MX2007005435A - Biomarcador para insuficiencia cardiaca. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere, en general, a la insuficiencia cardiaca y, en particular, a un metodo para evaluar a pacientes con insuficiencia cardiaca al supervisar los niveles de la cinasa de receptores ??-adrenergicos (??-ARK1) en linfocitos de estos pacientes.

Description

BIOMARCADOR PARA INSUFICIENCIA CARDIACA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere, en general, a la insuficiencia cardiaca y, en particular, a un método para evaluar a pacientes con insuficiencia cardíaca al supervisar los niveles de cinasa de receptores ß-adrenérgicos (ßARKl o GRK2) en los linfocitos de estos pacientes .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los receptores ß-adrenérgicos (ßARs) median directamente el control del sistema nervioso simpático de la inotropía y cronotropía cardíaca. El miocito cardíaco adulto expresa principalmente los ßi- y ß2- Rs, siendo el ßi-Ar el subtipo más abundante (>75%) (Brodde, Basic Res Cardiol . 91:35-40 (1996)) . Después de la unión a agonistas, estos subtipos se acoplan principalmente a la proteína G, Gs, conduciendo a la activación de la adenilil-ciclasa y la producción aumentada del segundo mensajero cAMP en el miocito cardíaco (Stiles y colaboradores, Cardiac adrenergic receptors. Annu Rev Med. 35:149-64 (1984)). En la insuficiencia cardíaca humana crónica (HF, por sus siglas en inglés) , el deterioro de la función ventricular está asociado con alteraciones de la señalización de ßAR cardíacos, inclusive tanto una reducción de la densidad de ßi-AR como el desacoplamiento funcional de los ßARs restantes (Roc an y colaboradores, Nature 415:206-12 (2002)). Este último fenómeno es conocido como desensibilización y es desencadenado por la fosforilación de los ßARs ocupados por agonistas mediante las cinasas de receptores acoplados a la proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) (GRKs, por sus siglas en inglés) (Rockraan y colaboradores, Nature 415:206-12 (2002)). Los ßx- y ß2-ARs pueden ser fosforilados ambos por las GRKs y en el corazón, la GRK prominente parece ser la GRK2, también conocida como la cinasa de ßAR (ßARKl) (Lefkowitz, Cell . 74:409-12 (1993) ) . La ßARKl (o GRK2) es una enzima citosólica que localiza a la membrana a través de la unión a las subunidades Gß? de las proteínas G heterotriméricas activadas (Rockman y colaboradores, Nature 415:206-12 (2002), Lefkowitz, Cell . 74:409-12 (1993), Pierce y colaboradores, Nat Rev Mol Cell Biol . 3:639-50 (2002)). Juega un papel importante en el control de la señalización y función de los ßAR cardíacos como se demuestra en ratones transgénicos con sobreexpresión miocardíaca de la cinasa (Koch y colaboradores, Science 268:1350-3 (1995)). En estos ratones, la producción de cAMP y la contractilidad cardíaca en respuesta a la estimulación de ßAR se redujo significativamente cuando la ßARKl se incrementó de 3-4 veces (Koch y colaboradores, Science 268:1350-3 (1995)). Además, los estudios en ratones donde la actividad o expresión de ßARKl se redujeron en el corazón mostraron un incremento en la señalización y función cardíaca de ßAR (Koch y colaboradores, Science 268:1350-3 (1995), Rockman y colaboradores, J Biol . Chem. 273:18180-4 (1998)). Estos estudios fueron los primeros en demostrar, in vivo, la dependencia crítica de los niveles de ßARKl sobre la señalización de ßAR cardíacos. Los niveles de ßARKl en el miocardio parecen ser regulados activamente, puesto que en la HF humana así como también en modelos animales, existe una elevación característica de la expresión y actividad miocardíaca de la ßARKl (üngerer y colaboradores, Circulation 87:454-63 (1993), üngerer y colaboradores, Circ. Res. 74:206-13 (1994), Maurice y colaboradores, Am . J. Physiol . 276:H1853-60 (1999), Anderson y colaboradores, Hypertension . 33:402-7 (1999), Rockman y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . EUA. 95:7000-5 (1998), Ping y colaboradores, Am J Physiol . 273:H707-17 (1997), Harris y colaboradores, Basic Res Cardiol . 96:364-8 (2001)). Este incremento en la ßARKl (de 2 a 3 veces) parece ser responsable de la desensibilización aumentada hacía ßAR observada en el miocardio comprometido (Rockman y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . EUA. 95:7000-5 (1998), Ping y colaboradores, Am J Physiol . 273:H707-17 (1997), Harris y colaboradores, Basic Res Cardiol . 96:364-8 (2001), White y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . EUA . 97:5428-33 (2000)). La ßARKl parece ser la molécula reguladora principal de ßAR que está alterada en la HF humana ya que las ß-arrestinas y GRK3 no están alteradas en los corazones humanos deficientes (Ungerer y colaboradores, Circulation 87:454-63 (1993), Ungerer y colaboradores, Circ. Res . 74:206-13 (1994)). La GRK5 , otra GRK principal en el miocardio, no ha sido estudiada en la HF humana aunque se ha mostrado que es sobrerregulada en algunos modelos animales (Ping y colaboradores, Am J Physiol . 273:H707-17 (1997), Vinge y colaboradores, Am. J. Physiol . 281:H2490-9 (2001) ) . La relevancia de las anormalidades moleculares de la señalización de ßAR con respecto a la patogénesis de la HF humana, y quizás de manera más importante con respecto a la consecuencia de la HF, no se entiende completamente. Un aspecto importante de la señalización de ßAR es que las propiedades del sistema en los glóbulos blancos circulantes parecen simular aquellas observadas en tejidos sólidos. Esto se observó primero en el corazón en 1986 (Brodde y colaboradores, Science 231:1584-5 (1986)) y muchos otros reportes también han utilizado el sistema de linfocitos para estudiar la señalización de ßAR y para hacer extrapolaciones al sistema de ßAR cardíacos (Bristow y colaboradores, Clin . Investig. 70:S105-13 (1992), Jones y colaboradores, J. Cardiovasc. Pharmacol . 8:562-6 (1986), Sun y colaboradores, Crit . Care Med. 24:1654-9 (1996), Dzimiri y colaboradores, Clin Exp Pharmacol Physiol . 23:498-502 (1996)). Muchos datos se han acumulado recientemente en modelos experimentales que sugieren que la expresión y actividad incrementadas de ßARKl en el miocardio deficiente pueden contribuir a la patogénesis de la HF (Rockman y colaboradores, Nature 415:206-12 (2002)). La presente invención resulta, al menos en parte, de estudios diseñados para investigar el valor de la señalización de ßAR cardíacos y la actividad de ßARKl en la evolución y la gravedad de la HF humana. Estos estudios han demostrado que los niveles sanguíneos y cardíacos (aurícula derecha) de ßARKl se correlacionan en una forma directa. La invención proporciona de esta manera un método para evaluar la gravedad de la HF al supervisar el contenido y la actividad de ßARKl en los linfocitos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para evaluar el estado de pacientes con HF al supervisar los niveles de ßARKl en los linfocitos de estos pacientes. Los niveles elevados de ßARKl en los linfocitos se correlacionan con niveles cardíacos elevados de ßARKl y están asociados con un pronóstico desfavorable. Los objetivos y las ventajas de la presente invención serán claros a partir de la descripción que sigue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figuras 1A-1C. (Figura. ÍA) Una gráfica que muestra la correlación directa entre la actividad de GRK soluble medida por medio de la fosforilación in vitro de rodopsina y la expresión de ßARKl detectada por medio de la inmunotransferencia de proteínas. (Figura IB) Una gráfica que muestra una correlación inversa entre la actividad de la GRK soluble y la estimulación con isoproterenol (ISO) de la actividad de adenilil-ciclasa en membranas cardíacas de biopsias de LV de corazones humanos, deficientes, explantados. La actividad de adenilil-ciclasa se coloca en un diagrama por el % de respuesta al ISO sobre la estimulación basal (n=24, p<0.05). (Figura 1C) Utilizando un planteamiento similar en los mismos ejemplos, se observó una correlación directa entre la densidad de ßAR y la señalización de ßAR (actividad de adenilil-ciclasa estimulada con ISO sobre la estimulación basal, n=24, p<0.0001) .

