ME02176B - Konjugati oligomerno-opioidnog agonista - Google Patents

Konjugati oligomerno-opioidnog agonista

Info

Publication number
ME02176B
ME02176B MEP-2015-44A MEP4415A ME02176B ME 02176 B ME02176 B ME 02176B ME P4415 A MEP4415 A ME P4415A ME 02176 B ME02176 B ME 02176B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
nalbuphine
mixture
mmol
concentrated
added
Prior art date
Application number
MEP-2015-44A
Other languages
English (en)
Inventor
Jennifer Riggs-Sauthier
Timothy Andrew Riley
Bo-Liang Deng
Original Assignee
Nektar Therapeutics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nektar Therapeutics filed Critical Nektar Therapeutics
Publication of ME02176B publication Critical patent/ME02176B/me

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4748—Quinolines; Isoquinolines forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

KONJUGATI OLIGOMERNO-OPIOIDNOG AGONISTA
 
Opis
REFERENCA NA SLIČNU PRIJAVU
Ova prijava se poziva na prioritet prema 35 U.S.C. §119(e) za privremenu prijavu iz Sjedinjenih Američkih Država br. No. 60/906,387, podnetu 12 marta 2007.
 
OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje hemijski modifikovane opioidne agoniste koji poseduju određene prednosti nad opioidnim agonistima kojima nedostaje hemijska modifikacija. Ovde opisani hemijski modifikovani opioidni agonisti odnose se na i/ili imaju primenu ili primene u oblastima otkrića lekova, farmakoterapije, fiziologije, organske hemije i polimerne hemije.
 
POZADINA PRONALASKA
Opioidni agonisti, kao što je morfin, već se dugo koriste za lečenje pacijenata koji pate od bola. Opioidni agonisti ispoljavaju svoje analgetičke i druge farmakološke efekte kroz interakciju sa opioidnim receptorima, od kojih, postoje tri glavne klase: mu (µ) receptori, kapa (κ) receptori, te delta (δ) receptori. Većina klinički korišćenih opioidnih agonista su relativno selektivni za mu receptore, mada opioidni agonisti tipično imaju agonističku aktivnost kod drugih opioidnih receptora (posebno kod povećanih koncentracija).
 
Opioidi ispoljavaju svoje efekte selektivnom inhibicijom oslobađanja neurotransmitera, kao što su acetilholin, norepinefrin, dopamin, serotonin, te supstanca P.
 
Farmakološki, opioidni agonisti predstavljaju važnu grupu agenasa korišćenih u upravljanju sa bolom. Nažalost, upotreba opioidnih agonista je povezana sa potencijalom za zloupotrebu. Pored toga, davanje opioidnih agonista često rezultira sa značajnim metabolizmom prvog prolaza. Nadalje, primena opioidnih agonista rezultata sa značajnim CNS-posredovanim efektima, kao što usporavanje disanja, što može dovesti do smrti. Stoga, smanjenje bilo koje od ovih ili drugih karakteristika može poboljšati njihovu poželjnost kao terapeutskih lekova.
 
Predmetni pronalazak nastoji se baviti ovim i drugim potrebama iz stanja tehnike obezbeđivanjem u vodi rastvorljivog konjugata, ne-peptidnog oligomera i opioidnog agonista.
 
REZIME PRONALASKA
U jednom ili više ostvarenja pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje, gde pomenuto jedinjenje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan za u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kao što je definisano u patentnim zahtevima.
 
Opisano je jedinjenje koje sadrži ostatak kapa opioidnog agonista kovalentno vezan (poželjno preko stabilne veze) na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer [gde se podrazumeva da je kapa opioidni agonist (i) preferirano selektivan za kapa opioidne receptore preko mu opioidnih receptora i preko delta opioidnih receptora kod iste vrste sisara, te (ii) da će imati aktivnost agonista na kapa receptor].
 
Opisano je jedinjenje koje sadrži ostatak mu opioidnog agonista kovalentno vezan (poželjno preko stabilne veze) na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer [gde se podrazumeva da je kapa opioidni agonist (i) preferirano selektivan za mu opioidne receptore preko i kapa opioidnih receptora i delta opioidnih receptora u okviru iste vrste sisara, i (ii) da će imati aktivnost agonista na mu receptor].
 
U jednom ili više izvođenja prema opisu, obezbeđeno je jedinjenje, gde pomenuto jedinjenje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan preko stabilne veze na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer, pri čemu opioidni agonist ima strukturu obuhvaćenu sa sledećom formulom:
 
gde:
R1 je H ili organski radikal [kao što su metil, etil i -C(O)CH3];
R2 je H ili OH;
R3 je H ili organski radikal;
R4 je H ili organski radikal;
isprekidana linija ("---") predstavlja opcionu dvostruku vezu;
Y1 je O (kiseonik) ili S; i
R5 je odabran iz grupe koju čine
 
i
 
(bez obzira na stereohemiju), gde R6 je organski radikal [uključujući C(O)CH3].
 
U jednom ili više izvođenja prema opisu, obezbeđeno je jedinjenje, gde pomenuto jedinjenje sadrži:
(i) jedinjenje koje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan preko stabilne veze na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer; i
(ii) farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
 
Ovde je opisan oblik doziranja, gde oblik doziranja sadrži jedinjenje koje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan preko stabilne veze na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Ovde je opisan postupak, gde postupak obuhvata kovalentno vezivanje u vodi rastvorljivog, ne-peptidnog oligomera na opioidni agonist.
 
Ovde je opisan postupak, gde postupak obuhvata davanje jedinjenja koje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan preko stabilne veze na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Ovde je opisan postupak, gde postupak obuhvata vezivanje (npr., selektivno vezivanje) mu opioidnih receptora, gde se pomenuto vezivanje postiže davanjem jedinjenja koje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer. Opisan je postupak, te postupak obuhvata vezivanje (npr., selektivno vezivanje) mu opioidnih receptora, gde se pomenuto vezivanje postiže davanjem efikasne količine jedinjenja pacijentu koji je sisar koje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Opisan je postupak, gde postupak obuhvata vezivanje (npr., selektivno vezivanje) kapa opioidnih receptora, gde se pomenuto vezivanje postiže davanjem jedinjenja koje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer. Opisan je postupak, te postupak obuhvata vezivanje (npr., selektivno vezivanje) kapa opioidnih receptora, gde se pomenuto vezivanje postiže davanjem efikasne količine jedinjenja pacijentu koji je sisar koje sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Ovi i drugi ciljevi, aspekti, varijante i karakteristike pronalaska će postati jasnije kada se čitaju zajedno sa detaljnim opisom koji sledi.
 
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Kako se koristi u ovoj specifikaciji, forme jednine obuhvataju množinu osim ako kontekst jasno navodi drugačije.
 
U opisivanju i zahtevima predmetnog pronalaska, koristiti će se sledeća terminologija u skladu sa dole opisanim definicijama.
 
"U vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer" označava oligomer koji je najmanje 35% (po težini) rastvorljiv, poželjno više od 70% (po težini), te poželjnije više od 95% (po težini) rastvorljiv, u vodi kod sobne temperature. Tipično, ne-filtriran vodeni preparat "u vodi rastvorljivog" oligomera prenosi najmanje 75%, poželjnije najmanje 95%, od iznosa svetlosti koje prenosi isti rastvor posle filtriranja. Međutim najpoželjnije je, da u vodi rastvorljiv oligomer je najmanje 95% (po težini) rastvorljiv u vodi ili potpuno rastvorljiv u vodi. U pogledu toga što je "ne-peptidni," oligomer je ne-peptidni kada ima manje od 35% (po težini) ostataka amino kiselina.
 
Termini "monomer," "monomerna podjedinica" i " monomerna jedinica" su ovde korišćeni naizmenično i odnose se na jednu od osnovnih strukturnih jedinica polimera ili oligomera. U slučaju homo-oligomera, jedna ponavljajuća strukturna jedinica formira oligomer. U slučaju ko-oligomera, dve ili više strukturnih jedinica se ponavljaju - ili u obrascu ili nasumično – tako da formiraju oligomer. Poželjni oligomeri su homo-oligomeri. U vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer tipično sadrži jedan ili više serijski vezanih monomera koji formiraju lanac monomera. Oligomer se može formirati iz jednog tipa monomera (tj., oligomer je homo-oligomerni) ili dva ili tri tipa monomera (tj., oligomer je ko-oligomerni).
 
"Oligomer" je molekul koji poseduje od oko 2 do oko 50 monomera, poželjno od oko 2 do oko 30 monomera. Arhitektura jednog oligomera može da varira. Specifični oligomeri za upotrebu u pronalasku uključuju one koji imaju različite geometrije, kao što su linearna, razgranata ili račvasta, te će biti opisani u više detalja u daljem tekstu.
 
"PEG" ili "polietilen glikol," kako se ovde koristi, ima za cilj da obuhvati sve u vodi rastvorljive poli(etilen okside). Ukoliko nije drugačije naznačeno, "PEG oligomer" (takođe se naziva oligoetilen glikol) je onaj u kojem u suštini sve (te poželjnije sve) monomerne podjedinice su podjedinice etilen oksida. Međutim, oligomer može da sadrži posebne završne zatvarajuće grupe ili funkcionalne grupe, npr., za konjugaciju. Tipično, PEG oligomeri za upotrebu u predmetnom pronalasku će sadržavati jednu od sledeće dve strukture: "-(CH2CH2O)n-" ili "-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-," u zavisnosti da li je terminalni kiseonik premešten, npr., tokom sintetičke transformacije. Za PEG oligomere, "n" varira od oko 2 do 50, poželjno od oko 2 do oko 30, te terminalne grupe i arhitektura ukupnog PEG može varirati. Kada PEG dodatno sadrži funkcionalnu grupu, A, za povezivanje na, npr., lekom malog molekula, funkcionalna grupa kada je kovalentno vezana za PEG oligomer ne rezultuje sa formiranjem veze ili veza kiseonik-kiseonik (-O-O-, peroksidne veze), ili (ii) veze azot-kiseonik (N-O, O-N).
 
"Završna zatvarajuća grupa" je generalno nereaktivna grupa koja sadrži ugljenik vezana za terminalni kiseonik PEG oligomera. Primeri završnih zatvarajućih grupa sadrže C1-5 alkil grupu, kao što su metil, etil i benzil), kao i aril, heteroaril, ciklo, heterociklo, i slično. Za potrebe ovog pronalaska, poželjne zatvarajuće grupe imaju relativno niske molekulske težine kao što su metil ili etil. Završna zatvarajuća grupa može takođe da sadrži obeleživač koji se može detektovati. Takvi obeleživači obuhvataju, bez ograničenja, fluorescentne obeleživače, hemiluminescentne obeleživače, delove koji se koriste kod obeležavanja enzima, kolorimetrijske obeleživače (npr., boje), metalne jone, te radioaktivne delove.
 
"Razgranati", u odnosu na geometriju ili ukupnu strukturu nekog oligomera, se odnosi na oligomer koji ima dva ili više polimera koji predstavljaju različite "grane" koje se rasprostiru od tačke grananja.
 
"Račvanje" u odnosu na geometriju ili ukupnu strukturu nekog oligomera, odnosi se na oligomer koji ima dve ili više funkcionalnih grupa (tipično kroz jedan ili više atoma) koje se rasprostiru od tačke grananja.
 
"Tačka grananja" se odnosi na bifurkacionu tačku koja sadrži jedan ili više atoma u kojima se jedan oligomer grana ili račva iz linearne strukture u jedan ili više dodatnih krakova.
 
Termin "reaktivan" ili "aktiviran" se odnosi na funkcionalnu grupu koja lako reaguje ili u praktičnoj stopi pod konvencionalnim uslovima organske sinteze. Ovo je u suprotnosti sa onim grupama koje ili ne reaguju ili zahtevaju jake katalizatore ili nepraktične uslove reakcije kako bi reagovali (tj., "ne-reaktivna" ili "inertna" grupa).
 
"Ne odmah reaktivna," sa osvrtom na funkcionalnu grupu prisutnu na molekulu u reakcionoj smeši, ukazuje da grupa u velikoj meri ostaje netaknuta pod uslovima koji su efikasni da dobije željena reakcija u reakcionoj smeši.
 
"Zaštitna grupa" je grupa koja sprečava ili blokira reakciju određene hemijski reaktivne funkcionalne grupe u molekulu pod određenim uslovima reakcije. Zaštitna grupa će varirati u zavisnosti od tipa hemijski reaktivne grupe koja je zaštićena kao i reakcionih uslova koji se koriste, te prisustva dodatnih reaktivnih ili zaštitnih grupa u molekulu. Funkcionalne grupe koje se mogu zaštititi obuhvataju, na primer, karboksilne kisele grupe, amino grupe, hidroksilne grupe, tiol grupe, karbonil grupe i slično. Reprezentativne zaštitne grupe za karboksilne kiseline obuhvataju estre (kao što je p-metoksibenzil estar), amid i hidrazide; za amino grupe, karbamate (kao što je terc-butoksikarbonil) i amid; za hidroksilne grupe, etre i estre; za tiol grupe, tioetre i tioestre; za karbonilne grupe, acetale i ketale, i slično. Takve zaštitne grupe su dobro poznate onima koji su verzirani u tehnici i opisane su, na primer, u T.W. Greene i G.M. Wuts, Protective groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999, te ovde citirane reference.
 
Funkcionalna grupa u "zaštićenom obliku" se odnosi na funkcionalnu grupu koja nosi zaštitnu grupu. Kako se ovde koristi, termin "funkcionalna grupa" ili bilo koji njegov sinonim obuhvata njihove zaštićene oblike.
 
"Fiziološki razdvojiva" ili "koja može hidrolizovati" ili "razgradiva" veza je relativno labilna veza koja reaguje sa vodom (tj. koja hidrolizuje) pod običnim fiziološkim uslovima. Tendencija veze da hidrolizuje u vodi pod običnim fiziološkim uslovima zavisiće ne samo od opšteg tipa veze koja povezuje dva centralna atoma već i od supstituenata vezanih za ove centralne atome. Takve su veze uglavnom prepoznatljive stručnjacima u tehnici. Odgovarajuće hidrolitički nestabilne ili slabe veze uključuju ali nisu ograničene na karboksilatni estar, fosfatni estar, anhidride, acetale, ketale, aciloksialkil etar, imine, ortoestre, peptide, oligonukleotide, tioestre i karbonate.
 
"Enzimski razgradiva veza" označava vezu koja je predmet degradacije od strane jednog ili više enzima pod običnim fiziološkim uslovima.
 
"Stabilna" povezanost ili veza se odnosi na hemijsku grupu ili vezu, tipično na kovalentnu vezu, koja je suštinski stabilna u vodi, to jest, ne podleže hidrolizi pod običnim fiziološkim uslovima u bilo kojoj meri tokom dužeg vremenskog perioda. Primeri hidrolitički stabilnih veza uključuju, ali nisu ograničeni, na sledeće: veze ugljenik-ugljenik (npr, u alifatičnim lancima), etre, amid, uretane, amine i slično. Generalno, stabilna veza je ona koja ima brzinu hidrolize manju od oko 1-2% dnevno pod običnim fiziološkim uslovima. Stope hidrolize za reprezentativne hemijske veze mogu se naći u većini standardnih udžbenika hemije.
 
U kontekstu opisivanja konsistencije oligomera u datoj kompoziciji, "suštinski " ili "u osnovu" označava skoro potpuno ili potpuno, na primer, 95% ili više, poželjnije 97% ili više, još poželjnije 98% ili više, čak poželjnije 99% ili više, čak još poželjnije 99.9% ili više, te je 99.99% ili više najpoželjnije za neku datu količinu.
 
"Monodisperzibilni" se odnosi na kompoziciju oligomera pri čemu suštinski svi oligomeri u kompoziciji imaju dobro definisanu, jedinstvenu molekulsku težinu i definisan broj monomera, kao što je određeno hromatografijom ili masenom spektrometrijom. Kompozicije monodisperzibilnih oligomera su u jednom smislu čiste, to jest, suštinski sadrže molekule koje imaju jedan i definisan broj monomera umesto nekoliko različitih brojeva monomera (tj., kompozicija oligomera ima tri ili više različitih veličina oligomera). Kompozicija monodisperzibilnih oligomera ima vrednost MW/Mn od 1.0005 ili manje, te poželjnije, vrednost MW/Mn od 1.0000. Kao dodatak, kompozicija koja sadržava monodisperzne konjugate znači da suštinski svi oligomeri svih konjugata u kompoziciji imaju jedan i definisan broj (ceo broj) monomera umesto distribucije, te bi imali vrednost MW/Mn od 1.0005, te poželjnije, vrednost MW/Mn od 1.0000 ukoliko oligomer nije vezan za ostatak opioidnog agonista. Kompozicija koja se sastoji od monodisperznih konjugata može obuhvatati, jednu ili više ne-konjugiranih supstanci kao što su rastvarači, reagensi, ekscipijensi, i tako dalje.
 
