LV10499B - Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, dna, vector, plasmid, micro-organism, method for preparing of dna, method for preparing of protein, method for enzymatic analysis, reagent - Google Patents
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Abstract
Aparakstīta rekombinantā glikozes-6-fosfāta dehidrogenāze, kas raksturojas ar SEQ ID NO: 1 secību, un tās iegūšanas paņēmiens. Rekombinanto vektoru, kas satur glikozes-6-fosfāta dehidrogenāzes gēnu, izmanto E.coli transformēšanai, transformēto baktēriju kultivē un izdala vajadzīgo fermentu no kultūrvides vai šūnām.Described recombinant glucose-6-phosphate dehydrogenase characterized by the sequence of SEQ ID NO: 1 and the method of obtaining it. A recombinant vector comprising a glucose-6-phosphate dehydrogenase gene used to transform E. coli, the transformed bacterium is cultured and the desired enzyme is released from the culture medium or cells.
Description
LV 10499LV 10499
Dte Giucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P-OH) kataiysiert den ersten Schritt im oxidativen Giucose· Metaboiismus Dacei wird Glucose-6-Phcsphat zu Giuconsāure-6-Phosphat oxidiert. Aāhrend NAO* ocerund NAOP a s Cosubstrat reduziert vverden Durch die Giucose-Oxidation werden schiieSiicn Pentose· zucker fūr den Nuc'emsāure-Stoffvvechsei erzeugt 5 Die Giucose-6-Pb.ospnat-Dehydrogenase kann beispielsweise aus Leuconostoc mesenteroides ge-von-ren *erden. Oieses Enzym kann sowohl NAD als auch NADP* als Cofaktor vervvencen. im Geger.satz zum Enzym aus Hefe. das lūr NADP spezifiscn ist Das Enzym liegt als Dimer, bestehenp aus zwei gle'cnen monomeren Unteremheiten rr.it emem Molekuiargewicht von 55 000 D vor Es besitzt tei 25’C eme spez fische Aovitāt von 550 U mg. <0 Nacnteile des Verfahrens zur Gewmnung von G6P-DH aus Baktenen der Gattung LeuCC^cstCC bestenen ua carm. dafl die Milchsāure-Baktenen komple.ve Nāhrstoffansprūche besitzen und daher m den mofltech-mscb ver/vendeten Nāhrmedien nur langsam vvachsen und eme gennge Zelldichte erreicher, Zudem ist der Genalt der Biomasse an G6P-DH bei Leuconostoc nur senr gering (ungefāhr 1 °b des Gesant-Zellprcteins) Zur Bereitsteilung ausreichender Mengen an G6P-DH smd daher grofle Fermentations-Dimensionen notvven->5 dig. Weiterhm kann /vegen der groflen Mengen an Fremdprotem nur eme Enzymprāparation mt germger spezifischer Aktivitat erhalten vveraen.Catecholysis of Dte Giucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P-OH) Schritt im oxidativen Giucose · Metabolism Dace wird Glucose-6-Phcsphat zu Giuconsāure-6-Phosphat oxidiert. Ahahrend NAO * ocerund NAOP as Cosubstrat reduzer vverden Durch die Giucose-Oxidation werden schiieSiicn pentose · zucker fur den Nuc'emsāure-Stoffvvechsei erzeugt 5 Die Giucose-6-Pb. . Oieses Enzym Ks sowohl NAD als auch NADP * als Cofaktor vervquice. im Geger.satz zum Enzym aus Hefe. das lūr NADP spesifiscn ist das Enzym liegt als Dimer, bestehenp aus zwei gle'cnen monomeren Unteremheiten rr.it emem Moleculari gewicht von 55,000 D vor Es besitzt te 25'C eme spez fische Aovitat von 550 U mg. < 0 Nacnteile des Verfahrens zur Gewmnung von G6P-DH aus Baktenen der Gattung LeuCC ^ cstCC bestenen ua carm. dafl die Milchsāure-Baktenen Komple.ve Nāhrstoffansprūche besitzen und daher m den mofltech-mscb ver / vendeten Nahrmedien nur langsam vvachsen und eme gellge Zelldichte presenticher, Zudem ist der Genalt der Biomass an G6P-DH and Leuconostoc nur senr gering (ungefāhr 1 ° b des Gesant-Zellprcteins) Zur Bereitsteilung ausreichender Mengen an G6P-DH smd daher grofle Fermentations-Dimensionen notvven- > 5 dig. Weiterhm Kann / Vegen der Groflen Mengen an Fremdprotem nur eme Enzymation mt germger spezifischer Aktivitat erhalten vveraen.