Figuras 2A y 2B. (Figura 2A) Una gráfica que muestra la correlación directa entre la expresión de ßARKl en el corazón (biopsias de aurícula derecha) y en los linfocitos de pacientes con HF. La expresión de ßARKl se evaluó por medio de la inmunotransferencia de proteínas y los datos se expresan como unidades arbitrarias de densitometría. (Figura 2B) . Un autorradiograma representativo de una inmunotransferencia de proteínas que muestra la expresión de ßARKl en extractos de linfocitos y en extractos de apéndices de aurícula derecha de los mismos conjuntos de pacientes humanos con HF (#37 y #53) con diferentes grados de disfunción ventricular. Figuras 3A-3C. (Figura 3A) Una gráfica que muestra la relación inversa entre la actividad de GRK soluble y la función cardíaca (% de fracción de expulsión (EF, por sus siglas en inglés) de LV) evaluada en pacientes con HF (n=55, p<0.02). (Figura 3B) Utilizando un corte de 45% de la LVEF, los 55 pacientes con HF se dividieron en dos grupos . Aquellos que mostraban una función cardíaca reducida también tuvieron una actividad más alta de GRK soluble en los linfocitos. *, p<0.05 (prueba t de Student No Apareada) . (Figura 3C) Cuando los pacientes se ordenaron en niveles de acuerdo con su clase de HF de NYHA, hubo un incremento significativo y progresivo en la actividad de GRK soluble en los linfocitos.