Termin "bimodalno", vezano na oligomernu kompoziciju, odnosi se na oligomernu kompoziciju gde suštinski svi oligomeri u sastavu imaju jedan od dva definisana i različita broja (celi brojevi) monomera umesto distribucije, te čija se distribucija molekulskih težina, kada se pokaže kao broj frakcija naspram molekulske težine, pojavljuje kao dva odvojena prepoznatljiva pika. Poželjno, za bimodalnu kompoziciju oligomera kao što je ovde opisana, svaki je pik generalno simetričan svojoj srednjoj vrednosti, iako se veličina dva pika može razlikovati. Idealno, indeks polidisperzibilnosti svakog pika u bimodalnoj distribuciji, Mw/Mn, je 1.01 ili manje, poželjnije 1.001 ili manje, te čak još poželjnije 1.0005 ili manje, te najpoželjnije vrednost MW/Mn od 1.0000. Dodatno, kompozicija sastavljena od bimodalnih konjugata znači da suštinski svi oligomeri svih konjugata u kompoziciji imaju jedan od dva definisana i različita broja (celi brojevi) monomera naspram velike distribucije, te može da ima vrednost MW/Mn od 1.01 ili manje, poželjnije 1.001 ili manje i čak još poželjnije 1.0005 ili manje, te najpoželjnije vrednost MW/Mn od 1.0000 ukoliko oligomer nije vezan za ostatak opioidnog agonista. Kompozicija koja se sastoji od bimodalnih konjugata može obuhvatati, jednu ili više ne-konjugiranih supstanci kao što su rastvarači, reagensi, ekscipijensi, i tako dalje.
 
Termin "opioidni agonist" se ovde koristi tako da označava organsko, anorgansko ili organometalno jedinjenje koje tipično ima molekulsku težinu manju od oko 1000 Daltona (i tipično manje od 500 Daltona) i ima neki stepen aktivnosti kao mu i/ili kapa agonist. Opioidni agonisti obuhvataju oligopeptide i druge biomolekule koji imaju molekulsku težinu manju od oko 1000.
 
"Biološka membrana" je bilo koja membrana, uglavnom napravljena od specijalizovanih ćelija ili tkiva, koja služi kao barijera za barem neke strane entitete ili na drugi način nepoželjne materije. Kako se ovde koristi "biološka membrana" uključuje one membrane koje su povezane sa fiziološkim protektivnim barijerama, uključujući, na primer: krvno-moždanu barijeru (BBB); krvno-cerebrospinalnu tečnu barijeru; barijeru krv-placenta; barijeru krv-mleko; barijeru krv-testisi; te barijeru sluzokože, uključujući vaginalnu sluzokožu, sluzokožu uretre, analnu sluzokožu, bukalnu sluzokožu, sublingvalnu sluzokožu, rektalnu sluzokožu, i tako dalje. Osim ako kontekst jasno diktira drugačije, termin "biološka membrana" ne obuhvata membrane povezane sa srednjim gastrointestinalnim traktom (npr. stomakom i tankim crevom).
 
„Stopa prelaza biološke membrane", kako se ovde koristi, daje meru sposobnosti jedinjenja da pređe biološku membranu (kao što je membrana povezana sa krvno-moždanom barijerom). Mogu se koristiti različite metode za procenu transporta molekula preko bilo koje date biološke membrane. Metode za procenu stope prelaza biološke membrane povezane sa datom biološkom barijerom (npr. krvno-cerebrospinalnu tečnom barijerom, barijerom krv-placenta, barijerom krv-mleko, intestinalnom barijerom, i tako dalje), poznate su u tehnici, ovde opisane i/ili u relevantnoj literaturi, ili ih može odrediti lice koje je uobičajeno verzirano u oblasti tehnike.
 
"Smanjena brzina metabolizma" u odnosu na predmetni pronalazak, odnosi se na merljivo smanjenje brzine metabolizma u vodi rastvorljivog konjugata oligomera-leka malog molekula u poređenju sa brzinom metabolizma leka malog molekula koji nije vezan na u vodi rastvorljiv oligomer (tj., samog leka malog molekula) ili sa referentnim standardnim materijalom. U posebnom slučaju "smanjenja brzine metabolizma prvog prolaza", tražena je ista "smanjena brzina metabolizma" sem što se lek malog molekula (ili referentni standardni materijal), te odgovarajući konjugat, daje oralno. Oralno davani lekovi se apsorbuju iz gastrointestinalnog trakta u portalnu cirkulaciju i moraju da prođu kroz jetru pre dolaska u sistemsku cirkulaciju. Pošto je jetra primarno mesto metabolizma leka ili biotransformacije, značajna količina leka može da metaboliše pre nego što uopšte dođe u sistemsku cirkulaciju. Stepen metabolizma prvog prolaza, a time, bilo kakvo njegovo smanjenje, može se meriti brojnim različitim pristupima. Na primer, uzorci krvi životinja mogu se sakupljati u merenim vremenskim intervalima u plazmi ili serumu i mogu da budu analizirani tečnom hromatografijom/masenom spektrometrijom radi utvrđivanja nivoa metabolita. Druge tehnike za merenje "smanjene brzine metabolizma" povezane sa metabolizmom prvog prolaza i drugi metabolički procesi poznati su u struci, te su ovde opisani i/ili su opisani u relevantnoj literaturi, i/ili ih mogu odrediti stručnjaci iz ove oblasti tehnike. Poželjno, konjugat prema pronalasku može da obezbedi redukovanu brzinu smanjenja metabolizma koja zadovoljava barem jednu od sledećih vrednosti: najmanje oko 30%; najmanje oko 40%; najmanje oko 50%; najmanje oko 60%; najmanje oko 70%; najmanje oko 80%; te najmanje oko 90%. Jedinjenje (kao što je lek malog molekula ili njegov konjugat) koje je "oralno bioraspoloživo" je ono koje kada se primenjuje oralno poželjno ima bioraspoloživost veću od 25%, a poželjno veću od 70%, gde je bioraspoloživost jedinjenja deo datog leka koji dostiže sistemsku cirkulaciju u ne-metabolizovanom obliku.
 
"Alkil" se odnosi na ugljovodonični lanac, tipično u rasponu dužine od oko 1 do 20 atoma. Takvi ugljovodonični lanci su poželjno ali ne obavezno zasićeni i mogu biti razgranati ili ravnog lanca, iako je tipično poželjan ravni lanac. Primeri alkil grupa uključuju metil, etil, propil, butil, pentil, 1-metilbutil, 1-etilpropil, 3-metilpentil, te slično. Kako se ovde koristi, "alkil" obuhvata cikloalkil kada su navedeni tri ili više atoma ugljenika. "Alkenil" grupa je alkil sa 2 do 20 atoma ugljenika sa barem jednom dvostrukom vezom ugljenik-ugljenik.
 
Termini "supstituisani alkil" ili "supstituisani Cq-r alkil" gde su q i r celi brojevi koji identifikuju raspon atoma ugljenika sadržanih u alkil grupi, označava gore pomenute alkil grupe koje su supstituisane sa jednim, dva ili tri halo atoma (npr., F, Cl, Br, I), trifluorometil, hidroksi, C1-7 alkil (npr., metil, etil, n-propil, izopropil, butil, t-butil, i tako dalje), C1-7 alkoksi, C1-7 aciloksi, C3-7 heterociklički, amino, fenoksi, nitro, karboksi, karboksi, acil, cijano. Supstituisane alkil grupe mogu biti supstituisane jednom, dva ili tri puta sa istim ili sa različitim supstituentima.
 
"Niži alkil" se odnosi na alkil grupu koja sadrži od 1 do 6 atoma ugljenika, te može biti ravnog lanca ili razgranata, kako je prikazano za metil, etil, n-butil, i-butil, t-butil. "Niži alkenil" se odnosi na nižu alkil grupu od 2 do 6 atoma ugljenika koja ima najmanje. jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik.
 
"Ne-ometajući supstituenti" su one grupe koje, kada su prisutne u molekulu, su tipično ne-reaktivne sa drugim funkcionalnim grupama sadržanim u molekulu.
 
"Alkoksi" se odnosi na -O-R grupu, gde R je alkil ili supstituisani alkil, poželjno C1-C20 alkil (npr., metoksi, etoksi, propiloksi, benzil, itd.), poželjno C1-C7.
 
"Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" ili "farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na komponente koje mogu da budu sadržane u kompozicijama prema pronalasku kako bi se obezbedila kompozicija koja ima prednost (npr. pogodnija za davanje pacijentu) u poređenju sa kompozicijom kojoj nedostaju pomenute komponente i koja je prepoznata da ne izaziva značajne štetne toksikološke efekte na pacijenta.
 
Termin "aril" označava aromatičnu grupu koja ima do 14 atoma ugljenika. Aril grupe obuhvataju fenil, naftil, bifenil, fenantrenil, naftacenil, te slično. "Supstituisani fenil" i "supstituisani aril" označava odgovarajuću fenil grupu i aril grupu, supstituisanu sa jednim, dva, tri, četiri ili pet (npr. 1-2,1-3 ili 1-4 supstituenata) odabranih od halo (F, Cl, Br, I), hidroksi, hidroksi, cijano, nitro, alkil (npr., C1-6 alkil), alkoksi (npr., C1-6 alkoksi), benziloksi, karboksi, aril, i tako dalje.
 
"Aromatični radikal" je grupa atoma koji sadrže barem aril i opciono jedan ili više atoma. Pogodni aromatični radikali su ovde opisani.
 
Radi jednostavnosti, hemijske grupe su definisane i označene u celosti prvenstveno kao univalentni hemijski radikali (npr, alkil, aril, itd.). Ipak, ovi termini se koriste i za prenošenje odgovarajućih multivalentnih radikala pod odgovarajućim strukturnim okolnostima koje su jasne onima koji su verzirani u ovoj oblasti tehnike. Na primer, dok se "alkil" radikal uopšteno odnosi na monovalentni radikal (npr., CH3-CH2-), u određenim situacijama dvovalentna vezujuća grupa može biti "alkil", u kom slučaju će stručnjaci u tehnici razumeti da je alkil dvovalentni radikal (npr., -CH2-CH2-), što je ekvivalentno terminu "alkilen". (Slično tome, u uslovima u kojima se traži dvovalentni radikal i naveden je kao "aril," lica verzirana u oblasti tehnike će razumeti da se termin "aril" odnosi na odgovarajući dvovalentni radikal, arilen). Svi atomi se podrazumevaju da imaju normalan broj valencija za formiranje veze (tj., 4 za ugljenik, 3 za N, 2 za O, i 2, 4, ili 6 za S, u zavisnosti od oksidacionog stanja S).
 
Termini "farmakološki efikasna količina", "fiziološki efikasna količina," i "terapeutski efikasna količina" su ovde korišćeni naizmenično da se označi količina u vodi rastvorljivog konjugata oligomernog leka malog molekula prisutnog u kompoziciji koja je potrebna da obezbedi prag nivoa aktivnog sredstva i/ili konjugata u krvotoku ili u ciljanom tkivu. Precizna količina će zavisiti od brojnih faktora, npr., određenom aktivnom agensu, komponentama i fizičkim karakteristikama kompozicije, populaciji pacijenata kojoj je namenjena, razmatranjima pacijenata, i slično, te je lako može odrediti stručnjak sa iskustvom u tehnici, na osnovu informacija sadržanih i dostupnih u relevantnoj literaturi.
 
"Dvofunkcionalan" oligomer je oligomer koji ima sadržane dve funkcionalne grupe, tipično na svojim krajevima. Kada su funkcionalne grupe iste, za oligomer se kaže da je homodifunkcionalan. Kada su funkcionalne grupe različite, za oligomer se kaže da je heterobifunkcionalan.
 
Ovde opisan bazični reaktant ili kiseli reaktant uključuje neutralni, nabijeni, te bilo koje odgovarajuće oblike njihovih soli.
 
Izraz "pacijent," se odnosi na živi organizam koji pati od ili je sklon stanju koje se može sprečiti ili lečiti davanjem konjugata kako je ovde opisano, tipično, ali ne nužno, u obliku u vodi rastvorljivog konjugata oligomera-leka malih molekula, te obuhvata i ljude i životinje.
 
Opciono" ili "izborno" znači da naknadno opisana okolnost može ali ne mora nužno da se javlja, tako da opis obuhvata slučajeve gde se okolnost dešava i slučajeve gde se ne dešava.
 
Kao što je navedeno gore, pronalazak se odnosi na jedinjenje koja sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan preko stabilne ili degradirajuće veze na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
U jednoj ili više realizacija pronalaska, predviđeno je jedinjenje, te jedinjenje sadržava ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan preko stabilne ili degradirajuće veze na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer, gde opioidni agonist ima strukturu obuhvaćenu sledećom formulom:
 
gde:
R1 je metil;
R2 je OH;
R3 je metil;
R4 je H;
Y1 je O; i
R5 je
 
 
Specifični opioidni agonist je oksikodon.
 
Smatra se da je prednost jedinjenja iz predmetnog pronalaska njihova sposobnost da zadrže neki stepen aktivnosti opioidnog agonista dok takođe pokazuju smanjenje metabolizma i/ili rezultiraju sa smanjenjem CNS-posredovanih efekata povezanih sa odgovarajućim opioidnim agonistom u ne-konjugovanom obliku. Iako nije želja da se vežemo za teoriju, veruje se da ovde opisani konjugati koji sadrže oligomer - za razliku od ne-konjugovanog "originalnog" opioidnog agonista - ne metabolišu tako lako zato jer oligomer služi da smanji ukupan afinitet jedinjenja na supstrate koji mogu da metabolišu opioidne agoniste. Pored toga (i opet, ne želeći da se vežemo za teoriju), dodatna veličina uvedena sa oligomerom - za razliku od ne-konjugovanog "originalnog" opioidnog agonista - smanjuje sposobnost jedinjenja da pređe krvno-moždanu barijeru.
 
Upotreba oligomera (npr., iz monodisperzne ili bimodalne kompozicije oligomera, za razliku od relativno nečistih kompozicija) da formiraju konjugate prema pronalasku može povoljno izmeniti određene karakteristike povezane sa odgovarajućim lekom malih molekula. Na primer, konjugat prema pronalasku, kada se daje bilo kojim od brojnih podesnih načina administracije, kao što su parenteralno, oralno, transdermalno, bukalno, pulmonarno ili nazalno, pokazuje smanjenu penetraciju kroz krvno-moždanu barijeru. Poželjno je da konjugat pokazuje usporen, minimalan ili gotovo nikakav prelaz kroz krvno-moždanu barijeru, dok još ipak prelazi gastrointestinalne (GI) zidove i ulazi u sistemsku cirkulaciju ukoliko je namenjen za oralnu primenu. Štaviše, konjugati prema predmetnom pronalasku zadržavaju stepen biološke aktivnosti, kao i bioraspoloživost u svojem konjugovanom obliku u odnosu na biološku aktivnost i biodostupnost jedinjenja bez svih oligomera.
 
U pogledu krvno-moždane barijere ("BBB"), ova barijera ograničava transport lekova iz krvi do mozga. Ova barijera se sastoji od kontinuiranog sloja jedinstvenih endotelijalnih ćelija spojenih čvrstim čvorovima. Cerebralne kapilare, koje sadrže više od 95% ukupne površine BBB, predstavljaju glavni put za ulazak većine rastvorenih supstanci i lekova u centralni nervni sistem.
 
Za jedinjenja čiji stepen sposobnosti prelaza krvno-moždane barijere nije odmah poznat, takva sposobnost se može odrediti korišćenjem pogodnog životinjskog modela kao što je model in situ perfuzije mozga pacova ("RBP") kako je ovde opisano. Ukratko, RBP tehnika obuhvata postavljanje kanile u karotidnu arteriju što je praćeno perfuzijom sa rastvorom jedinjenja pod kontrolisanim uslovima, posle čega sledi faza ispiranja radi uklanjanja preostalog jedinjenja u vaskularnom prostoru. (Takve analize mogu se sprovesti, na primer, od strane istraživačkih organizacija, kao Absorption Systems, Exton, PA). Preciznije, u RBP modelu, kanila se postavlja u levu karotidnu arteriju, a bočne grane su povezane. Fiziološki pufer sadrži analit (obično, ali ne nužno u nivou koncentracije od 5 mikromola) koji se perfuzionira pri protoku od oko 10 mL/minut u jednom prolazu eksperimenta perfuzije. Posle 30 sekundi, perfuzija se zaustavlja, a vaskularni sadržaj mozga se ispere sa puferom bez jedinjenja kroz dodatnih 30 sekundi. Tkivo mozga se zatim uklanja i analizira na koncentracije jedinjenja pomoću tečne hromatografije sa tandem detekcijom masenom spektrometrijom (LC/MS/MS). Alternativno, permeabilnost krvno-moždane barijere može biti procenjena na osnovu proračuna molekularne polarne površine jedinjenja ("PSA"), koja je definisana kao zbir površinskih doprinosa polarnih atoma (obično kiseonika, azota i spojenih atoma vodonika) u molekulu. Pokazano je da je PSA u korelaciji sa transportnim karakteristikama jedinjenja kao što je transport kroz krvno-moždanu barijeru. Metode za određivanje PSA jedinjenja se mogu naći, npr., u, Ertl, P., i sar., J. Med. Chem. 2000, 43, 3714-3717; i Kelder, J., i sar., Pharm, Res. 1999, 16, 1514-1519.
 
