MEDIO PARA LA RECUPERACIÓN DE VIRUS, USO DEL MISMO Y ESTUCHE DIAGNÓSTICO VIRAL QUE LO INCLUYE
Campo Técnico La presente invención se relaciona con un medio de recuperación de virus, su uso y un estuche diagnóstico que lo incluye. Más particularmente, a invención se relaciona con un medio de recuperación de virus que se dosifica con una hormona, tal como la dexametasona y una enzima tal como la tripsina. Los procedimientos diagnósticos convencionales para identificar virus incluyen recipientes para sembrar líneas celulares en particular seleccionadas en función de su sensibilidad a ciertos virus y entonces inocular el cultivo de células con una muestra biológica que contiene virus y entonces, inocular el cultivo celular con una muestra biológica que contiene putativamente un virus. Tales muestra biológicas incluyen entro otros saliva, orina, heces fecales, fluido cerebrospinal (CSF) , fluidos respiratorios e hisopos tales como aquellos para la boca, cavidad nasal, garganta, piel y genitales. El cultivo celular inoculado es entonces incubado y las células se examinan para determinar efectos citopáticos inducidos por el virus. A medida que ciertos virus solamente crecen en ciertas células, los virus pueden identificarse en base al tipo de células en el cual ya sea que se induce ya sea un efecto citopático (CPE) o no se induce el efecto citopático. Existen un gran número de protocolos alternativos a este procedimiento incluyendo la remoción de células que han sido inoculadas con una preparación de virus y sometiendo las células a una tripzinación y detectando los virus por anticuerpos monoclonales específicos a péptidos virales-derivados marcados con una molécula reportera tal como una molécula de fluoresceína (FITC). Una alternativa adicional es incluir una cubierta dentro de un tubo de cultivo para incrementar la recuperación de las células. El método del tubo convencional (traditional-drum) utiliza tubos de cubierta roscada en los cuales se siembra con líneas celulares adecuadas. Después de alcanzar alrededor del 80% de la confluencia celular se inocula el tubo con una muestra adecuada y se monitorea para determinar el CPE hasta por tres semanas. Se requiere monitorear el CPE diariamente durante la primera semana. Un monitorea menos frecuente es aceptable para la segunda y la tercera semanas. A menudo el pasaje a ciegas se requiere para incrementar la recuperación viral . Una de las desventajas del método de tubo convencional es que requiere de tiempo y trabajo exhaustivo. En general, dos personas revisan el mismo tubo para determinar el CPE por microcopia de luz visible para evitar la subjetividad. Además, no todos los virus causan una CPE visible y aquellos que no son incapaces de ser detectados por este método. Además, la formación CPE monitoreada en el método de tubo convencional es altamente dependiente de la sensibilidad de las líneas celulares y la capacidad de los virus para producir cambios similares al CPE dando un resultado falso. También, algunos virus producen CPE solamente después de un período prolongado de tiempo (por ejemplo, Ci tomagalovirus
(CMV) ) . Así, en vista de que los resultados obtenidos por el método del tubo convencional predominantemente se basan fundamentalmente en la determinación de CPE y se confirman rutinariamente por cualquier otro método, puede ocurrir un diagnóstico no preciso. Usando el método del tubo convencional es prácticamente imposible usar 2 ó 3 tubos por muestra debido a la acumulación resultante de tubos (40 muestras por día crean 500 tubos en la primera semana solamente) . El método del frasco vial es actualmente el método más avanzado en el estado de la técnica para la recuperación de virus. El método de frasco o vial de cubierta se basa en el uso de un frasco vial de 5ml de plástico (16mm de diámetro) con un labio translúcido. Siguiendo un tratamiento apropiado, una cubierta de sellado periférico de (13mm) se inserta en el frasco vial. El frasco vial se siembra con una línea celular sensible que crece en monocapa en el labio de cubierta. Cuando la monocapa alcanza alrededor del 80-90% de confluencia, se descarta el medio y se inocula el frasco vial con la muestra del paciente. Entonces, se monitorea el frasco vial incubado para determinar el CPE, seguido de la remoción de la cubierta. La cubierta puede fijarse a un portaobjetos para su observación al microscopio y teñirse con anticuerpos monoclonales. La ventaja del método del frasco vial es que puede incrementarse la recuperación de virus por centrifugación de los frascos viales después de la inoculación que puede acortarse o prolongarse