MX2007010384A - Revascularizacion de tejido retinado isquemico y metodo de seleccion para el mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo de tratamiento para promover la revascularizacion fisiologica benefica de tejido retiniano isquemico. El metodo comprende administrar a un mamifero que sufre de una isquemia vascular retiniana una cantidad terapeuticamente efectiva de un fragmento angiostatico de triptofanil-tRNA sintetasa (TrpRS), lo que en consecuencia inhibe simultaneamente la neovascularizacion patologica mientras promueve revascularizacion fisiologica benefica de areas danadas de la retina. En una modalidad preferida, el fragmento angiostatico de TrpRS es T2-TrpRS o T2-TrpRS-GD. De preferencia, el mamifero es un paciente humano que sufre de isquemia retiniana. Un metodo de seleccion para identificar y evaluar agentes terapeuticos para tratar enfermedades neovasculares retinianas se describe tambien.

Description

REVASCULARIZACION DE TEJIDO RETINIANO ISQUÉMICO Y MÉTODO DE SELECCIÓN PARA EL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el tratamiento de enfermedades neovasculares retinianas. Más particularmente esta invención se relaciona con métodos para promover revasculapzación retmiana al administrar un fragmento de proteína angiostática a un paciente, y con métodos de selección para identificar agentes terapéuticos para tratar enfermedades vasculares retinianas ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades vasculares de la retina, incluyendo retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad exudativa (ARMD) , retmopatía de premadurez (ROP) y oclusiones vasculares, son causas principales de impedimento visual y ceguera. Este grupo de enfermedades es el foco de intensa investigación que tiene como meta identificar modalidades de tratamiento novedosas que ayudarán a prevenir o modificar la neovascularización ocular patológica. Por ejemplo, la ARMD afecta de 12 a 15 millones de Estadounidenses por arriba de 65 años y provoca pérdida de visión en 10-15% de ellos como un efecto directo de la neovasculapzac ón coroidea (sub-retiniana) La causa principal de pérdida de visión para los Estadounidenses por debajo de 65 años es la diabetes; 16 millones de individuos en los Estados Unidos son diabéticos y 40,000 por año sufren de complicaciones oculares de la enfermedad, con frecuencia un resultado de la neovascularización retiniana. Mientras que la fotocoagulación con láser ha sido efectiva en prevenir la pérdida de visión severa en subgrupos de pacientes diabéticos de alto riesgo, la incidencia global en 10 años de la retinopatía permanece sustanclalmente sin cambio Para pacientes con neovasculapzación coroidea debida a ARMD o enfermedad ocular inflamatoria tales como histoplasmosis ocular, fotocoagulación, con pocas excepciones, es inefectiva en prevenir la pérdida de visión Mientras que terapias fotodinámicas no destructivas recientemente desarrolladas se mantienen promisorias para reducir temporalmente la pérdida individual en pacientes con neovascularización coroidea previamente sin tratamiento, sólo 61 4% de los pacientes tratados cada 3-4 meses tuvo visión mejorada o estabilizada comparados con 45.9% del grupo tratado con placebo. La degeneración macular relacionada con la edad y la retmopatía diabética son las causas principales de pérdida de visión en las naciones industrializadas y lo hacen así como un resultado de la neovasculapzación retimana anormal Ya que la retina consiste de capas de neuronas, glia, y elementos vasculares bien definidos, disturbios relativamente pequeños tales como aquellos vistos en la proliferación vascular o edema pueden conducir a pérdida significativa de función visual. Las degeneraciones retimanas heredadas, tal como retinitis pigmentosa (RP) , se asocian también con anormalidades vasculares, tales como estrechamiento arteriolar y atrofia vascular. Mientras que progreso significativo se ha hecho en identificación de factores que promueven e inhiben la angiogénesis , no existe tratamiento actualmente disponible para tratar de manera específica la enfermedad vascular ocular . Las degeneraciones heredadas de la retina afectan hasta 1 en 3500 individuos y se caracterizan por ceguera nocturna progresiva, pérdida del campo visual, atrofia del nervio óptico, atenuación artepolar, permeabilidad vascular alterada y pérdida central de visión que con frecuencia progresa a ceguera completa (Heckenlively, J. R., editor, 1988; Retinitis Pigmen tosa , Philadelphia : JB Lippmcott Co . ) . El análisis genético molecular de estas enfermedades ha identificado mutaciones en más de 110 genes diferentes que contribuyen sólo a un porcentaje relativamente pequeño de los individuos afectados conocidos (Humphpes et al . , 1992, Sci ence 256; 804-808; Farrar et al . 2002, EMBO J. 21-857-864). Muchas de estas mutaciones se asocian con componentes enzimáticos y estructurales de la maquinaría de fototransducción incluyendo rodopsma, cGMP fosfodiesterasa, rds perifepna, y RPE65. A pesar de estas observaciones, no existen aún tratamientos efectivos para retardar o invertir la progresión de estas enfermedades degenerativas retimanas. Avances recientes en terapia génica han conducido a inversión exitosa de los fenotipos rds (Ali et al . 2000, Na t . Genet . 25:306-310) y rd (Takahashi et al . 1999, J". Virol . 73:7812-7816) en ratones y el fenotipo RFPE65 en perros (Acland et al . 2001, Na t . Genet . 28:92-95) cuando el transgen silvestre se suministra a fotoreceptores del epitelio pigmentado retiniano (RPE) en animales con una mutación específica. La angiogénesis es el proceso por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos. En respuesta a señales químicas específicas, los capilares brotan a partir de vasos existentes, que eventualmente crecen en tamaño según se necesite por el organismo Inicialmente , las células endoteliales , las cuales revisten los vasos sanguíneos, se dividen en una dirección ortogonal al vaso existente, formando un brote sólido. Células endoteliales adyacentes forman entonces grandes vacuolas y las células se redisponen de manera que las vacuolas se orientan a sí mismas extremo a extremo y eventualmente se fusionan para formar el lumen de un nuevo capilar (formación de tubo) .

La angiogénesis se estimula por una serie de condiciones, tal como en respuesta a una herida, y acompaña virtualmente a todo el crecimiento de tejidos en organismo vertebrados tales como mamíferos. La angiogénesis juega también un papel en ciertos estados de enfermedad tales como retmopatía diabética y ciertos cánceres. El crecimiento de tumores, por ejemplo, requiere crecimiento de vasos sanguíneos para proporcionar oxígeno y nutrientes al te ido tumoral en crecimiento. La angiogénesis puede detenerse o inhibirse al interferir con las señales químicas que estimulan el proceso angiogénico. Por ejemplo, las células endoteliales angiogénicas producen proteasas para digerir la lámina basal que rodea los vasos sanguíneos, despejando de esta manera una ruta para el nuevo capilar. La inhibición de estas proteasas, o su formación, puede evitar que se formen nuevos vasos. Asimismo, las células endoteliales proliferan en respuesta a señales químicas. Señales de proliferación particularmente importantes incluyen las familias de proteínas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) . Se ha mostrado que el VEGF está involucrado en vascularización de ciertos tumores. La interferencia con estos procesos de señalización de proliferación puede también inhibir la angiogénesis .