Figuras 4A y 4B. Las muestras apareadas de LVs humanos deficientes se obtuvieron al momento del implante del LVAD y el transplante cardíaco subsecuente y la proteína (Figura 4A) y el ARNm (Figura 4B) de ßARKl se midieron (n=12) . (Figura 4A) Los resultados (promedio±SEM) de la inmunotransferencia de ßARKl en muestras previas (núcleo) y posteriores (LV) al LVAD con una inmunotransferencia Western representativa mostrada. (+) el control es ßARKl purificada. *, valores P<0.005 contra previo al LVAD. (Figura 4B) PCR con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real de las mismas muestras (n=12) utilizando la metodología de fluorescencia verde SYBRMR. *, valores P<0.05 contra previo al LVAD (prueba t de Student Apareada) . Figuras 5A y 5B. (Figura 5A) Actividad cardíaca de GRK soluble (promedio±SEM) encontrada en muestras cardíacas previas y posteriores al LVAD (n=4 pares) . Los lisados cardíacos solubles se purificaron como se describiera y se incubaron con [32P-ATP] y membranas purificadas de segmentos exteriores de bastoncillos enriquecidas con la rodopsina GPCR (Rho) (Choi y colaboradores, J. Biol. Chem. 272:17223-17229 (1997), Iaccarino y colaboradores, Circulation 98: 1783-1789 (1998) ) . Mostrada en la inserción se encuentra un autorradiograma de la incorporación de fósforo en Rho después de la electroforesis en gel. *, valores P<0.05 contra previo al LVAD (prueba t) . (Figura 5B) Actividad AC de membrana en lisados cardíacos de muestras de LV previas y posteriores al LVAD apareadas (n=4) . Los datos mostrados son el promedio+SEM del % de estimulación con ISO sobre la actividad basal mostrando un incremento significativo en la sensibilidad hacia ßAR. P<0.05 contra previo al LVAD. Figuras 6A y 6B . (Figura 6A) Niveles de proteínas de ßARKl en los linfocitos en una muestra de sangre obtenida de dos pacientes antes del implante del LVAD (Previo) y después de la explantación (Posterior) . Los datos promedio de la inmunotransferencia Western anterior se muestran en el histograma. La ßARKl purificada es el control (+) . (Figura 6B) Los niveles cardíacos de proteína de GRK5 en muestras apareadas previas (núcleo) y posteriores (LV) al LVAD. Los datos son el promedio+SEM de n=15 pares de muestras en unidades de densitometría relativas de las inmunotransferencias Western exploradas. Una inmunotransferencia representativa se muestra en la inserción con la GRK5 purificada como el control (+) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para evaluar a pacientes con HF al medir los niveles de ßARKl en los linfocitos. La presente invención resulta de estudios que demuestran que los niveles sanguíneos y cardíacos de ßARKl y la actividad de GRK se correlacionan en forma directa. De esta manera, el contenido de ßARKl en los linfocitos puede servir como un medio fácilmente accesible para supervisar los niveles cardíacos de ßARKl y para proporcionar una indicación de la señalización de ßAR en el miocardio y la gravedad de la HF . Los niveles y/o la actividad de ßARKl pueden supervisarse para evaluar el progreso de la terapia en la HF, un nivel elevado de ßARKl está asociado con la pérdida de la sensibilidad a ßAR y un pronóstico desfavorable de un paciente con HF . De acuerdo con la presente invención, los linfocitos pueden recolectarse de pacientes y someterse a ensayo para los niveles de proteínas de ßARKl, actividad de GRK y/o contenido de ARNm de ßARKl . Más específicamente, la sangre del paciente puede recolectarse y puede evitarse su coagulación utilizando, por ejemplo EDTA. Los linfocitos pueden aislarse p.or medio del gradiente de Ficoll (Chuang y colaboradores, J. Biol. Chem. 267:6886-6892 (1992)), u otros medios convenientes. Los linfocitos entonces pueden procesarse adicionalmente o pueden almacenarse congelados (por ejemplo, a -80°C) . Los niveles de proteína de ßARKl pueden determinarse utilizando cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo, los linfocitos pueden procesarse y usarse utilizando amortiguadores que contienen detergente (Iaccarino y colaboradores, Circulation 98:1783-1789 (1998) ) y los niveles de proteína de ßARKl en extractos citosólicos pueden detectarse por medio de una técnica de ensayo ELISA (Oppermann y colaboradores, J. Biol. Chem. 274:8875-8885 (1999)) o por medio de la inmunotransferencia Western utilizando anticuerpos específicos para ßARKl (monoclonales o policlonales) . Los ejemplos de anticuerpos adecuados incluyen los anticuerpos policlonales (C-20) de Santa Cruz Biotechnology (número de catalogo SC-561) y anticuerpos monoclonales producidos contra, por ejemplo, un epítopo dentro de la terminal carboxilo de ßARKl (Oppermann y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci. EUA 93:7649 (1996)). Estos anticuerpos son comercialmente disponibles, por ejemplo, a través de Upstate (por ejemplo, clon C5/1, número de catalogo 05-465) . La cuantificación de la ßARKl inmunorreactiva puede efectuarse al explorar la película autorradiográfica resultante utilizando, por ejemplo, el programa ImageQuantMR. Alternativamente, la visualización de ßARKl puede efectuarse utilizando la quimioluminiscencia mejorada estándar (Iaccarino y colaboradores, Circulation 98:1783-1789 (1998)), los equipos para la misma son comercialmente disponibles. Otros planteamientos para determinar los niveles de proteína de ßARKl incluyen un método de ensayo ELISA y la inmunofluorescencia (Oppermann y colaboradores, J. Biol. Chem. 274:8875-8885 (1999)). Mientras que anteriormente se hace referencia al uso de linfocitos, los niveles de ßARKl pueden medirse potencialmente utilizando suero. Además de los niveles de proteína de ßARKl, la actividad de GRK citosólica también puede someterse a ensayo en los extractos de células (Iaccarino y colaboradores, Circulation 98:1783-1789 (1998)). Mientras que se puede utilizar cualquier medio conveniente, los medios preferidos son ensayos basados en la fosforilación dependiente de la luz de la membrana de segmentos exteriores de bastoncillos enriquecida con rodopsina utilizando [?-32P] -ATP (Iaccarino y colaboradores, Circulation 98:1783-1789 (1998), Iaccarino y colaboradores, Hypertension 33:396-401 (1999), Iaccarino y colaboradores, J. Amer. Coll. Cardiol. 38:55-60 (2001), Choi y colaboradores, J. Biol. Chem. 272:17223-17229 (1997)). La actividad de GRK soluble representa principalmente la actividad de ßARKl . (Véase también De Blasi y colaboradores, J. Clin. Invest. 95:203-210 (1995)). Además de la rodopsina, la actividad de la GRK2 puede someterse a ensayo utilizando substratos de péptidos adecuados (Pitcher y colaboradores, J. Biol. Chem. 271:24907-24913 (1996)). Como se indicara anteriormente, el presente método también puede basarse en la determinación de los niveles de ARNm de ßARKl en los linfocitos. El ARNm de ßARKl puede determinarse utilizando cualquiera de una variedad de planteamientos, inclusive el análisis de inmunotransferencia Northern (véase, por ejemplo, De Blasi y colaboradores, J. Clin. Invest. 95:203-210 (1995)) o la PCR con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real utilizando la metodología de fluorescencia verde SYBRMR (Most y colaboradores, J. Clin. Invest. in press (Diciembre de 2004) ) . Se apreciará a partir de una lectura de lo anterior que el presente planteamiento puede utilizarse en la etapa de selección inicial de pacientes, donde los niveles de proteína, ARNm y/o actividad de ßARKl presentes en los linfocitos de un paciente se comparan con los niveles de un control (sin enfermedad) . Los datos disponibles indican que los niveles normales (control) de la proteína de ßARKl son aproximadamente 100 ng/ml de sangre entera. Los incrementos de aproximadamente 50% o más sobre los niveles de control pueden considerarse "altos". En la práctica, los niveles de ßARKl pueden correlacionarse con la función cardíaca de línea base del paciente. El presente método también se puede utilizar para seguir la pista del estado del paciente (por ejemplo, después de una intervención terapéutica) al comparar los niveles de proteína, ARNm y/o actividad de ßARKl en los linfocitos en diferentes puntos en el tiempo después del inicio de varios regímenes (por ejemplo, regímenes de fármacos) . La invención proporciona de esta manera un método para supervisar los efectos de una terapia (por ejemplo, el uso de inhibidores de ACE, antagonistas de ATI y ß-bloqueadores) y procedimientos (inclusive el bloqueo de ßAR) sobre la señalización de ßAR. Cuando surge la oportunidad (tal como durante la cirugía cardíaca) se pueden tomar muestras de tejido de miocardio para asegurar la correlación entre los niveles de ßARKl en la sangre y en los tejidos. Los datos presentados en los ejemplos que siguen demuestran una relevancia crítica de la ßARKl en el establecimiento de una disfunción de ßAR en el corazón humano. Específicamente, los datos indican que la medición de la ßARKl en muestras de sangre puede utilizarse para supervisar los niveles de expresión relativos de esta GRK en el miocardio. Además, el contenido y la actividad de ßARKl en los linfocitos en pacientes humanos con HF parecen seguir la pista de la gravedad de la enfermedad y de esta manera se utilizan como pronóstico. Ciertos aspectos de la invención pueden describirse con mayor detalle en los ejemplos no limitantes que siguen.