en sus tiempos necesarios para obtener resultados tan cortos como 2-3 días. Además, usando el método del frasco vial no hay necesidad de esperar para determinar el CPE visible. Puede eliminarse la cubierta al Segundo o al tercer día teñirla con anticuerpos monoclonales adecuados y determinar los resultados (CPE específico) confirmados usando tinciones antígeno anticuerpo. Sin embargo, el método del frasco vial también representa un gran número de desventajas, requiere de mucho tiempo en virtud de que las cubiertas requieren un tratamiento especial: lavados múltiples con detergente y con acetona seguidos de lavados con agua destilada y esterilización. Las cubiertas también deben ser insertadas manualmente en los frascos viales. Otra desventaja del método del frasco vial es que como el método de tubo convencional es necesaria la observación diaria para determinar CPE. Además, si es necesaria la tinción por inmunofluorescencia, el procedimiento requerido es complicado y requiere de mucho tiempo. El medio del frasco vial tiene que ser eliminado y la cubierta eliminada manualmente (usando fórceps específicos), secado con aire y fijado a un portaobjetos para su observación al microscopio (usando grasa al vacío). La remoción de las cubiertas es tediosa, dado que las cubiertas pueden romperse por una manipulación ruda, o volteada y fijada al microscopio con la monocapa al revés no intencionalmente. Otra complicación puede surgir debido a que las células que se siembran también crecen en el fondo de la cubierta fijándose así al frasco vial. La remoción de tal cubierta es muy laboriosa. Prácticamente, usando el método de la cubierta de frasco vial es imposible usar más de 2 ó 3 tubos por muestra debido a la acumulación de tubos (40 muestras por día crean 500 cubiertas viales por semana) . Además, una gran cantidad de anticuerpos monoclonales se requieren para teñir por inmunofluorescencia a efecto de cubrir la cubierta de labio de 13 mm redonda. El método de placa de 96 pozos es otro método que se usa solamente en casos muy limitados para recuperar los virus que se desarrollan a partir de virus que crecen en la misma línea celular (por ejemplo, si los pozos se siembran con una línea celular LLC-MK2 es posible la recuperación de virus parainfluenza y también virus de la influenza) . Se usan Anticuerpos Monoclonales para diagnostico junto con una placa de 96 pozos. Este método tiene ventajas en que las muestras son fáciles de manipulación cuando se siembran con una línea celular; Pueden inocularse una gran cantidad de muestras sobre la misma placa; es posible el incremento por centrifugación; solamente se requiere un número reducido de media (solamente 0.2mL en lugar de 1-1.5mL usado en cubiertas de frascos viales) ; las técnicas de antígeno-anticuerpo podrían usarse para confirmar resultados; y el método también permite monitorear el CPE de fácil "lectura". Sin embargo, el método de placa de 96 pozos requiere que toda la placa sea usada para detección de antígeno anticuerpo que en general no es práctica. También se requiere que toda la placa debe ser usada el mismo día, aún cuando el número de muestras es más pequeño que el requerido para usar toda la placa. Esto significa que para cada día deben usarse un juego nuevo de placas diferentes. Además, generalmente sólo pueden usarse una o dos líneas de células diferentes por placa (el mismo tipo de muestra se inocula sobre la placa) . Como tal, los métodos que confirman la determinación de virus deben hacerse en la placa completa y al mismo tiempo. Esta desventaja resulta en una situación en la cual una vez que se completa la detección no quedan disponibles para repetir el procedimiento en caso de un error o después de un período prolongado de incubación. En los métodos anteriores, el medio de cultivo de células usados es a menudo administrado con aditivos para permitir la recuperación viral mejorada. El inventor de la presente ha encontrado que un medio de cultivo que se dosifica tanto con hormona como con enzima ventajosamente optimiza la recuperación viral manteniendo las sensibilidad de la línea celular a su máximo, así como ayudando en la fijación de virus a la pared celular y en algunos casos reduciendo el tiempo que toma producir el resultado final. Esto ha llevado al medio de recuperación de virus de la invención que ventajosamente puede usarse en la recuperación de todos los virus apropiados para cultivo celular como se establece en la invención que ventajosamente puede usarse en la recuperación de todos los virus apropiados para cultivo celular como se establece en la siguiente descripción.
