MX2007004165A - Agentes de transporte derivados de cupredoxinas y metodos de utilizar los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención divulga métodos y materiales para la entrega de un compuesto transportador dentro de una célula de cáncer. La entrega del compuesto transportador se logra mediante el uso de los dominios de transducción de las proteínas derivados de las cupredoxinas. La invención además divulga métodos para el tratamiento y diagnóstico del cáncer.

Description

AGENTES DE TRANSPORTE DERIVADOS DE CUPREDOXINAS Y MÉTODOS DE UTILIZAR LOS MISMOS. SOLICTUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud patente provisional norteamericana número 60/616,782, presentada el 7 de octubre de 2004, de la solicitud patente provisional norteamericana número 60/680,500, presentada el 13 de mayo de 2005, y de la solicitud patente provisional norteamericana número 60/700,297, presentada el 19 de julio de 2005. El contenido integro de estas solicitudes es ¦incorporado completamente aquí como referencia. DECLARACIÓN DE INTERÉS GUBERNAMENTAL El contenido de esta solicitud ha sido apoyado por una concesión de- una investigación de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) , Bethesda, Mariland, de los Estados Unidos de América (Número de Concesión ES 04050-18) . El gobierno puede tener ciertos derechos en esta invención. ANTECEDENTES La entrada de una proteina en una célula de mamífero es frecuentemente dictada por un segmento pequeño de la proteína, que se refiere comúnmente como un "dominio de la transducción de la proteina" o PTD. Este segmento se puede utilizar como una señal unida a una proteína foránea para facilitar transporte de tal proteína en una célula de mamífero. Por ejemplo, los péptidos antipáticos se utilizan para facilitar la incorporación de metaloporfirinas cortadoras de ADN como fármacos antitumorales potenciales en los fibroblastos humanos HS68 o en las células L1210 de leucemia linfocítica murina (Chaloin, L. et al. Bioconjugate Chem. 12:691 - 700, (2001)). Los péptidos, llamados péptidos penetrantes de la célula, tales como penetratin, transportan, Tat (aminoácidos 47-57 ó 48-60) y el péptido antipático modelo MAP, se han utilizado como -vehículos de entrega para transportar sustancias farmacológicamente importantes, tales como oligonucleótidos antisentido, proteínas y péptidos (Hallbrink, M« et al. Biochem. Biophys. Acta 1515:101 - 109 (2001); Lindgren, M. , et al. Trends Pharmacol. Sci. 21:99 -103 (2000)). Tales péptidos, particularmente el homeodominio de unión al ADN de Antennapedia, un factor de la transcripción de Drosophila, o el péptido portador de 21 residuos Pep-1, son internalizados por muchos tipos de células en cultivo, tal como las HS68 humanas o los fibroblastos NIH-3T3 murinos, a 37 °C ó a 4°C. La falta del efecto del cambio de temperatura sugiere un mecanismo de penetración diferente al de la endocitosis clásica (Morris, M.C. et al. Nature Biotechnol. 19:1173 ~ 1176 (2001)), que requiere de las proteínas del receptor quiral. Uno de los péptidos más ampliamente utilizados para transportar compuestos farmacológicamente activos en células de mamiferos es el dominio de la transducción de la proteina rica en arginina de once aminoácidos (PTD) de la proteina transactivatora Tat del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-I) (Schwarze, S.R. et' al. Science 285:1569 - 1572 (1999), Schwarze, S.R. et al. Trends Cell. Biol. 10:29Q - 295 (2000) ) . La inyección intraperitoneal de la proteina de fusión beta galactosidasa/Tat de 12Q kDa resulta en la transducción transcelular de la proteina de fusión en virtualmente todos los tejidos en ratones incluyendo el paso a través de la barrera hemato-encef lica. Este péptido corto del dominio de la Tat del VIH-I se ha demostrado que media la internalización celular de grandes moléculas o partículas, incluyendo nanoparticulas magnéticas, vectores fagos, liposomas y plámidos de ADN. ? diferencia de otros péptidos penetrantes de la célula discutidos arriba, la internalización de las proteínas transportadoras o "cargo" por la Tat de longitud completa o por su dominio de la transducción de 11 aminoácidos, se deteriora significativamente a 4 °C (Liu, Y. et al. Nat. Med. 6:1380 -1387 (2000), Suzuki, T. et al. J. Biol. Chem. 277:2437 - 2443 (2002) ) y requiere de- interacciones con receptores tales como las cadenas de sulfato de heparan de la membrana celular de los proteoglicanos de sulfato de heparan. La mayor parte de los PTDs identificados hasta la fecha se ha derivado de fuentes virales y de mamiferas. Otras fuentes de PTDs serian deseables para el diseño de varias secuencias experimentales, y para las terapias de animales y humanas y para procedimientos profilácticos. Una fuente alternativa de PTDs son las células bacterianas. Aunque o las proteínas bacterianas tales como la toxina del cólera se conoce que entran en el citosol de la células de mamíferos (Sofer, A. y Futerman, A.H.J. Biol Chem. 270:12117 - 12122 (1995)}, la citotoxicidad de tales proteínas ha limitado el uso de las proteínas bacterianas, o de los PTDs derivados de ellas, para transportar cargas o compuestos farmacológicamente importantes en las células de mamíferos. RESUMEN INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención es un péptido que tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos para cuando menos una cupredoxina tipo salvaje ( t) de longitud completa o para la proteína de la membrana externa H.8, y el cual facilita la entrada de una molécula transportadora enlazada a él en una célula de cáncer de mamífero. En algunas materializaciones, el péptido al menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos que una azurina, una plastocianina, una rusticíanina, una pseudoazurina, una auracianina o una proteína similar a la azurina de longitud completa, o para la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 1, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 2, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 3, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 4, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 29, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 30, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 31, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 32, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 33, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 34, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 36 e IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 43* En algunas materializaciones, el péptido se deriva de Pseudomonas aeruginosa, Phormidium laminosum, Thiobacillus ferrooxidans, Aehromobacter cicloclastes, Pseudomonas syringa, Neisseria meningitidis, Vibrio parahaemolyticus, Bordetella bronchiséptica, Bordetella pertussis, Chloroflexus aurantiacus y Neisseria gonorrhoeae. En otras materializaciones, el péptido es al menos de 10 residuos y no más que 50 residuos de longitud. En algunas materializaciones, el péptido comprende una secuencia que tiene al menos identidad en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 90% con la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 5, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 6, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 7, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 9, IDENTIFICACIÓN DE. SEC. NO.: 37, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 38, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 39, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 40, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 41, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 42, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 43, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 44, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 46, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 47 o IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 47. En otras materializaciones, el péptido comprende o consiste en la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 5, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 6, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 7, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 9, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 37, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 38, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 39, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 40, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 41, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 42, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 43, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 44, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 46, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 47 o IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 47. En algunas materializaciones, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos DGXXXXXDXXYXKXXD y DGXXXXDXXYXXXD, donde D es ácido aspártico, G es glicina, Y es tirosina, K es lisina y X es cualquier aminoácido. Finalmente, en algunas materializaciones, el péptido tiene homología estructural significativa para los 50-77 aminoácidos de la región de la azurina de Pseudomonas aeruginosa. Otro aspecto de la invención es un complejo que comprende un compuesto transportador y una secuencia de aminoácidos, donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos una identidad de secuencia de aproximadamente el 90% con una cupredoxina o un fragmento de la misma, la secuencia de aminoácidos, o el fragmentos de ésta, se liga o enlaza al compuesto transportador, y la secuencia de aminoácidos facilita la entrada del compuesto transportador en una célula de cáncer de mamífero. En algunas materializaciones, la secuencia de aminoácidos de este complejo tiene al menos identidad en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 90% cuando menos para una cupredoxina tipo salvaje de longitud completa o la proteina de la membrana externa H.8. En otras materializaciones, el compuesto transportador es una proteina, una lipoproteína, un polipéptido, un péptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un pigmento, una microparticula, una nanoparticula, una toxina y un fármaco. En materializaciones particulares, la carga es una proteina o un polipéptido el cual está enlazado a una secuencia de aminoácidos para formar una proteina de fusión. En otras materializaciones particulares, el compuesto transportador es una toxina, más particularmente la exotoxina A. de Pseudomonas aeruginosa. En otras materializaciones, la carga es una sustancia detectable, más específicamente una sustancia detectable por fluorimetria, microscopía. Rayos X CT, MRI o ultrasonido. Finalmente, la invención también comprende el complejo en un portador farmacéuticamente apropiado. Otro aspecto de la presente invención se dirige a un método para entregar un compuesto transportador en una célula. En una materialización, este método comprende poner en contacto una célula o las células con el complejo anteriormente mencionado. En otras materializaciones, la célula, o las células se originan de un paciente que sufre de cáncer, y se reintroducen en el paciente. En otras materializaciones, la célula es una célula de cáncer, más específicamente una célula de osteosarcoma, una célula de carcinoma de pulmón, una célula de carcinoma de colon, una célula de linfoma, una célula de leucemia, una célula sarcoma de tejido blando, una célula de carcinoma de seno, una célula de carcinoma de hígado, célula de carcinoma de vejiga o una célula de carcinoma de próstata. En otras materializaciones, el complejo se administra a un paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva. En otras materializaciones, el complejo se administra por vía intravenosa, tópica, subcutánea, intramuscular o -en un tumor. En otras materializaciones, el complejo se co-administra con otro tratamiento para el cáncer. Otro aspecto de la invención es un método para diagnosticar cáncer. En algunas materializaciones, el complejo con una carga que es una sustancia detectable, se administra a un paciente con cáncer y se detecta la localización de la carga. En materializaciones particulares, el compuesto transportador es un agente de contraste por rayos X y son detectadas por Rayos X CT, el compuesto transportador es un agente de contraste de para imagen por resonancia magnética y es detectado por MRI, y el agente de carga es un agente de contraste para ultrasonido y es detectable por ultrasonido. En otras materializaciones, la célula o las células se ponen en contacto con un complejo con una sustancia detectable y la localización de la carga se detecta. Otro aspecto de la invención es un conjunto que contiene uno de los anteriores complejos. En algunas materializaciones, el conjunto además comprende un adyuvante o un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otras materializaciones, el conjunto adicianalmente comprende un vehículo para la administración del reactivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS: IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 1 es la secuencia de aminoácidos de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 2 es la secuencia de aminoácidos de la plastocianina de Phormidium laminosum. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 3 es la secuencia de aminoácidos de la rusticianina de los Thiobacillus férrooxidans. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.; 4 es la secuencia de aminoácidos de la pseudoazurina de Achromobacter cicloclastes. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 5 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 36-128 aminoácidos de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 6 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 36-89 aminoácidos de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO,: 7 -es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 36-77 aminoácidos de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 8 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 36-50 aminoácidps de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 9 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 50-77 aminoácidos de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 10 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 50-66 aminoácidos de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 11 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de aminoácidos azu 67-77 de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 12 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el pGST-azu 36-128. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 13 es la secuencia de aminoácidos del cebador inverso para el pGST-azu 36-128. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 14 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el pGST-azu 36-50. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 15 es la secuencia de aminoácidos del cebador inverso para el pGST-azu 36-50. IDENTIFICACIÓN DEL SEC. NO.: 16 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el pGST-azu 36-77. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 17 es la secuencia de aminoácidos del cebador inverso para el pGST-azu 36-77.

IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 18 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el pGST-azu 36-89. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 19 es la secuencia de aminoácidos del cebador inverso para el pGST-azu 36-89. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 20 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el pGST-azu 50-77. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 21 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el pGST-azu 67-77. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 22 es la secuencia de aminoácidos del cebador inverso para el pGST-azu 50-77 y el pGST-azu 67-77. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 23 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el pGST-azu 50-66. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 24 es la secuencia de aminoácidos del cebador inverso para el pGST-azu 50-66. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 25 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el gen de la proteina fluorescente verde. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 26 es la secuencia de aminoácidos del cebador inverso para el gen de la proteina fluorescente verde. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 27 es la secuencia de aminoácidos del cebador delantero para el gst-gfp-azu 50-77. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 28 es la secuencia de aminoácidos del cebador inverso para el gst-gfp-azu 50-77.

IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 29 es la secuencia de aminoácidos de la azurina de Pseudomonas syringae. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 30 es la secuencia de aminoácidos de la azurina/ proteina H.8 de la membrana externa de Neisseria meningitidis. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 31 es la secuencia de aminoácidos de la azurina del Vibrio parahaemolyticus . IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 32 es la secuencia de aminoácidos de la azurina de Bordetella bronchiseptica. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 33 es la secuencia de aminoácidos de la auracianina A de Chloroflexus aurantiacus. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 34 es la secuencia de aminoácidos de la auracianina B de Chloroflexus aurantiacus. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 35 es una secuencia de aminoácidos artificial que representa los residuos conservados en el dominio de entrada de la cupredoxina donde D es ácido aspártico, G es glicina, Y es tirosina, K es lisina y X es cualquier aminoácido.

IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 36 es la secuencia de aminoácidos de la proteina Laz de Neisseria gonorrhoeae-. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 37 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 50-67 aminoácidos de la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 38 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 57-89 aminoácidos de la auracianina B de Chloroflexus aurantiacus. IDENTIFICACIÓN DE SEC- NO. : 39 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 50-77 aminoácidos de la azurina de Bordetella pertussis. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 40 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 106-132 aminoácidos de la proteina Laz de Neisseria meningitidis. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 41 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 53-70 aminoácidos de la azurina de P. aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 42 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de aminoácidos 53-64 de la azurina de P. aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 43 es la secuencia de aminoácidos de la azurina de bordetella pertussis. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 44 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 51-77 aminoácidos de la azurina de P. aeruginosa. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 45 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 51-77 aminoácidos de la azurina de Pseudomonas syringae. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 46 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 52-78 aminoácidos de la azurina de Vibrio pa a aemolyticus .

IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 47 es la secuencia de aminoácidos del fragmento de 51-77 aminoácidos de la azurina de Bordetella bronchiseptica. IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 48 es una secuencia de aminoácidos artificial que representa los residuos conservados en el dominio de entrada de la cupredoxina donde D es ácido aspártico, G es glicina, Y es tirosina, K es lisina y X es cualquier aminoácido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1 (a) y (b) . Gráficos que muestran que la entrada de la azurina se correlaciona con la citotoxicidad, (a) Ensayos de MTT fueron realizados para la determinación de la citotoxicidad inducida azurina tipo salvaje contra J774, en células UISOMel-2 y fibroblastos, (b) análisis de la progresión del ciclo celular en células normales humanas de fibroblastos tratadas con la azurina mutante 44KM64E. Las células de fibroblastos fueron incubadas con 0 {control), 0.5 ó 1.0 mg/ml de la azurina mutante por 24 horas. Al final del tratamiento, el contenido del ADN en las células fue determinado por citometria de flujo. Figura 2 (a) y (b) . (a) Representación esquemática de varias construcciones de azurina truncada y sus perfiles de purificación. Varios fragmentos del gen azu fueron fusionados en el extremo 3 ' del gen gst en marco, (b) proteínas de fusión GST-azu fueron purificadas después del crecimiento y de la lisis celular,, cargadas en SDS-PAGE y visualizadas por tinción con Azul de Coomassie. Figura 3 (a) , (b) y (c) . (a) Diagrama que muestra la construcción de una proteína de fusión GST-GFP-azu 50-77. El gen gfp fue introducido en el extremo 3' del gen gst (para GST-GFP) y el fragmento azu 50-77 entonces fue ligado en el extremo 3 1 del gen gfp en marco para producir la proteína de ¦fusión GST-GFP-azu 50-77. GST- GFP-azu 50-77 fue purificada como sola proteína de fusión a partir de los lisados celulares. Las proteínas purificadas fueron corridas en SDS- PAGE y detectadas por tinción de Azul de Coomassie (9 (b) ) y también por Western blotting usando un anticuerpo anti- azurina (9 (c) ) . Figura 4 (a) , (b) y (c) . Diagramas que muestran un estudio cinético para la internalización de las proteínas de fusión GST-Proteína fluorescente verde (GFP) y GST-GFP-azurina. La fluorescencia verde fue ensayada en células J774 tratadas con varias concentraciones de GST-GFP (10 (a) ) o GST-GFP-azu 50- 77 (10 (b) ) 37 °C por 1 hora. Diez mil células fueron analizadas por citometría de flujo, (c) Dependencia de la internalización de GST-GFP-azu 50-77. Las células J774 fueron incubadas con 200 µg/ml de GST-GFP-azu 50-77 por tiempos indicadas a 37°C y analizadas por citometría de flujo. Figura 5 (a), (b) y (c) . (a) Diagrama que muestra el dominio III de la exotoxina A (aminoácidos 405-613) , así como parte del dominio Ib (aminoácidos 381-404) , se fusionó a GST (GST-PEDIII) según lo descrito anteriormente para la fusión de GST-GFP. El fragmento azu 50-77 entonces fue ligado al extremo carboxilo de GST-PEDIII (GST~PEDIII-azu 50-77), usando PCR. (b) Las proteínas de fusión fueron purificadas por gel filtración en una columna cromatográfica de glutatión Sefarosa 4B y corridas sobre SDS-PAGE para la determinación del tamaño, (c) diagrama que muestra la acción de la proteína de fusión GST-PEDIII-azu 50-77 en células de cáncer üISO-Mel-2 y en células normales de fibroblastos (FBT) , según lo determinado por citotoxicidad mediada por PEDIII. Varias concentraciones, según lo indicado, de GST-PEDIII y GST-PEDIII-azu 50-77 fueron incubadas con células UISO- Mel-2 y FBT por 24 h, después de lo cual la viabilidad celular fue determinada por ensayo de MTT. Figura 6, Diagrama que muestra la localización de la a-hélice en la azurina tipo salvaje así como en el dominio de la transducción de la proteína 50-77 de la azurina tipo salvaje. Se indica el reemplazo de tres aminoácidos en el dominio de la azurina 50-77 por residuos prolina. Figura 7. Diagrama de la citotoxicidad mediada por PEDIII de la proteína de fusión GST-PEDIII- rusticianina contra células de cáncer üISO-Mel—2 y células FBT. Varias concentraciones, según lo indicado, de GST-PEDIII y de GST-PEDIII-azu 50-77 fueron incubadas con las células UISO-Mel-2 y FBT por 24 h, después de lo cual se determinó la viabilidad celular por análisis de MTT. Figura 8 (a) y (b) . (a) Diagrama que muestra la alineación estructural de la azurina con otras cupredoxinas, según lo computado por el algoritmo VAST. Las partes extendidas del N-terminal de la auracianina B y la rusticianina, que están ausentes en la azurina, se han omitido en la figura. Las barras negras indican las regiones de la azurina que se pueden sobreponer sobre los residuos de cada vecino. Los espacios en blanco son regiones sin alinear. El dominio de la transducción de la proteina azurina (PTD) , aminoácidos 50-77de la azurina, donde no hay alineación con la rusticianina es destacado por las líneas discontinuas verticales. Los números entre paréntesis después de los nombres de las cupredoxinas son los números de acceso de la proteína en la base datos (b) . Alineación múltiple de las secuencias de aminoácidos de los residuos que comprenden la parte media en algunas azurinas bacterianas conocidas. Géneros y especies bacterianas se abrevian como sigue: Psae, Pseudomonas aeruginosa (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 44); Pssy, Pseudomonas syringae- (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 45); Neme, Neisseria meningitidis (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 40); Vipa, Vibrio parahaemolyticus (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 46); Bobr, Bordetella bronchiseptica (IDENTIFICACIÓN DE SEC.

NO.: 47). Los números de aminoácidos que intervienen se dan entre paréntesis. El software CLUSTAL X (Higgins y Sharp, Gene 101:6427 - 6432 (1988)) fue utilizado para generar esta alineación múltiple de secuencias. Figura 9. La Figura 9 representa un diagrama de la proteína Laz de Neisseria meningitidis y de la proteína azurina de Pseudomonas aeruginosa. La fraseología a la izquierda de la barra indica el nombre de la proteína. La fraseología sobre las barras indica el nombre de la región de la proteína directamente debajo en la barra. Los números debajo de la barra indican el número de aminoácidos de las regiones de unión de la proteína. Figura 10, La Figura 10 representa las construcciones de varias proteínas de fusión de azurinas. La fraseología a la izquierda de la barra indica el nombre de la construcción, con el producto del plásmido y la proteina indicado. La fraseología sobre la barra índica la región de la proteína representada directamente debajo en la barra. "N.SP" indica el péptido señal de Neisseria gonorrhoeae; ¾H.8" indica la región H.8 de Neisseria gonorrhoeae? "N.Azu" indica la azurina de Neisseria gonorrhoeae; "P.SP" indica el péptido señal de Pseudomonas aeruginosa; y "P.Azu" indica el péptido señal de P. aeruginosa. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MATERIALIZACIONES La presente invención se relaciona con los métodos y materiales para entregar un compuesto transportador en una célula. La entrega del compuesto transportador según esta invención se logra mediante el uso de un polipéptido de transporte apropiado. En una materialización de la invención, el compuesto transportador se enlaza al polipéptido de transporte. Los péptidos de transporte apropiados incluyen una cupredoxina o un fragmento de una cupredoxina que contiene "u dominio de entrada de la cupredoxina"'. El término "dominio de entrada de la cupredoxina" se refiere a un fragmento de una cupredoxina que incluye la secuencia amino que se requiere para la entrada de la cupredoxina en una célula de cáncer de mamífero. Los compuestos transportadores entregados por la presente invención incluyen, pero no se- limitan a, proteínas, lipoproteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos antisentido, pigmentos, etiquetas fluorescentes y radiactivas, micropartículas o nanopartículas, toxinas, moléculas inorgánicas y orgánicas, moléculas pequeñas, y fármacos. En algunas materializaciones, los fármacos y las toxinas matan a las células tumorales. En una materialización de la invención, la cupredoxina es una azurina, tal como la azurina tipo salvaje de Pseudomonas aeruginosa. La "azurina tipo salvaje" se refiere a la azurina tipo salvaje de P. aeruginosa. Similarmente, el término "dominio de entrada de la azurina tipo salvaje" se refiere a un fragmento de la azurina tipo salvaje que incluye la secuencia amino que se requiere para la entrada de la azurina tipo salvaje en una célula. En otras materializaciones de la invención, la cupredoxina es un plastocianina, un rusticianina, o un pseudoazurina, entre otras. En materializaciones especificas, la azurina es de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringa, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio parahaemolyticus o de Boxdetella bronchiseptica, entre otros. En una materialización, un compuesto transportador se entrega para matar o retardar la progresión del ciclo celular en una célula, tal como una célula de cáncer. Tal célula de cáncer puede ser, por ejemplo, una célula de osteosarcoma, una célula de carcinoma de pulmón, una célula de carcinoma de colon, una célula de linfoma, una célula de leucemia, célula de sarcoma de tejido blando o célula de carcinoma de seno, de hígado, de vejiga o de próstata, entre otras. Por ejemplo, el compuesto transportador pued ser una proteína de control del ciclo celular, tal como p53; un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, tal como pl6, p21 ó p27; una proteína suicida tal como la timidina quinasa o la nitroreductasa; una citoquina u otra proteína inmunomoduladora tal como la interleuquina 1, interleuquina 2 o el factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) ; o una toxina, tal como exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, entre otras. En otras materializaciones, se entrega un fragmento biológicamente activo de una de las clases de compuestos mencionadas. En otra materialización, el compuesto transportador se entrega para generar una imagen del tejido blanco. Por ejemplo, el tejido blanco puede ser un cáncer y el compuesto transportador puede ser uno de uso general para generar una imagen para la detección por tomografia computarizada de rayos X (CT) , proyección de imagen por resonancia magnética (MRI) y ultrasonido. En estas materializaciones, el compuesto transportador es un rayo gama o un positrón que emite el radioisótopo, un agente de contraste para la proyección de imagen por resonancia magnética, un agente de contraste para rayos X, o un agente de contraste para ultrasonido. Cupredoxinas Las "cupredoxinas" son pequeñas proteínas azules que contienen cobre y tienen propiedades de transferencia de electrones (10-20 kDa) , las cuales participan en, por ejemplo, las cadenas redox bacterianas o la fotosíntesis. El ión de cobre se une solamente por la matriz de la proteína. Un arreglo planar trigonal torcido especial para los ligandos de dos histidinas y un cisteinato alrededor del cobre, da lugar a las características electrónicas muy peculiares del sitio del metal y de un color azul intenso. Un número de cupredoxinas se han caracterizado cristalográficamente en el medio a alta resolución- Las cupredoxinas incluyen las azurinas, las plastocianinas, las rusticianinas, las pseudoazurinas, las auracianinas y las proteínas similares a azurinas. Según lo utilizado aquír el término "cupredoxina" incluye la forma de la proteína sin el átomo de cobre presente, así como la proteína que- contiene cobre. Azurinas Las azurinas son proteínas que contienen cobre de 128 residuos de aminoácidos que pertenecen a la familia de las cupredoxinas involucradas en la transferencia de electrones en las plantas y en ciertas bacterias. Las azurinas incluyen aquellas provenientes de P. aeruginosa (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 1) azurina tipo salvaje"), A. xilosoxidans, y A. denitrificans (Murphy, L.M. et al, J. Mol. Biol. 315:859 - 71 (2002)). Aunque la homología de las secuencias entre las azurinas varía entre el 60-90%, la homología estructural entre estas moléculas es alta. Todas las azurinas tienen un ß-sandich con el motivo o patrón de "llave griega" y el único átomo de cobre se coloca siempre en la misma región de la proteína. Además, las azurinas poseen un parche hidrofóbico esencialmente neutro que rodea el sitio del cobre (Murphy et al.) . Plastocianinas Las plastocianinas son las cupredoxinas que se encuentran en las plantas eucarióticas y en las cianobacterias . Contienen una molécula de cobre por molécula y son azules en su forma oxidada. Ocurren en el cloroplasto, donde funcionan como portadoras de electrones. Desde la determinación de la estructura de la plastocianina del álamo en 1978, la estructura de las plastocianinas de las algas (Scenedesmus, Enteromorpha, Chlamydomonas) y de las plantas (French bean) ha sido determinada ya sea por métodos cristalográficos o por NMR, y la estructura de la del álamo se ha refinado a una resolución de 1.33 Á. La DENTIFICACJÓN DE SEC. NO. : 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la plastocianina de la cianobacteria Phormidium laminosum. A pesar de la divergencia de la secuencia entre las plastocianinas de .las algas y de las plantas vasculares (Ej . , identidad de secuencia del 62% entre las Chlamydomonas y las proteínas del álamo) , las estructuras tridimensionales se conservan (Ej . , desviaciones de 0.76 Á rms en las posiciones alfa C entre las proteínas de Chlamydomonas y del álamo). Los rasgos estructurales incluyen un sitio de unión al cobre tetraédrico torcido en un extremo de un barril beta de ocho hebras antiparalelas, un parche negativo pronunciado, y una superficie hidrofóbica plana. El sitio del cobre se optimiza para su función de transferencia electrónica, y los parches negativos e hidrofóbicos se proponen como que están implicados en el reconocimiento de las parejas de reacción fisiológicas. La modificación química, el entrelazamiento, y los experimentos de mutagénesis sitio-dirigida han confirmado la importancia de los parches negativos e hidrofóbicos en las interacciones de unión con el citocromo f, y han validado el modelo de las dos trayectorias funcionalmente significativas de la transferencia de electrones en las plastocianinas- Una trayectoria supuesta de la transferencia electrónica es relativamente corta (aproximadamente 4 Á) e involucra al ligando del cobre expuesto al solvente His-87 en el parche hidrofóbico, mientras que la otra trayectoria es más larga (aproximadamente 12-15 Á} e involucra al residuo casi conservado Tyr-83 en el parche negativo (Redinbo et al, J. Bioenerg. Biomembr. 26 (1): 49-66 (1994)). Rusticianinas Las rusticianinas son polipéptidos de simple cadena que contienen cobre azul y que se obtienen a partir de un Thiobacillus. La estructura cristalina por rayos X de la forma oxidada de la cupredoxina rusticianina, extremadamente estable y altamente oxidante^ proveniente de Thiobacillus ferrooxidans (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 3) ha sido determinada por la difracción anómala multi-longitud de onda y refinada a una resolución de 1.9 Á. Las rusticianinas se componen de un plegamiento tipo sandwich beta central compuesto de dos láminas u hojas plegadas ß de seis y siete hebras. Como otras cupredoxinas,- el ión cobre es coordinado por un agrupamiento o closter de cuatro residuos conservados (His 85, Cys 1387 His 143, Met 148) dispuestos en un tetraedro torcido (Walter, R.L. et al, J. Mol. Biol. 263:730 - 51 (19.96) ) . Auracianinas Tres proteínas azules de cobre pequeñas designadas como auracianina A, auracianina B-l, y la auracianina B-2 se han aislado a partir de la bacteria fotosintética verde termofílica deslizante Chloroflexus aurantiacus. Las dos formas B tienen características casi idénticas la una a la otra, pero son distintas de la forma A. La electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio muestra masas moleculares monoméri.cas aparentes como 14 (A) , 18 (B-2) , y 22 (Bl) kDa. La secuencia de aminoácidos de la auracianina A se ha determinado y mostró que la auracianina A es un polipéptido de 139 residuos. (Van Dreissche et al, Protein Science 8:947 - 957 (1999) . His58, Cysl23, Hisl28, y Metl32 se espacian de una manera esperada, si son los ligandos de los metales conservados evolutivamente como en las proteínas de cobre pequeñas conocidas, plastocíanina y azurina. La predicción de la estructura secundaria también indica que la auracianina tiene una estructura general de barril beta similar a la de la azurina de Pseudomonas aeruginosa y de la plastocianina de las hojas del álamo. Sin embargo, la auracianina aparece tener secuencias características de ambas clases de secuencias de las proteínas de cobre pequeñas.. La semejanza total con una secuencia consenso de azurina es aproximadamente igual que con una secuencia consenso de plastocianina, a saber 30.5%. La región 1-18 de la secuencia N-terminal de la auracianina es notablemente rica en glicina y aminoácidos que contienen grupos hidroxilo. Véase la secuencia de aminoácidos ejemplar IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 33 para la cadena A de la auracianina de Chloroflexus aurantiacus (No. de Acceso NCBI . ???12874 del NCBI Protein Data Bank) . La molécula de auracianina B tiene un plegamiento estándar de cupredoxina. La estructura cristalina de la auracianina B de Chloroflexus aurantiacus ha sido estudiada (Bond et al, J. Mol. Biol. 306:47 - 67 (2001)). A excepción de una hebra N-terminal adicional, la molécula es muy similar a la de la cupredoxina bacteriana, azurina. Como en otras cupredoxinas, uno de los ligandos del Cu se encuentra en la hebra 4 del polipéptido y las otras tres se encuentran a lo largo de un lazo grande entre las hebras 7 y 8. La geometría del sitio del Cu se discute en cuanto al espaciamiento de los aminoácidos entre los últimos tres ligandos. El dominio de unión al Cu de la auracianina B caracterizado cristalográficamente está probablemente atado al lado periplásmico de la membrana citoplásmica por una cola del N-terminal que exhibe identidad de secuencia significativa con otras varias proteínas conocidas asociadas a membrana que transfieren electrones. Las secuencias de aminoácidos de las formas B se presentan en McManus et al. (J Biol Chem. 267:6531 - 6540 (1992).}. Véase la secuencia de aminoácidos ejemplar IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 34 para la cadena A de la auracianina B de Chloroflexus aurantiacus (No .de Acceso 1QHQA del NCBI Protein Data Bank) . Pseudoazurinas Los pseudoazurinas son una familia de polipéptidos de simple cadena que contienen cobre azul. La secuencia de aminoácidos de la pseudoazurina obtenida de Achromobacter cicloclastes se muestra en la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 4. El análisis de la estructura por rayos X de la pseudoazurina muestra que tiene una estructura simila -a las azurinas aunque existe una baja homología en las secuencias entre estas proteínas. Dos diferencias principales existen entre la estructura total de los pseudoazurinas y las azurinas. Existe una extensión del carboxilo Terminal en las pseudoazurinas, con respecto a las azurinas, consistiendo en dos alfa-hélices. En la región de la mitad del péptido, las azurinas contienen un lazo extendido, acortado en los pseudoazurinas, que forma una aleta que contiene una -hélice corta. Las únicas diferencias mayores en el sitio del átomo de cobre son la conformación de la cadena lateral MET y la longitud del enlace Met-S cobre, que es significatidamente más corta en la pseudoazurina que en la azurina. Actividad Citotóxica de las Cupredoxinas Las cupredoxinas se han estudiado extensivamente por sus propiedades de transferencia electrónica (redox) pero hasta hace poco tiempo no se conocía que exhibían efectos citotóxicos. La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de los inventores de que las cupredoxinas, así como las proteínas de redox que contienen hierro (haem) , el citocromo c551, inducen apoptosis o inhiben la progresión del ciclo celular en células tumorales de macrófagos en ratón J774 y en células de cáncer humanas. La actividad redox de las cupredoxinas no es crítica para su actividad citotóxica. Por ejemplo, las cupredoxinas sin un átomo de cobre frecuentemente exhiben una actividad redox mucho más baja comparada con aquellas que contienen el átomo de cobre, sin embargo muestran actividad citotóxica significativa. Con respecto a su actividad en células de cáncer, las cupredoxinas inducen solamente un nivel bajo de apoptosis in vivo en tejidos normales de ratones tratados con cupredoxxna que portan tumores. La actividad citotóxica de las cupredoxinas se describe en la solicitud de patente co-pendiente serial número US 10/047,710, presentada el 15 de enero de 2002, y en la solicitud de patente co-pendiente serial número ÜS 10/720.603 presentada el 24 de noviembre de 2003. Estas solicitudes anteriores se incorporan aquí como referencia. Los presentes inventores ahora muestran que el efecto selectivo de las cupredoxinas en las células de cáncer, está relacionado con la capacidad de las cupredoxinas para entrar en estas células. En el ejemplo 5, los inventores muestran que las cupredoxinas entran en las células J774. Estas células son formas ascíticas del sarcoma celular del retículo murino con propiedades similares a los macrófagos. En los ejemplos 18 y 19, los inventores han mostrado que una proteína similar a la azu ina, la proteína de la membrana externa H.8 de Neisseria, también conocida como Laz, puede específicamente penetrar las células tumorales del cerebro. En comparación, las cupredoxinas muestran una extremadamente un reducido índice de entrada en las células normales. En una materialización, la presente invención se relaciona con un "complejo'"' que contiene una cupredoxina o un fragmento de una cupredoxina enlazado a un "compuesto transportador" que debe ser entregado en una célula. El compuesto transportador puede ser enlazado covalente o no-covalentemente para formar el complejo. Los métodos para preparar tal complejo son bien conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, si el compuesto transportador es una proteína o un polipéptido, el complejo se puede formar como una proteína de fusión. Alternativamente, el compuesto transportador se puede enlazar covalentemente a la cupredoxina, o al fragmento de la cupredoxina, directamente o a través de una molécula linker o enlazadora, vía, por ejemplo de un acoplamiento disulfuro o mediante un éster. Dominio de entrada de la cupredoxina La invención proporciona un dominio de la transducción de la proteína que permite el transporte de un compuesto transportador o "cargo" enlazado, en las células de cáncer de mamíferos pero no en las células no cancerosas. Se ha descubierto que las proteínas cupredoxinas comprenden un dominio de la transducción de la proteína, que es el dominio de entrada de la cupredoxina, que facilita la entrada del transportador enlazado en las células de cáncer de mamíferos. En algunas materializaciones, la proteína entera de cupredoxina se puede utilizar para facilitar el transporte del compuesto transportador enlazado de forma selectiva en las células de cáncer. En otras materializaciones, una porción de una cupredoxina se puede utilizar para transportar el transportador enlazado en las células de cáncer. En algunas materializaciones, el dominio de entrada de la cupredoxina consiste en una región de una cupredoxina que sea menor que la longitud completa de la proteína tipo salvaje. En algunas materializaciones, el dominio de entrada de la cupredoxina consiste en más de aproximadamente 10 residuos, aproximadamente 15 residuos o aproximadamente 20 residuos de una cupredoxina. En algunas materializaciones, el dominio de entrada de la cupredoxina consiste en no más de aproximadamente 50 residuos, aproximadamente 40 residuos o aproximadamente 30 residuos de una cupredoxina. En algunas materializaciones, el dominio de entrada de la cupredoxina tiene al menos identidad en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 90%, al menos identidad en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 95% o al menos identidad en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 99% para una cupredoxina. Según lo utilizado aquí, los términos "polipéptido, " "péptido," y "proteína" se utilizan alternativamente para referir a un polímero de residuos de aminoácidos. ün "polipéptido", "péptido" o "proteína" se pueden sintetizar dentro de una célula y aislarse a partir de otras proteínas y componentes celulares. Alternativamente, un "polipéptido", "péptido" o "proteína" se pueden sintetizar artificialmente según los métodos bien conocidos en el arte, y también pueden estar libres de otras proteínas. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente. Los términos también se aplican a los polímeros naturales de aminoácidos. Los términos "polipéptido," "péptido," y "proteína" son también inclusivos de modificaciones, que incluyen, pero no se limitan a, glicosilaeión, unión a lipidos, sulfatación, gamma carboxilación de los residuos del ácido glutámico, y ribosilación ADP. Será apreciado que los polipéptidos no son siempre completamente lineares. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden ramificar como resultado de la ubiquitinación y pueden ser circulares (con o sin ramificación) , generalmente como resultado de acontecimientos de post-traducción, incluyendo eventos de procesamiento natural y eventos causados por la manipulación humana que no ocurren naturalmente. Los polipéptidos circulares, ramificados y ramificados circulares se pueden sintetizar por procesos naturales de no-traducción y también por métodos completamente sintéticos. Los ejemplos describen un método de identificar los fragmentos de azurina tipo salvaje de P. aeruginosa que son apropiados para el uso en la presente invención. Tal método también se puede utilizar para identificar los fragmentos de otras cupredoxinas. Los ejemplos 1 y 2 describen la construcción de una serie de fusiones de la glutatión S-transferasa ("GST") con la azurina tipo salvaje truncada en ambos extremos N- y Oterminal. Estos ejemplos también describen la purificación de los productos de las protexnas de fusión. El ejemplo 9 muestra las internalización de tales fusiones en las células J774 a 37 °C. Mientras que la azurina tipo salvaje fue internalizada, la GST permaneció en la periferia de las células y no fue internalizada. Las azu 36-128 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 5) y azu 36-89 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 6) fueron internalizadas, al igual que la azu 36-77 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 7). Truncamientos adicionales muestran que, mientras que la azu 50-77 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 9) es internalizada, la internalización de la azu 36-50 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 8) es altamente ineficiente. Otros truncamientos de la azu 50-77 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 9) a la azu 50-66 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 10) y azu 67-77 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 11) demuestran muy pequeña internalización, indicando que la internalización eficiente requiere no interferir con la secuencia en o aproximadamente las posiciones 66-67. Desde un punto de vista práctico, los datos apoyan el uso de los aminoácidos 50 a 77 para el transporte eficiente. En algunas materializaciones, el dominio de entrada de la cupredoxina es un dominio de entrada de la azurina tipo salvaje. En una materialización de la presente invención, un dominio de entrada de la azurina tipo salvaje contiene al menos los aminoácidos 50 a 77 de la azurina tipo salvaje (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 9). En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la azurina tipo salvaje contiene al menos los aminoácidos 36 a 77 de la azurina tipo salvaje (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 7). En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la azurina tipo salvaje contiene al menos los aminoácidos 36 a 89 de la azurina tipo salvaje (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 6) . En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la azurina tipo salvaje contiene al menos los aminoácidos 36 a 128 de la azurina tipo salvaje (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 5). En aún otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la azurina tipo salvaje contiene al menos los aminoácidos 50 a 67 de la azurina tipo salvaje (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 37). En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la azurina tipo salvaje contiene al menos los aminoácidos 53 a 70 de la azurina tipo salvaje (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 41). En aún otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la azurina tipo salvaje contiene al menos los aminoácidos 53 a 64 de la azurina tipo salvaje (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 42). En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la cupredoxina es un dominio de entrada de una cupredoxina diferente de la azurina de P. aeruginosa. En diversas materializaciones, el dominio de entrada de la cupredoxina puede ser un fragmento de plastocianina de la cianobacteria Phormidium laminosum (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 2), la rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 3); la pseudoazurina de Achromobacter cicloclastes (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 4), la azurina de Pseudomonas syringae (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 29), la azurina de Neisseria meningitidis (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 30), la azurina de Neisseria gonnor oeae (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 36), la azurina de Vibrio parahaemolyticus (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 31), la azurina de Bordetella bronchiseptica (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 32), la azurina de Bordetella pertussis (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 43) o una auracianina de C loroflexus aurantiacus (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 33 y 34). En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la cupredoxina contiene al menos los aminoácidos 57 a 89 de la auracianina B de Chloroflexus aurantiacus (IDENTIFICACIÓ DE SEC. NO.: 38). En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la cupredoxina contiene al menos los aminoácidos 50 a 77 de Bordetella pertussis (IDENTIFICACIÓN DE SEC- NO. : 39) . En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la cupredoxina contiene al menos los aminoácidos 106 a 132 de N. meningitidis (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 40). En otra materialización de la invenció r el dominio de entrada de la cupredoxina contiene al menos los aminoácidos 51-77 de la azurina de Pseudomonas syringae (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 45) . En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la cupredoxina contiene al menos los aminoácidos 89-115 de la proteina Laz de Neisseria meningitidis (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 40). En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la cupredoxina contiene al menos los aminoácidos 52-78 de la azurina de Vibrio para aemolyticus (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 46). En otra materialización de la invención, el dominio de entrada de la cupredoxina contiene al menos los aminoácidos 51-77 de la azurina de Bordetella bronchiseptica (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 47) . Modificación de un dominio de entrada de la cupredoxina En otra materialización de la presente invención, el dominio de entrada de una cupredoxina es químicamente modificado o genéticamente alterado para producir las variante's que conservan la capacidad d.e transportar un compuesto transportador en una célula. Por ejemplo, el ejemplo 14 muestra que la azurina tipo salvaje que tiene residuos de prolina introducidos en las posiciones 54, 61 y 70, conserva su capacidad de entrar en las células UISO-Mel-2. En otra materialización, el dominio de entrada de la cupredoxina comprende una secuencia conservada ( (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 35) o (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 48) donde D es ácido aspártico, G es glicina, Y es tirosina, K es lisina y X es cualquier aminoácido. Ver el ejemplo 17.

