g' h' i' j' k' G m' n' o' , en la que el aminoácido c' es serina; el aminoácido d' es arginina; el aminoácido e' es ácido glutámico; el aminoácido f es tirosina; el aminoácido g' es tirosina; el aminoácido h' es arginina; el aminoácido i' es triptofanon; el aminoácido j' es tirosina; el aminoácido k' es treonina; el aminoácido G es alanina; el aminoácido m' es isoleucina; el aminoácido n' es ácido aspártico; y el aminoácido o' es tirosina. En una forma de realización, el anticuerpo comprende las secuencias HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 que corresponde a las expuestas para los clones apu3.01, apu3.02, apu3.03, apu3.04, apu3.05, apu3.06, apu3.07, apu3.08, apu3.09, apu3.10 y 3.11 en la Figura 23. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia aminoacídica m' w' x' y' z' A B C D E F G, en la que el aminoácido w' es glutamina; el aminoácido x' es glutamina; el aminoácido y' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido z' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido A se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido B se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido C se selecciona entre prolina, serina y leucina; el aminoácido D se selecciona entre serina, prolina y tirosina o no está presente; el aminoácido E se selecciona entre leucina y fenilalanina o no está presente; el aminoácido F se selecciona entre fenilalanina, valina, treonina e isoleucina; y el aminoácido G se selecciona entre arginina, treonina y fenilalanina. En una forma de realización el anticuerpo comprende una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 que corresponde a la secuencia HVR-L3 expuesta para los clones apul7, apul8, apul9, apu20, apu21, apu22, apu23 y apu24 en la Figura 11C. En una forma de representación, el anticuerpo comprende una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia aminoacídica Q-Q-Y-S-S-Y-S-S-L-F-T (identifícador de secuencia n°: 772). En una forma de realización el anticuerpo comprende una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 que corresponde a la secuencia HVR-L3 expuesta para los clones apu2.11, apu2.12, apu2.13, apu2.14, apu2.15, apu2.16, apu2.17, apu2.18, apu2.19 y apu2.20 en la Figura 17B. En una forma de realización el anticuerpo comprende una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 que corresponde a la secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 777. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 63, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina y el anticuerpo comprende una secuencia HVR-Hl de identifícador de secuencia n°: 330, una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 339, una secuencia HVR-H3 del identifícador de secuencia n°: 348, una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 357. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 63, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina y el anticuerpo comprende una secuencia HVR- Hl de identificador de secuencia n°: 739, una secuencia HVR-H2 del identificador de secuencia n°: 750, una secuencia HVR-H3 del identificador de secuencia n°: 761, una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identificador de secuencia n°: 772. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a Usina 63, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina y el anticuerpo comprende una secuencia HVR-Hl de identificador de secuencia n°: 740, una secuencia HVR-H2 del identificador de secuencia n°: 751 , una secuencia HVR-H3 del identificador de secuencia n°: 762, una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identificador de secuencia n°: 773. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a Usina 63, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina y el anticuerpo comprende una secuencia HVR-Hl de identificador de secuencia n°: 744, una secuencia HVR-H2 del identificador de secuencia n°: 755, una secuencia HVR-H3 del identificador de secuencia n°: 766, una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identificador de secuencia n°: 777. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a Usina 63, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina y el anticuerpo comprende una secuencia HVR-Hl de identificador de secuencia n°: 795, una secuencia HVR-H2 del identificador de secuencia n°: 807, una secuencia HVR-H3 del identificador de secuencia n°: 819, una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 777. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado que se une al mismo determinante antigénico sobre la poliubiquitina que el anticuerpo de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, en el que el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado que compite con cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente para la unión a poliubiquitina, en el que el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina. En un aspecto, cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente se une específicamente a una proteína poliubiquitinada. En un aspecto, al anticuerpo inhibe, además, la degradación de la proteína poliubiquitinada. En un aspecto, el anticuerpo modula, además, una vía de señalización mediada por poliubiquitina. En un aspecto, el anticuerpo inhibe, además, una vía de señalización mediada por poliubiquitina. En un aspecto, el anticuerpo estimula, además, una vía de señalización mediada por poliubiquitina. En un aspecto, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención. En un aspecto, se proporciona un vector que comprende el ácido nucleico. En un aspecto, se proporciona un anfitrión celular que comprende el vector. En un aspecto, se proporciona una estirpe celular capaz de producir un anticuerpo de la invención. En un aspecto, se proporciona un método para producir un anticuerpo de la invención, que comprende el cultivo de un anfitrión celular que comprenda una molécula de ácido nucleico que codifique el anticuerpo en condiciones en las que el anticuerpo se produce. En un aspecto, se proporciona una composición que contenga una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, se proporciona un método para identificar la presencia de poliubiquitina o de una proteína poliubiquitinada en una muestra, que permita el contacto de la muestra con al menos uno de los anticuerpos de la invención. En un aspecto, se proporciona un método para el tratamiento de un enfermedad o proceso asociado a la desregulación de la poliubiquitina en un paciente y el método incluye la administración al paciente de una cantidad eficaz de al menos uno de los anticuerpos de la invención. En un aspecto, el pacientes es un mamífero. En un aspecto, el paciente es humano. En un aspecto, la enfermedad se selecciona entre cáncer, un trastorno muscular, un trastorno genético relacionado con la vía de la ubiquitina, una enfermedad inflamatoria/inmunitaria y un trastorno neurológico. En un aspecto, la enfermedad se selecciona entre carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, distrofia muscular, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, fibrosis quística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pick y enfermedad de Paget. En un aspecto se proporciona un método para determinar la presencia de una poliubiquitina o de una proteína poliubiquitinada en una muestra que se cree que contiene una poliubiquitina o una proteína poliubiquitinada, que comprende la exposición de la muestra a al menos uno de los anticuerpos de la invención y la determinación de la unión a al menos uno de los anticuerpos a una poliubiquitina o proteína poliubiquitinada en la muestra.

En un aspecto, se proporciona un método para separar una proteína poliubiquitinada de una proteína no poliubiquitinada en una muestra, lo que comprende el contacto de la muestra con al menos uno de los anticuerpos de la invención. En un aspecto, se proporciona un método para determinar la función y/o actividad de una poliubiquitina en una célula, lo que comprende el contacto de la célula con al menos uno de los anticuerpos de la invención y la evaluación del efecto de dicho paso de contacto en la célula. En un aspecto, se proporciona un método para determinar la función y/o actividad de una poliubiquitina en una muestra, lo que comprende el contacto de la muestra con al menos uno de los anticuerpos de la invención y la evaluación del efecto de dicho paso de contacto en la muestra. En otra forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a una poliubiquitina enlazada a Usina 63, en la que el anticuerpo se une a un epítopo en la poliubiquitina enlazada a lisina 63. En un aspecto, el epítopo incluye residuos tanto en una primera subunidad con ubiquitina como en una segunda subunidad con ubiquitina de la poliubiquitina enlazada a lisina 63. En otro de estos aspectos, el epítope incluye al menos uno de los residuos de una primera subunidad de ubiquitina seleccionada entre Glu-18, Pro-19, Ser-20, Asp-21, Thr-55, Leu-56, Ser-57, Asp-58, Asn-60, Ile-61 y Gln-62. En otro de estos aspectos, el epítopo incluye al menos uno de los residuos de una segunda subunidad de ubiquitina seleccionada entre Leu-8, Thr-9, Glu-34, Gly-35, Ile-36, Pro-37, Asp-39, Gln-40, Leu-71, Arg-72, Leu-73, Arg-74 y Gly-75. En otro de estos aaspectos, el epítopo incluye al menos uno de los residuos en una primera subunidad de ubiquitina seleccionada entre Glu-18, Pro-19, Ser-20, Asp-21, Thr-55, Leu- 56, Ser-57, Asp-58, Asn-60, Ile-61y Gln-62 y al menos uno de los residuos en una segunda subunidad de ubiquitina seleccionada entre Leu-8, Thr-9, Glu-34, Gly-35, Ile-36, Pro-37, Asp-39, Gln-40, Leu-71, Arg-72, Leu-73, Arg-74 y Gly-75. En una forma de realización, se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a una primera poliubiquitina que comprende al menos un enlace isopéptidico a un primer residuo de lisina en una primera posición aminoacídica de una molécula de ubiquitina, en la cual el anticuerpo no se une específicamente a una segunda poliubiquitina que comprenda al menos un enlace isopéptidico a un segundo residuo de lisina en una segunda posición aminoacídica de una molécula de ubiquitina y en la cual difieren la primera y la segunda posiciones aminoacídicas. Un anticuerpo de la invención puede estar en diversas formas. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención no es un anticuerpo humano, por ejemplo, no es un anticuerpo producido en un ratón transgénico (por ejemplo, como se describe en el documento W096/33735). Un anticuerpo de la invención puede ser de longitud completa o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento que comprenda un componente de unión a antígeno). En otra forma de realización, la invención proporciona un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A muestra la secuencia aminoacídico de la ubiquitina humana y los residuos de lisina se indican con texto subrayado y en negrita. La Figura IB muestra un dibujo esquemático del enlace formado entre la lisina 48 o la lisina 63 de una primera molécula de ubiquitina y el residuo glicínico carboxiterminal de una segunda molécula de ubiquitina. Las Figuras 2A-2C muestran las secuencias en bucle de HVR de la cadena pesada de moléculas del anticuerpo antipoliubiquitina que reconocen específicamente la poliubiquitina enlazada a K48, como se describe en el Ejemplo 1(A). El designador "48" indica que la molécula del anticuerpo reconoce específicamente la poliubiquitina enlazada a K48. El designador "ambos" indica que la molécula del anticuerpo reconoce tanto la poliubiquitina enlazada a K48 como la enlazada a K63. El designador "todos" indica que la molécula del anticuerpo reconoce tanto la poliubiquitina enlazada a K48 como la enlazada a K63, así como la monoubiquitina. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las figuras muestran las secuencias de HVR de cadena pesada, Hl, H2 y H3. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. Las Figuras 3A-3B muestran las secuencias en bucle de HVR de la cadena pesada de moléculas del anticuerpo antipoliubiquitina que reconocen específicamente la poliubiquitina enlazada a K63, como se describe en el Ejemplo 1(A). El designador "63" indica que la molécula del anticuerpo reconoce específicamente la poliubiquitina enlazada a K63. El designador "ambos" indica que la molécula del anticuerpo reconoce tanto la poliubiquitina enlazada a K63 como la enlazada a K48. El designador "todos" indica que la molécula del anticuerpo reconoce tanto la poliubiquitina enlazada a K63 como la enlazada a K48, así como la monoubiquitina. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las figuras muestran las secuencias de HVR de cadena pesada, Hl, H2 y H3. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. Las Figuras 4 A y 4B y 5 muestran ejemplos de secuencias de estructuras de consenso humanas de aceptor para uso en la práctica de la invención con identifícadores de secuencia como se indica a continuación: Estructuras de consenso pesada variable (VH) (Figuras 4A y 4B) Estructura de consenso del subgrupo I humano VH menos las CDR de Kabat (identificador de secuencia n°: 1 1 1) Estructura de consenso del subgrupo I humano VH menos regiones hipervariables extendidas (identificador de secuencia núms: 1 12-114) Estructura de consenso del subgrupo II humano VH menos las CDR de Kabat (identificador de secuencia n°: 115) Estructura de consenso del subgrupo II humano VH menos regiones hipervariables extendidas (identificador de secuencia núms: 1 16-118) Estructura de consenso del subgrupo III humano VH menos las CDR de Kabat (identificador de secuencia n°: 1 19) Estructura de consenso del subgrupo III humano VH menos regiones hipervariables extendidas (identificador de secuencia núms: 120-122) Estructura del aceptor humano VH menos las CDR de Kabat (identificador de secuencia n°: 123) Estructura del aceptor humano VH menos regiones hipervariables extendidas (identificador de secuencia núms: 124-125) Estructura del aceptor 2 humano VH menos las CDR de Kabat (identificador de secuencia n°: 126) Estructura del aceptor 2 humano VH menos regiones hipervariables extendidas (identificador de secuencia núms: 127-129) Estructuras de consenso ligera variable (VL) (Figuras 5A y 5B) Estructura de consenso del subgrupo I humano kappa VL (identificador de secuencia n°: 130) Estructura de consenso del subgrupo II humano kappa VL (identificador de secuencia n°: 131) Estructura de consenso del subgrupo III humano kappa VL (identificador de secuencia n°: 132) Estructura de consenso del subgrupo IV humano kappa VL (identificador de secuencia n°: 133) La Figura 6 muestra las secuencias de la región estructural de las cadenas ligera y pesada de huMAb4D5-8. Los números que aparecen como superíndice/negrita indican posiciones de aminoácidos según Kabat. La Figura 7 muestra las secuencias de la región estructural modificada/variante de las cadenas ligera y pesada de huMAb4D5-8. Los números que aparecen como superíndice/negrita indican posiciones de aminoácidos según Kabat. Las Figuras 8A-8C muestran las secuencias en bucle de HVR de la cadena pesada de moléculas del anticuerpo antipoliubiquitina que reconocen específicamente la poliubiquitina enlazada a K48, como se describe en el Ejemplo 1(A). Las figuras muestran las secuencias de HVR de cadena pesada, Hl, H2 y H3. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. Las Figuras 9A-9B muestran las secuencias en bucle de HVR de la cadena pesada de moléculas del anticuerpo antipoliubiquitina que reconocen específicamente la poliubiquitina enlazada a K63, como se describe en el Ejemplo 1(A). Las figuras muestran las secuencias de HVR de cadena pesada, Hl, H2 y H3. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. Las Figuras 10A-10C muestran las secuencias en bucle de HVR de cadena ligera y de cadena pesada de moléculas de anticuerpos antipoliubiquitina apu01-apul5 que reconocen específicamente la poliubiquitina enlazada a K48 y que eran reconocidos por un anticuerpo específico para pentahistidina, como se describe en el Ejemplo 1(B). Las figuras muestran las secuencias de HVR de cadena pesada, Hl, H2 y H3 y la secuencia de HVR de cadena ligera, L3. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. Las Figuras 1 1 A-l 1C muestran las secuencias en bucle de HVR de la cadena ligera y de la cadena pesada de moléculas de anticuerpos antipoliubiquitina apul7-apu24 que reconocen específicamente la poliubiquitina enlazada a K63 y que eran reconocidos por un anticuerpo específico para pentahistidina, como se describe en el Ejemplo 1(B). Las figuras muestran las secuencias de HVR de cadena pesada, Hl, H2 y H3 y la secuencia de HVR de cadena ligera, L3. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. La Figura 12 muestra las interacciones de unión entre varias concentraciones del Fab de antipoliubiquitina apu09 y de la poliubiquitina enlazada a K63 o a K48 observadas usando el análisis BIACORE®, como se describe en el ejemplo 1(C). La Figura 13A - 13C muestra las interacciones de unión entre varias concentraciones del Fab de antipoliubiquitina apul8 y de la poliubiquitina enlazada a K63 o a K48 observadas usando el análisis BIACORE®, como se describe en el ejemplo 1(C). Las Figuras 14A-14F muestran las secuencias en bucle de HVR de la cadena pesada de moléculas de anticuerpos antipoliubiquitina de segunda generación basadas en la secuencia del Fab de apu05, que reconoce específicamente la poliubiquitina enlazada a K48, como se describe en el Ejemplo 2. Las figuras muestran las secuencias de HVR de la cadena pesada, Hl, H2 y H3. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. El texto sombreado indica que la secuencia es idéntica a la secuencia aminoacídica de la secuencia de HVR correspondiente en el Fab apu05. El texto en negrita indica que el anticuerpo ha demostrado una unión fuerte en el inmunoanálisis ELISA de fagos descrito en el Ejemplo 2. Las Figuras 15A-15C muestran las secuencias en bucle de HVR de la cadena pesada de moléculas de anticuerpos antipoliubiquitina de segunda generación basadas en la secuencia del Fab de apul 8, que reconoce específicamente la poliubiquitina enlazada a K63, como se describe en el Ejemplo 2. Las figuras muestran las secuencias de HVR de la cadena pesada, Hl, H2 y H3. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. El texto sombreado indica que la secuencia es idéntica a la secuencia aminoacídica de la secuencia de HVR correspondiente en el Fab de apul8. El texto en negrita indica que el anticuerpo ha demostrado una unión fuerte en el inmunoanálisis ELISA de fagos descrito en el Ejemplo 2. Las Figuras 16A y 16B muestran las secuencias aminoacídicas de las regiones hipervariables de la cadena pesada de las moléculas del Fab derivadas del apu05 mutagenizado que reconocía específicamente la poliubiquitina enlazada a K48 (apu2.01-apu2.10) y que era reconocido por un anticuerpo específico para la pentahistidina, como se describe en el ejemplo 2. Las figuras muestran las secuencias de HVR de la cadena pesada, Hl, H2 y H3, y la secuencia de HVR de la cadena ligera, L3. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. El texto sombreado indica que la secuencia es idéntica a la secuencia aminoacídica de la secuencia de HVR correspondiente en el Fab apu05. Las Figuras 17A y 17B muestran las secuencias aminoacídicas de las regiones hipervariables de la cadena pesada de las moléculas del Fab derivadas del apul 8 mutagenizado que reconocía específicamente la poliubiquitina enlazada a K63 (apu2.1 1-apu2.20) y que era reconocido por un anticuerpo específico para la pentahistidina, como se describe en el ejemplo 2. Las figuras muestran las secuencias de HVR de la cadena pesada, Hl, H2 y H3, y la secuencia de HVR de la cadena ligera, L3. El designador "n.p." indica que determinados clones no tenían un aminoácido en la posición indicada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de abat, como se describe más adelante. El texto sombreado indica que la secuencia es idéntica a la secuencia aminoacídica de la secuencia de HVR correspondiente en el Fab de apul 8. La Figura 18 muestra los resultados del inmunoanálisis ELISA en fagos descrito en el ejemplo 2, en el que se evaluaba la unión de cada uno de los Fab de segunda generación de apu2.01-2.20 a poliubiquitina enlazada a K48, poliubiquitina enlazada a K63, monoubiquitina y albúmina de suero bovino. Las Figuras 19A y 19B muestran los resultados de experimentos de Western blotting descritos en el ejemplo 1. La Figura 19A muestra la unión de los Fab producidos desde los clones apuOl a apul5 hasta la tetraubiquitina enlazada a K48 inmovilizada. La Figura 19B muestra una falta de unión de los Fab producidos desde los clones apul 8 a apu24 hasta la poliubiquitina enlazada a K63 inmovilizada. Las figuras 20A y 20B muestran los resultados de los experimentos de western blotting descritos en el ejemplo 2. La Figura 20A muestra la unión de apu2.01-apu2.10 a tetraubiquitina enlazada a K48 inmovilizada y la falta de unión a diubiquitina enlazada a K63 inmovilizada. La Figura 20B muestra la unión de apu2.1 l -apu2.20 a tetraubiquitina enlazada a K63 inmovilizada y la falta de unión a diubiquitina enlazada a K48 inmovilizada. Las Figuras 21 A y 21 B muestran los análisis Western blot procedentes de experimentos de inmunoprecipitación para detectar el estado de ubiquitinación de la RIP, como se describe en el Ejemplo 3. El análisis de la Figura 21 A incluye muestras que se han inmunoprecipitado con apu2.16 IgG para capturar proteínas poliubiquitinadas enlazadas a K63. El análisis de la Figura 21B incluye muestras que se han inmunoprecipitado con apu2.07 IgG para capturar proteínas poliubiquitinadas enlazadas a K48. La tinción usada en los dos análisis fue un anticuerpo anti-RIP. La Figura 22 muestra los resultados del inmunoanálisis ELISA en fagos descrito en el ejemplo 4, en el que se evaluaba la unión de cada uno de los clones de tercera generación apu3.01-3.12 a poliubiquitina enlazada a K48, poliubiquitina enlazada a K63, monoubiquitina y albúmina de suero bovino. La Figura 23A - 23B muestra las secuencias aminoacídicas de las regiones hipervariables de la cadena pesada de clones derivados de apu2.16 mutagenizado que reconocía específicamente la poliubiquitina enlazada a K63 (apu3.01-apu3.12), como se describe en el ejemplo 4. Las figuras muestran las secuencias de la HVR de la cadena pesada, Hl, H2 y H3. El designador "ND." indica que la secuencia no fue determinada. Las posiciones aminoacídicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. El texto sombreado indica que la secuencia es idéntica a la secuencia aminoacídica de la secuencia de HVR correspondiente en apu2.16. Las figuras 24A-24D muestran los resultados de los experimentos de western blotting descritos en el ejemplo 4. La Figura 24A muestra la unión de apu2.07 IgG a una tri- a heptaubiquitina enlazada a K48 inmovilizada y la falta de unión a monoubiquitina o tri- a heptaubiquitina enlazadas a K63 inmovilizada. La Figura 24B muestra la unión de apu3.07 IgG a tri- a hepataubiquitina enlazada a K63 inmovilizada y la falta de unión a monoubiquitina o tri- a heptaubiquitina enlazada a K48 inmovilizada. La Figura 24C muestra la unión dependiente de la concentración de apu2.07 IgG a tetraubiquitina enlazada a K48 inmovilizada y la falta de unión a tetraubiquitina enlazada a K63 inmovilizada. La Figura 24D muestra la unión dependiente de la concentración de apu3.07 IgG a tetraubiquitina enlazada a K63 inmovilizada y la falta de unión a tetraubiquitina enlazada a K48 inmovilizada. La Figura 25 muestra los resultados de un experimento Western blotting descrito en el Ejemplo 4. La figura muestra la unión de un anticuerpo policlonal anti-ubiquitina, apu2.07 IgG, and apu3.07 IgG a lisados inmovilizados de células 293T tratadas (+) o no tratadas (-) con Velcade®. Las Figuras 26A-26C muestran las interacciones entre un fab específico de poliubiquitina enlazada a K63 de la invención y poliubiquitina enlazada a K63 como se determina mediante análisis cristalográfico. La Figura 26A muestra el complejo formado entre el fab específico de poliubiquitina enlazada a K63 apu2.16 y una diubiquitina enlazada a K63. Apu2.16 se muestra en el diagrama en forma de cinta situado en la parte inferior de la figura, mientras que la diubiquitina enlazada a K63 se muestra en forma globular en la parte superior de la figura. La Figura 26B muestra la superficie de la diubiquitina enlazada a K63, con los residuos dentro de 4.5 Á del fragmento en color gris oscuro y los residuos de interés marcados. La Figura 26C muestra la superficie de apu2.16, con esos residuos dentro de 4.5 Á del dímero de la ubiquitina enlazada a K63 en color gris oscuro. Las CDR están marcadas.

MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Técnicas generales La práctica de la presente invención empleará, salvo indicación en contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la técnica conocida. Estas técnicas se explican completamente en la literatura sobre la materia, como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", third edition (Sambrook et al., 2001); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullís et al., ed., 1994); PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)); Harlow and Lañe, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); and "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001).

Definiciones En la presente memoria descriptiva, los términos "ubiquitina" y "monoubiquitina" son intercambiables y se definen como todas las especies de ubiquitina sintética y humana nativa sustancialmente similares a una proteína de 76 aminoácidos que contiene al menos un residuo de Usina en el aminoácido 6, el aminoácido 22, el aminoácido 27, el aminoácido 29, el aminoácido 33, el aminoácido 48 y/o el aminoácido 63. En la presente memoria descriptiva, por "poliubiquitina" se entienden todas las especies de cadenas poliméricas sintéticas y humanas nativas de ubiquitina que pertenecen a clases sintéticas y humanas de diferentes enlaces poliméricos de ubiquitina, incluidas poliubiquitina enlazada a K6, poliubiquitina enlazada a K22, poliubiquitina enlazada a K27, poliubiquitina enlazada a K29, poliubiquitina enlazada a K33, poliubiquitina enlazada a K48 y poliubiquitina enlazada a K63. La poliubiquitina puede ser de cualquier longitud e incluye al menos dos porciones de ubiquitina. La poliubiquitina se distingue de repeticiones en tándem de ubiquitina que se expresan originalmente como una proteína única. En la presente memoria descriptiva, los términos "poliubiquitina enlazada a K*" y "poliubiquitina enlazada a Lys*" son intercambiables y se refieren a una molécula de poliubiquitina que comprende al menos una unión isopeptídica entre el extremo carboxiterminal de una porción de ubiquitina y una lisina en posición * en otra porción de ubiquitina. Por ejemplo, una "poliubiquitina enlazada a K63" se usa de forma intercambiable con una "poliubiquitina enlazada a Lys63 " y los dos términos se refieren a una molécula de poliubiquitina que comprende una unión isopeptídica entre el extremo carboxiterminal de una de las porciones de ubiquitina en la molécula y la lisina en posición 63 en otra porción de ubiquitina en la molécula. En la presente memoria descriptiva, una afirmación en el sentido de que un primer enlace a lisina "difiere" de un segundo enlace a lisina indica que el primer enlace a lisina entre una porción de ubiquitina y otra porción de ubiquitina contiene un residuo de lisina diferente (por ejemplo, K6, K22, K27, K29, K33, K48 y/o K63) al del segundo enlace a lisina entre una porción de ubiquitina y otra porción de ubiquitina. En la presente memoria descriptiva, por "vía de la ubiquitina" se entiende una vía bioquímica en una célula o reconstituida in vitro que incluye ubiquitina y/o poliubiquitina.

Un anticuerpo "aislado" es aquél que se ha identificado y separado, y/o recuperado, a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en la investigación, el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En una realización, el anticuerpo se purificará (1) en más del 95% de su peso tal como se determina, por ejemplo, por el método de Lowry, y en algunas realizaciones, en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o internos mediante el uso, por ejemplo, de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, empleando, por ejemplo, una tinción con azul de Coomassie o plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. En cualquier caso, normalmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. En la presente memoria descriptiva, los términos "anticuerpo anti-ubiquitina" y "anticuerpo antimonoubiquitina" son intercambiables y se refieren a un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una molécula de ubiquitina. En la presente memoria descriptiva, por "anticuerpo antipoliubiquitina" se entiende un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una molécula de poliubiquitina. En la presente memoria descriptiva, por "anticuerpo antipoliubiquitina enlazado a 48" se entiende un anticuerpo capaz de unirse específicamente a poliubiquitina enlazada a K48.

En la presente memoria descriptiva, por "anticuerpo antipoliubiquitina enlazado a K63" se entiende un anticuerpo capaz de unirse a poliubiquitina enlazada a K63. Las frases "sustancialmente similar", "sustancialmente el/la mismo(a)", "equivalente" o "sustancialmente equivalente", tal y como se usan en la presente memoria descriptiva" denotan un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado a una molécula y el otro asociado a una molécula de control/referencia), de forma que alguien experto en la materia consideraría la diferencia entre los dos valores de escasa significación estadística y/o biológica dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd, efectos antivíricos, etc.). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, inferior al 50% aproximadamente, al 40% aproximadamente, al 30% aproximadamente, al 20% aproximadamente y/o al 10% aproximadamente como función del valor para la molécula de control/referencia. Las frases "sustancialmente reducido(a)", "sustancialmente diferente", tal y como se usan en la presente memoria descriptiva" denotan un grado suficientemente elevado de diferencia entre dos valores numéricos (por lo general, uno asociado a una molécula y el otro asociado a una molécula de control/referencia), de forma que alguien experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene una significación estadística y/o biológica dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, superior al 10% aproximadamente, al 20% aproximadamente, al 30% aproximadamente, al 40% aproximadamente y/o al 50% aproximadamente como función del valor para la molécula de control/referencia.

Por "afinidad de unión" generalmente se entiende la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su molécula de enlace (por ejemplo, un antígeno). Salvo indicación en contrario, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 : 1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su molécula de enlace Y se puede representar por lo general mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante métodos habituales conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la presente memoria descriptiva. Los anticuerpos de baja afinidad se suelen unir al antígeno lentamente y se suelen disociar de inmediato, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen al antígeno más rápidamente, por lo general, y suelen permanecer unidos más tiempo. Son diversos los métodos de medir la afinidad de unión conocidos en la técnica y todos ellos se pueden utilizar para los fines de la presente invención. A continuación, se describen, a modo de ejemplo, formas de realización específicas. En una forma de realización, el "Kd" o el "valor Kd" según esta invención se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno, como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de Fab a antígenos se mide equilibrando los Fab con una concentración mínima del antígeno marcado en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado y, luego, capturando el antígeno unido con una placa de anticuerpo de revestimiento anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer las condiciones del ensayo, las placas de microtitulación (Dynex) son recubiertas durante toda la noche con 5 µ^p?? de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato sódico (pH 9,6) y, a continuación, son bloqueadas con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (23 °C aproximadamente). En una placa no adsorbente (Nunc n° 269620), 100 pM o 26 pM de antígeno marcado con [^5j] se mezclan con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, que concuerde con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). A continuación, el Fab de interés se incuba durante toda la noche; no obstante, la incubación puede continuar durante más tiempo (por ejemplo, 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego, se extrae la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS. Una vez secas las placas, se añaden 150 µ?/pocillo de centelleador (MicroScint-20; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que proporcionan menos del 20% de unión máxima o un 20% para uso en ensayos de unión competitivos. Según otra forma de realización, el Kd o valor Kd se mide utilizando análisis de resonancia plasmón de superficie que usa BIAcoreTM_2000 o BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). Los biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 µ^??? (~0.2 µ?) antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína emparejada. Tras la inyección del antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyecta el doble de diluciones seriadas de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25 °C a un caudal de 25 µ?/min aproximadamente. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (kon) se calculan utilizando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmuir (BlAcore Evaluation Software, versión 3.2) al encajar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como el cociente k0ff kon Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la tasa de asociación excede de 10^ M~l s~l según el ensayo de resonancia plasmón de superficie mencionado anteriormente, la tasa de asociación se puede determinar utilizando una técnica de absorción fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de frecuencia) a 25 °C de 20 nM de un anticuerpo anti-antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones cada vez más elevadas de antígeno según medición en un espectrómetro, como un espectrómetro equipado con módulo "stop-flow" (interruptor de flujo) (Aviv Instruments) o un espectrómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitador. Según esta invención, también se puede determinar la "tasa de asociación" o "kon" con la misma técnica de resonancia plasmón de superficie descrita anteriormente utilizando BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU). Los biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 µg/ml (-0.2 µ?) antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína emparejada. Tras la inyección del antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyecta el doble de diluciones seriadas de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25 °C a un caudal de 25 µ?/min aproximadamente. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koft) se calculan utilizando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmuir (BIAcore Evaluation Software, versión 3.2) al encajar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculaba como el cociente kof kon Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881.