La presente invención también tiene por objeto proporcionar un estuche para facilitar medios rápidos, eficientes y no costosos para aliviar las desventajas de los montajes de charola de microtítulo y proporcionar una recuperación de virus incrementada, de preferencia que es fácilmente modificada dependiendo del diagnóstico que se conducirá. La invención también se relaciona con un método para detectar un virus usando el medio para la recuperación de virus de la invención. Ventajosamente, la invención proporciona flexibilidad en las opciones en el uso que se ha dado a conocer en la presente . Por tanto, la presente invención proporciona un medio para la recuperación de virus que incluye un medio de cultivo de células adicionado con al menos una hormona y al menos una enzima . Como se usa en la presente, los términos "medio de recuperación de virus" o "medio para recuperar virus" se refieren a un medio o a medios que se usan para desarrollar o aislar virus. Por ejemplo, el medio para la recuperación de virus incluye medio de mantenimiento. La enzima agregada al medio de cultivo celular no está limitada particularmente a una persona con conocimientos en el estado de la técnica que podría identificar enzimas apropiadas. En algunas modalidades, el término "enzima" se refiere a una enzima proteolítica. Es estas modalidades la enzima es de preferencia una proteasa de serina o de aspartato. Ejemplos de enzimas incluyen tripsina, quimiotripsina o pepsina. En modalidades preferidas la enzima es tripsina. La hormona agregada al medio de cultivo de células no está particularmente limitada y una persona con conocimientos en el arte podría identificar hormonas apropiadas. En algunas modalidades, el término "hormona" se refiere a corticoesteroides, de preferencia, un glucocorticoide. Más preferiblemente, la hormona se selecciona a partir de dexametasona, hidrocortisona, acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, betametasona, triamcinolona, beclometazona, acetato de fludrocortisona, acetato de deoxicorticosterona (DOCA) y aldosterona. En una modalidad preferida, la hormona es dexametasona. La hormona puede ser ya sea sintética o de origen natural. Mientras que la combinación de hormona y enzima es la modalidad más preferida, alternativamente se ha encontrado que la DMSO (dimetilsulfóxido) y DEAE (dextrán) también puede ser útil. La cantidad de la enzima agregada al medio de cultivo se encuentra de preferencia, en el intervalo de 1-5 µg/ml, de preferencia alrededor de 2.5 µg/ml. La concentración de hormona en el medio de cultivo, de preferencia se encuentra en el intervalo de 10"4M- 10~dM y más preferiblemente alrededor de 10~BM. sin embargo, en el caso de dexametasona y tripsina, que se prefieren, se ha encontrado que un medio de cultivo de células adicionado con alrededor de 2.5 µg/ml tripsina y dexametasona a una concentración de alrededor de 10"5M proporciona el resultado óptimo. Por tanto, una modalidad específica de la invención proporciona un medio de recuperación de virus que incluye un medio de cultivo de células adicionado con tripsina 2.5µg/ml y dexametasona a una concentración de l?"5M. El medio de cultivo de células que puede usarse de conformidad con la invención no está limitado en forma particular. Por ejemplo, estos pueden incluir medio -199, DMEM, RPMI-1640 o MEM-EAGLE. Como se identificará fácilmente sin embargo, existe una amplia variedad de medios diferentes que pueden soportar el crecimiento de células y que están fácilmente disponibles a aquellos con conocimientos promedio. Sin embargo, conforme a una modalidad preferida el medio de cultivo celular es MEM-EAGLE. El medio de cultivo de células puede estar adicionado con aditivos que apoyan el crecimiento de células y virus y tales aditivos se conocen por aquellos expertos en el arte.
Se sabe que las líneas celulares particulares y/o los virus podrían requerir aditivos específicos para crecimiento óptimo y viabilidad. Ejemplo de aditivos incluyen L-glutamina, amino ácidos, antibióticos, suero, sales de Hanks balanceadas, azúcares tales como D-glucosa, sales inorgánicas, vitaminas, rojo de fenilo, amortiguadores tales como HEPES y agentes tensioactivos tales como Tween 80. El medio de recuperación de virus descrito antes puede usarse para identificar virus tales como el método de tubo convencional y el método del frasco vial recubierto.