Las variantes de un dominio de entrada de la cupredoxina se pueden sintetizar por técnicas estándares. Los derivados son secuencias de aminoácidos formadas a partir de los compuestos nativos, ya sea directamente o por modificación o sustitución parcial. Los análogos son secuencias de aminoácidos que tienen una estructura similar, pero no idéntica, al compuesto nativo pero difieren de él en cuanto a ciertos componentes o cadenas laterales. Los análogos se pueden sintetizar u obtener a partir de un origen evolutivo diferente. Las variantes pueden ser de longitudes completas o diferentes de longitud completa, si el derivado o el análogo contienen un aminoácido modificado. Las variantes de un dominio de entrada de cupredoxina incluyen, pero no se limitan a, las moléculas que comprenden las regiones que son sustancxalmente homologas al dominio de entrada de la cupredoxina por al menos aproximadamente el 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, ó 99% de identidad sobre una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico, o cuando es comparada a una secuencia alineada en la cual la alineación es realizada por un algoritmo de homología. El término de "por ciento (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" entre el dominio de entrada de una cupredoxina y una secuencia candidata, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en un dominio de entrada de la cupredoxina que son idénticos a los residuos de aminoácidos en una secuencia candidata cuando las dos secuencias se alinean. Para determinar el % de identidad de aminoácidos, las secuencias se alinean y en caso necesario, se introducen espacios para alcanzar el máximo % de identidad de secuencias; las sustituciones conservadoras no se consideran como parte de la identidad de secuencia. Los procedimientos de alineación de secuencias de aminoácidos para determinar los por cientos de identidad, son bien conocidos para los de habilidad en el arte. Frecuentemente se utilizan softwares disponibles públicamente tales como los softwares PLAST, BLAST2, ALIGN2 o Megalign (DNASTAR) para alinear las secuencias peptidicas. Cuando las secuencias de aminoácidos se alinean, los % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada (la cual se puede formular alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada la cual tiene o abarca un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se pueden calcular como: % de identidad de la secuencia de aminoácidos = X/Y. 100, donde X es el número de los residuos de aminoácidos registrados como coincidencias idénticas mediante el programa o el algoritmo de alineación de secuencias de A y B, y Y es el número total de los residuos de aminoácidos en B. Si la longitud de la secuencia de aminoácidos de A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos de B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A para B no será igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B para A. Se pueden introducir cambios en un dominio de entrada de la cupredoxina que incurren en alteraciones en las secuencias de aminoácidos del dominio de entrada de la cupredoxina que anulan la capacidad del dominio, de entrada de la cupredoxina de transportar un compuesto transportador en una célula. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar en la secuencia del dominio de entrada de la cupredoxina sin anular su capacidad de transportar un compuesto transportador en una célula, mientras que un residuo de aminoácido "esencial." se requiere para tal actividad. Los aminoácidos para los cuales las sustituciones "conservadoras" se pueden hacer, son bien conocidos en el arte. Las sustituciones conservadoras útiles se muestran en la tabla 1, "Sustituciones preferidas". Sustituciones conservadoras mediante las cuales un aminoácido de una clase se sustituye por otro aminoácido de la misma clase, caen dentro del alcance de la invención, siempre y cuando la sustitución no anule la actividad del dominio de entrada de la cupredoxina. Tales intercambios que dan lugar a una actividad alterada del dominio de entrada de la cupredoxina se contemplan como parte de la invención, siempre y cuando tal actividad sea apreciable.

Tabla 1: Sustituciones preferidas Las sustituciones "no-conservadoras" que afectan (1) la estructura de la espina dorsal del polipéptido, tal como una conformación lámina-ß o a-helicoidal, (2) la carga, (3) idrofobicidad, o (4) el volumen de la cadena lateral del sitio blanco, pueden modificar la función del dominio de entrada de la cupredoxina. Los residuos se dividen en los grupos basados en las propiedades " comunes de la cadena lateral según lo denotado en la tabla 2. Las sustituciones no-conservadoras exigen el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones no-conservadoras mediante las cuales un aminoácido de una clase se sustituye por otro aminoácido de clase diferente caen dentro del alcance de la invención, siempre y cuando la sustitución no anule- la actividad del dominio de entrada de la cupredoxina. Tales intercambios que dan lugar a la actividad alterada del dominio de la cupredoxina se contemplan como parte de la invención siempre y cuando tal actividad es apreciable.

