MX2008000884A - Anticuerpos anti-cd26 y metodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD26 novedoso y otros polipéptidos relacionados, asícomo polinucleótidos novedosos que codifican para los anticuerpos y polipéptidos. La invención también proporciona métodos para producir los anticuerpos y polipéptidos. Se proporcionan además composiciones y células que comprenden los anticuerpos o polipéptidos. También se proporcionan métodos de uso de los anticuerpos y/o polipéptidos, como para inhibir la proliferación celular y en el tratamiento contra afecciones asociadas con el CD26.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CD26 Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención se relaciona de manera general con anticuerpos anti-CD26 y otros polipéptidos, y en particular, con anticuerpos anti-CD26 humanizados, así como con métodos de uso de los anticuerpos y otros polipéptidos para el tratamiento contra enfermedades asociadas con la expresión de CD26.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El CD26 es una glicoproteína de la superficie celular de 110 kDa ampliamente distribuida. El CD26 fue inicialmente definido como un antígeno de activación de células T (Fox et al. (1984) J. Immunol . 133, 1250-1256, Fleischer (1987) J. Immunol. 138, 1346-1350, y Morimoto et al. (1989) J. Immunol. 143, 3430-3439). Esta molécula ha mostrado tener la actividad dipeptidil peptidasa IV (DPPIV; EC3.4.14.5) en su dominio extracelular, y una amplia distribución tisular (Hegen et al. (1990) J. Im unol. 144, 2908-2914 y Ulmer et al. (1990) J. Im unol. 31, 429-435). El CD26 tiene funciones múltiples en la fisiología de las células T humanas. Por ejemplo, las evidencias sugieren que el CD26 puede liberar una señal coestimuladora para la activación de células T (Morimoto et al. (1994) Immunologist Ref: 189385 Ha sido producido un anticuerpo monoclonal de ratón contra el CD26 el cual es conocido como anticuerpo 1F7. (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,120,642, Publicación PCT No. WO 91/07985 (Schlossman et al.), y Morimoto et al. (1989) J. Immunology, 143:3430-3439). El anticuerpo 1F7 fue identificado por unirse a un antígeno comprendido de una glicoproteína con un peso molecular de 110,000 daltons sobre linfocitos CD4 y CD8 humanos y posteriormente identificado como CD26, el cual estaba presente sobre células inductoras auxiliares pero no células inductoras supresoras. De este modo, el anticuerpo monoclonal 1F7 ha sido reportado como capaz de distinguir entre células inductoras auxiliares e inductoras supresoras en poblaciones de linfocitos CD4 humanos. Además, el anticuerpo 1F7 y otros anticuerpos monoclonales anti-CD26 han sido propuestos como útiles en el tratamiento contra algunas enfermedades asociadas con células que expresan CD26, como algunos cánceres. (Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Estadounidense No. 2003/0031665 y la Publicación PCT No. WO 02/092127 (Nam Hoang Dang et al.).) La unión del anticuerpo monoclonal anti-CD26 1F7 a CD26 condujo reportes a una interrupción del ciclo celular en el punto Gl/S, y el acoplamiento de CD26 indujo una interrupción de Gl sobre transfectantes de Jurkat CD26 a través de un aumento de la expresión de la proteína reguladora del ciclo celular p21. También se ha reportado que el tratamiento con anticuerpo 1F7 inhibe la formación de tumor CD26+ y mejora la sobrevivencia en un modelo de ratón (Ho et al. (2001) Clinical Cáncer Research, 7:2031-2040). Otros anticuerpos monoclonales murinos anti-CD26 que han sido identificados incluyen anticuerpos anti-CD26 E19 y E26. (Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,573,096, Publicación de Patente Estadounidense No. 2002/0132979, Publicación de Patente Estadounidense No. 2002/0132979, Publicación de Patente Estadounidense No. 2004/0115202, Publicación PCT No. WO 01/74299 (Chen et al.), y Ghersi et al. (2002) J. Biological Chemistry, 32:29231-29241) . Se ha reportado que esos anticuerpos exhiben efectos inhibidores sobre la migración celular de fibroblastos y células de una monocapa, y efectos inhibidores sobre la formación de tubos de vasos sanguíneos, y efecto inhibidor sobre la invasión y formación de brotes capilares de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas. Se ha propuesto el uso de anticuerpos en tratamientos para inhibir la invasión por cáncer y angiogénesis. Otro anticuerpo monoclonal anti-CD26 de ratón que ha sido generado es el 14D10 (también referido aquí como CM03) . (Véase, por ejemplo, Dong et al. (1998) Mol Immunol . 35(1): 13-21 y Publicación de Patente Estadounidense No. 2003/0031665.) La modificación de la actividad del CD26 probaría ser útil en el tratamiento a base de una variedad de alimentos. Los anticuerpos monoclonales anti-CD26 son medios para modificar el efecto de CD26. Los anticuerpos monoclonales murinos han sido ensayados en terapia humana. Sin embargo, cuando los anticuerpos murinos son usados terapéuticamente en humanos, se desarrolla una respuesta del anticuerpo anti-murino humano ("HAMA") en un número significativo de individuos tratados. En la respuesta HAMA, los sujetos tratados desarrollan anticuerpos contra anticuerpos de ratón. Esto no únicamente limita la efectividad de la terapia con anticuerpo monoclonal murino, sino que también conduce a reacciones alérgicas las cuales pueden dar como resultado anafilaxis. Además, aún los anticuerpos quiméricos que comprenden regiones Fc y regiones Fv de ratón pueden activar potencialmente respuestas HAMA. Para minimizar la respuesta HAMA, algunos investigadores han tratado de producir anticuerpos que no sean reconocidos como extraños por el sistema inmune humano. Un método usado es la "humanización" de anticuerpos. Esos anticuerpos humanizados pueden contener secuencias las cuales son sustancialmente de origen humano pero que también contienen generalmente algunos residuos de la región determinante de la complementariedad ("CDR") y/o residuos de la región estructural que se originan de una especie diferente, como especies de roedores, o que son puramente artificiales. Una variedad de diferentes formas para humanizar los anticuerpos es conocida en la técnica. Una forma de humanización es "injertando" regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") murinas específicas del antígeno sobre la estructura de una molécula de inmunoglobulina humana. Otro nivel de humanización puede incluir la modificación genética de CDR murinas u otras secuencias de región variable para ser "más humana", reduciendo por lo tanto la respuesta HAMA. Por ejemplo, otra forma de humanización es injertando las regiones de cadena variable pesada y ligera de una especie, como el ratón, sobre regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas y entonces reemplazar los residuos individuales en la región estructural ("FR") y/o regiones determinantes de la complementariedad con residuos derivados de anticuerpos humanos y/o residuos diseñados para hacer disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo en humanos. Todas las técnicas pueden incluir una modificación genética adicional de las secuencias del anticuerpo para incrementar la efectividad de la unión al efecto biológico del anticuerpo. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, sitios en la Internet y números de acceso/secuencias de bases de datos (incluyendo las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos) citadas aquí se incorporan por lo tanto como referencia en su totalidad para todos los propósitos en el mismo grado en que si cada publicación, patente, solicitud de patente, sitio en Internet o número de acceso/secuencia de base de datos individual fuera indicada específica e individualmente, incorporada como referencia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polipéptidos novedosos como anticuerpos anti-CD26, fragmentos de anticuerpos anti-CD26, y otros polipéptidos relacionados con los anticuerpos anti-CD26. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD26 son anticuerpos anti-CD26 humanizados. Los polinucleótidos que comprenden las secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos también son proporcionados. También se proporcionan vectores y células del anfitrión que comprenden los polinucleótidos. Las composiciones, como las composiciones farmacéuticas, que comprenden los polipéptidos de la invención también se proporcionan. También se proporcionan métodos para producir los polipéptidos. Además, se proporcionan métodos de uso de los polipéptidos o composiciones que comprenden los polipéptidos para inhibir la proliferación de las células que expresan CD26 o en tratamiento o diagnóstico de las afecciones asociadas con la expresión de CD26. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) un CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia GX?X2LX3TYGVH (SEQ ID NO: 31), donde Xi es F o Y, X2 es S o T, y X3 es T, N, o S; (b) un CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia VIWGX?GRTDYDX2X3FMS (SEQ ID NO: 32), donde Xi es G o D, X2 es A o S, y X3 es A o S; y/o (c) un CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia XiRHDWFDY (SEQ ID NO: 33), donde Xi es N o S. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) un CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia Xi ASQX2IRNX3LN (SEQ ID NO:34), donde Xi es S o R, X2 es G o D, y X3 es S o N; (b) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia YSSNLX?X2 (SEQ ID NO: 35), donde Xi es H o Q y X2 es S o T; y/o (c) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQSX?KLPX2T (SEQ ID NO: 36), donde Xi es I o N y X2 es F o L. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende: (a) uno o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de (i) un CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia GX]X2LX3TYGVH (SEQ ID NO:31), donde Xi es F o Y, X2 es S o T, y X3 es T, N, o S, (ii) un CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia VIWGX?GRTDYDX2X3FMS (SEQ ID NO:32), donde Xi es G o D, X2 es A o S, y X3 es A o S, y (iii) un CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia XiRHDWFDY (SEQ ID NO: 33), donde Xi es N 0 S; y/o (b) uno o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de (i) un CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia X?ASQX2IRNX3LN (SEQ ID NO:34), donde Xx es S o R, X2 es G o D, y X3 es S o N, (ii) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia YSSNLX?X2 (SEQ ID NO:35), donde Xi es H o Q y X2 es S o T, y (iii) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQSXXKLPX2T (SEQ ID NO:36), donde Xi es 1 o N y X2 es F o L. En un aspecto más, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende: (a) uno o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR de cadena pesada que tienen cada uno al menos aproximadamente 80% de identidad con un CDR seleccionado del grupo que consiste de (i) un CDRl de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 55), GFSLSTYGVH (SEQ ID NO: 56), y GYSLTTYGVH (SEQ ID NO:57), (ii) un CDR2 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO: 58) y VIWGDGRTDYDSSFMS (SEQ ID NO: 59), y (iii) una secuencia de CDR3 de cadena pesada NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60); y/o (b) uno o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR de cadena ligera que tienen cada uno al menos aproximadamente 80% de identidad cuando un CDR es seleccionado del grupo que consiste de (i) un CDRl de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de RASQDIRNNLN (SEQ ID NO: 61), RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), y SASQDIRNSLN (SEQ ID NO: 63), (ii) un CDR2 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de YSSNLHS (SEQ ID NO: 64), YSSNLQS (SEQ ID NO: 65) y YSSNLHT (SEQ ID NO: 66), y (iii) un CDR3 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de QQSIKLPLT (SEQ ID NO: 67), QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68), y QQSNKLPLT (SEQ ID NO: 69). En otro aspecto más, la invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) una FR1 de cadena pesada que comprende la secuencia EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS (SEQ ID NO: 37), donde Xi es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, y Xg es T o K; (b) una FR2 de cadena pesada que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWXiG (SEQ ID NO:38), donde Xi es V o M; (c) una FR3 de cadena pesada que comprende la secuencia RVTISX?DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R (SEQ ID NO: 39), donde Xj. es K o R, X2 es N o T, X3 es S o N, X4 es V o A, X5 es M o L, y X? es V, M, o T; y/o (d) una FR4 de cadena pesada que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40). En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En un aspecto más, la invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) una FR1 de cadena ligera que comprende la secuencia X1IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C (SEQ ID NO: 41), donde Xi es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E, X8 es V o A, y X9 es T o S; (b) una FR2 de cadena ligera que comprenden la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 42); (c) una FR3 de cadena ligera que comprende la secuencia GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC (SEQ ID NO: 43), donde Xi es S, D, o A, X2 es E o Q, X3 es P o A, X4 es F o V, y X5 es T, A, o í; y/o (d) una FR4 de cadena ligera que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44). En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende: (a) uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) regiones estructurales de cadena pesada seleccionados del grupo que consiste de (i) una FR1 de cadena pesada que comprende la secuencia EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS (SEQ ID NO:37), donde Xi es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, y X9 es T o K; (ii) una FR2 de cadena pesada que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWXiG (SEQ ID NO:38), donde X? es V o M, (iii) una FR3 de cadena pesada que comprende la secuencia RVTISX1DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R (SEQ ID NO: 39), donde Xi es K o R, X2 es N o T, X3 es S o N, X4 es V o A, X5 es M o L, y X6 es V, M, o T, y (iv) una FR4 de cadena pesada que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:40); y/o (b) uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) regiones estructurales de cadena ligera seleccionados del grupo que consiste de (i) una FR1 de cadena ligera que comprende la secuencia X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RXsTIX9C (SEQ ID N0:41), donde Xi es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E, X8 es V o A, y X9 es T o S, (ii) una FR2 de cadena ligera que comprende la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 42), (iii) una FR3 de cadena ligera que comprende la secuencia GVPX?RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC (SEQ ID NO: 43), donde Xx es S, D, o A, X2 es E o Q3 X3 es P o A, X es F o V, y X5 es T, A, o í, y (iv) una FR4 de cadena ligera que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44). En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende uno o más de CDR de cadena pesada descritos aquí y/o uno o más FR de cadena pesada descritos aquí (por ejemplo, anteriormente o en otra parte aquí, como en las Figuras 3 y 5). En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada que comprende uno o más de CDR de cadena pesada, descritos aquí y/o uno o más FR de cadena pesada, descritos aquí. Además, la invención también proporciona un polipéptido que comprende uno o más CDR de cadena ligera descritos aquí y/o uno o más FR de cadena ligera descritos aquí. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende uno o más CDR de cadena ligera descritos aquí y/o uno o más FR de cadena ligera descritos aquí. En algunas modalidades, el polipéptido comprende los siguiente: (1) uno o más CDR de cadena pesada descritos aquí y/o uno o más FR de cadena pesada descritos aquí; y (2) uno o más CDR de cadena ligera descritos aquí y/o uno o más FR de cadena ligera descritos aquí. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende uno o más CDR de cadena pesada descritos aquí y/o una región variable de cadena ligera que comprende uno o más CDR de cadena ligera descritos aquí. La invención proporciona además una región variable de cadena pesada que comprende uno o más de los CDR de cadena pesada, descritos aquí y/o uno o más FR de cadena pesada, descritos aquí. Además, la invención también proporciona una región variable de cadena ligera que comprende uno o más CDR de cadena ligera descritos aquí y/o uno o más FR de cadena ligera descritos aquí. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos EVQLVX?SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLXsCX9ASGX?oX??LX?2TYGVHWVRQA PGKGLEWX?3GVIWGX?4GRTDYDX?5X?6FMSRVTISX?7DX?8SKX?9TX20YLQX2?NSLRAED TAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:29), donde Xi es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S5 X9 es T o K, X?0 es F o Y, Xn es S o T, Xi2 es T, N, o S, Xi3 es V o M, Xi4 es G o D, Xi5 es A o S, Xie es A o S, Xi7 es K o R, X18 es N o T, Xi9 es S o N3 X2o es V o A, X2i es M o L, X22 es V, M, o T, y X23 es N o S. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX?oASQX??IRNX?2LNWYQQKP GQAPRLLIYYSSNLX?3Xi4GVPX?5RFSGSGSGTDFTLTISRLX?6Xi7EDX?8AX?9YYCQQSX 20KLPX2?TFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 30), donde Xx es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E, X8 es V o A, X9 es T o S, X10 es S o R, Xn es G o D, Xi2 es S o N, X13 es H o Q, Xi4 es S o T, X15 es S, D, o A, Xi6 es E o Q, X17 es P o A, X?8 es F o V, X19 es T, A, o I, X20 es I o N y X2? es F o L. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además la secuencia de aminoácidos EVQLVX?SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX?oX??LXI2TYGVHWVRQA PGKGLEWX?3GVIWGX?4GRTDYDX?5Xi6FMSRVTISXi7DX?8SKX?9TX2oYLQX2?NSLRAED TAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:29) , donde X? es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, X9 es T o K, X10 es F o Y, Xn es S o T, Xi2 es T, N, o S, X13 es V o M, X14 es G o D, XX5 es A o S, Xi6 es A o S, Xi7 es K o R, Xi8 es N o T, X19 es S o N, X20 es V o A, X21 es M o L, X22 es V, M, o T, y X23 es N o S. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que es una forma humanizada del anticuerpo murino 14D10.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de YSLR WISDHEYLY (SEQID NO: 45; péptido 6), LEYNYVKQWRHSY (SEQ ID NO: 46; péptido 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 7; péptido 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48; péptido 84), RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 49; péptido 132), YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO: 50; péptido 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO: 51; péptido 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52; péptido 29), SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO:53; péptido 30), y IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO:54; péptido 63). En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido, que comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21 o fragmentos de una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21, y/o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de SEQID NOS: 22-28 o con un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de la SEQ ID NOS: 22-28. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido, que comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21, y/o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQID NOS: 22-28. En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 3: X376, X377, X378, X379, X380, X381, y X394 (SEQ ID NOS:15-21, respectivamente). En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 5: X384, X385, X386, X387, X388, X399, y X420 (SEQ ID NOS:22-28, respectivamente). En otro aspecto más, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de cada una de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 3 o la Figura 5: X376, X377, X378, X379, X380, X381, X394, X384, X385, X386, X387, X388, X399, y X420 (SEQ ID NOS:15-28). En otro aspecto más, la invención proporciona un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que comprende la SEQ ID NO: 217, o un fragmento o variante de la misma. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que comprende la SEQ ID NO: 218, o un fragmento o variante de la misma. En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido no es un anticuerpo policlonal murino. En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido no es un anticuerpo monoclonal de ratón. En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido no es un anticuerpo monoclonal murino 14D10. En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido no comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDA AFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 90) . En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como de los aspectos descritos aquí, el polipéptido no comprende una región variable de cadena ligera de la secuencia • DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPS RFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 91) . En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido no comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDA AFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 90) y una región variable de cadena ligera de la secuencia DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYS SNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 91) . En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido no es el anticuerpo monoclonal de ratón 1F7. En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, el polipéptido tiene una o más de las siguientes características: se une a CD26; modula la actividad de CD26, produce la interrupción del ciclo celular de células CD26+ en el punto Gl/S; inhibe la proliferación de las células que expresan CD26, y/o es útil en el tratamiento contra una afección (como una enfermedad o trastorno) asociada con la expresión de CD26. En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido se une a CD26. También se proporcionan los métodos para producir cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para producir los anticuerpos descritos aquí, que comprenden expresar uno o más polinucleótidos en una célula anfitriona, donde cada cadena del anticuerpo es codificada por al menos uno de los polinucleótidos . La invención proporciona además kits que comprenden cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente. La invención proporciona además composiciones, como composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente, así como otros polipéptidos descritos aquí. De igual modo se proporciona el uso de cada uno de esos polipéptidos en la elaboración de una composición farmacéutica o medicamento. Las composiciones pueden ser usadas en cualquiera de los métodos descritos aquí. La invención proporciona métodos para inhibir la proliferación de una célula que expresa CD26, que comprende poner en contacto la célula con un polipéptido descrito aquí (típicamente con una cantidad del polipéptido efectiva para efectuar la inhibición deseada) . Además, la invención proporciona métodos para tratar una afección asociada con la expresión de CD26 en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un polipéptido descrito aquí al sujeto. Las composiciones descritas aquí pueden ser usadas en el tratamiento contra una variedad de enfermedades o afecciones, como la enfermedad injerto contra anfitrión, enfermedad autoinmune, o cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es una enfermedad maligna hematológica . En algunas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. La invención también proporciona el uso de las composiciones descritas aquí para inhibir el progreso de un cáncer CD26+, inhibir el crecimiento de tumores que expresen CD26, inducir la regresión de un tumor que exprese CD26, y/o inhibir la metástasis de células cancerígenas que expresen CD26. En algunos aspectos, la invención proporciona polinucleótidos que codifican para los polipéptidos descritos aquí. En algunos aspectos, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de cada una de las secuencias mostradas en la Figura 2 y la Figura 4 (SEQ ID NOS: 1-14). En aspectos adicionales, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente 80% idéntica a un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de cada una de las secuencias mostradas en la Figura 2 y la Figura 4 (SEQ ID NOS: 1-14). En otros aspectos, la invención proporciona además un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de cada una de las siguientes secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 3 y la Figura 5: X376, X377, X378, X379, X380, X381, X394, X384, X385, X386, X387, X388, X399, y X420 (SEQ ID NOS: 15-28). También se proporcionan vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente. En algunas modalidades, los polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) de la invención no incluyen las exclusiones descritas aquí. Con respecto a las secuencias de la presente, las cuales comprenden aminoácidos sustituyentes, como es evidente para el experto en la técnica, cada aminoácido sustituyente puede ser seleccionado independientemente. La invención también proporciona secuencias que comprenden aminoácidos sustituyentes en los cuales uno o más de los aminoácidos sustituyentes son eliminados. Donde los aspectos o modalidades de la invención son descritos en términos de un grupo de Markush u otro agrupamiento de alternativas, la presente invención abarca no únicamente todo el grupo listado como un todo, sino a cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, pero también uno o más de los miembros del grupo ausentes en el grupo principal. La presente invención también contempla la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo de la invención reclamada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de VH de CM03 (SEQ ID NO: 90) y VL de CM03 (SEQ ID NO: 91). La Figura 2 muestra las secuencias de ADN de variantes de VL humanizadas X376 (SEQ ID NO: 1), X377 (SEQ ID NO:2), X378 (SEQ ID NO:3), X379 (SEQ ID NO:4), X380 (SEQ ID NO:5), X381 (SEQ ID NO:6), y X394 (SEQ ID NO:7). La Figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de CM03 VL (SEQ ID NO: 91) y variantes de VL humanizadas X376 (SEQ ID NO:15), X377 (SEQ ID NO:16), X378 (SEQ ID NO:17), X379 (SEQ ID NO:18), X380 (SEQ ID NO:19), X381 (SEQ ID NO:20), y X394 (SEQ ID NO:21). Los esquemas de numeración de Kabat y secuenciales son idénticos para las regiones variables de cadena ligera. La Figura 4 muestra las secuencias de ADN para variantes de VH humanizadas X384 (SEQ ID N0:8), X385 (SEQ ID N0:9), X386 (SEQ ID NO: 10), X387 (SEQ ID NO:ll) y X388 (SEQ ID NO: ID NO: 12), X399 (SEQ ID NO:13) y X420 (SEQ ID NO:14). La Figura 5 muestra las secuencias de aminoácidos de CM03 VH (SEQ ID NO: 90) y variantes de VH humanizadas X384 (SEQ ID NO:22), X385 (SEQ ID NO:23), X386 (SEQ ID NO:24), X387 (SEQ ID NO:25) y X388 (SEQ ID NO:26), X399 (SEQ ID NO:27) y X420 (SEQ ID NO:28). Se muestran ambos esquemas de numeración secuencial y de Kabat. El esquema de numeración de Kabat incluye 82a, 82b, y 82c. La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de VH y VL de. Fabs que comprenden la variante de VH y variante de VL seleccionadas: X389, X390, X391, X392, X393, X394, X395, X396, X399, X420, y X429. El Fab X389 comprende X384 VH (SEQ ID NO:22) y X376 VL (SEQ ID NO: 15), el Fab X390 comprende X385 VH (SEQ ID NO:23) y X376 VL (SEQ ID NO: 15), el Fab X391 comprende X388 VH (SEQ ID NO:26) y X376 VL (SEQ ID NO: 15), el Fab X392 comprende X384 VH (SEQ ID NO:22) y X379 VL (SEQ ID NO: 18), el Fab X393 comprende X385 VH (SEQ ID NO:23) y X379 VL (SEQ ID NO: 18), el Fab X394 comprende X384 VH (SEQ ID NO:22) y X394 VL (SEQ ID NO:21), el Fab X395 comprende X384 VH (SEQ ID NO:22) y X380 VL (SEQ ID NO: 19), el Fab X396 comprende X385 VH (SEQ ID NO: 23) y X380 VL (SEQ ID NO: 19), el Fab X399 comprende X399 VH (SEQ ID NO:27) y X380 VL (SEQ ID NO: 19), el Fab X420 comprende X420 VH (SEQ ID NO:28) y X380 VL (SEQ ID NO: 19), y el Fab X429 comprende X399 VH (SEQ ID NO:27) y X394 VL (SEQ ID NO:21). La Figura 7 muestra un gel cargado con muestras de proteínas que contienen Fabs que comprenden variantes de CM03 VL X376, X377, X378, X379, X380, o X381 apareadas con CM03 VH, así como Fabs que comprenden variantes de CM03 VH X384, X385, X386, apareadas con CM03 VL, expresadas en E . coli cepa TG1. La Figura 8 muestra una representación cuantitativa de acumulación de proteína que contiene Fabs que comprenden variantes de CM03 VL X376, X377, X378, X379, X380, o X381 apareadas con CM03 VH, así como el Fab X369 (que comprende CM03 VH y CM03 VL) , expresada en E. coli . La Figura 9 muestra un gel cargado con muestras de proteína que contienen Fabs que comprenden variantes de CM03 VH X387 o X388 apareadas con CM03 VL, expresadas en E . coli cepa TG1, así como el Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396 (que comprende pares de variantes de VH y VL) expresadas en E. coli cepa HB2151. La Figura 10 muestra una representación cuantitativa de la acumulación del Fab del CM03 X369 y los siguientes Fab que comprenden pares de variantes de VH y VL de CM03, expresadas en E . coli cepa HB2151: X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396. La Figura 11 muestra una representación cuantitativa de la acumulación de Fab que comprende una variante de VH de CM03 X384, X385, X386, X387 o X388 apareada con VL de CM03 en E . coli . La Figura 12A muestra el Fab X369 de CM03 unido al CD26 humano y la respuesta después de la introducción de X369 adicional . La Figura 12B muestra el Fab X369 de CM03 unido al CD26 humano y la respuesta después de la introducción de un Fab que comprende VL de X377 y VH de CM03. La Figura 12C muestra la unión del Fab X377 a CD26 humano y la unión del Fab X377 al CD26 humano al cual previamente se había unido el Fab X369 de CM03. La Figura 13 muestra un análisis de afinidad de CM03 X369 y los siguientes Fabs que comprenden variantes de VH y variantes de VL de CM03: X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396. La Figura 14 muestra Fab X369 de CM03 y Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396 de CM03 que compiten con el AcM murino de ascitos CM03 (14D10) no purificado para unirse al CD26 humano. La Figura 15 muestra el por ciento de inhibición de la proliferación de células JKT/CD26+ por Fab X369 de CM03 y Fabs que comprenden pares de variantes de VH/VL (X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396) , así como un Fab que comprende la variante X376 y VH de CM03.

La Figura 16 muestra un diagrama de un anticuerpo IgGl que incluye la interacción cadena-cadena de IgGl. La secuencia de la bisagra indicada de la SEQ ID NO: 86. La Figura 17A muestra una cadena pesada ejemplar ligada a una secuencia líder. Se muestra la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera (IgGl humana) (SEQ ID NO:87) . La Figura 17B muestra una cadena pesada ejemplar ligada a una secuencia líder. Se muestra la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera (kappa humana) (SEQ ID NO: 88) . La Figura 18 muestra anticuerpos monoclonales humanizados recombinantes (AcMrhu) 409, 410, 411, y 412 expresados en células HEK, y AcMrhu 411 expresado en células CHO. La Figura 19 muestra AcMrhu 409, 410, 411, y 412 uniéndose específicamente al CD26 humano. La Figura 20 muestra datos de ELISA que muestran la unión de CD26 por variantes de AcMrhu. La Figura 21 muestra el efecto de 2.5 µg/ml de AcMrhu 409 y 410 sobre células JKT/CD26+ a las 48 horas. La Figura 22 muestra el efecto de 0.05, 0.1, 0.5, 2.5, y 5 µg/ml de AcMrhu 411 sobre células JKT/CD26+ a las 48 horas . Las Figuras 23A y 23B muestran datos de MTT (% de inhibición) de AcMrhu 409, 410, 411, 412, 420 y 429 producidos en células HEK293. La Figura 24 muestra péptidos 13 mérico reactivos con anticuerpos AcMrhu 409, 411, 412 y 420 humanizados. La Figura 25 muestra un diagrama de listón de la estructura cristalina de CD26-1J2E humano. Los péptidos más reactivos en experimentos del trazo del mapa del epítope con AcMrhu 409 son de color más claro. La Figura 26 muestra un diagrama de listón de la estructura cristalina de CD26-1J2E humano. Los péptidos más reactivos en experimentos del trazo del mapa del epítope con AcMrhu 411 son de color más claro. La Figura 27 muestra un diagrama de listón de la estructura cristalina de CD26-1J2E humano. Los péptidos más reactivos en experimentos del trazo del mapa del epítope con AcMrhu 412 son de color más claro. La Figura 28 muestra un diagrama de listón de la estructura cristalina de CD26-1J2E humano. Los péptidos más reactivos en experimentos del trazo del mapa del epítope con AcMrhu 420 son de color más claro. La Figura 29 muestra que el tratamiento con AcMrhu 411 induce la regresión tumoral en Karpas299 (linfoma de células T) en un modelo de xenoinjerto de ratón. Los datos representan los valores de la media ± DEM de 10 animales. La Figura 30 muestra que el tratamiento con AcMrhu 411 retrasa significativamente el crecimiento del tumor 786-0 (carcinoma de riñon) en un modelo de xenoinjerto de ratón. Los datos representan los valores de la media ± DEM de 10 animales . La Figura 31 muestra que el tratamiento con AcMrhu 411 reduce el crecimiento del tumor del xenoinjerto Caki-2 (carcinoma de riñon) en una forma dependiente de la dosis.