Alternativamente, el medio de recuperación de virus puede usarse en el método descrito más abajo. Conforme con otra modalidad de la invención se proporciona el uso del medio de recuperación de virus descrito antes en un método para la determinación de virus. Por tanto, se proporciona un método para detectar un virus que comprende: (i) proporcionar una línea celular apropiada para inoculación de virus; (ii) pre-tratamiento apropiado de una muestra para obtener una muestra que potencialmente contiene un virus a detectarse; (iii) inocular las células con una muestra que potencialmente contiene un virus a detectarse;
(iv) incubar las células inoculadas; (v) reemplazar el medio de muestra con un medio de recuperación de virus que comprende un medio de cultivo de células adicionado con al menos una hormona y al menos una enzima; (vi) incubar la muestra a partir de (iv) ; y (vii) detector el virus. La línea celular puede seleccionarse para ser apropiada para el crecimiento y aislamiento de un virus en particular. Por ejemplo, la línea celular LLC-MK2 es apropiada para detector virus de la parainfluenza, MDCK para virus de la influenza; HEP -2 para
Virus Sincicial Respira torio (RSV) y MRC-5 para
Ci tomegalovirus (CMV) , virus Herpes simplex (HSV) ,
Enterovirus y Rinovirus. Un persona con conocimientos promedio podría seleccionar la línea celular apropiada para el aislamiento y desarrollo de un virus determinado. Como se usa en la presente, el término "una muestra que potencialmente contiene un virus a ser detectado" incluye muestras obtenidas a partir del sujeto que puede o puede no estar infectado con un virus. Por tanto, la muestra podría contener un virus detectable o podría no contener ningún virus. Las muestras apropiadas pueden obtenerse a partir de saliva, suero, orina, heces fecales, fluido cerebroespinal (CSF) , fluidos respiratorios tales como a partir de lavados bronquiales, alveolares, aspirados nasofaríngeos, e hisopos tales como aquellos para la boca, cavidad nasal, garganta, piel y genitales. La muestra puede prepararse para su uso por dilución con un medio apropiado que es compatible con la línea celular y virus. El sujeto puede ser de cualquier especie de animal que puede infectarse con un virus. Por ejemplo, el sujeto puede ser una ave, pez o mamífero. En algunas modalidades, el sujeto es un mamífero. Mamíferos apropiados incluyen animales de granja tales como ovejas, ganado vacuno, ganado porcino, venados y similares, animales de compañía tales como perros, gatos, conejos, cobayos de Guinea y los similares, animales de laboratorio tales como ratones, ratas, monos y los similares, animales en cautiverio tales como aquellos que se mantienen en zoológicos humanos. Mamíferos preferidos son humanos. En otras modalidades, el sujeto puede ser una ave, particularmente aves de granja tales como gallinas y pavos. Métodos de pre-tratamiento específicos de muestras para obtener muestras apropiadas para la detección de virus se conocen bien por los expertos en el arte pero podrían incluir, sin limitarse a sonicación y centrifugación. El medio de recuperación de virus de conformidad con la presente invención puede usarse para la recuperación de un gran número de virus diferentes que son apropiados para cultivo celular. La persona con conocimientos en la materia reconocerá que tales virus incluyen, pero no se limitan a Virus Sinci cial Respira torios, Parainfluenza 1,2,3,4 (Pl 1,2,3,4), Influenza A5B (Inf A5B) , Virus Smcicial Respira torio (RSV)5 Adenovirus (AD) 5 Rinovirus (RH)5 Citomegalovirus (CMV) y virus del grupo Enterovirus (ENT) incluyen Echovirus, Coxaquievirus, Enterovirus y Poliovirus, y también virus no-respiratorios tales como, pero sin limitarse a, virus Herpes simplex (HSV) 1, 2, virus Vari cella zoster (VZV), Rubéola, paperas, sarampión, rotavirus y poliomavirus . En el método de la invención las células inoculadas pueden incubarse con la muestra usando condiciones conocidas. Por ejemplo, las células inoculadas pueden incubarse a 37°C durante un periodo que resulta en la infección de las células con el virus, tal como 45 a 90 minutos, especialmente 60 minutos. La incubación puede lograrse en un incubador o puede desarrollarse con centrifugación. Los virus pueden detectarse usando métodos de determinación comunes en el arte tales como técnicas de inmunodeteccion tales como inmunofluorescencia, tinciones, visualizacion de CPE5 generalmente usando técnicas moleculares tales como reacción en cadena de polimerasa