Diversos factores se involucran en la angiogénesis . Las moléculas acidas y básicas del factor de crecimiento de fibroblastos son mitógenos para células endoteliales y otros tipos celulares. Un mitógeno altamente selectivo para las células endoteliales basculares es el factor de crecimiento endotelial bascular (VEGF) . En el adulto normal, la angiogénesis está estrechamente regulada, y se limita a cicatrización de heridas, embarazo y ciclo menstrual. La angiogénesis se activa por moléculas angiogénicas específicas tales como factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) básico y ácido, de VEGF, angiogenina, factor de crecimiento transformante (TGF) , factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . La angiogénesis puede suprimirse por moléculas inhibidoras tales como interferon-a, trombospondma-1 , angiostatma y endostatma. Es el equilibrio de estos estimuladores e inhibidores que se presentan de manera natural lo que controla la vasculatura capilar normalmente latente. Cuando este equilibrio se altera, como ciertos estados de enfermedad, las células endoteliales capilares se inducen a proliferar, migrar y en última instancia diferenciarse. La ang ogénesis juega un papel central en una diversidad de enfermedades incluyendo cáncer y neovasculapzación ocular. La metástasis y crecimiento sostenido de una diversidad de tumores ha mostrado también ser dependiente de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos del huésped en el tumor en respuesta a factores angiogénicos derivados del tumor. La proliferación de nuevos vasos sanguíneos en respuesta a una diversidad de estímulos se presenta como el hallazgo dominante en la mayor parte de las enfermedades oculares y aquella ceguera incluyendo retmopatía diabética proliferativa, ARMD, glaucoma rubeótico, queratitis intersticial y retmopatía de la premadurez. En estas enfermedades, el daño al tejido puede estimular la liberación de factores angiogénicos lo que resulta en proliferación capilar. El VEGF juega un papel dominante en neovascularización del iris y retmopatías neovasculares . Mientras que los reportes muestran claramente una correlación entre los niveles de VEGF infraoculares y la neovascularización ocular retmopática isquémica, el FGF probablemente juega un papel . Se sabe que el FGF básico y ácido se presenta en la resina del adulto normal, incluso cuando niveles detectables no se correlacionan consistentemente con la neovasculapzación. Esto puede deberse en gran medida al hecho de que el FGF se une estrechamente al componente cargado de la matriz extracelular y no puede estar fácilmente disponible en una forma que puede difundir de manera libre que podría detectarse por ensayos estándar de fluidos infraoculares. Una ruta final común en la respuesta angiogénica involucra intercambio de información mediada por mtegrma entre una célula endotelial vascular en proliferación y la matriz extracelular. Esa clase de receptores de adhesión, llamados mtegrinas, se expresa como heterodímeros que tienen una subunidad a y ß en todas las células. Una íntegpna tal, avj63, es el miembro más promiscuo de esta familia y permite a las células endoteliales mteractuar con una amplia variedad de componentes de matriz extracelular. Antagonistas peptídicos y de anticuerpos de esta mtegrma inhiben angiogénesis al inducir selectivamente la apoptosis de las células endoteliales vasculares en proliferación. Existen dos rutas dependientes de citocina de la angiogénesis y pueden definirse por su dependencia de mtegrina celulares vasculares distintas, c.v?3 y c¿vß5 . Específicamente, la angiogénesis inducida por FGF básico y VEGF depende de las mtegrinae av?3 y ot ßb l respectivamente, ya que los antagonistas de anticuerpos de cada mtegrina bloquean selectivamente una de estas rutas angiogénicas en los modelos corneal de conejo y de membrana clorioalantoidea de pollo (CAM) . Los antagonistas de péptido que bloquean todas las mtegrinas av inhiben la angiogénesis estimulada con FGF y VEGF. Mientras que los vasos sanguíneos oculares humanos normales no presentan cualquier integrina, las integrinas av/33 y otvß5 , se presentan selectivamente en los vasos sanguíneos en tejidos de pacientes con enfermedad ocular neovascular activa. Mientras que sólo vß3 se observó consistentemente en tejido de pacientes con ARMD, o>vß~ y o>vß5 se presentaron en tejidos de pacientes con retinopatía diabética proliferativa. Los antagonistas peptídicos de integrinas administrados sistémicamente bloquearon la formación de nuevos vasos sanguíneos en un modelo en ratón de vasculogenésis retiniana. Los tratamientos potenciales de prueba para enfermedades neovasculares retinianas se han facilitado en gran medida por el desarrollo de modelos de retinopatía inducida por oxígeno (OÍR) en varias especies animales, incluyendo en gato pequeño, el cachorro de beagle, la rata y el ratón. En cada uno de estos modelos, la exposición de animales recién nacidos a hiperoxia (o a hiperoxia e hipoxia alternantes) impulsa la regresión o retardo del desarrollo vascular retiniano, seguido por angiogénesis anormal después de su regreso a niveles de oxígeno normales. Estos modelos reflejan los eventos que ocurren durante la retinopatía de la premadurez (ROP) , un padecimiento que involucra neovascularización patológica que puede afectar a los infantes prematuros . Durante la última década, el modelo de ratón de OÍR se ha vuelto el modelo más común para estudiar la angiogénesis anormal asociada con retinopatías inducidas por oxígeno. El patrón de anormalidades vasculares en este modelo difiere ligeramente de aquel observado en la ROP; en el ratón la retina posterior central se vuelve carente de vasos después de la exposición a hiperoxia mientras que en infantes humanos la periferia carece de vasos. No obstante, este es un modelo bien aceptado para estudiar mecanismos de enfermedad y tratamiento potencial de retinopatía inducida por hipoxia, y los cambios vasculares son muy consistentes, reproducibles y cuantificables . En años recientes, el uso de este modelo se ha extendido al estudio general de vasculopatías isquémicas e intervenciones anti -angiogénicas relacionadas, y ahora se utiliza de manera extensa en ambientes de investigación básica y aplicada. El método históricamente común para cuantificar la respuesta neovascular proliferativa en el modelo de OÍR en ratón se basa en contar el número de células asociadas con vasos nuevos que se extienden desde la retina al interior de la cámara vitrea ("núcleos de pre-membrana limitante interna (ILM)") . Esto se hace en secciones transversales sagitales, usualmente en regiones cercanas a (pero no incluyendo) la papila óptica. El método es muy laborioso, tardado y está lleno de dificultades, incluyendo la necesidad de diferenciar células de los vasos anormales de aquellas de los vasos hialoides en la cámara vitrea. Ya que en general, sólo se evalúa cada 30ava. sección consecutiva, una gran porción del tejido no se cuantifica la que introduce potencialmente grandes errores en el muestreo. Además, ya que los ojos completos se dividen inmediatamente, esto evita la valoración en el mismo ojo de otro parámetro importante en este modelo, es decir el grado de proliferación vascular y velocidad de revascularización ret imana que se presenta de manera concomitante con formación de cresta neovasculares anormales. Este parámetro se valora mejor en preparaciones retinianas de montaje retiniano completo. En consecuencia, existe una necesidad continua de métodos mejorados para tratar enfermedades neovasculares retinianas y para evaluar la eficacia terapéutica de tales tratamientos en la retina completa. Los métodos de la presente invención satisfacen estas necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método de tratamiento para promover revasculapzación fisiológica de tejido retimano isquémico. El método comprende administrar a un mamífero que sufre de isquemia retiniana una cantidad terapéuticamente efectiva de un fragmento angiostático de triptofanil-tRNA smtetasa (TrpRS) , lo que en consecuencia inhibe simultáneamente la neovasculapzación patológica de la retina mientras que promueve revasculapzación fisiológica benéfica de áreas dañadas de la retina. En una modalidad preferida, el fragmento angiostático de TrpRS es el fragmento T2. De preferencia, el mamífero es un paciente humano que sufre de isquemia retiniana. El método de tratamiento de la presente invención es útil para el tratamiento de enfermedades oculares isquémicas y neovasculares, incluyendo retmopatías isquémicas tales como retmopatía diabética, retinopatía de la premadurez y similares. Otro aspecto de la presente invención es un método de selección para la identificación y evaluación de la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos potenciales para tratar enfermedades neovasculares retinianas. El método comprende exponer un ratón recién nacido, de preferencia de aproximadamente 7 