U pogledu krvno-moždane barijere, konjugat u vodi rastvorljivog, ne-peptidnog oligomera-leka malog molekula pokazuje stopu prelaza krvno-moždane barijere koja je smanjena u odnosu na stopu prelaza leka malog molekula koji nije vezan na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer. Poželjni primeri smanjenja stope prelaza krvno-moždane barijere za ovde opisana jedinjenja uključuju smanjenja od: barem oko 30%; barem oko 40%; barem oko 50%; barem oko 60%; barem oko 70%; barem oko 80%; ili barem oko 90%, u odnosu na stope prelaza krvno-moždane barijere za mali molekul leka koji nije vezan na u vodi rastvorljiv oligomer. Poželjno smanjenje stope prelaza krvno-moždane barijere za konjugat je barem oko 20%.
 
Kao što je gore pomenuto, jedinjenja prema pronalasku sadrže ostatak opioidnog agonista. Testovi za određivanje da li dato jedinjenje (bez obzira da li je jedinjenje u konjugovanom obliku ili ne) može da deluje kao agonist na mu receptor ili kapa receptore su opisani dole.
 
U nekim slučajevima, opioidni agonisti mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Pored toga, opioidni agonisti mogu da se dobiju hemijskom sintezom. Sintetički pristupi za pripremanje opioidnih agonista su opisani u literaturi, te na primer, u američkim patentima brojevi: 2,628,962, 2,654,756, 2,649,454, i 2,806,033.
 
Svaki od ovih (i drugih) opioidnih agonista može biti kovalentno vezan (bilo direktno ili preko jednog ili više atoma) na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Opioidni agonist za spajanje na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer ima slobodnu hidroksilnu, karboksilnu, tio, amino grupu, ili slično (tj., "ručku") pogodnu za kovalentno vezivanje za oligomer. Pored toga, opioidni agonist može biti modifikovan uvođenjem reaktivne grupe, poželjno konverzijom jedne od postojećih funkcionalnih grupa u funkcionalnu grupu pogodnu za formiranje stabilne kovalentne veze između oligomera i leka.
 
Oligomer je homo-oligomer etilen oksida. Obično, mada ne obavezno, terminus (ili terminusi) na oligomeru koji nije kovalentno vezan na mali molekul je ograničen da ga učini nereaktivnim. Alternativno, terminus može da sadrži reaktivnu grupu. Kada je terminus reaktivna grupa, ta je reaktivna grupa ili izabrana tako da bude nereaktivna pod uslovima formiranja finalnog oligomera ili tokom kovalentnog vezivanja oligomera na lek malog molekula, ili je zaštićena ako je to potrebno. Jedna zajednička završna-funkcionalna grupa je hidroksil ili-OH, naročito za oligoetilen okside.
 
U vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer (npr., "POLI" u raznim strukturama koje su ovde pomenute) može imati bilo koju od brojnih različitih geometrija. Na primer, može biti linearni, razgranati ili račvast. Najtipičnije, u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer je linearni ili je razgranat, na primer, koji ima jednu tačku račvanja.
 
Molekulska težina u vodi rastvorljivog, ne-peptidnog oligomera, isključujući linker deo, generalno je relativno niska. Primeri vrednosti molekulske težine u vodi rastvorljivog polimera uključuju: ispod oko 1500; ispod oko 1450; ispod oko 1400; ispod oko 1350; ispod oko 1300; ispod oko 1250; ispod oko 1200; ispod oko 1150; ispod oko 1100; ispod oko 1050; ispod oko 1000; ispod oko 950; ispod oko 900; ispod oko 850; ispod oko 800; ispod oko 750; ispod oko 700; ispod oko 650; ispod oko 600; ispod oko 550; ispod oko 500; ispod oko 450; ispod oko 400; ispod oko 350; ispod oko 300; ispod oko 250; ispod oko 200; te ispod oko 100 Daltona.
 
Primeri raspona molekulskih težina u vodi rastvorljivog, ne-peptidnog oligomera (isključujući linker deo) uključuju: od oko 100 do oko 1400 Daltona; od oko 100 do oko 1200 Daltona; od oko 100 do oko 800 Daltona; od oko 100 do oko 500 Daltona; od oko 100 do oko 400 Daltona; od oko 200 do oko 500 Daltona; od oko 200 do oko 400 Daltona; od oko 75 do 1000 Daltona; te od oko 75 do oko 750 Daltona.
 
Broj monomera kod u vodi rastvorljivog, ne-peptidnog oligomera spada u okvir jednog ili više od sledećih raspona: između 1 i 30 (zaključno); između 1 i 25; između 1 i 20; između 1 i 15; između 1 i 12; između 1 i 10. U nekim slučajevima, broj monomera u seriji u oligomeru (i u odgovarajućem konjugatu) je jedan od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8. U dodatnim realizacijama, oligomer (i odgovarajući konjugat) sadrži 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 monomera. U još daljim realizacijama, oligomer (i odgovarajući konjugat) poseduje 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 monomera u seriji. Prema tome, u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer je CH3-(OCH2CH2)n-, i "n" je ceo broj koji može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30, te može spadati u jedan ili više od sledećih raspona: između 1 i 25; između 1 i 20; između 1 i 15; između 1 i 12; između 1 i 10.
 
Kada u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 monomera, vrednosti odgovaraju metoksi završnom krajnjem oligo(etilen oksidu) koji ima odgovarajuće molekulske težine od oko 75, 119, 163, 207, 251, 295, 339, 383, 427, te 471 Daltona. Kada oligomer ima 11, 12, 13, 14, ili 15 monomera, vrednosti odgovaraju metoksi završnom krajnjem oligo(etilen oksidu) koji ima odgovarajuće molekulske težine do oko 515, 559, 603, 647, te 691 Daltona.
 
Kada je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer vezan na opioidni agonist (za razliku od dodavanja korak po korak jednog ili više monomera kako bi efikasno "izrastao" oligomer na opioidnom agonistu), poželjno je da kompozicija sadrži aktivisani oblik u vodi rastvorljivog, ne-peptidnog oligomera koji je monodisperzovan. Međutim, u tim slučajevima, gde je korišćena bimodalna kompozicija, kompozicija će posedovati bimodalnu distribuciju sa centrom oko bilo koja dva od gore pomenutih brojeva monomera. Idealno, indeks polidisperzivnosti svakog pika u bimodalnoj distribuciji, Mw/Mn, je 1.01 ili manje, te čak još poželjnije, je 1.001 ili manje, te čak još poželjnije je 1.0005 ili manje. Najpoželjnije, svaki pik ima vrednost Mw/Mn od 1.0000. Na primer, bimodalni oligomer može imati bilo koji od sledećih primera kombinacija monomernih podjedinica: 1-2,1-3,1-4, 1-5, 1-6, 1-7,1-8,1-9, 1-10, i tako dalje; 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9,2-10, i tako dalje; 3-4,3-5,3-6,3-7, 3-8, 3-9, 3-10, i tako dalje; 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, i tako dalje; 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, i tako dalje; 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, i tako dalje; 7-8, 7-9, 7-10, i tako dalje; i 8-9, 8-10, i tako dalje.
 
U nekim slučajevima, kompozicija koja sadrži aktivisani oblik u vodi rastvorljivog, ne-peptidnog oligomera će biti trimodalna ili čak tetramodalna, koja sadrži raspon monomernih jedinica kako je prethodno opisano. Kompozicije oligomera koje imaju dobro definisanu smešu oligomera (tj., koje su bimodalne, trimodalne, tetramodalne, i tako dalje) mogu biti pripremljene mešanjem prečišćenih monodisperznih oligomera da se dobije željeni profil oligomera (smeša dva oligomera koji se razlikuju samo u broju monomera je bimodalna; smeša tri oligomera koji se razlikuju samo u broju monomera je trimodalna; smeša četiri oligomera koji se razlikuju samo u broju monomera je tetramodalna), ili alternativno, mogu se dobiti pomoću kolonske hromatografije polidisperznog oligomera obnavljanjem "centralnog reza", da se dobije smeša oligomera u jednom željenom i definisanom rasponu molekularne težine.
 
Poželjno je da se u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer dobiva iz kompozicije koja je poželjno unimolekularna ili monodisperzna. To jest, da oligomeri u kompoziciji imaju istu diskretnu vrednost molekulske težine, a ne raspodelu molekulskih težina. Neki monodisperzni oligomeri mogu se nabaviti iz komercijalnih izvora kao što su oni dostupni od tvrtke Sigma-Aldrich, ili alternativno, mogu biti pripremljeni direktno iz komercijalno dostupnih polaznih materijala kao što je Sigma-Aldrich. U vodi rastvorljivi, ne-peptidni oligomeri mogu se pripremiti kako je opisano u Chen Y., Baker, G.L., J. Org. Chem., 6870-6873 (1999), WO 02/098949, te u objavi američke prijave patenta 2005/0136031.
 
U ovom opisu veza "X" između u vodi rastvorljivog, ne-peptidnog oligomera i malog molekula se obično formira reakcijom funkcionalne grupe na terminusu oligomera (ili jednog ili više monomera kada se želi da oligomer "raste" na opioidnom agonistu) sa odgovarajućom funkcionalnom grupom u opioidnom agonistu. Ilustrativne reakcije su ukratko opisane u daljem tekstu. Na primer, amino grupa na oligomeru može da reaguje sa karboksilnom kiselinom ili aktivisanim derivatom karboksilne kiseline na malom molekulu, ili obrnuto, da proizvede amidnu vezu. Alternativno, reakcija amina na oligomeru sa aktivisanim karbonatom (npr. sukcinimidil ili benzotriazil karbonatom) na leku, ili obratno, formira karbamatnu vezu. Reakcija amina na oligomeru sa izocijanatom (R-N=C=O) na leku, ili obratno, formira ureja vezu (R-NH-(C=O)-NH-R'). Dalje, reakcija alkoholne (alkoksidne) grupe na oligomeru sa alkil halogenidom, ili halogenidnom grupom u leku, ili obrnuto, formira etarsku vezu. U još jednom pristupu kuplovanja, mali molekul koji ima aldehidnu funkciju je kuplovan na oligomernu amino grupu reduktivnom aminacijom, što dovodi do formiranja sekundarne aminske veze između oligomera i malog molekula.
 
Posebno poželjan u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer je oligomer koji nosi aldehidnu funkcionalnu grupu. U tom smislu, oligomer će imati sledeću strukturu: CH3O-(CH2-CH2-O)n-(CH2)p-C(O)H, gde (n) je jedan od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 i (p) je jedan od 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7. Poželjne vrednosti za (n) su 3, 5 i 7 i poželjne vrednosti za (p) su 2; 3 i 4. Pored toga, atom ugljenika alfa za -C(O)H radikal može opciono biti supstituisan sa alkilom.
 
Tipično, terminus za u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer koji ne nosi funkcionalnu grupu je ograničen da ga se učini nereaktivnim. Kada oligomer ne obuhvata dalju funkcionalnu grupu na drugom terminusu od onog koji je namenjen za formiranje konjugata, ta je grupa ili izabrana tako da je nereaktivna pod uslovima formiranja veze "X," ili je zaštićena tokom formiranja veze "X."
 
Kako je gore navedeno, u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer pre konjugacije obuhvata barem jednu funkcionalnu grupu. Funkcionalna grupa tipično sadrži elektrofilnu ili nukleofilnu grupu za kovalentno vezivanje na mali molekul, u zavisnosti od reaktivne grupe koja se nalazi unutar ili je uvedena u mali molekul. Primeri nukleofilnih grupa koje mogu biti prisutne bilo u oligomeru ili malom molekulu uključuju hidroksil, amino, hidrazin (-NHNH2), hidrazid (-C(O)NHNH2), i tiol. Poželjni nukleofili uključuju amin, hidrazin, hidrazid, i tiol, naročito amin. Većina lekova malih molekula za kovalentno vezivanje na oligomer će imati slobodnu hidroksilnu, amino, tio, aldehidnu, keton ili karboksilnu grupu.
 
Primeri elektrofilnih funkcionalnih grupa koje mogu biti prisutne bilo u oligomeru ili malom molekulu obuhvataju karboksilnu kiselinu, karboksilni estar, naročito imid estre, ortoestar, karbonat, izocijanat, izotiocijanat, aldehid, keton, tion, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, sulfon, maleimid, disulfid, jod, epoksid, sulfonat, tiosulfonat, silan, alkokisilan te halosilan. Specifičniji primeri ovih grupa obuhvataju sukcinimidil estar ili karbonat, imidazoil estar ili karbonat, benzotriazol estar ili karbonat, vinil sulfon, hloroetilsulfon, vinilpiridin, piridil disulfid, jodoacetamid, glioksal, dion, mesilat, tozilat, i trezilat (2,2,2-trifluoroetansulfonat).
 
Takođe su uključeni analozi sumpora za nekoliko pomenutih grupa, kao što su tion, tion hidrat, tioketal, 2-tiazolidin tion, itd., kao i hidrati ili zaštićeni derivati bilo kojeg od gore pomenutih radikala (npr. aldehid hidrat, hemiacetal, acetal, keton hidrat, hemiketal, ketal, tioketal, tioacetal).
 
"Aktivisani derivat" karboksilne kiseline se odnosi na derivat karboksilne kiseline koji lako reaguje sa nukleofilima, generalno mnogo lakše nego ne-derivatizovane karboksilne kiseline. Aktivisane karboksilne kiseline uključuju, na primer, halogenidnu kiselinu (kao što su kiseli hloridi), anhidride, karbonate i estre. Takvi estri uključuju imid estre, opšte forme -(CO)O-N[(CO)-]2; na primer, N-hidroksisukcinimidil (NHS) estre ili N-hidroksiftalimidil estre. Takođe su poželjni imidazolil estri i benzotriazol estri. Posebno poželjni su estri aktivisane propionske kiseline ili butanoične kiseline, kao što je opisano u zajedničkom američkom patentu 5,672,662. Ovo uključuje grupe oblika -(CH2)2-3)C(=O)O-Q, gde je Q poželjno izabran iz skupine koju čine N-sukcinimid, N-sulfosukcinimid, N-ftalimid, N-glutarimid, N-tetrahidroftalimid, N-norbornen-2,3-dikarboksimid, benzotriazol, 7-azabenzotriazol, te imidazol.
 
Druge poželjne elektrofilne grupe obuhvataju sukcinimidil karbonat, maleimid, benzotriazol karbonat, glicidil etar, imidazoil karbonat, p-nitrofenil karbonat, akrilat, trezilat, aldehid, te ortopiridil disulfid.
 
Ove elektrofilne grupe podležu reakciji sa nukleofilima, npr. hidroksi, tio ili amino grupama, za dobijanje različitih vrsta veza. Za ovaj pronalazak poželjne su reakcije koje pogoduju formiranju hidrolitički stabilne veze. Na primer, karboksilne kiseline i njihovi aktivisani derivati, koji uključuju ortoestre, sukcinimidil estre, imidazolil estre i benzotriazol estre, reaguju sa pomenutim vrstama nukleofila tako da formiraju odgovarajuće estre, tioestre i amide, od kojih su amidi najviše hidrolitički stabilni. Karbonati, uključujući sukcinimidil, imidazolil i benzotriazol karbonate, reaguju sa amino grupama da formiraju karbamate. Izocijanati (R-N=C=O) reaguju sa hidroksil ili amino grupama da formiraju, odgovarajuće, karbamatne veze (RNH-C(O)-ILI') ili ureja veze (RNH-C(O)-NHR'). Aldehidi, ketoni, glioksali, dioni i njihovi hidrati ili alkoholni adukti (tj. aldehid hidrat, hemiacetal, acetal, keton hidrat, hemiketal, te ketal) poželjno reaguju sa aminima, posle čega, ukoliko se želi, sledi redukcija dobijenog imina, da dobije aminska veza (reduktivna aminacija).
 
Nekoliko elektrofilnih funkcionalnih grupa obuhvata dvostruke elektrofilne veze na koje se mogu dodati nukleofilne grupe, kao što su tioli, da formiraju, na primer, tioetarske veze. Ove grupe uključuju maleimide, vinil sulfone, vinil piridin, akrilate, metakrilate i akrilamide. Druge grupe obuhvataju odlazeće grupe koje mogu biti zamenjene nukleofilom; tu spadaju hloretil sulfon, piridil disulfidi (koji uključuju cepajuću S-S vezu), jodoacetamid, mesilat, tozilat, tiosulfonat, i trezilat. Epoksidi reaguju otvaranjem prstena sa nukleofilom, tako da formiraju, na primer, etar ili amin vezu. Reakcije uključuju komplementarne reaktivne grupe kao što su one gore pomenute na oligomeru i mali molekul se koristi za pripremu konjugata prema predmetnom pronalasku
 
U nekim slučajevima opioidni agonist ne može imati funkcionalnu grupu koja je podesna za konjugaciju. U tom slučaju, moguće je modifikovati "originalni" opioidni agonist tako da nema željenu funkcionalnu grupu.
 