(PCR) 5 transcpptasa inversa PCR (RT-PCR) y amplificación de la secuencia de ácido nucleico (NASBA) . El medio de recuperación de virus de conformidad con la invención puede usarse ventajosamente relativamente fácil en un montaje de charola de micro-titulación multi-pozos. Sin embargo, como se reconocerá fácilmente existen montajes de charola de cultivo de células diferentes, que están disponibles fácilmente al experto en el arte. Por ejemplo, las placas de microtitulación que contienen pozos múltiples en el arte. En una modalidad, usarse un montaje de charola como se describe en la Patente de Invención Australiana No. 2001100242. Alternativamente, y conforme a una modalidad preferida el montaje de charola de microtitulación incluye, primeras, segundas y terceras unidades de charola cada una con una pluralidad de receptáculos; y una pluralidad de pozos para muestras que son complementarios con los receptáculos, cada uno de esos pozos es individual y separadamente retenible dentro y removible desde un receptáculo respectivo de la pluralidad de receptáculos; en donde cada uno de las segundas y terceras unidades de charola se adapta en acoplamiento liberable la primera unidad de charola permite que el montaje de una charola de microtítulo que consiste de la primera y segunda unidad de charola y/o la tercera unidad de charola. Cada una de la primera, segunda y tercera unidades de charola pueda tomar cualquier forma apropiada, aunque se apreciará que generalmente se prefieren unidades de charola rectangulares generalmente, a efecto de proporcionar varios arreglos de receptáculos para recibir los pozos de muestra con solución a analizarse, en una modalidad preferida las primeras unidades de charola incluyen un arreglo 48 receptáculos en una matriz de 6 x 8 , la segunda unidad de charola incluye un arreglo de 48 receptáculos en una matriz de 6 x 8 y la tercera unidad de charola incluye un arreglo de 16 receptáculos en una matriz de 2 x 8. Por tanto, puede formarse una charola de microtítulo doble de 6 x 8 (i.e. 12 x 8) usando la primera unidad de charola y la segunda unidad de charola, una charola de microtítulo de 8 x 8 puede formarse usando la primera unidad de charola y la tercera unidad de charola y puede formarse una charola de microtítulo de 14 x 8 usando las tres unidades de charola. Se apreciará que unidades de charola interpuestas adicionales pueden incluirse para extender el número de receptáculos o pozos deseados. El acoplamiento de la segunda y tercera charolas a la primera unidad de charola puede lograrse por cualquier medio apropiado. Por ejemplo, esto puede incluir un acoplamiento de broche de chasquido o similares. Conforme con una modalidad preferida, la segunda y tercera unidades de charola, cuando se acoplan con la primera unidad de charola, abunda con lados opuestos de la primera unidad de charola. De preferencia, la segunda y tercera unidades de charola incluye brazos periféricos que se acoplan liberablemente con manguitos complementarios en cualquier lado de la primera charola. En una modalidad preferida, cada uno de los pozos está retenido elásticamente en un receptáculo. Por ejemplo, cada uno de los pozos puede ser retenible elásticamente dentro de un receptáculo respectivo en virtud de un acoplamiento de fricción. Es decir, cada pozo puede ahusarse de forma tal que la base del pozo se inserte dentro de un receptáculo respectivo, pero debido al incremento en el diámetro del pozo, la pared es alojada dentro de su receptáculo respectivo. Otras alternativas se determinarán fácilmente por un experto en el arte. Por ejemplo, cada uno de los pozos puede incluir al menos una cresta en una superficie externa del mismo que acopla una pared interna o paredes internas del receptáculo respectivo de la primera, segunda y/o tercera unidades de charola causando el acoplamiento por fricción. De preferencia, al menos una de las unidades de charola se proporciona con medios de identificación para identificar pozos con muestra en los receptáculos. En particular, los medios de identificación pueden incluir una rejilla o una matriz de referencia en donde cada fila de la pluralidad de receptáculos incluye un código de letra y en cada columna de la pluralidad de receptáculos se proporciona con un código numérico correspondiente. Cada una de las primeras, segundas y terceras unidades de charola o cualquier combinación de las mismas puede proporcionarse con una cubierta complementaria, de preferencia adaptada para proporcionar cada uno de los pozos de muestra con cubiertas individuales. En particular, la cubierta incluye de preferencia, una pluralidad de crestas circulares cada uno de los cuales, cuando la cubierta se coloca en la unidad o unidades de charola respectiva, engloba el orificio de un pozo de muestra respectivo para englobar sustancialmente una muestra mantenida en el pozo. En otra modalidad, los pozos de muestra no están ni individual ni separadamente retenidos, sino más bien retenidos como una unidad de pozos de muestra. Las unidades de pozos de muestra son preferiblemente solamente pequeñas, incluyendo hasta cuatro pozos de muestra. Por tanto, el montaje de charola de micro título incluye, de preferencia primeras, segundas y terceras unidades de charola que tienen una pluralidad de receptáculos; y una pluralidad de unidades de pozos de muestra, en donde cada una de las unidades de pozos de muestra incluye hasta 4 pozos de muestra cada uno que es complementario con un receptáculo respectivo, y en donde cada una de las unidades de de pozo de muestra es, como una unidad, retenible dentro de un gran número de receptáculos de la pluralidad de receptáculos correspondientes con el número de pozos de muestra de la unidad de pozos de muestra; en donde cada una de las unidades de segunda y tercera charola se adapta