EJEMPLO 1 DETALLES EXPERIMENTALES Población de Estudio Se estudiaron tres grupos de pacientes . El primer grupo consistió de 24 pacientes que se sometieron a transplante cardíaco debido a un grave deterioro funcional y presentaron las características clínicas indicadas en la Tabla 1 (Grupo 1) . Un segundo grupo incluyó 55 pacientes que se admitieron en la unidad de cuidados intensivos con un grado variante de disfunción cardíaca (Grupo 3) . Entre este grupo, 10 pacientes se sometieron a cirugía cardíaca optativa (Tabla 1, Grupo 2) . Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con los lineamientos Institucionales .

Tabla 1: Características Clínicas de Pacientes Analizados en este Estudio.

Muestras de Miocardio El seguimiento de la cardioplejía por amortiguador-sangre, especímenes de tejido del ventrículo izquierdo (LV, por sus siglas en inglés) transmural (8 2 gramos de peso en húmedo) de corazones deficientes se obtuvieron durante el transplante cardíaco de 24 pacientes con HF debido a cardiomiopatía isquémica o dilatada. Los apéndices de la aurícula derecha (« 200 mg de peso en húmedo) también se obtuvieron de pacientes del Grupo 2 que se sometieron a la cirugía cardíaca (injerto de desviación o reemplazo valvular aortocoronario) . Inmediatamente después de la remoción, todos los especímenes se colocaron en solución salina helada, se enjuagaron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.

Muestras de Linfocitos Periféricos La sangre se recolectó y no se permitió su coagulación con EDTA. En los pacientes del Grupo 2, la sangre se recolectó el día antes de la cirugía. Los linfocitos se aislaron por medio del gradiente de Ficoll utilizando HISTOPAQUE-1077MR (Sigma) , se congelaron y se almacenaron a -80°C hasta el día del ensayo (Bristow y colaboradores, Clin . Investig. 70:S105-13 (1992), Sun y colaboradores, Crit . Care Med. 24:1654-9 (1996)).

Ensayos de Densidad de ßAR y Actividad de Adenilil-ciclasa de Membrana Las membranas de miocardio crudas se prepararon a partir de biopsias o linfocitos de miocardio como se describiera previamente (Iaccarino y colaboradores, Circulation . 98:1783-9 (1998), Iaccarino y colaboradores, Hypertension . 33:396-401 (1999)). La densidad de ßAR se determinó por medio de la unión de radioligandos con el ligando de ßAR no selectivo [125I]-CYP y la actividad de adenilil-ciclasa de membrana y cAMP, bajo condiciones básales y en presencia de ya sea 100 µmol/L de isoproterenol (ISO) o 10 mmol/L de NaF y cAMP, se cuantificó utilizando métodos estándar (Iaccarino y colaboradores, Circula tion . 98:1783-9 (1998), Iaccarino y colaboradores, Hypertension . 33:396-401 (1999)).

Inmuno transferencia de Proteínas La inmunodetección de niveles en el miocardio de ßARKl se realizó utilizando extractos cardíacos solubilizados con detergente después de la inmunoprecipitación (IP, por sus siglas en inglés) como se describió anteriormente (Iaccarino y colaboradores, Circulation . 98:1783-9 (1998), Iaccarino y colaboradores, Hypertension . 33:396-401 (1999)). Las IP's se realizaron utilizando un anticuerpo monoclonal anti-GRK2/GRK3 (C5/1, Upstate Biotechnology) seguido por la inmunotransferencia Western con un anticuerpo policlonal específico para ßARKl (GRK2) (C-20, (número de catalogo SC-561)) Santa Cruz Biotechnology) (Iaccarino y colaboradores, Circulation 98:1783-9 (1998), Iaccarino y colaboradores, Hypertension 33:396-401 (1999), Iaccarino y colaboradores, JJ Amer. Coll . Cardiol . 38:55-60 (2001)). La cuantificación de la ßARKl inmunorreactiva se realizó por medio de la exploración de la película de autorradiograma y utilizando el programa ImageQuant" (Molecular Dynamics) (Iaccarino y colaboradores, J. Amer. Coll . Cardiol . 38:55-60 (2001)).

Ensayos de Actividad de GRK Los extractos se prepararon a través de la homogeneización de tejido o linfocitos cardíacos en 2 mL de amortiguador de lisis libre de detergente helado. Las fracciones citosólicas y las fracciones de membrana se separaron por medio de la centrifugación y la actividad de GRK soluble se evaluó en fracciones citosólicas (100 a 150 µg de proteína) por medio de la fosforilación dependiente de luz de las membranas de segmentos exteriores de bastoncillos enriquecidas con rodopsina utilizando [?-32P] - ATP (Iaccarino y colaboradores, Circulation . 98:1783-9 (1998), Iaccarino y colaboradores, Hypertension. 33:396-401 (1999), Iaccarino y colaboradores, J. Amer. Coll . Cardiol . 38:55-60 (2001), Choi y colaboradores, JJ Biol . Chem. 272:17223-17229 (1997)). La actividad de GRK soluble representa principalmente la actividad de ßARKl y los cambios en la expresión de ßARKl se correlacionan con la señalización alterada de ßAR (Choi y colaboradores, J. Biol . Chem. 272 :1 '223 -17'229 (1997)).

Análisis Estadístico El análisis estadístico se realizó utilizando el programa Systat 7.0MR para WindowsMR. Los valores se proporcionan como el promedio+SEM. Para comparar los grupos, se utilizó una prueba t de Student no apareada. Las correlaciones entre variables se estudiaron utilizando el análisis de la prueba de regresión lineal . La correlación se consideró significativa cuando el valor p para la prueba F fue menor que 0.05. El efecto de la densidad de ßAR y la actividad de GRK sobre la actividad de adenilil-ciclasa también se calculó utilizando éstos como coeficientes en un análisis de regresión múltiple gradual progresiva.