Sin embargo, si la tasa de asociación excede de 10^ M~l s~l según el ensayo de resonancia plasmón de superficie mencionado anteriormente, la tasa de asociación se puede determinar utilizando una técnica de absorción fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de frecuencia) a 25 °C de 20 nM de un anticuerpo anti-antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones cada vez más elevadas de antígeno según medición en un espectrómetro, como un espectrómetro equipado con módulo "stop-flow" (interruptor de flujo) (Aviv Instruments) o un espectrómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitador. En la presente memoria descriptiva, por "vector" se entiende una molécula de un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un bucle de ADN circular de doble hebra al que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector fágico. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos adicionales de ADN se pueden ligar al genoma vírico. Algunos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en un anfitrión celular en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales en mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales en mamíferos) se pueden integrar en el genoma de un anfitrión celular al introducirse en el anfitrión y, de este modo, se replican al mismo tiempo que el genoma del anfitrión. Asimismo, hay vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados por su función. Estos vectores se denominan en la presente memoria descriptiva "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante tienen con frecuencia la forma de plásmidos. En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" son intercambiables, dado que el plásmido es la forma de vector más frecuentemente usada. En la presente memoria descriptiva, "polinucleótido", o "ácido nucleico", son términos usados indistintamente y se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede incluir nucleótidos modificados, como nucleótidos mediados y sus análogos. De estar presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede producir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede ser modificado nuevamente tras la síntesis, por ejemplo mediante conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "cofias", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de forma natural por un análogo; modificaciones de enlaces internucleótidos, como aquellas en las que intervienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.); las que contienen porciones colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.); las que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.); las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.); las que contienen alquilantes; las que contienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), así como formas no modificadas de polinucleótido(s). Asimismo, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los azúcares puede ser sustituido, por ejemplo, por grupos de fosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede ser conjugado a soportes sólidos o semisólidos. El OH terminal 5' y 3' puede ser fosforilado y sustituido por aminas o porciones de grupos orgánicos en casquete (capping) de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden ser derivatizados a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidos en este ámbito; por ejemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-allil, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares f ranosas, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleósidos básicos como metil ribosida. Uno o más enlaces de fosfodiéster pueden ser sustituidos por otros grupos de enlace alternativos. Estos grupos alternativos de enlace incluye formas de realización en las que el fosfato es sustituido por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ("formacetal"), donde cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1 a 20 C) que contiene opcionalmente un enlace a éter (-0-), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil o aradil. No todos los enlaces en un polinucleótido tienen que ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en la presente memoria descriptiva, incluido el ARN y el ADN. En la presente memoria descriptiva, "oligonucleótido" se refiere por lo general a polinucleótidos cortos, habitualmente de hebra única y sintéticos que suelen tener una longitud inferior a 200 nucleótidos, aunque no necesariamente. Los términos "oligonucleótido" y "poligonucleótido" no se excluyen mutuamente. La descripción anteriormente incluida sobre polinucleótidos es aplicable igualmente y en su integridad a los oligonucleótidos. Los "anticuerpos" (Ab) e "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que por lo general no presentan especificidad a antígenos. Por ejemplo, los polipéptidos de la última clase se producen a niveles bajos en el sistema linfático y a niveles mayores por los mielomas. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos monovalentes, anticuerpos polivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos en tanto en cuanto presenten la actividad biológica deseada) y también pueden incluir determinados de anticuerpos (como se describe en mayor detalle en la presente memoria descriptiva). Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o con afinidad madurada. Por "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo" se entienden los dominios amino terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Estos dominios suelen ser las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular con relación a su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos, denominados regiones de determinación de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, de los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman estructura (FR). Cada dominio variable de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FR que, en gran parte, adoptan una configuración de hoja-ß, conectadas por tres CDR, que crean bucles que conectan la estructura de la hoja-ß, y en algunos casos forman parte de ella. Las CDR de cada cadena se mantienen unidas y en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, junto a las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno de ellos con un solo sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación a antígeno y sigue siendo capaz de establecer un enlace cruzado con el antígeno. El "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a antígeno. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está compuesta por un dímero de un domino variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. En una especie Fv de cadena única, un dominio variable de cadena pesada y otro de cadena ligera se pueden enlazar covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible, de forma que las cadenas pesada y ligera se asocien en una estructura "dimérica" análoga a la presente en una especie Fv de dos cadenas. En esta configuración, las tres regiones CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. No obstante, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres regiones CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer un antígeno y unirse a él, aunque con una afinidad inferior a la del sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisternas de la región bisagra de un anticuerpo. Fab'-SH es la designación que se da en la presente memoria descriptiva al Fab' en que el (los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes presenta(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpos se producían originalmente como pares de fragmentos Fab' con cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros emparejamientos químicos de fragmentos de anticuerpos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier vertebrado pueden asignarse a una de dos clases claramente diferenciadas, denominadas kappa (?) y lambda (?), en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Según las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a distintas clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden seguir dividiéndose en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA] e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen de forma general, por ejemplo, en Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000). Un anticuerpo puede formar parte de una molécula de fusión más amplia, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo a una o más proteínas o péptidos. En la presente memoria descriptiva, los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se usan indistintamente para hacer referencia a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo definidos a continuación. Estos términos hacen referencia en concreto a un anticuerpo con cadenas pesadas que contiene la región Fe. Los "fragmentos de anticuerpos" contienen únicamente una porción de un anticuerpo intacto, en la que la porción conserva al menos una, aunque también puede conservar la totalidad o la mayoría, de las funciones normalmente asociadas a esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo contiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, de este modo, conserva la capacidad para unirse al antígeno. En otra forma de realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo una que contiene la región Fe, conserva al menos una de las funciones biológicas habitualmente asociadas a la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, como la unión a FcRn, la modulación de la semivida del anticuerpo, la función de la ADCC y la unión a complemento. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que in vivo tiene una semivida sustancialmente similar a la de un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de este tipo puede contener un brazo de unión a antígeno enlazado a una secuencia Fe capaz de dar estabilidad in vivo al fragmento. En la presente memoria descriptiva, por "anticuerpo monoclonal" se entiende un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos excepto en posibles mutaciones de formación natural que podrían estar presentes en cantidades insignificantes. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que consiste en que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en la que la secuencia polipeptídica de unión a dicha diana se obtuvo mediante un procedimiento que incluye la selección de una sola secuencia polipeptídica de unión a la diana a partir de muchas secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser una selección de un solo clon a partir de muchos clones, como un conjunto de clones de hibridoma, clones fágicos o clones de ADN recombinante. Es conveniente saber que la secuencia de unión a la diana elegida puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenia in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y un anticuerpo que comprenda la secuencia de unión a la diana alterada es, además, un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que no suelen estar contaminadas por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que consiste en que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que sea necesario producir el anticuerpo por algún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilicen de conformidad con la presente invención pueden obtenerse a partir de diversas técnicas, incluido, por ejemplo, el procedimiento del hibridoma (por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), los métodos del ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. n° 4.816.567), las tecnologías de reproducción de imágenes de fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), y técnicas para producir anticuerpos humanos o semejantes a los humanos en animales que tienen partes o la totalidad de los loci de la inmunoglobulina humana o los genes que codifican las secuencias de la inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, el documento W098/24893; el documento WO96/34096; el documento W096/33735; el documento WO91/10741 ; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes de EE.UU. núms. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

En la presente memoria descriptiva, los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. N° 4.816.567 y Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, los murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una forma de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos procedentes de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), como ratón, rata, conejo o primates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o el donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables (o al menos uno, y típicamente dos) en los que todos, o sustancialmente todos, los bucles hipervariables correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente humana. Para más detalles, véase Jones et al, Nature, 321 :522-525 (1986), Riechmann et al, Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992). Consúltense también los siguientes artículos y referencias citadas en los mismos: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

En la presente memoria descriptiva, por "región hipervariable", "HVR" o "HV" se entienden las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos contienen seis regiones hipervariables: tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3). En la presente memoria descriptiva se usan y engloban diversas delineaciones de regiones hipervariables. Las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de las secuencias y son las más frecuentemente usadas (Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia, en cambio, se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia and Lesk J. Mol. Biol 196:901- 917 (1987)). Las regiones hipervariables de AbM representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son las utilizadas en el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristales complejos disponibles. Los residuos procedentes de cada una de estas regiones hipervariables se indican a continuación.

Bucle ! Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24 -L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50 -L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89 -L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26 -H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat ) Hl H31-H35 H26 -H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50 -H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95 -H102 H96-H101 H93-H101 Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables ampliadas" como se indica a continuación: 24-36 ó 24-34 (Ll), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 ó 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (Hl), 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en la VH. Los residuos de dominio variable están variables según Kabal y col., como se ha indicado anteriormente, para cada una de estas definiciones. Los residuos de una "estructura" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos de los de una región hipervariable, tal como se define en la presente memoria descriptiva. El término "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat", y las variaciones de los mismos, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios de cadena variable de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que correspondan a un acortamiento de una FR o HVR del domino variable o a una inserción en ellas, respectivamente. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácidos (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después de un residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede estar determinada para un anticuerpo dado por una alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat. Los fragmentos "Fv de cadena simple" o "scFv" de un anticuerpo comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo presentes en una cadena simple de polipéptidos. Por lo general, el polipéptido scFv comprende también un enlazador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL). Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, estos dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, la patente europea 404.097, el documento WO 93/11161 y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Un "anticuerpo humano" es aquel que contiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producción de anticuerpos humanos expuestas en la presente memoria descriptiva. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que contenga residuos de unión a antígeno no humanos. Un anticuerpo con "maduración de afinidad" es aquél con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que dan lugar a una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo padre que no incluye dicha(s) alteración(es). En una forma de realización, un anticuerpo con maduración de afinidad presenta afinidades nanomolares e incluso picomolares para el antígeno diana. Los anticuerpos con maduración de afinidad se producen mediante procedimientos bien conocidos en el sector. En Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992), se describe la maduración de afinidad a través de la transposición de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos de estructura se describen en: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA, 91 :3809-3813 (1994), Schierj col, Gene, 169: 147-155 (1995), Yelton y col, J. Immunol, 155:1994-2004 (1995), Jackson y col, J. Immunol, 154(7):3310-9 (1995) y Hawkins j/ col, J. Mol. Biol, 226:889-896 (1992). Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Algunos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. En la presente memoria descriptiva, un "anticuerpo agonista" es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés. Un "trastorno" es un proceso que se beneficiaría del tratamiento con un anticuerpo de la invención. Incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluidos los procesos patológicos que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Entre los ejemplos de trastornos que se van a tratar en la presente memoria descriptiva están cáncer, trastornos musculares, trastornos genéticos asociados a la vía de la ubiquitina, trastornos inmunitarios/inflamatorios, trastornos neurológicos y otros trastornos asociados a la vía de la ubiquitina.

Los términos "trastorno de la proliferación celular" y "trastorno de la proliferación" se refieren a trastornos asociados a algún grado de proliferación celular anómala. En una realización, el trastorno de la proliferación celular es cáncer. En la presente memoria descriptiva, por "tumor" se entiende todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, tanto benigna como maligna, así como todas las células y tejidos cancerosos y precancerosos. Tal y como se usan en la presente memoria descriptiva, los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno de proliferación celular", "trastorno de proliferación" y "tumor" no se excluyen mutuamente. Los términos "cáncer" y "canceroso" describen o se refieren al estado fisiológico de los mamíferos típicamente caracterizado por un crecimiento/proliferación celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer están carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más concretos de estas clases de cáncer son el cáncer de células escamosas, el cáncer de células pulmonares pequeñas, el adenocarcinoma pulmonar, el carcinoma pulmonar escamoso, el cáncer de peritoneo, el cáncer hepatocelular, el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de las glándulas salivales, el cáncer de riñon, el cáncer de hígado, el cáncer de próstata, el cáncer vulval, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, la leucemia y otros trastornos linfoproliferativos y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. El término "trastorno muscular" describe o se refiere al estado fisiológico en animales que tienen músculos típicamente caracterizado por deterioro o debilidad del músculo liso y/o esquelético que ocasiona una reducción significativa de la función muscular normal. Entre los ejemplos de trastornos musculares están distrofia muscular, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Isaac, síndrome de la persona rígida, parálisis periódica familiar, miopatía, miotonía, rabdomiolisis, atrofia muscular y diversos tipos de debilidad muscular y rigidez muscular. El término "trastorno genético asociado a la vía de la ubiquitina" describe o se refiere a un trastorno de base genética típicamente caracterizado por un funcionamiento anómalo de la vía de la ubiquitina o que se ve favorecido por este tipo de funcionamiento. Entre los ejemplos de trastornos genéticos asociados a la vía de la ubiquitina se encuentran la fibrosis quística, el síndrome de Angelman y el síndrome de Liddle. Los términos "trastorno neurológico" o "enfermedad neurológica" describen o se refieren a una enfermedad o trastorno del sistema nervioso central y/o periférico en mamíferos típicamente caracterizada por el deterioro del tejido nervioso o el deterioro de la comunicación entre las células del tejido nervioso. Entre los ejemplos de trastornos neurológicos destacan enfermedades neurodegenerativas (como la enfermedad de los cuerpos de Lewy, el síndrome postpoliomielities, el síndrome de Shy-Draeger, atrofia olivopontocerebeloso, la enfermedad de Parkinson, atrofia de múltiples sistemas, degeneración estriatonigral, tauopatías (como la enfermedad de Alzheimer y parálisis supranuclear), enfermedades priónicas (como la encefalopatía espongiforme bovina, la tembladera, el síndrome de Creutzfeldt-Jakob, el kuru, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la caquexia crónica e insomnio familiar letal), parálisis bulbal, enfermedad de la motoneurona y trastornos heterodegenerativos del sistema nervioso (incluidos la enfermedad de Canavan, la enfermedad de Huntington, la lipofuscinosis ceroide neuronal, la enfermedad de Alexander, el síndrome de Tourette, el síndrome del cabello ensortijado de Menkes, el síndrome de Cockayne, el síndrome de Halervorden-Spatz, la enfermedad de Lafora, el síndrome de Rett, la degeneración hepatolenticular, el síndrome de Lesch-Nyhan y el síndrome de Unverricht-Lundborg), demencia (incluida la enfermedad de Pick y la ataxia espinocerebelosa). Los términos "trastorno inflamatorio" y "trastorno inmunitario" describen o se refieren a trastornos causados por mecanismos inmunitarios anómalos y/o señalización anómala de las citocinas. Entre los ejemplos de trastornos inflamatorios e inmunitarios están enfermedades autoinmunitarias, síndromes de deficiencia inmunológica e hipersensibilidad. En la presente memoria descriptiva, una "enfermedad autoinmunitaria" es una enfermedad o trastorno no maligno y dirigido contra los propios tejidos de un individuo. En la presente memoria descriptiva, las enfermedades autoinmunitarias excluyen específicamente las enfermedades o estados cancerosos o malignos, en especial, el linfoma de células B, la leucemia linfoblástica aguda (LLA), la leucemia linfocítica crónica (LLC), la leucemia de células pielosas y la leucemia mieloblástica crónica. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios están las respuestas inflamatorias como enfermedades cutáneas inflamatorias incluida la psoriasis y la dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica), el escleroderma sistémico y la esclerosis; las respuestas asociadas a la enfermedad intestinal inflamatoria (como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa); el síndrome de distrés respiratorio (incluido el síndrome de distrés respiratorio del adulto; ARDS); dermatitis; meningitis; uveitis; colitis; glomerulonefritis; procesos alérgicos, como eczema y asma y otros procesos en los que se produce infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas; ateroesclerosis; deficiencia de adherencia leucocitaria; artritis reumatoide; lupus sistémico eritematoso (LSE) (incluido nefritis lúpica, lupus cutáneo); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus tipo I o diabetes mellitus insulinodependiente); esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmunitaria; tiroiditis de Hashimoto; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjogre; diabetes juvenil; y respuestas inmunitarias asociadas a hipersensiblidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T típicamente encontrada en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades en las que interviene diapédesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC); síndrome de lesiones de múltiples órganos; anemia hemolítica (incluida crioglobinemia o anemia positiva de Coombs); miastenia gravis; enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo; enfermedad antimembrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídico; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigoide buloso; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunitarias; enfermedad de Reiter; síndrome de la persona rígida; enfermedad de Behcet; arteritis de células gigantes; nefritis compleja autoinmune; nefropatía de la IgA; polineuropatías de la IgM; púrpura trombocitopénica inmunitaria (PTI) o trombocitopenia autoinmunitaria, etc. Entre los ejemplos de síndromes de deficiencia inmunológica están ataxia, telangiectasia, síndrome de deficiencia de adhesión leucocitaria, linfopenia, disgammaglobulinemia, infecciones por VIH o deltaretrovirus, inmunodeficiencia variable común, inmunodeficiencia combinada grave, disfunción bactericida fagocítica, agammaglobulinemia, síndrome de DiGeorge y síndrome de Wiskott-Aldrich. Entre los ejemplos de hipersensibilidad están alergias, asma, dermatitis, urticaria, anafilaxis, síndrome de Wissler y púrpura trombocitopénica. En la presente memoria descriptiva, "tratamiento" es una intervención clínica en un intento de alterar el proceso natural del individuo o célula tratada y se puede realizar bien como prevención bien durante la evolución de la enfermedad. Son efectos deseables del tratamiento la prevención de la enfermedad o de su recidiva, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención o disminución de la enfermedad y/o daño tisular/en órganos, la disminución del ritmo de progresión de la enfermedad, la mejora o los cuidados paliativos del estado de la enfermedad y la remisión o un pronóstico de mejoría. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. Un "sujeto" es un vertebrado. En algunas formas de realización, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen animales de granja (como vacas), animales utilizados en actividades deportivas, animales de compañía (como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En algunas formas de realización, el vertebrado es un humano. A efectos de tratamiento, "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, animales de compañía, utilizados en actividades deportivas, o en zoos, como perros, caballos, gatos, vacas, etc. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. Una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz, a las dosis y durante el tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula de la invención puede variar según factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula para dar lugar a una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella a la que los efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula son contrarrestados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad eficaz desde el punto de vista profiláctico" es una cantidad eficaz, a las dosis y durante el tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Habitualmente, aunque no necesariamente, dado que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de la enfermedad o en una etapa temprana, la cantidad profilácticamente eficaz sería inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz. El término "agente citotóxico", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa su destrucción. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At21 1, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etoposido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercaladores, enzimas y fragmentos de estas como nucleoliticenzimas, antibióticos y toxinas como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de estos y los diversos agentes antineoplásicos o antitumorales divulgados más adelante. Otros agentes citotóxicos se describen más adelante. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células tumorales.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos serían los agentes alquilantes como la tiotepa y la ciclofosfamida (CYTOXAN®); los sulfonatos de alquilo como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas como la benzodopa, la carboquona, la meturedopa y la uredopa; las etiloniminas y metilamelaminas incluyendo la altretamina, la trietilenomelamina, la trietilenofosforamida, la trietilenotiofosforamida y la trimetilolomelamina; los acetogeninos (en especial, el bullatacín y la bullatacinona); el delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); la beta-lapachona; el lapachol; las colchicinas; el ácido betulínico, una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético (HYCAMTIN®), el CPT-1 1 (irinotecán, CAMPTOSAR®), la acetilcamptotecina, la escopolectina y la 9-aminocamptotecina); la briostatina; la callistatina; el CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina); la podofilotoxina; el ácido podofilínico; la teniposida; las criptofícinas (particularmente la criptofícina 1 y la 8); la dolastatina; la duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); la eleuterobina; la pancratistatina; una sarcodictina; la espongistatina; los gases nitrógeno como el clorambucil, la clornafacina, la colofosfamida, la estramustina, la ifosfamida, la mecloretamina, el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina, la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida y la uramustina; las nitrosureas como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimustina; los antibióticos como los de enedina (por ejemplo, la calicheamicina, especialmente la calicheamicina gammall y la omegall (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); la dinemicina, incluyendo la dinemicina A; una esperamicina; el cromóforo de neocarcinostatina y los cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteína relacionados (las aclacinomisinas, la actinomicina, la autramicina, la azaserina, las bleomicinas, la cactinomicina, la carabicina, la carminomicina, la carcinofilina, las cromomicinas, la dactinomicina, la daunorrubicina, la detorrubicina, la 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, la doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, la morfolino-doxorrubicina, la cianomorfolino-doxorrubicina, la 2-pirrolino-doxorrubicina y la desoxidoxorrubicina), la epirrubicina, la esorrubicina, la idarrubicina, la marcelomicina, las mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina, las olivomicinas, la peplomicina, la potfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorrubicina, la estreptonigrina, la estreptozocina, la tubercidina, el ubenimex, la cinostatina y la zorrubicina); los antimetabolitos como el metotrexato y el 5-fluorouracilo (5-FU); los análogos del ácido fólico como la denopterina, el metotrexato, la teropterina y el trimetrexato; los análogos de la purina como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina y la tioguanina; los análogos de la pirimidina como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina, el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina, la doxifluridina, la enocitabina y la floxuridina; los andrógenos como la calusterona, el propionato de dromostanolona, el epitiostanol, el mepitiiostano, la testolactona los antiadrenérgicos como la aminoglutetimida, el mitotano y el trilostano; un reabastecedor del ácido fólico como el ácido folínico; la aceglatona; el glucósido aldofosfamida; el ácido aminolevulínico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucil; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina; la diaziquona; la elfornitina; el acetato de eliptinio; una epotilona; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentinán; la lonidainina; los maitansinoides como la maitansina y las ansamitocinas; la mitoguazona; la mitoxantrona; el mopidanmol; la nitraerina; el pentostatín; el fenamet; la pirarrubicina; la losoxantrona; la 2-etilhidracida; la procarbacina; el complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); el razoxano; la rizoxina; el sizofirán; el espirogermanio; el ácido tenuazónico; la triaciquona; la 2,2',2"-triclorotrietilamina; los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, el verracurín A, el roridín A y la anguidina); el uretano; la vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); la dacarbacina; la manomustina; el mitobronitol; el mitolactol; el pipobromán; la gacitosina; la arabinosida ("Ara-C"); la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel (TAXOL®) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), la formulación de nanopartículas de paclitaxel mediante ingeniería de albúmina libre de Cremofor (ABRAXANE™) (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y el doxetaxel (TAXOTERE®) (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); el clorambucil; la gemcitabina (GEMZAR®); la 6-tioguanina; la mercaptopurina; el metatrexato; los análogos de platino o los basados en platino como el cisplatino y el carboplatino; la vinblastina (VELBAN®); el platino; el etopósido (VP-16); la ifosfamida; la mitoxantrona; la vincristina (ONCOVIN®); el oxaliplatino; la leucovovina; la vinorrelbina (NAVELBINE®); la novantrona; el edatrexato; la daunomicina; la aminopterina; el ibandronato; el inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa; la difluorometilornitina (DMFO); los retinoides como el ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores, así como las combinaciones de una o más de las sustancias anteriores como la CHOP, la abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y la FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina.

También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que regulan, reducen, bloquean o inhiben los efectos de las hormonas que pueden fomentar el crecimiento del cáncer y se presentan a menudo en la forma de un tratamiento sistémico o del cuerpo entero. Estos agentes podrían ser hormonas propiamente. Como ejemplos tendríamos los antiestrógenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERMs), incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno (también el tamoxifeno NOLVADEX®), el raloxifeno (EVISTA®), el droloxifeno, el 4-hidroxitamoxifeno, el trioxifeno, el keoxifeno, el LY117018, la onapristona y el toremifeno (FARESTON®); las antiprogesteronas; los reguladores a la baja de los receptores de estrógenos (ERDs); los agentes que oprimen o cierran los ovarios, por ejemplo, los agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) como el acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®), el acetato de goserelina, el acetato de buserelina y la tripterelina; otros antiandrógenos como la flutamida, la nilutamida y la bicalutamida y los inhibidores de la aromatasa que inhiben el enzima aromatasa, encargado de regular la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, como, por ejemplo, las 4(5)-imidazolas, la aminoglutetimida, el acetato de megestrol (MEGASE®), el exemestano (AROMASIN®), la formestania, la fadrozola, la vorozola (RIVISOR®), la letrozola (FEMARA®) y la anastrozola (ARIMIDEX®). Además, esta definición de los agentes quimioterapéuticos incluye los bisfosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), el etidronato (DIDROCAL®), el NE-58095, el ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), el alendronato (FOSAMAX®), el pamidronato (AREDIA®), el tiludronato (SKELID®) o el risedronato (ACTONEL®), así como la troxacitabina (un análogo de la citosina nucleósida 1,3-dioxolano); los oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión génica en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como, por ejemplo, el PKC-alfa, el Raf, el H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); las vacunas como THERATOPE® y las que se aplican para terapias génicas, por ejemplo, la ALLOVECTI ®, la LEUVECTIN® y la VAXID®; el inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); el rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); el ditosilato de lapatiniba (un inhibidor de molécula pequeña doble tirosina quinasa del ErbB-2 y el EGFR conocido también como GW572016) y las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores.

Composiciones y métodos para producir los mismos La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a poliubiquitina pero no a monoubiquitina. En concreto, se proporcionan anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a una poliubiquitina que contenga un primer enlace a Usina pero no una poliubiquitina que comprenda un segundo enlace, distinto, a lisina. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H1 que contiene la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 1-25, 81-89, 151-175, 229-239, 265-279, 329-336, 392-459, 599-629, 695-704, 739-748, and 789-799. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de consenso de la región HVR-H1 seleccionada a partir de los identificadores de secuencia núms: 26, 90, 176, 240, 280, 337, 460, 630, 705, 749, and 800. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H2 que contenga la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 27- 51, 91-99, 177-201, 241-251, 281-295, 338-345, 461-528, 631-661, 706-715, 750-759, and 801-81 1. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de consenso de la región HVR-H2 seleccionada a partir de los identificadores de secuencia núms: 52, 100, 202, 252, 296, 346, 529, 662, 716, 760, and 812. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H3 que contenga la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 53-77, 101-109, 203-227, 253-263, 297-311, 347-354, 530-597, 663-693, 717-726, 761-770, and 813-823. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de consenso de la región HVR-H3 seleccionada a partir de los identificadores de secuencia núms: 78, 1 10, 228, 264, 312, 355, 598, 694, 727, 771 y 824. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-Hl que contiene la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599-630, 695-705, 739-749 y 789-800 y una región HVR-H2 que contenga la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281-296, 338-346, 461-529, 631-662, 706-716, 750-760, and 801-812. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-Hl que contenga la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599-630, 695-705, 739-749 y 789-800 y una región HVR-H3 que contenga la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 53-78, 101-110, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717-727, 761-771, and 813-824. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H2 que contenga la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281-296, 338-346, 461-529, 631-662, 706-716, 750-760 y 801-812 y una región HVR-H3 que contenga la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 53-78, 101-110, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717-727, 761-771 y 813-824. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L3 que contiene la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 313-327, 356-363, 728-737, and 772-781. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de consenso de la región HVR-L3 seleccionada a partir de los identificadores de secuencia núms: 328, 364, 738 y 782. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L3 que contiene la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 313-328, 356-364, 728-738, y 772-782, y, además, contiene al menos una de las secuencias de la HVR-H1, HVR-H2 or HVR-H3 seleccionadas a partir de los identificadores de secuencia núms: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599-630, 695-705, 739-749 y 789-800; identificadores de secuencia núms: 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281-296, 338-346, 461-529, 631-662, 706-716, 750-760 y 801-812; e identificadores de secuencia núms: 53-78, 101-110, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717-727, 761-771 y 813-824, respectivamente. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o las cuatro siguientes: (i) una secuencia HVR-H1 que contenga al menos una secuencia de identificadores de secuencia núms: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599-630, 695-705, 739-749 y 789-800. (ii) una secuencia HVR-H2 que contenga al menos una secuencia de identifícadores de secuencia núms: 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281-296, 338-346, 461- 529, 631-662, 706-716, 750-760 y 801-812. (iii) una secuencia HVR-H3 que contenga al menos una secuencia de identifícadores de secuencia núms: 53-78, 101-1 10, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530- 598, 663-694, 717-727, 761-771 y 813-824. (iv) una secuencia HVR-L3 que contenga al menos una secuencia de identifícadores de secuencia núms: 313-328, 356-364, 728-738 y 772-782. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a K48 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K63 con afinidad sustancialmente disminuida, que comprende al menos una, al menos dos, al menos tres o las cuatros siguientes: (i) una secuencia HVR-H1 que contenga al menos una secuencia de identifícadores de secuencia núms: 1-26, 151-176, 265-280, 392-460 y 695- 705; (ii) una secuencia HVR-H2 que contenga al menos una secuencia de identifícadores de secuencia núms: 27-52, 177-202, 281-296, 461-529 y 706-716; (iii) una secuencia HVR-H3 que contenga al menos una secuencia de identifícadores de secuencia núms: 53-78, 203-228, 297-312, 530-598 y 717-727; y (iv) una secuencia HVR-L3 que contenga al menos una secuencia de identifícadores de secuencia núms: 313-328 y 728-738.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a K63 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K48 con afinidad sustancialmente disminuida, que comprende al menos una, al menos dos, al menos tres o las cuatros siguientes: (i) una secuencia HVR-H1 que contenga al menos una secuencia de identificadores de secuencia núms: 81-90, 229-240, 329-337, 599-630, 739-749 y 789-800; (ii) una secuencia HVR-H2 que contenga al menos una secuencia de identificadores de secuencia núms: 91-100, 241-252, 338-346, 631-662, 750-760 y 801-812; (iii) una secuencia HVR-H3 que contenga al menos una secuencia de identificadores de secuencia núms: 101-110, 253-264, 347-355, 663-694, 761-771 y 813-824; (iv) una secuencia HVR-L3 que contenga al menos una secuencia de identificadores de secuencia núms: 356-364 y 772-782. Las secuencias de aminoácidos de identificadores de secuencia núms: 1-78, 81-106-149, 151-364, 392-782 y 789-824 están numeradas con respecto a HVR individuales (es decir, Hl, H2, H3, L3) como se indica en las Figuras 2, 3, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 17, y 22, y la numeración concuerda con el sistema de numeración de abat descrito más adelante. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende una, dos, tres o todas las secuencias de HVR de (i) a (iv) anteriores y HVR-L1 y/o HVR-L2 comprende una secuencia de consenso según Kabat (por ejemplo, identificador de secuencia n°: 79 (HVR-Ll) y 80 (HVR-L2)). En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden secuencias de la HVR de la cadena pesada como se muestran en las Figuras 2, 3, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 17 y 22. En una realización, los anticuerpos comprenden, además, secuencias de la HVR de la cadena ligera como se muestran en las Figuras 10, 1 1, 16 y 17. Algunas realizaciones de anticuerpos de la invención comprenden un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU) (al que también se hace referencia en la Patente de EE.UU. n° 6.407.213 y en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93) como se muestra en el identificador de secuencia n°: 783 más adelante. 1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (identificador de secuencia n°: 783) (los residuos de la HVR están subrayados) RASQSVSSAVA En una forma de realización, la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de huMAb4D5-8 se modifica en una o más posiciones 28, 30, 31, 53, 66 y 91 (Asp, Asn, Thr, Phe, Arg y His, como se ha indicado en negrita/cursiva anteriormente, respectivamente). En una realización, la secuencia modificada de huMAb4D5-8 comprende Ser en la posición 28, Ser en la posición 30, Ser en la posición 31, ser en la posición 53, Gly en la posición 66 y/o Ser en la posición 91. Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene la secuencia mostrada en el identificador de secuencia n°: 784 más adelante. 1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (identificador de secuencia n°: 784) (los residuos de la HVR están subrayados) Los residuos sustituidos con respecto a huMAb4D5-8 aparecen en negrita/cursiva arriba. Los anticuerpos de la invención pueden afectar a cualquier secuencia de dominio variable de la estructura apropiada, siempre que la actividad de unión a poliubiquitina que incluya un enlace concreto a lisina se conserve en su mayor parte. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una secuencia de consenso de la estructura de la cadena pesada del subgrupo III humano. En una realización de estos anticuerpos, la secuencia de consenso de la estructura comprende sustitución en las posiciones 71, 73 y/o 78. En algunas realizaciones de estos anticuerpos, la posición 71 es A, la 73 es T y/o la 78 es A. En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias de estructuras de dominio variable de la cadena pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU.) (también mencionada en la Patente de EE.UU. n° 6.407.213 y 5.821.337 y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93). En una realización, estos anticuerpos comprenden, además, una secuencia de consenso de la estructura de la cadena ligera ?? humana. En una realización, estos anticuerpos comprenden al menos una, dos o todas las secuencias de la HVR de la cadena ligera del identifícador de secuencia n°: 79, 80, 313-328, 356-364, 728-738 y 772-78. En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias de la HVR de la cadena ligera de huMAb4D5-8 como se describen en las Patentes de EE.UU. núms. 6.407.213 y 5.821.337). En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias del dominio variable de la cadena ligera de huMAb4D5-8 (identifícador de secuencia n°: 783 y 784) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU.) (también mencionados en las Patentes de EE.UU. núms. 6.407.213 y 5.821.337, Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93). En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de las estructuras comprende la secuencia de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 1 1 1-129, 138-141 y 146-149 y las secuencias HVR Hl, H2 y H3 se seleccionan de al menos uno de los identificadores de secuencia núms: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599-630, 695-705, 739-749, and 789-800; 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281-296, 338-346, 461-529, 631-662, 706-716, 750-760, and 801-812; and 53-78, 101-1 10, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717-727, 761-771 y 813-824, respectivamente. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, en el que la secuencia de las estructuras comprende la secuencia de al menos uno de los identifícadores de secuencia núms: 130-133, 134-137 y 142-145, la secuencia de la HVR-L1 es el identifícador de secuencia n°: 79, la secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y la secuencia de la HVR-L3 se selecciona entre al menos uno de los identifícadores de secuencia núms: 313-328, 356-364, 728-738 y 772-782. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de las estructuras comprende al menos una secuencia de los identifícadores de secuencia núms: 1 1 1-129 y las secuencias de la HVR Hl , H2 y H3 son los identifícadores de secuencia núms: 1, 27 y 53, respectivamente (clon 48-1). Del mismo modo, en otras realizaciones, los anticuerpos de cada uno de los clones 48-2 a 48-118, los clones 63-1 a 63-51, los Fab apuOl a apu24, los Fab apu2.01 a apu2.20 y los clones apu3.01 a 3.11 comprenden un dominio variable de cadena pesada, donde la secuencia de estructuras comprende al menos una secuencia de los identifícadores de secuencias núms: 1 11-129, y las secuencias de la HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 son las secuencias específicamente enumeradas para cada clon o Fab en las Figuras 2, 3, 8-11, 14-17 y 22. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, donde la secuencia de la estructura comprende al menos una secuencia de los identifícadores de secuencia núms: 130-133 y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identifícadores de secuencia núms: 79, 80 y 313, respectivamente (Fab apuOl). Del mismo modo, en otra realización, los anticuerpos de cada uno de los Fab apuOl a apu24 y los Fab apu2.01 a apu2.20 comprenden un dominio variable de cadena ligera, donde la secuencia de las estructuras comprende al menos una secuencia de los identifícadores de secuencia núms: 130-133 y una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, la secuencia de la HVR-L2 es el identifícador de secuencia n°: 80 y las secuencias de la HVR- L3 son las secuencias específicamente enumeradas para cada Fab en las Figuras 10, 1 1C, 16B y 17B. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de las estructuras comprende al menos una secuencia de los identificadores de secuencia núms: 138-141 y las secuencias de la HVR Hl, H2 y H3 son los identificadores de secuencia núms: 1, 27 y 53, respectivamente (clon 48-1). Del mismo modo, en otras realizaciones, los anticuerpos de cada uno de los clones 48-2 a 48-118, los clones 63-1 a 63-51, los Fab apuOl a apu24, los Fab apu2.01 a apu2.20 y los clones apu3.01-3.11 comprenden un dominio variable de cadena pesada, donde la secuencia de estructuras comprende al menos una secuencia de los identificadores de secuencias núms: 138-141, y las secuencias de la HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 son las secuencias específicamente enumeradas para cada clon o Fab en las Figuras 2, 3, 8-11, 14-17 y 22. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, donde la secuencia de la estructura comprende al menos una secuencia de los identificadores de secuencia núms: 134-137 y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identificadores de secuencia núms: 79, 80 y 313, respectivamente (Fab apuOl). Del mismo modo, en otra realización, los anticuerpos de cada uno de los Fab apuOl a apu24 y los Fab apu2.01 a apu2.20 comprenden un dominio variable de cadena ligera, donde la secuencia de las estructuras comprende al menos una secuencia de los identificadores de secuencia núms: 134-137 y una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, la secuencia de la HVR-L2 es el identificador de secuencia n°: 80 y las secuencias de la HVR-L3 son las secuencias específicamente enumeradas para cada Fab en las Figuras 10, 1 1C, 16B y 17B.