Moguće je pripremiti konjugat opioidnog agonista malog molekula koji nosi karboksilnu grupu gde je karboksilna grupa koja nosi opioidni agonist malog molekula kuplovana na amino-terminisani oligomerni etilen glikol, da se dobije konjugat koji ima amidnu grupu koja kovalentno povezuje opioidni agonist malog molekula na oligomer. Ovo se može izvesti, na primer, kombinovanjem karboksilne grupe koja nosi opioidni agonist malog molekula sa amino-terminisanim oligomernim etilen glikolom u prisustvu reagensa za kuplovanje, (kao što je dicikloheksilkarbodiimid ili "DCC") u anhidrovanom organskom rastvaraču.
 
Dodatno, moguće je pripremiti konjugat opioidnog agonista malog molekula koji nosi hidroksilnu grupu gde je hidroksilna grupa koja nosi opioidni agonist malog molekula kuplovana za oligomerni etilen glikol halogenid da se dobije etrom (-O-) vezan konjugat malog molekula. Ovo se može izvesti, na primer, korišćenjem natrijum hidrida da se deprotonuje hidroksilna grupa što je praćeno reakcijom sa halogenidnim terminisanim oligomernim etilen glikolom.
 
U sledećem primeru, moguće je pripremiti konjugat opioidnog agonista malog molekula koji nosi keton grupu, najpre redukovanjem keton grupe tako da formira odgovarajući hidroksilnu grupu. Posle toga, opioidni agonist malog molekula koji sada nosi hidroksilnu grupu može biti kuplovan kako je ovde opisano.
 
U još jednom drugom slučaju, moguće je pripremiti konjugat opioidnog agonista malog molekula koji nosi amino grupu. U jednom pristupu, amino grupa koju nosi opioidni agonist malog molekula i oligomer koji nosi aldehid su rastvoreni u pogodnom puferu posle čega se dodaje pogodno redukciono sredstvo (npr., NaCNBH3). Nakon redukcije, dobijena je amino veza koja se formira između amino grupe na opioidnom agonistu malog molekula koji sadrži amino grupu i karbonil ugljenika na oligomeru koji nosi aldehid.
 
U drugom pristupu za pripremanje konjugata opioidnog agonista malog molekula koji nosi amino grupu, oligomer koji nosi karboksilnu kiselinu i opioidni agonist malog molekula koji nosi amino grupu se kombinuju, obično u prisustvu agensa za kuplovanje (npr., DCC). Rezultat je amidna veza koja se formira između amino grupe na opioidnom agonistu malog molekula koji sadrži amino grupu i karbonila na oligomeru koji nosi karboksilnu kiselinu.
 
Opisani konjugati opioidnih agonista sa formulom I uključuju one koji imaju sledeću strukturu:
 
gde svaki od R2, R3, R4, isprekidana linija ("---"), Y1 i R5 su kao što je prethodno definisano u vezi sa Formulom I, X je spejser grupa i POLI je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Konjugati opioidnog agonista sa formulom I su oni koji imaju sledeću strukturu:
 
gde svaki od R1, R2, R3, R4, isprekidana linija C"---"), Y1 X i POLI su kao što je definisano u zahtevima.
 
Postoje takođe opisani konjugati opioidnih agonista sa formulom I koji obuhvataju one koji imaju sledeću strukturu:
 
gde svaki od R1, R2, R3, R4, Y1 i R5 je kao što je prethodno definisano u vezi sa Formulom I, X je spejser grupa i POLI je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Opisani su konjugati opioidnih agonista sa formulom I koji obuhvataju one koji imaju sledeću strukturu:
 
gde svaki od R1, R2, R3, R4, Y1 i R5 je kao što je prethodno definisano u vezi sa Formulom I, X je spejser grupa i POLI je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Opisani su konjugati opioidnih agonista sa formulom I koji obuhvataju one koji imaju sledeću strukturu:
 
gde svaki od R1, R3, R4, isprekidana linija ("---"), Y1 i R5 je kao što je prethodno definisano u vezi sa Formulom I, X je spejser grupa i POLI je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Opisani su konjugati sledećih formula:
 
 
 
Konjugat prema pronalasku ima sledeću formulu
 
Opisani su konjugati sa sledećim formulama
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
i
 
gde, kada je prisutan, svaki od R1, R2, R3, R4, isprekidana linija ("---"), Y1 i R5 su kao što je prethodno definisano u vezi sa Formulom I, a promenljiva "n" je ceo broj od 1 do 30. Konjugati koji ne spadaju pod obim zahteva ne čine deo ovog pronalaska.
 
Dodatni opisani konjugati obuhvataju one niže pomenute:
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
gde, za svaki od gore pomenutih konjugata, X je linker (npr., kovalentna veza "-" ili jedan ili više atoma) i POLI je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Dodatni konjugat je opisan ispod:
 
gde:
R1 je acil
R2 je odabran iz grupe koju čine vodonik, halogen, nesupstituisani alkil i alkil supstituisan sa halogenom;
R3 je odabran iz grupe koju čine halogen i alkoksi;
R3 je odabran iz grupe koju čine hidroksil, ester, alkoksi, te alkoksialkil;
A1 je alkilen;
X je linker; i
POLI je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer.
 
Konjugati iz ovog pronalaska pokazuju smanjenu brzinu prelaza krvno-moždane barijere. Štaviše, konjugati održavaju najmanje oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ili više bioaktivnosti nemodifikovanog matičnog leka malog molekula.
 
Iako se veruje da je ovde opisan pun obim ovde izloženih konjugata, oligomer optimalne veličine može se odrediti na sledeći način.
 
Prvo, oligomer dobijen iz monodisperznog ili bimodalnog u vodi rastvorljivog oligomera je konjugovan sa lekom malog molekula. Poželjno, lek je oralno biodostupan, te sam za sebe, pokazuje nezanemarivu stopu prelaza krvno-moždane barijere. Sledeće, sposobnost konjugata da pređe krvno-moždanu barijeru se određuje korišćenjem odgovarajućeg modela i poređenjem sa ne modifikovanim matičnim lekom. Ukoliko su rezultati povoljni, to jest, ako je na primer, stopa prelaza značajno smanjena, tada se dalje ocenjuje bioaktivnost konjugata. Poželjno, jedinjenja prema pronalasku održavaju značajan stepen biološke aktivnosti u odnosu na osnovni lek, odnosno, veći od oko 30% od biološke aktivnosti matičnog leka, ili još poželjnije, veći od oko 50% biološke aktivnosti matičnog leka.
 
Gore pomenuti koraci se ponavljaju jedan ili više puta koristeći oligomere istog tipa monomera ali koji imaju različit broj podjedinica i rezultati se upoređuju.
 
Za svaki konjugat čija je sposobnost da pređe krvno-moždanu barijeru smanjena u odnosu na ne-konjugovani lek malog molekula, potom se procenjuje njegova oralna biodostupnost. Na osnovu ovih rezultata, to jest, na osnovu poređenja konjugata oligomera različitih veličina prema datom malom molekulu na datoj poziciji ili lokaciji unutar malog molekula, moguće je odrediti veličinu najefikasnijeg oligomera kod dobivanja konjugata koji ima optimalnu ravnotežu između smanjenja stope prelaza biološke membrane, oralne bioraspoloživosti, te biološke aktivnosti. Mala veličina oligomera pravi takve projekcije izvodljivim, te omogućava efikasno prilagođavanje karakteristika dobijenog konjugata. Praveći male, postepene promene u veličini oligomera, te koristeći eksperimentalan pristup dizajnu, moguće je efikasno identifikovati konjugat koji ima povoljan balans smanjenja stope prelaza biološke membrane, bioaktivnosti, te oralne bioraspoloživosti. U nekim slučajevima, vezivanje jednog oligomera kako je ovde opisano, efikasno je da se zaista poveća oralna bioraspoloživost leka.
 
Na primer, lice uobičajeno verzirano u ovoj oblasti tehnike, pomoću rutinskih eksperimenata, može odrediti molekularnu veličinu i tip veze koja najbolje odgovara za poboljšanje oralne bioraspoloživosti prvo pomoću pripreme niza oligomera sa različitim težinama i funkcionalnim grupama, a zatim sa dobijanjem neophodnih profila oslobađanja davanjem konjugata pacijentu i periodičnim uzimanjem uzoraka krvi i/ili mokraće. Kada je dobijen niz profila oslobađanja za svaki testirani konjugat, moguće je identifikovati pogodan konjugat.
 
Životinjski modeli (glodari i psi) mogu se takođe koristiti za proučavanje oralnog transporta leka. Pored toga, metode koje nisu in vivo obuhvataju model isečenog tkiva creva glodara i model Caco–2 ćelijskog monosloja tkiva-kulture. Ovi modeli su korisni za predviđanje oralne biodostupnosti leka.
 
Da bi se odredilo da li opioidni agonist ili konjugat opioidnog agonista i u vodi rastvorljiv ne-peptidni oligomer ima aktivnost kao mu opioidni receptorski agonist, moguće je testirati takvo jedinjenje. Na primer, KD (afinitet vezivanja) i Bmax (receptorski broj) može da se odredi korišćenjem modifikovanog pristupa od onog koji je opisan u Malatynska i sar. (1995) NeuroReport 6:613-616. Ukratko, humani mu receptori mogu rekombinantno biti eksprimirani u ćelijama jajnika kineskog hrčka. Može da se koristi radioligand [3H]-diprenorfin (30-50 Ci/mmol) sa konačnom koncentracijom liganda od [0.3 nM]. Nalokson se koristi kao nespecifična determinanta [3.0 nM], referentno jedinjenje i pozitivna kontrola. Reakcije se izvode u 50 mM TRIS-HCl (pH 7.4) koji sadrži 5 mM MgCl2, kod 25 °C kroz 150 minuta. Reakcija se prekida brzom vakuum filtracijom na filterima od staklenih vlakana. Radioaktivnost uhvaćena na filterima se određuje i upoređuje sa kontrolnim vrednostima kako bi se utvrdile bilo kakve interakcije testiranog jedinjenja sa kloniranim mu mestom vezivanja.
 
Slično testiranje može da se provede za kapa opioidni receptorski agonist. Videti, na primer, Lahti i sar. (1985) Eur. Jml. Pharmac. 109:281-284; Rothman i sar. (1992) Peptides 13:977-987; Kinouchi i sar. (1991) Eur. Jrnl. Pharmac. 207:135-141. Ukratko, humani kapa receptori mogu se dobiti iz cerebelarnih membrana zamorčeta. Može da se koristi radioligand [3H]-U-69593 (40-60 Ci/mmol) sa konačnom koncentracijom liganda od [0.75 nM]. U-69593 se koristi kao nespecifična determinanta [1.0 µM], referentno jedinjenje i pozitivna kontrola. Reakcije se izvode u 50 mM HEPES (pH 7.4) kod 30 °C kroz 120 minuta. Reakcija se prekida brzom vakuum filtracijom na filterima od staklenih vlakana. Radioaktivnost uhvaćena na filterima se određuje i upoređuje sa kontrolnim vrednostima kako bi se utvrdile bilo kakve interakcije testiranog jedinjenja sa kloniranim kapa mestom vezivanja.
 
Ovaj pronalazak takođe obuhvata farmaceutske preparate koji sadrže konjugat kako je ovde opisano u kombinaciji sa farmaceutskim ekscipijentom. Generalno, sam konjugat će biti u čvrstom obliku (npr. precipitat), koji se može kombinovati sa pogodnim farmaceutskim ekscipijentom koji može biti bilo u čvrstom ili u tečnom obliku.
 
Primeri ekscipijenata obuhvataju, bez ograničenja, one odabrane iz grupe koju čine ugljeni hidrati, neorganske soli, antimikrobni agensi, antioksidanti, surfaktanti, puferi, kiseline, baze, te njihove kombinacije.
 
Kao ekscipijens može biti prisutan ugljeni hidrat kao što je šećer, derivatizovani šećer kao alditol, aldonska kiselina, esterifikovani šećer i/ili polimer šećera. Specifični ekscipijensi ugljenih hidrata uključuju, na primer: monosaharide, kao što je fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza, D-manoza, sorboza, i slično; disaharide, kao što su laktoza, saharoza, trehaloza, celobioza, i slično; polisaharide, kao što su rafinoza, melezitoza, maltodekstrini, dekstrani, skrobovi i slično; te alditole, kao što su manitol, ksilitol, maltitol, laktitol, ksilitol, sorbitol (glucitol), piranozil sorbitol, mioinozitol, i slično.
 
Ekscipijent može takođe da obuhvata neorgansku so ili pufer kao što je limunska kiselina, natrijum hlorid, kalijum hlorid, natrijum sulfat, kalijum nitrat, monobazni natrijum fosfat, natrijum fosfat, te njihove kombinacije.
 
Preparat može takođe da sadrži antimikrobni agens za sprečavanje ili odvraćanje rasta mikroba. Neograničavajući primeri antimikrobnih agenasa pogodnih za ovaj pronalazak uključuju benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzil alkohol, cetilpiridinijum hlorid, hlorobutanol, fenol, feniletil alkohol, fenilživa nitrat, timersol, te njihove kombinacije.
 
U preparatu može takođe da bude prisutan antioksidans. Antioksidansi se koriste za sprečavanje oksidacije, čime se sprečava pogoršanje konjugata ili drugih komponenti preparata. Pogodni antioksidansi za korišćenje u predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, hipofosfornu kiselinu, monotioglicerol, propil galat, natrijum bisulfit, natrijum formaldehid sulfoksilat, natrijum metabisulfit, te njihove kombinacije.
 
Kao ekscipijens može biti prisutan surfaktant. Primeri surfaktanata obuhvataju: polisorbate, kao što su "Tween 20" i "Tween 80," te pluronike kao što su F68 i F88 (oba su dostupni od BASF, Mount Olive, New Jersey); sorbitan estre; lipide, kao što su kao što su lecitin i drugi fosfatidilholini, fosfatidiletanolamini (iako poželjno ne u lipozomalnoj formi), masne kiseline i masne estre; steroide, kao što je holesterol; te helirajuće agense, kao što su EDTA, cink i drugi takvi pogodni katjoni.
 
Farmaceutski prihvatljive kiseline ili baze mogu biti prisutne u preparatu kao ekscipijent. Primeri kiselina koje se mogu da se koriste obuhvataju one odabrane iz grupe koju čine hlorovodonična kiselina, sirćetna kiselina, fosforna kiselina, limunska kiselina, jabučna kiselina, mlečna kiselina, mravlja kiselina, trihlorsirćetna kiselina, azotna kiselina, perhlorna kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina, fumarna kiselina, te njihove kombinacije. Primeri pogodnih baza uključuju, baze izabrane iz grupe koju čine natrijum-hidroksid, natrijum acetat, amonijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum acetat, kalijum acetat, natrijum fosfat, kalijum fosfat, natrijum citrat, natrijum format, natrijum sulfat, kalijum sulfat, kalijum fumarat, te njihove kombinacije.
 
Količina konjugata u kompoziciji će varirati u zavisnosti od niza faktora, ali će kada se kompozicija čuva u jediničnim dozama optimalno biti terapeutski efikasna doza. Terapeutski efikasna doza može se odrediti eksperimentalno ponovljenim davanjem povećanih količina konjugata kako bi se utvrdilo koji iznos daje klinički željenu krajnju tačku.
 
Količina svakog pojedinačnog ekscipijensa u kompoziciji će varirati u zavisnosti od aktivnosti ekscipijensa i posebnih zahteva kompozicije. Tipično, optimalna količina bilo kojeg pojedinačnog ekscipijensa određuje se kroz rutinsko eksperimentisanje, odnosno, pripremom kompozicija koje sadrže različite količine ekscipijensa (u rasponu od najniže do najviše), ispitivanjem stabilnosti i drugih parametara, a zatim određivanjem raspona u kojem se postižu optimalne performanse bez značajnih štetnih efekata.
 
Međutim, generalno, ekscipijent će biti prisutan u preparatu u količini od oko 1% do oko 99% po težini, poželjno od oko 5%-98% po težini, poželjnije od oko 15-95% po težini ekscipijensa, sa najpoželjnijim koncentracijama manjim od 30% po težini.
 
Ovi prethodni farmaceutski ekscipijensi zajedno sa drugim ekscipijensima i opštim znanjem koje se odnosi se na farmaceutske kompozicije opisani su u "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), i Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
 
Farmaceutske kompozicije mogu da imaju bilo koji broj formi i pronalazak u tom pogledu nije ograničen. Primeri preparata su najpoželjnije u formi pogodnoj za oralno davanje kao što su tablete, kaplete, kapsule, gel kapsule, troheje, disperzije, suspenzije, rastvori, eliksiri, sirup, lozenge, transdermalni flaster, sprej, supozitoriji, te prah.
 