días, a hiperoxia durante un período de tiempo suficiente para inducir regresión medible de la vasculatura retiniana, de preferencia aproximadamente de 5 días, y subsecuentemente regresar a los ratones a normoxia. Después del regreso a normoxia, un agente terapéutico potencial se administra entonces a un o o del ratón. La retina completa del ojo tratado se aisla, de preferencia aproximadamente a los 5 días después del regreso a normoxia . Una retina sustanclalmente completa también se aisla de un o o control del mismo ratón o un ratón de la misma edad expuesto al mismo nivel de hiperoxia durante la misma cantidad de tiempo. Al ojo control de preferencia se ha administrado una solución tampón o salina en lugar del agente terapéutico potencial . Los vasos sanguíneos de las retinas tratadas y de control se tiñen para fácil identificación y visualización . Imágenes micrográficas de la retina teñidas sustanclalmente completas se adquieren para visualizar el área de obliteración vascular provocada por la hiperoxia y el área de crestas neovasculares pre-retinianas que se forma al regresar a normoxia . Las imágenes micrográficas se analizan entonces para valorar el área de obliteración vascular provocada por las condiciones hiperóxicas y para valor el grado de neovasculapzación patológica que se presenta al regresar a normoxia . La eficacia de un agente terapéutico potencial se valora al comparar el área de obliteración vascular en los o os tratados versus los ojos control y al comparar el área de crestas neovasculares pre-retimanas en los o os tratados versus los o os control. El grado de neovascularización patológica se evidencia por el área de la retina que exhibe las crestas neo-vasculares pre-retimanas en los o os tratados con relación a los o os control. Una disminución en el área de crestas neovasculares pre-retinianas indica actividad angiostática, es decir, que el agente inhibe la neovascularización patológica. La evaluación de la revascularización se realiza al comparar el área de obliteración vascular en ojos tratados con relación al control. Una reducción en el área de obliteración vascular en los ojos tratados versus los controles indica que el agente terapéutico induce revascularización fisiológica benéfica de las retinas dañadas .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa montajes fotomicrográficos de retinas completas teñidas de ratones recién nacidos, que ilustra el desarrollo normal de la vasculatura en el ojo del ratón a partir de los 9 días (P9) a los 22 días (P22) después del nacimiento. Los paneles A, B y C ilustran la vasculatura en P9, P18 y P22 respectivamente, visualizado al teñir con perfusión FITC-dextrano. Los paneles D, E y F ilustran la vasculatura en P9, P18 y P22, respectivamente, visualizada al teñir con la lectina GS . La Figura 2 representa montajes fotomicrográficos y gráficas que ilustran el desarrollo de vasculatura retiniana en ratones recién nacidos expuestos a hiperoxia durante el período de P7 a P12. Los paneles A, B y C son fotomicrografías que muestran áreas de obliteración vascular. El panel D (gráfica superior) es una gráfica de 5 área retiniana versus edad. El panel D (gráfica inferior) es una gráfica de área de obliteración vascular versus edad El panel E es un diagrama de dispersión que muestra la correlación del área reti ana del o o izquierdo con el área ret imana del o o derecho. El panel F es un diagrama de dispersión que muestra la correlación del área obliterada vascular del o o izquierdo con el área obliterada vascular del ojo derecho. El panel G es una gráfica de barras que muestra la ba a variabilidad observador a observador de área medida de la obliteración vascular para 6 diferentes retinas aisladas en diferentes edades medidas por 4 diferentes observadores de acuerdo con el método de selección de la invención. La Figura 3 representa fotomicrografías y gráficas que ilustran el desarrollo de crestas neovasculares pre-retinianas en ratones recién nacidos expuestos a hiperoxia durante el período de P7 a P12. Los paneles A-F son fotomicrografías en las cuales el Panel A se proyecta para mostrar crestas neovasculares pre-retmianas (porciones claras) . El panel B muestra la imagen del Panel A con las crestas vasculares en ro o. El panel C muestra que las áreas de las crestas neovasculares se perfunden sólo parcialmente - las crestas conectadas a la vasculatura subyacente se muestran en verde. El panel D muestra que las células teñidas con ísolectma GS son predominantemente positivas a CDE31 (verde) , lo que indica linaje vascular. El panel E muestra que algunas células de linaje de macrófago (verde) se presentan entre las crestas neovasculares positivas a CD31. El panel G es una gráfica que muestra el área de crestas neovasculares como una función de la edad. El panel H muestra una correlación del área de crestas neovasculares del ojo derecho versus el o o izquierdo. El panel I es una gráfica de barras que ilustra la ba a variabilidad entre observadores en la determinación del área de crestas neovasculares de acuerdo con el método de selección de la invención. El panel J muestra la correlación entre el área de crestas cuando se mide por el método de selección de la invención versus el método laborioso de sección transversal de la técnica anterior de medición de núcleos de pre-ILM. La Figura 4 representa fotomicrografías y gráficas que ilustran la cuantificación de la oliferación vascular y áreas de crestas neovasculares pre-retimanas en ratones recién nacidos expuestos a h peroxia durante el período de P7 a P12, de acuerdo con el método de selección de la invención Panel A: (imagen derecha superior) muestra el área de obliteración vascular de un o o de ratón control expuesto a hiperoxia de acuerdo con el método de selección de la invención; (imagen media superior) muestra área de crestas neovasculares (ro o) para el ojo del ratón control; (imagen izquierda superior) es una sección transversal de la retina control que muestra núcleos de pre-ILM (flecha) . Panel B: (imagen derecha inferior) muestra el área de obliteración vascular de un ojo de ratón expuesto a hiperoxia y tratado con un inhibidor de iNOS de acuerdo con el método de selección de la invención; (imagen media inferior) muestra el área de crestas neovasculares (rojo) para el o o de ratón tratado; (imagen izquierda inferior) es una sección transversal de la retina tratada que muestra núcleos de pre-ILM (flechas) . Panel B: (gráfica izquierda) compara el área de obliteración vascular para el o o control versus el ojo tratado con iNOS ; (gráfica media) compara el área de crestas neovasculares para el o o control versus el ojo tratado con iNOS; (gráfica derecha) compara el número de núcleos de pre-ILM para el o o control versus el o o tratado con iNOS . La Figura 5 representa fotomicrografías y gráficas que ilustran la cuantificación de los efectos de mejoría de un fragmento angiostático de TrpRS sobre la obliteración vascular y la formación de crestas neonatales en ratones recién nacidos expuestos a hiperoxia durante el período de P7 a P12, de acuerdo con el método de selección de la invención. El panel A es una gráfica que compara el área de crestas neovasculares para ojos tratados con varias dosis con T2 -TrpRS comparados con ojos tratados con dosis similares de TrpRS completo en el método de selección de la invención. El panel B es una gráfica que compara el área de obliteración vascular para o os tratados con diversas dosis de T2 -TrpRS comparados con o os tratados con dosis similares de TrpRS completo en el método de selección de la invención. Los paneles C y D ilustran el área reducida de obliteración vascular para o os tratados con T2-TrpRS (C) versus o os control inyectados con tampón PBS (D) . El panel E ilustra la revasculapzación acelerada inducida por T2-TrpRS (imagen superior) versus el ojo control (imagen inferior) . El panel F ilustra que el aptámero VEGF provoca un retardo en la revascularización de áreas obliteradas vasculares. Los paneles G y H son gráficas que comparan la actividad de T2 -TrpRS y el aptámero VEGF en el método de selección de la presente invención. La Figura 6 ilustra la secuencia de residuos de amino ácidos de T2-TrpRs (SEC. DE IDENT. NO . : 1) y la mutante T2-TrpRS-GD (SEC. DE IDENT. NO . : 2) . La Figura 7 ilustra la secuencia de residuos de ammo ácidos de mini-TrpRs (SEC. DE IDENT. NO.: 3). La Figura 8 ilustra la secuencia de residuos de amino ácidos de Tl-TrpRS (SEC. DE IDENT. NO.: 41).