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de las estructuras comprende al menos una secuencia de los identificadores de secuencia núms: 146-149 y las secuencias de la HVR Hl, H2 y H3 son los identificadores de secuencia núms: 1 , 27 y 53, respectivamente (clon 48-1). Del mismo modo, en otras realizaciones, los anticuerpos de cada uno de los clones 48-2 a 48-118, los clones 63-1 a 63-51, los Fab apuOl a apu24, los Fab apu2.01 a apu2.20 y los clones apu3.01 a 3.11 comprenden un dominio variable de cadena pesada, donde la secuencia de estructuras comprende al menos una secuencia de los identifícadores de secuencias núms: 146-149, y las secuencias de la HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 son las secuencias específicamente enumeradas para cada clon o Fab en las Figuras 2, 3, 8-11, 14-17 y 22. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, donde la secuencia de la estructura comprende al menos una secuencia de los identifícadores de secuencia núms: 142-145 y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identifícadores de secuencia núms: 79, 80 y 313, respectivamente (Fab apuOl). Del mismo modo, en otra realización, los anticuerpos de cada uno de los Fab apuOl a apu24 y los Fab apu2.01 a apu2.20 comprenden un dominio variable de cadena ligera, donde la secuencia de las estructuras comprende al menos una secuencia de los identifícadores de secuencia núms: 142-145 y una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, la secuencia de la HVR-L2 es el identifícador de secuencia n°: 80 y las secuencias de la HVR-L3 son las secuencias específicamente enumeradas para cada Fab en las Figuras 10, 1 1C, 16B y 17B. En una realización, un anticuerpo de la invención tiene maduración de afinidad para obtener la afinidad de unión a la diana deseada. En un ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K48 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K63 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 29, 30, 33 y 34 de la HVR-H1. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K48 con alta afinidad pero se une a poliubiquitina enlazada a K63 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 52 y 52a de la HVR-H2. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K48 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K63 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 99, 100, 100a y 100b de la HVR-H3. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K48 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K63 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 95-100, 100a y 100b de la HVR-H3. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K48 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K63 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 91 y 96 de la HVR-L3. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K63 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K48 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 29-34 de la HVR-H1. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K63 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K48 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 50, 52, 52a, 53-56 y 58 de la HVR-H2.En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K63 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K48 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 95-100, 100a, 100b y 100c de la HVR-H3. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K63 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K48 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 91-95, 95a y 95b de la HVR-L3. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K63 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K48 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 29-34 de la HVR-H1. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K63 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K48 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 50, 52, 54, 56 y 58 de la HVR-H2. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad que específicamente se une a poliubiquitina enlazada a K63 con alta afinidad, pero se une a poliubiquitina enlazada a K48 con afinidad sustancialmente reducida comprende sustitución en las posiciones de aminoácidos 95-100, 100a, 100b y 100c de la HVR-H3.

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, que comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 265, 281 y 297. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, que comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 79, 80 y 313. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, que comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 265, 281 y 297 y también comprende un dominio variable de la cadena variable que contiene la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 79, 80 y 313. En otra realización, un anticuerpo de la invención que corresponde a un número de clones concreto comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene una secuencia de las HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 como se explica en las Figuras 2, 3, 8, 9, 10, 11, 14-17 y 22 para ese número de clones. En otra realización, un anticuerpo de la invención correspondiente a un número de clones concreto comprende un dominio variable de la cadena ligera que contiene una secuencia de la HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia de la HVR-L3 descrita en las Figuras 10, 1 1 , 16 y 17 para ese número de clones. En otra realización, un anticuerpo de la invención que corresponde a un número de clones concreto comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene una secuencia HYR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 como se explica en las Figuras 2, 3, 8, 9, 10, 11, 14-17 y 22 para ese número de clones y también comprende un dominio variable de la cadena ligera que contiene una secuencia de la HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR.-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia de la HVR-L3 descrita en las Figuras 10, 1 1, 16 y 17 para ese número de clones.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados para unirse a poliubiquitina. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo determinante antigénico en la poliubiquitina que cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente. Como se muestra en la presente memoria descriptiva, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a una poliubiquitina aislada con un enlace a lisina específico. Como se muestra en la presente memoria descriptiva, los anticuerpos de la invención también se unen específicamente a poliubiquitina con un enlace a lisina específico cuando esa poliubiquitina está anexa a una proteína heteróloga (véanse, por ejemplo, los ejemplos 3 y 4). Se proporcionan composiciones que comprenden al menos un anticuerpo antipoliubiquitina o al menos un polinucleótido que comprende secuencias que codifican un anticuerpo antipoliubiquitina. En algunas realizaciones, una composición puede ser una composición farmacéutica. Como se usa en la presente memoria descriptiva, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen a una o más poliubiquitinas y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos que se unen a una o más poliubiquitinas. Estas composiciones pueden contener, además, vehículos aptos, como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyan soluciones tamponadas, que son bien conocidas en el sector. También se proporcionan anticuerpos y polinucleótidos aislados. En algunas realizaciones, los polinucleótidos y los anticuerpos aislados son sustancialmente puros. En una realización, los anticuerpos antipoliubiquitina son monoclonales. En otra realización, se proporcionan los fragmentos de los anticuerpos antipoliubiquitina (por ejemplo, los fragmentos Fab, Fab'-SH y F(ab')2). Estos fragmentos de anticuerpos se pueden crear por medios tradicionales, como digestión enzimática, o se pueden generar mediante técnicas recombinantes. Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser quiméricos, humanizados o humanos. Estos fragmentos son útiles para los fines diagnósticos y terapéuticos expuestos a continuación.

Generación de anticuerpos antipoliubiquitina utilizando una librería de representación de imágenes de fagos Se conocen diversos métodos en el sector para generar librerías de representación de imágenes de fagos a partir de las cuales se puede obtener un anticuerpo de interés. Un método para generar anticuerpos de interés es mediante el uso de una librería de anticuerpos de fagos como se describe en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93.

Los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se pueden obtener utilizando librerías combinatorias para detectar clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o actividades deseadas. En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan mediante la detección de librerías de fagos que contienen fagos que representan diversos fragmentos de la región variable (Fv) de anticuerpos fusionados a proteína de revestimiento de fagos. Estas librerías de fagos son cribadas mediante cromatografía de afinidad para detectar el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado son adsorbidos al antígeno y, de este modo, separados de los clones de la biblioteca que no tienen capacidad de unión. Los clones con capacidad de unión se eluyen entonces del antígeno y pueden ser enriquecidas aún más mediante ciclos adicionales de adsorción/elución de antígenos. Cualquiera de los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se puede obtener diseñando un procedimiento apropiado de detección de antígenos para seleccionar el clon del fago de interés, seguido por la construcción de un clon del anticuerpo antipoliubiquitina de longitud completa utilizando las secuencias de Fv del clon del fago de interés y secuencias de la región constante (Fe) convenientes, descritas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo está formado a partir de dos regiones variables (V) de unos 1 10 aminoácidos, una correspondiente a la cadena ligera (VL) y otra correspondiente a la cadena pesada (VH), que presentan en ambos casos tres bucles hipervariables o regiones de determinación de complementariedad (CDR). Los dominios variables se pueden representar funcionalmente en el fago, bien como fragmentos de Fv de cadena única (scFv), en los que VH y VL están covalentemente enlazadas por medio de un péptido corto y flexible, o como fragmentos Fab, en los que están fusionados a un dominio constante e interactúan no covalentemente, como se describe en Winter et al. , Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Como se usa en la presente memoria descriptiva, los clones de fagos que codifican scFv y los clones de fagos que codifican Fab se denominan colectivamente "clones de fagos Fv" o "clones Fv". Los repertorios de genes de VH y VL se pueden clonar por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar aleatoriamente en librerías de fagos, en las que se puede buscar por clones de unión a antígeno, como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994). Las bibliotecas procedentes de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin la necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio nativo se puede clonar para proporcionar una única fuente de anticuerpos humanos a una gran variedad de antígenos extraños y también de autoantígenos sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al, EMBO J, 12: 725-734 (1993). Por último, las librerías nativas también se pueden producir sintéticamente mediante la clonación de segmentos de genes V no reorganizados procedentes de células madre y utilizando cebadores de la PCR que contenga secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 muy variables y para conseguir la reorganización in vitro como se describe en Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 221: 381-388 (1992). El fago filamentoso se utiliza para representar fragmentos de anticuerpos mediante fusión a la proteína de revestimiento menor pIII. Los fragmentos de anticuerpos se pueden representar como fragmentos Fv de cadena única, en los que los dominios de VH y VL están conectados a la misma cadena polipeptídica mediante un separador de polipéptidos flexible, como se describe en Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena se fusiona a pIII y la otras se segregan en el periplasma del anfitrión celular bacteriano donde el ensamblaje de una estructura proteínica de revestimiento de Fab se representa en la superficie del fago mediante el desplazamiento de las proteínas de revestimiento de tipo salvaje, por ejemplo, como se describe en Hoogenboom et al, Nucí Acids Res., 19: 4133-4137 (1991). En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen a partir de inmunocitos recolectados de humanos o animales. Si se desea una librería que presente un sesgo a favor de clones antipoliubiquitina, el sujeto es inmunizado con poliubiquitina para generar una respuesta a anticuerpos y las células esplénicas y/o los linfocitos B circulantes u otros linfocitos de la circulación periférica (PBL) se recuperan para la construcción de la librería. En una realización, una librería de fragmentos de genes de anticuerpos humanos sesgada a favor de clones de antipoliubiquitina human se obtiene generando una respuesta a un anticuerpo antipoliubiquitina humano en ratones transgénicos portadores de una matriz de genes humanos funcionales de la inmunoglobulina (y carentes de un sistema funcional de producción de anticuerpos endógenos), de forma que la inmunización con poliubiquitina da lugar a linfocitos B productores de anticuerpos humanos antipoliubiquitina. La generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos se describe en la Sección (III)(b). El enriquecimiento adicional de poblaciones celulares reactivas a antipoliubiquitina se puede obtener mediante un procedimiento de detección adecuado para aislar linfocitos B que expresen un anticuerpo unido a membrana específico de la poliubiquitina, por ejemplo, mediante separación celular con cromatografía de afinidad a poliubiquitina o adsorción de células a poliubiquitina marcada con flurocromo seguida de separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Alternativamente, el uso de células esplénicas y/o linfocitos B u otros PBL procedentes de un donante no inmunizado ofrecen una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos y también permite la construcción de una librería de anticuerpos usando cualquier especie animal (humana o no humana) en la que la poliubiquitina no es antigénica. En el caso de librerías que incorporen construcción de genes de anticuerpos in vitro, las células madre se recolectan del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifiquen segmentos de genes de anticuerpos no organizados. Los inmunocitos de interés se pueden obtener de diversas especies animales, como humanos, ratón, rata, lagomorfa, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina y especies aviares, etc.

Los segmentos de regiones variables de genes anticuerpos que codifican ácidos nucleicos (incluidos los segmentos VH y VL) se recuperan a partir de las células de interés y se amplifican. En el caso de librerías de genes de VH y VL reorganizadas, el ADN deseado se puede obtener aislando el ADN o el ARNm genómico de los linfocitos, seguido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que se acoplen a los extremos 5' y 3' de los genes de la VH y la VL reorganizados, como se describe en Orlandi et al, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), lo que permite obtener diversos repertorios de genes V para su expresión. Los genes V se pueden amplificar a partir del ADNc y del ADN genómico con cebadores reversos en el extremo 5' del exon que codifica el dominio V maduro y cebadores anversos dentro del segmento J como se describe en Orlandi et al. (1989) and in Ward et al., Nature, 341 : 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar desde el ADNc, los cebadores reversos también se pueden situar en el exon líder, como se describe en Jones et al, Biotechnol, 9: 88-89 (1991), y los cebadores anversos dentro de la región constante, como se describe en Sastry et al, Proc. Nati Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar la complementariedad, se puede incorporar la degeneración en los cebadores como se describe en Orlandi et al. (1989) o Sastry et al. (1989). En algunas realizaciones, la diversidad de las librerías se maximiza utilizando cebadores de la PCR dirigidos a cada familia de genes V para amplificar todas las organizaciones disponibles de VH y VL presentes en la muestra de ácidos nucleicos de inmunocitos, por ejemplo, como se describe en el método de Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991) o como se describe en el método de Orum et al, Nucleic Acids Res., 21 : 4491-4498 (1993). Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción poco habituales dentro del cebador de la PCR como una marca en un extremo, como se describe en Orlandi et al. (1989), o mediante una nueva amplificación de la PCR con un cebador marcado, como se describe en Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991). De segmentos de genes V in vitro se pueden derivar repertorios de genes V sintéticamente reorganizados. La mayoría de los segmentos de genes VH humanos se han clonado y secuenciado (según Tomlinson et al, J. Mol. BioL, 227: 776-798 (1992)), y mapeados (explicados en Matsuda et al, Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluidos todas las principales conformaciones del bucle Hl y H2) se pueden utilizar para generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de la PCR que codifican bucles de H3 de secuencia y longitud diversas, como se describe en Hoogenboom and Winter, J. Mol. BioL, 227: 381-388 (1992). Los repertorios de VH también se pueden hacer con toda la diversidad de secuencias centrada en un bucle de H3 largo de una única longitud, como se describe en Barbas et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Los segmentos de VK y ?? humanos se han clonado y secuenciado (explicado en Williams and Winter, Eur. J. Immunol, 23: 1456-1461 (1993)) y se pueden utilizar para hacer repertorios sintéticos de la cadena ligera. Los repertorios de genes V sintéticos, basados en una gran variedad de dominios de VH y VL y longitudes de L3 y H3, codificarán anticuerpos de considerable diversidad estructural. Tras la amplificación de los ADN codificadores de genes V, los segmentos de genes V de línea germinal se pueden reorganizar in vitro según los procedimientos de Hoogenboom and Winter, J. Mol. BioL, 227: 381-388 (1992). Se pueden construir repertorios de fragmentos de anticuerpos mediante combinación de repertorios de genes de VH y VL juntos de varias formas. Cada repertorio se puede crear en vectores diferentes y los vectores se pueden recombinar in vitro, por ejemplo, como se describe en Hogrefe et al, Gene, 128: 1 19-126 (1993), o in vivo mediante infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouse et al, Nucí Acids Res., 21 : 2265-2266 (1993). El procedimiento de la recombinación in vivo se aprovecha de las dos cadenas de los fragmentos Fab para superar el límite en el tamaño de la librería impuesto por la eficacia de transformación de E. coli. Los repertorios de VH y VL nativos se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector fágico. Las dos librerías se combinan a continuación mediante infección fágica de bacterias que contienen fagémidos, de forma que cada célula contiene una combinación distinta y el tamaño de la librería sólo esté limitado por el número de células presente (unos 1012 clones). Los dos vectores contienen señales de recombinación in vivo, por lo que los genes VH y VL se recombinan en un único replicón y se introducen en viriones fágicos. Estas enormes librerías proporcionan gran número de diversos anticuerpos con buena afinidad (¾" de aproximadamente 10" M). Alternativamente, los repertorios se pueden clonar secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbas et al, Proc. Nati Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o ensamblar juntos mediante PCR y, luego, clonarlos, como se describe en Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991). El ensamblaje de la PCR también se puede utilizar para unir los ADN de la VH y la VL con ADN que codifica un espaciador peptídico flexible para formar repertorios de Fv de cadena única (scFv). En otra técnica, "el ensamblaje de la PCR en el interior de la célula" se usa para combianr genes VH y VL dentro de linfocitos mediante PCR y, luego, clonar repertorios de genes enlazados, como se describe en Embleton et al, Nucí Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

La detección de las librerías se puede conseguir mediante cualquier técnica conocida en el sector. Por ejemplo, se puede utilizar poliubiquitina para revestir los pocilios de placas de adsorción, expresada en anfitriones celulares en placas de adsorción o utilizada en separación celular, o conjugada con biotonina para captura con partículas revestidas de estreptavidina, o utilizadas en cualquier otro procedimiento conocido en el sector para detectar librerías de representación de imágenes de fagos. Las muestras de librerías de fagos están en contacto con poliubiquitina inmovilizada en condiciiones aptas para la unión de al menos una porción de partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, incluido le pH, la concentración iónica, la temperatura y similares, se seleccionan de forma que imiten condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y, luego, se eluyen mediante ácido, por ejemplo, como se describe en Barbas et al, Proc. Nati. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), o mediante álcali, por ejemplo como se describe en Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991), o mediante competición antigénica con la poliubiquitina, por ejemplo, en un procedimiento similar al procedimiento de competición antigénica de Clackson et al, ? ature, 352: 624-628 (1991). Los fagos se pueden enriquecer de 20 a 1.000 veces en una única serie de selección. Además, los fagos enriquecidos se pueden cultivar en cultivos bacterianos y estar sometidos a nuevas series de selección. La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluida la cinética de la disociación durante el lavado y si múltiples fragmentos de anticuerpos de un único fago se pueden unir simultáneamente a antígeno. Los anticuerpos con rápida cinética de disociación (y afinidades de unión débiles) se puden conservar mediante el uso de lavados cortos, representación de imágenes de fagos multivalente y densidad de revestimiento alta del antígeno en fase sólida. La densidad elevada no sólo estabiliza al fago durante las interacciones multivalentes, sino que, además, favorece la unión del fago disociado otra vez. La selección de anticuerpos con lenta cinética de disociación (y buenas afinidades de unión) se puede promover mediante el uso de largos lavados y representación de imágenes de fagos monovalente, como se describe en Bass et ai, Proteins, 8: 309-314 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una baja densidad de revestimiento del antígenos como se describe en Marks et al, Biotechnol, 10: 779-783 (1992). Es posible seleccionar entre anticuerpos de fagos de distintas afinidades, incluso con afinidades que difirieren ligeramente, para poliubiquitina. Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como la realizada en algunas de las técnicas de maduración de la afinidad descritas anteriormente) es probable que ocasione muchos mutantes, la mayoría de unión a antígeno, y unos cuantos con afinidad más alta. Con una poliubiquitina limitada, es raro que se pudieran completar fagos de alta afinidad. Para conservar todos los mutantes de afinidad más altas, los fagos se pueden incubar con una cantidad mayor de poliubiquitina biotinilada, pero con la poliubiquitina biotinilada a una concentración de molaridad menor de la constante de afinidad molar diana para poliubiquitina. Los fagos con afinidad de unión más alta pueden, entonces, ser capturados por partículas paramagnéticas revestidas de estreptavidina. Esta "captura en equilibrio" permite seleccionar los anticuerpos según sus afinidades de unión, son una sensibilidad que permite aislar clones mutantes con una afinidad tan solo dos veces más elevada de la enorme cantidad de fagos con afinidad menor. Las condiciones usadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también se pueden manipular para distinguirlos en función de la cinética de disociación.

Los clones antipoliubiquitina se pueden seleccionar por actividad. En una realización, la invención proporciona anticuerpos antipoliubiquitina que bloquean la unión entre un ligando de poliubiquitina y poliubiquitina, pero no bloquean la unión entre un ligando de poliubiquitina y una segunda proteína. Los clones de Fv que corresponden a estos anticuerpos antipoliubiquitina se pueden seleccionar (1) aislando clones antipoliubiquitina de una librería de fagos como se ha descrito en la Sección B(l)(2) anterior y, opcionalmente, amplificando la población aislada de clones de fagos cultivando la población en un anfitrión bacteriano apropiado; (2) seleccionando poliubiquitina y una segunda proteína contra la que se desea una actividad bloqueante y no bloqueante, respectivamente; (3) adsorbiendo los clones de fagos antipoliubiquitina a poliubiquitina inmovilizada; (4) usando una mayor cantidad de la segunda proteína para eluir los clones no deseados que reconocen los determinantes de unión a poliubiquitina que se solapan o son compartidos con los determinantes de unión de la segunda proteína; y (5) elución de los clones que no se han adsorbido aún tras el paso (4). Opcionalmente, los clones con las propiedades bloqueantes/no bloqueantes deseadas se pueden enriquecer también mediante repetición de los procedimientos de selección descritos en la presente memoria descriptiva una o más veces. El ADN que codifica los clones de Fv de la invención es rápidamente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando cebadores oligonucleóticos diseñados para amplificar específicamente las regiones que codifican las cadenas ligera y pesada de interés de plantillas de ADN de fagos o hibridoma). Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células anfitrión, como por ejemplo las células E. coli, las células COS de monos, las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que, de otro modo, no producen la proteína de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células anfitrión recombinantes. Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias del ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al, Curr. Opinión in Immunol., 5: 256 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992). El ADN que codifica los clones de Fv de la invención se pueden combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican las regiones constantes de la cadena ligera y/o la cadena pesada (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas se pueden obtener según Kabat et al, como se ha descrito anteriormente) para formar clones que codifiquen cadenas ligeras y/o pesadas de longitud total o parcial. Se tendrá en cuenta que las regiones constantes de cualquier isótopo se pueden utilizar para este fin, incluidas las regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie animal o humana. Un clon de Fv se deriva del ADN del dominio variable de una especie animal (por ejemplo, un humano) y, luego, se fusiona al ADN de la región constante de otra especie animal para formar una o más secuencias de codificación, puesto que una cadena ligera y/o pesada de longitud completa e "híbrida" está incluida en la definición de anticuerpo "híbrido" y "quimérico" como se usa en la presente memoria descriptiva. En una realización, un clon de Fv derivado de ADN variable humano se fusiona con ADN de región constante humano para formar una o más secuencias de codificación para todas las cadenas ligeras y/o pesadas de longitud parcial o completa y humanas.

Los anticuerpos producidos por librerías nativas (bien natural bien sintéticas) pueden ser de afinidad moderada ((¾"' de aproximadamente 106 a 107 M"1), pero la maduración de la afinidad también se puede imitar in vitro mediante construcción y reselección a partir de librerías secundarias, como se describe en Winter et al. (1994), citado anteriormente. Por ejemplo, la mutación se puede introducir aleatoriamente in vitro utilizando polimerasa con tendencia al error (explicado en Leung et al, Technique, 1 : 11-15 (1989)) en el procedimiento de Hawkins et al, J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992) o en el procedimiento de Gram et al, Proc. Nati Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Asimismo, la maduración de la afinidad se puede realizar mediante mutación aleatorizada de una o más CDR, por ejemplo, utilizando PCR con cebadores de secuencia aleatoria que abarquen la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y detecten clones de afinidad más alta. El documento WO 9607754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describía un procedimiento para inducir la mutagenia en una región de determinación de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulinas para crear una librería de genes de la cadena ligera. Otro método eficaz consiste en recombinar los dominios de VH o VL seleccionados por representación de fagos con repertorios de variantes de domino V que se producen naturalmente obtenidos a partir de donantes no inmunizados y detectar los de mayor afinidad en varias series de nueva transposición de cadenas, como se describe en Marks et al, Biotechnol, 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpos con afinidades del orden de 10"9 M.

Otros métodos de generar anticuerpos antipoliubiquitina Otros métodos de generar y evaluar la afinidad de anticuerpos son bien conocidos en el sector y se describen, por ejemplo, en Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Patente de EE.UU. n°. 4.816.567; Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987; Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980); Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl, 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al, EMBO J, 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci. 81 : 6851-6855 (1984).

Métodos generales En general, la invención proporciona anticuerpos antipoliubiquitina que son útiles para el tratamiento de trastornos mediados por la poliubiquitina en los que se desea un bloqueo total o parcial de una o más actividades de la poliubiquitina. En una realización, los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se usan para tratar el cáncer. En otra realización, los anticuerpos antipoliubiquitina proporcionados en la presente memoria descriptiva se usan para tratar trastornos musculares, como los indicados anteriormente. En otra realización, los anticuerpos antipoliubiquitina proporcionados en la presente memoria descriptiva se usan para tratar trastornos neurológicos, como los indicados anteriormente. En otra realización, los anticuerpos antipoliubiquitina proporcionados en la presente memoria descriptiva se usan para tratar enfermedades genéticas. En otra realización, los anticuerpos antipoliubiquitina proporcionados en la presente memoria descriptiva se usan para tratar trastornos inflamatorios/inmunitarios. Las propiedades únicas de los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención los hacen especialmente útiles para distinguir entre distintas formas de poliubiquitina enlazadas a lisina en un sistema celular sin recurrir a métodos biofísicos o de manipulación genética caros y dificultosos, como la espectrometría de masas. Los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se pueden utilizar para caracterizar las funciones y actividades de poliubiquitinas específicas enlazadas a Usinas, tanto in vitro como in vivo. Los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención también se pueden utilizar para determinar el papel de poliubiquitinas enlazadas a Usinas específicas en el desarrollo de la patogenia de las enfermedades. Los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se pueden usar también para tratar enfermedades en las que una o más poliubiquitinas específicas enlazadas a lisina tienen una regulación anómala o un funcionamiento anómalo sin interferir en la actividad normal de las poliubiquitinas para las que los anticuerpos antipoliubiquitina no son específicos. En otro aspecto, los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención tiene utilidad como reactivos para la detección y aislamiento de poliubiquitina de enlaces de lisina específicos, como detección de poliubiquitina en varios tipos y tejidos celulares, incluida la determinación de la densidad y distribución de la poliubiquitina en poblaciones celulares y dentro de una célula dada y la separación celular basada en la presencia o cantidad de poliubiquitina. En otro aspecto, los anticuerpos antipoliubiquitina presentes son útiles para el desarrollo de antagonistas de la poliubiquitina con patrones de actividad de bloqueo similares a los de los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos antipoliubiquitina enlazados a K48 de la invención se pueden usar para determinar e identificar otros anticuerpos que tengan las mismas características de unión a poliubiquitina enlazada a K48 y/o capacidades de bloqueo de las vías mediadas por la poliubiquitina enlazada a K48. Del mismo modo, los anticuerpos antipoliubiquitina enlazados a K63 de la invención se pueden usar para determinar e identificar otros anticuerpos que tengan las mismas características de unión a poliubiquitina enlazada a K63 y/o capacidades de bloqueo de las vías mediadas por la poliubiquitina enlazada a K63. En otro ejemplo, los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se pueden usar para identificar otros anticuerpos antipoliubiquitina que se unen sustancialmente al mismo o a los mismos determinantes antigénicos de poliubiquitina, como los anticuerpos ejemplificados en la presente memoria descriptiva, incluidos epítopos lineales y conformacionales. Los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se pueden usar en ensayados basados en las vías fisiológicas en las que interviene la poliubiquitina para detectar antagonistas de molécula pequeña de poliubiquitina con uno o más enlaces de lisina específicos que tendrán efectos farmacológicos similares en el bloqueo de la unión de una o más moléculas de unión a poliubiquitina con esos enlaces a lisina. Por ejemplo, se sabe que la poliubiquitina enlazada a K-48 interviene en la degradación dirigida de proteasomas de ciertas proteínas (véase, por ejemplo, Chau et al., Science 243: 1576-1583 (1989); Finley et al, Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick et al., Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004)); así, los anticuerpos antipoliubiquitina enlazados a K48 se pueden utilizar en detecciones para identificar antagonistas de molécula pequeña de la degradación dirigida de proteasomas mediada por poliubiquitina enlazada a K48 mediante la comparación de la actividad de una o más posibles antagonistas de molécula pequeña con la actividad de los anticuerpos antipoliubiquitina enlazados a K48 en esa vía. Del mismo modo, en otro ejemplo, se sabe que la poliubiquitina enlazada a K63 interviene en la reparación del ADN (véase, por ejemplo, Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004)), y, de este modo, la actividad de los anticuerpos antipoliubiquitina enlazada a K-63 para actuar como antagonistas de una vía de la reparación del ADN se puede comparar con la actividad de uno o más antagonistas potenciales de molécula pequeña de poliubiquitina enlazada a K63 en la misma vía de reparación del ADN. Del mismo modo, en otro ejemplo, se sabe que la poliubiquitina enlazada a K-63 interviene en la formación de cuerpos de Lewy en la enfermedad de Parkinson (véase, por ejemplo, Lim et al., J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005)), y, de este modo, la actividad de los anticuerpos antipoliubiquitina enlazada a K-63 para actuar como antagonistas de la formación de cuerpos de Lewy se puede comparar con la actividad de uno o más antagonistas potenciales de molécula pequeña de poliubiquitina enlazada a K63 en la actuación como antagonistas de la formación de cuerpos de Lewy. La generación de posibles anticuerpos se puede lograr utilizando procedimientos habituales en el sector, incluidos los descritos en la presente memoria descriptiva, como la técnica del hibridoma y la detección de librerías de representación en imágenes de fagos de moléculas de unión. Estos métodos están reconocidos en el sector. Los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se pueden obtener utilizando librerías combinatorias para detectar clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o actividades deseadas. En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan mediante la detección de librerías de fagos que contienen fagos que representan diversos fragmentos de la región variable (Fv) de anticuerpos fusionados a proteína de revestimiento de fagos. Estas librerías de fagos son cribadas mediante cromatografía de afinidad para detectar el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado son adsorbidos al antígeno y, de este modo, separados de los clones de la biblioteca que no tienen capacidad de unión. Los clones con capacidad de unión se eluyen entonces del antígeno y pueden ser enriquecidas aún más mediante ciclos adicionales de adsorción/elución de antígenos. Cualquiera de los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención se puede obtener diseñando un procedimiento apropiado de detección de antígenos para seleccionar el clon del fago de interés, seguido por la construcción de un clon del anticuerpo antipoliubiquitina de longitud completa utilizando las secuencias de Fv del clon del fago de interés y secuencias de la región constante (Fe) convenientes, descritas en Kabat et al, of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Véase también PCT Pub. WO03/102157, y la bibliografía incluida en este documento. En una realización, los anticuerpos antipoliubiquitina de la invención son monoclonales. También dentro del ámbito de la invención, están fragmentos de anticuerpos como los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH y F(ab')2, y las variaciones de ellos, de los anticuerpos antipoliubiquitina proporcionados en la presente memoria descriptiva. Estos fragmentos de anticuerpos se pueden crear por medios tradicionales, como digestión enzimática, o se pueden generar mediante técnicas recombinantes. Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser quiméricos, humanizados o humanos. Estos fragmentos son útiles para los fines diagnósticos y terapéuticos experimentales expuestos en la presente memoria descriptiva.

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos excepto en posibles mutaciones de formación natural que podrían estar presentes en cantidades insignificantes. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo de que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Los anticuerpos monoclonales antipoliubiquitina de la invención se pueden producir utilizando diversos métodos conocidos en el sector, incluido el método del hibridoma descrito primero por Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), o alternativamente mediante métodos del ADN recombinante (por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 4.816.567).