Tabla 2: Clases de aminoácidos: En otra materialización, las variantes de un dominio de entrada de la cupredoxina tienen una semejanza estructural significativa con los residuos 50-77 de la azurina de P. aeruginosa. Ejemplos de los estudios que determinan la homología estructural significativa entre las cupredoxinas y otras proteínas incluyen a Toth et al. (Developmental Cell 1: 82-92 (2001)). Específicamente, la homología estructural significativa entre una variante del dominio de entrada de la cupredoxina y los residuos50-77 de la azurina de P. aeruginosa se determina usando el algoritmo VAST (Gibrat et al, Curr Opin Struct Biol 6:377 - 385 (1996); Madej et al, Proetins 23:356 - 3690 (1995)). En materializaciones específicas, el valor de p por VAST a partir de una comparación estructural de una variante del dominio de entrada de la cupredoxina y los residuos 50-77de la azurina de P. aeruginosa es menor que aproximadamente 10-3, menor que aproximadamente 10-5, o menor que aproximadamente 10-7. En otras materializaciones, la homología estructural significativa entre una variante del dominio de entrada de la cupredoxina y los residuos 50-77 de la azurina de P. aeruginosa se puede determinar usando el algoritmo DALI (Holm & Sandler, J. Mol. Biol. 233:123 - 138 (1993)). En materializaciones específicas, la puntuación Z mediante DALI para una comparación estructural en parejas, es al menos aproximadamente 3.5, al menos aproximadamente 7.0, o al menos aproximadamente 10.0. Las modificaciones al dominio de entrada de la cupredoxina se pueden hacer usando métodos conocidos en el arte tal como mutagénesis (sitio-dirigida) mediada por oligonucleótidos, exploración de alaninas (alanine scanning) , y mutagénesis por PCR. La mutagénesis sitio-dirigida (Cárter, Biochem J. 237:1 - 7 (1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329 - 50 (1987)), mutagénesis en cásete, mutagénesis por selección de restricción (Wells et al, Gene 34:315 - 23 (1985)) u otras técnicas conocidas se pueden realizar sobre el ADN clonado para producir una variante de ácido nucleico del dominio de entrada de la cupredoxina. Adicionalmente, los nucleótidos que codifican para los dominios de entrada con semejanza estructural a los dominios de entrada de la cupredoxina, se pueden sintetizar por métodos que son bien conocidos en el arte. Además, las moléculas de proteínas que son dominios de entrada del tipo salvaje o variantes de la cupredoxina, se pueden sintetizar por métodos que son bien conocidos en el arte. Ácidos nucleicos que codifican para el dominio de entrada de la cupredoxina y complejo de un dominio de entrada de la cupredoxina enlazado a un compuesto transportador En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteina de fusión que comprende un dominio de entrada de la cupredoxina enlazado a un compuesto transportador, donde el compuesto transportador es una proteina o un péptido. La molécula de ácido nucleico según la invención se puede preparar por una combinación de técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, las secuencias del ácido nucleico para el dominio de entrada de la cupredoxina y el compuesto transportador se pueden preparar individualmente por síntesis química o clonación. Las secuencias del ácido nucleico entonces se ligan con un ligasa en orden para dar una molécula de ácido nucleico de interés .

Métodos de entregar un compuesto transportador usando un dominio de entrada de la cupredoxina Se conoce que muchos péptidos ricos arginina se transfieren a través de las membranas de las células de mamíferos y trasladan compuestos transportadores proteicos dentro de tales células (Suzuki, T. , et al J. Biol Chem. 277:2437 - 43 (2002)). Por ejemplo, un segmento corto rico en arginina de 11 aminoácidos (aminoácidos 47-57) de la proteína Tat del VIH, permite el transporte de las proteínas transportadoras en las células de mamíferos (Sch arze, SR. , et al. Trends Cell. Biol. 10:290 - 95 (2000)). Los dominios de entrada sintéticos que fortalecen el contenido alfa-helicoidal y optimizan la colocación de los residuos de arginina, se ha demostrado que tienen potencial incrementado como dominios de la transducción de la proteina (Ho, A., et al. Cáncer Res. 61: 474-77 (2001)). En comparación, la azurina tipo salvaje tiene un solo residuo arginina. Por lo tanto se creía, pero no se estaba seguro hasta después de la presente invención, que su modo de entrada es diferente al de la proteína Tat. La presente invención comprende el. uso de aquellos fragmentos de cupredoxina que facilitan la entrada de un compuesto transportador en una célula. Tales fragmentos se pueden determinar por cualquier método que identifique esos fragmentos requeridos para la entrada en una célula. En uno de tales métodos, un fragmento de cupredoxina se enlaza a una sustancia marcadora y se ejecuta una prueba para determinar si el fragmento de cupredoxina entra a una célula. Tales métodos se pueden utilizar para identificar los fragmentos apropiados de cupredoxinas discutidos arriba. En varias materializaciones de la presente invención, el compuesto transportador se une a una cupredoxina tal como la azurina de P. aeruginosa. (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 1) ("azurina tipo salvaje"); la plastocianina de la cianobacteria Phormidiu laminosum (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 2); la rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 3); o la pseudoazurina de Achromobacter cicloclastes (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 4), las azurinas de Pseudomonas syringa (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 29) r Neisseria meningitidis (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 30), Vibrio parahaemolyticus {IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 31) , Bordetella bronc iseptica (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 32) , la auracianina A y B de Chloroflexus aurantiacus (IDENTIFICACIÓN DE SECS. NOS.: 33 y 34) o de Neisseria gonorrhoeae (identificación SEQ NO 36) , entre otras azurinas y proteínas similares a la azurina. En otras materializaciones, el transportador se enlaza a un dominio de entrada de la cupredoxina. En varias materializaciones de la presente invención, un dominio de entrada de la cupredoxina entrega un compuesto transportador en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, la entrega se puede alcanzar in vitro mediante la adición un complejo de un dominio de entrada de la cupredoxina y un compuesto transportador a un cultivo celular, tal como un frotis o citología vaginal (pap smear) . Alternativamente, la entrega puede se alcanzar ex vivo agregando el complejo a una muestra extraída de un paciente, por ejemplo, de la sangre, de un tejido, o de la médula, y retornar la muestra tratada al paciente. La entrega se puede también lograr mediante la administración del complejo directamente a un paciente. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para propósitos terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico o de investigación. Los compuestos transportadores entregados mediante la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las proteínas, lipoproteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleico antisentido, pigmentos, micropartículas o nanopartículas, toxinas, moléculas orgánicas e inorgánicas, moléculas pequeñas, y fármacos. En una materialización, una sustancia detectable, por ejemplo, una sustancia fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde; una sustancia luminiscente; una enzima, tal como la ß-galactosidasa; o una proteína radiactiva o biotinilada, se entrega para conferir un fenotipo detectable a una célula. Similarmente, las micropartículas o nanopartículas marcadas con una sustancia detectable, por ejemplo, una sustancia fluorescente, se pueden entregar también, ün ejemplo de nanopartículas apropiadas se encuentra en la patente No. ÜS 6,383,500 publicada el 7 de mayo de 2002, que expresamente se incorpora aquí como referencia. Muchas de tales sustancias detectables se conocen por los expertos en la materia. En algunas materializaciones, el compuesto transportador es una sustancia detectabl que es apropiada para tomografía computarizada de rayos X, proyección de imagen por resonancia magnética, proyección de imagen por ultrasonido o escintigrafia con radionucleidos . En estas materializaciones, el compuesto transportador se administra al paciente para el propósito de diagnóstico. ün agente de contraste se administra como un compuesto transportador para intensificar la imagen obtenida por Rayos X CT, MRI y ultrasonido. La administración de un compuesto transportador de radionucleido que se apunta al tejido tumoral, via el dominio de entrada de la cupredoxina, se puede utilizar para la escintigrafia con radionucleidos. En algunas materializaciones, el dominio de entrada de la cupredoxina puede contener el radionucleótido con o sin un compuesto transportador.. En otras materializaciones, el compuesto transportador es un rayo gama o un positrón que emite radioisótopos, un agente de proyección de imagen por resonancia magnética, un agente de contraste para rayos X, o un agente de contraste para ultrasonido. Los agentes de contraste apropiados para ultrasonido para usar como compuestos transportadores incluyen, pero no se limitan a, una microburbuja de un gas biocompatible, un portador liquido, y una microesfera de tensoactivo, además comprenden un resto enlazador opcional, Ln, entre los restos que apuntan y la microburb ja. En este contexto, el término de portador liquido significa que una solución acuosa y el término tensoactivo significa cualquier material anfifilico que produzca una reducción en la cepa interfacial en una solución. Una lista de tensoactivos apropiados para formar microesferas de tensoactivo se divulgan en el documento EP 0727225A2, el cual expresamente se incorpora aqui como referencia. El término "microesfera de tensoactivo" incluye nanoesferas, liposomas, vesículas y similares. El gas biocompatible puede ser aire, o un fluorocarbono, tal como un perfluoroalcano C3-C5, que proporciona la diferencia en ecogenicidad y asi el contraste en la proyección de la imagen del ultrasonido. El gas se encapsula o se contiene en la microesfera a la cual se une el dominio de entrada de la cupredoxina, opcionalmente vía un grupo enlazador. La unión puede ser covalente, iónico o por fuerzas de van der Waals. Los ejemplos específicos de tales agentes de contraste incluyen perfluorocarbonos encapsulados en lípidos con una pluralidad de péptidos, polipéptidos o de peptidomiméticos que se unen a los receptores de la neovasculatura tumoral. Los agentes de contraste apropiados para rayos X para utilizarlos como compuestos transportadores incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los que absorben rayos X o átomos ""pesados" de número atómico 20 o mayor, o que adicionalmente comprenden un resto enlazador opcional, In, entre el dominio de entrada de la cupredoxina y los átomos absorbentes de rayos X. El átomo pesado frecuentemente utilizado en agentes de contraste para rayos X es el yodo. Recientemente se han divulgado agentes de contraste para rayos X que comprenden quelatos de metales (Ej . , patente No. ÜS 5,417,959) y poliquelatos que comprenden una pluralidad de iones metálicos (Ej . , patente No. US 5,679,810). Más recientemente, se han divulgado los complejos de agrupamientos multinucleares como agentes de contraste para rayos X (Ej., patente No. US 5,804,161, PCT WO91/14460, y PCT WO 92/17215) . Los agentes de contraste apropiados para MRI para el uso como compuestos transportadores incluyen, pero no se limitan a, unos o más iones de metales paramagnéticos, que comprenden adicionalmente un resto enlazador opcional, Ln, entre el dominio de entrada de la cupredoxina y los iones de metales paramagnéticos. Los iones de metales paramagnéticos están presentes bajo la forma de complejos metálicos o partículas de óxido metálico. Las patentes No. US 5,412,148 y US 5,760,191, describen ejemplos de queladores para los iones de metales paramagnéticos para ser utilizados como agentes de contraste para MRI. La patentes Nos. US 5,801,228, US 5,567,411 y US 5,281,704, describen ejemplos de poliquelantes útiles para formar complejos de más de un ión metálico paramagnético con vistas a utilizarlos como agentes de contraste en MRI. La patente No US 5,520,904, describe las composiciones de partículas que comprenden iones metálicos paramagnéticos para utilizarlos como agentes de contraste en MRI.

En otra materialización, un compuesto transportador se entrega para detener o retardar la progresión del ciclo celular en una célula o matar la célula, tal como una célula de cáncer. Tal célula de cáncer puede ser, por ejemplo, una célula de osteosarcoma, una célula de carcinoma de pulmón, una célula de carcinoma de colon, una célula de linfoma, una célula de leucemia, célula de sarcoma de tejido blando o célula de carcinoma de seno, de higado, de vejiga o de próstata. Por ejemplo, el compuesto transportador puede ser una proteina de control del ciclo celular, tal como p53; un inhibidor de quinasa ciclina-dependiente tales como pl6, p21 o p27; una proteina de suicidio tal como la timidina quinasa o la nitroreductasa; una citoquina u otra proteina inmunomoduladora tal como la xnterleuquxna 1, xnterleuquxna 2 o el factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) ; o una toxina, tal como la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. En otras materializaciones, se entrega un fragmento biológicamente activo de una de las clases de compuestos antes referidas. En otra materialización, el compuesto transportador es un ácido nucleico que codifica para una de las clases mencionadas de compuestos. En otra materialización, el compuesto transportador es un fármaco utilizado para el tratamiento del cáncer. Tales fármacos incluyen, por ejemplo, el 5-fluorouracilo; el interferón alfa; el metotrexato; el tamoxifeno; y la vincristina. Los ejemplos anteriores se proporcionan solamente como ilustración, muchos otros de tales compuestos se conocen por los expertos en la materia. Los compuestos apropiados para tratar el cáncer incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno, alquilsulfonatos, nitrosoureas, etileniminas, y triazenos; antimetabolitos tales como antagonistas del folato, análogos de purina, y análogos de pirimidina; antibióticos tales como antraciclinas, bleomicinas, mitomicina, dactinomicina, y plicamicina; enzimas tales como asparaginasa; inhibidores de la proteina farnesil-transferasa; inhibidores de la 5. alfa. -reductasa; inhibidores de la 17.beta.—hidroxiesteroide dehidrogenasa tipo 3; agentes hormonales tales como glucocorticoides, estrógenos/antiestrógenos, andrógenos/antiandrógenos, progestinas, antagonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante, acetato de octreotide; agentes disruptores de los microtúbulos, tales como las ecteinascidinas o sus análogos y derivados; agentes estabilizantes de los microtúbulos tales como los taxanos, por ejemplo, paclitaxel (Taxol™) , docetaxel (Taxotere™) , y sus análogos, y epotilonas, tales como epotilonas A-F y sus análogos; productos derivados de las plantas, tales como alcaloides de vinca, epipodofilotoxinasr, taxanos; e inhibidores de la topiosomerasa; inhibidores de la proteina fenil-transferasa; y agentes misceláneos tales como hidroxiurea, procarbazina, mitotano, hexametilmelamina, complejos de coordinación del platino tales como cisplatino y carboplatino; y otros agentes usados como agentes anticáncer y citotóxicos tales como modificadores de la respuesta biológica, factores de crecimiento; moduladores inmunes y anticuerpos monoclonales. Ejemplos representativos de estas clases de agentes anticáncer y citotóxicos incluyen pero no se limitan al clorhidrato de mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, melfalán, ifosfamida, busulfán, carmustina, lomustina, semustina, streptozocina, tiotepa, dacarbazina, metotrexato, tioguanina, mercaptopurina, fludarabina, pentastatina, cladribina, citarabina, fiuorouracilo, clorhidrato de doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, sulfato de bleomicina, mitomicina C, actinomicina D, safracinas, saframicinas, quinoca ci as, discodermolidas, vincristina, vinblastina, tartrato de vinorelbina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido, paclitaxel, tamoxifeno, estramustina, fosfato de sodio de estramustina, flutamida, buserelina, leuprolida, pteridinas, diyneses, levamisol, aflacón, interferón, interleuquinas, aldesleuquina, filgrastim, sargramostim, rituximab, BCG, tretinoina, clorhidrato de irinotecan, betametasona, clorhidrato de gemcitabina, altretamina, y topoteca y cualesquiera análogos o derivados de los mismos . Los miembros preferidos de estas clases incluyen,, pero no se limitan a, paclitaxel, cisplatino, carboplatino, doxorubicina, carminomicina, daunorubicina, aminopterina, metotrexato, metopterina, mitomicina C, ecteinascidina 743, o pofiromicina, mercaptopurina, 5-fluorouracilo, 6-gemcitabina, arabinósido de citosina, podofilotoxina o los derivados de la podofilotoxina tales como etopósido, fosfato de etopósido o tenipósido, melfalán, vinblastina, vincristina, leurosidina, vindesina y leurosina. Ejemplos de otros agentes anticáncer y citotóxicos útiles como compuestos transportadores incluyen los siguientes: derivados de la epotilona según lo encontrado en la patente alemana No. 4138042,8; y en las solicitudes WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253 y WO 00/00485; inhibidores de quinasa dependientes de ciclina según lo encontrado en WO 99/24416 (véase también la patente No. US 6,040,321}; e inhibidores de la proteina fenil-transferasa según lo encontrado en WO 97/30992 y WO 98/54966; y agentes tales como los descritos genéricamente y específicamente en la patente No US 6,011,029 (los compuestos de cuya patente se pueden emplear junto con cualquier modulador de NHR (incluyendo, pero no limitado, a aquellos de la presente invención) por ejemplo moduladores de AR, moduladores de ER, moduladores de LHRH, o con la castración quirúrgica, especialmente en el tratamiento del cáncer) . Los agentes terapéuticos diferentes de los anteriores, cuando se emplean como compuestos transportadores con los compuestos de la presente invención, pueden ser utilizados, por ejemplo, en las cantidades indicadas en el Physicians' Desk Reference (PDR) o según lo determinado de otra manera por uno con habilidad ordinaria en el arte. Composiciones farmacéuticas que contienen un dominio de entrada de la cupredoxina Las composiciones farmacéuticas que contienen un complejo de un dominio de entrada de la cupredoxina enlazado a un compuesto transportador, se pueden fabricar de cualquier manera convencional, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, emulsificación, encapsulación, atrapamiento, o liofilización. El complejo se puede combinar fácilmente con un portador farmacéuticamente aceptable bien conocido en el arte. Tales portadores permiten a la preparación ser formulados como una tableta, pildora, gragea, cápsula, liquido, gel, jarabe, mezcla, suspensión, y similares. Los excipientes apropiados pueden también incluir, por ejemplo, rellenos y preparaciones de celulosa. Otros excipientes pueden incluir, por ejemplo, sustancias aromáticas, agentes colorantes, antiadherentes, espesantes, y otros aditivos, adyuvantes, o aglutinantes aceptables. Tales composiciones se pueden utilizar en, por ejemplo, la detección o la proyección de imagen de un tipo celular o en el tratamiento de una condición relacionada con la muerte celular o en la prevención de la misma. Las composiciones se pueden administrar en cantidad suficiente para prevenir o tratar una condición relacionada con la resistencia a la muerte celular. Según lo utilizado aqui, el término "una condición relacionada con la resistencia a la muerte celular"' se refiere a una enfermedad, estado, o dolencia caracterizada por al menos una tendencia para la vida celular prolongada en comparación con una célula sana similar, según lo determinado por un médico o un clinico razonablemente experimentado. Típicamente, el organismo hospedero es un mamífero, tal como un ser humano o un animal. Administración de las composiciones que contienen un dominio de entrada de la cupredoxina Las composiciones que contienen un dominio de entrada de la cupredoxina se pueden administrar por cualquier ruta apropiada, por ejemplo, por vía oral, bucal, por inhalación, sublingual, rectal, vaginal, transuretral, nasal, tópica, percutánea, es decir, transdérmica o parenteral (incluyendo administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intracoronaria) . Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de los mismos se pueden administrar en cualquier cantidad eficaz para alcanzar su propósito previsto. Cuando son administrados para tratar una condición relacionada con la resistencia a la muerte celular, la composición se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva. wüna cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad efectiva para prevenir el desarrollo, o aliviar los síntomas existentes, del sujeto que es tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva es en conformidad con la capacidad de los expertos en la materia.