Los datos representan los valores de la media ± DEM de 10 animales . La Figura 32 muestra el tratamiento con AcMrhu 411 reduce el crecimiento del tumor del xenoinjerto Caki-2 (carcinoma de riñon) con mayor eficacia usando terapia combinada. Los datos representan los valores de la media ± DEM de 10 animales. La figura 33 muestra que el tratamiento con Acmrhu 411 reduce el crecimiento del tumor de xenoinjerto PC-3 (carcinoma de próstata) en ratón SCID. Los datos representan los valores de la media ± DEM de 10 animales. La figura 34 muestra que el Acmrhu 411 reduce el crecimiento del tumor PC-3 con mayor eficacia usando terapia combinada. La figura 35 muestra que el tratamiento con Acmrhu 411 retrasa el crecimiento del tumor DU-145 (carcinoma de próstata) en el modelo de xenoinjerto del ratón. Los datos representan los valores de la media ± DEM de 10 animales. La figura 36 muestra que el tratamiento con Acm rhu 411 se atenúa significativamente la metástasis de pulmón inducida por H226 (carcinoma de pulmón) en ratones de nudo NCR. La línea en cada grupo representa el valor medio. La figura 37 muestra el nivel y porcentaje de expresión en la superficie celular de CD26 en varias líneas celulares de cáncer. La figura 38 muestra el clon de vector genético doble pY392/DGV/YsCHl-3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una variedad de polipéptidos novedosos incluyendo aquéllos que comprenden uno o más CDR o FR de un anticuerpo anti-CD26 que comprende una región variable de cadena pesada o región variable de cadena ligera (o fragmento de la misma) de un anticuerpo anti-CD26. En algunas modalidades, los polipéptidos se unen a CD26. En particular, se proporciona una variedad de anticuerpos anti-CD26 novedosos, que incluye, pero no se limita a, anticuerpos anti-CD26 humanizados. También se proporcionan composiciones, como composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos. También se proporcionan los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos y vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos. También se proporcionan métodos para producir y usar los polipéptidos. En algunos casos, los polipéptidos de la invención son útiles como intermediarios para producir, por ejemplo, polipéptidos (como anticuerpos) que se unen a CD26. Debe comprenderse que cuando las modalidades sean descritas aquí con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan modalidades en otras circunstancias análogas descritas en términos "consiste de" y/o "consiste esencialmente de".

Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Esas técnicas son explicadas más completamente en la literatura, como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (Rl. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) ; Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a un blanco, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa aquí, el término abarca no únicamente anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , cadenas individuales (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción del anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, como IgG, IgA, o IgM (o subclase de los mismos), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de esas pueden ser divididas además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamados alfa, delta, epsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las estructuras de la subunidad y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de las inmunoglobulinas son bien conocidas. Como se usa aquí, "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, y que los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, las cuales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que es obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe constituirse en un requisito de producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser producidos por métodos de ADN recombinante como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,816,567. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser aislados de bibliotecas de fagos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, por ejemplo. Como se usa aquí, anticuerpos "humanizados" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murino) que son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab1, F(ab')2 o las subsecuencias de la unión de antígeno de los anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Algunos anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en la cual los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) como ratón, rata, o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, los residuos de la región estructural Fv (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Algunos anticuerpos humanizados comprenden al menos uno, y típicamente dos, dominios variables que se derivan generalmente de una especie no humana (anticuerpo donador) como un ratón, rata, o conejo que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas, pero en los cuales uno o más de los residuos de la región estructural Fv y/o uno o más de los residuos CDR de Fv han sido reemplazados por un residuo humano correspondiente (es decir, un residuo derivado de una secuencia de anticuerpo humano) . De manera más típica, al menos una pluralidad de residuos de la región estructural Fv tendrán que ser reemplazados en uno o más de los dominios variables del anticuerpo humanizado. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o estructurales importadas, pero que se incluyen para refinar y optimizar aún más el funcionamiento del anticuerpo. Algunos anticuerpos humanizados comprenderán sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los CDR corresponden a aquéllos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son aquéllas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Algunos anticuerpos humanizados comprenderán sustancialmente todos de al menos uno, típicamente dos, dominios variables, en los cuales la mayoría de los aminoácidos residuales de los CDR corresponden a aquéllos de una inmunoglobulina no humana y uno o más de los aminoácidos residuales de las FR son aquéllos de la secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo humanizado, de manera óptima, también comprenderá al menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente de una inmunoglobulina humana. Algunos anticuerpos humanizados tienen regiones Fc modificadas como se describe en la WO 99/58572. Algunas formas de los anticuerpos humanizados tienen uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis) CDR las cuales están alteradas con respecto al anticuerpo original, los cuales también son conocidos como uno o más CDR "derivados de" uno o más CDR del anticuerpo original. Como se usa aquí, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido producido usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos conocidos en la técnica o descritos aquí. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena ligera humana. Uno de esos ejemplos es un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera de murinos y de cadena pesada de humanos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos usando varios métodos conocidos en la técnica. En una modalidad, un anticuerpo humano es seleccionado de una biblioteca de fagos, donde la biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanos también pueden ser producidos introduciendo sitios de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos hayan sido parcial o completamente inactivados. Este método es descrito en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016. De manera alternativa, el anticuerpo humano puede ser preparado inmortalizando linfocitos de humano B que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno blanco (esos linfocitos B pueden ser recuperados de un individuo o que pudieron haber sido inmunizados in vi tro) . Véase, por ejemplo, Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol . , 147 (l):86-95; y la Patente Estadounidense No. 5,750,373. En algunas modalidades, un anticuerpo humano es "completamente humano" y lo que significa que el anticuerpo contiene polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera humanos. Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" son usados de manera intercambiable aquí para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, que puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por entidades diferentes a aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como conjugación con un componente de marcación. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Debe comprenderse que, debido a que los polipéptidos de esta invención se basan en un anticuerpo, los polipéptidos pueden ocurrir como cadenas individuales o cadenas asociadas, "Polinucleótido" o "ácido nucleico" como se usa de manera intercambiable aquí, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye el ADN y el ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, y cualquier sustrato que pueda ser incorporado en un polímero por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura nucleotídica puede ser impartida antes o después del montaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos . Un polinucleótido puede ser modificado además después de la polimerización, como por conjugación con el componente de marcación. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "coronas", sustitución de uno o más nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas como, por ejemplo, aquéllas con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fósforotioatos, fósforoditioatos, etc.), aquéllos que contienen entidades pendientes como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), aquéllos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquéllos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquéllos que contienen alquiladores, aquéllos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), así como formas no modificadas de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo comúnmente presentes en los azúcares pueden ser reemplazados, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden ser conjugados a soportes sólidos. El OH terminal 5' y 3' puede ser fosforilado o sustituido con aminas o porciones de grupos coronantes orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También pueden ser derivados otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener por ejemplo formas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son conocidas de manera general en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil, 2 '-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos como la arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleosídicos básicos como el metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos enlazantes alternativos. Esos grupos enlazantes alternativos incluyen, pero no se limitan a, modalidades donde el fosfato es reemplazado por P (0) S ( "tioato" ) , P(S)S ("ditioato"), "(0)NR2 ("amidato"), P(0)R5 P(0)0R', CO o CH2 ( "formacetal" ) , en la cual cada R o R1 es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-0-) , arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos referidos aquí, incluyendo el ARN y ADN. Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de cada cadena pesada y ligera consisten de cuatro regiones estructurales (FR) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables . Las CDR en cada cadena son mantenidas juntas muy cerca por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen en la formación del sitio de unión de antígeno de anticuerpo. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un método basado en la viabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Im unological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD) ) ; y (2) un método basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)).

Además, combinaciones de esos dos métodos son algunas veces usadas en la técnica para determinar las CDR. Una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Un epítope que "une preferentemente" o "une específicamente" (usado de manera intercambiable aquí) a un anticuerpo o polipéptido es un término bien comprendido en la técnica, y los métodos para determinar esa unión específica o preferente también son conocidos en la técnica. Se dice que una molécula exhibe "unión específica" o "unión preferente" si reacciona o se asocia de manera más frecuente, más rápida, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular de lo que lo hace con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferentemente" a un blanco si se une con mayor afinidad, avidez, mayor facilidad y/o mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferentemente a un epítope de CD26 es un anticuerpo que se une a este epítope de CD26 con mayor afinidad, avidez, mayor facilidad y/o con mayor duración de lo que se une a otros epítopes de CD26 o epítopes diferentes de CD26. También se comprende leyendo esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o una porción o epítope) que se une específica o preferentemente a un primer blanco puede o no unirse específica o preferentemente a un segundo blanco. Por lo tanto, la "unión específica" o "unión preferente" no necesariamente requiere (aunque puede incluir) una unión exclusiva. De manera general, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa la unión preferente. Una "célula anfitriona" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido el receptor de vectores para la incorporación de insertos polinucleotídicos . Las células huésped incluyen la progenie de una sola célula anfitriona, y la progenie puede o no necesariamente ser completamente idéntica (en morfología o en el complemento del ADN genómico) a la célula madre original debido a mutación natural, accidental, o deliberada. Una células huésped que incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido de esta invención. Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que esté "aislada" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición la cual está en una forma no encontrada en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aisladas incluyen aquéllas que han sido purificadas hasta un grado en que no están ya en la forma en al cual se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición la cual está aislada está sustancialmente pura. Como se usa aquí, "tratamiento" es un método para obtener resultados clínicos benéficos o deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, la disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o aletargamiento del progreso de la enfermedad, alivio o paliación del estado de enfermedad, y reducción (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable . "Tratamiento" también puede significar prolongar la sobrevivencia en comparación con la sobrevivencia esperada si no se recibe tratamiento. En algunos casos, el "tratamiento" contra una enfermedad puede abarcar, pero no se limita a, curar una enfermedad. En algunas modalidades, los resultados benéficos o deseados con respecto a una afección incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejorar una afección, curar una afección, disminuir la severidad de una afección, retardar el progreso de una afección, aliviar uno o más síntomas asociados con una afección, incrementar la calidad de vida de quién padezca una afección, y/o prolongar la sobrevivencia. Aquellas modalidades donde las composiciones descritas aquí son usadas para el tratamiento contral cáncer, los resultados benéficos y deseados pueden incluir, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación de (o destruir) células neoplásicas o cancerosas, inhibir la metástasis de células neoplásicas, disminuir el tamaño de un tumor, inhibición del crecimiento de un tumor, regresión de un tumor, remisión de un cáncer, disminución de los síntomas resultantes del cáncer, incremento de la calidad de vida de aquéllos que padezcan de cáncer, disminución de la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar el cáncer, retraso del progreso del cáncer y/o prolongación de la sobrevivencia de pacientes que tengan cáncer. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para efectuar resultados clínicos benéficos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una cantidad efectiva de un polipéptido, como un anticuerpo anti-CD26, descrita aquí es una cantidad suficiente para aliviar, estabilizar, revertir, hacer lento y/o retrasar el progreso de una afección asociada con la expresión de CD26. Como es comprendido en la técnica, una cantidad efectiva de, por ejemplo un anticuerpo anti-CD26 puede variar, dependiendo, in ter alia , de la historia del paciente, así como otros factores como el tipo (y/o dosis) del anticuerpo anti-CD26 usado. Como es evidente de esta descripción a un experto en la técnica, esos principios se aplican a modalidades de polipéptidos. Un "individuo", también referido aquí como un "sujeto", es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, de manera más preferible un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja (como vacas), animales para deportes, mascotas (como gatos, perros y caballos) primates, ratones y ratas. Como se usa aquí, "vector" significa un plásmido recombinante, el cual es capaz de liberar, y preferiblemente expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula anfitriona. Los ejemplos de vectores incluyen pero no se limitan a, vectores virales, ADN puro o vectores de expresión de ARN, plásmidos, cósmidos o vectores de fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores que expresan ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucarióticas, como células productoras. Como se usa aquí, "soporte farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material el cual, cuando se combine con un ingrediente activo, permita que el ingrediente retenga la actividad biológica y no reaccione con el sistema inmune del sujeto y no sea tóxico al sujeto cuando sea liberado. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar como solución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones como la emulsión aceite/agua, y varios tipos de agentes humectantes. Los diluentes preferidos para la administración por aerosol o parenteral son solución salina amortiguada con fosfato o solución salina normal (0.9%). Las composiciones que comprenden esos soportes son formuladas por métodos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000) . El término "koff" como se usa aquí, pretende referirse a la constante de velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno . El término "KD", como se usa aquí, pretende referirse a la constante de disociación de interacción anticuerpo-antígeno. Como se usa aquí, "sustancialmente puro" se refiere a material el cual es al menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes), de manera más preferida en un 90% puro, de manera más preferida al menos 95% puro, de manera más preferida al menos 98%, de manera más preferible al menos 99% puro.

Polipéptidos La invención proporciona una variedad de polipéptidos novedosos que comprenden una o más regiones determinantes de la complementariedad de cadenas (CDR) , de cadena pesada y/o cadena ligera, regiones estructurales (FR) de cadena pesada y/o de cadena ligera, y/o regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera (VH y VL, respectivamente). En algunas modalidades, los polipéptidos son anticuerpos. En algunas modalidades, los polipéptidos están aislados. La invención también abarca polipéptidos los cuales son sustancialmente puros. En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos quiméricos. En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. En algunas modalidades los anticuerpos son anticuerpos humanos. En algunas modalidades, los polipéptidos no son anticuerpos monoclonales murinos (es decir, son diferentes). En algunas modalidades, los polipéptidos no son anticuerpos monoclonales de ratón (es decir, son diferentes) . En algunas modalidades, los polipéptidos no son (es decir, son diferentes) el anticuerpo 14D10 (Dong et al. (1998) Mol Immunol. 35(1):13-21 y Publicación de Patente Estadounidense No. 2003/0031665). En algunas modalidades, los polipéptidos no comprenden la VH o la VL (o ambas de la VH y VL) o una CDR, FR, conjunto de CDR, o conjunto de FR particular del anticuerpo 14D10. En algunas modalidades, los polipéptidos no comprenden una o más de las CDR y/o una o más de las FR del anticuerpo 14D10. En algunas modalidades, los polipéptidos no comprenden todas las CDR y/o todas las FR del anticuerpo 14D10. En algunas modalidades, los polipéptidos no comprenden ambas de la VH y VL del anticuerpo 14D10. (La VH y VL y la CDR y FR del anticuerpo 14D10 se identifican en las Figuras 3 y 5. ) En algunas modalidades, el polipéptido no comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDA AFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (CMO3 VH; SEQ ID NO: 90). En algunas modalidades, el polipéptido no comprende una región variable de cadena ligera de la secuencia DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRF SGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (CM03 VL; SEQ ID NO: 91). En algunas modalidades, el polipéptido no comprende ambas de una región variable de cadena pesada de la secuencia QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDA AFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 90) y una región variable de cadena ligera de la secuencia DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRF SGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 91). En algunas modalidades de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, así como otros aspectos descritos aquí, el polipéptido no es el anticuerpo monoclonal de ratón 1F7 (Patente Estadounidense No. 5,120,642; Publicación PCT No. WO 91/07985 (Schlossman et al.); Morimoto et al. (1989) J. Immunology, 143:3430-3439). En algunas modalidades, los polipéptidos no comprenden ambas de la VH y VL del anticuerpo 1F7. En algunas modalidades, los polipéptidos no comprenden una o más de la CDR y/o una o más de las FR del anticuerpo 1F7. En algunas modalidades, los polipéptidos no comprenden todas las CDR y/o todas las FR del anticuerpo 1F7. En algunas modalidades, los polipéptidos son anticuerpos madurados por afinidad. En algunas modalidades, un polipéptido descrito aquí es una cadena de anticuerpo, como una cadena pesada o una cadena ligera. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera (por ejemplo, una región variable de cadena ligera que comprende una o más CDR de cadena ligera descritas aquí y/o una o más FR de cadena ligera descritas aquí) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada (por ejemplo, una región variable de cadena pesada que comprende una o más de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (CDR) descritas aquí y/o una o más de las regiones estructurales de cadena ligera (FR) descritas aquí) . En algunas modalidades, la invención abarca polipéptidos los cuales comprenden ambas de una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada. La invención abarca además polipéptidos los cuales son intermediarios en la síntesis de anticuerpos u otros polipéptidos de unión de CD26. En algunas modalidades, los polipéptidos, como los anticuerpos, descritos aquí se unen a CD26. En algunas modalidades, los polipéptidos descritos aquí preferiblemente se unen a CD26. En algunas modalidades, los polipéptidos se unen a CD26 humana. En algunas modalidades, los polipéptidos preferiblemente se unen a CD26 humano. En algunas modalidades, los polipéptidos reaccionan de manera cruzada con CD26 humano y CD26 de otras especies. En algunas modalidades, un polipéptido descrito aquí se une al CD26 humano con una KD de aproximadamente 200 nM o menos, aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 30 nM o menos, aproximadamente 12 nM o menos, o aproximadamente 6 nM o menos, o aproximadamente 3 nM, o aproximadamente 1 nM o menos. En algunas modalidades, el polipéptido se une al CD26 humano con una KD de aproximadamente 10 nM o menos. En algunas modalidades, el polipéptido se une al CD26 humano con una KD de aproximadamente 6 nM o menos. En algunas modalidades, el polipéptido se une al CD26 humano con una KD de aproximadamente 3 nM o menos. En algunas modalidades, el polipéptido se une al CD26 humano con una KD de aproximadamente 1 nM o menos. En algunas modalidades, el polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) se une al CD26 humano con una KD de aproximadamente 0.1 nM hasta aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 0.1 nM hasta aproximadamente 6 nM, de aproximadamente 0.1 nM hasta aproximadamente 3 nM, o de aproximadamente 0.1 nM hasta aproximadamente 1 nM. En algunas modalidades, los polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) descritos aquí se unen a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO: 45; péptido 6), LEYNYVKQWRHSY (SEQ ID NO: 46; péptido 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 47; péptido 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48; péptido 84), RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 49; péptido 132), YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO: 50; péptido 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO: 51; péptido 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52; péptido 29), SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO:53; péptido 30), y I YVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO:54; péptido 63) . En algunas modalidades, los polipéptidos descritos aquí preferiblemente se unen a uno o más péptidos. Esos péptidos son regiones del CD26 humano. En algunas modalidades, los polipéptidos descritos aquí se unen al mismo epítope que el anticuerpo monoclonal de ratón 14D10. En algunas modalidades, los polipéptidos descritos aquí are son capaces de bloquear la unión del anticuerpo monoclonal de ratón 14D10 al CD26 humano en un ensayo competitivo. En algunas modalidades, los polipéptidos descritos aquí son capaces de bloquear la unión de anticuerpo monoclonal de ratón 1F7 al CD26 humano en un ensayo competitivo. Los métodos para determinar la afinidad son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de la unión puede ser determinada usando un biodetector BIAcore, un biodetector KinExA, ensayos de proximidad de destellos, ELISA, inmunoensayo ORIGEN (IGEN), extinción de fluorescencia, transferencia de fluorescencia, y/o presentación de levadura. La afinidad de la unión también puede ser determinada usando un bioensayo adecuado. Una forma de determinar la afinidad de unión de anticuerpos a CD26 es midiendo la afinidad de fragmentos Fab monofuncionales a los anticuerpos. Para obtener los fragmentos Fab monofuncionales, anticuerpos, por ejemplo, IgG pueden ser escindidos con papaína o expresados de manera recombinante. Las afinidades de fragmentos de Fab de anti- CD26 de anticuerpos monoclonales pueden ser determinadas por un sistema de Resonancia Plasmónica Superficial (SPR) (BIAcore 3000MR, BIAcore, Inc., Piscaway, NJ) . Se usan microcircuitos integrados SA (estreptavidina) de acuerdo a las instrucciones del distribuidor. Puede diluirse CD26 biotinilado en HBS-EP (HEPES 100 mM pH 7.4, NaCl 150 M, EDTA 3 mM, P20 al 0.005%) e inyectado sobre el microcircuito a una concentración de 0.005 mg/mL. Usando un tiempo de flujo variable a través de los canales del microcircuito individuales, se logran dos valores de densidad de antígeno: 10-20 unidades de respuesta (UR) para estudios cinéticos detallados y 500-600 UR para la concentración. Una mezcla de amortiguador de elución de Pierce y NaCl 4 M (2:1) remueve efectivamente el Fab unido conservando la actividad del CD26 sobre un microcircuito durante 200 inyecciones. Puede ser usado amortiguador HBS-EP como amortiguador de ensayo para todos los ensayos BIAcore. Se inyectan diluciones en serie (KD estimado de 0.1-10x) de muestras de Fab purificado durante 2 min a 100 µL/min y se permiten generalmente tiempos de disociación de hasta 30h min. Las concentraciones de proteínas de Fab pueden ser determinadas por ELISA y/o electroforesis de SDS-PAGE usando un estándar de Fab de concentración conocida (determinada por análisis de aminoácidos). Las velocidades de asociación cinética (Kon) y las velocidades de disociación (koff) se obtienen simultáneamente ajustando los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 (Lofas & Johnsson, 1990) usando el programa de evaluación BIA. En valores de la constante de disociación en equilibrio (KD) son calculados como k0ff/kon. En algunas modalidades, la invención abarca polipéptidos, como anticuerpos, los cuales inhiben la proliferación de las células que expresan CD26. La invención también abarca modalidades donde los polipéptidos son útiles en el tratamiento contra una afección (como una enfermedad o trastorno) asociado con la expresión de CD26 (por ejemplo, una enfermedad maligna de células T) . En algunas modalidades, los polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) de la invención pueden tener una o más de las siguientes características: (a) se unen a CD26; (b) modulan la actividad CD26, (c) hacen que se interrumpa el ciclo celular de células CD26+ en el punto Gl/S; (d) inhiben la proliferación de células que expresan CD26, y/o (e) son útiles en el tratamiento contra una afección asociada con la expresión de CD26. En algunas modalidades, los polipéptidos son útiles en la inhibición del crecimiento de un tumor que expresa CD26, inducción de regresión de un tumor que expresa CD26, y/o inhibición de la metástasis de células cancerígenas que expresan CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión CD26 es mediada, al menos en parte, por CD26 En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión CD26 es una afección asociada con la proliferación de células que expresan CD26. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es un cáncer (por ejemplo, un cáncer de tumor sólido, cáncer pancreático, cáncer de riñon o linfoma) , una enfermedad o trastorno autoinmune, enfermedad de injerto contra anfitrión (GVHD) , o una enfermedad o trastorno inflamatorio. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis) regiones determinantes de una complementariedad (CDR) descritas aquí. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada descritas aquí y/o una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR de cadena ligera descritas aquí. En algunas de las modalidades, el polipéptido comprende además una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) regiones estructurales (FR) de cadena pesada descritas aquí y/o uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) FR de cadena ligera descritas aquí. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada descritas aquí y/o una región variable de cadena ligera que comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR de cadena ligera descritas aquí. En algunas de las modalidades, la región variable de cadena pesada comprende además una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) regiones estructurales (FR) de cadena pesada descritas aquí y/o la región variable de cadena ligera comprende además una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) FR de cadena ligera descritas aquí.

Debe comprenderse que la referencia a "CDR de cadena pesada" o "CDR de cadena ligera" no significa que todas las modalidades de esas CDR estén contenidas en una cadena pesada o cadena ligera, respectivamente. Esos términos se usan por conveniencia para indicar su origen. La invención, sin embargo, no incluye modalidades en las cuales una o más de las CDR estén contenidas dentro de (a) regiones variables de cadena pesada y/o regiones variables de cadena ligera, y/o (b) cadenas pesadas y/o cadenas ligeras. Los mismos principios se aplican a las designaciones estructurales. La invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende: (a) una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR de cadena pesada que tienen cada uno al menos aproximadamente 80% de identidad con una CDR seleccionada del grupo que consiste de (i) una CDRl de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 55), GFSLSTYGVH (SEQ ID NO: 56), y GYSLTTYGVH (SEQ ID NO:57), (ii) una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO: 58) y VIWGDGRTD YDSSFMS (SEQ ID NO:59), y (iii) una secuencia de CDR3 de cadena pesada NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60); y/o (b) uno o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR de cadena ligera que tienen cada uno al menos aproximadamente 80% de identidad con una CDR seleccionada del grupo que consiste de (i) una CDRl de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de RASQDIRNNLN (SEQ ID NO: 61), RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), y SASQDIRNSLN (SEQ ID NO: 63), (ii) una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de YSSNLHS (SEQ ID NO: 64), YSSNLQS (SEQ ID NO: 65) y YSSNLHT (SEQ ID NO: 66), y (iii) una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de QQSIKLPLT (SEQ ID NO: 67), QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68), y QQSNKLPLT (SEQ ID NO: 69). En algunas modalidades, las CDR tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, o 100% de identidad con las secuencias indicadas. En algunas modalidades, el polipéptido se une a CD26. En algunas modalidades, el polipéptido no es un anticuerpo monoclonal murino. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo que comprende: (i) una CDRl de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 55), (ii) una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO:58), y (iii) una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60). En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo que comprende (i) una CDRl de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), (ii) una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con YSSNLQS (SEQ ID NO: 65), y (iii) una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR, donde cada una de las CDR comprende una CDR de una región variable de cadena pesada (VH) X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420 mostrado en la figura 5. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) CDR, donde cada una de las CDR comprende una CDR de una región variable de cadena ligera (VL) mostrado en la figura 3 como cualquiera de las secuencias X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394. En algunas modalidades, una o más CDR son CDRl, CDR2, o CDR3 de la región variable de cadena ligera o la región variable de cadena pesada mostrado en la figura 3 o 5, respectivamente (por ejemplo, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-Hl, CDR-H2, y/o CDR-H3). Algunas modalidades incluyen polipéptidos (como anticuerpos) que comprenden una o más CDR de una secuencia de región variable de cadena pesada (VH) X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420 mostrado en la figura 5, así como una o más CDR de una secuencia de región variable de cadena ligera X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394 mostrado en la figura 3. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, el cual comprende al menos una CDR que es al menos aproximadamente 80% idéntica a al menos una CDR, al menos dos CDR, o al menos tres CDR de una VH mostrado en la figura 5 como cualquiera de las secuencias X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420 o de una región variable de cadena ligera (VL) mostrado en la figura 3 como cualquiera de las secuencias X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394. Otras modalidades incluyen polipéptidos los cuales comprenden al menos dos o tres CDR que son al menos aproximadamente 80% idénticas a al menos dos o tres CDR de una VH mostrado en la figura 5 como cualquiera de las secuencias X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420 o una VL mostrado en la figura 3 como cualquiera de las secuencias X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394. En algunas modalidades, una o más CDR sustancialmente homologas a al menos una CDR, al menos dos, o al menos tres CDR de una VH o VL mostradas en la figuras 5 o 3 son al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% idénticas a al menos uno, al menos dos, o al menos tres CDR de una VH o VL mostrado en la figura 5 como cualquiera de las secuencias X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420 o mostrado en la figura 3 en cualquiera de las secuencias X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394. En algunas modalidades, la CDR es una CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, y/o CDR-H3. La determinación de la CDR está también dentro de la experiencia de la técnica. En algunas modalidades, las CDR son CDR de Kabat. En otras modalidades, las CDR son CDR de Chothia. En modalidades aún más, una o más de las CDR son definidas por una combinación de las definiciones de Kabat y Chothia . En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia GX?X2LX3TYGVH (SEQ ID NO: 31), donde Xi es F o Y, X2 es S o T, y X3 es T, N, o S; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia VIWGX?GRTDYDX2X3FMS (SEQ ID NO: 32), donde X? es G o D, X2 es A o S, y X3 es A o S; y/o (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia XiRHDWFDY (SEQ ID NO:33), donde Xx es N o S. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la CDRl. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la CDR2. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la CDR3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la CDRl, la CDR2, y la CDR3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende la CDRl, la CDR2, y/o la CDR3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además una región variable de cadena ligera (por ejemplo, una región variable de cadena ligera descrita aquí) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena pesada que comprende (i) una CDRl que comprende la secuencia GX?X2LX3TYGVH (SEQ ID N0:31), donde X? es F o Y, X2 es S o T, y X3 es T, N, o S; (ii) una CDR2 que comprende la secuencia VIWGX?GRTDYDX2X3FMS (SEQ ID NO: 32), donde Xj. es G o D, X2 es A o S, y X3 es A o S; y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia XiRHDWFDY (SEQ ID NO:33), donde Xi es N o S. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR de cadena pesada. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una CDRl de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 55), GFSLSTYGVH (SEQ ID NO: 56), y GYSLTTYGVH (SEQ ID NO:57). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO:58) y VIWGDGRTDYDSS FMS (SEQ ID NO:59). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de cadena pesada.

Nuevamente, donde cualquier aspecto o modalidad de la invención es descrita aquí en términos de que un grupo de Markush u otro agrupamiento alternativo, la presente invención abarca no únicamente todo el grupo listado como un todo, sino cada uno de los miembros del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, pero también uno o más de los miembros del grupo ausentes del grupo principal. La presente invención también contempla la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo en la invención reclamada. En algunas modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena pesada que comprende: (a) una CDRl que comprende la secuencia GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 55); (b) una CDR2 que comprende la secuencia VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO:58); y (c) una CDR3 que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60). En algunas modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena pesada que comprende: (a) una CDRl que comprende la secuencia GFSLSTYGVH (SEQ ID NO: 56); (b) una CDR2 que comprende la secuencia VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO:58); y (c) una CDR3 que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60). En algunas modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena pesada que comprenden: (a) una CDRl que comprende la secuencia GYSLTTYGVH (SEQ ID NO:57); (b) una CDR2 que comprende la secuencia VIWGDGRTDYDSSFMS (SEQ ID NO: 59); y(c) una CDR3 que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60).

En algunas modalidades de cada una de las anteriores, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende la CDRl, CDR2, y CDR3 especificada. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) una CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia X?ASQX2IRNX3LN (SEQ ID NO:34), donde Xi es S o R, X2 es G o D, y X3 es S o N; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia YSSNLX?X2 (SEQ ID NO: 35), donde Xi es H o Q y X2 es S o T; y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQSX?KLPX2T (SEQ ID NO: 36), donde Xi es I o N y X2 es F o L. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la CDRl. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la CDR2. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la CDR3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la CDRl, la CDR2, y la CDR3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende la CDRl, la CDR2, y/o la CDR3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además una región variable de cadena pesada (por ejemplo, una región variable de cadena pesada descrita aquí). En algunas modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena ligera que comprende (i) una CDRl que comprende la secuencia X?ASQX2IRNX3LN (SEQ ID NO:34), donde Xi es S o R, X2 es G o D, y X3 es S o N; (ii) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLXiX2 (SEQ ID NO: 35), donde Xi es H o Q y X2 es S o T; y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia QQSX?KLPX2T (SEQ ID NO:36), donde Xi es I o N y X2 es F o L. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende las CDR de cadena ligera. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una CDRl de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de RASQDIRNNLN (SEQ ID NO: 61), RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), y SASQDIRNSLN (SEQ ID NO: 63). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de YSSNLHS (SEQ ID NO: 64), YSSNLQS (SEQ ID NO: 65) y YSSNLHT (SEQ ID NO: 66). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de QQSIKLPLT (SEQ ID NO: 67), QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68), y QQSNKLPLT (SEQ ID NO: 69). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende la CDR de cadena ligera. En algunas modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena ligera que comprenden (a) una CDRl que comprende la secuencia RASQDIRNNLN (SEQ ID NO: 61), (b) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLHS (SEQ ID NO: 64), y (c) una CDR3 que comprende la secuencia QQSIKLPLT (SEQ ID NO: 67).