Vectores, células huésped y métodos recombinantes Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para clonación subsiguiente (amplificación del ADN) o para expresión. Se aisla el ADN que codifica el anticuerpo y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. Le elección del vector depende en parte del anfitrión celular que se utilice. Entre las células huésped se incluyen células de origen procariótico o eucariótico (por lo general, de mamíferos). Se tendrá en cuenta que las regiones constantes de cualquier isótopo se pueden utilizar para este fin, incluidas las regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie animal o humana.

Generación de anticuerpos utilizando células huésped procarióticas Construcción de vectores Las secuencias de polinucleótidos que codifiquen componentes de polipéptidos del anticuerpo de la invención se pueden obtener utilizando técnicas recombinante estándar. Las secuencias deseadas de polinucleótidos se pueden aislar y secuenciar a partir de anticuerpos que producen células como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden sintetizar usando técnicas de PCR o sintetizador de nucleótidos. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en los huéspedes procarióticos. Muchos vectores que están disponibles y son conocidos en el sector se pueden utilizar para el fin de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se van a insertar en el vector y de la célula huésped concreta que se transformará con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo o ambas) y su compatibilidad con la célula huésped concreta en la que resida. Los componentes del vector incluyen, por lo general: un origen de replicación, un gen marcador de la selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS), una secuencia de señal, la inserción del ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción. En general, los vectores plásmidos que contienen secuencias de control y replicón que se derivan de especies compatibles con la célula huésped se usan en conexión con estos huéspedes. Por lo general, el vector lleva un sitio de replicación, así como secuencias de marcado, que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma habitualmente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie E. coli . El pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, de este modo, proporcionan una forma fácil de identificar células transformadas. El pBR322, sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos pueden contener también, o ser modificados para que contengas, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados del pBR322 usados para la expresión de anticuerpos concretos se describen en detalle en Cárter et al., Patente de EE.UU. n° 5.648.237. Además, los vectores fágicos que contienen secuencias de control y replicón que son compatibles con los microorganismos huésped se pueden usar como vectores de transformación en relación con estos huéspedes. Por ejemplo, un bacteriófago como ?T??.??.-? ? se puede utilizar para marcar un vector recombinante que se pueda utilizar para transformar células huésped susceptibles como E. coli LE392. El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotores de cistrón, que codifiquen cada uno de los componentes polipeptídicos. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida situada antes del extremo 5' del promotor en un cistrón que modula su expresión. Los promotores procarióticos suelen pertenecer a dos clases: inducibles y constitutivos. El promotor inducible es aquel que inicia un aumento de los niveles de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Se conocen un gran número de promotores reconocidos por diversas células huésped posibles. El promotor seleccionado puede ser funcionalmente enlazado al ADN del cistrón que codifica la cadena pesada o ligera mediante eliminación del promotor del ADN fuente por medio de digestión enzimática mediante restricción e inserción de la secuencia aislada del promotor en el vector de la invención. Tanto la secuencia nativa del promotor como muchos promotores heterólogos se pueden utilizar para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterólogos, puesto que por lo general permiten una mayor transcripción y una mayor producción del gen diana expresado, frente al promotor polipeptídico diana nativo.

Los promotores aptos para su uso con huéspedes procarióticos incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de lactosa y beta galactamasa, un sistema promotor a base de triptofano (trp) y promotores híbridos como el promotor tac o el trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (como otros promotores de fagos o bacterianos conocidos) también son aptos. Se han publicado sus secuencias de nucleótidos, lo que permite que un experto pueda ligarlas a cistrones que codifiquen las cadenas pesada y ligera dianas (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando enlazadores o adaptadores que proporcionen sitios de restricción necesarios.

En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de la secuencia de señal de la secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados en una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia de señal seleccionada a efectos de esta invención es aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal). Para las células huésped procari óticas que no reconocen ni procesan las secuencias de señal nativas a los polipéptidos heterólogos, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, entre un grupo formado por fosfatasa alcalina, penicilasa, lpp o líderes de enterotoxina II termoestable (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una realización de la invención, las secuencias de señal usada en los dos cistrones del sistema de expresión son secuencias de señal STII o variantes de ellas.

En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas según la invención se pueden producir en el citoplasma de la célula huésped y, por lo tanto, no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. A este respecto, las cadenas pesada y ligera de inmunoglobuna se expresan, multiplican y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Determinadas cepas de huéspedes (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB) ofrecen condiciones citoplasmáticas que son favorables a la formación de uniones de disulfidos, lo que permite una multiplicación y ensamblaje correctos de las subunidades de las proteínas expresadas. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

Los anticuerpos de la invención también se pueden producir usando un sistema de expresión en el que la relación cuantitativa de los componentes polipeptídicos expresados se pueda modular para maximizar la producción de anticuerpos secretados y debidamente ensamblados de la invención. Esta modulación se logra al menos en parte mediante modulación simultánea de concentraciones translacionales para los componentes polipeptídicos.

Una técnica para la modulación de la concentración translacional se divulga en Simmons et al., Patente de EE.UU. n° 5.840.523. Utiliza variantes de la región de iniciación translacional (TIR) dentro de un cistrón. Para una TIR dada, se puede crear una serie de variantes de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos con un intervalo de concentraciones translacionales, lo que proporciona un medio conveniente mediante el cual ajustar este factor al nivel de expresión deseado de la cadena específica. Las variantes de la TIR se pueden generar mediante técnicas de mutagenia convencionales que dan lugar a cambios en codones que pueden alterar la secuencia aminoacídica. En algunas realizaciones, los cambios en la secuencia de nucleótidos son silenciosos. Las alteraciones en la TIR pueden incluir, por ejemplo, alteraciones en el número o espaciado de secuencias de Shine-Dalgarno, junto con alteraciones en la secuencia de la señal. Un método para generar secuencias de señal mutantes es generar un "banco de codones" al inicio de una secuencia de codificación que no cambie la secuencia de aminoácidos de la secuencia de la señal (es decir, los cambios son silenciosos). Esto se puede conseguir cambiando la posición del tercer nucleótido de cada codón; además, algunos aminoácidos, como leucina, serina y arginina, tiene múltiples posiciones primera y segunda que pueden añadir complejidad para realizar el banco. Este método de mutagenia se describe en detalle en Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.

En una realización, un conjunto de vectores se genera con un intervalo de concentraciones de TIR para cada cistrón en ellos. Este conjunto limitado permite una comparación de los niveles de expresión de cada cadena, así como la producción de los productos deseados de anticuerpos en varias combinaciones de concentraciones de TIR. Las concentraciones TIR se puede determinar cuantificando el nivel de expresión de un gen indicador como se describe en detalle en Simmons et al. Patente de EE.UU. n° 5.840.523. En función de la comparación de las concentraciones translacionales, las TRI individuales se seleccionan para su combinación en los constructos del vector de expresión de la invención.

Las células huésped procarióticas aptas para la expresión de anticuerpos de la invención incluyen Archaebacteria y Eubacteria, como microorganismos grampositivos o gramnegativos. Entre los ejemplos de bacterias útiles están Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilli (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacteria, las especies Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. En una realización, se utilizan células gramnegativas. En una realización, se utilizan células E. coli como huéspedes para la invención. Entre los ejemplos de cepas E. coli están W31 10 (Bachmann, Cellular and Molecular Biologv, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) y derivados de las mismas, que incluyen la cepa 33D3 con el genotipo W3110 ÍfliuA (?????) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente de EE.UU. n°. 5.639.635). Otras cepas y derivados de las mismas, como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. colix 1776 (ATCC 31,537) y E. coli RV308(ATCC 31 ,608) también están indicados. Estos ejemplos tienen carácter ilustrativo y no limitante. Los métodos para construcción de derivados de cualquiera de las bacterias antes mencionadas con genotipos definidos son conocidos en el sector y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Por lo general, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas que tiene en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies E. coli, Serratia o Salmonella se pueden usar bien como huésped cuando plásmidos bien conocidos como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 se utilizan para suministrar al replicón. Típicamente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas puede ser deseable incorporar al cultivo celular inhibidores adicionales de la proteasa.

Producción de anticuerpos Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Transformación significa introducir ADN en el huésped procariótico de forma que el ADN sea replicable, bien como elemento extracromosómico bien como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio se usa por lo general para células bacterianas que contienen barreras sustanciales en la pared celular. Otro método de transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Otra técnica utilizada es la electroporación.

Las células procarióticas usadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en el sector y aptos para cultivo de células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios apropiados son caldo de luria (LB) más nutrientes suplementarios necesarios. En algunas realizaciones, los medios también contienen un agente de selección, elegido en función de la construcción del vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de células procarióticas que contengan el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios de cultivo para el crecimiento de células que expresan un gen resistente a ampicilina.

Los anticuerpos necesarios aparte de carbono, nitrógeno y fuentes inorgánicas de fosfato también se pueden incluir a concentraciones apropiadas introducidas solas en una mezcla con otro suplemento o medio de cultivo como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados a partir del grupo formado por glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritriol y ditiotreitol.

Las células huésped procarióticas se cultivan a temperaturas apropiadas. El crecimiento de E. coli, por ejemplo, se produce a un rango de temperaturas comprendido entre unos 20 °C y unos 39 °C, entre unos 25 °C y unos 37 °C y a unos 30 °C. El pH del medio de cultivo puede ser cualquiera comprendido entre 5 y 9 aproximadamente, dependiendo sobre todo del microorganismo huésped. El pH para E. coli puede oscilar entre 6,8 y 7,4 aproximadamente o ser de 7,0.

Si un promotor inducible se utiliza en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteína se induce en condiciones aptas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, los promotores PhoA se utilizan para controlar la transcripción de los polipéptidos. Según esto, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitador de fosfato para la inducción. En una realización, el medios de cultivo limitador de fosfato es el C.R.A.P (véase, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Se pueden utilizar otros inductores diversos, según el constructo de vector empleado, como se sabe en el sector.

En una realización, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en el periplasma de las células huésped y se recuperan allí. La recuperación de las proteínas suponen la ruptura de los microorganismos, por lo general mediante choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez producida la ruptura de las células, los desechos celulares o células enteras se pueden eliminar mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden ser purificadas más, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con resina. De manera alternativa, pueden transportarse proteínas dentro del medio de cultivo y aislarse en él. Las células pueden retirarse del cultivo, y el sobrenadante del cultivo puede filtrarse y concentrarse para proceder a la posterior purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden volver a aislarse e identificarse mediante métodos comunes conocidos tales como la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) y ensayos Western blot.

En uno de los aspectos de la invención, la producción de anticuerpos se realiza en gran cantidad mediante proceso de fermentación. Existen varios procesos disponibles de fermentación de lotes alimentados a gran escala para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala se realizan en dispositivos de al menos 1000 litros de capacidad, por ejemplo, entre 1.000 y 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores utilizan agitadores de hélice para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (una fuente común de carbono/energía). La fermentación a pequeña escala hace referencia generalmente a la fermentación en fermentadores de aproximadamente no más de 100 litros de capacidad volumétrica, y pueden variar de 1 a 100 litros aproximadamente.

En un proceso de fermentación, la inducción de expresión proteica se inicia típicamente después de que las células hayan crecido en condiciones adecuadas hasta alcanzar la densidad deseada, p. ej. una OD550 de entre 180-220, momento en el cual las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Pueden utilizarse distintos inductores, de acuerdo con el constructo del vector utilizado, tal y como se conoce en el sector y como se ha descrito anteriormente. Las células pueden hacerse crecer durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen normalmente durante unas 12-50 horas, aunque es posible utilizar tiempos de inducción más cortos o más prolongados.

Pueden modificarse distintas condiciones de fermentación para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje adecuado y el plegamiento de los polipéptidos de anticuerpos secretados, pueden utilizarse vectores adicionales que sobreexpresan la proteína chaperona, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidil- propil cis,trans-isomerasa con actividad chaperona) para co-transformar las células huésped procarióticas. Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan la solubilidad y el plegamiento adecuado de proteínas heterólogas producidas en células bacteriales huésped. Chen y col. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n° 6.083.715; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n°. 6.027.888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210.

Pueden utilizarse ciertas cepas huésped con deficiencia de enzimas proteolíticas para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas (especialmente las que son sensibles desde el punto de vista proteolítico). Por ejemplo, las cepas de células huésped pueden modificarse para efectuar mutaciones genéticas relativas a los genes que codifican proteasas bacteriales conocidas tales como la Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de éstas. Algunas cepas de E. coli con deficiencia de proteasas están disponibles, y descritas, por ejemplo en Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., Patente de EE.UU. 5.264.365; Georgiou et al., Patente de EE.UU. 5.508.192; Hará et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

En una realización, en el sistema de expresión de la invención se utilizan como células huésped cepas de E. coli con deficiencia de enzimas proteolíticas transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas.

Purificación de anticuerpos En una realización, la proteína de anticuerpo que se produce mediante la invención descrita en la presente memoria se purifica de nuevo para obtener preparaciones que son substancialmente homogéneas para posteriores ensayos y usos. Pueden emplearse métodos estándar del sector para la purificación de proteínas. Los siguientes procedimientos tienen carácter ejemplar en lo que se refiere a procedimientos de purificación adecuados. Fraccionamiento en columnas de intercambio iónico o de inmunoafínidad, precipitación en etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en anhídrido silícico o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromatoisoenfoque, SDS-PAGE, precipitación en sulfato de amonio y filtrado en gel mediante, por ejemplo, Sephadex G-75.

En un aspecto, se utiliza Proteína A inmovilizada en una fase sólida para purificación por inmunoafínidad de los productos de anticuerpos de la invención. La proteína A es una proteína de pared celular de 41kD del Staphylococcus áureas que se une con gran afinidad a la región Fe de los anticuerpos. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13. La fase sólida a la que se fija la Pro teína A puede ser una columna que contenga una superficie de vidrio o anhídrido silícico, o una columna de ácido silícico o de vidrio poroso controlado. En ciertas aplicaciones, la columna se recubre con un reactivo, como el glicerol, para evitar una posible adherencia inespecífica de contaminantes.

Como primer paso de purificación, la preparación derivada del cultivo celular, según lo descrito anteriormente, puede aplicarse a una fase sólida de Proteína A inmovilizada para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la Proteína A. La fase sólida se lavaría a continuación, para eliminar los contaminantes unidos inespecífícamente a ella. Finalmente, el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida mediante elución.

Generación de anticuerpos usando células huésped eucarióticas Los componentes del vector suelen incluir, entre otros, uno o más elementos siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcador, un potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción. (i) Componente de secuencia de la señal Un vector para uso en una célula huésped eucariótica puede también contener una secuencia de señal u otro polipéptido con una escisión específica en el término N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada generalmente es aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal). En la expresión celular de los mamíferos, están disponibles las secuencias de señal de los mamíferos así como los líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal del herpes simplex gD.

El ADN para la región de dicho precursor está ligado en la estructura de lectura al ADN que codifica el anticuerpo. (i i) Origen de la replicación Por lo general, un componente origen de la replicación no es preciso para los vectores de expresión en mamíferos. Por ejemplo, el origen SV40 se puede utilizar habitualmente sólo porque contiene el promotor precoz. (i i i) Componente gen de selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, si procede o (c) suministran nutrientes básicos no disponibles a partir de medios complejos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Estas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que otorga resistencia al fármaco y, así, sobrevive a la estrategia de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de las células encargadas de absorber el ácido nucleico del anticuerpo, como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína I y II (por ejemplo, genes de metalotioneína en primates) adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se pueden identifican primero a través del cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo del DHFR. Las células huésped adecuadas cuando se utiliza el DHFR tipo natural incluye, por ejemplo, la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad del DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, las células huésped (en especial los huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, la proteína DHFR natural y otro marcador seleccionable como la aminoglicosida 3'-fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse mediante crecimiento celular en medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase la patente de Estados Unidos n° 4.965.199. (iv) Componente promotor Los vectores de expresión y clonación suelen contener un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente enlazado al ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, un anticuerpo). Se conocen las secuencias de promotores para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT situada aproximadamente entre las bases 25 y 30 antes del extremo 5' del promotor desde el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada entre las bases 70 y 80 antes del extremo 5' del promotor desde el inicio de la transcripción de muchos genes es la región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli(A) al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan bien en los vectores de expresión eucariótica.

La transcripción del polipéptido de anticuerpos a partir de los vectores en células huésped de mamíferos se puede controlar, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el poliomavirus, el virus de la viruela de las aves de corral, el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviario, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el Simian Virus 40 (SV40); a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina; a partir de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen fácilmente como un fragmento de restricción del SV40 que también contiene el origen viral de replicación del SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene fácilmente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión del ADN en huéspedes de mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como vector se da a conocer en la Patente de Estados Unidos n° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de Estados Unidos N° 4.601.978. Véase también Reyes y col., Nature 297:598-601 (1982) para la expresión del ADNc del interferón beta humano en células de ratón bajo control de un promotor timidina cinasa a partir del virus del herpes simplex. Alternativamente, la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous se puede utilizar como promotor. (v) Componente elemento potenciador La transcripción de un ADN que codifique un polipéptido de un anticuerpo de esta invención a través de eucariotas más altas se puede aumentar con frecuencia al insertar la secuencia de un potenciador en el vector. Se conocen ya muchas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína alfa e insulina). No obstante, lo habitual es que se utilice un potenciador procedente de un virus de células eucarióticas. Entre los ejemplos destacan el potenciador SV40 en el lado tardía del origen de la replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) para elementos de potenciación para la activación de los promotores eucarióticos. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' a 3' a la secuencia de codificación del polipéptido del anticuerpo, pero está situado generalmente en un sitio 5' desde el promotor. (vi) Componente finalización de la transcripción Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas contendrán también por lo general secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Estas secuencias están habitualmente disponibles desde las regiones no traducidas del extremo 5' y ocasionalmente el 3' de los ADN o ADNc virales o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de finalización de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento W094/1 1026 y el vector de expresión que se da a conocer en el mismo. (vii) Selección y transformación de células huésped Entre las células huésped apropiadas para clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente memoria descriptiva están células eucariotas más altas, incluidas células huésped de vertebrados. La progagación de células de vertebrados en cultivos (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Ejemplos de líneas celulares útiles de mamíferos son la línea CVl de riñón del mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham col., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVl ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL- 1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células caninas de riñón (MDCK, ATCC CCL 34); células de riñón de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células humanas de pulmón (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col, Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (viii) Cultivo de células huésped Las células huésped utilizadas para producir un anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en diversos medios. Medios comercialmente disponibles como Ham's FIO (Sigma), Minimal Essential Médium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle's Médium ((DMEM), Sigma) son aptos para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y col, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y col, Anal Biochem .102:255 (1980), Patentes de Estados Unidos N°s 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; o la patente de Estados Unidos Re. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede suplementar cuando sea necesario con hormonas y otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), soluciones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™), elementos de traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes por lo habitual en las concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se pueden incluir también otros suplementos necesarios a concentraciones adecuadas que serán conocidas por aquellos con conocimientos en la materia. Las condiciones del cultivo, como temperatura o pH entre otras, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para expresión y serán conocidas por los expertos en la materia. (ix) Purificación del anticuerpo Al utilizar técnicas recombinantes, se puede producir el anticuerpo intracelularmente, en el espacio periplásmico, en el espacio periplasmático, o directamente se puede secretar en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso, los residuos de partículas, bien células huésped o fragmentos Usados, se elimina por lo general, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltrado. Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran primero, por lo general, utilizando un filtro para concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltrado Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa como PMSF en cualquiera de las fases anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes casuales. La composición del anticuerpo preparado a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Esta última es una técnica de purificación generalmente aceptada. La idoneidad de los reactivos de afinidad como la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo del domino Fe de la inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas humanas ??, ?2, o ?4 (Lindmark ^ coi, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la ?3 humana (Guss y col, EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que el ligando de afinidad se une es con frecuencia la más agarosa, pero también están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como vidrio poroso controlado o poli(estirenodivinil)benceno, permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) es útil para la purificación. También están disponibles, dependiendo del anticuerpo que quiera recuperarse, otras técnicas para la purificación de las proteínas, como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en anhídrido silícico, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio iónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), cromatoisoenfoque, SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio. Siguiendo cualquiera de las fases preliminares de purificación, la mezcla que contiene el anticuerpo de interés y los contaminantes puede estar sujeta a nuevas etapas de purificación, según sea necesario, por ejemplo, mediante cromatografía de interacción hidrófoba con pH bajo utilizando una solución de elución a un pH entre 2,5 y 4,5, preferiblemente a concentraciones bajas en sal (por ejemplo, entre 0-0,25M aproximadamente) .

Conviene señalar que, en general, las técnicas y métodos para la preparación de anticuerpos para uso en investigación, pruebas y uso clínico están consolidados en el sector, son coherentes con todo lo anterior y/o se consideran apropiados por un experto en el sector para el anticuerpo concreto de interés.

Ensayos de actividad Los anticuerpos de la invención se pueden caracterizar por sus propiedades físico-químicas y por sus funciones biológicas mediante varios ensayos conocidos en la especialidad.

Asimismo, los anticuerpos purificados se pueden caracterizar mediante una serie de ensayos que incluyen la secuenciación del extremo N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía líquida de alta resolución no desnaturalizante de exclusión por tamaño (HPLC), espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.

En los casos necesarios, los anticuerpos se analizan por su actividad biológica. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se prueban por su actividad de unión al antígeno. Los ensayos de unión al antígeno que se conocen en la especialidad y pueden ser usados en la presente memoria descriptiva incluyen ensayos de unión competitiva o directa que usan técnicas como western blots, radioinmunoensayos, ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A.

En una forma de realización, la invención contempla un anticuerpo alterado que tiene algunas, pero no la totalidad, de las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para muchas aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, pero determinadas funciones efectoras (como complemento y ADCC) son innecesarias o dañinas. En algunas formas de realización, se miden las actividades Fe del anticuerpo para asegurar que sólo se mantienen las propiedades deseadas. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo para confirmar la reducción/depleción de actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión del receptor Fe (FcR) pueden ser realizados para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por eso es probable que carezca de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, células NK, expresan sólo Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991). Se describe un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente de EE.UU. n° 5.500.362 o 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para tales ensayos se encuentran las células mononucleares de la circulación periférica (PBMC) y las células asesinas (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se desvela en Clynes et al. PNAS (EE. UU.) 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo los ensayos de unión Clq para confirmar que el anticuerpo no puede unirse al Clq y por ello carece de actividad CDC. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996). También se pueden realizar la unión de FcRn y eliminación in vi'vo/determinaciones de semivida con el uso de métodos conocidos en la especialidad.

Fragmentos de anticuerpos La presente invención engloba fragmentos de anticuerpos. En determinadas circunstancias, existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, en vez de anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite una rápida eliminación y puede llevar a un mejor acceso a tumores sólidos. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenían mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células anfitrión recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden expresarse todos en E. coli y secretarse a partir de E. coli, lo que permite la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se puede recuperar directamente de E. coli y unir químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter col., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otro planteamiento, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de cultivos de células anfitrión recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')2 con mayor semivida in vivo que comprende residuos de un epítopo de unión a receptor de rescate se describe en la patente de Estados Unidos n° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán conocidas por el médico cualificado. En otras formas de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv). Véase el documento WO 93/16185; la patente de Estados Unidos n° 5.571.894 y la patente de Estados Unidos n° 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con puntos de combinación intactos que están privados de regiones constantes; por ello, son aptos para una unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv se pueden construir para obtener la fusión de una proteína efectora en el extremo carboxi terminal o amino terminal de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal y como se describe en la patente de Estados Unidos n° 5.641.870. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecífícos.

Anticuerpos humanizados La presente invención engloba anticuerpos humanizados. Son diversos los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos que están descritos en la materia. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducido en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen a menudo como residuos "importados", que generalmente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y sus colaboradores (Jones y col, (1986) Nature 321 :522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), sustituyendo las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. n° 4.816.567) en que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de puntos análogos de anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para realizar los anticuerpos humanizados puede ser muy importante para disminuir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento llamado "la más apta", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de un roedor se coteja con toda la librería de secuencias conocidas de dominios variables humanos. La secuencia humana que se parece más a la del roedor se acepta, entonces, como la estructura humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 :2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro procedimiento utiliza una estructura concreta derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de cadenas ligeras o pesadas. Esta misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151 :2623.

Es deseable también, por lo general, que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad con el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, siguiendo uno de los procedimientos, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y las humanizadas. Los modelos tridimensionales de la inmunoglobulina están comúnmente disponibles, y los expertos en la materia los conocen de sobra. Existen programas informáticos que ilustran y muestran las estructuras probables de conformación tridimensional de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel que los residuos probablemente desempeñan en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de la FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación y lograr así la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo una mayor afinidad con el (los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervariable influyen directamente y en mayor medida en la unión al antígeno.

Anticuerpos humanos Los anticuerpos humanos antipoliubiquitina de la invención se pueden construir combinando una o más secuencias de dominio variable Fv de clones seleccionadas de librerías de representación en imágenes de fagos derivados de humanos con una o más secuencias de domino constante humanas, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los anticuerpos humanos monoclonales antiubiquitina de la invención se pueden producir por el procedimiento del hibridoma. Las estirpes celulares del mieloma humano y del heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, en Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al, J. Immunol., 147: 86 (1991). Actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, una vez inmunizados, de generar un repertorio completo de anticuerpos humanos cuando no se produzca inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región (JH) del anticuerpo que se une a la cadena pesada en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal inhibe por completo la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes humanos de la inmunoglobulina de línea germinal a uno de estos ratones mutantes de línea germinal ocasionará la producción de anticuerpos humanos al actuar sobre el antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al, Proc. Nati Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al, Year in Immunol, 7: 33 (1993). También se puede utilizar la transposición de genes para derivar anticuerpos humanos de no humanos, por ejemplo, anticuerpos de roedores, en los que el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de inicio. Según este método, que también se denomina "impronta de epítopos", la región variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido mediante técnicas de representación en imágenes de fagos como las descritas anteriormente se sustituye por un repertorio de genes de dominio V humanos, lo que crea una población de quimeras Fab o scFv de cadena humana/cadena no humana. La selección con el antígeno da lugar al aislamiento de un Fab o scFV quimérico de cadena humana/cadena no humana, en el que la cadena humana restaura el sitio de unión a antígeno destruido al eliminar la cadena no humana correspondiente del clon de la representación del fago primario; es decir, el epítopo rige (sella) la elección de la molécula de la cadena humana. Cuando se repite el proceso para sustituir la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la tradicional humanización de anticuerpos no humanos mediante transplante de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos que no tienen residuos FR o CDR de origen no humano.

Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión con al menos dos antígenos diferentes. En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanos o humanizados. En algunas realización, una de las especificidades de la unión es para poliubiquitina que incluye un enlace específico a Usina y la otra es para cualquier otro antígeno. En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos poliubiquitinas diferentes con dos enlaces distintos a Usina. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Los procedimientos para realizar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia. La producción recombinante tradicional de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en que las dos cadenas tienen distintas especificidades (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y la cantidad de producto que se obtiene es baja. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al, EMBO J., 10: 3655 (1991). Según una realización distinta, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias de los dominios constantes de la inmunoglobulina. La fusión es, por ejemplo, con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En algunas realizaciones, la primera región constante de cadena pesada (CHl) que contengan el lugar necesario para la unión de la cadena ligera está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan a un organismo huésped adecuado. Esto ofrece una gran flexibilidad a la hora de ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones donde los índices desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizadas en la construcción proporcionan las producciones óptimas. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o todas tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en índices iguales da como resultado producciones elevadas o los índices no tienen particular importancia. En una realización de este método, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecífica proporciona una forma sencilla de separación. Este método se desveló en el documento WO 94/04690. Para obtener mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, consúltese, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121 :210 (1986). Según otro método, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede modificar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La interfaz comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) larga(s) se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodímero con relación a otros productos finales no deseados como los homodímeros. Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede emparejar con la avidina, el otro con la biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para conseguir que las células del sistema inmunitario actúen sobre células no deseadas (patente de EE.UU. n° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección de VIH (documentos WO 91/00360 y WO 92/00373 y la patente europea EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden obtener utilizando cualquier procedimiento de reticulación oportuno. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la materia y se desvelan en la patente de EE.UU. n° 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar mediante un enlace químico. Brennan et al, Science, 229: 81 (1985) se describe un procedimiento en que los anticuerpos intactos se escinden por vía proteolítica para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito de sodio del agente que forma complejos con el ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados del tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados del Fab'-TNB se reconvierte entonces en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado del Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los recientes progresos han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que se pueden emparejar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecífica F(ab')2 completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a un emparejamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Por lo tanto, el anticuerpo biespecífico formado era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos cito tóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano. También se han descrito varias técnicas para realizar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al, J. Immunol., 148(5): 1547- 1553 (1992). Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para producir los homodímeros del anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger ^ col, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando, por tanto, dos puntos de unión al antígeno. También se ha informado de otra estrategia para realizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv de cadena única (sFv). Véase Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994). También se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol 147: 60 (1991).

Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más de prisa que un anticuerpo bivalente por una célula que exprese un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son los que no pertenecen a la clase IgM) con tres o más sitios de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. El dominio preferente de dimerización comprende, por ejemplo, una región Fe o una región bisagra o consiste en ellas. En esta situación, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión al antígeno amino-terminal a la región Fe. En una realización, un anticuerpo multivalente comprende, por ejemplo, entre tres y 8, aproximadamente, o cuatro sitios de unión a antígeno, o está formado por ellos. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptidos (por ejemplo, dos cadenas de polipéptidos) en la que la cadena o cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio de variable, VD2 es un segundo dominio de variable, Fe es una cadena de polipéptidos de una región Fe, XI y X2 representan una aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender: VH-CH1-enlazador flexible-VH-CHl- cadena de la región FC o VH-CH1-VH-CH1 -cadena de la región Fe. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva puede comprender, además, preferentemente, al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva, por ejemplo, puede comprender entre dos y cuatro polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera considerados en esta memoria descriptiva comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, un dominio CL.

Variantes de anticuerpos En algunas realizaciones, se contemplan la(s) modifícación(es) de la secuencia de aminoácidos descritas en la presente memoria. Por ejemplo, se puede querer mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar al introducir cambios nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis del péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones dentro y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias del aminoácido del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se puede realizar para llegar a la construcción final, siempre que ésta posea las características deseadas. Las alteraciones aminoacídicas pueden ser introducidas en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del sujeto en el momento en que se realiza la secuencia.

Un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagenia se denomina "mutagenia de barrido de alanina", tal como se describe en Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. En la presente memoria descriptiva, se identifica un residuo o grupo de residuos de dianas (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido con carga negativa o neutral (alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Estas ubicaciones de los aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo más u otras variantes en, o para, los puntos de sustitución. Por tanto, a pesar de que el sitio donde introducir una variación de una secuencia de aminoácidos esté predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se tenga un carácter predeterminado. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un lugar dado, se realiza el barrido de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las inmunoglobulinas expresadas se monitorizan para detectar la actividad deseada.

Las inserciones en las secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxi terminal que varían en longitud desde un simple residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionil en el extremo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o terminal o C del anticuerpo a una enzima (por ej. para ADEPT) o un polipéptido que aumente la semivida sérica del anticuerpo.

Otra clase de variante es una variante de sustitución de un aminoácido. Estas variantes reemplazan al menos un residuo de aminoácidos en la molécula del anticuerpo por un residuo diferente. Los lugares de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla A bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Si dichas sustituciones ocasionan un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla A, o como se describe a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos se pueden monitorizar.

TABLA A Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la columna vertebral del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación plana o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar diana, o (c) el residuo de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., págs. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) apolares: Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares no cargados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) acídicos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H) Alternativamente, los residuos que aparecen naturalmente se pueden dividir en grupos basándose en sus propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Estos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios de sustitución conservadora o en los sitios restantes (no conservados). Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ej., un anticuerpo humanizado o humano). Por lo general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para profundizar en su desarrollo tendrá(n) propiedades biológicas modificadas (es decir, mejoradas) con relación al anticuerpo parental desde el cual se generó (generaron). Una manera conveniente de generar dichas variantes de sustitución involucra la maduración de afinidad utilizando una presentación en fagos. De manera resumida, varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo, los sitios 6-7) se mutan para generar todas las sustituciones posibles de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos así generados se representan a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones a, al menos, parte de una proteína de revestimiento de fagos (por ejemplo, con el producto del gen III de M13 que hay dentro de cada partícula. Las variantes representadas en fagos se examinan entonces para detectar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se desvela en la presente memoria descriptiva. Para identificar los lugares de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar mutagenia mediante barridos (por ejemplo, barridos de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyan significativamente a la unión del antígeno. Como alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y los residuos adyacentes son candidatos a la sustitución de acuerdo con las técnicas conocidas en el sector, incluidas las explicadas en la presente memoria descriptiva. Una vez generadas dichas variantes, el panel de variantes está sujeto a examen utilizando técnicas conocidas en el sector, incluidas las descritas en la presente memoria descriptiva, y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes se pueden seleccionar para profundizar en su desarrollo.