Oralni dozni oblici su poželjni za one konjugate koji su oralno aktivni, te uključuju tablete, kaplete, kapsule, gel kapsule, suspenzije, rastvore, eliksire, te sirupe, a mogu takođe da sadrže mnoštvo granula, perli, prašaka ili peleta koji su opciono inkapsulirani. Takvi dozni oblici se pripremaju uz pomoć konvencionalnih postupaka poznatih onima u oblasti farmaceutskih formulacija i opisanih u odgovarajućim tekstovima.
 
Tablete i kaplete, na primer, mogu se proizvesti korišćenjem standardnih postupaka i opreme za tabletiranje. Tehnike direktne kompresije i granulacije imaju prednost kada se pripremaju tablete ili kaplete koje sadrže ovde opisane konjugate. Pored konjugata, tablete i kaplete uopšteno će sadržavati neaktivne, farmaceutski prihvatljive materijale nosača kao što su veziva, lubrikanti, dezintegranti, punila, stabilizatori, surfaktanti, sredstva za bojenje i slično. Veziva se koriste da obezbede kohezivne kvalitete tablete, te se tako obezbeđuje da tableta ostaje netaknuta. Pogodni materijali uključuju veziva, skrob (uključujući kukuruzni skrob i preželatinizirani skrob), želatin, šećere (uključujući sukrozu, glukozu, dekstrozu i laktozu), polietilen glikol, voskove, te prirodne i sintetičke gume, npr. akacija, natrijum alginat, polivinilpirolidon, celulozne polimere (uključujući hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, metil celulozu, mikrokristalnu celulozu, etil celulozu, hidroksietil celulozu, i slično), te Veegum. Maziva se koriste za olakšavanje proizvodnje tableta, olakšavanje protoka praha i sprečavanje nakupljanja čestica (tj. lom čestica) kada pritisak oslabi. Korisna maziva su magnezijum stearat, kalcijum stearat, te stearinska kiselina. Dezintegranti se koriste za olakšavanje dezintegracije tablete, te su generalno skrob, gline, celuloze, algini, gume, ili umreženi polimeri. Fileri uključuju, na primer, materijale kao što su silicijum dioksid, titanijum dioksid, aluminijum oksid, talk, kaolin, celuloza u prahu, i mikrokristalna celuloza, kao i rastvorljive materijale kao što su manitol, ureja, saharoza, laktoza, dekstroza, natrijum hlorid, i sorbitol. Stabilizatori, koji su dobro poznati u tehnici, se koriste za inhibiciju ili usporavanje reakcija raspadanja leka koje uključuju, na primer, oksidativne reakcije.
 
Kapsule su takođe poželjne oralne dozne forme, u kom slučaju konjugat koji sadrži preparat može da bude inkapsuliran u formi tečnosti ili gela (npr. u slučaju gel kapsule) ili u čvrstoj formi (uključujući čestice kao što su granule, perle, prahovi ili peleti). Pogodne kapsule obuhvataju tvrde i meke kapsule, te su generalno napravljene od želatina, skroba, ili celuloznih materijala. Dvodelne tvrde želatinske kapsule su poželjno zatvorene, kao što je sa trakama od želatina ili slično.
 
Obuhvaćene su parenteralne formulacije u suštinski suvom obliku (tipično kao liofilizat ili talog, koji mogu biti u formi praha), kao i formulacije pripremljene za injekcije, koje su tipično u formi tečnosti i zahtevaju korak rekonstituisanja suvog oblika parenteralne formulacije. Primeri pogodnih razblaživača za rekonstituisanje čvrstih kompozicija pre injekcije uključuju bakteriostatsku vodu za injekcije, 5% dekstrozu u vodi, fosfatni pufer, Ringerov rastvor, slani rastvor, sterilnu vodu, dejonizovanu vodu, te njihove kombinacije.
 
U nekim slučajevima, kompozicije namenjene za parenteralnu primenu mogu imati oblik nevodenih rastvora, suspenzija, ili emulzija, koji je svaki tipično sterilan. Primeri nevodenih rastvarača ili vehikuluma su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje i kukuruzno ulje, želatin, te injektibilni organski estri kao što je etil oleat.
 
Ovde opisane parenteralne formulacije mogu da sadrže adjuvante kao što su konzervansi, agensi za vlaženje, emulgatori i agensi za dispergovanje. Formulacije se prave sterilnim inkorporacijom sterilizujućih agensa, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, zračenjem, ili toplotom.
 
Konjugat se takođe može davati kroz kožu korišćenjem konvencionalnog transdermalnog flastera ili drugog transdermalnog sistema, pri čemu je konjugat sadržan unutar laminirane strukture koja služi kao uređaj za davanje leka koji se stavlja na kožu. U takvoj strukturi, konjugat se nalazi u sloju, ili "rezervoaru" koji leži ispod gornjeg sloja osnove. Laminirana struktura može da sadrži jedan rezervoar, ili može da sadrži više rezervoara
 
Konjugat se takođe može formulisati u supozitorij za rektalnu primenu. U pogledu supozitorija, konjugat se meša sa osnovnim materijalom supozitorija koji je (npr. ekscipijent koji ostaje čvrst na sobnoj temperaturi, ali omekšava, topi se ili rastvara kod telesne temperature) kao što su kakao maslo (ulje kakaovca), polietilen glikoli, glicerinovani želatin, masne kiseline, te njihove kombinacije. Supozitoriji mogu biti pripremljeni, na primer, provođenjem sledećih koraka (ne nužno u predstavljenom redosledu): topljenje osnovnog materijala supozitorija da bi se formirao rastop; uključivanje konjugata (pre ili posle topljenja osnovnog materijala supozitorija); sipanje rastopa u kalup; hlađenje rastopa (npr., stavljanje kalupa koji sadrži rastop u okruženje sobne temperature) da se time formiraju supozitoriji; te uklanjanje supozitorija iz kalupa.   Pronalazak takođe obezbeđuje konjugat kao što je ovde opisano za davanje pacijentu koji pati od stanja koje odgovara na tretman sa konjugatom. Lečenje obuhvata primenu, generalno oralno, terapeutski efikasne količine konjugata (poželjno date kao deo farmaceutskog preparata). Takođe su razmatrani drugi oblici davanja, kao što je pulmonalno, nazalno, bukalno, rektalno, sublingvalno, transdermalno i parenteralno. Kako se ovde koristi, izraz "parenteralno" obuhvata subkutano, intravensko, intra-arterijsko, intraperitonealno, intrakardijalno, intratekalno i intramuskularno ubrizgavanje, kao i infuzione injekcije.   U slučajevima kada se koristi parenteralna primena, može biti neophodno koristiti nešto veće oligomere od onih prethodno opisanih, sa molekulskim težinama u rasponu od oko 500 do 30 hiljada Daltona (npr., koji imaju molekulske težine od oko 500, 1000, 2000, 2500, 3000, 5000, 7500, 10000,15000, 20000, 25000, 30000 ili čak još više).   Metod davanja može da se koristi za lečenje bilo kog stanja koje se može regulisati ili sprečiti primenom određenog konjugata. Oni koji su uobičajeno verzirani u oblasti tehnike će poznavati koja stanja specifični konjugat može efikasno lečiti. Stvarna doza koja će se primenjivati varira u zavisnosti od starosti, težine i opšteg stanja subjekta, kao i ozbiljnosti stanja koje se leči, proceni lekara, te konjugatu koji se primenjuje. Terapijski efikasne količine su poznate stručnjacima u oblasti i/ili su opisane u relevantnim referentnim tekstovima i literaturi. Generalno, terapeutski efikasna količina biće u opsegu od oko 0.001 mg do 1000 mg, poželjno u dozama od 0.01 mg/dnevno do 750 mg/dnevno, te poželjnije u dozama od 0.10 mg/dnevno do 500 mg/dnevno.   Jedinična doza bilo kojeg datog konjugata (opet, poželjno obezbeđena kao deo farmaceutskog preparata) može biti davana u raznim režimima doziranja u zavisnosti od procene lekara, potrebama pacijenta, i tako dalje. Poseban režim doziranja biće poznat onima sa uobičajenim iskustvom u tehnici ili se može eksperimentalno odrediti, korišćenjem rutinskih metoda. Primeri režima doziranja uključuju, davanje pet puta dnevno, četiri puta dnevno, tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, tri puta nedeljno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, dva puta mesečno, jednom mesečno, te bilo koju njihovu kombinaciju. Kada je postignuta klinička krajnja tačka, doziranje kompozicije se zaustavlja.   Jedna od prednosti davanja konjugata prema predmetnom pronalasku je da se smanjenje metabolizma prvog prolaza može ostvariti u odnosu na matični lek. Takav rezultat je prednost za mnoge lekove za oralno davanje koji značajno metabolišu prolaskom kroz creva. Na ovaj način, prolaz konjugata se može modulisati odabirom molekularne veličine oligomera, veze, te položaja kovalentne veze koji obezbeđuju željene karakteristike prolaza. Lice koje je uobičajeno verzirano u stanju tehnike može na osnovu ovde datih razmatranja da odredi idealnu molekularnu veličinu oligomera. Poželjno smanjenje metabolizma prvog prolaza za konjugat u poređenju sa odgovarajućim ne konjugovanim lekom malog molekula uključuje: najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30; najmanje oko 40; najmanje oko 50%; najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80% i najmanje oko 90%.   Opisan je postupak za smanjenje metabolizma aktivnog agensa. Postupak obuhvata korake: pripremu monodisperznog ili bimodalnog konjugata, te se svaki konjugat sastoji od grupe nastale od leka malog molekula kovalentno vezanog stabilnom vezom na u vodi rastvorljiv oligomer, gde pomenuti konjugat ima redukovanu stopu metabolizma u poređenju sa stopom metabolizma za lek malog molekula koji nije vezan na u vodi rastvorljiv oligomer; te davanje konjugata pacijentu. Tipično, se davanje vrši putem jedne vrste davanja koje je odabrano iz grupe koju čine oralno davanje, transdermalno davanje, bukalno davanje, transmukozalno davanje, vaginalno davanje, rektalno davanje, parenteralno davanje, te pulmonalno davanje.   Iako korisni u smanjenju za mnoge tipove metabolizma (uključujući oba metabolizma Faze I i Faze II) koji mogu da se redukuju, konjugati su naročito korisni kada lek malog molekula metaboliše pomoću enzima jetre (npr., jedne ili više izoformi citohroma P450) i/ili pomoću jednog ili više crevnih enzima.   EKSPERIMENTALNO Svi hemijski reagensi u priloženim primerima, ukoliko nije drugačije pomenuto, su komercijalno dostupni. Priprema PEG-mera je opisana, na primer, u objavljenoj američkoj prijavi patenta br. 2005/0136031.   Svi 1H NMR (nuklearna magnetna rezonanca) podaci generisani su na NMR spektrometru proizvođača Bruker (MHz ≥ 300). Spisak određenih jedinjenja, kao i izvor jedinjenja je prikazan ispod.   PRIMER 1 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup A" PEG-Nalbufin se priprema upotrebom prvog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.     Desalinizacija Nalbufin hidrohlorid dihidrata: Nalbufin hidrohlorid dihidrat (600 mg, od Sigma) rastvoren je u vodi (100 mL). Dodat je zasićeni vodeni rastvor K2CO3 i zatim je podešen pH na 9.3 sa 1 N HCl rastvorom, zasićenim sa natrijum hloridom. Rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (100 mL), osušen preko Na2SO4, koncentrovan do suva i osušen pod visokim vakumom uz prinos Nalbufina (483.4 mg, 97% regeneracija). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR u CDCl3.         Sinteza 3-O-mPEG3-Nalbufina (2) (n = 3):     Nalbufin (28.5 mg, 0.08 mmol) je rastvoren u smeši acetona (2 mL) i toluena (1.5 mL). Dodat je kalijum karbonat (21 mg, 0.15 mmol), što je praćeno dodavanjem mPEG3-Br (44.5 mg, 0.20 mmol) kod sobne temperature. Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 27.5 časova. Dodato je još kalijum karbonata (24 mg, 0.17 mmol). Smeša se zagreva u CEM mikrotalasnoj pećnici tako da je postignuta temperatura 60 °C tokom 20 minuta, te zatim tako da je postignuta temperatura 100 °C tokom 30 minuta. Dodat je DMF (0.2 mL). Smeša se zagreva sa mikrotalasnom pećnicom na 60 °C tokom 20 minuta, te na 100 °C tokom 30 minuta. Reakcija je koncentrovana da bi se uklonili organski rastvarači, ostatak je pomešan sa vodom (10 mL), te ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko NaxSO4, te je koncentrovan. Sirovi proizvod je proveren sa HPLC i LC-MS. Ostatak je ponovo pomešan sa vodom (10 mL), pH je podešen na 2.3 sa 1N HCl, te ispran sa dihlorometanom (2 x 15 mL). Vodeni rastvor je podešen na pH 10.4 sa 0.2 N NaOH, te ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa Biotage fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu što je rezultiralo sa željenim produktom 3-O-mPEG3-Nalbufinom (2) (n = 3) (32.7 mg) uz 81% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG4-Nalbufina (2) (n = 4):     Smeša nalbufina (96 mg, 0.27 mmol) i mPEG4-OM (131 mg, 0.46 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (113 mg, 0.82 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mEG4-Nalbufin 2 (n = 4) (109 mg) uz 74% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG5-Nalbufina (2) (n = 5):     Smeša nalbufina (78.3 mg, 0.22 mmol) i mPEG5-OM (118 mg, 0.36 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (93 mg, 0.67 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG5-Nalbufin (2) (n = 5) (101 mg) sa 76% prinosom. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG6-Nalbufina (2) (n = 6):     Smeša nalbufina (89.6 mg, 0.25 mmol) i mPEG6-OM(164 mg, 0.44 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (98 mg, 0.71 mmol) grejana je do refluksa kroz 18 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG6-Nalbufin (2) (n = 6) (144 mg) uz 91 % prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 3-O-mPEG7-Nalbufina (2) (n = 7): Smeša nalbufina (67 mg, 0.19 mmol) i mPEG7-Br (131 mg, 0.33 mmol)) u acetonu (10 mL) u prisustvu kalijum karbonata (67 mg, 0.49 mmol) grejana je do refluksa kroz 6 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa dihlorometanom. Rastvor je koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG7-Nalbufin (2) (n = 7) (40.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8):     Smeša nalbufina (60 mg, 0.17 mmol) i mPEG8-Br (105.7 mg, 0.24 mmol) u prisustvu kalijum karbonata (40.8 mg, 0.30 mmol) u toluenu/DMF (3 mL/0.3 mL) zagrevana je sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Zatim je dodat aceton (1 mL). Posle toga smeša se zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura od 100 °C kroz 90 minuta, dodato je još K2CO3 (31 mg, 0.22 mmol) i mPEG8-Br (100 mg, 0.22 mmol). Smeša je zagrevana sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 60 minuta. Ponovno je dodat mPEG8-Br (95 mg, 0.21 mmol). Smeša se ponovo zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je pomešan sa vodom (2 mL) i slanim rastvorom (10 mL). pH rastvora je podešen na 1.56 sa 1 N HCl, te se ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je osušen sa Na2SO4, koncentrovan do prinosa ostatka I (smeša željenog produkta i prekursorskog materijala). Vodeni rastvor je promenjen do pH 10.13 sa 0.2 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Organski rastvor je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije ostatak II (19.4 mg), koji je sadržavao produkt i polazni materijal Nalbufin. Ostatak I je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8) (44.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   PRIMER 2 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup B" PEG-Nalbufin se dobija korišćenjem drugog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.     Sinteza 3-O-MEM-Nalbufina (3):     Nalbufin (321.9 mg, 0.9 mmol) je rastvoren u acetonu/toluenu (19 mL/8 mL). Zatim je dodat kalijum karbonat (338 mg, 2.45 mmol), što je praćeno dodavanjem MEMCI (160 µL, 1.41 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi kroz 21 čas, te je dodat MeOH (0.3 mL) da se neutrališe reakcija. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suva. Ostatak je pomešan sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (15 mL), te je ekstrahovan sa dihlorometanom (3 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-MEM-Nalbufin (3) (341 mg) i polazni materijal Nalbufin (19.3 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 3):     20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):     6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Pronalazak takođe obezbeđuje konjugat kao što je ovde opisano za davanje pacijentu koji pati od stanja koje odgovara na tretman sa konjugatom. Lečenje obuhvata primenu, generalno oralno, terapeutski efikasne količine konjugata (poželjno date kao deo farmaceutskog preparata). Takođe su razmatrani drugi oblici davanja, kao što je pulmonalno, nazalno, bukalno, rektalno, sublingvalno, transdermalno i parenteralno. Kako se ovde koristi, izraz "parenteralno" obuhvata subkutano, intravensko, intra-arterijsko, intraperitonealno, intrakardijalno, intratekalno i intramuskularno ubrizgavanje, kao i infuzione injekcije.
 