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un método para promover revascularización fisiológica benéfica de tejido retimano isquémico comprende administrar a un mamífero que sufre de isquemia retimana una cantidad terapéuticamente efectiva de un fragmento angiostático de triptofaml- tRNA smtetasa (TrpRS) , lo que por consiguiente simultáneamente inhibe la neovasculapzación patológica mientras que promueve revasculapzación fisiológica de áreas dañadas de la retina. De preferencia, el fragmento TrpRS se administra por inyección mtravítrea en el o o. Los fragmentos angiostáticos preferidos de TrpRS incluye el fragmento T2 (T2-TrpRS; SEC. DE IDENT. NO.: 1, FIGURA 6), un mutante de T2-TrpRS (T2 -TrpRS -GD; SEC. DE IDENT. NO.: 1, FIGURA 6), un TrpRS truncado conocido como mim-TrpRS (SEC. DE IDENT. NO.: 3, FIGURA 7) y Tl-TrpRS (SEC DE IDENT. NO.: 4, FIGURA 8). La secuencia de residuos de ammo ácidos de T2-TrpRS-GD (SEC. DE IDENT. NO.: 2), difiere de la SEC. DE IDENT. NO. : 1 en dos sustituciones de residuos de arrimo ácidos (es decir, S121G y Y122D) De más preferencia, el fragmento angiostático de TrpRS es el fragmento T2. Otro aspecto de la presente invención es un método de selección para la evaluación de la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos putativos para tratar enfermedades neovasculares retimanas. El método utiliza un modelo de ratón de retinopatia inducida por oxígeno para estimular un estado de enfermedad retmopática en el ojo de un ratón. El método comprende exponer a ratones recién nacidos (de preferencia aproximadamente de 7 días) a hiperoxia (por ejemplo, una atmósfera de 75% de oxígeno) durante un período de tiempo suficiente para inducir regresión medible de revasculatura ret imana, de preferencia aproximadamente de 5 días, y regresar subsecuentemente a los ratones a normoxia (es decir, aire normal) . Después de regresar a normoxia, se administra entonces a un o o de cada ratón un agente terapéutico potencial. De preferencia, a un ojo de un ratón individual se le administra el agente terapéutico, mientras que al otro o o se administra un placebo, tal como solución salina o una solución tampón, como un control. Alternativamente, algunos ratones pueden utilizarse como controles mientras otros se tratan con el agente terapéutico potencial. Retinas completas de los ratones tratados y control se aislan, de preferencia aproximadamente a los 5 días después de regresar a normoxia, y los vasos sanguíneos de los mismos se tiñen para rápida identificación. Imágenes micrográficas de sustanclalmente las retinas teñidas completas se adquieren y analizan para valorar el área de obliteración vascular provocada por las condiciones hiperóxicas y para valorar el grado de neovasculapzación patológica que ocurre al regresar a normoxia . La eficacia de un agente terapéutico potencial se valora al comparar el área de obliteración vascular en ojos tratados versus o os control y/o al comparar el área de crestas neovasculares pre-retimanas en los ojos tratados versus los o os control. Un método de selección preferido para identificar y evaluar la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos potenciales para tratar enfermedades neovasculares ret imanas comprende exponer un ratón recién nacido a hiperoxia durante un período de tiempo suficiente para inducir regresión medible de vasculatura reti ana y regresar los ratones a normoxia . A continuación, una solución del agente terapéutico putativo se administra a un o o del ratón Después de un período de hasta aproximadamente 5 días, el ratón se sacrifica y sustanclalmente la retina completa se retira del ojo al cual se administró el agente terapéutico putativo. La vasculatura de la retina se tiñe, y se adquiere la imagen de manera micrográfica de sustanclalmente la retina teñida completa para visualizar la vasculatura de la retina. Por lo menos uno de (a) el área de obliteración vascular observable en la retina teñida, y (b) el área de crestas neovasculares pre-retimanas en la retina teñida, se determina a partir de la imagen. Subsecuentemente, se hace una comparación de por lo menos uno de (i) el área de obliteración vascular observable en la retina teñida comparada con el área de obliteración vascular observable en una retina teñida de un o o control de un ratón expuesto a las mismas condiciones de hiperoxia pero sin administrar el agente terapéutico putativo y (b) el área de crestas neovasculares pre-reti anas en la retina teñida comparada con el área de crestas vasculares pre-retimanas en una retina teñida de un o o control de un ratón expuesto a las mismas condiciones de hiperoxia pero sin administrar el agente terapéutico putativo. Un método de selección preferido para identificar y evaluar la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos potenciales para tratar enfermedades neovasculares y ret imanas comprende: exponer un ratón recién nacido de 7 días a una atmósfera que contiene aproximadamente 75% de oxígeno durante aproximadamente 5 días (condiciones hiperóxicas) ; regresar al ratón a una atmósfera de aire normal (normoxia) ; administrar un agente terapéutico potencial a un ojo del ratón después del regreso a aire normal; sacrificar al ratón y retirar sustanclalmente la retina completa del o o al cual se administró el agente terapéutico putativo; teñir la vasculatura de la retina del ojo al cual se administró el agente terapéutico putativo; preparar por lo menos una imagen micrográfica de sustanclalmente la retina teñida completa para visualizar la vasculatura de la misma; determinar el área de obliteración vascular observable en la retina teñida y el área de crestas neovasculares pre-retimanas en la retina teñida a partir de por lo menos una imagen micrográfica; comparar en el área de obliteración vascular observable en la retina teñida con el área de obliteración vascular observable en una retina teñida de un ojo control de un ratón expuesto a las mismas condiciones hiperóxicas, no habiéndose administrado al ojo control con el agente terapéutico putativo; y comparar el área de crestas neovasculares pre-retimanas en la retina teñida con el área de crestas vasculares pre-retinianas observables en una retina teñida de un ojo control de un ratón expuesto a las mismas condiciones hiperóxicas, el ojo control no habiéndose administrado con el agente terapéutico putativo. El grado de neovascularización patológica se evidencia por el área de la retina que exhibe crestas neovasculares pre-retimanas en los ojos tratados con relación a los o os control visibles en la imagen micrográfica. Una disminución en el área de crestas neovasculares pre-retimanas indica actividad angiostática, es decir, que el agente inhibe la neovascularización patológica La evaluación de revasculapzación se realiza al comparar el área de obliteración vascular en retinas de o os tratados versus o os control. Una reducción en el área de obliteración vascular en retinas de ojos tratados versus controles indica que el agente terapéutico induce revascularización fisiológica benéfica de retinas dañadas. Las composiciones terapéuticas que comprenden un fragmento de TrpRS angiostático pueden incluir portadores, excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables, farmacológicamente apropiados. En general, estos portadores incluyen soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados tal como solución salina tamponada de fosfato (PBS) . Vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Rmger, cloruro de dextrosa y sodio, solución lactosada de Rmger o aceites fijos. Además, los vehículos intravenosos pueden incluir reconstituyentes de fluidos y nutrientes, y reconstituyentes de electrolitos, tales como aquellos mostrados en dextrosa de Rmger. Excipientes tales como conservadores y otros aditivos pueden también presentarse, tales como, por ejemplo, antimicrobianos , antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. Ayudantes de formulación, portadores, otros excipientes adecuados, y métodos para formular composiciones farmacéuticas se describen en Remmgton ' s Pharmaceu ti cal Sciences , 14ht Ed. , Mack Publishing Co . , 1970, particularmente Parte VIII, "Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture", páginas 1461 - 1762, las descripciones relevantes de la cual se incorporan en la presente para referencia. Las composiciones terapéuticas pueden empacarse en botellas o frascos adecuadamente esterilizados, ya sea en dosis múltiples o en formas de dosificación unitaria. Los contenedores se sellan de preferencia herméticamente después de llenarse con una composición de la invención. De preferencia, las composiciones se empacan en un contenedor que tiene una etiqueta fija al mismo, cuya etiqueta identifica los fármacos presentes en la composición, y lleva una notificación en una forma preescrita por una agencia gubernamental tal como la dirección de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos, que refleja la aprobación de la composición ba o las leyes apropiadas, información de dosificación y similares. La etiqueta de preferencia contiene información acerca de la composición que es útil para un profesional del cuidado de la salud que administra la composición a un paciente. El paquete también contiene de preferencia materiales de información impresos que se relacionan con la administración de la composición, instrucciones, indicaciones y cualesquiera advertencias requeridas necesarias .