En algunas modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena ligera que comprende (a) una CDRl que comprende la secuencia RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), (b) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLQS (SEQ ID NO: 65), y (c) una CDR3 que comprende la secuencia QQSIKLPFT (SEQ ID NO:68). En algunas otras modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena ligera que comprende (a) una CDRl que comprende la secuencia SASQDIRNSLN (SEQ ID NO: 63), (b) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLHT (SEQ ID NO: 66), y (c) una CDR3 que comprende la secuencia QQSNKLPLT (SEQ ID NO: 69). En algunas modalidades de cada una de las anteriores, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende la CDRl, CDR2, y CDR3 especificada. En algunas modalidades, el polipéptido comprende CDR de cadena pesada que comprende (a) una CDRl que comprende la secuencia GFSLTTYGVH (SEQ ID NO:55), (b) una CDR2 que comprende la secuencia VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO:58), y (c) una CDR3 que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60), y/o CDR de cadena ligera que comprende (a) una CDRl que comprende la secuencia RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), (b) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLQS (SEQ ID NO: 65), y (c) una CDR3 que comprende la secuencia QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68). En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia GX?X2LX3TYGVH (SEQ ID NO: 31), donde Xx es F o Y, X2 es S o T, y X3 es T, N, o S, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia VIWGX?GRTDYDX2X3FMS (SEQ ID NO: 32), donde Xx es G o D, X2 es A o S, y X3 es A o S, y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia XiRHDWFDY (SEQ ID NO: 33), donde Xi es N o S, y comprende además una CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia X?ASQX2IRNX3LN (SEQ ID NO:34), donde Xi es S o R, X2 es G o D, y X3 es S o N, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia YSSNLX]X2 (SEQ ID NO: 35), donde Xi es H o Q y X2 es S o T, y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQSX?KLPX2T (SEQ ID NO:36), donde Xi es I o N y X2 es F o L. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido comprende las tres CDR de cadena pesada CDRl, CDR2, y CDR3, así como las tres CDR de cadena ligera CDRl, CDR2, y CDR3. La invención también abarca polipéptidos que comprenden una o más CDR descritas aquí, donde los polipéptidos comprenden además una o más FR descritas aquí. En algunas modalidades, las CDR y/o FR están en un orden secuencial. La invención proporciona además una región variable de cadena pesada que comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) de las CDR de cadena pesada, descritas aquí. En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende además una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) de las FR de cadena pesada, descritas aquí. Además, la invención también proporciona una región variable de cadena ligera que comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, o tres) de las CDR de cadena ligera descritas aquí. En algunas modalidades, la región variable de cadena ligera comprende además una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) de las FR de cadena ligera, descritas aquí. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido, que comprende una o más regiones estructurales (FR) de cadena pesada descritas aquí y/o una o más regiones estructurales de cadena ligera descritas aquí. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende una o más FR de cadena pesada descritas aquí y/o una región variable de cadena ligera que comprende una o más FR de cadena ligera descritas aquí. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) FR, donde cada FR comprende una FR de una región variable de cadena pesada (VH) mostrado en la figura 5 como cualquiera de las secuencias X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420. En algunas modalidades, la FR de una región variable de cadena pesada en la figura 5 es FR1, FR2, FR3, o FR4. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) FR, donde cada FR comprende una FR de una región variable de cadena ligera (VL) mostrado en la figura 3 como cualquiera de las secuencias X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394. En algunas modalidades, la FR de una región variable de cadena ligera en la figura 3 es FR1, FR2, FR3, o FR4. Algunas modalidades incluyen polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) que comprenden una o más FR de una región variable de cadena pesada (VH) mostrado en la figura 5 como cualquiera de las secuencias X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420 así como una o más FR de una región variable de cadena ligera mostrada en la figura 3 en cualquiera de las secuencias X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido (como un anticuerpo) , el cual comprende al menos una FR que es sustancialmente homologa a al menos una FR, al menos dos FR, al menos tres FR, o al menos cuatro FR de una VH mostrado en la figura 5 como cualquiera de las secuencias X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420 o una VL mostrado en la figura 3 en cualquiera de las secuencias X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394. En algunas modalidades, una o más FR sustancialmente homologas a al menos una FR, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro FR de una VH o VL mostrada en la figura 5 o 3 son al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% idénticas a al menos uno, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro FR de una VH o VL mostrado en la figura 5 como cualquiera de las secuencias X384, X385, X386, X387, X388, X399, o X420 o mostrado en la figura 3 como cualquiera de las secuencias X376, X377, X378, X379, X380, X381, o X394. En otro aspecto más, la invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) una FR1 de cadena pesada que comprende la secuencia EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS (SEQ ID NO:37), donde Xi es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, y X9 es T o K; (b) una FR2 de cadena pesada que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWXiG (SEQ ID NO:38), donde Xi es V o M; (c) una FR3 de cadena pesada que comprende la secuencia RVTISX?DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R (SEQ ID NO: 39), donde Xi es K o R, X2 es N o T, X3 es S o N, X4 es V o A, X5 es M o L, y X6 es V, M, o T; y/o (d) una FR4 de cadena pesada que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40). En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FR1. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FR2. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FR3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FRl, la FR2, la FR3, y la FR4. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende la FRl, la FR2 , la FR3, y/o la FR4. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además una región variable de cadena ligera. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una FRl de cadena pesada que comprende la secuencia EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTAS (SEQ ID NO: 70) EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTAS (SEQ ID N0:71), EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTAS (SEQ ID NO:72), o EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTAS (SEQ ID NO: 73). En otras modalidades, el polipéptido comprende una FR2 de cadena pesada que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID NO:74) o WVRQAPGKGLEWMG (SEQ ID NO:75). En otras modalidades, el polipéptido comprende una FR3 de cadena pesada que comprende la secuencia RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR (SEQ ID NO:76), RVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMR (SEQ ID NO:77), o RVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO:78). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una FR4 de cadena pesada que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40). En algunas modalidades, el polipéptido comprende regiones estructurales de cadena pesada que comprenden (a) una FRl que comprende la secuencia EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTAS (SEQ ID NO: 70), (b) una FR2 que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID NO:74), (c) una FR3 que comprende la secuencia RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR (SEQ ID NO: 76), y (d) una FR4 que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40). En otras modalidades, el polipéptido comprende regiones estructurales de cadena pesada que comprenden (a) una FRl que comprende la secuencia EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTAS (SEQ ID NO: 71), (b) una FR2 que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID NO: 74), (c) una FR3 que comprende la secuencia RVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCMR (SEQ ID NO:77), y (d) una FR4 que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40) . En otras modalidades más, el polipéptido comprende regiones estructurales de cadena pesada que comprenden (a) una FRl que comprende la secuencia EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTAS (SEQ ID NO: 72), (b) una FR2 que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWMG (SEQ ID NO: 75), (c) una FR3 que comprende la secuencia RVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO:78), y (d) una FR4 que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40). En algunas modalidades alternativas, el polipéptido comprende regiones estructurales de cadena pesada que comprenden (a) una FRl que comprende la secuencia EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTAS (SEQ ID NO: 73), (b) una FR2 que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID NO:74), (c) una FR3 que comprende la secuencia RVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMR (SEQ ID NO:76), y (d) una FR4 que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40). En algunas modalidades, las regiones estructurales de cadena pesada están contenidas dentro de una región variable de cadena pesada.

En un aspecto más, la invención proporciona un polipéptido, que comprende (a) una FRl de cadena ligera que comprende la secuencia X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9C (SEQ ID NO: 41), donde Xx es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E, X8 es V o A, y X9 es T o S; (b) una FR2 de cadena ligera que comprende la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 42); (c) una FR3 de cadena ligera que comprende la secuencia GVPX?RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC (SEQ ID NO: 43), donde Xi es S, D, o A, X2 es E o Q, X3 es P o A, X4 es F o V, y X5 es T, A, o I; y/o (d) una FR4 de cadena ligera que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44). En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FRl. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FR2. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FR3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FR4. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la FRl, la FR2, la FR3, y la FR . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende la FRl, FR2, FR3, y/o FR4. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además una región variable de cadena pesada. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una FRl de cadena ligera que comprende la secuencia DILMTQSPSSLSASPGDRVTISC (SEQ ID NO: 79), DILLTQSPSSLSATPGERATITC (SEQ ID NO: 80), o EIEMTQSPSSLSVSAGERATISC (SEQ ID NO: 81). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una FR2 de cadena ligera que comprende la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:42). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una FR3 de cadena ligera que comprende la secuencia GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYC (SEQ ID NO:82), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYC (SEQ ID NO: 83), o GVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYC (SEQ ID NO:84). En algunas modalidades, el polipéptido comprende un FR4 de cadena ligera que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44). En algunas modalidades, el polipéptido comprende regiones estructurales de cadena ligera que comprenden (a) una FRl que comprende la secuencia DILMTQSPSSLSASPGDRVTISC (SEQ ID NO: 79), (b) una FR2 que comprende la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:42), c) una FR3 que comprende la secuencia GVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYC (SEQ ID NO: 82), y (d) una FR4 que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44). En algunas modalidades, el polipéptido comprende regiones estructurales de cadena ligera que comprenden (a) una FRl que comprende la secuencia DILLTQSPSSLSATPGERATITC (SEQ ID NO: 80), (b) una FR2 que comprende la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:42), (c) una FR3 que comprende la secuencia GVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPED VAAYYC (SEQ ID NO: 83), y (d) una FR4 que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44). En algunas modalidades, el polipéptido comprende regiones estructurales de cadena ligera que comprenden (a) una FRl que comprende la secuencia EIEMTQSPSSLSVSAGERATISC (SEQ ID NO: 81), (b) una FR2 que comprende la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:42), (c) una FR3 que comprende la secuencia GVPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYC (SEQ ID NO:84), y (d) una FR4 que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 44). En algunas modalidades, las regiones estructurales de cadena ligera están contenidas dentro de una región variable de cadena ligera. La invención proporciona además una región variable de cadena pesada que comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) de la FR de cadena pesada descrita aquí. Además, la invención también proporciona una región variable de cadena ligera que comprende una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro) de las FR de cadena ligera, descritas aquí. La invención proporciona además un polipéptido que comprende una o más de las regiones variables de cadena pesada descritas aquí y/o una de las regiones variables de cadena ligera descritas aquí. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende una o más de las CDR de cadena pesada, descritas aquí y/o uno o más de las FR de cadena pesada, descritas aquí. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprende una o más de las CDR de cadena ligera descritas aquí y/o una o más de las FR de cadena ligera descritas aquí. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos EVQLVXi SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLXsCX9ASGX?oX??LX?2TYGVHWVRQAPGKGLEWX13GVIWGX?4G RTDYDX?5X?6FMSRVTISX?7DX?8SKX?9TX20YLQX2?NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFD YWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 29) , donde Xi es E o Q, X2 es A o G, X3 s G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, X9 es T o K, X?0 es F o Y, Xn es S o T, X12 es T, N, o S, Xi3 es V o M, Xi4 es G o D, Xi5 es A o S, X?6 es A o S, X17 es K o R, X18 es N o T, Xi9 es S o N, X20 es V o A, X2i es M o L, X22 es V, M, o T, y X23 es N o S. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia EVQLVX?SGX2X3X4X5QPGX6 X7LRLXsCX9ASGX?oX??LX?2TYGVHWVRQAPGKGLEWX?3GVIWGX?4GRTDYDX15Xi6FMSR VTISXI7DXI8SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:29) , donde Xi es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, X9 es T o K, Xio es F o Y, Xn es S o T, Xi2 es T, N, o S, Xi3 es V o M, Xi4 es G o D, Xi5 es A o S, X?6 es A o S, X?7 es K o R, Xis es N o T, Xi9 es S o N, X20 es V o A, X2i es M o L, X22 es V, M, o T, y X23 es N o S. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además una región variable de cadena ligera. Las CDR (CDRl, CDR2, y CDR3) de la región variable de cadena pesada están subrayadas (y colocadas en orden secuencial) en la siguiente secuencia: EVQLVX?SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX?0X??LX?2TYGVHWVRQAPGKGLEWX?3GV IWGX14GRTDYDX?5X?6FMSRVTISX17DX18SKX19TX2oYLOX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23 RHDWFDYWGOGTTVTVSS (SEQ ID NO:29), donde Xx es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, X9 es T o K, X?0 es F o Y, Xn es S o T5 Xi2 es T5 N, o S, Xi3 es V o M, Xi4 es G o D, Xi5 es A o S, Xi6 es A o S, X17 es K o R, X?8 es N o T, Xi9 es S o N, X20 es V o A, X2i es M o L, X22 es V, M, o T, y X23 es N o S. La CDR2 y la CDR3 de la región variable de cadena pesada (CDR-H2 y CDR-H3) fueron definidas de acuerdo a la definición de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edit., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)). CDRl de la región variable de cadena pesada (CDR-H1) fue definida de acuerdo a una combinación de las definiciones de Kabat y Chothia (Chothia et al., J Mol. Biol, 196:901-917). Esos métodos son conocidos en la técnica para definir CDR de anticuerpos. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol. Biol, 293:865-881 (1999) y Muller et al., Structure, 6:1153-1167 (1998) . Dentro de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:29, la posición de la CDRl es H26-35, la posición de la CDR2 es H50-65, y la posición de la CDR3 es H95-102, sobre la base de la numeración de Kabat. De acuerdo a la numeración secuencial, la posición de la CDRl es H26-35, la posición de la CDR2 es H50-65, y la posición de la CDR3 es H98-105.

(Véase, por ejemplo, la figura 5 para la ilustración de la posición de la CDR y FR de la región variable de cadena pesada sobre las secuencias de la región variable de cadena pesada, ejemplares, seleccionadas). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKG LEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDY WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:22; X384), EVQLVQSGGGVKQPGETLRLTCTASGF SLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTAYLQMNSLRAE DTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:23; X385), EVQLVQSGGGLKQPGETLRLSCTASGYSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWMGVIWGDGRTDYDS SFMSRVTISKDTSKSTAYLQLNSLRAEDTAVYYCTRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:26; X388), y EVQLVESGGGVKQPGETLRLTCTASGFSLSTYGVHWVRQ APGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRH DWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:28; X420). En algunas modalidades, el polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:22 (X384), SEQ ID NO:23 (X385), SEQ ID NO:26 (X388), y SEQ IDNO:28 (X420). En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX?oASQX??IRNX?2LNWYQQKPGQAPRLLIYYS SNLX13Xi4GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX?6X?7EDX?8AX?9YYCQQSX20KLPX2?TFGS GTKVEIK (SEQ ID NO: 30) , donde Xi es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X es D o E, X8 es V o A, X9 es T o S, X?0 es S o R, Xn es G o D, Xi2 es S o N, XX3 es H o Q, Xi4 es S o T, Xi5 es S, D, o A, XX6 es E o Q, X17 es P o A, X?8 es F o V, Xi9 es T, A, o I, X20 es I o N y X2i es F o L. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos de X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX?oASQX??IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIYYS SNLX?3Xi4GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX?8AX?9YYCQQSX2oKLPX2?TFGS GTKVEIK (SEQ ID NO: 30), donde Xi es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E3 X8 es V o A, X9 es T o S, XXo es S o R, Xn es G o D, Xi2 es S o N, Xi3 es H o Q, Xi4 es S o T, XX5 es S, D, o A, Xi6 es E o Q, X17 es P o A, Xi8 es F o V, Xi9 es T, A, o I, X20 es I o N y X2i es F o L. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además una región variable de cadena pesada. Las CDR (CDRl, CDR2, y CDR3) de la región variable de cadena ligera están subrayadas (y colocadas en orden secuencial en la siguiente secuencia: X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6 GX7RX8TIXgCX?oASQX??IRNX?2LNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLX?3Xi4GVPX?5RFSGSG SGTDFTLTISRLX?6X?7EDX18AX19YYCQQSXX20KLPX2?TFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 30) , donde Xi es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E, X8 es V o A, Xg es T o S, Xio es S o R, Xn es G o D, X12 es S o N, X13 es H o Q, X14 es S o T, X?5 es S, D, o A, Xi6 es E o Q, X17 es P o A, X?8 es F o V, X?9 es T, A, o í, X20 es I o N y X21 es F o L. La CDRJ, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2, y CDR-L3, respectivamente) mostradas fueron definidas de acuerdo a la definición de Kabat (Kabat et al. Sequences of Proteins of I munological Interest, 4th edit., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)). La posición de la CDRl en la región variable de cadena ligera es L24-34, la posición de la CDR 2 en la región variable de cadena ligera es L50-56, y la posición de la CDR3 en la región variable de cadena ligera es L89-97 (bajo ambos esquemas de numeración secuencial y de Kabat) . (Véase, por ejemplo, la figura 3 para una ilustración de la posición de la CDR y FR de la región variable de cadena ligera sobre las secuencias de la región variable de cadena ligera, ejemplares, seleccionadas.) En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de DILMTQSPSSLSASPGDRVTISCRASQDIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLHSGVPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYCQQSIKLPLTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 15; X376) , DILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 18; X379),y EIEMTQSPSSLSVSAGERATISCSASQDIRNSLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLHTGVPAR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDVAIYYCQQSNKLPLTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 19; X380). En algunas modalidades, el polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 15 (X376) , SEQ ID NO: 18 (X379) , y SEQ ID NO: 19 (X380) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende ambas de (a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:22 (X384), SEQ ID NO:23 (X385), SEQ ID NO:26 (X388), y SEQ ID NO:28 (X420) y (b) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 15 (X376) , SEQ ID NO: 18 (X379), y SEQ ID NO: 19 (X380) . En algunas modalidades, el polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende ambas de (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 22 (X384), SEQ ID NO:23 (X385), SEQ ID NO:26 (X388), y SEQ ID NO:28 (X420) y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:15 (X376), SEQ ID NO:18 (X379), y SEQ ID NO:19 (X380) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: ID NO: 26 (X388) y una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 (X376). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 (X384) y una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 (X379). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 (X420) y una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 (X380). En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 (X385) y una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 (X380) . En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 (X388) y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 (X376) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 (X384) y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 (X379) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 (X420) y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 (X380) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 (X385) y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 (X380). En algunas modalidades, el polipéptido que comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera es un anticuerpo. La invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo que comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21 o un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21, y/o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOS. 22-28 o un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 22-28. En algunas modalidades las secuencias de aminoácidos tienen al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 99% de identidad, o 100% de identidad a las secuencias indicadas. En algunas modalidades, el polipéptido comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad con la SEQ ID NO: 18 o un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, y/o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 o un fragmento de una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22. En algunas modalidades, el fragmento comprende al menos aproximadamente 10 aminoácidos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos, al menos aproximadamente 50 aminoácidos, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido se une a CD26. En algunas modalidades, el polipéptido no es un anticuerpo monoclonal murino. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 5: X384, X385, X386, X387, X388, X399, y X420 (SEQ ID NOS:22-28, respectivamente) . La invención también proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 5: X384, X385, X386, X387, X388, X399, y X420 (SEQ ID NOS:22-28, respectivamente). Por ejemplo, en algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con la SEQ ID NO:22 (X384). En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con la SEQ ID NO:23 (X385) . En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con la SEQ ID NO:26 (X388). En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con la SEQ ID NO: 28 (X420) . En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 99% de identidad, o 100% de identidad con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias mostrada en la Figura 5: X384, X385, X386, X387, X388, X399, y X420 (SEQ ID NOS:22-28, respectivamente) . Por ejemplo, en algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende al menos aproximadamente 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOS: 22-28. En algunas otras modalidades, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 22-28. En un aspecto más, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 3: X376, X377, X378, X379, X380, X381, y X394 (SEQ ID NOS.15-21, respectivamente) . La invención proporciona además un polipéptido, como un anticuerpo, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 3: X376, X377, X378, X379, X380, X381, y X394 (SEQ ID NOS: 15-21, respectivamente). Por ejemplo, en algunas modalidades, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 (X376) . En algunas modalidades, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 (X379) . En algunas modalidades, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 (X380). En algunas modalidades, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 99% de identidad, o 100% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 3: X376, X377, X378, X379, X380, X381, y X394 (SEQ ID NOS: 15-21, respectivamente) . Por ejemplo, en algunas modalidades, la región variable de cadena ligera comprende al menos aproximadamente 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21. En otras modalidades, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende ambas de una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 22-28 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 22-28. En algunas modalidades, el polipéptido comprende al menos 5 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos, o al menos aproximadamente 50 aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 15-28. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-28. Una muestra de E. coli que contiene un plásmido que codifica para las cadenas pesada y ligera de AcMrhu 411 ha sido depositada bajo el nombre de "Escherichia coli DH5OÍ con un plásmido que tiene un inserto de cadena pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal humanizado contra ADNc de CD26 humano", y con la designación de cepa "S604069. YST-pABMC148 (x411) , "con la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, Virginia, 20108, Estados Unidos de América (10801 University Blvd. , Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de América) en Junio 30, 2006, bajo las disposiciones del tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional en Depósitos de Microorganismos para Propósitos de un Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-7695. En consecuencia, la invención proporciona un polipéptido que comprende la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo codificado por el plásmido en E. coli en la muestra nombrada "Escherichia coli DH5 con un plásmido que tiene un inserto de cadena pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal humanizado contra ADNc de CD26 humano", que tiene la designación de cepa "S604069.YST-pABMC148 (x411)", depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) bajo las disposiciones del tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósitos de Microorganismos para Propósitos de un Procedimiento de Patente. La invención proporciona además un polipéptido que comprende la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera del anticuerpo codificado por el plásmido en E. coli "Escherichia coli DH5a con un plásmido que tiene un inserto de cadena pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal humanizado contra ADNc de CD26 humano", y con la designación de cepa "S604069.YST-pABMCl48 (x411), depositada con la ATCC en Junio 30, 2006, bajo las disposiciones del tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de un Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-7695. La invención también proporciona un anticuerpo codificado por el plásmido depositado con la ATCC en E. coli como numero de acceso PTA-7695. La invención proporciona además polipéptidos que comprenden fragmentos de las secuencias polipeptídicas descritas aquí (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS : 15-21, SEQ IDS NOS: 22-28, SEQ IDS NO:29, O SEQ IDS NO:30). En algunas modalidades, el polipéptido comprende un fragmento de una secuencia polipeptídica descrita aquí, donde el fragmento es de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 75 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. La invención proporciona además un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que comprende la SEQ ID NO: 217 (véase el Ejemplo 4, más adelante), o un fragmento o variante del mismo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 217. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la SEQ ID NO:217 excepto por la secuencia señal. (Un experto en la técnica apreciará fácilmente que en algunas modalidades, la secuencia señal de un polipéptido es escindida del polipéptido) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende la región variable de la SEQ ID NO: 217. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% de identidad con la SEQ ID NO: 217 (o un fragmento de la misma) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende un fragmento de la SEQ ID NO:217 (o de su región variable), donde el fragmento es al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 75 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el polipéptido se une al CD26 humano. La invención proporciona además un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que comprende la SEQ ID NO: 218 (véase el Ejemplo 4, más adelante), o un fragmento o variante del mismo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 218. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 218 excepto para la secuencia señal.

(Un experto en la técnica apreciará fácilmente que en algunas modalidades, la secuencia señal de un polipéptido está escindida de polipéptidos. En algunas modalidades, el polipéptido comprende la región variable de la SEQ ID NO: 218. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% de identidad con la SEQ ID NO: 218 (o un fragmento de la misma) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende un fragmento de la SEQ ID NO:218 (o de su región variable), donde el fragmento es de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 75 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el polipéptido comprende además la SEQ ID NO: 218 (véase el Ejemplo 4, más adelante), o un fragmento o variante del mismo. En algunas modalidades, el polipéptido se une al CD26 humano. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo que comprende al menos una cadena pesada (por ejemplo, dos cadenas pesadas) , cada una de las cuales comprende la SEQ ID NO: 217 sin la secuencia señal, y al menos una cadena ligera (por ejemplo, dos cadenas ligeras), cada una de las cuales comprende la SEQ ID NO:218 sin la secuencia señal. La invención proporciona además un polipéptido que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 219 y/o SEQ ID NO: 220 (mostrada en el Ejemplo 13, más adelante), o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido, como un anticuerpo, que se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO:45; péptido 6), LEYNYVKQWRHSY (SEQ ID NO:46; péptido 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; péptido 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48; péptido 84), RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 49; péptido 132), YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO: 50; péptido 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO:51; péptido 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO: 52; péptido 29), SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO:53; péptido 30), y IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO:54; péptido 63) . En algunas modalidades, el polipéptido preferiblemente se une a uno o más péptidos. Esos péptidos son regiones del CD26. En algunas modalidades, el polipéptido se une preferiblemente a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO:45; péptido 6), LEYNYVKQWRHSY (SEQ ID NO:46; péptido 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 47; péptido 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO: 48; péptido 84), RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 49; péptido 132), YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO: 50; péptido 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO: 51; péptido 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52; péptido 29), SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO: 53; péptido 30), y IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO:54; péptido 63), con relación a uno o más péptidos correspondientes a otras regiones del CD26 humano. En algunas modalidades, el polipéptido (por ejemplo, el anticuerpo) se une a cada uno de los siguientes péptidos: YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO:45; péptido 6) ; LEYNYVKQWRHSY (SEQ ID NO:46; péptido 35); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 47; péptido 55); LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO: 8; péptido 84); y RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO:49; péptido 132). En algunas modalidades, el polipéptido se une a cada uno de los siguientes péptidos: YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO:45; péptido 6); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; péptido 55); RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO:49; péptido 132); YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO:50; péptido 37); y EEEVFSAYSALWW (SEQ ID NO:51; péptido 79). En algunas modalidades, el polipéptido se une a cada uno de los siguientes péptidos: DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO: 52; péptido 29); SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO:53; péptido 30); y TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; péptido 55). En algunas modalidades, el polipéptido se une a cada uno de los siguientes péptidos: DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO: 52; péptido 29); SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO:53; péptido 30); TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47; péptido 55); y IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO:54; péptido 63). En algunas modalidades, los polipéptidos se unen preferiblemente a los péptidos especificados. Pueden ser usados ensayos competitivos para determinar si dos anticuerpos se unen al mismo epítope reconociendo epítopes idénticos o esféricamente superpuestos.

Véase, por ejemplo, Dong et al. (1998) y los experimentos de especificidad en los ejemplos más adelante. Típicamente, el antígeno es inmovilizado sobre una placa multipozos y se mide la capacidad de los anticuerpos no marcados para bloquear la unión de anticuerpos marcados. Las marcas comunes para esos ensayos competitivos son marcas radioactivas y marcas enzimáticas. Además, las técnicas de trazo de mapas de epítopes conocidas por aquellos expertos en la técnica pueden ser usadas para determinar los epítopes con los cuales se unen los anticuerpos. Véase, por ejemplo el Ejemplo 3 (e) más adelante . En algunas modalidades, un polipéptido descrito aquí comprende una o más regiones constantes. En algunas modalidades, un polipéptido descrito aquí comprende una región constante humana. En algunas modalidades, la región constante es una región constante de la cadena pesada. En otras modalidades, la región constante es una región constante de la cadena ligera. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región constante la cual tiene al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, o 100% de identidad con una región constante humana. En algunas modalidades, un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) descrito aquí comprende una región Fc . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una región Fc humana. En algunas modalidades, un polipéptido descrito aquí comprende una región Fc la cual tiene al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, o 100% de identidad con una región Fc humana. En algunas modalidades, un anticuerpo descrito aquí es un anticuerpo IgG. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgGl. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgG humano. La invención proporciona anticuerpos en formas monomérica, dimérica y multivalente . Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes, pueden ser preparados usando los anticuerpos descritos aquí. Los métodos para producir anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basaba en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, con las dos cadenas pesadas teniendo diferentes especificidades (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539) . De acuerdo a un método para producir anticuerpos biespecíficos, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de unión anticuerpo-antígeno) son fusionados con secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de la bisagra, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1), conteniendo el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados, y son cotransfectados en un organismo anfitrión adecuado. Esto proporciona una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en modalidades cuando se usan relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas en la construcción que proporciona rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales de cómo resultado un alto rendimiento o cuando las relaciones no sean de significado particular. En un método, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida como una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de inmunoglobulina en únicamente una mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina indeseables. Este método es descrito en la publicación PCT No. WO 94/04690, publicada en Marzo 3, 1994. Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos unidos de manera covalente, también están dentro del alcance de la invención. Esos anticuerpos han sido usados para dirigir células del sistema inmune a células indeseables (Patente Estadounidense No. 4,676,980), y para el tratamiento contra la infección por VIH (Publicaciones de Solicitudes PCT Nos. WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser producidos usando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Los agentes y técnicas de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y son descritos en la Patente Estadounidense No. 4,676,980. En ciertas modalidades, un anticuerpo descrito aquí es un fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv y F(ab')2. En algunas modalidades, el anticuerpo es un Fab. Han sido desarrolladas varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Esos fragmentos pueden ser derivados vía digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 y Brennan et al., 1985, Science 229:81), o producidos directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E . coli y acoplados químicamente para acoplar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). En otra modalidad, el F(ab')2 es formado usando la cremallera de la enzima GCN4 para promover el impacto de la molécula de F(ab')2. De acuerdo a otro método, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')2 son aislados directamente de cultivo de células huésped recombinantes . En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son cadenas individuales (ScFv) , mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos lineales de dianticuerpos, anticuerpos de una sola cadena, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina.

Los fragmentos de región variable de una sola cadena son producidos enlazando las regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada usando un péptido enlazante corto. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Un ejemplo de un péptido enlazante es (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 85), el cual forma un puente de aproximadamente 3.5 nm entre el carboxi terminal de una región variable y el anillo terminal de la otra región variable. Han sido diseñados y usados enlazantes de otras secuencias. Bird et al. (1988). Los enlazantes pueden a su vez ser modificados para funciones adicionales, como la unión de fármacos o la unión a soportes sólidos. Las variantes de una sola cadena pueden ser producidas ya sea de manera recombinante o sintéticamente. Para la producción sintética de scFv, puede ser usado un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv, un plásmido adecuado que contiene el polinucleótido que codifica para el scFv puede ser introducido en una células huésped adecuada, ya sea eucariótica, como una levadura, planta, insecto o células de mamífero, o procariótica, como E . coli . Los polinucleótidos que codifican para el scFv de interés pueden ser producidos por manipulaciones de rutina como ligación de polinucleótidos. El scFv resultante puede ser aislado usando técnicas de purificación de proteínas estándar conocidas en la técnica. Otras formas de anticuerpos de una sola cadena, como los dianticuerpos también son abarcadas. Los dianticuerpos son anticuerpos divalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL están expresados sobre una sola cadena polipeptídica, pero usando un enlazante que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, forzando por lo tanto los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión de antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J. , et al. (1994) Structure 2:1121-1123) . La invención abarca modificaciones a anticuerpos u otros polipéptidos descritos aquí, incluyendo anticuerpos funcionalmente equivalentes, las cuales no afectan de manera significativa sus propiedades y variantes, las cuales tienen actividad mejorada o disminuida. Debe comprenderse que los principios de modificación se aplican a polipéptidos así como a anticuerpos. La modificación de los polipéptidos es una práctica de rutina en la técnica y no necesita ser descrito aquí con detalle. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de aminoácidos residuales, una o más supresiones o adiciones de aminoácidos, las cuales no cambian de manera significativamente dañina la actividad funcional, o el uso de análogos químicos.