para acoplar reparablemente la primera unidad de charola permitiendo el montaje de una charola de micro-título que consiste de la primera unidad de charola y la segunda unidad de charola y/o la tercera unidad de charola. Conforme con esta modalidad, las unidades de pozo de muestras incluyen hasta cuatro pozos de muestra que pueden configurarse dependiendo de de diagnóstico en particular que se lleve a cabo. Por ejemplo, puede ser deseable presentar una muestra por duplicado de forma tal de duplicar las pruebas a realizarse. En ciertas modalidades las unidades de charola están configuradas de forma tal que el número de receptáculos en cada línea o en cada columna del montaje corresponda con el número de pozos de muestra en cada unidad de pozos de muestra. Las unidades de pozos de muestra pueden fabricarse como se desea. A ese respecto, los pozos de muestra de cada una de las unidades de pozos de muestra puede estar formada integralmente o puede fijarse desprendiblemente de cada una de las otras para formar pozos de muestra individuales. En estas últimas dos opciones, debe entenderse que la conexión de pozos de muestra individual puede lograrse usando cualesquier medio disponible para conectar artículos de plástico, pequeños que se conectan unos a otros liberablemente. Aún conforme a otros aspecto de la presente invención se proporciona un estuche diagnóstico viral que comprende el medio de recuperación de virus de la invención, un montaje de charola de micro-título como se describe anteriormente, y opcionalmente fórceps adaptados para facilitar la remoción de los pozos de muestra o unidades de pozos de muestra a partir de la placa de micro-título. Los fórceps pueden tomar cualquier forma apropiada a condición de que aseguren la sujeción de los pozos de muestra o se facilitan unas unidades de pozo de muestra que incluyen hasta cuatro pozos de muestra. En una modalidad preferida los fórceps especialmente adaptados para este propósito incluyendo una primera porción a insertarse en el pozo y una segunda porción que coopera con la primera porción y sujeta la superficie exterior de la pared. La primera porción es de preferencia circular en sección transversal y de un tamaño para proporcionar una holgura mínima desde la pared interior del pozo cuando se inserta en el pozo. El montaje antes descrito y el medio de recuperación de virus puede proporcionar ventajas específicas sobre los métodos conocidos y los montajes actualmente disponibles. En particular, los montajes y la solución puede facilitar una sensibilidad mejorada (mayor), usando cinco o más líneas celulares altamente específicas para la misma muestra. También se dispone de una magnificación por centrifugación. A este respecto, las fuerzas de la centrifugación incrementan la absorción viral y acortan así e tiempo el tiempo para determinación viral, en algunos casos hasta por hasta 10 veces. Además, entre 8-16 muestras pueden inocularse en una de las placas resultantes en más muestras manejadas por un mismo operador. Aún más, se proporciona una mayor flexibilidad al diseñar los montajes de las primeras, segundas y terceras unidades de charola. Puede proporcionarse una objetividad incrementada por métodos que emplean los montajes y solución usando una técnica de determinación rápida por medio de fluorescencia o marcado enzimático y produciendo resultados confirmados que están disponibles (para el 80% de los virus comunes) dentro de 1-2 días. A este respecto, los montajes son versátiles en que pueden permitirse hasta 14 líneas de células diferentes permitiendo así la determinación de una gran gama de virus a detectarse usando una combinación de diferentes anticuerpos monoclonales. El CPE también puede ser monitoreado. Además, dado que una muestra puede inocularse en diferentes líneas celulares pueden usarse distintos anticuerpos monoclonales en las diferentes líneas celulares y dentro de un tiempo diferente. En caso de un error hay pozos separados con muestra inoculada todavía disponibles para permitir pruebas adicionales. Los métodos que incorporan el uso de los montajes y soluciones pueden proporcionar beneficios por ahorro en tiempo facilitando que haya resultados en 1-3 días. Tales métodos representan un gran ahorro en la mano de obra. Los montajes también permiten pruebas eficientes con respecto a los costos como por ejemplo, solamente se requiere una pequeña cantidad de anticuerpos monoclonales para una prueba
(20 µl en comparación con 60-80 µl de anticuerpos monoclonales requerida para una prueba usando el método del). Cuando está en uso, la placa se siembra con una pluralidad de líneas celulares. La elección de líneas celulares usadas para la determinación depende del tipo de muestra y de la presencia de los virus esperados. Por ejemplo sin limitar la invención a una línea de células en particular puede usarse la línea de células LLC-MK2 para determinar los virus de Parainfluenza; la MDCK para virus Infl uenzae; la HEP -2 para RSV y la línea de células MRC-5 para el aislamiento CMV, HSV, Enterovirus y Rinovirus. Seguido de la siembra, cada muestra es entonces inoculada sobre una hilera diferente de la placa.