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de los aminoácidos que aparezcan naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigido al lugar), mutagénesis dirigida mediante PCR y mutagénesis por inserción de un cásete de una variante preparada anteriormente o de una versión no variante del anticuerpo.

Puede ser deseable introducir una o más modificaciones en los aminoácidos en la región Fe de anticuerpos de la invención, lo que genera una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas) que contenga una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos, incluida la de la cisteína bisagra.

Según esta descripción y los conocimientos del sector, se contempla que en algunas realizaciones un anticuerpo de la invención pueda comprender una o más alteraciones, frente a su anticuerpo homólogo de tipo natural, por ejemplo, en la región Fe. Estos anticuerpos conservarían, no obstante, las mismas características necesarias para uso terapéutico, frente a su homólogo de tipo natural. Por ejemplo, se cree que se pueden realizar algunas alteraciones en la región Fe que daría como resultado la unión Clq alterada y/o en Citotoxicidad Dependiente de Complementos (CDC), por ejemplo, como se describe en W099/51642. Véase también Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); Patente de EE.UU. n° 5.648.260; Patente de EE.UU. 5.624.821 ; y W094/29351 que tratan otro ejemplos de variantes de regiones Fe.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en la interfaz de polipéptidos Fe que comprenden la región Fe, donde las modificaciones facilitan y/o fomentan heterodimerización. Estas modificaciones comprenden la introducción de una protuberancia en un primer polipéptido Fe y una cavidad en un segundo polipéptido Fe, donde la protuberancia se puede posicionar en la cavidad para que fomente la acomplejación del primer y segundo polipéptidos Fe. Los métodos de generación de anticuerpos con estas modificaciones se conocen en esta especialidad, por ejemplo, los descritos en la Patente de EE.UU. n° 5.731.168.

Inmunoconjugados En otro aspecto, la invención proporciona inmunoconjugados, (ADC), que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico como por ejemplo un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, animal o vegetal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

El uso de anticuerpos conjugados con fármaco para la administración local de agentes citostáticos o citotóxicos, es decir los fármacos para matar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151 -172; Patente de EE.UU. 4.975.278) permite una administración delimitada del fármaco a tumores, y acumulación intracelular del mismo, donde la administración sistemática de estos agentes no conjugados con fármacos pueden resultar en inaceptables niveles de toxicidad tanto para las células normales, como para las células tumorales que se intentan eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). Se busca la máxima eficacia con la mínima toxicidad. Ambos, anticuerpos monoclonales y policlonales, han sido descritos como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol. Immunother., 21 :183-87). Algunos medicamentos empleados en estos métodos incluyen la daunomicina, la doxorrubicina, el metotrexato y la vindesina (Rowland et al., (1986) supra). Entre las toxinas empleadas en anticuerpos conjugados con toxinas se encuentran toxinas bacterianas como la toxina de la difteria, toxinas vegetales como la ricina, toxinas de pequeñas moléculas como la geldanamicina (Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cáncer Inst. 92(19): 1573-1581 ; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y calicheamicina (Lode et al. (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden afectar sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión de tubulina, la unión de ADN o la inhibición de la topoisomerasa. Algunos medicamentos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos receptores de proteínas. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un anticuerpo conjugado con radioisótopos compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa IgGl murina dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de los linfocitos B cancerosas y normales y contra el radioisótopo l uIn o 90Y unido por un quelante enlazador de tiourea (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). A pesar de que el Zevalin presenta actividad contra las células B del linfoma non-Hodgkin (NHL), su administración tiene como resultado unas citopenias severas y prolongadas en la mayor parte de los pacientes. MYTOLARG™ (Gentuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto de un anticuerpo hu CD33 enlazado a calicheamicina, se aprobó en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; Patente de EE.UU. nos 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 57391 16; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Inmugen, Inc.), un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 enlazado al grupo de fármacos de los maitansinoides por medio de un enlazado de disulfido SPP, DM1, está probado para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, como los de colon, de páncreas, gástricos y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal del antígeno de membrana antiprostático (PSMA) enlazado al grupo de los maitansinoides, DM1, fue probado para el tratamiento potencial de los tumores de próstata. Los péptidos auriestatinos, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, fueron conjugados a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos para CD30 en tumores hematológicos (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) y se encuentran bajo desarrollo terapéutico. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen en la presente memoria descriptiva (anteriormente). Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordü, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de la Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y el tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993. Se dispone de diversos radionuclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Entre los ejemplos están 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 186 and Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteína bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HC1), ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato), aldehidos (por ejemplo, glutaráldehídos), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (por ejemplo, 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como l,5-difluoruro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido triaminopentaacético 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Véase el documento W094/11026. Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, como una calicheamicina, maitansinoides, dolostatinas, aurostatinas, un tricoteceno y un CC1065, y los derivados de estas toxinas que tengan una actividad tóxica, también se contemplan en la presente memoria descriptiva.

Maitansina y maitansinoides En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez a partir del arbusto de África oriental Maytenus serrata (Patente de Estados Unidos 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producían maitansinoides, como el maitansinol y los ésteres de C-3 amitansinol (Patente de Estados Unidos n° 4.151.042). El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se revelan, por ejemplo, en las Patentes estadounidenses nos 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533. Las porciones de fármacos maitansinoides son porciones de fármacos que resultan atractivas para la elaboración de conjugados de anticuerpos con fármacos por sus siguientes características: (i) son relativamente accesibles en lo que se refiere a su preparación mediante fermentación, modificación química o derivación de productos de fermentación, (ii) son fáciles de someter a derivación, con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de los enlazadores no disulfuro con anticuerpos, (iii) estabilidad en plasma, y (iv) resultan efectivos frente a distintas líneas celulares tumorales. A continuación se citan algunos ejemplos de realizaciones de porciones de fármacos maitansinoides: DM1 ; DM3; y DM4. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, los métodos para elaborar éstos, y su uso terapéutico se revela, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos 5.208.020, 5.416.064 y en la Patente europea EP 0 425 235 Bl , y los descubrimientos de las mismas se incorporan expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Liu y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describe los inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era altamente citotóxico para con las células de cáncer de colon en cultivo y demostró actividad antineoplásica en ensayos de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugaba por medio de un enlazado de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en las líneas celulares de cáncer de colon humanas, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1 -maitansinoide se probó in vitro en la línea celular de cáncer de mama SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco consiguió un alto grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría aumentarse si se aumenta el número de moléculas maitansinoides por cada molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una citotoxicidad sistémica baja en ratones.

Pueden prepararse conjugados anticuerpo-maitansinoide mediante enlace químico de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin hacer que disminuya significativamente la actividad biológica de ambos elementos del conjugado. Véase, p- ej. la Patente de EE.UU. n° 5.208.020 (los descubrimientos de la cual se incorporan expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia). Una media de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por anticuerpo ha mostrado eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la función o la solubilidad del anticuerpo, a pesar de que cabría esperar que incluso una molécula toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad en relación con el uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en el sector y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se revelan maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 5.208.020 y en otras patentes y publicaciones no patentadas a las que anteriormente se ha hecho referencia. Los maitansinoides incluyen el maitansinol y análogos modificados del maitansinol, en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como distintos ésteres del maitansinol. Se conocen muchos grupos de enlace en la materia para producir conjugados anticuerpo-maitansinoide, incluidos, por ejemplo, los revelados en la Patente de Estados Unidos n° 5.208.020 o en la Patente Europea 0 425 235 Bl, and Chari y col. Cáncer Research 52: 127-131 (1992), y la Solicitud de patente EE.UU. N° 10/960.602, presentada el 8 de oct. 2004, (cuyos descubrimientos se incorporan expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia). Los conjugados anticuerpo-maitansinoide que incluyen el componente enlazador SMCC pueden prepararse se la manera que se describe en la Solicitud de Patente EE.UU N° 10/960.602, presentada el 8 de oct. 2004. Los grupos enlazantes incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a la peptidasa o grupos lábiles a la estearasa, como se revela en las patentes anteriormente identificadas. En la presente memoria descriptiva se dan ejemplos y se describen grupos enlazantes adicionales.

Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteína bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HCI), ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato), aldehidos (por ejemplo, glutaráldehídos), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (por ejemplo, 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como l,5-difluoruro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de unión incluyen N-sucinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson col, Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y N-sucinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfido. El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace con éster se puede formar mediante reacción con un grupo hidroxilo que utilice técnicas de unión convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una forma de realización, el enlace se forma en la posición 3 del maitansinol o un análogo del maitansinol. Auristatinas y dolostatinas En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos peptídicos a la dolostatina y derivados, las auristatinas (Patentes de EE.UU. N05. 5635483; 5780588). Se ha establecido que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de microtúbulos, la hidrólisis GTP, y la división nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad anticancerígena (U.S. 5663149) y antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La porción del fármaco auristatina o dolastatina puede estar unida al anticuerpo a través de los extremos terminales N (amino) ó C (carboxil) de la porción peptídica del fármaco (WO 02/088172). Ejemplos de realizaciones de auristatina incluyen las porciones DE y DF enlazadas a monometilauristatina por el extremo terminal N, como se revela en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Ser. EE.UU N°. 10/983,340, present. 5 nov. 2004, cuyo contenido se incorpora expresamente en su totalidad a modo de referencia.

Algunos ejemplos de realizaciones de auristatina incluyen MMAE y MMAF. Otros ejemplos de realizaciones que incluyen MMAE o MMAF y varios componentes enlazantes (descritos en la presente memoria con mayor detalle) incluyen Ab-MC-vc-PAB-MMAF, Ab-MC-vc-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE and Ab-MC-MMAF. Por lo general, las porciones de fármacos basadas en péptidos pueden prepararse formando un enlace peptídico entre uno o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Tales enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (véase E. Schróder and K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las porciones de fármacos auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos siguientes: EE.UU. 5.635.483; EE.UU. 5.780.588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111 :5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; and Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863. Véase también Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", U.S. Ser. No. 10/983,340, present. 5 Nov. 2004, incorporación mediante referencia en su totalidad (que revela, p.ej., enlazadores y métodos de preparación de compuestos de monometilvalina tales como conjugados MMAE/MMAF-enlazadores).

Calicheamicina En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de la calicheamicina es capaz de producir la ruptura del ADN de hebra doble en concentraciones por debajo de picomolar. Para la preparación de conjugados de la familia de la calicheamicina, véanse las patentes de Estados Unidos 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 , 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company). Entre los análogos estructurales de la calicheamicina que se pueden utilizar están ?? ', a2', a3', N-acetil-?? ', PSAG y ?? (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes de EE.UU. anteriormente mencionadas para American Cyanamid). Otro fármaco antineoplásico con el que es posible conjugar el anticuerpo es QFA que es un atifolato. Tanto la calicheamicina como el QFA tienen puntos intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por ello, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo potencia enormemente sus efectos citotóxicos. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las Patentes de EE.UU. 5.053.394, 5.770.710, así como las esperamicinas (Patente de EE.UU. n° 5.877.296).

Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de la Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria offícinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y el tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Esta invención también contempla un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ej. un ribonucleasa o una endonucleasa de ADN como por ejemplo la desoxirribonucleasa; ADNasa). Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Hay disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la 21 1 131 125 90 186 producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen At , 1 , 1 , Y , Re , Re188, Sm153, Bi212, P32 Pb212e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para gammagrafía, por ejemplo Tc99m o I123, una etiqueta rotatoria para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como diagnóstico por imágenes obtenidas mediante resonancia magnética, MRI), como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-1 1, fiuorina-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. El radio u otros marcadores se pueden incorporar en el conjugado en formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores adecuados de aminoácidos que contengan, por ejemplo, fluorina- 19 en vez de hidrógeno. Etiquetas como Tc99m o I123, Re186, Re188 e Inm se pueden unir a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 se puede unir a través de un residuo de Usina. El método IODOGEN (Fraker y col (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) se puede utilizar para incorporar yodo-123. "Anticuerpos monoclonales en inmunogammagrafía" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos detalladamente. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a pro teína bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HC1), ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato), aldehidos (por ejemplo, glutaráldehídos), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (por ejemplo, 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como l,5-difluoruro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). El ácido triaminopentaacético 1 -isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Consúltese el documento W094/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil al ácido, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador de fotolabilo o un enlazador que contenga disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de EE.UU n° 5.208.020). Los compuestos de la invención contemplan expresamente el ADC preparado con reactivos reticulares: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (sucinimidil-(4-vinilsulfona)benzoata) que está comercializado (por ejemplo, por Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE.UU). Veánse las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. Preparación de los conjugados de anticuerpos con fármacos En los conjugados de anticuerpos con fármacos (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga a una o más porciones de un fármaco (D), por ejemplo, porciones de fármaco de 1 a 20 aproximadamente por anticuerpo, a través de un enlazador (L). Los ADC de la formula I se pueden preparar por varios medios, empleando reacciones químicas orgánicas, condiciones y reactivos conocidos por los expertos, como: (1) una reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un agente enlazador bivalente, para formar un Ab-L, mediante una unión bivalente, seguida de la reacción con una fracción del fármaco D; y (2) una reacción de un grupo nucleofílico de una fracción del fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de la reacción con el grupo nucleofílico del anticuerpo. En la presente memoria descriptiva, se describen los métodos adicionales para la preparación del ADC.

Ab-(L-D)p I El enlazador puede estar formado por uno o más componentes enlazadores. Los componentes de enlace ejemplares incluyen: 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-fe"), p-aminobensiloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC), y N-Succinimidil (4-yodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Los componentes enlazadores adicionales son conocidos en el sector y algunos se describen en la presente memoria descriptiva. Véase también "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", EE.UU. N° de serie 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004, cuyo contenido está incorporado íntegramente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. En ciertas formas de realización, el enlazador puede comprender residuos de aminoácidos. Los componentes enlazadores ejemplares de aminoácidos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-fe). Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gli-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gli-gli-gli). Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente enlazador de aminoácidos incluyen aquellos que ocurren de forma natural, tales como los aminoácidos menores y los análogos de aminoácidos que no ocurren de forma natural, como la citrulina. Los componentes enlazadores pueden designarse y optimizarse en su selectividad para la escisión mediante una enzima específica, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.

A continuación se muestran las estructuras ejemplares de los componentes enlazadores (donde la línea ondulada indica los sitios de unión covalentes a otros componentes del ADC) Los componentes enlazadores ejemplares adicionales y las abreviaturas incluyen (donde se muestra el anticuerpo (Ab) y el enlazador, y p va de 1 a aproximadamente 8): Los grupos nucleofílicos en los anticuerpos incluyen: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino de la cadena lateral, por ej. Usina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por ej. cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcares donde el anticuerpo es glicosilado.

Los grupos amino, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y son capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrofílicos en las porciones del enlazador y los reactivos enlazadoras, que incluyen: (i) ésteres activos como los ésteres NHS, los ésteres HOBt, haloformatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo, y grupos maleimidos. Ciertos anticuerpos contienen bisulfuros de intercadena reducible, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden convertirse en reactivos mediante conjugación con reactivos enlazadores mediante el tratamiento con un agente reductor como el DDT (ditiotreitol). Por lo tanto, cada puente de cisteína formará, en teoría, dos nucleofilos tiol reactivos. Los grupos nucleofílicos adicionales pueden introducirse en los anticuerpos a través de la reacción de las Usinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) lo que da lugar a la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden ser introducidos en un anticuerpo (o un fragmento del mismo) mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o mas residuos de cisteína (por ej. preparando anticuerpos mutantes que comprendan uno o más residuos de aminoácidos de cisteínas no nativas). Los conjugados de anticuerpos de la invención con fármacos, también pueden producirse mediante la modificación del anticuerpo para introducir porciones electrofílicas, las cuales pueden reaccionar con sustituyentes nucleofílicos en el reactivo enlazador o el fármaco. Las azúcares de los anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ej. con reactivos oxidantes de periodato, a fin de formar grupos cetonas o aldehidos, los cuales pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazadores o las fracciones del fármaco. Los grupos resultantes de amina base de Schiff pueden formar un ligamiento estable, o pueden reducirse, por ej. mediante los reactivos de hidruro de boro para formar enlaces amina estables. En una forma de realización, la reacción de la porción carbohidratada de un anticuerpo glicosilado, ya sea con galactosa oxidasa o con metaperiodato de sodio, puede producir grupos de carbonilo (aldehidos y cetonas) en la proteína que pueden reaccionar con los grupos apropiados en el fármaco (técnicas de bioconjugado de Hermanson). En otra forma de realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N-terminal pueden reaccionar con metaperiodato de sodio, lo que da lugar a la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugados Químicos 3: 138-146; EE.UU. 5362852). Este aldehido se puede hacer que reaccione con un fragmento de fármaco o un nucleófilo enlazador. Del mismo modo, los grupos nucleofílicos en una fracción del fármaco incluyen los siguientes compuestos: los grupos amino, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y aril-hidracida, capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en las fracciones enlazadoras y reactivos enlazadores, que incluyen: (i) ésteres activos como los ésteres NHS, los ésteres HOBt, haloformos, y haluro de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo, y grupos maleimidos. Alternativamente, es posible realizar una fusión de proteínas que contengan el anticuerpo y el agente citotóxico, por ej. mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede incluir regiones respectivas que codifiquen las dos porciones del conjugado, ya sea adyacente uno a otro o en forma separada por una región que codifica un péptido de enlace, el cual no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En otra forma de realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (como la estreptavidina) y actuar previamente contra el tumor, donde se administra al paciente el conjugado receptor del anticuerpo, luego, se elimina de la circulación el conjugado no unido, utilizando un agente de eliminación, y posteriormente se administra un "ligando" (por ej. la avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ej. un radionucleótido). El anticuerpo (Ab)-MC-MMAE puede prepararse conjugando MC-MMAE con cualquiera de los anticuerpos que se indican en la presente memoria descriptiva de la manera que se indica a continuación. El anticuerpo disuelto en 500 mM de borato de sodio y 500 mM de cloruro de sodio a pH 8,0 es tratado con un exceso de 100 mM de ditiotreitol (DTT). Después de incubarlo a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos, se sustituye el búfer por elución con resina Sephadex G25 y elución con PBS con 1 mM DTP A. Se controla el valor tiol/Ab mediante la determinación de la reducción de la concentración de anticuerpos a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol mediante la reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y la determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfría en hielo. El reactivo enlazador del fármaco, maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE), es decir, MC-MMAE, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua en la concentración conocida, y se agrega al anticuerpo reducido enfriado 2H9 en PBS. Después de aproximadamente una hora, se agrega un exceso de maleimido para extinguir la reacción y cubrir cualquier anticuerpo del grupo tiol no reactivo. La mezcla de reacción se concentra mediante centrifugación de ultrafiltración y el 2H9-MC-MMAE se purifica y se desalina por elución con resina G25 en PBS, filtrada a través de filtros de 0,2 µ?? en condiciones estériles, y congelada para su almacenamiento. El anticuerpo MC-MMAP puede prepararse conjugando MC-MMAF con cualquiera de los anticuerpos que se proporcionan en la presente memoria descriptiva, siguiendo el protocolo previsto para la preparación del Ab-MC-MMAE. El anticuerpo MC-val-cit-PAB-MMAE se prepara conjugando MC-val-cit-PAB-MMAE con cualquiera de los anticuerpos que se proporcionan en la presente memoria descriptiva, siguiendo el protocolo previsto para la preparación del Ab-MC-MMAE. El anticuerpo MC-val-cit-PAB-MMAF se prepara conjugando MC-val-cit-PAB-MMAF con cualquiera de los anticuerpos que se proporcionan en la presente memoria descriptiva, siguiendo el protocolo previsto para la preparación del Ab-MC-MMAE. El anticuerpo SMCC-DM1 se prepara conjugando SMCC-DM1 con cualquiera de los anticuerpos que se proporcionan en la presente memoria descriptiva, a saber: Se realiza una derivatización del anticuerpo purificado con Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) para introducir el enlazador SMCC. Específicamente, el anticuerpo es tratado a 20 mg/ml en 50 mM de fosfato de potasio / 50 mM de cloruro de sodio / 2 mM de EDTA, pH 6,5 con 7,5 equivalentes molares de SMCC (20 mM en DMSO, 6,7 mg/ml). Después de mezclar durante 2 horas en argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción es filtrada a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con 50 mM de fosfato de potasio / 50 mM de cloruro de potasio / 2 mM de EDTA, pH 6,5. Se realizan análisis combinados de las fracciones que contienen anticuerpos.

El anticuerpo SMCC preparado de esta forma, es diluido con 50 mM de fosfato de potasio / 50 mM de cloruro de sodio / 2 mM EDTA, pH 6,5 hasta una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml, y reactivada con 10 mM de solución DM1 en dimetilacetilamida. Se mezcla la reacción a temperatura ambiente en argón durante 16,5 horas. Se filtra la mezcla reactiva de conjugación a través de una columna Sephadex G25 de filtración en gel (1 ,5 x 4,9 cm) con 1 x PBS a un pH de 6,5. La ratio del fármaco DM1 con el anticuerpo (p) puede ser de aproximadamente 2 a 5, según medición de la absorbancia a 252 nm y a 280 nm. El Ab-SPP-DMl se prepara conjugando SPP-DM1 con cualquiera de los anticuerpos que se proporcionan en la presente memoria descriptiva que se indican a continuación. Se realiza una derivatización del anticuerpo purificado con N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato para introducir los grupos de ditiopiridilo. El anticuerpo (376,0 mg, 8 mg/ml) en 44,7 mi de 50 mM búfer de fosfato de potasio (pH 6,5) que contiene 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de EDTA es tratado con SPP (5,3 equivalentes molares en 2,3 mi de etanol). Después de la incubación durante 90 minutos en argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción es filtrada en gel a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con 35 mM de citrato de sodio, 154 mM de cloruro de sodio, 2 mM búfer EDTA. Se realizaron análisis combinados de las fracciones que contienen anticuerpos. El grado de modificación del anticuerpo es determinado de la forma que se describe anteriormente. Los anticuerpos SPP-Py (aproximadamente 10 µp???ee de grupos liberadores de 2-tiopiridina) se diluyen con los mencionados 35 mM de búfer citrato de sodio, pH 6,5, a una concentración final de aproximadamente 2,5 mg/ml. Luego se agrega DM1 (1,7 equivalentes, 17 µG ??eß) en 3,0 mM dimetilacetamida (DMA, 3% v/v en la mezcla de reacción final) a la solución del anticuerpo. La reacción continua a temperatura ambiente en argón durante aproximadamente 20 horas. Se carga la mezcla de reacción a una columna Sephacryl S300 de filtración en gel (5,0 cm x 90,0 cm, 1,77 1) equilibrada con 35 mM de citrato de sodio, 154 mM de NaCl, pH 6,5. El caudal puede ser de aproximadamente 5,0 ml/min y se toman 65 fracciones (20,0 mi cada una). La cantidad de moléculas del fármaco DM1 enlazadas por molécula del anticuerpo (?') esta determinada por la medición de la absorbancia a 252 nm y 280 nm, y puede ser de aproximadamente 2 a 4 DM1 fracciones del fármaco, por cada anticuerpo 2H9. El anticuerpo BMPEO-DM1 se prepara conjugando BMPEO-DM1 con cualquiera de los anticuerpos que se proveen en la presente memoria descriptiva, a saber: El anticuerpo es modificado por el reactivo bis-malaimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), dejando un grupo malaimido puro en la superficie del anticuerpo. Esto puede lograrse mediante la disolución de BM(PEO)4 en una mezcla de 50% de etanol/agua a una concentración de 10 mM y agregando un exceso molar multiplicado por diez a una solución que contiene anticuerpos en salina búfer fosfato de aproximadamente 1 ,6 mg/ml (10 micromolar) y permitiendo que reaccione durante 1 hora para formar un anticuerpo enlazador intermedio, 2H9-BMPEO. El exceso de BM(PEO)4 es eliminado por la filtración en gel (columna HiTrap, Pharmacia) en 30 mM de citrato, pH 6 con 150 mM de búfer NaCl. Aproximadamente un exceso molar DM1 multiplicado por 10 veces, se disuelve en dimetil acetamida (DMA) y se agrega al 2H9-BMPEO intermedio. Asimismo, puede emplearse dimetil formamida (DMF) para disolver el reactivo de fracción del fármaco. Está permitido que la mezcla reaccione al PBS para eliminar el DM1 puro, durante la noche con anterioridad a la filtración en gel o diálisis. La filtración en gel en las columnas S200 en PBS se utiliza para eliminar los adicionales de alto peso molecular y para suministrar 2H9-BMPEO-DM1 purificado.

Derivados del anticuerpo Los anticuerpos de la invención pueden modificarse aún más a fin de que contengan fracciones no proteicas adicionales que son conocidas en el sector y se encuentran disponibles. En una forma de realización, las fracciones adecuadas para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de los polímeros solubles en agua incluyen los siguientes componentes: polietilenglicol (PEG), copolímero de etilenglicol / propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrán, alcohol polivinilo, polivinilpirrolidona, poli-l,3-dioxolano, poli-l,3,6-trioxano, copolímero anhídrido etileno/maleico, poliaminoácidos (ya sean homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrán o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, oxido de prolipropileno / copolímeros de oxido de etileno, polialcoholes polioxietilados (por ej. glicerol), alcohol polivinilo, y mezclas de los mismo. Es posible que el polietilenglicol propionaldehido ofrezca ventajas en la elaboración, dada su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede se ramificado o no. La cantidad de polímetros adheridos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, los polímeros pueden ser las mismas o diferentes moléculas. Generalmente, la cantidad y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización pueden determinarse en función de ciertas consideraciones, como las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el anticuerpo derivatizado será utilizado en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otra forma de realización, se proporcionan los conjugados del anticuerpo y la fracción no proteica que puede calentarse selectivamente mediante la exposición a radiación. En una forma de realización, la fracción no proteica es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 102: 11600-1 1605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye una longitud de onda que no dañe las celulaa comunes, pero que caliente las fracciones no proteicas hasta una temperatura en la cual se eliminen las células próximas a las fracciones no proteicas del anticuerpo.

Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas que comprenden el anticuerpo de la invención se preparan para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales que sean fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Editores (1980)), en forma de formulaciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones liofilizadas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en todas las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones tamponadas tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como por ejemplo, cloruro amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; alcohol bencilo, fenol o butilo benzil alcohol; alquil parabeno como el metal o propel parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); bajo peso molecular (menos de 10 residuos) polipéptidos; proteínas, como cera albúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímetros hidroilicos como la polivinilpirrolidone; aminoácidos como glicerina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes como la EDTA; azúcares como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones de formación salina como el sodio; complejos metálicos (por ej. complejos Zn-proteína); y/o tensoactivos no surfactantes como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

La formulación de la presente memoria descriptiva también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, que incluye aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Dichas moléculas están presentes en combinación en cantidades que sean eficaces para el fin que se pretende.

Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A., Editor, (1980).

Las formulaciones para administrar in vivo deben ser estériles. Esto se logra filtrando a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices están en forma de elementos moldeados, por ej. películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli-(2-hidroxietil-metacrilato), o poli-(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico ? etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido glicólico-ácido láctico como por ejemplo LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como por ejemplo el acetato de etilenvinilo y ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas por un periodo de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo menores. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el organismo por un largo periodo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición la humedad a 37 °C, resultando enana perdida de la actividad biológica y en posibles cambios en la inmunogenicidad. Es posible concebir estrategias racionales para su estabilización dependiendo del mecanismo que intervenga. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de uniones intermoleculares S-S mediante el intercambio tio-bisulfido, se puede lograr la estabilidad mediante la modificación de los residuos sulfidrilos, liofilizando soluciones ácidas, controlando la humedad, utilizando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones de matrices de polímeros especificas.

Usos Los anticuerpos de la invención se pueden usar, por ejemplo, en métodos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo. Los anticuerpos de la invención se pueden usar como antagonistas para bloquear total o parcialmente la actividad in vitro, ex vivo e in vivo del antígeno específico. Además, por lo menos alguno de los anticuerpos de la invención puede neutralizar la actividad antígena de otras especies. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención pueden usarse para inhibir la actividad de un antígeno específico, por ejemplo, en un cultivo celular que contenga el antígeno, en humanos o en otros mamíferos que tengan el antígeno con el que un anticuerpo de la invención reaccione (ej. chimpancé, babuino, tití, macaco de Java y macaco de la India, cerdo o ratón). En una forma de realización, un anticuerpo de la invención se puede usar para inhibir las actividades del antígeno mediante el contacto del anticuerpo con el antígeno de tal manera que la actividad del antígeno quede inhibida. En una forma de realización, el antígeno es una molécula proteínica humana.

En una forma de realización, un anticuerpo de la invención se puede usar en un método para inhibir un antígeno en un sujeto que sufre un trastorno en el que la actividad antígena es perjudicial, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invención de tal manera que se inhiba la actividad en el sujeto. En una forma de realización, el antígeno es una molécula proteínica humana. De manera alternativa, el sujeto puede ser un mamífero que expresa el antígeno con el que se une un anticuerpo de la invención.

Además, el sujeto puede ser un mamífero al que se le ha introducido el antígeno (ej. mediante la administración del antígeno o mediante la expresión de un trasgén antígeno). Un anticuerpo de la invención puede administrarse a un sujeto humano para fines terapéuticos. Además, un anticuerpo de la invención se puede administrar a mamíferos no humanos que expresan un antígeno con el que el anticuerpo reaccione (ej. primate, cerdo o ratón) para fines veterinarios o como modelo animal de una enfermedad humana. Sobre esto último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (ej. pruebas de dosis y periodos de administración). Los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar, inhibir, mejorar o prevenir enfermedades y trastornos asociados a la expresión anómala y/o a la actividad de poliubiquitinas y proteínas poliubiquitinadas, incluyendo entre otros, cáncer, trastornos musculares, trastornos genéticos asociados a la vía de la ubiquitina, trastornos inflamatorios/inmunitarios, trastornos neurológicos y otros trastornos asociados a la vía de la ubiquitina. Además, los anticuerpos de la invención se pueden usar para retrasar la progresión y prevenir y retrasar la recidiva de dichas enfermedades y trastornos.

En un aspecto, un anticuerpo de la invención de bloqueo es específico para una poliubiquitina que contiene un enlace concreto a Usina e inhibe la actividad normal de poliubiquitina bloqueando o interfiriendo con la interacción con dicha poliubiquitina y, de ese modo, inhibiendo la vía de señalización y otras reacciones moleculares o celulares asociadas.

En algunas formas de realización, el inmunoconjugado que comprende un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico es administrado al paciente. En algunas formas de realización, el inmunoconjugado y/o el antígeno al que va unido es internalizado por la célula, lo que ocasiona una mayor eficacia terapéutica del inmunoconjugado para inactivar la célula diana a la que se une. En una forma de realización, el agente citotóxico actúa o interfiere con el ácido nucleico en la célula diana. Como ejemplos de los citados agentes citotóxicos se encuentra cualquiera de los agentes quimioterapéuticos citados en la presente memoria descriptiva (por ejemplo un maitansinoide o una caliqueamicina), un isótopo radioactivo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o junto con otras composiciones en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede administrar conjuntamente con otro anticuerpo, y/o agentes terapéuticos/adyuvantes (por ej. esteroides). Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede combinar con antiinflamatorios y/o antisépticos en un esquema de tratamiento, por ej. al tratar cualquiera de las enfermedades descritas en esta memoria, incluyendo cáncer, trastornos musculares, trastornos genéticos asociados a la vía de la ubiquitina, trastornos inflamatorios/inmunitarios, trastornos neurológico y otros trastornos asociados a la vía de la ubiquitina. Las terapias combinadas descritas anteriormente incluyen administración combinada (en la que los dos o más agentes se incluyen en la misma o en formulaciones separadas), y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede ocurrir con anterioridad, y/o después, la administración de la terapia o terapias asociadas.