En varias materializaciones, la composición incluye portadores y excipientes (que incluyen pero no se limitan a las soluciones tamponadas o buffers, carbohidratos, manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, agentes quelantes, antioxidantes, y bacteriostáticos, agentes de suspensión, espesantes y/o preservantes) , aguar aceites, soluciones salinas, soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, otras sustancias auxiliares terapéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse condiciones fisiológicas, tales como neutralizantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares. Será reconocido que, mientras que se puede emplear cualquier portador apropiado conocido para los de habilidad ordinaria en el arte con el objetivo de administrar las composiciones de esta invención, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración. Los compuestos se pueden también encapsular dentro de liposomas usando tecnología bien conocida. Las microesferas biodegradables se pueden también emplear como portadores para las composiciones de esta invención. Microesferas biodegradables apropiados se muestran, por ejemplo, en las patentes Nos. US 4,897,268, US 5,075,109, US 5,928,647, US 5,811,128, US 5,820,883, US 5853.763, US 5,814,344 y US 5,942,252 "Compuestos" según lo utilizado aquí, incluyen los péptidos, las secuencias de aminoácidos, los compuestos transportadores y los complejos de la presente invención. La vida media en la circulación sanguínea de las composiciones de la invención se puede extender u optimizar por varios métodos bien conocidos para aquellos con destreza en el arte, incluyendo pero no limitado a, los péptidos circularizados (Monk et al, BioDrugs 19 (4): 261-78, (2005); DeFreest et al, J. Pept. Res. 63 (5): 409-19 (2004)), D, L peptides (diastereomer) , (Futaki et al, Biol del J. C em. el 23 Feb; 276 (8): 5836-40 (2001); Papo et al, Cáncer Res. 64 (16): 5779-86 (2004); Molineros et al, Biochem. Pharmacol. 36 (1): 169-76, (1987)); péptidos que contienen aminoácidos inusuales (Lee et al, J. Pept. Res. 63 (2): 69-84 (2004)), y modificaciones N- y C- terminales (Labrie et al, Clin. Invest. Med. 13 (5): 275-8, (1990)). De interés particular son la d-isomerización (sustitución) y la modificación de la estabilidad del péptido vía sustitución de D- o L-aminoácidos . Las composiciones de la invención se pueden esterilizar por técnicas convencionales, bien conocidas de esterilización, o pueden ser esterilizadas por filtración. Las soluciones acuosas resultantes se pueden empaquetar para utilizar como son, o liofilizar, la preparación liofilizada puede ser combinada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones de la invención se pueden administrar en una variedad de maneras, incluyendo por inyección (Ej . , intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal y similares) , por inhalación, por administración tópica, por supositorio, usando un parche transdérmico o por vía oral. Cuando la administración es por inyección, la composición se puede formular en soluciones acuosas, preferiblemente en soluciones tamponadas fisiológicas o buffers compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o buffer salino fisiológico. La solución puede contener agentes para formular tales como agentes suspensores, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la composición puede estar en forma de polvo para su reconstitución antes de usar, con un vehículo apropiado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos . Cuando la administración es por inhalación, la composición se puede entregar bajo la forma de un atomizador de aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador con el uso de un propulsor apropiado, Ej . , diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono u otro gas apropiado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para entregar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de, por ejemplo, gelatina para el uso en un inhalador o un insuflador, se pueden formular conteniendo una mezcla de las proteínas en polvo y una base apropiada de polvo tal como lactosa o almidón. Cuando la administración por administración tópica, la composición se puede formular como soluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones, y similares, que son bien conocidos en el arte. En algunas materializaciones, la administración es por medio de un parche transdermico. Cuando la administración es por supositorio (Ej . , rectal o vaginal), la composición se-puede también formular en composiciones que contienen bases convencionales de supositorio. Cuando la administración es oral, la composición se puede formular fácilmente en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el arte. Un portador sólido, tal como manitol, lactosa, estearato de magnesio, y similares pueden ser empleados; tales portadores permiten a las quimiotaxinas ser formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un sujeto a ser tratado. Para las formulaciones sólidas orales por ejemplo, polvos, cápsulas y tabletas, los excipientes apropiados incluyen rellenos tales como azúcares, de la preparaciones de celulosa, agentes granulantes, y agentes de aglutinates. Otros portadores apropiados, bien conocidos en el arte, también incluyen portadores polivalentes, tales como un polisacárido capsular bacteriano, un dextrana o un vector construido por ingeniería genética. Adicionalmente, las formulaciones de liberación sostenida que incluyen la composición, incluyen la composición que permite la liberación de la composición por períodos de tiempo prolongados, de forma tal que sin la formulación de liberación sostenida, la composición seria eliminada a partir del sistema de un sujeto, y/o degradada, por ejemplo, por las proteasas o mediante hidrólisis simple, antes de provocar o desarrollar un efecto terapéutico. La formulación exacta, la ruta de administración,, y la dosificación, se determina por el médico asistente, considerando la condición del paciente. La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajusfar individualmente, para proporcionar los niveles del complejo en el plasma que son suficientes para mantener el efecto terapéutico.

Generalmente, la composición deseada se administra en una mezcla con un portador farmacéutico, seleccionado con respecto a la ruta prevista de administración y la práctica farmacéutica estándar. La dosificación apropiada, por supuesto, variará dependiendo de, por ejemplo, el compuesto que contiene el dominio de entrada de la cupredoxina empleado, el hospedero, el modo de administración y la naturaleza y severidad de las condiciones que son tratadas o diagnosticadas. Sin embargo, en una materialización de los métodos de la presente invención, los resultados de tratamiento satisfactorios en seres humanos se indican para ser obtenidos en dosificaciones diarias de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del compuesto que contiene el dominio de entrada de la cupredoxina. En una materialización, una dosificación diaria indicada para el tratamiento en seres humanos puede estar en el rango entre aproximadamente 0.7 mg a aproximadamente 1400 mg de un compuesto que contiene el dominio de entrada de la cupredoxina convenientemente administrado, por ejemplo, en dosis diarias, dosis semanales, dosis mensuales, y/o mediante dosificación continua. Las dosis diarias pueden estar en dosificaciones discretas desde 1 a 12 veces por día- Alternativamente, las dosis se pueden administrar cada otro día, cada tercer día, cada cuarto día, cada quinto día, cada sexto día, cada semana, y similarmente en incrementos de días hasta 31 días. La dosificación puede ser continua, intermitente o una sola dosis, usando cualquier forma de dosificación aplicable, incluyendo tabletas, parches, administración i.v. y similares. Más específicamente, la composición se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva. En materializaciones específicas, la cantidad terapéuticamente efectiva es de aproximadamente 0.01-20 mg/kg de peso corporal. En materializaciones específicas, el nivel de dosis es de aproximadamente 10 mg/kg/día, aproximadamente 15 mg/kg/día, aproximadamente 20 mg/kg/día, aproximadamente 25 mg/kg/día, aproximadamente 30 mg/kg/día, aproximadamente 35 mg/kg/día, aproximadamente 40 mg/kg/día, aproximadamente 45 mg/kg/día o aproximadamente 50 mg/kg/día. El método de introducir los compuestos que contienen el dominio de entrada de la cupredoxxna a los pacientes es, en algunas materializaciones, la co-administración con otros fármacos conocidos para tratar el cáncer. Tales métodos son bien conocidos en el arte. En una materialización específica, los compuestos que contienen el dominio de entrada de la cupredoxxna son parte de un coctel o contiene una co-dosificación de otros fármacos para tratar el cáncer. Tales fármacos incluyen, por ejemplo, los aquí enumerados y específicamente el 5-fluorouracil; el interferón alfa; el metotrexato; el tamoxífeno; y la vincristina. Los ejemplos mencionados se proporcionan a modo de ilustración solamente, muchos otros de tales compuestos son conocidos para los expertos en la materia. Otros fármacos apropiados para tratar el cáncer incluyen, pero no se limitan a, agentes tales como agentes alquilantes como las mostazas de nitrógeno, alquilsulfonatos, nitrosoureas, etileniminas, y triazenos; antimetabolitos tales como antagonistas del folato, análogos de purina, y análogos de pirimidina; antibióticos tales como antraciclinas, bleomicinas, mitomicina, dactinomicina, y plicamicina; enzimas tales como asparaginasa; inhibidores de la proteina farnesil-transferasa; inhibidores de la 5. alfa. -reductasa; inhibidores de la 1 .beta. -hidroxisteroide dehidrogenasa tipo 3; agentes hormonales tales como glucocorticoides, estrógenos/antiestrógenos, andrógenos/antiandrógenos, progestinas, antagonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante, acetato de octreotide; agentes disruptores del los microtúbulos, tales como las ecteinascidinas o sus análogos y derivados; agentes estabilizantes de los microtúbulos tales como los taxanos, por ejemplo, paclitaxel (Taxol™) , docetaxel (Taxotere™) , y sus análogos, y epotilonas, tales como epotilonas A-F y sus análogos; productos derivados de las plantas, tales como alcaloides de vinca, epipodofilotoxinas, taxanos; e inhibidores de la topiosomerasa; inhibidores de la proteina fenil-transferasa; y agentes misceláneos tales como hidroxiurea, procarbazina, mitotano, hexametilmelamina, complejos de coordinación del platino tales como cisplatino y carboplatino; y otros agentes usados como agentes anticáncer y citotóxicos tales como modificadores de la respuesta biológica, factores de crecimiento; moduladores inmunes y anticuerpos monoclonales. Los compuestos de la invención se pueden también utilizar conjuntamente con radioterapia y cirugía. Ejemplos representativos de estas clases de agentes anticáncer y citotóxicos incluyen pero no se limitan al clorhidrato de mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil, melfalán, ifosfamida, busulfán, carmustina, lomustina, semustina, streptozocina, tiotepa, dacarbazina, metotrexato, tioguanina, mercaptopurina, fludarabina, pentastatina, cladribina, citarabina, fiuorouracilo, clorhidrato de doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, sulfato de bleomicina, mitomicina C, actinomicina D, safracinas, saframiciñas, quinocarcinas, discodermolidas, vincristina, vinblastina, tartrato de vinorelbina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido, paclitaxel, tamoxifeno, estramustina, fosfato de sodio de estramustina, flutamida, buserelina, leuprolida, pteridinas, diyneses, levamisol, aflacón, interferón, interleuquinas, aldesleuquina, filgrastim, sargramostim, rituximab, BCG, tretinoina, clorhidrato de irinotecan, betametosona, clorhidrato de gemcitabina, altretamina, y topoteca y cualesquiera análogos o derivados de los mismos. Los miembros preferidos de estas clases incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel, cisplatino, carboplatino, doxorubicina, carminomicina, daunorubici a, aminopterina, metotrexato, metopterina, mitomicina C, ecteinascidina 743, o pofiromicina, mercaptopurina, 5-fluorouracilo, 6-gemcitabina, arabinósido de citosina, podofilotoxina o los derivados de la podofilotoxina tales como etopósido, fosfato de etopósido o tenipósido, melfalán, vinblastina, vincristina, leurosidina, vindesina y leurosina. Ejemplos de otros agentes anticáncer y citotóxicos útiles como compuestos transportadores incluyen los siguientes: derivados de la epotilona según lo encontrado en la patente alemana No. 4138042.8; y en las solicitudes WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253 y WO 00/00485; inhibidores de quinasa dependientes de ciclina según lo encontrado en WO 99/24416 (véase también la patente No. US 6,040,321); e inhibidores de la proteina fenil-transferasa según lo encontrado en WO 97/30992 y WO 98/54966,· y agentes tales como los descritos genéricamente y especificamente en la patente No US 6,011,029 (los compuestos de cuya patente se pueden emplear junto con cualquier modulador de NHR (incluyendo, pero no limitado, a aquellos de la presente invención) por ejemplo moduladores de AR, moduladores de ER, moduladores de LHRH, o con la castración quirúrgica, especialmente en el tratamiento del cáncer) . Las composiciones farmacéuticas usadas de acuerdo con la presente invención se pueden formular de una manera convencional usando unos o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de la composición, los agentes activos, para inhibir o estimular la secreción de la composición, o una mezcla de ellos, en las preparaciones que se pueden utilizar terapéuticamente. Las moléculas de ácido nucleico que codifican un dominio de entrada de la cupredoxina o una proteina de fusión que combina cualquier dominio de entrada y un compuesto transportador, se pueden insertar en vectores y utilizar como vectores en terapia génica. En terapia génica, los vectores se pueden entregar a un sujeto, mediante por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (Nabel et al, Patente No. US 5,328,470, 1994, U.S.A.), o por inyección estéreo táctica (Chen et al., Proc Nati Acad Sci USA, vol. 91, pp 3054-57 (1994)). La preparación farmacéutica de un vector para terapia génica puede incluir un diluyente aceptable o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual el vehículo de entrega del gene se impregna. Alternativamente, donde el vector de la entrega del gen completo se puede producir a partir de células recombinantes intactas, Ej . , vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir unas o más células que produzcan el sistema de entrega del gene. En un aspecto, la composición se entrega como ADN tal como el complejo es generado in situ. En una materialización, el ADN está "desnudo," según lo descrito, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745 - 49 (1993) y revisado por Cohén, Science 259 1691-92 (1993) . La incorporación del ADN desnudo se puede incrementar mediante el recubrimiento del ADN sobre un portador, Ej . una perla biodegradable, que se transporta eficientemente en las células. En tales métodos, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de entrega conocidos para los de habilidad ordinaria en los sistemas del arte, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, sistemas de expresión bacterianos y virales. Las técnicas para incorporar el ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidas para los de habilidad ordinaria en el arte. Véanse por ejemplo, la patente No. US 5,736,524 y las solicitudes WO90/11092, WO93/24640, WO 93/17706. Los vectores, usados transferir el material genético de un organismo a otro, se pueden dividir en dos clases generales: Los vectores de clonación son replicados en plásmidos o fagos con regiones que no son esenciales para la propagación en una célula hospedera apropiada y en los cuales el ADN foráneo puede ser insertada; el ADN foráneo se replica y propaga como si fuera un componente del vector. Un vector de expresión (tal como un plásmido, una levadura, o un genoma de virus animal) se utiliza para introducir el material genético foráneo en una célula hospedera o un tejido para transcribir y traducir el ADN foráneo, tal como el ADN de la composición. En los vectores de expresión, el ADN introducido se liga operablemente a elementos tales como promotores que señalan a la" célula hospedera transcribir el ADN insertado- Algunos promotores son excepcionalmente útiles, por ejemplo los promotores inducibles que controlan la transcripción del gen en respuesta a factores específicos. Un polinucleótido de la composición operablemente ligado a un promotor inducible, puede controlar la expresión del polipéptido o de los fragmentos del dominio de entrada de la azurina tipo salvaje de la composición. Ejemplos de- promotores inducibles clásicos incluyen aquellos que sean responden al x-interferón, al shock por calor (heat shock), a los iones de metales pesados, y a los esteroides tales como los glucocorticoides (Kaufman, Methods Enzymol. 185:487 - 511 (1990)) y a la tetraciclina. Otros promotores inducible deseables incluyen los que no sean endógenos a las células en las cuales se está introduciendo la construcción, pero, sin embargo, responden en esas células cuando se provee el agente de inducción exógeno. Generalmente, los vectores de expresión útiles son frecuentemente plásmidos. Sin embargo, otras formas de vectores de expresión, por ejemplo los vectores virales (Ej . , retroviruses defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adeno-asociados) se contemplan. La opción del vector se dicta por el organismo o las células que son utilizadas y el destino deseado del vector. Los vectores comprenden generalmente secuencias señales, orígenes de replicación, genes marcadores, elementos reforzadores o enhancers, promotores, y secuencias de terminación de la transcripción. Conjuntos que comprenden un complejo del dominio de entrada de la cupredoxina y un compuesto transportador En otro aspecto, la invención proporciona conjuntos o kits que contienen uno o más de los siguientes componentes en un paquete o un envase: (1) un reactivo que comprende un complejo de un dominio de entrada de la cupredoxina enlazado a un compuesto transportador; (2) un reactivo que contiene un adyuvante o un excipiente terapéuticamente aceptable; (3) un vehículo para la administración, tal como una jeringuilla; (4) instrucciones para la administración.