RESULTADOS Señalización ß-adrenérgica en el miocardio humano deficiente Las características clínicas de los pacientes de quienes se obtuvo el tejido de corazón durante el transplante (Grupo 1) se listan en la Tabla 1. La expresión y actividad de ßARKl en extractos citosólicos de estas muestras de corazón deficiente se evaluó primero y se descubrió que había una correlación directa entre la proteína de ßARKl y la actividad de GRK in vitro (R = 0.609, p<0.05; n=24) (Figura ÍA) . Puesto que los estudios experimentales en animales han mostrado que los niveles de ßARKl en el miocardio pueden influir en gran medida en la señalización de ßAR en el corazón (Koch y colaboradores, Science 268:1350-1353 (1995), Rockman y colaboradores, J. Biol. Chem. 273:18180-18184 (1998)), se evaluó la relación entre la actividad de adenilil-ciclasa mediada por ßAR en membranas cardíacas y la actividad de ßARKl citosólica. La relación entre la densidad de ßAR y la producción de cAMP también se evaluó en las mismas biopsias de corazón deficiente. Primero, una correlación inversa significativa se encontró entre la actividad de GRK soluble y la sensibilidad a ßAR. Como demuestra la Figura IB, cuando la actividad de GRK es mayor, la señalización de ßAR, medida por medio de la actividad de adenilil-ciclasa estimulada con ISO, es suprimida. Además, como se esperaría, hubo una correlación positiva encontrada entre la producción de cAMP mediada por ISO y la densidad de ßAR de miocardio (Figura ÍC) . Por lo tanto, tanto la densidad de ßAR como la actividad de GRK afectan significativamente la producción de cAMP, como es indicado por el análisis de regresión lineal (F=31.861, p<0.001; densidad de ßAR: T: 6,285, p<0.001; actividad de GRK: T:-3,311, p<0.005). Para verificar si la señalización ß-adrenérgica de miocardio alterada tiene alguna relación con los resultados de la HF humana y si la actividad de ßARKl podría vincularse con la gravedad de la enfermedad, la actividad de GRK soluble en biopsias de LV se midió y los niveles se compararon en pacientes con tiempos variantes entre su diagnosis inicial de HF a cuando se realizó la intervención del transplante cardíaco o implante de un dispositivo para asistir al LV. La población utilizada en este análisis consistió de 15 pacientes del Grupo 1 (Tabla 1) que tenían una evolución rápida del HF (<2 años) . Este marco de tiempo se seleccionó de manera arbitraria para evitar cualquier efecto confuso de mecanismos adaptables que pudiera haber ocurrido en pacientes con un historial más grande de la enfermedad. Dentro de este grupo, 5 pacientes requirieron intervención dentro de 7 meses después de la diagnosis y en estos pacientes, la actividad de GRK soluble cardíaca (46±10 fmol de Pi/mg de proteína/minuto) fue significativamente más alta que aquella encontrada en extractos de miocardio de los 10 pacientes restantes quienes tuvieron una intervención entre 7 y 24 meses después de una diagnosis de HF inicial (30+2 fmol de Pi/mg de proteína/minuto) (p<0.005, prueba t) . Interesantemente, en estos mismos dos grupos no hubo diferencia en la densidad de ßAR de miocardio (41+13 f ol/mg de proteína de membrana contra 38+4 fmol/mg de proteína de membrana) o actividad de adenilil-ciclasa. De esta manera, aunque el tamaño de muestra pequeño fue relativamente pequeño y las condiciones de corte se seleccionaron después de esto, estos datos sugieren que la ßARKl cardíaca puede ser un predictor más adecuado de la gravedad de la enfermedad y/o el riesgo del progreso que la densidad o acoplamiento de ßAR.

Señalización ß-adrenérgica en linfocitos periféricos en HF Una hipótesis que se sometió a prueba fue si el sistema de ßAR y en particular ßARKl en los glóbulos blancos podría utilizarse como un sustituto para lo que se observa en el miocardio deficiente. A fin de verificar cualquier correlación entre los linfocitos cardíacos y periféricos en términos de actividad de GRK, se midió la expresión de ßARKl en apéndices de la aurícula derecha de biopsias quirúrgicas y linfocitos de pacientes en los pacientes del Grupo 2 (Tabla 1) . Estos pacientes se sometieron a cirugía por una enfermedad de la arteria coronaria o reemplazo valvular y estuvieron en general en la clase 1-3 de HF de NYHA. Como se muestra en la Figura 2A, se encontró una correlación directa entre la expresión de ßARKl en el miocardio y en los linfocitos, indicando que los niveles en los linfocitos de esta GRK simula la expresión cardíaca. Específicamente, cuando los niveles de ßARKl son elevados en el miocardio, esto también es aparente en los extractos de linfocitos. Un ejemplo de esto se muestra en la Figura 2B en dos pacientes con HF con diferente gravedad de la enfermedad. Basándose en esta observación, el análisis de la expresión de ßARKl y la actividad de GRK en los linfocitos se extendió a un número más grande de pacientes con diferentes grados de función cardíaca, que variaba de normal a reducida significativamente (como se evaluó por medio de la ecocardiografía) . Las características de estos pacientes (Grupo 3) se listan en la Tabla 1. Si el contenido de ßARKl en los linfocitos estaba correlacionado con la función cardíaca se evaluó específicamente al colocar en un diagrama la fracción de expulsión de LV (LVEF, %) contra la actividad de GRK soluble en los linfocitos. Como se muestra en la Figura 3A, hay una correlación inversa estadísticamente significativa entre la LVEF y la actividad de ßARKl en la sangre de estos 55 pacientes. Esto puede observarse más claramente cuando este grupo se divide en dos grupos en un corte funcional de 45% de la LVEF. La actividad de GRK con citosol es significativamente más alta en los glóbulos blancos de pacientes con una función de LV más pobre (Figura 3B) . Similarmente, se observó un incremento gradual en la actividad de GRK con una clase funcional de NYHA (Figura 3C) . No tomando en cuenta la totalidad de otras variables en estos pacientes tales como tolerancia al ejercicio, tratamientos con fármacos específicos u otras mediciones de la función cardíaca, el uso de la LVEF parece indicar que en pacientes con una función ventricular más baja, existen niveles cardíacos más altos de actividad de ßARKl que pueden medirse en los linfocitos periféricos. Haciendo una síntesis, el estudio descrito anteriormente se enfoca' en el papel de la GRK, ßARKl (o GRK2) en la HF humana y proporciona tres observaciones novedosas principales: 1) la demostración que los niveles cardíacos de ßARKl incrementados se correlacionan con la señalización de ßAR disminuida en corazones humanos deficientes; 2) la demostración directa que los niveles cardíacos de ßARKl y la actividad de GRK pueden supervisarse utilizando linfocitos periféricos; y 3) la sugerencia que la ßARKl incrementada puede estar asociada con una HF progresiva más rápidamente y un resultado clínico adverso. Estos datos indican la utilidad en la medición de los niveles en la sangre de esta GRK en pacientes con HF durante la selección inicial para esta enfermedad. Varios estudios en modelos animales han proporcionado un análisis minucioso de los mecanismos por medio de los cuales la ßARKl participa en el desacoplamiento de la señalización de ßAR y el comienzo de la HF (Rockman y colaboradores, Nature 415:206-12 (2002)).