Un anticuerpo de la invención (y agente terapéutico asociado) puede administrarse por cualquier medio apto, incluyendo las vías parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, la vía intralesional. Las infusiones parentales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal y subcutánea. Además, el anticuerpo se administra correctamente mediante infusión de efecto rápido con dosis del anticuerpo cada vez menores. La dosificación puede realizarse mediante cualquier vía adecuada, por ej. mediante inyecciones vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

La localización de la diana de unión de un anticuerpo de la invención puede considerarse para la preparación y para la administración del anticuerpo. Cuando la diana de unión es una molécula intracelular, algunas formas de realización de la invención proporcionan al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se introduzca en la célula donde se localiza la diana de unión. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención puede expresarse intracelularmente como un intracuerpo. El término 'intracuerpo', del modo utilizado en la presente memoria descriptiva, se refiere a un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se expresa intracelularmente y que es capaz de unirse selectivamente a una molécula diana, tal y como se describe en Marasco Gene Therapy, 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); Patentes de EE.UU. núms. 6.004.940 y 6.329.173; U.S. Application Publication No. 2003/0104402, y PCT Publication No. WO2003/077945. La expresión intracelular de un intracuerpo surte efecto introduciendo un ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado o la porción de unión al antígeno del mismo (que carece de secuencia líder de tipo natural y señales secretoras normalmente asociadas con el gen que codifica ese anticuerpo o fragmento de unión al antígeno) en una célula diana. Se pueden utilizar todos los procedimientos estándar de introducción de ácidos nucleicos en una célula, incluidos, entre otros, la microinyección, la inyección balística, la electroporación, la precipitación con fosfato cálcico, liposomas y transfección con vectores retrovirales, adenovirales, adenoviral asociado y vectores para vacunas con el ácido nucleico de interés. Uno o más ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un anticuerpo antipoliubiquitina de la invención, se pueden administrar a una célula diana, de tal modo que uno o más intracuerpos son expresados, los cuales son capaces de unirse intracelularmente a una poliubiquitina y modularse de una o más vías celulares mediadas por las poliubiquitina.

En otra realización, se proporcionan anticuerpos interiorizantes. Los anticuerpos pueden poseer ciertas características que aumentan la administración de anticuerpos a las células o que pueden modificarse para poseer dichas características. Las técnicas para lograr esto son conocidas en el sector. Por ejemplo, la cationización de un anticuerpo, que sirve para facilitar su absorción en las células (véase, por ej. Patente de EE.UU. n°. 6.703.019). Las lipofecciones o liposomas se pueden utilizar también para que el anticuerpo actúe en las células. Allí donde se utilizan los fragmentos del anticuerpo, el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana es, por lo general, ventajoso. Por ejemplo, tomando como referencia las secuencias de la región variable de un anticuerpo, las moléculas péptido pueden diseñarse para retener la capacidad de unión de la secuencia de la proteína diana. Estos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante la tecnología de ADN recombinante. Véase, por ej. Marasco y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).

La entrada de polipéptidos moduladores en las células diana puede aumentarse mediante métodos conocidos en el sector. Por ejemplo, ciertas secuencias, como aquellas derivadas del Tat IVH, o la proteína Antennapedia homeodomain son capaces de absorber directa y eficientemente las proteínas heterólogas a través de las membranas celulares. Véase, por ej. Chen y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329 Cuando la diana de unión se localiza en el cerebro, algunas formas de realización de la invención proporcionan al anticuerpo o fragmento de unión al antigeno que atraviese la barrera hematoencefálica. Algunas enfermedades neurodegenerativas se asocian con el aumento de permeabilidad de la barrera hematoencefálica, de tal forma que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno puede introducirse al cerebro fácilmente. Para los casos en los que la barrera de hematoencefálica permanece intacta, existen varios enfoques en el sector para el transporte de moléculas a través de la misma, entre otros, métodos físicos y métodos basados en lípidos y métodos de receptor y de canal. Los métodos físicos de transporte del anticuerpo o fragmento de unión de antígeno a través de la barrera hematoencefálica incluyen, entre otros, la circunvalación completa de la barrera hematoencefálica o la creación de aperturas en la misma. Los métodos de circunvalación incluyen, entre otros, la inyección directa en el cerebro (véase, por ej. Papanastassiou y col. Gene Therapy 9: 398-406 (2002)), entrega aumentada de infusión y convención intersticial (véase, por ej. Bobo y col. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 2076-2080 (1994)), e implantación de un dispositivo de administración en el cerebro (véase por ej. Gilí y col. Nature Med. 9: 589-595 (2003); and Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Los métodos de creación de aperturas en la barrera incluyen, ente otros, ultrasonidos (véase por ej. Patente de EE.UU. n° 2002/0038086), presión osmótica (por ej. mediante administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A., Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)), permeabilización, por ej. bradicinina o permeabilizador A-7 (véase ej. U.S. Nos. 5.1 12.596, 5.268.164, 5.506.206 y 5.686.416), transfección de neuronas a ambos lados de la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican el anticuerpo o fragmento de unión del antígeno (véase, por ej. Patente de EE.UU. n° 2003/0083299). Los métodos de transporte del anticuerpo o fragmento de unión del antígeno a través de la barrera hemoencefálica basados en lípidos incluyen, entre otros, el encapsulamiento del anticuerpo o fragmento de unión del antígeno en liposomas que se emparejan a los fragmentos de unión del anticuerpo para unirse a los receptores en el endotelio vascular de dicha barrera (véase por ej. Publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos n° 20020025313), y el recubrimiento del anticuerpo o fragmento de unión del antígeno en partículas lipoproteínicas de baja densidad (véase por ej. Publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos n° 20040204354) o apolipoproteína E (véase por ej. Publicación de solicitud de Patente de EE.UU. n° 20040131692). Los métodos de transporte del anticuerpo o fragmento de unión del antígeno a través de la barrera hemoencefálica de receptor y de canal incluyen, entre otros, el uso de bloqueadores glucocorticoides para aumentar la permeabilidad de dicha barrera (véase por ej. Publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos núms. 2002/0065259, 2003/0162695, y 2005/0124533); canales activantes de potasio (véase, por ej. Publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos n° 2005/0089473), transportadores de fármaco inhibidor ABC (véase por ej. Publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos n° 2003/0073713); anticuerpos recubridores con una actividad de transferrina y modulante de uno o más receptores de transferrina (véase, por ej. Publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos n° 2003/0129186), y cationización de los anticuerpos (véase, por ej. Patente de EE.UU. n°. 5.004.697). La composición de anticuerpos de la invención debería formularse, dosificarse y administrarse de una manera consistente empleando una práctica médica adecuada. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno concreto tratado, el mamífero concreto tratado, la enfermedad del paciente en particular, la causa del trastorno, la localización de la administración del agente, el método de administración, la regulación de la administración y otros factores conocidos por los facultativos. El anticuerpo puede formularse opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención, el tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores ya abordados con anterioridad. Estos son generalmente usados en las mismas dosis y con las mismas vías de administración descritas en la presente memoria descriptiva o aproximadamente entre 1 y 99% de las dosis descritas en la misma, o en cualquier dosis y mediante cualquier vía empírica y clínicamente considerada apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo de la invención (cuando se utiliza aislado o en combinación con otros agentes como los quimioterapéuticos) dependerá del tipo de enfermedad que se tratará, el tipo de anticuerpo, la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo y la discreción del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis incicial candidata para la administración en un paciente es de aproximadamente de 1 g/kg a 15 mg/kg (por ej. 0,lmg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosis diaria normal puede oscilar entre aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantendría, por lo general, hasta que ocurriese una supresión deseada de los síntomas de la misma. Un ejemplo de dosis del anticuerpo se encontraría en el intervalo de aproximadamente de 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, se puede administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de manera intermitente, por ej. una vez por semana o cada tres semanas (por ej. de modo que el paciente reciba desde aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ej. aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una mayor carga de dosis inicial seguida de una o más dosis menores. Un ejemplo de tratamiento de dosificación comprende la administración de una dosis de una carga aproximada de 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. No obstante, otros regímenes de dosificación también pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Artículos fabricados In another aspect of the invention, an article of manufacture containing materials useful for the treatment, prevention and/or diagnosis of the disorders described above is provided. The article of manufacture comprises a container and a label or package insert on or associated with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, etc. The containers may be formed from a variety of materials such as glass or plástic. The container holds a composition which is by itself or when combined with another composition effective for treating, preventing and/or diagnosing the condition and may have a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle). At least one active agent in the composition is an antibody of the invention. The label or package insert indicates that the composition is used for treating the condition of choice. Moreover, the article of manufacture may comprise (a) a first container with a composition contained therein, wherein the composition comprises an antibody of the invention; and (b) a second container with a composition contained therein, wherein the composition comprises a further cytotoxic or otherwise therapeutic agent. The article of manufacture in this embodiment of the invention may further comprise a package insert indicating that the compositions can be used to treat a particular condition. Alternatively, or additionally, the article of manufacture may further comprise a second (or third) container comprising a pharmaceutically-acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate-buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. It may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.

The following are examples of the methods and compositions of the invention. It is understood that various other embodiments may be practiced, given the general description provided above.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA PRIMERA GENERACIÓN DE ANTICUERPOS ANTIPOLIUBIQUITINA A) Separación de librería Los fagos de librerías de anticuerpos simples fueron sometidos a unión contra péptidos sintéticos inmovilizados que incluyen un enlace isopéptido que imita bien a la poliubiquitina enlazada a K48, o bien a la poliubiquitina enlazada a K63. No se observó ningún enrequecimiento tras seis series de selección. Los péptidos sintéticos fueron alargados y se volvieron a monitorizar las librerías de anticuerpos simples. Una vez más, no se observó ningún enrequecimiento tras seis series de selección. Se sometió a los fagos de la librería de anticuerpos simples YS-B a cuatro series de unión contra cadenas de poliubiquitina las cuales presentan diferentes enlaces de isopéptido de ubiquitina. La librería de anticuerpo YS-B contiene aminoácidos aleatorios en las tres cadenas pesadas CD y cadenas ligeras CDR3 (véase patente de EE.UU. N° 2005-0106667) y se basa en el anticuerpo humanizado 4D5. Las cadenas de poliubiquitina enlazadas a K63 o K48 de longitud completa sintetizadas enzimáticamente de 3 a 7 unidades de longitud (Boston Biochem) fueron inmovilizadas en 96 pocilios Maxisorp (NUNC). Las placas estuvieron recubiertas durante la noche con 5 µg/ml de poliubiquitina enlazada a K48 o K63 en tampón carbonato 50mM, pH 9,6. Las placas recubiertas se lavaron con fosfato tamponado salino (PBS) y se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) o caseína, a una concentración de 0,2% en PBS. Posteriormente, las placas se lavaron con PBS que contenía 0,05% Tween 20 (PBST) a 25°C. Se encubó cada pocilio con 100 µ? de 1012 fago/ml en solución tamponada (BSA o caseína, 0,2% en PBST) durante 2 horas a temperatura ambiente. Cada pocilio se lavó en ocho ocasiones para retirar los fagos no unidos. Se eluyeron los fagos por incubación con 0,1 M HCl durante 10 minutos, y el eluyente fue neutralizado con 2 M Tris base. Los fagos eluídos fueron propagados en Escherichia coli XLl-blue (Stratagene) con la adición del fago auxiliar M13-K07 (New England Biolabs). Los fagos amplificados fueron usados para series adicionales de selección contra la misma diana que se empleó en la serie anterior. Para las series de selección dos a cuatro, se incluyeron 10 µg/ml de ubiquitina en la solución tamponada a modo de contraselección. Las series tres y cuatro se también se separaron con y sin contraselección adicional: o 10 µg/nll de poliubiquitina enlazada a K63 en la selección de poliubiquitina enlazada a K48 o 10 µg/ml de poliubiquitina enlazada a K48 en la selección de poliubiquitina K63. Para aquellos clones donde las series de selección dos a cuatro no disponían de contraselección de poliubiquitina, los clones individuales habían crecido en un formato de 96 pocilios en 400 µ? de 2YT caldo suplementado con carbenicilina y M13-K07 fago auxiliar. Se utilizaron los sobrenadantes de estos cultivos en fagos de alto rendimiento de ELISA para monitorizar clones para la unión a poliubiquitina enlazada a K48, poliubiquitina enlazada a K63, unibiquitina y BSA. Todos los clones fueron sometidos a análisis secuencial de ADN. Una parte de la cadena pesada que incluye el HVR fue secuenciada, de modo que permitió el análisis de las regiones hipervariables de la cadena pesada. Las regiones hipervariables de cadena pesada para los clones que reconocen la poliubiquitina enlazada a K48, o ambas, tanto la poliubiquitina enlazada a K63 como a K48 se muestran en las figuras 2A-C. Las regiones hipervariables de cadena pesada para clones que reconocen la poliubiquitina enlazada a K63, o ambas, tanto la poliubiquitina enlazada a K48 como a K63 se muestran en las figuras 3A y 3B. No se secuenció la cadena ligera HVR para cada clon, pero en base a la naturaleza de la librería YS-B, se esperaba que las secuencias de HVR-Ll y HVR-L2 se mantuviesen invariables, mientras que la secuencia HVR-L3 se esperaba que fuese específica para cada clon. La secuencia HVR-Ll es RASQSVSSAVA (identificador de secuencia n°: 79) y la secuencia de la HVR-L2 es SASSLYS (identificador de secuencia n°: 80), de acuerdo con el diseño de la librería. Todos los clones presentaron las mismas secuencias de estructuras de cadena pesada y de cadena ligera (véase la Figura 6). Un grupo diferente de clones incluyó contraselección con 10 µg/ml de poliubiquitina de un enlace de Usina diferente (bien poliubiquitina enlazada a K48 o bien a K63) en las series de selección dos a cuatro. Se emplearon diez µ? del fago eluído de la cuarta serie de selección para infectar al crecimiento de E. coli CJ236 durante 20 minutos, que se cultivaron durante la noche en agar sólido que contenía carbenicilina. Quince mililtros de 2YT caldo suplementado con carbenicilina y cloranfenicol se añadieron a la placa para resuspender el fagémido que contenía células CJ236. Se añadió el fago auxiliary M13-K07. Tras la incubación durante una hora a 37 °C con agitación, se añadieron 2,5 mi de la suspensión a 250 mi de 2YT caldo suplementado con carbenicilina y kanamicina. Se dejó crecer la suspensión durante la noche.

Los fagos fueron recogidos por precipitación con polietilenglicol, y el ADN Kunkel fue aislado utilizando un kit rotatorio MI 3 (Qiagen). Se utilizó un molde de un microgramo Kunkel para la mutagénesis de Kunkel (ver Kunkel, Proc. Nati. Sci. USA 82:488 (1985)) con el oligonucleótido F1560 -2 (TCTTGTGACAAAACTCACCATCACCATCACCATCACTA GGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTT) (identificador de secuencia n°: 150). La reacción de la mutagénesis se transformó en E. coli XLl-blue y se cultivó durante la noche en agar sólido que contenía carbenicilina. Los clones individuales fueron recogidos y cultivados tal como se explicó anteriormente y detectados contra poliubiquitina enlazada a K63 y K48, monoubiquitina, BSA y anticuerpo antipentaHis (Qiagen) en un fago ELISA como se describió anteriormente. Se sometió a análisis secuencial de ADN a los clones identificados como específicos para poliubiquitina enlazada a K48 o K63. Las secuencias de aminoácido de las regiones hipervariables HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 se muestran en las figuras 8A-C (específicas para poliubiquitina enlazada a K48) y 9A y 9B (específico para poliubiquitina enlazada a K63). No se secuenció la cadena ligera HVR para cada clon, pero en base a la naturaleza de la librería YS-B, se esperaba que las secuencias de HVR-L1 y HVR-L2 se mantuviesen invariables, mientras que la secuencia HVR-L3 se esperaba que fuese específica para cada clon. La secuencia HVR-L1 es RASQSVSSAVA (identificador de secuencia n°: 79) y la secuencia de la HVR-L2 es SASSLYS (identificador de secuencia n°: 80), de acuerdo con el diseño de la librería. Todos los clones presentaron las mismas secuencias de estructuras de cadena pesada y de cadena ligera (véase la Figura 6).

(B) Producción de Fab Para la producción de Fab, los fagos de sobrenadante de clones únicos positivos para la marca de pentahistidina fueron usados para infectar el E. coli FF34B8, una línea celular en la que el episoma F' fue añadido al 34B8 uniendo al XL1 y cultivando en medio sólido selectivo. Las células infectadas se depositaron sobre agar sólido que contenía carbenicilina y cultivadas durante la noche. Las colonias singulares de FF34B8 que contenían fagémido se recogieron de las placas y crecieron durante la noche a 37 °C en LB que contenía carbenicilina. Esos cultivos se emplearon después para inocular 500 mi de medio CRAP (3,57 g (NH4)2S04, 0,71 g citrato de sodio - 2H20, 1.07 g KC1, 5,36 g extrato de levadura (certificado), 5,36 g hicasa SF (Sheffield), pH ajustado a 7,3 por adición de KOH y volumen ajustado a 872 mi con agua ultrapura, autoclavada, enfriada a 55°C, a la que se le añadió (por 1) 1 10 mi 1 M MOPS pH 7,3, 1 1 mi 50% de glucosa y 7ml 1 M MgS04 ) que contiene carbenicilina y cultivó durante 24 horas a 30 °C con agitación. Las células fueron recogidas por centrifugación y los pellets de célula fueron almacenados a -20 °C. Los Fabs se purificaron resuspendiendo cada célula en 35 mi de solución tamponada de lavado fría (PBS + 150 mM NaCl) que contenía 0,2 mg/ml de lisozima y and 0,3 U/ml de ADNasa I. Se transfirieron los pellets de célula a tubos de centrifugado de 50 mi y centrifugaron rápidamente a 25 °C durante 45 minutos. Los pellets se centrifugaron y el lisado fue cargado en columnas de 1 mi de proteína G-sefarosa reequilibradas con solución tamponada de lavado a 4 °C. Las columnas se lavaron con 50 mi de solución tamponada fría, eluída con 3 mi 0,1 M de ácido acético y neutralizadas con 150 µ? de 2 M Tris base. Se les realizó un cambio de tampón a los Fab eluídos en PBS y se concentraron usando Centriprep de 10 filtros centrífugos (Millipore). Las concentraciones de Fab resultantes se determinaron espectrofotométricamente (1 OD2 onm = l,55mg/ml). Los Fabs concentrados se almacenaron a 4 °C. Cada Fab fue incluido en un análisis de proteína ELISA, como descrito anteriormente, para determinar su afinidad relativa a poliubiquitina enlazada a K48 y a K64, y para confirmar que el Fab no era un reactivo con monoubiquitina o BSA. Los Fab apu01-15 presentaron mayor afinidad a la poliubiquitina enlazada a K48 que a la poliubiquitina enlazada a K63. Los Fab apul7-apu24 demostraron mayor especificidad a la poliubiquitina enlazada a K63 que a la poliubiquitina enlazada a K48 en ELISA. Apu 16 no fue producido como un Fab. Todos los Fab fueron sometidos a análisis secuencial de ADN. Las secuencias de aminoácidos de regiones hipervariables HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3 y HVR-L3 para cada Fab que se unieron a la poliubiquitina enlazada a K48 se muestran en las figuras 10A-C. Las secuencias de aminoácidos de regiones hipervariables HVR-Hl, HVR-H2, HVR-H3 y HVR-L3 para cada Fab que se unió específicamente a la poliubiquitina enlazada a K63 se muestran en las figuras 1 1A-C. Las secuencias estructurales de cadena ligera y pesada para cada Fab aparecen en la Figura 6. Las dos primeras regiones hipervariables de cadena ligera, HVR-L1 y HVR-L2, fueron idénticas para cada clon, de acuerdo con el diseño de la librería (ver identificadores de secuencia N°: 79 y 80, anteriormente). (C) Análisis de Afinidad de Fab aislados Las afinidades de Fab seleccionados (ver sección (B), anteriormente) para ubiquitina y sus formas ligadas a la lisina fueron determinadas por resonancia plasmón de superficie usando un sistema BIACORE 3000 (Biacore). Aproximadamente 100 unidades de resonancia de ubiquitina, diubiquitina enlazada a K48 o K63, o poliubiquitina enlazada a K48 o K63 (longitudes de cadena 3 a 7) fueron inmovilizadas en diferentes flujos celulares de chips CM5 usando el protocolo de acoplamiento amino provisto por el fabricante. En cada experimento, el flujo celular 1 fue activado y bloqueado con etanolamina sin inmovilizar la proteína, para ser usado para sustracción de referencia. Se inyectaron diluciones seriales de proteínas de Fab (1,6-100 nM) de cada, de apuOl a apu24 (50 µ? total a un caudal de 25 µ?/minuto) en cada flujo celular. Se registró la señal para cada flujo celular y se sustrajo la señal de referencia. Después de un periodo de disociación (5 minutos), la superficie del chip se generó con 13 µ? de 20 mM HC1. Se muestran ejemplos de curvas de unión para los Fabs apu09 y apul 8 en las Figuras 12 y 13. El apu09 se une a la poliubiquitina enlazada a K48, pero no a la poliubiquitina enlazada a K63, como se muestra en la Figura 12. La Figura 13A muestra las curvas de unión apul8 a la poliubiquitina enlazada a K48. Mientras se observan algunas uniones, es sustancialmente menos de la unión observada a la poliubiquitina enlazada a K63 (Figura 13B). Se llevaron a cabo análisis similares para cada Fab. Las constantes cinéticas y las constantes de unión fueron calculadas de forma simultánea mediante análisis de regresión no lineal, con el uso del software proporcionado por el fabricante y se muestran en la Tabla B. "NB" en la Tabla B indica que no se detectó unión alguna para la interacción indicada, "nd" en la Tabla B indica que los datos no se midieron para la interacción indicada. Los resultados muestran que las constantes cinéticas de un Fab particular para la unión a la diubiquitina son muy similares a los de la unión a la poliubiquitina. Así, los Fabs aparecen para reconocer un enlace isopéptido particular entre dos grupos de ubiquitina.

TABLA B: Las constantes cinéticas de Fabs antipoliubiquitina como se Midieron mediante el Análisis de BI ACORE®.

(D) Western Blot La tetraubiquitina (enlazada a K48 o a 63, según sea apropiado) y la diubiquitina (bien enlazada a K48, bien enlazada a K63) (Boston Biochem) fueron separadas en geles de poliacrilamida y transferidas por electroblotting a membranas nitrocelulosas. Los sitios de unión no específicos en las membranas fueron bloqueados incubando las membranas durante la noche a 4 °C en el reactivo de bloqueo Qiagen al 0,5% (Qiagen). Las membranas bloqueadas se colocaron en un aparato miniblotter. Los clones Fabs (1 µ¾/p?1) se aplicaron a secciones seriales de la membrana en reactivo de bloqueo Qiagen al 0,5% (Qiagen). Después de una hora de periodo de incubación, se lavaron las membranas. Se revelaron los anticuerpos antiubiquitina unidos a la membrana utilizando el anticuerpo antipentahistidina con HRP conjugado (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los Fabs específicos de poliubiquitina enlazada a K48 producidos de los clones apuOl a apul 5 se unieron a la tetraubiquitina enlazada a K48 inmovilizada a nitrocelulosa (véase la Figura 19B). No se observó unión alguna entre los Fabs específicos de la poliubiquitina enlazada a K63 producidos de lo clones apul 7 a apu24 y la poliubiquitina enlazada a K63 inmovilizada en membranas de nitrocelulosa (véase la Figura 19A).

EJEMPLO 2 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI POLIUBIQUITINA DE SEGUNDA GENERACIÓN Las librerías de segunda generación para la representación de Fab se construyeron a partir de fagémidos que codifican los clones apu05 (poliubiquitina selectiva enlazada a K48) y apul 8 (poliubiquitina selectiva enlazada a K63) anteriormente codificados (véase las Figuras 10 y 1 1). Los fagos provenientes de estos clones se utilizaron para infectar las células CJ236 y para preparar los moldes de ADN de Kunkel. Luego, estos moldes se mutagenizaron para insertar codones de terminación y, los moldes que contienen los codones de terminación, se utilizaron para construir una librería de la siguiente manera: El Fab del apu05 se mutagenizó de acuerdo a dos esquemas diferentes para crear dos librerías diferentes derivadas del apu05. En la primera librería, sólo se mutagenizó la secuencia de la HVR-H3. La secuencia de la HVR-H3 primero se modificó para que incluyera un codón de terminación del molde de Kunkel, seguido por una mutagénesis que utiliza cuatro oligonucleótidos mutagénicos. En todos los casos, el oligonucleóotido de codificación del codón de terminación fue CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 365). Los tres primeros oligonucleótidos mutagénicos fueron tres permutaciones de la misma secuencia deseada, en las que se fijó un residuo de tirosina y cada residuo de tirosina restante se aleatorizó mediante el conjunto de codones mixto N S (donde N corresponde a G, C, A o T y S corresponde a G o C); el aminoácido en la posición 100b se seleccionó a partir de la fenilalanina, metionina, leucina e isoleucina; el aminoácido en la posición 100a se seleccionó a partir de la glicina y alanina; y el resto de los aminoácidos se aleatorizaron de manera flexible. En este contexto, la aleatorización flexible indica que algunas posiciones de nucleótidos estuvieron ocupadas el 70% del tiempo por la base indicada y el 10% del tiempo estuvieron ocupadas por una de las otras tres bases. Para los siguientes nucleótidos, donde dicha aleatorización flexible se incluyó en una base específica, la presencia de la aleatorización flexible se indica mediante la presencia de un número en la posición de esa base. El número "5" indica que la base adenina está presente 70% del tiempo en esa posición, mientras que las bases guanina, citosina y timina están, cada una de ellas, presentes 10% del tiempo. Del mismo modo, el número "6" se refiere a la guanina, el "7" a la citosina y el "8" a la timina donde, en cada uno de los casos, cada una de las otras tres bases está presente únicamente el 10% del tiempo. Las tres primeras secuencias de oligonucleótidos mutagénicos fueron: CGTCTATTATTGTGCTCGC567TAC567N SNNS567GSTWTSGACTA CTGGGGTCAAGG (identificador de secuencia N°: 367), CGTCTATTATTGTGCTCGC567NNS567TACN S567 GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 368) y CGTCTATTATTGTGCTCGC567 N S567NNSTAC567GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 369). El cuarto oligonucleótido mutagénico incluyó la aleatorización de las tirosinas en las posiciones 96, 98 y 99 mediante el conjunto de codones mixto NNS; la selección del aminoácido en la posición 100b a partir de la fenilalanina, metionina, leucina e isoleucina; la selección del aminoácido en la posición 100a a partir de la glicina y la alanina y la aleatorización flexible en todas las demás posiciones, conforme a la nomenclatura de aleatorización flexible descrita anteriormente. La secuencia del cuarto oligonucleótido fue CGTCTATTATTGTGCTCGC567NNS567N SN S567GSTWTSGACTACTGGG GTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 370). En la segunda librería del apu05, se mutagenizaron las secuencias la HVR-H1 , HVR-H2, HVR-H3 y HVR-L3. La secuencia de la HVR-H 1 se modificó de manera tal que las serinas en las posiciones 30 y 33 se aleatorizaron mediante el conjunto de codones mixto NNS (donde N corresponde a G, C, A o T y S corresponde a G o C); el aminoácido en la posición 29 se seleccionó a partir de los aminoácidos fenilalanina, leucina, isoleucina y valina; y el aminoácido en la posición 34 se seleccionó a partir de la isoleucina y la metionina. Los oligonucleótidos que se utilizaron para mutagenizar la secuencia de la HVR-H1 del apu05 fueron GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (identifícador de la secuencia N°: 371) y GCAGCTTCTGGCTTCAACNTCN STACTCTNNSATSCACTGGGTGC GTCAGG (identifícador de la secuencia N°: 372). La secuencia de la HVR-H2 se modificó de manera tal que la tirosina en la posición 52 se aleatorizó mediante el conjunto de codones mixto NNS y el aminoácido en la posición 52a se seleccionó a partir de la prolina y la serina. Los oligonucleótidos que se utilizaron para mutagenizar la secuencia de la HVR-H2 fueron GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (identifícador de la secuencia N°: 373) y GGCCTGGAATGGGTTGCATCTATCNNSYCTTACTACTCTTACACCTCTTAT GCCGATAGCGTCAAGG (identifícador de la secuencia N°: 374). La secuencia HVR-H3 se modificó de manera tal que la tirosina en la posición 99 y la serina en la posición 100 se aleatorizaron mediante el conjunto de codones mixto NNS; el aminoácido en la posición 100a se seleccionó a partir de la glicina y la alanina; y el aminoácido en la posición 100b se seleccionó a partir de la fenilalanina, metionina, leucina e isoleucina. Los oligonucleótidos que se utilizaron para mutagenizar la secuencia de la HVR-H3 fueron CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (identifícador de la secuencia N°: 365) y CGTCTATTATTGTGCTCGCTCTTACTCTTACNNSNNSGSTWTSGACTACTGG GGTCA AGG (Identifícador de la secuencia N°: 375). La secuencia de la HVR-L3 se modificó de manera tal que la posición S91 se aleatorizó de acuerdo al conjunto de codones mixto N S y la posición 196 se seleccionó a partir de la fenilalanina, isoleucina y valina. Los oligonucleótidos que se utilizaron para mutagenizar la secuencia de la HVR-L3 fueron CGCAACTTATTACTGTCAGCAATAATAAACGTTCGGACAGGGTACC (identificador de la secuencia N°: 376) y CGCAACTTATTACTGTCAGCAAN STCTTACTCTTCTCTGDTTACGTTCGG ACAGGGTACC (identificador de la secuencia N°: 378). Se construyeron seis librerías diferentes derivadas del apu l 8 mediante seis esquemas de mutagénesis diferentes del apu 18. En la primera librería, sólo se mutagenizó la secuencia de la HVR-H3. La secuencia de la HVR-H3 primero se modificó para que incluyera un codón de terminación del molde de unkel, seguido de una metodología de mutagénesis que utiliza siete oligonucleótidos mutagénicos. En todos los casos, el oligonucleótido de codificación del codón de terminación fue CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 369). Los seis primeros oligonucleótidos mutagénicos eran tres permutaciones de la misma secuencia deseada, en los que se fijaron dos residuos de tirosina o triptófano y cada residuo de tirosina y triptófano restante se aleatorizó mediante el conjunto de codones mixto NNS (donde N corresponde a G, C, A o T y S corresponde a G o C); el aminoácido en la posición 100c se seleccionó a partir de la fenilalanina, metionina, leucina e isoleucina; el aminoácido en la posición 100b se seleccionó a partir de la glicina y alanina; y el resto de los aminoácidos se aleatorizaron de manera flexible, conforme a la nomenclatura de aleatorización descrita anteriormente. Las seis primeras secuencias de oligonucleótidos mutagénicos fueron: CGTCTATTATTGTGCTCGC655TACTAC565NNSNNS577GSTWTSGACTACTG GGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 379), CGTCTATTATTGTGCTCGC655N SN S565TGGTAC577GSTWTSGACTACTG GGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 380), CGTCTATTATTGTGCTCGC655TACBBS565NNSTAC577GSTWTSGACTACTG GGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 381 ), CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSTAC565TGGNNS577GSTWTSGACTACTG GGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 382), CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSTAC565TGGNNS577GSTWTSGACTACTG GGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 383) y CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSTAC565NNSTAC577GSTWTSGACTACTG GGGTCAAGG (identificador de la secuencia: 384). El séptimo oligonucleótido mutagénico incluyó la aleatorización de las tirosinas en las posiciones 96, 97 y 100 y el triptófano en la posición 99 mediante el conjunto de codones mixto N S; la selección del aminoácido en la posición 100b a partir de la fenilalanina, metionina, leucina e isoleucina; la selección del aminoácido en la posición 100c a partir de la fenilalanina, metionina, leucina e isoleucina; la selección del aminoácido en la posición 100b a partir de la glicina y la alanina, y la aleatorización flexible en todas las demás posiciones, conforme a la nomenclatura de aleatorización flexible descrita anteriormente. La secuencia del séptimo oligonucleótido fue la siguiente: CGTCTATTATTGTGCTCGC655N SN S565NNSN S577GSTWTSGACTACTG GGGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 385). En la segunda librería del apul 8, sólo se mutagenizó la secuencia de la HVR-H2. La secuencia de la HVR-H2 primero se modificó para que incluyera un codón de terminación del molde de unkel, seguido de una metodología de mutagénesis que utiliza cuatro oligonucleótidos mutagénicos. En todos los casos, el oligonucleótido de codificación del codón de terminación fue GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 373). Los tres primeros oligonucleótidos mutagénicos fueron tres permutaciones de la misma secuencia deseada, en las que se fijó un residuo de tirosina y cada tirosina restante y la serina en la posición 52 se aleatorizaron mediante el conjunto de codones mixto NNS (donde N corresponde a G, C, A o T y S corresponde a G o C); el aminoácido en la posición 52a se seleccionó a partir de la prolina y la serina; el aminoácido en la posición 55 se seleccionó a partir de la glicina y la serina; se fijó a la isoleucina en la posición 51 y a la treonina en la posición 57; y el resto de aminoácidos se aleatorizaron de manera flexible conforme a la nomenclatura de aleatorización flexible descrita anteriormente. Las tres primeras secuencias de oligonucleótidos mutagénicos fueron: GGCCTGGAATGGGTTGCATACATCN SYCTNNSNNSRGC567ACC567TATG CCGATAGCGTCAAGG (identifícador de la secuencia N°: 386), GGCCTGGAATGGGTTGCANNS ATCNNS YCTTACNNSRGC567ACC567TATG CCGATAGCGTCAAGG (identifícador de la secuencia N°: 387) y GGCCTGGAATGGGTTGCAN SATCNNSYCTNNSTACRGC567ACC567TATG CCGATAGCGTCAAGG (identifícador de la secuencia N°: 388). El cuarto oligonucleótido mutagénico incluyó la aleatorización de las tirosinas en las posiciones 50, 53 y 54 mediante el conjunto de codones mixto NNS; la selección del aminoácido en la posición 52a a partir de fenilalanina y la serina; la selección del aminoácido en la posición 55 a partir de la glicina y la serina; la fijación de los residuos de isoleucina y treonina en las posiciones 51 y 57, respectivamente; y la aleatorización flexible en todas las demás posiciones conforme a la nomenclatura de aleatorización flexible descrita anteriormente. La secuencia del cuarto oligonucleótido fue la siguiente: GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATCNNSYCTNNSNNSRGC567ACC567TATG CCGATAGCGTCAAGG (identificador de la secuencia N°: 389). En la tercera librería del apul 8, se mutagenizaron las secuencias de la HVR-H2 y HVR-H3. La secuencia de la HVR-H2 se modificó de manera idéntica a como se modificó la secuencia de la HVR-H2 de la segunda librería del apul 8, utilizando los mismos cuatro oligonucleótidos mutagénicos. La secuencia de la HVR-H3 se modificó de manera idéntica a como se modificó la secuencia de la HVR-H3 en la primera librería del apul 8, utilizando los mismos seis primeros oligonucleótidos mutagénicos. En la cuarta librería del apul 8, se mutagenizaron las secuencias de la HVR-H3 y HVR-L3. La secuencia de la HVR-H3 se modificó de manera idéntica a como se modificó la secuencia de la HVR-H3 en la primera librería del apul 8, utilizando los mismos seis primeros oligonucleótidos mutagénicos. La secuencia de la HVR-L3 primero se modificó para que incluyera un codón de terminación del molde de Kunkel, seguido de una mutagénesis que utiliza un oligonucleótido mutagénico. Dentro de la secuencia de la HVR-L3, se aleatorizaron las tirosinas en las posiciones 91 y 94 y la serina en la posición 95a mediante el conjunto de codones mixto NNS; la leucina en la posición 95b se seleccionó a partir de la fenilalanina, isoleucina y valina; y las serinas en las posiciones 92, 93 y 95 se aleatorizaron en forma flexible conforme a la nomenclatura de aleatorización flexible descrita anteriormente. Los oligonucleótidos que se utilizaron para la mutagénesis de la secuencia de la HVR-L3 fueron CGCAACTTATTACTGTCAGCAATAATAAACGTTCGGACAGGGTACC (identificador de la secuencia N°: 376) y CGCAACTTATTACTGTCAGCAANNS567567N S567N SCTGDTTACGTTCG GACAGGGTACC (identificador de la secuencia N°: 390).