Las inserciones o adiciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxi- terminal que fluctúan en longitud de un residuo hasta polipéptidos que contienen cientos o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de uno solo o múltiples aminoácidos residuales. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionil N-terminal o el anticuerpo fusionado a una marca de epítope. Otras variantes de inserción de 'la molécula de anticuerpo incluyen la función al N- o C-terminal del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo. Las variantes de sustitución tienen al menos un aminoácido residual en el anticuerpo u otra secuencia polipeptídica removida de un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las CDR, pero también se contemplaron las alteraciones de FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones conservativas". Si esas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden ser introducidos más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos separados.

TABLA 1: Sustituciones de Aminoácidos Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo son efectuadas seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura de esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio blanco, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se encuentran en la naturaleza se dividen en grupos sobre la base de propiedades comunes de la cadena lateral: (1) Hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) Hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; (3) Ácidos: Asp, Glu; (4) Básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) Residuos que tienen influencia sobre la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservativas son producidas intercambiando un miembro de una de esas clases por otra clase. Las sustituciones más conservativas implican intercambiar un miembro de una clase por otro miembro de la misma clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. En consecuencia, los enlaces de cisteína pueden ser agregados al anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente donde el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo como un fragmento Fv. Las modificaciones de aminoácidos pueden fluctuar del cambio o modificación de uno o más aminoácidos hasta un rediseño completo de una región, como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad y/o especificidad de unión. En algunas modalidades, se producen no más de una a cinco sustituciones conservativas de aminoácidos dentro de un dominio de CDR. En otras modalidades, se producen no más de una a tres sustituciones conservativas de aminoácidos dentro de un dominio de CDR3. En otra modalidad más, el dominio de CDR es CDRH3 y/o CDR L3. Las modificaciones también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraslacionales, como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación, y fosforilación. Los anticuerpos son glicosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol . 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacárido de las inmunoglobulinas afectan la función de la proteína (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína, lo cual puede afectar la conformación y superficie tridimensional presentada de la glicoproteína (Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glicoproteína dada a ciertas moléculas sobre la base de estructuras de reconocimiento específicas. También se ha reportado que la glicosilación de anticuerpos afecta la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . En particular, se reportó, que células CHO con expresión regulada por tetraciclina de ß (1, 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc bisectante, ha mejorado la actividad de ADCC (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180). La glicosilación de anticuerpos es típicamente ligada en N o ligada en O. Ligada en N se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina, y asparagina-X-cisteína, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de esas secuencias tripetídicas en el polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede ser usado 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo es efectuada de manera conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación ligados a N) . La alteración también puede ser producida por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación ligados a O) . El patrón de glicosilación de anticuerpos también puede ser alterado sin alterar la secuencia nucleotídica subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la células huésped usada para expresar el anticuerpo. Puesto que el tipo de célula usado para la expresión de las glicoproteínas recombinantes, por ejemplo anticuerpos, como agentes terapéuticos potenciales es dar una célula nativa, pueden esperarse variaciones en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062- 9070). Además de la elección de las células huésped, los factores que afectan la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, formulación de medios, densidad de cultivo, oxigenación, pH, esquemas de purificación y similares. Han sido propuestos varios métodos para alterar el patrón de glicosilación logrado en un organismo anfitrión particular incluyendo la introducción o sobreexpresión de ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacárido (Patentes Estadounidenses Nos. 5, 047, '335; 5,510,261 y 5,278,299). La glisocilación, o ciertos tipos de glicosilación, pueden ser removidos enzimáticamente de la glicoproteína, por ejemplo usando endoglicosidasa H (Endo H) . Además, la células huésped recombinante puede ser modificada genéticamente de modo que sea defectuosa en el procesamiento de ciertos tipos de polisacáridos. Esas y técnicas similares son bien conocidas en la técnica. Otros métodos de modificación incluyen usar técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Las modificaciones pueden ser usadas, por ejemplo, para la unión de marcas para inmunoensayos. Los polipéptidos modificados son producidos usando procedimientos establecidos en la técnica y pueden ser separados usando ensayos estándar conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen más adelante y en los ejemplos. Otras modificaciones de anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados como se describe en la Publicación PCT No. WO 99/58572, publicada en Noviembre 18, 1999. Esos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a la molécula blanco, un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa a todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Esos anticuerpos son capaces de unirse a la molécula blanco sin activar una lisis dependiente del complemento, significativa o destrucción mediada por células del blanco. En algunas modalidades, el dominio efectuado es capaz de unirse efectivamente a FcRn y/o Fc?RIIb. Esos se basan típicamente en dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos modificados de esta manera son particularmente adecuados para usarse en terapia con anticuerpos crónica, para evitar reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas a la terapia con anticuerpos convencional . En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención son conjugados. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido es conjugado con otro agente como un agente quimioterapéutico, un radionúclido, un agente inmunoterapéutico, una citocina, una quimocina, un agente formador de imágenes como una toxina, un agente biológico, un inhibidor enzimático o un anticuerpo.

En algunas modalidades, los polipéptidos, como los anticuerpos, son conjugados con porciones poliméricas solubles en agua. Los polipéptidos pueden ser conjugados con polietilen glicol (PEG) , monometoxi-PEG, copolímeros de etilen glicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextran, polivinil alcohol o similares. Los polipéptidos pueden ser modificados en posiciones aleatorias con la molécula, o en posiciones predeterminadas con la molécula y pueden incluir una, dos, tres o más porciones unidas. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. En algunas modalidades, la porción se une al polipéptido vía un enlazante. En algunas modalidades, la porción unida incrementa la vida media en circulación del polipéptido en un mamífero. Los métodos de unión de polímeros como el PEG a polipéptidos incluyendo los anticuerpos son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, los polipéptidos son polipéptidos PEGilados, como anticuerpos PEGilados. La invención incluye modalidades maduradas por afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos madurados por afinidad pueden ser producidos por procedimientos conocidos en la técnica (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al, 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J.

Immunol., 154 (7 ): 3310-9; Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; y WO2004/05818 ) . Los anticuerpos madurados por afinidad candidatos pueden ser separados o seleccionados por su afinidad de unión mejorada y/o alterada usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la selección y separación usando el análisis de resonancia plasmónica superficie BIAcore, y selección usando cualquier método conocido en la técnica para la selección, incluyendo presentación de fago, presentación de levadura y presentación de ribosoma. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados usando métodos de hibridoma, como aquéllos descritos por Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495. En un método de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal anfitrión apropiado, es inmunizado típicamente con un agente inmunizante para producir linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al agente inmunizante. De manera alternativa, los linfocitos pueden ser inmunizados in vi tro . Los anticuerpos monoclonales (así como otros polipéptidos) de la invención también pueden ser producidos por métodos de ADN recombinante, como aquéllos descritos en la Patente Estadounidense No. 4,816,567. Los métodos para preparar polipéptidos y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, el ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales es aislado, secuenciado y/o amplificado usando procedimientos convencionales, como usando sondas oligonucleotídicas o cebadores que sean capaces de unirse específicamente a genes o polinucleótidos que codifiquen para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales. Las secuencias que codifican para los polipéptidos, como los anticuerpos, de una secuencia deseada también pueden ser preparados fácilmente usando una combinación de métodos de ADN sintéticos, métodos de PCR, y técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, los cuales son entonces transfectados en células huésped como células de E. coli , células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que en otras circunstancias no produzcan proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención (por ejemplo, anticuerpos) son expresados en cualquier organismo, o células derivadas de cualquier organismo, incluyendo, pero sin limitarse a bacterias, levaduras, plantas, insectos y mamíferos. Los tipos particulares de células incluyen, pero no se limitan a, células Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras, E. coli , Bacillus subtilis, células SF9, células HEK-293, Neurospora, células BHK, células CHO, células COS, células HeLa, fibroblastos, líneas células de Schwannoma, líneas celulares mieloides y linfoides de mamífero inmortalizadas, células de Jurkat, mastocitos y otras 'células endocrinas y exocrinas y células neuronales. Una variedad de sistemas de expresión de proteína, vectores, y medios celulares útiles en la producción de polipéptidos son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Publicaciones de Patente Internacionales Nos. WO 03/054172, WO 04/009823, y WO 03/064630, así como las Publicaciones de Patentes Estadounidenses Nos. US 2005/0170454, US 2005/0084928, y US 2006/0003405, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En algunas modalidades, es usado un sistema de expresión glutamina sintetasa (GS) para la expresión de los polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos). El polipéptido puede ser purificado o aislado después de la expresión de acuerdo a métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los ejemplos de métodos de purificación incluyen técnicas electroforéticas, moleculares, inmunológicas y cromatográficas, incluyendo la cromatografía de intercambio iónico, afinidad hidrofóbica, y CLAP en fase inversa, y cromatoenfoque . El grado de purificación necesariamente variará dependiendo del uso del polipéptido. En algunos casos, no será necesaria la purificación.

El ADN puede ser modificado, por ejemplo, uniendo covalentemente a la inmunoglobulina que codifica a la secuencia de toda o parte de la secuencia codificadora para un polipéptido diferente a una inmunoglobulina. De esa manera, son preparados anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tengan la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal descrito aquí. Típicamente, esos polipéptidos no inmunoglobulínicos son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo divalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un CD26 del epítope de la superficie y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno o epítope de CD26 diferente. La invención también abarca anticuerpos humanizados. Los anticuerpos terapéuticos con frecuencia producen efectos adversos, en parte debido a la activación de una respuesta inmune dirigida contra anticuerpo administrado. Este puede dar como resultado una reducción de la eficacia del fármaco, agotamiento de las células que contiene el antígeno blanco, y una respuesta inflamatoria indeseable. Para evitar lo anterior, pueden ser generados anticuerpos humanizados anti-CD26 recombinantes. El principio general en la humanización de un anticuerpo implica retener la secuencia básica de la porción de unión del antígeno del anticuerpo, eliminando a la vez al menos porciones del resto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpo humano. Cuatro pasos generales tradicionales, pero no limitantes, para humanizar un anticuerpo monoclonal incluyen: (1) determinar la secuencia nucleotídica y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligero y pesado del anticuerpo inicial (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir cual región estructural o residuos y/o residuos de CDR del anticuerpo se usarán durante el proceso de humanización (3) las metodologías/técnicas de humanización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. La región constante también puede ser modificada para asemejarse más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmune si el anticuerpo es usado en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,997,867 y 5,866,692. En los anticuerpos humanizados recombinantes, la porción Fc? puede ser modificada para evitar interacción con el receptor de Fe? y el sistema inmune del complemento. Las técnicas para la preparación de esos anticuerpos son descritas en la WO 99/58572. Han sido descritas numerosas moléculas de anticuerpo "humanizado" que comprenden un sitio de unión de antígeno derivadas de una inmunoglobulina no humanas, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus regiones determinantes de la complementariedad (CDR) asociadas fusionadas a los dominios constantes humanos. Véase, por ejemplo, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991); Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987); y Brown et al. Cáncer Res. 47:3577-3583 (1987). Otras referencias describen CDR de ratón injertadas en una región estructural (FR) de soporte humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado. Véase, por ejemplo, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988); y Jones et al. Nature 321:522-525 (1986). Otras referencias describen CDR de roedor y soportadas por regiones estructurales de roedor de manera recombinante. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea No. 519,596. Esos tipos de moléculas "humanizadas" se diseñan para minimizar una respuesta inmunológica indeseable hacia moléculas de anticuerpo anti humano de ratón, lo cual limita la duración y efectividad de las aplicaciones terapéuticas de aquellas porciones en receptores humanos. Otros métodos de humanización de anticuerpos que también pueden ser utilizados pueden ser descritos por Daugherty et al. Nucí . Acids Res . , 19:2471-2476 (1991) y en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; ,866,692; 6,210,671; 6,350,861; y PCT WO 01/27160. Los métodos ejemplares adicionales para humanizar anticuerpos son descritos en la Publicación Internacional No.

WO 02/084277 y la Publicación Estadounidense No. US 2004/0133357, ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. En otra alternativa más, pueden ser obtenidos anticuerpos completamente humanos usando ratones comercialmente disponibles, los cuales han sido modificados para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específicas. Los animales transgénicos que se diseñaron para producir una respuesta inmune más deseable (por ejemplo, anticuerpos completamente humanos) más robusta también pueden ser usados para la colocación de anticuerpos humanizados o humanos. Los ejemplos de esas tecnologías son XenomouseMR de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y HuMAb-Mouse® y TC MouseMR de Medarex, Inc. (Princeton, NJ) . En otra alternativa, los anticuerpos pueden ser producidos de manera recombinante por la tecnología de presentación de un fago. Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743 y 6,265,150; y Winter et al., Annu. Rev. Immunol . 12:433-455 (1994). De manera alternativa, la tecnología de presentación de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) puede ser usada para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vi tro, a partir de repertorios de genes del dominio variable de inmunoglobulina (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo a esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo son clonados en marco ya sea en genes de proteína de recubrimiento mayores o menores de un bacteriófago filamentoso, como el M13 o fd, y presentados, fragmentos de anticuerpo funcional sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia del ADN de una sola hebra del genoma del fago, la selección basada en las propiedades funcionales del anticuerpo también puede dar como resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. De este modo, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. La presentación de fago puede ser efectuada en una variedad de formatos; para una revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3, 564-571 (1993) . Pueden ser usadas varias fuentes de segmentos del gen V para la presentación de fago. Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) aislado de un arreglo diverso de anticuerpos de anti-oxazolona de una biblioteca combinada aleatoria pequeña de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Puede ser construido un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden ser aislados anticuerpos para un arreglo diverso de antígenos (incluyendo autoantígeno) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Mark et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993) . En una respuesta inmune natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones en un alto porcentaje (hipermutación somática) . Algunos de los cambios introducidos conferirán mayor afinidad, y las células B que presentan inmunoglobulina superficiales de alta afinidad son replicadas y diferenciadas preferiblemente durante el desafío con antígeno posterior. Este proceso natural puede ser imitado empleando la técnica conocida como "arrastre de cadena", Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). En este método, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos por la presentación de fago puede ser mejorada reemplazando secuencialmente los genes de la región V de cadena pesada y ligera con repertorios de variantes naturales (repertorios) de genes del dominio V obtenido de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con afinidades en el intervalo de pM-nM. Una estrategia para producir repertorios de anticuerpo de fago muy grandes (también conocidos como "la madre de todas las bibliotecas") ha sido descrita por Waterhouse et al., Nucí. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). El arrastre de genes también puede ser usado para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos de roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares por el anticuerpo de roedor inicial. De acuerdo a este método, el cual también es conocido como "impresión del epítope", el gen del dominio V de cadena pesada o ligera de los anticuerpos de ratón obtenidos por la técnica de presentación de fago es reemplazado con un repertorio de genes del dominio V humano, creando quimeras de roedor-humano. La selección de un antígeno da como resultado el aislamiento de regiones variables humanas capaces de reestablecer un sitio de unión de antígeno funcional, es decir, que el epítope gobierna (imprime) la elección del patrón. Cuando el proceso se repite para reemplazar el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase la Solicitud de Patente PCT WO 9306213, publicada en Abril 1, 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedor injertando CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, los cuales no tienen residuos estructurales o de CDR de origen de roedor. Es evidente que aunque la discusión anterior pertenece a anticuerpos humanizados, los principios generales discutios aquí son aplicables a la adaptación de anticuerpos para usarse, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos. Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden ser preparados in vi tro usando métodos conocidos de química sintética de proteínas, incluyendo aquéllos que implican agentes reticulantes. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden ser construidas usando una reacción de intercambio de disulfuro o por la formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato . También pueden ser producidos fragmentos Fv de una soal cadena, como se describe en Iliades et al., 1997, FEBS Letters, 409:437-441. El acoplamiento de esos fragmentos de una sola cadena usando varios enlazantes es descrito en Kortt et al., 1997, Protein Engineering, 10:423-433. Una variedad de métodos para la producción recombinante y manipulación de anticuerpos, son bien conocidos en la técnica. En un aspecto, la invención proporciona métodos para producir los polipéptidos descritos aquí. En algunas modalidades, el método comprende expresar un polinucleótido en una célula anfitriona, donde el polinucleótido codifica para el polipéptido. En algunas modalidades, el método es un método para producir un anticuerpo y comprende expresar uno o más polinucleótidos en una células huésped (por ejemplo, en un cultivo celular) , donde cada cadena del anticuerpo es codificada por al menos uno de los polinucleótidos. En algunas modalidades, uno o más polinucleótidos se encuentran sobre el mismo vector. En otras modalidades, uno o más polinucleótidos se localizan sobre vectores separados. En algunas modalidades, los métodos para producir polipéptidos descritos aquí comprenden además el paso de aislar los polipéptidos de las células huésped en las cuales son expresadas (por ejemplo, aisladas del cultivo celular en el cual las células huésped crecieron.

Polinucleótidos , secuencias variantes , vectores y células huésped La invención proporciona además polinucleótidos que codifican para los polipéptidos, como anticuerpos, descritos aquí. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican para un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o región variable de cadena ligera descrita aquí. Se proporcionan vectores, como los vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos. Se proporcionan además las células huésped que comprenden los vectores y/o polinucleótidos de la invención. En algunas modalidades, los polinucleótidos están aislados. En un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de cada una de las secuencias mostradas en la Figura 2 y la Figura 4 (SEQ IDS NOS: 1-14), o un fragmento de las mismas. La invención proporciona además un polinucleótido que se híbrida bajo afecciones moderadamente rigurosas a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de aquellos polinucleótidos mostrados en la Figura 2 y la Figura 4 (SEQ IDS NOS: 1-14) . En algunas modalidades, el polinucleótido se híbrida bajo afecciones altamente rigurosas a un polinucleótido mostrado en la Figura 2 y la Figura 4 (SEQ IDS NOS: 1-14). En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de cada una de las siguientes secuencias mostradas en la Figura 3 o la Figura 5: X376, X377, X378, X379, X380, X381, X394, X384, X385, X386, X387, X388, X399, y X420 (SEQ ID NOS:15-28) . La invención proporciona además un polinucleótido que comprende un polinucleótido de la secuencia SEQ ID NO: 215 y/o SEQ ID NO:216 (véase el Ejemplo 4, más adelante), o un fragmento de la misma. En algunas modalidades, el fragmento comprende al menos 12, al menos 20, al menos 50, al menos 75, o al menos 100 nucleótidos. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende una polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 215 que codifica para la cadena pesada. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende un polinucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 216 que codifica para la cadena ligera. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 215 que codifica para la cadena pesada. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende un polinucleótido que comprende el fragmento de la SEQ ID NO: 216 que codifica para la cadena ligera. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 215 que codifica para la región variable de cadena pesada. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende un polinucleótido que comprende el fragmento de la SEQ ID NO: 216 que codifica para la región variable de cadena ligera. La invención también proporciona un polinucleótido (por ejemplo, un anticuerpo) que codifica para un polipéptido que comprende la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo codificado por el plásmido en E. coli en la muestra nombrada "Escherichia coli DH5a con el plásmido que tiene el inserto de la cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal humanizado contra ADNc de CD26 humano", que tiene la designación de cepa "S604069.YST-pABMC148 (x411) , " depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) en Junio 30, 2006, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de un Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-7695. La invención proporciona además un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera del anticuerpo codificado por el plásmido en E. coli en la muestra "Escherichia coli DH5a con el plásmido que tiene el inserto de la cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal humanizado contra ADNc de CD26 humano", que tiene la designación de cepa "S604069.YST-pABMCl48 (x411) , " depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) en Junio 30, 2006, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de un Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-7695. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende las secuencias que codifican para la cadena pesada y/o ligera de la secuencia depositada. Los sistemas de expresión que comprenden los vectores de expresión y células huésped pueden ser usados en un método de producción de un polipéptido, como un anticuerpo, de la invención, donde la células huésped es cultivada y el polipéptido producido por la células huésped cultivada es recuperado. Los polinucleótidos que codifican para anticuerpos de la invención también pueden ser proporcionados a un sujeto o anfitrión para la expresión del anticuerpo por las células del sujeto anfitrión. Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de esas secuencias también son abarcados por la presente invención. Los polinucleótidos pueden ser de una sola hebra (de codificación o antisentido) o doble hebra, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnARN, las cuales contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN en una forma uno a uno, y moléculas de ARN, las cuales no contienen intrones. Secuencias codificadoras o no codificadoras adicionales pueden, pero no necesariamente estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no necesariamente estar ligado a otras moléculas y/o materiales de soporte. También se proporcionan variantes de los polinucleótidos y polipéptidos descritos aquí. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, supresión y/o inserciones. En algunas modalidades, las variantes son tales que la unión del polipéptido codificado al CD26 humano no disminuye de manera sustancial, en relación al polipéptido codificado por el polinucleótido original o el polipéptido. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado puede ser evaluado generalmente como se describe aquí. Las variantes preferiblemente exhiben al menos aproximadamente 70% de identidad, de manera más preferible al menos aproximadamente 80% de identidad y de manera más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad en la secuencia original o una porción de la misma. En algunas modalidades, donde una secuencia está siendo comparada con una CDR o un fragmento pequeño, la ventana de comparación puede ser más pequeña, por ejemplo de al menos 7 aminoácidos o al menos 10 aminoácidos. Se dice que dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas son "idénticas" o tienen "identidad" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para su correspondencia máxima como se describe más adelante. Las comparaciones entre las dos secuencias son efectuadas típicamente comparando la secuencia sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" como se usa aquí, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, usualmente de 30 hasta aproximadamente 75, de 40 hasta aproximadamente 50, en la cual una secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias sean alineadas de manera óptima. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede ser conducida usando el programa Megalign en Lasergene de bioinformatics software (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), usando los parámetros predeterminados. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en la siguiente referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships . In Dayhoff, M.O. (ed. ) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. , 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, EW. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, MoL Biol. Evol .4 : 406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, WJ. y Lipman, DJ., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 726-730. De manera alternativa, el % de identidad (de aminoácidos) puede ser obtenido usando uno de los programas disponibles al público BLAST o BLAST-2. El programa de computadora WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). El por ciento de identidad de secuencia (de aminoácido) también puede ser determinado usando el programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa BLAST se basa en el método de alineación de Karlin y Altschul. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990) y como se discute en Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin Y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); y Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).

En algunas modalidades, el "porcentaje de identidad" es determinado comparando dos secuencias alineadas de manera óptima sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, donde la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos, usualmente de 5 a 15 por ciento, o 10 a 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (las cuales no comprenden adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado determinando el número de posiciones en las cuales las bases de ácido nucleico o aminoácidos residuales ocurren en ambas secuencias para producir el número de posiciones y similares, dividiendo el número de posiciones similares por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencias. En algunas modalidades, la ventana de comparación puede ser más pequeña (por ejemplo, 7 o 10 aminoácidos). Las variantes también pueden, o de manera alternativa, ser sustancialmente homologas a un polinucleótido descritos aquí, o una porción o complemento de las mismas. Esas variantes polinucleotídicas son capaces de hibridarce bajo afecciones moderadamente rigurosas a una secuencia de ADN natural que codifique para un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria) . En algunas modalidades, las variantes son capaces de hibridarce bajo afecciones altamente rigurosas a la secuencia original. Las "condiciones moderadamente rigurosamente adecuadas " incluyen prelavado en una solución de 5 X SSC, 0.5% SDS, EDTA a 1.0 mM (pH 8.0); hibridando a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido por dos lavados a 65°C durante 20 minutos con cada una de 2X, 0.5X y 0.2X SSC con un contenido de 0.1% de SDS. Como se usa aquí, "condiciones altamente rigurosas" o "afecciones altamente estrictas" son aquéllas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M /citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con 0.% de albúmina de suero bovino/0.15 de Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/amortiguador de fosfato de sodio 50mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (MNaCl 0.75, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, 5 x solución de Denhardt's, ADN de esperma de salmón (50 µg/ml), 0.1% de SDS, y 10% de sulfato de dextran a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C, seguido por un lavado riguroso consistente de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55°C. El experto reconocerá como ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores como la longitud de la sonda y similares. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias nucleotídicas que codifican para un polipéptido como se describe aquí. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso del codón son contemplados específicamente por la presente invención. Los polinucleótidos pueden ser preparados usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica. El ADN que codifica para un anticuerpo puede ser obtenido de una biblioteca de ADNc preparada de tejidos que expresa un ARNm del anticuerpo. El gen que codifica para el anticuerpo también puede ser obtenido de una biblioteca genómica o por síntesis oligonucleotídica . Las bibliotecas pueden ser separadas con sonda (como patrones o moldes de unión u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. Las bibliotecas ilustrativas incluyen la biblioteca de ADNc de hígado humano (ADNc más una extensión 5' de hígado humano, Clontech Laboratories, Inc.) y biblioteca de ADNc de riñon de ratón (ADNc con una extensión 5' de riñon de ratón, Clontech laboratories, Inc.). La selección de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada puede ser conducida usando procedimientos estándar, como aquéllos descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. De manera alternativa, el gen puede ser aislado codificando el anticuerpo usando tecnología PCR (Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Las variantes polinucleotídicas pueden ser preparadas generalmente por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la síntesis química, por ejemplo, por síntesis química por fosforamidita en fase sólida. Las modificaciones en una secuencia polinucleotídica también pueden ser introducidas usando técnicas de mutagénesis estándar, como la mutagénesis específica del sitio dirigida al oligonucleótido (véase Adelman et al., DNA 2:183, 1983). De manera alternativa, las moléculas de ARN pueden ser generadas por transcripción in vi tro o in vivo de secuencias de ADN que codifiquen para un anticuerpo, o una porción del mismo, siempre que el ADN se incorpore en un vector con un promotor de ARN polimerasa adecuado (como un T7 o SP6) .

Pueden ser usadas ciertas porciones para preparar un polipéptido codificado, como se describe aquí. Además, o de manera alternativa, puede ser administrada una porción a un paciente de modo que el polipéptido codificado sea generado in vivo (por ejemplo, transfectando células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, con un constructo de ADNc que codifique para el polipéptido, y administrando las células transfectadas al paciente) . Cualquier polinucleótido puede ser modificado adicionalmente para incrementar la estabilidad in vivo . Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de enlaces de fosfodiesterasa en el esqueleto; y/o la inclusión de bases no tradicionales como la inosina, queosina y wibutosina, así como formas modificadas de acetil-, metil-, tio- y otras de la anadenina, citidina, guanina, timina y uridina. Las secuencias nucleotídicas pueden ser unidas a una variedad de otras secuencias nucleotídicas usando técnicas de ADN recombinante establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser clonado en cualquiera de una variedad de vectores de clonación, incluyendo plásmidos, fagémidos, derivados de faga lambda y cósmidos. Los vectores de interés particular incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sonda y vectores de secuenciamiento. El general, el vector contendrá un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios de endonucleasa de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables. Otros elementos dependerán del uso deseado, y serán evidentes a aquellos expertos en la técnica . Dentro de ciertas modalidades, los polinucleótidos pueden ser formulados para permitir la entrada de una célula de un mamífero, y para permitir la expresión en él. Esas formulaciones son particularmente útiles para propósitos terapéuticos, como se describe más adelante. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que existen muchas formas de lograr la expresión de un polinucleótido en una célula blanco, y cualquier método adecuado puede ser empleado. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser incorporado en un vector viral, como, pero sin limitarse, a adenovirus, adenovirus asociado, retrovirus, o vaccinia u otros pox virus (por ejemplo, virus de la viruela avian) . Las técnicas para incorporan ADN en esos vectores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un vector de prioridad puede adicionalmente transferir o incorporar un gen para el marcador seleccionable (para ayudar a la identificación o selección de células transducidas) y/o una porción directora, como un gen que codifique para un ligando para un receptor para una célula blanco especifica, para hacer el vector blanco específico. El direccionamiento también puede ser logrado usando un anticuerpo, por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Composiciones y Ki ts Farma céuticos La presente invención proporciona además composiciones que comprenden los polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) y/o polinucleótidos descritos aquí. Por ejemplo, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos descritos aquí. También se proporcionan kits que comprenden los polipéptidos. Las composiciones de la invención incluyen composiciones de fármacos a granel útiles en la elaboración de composiciones no farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para la administración a un sujeto o paciente) las cuales pueden ser usadas en la preparación de formas de dosificación unitarias. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende un polipéptido descrito aquí y un excipiente farmacéuticamente aceptable (también referido aquí como "soporte farmacéuticamente aceptable"). En algunas modalidades, el polipéptido en la composición farmacéutica es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido en la composición farmacéutica es un anticuerpo humanizado.

Las composiciones farmacéuticas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros compuestos que puedan ser biológicamente activos o inactivos. Una composición farmacéutica puede contener ADN que codifique para uno o más de los polipéptidos como se describió anteriormente, de modo que el polipéptido sea generado in si tu . Como se hizo notar anteriormente, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de liberación conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, sistemas de expresión bacterianos y virales. Numerosos métodos de liberación de genes son bien conocidos en la técnica, como aquéllos descritos por Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, y referencias citadas aquí. Los sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen la secuencia de ADN necesarias para la expresión en el paciente (como un promotor y una señal de terminación adecuada) . En una modalidad preferida, el ADN puede ser introducido en un sistema de expresión viral (por ejemplo, vaccinia u otro poxvirus, retrovirus, o adenovirus), el cual puede implicar el uso de un virus competente para la replicación no patógena (defectuosa) . Los sistemas adecuados son descritos, por ejemplo, en Fisher-Hoch et al, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann.

N. Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine 8:17-21; Patentes Estadounidenses Nos. 4,603,112, 4,769,330, and 5,017,487; WO 89/01973; Patentes Estadounidenses No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation 88:2838-2848; y Guzman et al., 1993, Cir. Res. 73:1202-1207. Las técnicas para incorporar ADN en esos sistemas de expresión son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. El ADN también puede ser "desnudo" como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., 1993, Science 259:1745- 1749, y revisado por Cohén, 1993, Science 259:1691-1692. El ADN absorbido y desnudo puede incrementarse recubriendo el ADN sobre perlas biodegradables, las cuales son transportadas de manera eficiente hacia las células. Aunque cualquier soporte adecuado conocido por aquellos expertos en la técnica puede ser empleado en las composiciones farmacéuticas de ésta invención, el tipo de soporte variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para cualquier forma apropiada de administración incluyendo por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, como la inyección subcutánea, el soporte preferiblemente comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera, o un amortiguador. Para la administración oral, cualquiera de los soportes anteriores o un soporte sólido, como el manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sucrosa y carbonato de magnesio, pueden ser empleados. También pueden emplearse microesferas biodegradables (por ejemplo, poliglicolato de polilactato) como soporte para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,897,268 y 5,075,109. Esas composiciones también pueden comprender amortiguadores (por ejemplo, solución salina amortiguada neutra o solución salina amortiguada con fosfato) , carbohidratos, (por ejemplo, glucosa, mannosa, sucrosa o dextran), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como la glicina, antioxidantes, agente quelante como el EDTA o glutation, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o preservativos. De manera alternativa, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas como un liofilizado. Los compuestos también pueden ser encapsulados dentro de liposomas usando tecnología bien conocida. Las composiciones descritas aquí pueden ser administradas como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación como una cápsula o esponja que efectúe la liberación lenta del compuesto después de la administración) . Esas formulaciones pueden ser preparadas de manera general usando tecnológica bien conocida y administradas, por ejemplo, por vía oral, rectal o implantación subcutánea, o por implantación en el sitio blanco deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo disperso en una matriz de soporte y/o contenida dentro de un reservorio rodeado por la membrana controladora de la velocidad. Los soportes para usarse en esas formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferiblemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de componente activo. La cantidad de compuesto activo contenido dentro de la formulación de liberación sostenida depende del sitio de implementación, la velocidad y duración esperada de la liberación y la naturaleza de la afección a ser tratada. En algunas modalidades, el polipéptido también puede ser atrapado en microcápsulas, preparado, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina- y microcápsulas de poli (metacrilato de metilo), respectivamente), el sistema de liberación de fármacos, coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones . Esas técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000. Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítope de unión del receptor de salvamento en el anticuerpo (especialmente que fragmente anticuerpos) como se describe en la Patente Estadounidense 5,739,277, por ejemplo. Como se usa aquí, el término "epítope de unión del receptor de salvamento" se refiera a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable del incremento de la vida media en suero, in vivo de la molécula IgG. Los anticuerpos descritos aquí también pueden ser formulados como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo son preparados por métodos conocidos en la técnica, como se describe en Epstein et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030; y Patentes Estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con un tiempo de circulación mayor son descritas en la Patente Estadounidense No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden ser generados por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con un diámetro deseado. Además, los fragmentos de Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288, vía una reacción de intercambio de disulfuro. También se proporcionan los kits y artículos de manufactura que comprenden los polipéptidos, polinucleótidos, vectores, o células huésped. En algunas modalidades, el artículo de manufactura comprende un recipiente con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos y tubos de prueba. Los recipientes pueden ser formados de una variedad de materiales como vidrio o plástico. En algunas modalidades, el recipiente contiene una composición útil en la identificación y cuantificación de células que expresan CD26, la inhibición de la proliferación de células que expresan CD26 o el tratamiento contra una enfermedad asociada con la expresión de CD26. En algunas modalidades, la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición es útil para la identificación o cuantificación de células que expresan CD26, la inhibición de la proliferación de células que expresan CD26, o el tratamiento contra una enfermedad asociada con la expresión de CD26. En algunas modalidades, el kit de la invención comprende el recipiente de kit descrito anteriormente. En otras modalidades, el kit de la invención comprende el recipiente descrito anteriormente y un segundo recipiente que comprende un amortiguador. En algunas modalidades, el kit comprende un inserto de paquete con instrucciones para el uso de un polipéptido, polinucleótido, vector o células huésped contenida en el.

Métodos de uso de polipéptidos Los polipéptidos (como los anticuerpos) de la presente invención son útiles en una variedad de aplicaciones incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de diagnóstico y métodos de tratamiento terapéutico. También se proporcionan métodos de inhibición de la proliferación de células que expresan CD26. Los anticuerpos y polipéptidos de la invención pueden ser usados en la detección, diagnóstico y/o verificación de una afección (como una enfermedad o trastorno) asociada con la expresión de CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección asociada con la expresión de CD26 anormal. Por ejemplo, en algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección asociada con una expresión de CD26 alterada o aberrante (en algunas modalidades, la expresión de CD26 incrementada o disminuida (con relación a una muestra normal), y/o expresión inapropiada, como la presencia de la expresión en tejido y/o células que normalmente carecen de expresión de CD26, o ausencia de expresión de CD26 en tejidos o células que normalmente poseen la expresión de CD26) . En algunas modalidades, la afección asociada a la expresión de CD26 es una afección asociada con la sobreexpresión de CD26. Debe comprenderse que la sobreexpresión de CD26 incluye tanto un incremento en la expresión de CD26 en células o tejidos los cuales normalmente expresan CD26 con relación al nivel normal de expresión de CD26 en aquellas células o tejidos, así como la presencia de expresión de CD26 en tejidos o células que normalmente carecen de expresión de CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es mediada, al menos en parte, por CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección asociada con las células que expresan CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección asociada con la proliferación de células que expresen' CD26. En algunas modalidades, la proliferación de células que expresan CD26 es una proliferación anormal. El método de diagnóstico puede ser in vi tro o in vivo . Se hace referencia de manera ejemplar en esta discusión a anticuerpos, con la comprensión de que esta discusión también pertenece a los polipéptidos de la invención . Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo será marcado típicamente con una porción detectable, incluyendo pero sin limitarse a radioisótopos, marcas fluorescentes y varias marcas de enzima-sustrato. Los métodos para conjugar las marcas a un anticuerpo son conocidos en la técnica. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención no necesitan ser marcados, y la presencia de los mismos puede ser detectada usando un anticuerpo marcado el cual se une a los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser empleados en cualquier método de ensayo conocido, como ensayos de unión competitiva, ensayos de emparedados directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Anticuerpos: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987) . Los anticuerpos también pueden ser usados para ensayos de diagnóstico in vivo, la formación de imágenes in vivo . Generalmente, el anticuerpo es marcado con un radionúclido (como ?nIn, 99Tc, 1C, 131I, 125I, o 3H) de modo que las células o tejidos de interés puedan localizarse usando inmunoescintiografía . El anticuerpo también puede ser usado como un reactivo de tinción en patología, siguiendo los métodos bien conocidos en la técnica. En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la proliferación de una célula que expresa CD26. La inhibición de la proliferación de una célula que expresa CD26 abarca cualquier nivel observable de inhibición, incluyendo la inhibición parcial o completa de la proliferación. En algunas modalidades, la proliferación de las células es inhibida a al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98%, o aproximadamente 100%. El método puede ser in vi tro o in vivo . En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto la célula con un polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) descrito aquí. Generalmente, la célula será puesta en contacto con una cantidad del polipéptido suficiente para inhibir la proliferación de las células. Un número de células cancerígenas han sido identificadas por expresar CD26. Por ejemplo, el CD26 ha sido identificado por ser sobreexpresada en cada una de las siguientes células cancerígenas: linfoma de células T (Ruiz et al. (1998) Cytometry, 34:30-5); Leucemia Linfocítica Crónica B (B-CLL) (Bauvois et al. (1999) Br. J. Cáncer, 79:1042-8); carcinoma tiroide (Aratake et al. (1991) Am. J.

Clin. Pathol., 47:43-7); carcinoma de células básales (Moehrle et al. (1995) J. Cutan. Pathol. 22:241-7); cáncer de mama (Dixon et al. (1994) Clin. Pathol., 47:43-7); carcinoma hepatocelular (Stecca et al. (1997) 27:337-45); y tumores de pulmón (Sedo et al. (1991) 40:359-62). Los resultados experimentales que indican que el CD26 es expresado en una variedad de líneas celulares cancerígenas también se proporcionan en el ejemplo específico, Ejemplo 12, más adelante . En algunas modalidades de los aspectos descritos aquí, una célula que expresa CD26 es una célula humana. En algunas modalidades, una célula que expresa CD26 es una célula cancerosa. En algunas modalidades, una célula que expresa CD26 es una célula de cáncer hematológico, una célula de cáncer de Células T, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer renal, una célula de linfoma, una célula de cáncer de células B, una célula de cáncer tiroideo, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de estómago, una célula de cáncer testicular, una célula de cáncer uterino, una célula de cáncer cerebral, una célula de cáncer linfático, una célula de cáncer de la piel, una célula de cáncer óseo, una célula de cáncer rectal, una célula de sarcoma, una célula de cáncer de linfoma de Células T, una célula de adenocarcinoma de pulmón, una célula de carcinoma tiroideo, una célula de leucemia linfocítica crónica de células B, o una célula de linfoma de células B. En algunas modalidades, la célula cancerosa es una célula de linfoma, una célula de cáncer de riñon, una célula de cáncer de próstata, o una célula de cáncer de pulmón. En algunas modalidades, una célula que expresa CD26 es una célula tumoral, como una célula en un tumor sólido. En algunas modalidades, la célula tumoral es maligna o benigna. En algunas modalidades, una célula que expresa CD26 es una Célula T. En algunas modalidades, la célula es una Célula T humana. En algunas modalidades, la célula es una Célula T maligna. En algunas modalidades, una célula que expresa CD26 es una célula inmune hiperactiva. En algunas modalidades, una célula que expresa CD26 es una Célula T activada. En algunas modalidades, las células son humanas. En algunas modalidades, las célula cancerosa que expresa CD26 sobreexpresa CD26 con relación a una célula no cancerosa del mismo tipo. En algunas modalidades, la célula cancerosa que sobreexpresa CD26 es una célula de cáncer de mama, célula de cáncer de próstata, célula de cáncer colorrectal, célula de cáncer de ovario, célula de cáncer renal, linfoma de Células T, leucemia linfocítica crónica B (B-CLL), carcinoma de células básales, carcinoma hepatocelular, o una célula de cáncer de pulmón.

Los métodos para la evaluación de la inhibición de la proliferación de una célula son conocidos en la técnica e incluyen ensayos MTT. (Véase, por ejemplo, Aytac et al. (2003) British Journal of Cáncer 88:455-462, Ho et al. (2001) Clinical Cáncer Research 7:2031-2040, Hansen et al. (1989) J. Im unol. Methods, 119:203-210, y Aytac et al. (2001) Cáncer Res. 61:7204-7210.) También se proporcionan ejemplos de ensayos MTT en los ejemplos específicos 2 (G) , 3(D), y 5 más adelante . La invención proporciona además métodos para tratar una afección asociada con la expresión de CD26 en un sujeto. En algunas modalidades, el método de tratamiento contra una afección asociada con la expresión de CD26 en un sujeto, comprende, administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un polipéptido, como un anticuerpo, descrito aquí como el sujeto. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 se asocia con la expresión anormal de CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección asociada con la expresión alterada o aberrante de CD26 (en algunas modalidades, la expresión incrementada o disminuida de CD26 (con relación a una muestra normal) , y/o expresión inapropiada, como la presencia de expresión en tejidos y/o células que normalmente carecen de expresión de CD26, o ausencia de expresión de CD26 en tejidos o células que normalmente poseen expresión de CD26) . En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección asociada con la sobreexpresión de CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es mediada, al menos en parte, por CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección asociada con las células que expresan CD26. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección asociada con la proliferación de células que expresan CD26. En algunas modalidades, la proliferación de células que expresan CD26 es anormal. En algunas modalidades, las células que expresan CD26 son Células T. En algunas modalidades, la célula que expresa CD26 es una célula tumoral, la cual puede ser maligna o benigna. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es un cáncer en el cual las células cancerígenas son células cancerígenas CD26+ o expresan CD26 (es decir, un cáncer que expresa CD26) . (Las células adicionales que expresan CD26 se describieron anteriormente.) En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 en un sujeto es una trastorno proliferativo. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 en un sujeto es un cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es una enfermedad maligna hematológica CD26+. En algunas modalidades, es un cáncer de Células T, como un linfoma de Células T. Por ejemplo, en algunas modalidades, el cáncer es un linfoma linfoblástico de Células T o leucemia linfoblástica aguda. En otras modalidades, el cáncer es un linfoma de células grandes, anaplásico de Células T CD30+. En algunas modalidades, el cáncer es un linfoma de Células T periférico, una leucemia linfocítica crónica de Células T, un linfoma de Células T angioinmunoblástico, un linfoma de Células T angiocéntrico, una leucemia de Células T relacionada con HTLV, una leucemia de Células T adulta. En algunas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático, cáncer de riñon, o linfoma. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de células B, cáncer tiroideo, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer uterino, cáncer cerebral, cáncer linfático, cáncer de piel, cáncer óseo, cáncer rectal, sarcoma, cáncer pulmonar, leucemia linfocítica crónica de células B o un linfoma de células B. En algunas modalidades, el cáncer está asociado con una sobreexpresión de CD26. En algunas modalidades, el cáncer no es mesotelioma. En algunas modalidades, el cáncer no es melanoma. En algunas modalidades, el cáncer es linfoma, cáncer de riñon, cáncer de próstata, o cáncer de pulmón. En algunas modalidades, el cáncer es linfoma. En algunas modalidades, el cáncer es carcinoma de riñon. En algunas modalidades, el cáncer es carcinoma de próstata. En algunas modalidades, el cáncer es carcinoma de pulmón. En algunas modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es una enfermedad o trastorno inflamatorio. En algunas modalidades, la enfermedad inflamatoria se asocia con la sobreexpresión de CD26. En otras modalidades, la afección asociada con la expresión de CD26 es angiogénesis. En modalidades adicionales, la afección asociada con la expresión de CD26 es una afección que implica un estado inmune activado como, pero sin limitarse a, enfermedad de injerto contra anfitrión y enfermedades o trastornos autoinmunes. En algunas modalidades, la afección es la enfermedad de Addison' s, alopecia, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Behcet's, síndrome de fatiga crónica, enfermedad de Crohn' s, colitis ulcerativa, diabetes, fibromialgia, síndrome del Buen pastor, enfermedad de Graves' púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), lupus, esclerosis múltiple de Meniere's, miastenia gravis, común, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis reumatoide, fiebre reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, vasculitis, vitíligo, o granulomatosis de Wegener' s. En algunas modalidades, la afección que implica un estado inmunoactivado está asociada con la sobreexpresión de CD26.

En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar el cáncer. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir el progreso del cáncer en un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición descrita aquí al sujeto. La invención proporciona además un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el polipéptido al sujeto. En algunas modalidades, el sujeto tiene un tumor que expresa CD26 o ha tenido un tumor que expresa CD26 que ha sido removido. En algunas modalidades, se induce la regresión del tumor. La invención proporciona además un método para inhibir metástasis de células cancerígenas (por ejemplo, células cancerígenas que expresan CD26) en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición descrita aquí al sujeto. En algunas modalidades, los métodos descritos aquí comprenden además el paso de tratar al sujeto con una forma adicional de terapia. En algunas modalidades, la forma adicional de terapia es una terapia anticáncer adicional. En algunas modalidades los métodos descritos aquí comprenden además el paso de tratar al sujeto con quimioterapia, radiación, cirugía, terapia con hormonas, y/o inmunoterapia adicional. En algunas modalidades, la radiación es radiación con un haz externo o teleterapia. En algunas modalidades alternativas, la radiación es administrada como terapia interna o braquiterapia. En algunas modalidades, la forma adicional de terapia comprende la administración de uno o más agentes terapéuticos, como inhibidores de cinasas. En algunas modalidades, el agente terapéutico es un anticuerpo terapéutico, como el Avastin®, el cual es un anticuerpo anti-VEGF, Herceptin® (Trastuzumab) (Genentech, California) , el cual es un anticuerpo anti-HER2, Zenapax® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Switzerland) , el cual es un anticuerpo anti-CD25, y RituxanMR (IDEC PharrnVGenentech, Roche/Zettyaku) , el cual es un anticuerpo anti-CD20. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la angiogénesis. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un agente citotóxico. En algunas modalidades el agente terapéutico adicional es un agente anticáncer. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un agente antiinflamatorio. En algunas modalidades, el agente adicional comprende un agente seleccionado del grupo que consiste de paclitaxel (Taxol®) , docetaxel (Taxotere®) , prednisona, cisplatino, mitomicina, progesterona, citrato de tamoxifeno, fluorouracil, y clorhidrato de doxorrubicina . Los métodos descritos aquí (incluyendo los métodos terapéuticos) pueden ser efectuados por una sola inyección directa en un solo punto en el tiempo o puntos múltiples en el tiempo a uno o múltiples sitios. La administración también puede ser fácilmente simultánea en sitios múltiples. La frecuencia de administración puede ser determinada y ajustada durante el curso de la terapia, y se basa en los resultados de cumplimiento deseados. En algunos casos, pueden ser apropiadas formulaciones de liberación continua sostenida de de polipéptidos (incluyendo anticuerpos), polinucleótidos, y composiciones farmacéuticas de la invención. Varias formulaciones y dispositivos para lograr la liberación sostenida son bien conocidos en la técnica. Los pacientes, sujetos o individuos incluyen mamíferos, como humanos, bovinos, equinos, caninos, felinos, porcinos y ovinos. El sujeto es preferiblemente un humano, y puede o no estar afectado por una enfermedad o presentar actualmente los síntomas. En algunas modalidades, el sujeto tiene cáncer. En algunas modalidades, el sujeto tiene un tumor o ha tenido un tumor que fue removido. Debe comprenderse que si aún el tumor ha sido removido de un sujeto, las células tumorales pueden no obstante, en algunos casos, permanecer en el sujeto. Por ejemplo, aunque un tumor de un sitio pudiera haber sido removido, el tumor pudo haber experimentado metástasis y propagarse a otros lugares en el cuerpo. También, aunque un tumor pudo haber sido removido de un sujeto, una porción del tumor o algunas células tumorales pudieran haber sido dejadas de tras de manera inadvertida o de manera inevitable del sujeto debido al limitaciones en el procedimiento quirúrgico o similares. En algunas modalidades, el sujeto está en riesgo de desarrollar un tumor (o cáncer) . En algunas modalidades, el sujeto está siendo sometido o ha sido sometido a tratamiento adicional (por ejemplo, quimioterapia, cirugía, terapia con hormonas, radiación, o inmunoterapia adicional) . El anticuerpo es administrado preferiblemente al mamífero en un soporte; preferiblemente un soporte farmacéuticamente aceptable. Los soportes aceptables y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000. Típicamente, la se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer la formulación isotónica. Los ejemplos de soporte incluyen solución salina, solución de Ringer 's y solución de dextrosa. El pH de la solución es, de manera preferible de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8, y, de manera más preferible de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 7.5. Los soportes adicionales incluyen preparaciones de liberación sostenida como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices las cuales están en forma de artículos formados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Será evidente de aquellos expertos en la técnica que ciertos soportes pueden ser más preferidos dependiendo, por ejemplo, de la ruta de administración y la concentración del anticuerpo que esté siendo administrado. El anticuerpo puede ser administrado al mamífero por inyección (por ejemplo, sistémica, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraportal) , o por otros métodos, como la infusión, cual asegura la liberación al torrente sanguíneo en una forma efectiva. El anticuerpo también puede ser administrado por técnica de perfusión aislada, como la perfusión tisular aislada, para ejercer efectos terapéuticos locales. La inyección intravenosa es la preferida. Las dosis efectivas y programas para administrar el polipéptido (por ejemplo, el anticuerpo) pueden ser determinadas empíricamente, y hacer esas determinaciones están dentro de la experiencia de la técnica. Aquellos expertos en la técnica comprenderán que la dosis de anticuerpo que debe ser administrada variará dependiendo de, por ejemplo, el mamífero que recibirá el anticuerpo, la ruta de administración, el tipo particular de anticuerpo usado y otros fármacos que estén siendo administrados al mamífero. La guía para la selección de la dosis apropiada para un anticuerpo se encuentra en la literatura administración, sobre usos terapéuticos de anticuerpos, por ejemplo, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N. J. , 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389. Una dosis diaria típica de anticuerpo usado solo puede ocupar de aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg/kg o peso corporal o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Generalmente, cualquiera de las siguientes dosis pueden ser usadas: una dosis de al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 750 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 500 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 250 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 100 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 50 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 1 µg/kg peso corporal, o más, es administrada. En algunas modalidades, una dosis de un polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) proporcionada aquí es de entre aproximadamente 0.01 mg/kg y aproximadamente 50mg/kg, entre aproximadamente 0.05 mg/kg y aproximadamente 40 mg/kg, entre aproximadamente 0.1 mg y aproximadamente 30 mg/kg, entre aproximadamente 0.1 mg y aproximadamente 20 mg/kg, entre aproximadamente 0.5 mg y aproximadamente 15 mg, o entre aproximadamente 1 mg y 10 mg. En algunas modalidades, la dosis es de entre aproximadamente 1 mg y 5 mg. En algunas modalidades alternativas, la dosis es de entre aproximadamente 5 mg y lOmg. En algunas modalidades, puede estar presente más de un anticuerpo. Esas composiciones pueden contener al menos unos, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco anticuerpos diferentes (incluyendo polipéptidos) de la invención. El polipéptido también puede ser administrado al mamífero en combinación con cantidades efectivas de uno o más agentes terapéuticos. El polipéptido puede ser administrado de manera secuencial o concurrente con uno o más de otros agentes terapéuticos. Las cantidades de polipéptido y agente terapéutico dependen, por ejemplo de que tipo de fármacos sean usados, la afección fisiológica que esté siendo tratada, y la programación y rutas de administración, pero generalmente sería menos que si cada uno de usara individualmente . Después de la administración del anticuerpo al mamífero puede ser verificada la afección fisiológica del mamífero de varias formas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Los principios de administración y dosis anteriores pueden ser adaptados para los polipéptidos descritos aquí. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido (incluyendo un anticuerpo) de la invención también puede ser usado para la liberación y expresión del anticuerpo o el polipéptido en una célula deseada. Es evidente que puede ser usado un vector de expresión para dirigir la expresión del anticuerpo. El vector de expresión puede ser administrado sistémicamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, subucutáneamente, intratecalmente, intraventricularmente, oralmente, enteralmente, parenteralmente, intranasalmente, dérmicamente o por inhalación. Por ejemplo, la administración de vectores de expresión incluye la administración local o sistémica, incluyendo la inyección, administración oral, administración por cañón de partículas o catéter, y administración tópica. Un experto en la técnica está familiarizado con la administración de vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo . Véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 6,436,908; 6,413,942; y 6,376,471. La liberación dirigida de las composiciones terapéuticas que comprenden un polinucleótido que codifica para un polipéptido o anticuerpo de la invención también pueden ser usadas. Las técnicas de liberación de ADN mediada por el receptor son descritas en, por ejemplo, Findeis et al, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al, Gene Therapeutics : Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al, J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al, J. Biol Chem. (1994) 269:542; Zenke et al, Proc. Nati Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655; Wu et al, J. Biol Chem. (1991) 266:338. Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido son administradas en un intervalo de aproximadamente 100 ng hasta aproximadamente 200 mg de ADN para la administración local en un protocolo de terapia genética. Los intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng hasta aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 µg hasta aproximadamente 500 µg, y de aproximadamente 20 µg hasta aproximadamente 100 µg de ADN también pueden ser usados durante un protocolo de terapia genética. Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos de la presente invención pueden ser liberados usando vehículos de liberación de genes. El vehículo de liberación de gen puede ser de origen viral o no viral (véase, de manera general, Jolly, Cáncer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; y Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). La expresión de esas secuencias codificadoras puede ser inducida usando promotores de mamífero o heterólogos endógenos. La expresión de la secuencia codificadora puede ser constitutiva o regulada. Los vectores basados en virus para la liberación de un polinucleótido deseado y la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Los vehículos basados en virus ejemplares incluyen, pero no se limitan a, retrovirus recombinantes (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes Estadounidenses Nos. 5, 219,740; 4,777,127; Patente GB No. 2,200,651; y EP 0 345 242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus de Sindbis, virus de Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR- 1247), virus de Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitis equina Venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y vectores de virus adenoasociados (AAV) (véase, por ejemplo, las Publicaciones PCT Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655) . La administración de ADN ligado a adenovirus muertos como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 también puede ser empleada. También pueden ser empleados vehículos y métodos de liberación no virales, incluyendo, pero sin limitarse a, adenovirus muertos ligados o no ligados a ADN condensado policatiónicamente solos (véase, por ejemplo, Curiel, Hum.

Gene Ther. (1992) 3:147); ADN ligado al ligando (véase, por ejemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células vehículo que liberan células eucarióticas (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,814,482; Publicaciones PCT Nos. WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y WO 97/42338) y neutralización por fusión de la carga nucleica con membranas celulares. También puede emplearse ADN puro o desnudo. Los métodos de introducción de ADN puro o desnudo ejemplares son descritos en la Publicación PCT No. WO 90/11092 y la Patente Estadounidense No. 5,580,859. Los liposomas que pueden actuar como vehículos de liberación de genes son descritos en la Patente Estadounidense No. 5,422,120; Publicaciones PCT Nos. WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y EP 0 524 968. Métodos adicionales se describen en Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, y en Woffendin, Proc. Nati. Acad. ScL (1994) 91:1581. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar la invención.

EJEMPLOS Debe comprenderse que los ejemplos y modalidades descritos aquí son para propósitos ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de las mismas serán sugeridas por expertos en la técnica y se incluirán dentro del espíritu y punto de vista de esta solicitud.

Ejemplo 1 - Afinidad de unión y secuencias de VH y VL de Fab de CMO3 El CM03 (también referido aquí como 14D10) es un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra el CD26 humano. Las secuencias de VH y VL del CM03 fueron usadas como líderes para diseñar las variantes en los siguientes ejemplos. Se produjo un Fab que comprendía una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH) correspondiente a las secuencias de VL y VH, respectivamente, del anticuerpo monoclonal de ratón CM03. Este Fab de CM03 es con frecuencia referido aquí como "X369" o "CM03 X369" o similares. Se usó la tecnología Biacore® (resonancia plasmónica superficial, o "SPR") para determinar la afinidad del Fab de CM03 por CD26. Generalmente, los biodetectores basados en SPR verifican interacciones midiendo la concentración de biomoleculas cerca de una superficie. La superficie tiene uno de los pares de interacción inmovilizado sobre ella. La muestra que contiene los otros pares fluye sobre la superficie. Cuando moléculas de la muestra se unen al interactuante unido a la superficie, se mide una respuesta de SPR. La respuesta es proporcional a la masa de moléculas que se unen a la superficie. Esas mediciones de afinidad fueron tomadas a 25°C de acuerdo al manual del fabricante. Se preparó CD26 humano recombinante purificado (Dipeptidil peptidasa rh IV) comprada de R&D Systems, CAT# 1180-SE) como patrón en PBS, y se diluyeron en concentración de -0.05 mg/ml en amortiguador de acetato de sodio 10 mM a pH 5 antes de que fuera inmovilizada sobre un microcircuito integrado de CM5 (BiaCore Inc., CAT# BR-1000-14) . Los Fab producidos en E. coli como se describen más adelante fueron diluidos en PBS a una concentración de ~0.5 µM del ensayo. Un registro típico incluyó un periodo de inyección de 3 minutos del Fab seguido por un periodo de 15 minutos de disociación, y el análisis se efectuó sobre la base de los datos sin tratar de las curvas de unión en consecuencia . La afinidad es la fuerza de unión de una molécula otra en un solo sitio. La KD es la constante de disociación como una medida de la velocidad a la cual el anticuerpo se disocia del antígeno. Generalmente, los anticuerpos con KD menores tienen menor afinidad. Se usó la tecnología Biacore® para determinar la afinidad del Fab que comprende VH y VL de CM03 para el antígeno CD26 humano. Para estos datos, se determinó la KD de Fab de CM03 (1.63xl0~9). Esto indica una afinidad relativamente alta. Los datos de afinidad adicionales para el Fab de CM03 se muestran en la Tabla 2, más adelante.

TABLA 2 K^/SE (MM seg"1) I /SE (seg"1) KD (M) CM03 (X369 ) 5 . 09E+05 / 1 . 19E+04 8 . 29E-0 . / 3 . 40E-06 1 . 63e" La Figura 1 muestra las secuencias de la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) de Ac de ratón CM03 y Fab de CM03.

Ejemplo 2 - Fab de variantes de CM03 humanizados A. Secuencias Las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo CM03 fueron usadas para la humanización para producir una variedad de varias regiones variables de cadena pesada y ligera. Las secuencias de ácido nucleico de variantes de VL humanizadas X376 (SEQ ID NO: 1), X377 (SEQ ID NO:2), X378 (SEQ ID NO:3), X379 (SEQ ID NO:4), X380 (SEQ ID NO : 5 ) , X381 (SEQ ID NO: 6), y X394 (SEQ ID NO: 7) se muestran en la Figura 2. Los aminoácidos de las variantes de VL humanizadas X376 (SEQ ID NO: 15), X377 (SEQ ID NO:16), X378 (SEQ ID NO: 17), X379 (SEQ ID NO:18), X380 (SEQ ID NO: 19), X381 (SEQ ID NO:20), y X394 (SEQ ID NO:21) se muestran en la Figura 3. Las secuencias de ácido nucleico para las variantes de VH humanizadas X384 (SEQ ID NO: 8), X385 (SEQ ID NO: 9), X386 (SEQ ID NO: 10), X387 (SEQ ID NO:ll), X388 (SEQ ID NO: 12), X399 (SEQ ID N0:13) y X420 (SEQ ID N0:14) se muestran en la Figura 4. Las secuencias de aminoácidos para las variantes de VH humanizadas X384 (SEQ ID NO:22), X385 (SEQ ID NO:23), X386 (SEQ ID NO:24), X387 (SEQ ID NO:25), X388 (SEQ ID NO:26), X399 (SEQ ID NO:27) y X420 (SEQ ID NO:28) se muestran en la Figura 5. La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de pares seleccionados de regiones variables de cadena pesada y ligera variantes usadas para producir Fab que comprenden ambas variantes de VH y VL.