En contraste, solo dos estudios han descrito niveles incrementados de ßARKl en especímenes de autopsia de corazones humanos deficientes al momento de la explantación (Ungerer y colaboradores, Circulation 87:454-63 (1993), Ungerer y colaboradores, Circ. Res . 74:206-13 (1994)). Al evaluar la ßARKl y la señalización de ßAR de biopsias de LV similares tomadas en la explantación, se descubrió una correlación inversa entre la actividad de ßARKl y GRK y la señalización de ßAR. Esta es información importante para estar de acuerdo con el conocimiento existente que hay una correlación directa entre la densidad de ßAR en el miocardio y la producción cardíaca de cAMP en respuesta a la estimulación de ßAR. Estos datos sugieren una relevancia crítica de ßARKl en el establecimiento de la disfunción de ßAR en el corazón humano. Los procesos reguladores clave implicados en la señalización de ßAR son la desensibilización e interiorización de receptores, las cuales son desencadenadas por la fosforilación de ßAR por medio de ßARKl u otras GRKs (Rockman y colaboradores, Nature 415:206-12 (2002), Lefkowitz, Cell . 74:409-12 (1993), Pierce y colaboradores, Nat Rev Mol Cell Biol . 3:639-50 (2002)). Es posible que otros mecanismos también puedan contribuir a la disfunción de ßAR en la HF tales como la sobrerregulación de la subunidad a de la proteína G inhibidora de ciclasa Gi (Gai) y la expresión alterada de isoformas de adenilil-ciclasa (Bristow, J. Amer. Coll . Cardiol . 22:61A-71A (1993)). Sin embargo, debido al hecho que se descubrió una correlación inversa significativa entre la sensibilidad a ßAR y la actividad de GRK en el corazón deficiente, parece que la ßARKl juega un papel crítico en la regulación y la función de ßAR de miocardio humano . Un descubrimiento significativo adicional del estudio es la demostración que existe una correlación directa entre la expresión y la actividad linfocítica y cardíaca (apéndices de la aurícula derecha) de la ßARKl. De esta manera, la medición de ßARKl en muestras de sangre puede utilizarse para supervisar los niveles de expresión relativos de esta GRK en el miocardio. La posibilidad para utilizar linfocitos para supervisar los cambios en ßAR inducidos por fármacos o enfermedades en el corazón, el cual no es accesible fácilmente en los humanos, fue hipotetizada primero por Brodde y colaboradores { Science 231:1584-5 (1986)) y materializada adicionalmente por otros (Feldman y colaboradores, J. Clin . Invest . 79:290-4 (1987)). La utilidad de la supervisión de componentes de la señalización de ßAR en los linfocitos de pacientes con HF ha sido propuesta por varios grupos, sin embargo los datos están en conflicto con respecto a la utilidad final de la medición de proteínas G, densidad de ßAR y cAMP en los linfocitos (Brodde y colaboradores, Science 231:1584-5 (1986), Feldman y colaboradores, J. Clin . Invest . 79:290-4 (1987), Maisel • y colaboradores, Circulation 81:1198-204 (1990), Gros y colaboradores, J. Clin . Invest . 99:2087-93 (1997)). Con respecto a las GRKs, se ha presentado evidencia para soportar que la ßARKl incrementada en los linfocitos es una característica de ciertas patologías cardiovasculares que incluyen la hipertensión que soportan la concurrencia fenotípica entre los sistemas de ßAR cardíacos y en los linfocitos (Feldman y colaboradores, J.

Clin . Invest . 79:290-4 (1987), Maisel y colaboradores, Circulation 81:1198-204 (1990), Gros y colaboradores, JJ Clin . Invest . 99:2087-93 (1997)). El presente estudio se agrega a este escenario al proporcionar el descubrimiento novedoso que este sistema puede utilizarse para estudiar la molécula clave reguladora de ßAR, ßARKl y su actividad de GRK soluble asociada. Además, parece que el contenido y la actividad de ßARKl en los linfocitos en pacientes humanos con HF pueden seguir la pista de la gravedad de la enfermedad. Aunque los datos actuales no soportan el uso de la supervisión de GRK en los linfocitos como un predictor para los resultados de pacientes individuales, parece ser un marcador potencialmente útil para explorar en la selección inicial y para hacer el seguimiento de los pacientes con HF. El mecanismo responsable de las alteraciones similares en el sistema de ßAR de linfocitos y miocardio es incierto. Los datos recientes de Brodde y colegas (Werner y colaboradores, Basic Res . Cardiol . 96:290-8 (2001)) muestran que el bloqueo de ßAR en HF, un tratamiento que reduce la ßARKl cardíaca e incrementa la señalización en animales (Iaccarino y colaboradores, Circulation . 98:1783-9 (1998)), también puede incrementar las respuestas funcionales e inmunes a catecolaminas en los linfocitos (Werner y colaboradores, Basic Res . Cardiol . 96:290-8 (2001) ) . La señalización a través del sistema de ßAR en estos linfocitos se incrementó sin importar los efectos sobre la función cardíaca (Werner y colaboradores, Basic Res . Cardiol . 96:290-8 (2001)). Estos datos soportan el concepto que el sistema de GRK en los linfocitos y el corazón son regulados de manera similar. Se sabe que la exposición a la catecolamina crónica induce anormalidades en la señalización de ßAR tales como desrregulación de ßAR y que la HF está asociada con la norepinefrina circulante incrementada (Bristow, J. Amer. Coll . Cardiol . 22:61A-71A (1993), Hasking y colaboradores, Circulation 73:615-21 (1986) ) . De manera importante, las respuestas inmunes en pacientes con HF pueden modularse por medio del sistema nervioso simpático y el mecanismo subyacente parece implicar a ß2-ARs (Murray y colaboradores, Circulation 86:203-13 (1992)), lo cual podría ocurrir a través de la estimulación de epinefrina, la cual se incrementa en pacientes con HF (Kaye y colaboradores, Am . J. Physiol . 269:H182-8 (1995)). Puesto que la ßARKl de miocardio es sobrerregulada en respuesta a la activación adrenérgica crónica (Iaccarino y colaboradores, Circulation . 98:1783-9 (1998), Iaccarino y colaboradores, Hypertension . 33:396-401 (1999), Iaccarino y colaboradores, J. Amer. Coll . Cardiol . 38:55-60 (2001), Iaccarino y colaboradores, Hypertension 38:255-60 (2001)), una posibilidad es que las catecolaminas circulantes incrementadas (es decir norepinefrina y epinefrina) , pueden desencadenar un incremento en la expresión de ßARKl tanto en el linfocito como en el corazón a través de medios de estimulación de ßi- y ß2-AR. Sin embargo, esta hipótesis necesita ser explorada adicionalmente en pacientes con HF quienes han sido tratados con antagonistas de ßAR para determinar si el bloqueo en la activación de catecolamina crónica de ßARs en el corazón y glóbulos blancos circulantes puede afectar en realidad la expresión de ßARKl. Estos estudios clínicos adicionales también serán importantes para definir mejor la relación entre la actividad de ßARKl en los linfocitos y la sensibilidad adrenérgica en el miocardio. De manera interesante, se ha mostrado que este es el caso en los corazones de ratones expuestos crónicamente a carvedilol y atenolol (Iaccarino y colaboradores, Circulation . 98:1783-9 (1998)) y en cerdos con HF tratados con un ß-bloqueador (Ping y colaboradores, J. Clin . Invest . 95:1271-80 (1995)). Los estudios in vitro sugieren que los ß-bloqueadores reducen la expresión de ßARKl a través de la reducción de tanto el ARNm como la proteína de ßARKl (Iaccarino y colaboradores, Circulation . 98:1783-9 (1998)). En modelos animales de HF, la sobrerregulación de la actividad cardíaca de GRK se observa frecuentemente (Maurice y colaboradores, Am . J. Physiol . 276:H1853-60 (1999), Anderson y colaboradores, Hypertension . 33:402-7 (1999), Rockman y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci .

EUA. 95:7000-5 (1998), Ping y colaboradores, Am J Physiol . 273:H707-17 (1997), Harris y colaboradores, Basic Res Cardiol . 96:364-8 (2001), Iaccarino y colaboradores, J.

Amer. Coll . Cardiol . 38:55-60 (2001), Akhter y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . EUA. 94:12100-5 (1997), Asai y colaboradores, J. Clin . Invest . 104:551-8 (1999), Cho y colaboradores, J. Biol . Chem. 274:22251-6 (1999)), pero no siempre (Dorn y colaboradores, Mol . Pharmacol . 57:278-87 (2000)). Esta observación podría sugerir un papel diferencial de esta cinasa en la HF. En el presente estudio, se observó que el desempeño cardíaco disminuido (es decir la LVEF) no estaba asociado consistentemente con niveles incrementados de ßARKl. Sin embargo, los datos indican que podría haber una correlación entre la ßARKl y los resultados más negativos en la HF ya que en pacientes isquémicos la actividad cardíaca más alta de GRK estaba asociada con una HF más rápidamente progresiva. Estos descubrimientos en humanos en paralelo a un estudio reciente en ratones transgénicos, en el cual la expresión y la actividad incrementadas de ßARKl estaban asociadas con la cardiomiopatía severa y la mortalidad prematura (Iaccarino y colaboradores, J. Amer. Coll . Cardiol . 38:55-60 (2001)). Un caso para la ßARKl que representa una molécula para ser supervisada en la HF humana para predecir la gravedad de la enfermedad quizás es mejor ilustrada en los descubrimientos que la ßARKl fue significativa y progresivamente más alta con la escalada de la clase de HF de NYHA. Esto es similar a lo que se ha mostrado para el péptido natriurético del cerebro (BNP, por sus siglas en inglés) (Lee y colaboradores, J. Card Failure 8:149-54 (2002)). De manera importante, como el BNP, la expresión y la actividad de la ßARKl en los linfocitos representan un biomarcador novedoso y fácilmente evaluable para la HF humana. En términos generales, los datos indican que la medición de los niveles de ßARKl en los linfocitos es útil en la evaluación de pacientes con HF. Los estudios que implican poblaciones más grandes pueden utilizarse para aclarar el papel predictivo para la ßARKl en la HF.