En la quinta librería del apu l 8, se mutagenizaron las secuencias de la HVR-Hl y HVR-H2. La secuencia de la HVR-H2 se modificó de manera idéntica a como se modificó la secuencia de la HVR-H2 de la segunda librería del apul 8, utilizando los mismos cuatro oligonucleótidos mutagénicos. La secuencia de la HVR-H1 se modificó para que incluyera un codón de terminación; la serina en la posición 30 y la tirosina en la posición 33 se aleatorizaron mediante el conjunto de codones mixto NNS; el aminoácido en la posición 29 se seleccionó a partir de la fenilalanina, leucina, isoleucina y valina; el aminoácido en la posición 34 se seleccionó a partir de la isoleucina y la metionina, y los aminoácidos en las posiciones 31 y 32 se aleatorizaron de manera flexible conforme con la nomenclatura de aleatorización descrita anteriormente. Los oligonucleótidos que se utilizaron para la mutagénesis de la secuencia de la HVR-H1 fueron: GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (Identificador de la secuencia N°: 371) y GCAGCTTCTGGCTTCAACNTCNNS567567NNSATSCACTGGGTGCGTCAGG (identificador de la secuencia N°: 391). En la sexta librería del apul 8, se mutagenizaron las secuencias de la HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-L3. La secuencia de la HVR-H 1 se modificó de manera idéntica a como se modificó la secuencia de la HVR-H1 de la quinta librería del apul 8, utilizando el mismo oligonucleótido mutagénico. La secuencia de la HVR-H2 se modificó de manera idéntica a como se modificó la secuencia de la HVR-H2 de la segunda librería del apul 8, utilizando los mismos cuatro oligonucleótidos mutagénicos. La secuencia de la HVR-L3 se modificó de manera idéntica a como se modificó la secuencia de la HVR-H3 de la cuarta librería del apul 8, utilizando el mismo oligonucleótido mutagénico.

Las reacciones de mutagénesis para cada una de las dos librerías derivadas del apu5 y de cada una da las seis librerías derivadas del apu l 8 se transformaron en E. coli XL-1 electrocompetente mediante la electroporación. A las células se les permitió recuperarse durante 30 minutos a 37°C con agitación en un medio SOC. Se reservaron veinte microlitros del medio SOC con células para definir el número de transformantes y, luego, se transfirió el resto a 500 mi del medio de cultivo 2YT que contiene carbenicilina y el fago auxiliar M13K07 al 1010 por mililitro. Luego de 45 minutos a 37°C con agitación, el caldo de cultivo se complementó con canamicina y creció durante toda la noche a 37°C con agitación. El número de transformantes para cada librería fue >109. Los fagos se recogieron y concentraron desde el caldo de cultivo mediante centrifugación y precipitación con PEG y, posteriormente, se utilizaron en las series de selección. La poliubiquitina enlazada a K48 y la poliubiquitina enlazada a K63 se inmovilizaron en diferentes placas Maxisorp (NU C), tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 1 (A). Cada librería se clasificó en forma separada comparándola a su diana respectiva (poliubiquitina enlazada a 48 para las dos librerías derivadas del apu05, poliubiquitina enlazada a K63 para las seis librerías derivadas del apul 8) para una serie con la adición de 3 µ? de monoubiquitina en la solución tamponada de separación. Los fagos eluidos se amplificaron y agruparon (en dos conjuntos, uno para cada diana de poliubiquitina enlazada a la lisina) para las series de separación adicionales. Las siguientes series se selección se clasificaron mediante una fase de solución. Los conjuntos de fagos se incubaron con cadenas de poliubiquitina biotiniladas (Sulfo-NHS-biotina, Pierce) durante una a dos horas a temperatura ambiente en la solución tamponada de separación (PBST con 0,5% de Superbloque (Pierce)). La mezcla se diluyó cinco a diez veces en la solución tamponada de separación y se agregó a los pocilios recubiertos de neutravidina para una captura breve (5 minutos) de la poliubiquitina biotinilada. Una reacción que contiene cadenas de poliubiquitina no biotinilada sirvió de control para hacer el seguimiento de la unión de fagos básica. Las placas se lavaron con PBST y eluyeron con 0, 1 M de HCL durante 10 minutos. Las condiciones restrictivas se modularon de tres maneras: mediante la concentración de poliubiquitina biotinilada; mediante la adición del excedente de poliubiquitina no biotinilada para competir por la unión antes de efectuar la captura en los pocilios recubiertos de neutravidina y mediante la duración de la competición. Para cada serie de separación, la monoubiquitina y la poliubiquitina de la otra unión se agregó a una concentración de 30 µg/ml a la solución tamponada de separación durante la primera fase de la incubación. La primera serie de separación de la solución empleó 20 nM de poliubiquitina incubada con fagos durante una hora a temperatura ambiente. Luego, la mezcla se diluyó diez veces en una solución tamponada de separación y se capturó utilizando los pocilios recubiertos de neutravidina durante cinco minutos. Durante la segunda serie, el fago se equilibró con 20 nM de poliubiquitina biotinilada, tal como en la serie 1 , pero se diluyó diez veces más en la solución tamponada de separación que contenía 30 µg/ml de poliubiquitina no biotinilada (enlazada a K48 para la selección K48, enlazada a K63 para la selección K63) durante quince minutos de la selección de la tasa de desactivación seguido de la captura en pocilios recubiertos de neutravidina. La tercera serie de separación de la solución fue igual a la que se describió para la segunda serie, pero además incluyó 5 nM de poliubiquitina biotinilada y 30 minutos de selección de la tasa de desactivación. Después de una serie de separación de placas y de tres series de separación de la solución, se cultivaron clones individuales seleccionados de la segunda generación en un formato de 96 pocilios tal como se describió. Los clones individuales se examinaron mediante el inmunoanálisis ELISA en fagos y luego se secuenciaron. Después de la primera serie de separación de la solución, se observó un enriquecimiento de hasta cuarenta veces más para las librerías basadas en el apu05 y un enriquecimiento de hasta 7 veces más para las librerías basadas en el apul 8 (véase la Tabla C). Se obtuvo un enriquecimiento adicional de once veces para los clones específicos al K48 y un enriquecimiento adicional de 3 veces para los clones específicos al K63 después de la segunda selección (separación de la solución para la tasa de desactivación lenta) (véase la Tabla C). La tercera selección (tanto la separación de afinidad como la separación de la tasa de desactivación) produjo un enriquecimiento de 18 veces más para los clones específicos al K48 y un enriquecimiento de cuatro veces más para los clones específicos al K63 (véase la Tabla C).

Tabla C: Resultados de la separación de la solución de la librería de anticuerpos anti poliubiquitina de segunda generación Se identificaron sesenta y ocho clones únicos que se unen específicamente a la poliubiquitina enlazada a K48; tales clones fueron sometidos al análisis de la secuencia del ADN. Las secuencias de la HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 de dichos clones se muestran en las Figuras 14A-F. Se identificaron treinta y un clones únicos que se unen específicamente a la poliubiquitina enlazada a K63; dichos clones también fueron sometidos al análisis de la secuencia. Las secuencias de la HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 de dichos clones se muestran en las Figuras 15A-C. La secuencia de la HVR de la cadena ligera para cada uno de los clones específicos a la poliubiquitina enlazada a K48 y la poliubiquitina enlazada a K63 no se secuenciaron pero, al igual que con el apu05 y apul 8, las secuencias de la HVR-L1 y HVR-L2 se esperaba que fueran invariables, mientras que la secuencia de la HVR-L3 se esperaba que fuera específica al clon. La secuencia de la HVR-L1 es RASQSVSSAVA (identifícador de la secuencia N°: 79) y la secuencia de la HVR-L2 es SASSLYS (identificador de la secuencia N°: 80), de acuerdo con el diseño de la librería. Todos los clones tenían las mismas secuencias de estructura de cadena pesada y de cadena ligera (véase la Figura 6). Los veinte clones con la unión más grande observada (diez específicos a la poliubiquitina enlazada a 48 y diez específicos a la poliubiquitina enlazada a K63) se produjeron como Fab, tal como se describe en el Ejemplo 1. Los Fab del apu2.01 al apu2.20 fueron sometidos al análisis de la secuencia del ADN. Las secuencias de la HVR-H1 , HVR-H2, HVR-H3 y HVR-L3 de dichos clones se muestran en las Figuras 16A y B (Fab específicos a K48) y 17A y B (Fab específicos a K63). Los Fab del apu2.01 al apu2.20 se incluyeron en un ensayo de proteína del inmunoanálisis ELISA para determinar sus afinidades relativas para la poliubiquitina enlazada a 48 y la enlazada a K63, y para confirmar que los Fab no eran reactivos con la monoubiquitina o BSA (véase la Figura 18). En ese ensayo, cada uno de los clones del apu 2.1 1 y 2.12 demostraron una afinidad casi 300 veces mayor para la poliubiquitina enlazada a K63 que para la poliubiquitina enlazada a 48. Los apu2.20 y 2.16 tuvieron menos diferencias, aunque siguieron siendo notorias (casi 30 veces más y casi 10 veces más, respectivamente) en cuanto a la afinidad para la poliubiquitina enlazada a 63 en comparación con la poliubiquitina enlazada a K48. No se detectaron uniones de los clones apu2.01-apu2.10 en la poli o diubiquitina enlazada a K63. Además, cada Fab también se analizó mediante el análisis BIAcore, tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 1 (C). Las constantes cinéticas y constantes de unión obtenidas se muestran en la Tabla D. La leyenda "NB" de la Tabla D indica que no se detectó una unión para la interacción indicada.

TABLA D: Constantes cinéticas de Fabs antipoliubiquitina según medición mediante análisis BIAcore Varios Fab basados en el apu05 tenían un Kjs menor que el del Fab correspondiente al apu05 para la diubiquitina enlazada a K48, lo que representa una unión más fuerte a la poliubiquitina. Cada uno de los Fab del apu2.1 1 -2.20 se une no sólo a la poliubiquitina enlazada a K63 sino también, aunque en menor medida, a la diubiquitina enlazada a K48. Si bien sólo el apu2.13 tuvo un Kd menor que el apul 8, su Kd para la diubiquitina enlazada a K48 fue mayor que la del apu 18. Cada uno de los apu 2.1 1 , 2.12, 2.16 y 2.20 presentaron mejores índices de Kd para la poliubiquitina enlazada a K63 que Kd para la diubiquitina enlazada a K48 que el apul 8. Las constantes cinéticas observadas para la unión de los Fab basados en el apu 18 en la poliubiquitina enlazada a K63 fueron similares a las que se observaron para la unión en la diubiquitina enlazada a K63. La capacidad de cada Fab para unirse específicamente a la poliubiquitina inmovilizada en una membrana de nitrocelulosa también se evaluó mediante un análisis Western blot, tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 1 (D). La tetraubiquitina que contiene ya sea un enlace K48 o K63, la diubiquitina que contiene el enlace de lisina opuesto al de la tetraubiquitina (por ejemplo, la diubiquitina enlazada a K63 cuando se utilizó la tetraubiquitina enlazada a K48 o la diubiquitina enlazada a K48 cuando se utilizó la tetraubiquitina enlazada a K63) y la monoubiquitina se inmovilizaron en las membranas de intracelulosa y se evaluaron los Fab del apu2.01-2.20 para conocer sus capacidades para reconocer a las tres moléculas inmovilizadas (Figuras 20A y 20B). Ningún Fab reconoció específicamente a la monoubiquitina. Cada uno de los apu2.01-apu2.10 reconoció específicamente a la tetraubiquitina enlazada a K48 pero no reconoció a la diubiquitina enlazada a K63 inmovilizada (véase la Figura 20A). En el análisis aparecieron varias otras bandas, las cuales representan a las especies tri- penta- y octoubiquitinas en la preparación de la tetraubiquitina enlazada a K48. Los apu2.1 1-apu2.20 reconocieron específicamente a la tetraubiquitina enlazada a K63, pero no reconocieron a la diubiquitina enlazada a K48 inmovilizada (véase la Figura 20B). EJEMPLO 3: UNIÓN DE ANTICUERPOS ANTIPOLIUBIQUITINA A PROTEÍNAS POLIUBIQUITINADAS DE MANERA ENDÓGENA Anteriores experimentos habían demostrado que la actividad de la Proteína de interacción con receptor (RIP), un mediador esencial de 140 kD del complejo de señalización del receptor proximal TNF 1 (TNFR1), se modula mediante poliubiquitinación (Wertz et al., Nature 430: 694-699 (2004)). Cuando la RIP se poliubiquitina con cadenas de poliubiquitina enlazada a K63, se facilita la señalización mediante TNFR1. La eliminación de las cadenas de poliubiquitina enlazada a K63 de la RIP mediante el extremo N-terminal de-ubiquitinante de A20 y la sustitución por cadenas de poliubiquitina enlazada a K48 gracias a la función ubiquitina ligasa del extremo C-terminal A20, inactiva la REP y actúa sobre ella para proceder a la degradación proteosómica. Ese mecanismo se había dilucidado mediante el uso de líneas celulares que expresaban ubiquitina muíante con capacidad para formar poliubiquitina enlazada únicamente a K48 o K63. Se ha evaluado la capacidad de dos de las proteínas de unión de antipoliubiquitina enlazada a K48 y K63 de la invención para reconocer específicamente las formas de RIP poliubiquitinadas de manera diferente que existen el las células HeLa S3 en diferentes momentos específicos después de tratamiento con TNF. Se trataron cuatro litros de células HeLa S3, aproximadamente a 1.5 x 106 células/ml , con 21 µ? MG-132. Inmediatamente después del tratamiento, se retiró un litro de células del cultivo principal, recogidas mediante centrifugación, lavadas con 200 mi PBS y vueltas a centrifugar. Esta muestra se utilizó como punto cero de referencia temporal. Los tres litros de cultivo celular restantes se trataron con 100 ng/ml de TNF. Un litro de células fue retirado, recogido y lavado con 200 mi de PBS, y vuelto a centrifugar a los 5, 15, y 25 minutos luego del tratamiento con TNF. Las células de cada momento específico definido se sometieron a lisis en 30 mi de tampón de lisis IP (LB) ((20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCI, 1% Tritón x-100, 1 mM EDTA, 25 µ? MG-132, 10 mM NEM, 30 µ? de cada uno de los cócteles inhibidores 1 y 2 (Sigma), y 1 tableta Complete protease inhibitor (Roche)) Cada Usado se transfirió a un tubo 50 mi para centrifugación y se granuló dos veces durante cinco minutos a 10.000 x g. Se evaluó la concentración de proteínas del Usado de cada momento específico definido. Cada Usado (30 mi de cada momento específico con concentraciones de proteínas normalizadas) se incubó durante 1 ,25-1 ,5 horas con 1 mi de partículas de Proteínas A/G no bloqueadas a 4 °C. Las partículas y los residuos se separaron del Usado mediante centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos. Se tomó una muestra de cada Usado para análisis Western blot directo, y el volumen restante se congeló a -80 °C. Se tomaron cuatro muestras de 16 mi de cada Usado. A cada muestra se añadieron 25 mM MG-132 y 20 µ? NEM. Dos muestras se combinaron cada una con 2,4 µg/ml de un anticuerpo anti-TNFRl . Dos muestras se combinaron cada una con 2,4 de un anticuerpo de control (anti-myc). Todas las muestras se incubaron durante dos horas a 4 °C con rotación y, a continuación, se añadieron 150 µ? de una pasta de partículas de proteína A al 50%. Las muestras se incubaron a 4 °C durante 5 horas más con rotación. Las muestras se granularon mediante centrifugación, y las partículas se lavaron una vez con 15 mi LB, dos veces con 10 mi LB que contenía 1 M NaCl, y dos veces con 10 mi LB. Las partículas lavadas volvieron a suspenderse en 1 ,25 mi LB y se transfirieron a tubos de microfuga. Cada muestra fue aspirada de modo que el tubo alojara un volumen total de 950 µ?, y se añadieron 360 mg de urea sólida a cada muestra para conseguir una concentración final 6M de urea en cada muestra. Las muestras se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Las partículas de cada muestra se granularon mediante centrifugación. Se reservó una porción de cada sobrenadante para análisis Western blot, y el sobrenadante restante de cada muestra ( 1 mi por muestra, aproximadamente) se diluyó en 10 mi con dilución de tampón de disociación (1 % Triton-X100, 0,5% deoxicolato, 120 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7,2, y Complete protease inhibitor cocktail (Roche)). Cada muestra se dividió en dos porciones de cinco mi. Una porción se trató con 2.5 µg apu2.16 que se había reformateado desde la forma fab a la forma IgG, y la otra se trató con 2.5 µg apu2.07 que se había reformateado desde la forma fab a la forma IgG. A ambas muestras se añadieron 50 µ?, de partículas de proteína A, y se incubaron durante 5 horas a 4 °C. Las partículas de proteína A se granularon y se lavaron tres veces en TNFR1 LB, habiéndose transferido a tubos de microfuga durante el proceso de lavado. Se añadió solución tamponada de muestra a todas las muestras, y cada muestra (incluidas las que previamente se habían reservado para análisis Western blot) se redujo y se probó en geles de 10 pocilios de 1,5 mm 10% tris/glicina Novex® (Invitrogen). Después de probarlos, las proteínas de los geles se transfirieron a membranas PVDF Invitrolon™ (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas se bloquearon con PBS-T al 5% y se hibridaron con anticuerpo monoclonal anti-RIP (Becton Dickinson) hasta el día siguiente a temperatura ambiente. Los análisis se lavaron a continuación, se hibridaron con HRP-conjugado de anticuerpos secundarios anti-ratón de cabra (Cappel), se lavaron de nuevo, se expusieron al reactivo para activar quimioluminiscencia y se expusieron ante una película. Los resultados se muestran en las Figuras 21 A y 2 I B. La Figura 21 A describe el análisis que contiene las muestras que se inmunoprecipitaron en primer lugar con TNFRl o con anti-myc y a continuación se inmunoprecipitaron con la IgG apu2.16 (poliubiquitina enlazada a K63 selectiva). Como se muestra en la Figura 21 A, no es visible RIP ni en las muestras de control anti-myc ni en la muestra del punto cero de referencia temporal. La banda RIP fue más marcada en la muestra tomada a los 5 minutos y, a continuación, descendió de manera significativa en las muestras tomadas a los 15 y 25 minutos. La Figura 21B describe el análisis que contiene las muestras que se inmunoprecipitaron en primer lugar con TNFRl o con anti-myc y a continuación se inmunoprecipitaron con la IgG apu2.07 (poliubiquitina enlazada a K48 selectiva). Como se muestra en la Figura 2 I B, no se observó RIP en las bandas de control anti-myc control. Los niveles de REP en este análisis aumentaron con el tiempo, y fueron más altos en la muestra tomada a los 25 minutos. Estos datos se correlacionan con los resultados anteriores que indican que hasta la señalización a través de TNFRl , RIP primero se poliubiquitina con ubiquitina enlazada a K63 y, posteriormente, se deubiquitina y se poliubiquitina de nuevo con ubiquitina enlazada a K48 mediante A20. Así pues, los anticuerpos de la invención fueron capaces de unirse de manera específica y discriminar entre polipéptidos poliubiquitinados con ubiquitina enlazada a K63 y un polipéptido poliubiquitinado con ubiquitina enlazada a 48 que se había poliubiquitinado en células. EJEMPLO 4: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-POLIUBIQUITINA DE TERCERA GENERACIÓN Las librerías de tercera generación para presentación de Fab se construyeron a partir del fagémido que codificaba el clon anteriormente identificado apu2.16 (selectivo con respecto a poliubiquitina enlazada a K63) (véase Ejemplo 2 y Figuras 17A y 17B). El fago procedente de ese clon se utilizó para infectar células CJ236 para preparar un molde de ADN Kunkel. La plantilla posteriormente se mutagenizó para inserta codones de terminación, y las plantillas que contenían el factor de terminación se utilizaron en la construcción de librerías de la manera que se indica a continuación: El Fab apu2.16 se mutagenizó de acuerdo con tres esquemas diferentes para crear tres librerías diferentes derivadas de apu2.16. En la primera librería, HVR-Hl y HVR-H2 se mutagenizaron. El HVR-Hl se mutagenizó para incluir un codón de terminación en la plantilla Kunkel, seguido por una metodología de mutagénesis que utiliza un oligonucleótido mutagénico. La secuencia del oligonucleótido que codifica el codón de terminación era: GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (identifícador de secuencia n°: 371). El oligonucleótido mutagénico permitió que la isoleucina situada en la posición 29 fuera seleccionada por fenilalanina, leucina, isoleucina y valina; la isoleucina situada en la posición 34 fuera seleccionada por metionina y isoleucina mediante el conjunto de codones mixto NNS (en donde N corresponde a G, C, A o T y S corresponde a G o C); y la aleatorización flexible de aminoácidos K30, T31 , G32, y L33. La aleatorización flexible en este contexto indicó que ciertas posiciones de los nucleótidos estaban ocupadas en un 70% de las ocasiones por la base indicada, y 10% de las ocasiones ocupada por una de las tres bases restantes. Para los siguientes oligonucleótidos, en los que tal aleatorización flexible se incluyó en una base en particular, la presencia de la aleatorización flexible la indica la presencia de un número en esa posición de base. El número "5" indica que la base adenina estaba presente en el 70% de las ocasiones en esa posición, mientras que las bases guanina, citosina y timina estaban presentes cada una en el 10% de las ocasiones. De manera similar, el número "6" hace referencia a guanina, "7" a citosina y el "8" a timina, casos en los cuales las tres bases restantes estaban presentes sólo en el 10% de las ocasiones. La secuencia de oligonucleótidos utilizada para mutagenizar apu3.16 HVR-H1 fue la siguiente: GCAGCTTCTGGCTTCAACNTC556577668788ATSCACTGGGTGCGTCAGG (identificador de secuencia n°: 785). El HVR-H2 se modificó también para incluir un codón de terminación en la plantilla Kunkel, seguido por una mutagénesis en la que se utilizaron tres oligonucleótido mutagénico. El oligonucleótido que codifica el codón de terminación en todos los casos fue: GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG (identificador de secuencia n°: 373). Los tres oligonucleótidos mutagénicos fueron dos permutaciones de una secuencia deseada en primer orden de preferencia, y una secuencia deseada en segundo orden de preferencia. La secuencia deseada en primer lugar incluía: un residuo fijo y otro aleatorizado de tirosina cada uno en las posiciones 50 ó 54 mediante el uso del conjunto de codones mixto N S (descrito anteriormente); residuos fijos en las posiciones 51 (isoleucina), 52a (prolina), 53 (tirosina), 55 (glicina), y 57 (treonina); y aleatorización flexible de las posiciones S52, S56, y S58 (de acuerdo con el esquema de aleatorización flexible descrito anteriormente). La secuencia deseada en segundo lugar incluía: residuos fijos en las posiciones 51 (isoleucina), 52a (prolina), 53 (tirosina), 55 (glicina), y 57 (treonina); aleatorización rígida de las tirosinas presentes en las posiciones 50 y 54 mediante el uso del conjunto de codones mixto NNS (descrito anteriormente) y aleatorización flexible de las posiciones S52, S56, y S58 (de acuerdo con el esquema de aleatorización flexible descrito anteriormente). Los oligonucleótidos utilizados para mutagenizar apu2.16 HVR-H2 fueron GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATC567CCGTACTACGGT567ACC567TATGC CGATAGCGTCAAGG (identificador de secuencia n°: 786), GGCCTGGAATGGGTTGCATACATC567CCGTACNNSGGT567 ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (identificador de secuencia n°: 787), GGCCTGGAATGGGTTGCATACATC567CCGTACNNSGGT567 ACC567TATGCCGATAGCGTC AAGG (identificador de secuencia n°: 788). En la segunda librería apu2.16, HVR-H2 y HVR-H3 se mutagenizaron. HVR-H2 se mutagenizó de manera idéntica a las modificaciones realizadas a HVR-H2 en la primera librería apu2.16, mediante el uso del mismo oligonucleótido que contiene el codón de terminación y los mismos tres oligonucleótidos mutagénicos. HVR-H3 se mutagenizó de manera idéntica a las modificaciones realizadas a HVR-H3 en la primera librería apul 8 (descripción en Ejemplo 2), mediante el uso del mismo oligonucleótido que contiene el codón de terminación y los mismos seis oligonucleótidos mutagénicos. En la tercera librería apu2.16, HVR-H1 y HVR-H3 se mutagenizaron. HVR-H l se mutagenizó de manera idéntica a las modificaciones realizadas a HVR-H1 en la primera librería apu2.16, mediante el uso del mismo oligonucleótido que contiene el codón de terminación y el mismo oligonucleótido mutagénico. HVR-H3 se mutagenizó de manera idéntica a las modificaciones realizadas a HVR-H3 en la primera librería apul 8 (descripción en Ejemplo 2), mediante el uso del mismo oligonucleótido que contiene el codón de terminación y los mismos seis oligonucleótidos mutagénicos. Las reacciones de mutagénesis de cada una de las librerías derivadas de apu2.16 se transformaron en E. coli XL-1 electrocompetente mediante electroporación. Se dejó que las células se recuperaran durante 30 minutos a 37 °C con agitación en medio SOC. Se reservaron veinte microlitros del medio SOC que contenía las células para determinar el número de transformantes, y el medio restante se transfirió a continuación a 500 mi 2YT que contenían carbenicilina y 1010 fagos auxiliares M13K07 por mililitro. Después de 45 minutos de incubación a 37 °C con agitación, se añadió kanamicina al caldo de cultivo y se dejó crecer hasta el día siguiente a 37 °C con agitación. El número de transformantes para cada librería fue >109. Los fagos se recogieron y se concentraron a partir del caldo de cultivo mediante centrifugación y precipitación con PEG, y se utilizaron en series de selección posteriores. Las librerías de tercera generación se separaron cada una de manera separada frente a poliubiquitina enlazada a K63 inmovilizada en placas Maxisorp (NU C) como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 (A). Las condiciones restrictivas se modularon de tres maneras: mediante la concentración de poliubiquitina biotinilada; mediante la adición de exceso de poliubiquitina no biotinilada para competir en la unión antes de captura en los pocilios recubiertos de neutravidin y mediante la duración de la competición. Cada serie de separación de solución incluyo 3 µ? de monoubiquitina y 30 µg/ml de poliubiquitina enlazada a K48 en la solución tamponada de separación durante la incubación. El fago eluído se amplificó y se extrajo para series posteriores de separación. Las series posteriores de selección se separaron en fase solución. La primera serie de separación de solución incluyó 100 nM de poliubiquitina biotinilada (Sulfo-NHS-biotin, Pierce) incubada con las extracciones de fagos durante una hora a temperatura ambiente. La mezcla fue diluida diez veces en una solución tamponada de separación (PBST con 0,5% Superblock (Pierce)) y se capturó mediante pocilios recubiertos de neutravidin durante cinco minutos. Una reacción que contenía cadenas de poliubiquitina no biotinilada sirvió de control para el seguimiento de la unión de fagos básica. Las placas se lavaron con PBST y eluídas con HC1 0,1 M durante 10 minutos. Para la segunda serie de la solución separada, los fagos se equilibraron con 30 nM de poliubiquitina biotinilada , como en la serie uno, pero se diluyó diez veces en solución tamponada de separación que contenía 30 µg/ml de poliubiquitina no biotinilada (enlazada a K63) durante cinco minutos de selección de tasa de desactivación mediante captura en pocilios recubiertos de neutravidin. Después de la primera serie de separación de solución, se observó un factor de aumento de 6,5 en el caso de librerías combinadas basadas en apu2.16 (véase la Tabla E). Se obtuvo un enriquecimiento de factor 10 después de la segunda ordenación de solución para factor de desactivación lento (véase la Tabla E).

Tabla E: Resultados de la Separación de solución de librería de anticuerpos anti- poliubiquitina de tercera generación Después de una serie de separación de placa y de dos series de separación de solución, los clones individuales seleccionados de la tercera generación se dejaron crecer en una bandeja de 96 pocilios y se examinaron mediante test ELISA de fagos tal y como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. Se identificaron setenta y dos clones diferentes mediante secuenciación. De esos clones, doce demostraron el mayor grado de especificidad para la poliubiquitina enlazada a K63 en el ensayo ELISA de fagos (Figura 22). Esos doce fueron designados apu3.01-3.12, y sus secuencias HVR-H1 , HVR-H2, y HVR-H3 aparecen en la Figura 23. La cadena ligera HVR de cada uno de los clones específicos para poliubiquitina enlazada a K63 no se secuenció, pero se esperó que las secuencias de HVR-L1 y HVR-L2 no variaran, mientras que se esperaba que la secuencia HVR-L3 fuera idéntica a la de apu2.16. La secuencia HVR-L1 fue RASQSVSSAVA (identificador de secuencia n°: 79) y la secuencia HVR-L2 fue SASSLYS (identificador de secuencia n°: 80), de acuerdo con el diseño de la librería. Todos los clones tenían las mismas secuencias de estructuras de cadena pesada y cadena ligera (véase Figura 6).