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OÍR) Todo el trabajo con animales se adhirió a los lineamientos de protocolo estrictos para el cuidado y uso humano de animales en la investigación. La OÍR se indujo de acuerdo con el protocolo descrito por Smith et al . Invest . Opthalmol . Vi s . Sci . , 1994,35.101-111. Crías de ratón de siete días y sus madres se transfirieron de aire ambiente a un ambiente hiperóxico de aproximadamente 75% de oxígeno durante 5 días, y posteriormente se regresaron a aire ambiente (normoxia) La exposición a condiciones hiperóxicas se realizó al colocar las jaulas de los animales dentro de una incubadora infantil humana modificada. El oxígeno se hizo circular a través de la incubadora (utilizando una máquina de anestesia animal para controlar el flujo) y los niveles se monitorearon y se mantuvieron a 74-75% utilizando un analizador de oxígeno aprobado por la FDA (AX-300, Teledyne Analytical Instruments, CA, USA) Durante los 5 días de hiperoxia, los animales se examinaron por lo menos tres veces diariamente. Alimento y agua sin límite estuvieron disponibles para las madres en todo el experimento. Después de 5 días, es decir, en el Día 12 postnatal (P12) las jaulas se regresaron a aire ambiente.

Preparación de montaje completo retiniano e inmunohistoquímica Después de que los ratones se sacrificaron, los o os enucleados se fijaron en 4% de paraformaldehído en PBS durante aproximadamente 10 minutos, y las retinas se disecaron al hacer un corte circular detrás del limbo, aproximadamente en la raíz del iris, y entonces retirar la parte anterior del o o. El cristalino y la cámara vitrea se disecaron, y la retina se separó de las capas esclerótica y coroidea dejando la retina en una configuración de copa del o o Se hicieron incisiones relajantes radiales en la retina para dejarla colapsar y cualesquiera remanentes de la cámara vitrea o hialoide se retiraron cuidadosamente de la retina colapsada. Para la angiografía con FITC-dextrano, los animales se anestesiaron por inyecciones mtrapeptoneales de Quetamma HCl (Ketalar, Parke Davis, UK, lOOmg/kg) en combinación con el agente relajante Xilazma (2mg/kg) . Aproximadamente 300µl de FITC-Dextrano de alto peso molecular (2 x 106 Da) (concentración 50mg/ml, Sigma, St . Louis, MO) se inyectaron en el ventrículo izquierdo y se dejaron circular durante aproximadamente dos minutos antes de sacrificar al animal y enuclear los ojos. Para la tinción con isolectina G4 , las retinas se post-fi aron en 4% de paraformaldehído durante aproximadamente 45 minutos, y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche con ísolectma GS-IB4 de Gri ffonia simpl i ci folia (ísolectm GS) que se conjugó con Alexa Fluor 59 4 (Molecular Probes, dilución 1:150 en solución salina tamponada de fosfato (PBS) ) para ofrecer "ísolectma GS-594" . Después de 4-5 lavados con PBS durante un lapso de 2 horas, las retinas se montaron como preparaciones de montaje completo sobre portaobjetos con SLO FADE (Molecular Probes) para adquisición de imagen subsecuente. Ya que la ísolectma GS teñirá no sólo células endoteliales vasculares sino también macrófagos murmos activados, anticuerpos policlonales específicos para el marcador CD31 endotelial (BD Biosciences-Pharmmgen , dilución 1:100 en 10% de suero bovino fetal (FBS)/10% de tampón NGS) y anticuerpos contra el marcador F4/80 de macrófago (1:150) se utilizaron en un subgrupo de resmas para caracterizar además las células positivas a ísolectma GS. Las retinas se bloquearon con 20% de FBS, 20% de NGS en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con el anticuerpo primario e ísolectma GS-594 durante la noche. Después de lavado con PBS, anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 (Invitrogen Corporation) se aplicaron durante 2 horas, se lavaron, y las retinas se montaron como se describe en lo anterior.

Adquisición de Imágenes y Cuantificación Las imágenes micrográficas se tomaron utilizando un lente objetivo 4x con una resolución de detector de 512 x 512 píxeles. Se tuvo cuidado extremo para enfocar justo arriba de la membrana limitante interna de la retina utilizando microscopía confocal (BioRad) de manera que las crestas neovasculares pre- laminares se volvieron más prominentes que el plexo vascular superficial subyacente haciendo más fácil la cuantif icación subsecuente de las áreas de crestas neovasculares . En la mayor parte de los casos, cuatro imágenes superpuestas (cada una representando un cuadrante retimano) se adquirieron a partir de cada retina. Utilizando Adobe PHOTOSHOP® 6.0, los montajes se crearon entonces utilizando puntos de referencia de la retina tales como la papila óptica y vasos principales para alinear las imágenes. Estos montajes permitieron la visualización y cuantificación de la retina completa. En pocos casos donde las áreas obliteradas y todas las áreas de neovasculapzación se ubicaron hacia el centro de la retina, se adquirieron imágenes sencillas 4x centradas en la papila óptica. Mientras que la retina periférica no se incluye en su totalidad en tales imágenes, los cambios inducidos por OÍR relevantes pueden verse completamente en estos casos. Cada imagen individual se convirtió a un tamaño de 5.08 x 5.08 centímetros (2 x 2 pulgadas) con resolución de 300 píxeles por dos punto cincuenta y cuatro centímetros (por pulgada) previo a crear el montaje y cuantificar las áreas de obliteración y de crestas neovasculares . Después de que las imágenes se generaron y los montajes retiñíanos se crearon, la obliteración vascular y formaciones neovasculares anormales se cuantificaron por individuos en un protocolo ciego para evitar sesgos y las retinas reales se visualizaron bajo el microscopio siempre que fuera necesario para ayudar a determinar las áreas reales de obliteración y crestas neovasculares en las imágenes. Para medir las áreas de obliteración vascular, se utilizó la herramienta de selección a pulso de Adobe PHOTOSHOP®. Los límites de las áreas carentes de vasos sanguíneos se rastrearon y el área total de obliteración en píxeles se calculó. La medición de las áreas de crestas neovasculares también se realizó en la configuración de montaje retimano completo y se basó en la intensidad mayor de la tinción de ísolectma en estas regiones, su apariencia característica y las imágenes creadas al enfocar por arriba de la membrana limitante interna de la retina. Las crestas neovasculares se seleccionaron específicamente a mano utilizando la herramienta de varita mágica en el software Adobe PHOTOSHOP®. El área total en píxeles se determinó entonces. Una vez que las áreas se midieron en píxeles, se aplicó un factor de conversión, el cual para los parámetros se calculó de 27.8 µm2 por píxel, y se derivaron las áreas absolutas (en µm2) . Este factor de conversión se calculó con base en adquisición de imágenes (lentes de aumento (4x) y en parámetros de ensamble de montaje tales como tamaño (5.08 por 5.08 centímetros (2 x 2 pulgadas)) y resolución (300 píxeles por dos punto cincuenta y cuatro centímetros (por pulgada) ) al importar y crear los montajes en el software Adobe PHOTOSHOP®.

Secciones transversales retinianas y conteo de núcleos de pre-ILM En un subgrupo de seis o os, después de la cuantificación en la configuración de montaje completo, las retinas se retiraron de los portaobjetos y se procesaron para flexionamiento transversal y conteo de núcleos de pre-ILM. Después de fijación adicional en 4% de PFA, las retinas se incrustaron en parafma y se seccionaron sepalmente en su totalidad. Se realizó tinción H&E estándar, y todos los núcleos presentes en el lado vitreo de la ILM se contaron. El número promedio de núcleo por sección se calculó. En un grupo adicional de ojos tratados con inhibidor de iNOS (descrito en lo siguiente) , los ojos completos se incrustaron en paraf ma, se seccionaron transversalmente, se tiñeron con H&E, y una muestra de secciones transversales se contó como se describe previamente por Smith et al . El nervio óptico se identificó, y 2-4 secciones en cada lado del mismo, separadas 30 a 90 µm, se contaron para neovasculapzación Inyección de compuestos angiostáticos Se hicieron inyecciones mtravítreas en P12 (al regreso a normoxia) para los tratamientos de inyección sencilla, o en P13 y P16 para los tratamientos de inyección doble. En cada caso, volúmenes de 0.5 µL de la solución apropiada (control de PBS, soluciones de PBS que contienen agente terapéutico individual, o soluciones de PBS que contienen terapias de combinación, se inyectaron utilizando una jeringa Hamilton ajustada con una aguja de calibre 33.