Por ejemplo, si la placa es de 8 x 12, ocho muestras diferentes pueden inocularse en 12 pozos de cualquier hilera en hasta 12 líneas de células diferentes. Esta ventaja facilita la determinación de al menos doce virus. Se reconocerá sin embargo que esta configuración de placa de 96 pozos puede cambiarse de conformidad con los requisitos de diagnóstico específicos. Estos simplemente requiere una modificación apropiada a la selección de la línea de células para mantener la especificidad hacia los virus detectados. La presente invención se describe además por las siguientes Figuras y/o Ejemplos. Ahora se hará referencia a los dibujos que se acompañan que ilustran modalidades de charolas útiles con el medio de recuperación de virus en el estuche de un aspecto de la invención en el cual: La Figura 1 ilustra las primera, segunda y tercera unidades de charola en forma desensamblada; La Figura 2 ilustra las primer, segunda y tercera unidades de charola en una forma desensamblada; La Figura 3 ilustra las primera, segunda y tercer unidades de charola en forma semimontada; La Figura 4 ilustra la primera y tercera unidades de charola en una forma montada; La Figura 5 ilustra una pluralidad de pozos de muestra; y La Figura 6 ilustra una configuración típica de pozo para una matriz de 12 x 8. Refiriéndose a la Figura 1, se proporciona un montaje de charola 10 que incluye una primera unidad de charola 11, una segunda unidad de charola 12 y una tercer unidad de charola 13. Cada una de las unidades de charola 11, 12 y 13 incluye una pluralidad de receptáculos 14 que están adaptados para recibir pozos de muestra individuales (ver la Figura 5) o unidades pozo de muestra que están formadas de hasta cuatro de los pozos de muestra individual. La primera unidad de charola 11 incluye manguitos 15 a lo largo de sus orilla exterior. Los manguitos 15 se han adaptado para recibir brazos periféricos 16 de la segunda unidad de charola en un lado y brazos periféricos 17 de la tercera unidad de charola en un lado opuesto. Como tal, la segunda y tercera unidades 12, 13 puede acoplarse separablemente con la primera unidad de charola 11 como se ilustra mejor en la Figura 2 deslizando los brazos periféricos 16, 17 dentro de los manguitos 15 de la primera unidad de charola 11. El acoplamiento de la primera y segunda unidades de charola está particularmente bien ilustrado en la Figura 3. Refiriéndose a la Figura 5, cada pozo de muestra 50 incluye ventajosamente un cuerpo ahusado 51, una base 52 y un reborde anular 53 que definen un orificio al pozo 50. Con esta configuración, cada pozo puede ser retenido flexiblemente dentro de un receptáculo respectivo de la primera, segunda o tercera unidad de charola y eliminado según se desee. La Figura 6 ejemplifica un ejemplo de un configuración de placa de 12 x 8 pozos, típica (i.e. 2 x 6 x 8) que incluye un listado de virus a ser detectados, líneas celulares relevantes y días de remoción para cada línea Como se observa a partir de la Figura 6, la placa puede sembrarse con diferentes líneas celulares en el siguiente orden: Columnas 1-3 LLC-MK2; Columnas 4,5 MDCK Columna 6 Hep2 Columna 7 A549 Columna 8 RK1 3 Columnas 9-12 MRC-5. Una placa diseñada en esta forma permitiría por ejemplo la selección de, sin limitarse a, los virus respiratorios de la Parainfluenza 1,2,3,4 (Pl 1,2,3,4), Influenza A, B (Inf A,B) RSV, Adenovirus (AD) , Rinovirus (RH) , Ci tomegalovirus (CMV) , y virus del grupo Enterovirus (ENT) que consisten de Echovirus (Eco), Coxsackievirus (cox), Enterovirus (Ent) y Poliovirus (Polio) , así como pero sin limitarse a los virus Herpes simplex no-respiratorios (HSV) 1,2 y virus Varicela zoster (VZV) . En un ejemplo adicional, la configuración de una placa de 6 x 8 pozos puede consistir de líneas de células en el siguiente orden: Columns 1-3 A 549 Columns 4-6 MRC-5 Este permitiría por ejemplo la detección de virus tales como CMV, HSV 1,2, VZV, AD y aquellos del grupo Enterovirus. Finalmente una configuración de 14x8 pozos permitirá la detección de patógenos como Pl 1,2,3,4; Inf A,B; RSV; AD; RH; ENT (Echo, cox, Ent, Polio); HSV 1,2; VZV; Rubéola; Paperas; sarampión; Rotavirus; Poliomavirus y también otros virus patógenos usando líneas