U slučajevima kada se koristi parenteralna primena, može biti neophodno koristiti nešto veće oligomere od onih prethodno opisanih, sa molekulskim težinama u rasponu od oko 500 do 30 hiljada Daltona (npr., koji imaju molekulske težine od oko 500, 1000, 2000, 2500, 3000, 5000, 7500, 10000,15000, 20000, 25000, 30000 ili čak još više).
 
Metod davanja može da se koristi za lečenje bilo kog stanja koje se može regulisati ili sprečiti primenom određenog konjugata. Oni koji su uobičajeno verzirani u oblasti tehnike će poznavati koja stanja specifični konjugat može efikasno lečiti. Stvarna doza koja će se primenjivati varira u zavisnosti od starosti, težine i opšteg stanja subjekta, kao i ozbiljnosti stanja koje se leči, proceni lekara, te konjugatu koji se primenjuje. Terapijski efikasne količine su poznate stručnjacima u oblasti i/ili su opisane u relevantnim referentnim tekstovima i literaturi. Generalno, terapeutski efikasna količina biće u opsegu od oko 0.001 mg do 1000 mg, poželjno u dozama od 0.01 mg/dnevno do 750 mg/dnevno, te poželjnije u dozama od 0.10 mg/dnevno do 500 mg/dnevno.
 
Jedinična doza bilo kojeg datog konjugata (opet, poželjno obezbeđena kao deo farmaceutskog preparata) može biti davana u raznim režimima doziranja u zavisnosti od procene lekara, potrebama pacijenta, i tako dalje. Poseban režim doziranja biće poznat onima sa uobičajenim iskustvom u tehnici ili se može eksperimentalno odrediti, korišćenjem rutinskih metoda. Primeri režima doziranja uključuju, davanje pet puta dnevno, četiri puta dnevno, tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, tri puta nedeljno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, dva puta mesečno, jednom mesečno, te bilo koju njihovu kombinaciju. Kada je postignuta klinička krajnja tačka, doziranje kompozicije se zaustavlja.
 
Jedna od prednosti davanja konjugata prema predmetnom pronalasku je da se smanjenje metabolizma prvog prolaza može ostvariti u odnosu na matični lek. Takav rezultat je prednost za mnoge lekove za oralno davanje koji značajno metabolišu prolaskom kroz creva. Na ovaj način, prolaz konjugata se može modulisati odabirom molekularne veličine oligomera, veze, te položaja kovalentne veze koji obezbeđuju željene karakteristike prolaza. Lice koje je uobičajeno verzirano u stanju tehnike može na osnovu ovde datih razmatranja da odredi idealnu molekularnu veličinu oligomera. Poželjno smanjenje metabolizma prvog prolaza za konjugat u poređenju sa odgovarajućim ne konjugovanim lekom malog molekula uključuje: najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30; najmanje oko 40; najmanje oko 50%; najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80% i najmanje oko 90%.
 
Opisan je postupak za smanjenje metabolizma aktivnog agensa. Postupak obuhvata korake: pripremu monodisperznog ili bimodalnog konjugata, te se svaki konjugat sastoji od grupe nastale od leka malog molekula kovalentno vezanog stabilnom vezom na u vodi rastvorljiv oligomer, gde pomenuti konjugat ima redukovanu stopu metabolizma u poređenju sa stopom metabolizma za lek malog molekula koji nije vezan na u vodi rastvorljiv oligomer; te davanje konjugata pacijentu. Tipično, se davanje vrši putem jedne vrste davanja koje je odabrano iz grupe koju čine oralno davanje, transdermalno davanje, bukalno davanje, transmukozalno davanje, vaginalno davanje, rektalno davanje, parenteralno davanje, te pulmonalno davanje.
 
Iako korisni u smanjenju za mnoge tipove metabolizma (uključujući oba metabolizma Faze I i Faze II) koji mogu da se redukuju, konjugati su naročito korisni kada lek malog molekula metaboliše pomoću enzima jetre (npr., jedne ili više izoformi citohroma P450) i/ili pomoću jednog ili više crevnih enzima.
 
EKSPERIMENTALNO
Svi hemijski reagensi u priloženim primerima, ukoliko nije drugačije pomenuto, su komercijalno dostupni. Priprema PEG-mera je opisana, na primer, u objavljenoj američkoj prijavi patenta br. 2005/0136031.
 
Svi 1H NMR (nuklearna magnetna rezonanca) podaci generisani su na NMR spektrometru proizvođača Bruker (MHz ≥ 300). Spisak određenih jedinjenja, kao i izvor jedinjenja je prikazan ispod.
 
PRIMER 1 (Referentni primer)
Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup A"
PEG-Nalbufin se priprema upotrebom prvog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.
 
 
Desalinizacija Nalbufin hidrohlorid dihidrata:
Nalbufin hidrohlorid dihidrat (600 mg, od Sigma) rastvoren je u vodi (100 mL). Dodat je zasićeni vodeni rastvor K2CO3 i zatim je podešen pH na 9.3 sa 1 N HCl rastvorom, zasićenim sa natrijum hloridom. Rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (100 mL), osušen preko Na2SO4, koncentrovan do suva i osušen pod visokim vakumom uz prinos Nalbufina (483.4 mg, 97% regeneracija). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR u CDCl3.
 
 
 
 
Sinteza 3-O-mPEG3-Nalbufina (2) (n = 3):
    Nalbufin (28.5 mg, 0.08 mmol) je rastvoren u smeši acetona (2 mL) i toluena (1.5 mL). Dodat je kalijum karbonat (21 mg, 0.15 mmol), što je praćeno dodavanjem mPEG3-Br (44.5 mg, 0.20 mmol) kod sobne temperature. Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 27.5 časova. Dodato je još kalijum karbonata (24 mg, 0.17 mmol). Smeša se zagreva u CEM mikrotalasnoj pećnici tako da je postignuta temperatura 60 °C tokom 20 minuta, te zatim tako da je postignuta temperatura 100 °C tokom 30 minuta. Dodat je DMF (0.2 mL). Smeša se zagreva sa mikrotalasnom pećnicom na 60 °C tokom 20 minuta, te na 100 °C tokom 30 minuta. Reakcija je koncentrovana da bi se uklonili organski rastvarači, ostatak je pomešan sa vodom (10 mL), te ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko NaxSO4, te je koncentrovan. Sirovi proizvod je proveren sa HPLC i LC-MS. Ostatak je ponovo pomešan sa vodom (10 mL), pH je podešen na 2.3 sa 1N HCl, te ispran sa dihlorometanom (2 x 15 mL). Vodeni rastvor je podešen na pH 10.4 sa 0.2 N NaOH, te ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa Biotage fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu što je rezultiralo sa željenim produktom 3-O-mPEG3-Nalbufinom (2) (n = 3) (32.7 mg) uz 81% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG4-Nalbufina (2) (n = 4):     Smeša nalbufina (96 mg, 0.27 mmol) i mPEG4-OM (131 mg, 0.46 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (113 mg, 0.82 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mEG4-Nalbufin 2 (n = 4) (109 mg) uz 74% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG5-Nalbufina (2) (n = 5):     Smeša nalbufina (78.3 mg, 0.22 mmol) i mPEG5-OM (118 mg, 0.36 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (93 mg, 0.67 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG5-Nalbufin (2) (n = 5) (101 mg) sa 76% prinosom. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG6-Nalbufina (2) (n = 6):     Smeša nalbufina (89.6 mg, 0.25 mmol) i mPEG6-OM(164 mg, 0.44 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (98 mg, 0.71 mmol) grejana je do refluksa kroz 18 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG6-Nalbufin (2) (n = 6) (144 mg) uz 91 % prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 3-O-mPEG7-Nalbufina (2) (n = 7): Smeša nalbufina (67 mg, 0.19 mmol) i mPEG7-Br (131 mg, 0.33 mmol)) u acetonu (10 mL) u prisustvu kalijum karbonata (67 mg, 0.49 mmol) grejana je do refluksa kroz 6 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa dihlorometanom. Rastvor je koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG7-Nalbufin (2) (n = 7) (40.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8):     Smeša nalbufina (60 mg, 0.17 mmol) i mPEG8-Br (105.7 mg, 0.24 mmol) u prisustvu kalijum karbonata (40.8 mg, 0.30 mmol) u toluenu/DMF (3 mL/0.3 mL) zagrevana je sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Zatim je dodat aceton (1 mL). Posle toga smeša se zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura od 100 °C kroz 90 minuta, dodato je još K2CO3 (31 mg, 0.22 mmol) i mPEG8-Br (100 mg, 0.22 mmol). Smeša je zagrevana sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 60 minuta. Ponovno je dodat mPEG8-Br (95 mg, 0.21 mmol). Smeša se ponovo zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je pomešan sa vodom (2 mL) i slanim rastvorom (10 mL). pH rastvora je podešen na 1.56 sa 1 N HCl, te se ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je osušen sa Na2SO4, koncentrovan do prinosa ostatka I (smeša željenog produkta i prekursorskog materijala). Vodeni rastvor je promenjen do pH 10.13 sa 0.2 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Organski rastvor je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije ostatak II (19.4 mg), koji je sadržavao produkt i polazni materijal Nalbufin. Ostatak I je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8) (44.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   PRIMER 2 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup B" PEG-Nalbufin se dobija korišćenjem drugog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.     Sinteza 3-O-MEM-Nalbufina (3):     Nalbufin (321.9 mg, 0.9 mmol) je rastvoren u acetonu/toluenu (19 mL/8 mL). Zatim je dodat kalijum karbonat (338 mg, 2.45 mmol), što je praćeno dodavanjem MEMCI (160 µL, 1.41 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi kroz 21 čas, te je dodat MeOH (0.3 mL) da se neutrališe reakcija. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suva. Ostatak je pomešan sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (15 mL), te je ekstrahovan sa dihlorometanom (3 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-MEM-Nalbufin (3) (341 mg) i polazni materijal Nalbufin (19.3 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 3):     20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):     6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Nalbufin (28.5 mg, 0.08 mmol) je rastvoren u smeši acetona (2 mL) i toluena (1.5 mL). Dodat je kalijum karbonat (21 mg, 0.15 mmol), što je praćeno dodavanjem mPEG3-Br (44.5 mg, 0.20 mmol) kod sobne temperature. Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 27.5 časova. Dodato je još kalijum karbonata (24 mg, 0.17 mmol). Smeša se zagreva u CEM mikrotalasnoj pećnici tako da je postignuta temperatura 60 °C tokom 20 minuta, te zatim tako da je postignuta temperatura 100 °C tokom 30 minuta. Dodat je DMF (0.2 mL). Smeša se zagreva sa mikrotalasnom pećnicom na 60 °C tokom 20 minuta, te na 100 °C tokom 30 minuta. Reakcija je koncentrovana da bi se uklonili organski rastvarači, ostatak je pomešan sa vodom (10 mL), te ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko NaxSO4, te je koncentrovan. Sirovi proizvod je proveren sa HPLC i LC-MS. Ostatak je ponovo pomešan sa vodom (10 mL), pH je podešen na 2.3 sa 1N HCl, te ispran sa dihlorometanom (2 x 15 mL). Vodeni rastvor je podešen na pH 10.4 sa 0.2 N NaOH, te ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa Biotage fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu što je rezultiralo sa željenim produktom 3-O-mPEG3-Nalbufinom (2) (n = 3) (32.7 mg) uz 81% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
Sinteza 3-O-mPEG4-Nalbufina (2) (n = 4):
    Smeša nalbufina (96 mg, 0.27 mmol) i mPEG4-OM (131 mg, 0.46 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (113 mg, 0.82 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mEG4-Nalbufin 2 (n = 4) (109 mg) uz 74% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG5-Nalbufina (2) (n = 5):     Smeša nalbufina (78.3 mg, 0.22 mmol) i mPEG5-OM (118 mg, 0.36 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (93 mg, 0.67 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG5-Nalbufin (2) (n = 5) (101 mg) sa 76% prinosom. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG6-Nalbufina (2) (n = 6):     Smeša nalbufina (89.6 mg, 0.25 mmol) i mPEG6-OM(164 mg, 0.44 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (98 mg, 0.71 mmol) grejana je do refluksa kroz 18 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG6-Nalbufin (2) (n = 6) (144 mg) uz 91 % prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 3-O-mPEG7-Nalbufina (2) (n = 7): Smeša nalbufina (67 mg, 0.19 mmol) i mPEG7-Br (131 mg, 0.33 mmol)) u acetonu (10 mL) u prisustvu kalijum karbonata (67 mg, 0.49 mmol) grejana je do refluksa kroz 6 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa dihlorometanom. Rastvor je koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG7-Nalbufin (2) (n = 7) (40.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8):     Smeša nalbufina (60 mg, 0.17 mmol) i mPEG8-Br (105.7 mg, 0.24 mmol) u prisustvu kalijum karbonata (40.8 mg, 0.30 mmol) u toluenu/DMF (3 mL/0.3 mL) zagrevana je sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Zatim je dodat aceton (1 mL). Posle toga smeša se zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura od 100 °C kroz 90 minuta, dodato je još K2CO3 (31 mg, 0.22 mmol) i mPEG8-Br (100 mg, 0.22 mmol). Smeša je zagrevana sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 60 minuta. Ponovno je dodat mPEG8-Br (95 mg, 0.21 mmol). Smeša se ponovo zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je pomešan sa vodom (2 mL) i slanim rastvorom (10 mL). pH rastvora je podešen na 1.56 sa 1 N HCl, te se ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je osušen sa Na2SO4, koncentrovan do prinosa ostatka I (smeša željenog produkta i prekursorskog materijala). Vodeni rastvor je promenjen do pH 10.13 sa 0.2 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Organski rastvor je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije ostatak II (19.4 mg), koji je sadržavao produkt i polazni materijal Nalbufin. Ostatak I je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8) (44.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   PRIMER 2 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup B" PEG-Nalbufin se dobija korišćenjem drugog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.     Sinteza 3-O-MEM-Nalbufina (3):     Nalbufin (321.9 mg, 0.9 mmol) je rastvoren u acetonu/toluenu (19 mL/8 mL). Zatim je dodat kalijum karbonat (338 mg, 2.45 mmol), što je praćeno dodavanjem MEMCI (160 µL, 1.41 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi kroz 21 čas, te je dodat MeOH (0.3 mL) da se neutrališe reakcija. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suva. Ostatak je pomešan sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (15 mL), te je ekstrahovan sa dihlorometanom (3 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-MEM-Nalbufin (3) (341 mg) i polazni materijal Nalbufin (19.3 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 3):     20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):     6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Smeša nalbufina (96 mg, 0.27 mmol) i mPEG4-OM (131 mg, 0.46 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (113 mg, 0.82 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mEG4-Nalbufin 2 (n = 4) (109 mg) uz 74% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
Sinteza 3-O-mPEG5-Nalbufina (2) (n = 5):
    Smeša nalbufina (78.3 mg, 0.22 mmol) i mPEG5-OM (118 mg, 0.36 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (93 mg, 0.67 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG5-Nalbufin (2) (n = 5) (101 mg) sa 76% prinosom. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG6-Nalbufina (2) (n = 6):     Smeša nalbufina (89.6 mg, 0.25 mmol) i mPEG6-OM(164 mg, 0.44 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (98 mg, 0.71 mmol) grejana je do refluksa kroz 18 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG6-Nalbufin (2) (n = 6) (144 mg) uz 91 % prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 3-O-mPEG7-Nalbufina (2) (n = 7): Smeša nalbufina (67 mg, 0.19 mmol) i mPEG7-Br (131 mg, 0.33 mmol)) u acetonu (10 mL) u prisustvu kalijum karbonata (67 mg, 0.49 mmol) grejana je do refluksa kroz 6 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa dihlorometanom. Rastvor je koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG7-Nalbufin (2) (n = 7) (40.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8):     Smeša nalbufina (60 mg, 0.17 mmol) i mPEG8-Br (105.7 mg, 0.24 mmol) u prisustvu kalijum karbonata (40.8 mg, 0.30 mmol) u toluenu/DMF (3 mL/0.3 mL) zagrevana je sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Zatim je dodat aceton (1 mL). Posle toga smeša se zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura od 100 °C kroz 90 minuta, dodato je još K2CO3 (31 mg, 0.22 mmol) i mPEG8-Br (100 mg, 0.22 mmol). Smeša je zagrevana sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 60 minuta. Ponovno je dodat mPEG8-Br (95 mg, 0.21 mmol). Smeša se ponovo zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je pomešan sa vodom (2 mL) i slanim rastvorom (10 mL). pH rastvora je podešen na 1.56 sa 1 N HCl, te se ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je osušen sa Na2SO4, koncentrovan do prinosa ostatka I (smeša željenog produkta i prekursorskog materijala). Vodeni rastvor je promenjen do pH 10.13 sa 0.2 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Organski rastvor je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije ostatak II (19.4 mg), koji je sadržavao produkt i polazni materijal Nalbufin. Ostatak I je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8) (44.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   PRIMER 2 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup B" PEG-Nalbufin se dobija korišćenjem drugog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.     Sinteza 3-O-MEM-Nalbufina (3):     Nalbufin (321.9 mg, 0.9 mmol) je rastvoren u acetonu/toluenu (19 mL/8 mL). Zatim je dodat kalijum karbonat (338 mg, 2.45 mmol), što je praćeno dodavanjem MEMCI (160 µL, 1.41 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi kroz 21 čas, te je dodat MeOH (0.3 mL) da se neutrališe reakcija. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suva. Ostatak je pomešan sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (15 mL), te je ekstrahovan sa dihlorometanom (3 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-MEM-Nalbufin (3) (341 mg) i polazni materijal Nalbufin (19.3 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 3):     20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):     6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Smeša nalbufina (78.3 mg, 0.22 mmol) i mPEG5-OM (118 mg, 0.36 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (93 mg, 0.67 mmol) grejana je do refluksa kroz 16 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG5-Nalbufin (2) (n = 5) (101 mg) sa 76% prinosom. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
Sinteza 3-O-mPEG6-Nalbufina (2) (n = 6):
    Smeša nalbufina (89.6 mg, 0.25 mmol) i mPEG6-OM(164 mg, 0.44 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (98 mg, 0.71 mmol) grejana je do refluksa kroz 18 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG6-Nalbufin (2) (n = 6) (144 mg) uz 91 % prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 3-O-mPEG7-Nalbufina (2) (n = 7): Smeša nalbufina (67 mg, 0.19 mmol) i mPEG7-Br (131 mg, 0.33 mmol)) u acetonu (10 mL) u prisustvu kalijum karbonata (67 mg, 0.49 mmol) grejana je do refluksa kroz 6 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa dihlorometanom. Rastvor je koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG7-Nalbufin (2) (n = 7) (40.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8):     Smeša nalbufina (60 mg, 0.17 mmol) i mPEG8-Br (105.7 mg, 0.24 mmol) u prisustvu kalijum karbonata (40.8 mg, 0.30 mmol) u toluenu/DMF (3 mL/0.3 mL) zagrevana je sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Zatim je dodat aceton (1 mL). Posle toga smeša se zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura od 100 °C kroz 90 minuta, dodato je još K2CO3 (31 mg, 0.22 mmol) i mPEG8-Br (100 mg, 0.22 mmol). Smeša je zagrevana sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 60 minuta. Ponovno je dodat mPEG8-Br (95 mg, 0.21 mmol). Smeša se ponovo zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je pomešan sa vodom (2 mL) i slanim rastvorom (10 mL). pH rastvora je podešen na 1.56 sa 1 N HCl, te se ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je osušen sa Na2SO4, koncentrovan do prinosa ostatka I (smeša željenog produkta i prekursorskog materijala). Vodeni rastvor je promenjen do pH 10.13 sa 0.2 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Organski rastvor je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije ostatak II (19.4 mg), koji je sadržavao produkt i polazni materijal Nalbufin. Ostatak I je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8) (44.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   PRIMER 2 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup B" PEG-Nalbufin se dobija korišćenjem drugog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.     Sinteza 3-O-MEM-Nalbufina (3):     Nalbufin (321.9 mg, 0.9 mmol) je rastvoren u acetonu/toluenu (19 mL/8 mL). Zatim je dodat kalijum karbonat (338 mg, 2.45 mmol), što je praćeno dodavanjem MEMCI (160 µL, 1.41 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi kroz 21 čas, te je dodat MeOH (0.3 mL) da se neutrališe reakcija. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suva. Ostatak je pomešan sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (15 mL), te je ekstrahovan sa dihlorometanom (3 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-MEM-Nalbufin (3) (341 mg) i polazni materijal Nalbufin (19.3 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 3):     20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):     6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Smeša nalbufina (89.6 mg, 0.25 mmol) i mPEG6-OM(164 mg, 0.44 mmol) u acetonu (8 mL) u prisustvu kalijum karbonata (98 mg, 0.71 mmol) grejana je do refluksa kroz 18 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa acetonom i DCM. Rastvor je sakupljen i koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG6-Nalbufin (2) (n = 6) (144 mg) uz 91 % prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
 