Las inyecciones se hicieron entre el ecuador y el limbo corneal Durante la inyección, la ubicación de la aguja se visualizó a través de un microcopio de disección para asegurar que estaba en la cavidad vitrea, y de esta manera, minimizar la posibilidad de daño retimano o al cristalino.

Después de la inyección, los párpados se recolocaron para cerrar la fisura Resultados El proceso normal del desarrollo vascular retiniano postnatal en el ratón está bien caracterizado, e incluye crecimiento centrípeto de los vasos superficiales que emergen de la papila óptica al nacimiento y que alcanzan la periferia lejana de la retina aproximadamente 9-11 días después. Cerca del final de la primera semana después del nacimiento, los vasos cortos comienzan a sumergirse a partir de su red superficial para formar la red vascular profunda, que usualmente se completa en aproximadamente Pll-12. Entonces, se forma una capa de vasos intermedia (IL) final. El proceso se acompaña por oleadas de remodelación y recorte, y se completa en su mayor parte en aproximadamente P21-23. En ratones C57B16/J recién nacidos, la exposición a altos niveles de oxígeno altera significativamente esta secuencia ordenada de eventos. Después de la exposición a 75% de oxígeno entre P7 y P12, grandes áreas de la red vascular retroceden en el centro de la retina (obliteración vascular) , dejando sólo los vasos principales y prácticamente la red capilar ausente. Esto puede verse en preparaciones de montaje completo perfundidas con dextrano (Figura 1, Panel A) y teñidas con ísolectma (Figura 1, Panel D) de un ojo P9. Macrófagos positivos a ísolectma se presentaron también dentro del área de obliteración vascular (Figura 1, Panel D y también Figura 2, Panel C) . La retina periférica aún muestra evidencia de una red vascular comprimida principalmente de vasos superficiales (Figura 2, Panel C) al regresar a normoxia en P12, un estado relativo de isquemia en la retina deficientemente vascularizada impulsa el re-crecimiento de los vasos superficiales a partir de la periferia hacia dentro acompañado por brote vascular dentro de la retina para formar la capa vascular profunda y también brote anormal en la interconexión entre la retina y la vitrea (crestas vasculares pre-reti anas) . En aproximadamente P18, las áreas de obliteración vascular son más pequeñas, extendiendo alrededor de la papila óptica y a lo largo de las arterías retimanas principales (Figura 1, Panel B y E) y las crestas pre-retinianas son evidentes como regiones positivas a lectma, brillantemente teñidas (Figura 1, Panel E, Figura 3, Panel A) . Es importante notar que después de la perfusión de los vasos retiñíanos con un tinte fluorescente (en este caso Dextrano FITC) , las áreas de obliteración vascular se delinean claramente pero las crestas no pueden identificarse fácilmente (compárese la Figura 1, Panel B con Panel E) . En aproximadamente P22-23, la retina usualmente se revasculapza en gran medida (Figura 1, Panel C y Panel F) y las crestas se resuelven en su mayor parte aunque pueden pasar unos días más antes de que asuma una apariencia completamente normal.

Ejemplo 1. Áreas de Cuantificación de Obliteración Vascular y Velocidad de Revascularización Retiniana A fin de cuantificar la obliteración vascular y la velocidad de revascularización retiniana, se adquirieron imágenes de preparaciones de montaje completo retiniano inyectados con dextrano o teñidos con isolectina utilizando microscopia de fluorescencia a bajo aumento. Cuatro imágenes superpuestas se utilizaron para construir un montaje de la retina (Figura 2, Panel A) , y el área de obliteración (amarillo) así como también el área retiniana total (línea azul) se midieron utilizando programas de procesamiento de imágenes computari zados fácilmente disponibles (Figura 2, Panel B) . Ya que el límite entre la retina vascular y la carente de vasos sanguíneos usualmente está bien definido en estas preparaciones, la variabilidad inter-observador fue muy baja (Figura 2, Panel G) . Se tuvo cuidado de no incluir en el análisis áreas en las cuales estuviera presente un artefacto de disección o montaje. Los cambios en el área retiniana total con el tiempo se muestran en el panel superior de la Figura 2, Panel D. El crecimiento retiniano aparentemente continúa durante la hiperoxia y el área retiniana total crece en aproximadamente 20% entre P8 y P13. Después, la velocidad de cambio disminuye. El curso temporal de la obliteración de los vasos y revascularización (Figura 2, Panel D, gráfica inferior) muestra que la obliteración ocurre bastante rápidamente después de la exposición a hiperoxia en P7 y ocupa aproximadamente 30-35% del área retimana total entre P8-P12. La revascularización después de regresar a normoxia ocurre a una velocidad más lenta con neovascularización extensiva que comienza alrededor de P16, cuatro días después del regreso a normoxia . El proceso es bastante simétrico, según se demuestra por el alto grado de correlación entre los o os compañeros (es decir, o os del mismo animal) , en términos de área retmal total (Figura 2, Panel E) y especialmente en el grado de obliteración vascular (Figura 2, Panel F) . De preferencia, los controles de ojos compañeros se utilizan al practicar los métodos de la presente invención Ejemplo 2. Grado Cuantificado de Neovascularización Anormal Entre P15 y P22, y particularmente de P17-P19, el crecimiento vascular anormal ocurre en la interconexión entre la retina y la cámara vitrea en el modelo de OÍR en ratón. Estas crestas vasculares pre-retinianas son especialmente obvias en el límite de las regiones periférica vasculapzada y central obliterada de la retina. Estos elementos vasculares incorrectamente dirigidos se han cuantificado clásicamente en secciones transversales incrustadas en parafma teñidas con H&E al contar los núcleos de la células que sobresalen al lado vitreo de la membrana limitante interna (ILM) . Sin embargo, estas áreas pueden también observarse de manera bastante clara en imágenes de montajes completos teñidos con isolectina, como colecciones de células que yacen arriba de la red vascular superficial (Figura 1, Panel E, Figura 3, Panel A) . Utilizando una herramienta de umbral de intensidad (disponible en una serie de programas de análisis de imágenes comerciales), o el software Adobe PHOTOSHOP® para seleccionar las regiones de formación de crestas pre-retinianas a mano, el área de estas regiones positivas a isolectinas fuertemente teñidas puede medirse fácilmente (Figura 3, Panel B, áreas neovasculares marcadas en rojo) . La microscopia confocal ayuda a aclara la ubicación de estas células, así como también su relación con los vasos sanguíneos retiñíanos subyacentes (Figura 3, Panel C) . Nótese que estas áreas de proliferación se perfunden sólo parcialmente, como puede verse por los puntos verdes de dextrano FITC inyectados intravenosamente dentro de ellos (Figura 3, Panel C) este nivel limitado de perfusión impide utilizar angiografía dextrano-FITC para visualizar y cuantificar adecuadamente la cresta. Marcadores específicos de células muestran que la mayor parte de las células positivas a isolectina dentro de las crestas expresan el marcador CD31 endotelial, lo que confirma su identidad vascular (Figura 3, Panel D) . De manera interesante las células de linaje de macrófago se presentan también en los agregados como se muestra por mmunotmción con F4/80 (Figura 3 , Panel E) . El grado y curso temporal de la vascularización anormal se muestra en la Figura 3, Panel G. Entre P16-P20, aproximadamente 12-16% del área retiniana total se recubre por crestas neovasculares, llegando al máximo en P17. Es importante notar que la remodelación continua y rápida de estas crestas ocurre en P15-P22. A raíz de la revasculapzación retimana, la cual procede de manera concomitante con la remodelación, las áreas remodeladas también se resuelven. El grupo de células salientes relativamente grande visto anteriormente (Figura 3, Panel A-E) se reduce a filas de células positivas a ísolectma, las cuales generalmente siguen a los vasos retiñíanos (Figura 3, Panel F) y en última instancia desaparecen entre P22-P25 (Figura 1, Panel F) . Mientras la correlación entre ojos compañeros, en términos de formación de cresta, no es tan buena como aquella vista para la obliteración vascular, es no obstante un proceso simétrico en gran medida (Figura 3, Panel H) . La variabilidad del ínter-observador se ba a otra vez sin importar el punto en el tiempo estudiado y el grado de formación de crestas aparentes (Figura 3, Panel I) demostrando la consistencia y claridad relativas del método de cuantificación de la presente invención. Finalmente, a fin de examinar si las áreas neovasculares medidas en montajes completos correlacionan con el conteo de núcleo de pre-ILM (es decir, pre-retimano) en secciones transversales, una serie de retinas montadas completas previamente cuantificadas se incrustaron en parafma, se seccionaron de manera transversal y se contaron los núcleos de pre-ILM en todas las secciones. La Figura 2, Panel J muestra las proporciones de área de crestas y de conteo de núcleos en cada uno de 6 ojos diferentes, normalizados al promedio de cada parámetro. Es evidente que estos dos métodos de cuantificación están generalmente en concordancia (es decir un ojo con un área de crestas más grande tiende a tener también un conteo de núcleos más alto y viceversa) . El protocolo de cuantificación del método presente tiene ventajas sobre el método de conteo de sección transversal, sin embargo, en que la retina completa se evalúa al mismo tiempo.