B . Expresión Se usaron líneas celulares de E. coli para expresar las variantes de Fab de cadena pesada y ligera mostradas en las Figuras 7-10. Para la expresión, se inocularon líneas celulares de E . coli individuales en medio 2xYT que contenía 100 µg/ml de Carbenicilina para crecer a 37°C hasta DO600=~l antes de que se agregara IPTG a una concentración final de 0.5 mM, el cultivo fue entonces inducido a la producción de Fab a 30°C durante 4-5 horas. Las células fueron cosechadas y los extractos periplásmicos fueron preparados de acuerdo a un protocolo estándar (Phage Display, A Laboratory Manual, Carlos Barbas III et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) . El extracto crudo fue purificado en columna G de afinidad de proteína (Amerham-Pharmacia, CAT# 17-0404-01) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y se eluyó por medio de glicina 0.1 M, pH. 2.7, seguida por la neutralización inmediata por medio de Tris 1 M pH 8. Las muestras fueron dializadas contra PBS exhaustivamente y eventualmente determinadas para la concentración de proteína usando una DO280 antes del uso del análisis Biacore y otros ensayos . La Figura 7 muestra un gel de SDS-PAGE bajo afecciones no reductoras cargado con muestras purificadas por columna de proteína G de Fab de variantes de VL de CM03 X376, X377, X378, X379, X380, X381, así como Fab de variantes de VH X384, X385, X386 expresadas en E . coli cepa TG1. Las variantes de VL fueron apareadas con VH de CM03 en los Fab; las variantes de VH fueron apareadas con VL de CM03 en los Fab. En cada muestra se observó una banda de proteína alrededor de 50 kDa, pero los rendimientos fueron más altos en X376, X377, X380, X384, X385, y X386. La Figura 8 muestra una representación cuantitativa de la acumulación de proteína de Fab de variantes de VL CM03 X376, X377, X378, X379, X380, X381, Fab X369 (CM03) , expresada en E. coli . Las muestras X376, X377, y X380 tuvieron niveles más altos de proteínas Fab que el Fab CM03 murino. La Figura 11 muestra el rendimiento cuantitativo de la proteína de Fab que comprende variantes de VH X384, X385, X386, X387 o X388 apareadas con VL de CM03, expresadas en E. coli . La Figura 9 muestra un gel de SDS-PAGE bajo afecciones no reductoras cargado con muestras purificadas de columna de proteína G de la expresión de Fab de variantes de VH CM03 X387 y X388 en E. coli cepa TGl, así como de la expresión de Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396, comprendiendo cada una un par de una variante de VL y una variante de VH, en E. coli HB2151. (Las variantes de VH X387 y X388 fueron apareadas con VL de CM03) . Los pares de VL y VH de los Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396 se muestran en la Figura 6. En cada muestra se observó una banda de proteína alrededor de 50 kDa, pero los rendimientos fueron más altos en X389, X390, X391, X395 y X396. La Figura 10 muestra una representación cuantitativa de la acumulación de proteína variante de VH y variante de VL de Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396, así como X369 CM03, expresadas en E . col i cepa HB2151. En todos los casos las muestras de pares de variantes de Fab tuvieron niveles más altos de proteína que el Fab murino de CM03.

C. Propiedades de Fab La Tabla 3, a continuación, muestra un resumen de varias características físicas teóricas de los Fabs X369 (CM03 VH y VL) , X391, X392, X396 y X399. Por ejemplo, se muestran en peso molecular, número de residuos cargados, residuos hidrofóbicos, punto isoeléctrico y carga total.

TABLA 3 X392 Peso molecular 49634.45 Daltons 458 aminoácidos 41 aminoácidos (K, R) fuertemente básicos (+] 36 aminoácidos (D, E) fuertemente ácidos (-) 134 aminoácidos hidrofóbico (A, I, L, F, , V) 170 aminoácidos polares (N, C, Q, S, T, Y) 8.272 punto isoeléctrico 6.776 Carga a pH 7.0 X396 Peso molecular 49664.36 Daltons 458 aminoácidos 40 aminoácidos (K, R) fuertemente básicos (+) 39 aminoácidos (D, E) fuertemente ácidos (-) 132 aminoácidos hidrofóbico (A, I, L, F, W, V) 170 aminoácidos polares (N, C, Q, S, T, Y) 7.625 punto isoeléctrico 2.950 Carga a pH 7.0 X399 Peso molecular 49678.39 Daltons 458 aminoácidos 40 aminoácidos (K, R) fuertemente básicos (+) 39 aminoácidos (D, E) fuertemente ácidos (-) 132 aminoácidos hidrofóbico (A, I, L, F, W, V) 170 aminoácidos polares (N, C, Q, S, T, Y) 7.625 punto isoeléctrico 2.950 Carga a pH 7.0 D. Especificidad de un Fab que comprende una región variable de cadena ligera varian te Se efectuó un análisis de especificidad de Fab X369 de CM03 y un Fab que comprende una variante de VL X377 ligada a VH de CM03. Los datos se muestran en la Figura 12A, 12B, y 12C. Los datos fueron generados usando la tecnología Biacore®. El patrón de unión de CD26 fue como se describe más adelante . La Figura 12A muestra X369 (Fab de CM03) unido a CD26. También se muestra la respuesta después de la introducción de CM03 adicional a aproximadamente 800 segundos. La Figura 12B muestra el X369 (Fab de CM03) unido a CD26 humano. También se muestra la respuesta después de introducción de un Fab que comprende la variante de VL X377 apareada con VH de CM03 a aproximadamente 600 segundos. La Figura 12C muestra el Fab X377 unido al CD26 humano contra el Fab X377 unido al CD26 ocupado previamente por el Fab X369 de CM03. Un nivel disminuido de Fab X377 unido con CD26 el cual se encontraba unido previamente a X369, en comparación con el Fab X377 unido a CD26 previamente no unido, indica que el Fab X377 Fab y el Fab X369 de CM03 tienen el sitio de interacción similares o al menos superpuestos con CD26.

E. Afinidad de varian tes de Fab con CD26 humano La Tabla 4, a continuación, es un resumen de análisis de afinidad, incluyendo la KD, del X369 de CM03 así como del Fab que comprenden la VH de CMO3 combinada con cada una de las variantes de VL de CM03 X376, X377, X378, X379, X380, o X381. Estos datos fueron generados usando la tecnología Biacore®. El patrón de unión de CD26 se muestra a continuación.

TABLA 4 Variantes Kon/SE (M"1 .seg"1) Koffi/SE (seg"1 ) K D (M) Ki2 X369 5.09E+05/1 19E+04 8.29E-04/3.40E-06 1 63e-9 7.03 X376 2.58E+05/1 71E+03 5.96E-04/3.49E-06 2 31e-9 12.2 X377 3.17E+05/2 28E+03 5.96E-04/3.48E-06 1 88e-9 12.7 X378 2.85E+05/1 85E+03 8.30E-04/6.02E-06 2 92e-9 10.7 X379 5.78E+05/4 67E+03 6.70E-04/3.82E-06 1 16e-9 8.89 X380 2.94E+05/2 84E+03 6.87E-04/4.54E-06 2 33e-9 10.5 X381 2.93E+05/1 76E+03 6.01E-04/4.04E-06 2 10e-9 4.44 X369: Fab de CM03 murino La Tabla 5, a continuación, muestra un resumen de análisis de afinidad, incluyendo la KD, de X369 de CM03 y de Fab que comprenden una VL de CM03 apareada con las variantes de VH de CM03 X384, X385, X386, X387 o X388.

TABLA 5 Variantes Kon/ SE (M^ . seg"1 ) Kof f /SE ( seg"1 ) KD(M) Ki2 X369 5.09E+05/1.19E+04 8.29E-04/3.40E-06 1.63e-9 7.03 X384 2.62E+05/1.84E+03 3.12E-04/6.26E-06 1.19e-9 23.9 X385 2.56E+05/1.84E+03 3.75E-04/6.47E-06 1.47e-9 50.1 X386 1.84E+05/4.32E+03 4.98E-04/3.27E-06 2.71e-9 68.3 X387 1.96E+05/1.10E+04 1.00E-02/1.96E-04 5.11e-8 819 X388 2.35E+05/2.37E+03 6.98E-04/5.00E-06 2.98e-9 27.5 X369: Fab de CM03 murino La Figura 13 muestra un análisis de afinidad de Fab X369 (VH y VL de CM03) y los siguientes Fab que comprenden pares de variantes de VH y VL de CM03 humanizados: X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396. Véase la Figura 6 para las secuencias de aminoácidos de los pares de las regiones variables de cadena pesada y ligera variantes. El análisis se efectuó usando Biacore® como se describe en el Ejemplo 1, excepto que el patrón de unión de CD26 fue como se muestra en la Figura. La Tabla 6, a continuación, muestra un resumen de las tablas 4 y 5, así como los rendimientos de expresión de los Fab indicados. También muestra las cadenas pesada y ligera variantes usadas para producir las Fab seleccionadas, la KD, rendimiento, y relaciones de KD y rendimiento de las Fab seleccionadas que comprenden pares de variantes de VH y VL, en comparación con el Fab de CM03 TABLA 6 El Fab de CM03 murino es X369 # La relación del rendimiento de cada clona individual al rendimiento del CM03 murino ## La relación de la Kd del Fab de CM03 a la Kd de la clona individual.

F. Especificidad de Fab que comprenden pares de VH y VL varian tes para unirse al CD26 humano Se efectuó el análisis de especificidad de Fab seleccionados que comprenden pares de secuencias de VH y VL variantes. La Figura 14 muestra el Fab X369 de CM03 y los Fab de CM03 humanizados X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396 que compitieron con el CM03 AcM murino de ascitos no purificados (14D10) por la unión a CD26. La unión de 14D10 a CD26 fue comparada con la unión de 14D10 a C26 que previamente estaba ocupada por una variante de CM03. El Fab recombinante del CM03 clonado fue usado como control positivo. El análisis se efectuó usando Biacore® como se describe en el Ejemplo 1. Todos los Fab dan como resultado una disminución de al menos el 80% en la unión de 14D10 a CD26, indicando que los pares de variantes de Fab tienen un sitio de unión similar o al menos superpuesto como 14D10.

G. Actividad Biológica SE analizaron varios Fab que comprenden varios pares de regiones variables de cadena pesada y ligera humanizadas por su capacidad para inhibir la proliferación celular . El efecto de las diferentes variantes de Fab fue analizado en células de Jurkat CD26+ para el efecto ' inhibidor del crecimiento. Se usó el ensayo de bromuro de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2, 5-difeniltetrazolio ("MTT"), el cual es bien conocido en la técnica. Este ensayo es un método cuantitativo usado para determinar la proliferación celular. Generalmente, el ensayo MTT se basa en la capacidad de una enzima deshidrogenasa mitocondrial de células viables para escindir MTT y formar cristales de formazan azul oscuro. El número de células sobrevivientes es proporcionado al nivel de producto de formazan creado. El color puede ser cuantificado usando un ensayo colorimétrico simple. Para efectuar el ensayo MTT, de manera breve, se colocaron 50 µl de células de Jurkat CD26+ que crecían exponencialmente en una placa Microtituladora (50,000 células en un pozo de 50 µl) . Se agregaron Fab X369 y variantes de Fab de CM03 X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396 (que comprenden pares de variantes de VH y VL) , así como el Fab que comprende la variante de VL X376 y VH de CM03 VH a 0.1, 0.5, 1.5 y 10 µg/ml del medio de crecimiento y se mezclaron. Las células fueron incubadas durante 48 horas en un incubador de C02 a 37 °C. Se agregó MTT a aproximadamente 1 mg/ml. Las células fueron incubadas durante 2 a 37 °C. La extracción de formazan tomó lugar durante la noche en un incubador de C02. Se midió la absorbancia a 570 nm. La Figura 15 muestra el por ciento de inhibición de proliferación de células JKT/CD26+ por Fab X369 y Fab X389, X390, X391, X392, X393, X395 y X396 de CM03 (que comprenden pares de variantes de VH y VL) , así como una Fab que comprende la variante de VL X376 y VH de CM03. Todos los Fab produjeron la inhibición de la proliferación celular, con la mayor inhibición a nivel de 5 o 10 µg/ml.

Ejemplo 3 - Anticuerpos de IgGl de CM03 humanizados A. Secuencias Se generaron anticuerpos humanizados de longitud completa usando pares de VH y VL seleccionadas, la región constante de cadena pesada de IgGl humana y la región constante de cadena ligera kappa humana. La Figura 16 muestra la interacción cadena - cadena de la IgGl y la región de la bisagra. La Figura 17A muestra la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada. También muestra la posición de la variante de VH en la cadena pesada, y la secuencia líder. La Figura 17B muestra la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera. También muestra la posición de una variante de VL de la cadena ligera, y la secuencia líder. La Tabla 7 y la Tabla 8, a continuación, comparan la identidad de los pares de VH y VL usados para producir anticuerpos monoclonales humanizados recombinantes (AcMrhu) 409, 410, 411, 412, 420 y 429 con aquéllos de algunos Fab previamente probados. Las variantes de VH y VL usadas para producir los Fab que comprenden los pares variantes de VH y VL se muestran en la Tabla 8, a continuación. Por ejemplo, el AcMrhu410, también referido aquí como "X410," comprende las secuencias de VH X388 y VL X376, justo como el Fab X391. La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de pares seleccionados de cadena pesada y ligera variantes, como se describió anteriormente, exceptuando las X369 (Fab de CM03) . La secuencia de VH de CM03 y VL de CM03 de X369 (Fab de CM03) fueron usadas para generar AcMrhu409.

TABLA 7 Nomenclatura de los Fab AcM X369 (CM03) AcMrhu409 X391 AcMrhu410 X392 AcMrhu4H X396 AcMrhu412 X420 AcMrhu420 X429 AcMrhu429 TABLA 8 En Fab de CM03 Murino es X369 B . Expresión La figura 18 muestra anticuerpos monoclonales humanos altos recombinantes de longitud completa (Acmrhu) 409, 411, 410 y 412 expresados de manera transitoria en células HEK293 y purificados vía una columna de afinidad de proteína A, (Procep-A, Millipore, CAT# 113111827) de acuerdo a un manual del fabricante. El anticuerpo fue eluído por Acetato de Sodio a 100 mM pH 3.0 seguido por la neutralización inmediata por Tris 2 M pH 9.0. Las muestras fueron entonces centrifugadas en un rotor 4,000 rpm durante 30 minutos para remover material insoluble y se filtraron a través de un filtro de 0.2 µm para la esterilización antes del almacenamiento. La figura 18 también muestra Acmrhu 411 expresado de manera estable en células de ovario de Chínese hámster (CHO-DG44). En cada caso, la transfección se efectúa vía lipofectomina .

La figura 18 muestra un gel de poliacrilamida con SDS teñido con azul de Coomassie más allá de bajo afecciones reductoras. Se observaron dos bandas principales con porciones de migración consistentes con lo que se esperada para las cadenas pesadas y ligeras libres. La Tabla 7, anterior, muestra los rendimientos de los diferentes anticuerpos de longitud completa indicados expresados en células CHO.

C. Afinidad de AcMrhu por el CD26 humano Las afinidades de unión de CD26 de Acmrhu 409, 410, 411 y 412 a CD26 se muestran en la Tabla 9, a continuación. Los análisis de las mismas se efectuaron usando Biacore® como se describe en el Ejemplo 1, excepto que los patrones de unión fueron los Acmrhu anotados anteriormente. El Acmrhu 411 tuvo 3.7 veces la KD del Acmrhu 409. Los Acmrhu 410 y 412 tuvieron 0.5 y 0.4 veces la KD del Acmrhu 409, respectivamente . TABLA 9 Afinidad de Acmrhu por el Antígeno YSCMA Detectado por Biacore® La figura 19 muestra los datos que muestran que los Acmrhu 409, 411, 410 y 412 se unen específicamente al CD26 humano. La figura 20 muestra los datos de una ELISA usando el protocolo estándar ((Phage Display, A Laboratory Manual, Carlos Barbas III et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) que muestran la unión de variantes de Acmrhu expresadas de manera transitoria adicionales al CD26 humano (recubrimiento de lµg/ml de CD26 humano y conjugado a un anti-humano-kappa HRP de cabra (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, CAT# 2060-05) como el anticuerpo secundario de detección.

D. Actividad Biológica Se analizó el efecto antiproliferativo de Acm humano recombinantes específicos en Células de Jurkat CD26+ en un ensayo morfológico que evaluó la agregación inducida por los anticuerpos. La figura 21 muestra imágenes con células tratadas con Acmrhu 409 (imagen inferior izquierda) y Acmrhu (imagen inferior derecha) en una relación con tratamientos control (imágenes superiores). Ambos Acmrhu produjeron evidencia de inhibición de la proliferación celular con relación a los tratamientos control. La figura 22 muestra los resultados del tratamiento con 0.05 µg/ml (imagen inferior izquierda), 0.1 µg/ml (imagen inferior derecha), 0.5 µg/ml (imagen en la parte media izquierda), 2.5 µg/ml (imagen en la parte media derecha), y 5 µg/ml (imagen superior derecha) de Acmrhu 411 con relación al control (imagen superior izquierda) . Se observó evidencia de inhibición de la proliferación celular a niveles más altos anticuerpo. La evidencia de un efecto inhibidor fue mayor con el incremento del Acmrhu 411; la concentración más inhibidora fue a 5 µg/ml de Acmrhu 411. También se analizó el efecto de Acm humanos recombinantes específicos en células de Jurkat CD26+ para el efecto inhibidor del crecimiento usando un ensayo MTT. Los Acmrhus 409, 410, 411, 412, 420 y 429 fueron cada uno probados a varias concentraciones diferentes. La Tabla 10, a continuación, muestra un por ciento de inhibición observado en un ensayo MTT para varios Acm humanos recombinantes.

TABLE 10 Las Figuras 23 A y 23B también muestran los resultados del ensayo MTT de Acmrhu 409, 410, 411, 412, 420 y 429. La figura 23 A muestra la representación en forma de diagrama de líneas del por ciento de inhibición, mientras que la figura 23B muestra una representación de gráfica de barras de la misma. El tratamiento con todos los anticuerpos mostrados resultó en la inhibición de la proliferación celular. El tratamiento con concentraciones crecientes de los anticuerpos dio como resultado un incremento en el porcentaje de inhibición en todos los casos, con la excepción del Acmrhu420, el cual mostró una ligera disminución en el tratamiento con 5 µg/ml en oposición al tratamiento con 2.5 µg/ml.

E . Tra zo del Mapa del epí tope Los experimentos del trazo del mapa del epítope se efectuaron para determinar los sitios de unión probable de los anticuerpos monoclonales humanizados sobre CD26. El trazo del mapa del epítope se efectuó usando microarreglos de péptidos . Generalmente, este método de trazo requiere la síntesis de péptidos de secuencias superpuesta que corresponden selectivamente a toda o una parte de la secuencia de aminoácidos del antígeno (aquí, CD26 humano) .

Los péptidos se hacen reaccionar entonces con el anticuerpo de interés. Se lava el exceso de anticuerpo no unido. Se detecta el anticuerpo que reaccionó o unido. Puesto que la secuencia de cada péptido sobre pernos reactivos es conocida, las regiones reactivas del antígeno son deducidas del perfil de reactividad del microarreglo . El microarreglo estuvo compuesto de 144 péptidos 13 méricos derivados de CD26 humano superpuestos. A continuación se muestran las 766 secuencias de aminoácidos de CD26 (Dipeptidil peptidasa IV de membrana; SEQ ID NO: 89). 1 MKTPWKVLLG LLGAAALVTI ITVPVVLLNK GTDDATADSR KTYTLTDYLK 51 NTYRLKLYSL RWISDHEYLY KQENNILVFN AEYGNSSVFL ENSTFDEFGH 101 SINDYSISPD GQFILLEYNY VKQWRHSYTA SYDIYDLNKR QLITEERIPN 151 NTQWVTWSPV GHKLAYVWNN DIYVKIEPNL PSYRITWTGK EDIIYNGITD 201 WVYEEEVFSA YSALWWSPNG TFLAYAQFND TEVPLIEYSF YSDESLQYPK 251 TVRVPYPKAG AVNPTVKFFV VNTDSLSSVT NATSIQITAP ASMLIGDHYL 301 CDVTWATQER ISLQWLRRIQ NYSVMDICDY DESSGRWNCL VARQHIEMST 351 TGWVGRFRPS EPHFTLDGNS FYKIISNEEG YRHICYFQID KKDCTFITKG 401 TWEVIGIEAL TSDYLYYISN EYKGMPGGRN LYKIQLSDYT KVTCLSCELN 451 PERCQYYSVS FSKEAKYYQL RCSGPGLPLY TLHSSVNDKG LRVLEDNSAL 501 DKMLQNVQMP SKKLDFHLN ETKFWYQMIL PPHFDKSKKY PLLLDVYAGP 551 CSQKADTVFR LNWATYLAST ENHVASFDG RGSGYQGDKI MHAINRRLGT 601 FEVEDQÍEAA RQFSKMGFVD NKRIAIWGWS YGGYVTSMVL GSGSGVFKCG 651 IAVAPVSRWE YYDSVYTERY MGLPTPEDNL DHYRNSTVMS RAENFKQVEY 701 LLIHGTADDN VHFQQSAQIS KALVDVGVDF QAMWYTDEDH GIASSTAHQH 751 IYTHMSHFIK QCFSLP Únicamente se representaron los aminoácidos residuales 48-324 sobre el microarreglo. Los 13meros estuvieron desviados en dos aminoácidos. Por lo tanto, el péptido 1 representó los aminoácidos residuales 48-60, el péptido 2 representó los aminoácidos residuales 50-62, y así sucesivamente, terminando con el péptido 133 que representa los aminoácidos residuales 312-324. La tabla 11, a continuación muestra los datos señal para los Acmrhus 409, 411, 412, y 420. También muestra los aminoácidos representados por cada uno de los números de los péptidos mostrados en la figura 24. Las hileras 134-144 representan controles de fondo. Nótese que los anticuerpos descritos pueden reaccionar con otros picos fuera de las secuencias de aminoácidos usados en los microarrreglos . Adicionalmente, puede existir asociación con aminoácidos residuales no identificados como más reactivos. Esto puede, en parte, deberse a la disparidad entre la naturaleza lineal de los péptidos cortos unidos al microarreglo, y el contexto tridimensional del antígeno en un estado de longitud completa. Los 13meros fueron inmovilizados sobre una superficie de vidrio modificada. Los derivados peptídicos inmovilizados tuvieron la siguiente estructura general: superficie de vidrio modificada de un enlazante - 13mérico. Los microarreglos fueron pretratados con amortiguador de bloqueo durante 4 horas a temperatura ambiente, seguido por 3 lavados cada uno con amortiguador de PBS pH 7.5 y agua. Cada microarreglo pretratado fue explorado usando el explorador Array Worx-Microarray por la señal de fondo. No se detectaron señales. Se incubó un microarreglo control con anticuerpo anti-IgG humano marcado con fluoresceína (SIGMA #F9512, anti-IgG humano (específico de Fc) - anticuerpo FITC producido en cabra, 1:1000) durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por tres lavados, cada uno con amortiguador de PBS pH 7.5 y agua. Los microarreglos fueron entonces explorados usando el Explorador Array Worx-Microarray. Los microarreglos fueron incubados durante la noche a 6°C con AcMrhu 409, 411, 412 y 420, usando 10 µg de anticuerpo en 250 µl de amortiguador de ensayo (PBS-T, NaN3 al 0.1%). La incubación durante la noche fue seguida por tres lavados, con cada uno de amortiguador de PBS pH 7.5 y agua.

Los microarreglos fueron entonces explorados usando el Explorador Array Worx-Microarray. Se usó el paquete de programas de reconocimiento SPOT ArrayPro para el análisis de los datos. Se usó la media de las intensidades de la señal de tres subarreglos idénticos en cada microarreglo para la evaluación de los datos. La Tabla 11, a continuación, muestra los datos de intensidad de señal para los AcMrhus 409, 411, 412, y 420 para los péptidos 13méricos. La Figura 24 muestra una representación en forma de gráfica de barras de los datos de señales para AcMrhus 409, 411, 412, y 420.