Sinteza 3-O-mPEG7-Nalbufina (2) (n = 7):
Smeša nalbufina (67 mg, 0.19 mmol) i mPEG7-Br (131 mg, 0.33 mmol)) u acetonu (10 mL) u prisustvu kalijum karbonata (67 mg, 0.49 mmol) grejana je do refluksa kroz 6 časova, ohlađena do sobne temperature, filtrirana i čvrsta supstanca je isprana sa dihlorometanom. Rastvor je koncentrovan do suva. Ostatak je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG7-Nalbufin (2) (n = 7) (40.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
Sinteza 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8):
    Smeša nalbufina (60 mg, 0.17 mmol) i mPEG8-Br (105.7 mg, 0.24 mmol) u prisustvu kalijum karbonata (40.8 mg, 0.30 mmol) u toluenu/DMF (3 mL/0.3 mL) zagrevana je sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Zatim je dodat aceton (1 mL). Posle toga smeša se zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura od 100 °C kroz 90 minuta, dodato je još K2CO3 (31 mg, 0.22 mmol) i mPEG8-Br (100 mg, 0.22 mmol). Smeša je zagrevana sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 60 minuta. Ponovno je dodat mPEG8-Br (95 mg, 0.21 mmol). Smeša se ponovo zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je pomešan sa vodom (2 mL) i slanim rastvorom (10 mL). pH rastvora je podešen na 1.56 sa 1 N HCl, te se ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je osušen sa Na2SO4, koncentrovan do prinosa ostatka I (smeša željenog produkta i prekursorskog materijala). Vodeni rastvor je promenjen do pH 10.13 sa 0.2 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Organski rastvor je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije ostatak II (19.4 mg), koji je sadržavao produkt i polazni materijal Nalbufin. Ostatak I je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8) (44.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   PRIMER 2 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup B" PEG-Nalbufin se dobija korišćenjem drugog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.     Sinteza 3-O-MEM-Nalbufina (3):     Nalbufin (321.9 mg, 0.9 mmol) je rastvoren u acetonu/toluenu (19 mL/8 mL). Zatim je dodat kalijum karbonat (338 mg, 2.45 mmol), što je praćeno dodavanjem MEMCI (160 µL, 1.41 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi kroz 21 čas, te je dodat MeOH (0.3 mL) da se neutrališe reakcija. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suva. Ostatak je pomešan sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (15 mL), te je ekstrahovan sa dihlorometanom (3 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-MEM-Nalbufin (3) (341 mg) i polazni materijal Nalbufin (19.3 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 3):     20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):     6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Smeša nalbufina (60 mg, 0.17 mmol) i mPEG8-Br (105.7 mg, 0.24 mmol) u prisustvu kalijum karbonata (40.8 mg, 0.30 mmol) u toluenu/DMF (3 mL/0.3 mL) zagrevana je sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Zatim je dodat aceton (1 mL). Posle toga smeša se zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura od 100 °C kroz 90 minuta, dodato je još K2CO3 (31 mg, 0.22 mmol) i mPEG8-Br (100 mg, 0.22 mmol). Smeša je zagrevana sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 60 minuta. Ponovno je dodat mPEG8-Br (95 mg, 0.21 mmol). Smeša se ponovo zagreva sa CEM mikrotalasnom pećnicom tako da je postignuta temperatura 100 °C kroz 30 minuta. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je pomešan sa vodom (2 mL) i slanim rastvorom (10 mL). pH rastvora je podešen na 1.56 sa 1 N HCl, te se ekstrahuje sa dihlorometanom (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je osušen sa Na2SO4, koncentrovan do prinosa ostatka I (smeša željenog produkta i prekursorskog materijala). Vodeni rastvor je promenjen do pH 10.13 sa 0.2 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Organski rastvor je ispran slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije ostatak II (19.4 mg), koji je sadržavao produkt i polazni materijal Nalbufin. Ostatak I je prečišćen sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-mPEG8-Nalbufin (2) (n = 8) (44.6 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
PRIMER 2 (Referentni primer)
Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup B"
PEG-Nalbufin se dobija korišćenjem drugog pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.
 
 
Sinteza 3-O-MEM-Nalbufina (3):
    Nalbufin (321.9 mg, 0.9 mmol) je rastvoren u acetonu/toluenu (19 mL/8 mL). Zatim je dodat kalijum karbonat (338 mg, 2.45 mmol), što je praćeno dodavanjem MEMCI (160 µL, 1.41 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi kroz 21 čas, te je dodat MeOH (0.3 mL) da se neutrališe reakcija. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suva. Ostatak je pomešan sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (15 mL), te je ekstrahovan sa dihlorometanom (3 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-MEM-Nalbufin (3) (341 mg) i polazni materijal Nalbufin (19.3 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.     Sinteza 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 3):     20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):     6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Nalbufin (321.9 mg, 0.9 mmol) je rastvoren u acetonu/toluenu (19 mL/8 mL). Zatim je dodat kalijum karbonat (338 mg, 2.45 mmol), što je praćeno dodavanjem MEMCI (160 µL, 1.41 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi kroz 21 čas, te je dodat MeOH (0.3 mL) da se neutrališe reakcija. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suva. Ostatak je pomešan sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (15 mL), te je ekstrahovan sa dihlorometanom (3 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 2-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 3-O-MEM-Nalbufin (3) (341 mg) i polazni materijal Nalbufin (19.3 mg). Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
 
Sinteza 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 3):
    20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):     6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
20-mL posuda ispunjena je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (85 mg, 0.19 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da bi se uklonilo 7 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Posuda je isprana sa azotom. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 21 mg, 0.53 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje mPEG3-OM(94 mg, 0.39 mmol). Pošto je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 22.5 časova, dodato je još NaH (22 mg, 0.55 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C još dodatnih šest časova, dodat je NaH (24 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih 19 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na koloni sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 3) (79.4 mg) uz 71% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
Sinteza 6-O-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3):
    6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
6-O-mPEG3-3-O-MEM-Nalbufin (4) (79.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu kod sobne temperature kroz šest časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor ispran je sa dihlorometanom (5 mL), pH rastvora podešen je na 9.35 sa 0.2 N NaOH i čvrstim NaHCO3, rastvor se ekstrahuje sa dihlorometanom (4 x 30 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG3-Nalbufin (5) (n = 3) (62.5 mg) uz 93% prinosa. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
Sinteza 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 4):
    50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.   Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):     6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) i mPEG4-OM(145 mg, 0.51 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 61 mg, 1.52 mmol). Nakon šta je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 21.5 časova, dodato je još NaH (30 mg, 0.75 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz dodatnih pet časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (1 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (15 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš hromatografijom na silikagelu sa 0-10% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 4) (214.4 mg). 1H-NMR je pokazala nešto mPEG4-OM u produktu. Nije bilo pokušaja daljeg prečišćavanja. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS.
 
Sinteza 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4):
    6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).   Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
6-O-mPEG4-3-O-MEM-Nalbufin (4) (214.4 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 6 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.17 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% MeOH/DCM (Biotage) što je dovelo do čistog produkta 6-O-mPEG4-Nalbufina (5) (n = 4) (90.7 mg), uz nešto nečistog produkta. Produkt je potvrđen sa 1H-NMR, LC-MS. Nečisti deo je rastvoren u DCM (~1.5 mL). Dodat je 1 N HCl u etru (20 mL), i smeša je centrifugirana. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije drugi deo čistog produkta (24.8 mg).
 
Sinteza 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 5):
    50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OM(151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (38 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 20 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.5 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 102 mg, 2.55 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C tokom 18 časova, dodato je još NaH (105 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Dodat je NaH (87 mg) i smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 17.5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (3 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), te ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 3-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) (n = 5).   Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Sinteza 6-O-mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5):
    Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).   Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):     3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Gore pomenuti 6-O-mPEG5-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 2.5 časa. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.19 sa 1 N NaOH, ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Nakon prečišćavanja sa fleš kolonskom hromatografijom na silicijum-dioksidu, putem 1H-NMR primećen je mPEG-OM. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (18 mL) i centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (25 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je izolovan sa Biotage automatskom fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu sa 4-8% MeOH u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG5-Nalbufin (5) (n = 5) (55 mg).
 
Sinteza 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 6):
    3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):     Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
3-O-MEM-Nalbufin (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) i mPEG6-OM(199 mg, 0.53 mmol) rastvoren je u toluenu (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 12 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL), što je praćeno dodavanjem NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 41 mg, 1.03 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, dodato je još NaH (46 mg). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz naredna 24 časa. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), ekstrahovana sa EtOAc (4 x 15 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.
 
Sinteza 6-O-mPEG6-Nalbufina (5) (n = 6):
    Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).   Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Gore pomenuti 6-O-mPEG6-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom (5 mL), te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na pH 9.30 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (5 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (40 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (2 x 20 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (2 x 30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG6-Nalbufin (5) (n = 6) (68 mg).
 
Sinteza 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufina (4, n = 7):
    50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):     Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 9 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 50 mg, 1.25 mmol). Nakon što je dobijena smeša zagrevana na 45 °C kroz 22.5 časa, dodato je još NaH (38 mg, 0.94 mmol). Smeša je zagrevana na 45 °C kroz narednih 5 časova. Kada je smeša ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je razblažena sa vodom (10 mL), i ekstrahovana sa EtOAc (4 x 10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.
 
Sinteza 6-O-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7):
    Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).   Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Gore pomenuti 6-O-mPEG7-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 20 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.30 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu i ispran sa DCM u kiselim uslovima, pH je podešen na 9.35, ekstrahovan sa DCM. Produkt je i dalje kontaminiran sa malom količinom PEG. Ostatak je rastvoren u DCM (~2 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (10 mL), te je centrifugirano. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (10 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan da se dobije produkt 6-O-mPEG7-Nalbufin (5) (n = 7) (49 mg).
 
Sinteza 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 8):
    50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.   Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):     Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) i toluenom (15 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 6 mL toluena. Dodat je anhidrovani DMF (0.2 mL). Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 49 mg, 1.23 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 23 časa, smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (5 mL) i voda (10 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku.
 
Sinteza 6-O-mPEG8-Nalbufina (5) (n = 8):
    Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).   Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):     50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Gore pomenuti 6-O-mPEG8-3-O-MEM-Nalbufin (4) mešan je u 2 M HCl u metanolu (20 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.32 sa NaHCO3 i 0.2 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je rastvoren u DCM (~1 mL). Dodato je 1 N HCl u etru (20 mL), te je centrifugiran. Ostatak je sakupljen i ponovo rastvoren u DCM (30 mL). Rastvor DCM je ispran sa vodenim rastvorom 5% NaHCO3 (60 mL), vodom (30 mL), slanim rastvorom (30 mL), osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG8-Nalbufin (5) (n = 8) (78.4 mg).
 
Sinteza 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufina (4) (n = 9):
    50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.   Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):     Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
50-mL balon okruglog dna ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OM(245 mg, 0.48 mmol) i toluenom (20 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 10 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 63 mg, 1.57 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.5 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C tokom 17 časova. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 60 mg) na osnovu rezultata HPLC, te je tada smeša zagrevana na 45 °C kroz narednih 5.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor NaCl (2 mL) i voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 6-O-mPEG9-3-MEM-O-Nalbufin (207 mg) uz 90% prinosa.
 
Sinteza 6-O-mPEG9-Nalbufina (5) (n = 9):
    Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.   PRIMER 3 (Referentni primer) Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C" PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.       Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):     PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Gore pomenuti 6-O-mPEG9-3-O-MEM-Nalbufin (4) (207 mg, 0.24 mmol) mešan je u 2 M HCl u metanolu (33 mL) kod sobne temperature kroz 17 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na 9.16 sa 1 N NaOH, te je ekstrahovan sa dihlorometanom (4 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 3-8% metanola u dihlorometanu da se dobije produkt 6-O-mPEG9-Nalbufin (4) (n = 9) (129.3 mg) uz 70% prinosa.
 
PRIMER 3 (Referentni primer)
Priprema konjugata Oligomer-Nalbufin - "Pristup C"
PEG-Nalbufin se priprema korišćenjem trećeg pristupa. Šematski, pristup koji se sledi za ovaj primer je prikazan ispod.
 
 
 
Sinteza TrO-PEG5-OM (7) (n = 5):
    PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.     Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM   Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):     Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
PEG5-di-OM (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) rastvoren je u toluenu (30 mL), i koncentrovan pod sniženim pritiskom da se ukloni toluen. Ostatak je osušen pod visokim vakumom. Dodat je anhidrovani DMF (40 mL), zatim sledi dodavanje DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) i TrCl (tritil hlorid) (1.66 g, 5.84 mmol). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C kroz 22 časa. Reakcija je koncentrovana da se uklone rastvarači (visoki vakuum, 50 °C). Ostatak je pomešan sa vodom, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 25 mL). Kombinovani organski rastvor ispran je sa slanim rastvorom, osušen preko Na2CO3, te koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu što rezultira sa 1.29 g produkta uz 46 % prinosa. Produkt je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.
 