EJEMPLO 2 Se ha llevado a cabo un estudio que implica el uso de corazones de pacientes que se han sometido a una cirugía para el implante de un dispositivo para la asistencia mecánica del LV (LVAD) . Estos pacientes se someten típicamente al transplante cardíaco dentro de algunos meses y de esta manera, se pueden obtener muestras de corazón antes y después de la descarga. De manera importante, se ha mostrado que el uso del LVAD como un "puente para transplante" conduce a la recuperación del miocardio deficiente, un proceso denominado remodelación inversa (Zafeiridis y colaboradores, Circulation 98:656-662 (1998) ) . Puesto que los estudios previos han mostrado una normalización de la estructura y función cardíaca como una característica de la remodelación inversa posterior al LVAD que incluye la sensibilidad mejorada a ßAR (Zafeiridis y colaboradores, Circulation 98:656-662 (1998)), se propuso que la ßARKl podría estar implicada en este proceso. El ARNm, la proteína de ßARKl cardíaca y la actividad de GRK han sido medidas en muestras de LV humano previas y posteriores al LVAD. Al utilizar muestras apareadas, es posible examinar la ßARKl específicamente en el mismo corazón antes y después del soporte del LVAD. Los resultados iniciales muestran claramente que la ßARKl se reduce en el corazón deficiente después de un período de descarga (Figuras 4A y 4B) . Como se muestra en la inmunotransferencia Western (Figura 4A) , aunque las cantidades de proteína de ßARKl previas al LVAD son variables, existe una reducción significativa después de la descarga mediada por el LVAD. La longitud de tiempo promedio para el uso de LVDA en estos pacientes fue de 2 meses. El ARNm de la ßARKl se cuantificó utilizando la PCR con transcriptasa inversa en tiempo real utilizando la metodología de fluorescencia verde SYBRMR y esto -también mostró una reducción significativa de la expresión de ßARKl después de la descarga en la HF humana (Figura 4B) . Tanto el ARNm como la proteína de ßARKl se redujeron por aproximadamente 50%. La actividad cardíaca de GRK y la señalización de ßAR también se examinaron en conjuntos apareados de muestras previas y posteriores al LVAD de HF humana y los resultados preliminares se muestran en las Figuras 5A y 5B. Consistente con los resultados del ARNm y la proteína (Figura 5A) , la actividad cardíaca in vitro de la GRK soluble contra la rodopsina del substrato de GPCR se redujo significativamente en el LV después del LVAD (Figura 5A) . Se documentó previamente que la actividad de GRK soluble en extractos cardíacos es casi exclusivamente de la ßARKl (Iaccarino y colaboradores, Circulation 98:1783-1789 (1998)) . La actividad de la ßARKl más baja parece jugar un papel importante en la recuperación de miocitos después de la descarga ya que la actividad AC estimulada con ISO de la membrana en estas muestras se mejoró significativamente (Figura 5B) . De esta manera, como antes en los corazones humanos deficientes explantados (Figura ÍA) , hubo una correlación inversa entre la actividad cardíaca de GRK y la señalización y sensibilidad a ßAR. También es deseable determinar si los niveles de ßARKl encontrados en la sangre de pacientes tratados con el LVAD se correlacionan con los niveles cardíacos y si la ßARKl en los linfocitos puede utilizarse para supervisar el mejoramiento funcional posterior al LVAD o puede ayudar a predecir la recuperación del miocardio después de la descarga mecánica. La ßARKl ha comenzado a medirse en los linfocitos preparados de pacientes con el LVAD. Las muestras de sangre y linfocitos se han obtenido de pacientes antes del implante del LVAD y luego nuevamente al momento de la explantación y el transplante cardíaco. Los resultados preliminares en dos conjuntos de muestras de pacientes con el LVAD se muestran en la Figura 6A. Como la proteína de ßARKl cardíaca, los niveles de linfocitos de ßARKl se reducen sustancialmente en 2 meses del soporte del LVAD. Finalmente, muchos estudios en modelos animales de HF han mostrado que al igual que la ßARKl, la GRK5 también es sobrerregulada y de esta manera puede jugar un papel importante en la señalización y la función cardíaca y puede ser de importancia en la HF. Los niveles de expresión de GRK5 han sido medidos en 15 pares de muestras cardíacas previas y posteriores al LVAD y no se han encontrado alteraciones en los niveles de proteína de GRK5 después de la descarga (Figura 6B) . La PCR en tiempo real tampoco ha mostrado una alteración en los niveles de expresión de GRK5 posteriores al LVAD. Estos resultados soportan la conclusión que la ßARKl es la GRK crítica que está implicada en la regulación de la señalización y función de los ßAR cardíacos y es de importancia en la HF. Haciendo una síntesis, los datos anteriores demuestran que en los corazones humanos deficientes, el soporte de LVAD está asociado con niveles disminuidos del ARNm, la proteína de ßARKl y la actividad de GRK que pueden reproducirse en los linfocitos de estos pacientes y proporciona un mecanismo posible para la restauración de la señalización de ßAR y la remodelación inversa después de la descarga mecánica en el corazón deficiente. Todos los documentos y otras fuentes de información citadas anteriormente son incorporados por este acto en su totalidad a manera de referencia.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para supervisar el nivel cardíaco de la cinasa de receptores ß-adrenérgicos (ßARKl) en un paciente, caracterizado porque comprende supervisar el nivel de la ßARKl en los linfocitos del paciente, en donde una alteración en el nivel de ßARKl en los linfocitos es indicativa de una alteración en el nivel cardíaco de ßARKl en el paciente.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de la ßARKl en los linfocitos se determina al someter a ensayo el nivel de la proteína de ßARKl en los linfocitos.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el nivel de la proteína de ßARKl se somete a ensayo en un ensayo ELISA.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el nivel de la proteína de ßARKl se somete a ensayo por medio de la inmunotransferencia Western utilizando anticuerpos específicos para ßARKl.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de ßARKl en los linfocitos se determina al someter a ensayo el nivel de ARNm de ßARKl en los linfocitos.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el nivel de ARNm de ßARKl se somete a ensayo por medio de la PCR con transcriptasa inversa cuantitativa.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente está sufriendo de insuficiencia cardíaca.
8. 8. Un método para supervisar la función cardíaca en un paciente que sufre de insuficiencia cardíaca, caracterizado porque comprende comparar el nivel de ßARKl en linfocitos del paciente en un primer punto en el tiempo y un segundo punto en el tiempo, en donde una reducción en el nivel de ßARKl en los linfocitos en el segundo punto en el tiempo con relación al primer punto en el tiempo es indicativa de un mejoramiento en la función cardíaca en el paciente en el segundo punto en el tiempo y en donde una elevación en el nivel de ßARKl en los linfocitos en el segundo punto en el tiempo con relación al primer punto en el tiempo es indicativa de una disminución en la función cardíaca en el paciente en el segundo punto en el tiempo.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el primer punto en el tiempo y el segundo punto en el tiempo son antes de y subsecuentes al tratamiento del paciente para la insuficiencia cardíaca, respectivamente, en donde una falta de cambio en, o una elevación de, el nivel de ßARKl en los linfocitos en el segundo punto en el tiempo con relación al primer punto en el tiempo es indicativa de una falta de respuesta al tratamiento.
10. 10. Un método para supervisar el nivel cardíaco de la actividad de ßARKl en un paciente, caracterizado porque comprende supervisar el nivel de la actividad de ßARKl en los linfocitos del paciente, en donde una alteración del nivel de actividad de ßARKl en los linfocitos es indicativa de una alteración en el nivel cardíaco de la actividad de ßARKl en el paciente.
11. 11. Eí método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el paciente está sufriendo de insuficiencia cardíaca.
12. 12. Un método para supervisar la función cardíaca en un paciente que sufre de insuficiencia cardíaca, caracterizado porque comprende comparar el nivel de actividad de ßARKl en los linfocitos del paciente en un primer punto en el tiempo y un segundo punto en el tiempo, en donde una reducción en el nivel de actividad de ßARKl en los linfocitos en el segundo punto en el tiempo con relación al primer punto en el tiempo es indicativa de un mejoramiento en la función cardíaca en el paciente en el segundo punto en el tiempo y en donde una elevación en el nivel de actividad de ßARKl en los linfocitos en el segundo punto en el tiempo con relación al primer punto en el tiempo es indicativa de una disminución en la función cardíaca en el paciente en el segundo punto en el tiempo.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el primer punto en el tiempo y el segundo punto en el tiempo son antes de y subsecuentes al tratamiento del paciente para la insuficiencia cardíaca, respectivamente, en donde una falta de cambio en, o una elevación de, la actividad de ßARKl en los linfocitos en el segundo punto en el tiempo con relación al primer punto en el tiempo es indicativa de una falta de respuesta al tratamiento.