Las materializaciones en las cuales dos o más de los componentes (1) - (4) se encuentran en el mismo envase también se contemplan. Cuando se provee un conjunto, los diversos componentes de la composición se pueden empaquetar en envases separados y mezclar inmediatamente antes de uso. Tal empaquetado de los componentes puede permitir el almacenamiento por separado de larga duración, sin que las funciones de los componentes activos se pierdan. Los reactivos incluidos en el conjunto se pueden proveer en envases de cualquier clase, de forma tal que la vida de los diferentes componentes sea preservada y no adsorbida ni alterada por los materiales del envase. Por ejemplo, las ampulas de cristal selladas pueden contener el polipéptido o el polinucleótido liofilizado, o los buffers que se han empaquetado bajo un gas neutral, no-reaccionante, tal como el nitrógeno. Las ampules puede consistir de cualquier material apropiado, tal como cristal, polímeros orgánicos, tales como policarbonator poliestireno, etc., de cerámica, metal o cualquier otro material empleado típicamente para mantener reactivo similares. Otros ejemplos de envases apropiados incluyen botellas simples que se pueden fabricar de sustancias similares como las ampulas, y sobres, que pueden comprender hojas interiores alineadas, tales como aluminio o una aleación. Otros envases incluyen tubos de ensayo, viales, frascos, botellas, jeringuillas, o similares. Los envases pueden tener un puerto de acceso estéril, tal como una botella que tiene un tapón que se pueda perforar por una aguja hipodérmica de inyección- Otros envases pueden tener dos compartimientos que sean separados por una membrana fácilmente desprendible, que al retiro permita que los componentes sean mezclados. Las membranas desprendibles pueden ser de cristal, plástico, caucho, etc. Los conjuntos también pueden estar provistos de materiales de instrucción. Las instrucciones se pueden imprimir en el papel u otro substrato, ylo se pueden proveer como medio legible electrónicamente, tal como un disco blando (floppy) , un CD-ROM, un DVD-ROM, un disco Zip, una videocinta, una cinta magnética para audio, un dispositivo de memoria flash, etc. Las instrucciones detalladas pueden no estar asociadas físicamente al conjunto; en su lugar, un usuario puede ser dirigido a un sitio Web de Internet especificado por el fabricante o el distribuidor del conjunto, o proporcionado como un correo electrónico. ( Una comprensión más completa de la presente invención se puede obtener mediante referencia a los ejemplos siguientes específicos. Los ejemplos se describen solamente con el propósito de ilustrar la invención y no se conciben para limitar el alcance de la invención. Los cambios en la forma y la sustitución de equivalentes se contemplan, según las circunstancias puedan sugerir o rendir expedito. Aunque aquí se han empleado términos específicos, tales términos se conciben en un sentido descriptivo y no para propósitos de limitaciones. Las modificaciones y variaciones de la invención según lo arriba dispuesto, pueden realizarse sin salir del espíritu y alcance de la misma, y, por lo tanto, sólo tales limitaciones deben ser impuestas según lo indicado por las materializaciones que se anexan. EJEMPLOS Ejemplo 1 - Construcciones de plásmidos. Se construyeron plásmido que expresan derivados de la fusión de la glutatión S-transferasa (GST) -azurinas tipo salvaje truncadas (azu) mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando una polimerasa del DNA rectificadora de lectura. La Figura 6 muestra una representación esquemática de las varias construcciones truncadas de la azurina tipo salvaje. Para el pGST-azu 36-128, un fragmento amplificado por PCR fue introducido en los sitios BamHl y EcoRl del vector de expresión de GST comercial pGEXSX (Amersham Biosciences, Piscata ay, NJ 08855) . El fragmento fue amplificado con pUC19-azu como molde o patrón y los cebadores, 5'- CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC-3* (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 12) y 5 ' -CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 13), donde se subrayan los sitios BamHl y EcoRI introducidos respectivamente. El truncamiento del Carboxilo-terminal del gen azu fue acumulativamente realizado introduciendo un codón de parada usando el kit de mutagénesis sitio-dirigida QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA 92037). Para el pGST-azu 36-50, el pGST-azu 36-77 y el pGST-azu 36-89, los codones de parada fueron introducidos en los residuos Ser51, Ser78, y Gly90, respectivamente. El plásmido que portaba el pGST-azu 36-128 fue utilizado como ADN molde o patrón. Tres conjuntos de oligonucleótidos para mutagénesis sitio-dirigida se muestran a continuación. Para el pGST-azu 36-50: 5' -GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCC GCC GAC ATG CAG-31 (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 14), y 51 -CTG CAT GTC GGC GGC GGT TCA CAG TAC CCA GTT GTG GCC-3" (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.:: 15). Para el pGST-azu 36-77: 5'-CCT GAA GCC CGA CGA CTG ACG TGT CAT CGC CCA CAC C-3 ' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.:: 16) y 5 '-GGT GTG GGC GAT GAC ACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G-3' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.:17). Para el pGST-azu 36-89: 5 ' -CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGAAGG ACT CGG TGA CC-3' (IDENTIFICACIÓN DE SEC NO. : 18), 5' -GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG-3' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 19). Los plásmidos pGST-azu 50-77 y pGST-azu 67-77 fueron generados por PCR usando el pGST-azu 36-77 como ADN molde. Los fragmentos amplificados por PCR, azu 50-77 y azu 67-77, fueron obtenidos usando las cebadores delanteros 5'-CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACA TGC AGG G-3' (IDENTIFICACIÓN DE SEC.

NO. : 20) y 5 ' -CGGGATCC CCG GCC TGG ACA AGG ATT ACC TGA AGC CCG-3' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.:: 21), donde el sitio BamHl adicionalmente introducido es indicado mediante subrayado. La cebador inverso, 5 ' -CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.:: 22), fue utilizado en ambos casos. El plásmido que portaba el fragmento gst-azu 50-77, fue utilizado para generar el pGST-azu 50-66 por introducción de un codón de la parada en Gly67 usando los siguientes oligonucleótidos: 5'- GAC GGC ATG GCT TCC TGA CTG GAC AAG GAT TAC C -3 ' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 23), y 5 '-GGT AAT CCT TGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC- 3* (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 24). El gen que codifica para la proteina fluorescente verde (gfp) también fue amplificado por PCR. Las cebadores delanteros e inversos usados fueron: 5'-CGGGATCC CCA TGG TGA GCA AGGGCG-3 ' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 25) y 5' -CGGAATTC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC G-3 ' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 26) que contienen los sitios de BamHl y EcoRI en el extremo 5' de cada oligonucleótido. El fragmento resultante del PCR fue ligado en el vector pGEXSX para crear el pGST-GFP. Para la preparación del plásmido de ADN que lleva gst-gfp-azu 50-77, el gen azu 50-77 fue amplificado por PCR con pGST-azu 50-77 como molde y los cebadores 5' -CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CATGCA GGG-3 ' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 27) y 5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGC TCA GTC GTC GGG CTT CAG GTA ATC C-3' (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 28), .donde los sitios Xho I y Not I introducidos se subrayan respectivamente. El fragmento azu 50-77 purificado fue introducido en el pGST- GFP en los únicos sitios de las enzimas de restricción de Xho I y Not I. Ejemplo 2 - Purificación de proteínas. La azurina tipo salvaje y la azurina mutante M44KM64E fueron preparados y purificaron según lo descrito por Yamada, T. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. ., vol. 101, pp. 4770-75 (2004) , y en la solicitud de patente co-pendiente serial número US 10/720,603, cuyos contenidos se incorporan como referencia. Brevemente, el gen de la azurina tipo salvaje fue amplificado por PCR según el método descrito por Kukimoto et al., FEBS Lett, vol. 394, pp 87-90 (1996). El PCR fue realizado usando el ADN genómico de la cepa PAOl de P. aeruginosa como ADN molde. El fragmento amplificado de ADN de 545 pb, digerido con Hindlll y PstI, fue insertado en los sitios correspondientes de pUC19 de modo que el gen de la azurina fuera colocado corriente abajo del promotor lac para rendir un plásmido de expresión pUC 19- azuA. La cepa de E. coli JM1 09 fue utilizada como cepa hospedera para la expresión del gen de la azurina. La cepa recombinante de E. coli fue cultivada en el medio 2YT conteniendo 50 pg ml-1 de ampicilina, 0.1 nM de IPTG; y 0.5 mM de CuS04 por 16 h a 37 °C para producir azurina. Para la preparación de la azurina mutante M44KM64E, se realizó una mutagénesis sitio-dirigida del gen de la azurina usándole el kit QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) . Las mutaciones fueron confirmadas por secuenciamiento del DNA. El plásmido de ADN pET9a, que porta el gen rus que codifica la cupredoxina rusticianina de Acxdithiobadilus ferrooxidans, fue obtenido del Dr. Kazuhiko Sasaki, Central Research Institute of Electry Power Industry, Chiba, Japón. La rusticianina fue aislada a partir de E. coli BL21 (DE3) que alberga el gen rus, usando el método de Sasaki, K. , et al. Biosci. Biotechnol. Bioquímica., vol. 67, pp. 1039-47 (2003) con algunas modificaciones. Brevemente, un buffer de ácido acético (pH 4.0) y CM-Sefarosa (Sigma Chemicals, St. Louis, MES 63178) fueron utilizados en lugar del buffer beta-alanin (pH 4.0) y la columna TS -gel CM-650 (Tosoh Bioscience, LLC, Montgomery ille, PA 18936) . Otras dos cupredoxinas purificadas, la plastocianina de Phormidium laminosum y la pseudoazurina de Achromobacter cicloclastes fueron obtenidas a partir de la Dr. Beatrix G. Schlarb-Ridley, University of Cambridge, UK y el Dr. Christopher Dennison, University of Newcastle Upon Tyne, UK, respectivamente. Todos los derivados recombinantes de la fusión GST fueron purificados como sigue: Las células de E. coli BL21 fueron utilizadas como cepa hospedera. Después de la inducción con IPTG (0.4 mM) en la fase temprana del crecimiento log, en caldo L, las proteínas de fusión GST fueron purificadas a partir de los extractos celulares usando cromatografía de afinidad en Glutatión-Sefarosa 4B y una columna de gel-filtración de Sefadex 75 con PBS (Amersham Biosciences, Piscataway, TSIJ 08855) . Las proteínas purificadas, la azurina tipo salvaje y los derivados GST u otras cupredoxinas, marcadas con ALEXA FLUOR® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 97402) fueron aislados según las instrucciones del fabricante. El producto químico fluorescente libre no pegado fue removido mediante una columna de gel-filtración. Ejemplo 3 - Cultivos celulares. Las células J774 y ÜISO-Mel-2 (disponibles a partir del Frederick Cáncer Research and Development Center, Frederick, Mariland U.S.A.) fueron cultivadas según lo descrito en Yamada, T. et al., Infect. Immun. vol. 70, pp. 7054-62 (2002) ; Goto, M. , et al Mol. Microbiol., vol. 47, pp. 549-59 (2003) ; y Yamada, T. , et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. , vol. 99, pp. 14098-103 (2002), cuyos contenidos se incorporan como referencia. Las células de fibroblastos normales humanas (cultivo en existencia en la colección del Department of Surgical Oncology, University of Illinois at Chicago (UIC) , Chicago) fueron cultivadas en MEM con sales de Eagle, conteniendo de L-glutamina 2 mM, con sal, aminoácidos esenciales 0.1 mM MEM y suplementado con 10% de suero fetal bovino inacti ado por calor, penicilina 100 Units/ml y estreptomicina 100 µg/ l. Las células MCF-7 y MOF-IOF fueron cultivadas según lo descrito en Punj et al. Oncogen 23:2367 -78 (2004) .