de células apropiadas. La remoción de líneas de células, debido a la naturaleza de los pozos puede ser selectivos dependiendo del tiempo de agenda que es apropiado para la determinación viral específica en cuestión. En particular, si se desea la determinación de Pl 1-4, hablando de la hilera A por ejemplo, se eliminan los pozos A 1 a A 3 el día dos. Análogamente, si se desea la determinación de Inf A, B, se eliminan los pozos A 4 y A 5 el día dos. Sin embargo, si se requiere la determinación de Entero, entonces se elimina el pozo A 11 el día más apropiado (1-3). La naturaleza específica de los pozos individuales facilita la remoción selectiva de los pozos individuales y la detección viral. Ahora se hará referencia a un procedimiento en particular que puede seguirse usando un estuche de un aspecto de la invención, muchas etapas del cual son opcionales y no deben considerarse de ninguna manera limitativas de la invención. Usando pipetas Pasteur de vidrio estériles, se aspira el medio a partir de pozos a inocularse. Se facilita enormemente desechar las pipetas Pasteur en un recipiente de gran volumen . Usando un pipeta desechable, se inocula un número apropiado de pozos de la placa de pozos con aproximadamente 150-200 µl de muestra por pozo. La muestra restante se guarda a -70°C. Entonces se reemplaza el reborde en la placa y se escribe la fecha sobre las paredes en la placa. Después, se pesa la placa en una pesa digital y se equilibra con placas y tarjetas hasta que todas las placas tienen un peso equivalente (+/- 0.5g) y pueden equilibrarse en una centrifuga. La centrifuga se acciona a alrededor de 37°C y 3500 rpm durante un periodo de 60 min. Usando vacío y pipetas Pasteur cada muestra se aspira a partir de cada pozo y usando una pipeta desechable nueva para cada muestra, se rellena cada pozo con el medio de recuperación de virus de la invención . Entonces, se incuban las muestras en ambiente humidificado a 37°C en un incubador con C02 (5%) colocando las placas cuidadosamente en el incubador a C02 e incubando a 37 °C durante hasta siete días después de la inoculación de la última muestra. Se usa la tinción por inmunofluorescencia para determinar virus específicos en pozos únicos, usando anticuerpos monoclonales. Generalmente, apegándose al siguiente procedimiento: se usa succión al vacío, se elimina el medio del (los) pozo(s) apropiado (s) y los pozos eliminados de la placa usando fórceps especiales y transferidos a un apoyo diferente. Entonces, se secan con aire durante 5 minutos. Se agregan 300 µl de acetona fría a cada pozo y se deja fijar durante 15 minutos a -20°C. entonces se elimina el fijador y la muestra se seca de nuevo durante 2-3 minutos. Se agrega un anticuerpo monoclonal específico (primario) a cada pozo y se coloca en su lugar la cubierta de la placa y las muestras se incuban durante 30 minutos a 37°C. Entonces, las muestras se sacan del incubador y se rellena cada pozo con PBS. Entonces se elimina el PBS. Este proceso se repite cuatro veces más. De nuevo, la muestra se seca con aire durante 5 minutos, después de los cuales se agrega un anticuerpo secundario a cada pozo. Seguido lo anterior, se repite la incubación de la muestra con tratamientos repetidos de con PBS como se mencionó anteriormente y se hace un último lavado con agua bidestilada. Entonces se agrega una pequeña cantidad (una gota) de un medio de montaje preparado especialmente y se observan los resultados bajo microscopía fluorescente. Mediante esta y las reivindicaciones que siguen, a menos que se indique en contrario, las palabra "comprende" y variaciones como "que comprenden" y "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un entero o grupo de enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros o etapas. Los expertos en el arte apreciaran que la invención descrita en la presente es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de aquellas descritas específicamente. Se entenderá que la invención incluye todas las variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, modalidades, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta descripción, de manera individual o colectiva y en cualquier combinación de dos o más etapas o modalidades.