TABLA 11 Péptido Aminoácidos Valor Valor Medio Valor Valor No. Medio de de la Señal Medio de Medio de la Señal de AcMrhu411 la Señal la Señal de de de AcMrhu409 AcMrhu412 AcMrhu420 YLKNTYRLKLYSL 11 . 331731 3 . 504808 20 . 307692 18 . 951923 (SEQ ID NO. -92) KNTYRLKLYSLRW 82. 432692 16. 480769 23. 764423 31. 028846 (SEQ ID NO: 93) TYRLKLYSLRWIS 0. 663462 0.725962 0. 033654 1. 125 (SEQ ID NO: 94 ) RLKLYSLRWISDH 132.076923 51.326923 25.629808 35.057692 (SEQ ID NO: 95) KLYSLRWISDHEY 64.798077 43.125 7.591346 6.634615 (SEQ ID NO:96) YSLRWISDHEYLY 183.028846 97.456731 17.629808 53.947115 (SEQ ID NO:45) LRWISDHEYLYKQ 110.764423 20.586538 9.485577 5.115385 (SEQ ID NO: 97) WISDHEYLYKQEN 3.283654 0.735577 0.004808 0.009615 (SEQ ID NO: 98) SDHEYLYKQENNI 0.067308 0 (SEQ ID NO: 99) 10 HEYLYKQENNILV 0.033654 0.019231 0 0.024038 (SEQ ID NO: 100) 11 YLYKQENNILVFN 28.870192 5.783654 4.235577 2.649038 (SEQ ID NO: 101) 12 YKQENNILVFNAE 0.086538 0.009615 (SEQ ID NO: 102) 13 QENNILVFNAEYG 1.341346 1.942308 0.682692 1.432692 (SEQ ID NO: 103) 14 NNILVFNAEYGNS 0.009615 0.043269 (SEQ ID NO: 104) 15 ILVFNAEYGNSSV 0.105769 0.009615 (SEQ ID NO: 105) 16 VFNAEYGNSSVFL 3.865385 1.918269 0.177885 0 (SEQ ID NO: 106) 17 NAEYGNSSVFLEN 0.110577 0.0625 0.004808 0.067308 (SEQ ID NO: 107) 18 EYGNSSVFLENST (SEQ ID NO: 108) 19 GNSSVFLENSTFD 0.072115 (SEQ ID NO: 109) 20 SSVFLENSTFDEF 0.057692 0.379808 0.009615 (SEQ ID NO: 110) 21 VFLENSTFDEFGH 0.197115 0 (SEQ ID NO: 111) 22 LENSTFDEFGHSI 0.019231 0 (SEQ ID NO: 112) 23 NSTFDEFGHSIND 0.004808 0 (SEQ ID NO: 113) 24 TFDEFGHSINDYS 0.009615 0 (SEQ ID NO: 114) 25 DEFGHSINDYSIS (SEQ ID NO: 115) 26 FGHSINDYSISPD 0.033654 0 (SEQ ID NO: 116) 27 HSINDYSISPDGQ 0.004808 0.298077 (SEQ ID NO: 117) 28 INDYSISPDGQFI 0.004808 0.221154 0 0.163462 (SEQ ID NO: 118) 29 DYSISPDGQFILL 99.745192 2.163462 97.918269 167.634615 (SEQ ID NO: 52) 30 SISPDGQFILLEY 78.033654 6.264423 77.4375 103.365385 (SEQ ID NO: 53) 31 SPDGQFILLEYNY 4.9375 2.331731 3.807692 3.254808 (SEQ ID NO: 119) 32 DGQFILLEYNYVK 0.019231 0.019231 0.004808 0 (SEQ ID NO: 120) 33 QFILLEYNYVKQW 66.586538 21.817308 12.168269 12.769231 (SEQ ID NO: 121) 34 ILLEYNYVKQWRH 87.649038 15.658654 19.451923 47.341346 (SEQ ID NO: 122) 35 LEYNYVKQWRHSY 236.774038 84.745192 31.442308 42.360577 (SEQ ID NO: 46) 36 YNYVKQWRHSYTA 106.850962 28.245192 11.456731 15.4375 (SEQ ID NO: 123) 37 YVKQWRHSYTASY 193.5625 98.201923 25.764423 39.245192 (SEQ ID NO: 50) 38 KQWRHSYTASYDI 14.519231 4.769231 1.865385 1.793269 (SEQ ID NO: 125) 39 WRHSYTASYDIYD 32.307692 55.6875 4.144231 5.447115 (SEQ ID NO: 126) 40 HSYTASYDIYDLN 49.552885 32.163462 12.586538 17.990385 (SEQ ID NO: 127) 41 YTASYDIYDLNKR 0.980769 0.067308 0.408654 0.423077 (SEQ ID NO: 128) 42 ASYDIYDLNKRQL 0.043269 0.014423 (SEQ ID NO: 129) 43 YDIYDLNKRQLIT 2.889423 0.048077 (SEQ ID NO: 130) 44 IYDLNKRQLITEE (SEQ ID NO: 131) 45 DLNKRQLITEERI (SEQ ID NO: 132) 46 NKRQLITEERIPN (SEQ ID NO: 133) 47 RQLITEERIPNNT (SEQ ID NO: 134) 48 LITEERIPNNTQW 60.288462 12.057692 0.360577 0.971154 (SEQ ID NO: 135) 49 TEERIPNNTQWVT 0.961538 8.235577 0.139423 (SEQ ID NO: 136) 50 ERIPNNTQWVTWS 20.644231 34.629808 5.360577 1.331731 (SEQ ID NO: 137) 51 IPNNTQWVTWSPV 0.855769 2.701923 0.201923 (SEQ ID NO: 138) 52 NNTQWVTWSPVGH 0.129808 0.120192 0.504808 0.120192 (SEQ ID NO: 139) 53 TQWVTWSPVGHKL 1.639423 0.004808 2.567308 4.25 (SEQ ID NO: 140) 54 WVTWSPVGHKLAY 30.326923 13.004808 12.980769 15.149038 (SEQ ID NO: 141) 55 TWSPVGHKIAYVW 229.370192 123.73557798.365385 117.5625 (SEQ ID NO: 47) 56 SPVGHKIAYVNN 23.254808 11.745192 3.754808 4.826923 (SEQ ID NO: 142) 57 VGHKLAYVWNNDI 23.048077 9.668269 2.456731 1.528846 (SEQ ID NO: 143) 58 HKLAYVWNNDIYV 59.721154 33.754808 3.206731 4.235577 (SEQ ID NO: 144) 59 LAYVWNNDIYVKI 6.163462 0.682692 3.197115 6.730769 (SEQ ID NO: 145) 60 YVWNNDIYVKIEP 0.975962 0.076923 0 0.524038 (SEQ ID NO: 146) 61 WNNDIYVKIEPNL 0 0.038462 0 0.451923 (SEQ ID NO: 147) 62 NDIYVKIEPNLPS 0.004808 0.004808 0 0.259615 (SEQ ID NO: 148) 63 IYVKDEPNLPSYR 17.649038 8.125 41.081731 88.706731 (SEQ ID NO: 54) 64 VKIEPNLPSYRIT 2.5625 0.4375 2.201923 11.995192 (SEQ ID NO: 149) 65 IEPNLPSYRITWT 38.826923 40.802885 13.134615 11.346154 (SEQ ID NO: 150) 66 PNLPSYRITWTGK 4.447115 0.110577 1.716346 2.240385 (SEQ ID NO: 151) 67 LPSYRITWTGKED 1.745192 0.009615 0 0.014423 (SEQ ID NO: 152) 68 SYRITWTGKEDII 4.543269 0.216346 0.192308 (SEQ ID NO: 153) 69 RITWTGKEDIIYN 3.25 2.451923 0.283654 0.043269 (SEQ ID NO: 154) 70 TWTGKEDIIYNGI 5.533654 1.004808 0.009615 0.081731 (SEQ ID NO: 155) 71 TGKEDIIYNGITD 4.057692 (SEQ ID NO: 156) 72 KEDIIYNGITDWV 9.889423 10.134615 0.379808 0.125 (SEQ ID NO: 157) 73 DIIYNGITDWVYE 6.932692 33.557692 6.341346 11.5 (SEQ ID NO: 158) 74 IYNGITDWVYEEE 6.173077 0.293269 (SEQ ID NO: 159) 75 NGITDWVYEEEVF 0.961538 9.384615 1.538462 1.870192 (SEQ ID NO: 160) 76 ITDWVYEEEVFSA 0.144231 0.033654 0.274038 0.25 (SEQ ID NO: 161) 77 DWVYEEEVFSAYS 5.923077 13.658654 0.509615 2.038462 (SEQ ID NO: 162) VYEEEVFSAYSAL 7.956731 7.855769 4.355769 4.596154 (SEQ ID NO: 163) 79 EEEVFSAYSALWW 89.245192 96.394231 12.625 10.533654 (SEQ ID NO: 51) 80 EVFSAYSALWWSP 23.548077 17.735577 2.278846 4.100962 (SEQ ID NO: 164) 81 FSAYSALWWSPNG 62.177885 35.370192 2.278846 4.201923 (SEQ ID NO: 165) 82 AYSALWWSPNGTF 117.192308 67.831731 4.663462 7.091346 (SEQ ID NO: 166) 83 SALWWSPNGTFLA 7.413462 3.644231 0.048077 0.033654 (SEQ ID NO: 167) 84 LWWSPNGTFLAYA 140.740385 17.225962 30.399038 59.620192 (SEQ ID NO: 48) 85 WSPNGTFLAYAQF 0.033654 1.024038 2.721154 4.216346 (SEQ ID NO: 168) 86 PNGTFLAYAQFND 0.038462 0.524038 0.067308 0.004808 (SEQ ID NO: 169) 87 GTFLAYAQFNDTE 0.134615 0.028846 0 (SEQ ID NO: 170) 88 FLAYAQFNDTEVP 0.014423 (SEQ ID NO: 171) 89 AYAQFNDTEVPLI 0.4375 0.182692 (SEQ ID NO: 172) 90 AQFNDTEVPLIEY 0.009615 (SEQ ID NO: 173) 91 FNDTEVPLIEYSF 0.019231 2.302885 0.134615 40.956731 (SEQ ID NO: 174) 92 DTEVPLIEYSFYS 14.447115 11.865385 9.043269 10.764423 (SEQ ID NO: 175) 93 EVPLIEYSFYSDE 0.004808 0.269231 0.014423 11.201923 (SEQ ID NO: 176) 94 PLIEYSFYSDESL 0.067308 0.043269 1.524038 0.038462 (SEQ ID NO: 177) 95 IEYSFYSDESLQY 3.903846 6.139423 0.048077 0.336538 (SEQ ID NO: 178) 96 YSFYSDESLQYPK 0 0.014423 0 0.004808 (SEQ ID NO: 179) 97 FYSDESLQYPKTV 0.014423 0.014423 1.317308 0.052885 (SEQ ID NO: 180) 98 SDESLQYPKTVRV 0.014423 0.004808 1.014423 0.197115 (SEQ ID NO: 181) 99 ESLQYPKTVRVPY 0 0.086538 0.725962 0.0625 (SEQ ID NO: 182) 100 LQYPKTVRVPYPK 0 0.009615 0 0:004808 (SEQ ID NO: 183) 101 YPKTVRVPYPKAG 0.024038 0.004808 0.480769 0.846154 (SEQ ID NO: 184) 102 KTVRVPYPKAGAV 0 0.019231 0 0.048077 (SEQ ID NO: 185) 103 VRVPYPKAGAVNP 0 0 0 0 (SEQ ID NO: 186) 104 VPYPKAGAVNPTV 0.004808 0 0.168269 (SEQ ID NO: 187) 105 YPKAGAVNPTVKF 0.509615 (SEQ ID NO: 188) 106 KAGAVNPTVKFFV 0.245192 0.014423 3.235577 (SEQ ID NO: 189) 107 GAVNPTVKFFWN 8.730769 10.5625 11.230769 25.057692 (SEQ ID NO: 190) 108 VNPTVKFFWNTD 1.331731 1.283654 11.1875 (SEQ ID NO: 191) 109 PTVKFFWNTDSL 0.408654 0.004808 (SEQ ID NO: 192) 110 VKFFWNTDSLSS 0.024038 0 (SEQ ID NO: 193) 111 FFWNTDSLSSVT (SEQ ID NO: 194) 112 WNTDSLSSVTNA 0.043269 (SEQ ID NO: 195) 113 NTDSLSSVTNATS 0.028846 0.168269 0.004808 (SEQ ID NO: 196) 114 DSLSSVTNATSIQ 0.004808 0.033654 (SEQ ID NO: 197) 115 LSSVTNATSIQIT 0.067308 0.0625 0.004808 (SEQ ID NO: 198) 116 SVTNATSIQITAP 0.038462 0 (SEQ ID NO: 199) 117 TNATSIQITAPAS 0.009615 0 0.120192 (SEQ ID NO: 200) 118 ATSIQITAPASML (SEQ ID NO: 201) 119 SIQITAPASMLIG 0.024038 0 (SEQ ID NO: 202) 120 QITAPASMLIGDH 0.033654 0.466346 (SEQ ID NO: 203) 121 TAPASMLIGDHYL 0.019231 2.081731 0.168269 0.096154 (SEQ ID NO: 204) 122 PASMLIGDHYLCD 0.307692 0 0.014423 (SEQ ID NO: 205) 123 SMLIGDHYLCDVT 0.009615 0.4375 5.254808 7.514423 (SEQ ID NO: 206) 124 LIGDHYLCDVTWA 23.269231 12.663462 17.538462 0.913462 (SEQ ID NO: 207) 125 GDHYLCDVTWATQ 3.769231 1.798077 0.620192 0.057692 (SEQ ID NO: 208) 126 HYLCDVTWATQER 3.072115 0.033654 0.009615 0.245192 (SEQ ID NO: 209) 127 LCDVTWATQERIS 0.009615 0.009615 1.283654 0.024038 (SEQ ID NO:210) 128 DVTWATQERISLQ 0.278846 0.105769 0.043269 0.125 (SEQ ID NO: 211) 129 TWATQERISLQWL 72.225962 23.307692 9.456731 9.807692 (SEQ ID NO: :212) 130 ATQERISLQWLRR 10.014423 4.302885 1.855769 4.427885 (SEQ ID NO: :213) 131 QERISLQ LRRIQ 38.365385 5.254808 2.9375 2.778846 (SEQ ID N0:214) 132 RISLQWLRRIQNY 209.283654 113.02884631.177885 69.014423 (SEQ ID NO: :49) 133 SLQWLRRIQNYSV 45.5 6.509615 9.288462 12.918269 (SEQ ID NO: : 124) 134 control 11.682692 0.538462 13.995192 22.1875 135 Control 8.269231 0.572115 14.625 18.903846 136 Control 10.235577 0.581731 12.245192 18.4375 137 Control 9.600962 0.923077 11.855769 15.903846 138 Control 12.75 1.096154 14.259615 20.375 139 Control 10.3125 0.264423 14.586538 16.600962 140 Control 15.485577 1.461538 14.004808 23.466346 141 Control 13.721154 1.596154 15.317308 26.552885 142 Control 12.259615 1.086538 15.908654 24.144231 143 Control 10.322115 0.899038 13.5 22.610577 144 Control 10.572115 0.600962 16.177885 25.081731 La Figura 24 muestra que el AcMrhu 409 (que comprende VH y VL de CM03) tuvo la mayor reactividad contra los péptidos 6 (YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO:45)), 35 (LEYNYVKQ WRHSY (SEQ ID NO:46)), 55 (TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47)), 84 (LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48)) y 132 (RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO:49)). Cada uno de esos picos tuvo picos más pequeños asociados con péptidos 13méricos superpuestos. La reactividad con secuencias discontinuas sugirió un epítope discontinuo o conformacional . La Figura 25 muestra un diagrama de listón de la estructura cristalina de CD26_1 J2E humano, con los péptidos reactivos identificados anteriormente de color más claro. Las coordenadas del CD26 humano están disponibles al público (www. ncbi . nlm.nih. gov/Structure/MMDB/mmdb. shtml; Referencia: PubMed; MMDB: 25581; PDB: 1J2E; Description: Crystal Structure of Human Dipeptidyl Peptidase IV; Deposition: H.Hiramatsu et al.). La estructura tridimensional como se describe mostró que esas secuencias lineales, discontinuas se arreglaron una cerca de otra cuando el antígeno está en su estado tridimensional. Esto confirma además que este es probablemente un epítope discontinuo o conformacional . Nuevamente, nótese que debido a que únicamente los aminoácidos 48-324 fueron representados en esos experimentos, pueden existir otras áreas de reactividad fuera de esas secuencias . La AcMrhu 411 tuvo la reactividad más alta contra los péptidos 6 (YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO:45)), 37 (YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO:50)), 55 (TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47)), 79 (EEEVFSAYSALWW (SEQ IDN0.51)) y 132 (RISLQ WLRRIQNY (SEQ ID NO: 49). Cada uno de esos picos también tuvo picos más pequeños asociados con péptidos 13méricos asociados . La reactividad en las secuencias discontinuas nuevamente sugirió un epítope discontinuo o conformacional . La Figura 26 muestra un diagrama de listón de la estructura cristalina de CD26_1 J2E, con respecto a los reactivos identificados anteriormente, resaltados. La estructura tridimensional mostró que esas secuencias lineales, discontinuas se arreglaron cerca una de la otra cuando el antígeno está en su estado tridimensional, confirmando la naturaleza discontinua de este epítope. La AcMrhu 412 tuvo la reactividad más alta contra los péptidos 29 (DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52)), 30 (SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO: 53)) y 55 (TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47)). Cada uno de esos picos tuvo picos más pequeños asociados con picos 13méricos superpuestos. La Figura 27 muestra un diagrama de listón de la estructura cristalina de CD26_1 J2E, con los péptidos reactivos identificados anteriormente resaltados. La estructura tridimensional mostró que esas secuencias lineales, discontinuas se arreglaron una cerca de la otra cuando el antígeno está en su estado tridimensional, sugiriendo un epítope discontinuo o conformacional .

El AcMrhu 420 tuvo la reactividad más alta contra los péptidos 29 (DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO:52)), 30 (SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO:53)), 55 (TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO:47)) y 63 (IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO:54)). Cada una de esos tipos tuvo tipos más pequeños asociados con péptidos 13 méricos superpuestos. La figura 28 muestra un diagrama de listón de la estructura cristalina de CD26_1 J2E, con los péptidos reactivos identificados anteriormente resaltados. La estructura tridimensional no cree que esas secuencias lineales, discontinuas estaban arregladas una cerca de otra cuando el antígeno está en su estado tridimensional, sugiriendo nuevamente un epítope discontinuo o conformacional . Ejemplo 4 - Secuencias de anticuerpo de cadena pesada y cadena ligera recombinantes. Los anticuerpos IgGl humanizados que comprenden VH y VL de la Fab X392 u otras secuencias de VH y/o VL descritas aquí pueden ser introducidos en células como células de ovario de hámster Chínese (CHO) usando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Algunas secuencias ejemplares para un anticuerpo IgGl humanizado que comprenden la VH y VL del Fab X392 se proporcionan más adelante.

A. Secuencias de ADN que codifi can para una cadena pesada y una cadena ligera ejemplares Las secuencias nucleotídicas ejemplares que codifican para una cadena o una cadena ligera de un anticuerpo humanizado que comprende la VH y VL de Fab X392 se proporcionan más adelante. Las proteínas codificadas incluyen secuencias señal enfocadas a secuencias de VH y VL (las secuencias que codifican para secuencia señal están indicadas y subrayadas y las secuencias que codifican las regiones variables están indicadas en itálicas). Cadena pesada (SEQ ID NO:215): ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCCCGAA GTGCAGCTGGTGGAAAGCGGTGCTGGAGTGAAGCAGCCGGGTGGAACCCTGCGTCTGACCT GCACGGCTAGCGGTTTCAGCCTGACCACATACGGTGTGCACTGGGTGCGTCAGGCGCCCGG GAAAGGTCTGGAATGGGTGGGTGTAATCTGGGGCGATGGTCGTACCGATTACGATGCTGCT TTCATGAGCCGGGTGACCATCAGCAAAGATACCAGCAAAAGCACCGTGTACTTGCAGATGA ACAGCCTGCGTGCGGAAGATACTGCAGTGTACTACTGCATGCGTAATCGTCATGATTGGTT CGATTACTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACCGTCTCGAGCGC??GC?CC???GGCCC??CG GTATTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG CGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATG CCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Cadena ligera (SEQ ID NO:216): ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTG ACATCCTGCTGACCCAGTCTCCATCTTCTCTGTCTGCTACTCCTGGCGAACGTGCTACCAT CACCTGTCGTGCCTCTCAGGGCATCCGTAACAACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGT CAGGCCCCACGTCTGCTGATCTACTACTCTTCTAATTTGCAGTCCGGTGTGCCATCCCGTT TCTCCGGATCTGGTTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGACTGCAACCTGAAGA CGTTGCCGCCTACTACTGCCAGCAGTCTATCAAGCTGCCATTTACCTTCGGTTCTGGTACC AflAGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGA GGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTC ACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAG CAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC CGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG B . Secuencias de proteina para una cadena pesada y una cadena ligera ej emplares La secuencia de proteína ejemplar de una de una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo humanizado que comprende VH y VL de Fab X392 se proporciona más adelante. Las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera se muestran fusionadas a secuencias señal. (Las secuencias señal son indicadas y subrayadas y las regiones variables son indicadas en itálicas) . Cadena pesada (SEQ ID NO:217): MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVDLVESGaGVKOPGGrRLrcrASGFS rr YGVHWVROAPGKGLE /GVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTA VYYCMIUmHDWFDYWGQGTTVTVSSAS?KGPSVFPLAPSSKSTSGGtAALGC~ VKDYF?>EP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena ligera (SEQ ID NO:218): MSVPTOVLGLLLLWLTOARCDI Iir?SPSS SATPGE.RAriraASOGI.R NNLNWYOOKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQS IKLPFGFGSGIKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C Ej emplo 5 - Protocolo de ensayo MTT ej emplar Un protocolo de ensayo MTT ejemplar es el siguiente : Las células de Jurkat son transfectadas con un plásmido que codifica para un CD26 humano de longitud completa y seleccionada bajo 200 µg/ml G418. Las células se pasan a 1:5 cada tres días para mantener la viabilidad a >95%. Aproximadamente 48 horas antes del ensayo, el medio de centrifugación es reemplazado completamente por medio de crecimiento fresco (37 °C) centrifugando a 1100 rpm durante 5 min. (El medio de ensayo es el mismo que el medio de crecimiento: 87mL de medio líquido RPM-1640 (Hycluno: SH30027-02) ; 10 mL de FCS (tratada a 56°C durante 30 min); 0.5 mL de Penicilina/Estreptomicina (100 µg/mL); 2 mL de G418 (Calbiochem, 100 mg/ml en PBS) ; y 2 mL de L-glutamina (200mM, Hycluno, #SH30034.01) . ) Por el método, la viabilidad celular puede ser de 97-99% cuando el ensayo toma lugar. La viabilidad celular puede ser de al menos 95%. Las células son centrifugadas a 1100 rpm, en 5 min (Centrifugado con Beckman Benchtop) y el medio perfectamente removido. Las células son resuspendidas en 5-10 mi del medio completo para un cultivo en matraz T75. 0.01 mL de la suspensión celular se mezclan con 0.01 mL de azul de tripan (0.125% (IX), VWR, #VWb721-0) . Se colocan 0.01 mL en un hemacitómetro y se cuentan las células totales y células muertas. Se calcula el número de células mi como sigue: células totales/4 x factor de dilución x 10,000 = células/mL. % de células viables = (células total-células muertas) /células totales x 100. La células son entonces diluidas por medio del crecimiento completo a ~106 células viables por mL. Las células sangradas 0.05 mL/pozo, son transferidas al centro de 60 pozos de una placa de 96 pozos, y los pozos de los huevos son llenados con medios de crecimiento, 0.1 mL/pozo. Las muestras de anticuerpos son diluidas con medios de crecimiento a 0, 0.1, 0.2, 1.0, 5, y 10 µg/mL en un total de 0.2 mL. Para cada plato, existe un control negativo, amortiguador de formulación de anticuerpo, (usualmente PBS o PBS-T, u otros amortiguadores) y control de anticuerpo positivo (murino) triplicados. Si la muestra de anticuerpo es diluida en medio de crecimiento >10 veces, no es necesario amortiguador de formulación de anticuerpo. Los pozos circundantes en ranuras por medio de crecimiento para mantener el microambiente homogéneo en la placa. La placa es incubada en un incubador en 5% de C02 a 37 °C +/- 0.5°C, humedad del 90% durante 48 horas. Se agregan 25 µL de solución MTT (5 mg/mL de MTT) a cada pozo y se continúo su incubación durante 2 hr. (Para preparar la solución de MTT, se disuelven 50 mg de MTT (sal de tetrazolio de MTT, bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazolil-2) -2, 5-difeniltetrazolio, Calbiochem, #475989)) en polvo en 10 mL de PBS a temperatura ambiente y se filtra a través de una membrana de 0.2 µM después de solubilizar completamente). Se agregan 0.1 mL de amortiguador de extracción por pozo y la placa es incubada a 37°C durante 12 hr o durante la noche. (Para preparar el amortiguador de extracción, se pesan 20 g de SDS (P/W) en polvo y se disuelven 50 mL de agua MQ 50 mL de N,N-dimetil formamida a 37 °C. Posteriormente se equilibra la temperatura a la temperatura ambiente, se aplica y se ajusta el pH a 4.7 con HCl IM HCl. Finalmente se agrega CHX (cicloheximida, Calbiochem, 239764-100MG) ) hasta una concentración final de 20 µg/mL.) Los extractos en la placa son mezclados pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante 5 veces y descargando completamente la solución en las puntas. La placa es leída a 570 nm. La velocidad de inhibición (inhibición de la proliferación de células tumorales) se calcula generalmente como sigue: Velocidad de Inhibición (%)= 1- (menos Abs de pozos tratados con Mab/Abs de los pozos control con medios). Véase también Ho et al, (2001). Clinical Cáncer Res. Vol 7, 2031-2040.

Ej emplo 6 - Efi ca cia de Acmrhu 411 en ra tones desnudos NCR que tienen xenoinj erto de linfomas de Células T Karpas 299 El objetivo de este estudio fue examinar la capacidad del Acmrhu 411 para inhibir el crecimiento de xenoinjerto de linfomas de Células T Karpas 299. El efecto del Acmrhu 411 es solo comparado con Taxol® solo y Taxol® más Acmrhu 411 cuando se lleva siete días después del implante de la célula tumoral Materiales: Línea celular: La Karpa 299 es una línea de linfoma de Células T CD26 positiva humana y se obtuvo de DSMZ Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany, y comprada y enmarcada de Cell & Molecular Technologies, Inc., Phillipsburg, NJ. Animales: Ratones atímicos NCR hembra, que tenían un peso corporal de 18-22 g y fueron de aproximadamente 5-6 semanas de edad, se obtuvieron de Taconic (Germantown, NY) . Acmrhu 411: El BDS (Sustancia Farmacéutica Agranel), 1.0 ml/frasco, 10.3 mg/ml. lote#D0679 en PBS, pH 7.0, fabricado en Lonza Biologies, Slough, Rl . Medio y amortiguadores: El medio RPMI-1640 (Cat# -040-CV) y solución salina amortiguada con fosfato (PBS, Cat# 21-040-CV) se encontraron de Mediatech, Inc., Herndon, VA. El Paclitaxel (Taxol®, Cat# T7402) y Dimetilsulfoxido (DMSO, Cat# D2438) se obtuvieron Sigma, St.

Louis, MO. Métodos: Se implantaron cien animales subcutáneamente sobre el flanco derecho con 4-6xl06 células Karpa 299 en 100 µl de medio RPMI-1640. Cuando el tamaño del tumor alcanzó 100 mm3, los ratones fueron agrupados y se les administraron 100 µl i.v. de soluciones como sigue: Grupo 1, recibió vehículo (PBS); Grupo 2 recibió 10 mg/kg de paclitaxel (como una solución lOmg/ml en PBS con 20% de DMSO) ; Los grupos 3, 4 y 5 recibieron 3, 10 y 30 mg/Kg anticuerpo Acmrhu 411 respectivamente. El grupo 6 recibió una combinación de 10 mg/kg de Acmrhu 411 y 10 mg/kg de paclitaxel. 10 ratones de cada grupo fueron tratados tres veces a la semana durante 5 semanas por inyección intravenosa de volvía la vena de la cola. Los volúmenes de los tumores fueron medidos dos veces a la semana y los pesos corporales fueron medidos una vez por semana. No se notaron signos de toxicidad de distinción en los animales son sacrificados por eutanasia si era necesario. Ningún animal exhibió 20% más de pérdida de peso corporal fue sacrificado por eutanasia con propósitos humanitarios . Resultados: Como se muestra en la figura 29, la dosificación con Acmrhu 411 dio como resultado la contracción y en muchos casos la desaparición completa de los tumores a todas las dosis usadas, mientras que se observó el crecimiento del tumor constante en animales dosificadas con un anticuerpo control (IgG humano) o Taxol®, una rutina terapéutica usada en el estándar actual del cuidado en oncología. El peso corporal se mantuvo durante el tratamiento con Acmrhu 411 y no se observó toxicidad aparente (no se muestran los datos.). Esta eliminación del tumor depende del CD26 y se asumió que es mediada por la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) , apoptosis vía la inducción de las vías de señalización intracelulares (citolítica, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , o una combinación de esos mecanismos. En contraste, se encontró que el Acmrhu 411 no tiene eficacia en un modelo de xenoinjerto de ratón implantado con A375, una línea celular de meloma humano, la cual no expresa niveles significativa de proteína CD26 (No se muestran los datos).

Ejemplo 7 - Eficacia del Acmrhu 411 en ratones SCID que tienen xenoinjerto 786-0 (carcinoma de riñon) El objetivo de este estudio fue examinar la capacidad del Acmrhu 411 para inhibir el crecimiento de xenoinjerto en carcinomas de riñon 786-0. El efecto Acmrhu 411 solo fue comparado con PBS y compuestos anticáncer típicos (cisplatina y Taxol®) más Acmrhu 411. Materiales: Línea celular: 786-0 es una línea de carcinoma de riñon CD26 positiva humana y se obtuvo de la ATCC. Animales: Los ratones CB 17 SCID hembra, que tiene un peso corporal de 18-22 g y que son de aproximadamente 5-6 semanas de edad, se obtuvieron de Taconic (Germantown, NY) . El Cisplatino fue comprador de Sigma (Cat# P9394). El matrigel se obtuvo de BD Biosciences (Cat# 356237) . El HBSS se obtuvo de ATCC (Cat# 30-2213) . Todos los otros materiales en este estudio fueron los mismos que se describieron anteriormente en el Ejemplo 6. Métodos: Se implantaron setenta animales subcutáneamente sobre el flanco derecho con 5xl06 células suficiente 786-0 en 100 µl de HBSS y matrigel (HBSS: matrigel=l : 1) . Cuando el tamaño del tumor alcanzó 100 mm3, los ratones fueron agrupados y se les administraron 100 µl i.p. de soluciones como sigue: El grupo 1, recibió vehículo (PBS); Los Grupo 2, 3 y 4 recibieron 3, 10 y 30 mg/Kg de anticuerpo Acmrhu 411 respectivamente; el grupo 5 recibió una combinación de 30 mg/kg de Acmrhu 411, 10 mg/kg de paclitaxel y 2 mg/Kg cisplatina. 10 ratones de cada grupo fueron tratados dos veces a la semana durante tres semanas por una inyección intraperitoneal (i.p.) excepto que el cisplatino sería únicamente una vez.

Los volúmenes de los tumores fueron medidos dos veces a la semana y los pesos corporales fueron medidos una vez por semana. Se notaron los signos de toxicidad y distinción y los animales fueron sacrificados por eutanasia si era necesario. Cualquier animal que exhibiera 20% o más de pérdida de peso corporal fue sacrificado por eutanasia con propósitos humanitarios. Resultados: Como se muestra en la figura 30, el crecimiento de los tumores 786-0 fueron inhibidos significativamente en los animales tratados con Acmrhu 411 en comparación con los animales tratados con vehículo. Aunque los tumores secos 786-0 no fueron eliminados completamente en éste estudio, hubo un retraso significativo en el crecimiento con el tratamiento con Acmrhu 411. Además, una dosis de Acmrhu 411 alta (30 mg/Kg) sola jugo el mismo efecto que con las combinaciones de cisplatino y Taxol. El peso corporal se mantuvo durante el tratamiento con Acmrhu 411 y no se observó toxicidad evidente. (No se muestran los datos).

Ejemplo 8 - Eficacia e intervalo de dosificación del Acmrhu 411 en ratones desnudos NCR que contienen xenoinjertos Caki-2 (carcinoma de riñon) El objetivo de este estudio fue examinar la capacidad del Acmrhu 411 para inhibir el crecimiento de un injerto de carcinoma de riñon Caki-2 en una forma dependiente de la dosis. El efecto de la Acmrhu 411 fue comparado con control con vehículo así como una combinación de compuestos de quimioterapia. Materiales: Línea celular: Caki-2 es una línea de carcinoma de riñon CD26 positivo humano y se obtuvo de la ATCC. Animales: Ratones desnudos NCR hembra, que tienen un peso corporal de 18-22 g y crean de aproximadamente 5-6 semanas de edad, se obtuvieron de (Germantown, NY) . Docetaxel (cat# 01885) y la doxorrubicina (Cat# D515) se obtuvieron de Sigma. Todos los otros materiales en este estudio fueron los mismos que se describieron anteriormente en el Ejemplo 6-7. Métodos: Se implantaron 100 animales subcutáneamente sobre el flanco derecho con lxlO6 en células Caki2 en 100 µl de HBSS y matrigel (HBSS :matrigel:=l : 1) . Cuando el tamaño del tumor alcanzó 100 mm3, los ratones fueron agrupados y se les administraron 100 µl i.p. de soluciones como sigue: El grupo 1, recibió vehículo (PBS) ; Los Grupo 2, 3, 4 y 5 recibieron 1, 3, 10 y 30 mg/kg de anticuerpo Acmrhu 411 respectivamente; el grupo 6 recibió una combinación de 30mg/kg de Acmrhu 411, 10 mg/kg paclitaxel, 2 mg/kg de cisplatino, 2 mg/kg de docetaxel y 8 mg/kg de Doxorrubicina. El grupo 7 con Acmrhu 411, todos los otros fueron los mismos del grupo 6. 10 ratones de cada grupo fueron tratados dos veces a la semana durante tres semanas por i.p. excepto que se les dieron compuestos quimioterapéuticos (cisplatino, taxol, docetaxel y doxorrubicina) únicamente una vez por i.p. durante el estudio. Los volúmenes de los tumores fueron medidos dos veces a la semana y los pesos corporales fueron medidos una vez por semana. Se notaron los signos de toxicidad y distinción y los animales fueron sacrificados por eutanasia si era necesario. Cualquier animal que exhibiera el 20% o más de pérdida de peso corporal fue sacrificado por eutanasia por humanidad. Resultados: Como se muestra en la figura 31, el crecimiento de los tumores Caki-2 fue inhibida significativamente en animales tratados con Acmrhu 411 en comparación con los animales tratados con vehículo, además, la inhibición del Acmrhu 411 se mostró en la forma independiente de la dosis. Como se muestra en la figura 32, el Acmrhu 411 más compuestos quimioterapéuticos presentó un efecto inhibidor mucho más fuerte cuando se comparó con los compuestos solos, lo cual sugirió la eficacia adicional usando terapia combinada. El peso corporal se mantuvo durante el tratamiento con Acmrhu 411 y no se observó toxicidad aparente. (No se muestran los datos).

Ejemplo 9 - Eficacia del Acmrhu 411 en ratones SCID que contienen xenoinjerto PC-3 (carcinoma de próstata) El objetivo de este estudio fue examinar la capacidad del Acmrhu 411 para inhibir el crecimiento de un xenoinjerto de carcinoma de próstata de PC-3. El efecto del Acmrhu 411 fue comparado con vehículo control así como las combinaciones de compuestos quimioterapéuticos. Materiales: Línea celular: la PC-3 es una línea de carcinoma de próstata CD26 positiva humana y se obtuvo de la ATCC. Animales: Los ratones CB 17 SCID macho, que tienen un peso corporal de 18-22 g y que eran de aproximadamente 5-6 semanas de edad, se obtuvieron de Taconic (Germantown, NY) . Todos los otros materiales de este estudio fueron los mismos que se describieron anteriormente en los Ejemplos 6-8. Métodos : Se implantaron 80 animales subcutáneamente sobre el flanco derecho con 3xl06 células PC3 en 100 µl de HBSS y matrigel (HBSS :matrigel=l : 1) . Cuando el tamaño del tumor alcanzó 100 mm3, los ratones fueron agrupados y se les administraron 100 µl i.p. de soluciones como sigue: El Grupo 1, recibió vehículo (PBS) ; los Grupos 2, 3 y 4 recibieron 3, 10 y 30 mg/kg de anticuerpo AcMrhu 411 respectivamente; el grupo 5 recibió una combinación de 2 mg/kg cisplatino y 10 mg/kg de docetaxel. El grupo 6 con 30 mg/kg de AcMrhu 411, todos los otros lo mismo que el grupo 5. 10 ratones de cada grupo fueron tratados 3 veces a la semana durante 3 semanas por inyección intraperitoneal (i.p.) excepto que se les dieron compuestos de quimioterapia (cisplatino y docetaxel) únicamente 1 vez a la semana durante 2 semanas por ip. Los volúmenes de los tumores fueron medidos dos veces a la semana y los pesos corporales fueron medidos una vez por semana. Se notaron los signos de toxicidad O distensión y los animales fueron sacrificados por eutanasia si fue necesario. Cualquier animal que exhibiera 20% o más de pérdida de peso corporal fue sacrificado por eutanasia por humanidad. Resul tados : Como se muestra en la Figura 33, el crecimiento de los tumores de PC-3 fue inhibido significativamente en animales tratados con AcMrhu 411 en comparación con los animales tratados con vehículo. Además, como se muestra en la Figura 3A, el AcMrhu 411 más compuesto de quimioterapia presentó un efecto inhibidor mucho más fuerte que cuando se comparó con compuestos solos, en el cual sugirió la eficacia adicional usando terapia combinada. El peso corporal de los animales se mantuvo durante el tratamiento con AcMrhu 411 y no se observó toxicidad aparente (no se muestran los datos).