Ejemplo 4 - Co-cultivo de células J774, üISO-Mel-2 y fibroblastos y microscopía confocal. Las células J774, UISO-Mel-2, y los fibroblastos fueron cultivados en láminas individuales cubiertas. Después de la incubación durante la noche, las células fueron lavadas con medios frescos y las tres lineas celulares fueron plaqueadas sobre una plato de cultivo conteniendo 200 pg/ml de azurina tipo salvaje conjugada con ALEXA FLUOR® 568. Las células entonces fueron incubadas por 0.5 k.o. 3.5 h a 37 °C bajo C02 al 5%. Para la preparación de las muestras a observar al microscopio, las células fueron cultivadas en láminas durante la noche a 37 °C. Las células cultivadas fueron colocadas a 37 °C ó 4 °C por 2 h antes del tratamiento de la proteina. Los medios frescos pre-calentados a 37 °C o los medios frescos helados 4 °C fueron mezclados con cupredoxinas rojo-fluorescentes (marcadas con LEXA FLUOR® 568) o los derivados de la fusión de GST, e incubados con las células. Las células fueron lavadas con PBS, y fijadas con metanol a -20 °C por 5 Min. Después del lavarse dos veces con PBS y de la adición de medios de montaje conteniendo 1-5 ]iq/ml de 41 , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción nuclear (VECTASHILD, Vector, Burlingame, CA) , las iiriágenes fueron tomados mediante un microscopio confocal. Ejemplo 5 - Entrada de las cupredoxinas en las células J774. La azurina tipo salvaje, su variante mutante M44KM64E, la plastocianina, la pseudoazurina y la rusticianina fueron incubadas con células J774 como en el ejemplo 4, y las células fueron examinadas usando microscopía confocal. En estos experimentos, las cupredoxinas fueron conjugados con ALEXA FLUOR® 568 para despedir luz fluorescente roja e incubadas con las células J774 por 1 hora a 37 °C a una concentración de 200 µ?/?a?, y en experimento separado una azurina tipo salvaje y una rusticianina fueron incubadas con las células J 7 por 1 hora a 37 °C a una concentración de aproximadamente 6 a 7 uM. El núcleo fue teñido de azul con DAPI. Se mantuvo un control sin las proteínas. En todos los casos se observó que las cupredoxinas entraron en el citosol de las células J774. En experimentos similares, la auracianina A y B entran preferencialmente en las células de cáncer MCF7 y no entraron en las células no cancerosas del control . Ejemplo 6 - Entrada de la azurina tipo salvaje y la rusticianina varios tipos de células. La azurina tipo salvaje exhibe una actividad citotóxica reducida hacia las células de MCF-10F según lo contrastado con las células MCF-7 (Punj et al. Oncogen 23: 2367 - 2378 (2004) . Las células J774, los macrófagos perifonéales, las células del mástil, la linea celular de cáncer de seno humano MCF-7 y las células epiteliales normales humanas MCF-10F (cultivo en existencia en la colección del Department of Surgical Oncology, University of Illinois at Chicago (UIC) , Chicago) fueron tratadas y examinadas como en el ejemplo 5, y probadas para determinar si la azurina tipo salvaje podía entrar a tales células. La azurina tipo salvaje fue internalizada en las células J774 durante 45 min de incubación. Sin embargo, fue internalizada muy ineficientemente en los macrófagos perifonéales o en las células del mástil. Incluso después de la incubación por 6 horas, tales células mostraron solamente una entrada limitada. Similarmente, mientras que la azurina tipo salvaje entró eficientemente en las células de cáncer de seno MCF-7, mostró un índice extremadamente reducido de entrada en las células mamarias normales MCF-10F. La azurina conjugada a ALEXA FLUOR® entró eficientemente en células de cáncer UISOMel-2 y MCF-7 pero no en las células mamarias normales MCF 1QA1. La rusticianina conjugada a ALEXA FLUOR®, sin embargo, no sólo entró en el citosol de las células de cáncer UISOMel-2 y MCF-7, sino también en las células normales MCF 10Al. A diferencia de lo que ocurre en las células de cáncer, donde la rusticianina fue distribuida uniformemente en el citosol, en las células MCF 10A1, .gran parte de la rusticianina fue secuestrada en el espacio perinuclear que rodea al núcleo. Ejemplo 7 - Inhibición del crecimiento y la citotoxicidad mediada por la azurina tipo sálvaje. Para determinar adicionalmente la especificidad dé la entrada de la azurina tipo salvaje en varias células, se determinó la entrada de la azurina tipo salvaje conjugada a ALEXA FLUOR® en células J774, UISO-Mel-2 y fibroblastos normales de durante la incubación a 37 °C por 30 minutos y durante 3.5 horas. Se observó que la azurina tipo salvaje entró rápidamente en las células J77 y UISO-Mel-2 en 30 minutos; muy poca azurina tipo salvaje fue observada en el citosol de los fibroblastos durante este periodo. Después de 3.5 horas de incubación, solamente pequeñas cantidades de azurina tipo salvaje fueron encontradas en los fibroblastos. Se realizó un ensayo con bromuro de 3(4,5 dimetiltiazol-2-il-2,5 tetrazolium (MTT) para medir la citotoxicidad de la azurina tipo salvaje según lo descrito por Yamada, T. , et al. Infect. Immun. 70:7054 - €2 (2002), Goto, M. , et al. Mol. Microbiology 47:549 - 59 (2003), y en la solicitud de patente co-pendiente serial número US 10/720.603, presentada el 24 de noviembre de 2003, cuyos contenidos se incorporan como referencia. La figura 1 (b) muestra que la citotoxicidad significativa mediada por azurina tipo salvaje, fue observada solamente con las células J774 y ÜISO-Mel-2 durante 24 horas de incubación. La azurina imitante M44KM64E mostró muy poca apoptosis, induciendo actividad en las células J774, pero a la concentración de 1 mg/ml inhibió significativamente la progresión del ciclo celular (aproximadamente en un 95%) en la fase Gl a S. La progresión del ciclo celular fue analizada por citometria de flujo, según lo descrito por Hiraoka, Y. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., vol. 101: 6427-32 (2004) y Yamada, T. et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.101: 4770-75 (2004) , cuyo contenido se incorpora como referencia. La figura 1(a) muestra que cuando los fibroblastos fueron tratados con 500 g/ml o 1 mg/ml de la azurina imitante M44KM64E, el grado de inhibición de la progresión del ciclo celular fue de aproximadamente el 20%. Ejemplo 8 - Microinyección de azurina tipo salvaje en fibroblastos y en células MCF-10F. La azurina tipo salvaje fue microinyectada en fibroblastos y en células MCF-10F según lo utilizado en el método descrito por Punj, V., et al, Oncogen 23:2367 - 78 (2004). Las células fueron examinadas para la inducción de apoptosis, conduciendo a la condensación nuclear y a la fragmentación del DNA. Se observó condensación nuclear significativa y fragmentación del ADN (marcado de azul con DAPI) dentro de las células micro-inyectadas después de la incubación por 5 horas con la azurina tipo salvaje, pero no durante una incubación de 30 minutos con azurina. Ejemplo 9 - Internalizacion de los derivados de la fusión de la azurina tipo salvaje a 37 °C. Una serie de fusiones de GST y la azurina tipo salvaje, truncadas tanto en los extremos N- y C- terminales, fueron preparadas y purificadas como en el ejemplo 1 (Figura 2 (a) y 2 (b) ) . Usando la azurina tipo salvaje conjugada a ALEXA FLUOR® 568, GST y los derivados de la fusión de GST-azu, se observó la internalizacion en las células J774 a 37 °C durante la incubación por 1 hora, usando el método descrito en el ejemplo 5. El núcleo fue teñido de azul con DAPI. Mientras que la azurina tipo salvaje fue internalizada, GST permaneció en la periferia de las células y no fue internalizada. GST-azu 36-128 y GST-azu 36-89 fueron internalizadas, al igual que GST-azu 6-77. Otros truncamientos, sin embargo, mostraron que mientras que GST-azu 50-77 fue internalizada, GST-azu 36-50 fue altamente ineficaz y pareció formar aglomerados en la superficie. Ejemplo 10 - Internalizacion de los derivados de la fusión de azurina a 4 °C. Se examinó la internalizacion de la azurina tipo salvaje y de los derivados de la fusión de GST-azu en las células J774 incubadas a 4 °C. A 4 °C, la internalizacion de la azurina tipo salvaje dentro de las células J774 durante la incubación por 1 hora se deterioró seriamente, üna debilitación similar también fue observada con GST-azu 36-128 y GST-azu 36-89. Los GST-azu 36-77, GST-azu 50-77, GST-azu 50-66 y GST-azu 67-77 más cortos mostraron una debilitación severa de la internalización a 4 °C. Ejemplo 11 - Internalización dependiente de energía de la proteína de fusión GST-GFP-azu 50-77 en células J774 y melanoma UISO-MeI-2. La GST fue fusionada con la GFP, para hacer un derivado de fusión GST-GFP. Adicionalmente, azu 50-77 fue fusionado a la proteína de fusión GST-GFP (Mr 53 kDa) (Figura 3 (a) ) . La movilidad de los derivados de la fusión purificados GST, GST-GFP y GST-GFP-azu 50-77 fueron examinados sobre SDS-PAGE (Figura 3 (b) ) . La detección fue mediante tinción con Azul de Coomassie y por Western blotting usando un anticuerpo anti-azurina (Figura 3 (c) ) . La determinación del flujo citamétríco de las células J774 tratadas con concentraciones variables de GST-GFP mostró que esta proteína se une a las células J774. La separación por flujo citométrico de las células J77 tratadas con concentraciones incrementadas de la proteína de fusión GST-GFP-azu 50-77 demostró fluorescencia significativamente reducida en comparación con GST-GFP solamente (Figura 4) . Debe notarse que es conocido que la internalización de GFP en células de mamiferos conlleva a la pérdida de la fluorescencia. Esta reducción de la fluorescencia es también evidente cuando las células J774 se tratan con 200 g/ml de la proteina de fusión GST- GFP-azu 50-77 y se incuban por periodos de tiempo incrementados a 37 °C. Para determinar si existe cualquier diferencia en el perfil de unión e internalización de GST-GFP y GST-GFP-azu 50-77, las células J 7 y ÜISO-Mel-2 fueron incubadas con GST-GFP y GST-GFP-azu 50-77 a 37 °C y a 4 °C. La fluorescencia verde fue localizada usando microscopia confocal. En las células J774, la proteina de fusión de GST- GFP se unió a la superficie y no fue internalizada a 37 °C y a 4 °C. En cambio, se encontró que GST-GFP-azu 50-77 se internalizó a 37 °C, pero no a 4 °C. En las células UISO-Mel-2, la proteina de fusión GST-GFP se retuvo en la superficie tanto a 37 °C como a 4 °C. En cambio, similarmente a lo que ocurrió en las células J774, se observó que la proteina de fusión GST-GFP-azu 50-77 se internalizó a 37 °C pero no a 4 °C. Ejemplo 12 - Entrada de la azurina tipo salvaje en células de mamiferos mediante una penetración de la membrana celular y un mecanismo endocitico. Si la entrada de la azurina tipo salvaje es solamente dependiente de la endocitosis mediada por un receptor, ésta podría ser bloqueada por el protonóforo carbonil cianuro m-clorofenilhidrazona (CCCP) , un desacoplador mitocondrial de generación de energía, o por preincubación con azurina no marcada u otras cupredoxinas que bloquean los receptores. Las células J774 y ÜISO-MeI-2 fueron incubadas con cupredoxinas a concentraciones 10 veces en exceso por2 horas a 4 °C, las células fueron lavadas posteriormente para quitar las cupredoxinas, e incubadas con azurina conjugado con ALEXA FLUOR® 568 por 1 hora a 37 °C. Se observó tanta azurina internalizada como en las células no tratadas con las cupredoxinas. Los efectos de la citocalasina D (disponible a partir de Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo 63195) , un conocido inhibidor de la endocitosis mediada por receptor que interrumpe la red de microfilamentos celulares, y de la brefeldina ? (disponible a partir de Sigma Aldrich, St. Louis, Mo 63195) , que se conoce que interrumpe el aparato de Golgi e inhibe la secreción clásica mediada por vesícula, también fueron probados. El CCCP a la concentración de 20 pM redujo significativamente la incorporación de la azurina en las células UISO-Mel-2 al igual que la citocalasina D a 0.25 - 0.5 pM. La brefeldina A, por otra parte, no tuvo ningún efecto significativo. Ejemplo 13 - Entrada de un derivado de la fusión GST-PEDIII-azu 50-77 en las células UISO- Mel-2. Una fusión de GST y el dominio III (PEDIII) de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa fue construida según lo descrito por Hwang, J. et al, Cell 48:129 - 36 (1987); Reiter, Y. and Pastan, L., Trends Biotechnol. 16:513 - 20 (1998). Este derivado de la fusión de GST-PEDIII contenia los aminoácidos 381-613 de la exotoxina A. Se conoce que PEDIII presenta actividad ADP-ribosil transferasa e inhibe la síntesis de proteínas en las células eucarióticas, mediante la inhibición del factor 2 de la elongación eucariótica. Usando PCR según lo descrito para GST-GFP-azu 50-77, la secuencia azu 50-77 fue introducida al extremo carboxilo de la proteína de fusión GST-PEDIII (Figura 5 (a) ) . Estas dos proteínas de fusión (GSTPEDIII y GST-PEDIII-azu 50-77) fueron purificadas por cromatografía en columna de glutatión-sefarosa 4B como proteínas de 52 y 54 kDa (Figura 5 (b) ) . Las células UISO-Mel-2 y los fibroblastos normales (FBT) fueron entonces incubados por 24 h a 37 °C con varias concentraciones de estas proteínas, y el grado de muerte celular fue medido por ensayo de MTT según lo descrito en el ejemplo 7. Mientras que GST-PEDIII demostró solamente baja citotoxicidad, la proteína de fusión GST-PEDIII-azu 50-77 tuvo alta citotoxicidad debido a la entrada eficiente a las células UISO- Mel-2 (Figura 5 (c) ) . En cambio, las proteínas de fusión demostraron un bajo nivel de citotoxicidad hacia las células de fibroblastos. Ejemplo 14 - La desestabilización de la oc-hélice en la azurina tipo salvaje no tiene ningún efecto sustancial en su Internalización en las células UISO-Mel-2. Para examinar si la a-hélice desempeña un papel importante en la entrada de la azurina a las células, tres residuos de prolina, desestabilizantes de la hélice, fueron introducidos en las posiciones 54, 61 y 70 de la azurina tipo salvaje (Figura 6) y se examinó la entrada de la azurina de longitud completa y del mutante A54PT61PK70P en las células UISO-Mel-2. Las mutaciones simples y dobles en estas posiciones también fueron construidas y probadas para la entrada. La azurina mutante A54PT61PK7QP fue preparada por mutagénesis sitio-dirigida del gen de la azurina usando el kit de mutagénesis sitio-dirigida QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) . Los mutantes fueron incubados a 200 pg/ml con las células UISO-Mel-2 por 1 hora a 37 °C, después de lo cual la fluorescencia fue localizada por microscopía confocal. En todos los casos, las azurinas mutantes conjugadas a ALEXA FLUOR® 568 entraron en las células UISO-Mel-2. Similarmente, cuando la proteina de fusión de GST-GFP-azu 50-77, asi como su variante triple mutante A54PT61PK70P azu, fue examinada para la entrada en las células UISO-Mel-2, no se observó ninguna diferencia significativa. Ejemplo 15 - Entrada de un derivado de la fusión GST-PEDIII-Rusticianina en las células UISO-Mel-2. Una fusión de GST y el dominio III (PEDIII) de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa fue construida como en el ejemplo 13. Usando PCR según lo descrito para el GST- GFP-azu 50-77, la secuencia de longitud completa de la rusticianina fue introducida en el extremo carbox lo de la proteina de fusión GST-PEDIII. La proteina de fusión fue purificada por cromatograf a de columna de glutatión-sefarosa 4B. Las células UISO-Mel-2 y FBT entonces fueron incubadas por 24 h a 37 °C con varias concentraciones de la proteina de fusión, y el grado de la muerte celular fue medido por un sayo de MTT según lo descrito en el ejemplo 7. La proteina de fusión GST-PEDIII-rusticianina exhibió alta citotoxicidad contra las células UISO-Mel-2 (Figura 7) . En cambio, la proteina de fusión demostró solamente un nivel bajo de citotoxicidad hacia las células FBT. Ejemplo 16 - Competición de la Azurina con GST-Azu 55-77 para la entrada en las células J774. Un experimento de competición fue realizado con la azurina sin marcar a 37 °C en presencia de 7 µ? de GST-azu 50-77 conjugada ALEXA FLUOR®. Las células J774 fueron incubadas sin azurina conjugada a ALEXA FLUOR®, con GST-azu 50-77conj gada a ALEXA FLUOR® (7 µ?) y con GST-azu 50-77 conjugada a ALEXA FLUOR® (7 uM) en presencia de 7, 14 y 56 µ? de azurina sin marcar por 1 h a 37 °C, antes de determinar la entrada de GST-azu 50-77. Los resultados claramente demostraron que en comparación a 7 µ? GST-azu 50-77 marcada solamente, la presencia de cantidades de aumento de azurina sin marcar (7, 14 y 56 µ?) competió cada vez más con la entrada de 7 uM GST-azu 50-77 marcada. En cambio, cuando se utilizaron concentraciones similares (6, 12 y 48 uM) de rusticianina marcar en presencia de GST- azu 50-77 marcada, se observó muy poco efecto sobre la entrada de GST-azu 50-77. Ejemplo 17 - Secuencia y comparación estructural del dominio de transducción de la proteína Azurina (PTD) con otras cupredoxinas. La identidad de secuencia entre la azurina y la rusticianina en la región azu 50-77 es menos del 20%, al igual que lo es para varias otras cupredoxinas (De Rienzo et al, Protein Science 9:1439 - 1454, 2000; Murphy et al, J. Mol. Biol. 315:859 - 871, 2002). ün análisis estructural usando el algoritmo VAST {Gibrat et al, Curr. Opin. Struct. Biol. 6:377 - 385, 1996) entre la azurina y varios miembros de la familia de las cupredoxinas, demostraron una identidad significativa entre la región azu 50-77 y la de la cupredoxina auracianina B, una de las cupredoxina provenientes de la bacteria fotosintética termofilica verde C. aurantiacus (Bond et al, J. Mol. Biol. 306:47 - 67, 2001). Otros miembros de la familia de las cupredoxinas, mientras que muestra semejanza estructural con otras regiones de la azurina, carecieron de identidad significativa con la azurina PTD, aminoácidos 50-77 (Fig. 8 (a) ) . De hecho, cuando se compara con otras proteínas cuyas estructuras se han depositado en la base de datos proteínas, hubo semejanza estructural muy pequeña entre el azu PTD y otras proteínas. Una alineación múltiple de las secuencias de aminoácidos de los residuos en la región PTD de P. aeruginosa con secuencias conocidas de otras azurxnas bacterianas provenientes de patógenos, usando el programa de alineación CLUSTBL X (Higgíns and Sharp, id. 1988} . Mientras que la azurina del fitopatógeno P. syringae demostró alta identidad con la región PTD de la azurina de P. aeruginosa, una proteína similar a azurina de Neisseria meningitidxs (Gotschlich y Seiff, FEMS Microbiol. Lett. 43:253 - 255 (1987); a ula et al, Mol. Microbiol. 1:179 - 185 (1987); Cannon, Clin. Microbiol. Rev. 2:Sl-S4 (1989)) también mostró identidad significativa con el dominio PTD de la azurina de P. aeruginosa, al igual que las azurxnas provenientes de Vibrio parahaemolytxcus y de Bordetella bronchiseptica (Fig. 8 (b) ) . Una secuencia motivo D-G-X-X-X-X~X-D~X-X~Y-X-K-X-X-D (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 35) se encontró conservada en todas estas azurinas. Ejemplo 18 - laz de N. meningitidxs (H8~azurina) induce la muerte celular en células de tumor cerebral LH229. Neisseria meningitidxs (Nm) causa meningitis cerebroespinal, diseminándose en torrente sanguíneo, cruzando la barrera hemato-eiicefálica, presumiblemente por una ruta transcelular a través de las células endoteliales del cerebro, e invadiendo las meninges. Las azurinas de Pseudomonas aeruginosa y de Neisseria meningitidis tienen estructuras similares y alta homología en secuencia de aminoácidos (>50%) . Adicionalmente, la azurina de N. meningitidis es parte de un polipéptido más largo, Laz (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 30), que se encuentra en su N-terminal, un péptido superficial llamado H.8, el cual está presente en la membrana externa de N. meningitidis (Cannon, J.G., Clin. Microbiol. Rev. vol. 2, pp. 51-54 (1989)). El epitope antigénico H8 expuesto en la superficie también porta una señal para la lipidación. La proteína completa H8 de la membrana externa de N. meningitidis se mantiene en la superficie externa de las células de N. meningitidis. La proteína Laz de Neisseria gonorrhoeae es muy similar a la proteína Laz de N. meningitidis. El gen laz de Neisseria gonorrhoeae fue clonado en E. coli, y entonces dicho gen fue hiper-expresado en E. coli para producir la proteína Laz (Fig. 13) . La capacidad de la azurina purificada de P. aeruginosa y de la proteína Laz purificada Neisseria gonorrhoeae para inducir muerte celular en la línea celular LH22 de tumor cerebral, según lo medido por un ensayo de MTT (Yamada, T. , et al., Cell Cycle vol. 3, pp 1182-1187 (2004)). Mientras que la azurina de F. aeruginosa, cuando es expresado en E. coli, está presente en el periplasma, la proteína Laz, cuando es éxpresada en E. coli, fue encontrada en la membrana externa de E. coli. Además, mientras que la azurina tuvo una citotoxicidad muy baja hacia las células del tumor cerebral en el plazo de 24 horas, Laz mostró alta citotoxicidad, permitiendo la muerte del 90% de las células del tumor cerebral en 24 horas (Tabla 3) . La azurina mostró citotoxicidad incrementada luego de 48 horas (Tabla 4) . Este experimento indica ese azurina de P. aeruginosa y la H8-azurina de Neisseria gonorrhoeae (Laz, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 36) serán útiles para diagnosticar y/o para tratar tumores cerebrales in vitro e in vivo. Si Laz reduce el crecimiento del tumor cerebral in vivo, todo o una parte de la proteina será utilizada como "el dominio de entrada de la cupredoxina" de la invención para transportar las moléculas transportadoras, incluyendo marcadores radioactivos o fluorescentes o fármacos/toxinas que destruyen los tumores en el cerebro, y en las células tumorales del cerebro, para los propósitos de diagnóstico o terapéuticos .