 
Sinteza TrO-PEGn-OM (7) (n = različito):
Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg PEGn-di-OM
 
Sinteza TrO-PEG5-OM(8) (n = 5):
    Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.   Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito): Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Metansulfonil hlorid (0.35 mL, 4.48 mmol) dodat je u kapima u mešani rastvor TrO-PEG5-OM (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) i trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) u dihlorometanu (15 mL) na 0 °C. Posle dodavanja, nastali rastvor je mešan kod sobne temperature kroz 16.5 časova. Dodata je voda da se zaustavi reakcija. Organska faza je odvojena i vodeni rastvor je ekstrahovan sa dihlorometanom (10 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom (3 x 30 mL), osušen preko Na2SO4 i koncentrovan da se dobije produkt u vidu ulja (1.16 g) uz 78% prinosa. Produkt (8) (n = 5) je potvrđen pomoću 1H-NMR u CDCl3.
 
Sinteza TrO-PEGn-OM(8) (n = različito):
Prateći sličnu proceduru za dobijanje TrO-PEG5-OM, sintetisani su drugi TrO-PEGn-OM iz odgovarajućeg TrO-PEGn-OM.
 
Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufina (9) (n = 4):
    Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).   Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (120 mg, 0.27 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobijenog u Primeru 2], TrO-PEG4-OM(8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) i toluenom (40 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 30 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 150 mg, 3.75 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (0.2 mL). Dobijena smeša je zagrevana na 45 °C kroz 4.5 časa. Dodato je još NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 146 mg), i smeša je mešana na 45 °C kroz narednih 18 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (2 mL), te je dodata voda (15 mL) kako bi se reakcija umirila. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (4 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG4-Nalbufin (9) (n = 4) (~150 mg).
 
Sinteza 6-O-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4):
    Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):     Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG4-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 4) (150 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (12 mL) kod sobne temperature kroz jedan dan. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor podešen je na pH 9.08 sa NaOH, te ekstrahovan sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije produkt 6-O-OH-PEG4-Nalbufin (10) (n = 4) (26.9 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.
 
Sinteza 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufina (9) (n = 5):
    Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.   Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):     Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Okrugli balon ispunjen je sa 3-O-MEM-Nalbufinom (3) (318 mg, 0.71 mmol) [prethodno pripremljen u skladu sa sintezom jedinjenja (3) dobivenog u Primeru 2], TrO-PEG5-OM(8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) i toluenom (100 mL). Smeša je koncentrovana da se ukloni oko 75 mL toluena. Dodat je NaH (60% disperzija u mineralnom ulju, 313 mg, 7.8 mmol), nakon čega sledi dodavanje anhidrovanog DMF (1.0 mL). Dobijena smeša mešana je na sobnoj temperaturi kroz 30 minuta, te zatim na 60 °C kroz 19.5 časova. Smeša je ohlađena do sobne temperature, zasićena sa vodenim rastvorom NaCl (5 mL), te je dodata voda (5 mL) kako bi se reakcija umirila. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, te je koncentrovan. Ostatak je prečišćen sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu korišćenjem 0-10% metanola u dihlorometanu (Biotage) da se dobije produkt 3-O-MEM-6-O-TrO-PEG5-Nalbufin (718 mg). Produkt (9) (n = 5) je bio nečist, te je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
 
Sinteza 6-O-HO-PEG5-Nalbufina (10) (n = 5):
    Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.   Primer 4 (Referentni primer) Podaci o aktivnosti vezivanja Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.   Tabela 1 Vezujuća aktivnost Molekul Ki kod KAPA receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA Ki kod MU Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod MU Ki kod DELTA Receptora (nM) Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA Nalbufin 37.54; 14.36 1 6.74; 16.92; 23.89; 9.67 1 187.10; 323.8; 619.3; 145.20 1 3-O-mPEG2-Nalbufin* - - - - - - 6-O-mPEG3-Nalbufin 218.1 5.8 27.4 4.1 163.30 0.9 6-O-mPEG4-Nalbufin     17.54 0.7 148.90 0.5 6-O-mPEG5-Nalbufin 35.56 2.5 35.09 5.2 147.70 0.5 6-O-mPEG6-Nalbufin 246.9 6.6 44.28 1.9 130.00 0.9 6-O-mPEG7-Nalbufin 346.1 9.2 77.94 4.6 313.80 0.5 6-O-mPEG8-Nalbufin 282.2 7.5 79.55 8.2 167.50 1.2 6-O-MPEG9-Nalbufin 186.1 13.0 122.30 7.2 157.70 1.1 * Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.     PRIMER 5 (Referentni primer) Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593 Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.  
 
Gore pomenuti 6-O-TrO-PEG5-3-O-MEM-Nalbufin (9) (n = 5) (718 mg) mešan je u 2 M HCl u metanolu (30 mL) kod sobne temperature kroz 19 časova. Smeša je razblažena sa vodom, te je koncentrovana da se ukloni metanol. Vodeni rastvor je podešen na PH 9.16 sa NaOH, ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani organski rastvor je ispran sa slanim rastvorom, osušen preko Na2SO4, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen dva puta sa fleš kolonskom hromatografijom na silikagelu da se dobije vrlo čist produkt 6-O-HO-PEG5-Nalbufin 10 (n = 5) (139 mg) i manje čist produkt (48 mg). Produkt je analiziran sa 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.
 
Primer 4 (Referentni primer)
Podaci o aktivnosti vezivanja
Korišćenjem konvencionalnih tehnika afiniteta vezivanja testirano je nekoliko molekula da se odredi aktivnost vezivanja u kapa, Mu i delta opioidnim podtipovima opioidnih receptora. Rezultati su dati u tabeli 1.
 
Tabela 1
Vezujuća aktivnost
Molekul
Ki kod KAPA receptora (nM)
Preklapanje naspram Nalbufina kod KAPA
Ki kod MU Receptora (nM)
Preklapanje naspram Nalbufina kod MU
Ki kod DELTA Receptora (nM)
Preklapanje naspram Nalbufina kod DELTA
Nalbufin
37.54; 14.36
1
6.74; 16.92; 23.89; 9.67
1
187.10; 323.8; 619.3; 145.20
1
3-O-mPEG2-Nalbufin*
-
-
-
-
-
-
6-O-mPEG3-Nalbufin
218.1
5.8
27.4
4.1
163.30
0.9
6-O-mPEG4-Nalbufin
 
 
17.54
0.7
148.90
0.5
6-O-mPEG5-Nalbufin
35.56
2.5
35.09
5.2
147.70
0.5
6-O-mPEG6-Nalbufin
246.9
6.6
44.28
1.9
130.00
0.9
6-O-mPEG7-Nalbufin
346.1
9.2
77.94
4.6
313.80
0.5
6-O-mPEG8-Nalbufin
282.2
7.5
79.55
8.2
167.50
1.2
6-O-MPEG9-Nalbufin
186.1
13.0
122.30
7.2
157.70
1.1
* Serija molekula "3-O-mPEGn-Nalbufin" pripremljenih u Primeru 1 nije pokazala detektabilnu vezujuću aktivnost; za molekule gde je u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer kovalentno vezan na 3-O poziciji se veruje da su vredne kada je, na primer, kovalentna veza razgradiva forma veze.
 
 
PRIMER 5 (Referentni primer)
Priprema drugih konjugata sem sa Nalbufinom, U50488, i U69593
Konjugati opioidnih agonista koji su različiti od Nalbufina, U50488 i U69593 mogu se pripremiti kada se opšta šema sinteze i procedure predstavljene u Primeru 1 mogu slediti sem što je opioidni agonist prema formuli I supstituisan sa Nalbufinom, U50488 i U69593.
 

Claims (5)

1. Jedinjenje opioidnog agonista koji sadrži ostatak opioidnog agonista kovalentno vezan na u vodi rastvorljiv, ne-peptidni oligomer, te jedinjenje ima formulu: naznačeno time što: R1 je metil;R2 je OH;R3 je metil;R4 je vodonik;Y1 je kiseonik; ten je ceo broj od 1 do 30.
2.Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time što je n ceo broj od 1 do 10.
3.Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time što n je 6.
4.Kompozicija naznačena time što sadrži jedinjenje prema bilo kom zahtevu od 1 do 3, te opciono, farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
5.Jedinjenje prema bilo kom zahtevu od 1 do 3 ili kompozicija prema zahtevu 4, naznačena time što je za upotrebu u terapiji.
MEP-2015-44A 2007-03-12 2008-03-12 Konjugati oligomerno-opioidnog agonista ME02176B (me)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90638707P 2007-03-12 2007-03-12
PCT/US2008/003353 WO2008112288A2 (en) 2007-03-12 2008-03-12 Oligomer-opioid agonist conjugates
EP08742082.4A EP2134371B1 (en) 2007-03-12 2008-03-12 Oligomer-opioid agonist conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME02176B true ME02176B (me) 2015-10-20

Family

ID=39590911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2015-44A ME02176B (me) 2007-03-12 2008-03-12 Konjugati oligomerno-opioidnog agonista

Country Status (18)

Country Link
EP (4) EP2620163B1 (me)
JP (2) JP5420427B2 (me)
KR (1) KR101568428B1 (me)
CN (1) CN101646464B (me)
AU (1) AU2008226822B2 (me)
CA (1) CA2679479C (me)
CY (1) CY1117368T1 (me)
DK (1) DK2134371T3 (me)
ES (1) ES2534741T3 (me)
HR (1) HRP20150315T1 (me)
IL (1) IL200845A (me)
ME (1) ME02176B (me)
MX (1) MX2009009851A (me)
PL (1) PL2134371T3 (me)
PT (1) PT2134371E (me)
RS (1) RS53937B1 (me)
SI (1) SI2134371T1 (me)
WO (1) WO2008112288A2 (me)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10512644B2 (en) 2007-03-12 2019-12-24 Inheris Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-opioid agonist conjugates
US8173666B2 (en) 2007-03-12 2012-05-08 Nektar Therapeutics Oligomer-opioid agonist conjugates
US20110237614A1 (en) * 2008-09-16 2011-09-29 Nektar Therapeutics Pegylated Opioids with Low Potential for Abuse
CN105503889B (zh) * 2009-07-21 2019-12-24 尼克塔治疗公司 低聚物-阿片样激动剂轭合物
JP5837491B2 (ja) * 2009-07-21 2015-12-24 ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション オリゴマー−オピオイドアゴニスト抱合体
WO2011088140A1 (en) * 2010-01-12 2011-07-21 Nektar Therapeutics Pegylated opioids with low potential for abuse and side effects
WO2011123031A1 (en) * 2010-03-30 2011-10-06 Spago Imaging Ab Branched, compact polyethyleneglycol derivatives
BR112013013379B1 (pt) 2010-11-30 2021-02-23 Blackberry Limited método em um dispositivo de telecomunicações celulares sem fio alojado em uma célula servidora, dispositivo de telecomunicações celulares sem fio e mídia de armazenamento legível por computador
US10525054B2 (en) 2011-11-07 2020-01-07 Inheris Biopharma, Inc. Compositions, dosage forms, and co-administration of an opioid agonist compound and an analgesic compound
MX348933B (es) 2011-11-07 2017-07-03 Nektar Therapeutics Composiciones, formas de dosificacion y coadministracion de un compuesto agonista opioide y un compuesto analgesico.
CA2886276A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Nektar Therapeutics Solid salt form of alpha-6-mpeg6-o-hydroxycodone as opioid agonists and uses thereof
JP6577943B2 (ja) * 2013-06-28 2019-09-18 ネクター セラピューティクス κオピオイド作動薬及びその使用
CN107019803B (zh) * 2016-01-29 2020-09-15 北京键凯科技股份有限公司 具有低成瘾作用的聚乙二醇化阿片样物质
CN107033154B (zh) * 2016-02-02 2020-02-04 上海瀚迈生物医药科技有限公司 阿片受体拮抗剂缀合物及其应用
CN108210933B (zh) * 2016-12-22 2021-05-04 北京键凯科技股份有限公司 一种地佐辛与聚乙二醇的结合物
EP3723751A4 (en) * 2017-12-08 2021-07-07 The Rockefeller University KAPPA PYRANO [3,4-B] PYRAZINE OPIOID RECEIVER LIGANDS FOR THE TREATMENT OF ADDICTION, PRURITUS, PAIN AND INFLAMMATION
CA3095299A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Nof Corporation Method for purifying trityl group-containing monodispersed polyethylene glycol

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2628962A (en) 1949-10-20 1953-02-17 Mallinckrodt Chemical Works Method for preparing dihydrocodeinone, dihydromorphinone, and codeinone
US2654756A (en) 1949-10-20 1953-10-06 Mallinckrodt Chemical Works Process of preparing codeinone, dihydrocodeinone, and dihydromorphinone
US2649454A (en) 1951-08-20 1953-08-18 Univ California Method for preparing dihydromorphinone, dihydrocodeinone, and dihydropseudocodeinone
US2806033A (en) 1955-08-03 1957-09-10 Lewenstein Morphine derivative
US5475019A (en) * 1993-02-08 1995-12-12 East Carolina University Method of treating anxiety-related disorders with 2-aminocycloaliphatic amide compounds
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6835802B2 (en) 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US7056500B2 (en) * 2001-10-18 2006-06-06 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer conjugates of opioid antagonists
GB2399159B (en) 2002-01-11 2005-03-02 Valquest Ltd Flow mixer shuttle
US7351735B2 (en) * 2002-02-22 2008-04-01 Bayer Pharmaceuticals Corporation Benzofuran and benzothiophene derivatives useful in the treatment of hyper-proliferative disorders
WO2004039317A2 (en) * 2002-10-25 2004-05-13 Euro-Celtique S.A. Analogs and prodrugs of buprenorphine
ATE454169T1 (de) * 2003-03-13 2010-01-15 Controlled Chemicals Inc Oxycodon- konjugate mit niedrigerem missbrauch- potential und ausgedehnter tätigkeitsdauer
NZ583573A (en) 2003-12-16 2011-12-22 Nektar Therapeutics Pegylated naloxol
EP2064215B1 (en) 2006-09-22 2015-07-15 Zynerba Pharmaceuticals, Inc. Transdermally deliverable buprenorphine prodrugs and abuse-resistant compositions thereof
CA2667259A1 (en) * 2006-11-07 2008-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Dosage forms and co-administration of an opioid agonist and an opioid antagonist

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008112288A2 (en) 2008-09-18
RS53937B1 (sr) 2015-08-31
EP3222293A1 (en) 2017-09-27
WO2008112288A3 (en) 2008-12-24
CA2679479C (en) 2015-10-06
IL200845A (en) 2015-08-31
EP2134371A2 (en) 2009-12-23
AU2008226822B2 (en) 2013-08-01
JP5420427B2 (ja) 2014-02-19
EP2623123A1 (en) 2013-08-07
PT2134371E (pt) 2015-04-16
AU2008226822A1 (en) 2008-09-18
EP2134371B1 (en) 2015-01-14
JP2013151563A (ja) 2013-08-08
EP3222293B1 (en) 2019-11-27
MX2009009851A (es) 2009-09-24
KR101568428B1 (ko) 2015-11-11
DK2134371T3 (en) 2015-04-27
JP5877403B2 (ja) 2016-03-08
IL200845A0 (en) 2010-05-17
PL2134371T3 (pl) 2015-06-30
CN101646464A (zh) 2010-02-10
CY1117368T1 (el) 2017-04-26
HRP20150315T1 (hr) 2015-04-24
CA2679479A1 (en) 2008-09-18
EP2620163B1 (en) 2017-05-03
CN101646464B (zh) 2013-05-29
JP2010521466A (ja) 2010-06-24
ES2534741T3 (es) 2015-04-28
SI2134371T1 (sl) 2015-04-30
EP2620163A1 (en) 2013-07-31
KR20090118952A (ko) 2009-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ME02176B (me) Konjugati oligomerno-opioidnog agonista
CA2758460C (en) Methods of preparing monodisperse oligo (ethylene glycol) reagent compositions
KR101660996B1 (ko) 남용에 대한 낮은 잠재성을 갖는 페길화 오피오이드
US9126926B2 (en) Oligomer-anticholinergic agent conjugates
WO2009054916A2 (en) Oligomer conjugates of lidocaine and its derivatives
US9540330B2 (en) Oligomer-containing hydantoin compounds
AU2012227249B2 (en) Chemically modified small molecules
AU2014280956B2 (en) Chemically modified small molecules
HK1138501B (en) Oligomer-opioid agonist conjugates
HK1138501A (en) Oligomer-opioid agonist conjugates
HK1156849A (en) Pegylated opioids with low potential for abuse
MXPA06006914A (en) Chemically modified small molecules