Apu2.07 (véase Ejemplo 2 y Figuras 16A y 16B)) y apu3.07 (véase anterior y Figura 23) se expresaron en CHO o en 293 células como IgGs. Los constructos de expresión se elaboraron mediante mutagénesis Kunkel de los vectores pRK adecuados de mamíferos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de la IgG humana (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10(1990)). Las IgGs se purificaron por cromatografía de afinidad mediante metodologías estándar. Se evaluó la capacidad de cada IgG para unir de manera específica poliubiquitina con el enlace apropiado a una membrana de nitrocelulosa mediante Western blot. La monoubiquitina y las poliubiquitinas enlazadas a K48 ó K63 (Boston Biochem) se probaron en geles de poliacrilamida Tris-glicina 4-20% (Invitrogen). El contenido de los geles se transfirió a nitrocelulosa mediante electrotransferencia por adsorción. Los sitios de unión no específica de la membrana de nitrocelulosa se bloquearon durante una hora en una solución de leche en polvo no grasa al 5% disuelta en solución salina tamponada Tris con contenido de 0, 1% Tween-20 (TBST). Los anticuerpos específicos para K48 ó K63 se añadieron a continuación al análisis en una concentración de 2 µg/ml (apu 2.07 IgG) ó 1 µ^??? (apu3.07 IgG) y se incubaron durante una hora para dejar que tuvieran lugar las uniones. Como control positivo, uno de los análisis se incubó con anticuerpos anti-ubiquitina de conejo (Sigma). Los análisis se lavaron en TBST y los anticuerpos unidos se detectaron mediante Ig Fe (ICN) anti-humana de cabra conjugada con peroxidasa o Ig anti-conejo (Amersham) conjugada con peroxidasa diluida en proporción 1 : 10.000 en TBST con contenido del 5% de leche en polvo no grasa. Transcurrida una hora, los análisis se lavaron con TBST y se desarrollaron mediante reactivo Super Signal West Dura (Pierce) para poner de manifiesto la actividad de la peroxidasa. Los resultados se muestran en las Figuras 24A-24D.

Como se esperaba, la IgG apu2.07 reconoció de manera específica la tetraubiquitina enlazada a K48 y las tri- hasta heptaubiquitina enlazadas a K48 inmovilizadas (Figura 24A), pero no se unió a ninguna de las muestras de poliubiquitina enlazada a K63. De manera similar, la IgG apu3.07 reconoció de manera específica la tetraubiquitina enlazada a K63 y las tri- hasta heptaubiquitina enlazadas a K63 inmovilizadas (Figura 24B), pero no se unió a ninguna de las muestras de poliubiquitina enlazada a K48. La IgG tampoco se unió a monoubiquitina inmovilizada. Para evaluar la sensibilidad de cada IgG, se realizaron análisis Western blot adicionales con concentraciones variadas de tetraubiquitina enlazada a K48 y K63 inmovilizada (25-1000 ng/banda) (Figuras 24C y 24D). La IgG Apu2.07 detectó tan sólo 50 ng de tetraubiquitina enlazada a 48 inmovilizada, y de nuevo no se unió de manera específica a tetraubiquitina enlazada a K63 inmovilizada (Figura 24C). La IgG Apu3.07 detectó tan sólo 50 ng de tetraubiquitina enlazada a K63 inmovilizada, y de nuevo no se unió de manera específica a tetraubiquitina enlazada a K48 inmovilizada (Figura 24D). En ambos casos, cantidades aumentadas de tetraubiquitina inmovilizada produjeron aumentos de uniones observadas. Para determinar si las IgG podían detectar proteínas poliubiquitiniladas de manera endógena, se prepararon Usados de proteínas a partir de línea celular embriónica de riñón humano 293T tratadas con o sin 20 µ? del inhibidor de proteasomas Velcade® (bortezomib) durante cuatro horas. Los Usados se resolvieron mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida Tris-glicina al 4-20% (Invitrogen), y se procedió al análisis Western blot como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 25. Un anticuerpo policlonal anti-ubiquitina(Sigma) detectó un gran número de proteínas de alto peso molecular (bandas más a la izquierda) tanto en presencia como en ausencia de tratamiento con Velcade®. La IgG apu2.07 IgG se unió a numerosas proteínas de pesos moleculares variados (bandas más a la derecha) y las uniones observadas fueron de mayor peso en el caso de los lisados inmovilizados tratados con Velcade que en el caso de los Usados inmovilizados no tratados. De manera significativa se observó menos unión de carácter general de la IgG apu3.07 (bandas centrales), que se esperaba que se uniera a proteínas poliubiquitiniladas con poliubiquitina enlazada a K63 y no se apreció diferencia de uniones entre las bandas tratadas con Velcade y las no tratadas. Se sabe que la poliubiquitinilación con poliubiquitina enlazada a K48 afecta a proteínas intracelulares para degradación proteolítica (Chau et al., Science 243: 1576-1583 (1989); Finley et al., Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick et al., Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004)). Así pues, una explicación para los resultados de la IgG apu2.07 consiste en que was cuando se evitó el procesamiento proteolítico, aumentó la cantidad de proteínas poliubiquitiniladas con poliubiquitina enlazada a K48 en el lisado, lo que provocó el el aumento de uniones de la IgG apu2.07 en las muestras no tratadas. No hay constancia de que la poliubiquitinilación con poliubiquitina enlazada a K63 afecte a las proteínas para su degradación (Pickart y Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004); Hicke y Dunn, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19: 141-172 (2003); Spece et al., Mol. Cell Biol. 15: 1265-1273 (1995); Ulrich, Eukaryot. Cell 1 : 1-10 (2002); Spence et al., Cell 102: 67-76 (2000); Seibenhener et al., Mol. Cell. Biol. 24(18): 8055-8068 (2004)). Con todo esto, una explicación para los resultados obtenidos con IgG apu 3.07 consiste en que la inhibición de proteasomas no provocó acumulación de proteínas poliubiquitiniladas con poliubiquitina enlazada a K63. EJEMPLO 5: ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE UNIÓN DE FAB A ANTIPOLIIUBIQUITINA ENLAZADA A K63 Para comprender mejor la interacción del Fab antipoliubiquitina enlazada a K63 con la poliubiquitina, el Fab antipoliubiquitina enlazada a K63 apu2.16 fue cocristalizado con diubiquitina enlazada a K63. Los cristales habían crecido en gotas utilizando 1 µ? de una solución apu2.16 (15 mg/ml en 10 mM Tris, 75 mM NaCl pH 8.0) y 1 µ? de solución de pocilio (0.1 M LiCl, 0.1 M Tris pH 8.2, 1 M citrato). Se añadió a cada gota 0,5 µ? de 0, 1 M de cloruro de cobre y se sembró cada gota. Los grupos de cristales crecieron en el transcurso de varios días y se podrían manipular para obtener un cristal difractante único. La estructura se determinó por sustitución molecular. Los datos nativos se recogieron a 100K y procesados con HKL2000 Los cristales pertenecían al grupo espacio C2 con dimensiones celulares a= 177,7 Á, b= 94,9 Á, c= 97,9 Á, y ß = 107, con dos complejos en la unidad asimétrica. La estructura fue resuelta por sustitución molecular empleando el programa Phaser y las coordenadas de una variante del fragmento Fab 4d5 humanizado (PDB para 4d5: PDB código 1 FVE). La construcción del modelo se llevó a cabo en el programa Coot y la estructura se refino con Refmac5. La resolución de la estructura es 3, 1 Á. El complejo ha sido refinado a un R de 24,5% y un R)¡bre de 30,4%. La interacción entre apu2.16 y la diubiquitina enlazada a K63 se muestra en las Figuras 26A-26C. El epítopo estructural es una combinación de residuos los cuales cubren al menos el 25% de su área superficial accesible solvente sobre el Fab de unión y/o tiene más de un átomo en 4,5 Á de la cadena pesada o ligera del Fab. La cadena de ubiquitina que dona K63 es cadena A, y la cadena de ubiquitina que dona el extremo C terminal es cadena B. Los residuos de la cadena ligera del Fab pertenecen a la cadena L y los residuos de la cadena pesada del Fab pertenecen a la cadena H. El número de la cadena precede el número residual en la tabla inferior, y los residuos Fab se enumeran secuencialmente.

TABLA F: Residuos localizados en la interfaz de unión de la diubiquitina enlazada a K63 apu2.16.

Tal como se muestra en la Tabla F y se indica en la Figura 26B en gris oscuro, existían once residuos en la cadena A de la diubiquitina K63 y trece residuos en la cadena B de la diubiquitina K63 que se encontraban en 4,5 Á de apu2.16 cuando estaba unido a apu2.16. Como se muestra en la Tabla F y se indica en la Figura 26C en gris oscuro, existían ocho residuos en el apu2.16 de la cadena ligera y catorce residuos en el apu2.16 de la cadena pesada que se encontraban en 3,5 Á de la dubiquitina enlazada a K63 cuando estaba unida a aquella molécula. En base a estos datos, entre los residuos que probablemente medien en la interacción entre las dos en la diubiquitina enlazada a K63 se incluyen Glu-18, Ser-20, Leu-57 y Asp-58 en la cadena A y Pro-37, Arg-74 y Gly-75 en la cadena B. Cabe destacar, que el anticuerpo no interactúa íntimamente con el enlace K63-Gly-76, sino que en su lugar deriva especificidad por medio de interacciones de la superficie del complejo de diubiquitina que se une al enlace.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina.
2. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una primera poliubiquitina que comprende un primer enlace a lisina, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a una segunda poliubiquitina que comprenda un segundo enlace a lisina y en la que el primer enlace a lisina es distinto del segundo enlace a lisina.
3. El anticuerpo de la reivindicación 2, según la cual el anticuerpo se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 6, poliubiquitina enlazada a lisina 1 1 , poliubiquitina enlazada a lisina 27, poliubiquitina enlazada a lisina 29, poliubiquitina enlazada a lisina 33, poliubiquitina enlazada a lisina 48 o poliubiquitina enlazada a lisina 63.
4. El anticuerpo de la reivindicación 2, en la que la primera poliubiquitina se enlaza a lisina-48
5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en la que la segunda poliubiquitina se enlaza a lisina-63
6. El anticuerpo de la reivindicación 2, en la que la primera poliubiquitina se enlaza a lisina-63
7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en la que la segunda poliubiquitina se enlaza a lisina-48
8. Un anticuerpo aislado que se une específicamente tanto a una primera poliubiquitina que comprende un primer enlace a lisina como una segunda poliubiquitina que comprende un segundo enlace a lisina, en la cual el primer enlace a lisina es diferente del segundo enlace a lisina, el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina y el anticuerpo se une a la segunda poliubiquitina con una afinidad de unión sustancialmente menor que la afinidad de unión del anticuerpo para la primera poliubiquitina.
9. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 48, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina.
10. El anticuerpo de la reivindicación 9, que comprende además al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada entre HVR-Hl , HVR-H2, HVR-H3 y HVR-L3 de cualquiera de los identificadores de secuencia núms: 1 -25, 151 -175, 265-279, 392-459 y 695-704; identificadores de secuencia núms: 27-51 , 177-201 , 281-295, 461-528 y 706-715; identificadores de secuencia núms: 53-77, 203-227, 297-31 1 , 530-597 y 717-726; e identificadores de secuencia núms: 313-327 y 728-737, respectivamente.
1 1. El anticuerpo de la reivindicación 9, que comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-Hl , HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-Hl comprende la secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d se selecciona entre valina, fenilalanina, leucina e isoleucina; el aminoácido e se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido f es tirosina, el aminoácido g se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido h se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x y z a', en la que el aminoácido k es serina, el aminoácido 1 es isoleucina, el aminoácido m se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido n se selecciona entre prolina y serina, el aminoácido o es tirosina, el aminoácido p es tirosina, el aminoácido q se selecciona entre serina y glicina, el aminoácido r se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido s es treonina, el aminoácido t se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido u es tirosina, el aminoácido v es alanina, el aminoácido w es ácido aspártico, el aminoácido x es serina, el aminoácido y es valina, el aminoácido z es Usina y el aminoácido a' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica b' c' d' e' f g' h' i' j' k' G, en la que el aminoácido b' se selecciona entre ácido gutámico, serina, glicina y tirosina; el aminoácido c' se selecciona entre glicina, tirosina, serina y asparagina; el aminoácido d' se selecciona entre tirosina, serina, lisina, fenilalanina y ácido glutámico; el aminoácido e' se selecciona entre serina, tirosina, glicina y triptofanon; el aminoácido f se selecciona entre glutamina, tirosina, serina y glicina; el aminoácido g' se selecciona entre glicina, serina, tirosina, metionina y alanina; el aminoácido h' se selecciona entre glicina, alanina, prolina e isoleucina; el aminoácido i' se selecciona entre fenilalanina, isoleucina, metionina, alanina y leucina o no está presente; el aminoácido j' es fenilalanina o no está presente; el aminoácido k' es ácido aspártico; y el aminoácido es tirosina.
12. El anticuerpo de la reivindicación 9, que comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-H1 , HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-H1 comprende la secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d es isoleucina; el aminoácido e se selecciona entre serina y fenilalanina; el aminoácido f es tirosina, el aminoácido g se selecciona entre serina y glicina, el aminoácido h se selecciona entre serina y glicina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x y z a', en la que el aminoácido k es serina, el aminoácido 1 es isoleucina, el aminoácido m es tirosina, el aminoácido n es serina, el aminoácido o es tirosina, el aminoácido p es tirosina, el aminoácido q es serina, el aminoácido r se selecciona entre serina y tirosina, el aminoácido s es treonina, el aminoácido t es serina, el aminoácido u es tirosina, el aminoácido v es alanina, el aminoácido w es ácido aspártico, el aminoácido x es serina, el aminoácido y es valina, el aminoácido z es Usina y el aminoácido a' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica b' c' d' e' f g' h' i' j' k', en la que el aminoácido b' se selecciona entre serina y glicina; el aminoácido c' es tirosina; el aminoácido d' es serina; el aminoácido e' se selecciona entre tirosina y triptofanon; el aminoácido f se selecciona entre serina, tirosina, arginina, fenilalanina e histidina; el aminoácido g' se selecciona entre ácido glutámico, serina, leucina, fenilalanina, metionina, asparagina y valina; el aminoácido h' se selecciona entre alanina y glicina; el aminoácido i' se selecciona entre leucina, metionina, fenilalanina e isoleucina; el aminoácido j' es ácido aspártico; y el aminoácido k' es tirosina.
13. El anticuerpo de la reivindicación 9, que comprende una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia aminoacídica m' n' o' p' q' r' s' t' u' v' w', en la que el aminoácido m' es glutamina; el aminoácido n' es glutamina; el aminoácido o' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido p' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido q' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido r' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido s' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido t' se selecciona entre leucina, serina, prolina y tirosina; el aminoácido u' es prolina o no está presente; el aminoácido v' se selecciona entre fenilalanina, isoleucina, valina y leucina; y el aminoácido w' es treonina.
14. El anticuerpo de la reivindicación 9, que comprende una secuencia de HVR-L3, que comprende la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia n°: 728.
15. El anticuerpo de la reivindicación 1 1 , que comprende las secuencias HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 correspondientea a las expuestas para los clones apuOl , apu02, apu03, apu04, apu05, apu06, apu07, apu08, apu09, apulO, apul l , apul2, apul 3, apul4 o apul 5 en las Figuras 10A y 10 B.
16. El anticuerpo de la reivindicación 12, que comprende las secuencias HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 que corresponde a las expuestas para los clones apu2.01 , apu2.02, apu2.03, apu2.04, apu2.05, apu2.06, apu2.07, apu2.08, apu2.09 o apu2.10 en la Figura 16 A.
17. El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 correspondiente a la secuencia HVR-L3 expuesta para los clones apuO l , apu02, apu03, apu04, apu05, apu06, apu07, apu08, apu09, apul O, apul l , apul2, apul 3, apul4 o apul 5 en la Figura 10C.
18. El anticuerpo de la reivindicación 14, que comprende una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 que corresponde a la secuencia HVR-L3 expuesta para los clones apu2.01 , apu2.02, apu2.03, apu2.04, apu2.05, apu2.06, apu2.07, apu2.08, apu2.09 o apu2.10 en la Figura 16B.
19. El anticuerpo de la reivindicación 9, que comprende una secuencia HVR-H1 del identifícador de secuencia n°: 269, una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 285, una secuencia HVR-H3 del identifícador de secuencia n°: 301 , una secuencia de la HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 317.
20. El anticuerpo de la reivindicación 9, que comprende una secuencia HVR-Hl del identificador de secuencia n°: 701 , una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 712, una secuencia HVR-H3 del identifícador de secuencia n°: 723; una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 734.
21. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a poliubiquitina enlazada a lisina 63, en la que el anticuerpo no está específicamente unido a monoubiquitina.
22. El anticuerpo de la reivindicación 21, que comprende al menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada entre HVR-Hl , HVR-H2, HVR-H3 y HVR-L3 de cualquiera de los identifícadores de secuencia núms: 81 -89, 229-239, 329-336, 599-629, 739-748 y 789-799; identifícadores de secuencia núms: 91 -99, 241-251 , 338-345, 631-661 , 750-759 y 801-81 1 ; identifícadores de secuencia núms: 101 -109, 253-263, 347-354, 663-693, 761-770 y 813-823; identifícadores de secuencia núms: 356-363 y 772-781 , respectivamente.
23. El anticuerpo de la reivindicción 21, que comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-Hl , HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-Hl comprende la secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d se selecciona entre valina, isoleucina y fenilalanina, el aminoácido e se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido f se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido g se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido h se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x y z a', en la que el aminoácido k se selecciona entrre serina y tirosina; el aminoácido 1 es isoleucina; el aminoácido m se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido n se selecciona entre prolina y serina; el aminoácido o se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido p se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido q se selecciona entre serina y glicina; el aminoácido r se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido s es treonina; el aminoácido t se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido u es tirosina; el aminoácido v es alanina; el aminoácido w es ácido aspártico; el aminoácido x es serina; el aminoácido y es valina; el aminoácido z es lisina; y el aminoácido a' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica b' c' d' e' f g' h' i' j' k' G m' n' o' p' q' r' s' t' u' v', en la que el aminoácido b' se selecciona entre serina, ácido glutámico, glicina y triptofanon; el aminoácido c' se selecciona entre glicina, tirosina, isoleucina, glutamina y serina; el aminoácido d' se selecciona entre tirosina, metionina, glicina e isoleucina; el aminoácido e' se selecciona entre tirosina, arginina, fenilalanina, triptofanon, alanina y prolina; el aminoácido f se selecciona entre tirosina, triptofanon, serina y glicina; el aminoácido g' se selecciona entre glutamina, tirosina, serina, fenilalanina y valina; el aminoácido h' se selecciona entre glicina, treonina, triptofanon, lisina y prolina; el aminoácido i' se selecciona entre tirosina, alanina, triptofanon, ácido glutámico, prolina y serina; el aminoácido j' se selecciona entre triptofanon, isoleucina, tirosina y alanina; el aminoácido k' se selecciona entre triptofanon, tirosina, glicina y ácido aspártico o no está presente; el aminoácido G se selecciona entre tirosina, serina, fenilalanina y triptofanon o no está presente; el aminoácido m' se selecciona entre tirosina, ácido aspártico y serina o no está presente; el aminoácido n' se selecciona entre tirosina y alanina o no está presente; el aminoácido o' se selecciona entre treonina, serina, valina, glicina y tirosina o no está presente; el aminoácido p' se selecciona entre glicina, ácido aspártico, serina, metionina y tirosina o no está presente; el aminoácido q' se selecciona entre tirosina, alanina y glicina o no está presente; el aminoácido r' se selecciona entre tirosina, leucina y glicina o no está presente; el aminoácido s' es glicina o no está presente; el aminoácido t' se selecciona entre metionina y leucina o no está presente; el aminoácido u' es ácido aspártico; y el aminoácido v' es tirosina.
24. El anticuerpo de la reivindicción 21 , que comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-Hl , HVR-H2, HVR-H2, en la que HVR-Hl comprende al secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d se selecciona entre isoleucina, valina y leucina; el aminoácido e se selecciona entre lisina y metionina; el aminoácido f se selecciona entre treonina, metionina, asparagina, arginina e isoleucina; el aminoácido g se selecciona entre glicina, valina y fenilalanina; el aminoácido h se selecciona entre tirosina, isoleucina, leucina y fenilalanina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x y z a' b', en la que el aminoácido k es alanina; el aminoácido 1 es tirosina; el aminoácido m es isoleucina; el aminoácido n se seleciona entre serina, isoleucina y treonina; el aminoácido o es prolina; el aminoácido p es tirosina; el aminoácido q se selecciona entre leucina, tirosina, ácido aspártico, serina y triptofanon; el aminoácido r es glicina; el aminoácido s se selecciona entre triptofanon, valina, serina, asparagina, arginina y tirosina; el aminoácido t es treonina; el aminoácido u se selecciona entre arginina, asparagina, valina, treonina, serina y lisina; el aminoácido v es tirosina; el aminoácido w es alanina; el aminoácido x es ácido aspártico; el aminoácido y es serina; el aminoácido z es valina; el aminoácido a' es lisina; y el aminoácido b' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aminoacídica c' d' e' f g' h' i' j' k' G m' n' o', en la que el aminoácido c' es serina; el aminoácido d' es arginina; el aminoácido e' es ácido glutámico; el aminoácido f es tirosina; el aminoácido g' es tirosina; el aminoácido h' es arginina; el aminoácido i' es triptofanon; el aminoácido j' es tirosina; el aminoácido k' es treonina; el aminoácido G es alanina; el aminoácido m' es isoleucina; el aminoácido n' es ácido aspártico; y el aminoácido o' es tirosina.
25. El anticuerpo de la reivindicación 21 , que comprende una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia aminoacídica m' w' x' y' z' A B C D E F G, en la que el aminoácido w' es glutamina; el aminoácido x' es glutamina; el aminoácido y' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido z' se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido A se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido B se selecciona entre serina y tirosina; el aminoácido C se selecciona entre prolina, serina y leucina; el aminoácido D se selecciona entre serina, prolina y tirosina o no está presente; el aminoácido E se selecciona entre leucina y fenilalanina o no está presente; el aminoácido F se selecciona entre fenilalanina, valina, treonina e isoleucina; y el aminoácido G se selecciona entre arginina, treonina y fenilalanina.
26. El anticuerpo de la reivindicación 21, que comprende una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia aminoacídica Q-Q-Y-S-S-Y-S-S-L-F-T (identifícador de secuencia n°: 772).
27. El anticuerpo de la reivindicación 23, que comprende las secuencias HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 correspondientea a las expuestas para los clones apul 7, apul 8, apul9, apu20, apu21 , apu22, apu23 y apu24 en las Figuras 1 1A y 1 1 B.
28. El anticuerpo de la reivindicación 24, que comprende las secuencias HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 que corresponde a las expuestas para los clones apu2.1 1 , apu2.12, apu2.13, apu2.14, apu2.15, apu2.16, apu2.17, apu2.18, apu2.19 y apu2.20 en la Figura 17 A.
29. El anticuerpo de la reivindicación 25, que comprende una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 que corresponde a la secuencia HVR-L3 expuesta para los clones apul 7, apul 8, apul9, apu20, apu21 , apu22, apu23 y apu24 en la Figura 1 1C.
30. El anticuerpo de la reivindicación 26, que comprende una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 que corresponde a la secuencia HVR-L3 expuesta para los clones apu2.1 1, apu2.12, apu2.13, apu2.14, apu2.15, apu2.16, apu2.17, apu2.18, apu2.19 y apu2.20 en la Figura 17B.
31. El anticuerpo de la reivindicación 21, que comprende una secuencia HVR-H1 del identificador de secuencia n°: 330, una secuencia HVR-H2 del identificador de secuencia n°: 339, una secuencia HVR-H3 del identificador de secuencia n°: 348, una secuencia de la HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identificador de secuencia n°: 357.
32. El anticuerpo de la reivindicación 21 , que comprende una secuencia HVR-H1 del identificador de secuencia n°: 739, una secuencia HVR-H2 del identificador de secuencia n°: 750, una secuencia HVR-H3 del identificador de secuencia n°: 761 , una secuencia de la HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identificador de secuencia n°: 772.
33. El anticuerpo de la reivindicación 21 , que comprende una secuencia HVR-H1 del identificador de secuencia n°: 740, una secuencia HVR-H2 del identificador de secuencia n°: 751 , una secuencia HVR-H3 del identificador de secuencia n°: 762, una secuencia de la HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 773.
34. El anticuerpo de la reivindicación 21, que comprende al menos una secuencia seleccionada entre HVR-H1 , HVR-H2, HVR-H3, en la que HVR-H1 comprende al secuencia aminoacídica a b c d e f g h i j, en la que el aminoácido a es glicina; el aminoácido b es fenilalanina; el aminoácido c es asparagina; el aminoácido d se selecciona entre isoleucina, valina y leucina; el aminoácido e se selecciona entre lisina y metionina; el aminoácido f se selecciona entre treonina, metionina, asparagina, arginina e isoleucina; el aminoácido g se selecciona entre glicina, valina y fenilalanina; el aminoácido h se selecciona entre tirosina, isoleucina, leucina y fenilalanina; el aminoácido i se selecciona entre isoleucina y metionina; y el aminoácido j es histidina; en la que HVR-H2 comprende la secuencia aminoacídica k l m n o p q r s t u v w x y z a' b', en la que el aminoácido k es alanina; el aminoácido 1 es tirosina; el aminoácido m es isoleucina; el aminoácido n se seleciona entre serina, isoleucina y treonina; el aminoácido o es prolina; el aminoácido p es tirosina; el aminoácido q se selecciona entre leucina, tirosina, ácido aspártico, serina y triptofanon; el aminoácido r es glicina; el aminoácido s se selecciona entre triptofanon, valina, serina, asparagina, arginina y tirosina; el aminoácido t es treonina; el aminoácido u se selecciona entre arginina, asparagina, valina, treonina, serina y lisina; el aminoácido v es tirosina; el aminoácido w es alanina; el aminoácido x es ácido aspártico; el aminoácido y es serina; el aminoácido z es valina; el aminoácido a' es lisina; y el aminoácido b' es glicina; y en la que HVR-H3 comprende la secuencia aniinoacídica c' d' e' f g' h' i' j' k' m' n' o', en la que el aminoácido c' es serina; el aminoácido d' es arginina; el aminoácido e' es ácido glutámico; el aminoácido f es tirosina; el aminoácido g' es tirosina; el aminoácido h' es arginina; el aminoácido i' es triptofanon; el aminoácido j' es tirosina; el aminoácido k' es treonina; el aminoácido G es alanina; el aminoácido m' es isoleucina; el aminoácido n' es ácido aspártico; y el aminoácido o' es tirosina.
35. El anticuerpo de la reivindicación 34, que comprende las secuencias HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 que corresponde a las expuestas para los clones apu3.01 , apu3.02, apu3.03, apu3.04, apu3.05, apu3.06, apu3.07, apu3.08, apu3.09, apu3.10 y 3.1 1 en la Figura 23.
36. El anticuerpo de la reivindicación 34 ó 35, que comprende una secuencia HVR-L1 del identificador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identificador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 que corresponde a la secuencia HVR-L3 del identificador de secuencia n°: 777.
37. El anticuerpo de la reivindicación 21 , que comprende una secuencia HVR-H1 del identificador de secuencia n°: 744, una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 755, una secuencia HVR-H3 del identifícador de secuencia n°: 766, una secuencia de la HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 777.
38. El anticuerpo de la reivindicación 21, que comprende una secuencia HVR-H1 del identifícador de secuencia n°: 795, una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 807, una secuencia HVR-H3 del identifícador de secuencia n°: 819, una secuencia de la HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79, una secuencia de la HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 777.
39. El anticuerpo de la reivindicación 9, que comprende una secuencia HVR-H1 del identifícador de secuencia n°: 701 , una secuencia HVR-H2 del identifícador de secuencia n°: 712, una secuencia HVR-H3 del identifícador de secuencia n°: 723 y una secuencia HVR-L1 del identifícador de secuencia n°: 79 y una secuencia HVR-L2 del identifícador de secuencia n°: 80 y una secuencia HVR-L3 del identifícador de secuencia n°: 734.
40. Un anticuerpo aislado que se une al mismo determinante antigéncio sobre la poliubiquitina que el anticuerpo de cualquiera de los anticuerpos mencionados en las reivindicaciones 1 a 39, en el que el anticuerpo no se une específicamente a monoubiquitina.
41. Un anticuerpo aislado que compite con cualquiera de los anticuerpos mencionados en las reivindicaciones 1 a 39 para la unión a poliubiquitina, en el que el anticuuerpo no se une específicamente a monoubiquitina
42. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína poliubiquitinada.
43. El anticuerpo de la reivindicación 42, en la que el anticuerpo inhibe la degradación de la proteína poliubiquitinada.
44. El anticuerpo de la reivindicación 42, en la que el anticuerpo modula al menos una vía de señalización mediada por poliubiquitina.
45. El anticuerpo de la reivindicación 42, en la que el anticuerpo inhibe al menos una vía de señalización mediada por poliubiquitina.
46. El anticuerpo de la reivindicación 42, en la que el anticuerpo estimula al menos una vía de señalización mediada por poliubiquitina.
47. Una molécula de ácido nucléico que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39.
48. Un vector que comprende el ácido nucléico de la reivindicación 47.
49. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 48.
50. Una estirpe celular capaz de producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39.
51. Un método de producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, que comprende el cultivo de un anfitrión celular que comprenda una molécula de ácido nucléico que codifique el anticuerpo en condiciones en las que el anticuerpo se produce.
52. Una composición que contiene una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
53. Un método de identificar la presencia de poliubiquitina o de una proteína poliubiquitinada en una muestra, que suponga poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39.
54. Un método para el tratamiento de un enfermedad o proceso asociado a la desregulación de la poliubiquitina en un paciente y el método incluye la administración al paciente de una cantidad eficaz de al menos uno de los anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39.
55. El método de la reivindicación 54 en el que el paciente es un mamífero.
56. El método de la reivindicación 55 en el que el paciente es humano.
57. El método de la reivindicación 54, en el que la enfermedad se selecciona entre cáncer, un trastorno muscular, un trastorno genético relacionado con la vía de la ubiquitina, una enfermedad inflamatoria/inmunitaria y un trastorno neurológico.
58. El método de la reivindicación 57, en el que la enfermedad se selecciona entre carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, distrofia muscular, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, fibrosis quística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pick y enfermedad de Paget.
59. Un método para determinar la presencia de una poliubiquitina o de una proteína poliubiquitinada en una muestra que se cree que contiene una poliubiquitina o una proteína poliubiquitinada, que comprende la exposición de la muestra a al menos uno de los anticuerpos de las reivindicaciones 1 a 39 y la determinación de la unión a al menos uno de los anticuerpos a una poliubiquitina o proteína poliubiquitinada en la muestra.
60. Un método de separación de la proteína poliubiquitinada de una proteína no poliubiquitinada en una muestra, que suponga poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39.
61. Un método para determinar la función y/o actividad de una poliubiquitina en una célula, lo que comprende el contacto de la célula con al menos uno de los anticuerpos de las reivindicaciones 1 a 39 y la evaluación del efecto de dicho paso de contacto en la célula.
62. Un método para determinar la función y/o actividad de una poliubiquitina en una muestra, lo que comprende el contacto de la muestra con al menos uno de los anticuerpos de las reivindicaciones 1 a 39 y la evaluación del efecto de dicho paso de contacto en la muestra. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una primera poliubiquitina que comprende al menos un enlace isopéptidico a un primer residuo de lisina en una primera posición aminoacídica de una molécula de ubiquitina, en la cual el anticuerpo no se une específicamente a una segunda poliubiquitina que comprenda al menos un enlace isopéptidico a un segundo residuo de lisina en una segunda posición aminoacídica de una molécula de ubiquitina y en la cual difieren la primera y la segunda posiciones aminoacídicas.
63. El anticuerpo aislado de la reivindicación 21 , en la que el anticuerpo se une a un epítopo en la poliubiquitina enlazada a lisina 63.
64. El anticuerpo aislado de la reivindicación 63, en el que el epítopo incluye residuos tanto en una primera subunidad con ubiquitina como en una segunda subunidad con ubiquitina de la poliubiquitina enlazada a lisina 63.
65. El anticuerpo aislado de la reivindicación 64, en el que el epítopo incluye al menos un residuo en una primera subunidad de ubiquitina seleccionada entre Glu-18, Pro-19, Ser-20, Asp-21, Thr-55, Leu-56, Ser-57, Asp-58, Asn-60, Ile-61 y Gln-62.
66. El anticuerpo aislado de la reivindicación 64, en el que el epítopo incluye al menos un residuo en una primera subunidad de ubiquitina seleccionada entre Leu-8, Thr-9, Glu-34, Gly-35, Ile-36, Pro-37, Asp-39, Gln-40, Leu-71, Arg-72, Leu-73, Arg-74 y Gly-75.
67. El anticuerpo aislado de la reivindicación 64, en el que el epítopo incluye al menos un residuo en una primera subunidad de ubiquitina seleccionada entre Glu-18, Pro-19, Ser-20, Asp-21 , Thr-55, Leu-56, Ser-57, Asp-58, Asn-60, Ile-61 y Gln-62, y al menos un residuo en una segunda subunidad de ubiqutina seleccionada entre Leu-8, Thr-9, Glu-34, Gly-35, lle-36, Pro-37, Asp-39, Gln-40, Leu-71 , Arg-72, Leu-73, Arg-74 y Gly-75.
68. Un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo de cualquiera de las reclamaciones 1-39 o 63-67.