Tabla 3. Citotoxicidad de la azurina de P. aeruginosa y de la proteina Laz de N. gonorrhoeae para la linea celular LH229 de cáncer cerebral después de 24 horas de incubación.

Tabla 4. Citotoxicidad de la azurina de P. aeruginosa y de la proteina Laz de N. gonorrhoeae para la linea celular LH229 de cáncer cerebral después de 48 horas de incubación.

Ejemplo 19 - Citotoxicidad de la proteina Laz de Neisseria gonorrhoeae para las células de tumores cerebrales. Varios plásmidos fueron construidos que codifican construcciones de proteínas que incluyen la azurina de P. aeruginosa, la proteína Laz de Neisseria gonorrhoeae (IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 36), y proteínas de fusión, y las proteínas se probaron en un ensayo de MTT con líneas celulares de tumores cerebrales. Las construcciones de proteínas probadas incluyen la región H.8 de Laz de N. gonorrhoeae solamente, la azurina de P. aeruginosa solamente, la azurina N. gonorrhoeae solamente, y las construcciones representadas en la Figura 10. Los plásmidos que codifican las construcciones de proteínas se transformaron en E. coli u otro sistema de expresión apropiado, y las construcciones proteína son expresadas y las proteínas resultantes son purificadas . Las líneas celulares de tumores cerebrales incluyen NL229 y CCF-STTG1. Los resultados de este experimento indican que la región H.8 y/o la azurina del gen Laz son requeridas para permitir que la construcción de la proteína sea citotóxica para las células del tumor cerebral. Este experimento también determina si otras azurinas son más citotóxicas para las células del tumor cerebral si están fusionados a la región H.8. Los resultados de este experimento indican que la región H.8 puede adaptar una cupredoxina para ser citotóxica para la célula de cáncer del cerebro, transportando la azurina unida a las células de cáncer del cerebro. Por consiguiente, H.8 se puede utilizar como dominio de transporte para transportar una molécula transportadora en las células de cáncer del cerebro. Las cargas útiles incluyen tratamientos del cáncer y agentes de diagnóstico según lo conocido en el arte y dispuesto aquí. Ejemplo 20 - Tratamiento de los pacientes que sufren de cáncer. Un ensayo clinico de fase I/II de una fusión del dominio III de la exotoxina A y el dominio de entrada de una cupredoxina (fármaco en estudio) será realizado en los pacientes que sufren de cáncer. Específicamente, el dominio de entrada de la cupredoxina es la región de aminoácidos 50-67 de Pseudomonas aeruginosa y el dominio III de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa es el transportador, haciendo la proteina de fusión "PEDIII-azu 50-67" Esta proteína de fusión será construida según lo ilustrado en el ejemplo 13. Cuarenta y nueve pacientes adultos con cánceres de seno, colon y melanoma verificados histológicamente, que muestran progresión o recurrencia clínica y radiográfica siguiendo al tratamiento y régimen adecuado con los fármacos quimioterapéuticos aprobados por la FDA actualmente disponibles, serán incluidos en un estudio prospectivo abierto, administrando el fármaco en estudio. Para ser elegibles para la inscripción en el estudio, todos los pacientes muestran volumen en aumento del tumor mensurable después de la terminación del curso aprobado de los regímenes de quimioterapia. La evidencia de depósitos metastásicos persistentes y/o aumento continuado del tamaño o volumen debe ser histológicamente establecido. Esta prueba histológica se puede obtener por una biopsia por aspiración con aguja fina (FNA) . El programa de tratamiento será instituido después de obtener consentimiento informado de todos los pacientes de acuerdo con el comité examinador institucional de la universidad de Illinois, de Chicago y la FDA. Los pacientes no tendrán ninguna enfermedad intercúrrente tal como otra malignidad, historia de malignidad anterior, discrasias de la sangre, diabetes dependiente de insulina u otras enfermedades cardiovasculares serias que pudieran interferir en la evaluación apropiada de los efectos de la terapia propuesta. El trabajo de los valores iniciales de la sangre (conteos completos de sangre [CBC] y química del suero) incluyendo estudios de la función hepática (LFT) serán realizados antes de la iniciación de la terapia. Todos los pacientes elegibles no deben recibir ninguna quimioterapia para el cáncer concurrentemente durante el periodo del ensayo. Los fármacos en estudio serán administrados por inyección intravenosa diaria de una preparación terapéuticamente aceptable del fármaco en estudio por 12 semanas y los sujetos serán observados para cualquier dosis que limite la toxicidad. Habrá 7 niveles de dosis, comenzando con 10 mg/kg/dia y aumento en 5 mg/kg/dia hasta una dosis máxima de 50 mg/kg/dia. La eficacia de cada nivel de dosis será registrada en 7 pacientes con el cáncer mensurable avanzado (seno, colon, y melanoma) . La respuesta será estimada midiendo el tumor mensurable en 2 dimensiones (a y b) . 1) La desaparición total de los tumores metastásicos blanco será considerada como respuesta completa (CR) ; 2) Una reducción del 75% será considerada una respuesta parcial excelente, (PR) ; y 3) Una buena respuesta (PR) será la reducción del 50% del tamaño post-tratamiento 4) Una reducción del 25% del tamaño será considerada como enfermedad estable (SD) y 5) < 25% será considerado como ninguna respuesta (NR) . Los pacientes que muestran una progresión de la enfermedad tendrán su tratamiento continuado pero serán seguidos por unas 12 semanas adicionales . La desaparición total, y cualquier reducción de tamaño de los tumores metastásicos blanco indicarán que el tratamiento de la azurina es eficaz para tratar el cáncer. Otras indicaciones de que el tratamiento de la azurina es eficaz, son un índice de disminución en la aparición de tumores metastásicos nuevos y una disminución de la angiogénesis asociada a los tumores. Varias modificaciones y variaciones de los ejemplos y de los sistemas descritos de la invención serán evidentes para los expertos en la materia sin salirse del alcance y el espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito con respecto a materializaciones específicas, debe ser entendido que la invención según se ha reivindicado, no se debe limitar indebidamente a tales materializaciones específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para realizar la invención que son obvias para aquellos expertos en campos relacionados, se conciben dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (36)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido, que consiste de una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos cuando menos para una cupredoxina tipo salvaje de longitud completa o para la proteina de la membrana externa H.8, y que facilita la entrada de una molécula enlazada en una célula de cáncer de mamifero.

2. El péptido de la reivindicación 1, donde la cupredoxina se selecciona del grupo de consistente de azurina, plastocianina, rusticianina, pseudoazurina, auracianina y proteina similar a la azurina.

3. El péptido de la reivindicación 1, donde el péptido se deriva de un organismo seleccionado del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa, Phormidium lamínosum.r Thlobacillus ferrooxidans, Achromobacter cicloclastes, Pseudomonas syringa, Neisseria meningítidis, Vibrio parahaemolyticus, Bordetella bronchiséptica, Bordetella pertussis, Chloroflexus aurantíacus y Neisseria gonorrhoeae.

4. El péptido de la reivindicación 1, donde la cupredoxina se selecciona del grupo que consiste de la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 1, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 2, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 3, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 4, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 29, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 30, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 31, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 32, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 33, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 34, la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 36 y la IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 43.

5. El péptido de la reivindicación 1, el cual es al menos de aproximadamente 10 residuos y no más de aproximadamente 50 residuos en longitud.

6. El péptido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia que tiene al menos identidad en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 90% para una secuencia seleccionada del grupo que consiste de IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 5, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 6, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 7, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 9, SEQ NO. DE LA IDENTIFICACIÓN: 37, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 38, IDENTIFICACIÓN DE SEC, NO. : 39, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 40, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 41, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 42, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 43, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 44, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NQ. : 46, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 47, e IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 47.

7. El péptido de la reivindicación 6, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 5, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 6, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 7, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 9, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 37, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 38, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 39, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 40, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 41, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 42, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 43, IDENTIFICACIÓN DE SEC. -NO.: 44, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 46, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 47, e IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 47.

8. El péptido de la reivindicación 6, que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 5, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO. : 6, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 7, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 9, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 37, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 38, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 39, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 40, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 41, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 42, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 43, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 44, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 46, IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 47, e IDENTIFICACIÓN DE SEC. NO.: 47.

9. El péptido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de DGXXXXXDXXYXKXXD y DGXXXXDXXYXKXXD, donde D es ácido aspártico, G es glicina, Y es tirosina, K es lisina y X es cualquier aminoácido.

10. Un péptido que tiene homología estructural significativa para los 50-77 aminoácidos de la región de la azurina de Pseudomonas aerugínosa y que facilita la entrada de una molécula enlazada en una célula de cáncer de mamífero.

11. Un complejo que comprende un compuesto transportador y un péptido, donde el péptido tiene al menos identidad de secuencia de aproximadamente el 90% con una cupredoxina o un fragmento de la misma, donde el péptido, o los fragmentos de este, se enlazan al compuesto transportador, y donde el péptido facilita la entrada del compuesto transportador en una célula de cáncer de mamífero.

12. El complejo de la reivindicación 11, donde el péptido es el péptido de la reivindicación 1.

13. El complejo de la reivindicación 11, donde el compuesto transportador se selecciona del grupo que consiste de una proteina, una lipoproteína, un polipéptido, un péptido, un polisacárido, un ácido nucleico, ' un pigmento, una micropartícula, una nanoparticula, una toxina y un fármaco.

14. El complejo de la reivindicación 13, donde el compuesto transportador se selecciona del grupo que consiste de una proteína y un polipéptido, y donde el péptido se enlaza al compuesto transportador para formar una proteína de fusión.

15. El complejo de la- reivindicación 11, donde el compuesto transportador es una toxina.

16. El complejo de la reivindicación 15, donde la toxina es la exotoxina A de Pseudomonas aerugxnosa o un fragmento de la misma .

17. El complejo de la reivindicación 11, donde el compuesto transportador es una sustancia detectable.

18. El complejo de la reivindicación 17, donde la sustancia detectable es detectable por un método seleccionado a partir del grupo que consiste de fluorimetria, microscopía, rayos X CT, MRI y ultrasonido.

19. Una composición farmacéutica que comprende el complejo de la reivindicación 11 con un portador farmacéuticamente apropiado .

20. Un método que comprende poner en contacto una célula o células con el complejo de la reivindicación 11.

21. El método de la reivindicación 20, donde la célula o las células se originan de un paciente que sufre de cáncer, y posteriormente comprende la reintroducción de la célula o las células en el paciente.

22. El método de la reivindicación 20, donde la célula es una célula de cáncer.

23. El método de la reivindicación 22, donde la célula es una célula de cáncer seleccionada a partir del grupo que consiste de una célula de osteosarcoma, una célula de carcinoma de pulmón, una célula de carcinoma de colon, una célula de linfoma, una célula de leucemia, una célula sarcoma de tejido blando, una célula de carcinoma de seno, una célula de carcinoma de hígado, una célula de carcinoma de vejiga, una célula de melanoma, una célula de tumor cerebral y una célula de carcinoma de próstata.

24. Un método de tratar a un paciente con cáncer, donde el complejo de la reivindicación 11 se administra a dicho paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva.

25. El método de la reivindicación 24, donde el complejo se administra de una manera seleccionada del grupo que consistía de administración intravenosa, tópica, subcutánea, intramuscular, y en el tumor.

26. El método de la reivindicación 24, donde el complejo se administra conjuntamente con otro tratamiento para el cáncer.

27. Un método para la proyección de imagen de cáncer en un paciente, donde el complejo de la reivindicación 17 se administra a dicho paciente, y se detecta la localización del compuesto transportador.

28. El método de la reivindicación 27, donde el compuesto transportador es un agente del contraste para rayos X y se detecta la localización del compuesto transportador por rayos X CT.

29. El método de la reivindicación 27, donde el compuesto transportador es un agente de contraste para la proyección de imagen por resonancia magnética y se detecta la localización del compuesto transportador por M I.

30. El método de. la reivindicación 27, donde el compuesto transportador es un agente de contraste para ultrasonido y se detecta la localización del compuesto transportador por proyección de imagen por ultrasonido.

31. Un método para diagnosticar cáncer, donde una célula se pone en contacto con el complejo de la reivindicación 17 y se detecta la localización de la molécula transportadora.

32. Un conjunto que comprende un reactivo que comprende el complejo de la reivindicación 11.

33. El conjunto de la reivindicación 32, que comprende adicionalmente un reactivo que comprende un adyuvante o un excipiente farmac uticamente aceptable.

34. El conjunto de la reivindicación 32, que comprende adicionalmente un vehículo para la administración del reactivo .

35. El péptido de la reivindicación 1, donde la estructura del péptido se modifica para prolongar o para optimizar la vida media del péptido en el torrente sanguíneo

36. Una molécula de ácido nucleico, que codifica el péptido de las reivindicaciones 1 ó 10, o el complejo de la reivindicación 14.