Ejemplo 3. El efecto anti-angiogénico de un inhibidor de iNOS. La utilidad de la técnica de cuantificación de la presente invención se valoró y se comparó además con el método de la técnica anterior de conteo de núcleos de pre- ILM al examinar el efecto de un agente anti -angiogénico novedoso, un inhibidor de iNOS, sobre la revasculapzación y angiostasis retimana. El inhibidor (o control de solución salina) se suministró entre P12-P17 por inyecciones mtra-peritoneales una vez al día en o os de ratón, y en P17 los ojos se enuclearon y procesaron para cuantificación por una de las dos técnicas. La Figura 4, Panel A muestra preparaciones de montaje completo y la sección transversal de retina de ratones control P17 (fila superior) y animales tratados con inhibidor de iNOS (fila inferior) . Las áreas de obliteración vascular se delinean en los paneles izquierdo (líneas azules) , las áreas de crestas neovasculares se marcan en los mismos montajes completos en los paneles centrales (rojo), y los ejemplos de núcleos de pre-ILM se muestran en las secciones transversales a la derecha (flecha) . La inyección del inhibidor de iNOS redujo el área de obliteración vascular en aproximadamente 28% en comparación con los controles (Figura 4, Panel B, barras izquierda) . El área de crestas neovasculares, según se cuantificó a partir de montajes completos, se redujo en aproximadamente 30% (barras centrales) , lo cual es similar a la magnitud del efecto observado cuando los núcleos de pre-ILM se contaron en secciones transversales de (es decir, aproximadamente 36%, gráfica en la derecha inferior) .

Ejemplo 4. T2 -TrpRS inhibe potentemente la formación de crestas neovasculares en el modelo de OÍR T2 -TrpRS es un fragmento proteolítico de la triptofan tRNA smtetasa (TrpRS) que ha demostrado potencial angiostático potente en diversos modelos de angiogénesis , incluyendo el modelo Matrigel en ratón y el modelo de angiogénesis reti ana en ratón recién nacido. El método de la presente invención se utilizó para probar la actividad de T2 -TrpRS sobre la neovasculapzación patológica en el modelo de OÍR en ratón. Utilizando el método presente de cuantificación, los efectos de la inyección de T2 -TrpRS sobre la revascularización del plexus reti ano superficial después de obliteración vascular inducida por oxígeno se valoró también. Cuando se inyecta de manera mtravítrea en P12, justo cuando los ratones se regresaron de hiperoxia (75% de 02) a normoxia, T2 -TrpRS se redujo marcadamente el área de formación de crestas neovasculares en P17 en una materia dependiente de dosis (Figura 5) La tpptofan de tRNA smtetasa completa (FL-TrpRS) también demostró alguna actividad en la dosis más alta, pero niveles significativamente menores de inhibición se observaron cuando se comparó con inyecciones equivalentes de T2 -TrpRS. Como se encontró anteriormente que la FL-TrpRS no tiene actividad angiostática en otros modelos de angiogénesis, es posible que la actividad observada resulte de escisión natural de la FL-TrpRS a un producto similar a T2 -TrpRS después de la inyección m vivo . La áreas obliteradas se cuantificaron también en retinas control y tratadas con T2-TrpRS para analizar los efectos sobre la revascularización fisiológica de la retina después de la obliteración inducida por oxígeno (Figura 5, Panel B) . Aunque T2 -TrpRS inhibe de manera potente la formación de crestas neovasculares, la revascularización de los plexos superficial normal y vascular retimano profundo no se inhibió. De hecho, las retinas inyectadas con T2-TrpRS mostraron de manera consistente revascularización significativamente intensificada , incluso en las dosis más bajas. En retinas inyectadas con T2 -TrpRS, las áreas obliteradas en P17 se redujeron de manera consistente en aproximadamente 40% comparadas con las áreas obliteradas en retinas inyectadas con PBS control en P17 (Figura 5, Panel B) . Las áreas obliteradas al tiempo de la inyección (P12) fueron aproximadamente iguales (datos no mostrados) . De esta manera, la reducción significativa e inesperada en el área de obliteración en P17 sugiere una actividad novedosa para T2-TrpRS en promover revascularización fisiológica mientras que inhibe simultáneamente la neovascularización patológica. Después de la inyección de 1.25 mg/ojo de T2-TrpRS, la morfología vascular de la retina pareció casi normal, especialmente comparada con retinas normales o de OÍR inyectadas con control (Figura 5, Panel C-E). Incluso en P22, cuando las crestas neovasculares han retrocedido de manera natural y la retina está cicatrizando, los vasos nuevos en las retinas de OÍR de control parecen severamente anormales comparados con las retinas inyectadas con T2 -TrpRS en P17 (Figura 5, Panel E) . Las retinas inyectadas con FL-TrpRS también demostraron intensificación significativa del proceso de revascularización pero sólo en las dosis más altas. La actividad de T2 -TrpRS en el modelo de OÍR se comparó directamente con aquella de un aptámero de VEGF que ha mostrado propiedades como un antagonista de la actividad de VEGF165, y ha demostrado inhibición potente de la formación de crestas neovasculares inducidas por OÍR. Ambas moléculas angiostáticas fueron potentes inhibidores de la formación de crestas neovasculares. Los ojos inyectados con 1.25 mg/ojo de T2 -TrpRS exhibieron una ligera, pero significativa reducción en las áreas de crestas neovasculares comparados con las retinas tratadas con aptámero VEGF. De esta manera, incluso después de la inyección de concentraciones molares 10 veces por debajo de las del aptámero, T2-TrpRS exhibió actividad inhibitoria altamente competitiva sobre la formación de crestas neovasculares en el modelo de OÍR. A diferencia de T2- TrpRS, el aptámero VEGF no intensificó la revascularización del plexo superficial. De hecho, aunque el aptámero VEGF no evitó que ocurriera revascularización fisiológica, la revascularización se retrasó de manera consistente comparada con las retinas inyectadas con un vehículo control (PBS) (Figura 5, Panel F-G) . Este retraso en el proceso de revasculapzación para los ojos tratados con aptámero VEGF fue incluso más obvio en P19 después de dos inyecciones separadas de dosis más bajas (Figura 5, Panel H) Discusión El método actualmente aceptado para cuantificar neovasculapzación anormal en el modelo de OÍR se basa en el conteo de núcleos pre-lammares en secciones transversales histológicas del o o incrustadas en parafma, teñidas con H&E. Este método es muy laborioso, tardado y bastante variable y dependiente del observador, y también evita la cuantificación precisa del grado de obliteración vascular en el mismo o o ya que no se generan montajes completos retiñíanos. Mientras que el análisis de las áreas carentes de vasos sanguíneos se ha reportado previamente utilizando análisis de montaje completo, para los conocimientos actuales como el método de la presente invención es el primer método de selección que puede utilizarse para cuantificar las áreas absolutas de formación de crestas neovasculares y obliteración en un análisis en el mismo o o. El método presente utiliza escisión de tejidos y métodos de tinción de rutina y programas de computadora fácilmente disponibles, haciéndolo cómodamente dommable con baja variabilidad ínter-observador. Además, este método novedoso también tiene las ventajas de reducir el error en el muestreo ya que se cuantifican retinas completas en lugar de un número limitado de secciones. La diferenciación de núcleos vitreos asociados con el sistema hialoide de