Ejemplo 10 - Eficacia del AcMrhu 411 en ratones desnudos Ncr que tienen el injerto DU- 145 (carcinoma de próstata) El objetivo de este estudio fue examinar la capacidad del AcMrhu 411 para inhibir el crecimiento de un xenoinjerto de carcinoma de próstata DU-145. El efecto del AcMrhu 411 fue comparado con un vehículo control. Ma teriales : Línea celular: La DU-145 es una línea de carcinoma de próstata CD26 positiva humana se obtuvo de la ATCC. Animales : Los ratones desnudos NCR macho, que tenían un peso corporal de 18-22 g y eran de aproximadamente 5-6 semanas de edad, se obtuvieron de Taconic (Germantown, NY) . Todos los otros animales en este estudio fueron los mismos que se describieron anteriormente en los Ejemplos 6-10. Métodos : Se implantaron 30 animales subcutáneamente sobre el flanco derecho con 3xl06 Células DU145 en 100 µl de HBSS y matrigel (HBSS :matrigel=l : 1) . Cuando el tamaño del tumor alcanzó 100 mm3, los ratones fueron agrupados y se les administraron 100 µl i.p. de soluciones como sigue: El grupo 1, recibió el vehículo (PBS); el grupo 2 recibió 30 mg/kg de anticuerpo AcMrhu 411. 10 ratones de cada grupo fueron tratados dos veces a la semana durante 3 semanas por inyección intraperitoneal. Los volúmenes de los tumores fueron medidos dos veces a la semana y los pesos corporales fueron medidos una vez por semana. Se notaron los signos de toxicidad o distensión y los animales fueron sacrificados por eutanasia si fue necesario. Cualquier animal que exhibiera 20% o más de pérdida de peso corporal fue sacrificado por eutanasia por humanidad. Resultados: Como se muestra en la Figura 35, el crecimiento de los tumores DU-145 fue retrasado significativamente en animales tratados con AcMrhu 411 en comparación con los animales tratados con vehículo. El peso corporal se mantuvo durante el tratamiento con AcMrhu 411 y no se observó toxicidad aparente (no se muestran los datos) .

Ejemplo 11 - Eficacia del AcMrhu 411 en un modelo de metástasis de carcinoma de pulmón H226 El objetivo de este estudio fue examinar la capacidad del AcMrhu 411 para inhibir la metástasis inducida por H226, una línea celular de carcinoma de pulmón. El efecto del AcMrhu 411 fue comparado con vehículo control. Materiales: línea celular: la H226, es una línea de carcinoma de pulmón CD26-positiva humana y se obtuvo de la ATCC. Animales: Los ratones desnudos NCR hembra, que tenían un peso corporal de 18-22 g y de aproximadamente 5-6 semanas de edad, se obtuvieron de Taconic (Germantown, NY) . Todos los otros materiales de este estudio fueron los mismos que se describieron anteriormente en los ejemplos 6-10. Métodos : Dieciséis animales fueron inyectados con lxlO4 células H226 vía la vena de la cola y entonces divididos en dos grupos, con 8 ratones por grupo. El Grupo 1, recibió 100 µl de vehículo (PBS); el grupo 2 recibió el mismo volumen de 30mg/kg de anticuerpo AcMrhu 411. Ambos grupos fueron tratados dos veces a la semana durante 3 semanas por inyección ip. 4 semanas después del inicio de la dosificación, los animales fueron sacrificados por eutanasia y retirados los pulmones. Se contó el número total de metástasis en ambos pulmones de cada ratón. Resul tados : Como se muestra en la Figura 36, la dosificación con AcMrhu 411 dio como resultado una ocurrencia mucho menor de metástasis en comparación con el vehículo control. El valor medio fue de 67.25 en el grupo con PBS contra 10.5 en el grupo tratado con AcMrhu 411. El peso corporal se mantuvo durante el tratamiento con AcMrhu 411 y no se observó toxicidad aparente (no se muestran los datos).

Ejemplo 11 - Afinidad de unión de AcMrhu 411 El AcMrhu 411 fue producido por fermentación en cultivo de suspensión de células de mamífero (ovario de hámster chino) con sistema de expresión de glutamina sintetasa (GS System; Lonza Biologies, Slough, RU) . La afinidad de unión del AcMrhu 411 al CD26 humano (hu-CD26) se determinó usando el protocolo Biacore® estándar. También se determinó la afinidad de unión del anticuerpo monoclonal murino 14D10 al CD26 humano. Los resultados de esos estudios de unión se presentan en la Tabla 12, a continuación.

TABLA 12 En un ensayo de unión de células completas, se encontró que el AcMrhu 411 se une al CD26 endógeno en la membrana de Karpas-299 y el CD26 humano soluble con afinidad similar. (No se muestran los datos).

Ejemplo 12 - Expresión de CD26 en lineas celulares de cáncer El nivel y porcentaje de expresión en la superficie celular de CD26 fue medido en una variedad de líneas celulares de cáncer por citometría de flujo. Las líneas celulares de cáncer probadas en este estudio se listan a continuación en la Tabla 13.

TABLA 13 TABLA 13 Ma teriales y métodos : La AcMrhu 411 fue conjugado con Alex-488 usando un kit proporcionado por Invitrogen (Carlsbad, California) . Las suspensiones celulares se usaron como tales, mientras que las líneas celulares adherentes se disociaron con reactivo libre de enzima. Todas las células fueron 90-100% confluentes. Las células fueron lavadas con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) con 10% albúmina de suero bovina (BSA) por centrifugación (1200 rpm durante 5 min). Las células (100,000) fueron resuspendidas en 40 µl de PBS/BSA, AcMrhu411-Alexa-488 4 nM en replicas. Para el control negativo, el AcMrhu4H-Alexa-488 fue reemplazado con IgGl humana. Las células fueron incubadas durante 1-2 horas a temperatura ambiente con agitación moderada. Se agregaron 200 µl de PBS/BSA para diluir las células a ~500,000/ml. Las células en placas de 96 pozos fueron entonces analizadas con un citómetro de flujo Guava EasyCyteMR (Guava Technologies, Hayward, California) . El análisis de datos se efectuó con el programa Guava ExpressMR Plus. Resul tados : Los resultados del análisis de flujo del AcMrhu 411 conjugado con Alexa-488 se muestran en la Figura 37. Fueron evidentes niveles y porcentajes significativos de expresión de la superficie de la célula CD26 en varios tipos de células de cáncer, especialmente en líneas celulares de cáncer de riñon, próstata, y 299.

Ejemplo 13 - Un método efectuado adicional para la producción de purificación de AcMrhu 411 Un ejemplo no limitante de la producción del anticuerpo recombinante AcMrhu 411 por fermentación en cultivo en suspensión de células de mamífero (ovario de hámster Chino) con un sistema de expresión de Glutamine Synthetase (GS) creado por Lonza Biologies, Inc., así como de purificación posterior, se proporciona más adelante. El anticuerpo es el IgGl kappa con un peso molecular de 144672 daltons . Secuencias : La secuencia polipeptídica de la cadena pesada del AcMrhu 411 es como sigue: EVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWRQAPGKGLEWV GVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:219). La secuencia polipeptídica de la cadena ligera del AcMrh 411 es como sigue: DILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSS NLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSKLPFTFGSGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:220). Construcción del vector: La región variable de cadena pesada del AcMrhu 411 fue combinada con una secuencia del ADNc que codifica para una región constante IgG Iza para producir el vector genético de una sola cadena pesada (SGV) .

La región variable de cadena ligera fue clonada en el vector pConKappa propiedad de Lonza para formar el vector genético de una sola cadena ligera. Se construyeron vectores genéticos dobles ligando el cásete de expresión completo del vector de cadena pesada en el vector de cadena ligera para generar un solo vector que expresa ambas cadenas pesada y ligera completas de la AcMrhu 411. El vector genético doble (DGV) fue preparado a granel y linealizado con enzima de restricción Pvu I para su transfección en células CHO. Los fragmentos clonados de los genes de cadena pesada y cadena ligera dentro del vector fueron secuenciales para verificar los plásmidos recombinantes y se encontró que eran iguales a las secuencias esperadas. El vector genético doble fue probado por la expresión de anticuerpo en un sistema de transfección transitoria usando células CHO, y se mostró que expresa el anticuerpo plegado y secretado correctamente. Se identificó un doble vector genético doble para su uso adicional y fue renombrado como pY392/DGV/YsCHl-3 (Figura 38) . Construcción y selección de lineas celulares GS-CHO que expresan el an ticuerpo AcMrhu 411 IgGl/kappa : la GS-CHO, es una línea celular a CHOK1SV de Lonza Biologies, Inc. (Slough, RU) , se usó para producir el anticuerpo AcMrhu 411. Se construyó una línea celular GS-CHO transfectada con un vector genético doble, que contiene los genes de cadena pesada y ligera que codifica para un anticuerpo IgGl AcMrhu 411.

Las células CH0K1SV fueron transfectadas con el vector genético doble usando electroporación, y cultivadas en placas múltiples de 96 pozos. Cuatro de esas transfecciones fueron efectuadas en medio que contenía proteína CM25/10% de suero de carnero fetal dialisada (dFCS) (Lonza Biologies, Inc.). Las dos transfecciones restantes se efectuaron usando un protocolo de transfección libre de proteína, en la CD-CHO del medio libre de componentes animales (CDACF) , definida químicamente. El día después de la transfección, se agregó el agente selectivo L-metionin sulfoximina (MSX) a cada pozo de las placas de 96 pozos para dar una concentración final de 50 µM. Los sobrenadantes de los transfectantes resultantes fueron seleccionados para el anticuerpo montado usando un método de ELISA semicuantitativo . Todos los transfectantes seleccionados produjeron niveles detectables de anticuerpo. De esos datos, algunos de los transfectantes (derivados de transfecciones que contienen proteína y libre de proteína) fueron seleccionados para su evaluación adicional, sobre la base de la escala de sus concentraciones relativas de anticuerpo y una evaluación visual del crecimiento. Se efectuó una segunda selección basada en datos de productividad. Se adaptaron exitosamente 28 transfectantes que contenían proteína al crecimiento en el medio libre de proteína. Los cuatro transfectantes libres de proteína seleccionados no requieren ninguna adaptación.

Después de revisar los datos de crecimiento y productividad de cultivos en matraces con agitación del lote alimentado, las líneas celulares fueron seleccionadas usando los siguientes criterios de selección: concentración de anticuerpo de alta cosecha, una velocidad de producción específica alta, y características de crecimiento aceptables. La calidad del producto del anticuerpo purificado fue analizada por SDS-PAGE e IEF. La integridad de la secuencia genética que codifica para el anticuerpo AcMrhu 411 en la línea celular seleccionada (referida aquí como "AcMrhu411M" ) fue verificada comparándolas con las secuencias genéticas del vector de ADN con el cual se construyó la línea celular. El ARN total fue aislado del AcMrhu4HM de la línea celular y usado como molde o patrón para sintetizar ADNc. Esas secuencias que codifican para la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) fueron amplificadas específicamente por el método PCR usando cebadores que recosen a la región 5' no traducida (UTR) y 3'-UTR de las secuencias que codifican para la cadena. Los productos de ADN resultantes fueron secuenciados usando un conjunto de cebadores elegidos para permitir que todos los segmentos de ADNc de ambos productos de la PCR LC y HC sean secuencias en ambas direcciones de ida y regreso. Los transcriptos que codifican para la LC del anticuerpo AcMrhu 411 presentes en el AcMrhu411M de la línea células son idénticos a las secuencias dentro del vector que codifica para AcMrhu4H (pY392/DGV/YsCHl-3) usado para generar la línea celular AcMrhu4HM. Para la HC, las especies de ARN principales detectadas codificaron como secuencias de HC idénticas como las presentes en el vector que codifica para el AcMrhu4H (pY392/DGV/YsCHl-3) . Método de Producción del Acmrhu411 : El AcMrhu 411 es producido del banco de mastocitos en células GS-CHO. SE inoculan biorreactores a una concentración de células viables usando medio de cultivo bien definido y se mantiene la fermentación bajo afecciones estables y controladas. Las cosechas son alimentadas en una centrífuga de discos apilados, continua, identificados entonces recolectado en recipientes de bioproceso (BPCs) y almacenado a 4°C antes de la purificación. El proceso de fermentación y aislamiento comprende los siguientes, en el orden listado: descongelar la ampolleta; inoculación del matraz de agitación; inocular el Wave Bioreactor®; inoculación del fermentador de aire; fermentación; cosecha de la fermentación; centrifugación en discos apilados (Westfalia SAI); filtración posterior a la centrifugación (filtración lenticular de 2 etapas) ; filtración de 0.22 micrómetros; y purificación. Purificación del AcMrhu 411 : El proceso de purificación del anticuerpo comprende lo siguiente, en el orden listado: cromatografía de afinidad en proteína A; inactivación viral (mantener pH bajo (pH 3.7 +/- 0.1)); cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio aniónico, filtración de reducción de virus (Pall DV20); concentración y diafiltración; filtración (0.2 micrómetros) ; y llenado en recipientes para almacenamiento (-20° C) .

Ejemplo 14 - Formulación ejemplar adicional de AcMrhu 411 Una formulación ejemplar de AcMrhu se proporciona en la Tabla 14, más adelante. El producto farmacéutico puede ser proporcionado en forma de dosis parenteral líquida (10 mg/mL ± 1.0 mg/mL) que puede ser administrada fácilmente a los pacientes.

TABLA 14 Ingrediente Cantidad por mL AcMrhu 411 10 mg Citrato de sodio, USP 139 mg Acido cítrico, anhidro, USP 5.38 mg Sucrosa, granular, USP 600 mg NaOH o HCl Según sea necesario para el PH Agua para inyección (WFI) c.s. 1 mL Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (65)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido, caracterizado porque comprende: (a) uno o más CDR de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de (i) un CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia GX]X2LX3TYGVH (SEQ ID NO: 31), donde Xi es F o Y, X2 es S o T, y X3 es T, N, o S, (ii) un CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia VIWGX?GRTDYDX2X3FMS (SEQ ID NO: 32), donde Xi es G o D, X2 es A o S, y X3 es A o S, y (iii) un CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia XiRHDWFDY (SEQ ID NO:33), donde Xi es N o S; (b) uno o más CDR de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de (i) un CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia X?ASQX2IRNX3LN (SEQ ID NO:34), donde Xi es S o R, X2 es G o D, y X3 es S o N, (ii) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia YSSNLX?X2 (SEQ ID NO:35) , donde Xi es H o Q y X2 es S o T, y (iii) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQSX?KLPX2T (SEQ ID NO: 36), donde X? es I o N y X2 es F o L; o uno o más CDR de cadena pesada como se indica en (a) y uno o más CDR de cadena ligera como se indica en (b) ; donde el polipéptido no comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDA AFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 90) y una región variable de cadena ligera de la secuencia DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWYQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPS RFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 91) . 2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una o más CDR de cadena pesada como se indica en (a) . 3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende (i) uno o más CDR de cadena pesada seleccionados del grupo que consiste de (i) un CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia GX?X2LX3TYGVH (SEQ ID NO: 31), donde Xi es F o Y, X2 es S o T, y X3 es T, N, o S, (ii) un CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia VIWGX?GRTDYDX2X3FMS
2. (SEQ ID NO:32), donde Xi es G o D, X2 es A o S, y X3 es A o S, y (iii) un CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia
3. XiRHDWFDY (SEQ ID NO:33), donde Xi es N o S;
4. 4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende además (i) un CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia Xx ASQX2IRNX3LN (SEQ ID NO:34), donde Xi es S o R, X2 es G o D, y X3 es S o N; (ii) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia YSSNLX?X2 (SEQ ID NO: 35), donde Xi es H 0 Q y X2 es S o T; y (ii) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQSX?KLPX2T (SEQ ID NO: 36), donde X? es 1 o N y X2 es F o L.
5. 5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la CDRl comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 55), GFSLSTYGVH (SEQ ID NO: 56), y GYSLTTYGVH (SEQ ID NO:57) .
6. 6. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la CDR2 de cadena pesada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO: 58) y VIWGDGRTDYDSSFMS (SEQ ID NO: 59).
7. 7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60).
8. 8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende (a) CDR de cadena pesada que comprende (i) una CDRl que comprende la secuencia GFSLTTYGVH (SEQ ID NO:55) , (ii) una CDR2 que comprende la secuencia VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO:58), y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60) ; (b) CDR de cadena pesada que comprende (i) una CDRl que comprende la secuencia GFSLSTYGVH (SEQ ID NO:56) , (ii) una CDR2 que comprende la secuencia VIWGDGRTD YDAAFMS (SEQ ID NO: 58), y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60); o (c) CDR de cadena pesada que comprenden (i) una CDRl que comprende la secuencia GYSLTTYGVH (SEQ ID NO:57) , (ii) una CDR2 que comprende la secuencia VIWGDGRTDYDSSFMS (SEQ ID NO: 59), y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO:60) .
9. 9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además (a) una CDR de cadena ligera que comprenden (i) una CDRl que comprende la secuencia RASQDIRNNLN (SEQ ID NO: 61), (ii) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLHS (SEQ ID NO:64) , y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia QQSIKLPLT (SEQ ID NO: 67); (b) una CDR de cadena ligera que comprende (i) una CDRl que comprende la secuencia RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), (ii) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLQS (SEQ ID NO:65) , y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68); o (c) una CDR de cadena ligera que comprende (i) una CDRl que comprende la secuencia SASQDIRNSLN (SEQ ID NO: 63), (ii) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLHT (SEQ ID NO:66) , y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia QQSNKLPLT (SEQ ID NO: 69).
10. 10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una o más CDR de cadena ligera como se indica en (b) .
11. 11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende (i) un CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia X!ASQX2IRNX3LN (SEQ ID NO:34), donde Xi es S o R, X2 es G o D, y X3 es S o N; (ii) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia YSSNLX?X2 (SEQ ID NO: 35), donde Xi es H o Q y X2 es S o T; y (ii) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQSX?KLPX2T (SEQ ID NO: 36), donde Xi es I o N y X2 es F o L.
12. 12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la CDRl de cadena ligera comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de RASQDIRNNLN (SEQ ID NO: 61), RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), y SASQDIRNSLN (SEQ ID NO: 63).
13. 13. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la CDR2 de cadena ligera comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de YSSNLHS (SEQ ID NO: 64), YSSNLQS (SEQ ID NC-.65) y YSSNLHT (SEQ ID NO.66).
14. 14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la CDR3 de cadena ligera comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de QQSIKLPLT (SEQ ID NO: 67), QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68), y QQSNKLPLT (SEQ ID NO: 69).
15. 15. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende (a) CDR de cadena ligera que comprenden (i) una CDRl que comprende la secuencia RASQDIRNNLN (SEQ ID NO: 61), (ii) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLHS (SEQ ID NO.64) , y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia QQSIKLPLT (SEQ ID NO: 67); (b) CDR de cadena ligera que comprenden (i) una CDRl que comprende la secuencia RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), (ii) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLQS (SEQ ID NO: 65) , y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68); o (c) CDR de cadena ligera que comprenden (i) una CDRl que comprende la secuencia SASQDIRNSLN (SEQ ID NO.63), (ii) una CDR2 que comprende la secuencia YSSNLHT (SEQ ID NO:66) , y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia QQSNKLPLT (SEQ ID NO: 69).
16. 16. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una o más CDR de cadena pesada como se indica en (a) y una o más CDR de cadena ligera como se indica en (b) .
17. 17. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende además (a) una o más regiones estructurales de cadena pesada seleccionados del grupo que consiste de (i) una FRl de cadena pesada que comprende la secuencia EVQLVX?SGX2X3X4X5QPGX6X7 RLX8CX9AS (SEQ ID NO:37), donde Xi es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, y X9 es T o K; (ii) una FR2 de cadena pesada que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWXXG (SEQ ID NO:38), donde Xi es V o M; (iii) una FR3 de cadena pesada que comprende la secuencia RVTISX?DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R (SEQ ID NO: 39), donde Xx es K o R, X2 es N o T, X3 es S o N, X4 es V o A, X5 es M o L, y X6 es V, M, o T; y (iv) una FR4 de cadena pesada que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40); (b) una o más regiones estructurales de cadena ligera seleccionados del grupo que consiste de (i) una FRl de cadena ligera que comprende la secuencia X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RXsTIX9C (SEQ ID NO:41), donde Xi es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E, X8 es V o A, y X9 es T o S, (ii) una FR2 de cadena ligera que comprende la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 42), (iii) una FR3 de cadena ligera que comprende la secuencia GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDXAX5YYC (SEQ ID NO: 43), donde Xx es S, D, o A, X2 es E o Q3 X3 es P o A, X4 es F o V, y X5 es T, A, o í, y (iv) una FR4 de cadena ligera que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44); o (c) una o más regiones estructurales de cadena pesada como se indica en (a) y una o más regiones estructurales de cadena ligera como se indica en (b) .
18. 18. Un polipéptido, caracterizado porque comprenden: (a) una secuencia de aminoácidos que consiste de EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX?oX??LX?2TYGVHWVRQAPGKGLEWX?3GV IWGX?4GRTDYDX15Xi6FMSRVTISX17DX?8SKX?gTX20YLQX21NSLRAEDTAVYYCX22RX23 RHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 29), donde Xi es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X5 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S5 X9 es T o K, X10 es F o Y, Xn es S o T, Xi2 es T, N, o S, Xi3 es V o M, X14 es G o D, Xi5 es A o S, X?6 es A o S, X17 es K o R, X?8 es N o T, X19 es S o N3 X20 es V o A, X2i es M o L, X22 es V, M, o T, y X23 es N o S; (b) una secuencia de aminoácidos que consiste de X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX?oASQX??IRNX?2LNWYQQKPGQAPRLLIYYS SNLX?3Xi4GVPX?5RFSGSGSGTDFTLTISRLX?6X?7EDX18AX?9YYCQQSX20KLPX21TFGS GTKVEIK (SEQ ID NO:30) , donde Xi es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E, X8 es V o A, X9 es T o S, X?0 es S o R, Xn es G o D, Xi2 es S o N, Xi3 es H o Q, Xi es S o T, Xi5 es S, D, o A, X16 es E o Q, X?7 es P o A, Xi8 es F o V, Xi9 es T, A, o í, X20 es I o N y X21 es F o L; o (c) ambas secuencias de aminoácidos indicadas en (a) y la secuencia de aminoácidos indicada en (b) .
19. 19. Un polipéptido, caracterizado porque comprende : (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NOS:22-28; o (c) una secuencia de aminoácidos como se indica en (a) y una secuencia de aminoácidos como se indica en (b) ; donde un polipéptido no comprende ambas de una región variable de cadena pesada de la secuencia QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDA AFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 90) y una región variable de cadena ligera de la secuencia DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPS RFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:91) .
20. 20. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 15-21; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NOS:22-28; o (c) una secuencia de aminoácidos como se indica en (a) y una secuencia de aminoácidos como se indica en (b) .
21. 21. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende (a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOS: 15-21; (b) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOS: 22-28; o (c) una secuencia de aminoácidos como se indica en (a) y una secuencia de aminoácidos como se indica en (b) .
22. 22. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende (a) una región variable de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 y una región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15; (b) una región variable de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 y una región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ. ID NO: 18; (c) una región variable de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 y una región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19; o (d) una región variable de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 y una región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19.
23. 23. Un polipéptido, caracterizado porque comprende : (a) una o más regiones estructurales de cadena pesada seleccionados del grupo que consiste de (i) una FRl de cadena pesada que comprende la secuencia EVQLVX?SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9AS (SEQ ID NO:37), donde Xx es E o Q, X2 es A o G, X3 es G o E, X4 es L o V, X5 es V, K, o E, X6 es G o E, X7 es T o S, X8 es T o S, y X9 es T o K; (ii) una FR2 de cadena pesada que comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWXiG (SEQ ID NO:38), donde Xx es V o M; (iii) una FR3 de cadena pesada que comprende la secuencia RVTISX?DX2SKX3TX4YLQX5NSLRAEDTAVYYCX6R (SEQ ID NO: 39), donde Xi es K o R, X2 es N o T, X3 es S o N, X4 es V o A, X5 es M o L, y X6 es V, M, o T; y (iv) una FR4 de cadena pesada que comprende la secuencia WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40); (b) una o más regiones estructurales de cadena ligera seleccionados del grupo que consiste de (i) una FRl de cadena ligera que comprende la secuencia X?IX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RXsTIX9C (SEQ ID NO:41), donde Xi es D o E, X2 es L o E, X3 es M o L, X4 es A o V, X5 es S o T, X6 es L, P, o A, X7 es D o E, X8 es V o A, y X9 es T o S, (ii) una FR2 de cadena ligera que comprende la secuencia WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 42), (iii) una FR3 de cadena ligera que comprende la secuencia GVPX1RFSGSGSGTDFTLTISRLX2X3EDX4AX5YYC (SEQ ID NO: 43), donde Xi es S, D, o A, X2 es E o Q3 X3 es P o A, X4 es F o V, y X5 es T, A, o í, y (iv) una FR4 de cadena ligera que comprende la secuencia FGSGTKVEIK (SEQ ID NO:44); o (c) una o más regiones estructurales de cadena pesada como se indica en (a) y una o más regiones estructurales de cadena ligera como se indica en (b) ; donde un polipéptido no comprende ambas de una región variable de cadena pesada de la secuencia QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDA AFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS ( SEQ ID NO: 90) y una región variable de cadena ligera de la secuencia DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPS RFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 91) .
24. 24. Un anticuerpo que se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo, caracterizado porque consiste de YSLRWISDHEYLY (SEQ ID NO: 45; péptido 6), LEYNYVKQ WRHSY (SEQ ID NO: 46; péptido 35), TWSPVGHKLAYVW (SEQ ID NO: 47; péptido 55), LWWSPNGTFLAYA (SEQ ID NO:48; péptido 84), RISLQWLRRIQNY (SEQ ID NO: 49; péptido 132), YVKQWRHSYTASY (SEQ ID NO: 50; péptido 37), EEEVFSAYSALWW (SEQ ID N0:51; péptido 79), DYSISPDGQFILL (SEQ ID NO: 52; péptido 29), SISPDGQFILLEY (SEQ ID NO: 53; péptido 30), y IYVKIEPNLPSYR (SEQ ID NO:54; péptido 63), donde el anticuerpo no comprende ambas de una región variable de cadena pesada de la secuencia QVKLQESGPGLVQPSQTLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGRTDYDA AFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCVRNRHDWFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 90) y una región variable de cadena ligera de la secuencia DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCSASQGIRNSLNWQQKPDGAVKLLIYYSSNLHSGVPSRF SGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQSIKLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO.91).
25. 25. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo.
26. 26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .
27. 27. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado.
28. 28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.
29. 29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv y F(ab')2.
30. 30. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una cadena de anticuerpo.
31. 31. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque no es un anticuerpo monoclonal murino.
32. 32. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque está aislado.
33. 33. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a CD26.
34. 34. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el CD26 es CD26 humano.
35. 35. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque se une a CD26 humano con una KD de aproximadamente 6 nM o menos.
36. 36. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
37. 37. Un vector, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 36.
38. 38. Una célula anfitriona, caracterizada porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 36.
39. 39. Un polinucleótido, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NOS: 1-14.
40. 40. Una célula anfitriona, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 39.
41. 41. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
42. 42. Un método para inhibir la proliferación de una célula que expresa CD26, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
43. 43. Un método para tratar una afección asociada con la expresión de CD26 en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 al sujeto.
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la afección es una enfermedad autoinmune .
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la afección y la enfermedad de injerto contra el anfitrión.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la afección es un cáncer.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el cáncer es una enfermedad maligna hematológica .
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el sujeto tiene un tumor que expresa CD26 o tiene un tumor que expresa CD26 removido.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el cáncer es linfoma, cáncer de riñon, cáncer de próstata o cáncer de pulmón.
50. 50. Un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto que tiene un tumor que expresa CD26 y que tuvo un tumor que exprese CD26 removido, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 al sujeto.
51. 51. Un método para inhibir la metástasis de células cancerígenas que exprese CD26 en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 al sujeto.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el sujeto es humano.
53. 53. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, 19, ó 23, caracterizado porque es un anticuerpo .
54. 54. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, 19, ó 23, caracterizado porque se une a CD26.
55. 55. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, 19, ó 23.
56. 56. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, 19, ó 23 y un excipiente farmacéuticamente aceptable .
57. 57. Un método para inhibir la proliferación de una célula que expresa CD26, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con el polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, 19, ó 23.
58. 58. Un método para tratar la afección asociada con la expresión de CD26 en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, 19, ó 23 al sujeto.
59. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la afección es cáncer.
60. 60. Un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto que tiene un tumor que expresa CD26 y que tenga un tumor que expresa CD26 removido, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, 19, ó 23 al sujeto.
61. 61. Un método para inhibir metástasis de células cancerígenas que expresen CD26 en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, 19, ó 23 al sujeto.
62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende además el paso de tratar al sujeto con quimioterapia, radiación, cirugía, terapia con hormonas, o inmunoterapia adicional.
63. 63. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque comprende además el paso de tratar al sujeto con quimioterapia, radiación, cirugía, terapia con hormonas, o inmunoterapia adicional.
64. 64. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende (a) un CDR de cadena pesada que comprende: (i) un CDRl que comprende la secuencia GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 55), (ii) un CDR2 que comprende la secuencia VIWGDGRTDYDAAFMS (SEQ ID NO: 58) y (iii) una CDR3 que comprende la secuencia NRHDWFDY (SEQ ID NO: 60); y (b) un CDR de cadena ligera que comprende: (i) un CDRl que coitprende la secuencia RASQGIRNNLN (SEQ ID NO: 62), (ii) un CDR2 que copprende la secuencia YSSNLQS (SEQ ID NO: 65) y (iii) un CDR3 que copprende la secuencia QQSIKLPFT (SEQ ID NO: 68) .
65. 65. Un anticuerpo, caracterizado porque es codificado por el plásmido depositado con la ATCC en E. coli como número de acceso PTA-7695.