aquellos asociados con las crestas neovasculares puede también ser difícil en los métodos de sección transversal de la técnica anterior, particularmente en el modelo de OÍR en el cual ocurre la persistencia del sistema hialoide. En el método actual, los vasos hialoideos se retiran generalmente durante la disección y cualesquiera remanentes que permanecen, son fácilmente identificados y omitidos en el análisis. El método de selección actual se utilizó para valorar la actividad angiostática de T2 -TrpRS en el modelo de OÍR de angiogénesis patológicas. Un fuerte efecto angiostático dependiente de dosis de T2 -TrpRS sobre la neovasculapzación patológica en el modelo OÍR se observó. La inyección de aproximadamente 1.25 µg/ojo de T2 -TrpRS condujo a inhibición casi completa de la formación de crestas neovasculares. Estos efectos observados fueron comparables, si no es que superiores a, los de un aptámero VEGF, otro potente inhibidor de la neovascularización patológica en el modelo OÍR. Los efectos a largo plazo sobre la neovascularización asociada con OÍR se valoraron al analizar las neovascularización retimana en P19, después de dos inyecciones de inhibidores en dosis más bajas. T2 -TrpRS inhibió la neovasculapzación patológica y redujo la formación de crestas por arriba de 75% comparado con una reducción del 55% después del tratamiento con el aptámero VEGF (0.5 mg/ojo/myección, 53.9 picomoles) . Sorprendentemente, T2 -TrpRS también intensificó el proceso de revasculapzación fisiológica benéfica después de la retmopatía inducida por oxígeno. Aunque las áreas de obliteración fueron equivalentes al tiempo de la inyección, las áreas obliteradas en retinas tratadas con T2 -TrpRS se redujeron consistentemente a la mitad comparadas con las retinas control. En consecuencia, el tratamiento con T2-TrpRS condujo a cicatrización reti ana sorprendentemente rápida y más completa, y una vasculatura resultante que desde el punto de vista anatómico se asemeja más estrechamente a una vasculatura retimana normal. Numerosas variaciones y modificaciones de las modalidades descritas en lo anterior pueden efectuarse sin apartarse del espíritu y alcance las características novedosas de la invención. No se pretenden o deben inferirse limitaciones con respecto a las modalidades específicas ilustradas en la presente.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. REIVINDICACIONES 1. Un método para promover revascularización fisiológica benéfica de tejido retimano isquémico que comprende administrar a un mamífero que sufre de isquemia reti ana una cantidad terapéuticamente efectiva de un fragmento angiostático de triptofaml tRNA smtetasa (TrpRS) suficiente para inhibir la neovascularización patológica y para promover la revascularización fisiológica de áreas isquémicas de la retina. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento angiostático de TrpRS es T2-TrpRS (SEC. DE IDENT. NO.: 1). 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento angiostático de TrpRS es T2-TrpRS-GD (SEC DE IDENT. NO.: 2). 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento angiostático de TrpRS es im-TrpRS (SEC. DE IDENT. NO. : 3) . 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento angiostático de TrpRS es Tl -TrpRS (SEC. DE IDENT. NO.: 4). 6. Un método de selección para identificar y evaluar la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos potenciales para tratar enfermedades neovasculares retinianas, el método caracterizado porque comprende: exponer un ratón recién nacido a hiperoxia durante un período de tiempo suficiente para inducir regresión medible de la vasculatura retiniana; regresar el ratón a normoxia; después de regresar a normoxia, administrar un agente terapéutico putativo a un ojo del ratón; sacrificar al ratón después de un período de hasta aproximadamente 5 días después de administrar el agente terapéutico putativo al ojo; extraer sustancialmente la retina completa del ojo del ratón sacrificado al cual se administró el agente terapéutico putativo; teñir la vasculatura de la retina a la cual se administró el agente terapéutico putativo; preparar por lo menos una imagen micrográfica de la vasculatura teñida de la retina, visualizar el área de obliteración vascular y el área de crestas neovasculares pre-retinianas en por lo menos una imagen; y comparar por lo menos uno de (a) el área de obliteración vascular observable en la retina teñida comparada con el área de obliteración vascular observable en una retina teñida de un ojo control de un ratón expuesto a las mismas condiciones de hiperoxia, el o o control no habiéndose administrado con el agente terapéutico putativo, y (d) el área de crestas neovasculares pre-retmianas en la retina teñida comparada con el área de crestas vasculares pre-retimanas observable en una retina teñida de un ojo control de un ratón expuesto a las mismas condiciones de hiperoxia, el ojo control no habiéndose administrado con el agente terapéutico putativo. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ratón recién nacido tiene aproximadamente 7 días cuando se expone primero a hiperoxia . 8 El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ratón recién nacido se expone a hiperoxia durante aproximadamente 5 días . 9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ratón se expone a hiperoxia al colocar al ratón en una atmósfera que comprende aproximadamente 75% de oxígeno. 10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque un ojo de ratón se administra con el agente terapéutico putativo, mientras el otro ojo se administra con una solución no terapéutica, como un control . 11. Un método de selección para identificar y evaluar la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos potenciales para tratar enfermedades neovasculares retimanas, el método caracterizado porque comprende: exponer un ratón recién nacido de 7 días a una atmósfera que contiene aproximadamente 75% de oxígeno durante aproximadamente 5 días (condiciones hiperóxicas) ; regresar los ratones a una atmósfera de aire normal (normoxia) ; administrar un agente terapéutico potencial a un ojo de ratón y regresar a aire normal ; sacrificar al ratón y retirar sustanclalmente la retina completa del ojo al cual se administró el agente terapéutico putativo; teñir la vasculatura de la retina del ojo al cual se administró el agente terapéutico putativo; preparar por lo menos una imagen micrográfica de sustanclalmente la retina teñida completa, por lo menos una imagen visualizando el área de obliteración vascular y el área de crestas neovasculares pre-retimanas en la retina teñida; determinar el área de obliteración vascular observable en la retina teñida y el área de crestas neovasculares pre-retimanas en la retina teñida de por lo menos una imagen, comparar en el área de obliteración vascular observable en la retina teñida con el área de obliteración vascular observable en una retina teñida de un o o control de un ratón expuesto a las mismas condiciones hiperóxicas, el o o control no habiéndose administrado con el agente terapéutico putativo, y comparar el área de crestas neovasculares pre-retimana en la retina teñida con el área de crestas vasculares pre-retimanas observable en una retina teñida de un o o control de un ratón expuesto a las mismas condiciones hiperóxicas, no habiéndose administrado al ojo control con el agente terapéutico putativo. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el ojo control es del mismo ratón que el ojo al cual se administró el agente terapéutico putativo.