Der tedeutenaste Nachteii der be*annten G6P-DH aus Leuconostoc-Baktenen besteht jedcch m ihrer genngen TemperaturstabilitātDermatologic Nachteii der be * annten G6P-DH aus Leuconostoc-Baktenen besteht jedcch m ihrer genngen Temperature stability
Aufgate der voriiegenden Erfindung war es somit. eme Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase fcereitzu-20 steiien. Aelche die Nachteile des Štances der Technīk nient mehr aufvveist.Aufgate der voriiegenden Erfindung war es somit. em Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase fcereitzu-20 stei. Aelche die Nachteile des Štances der Technīk nient mehr aufvveist.
Die erfmdungsgemā/Je Aufgabe *md durch Bereitsteilung emer Giucose-6-Phosphat-Dehydrcgenase geicst. weiche die m SEQ ID NOI dargestellte Ammosāuresequenz enthalt und aus Leuconostoc mesente-roides. Subspezies dextranicus (DSM 20187). im «eiteren als Leuconostoc dextranicus bezeichnet ernālt-lich ist. zs VVeite'hm em Gegenstand der vorhegenden Erfmdung ist auch eme DNA, vveiche die m SEQ 10 NO 1 dargestente oder eme ihr im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechence erfmcungs-gemāfle Enzym kcdierende Sequenz enthalt.Die erfmdungsgemā / Je Aufgabe * md durch Bereitsteilung emer Giucose-6-Phosphat-Dehydrcgenase geicst. weiche die m SEQ ID NOI dargestellte Ammosāuresequenz enthalt und aus Leuconostoc mesente-roides. Subspezies dextranicus (DSM 20187). im «eiteren als Leuconostoc dextranicus bezeichnet erntal-lich ist. SEQ 10 NO 1 DEGRESTION DIAGNOSE, SEQ ID NO: 10 SEQ 10 NO 1 dargestent oder eme ihr immenen der Degeneration des genetischen Codes entsprechence erfmcungs-gemafle Enzym kcdierende Sequenz enthalt.
Die erfindungsgemāfle rekombmante DNA wurde durch Mustern einer L. dextranicus (DSM 20187) Genbank mīt emer geeigneten Oligonukieotid-Sonde īsoNert. wie vveiter unten ausfuhrlicher beschneben ist 30 Bei Expression der erfmdungsgemāflen rekombinanten DNA in E. coli Zellen zeigte smn ūberrascren-der-Aeise da/3 bereits germge Fermentatīcns-Voiumma zur Bereitsteilung der gewunschten Enzymmenge ausreichen Im Vergleich zur Gevvmnung der G6P-DH aus Leuconostoc wird eme Vemngerung aes Ferm.entations-Vciumens um den Faktor 1.500 bis 1:1000 erreicht. Uberdies erhālt man bei vemrgertem Aufremigungsauhvand G6P-DH-Prāparationen von hoher Remheit, d.h. mīt einer spezifischen Aktivitāt von 35 ca 900 U mg. inscesondere zeichnet sich jedoch das erfindungsgemāfle rekombmante Erzym ce< Isohe-rung aus E. coli ūberraschendervvetse durch eine deutlich verbesserte Temperaturstabilitāt gegenLber dem bekannten Enzym aus. Ein zusātzlicher Vorteii des rekombinanten Enzyms ist, da/3 es Lberraschendervveise mn Gegensatz zum bekannten Enzym aus Leuconostoc mcht mīt Giucose reagiert. Diese cekannte unspezifische Reaktion des Leuconostoc-Enzyms mīt Glucose (Olive und Levy, Biochemistry 6 (1967). 730) jo war bislang em erheblicher Nachteil bei der Durchfūhrung von Enzymtests da somit aufg.'urd des Vorhandenseins von Glucose in Blut. Serum oder Plasma faische Ergebnisse bei Bestimmungen auftreten konnten. Schliefliich unterscheidet sich das rekombmante Enzym von der bekannten G6P-DH auch durch emen unterschiedlichen Km-Wert fūr NADP und eme unterschiedliche Wirkung von Aktivatoren und Inhibitoren (z.B. Phosphat. Glycenn. Magnesiumionen. Hydrogencarbonat). js Weiterhin em Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombmanter Vektor. der eme oder mehrere Kopien der erfindungsgemā.len rekombinanten ONA enthalt. Em derartiger Vektor soli die Evpres· sion der erfmdungsgemā/3en rekompmanten DNA in fremden VVirtsorganismen ermcglichen Der erfm-durgsgemāfle Vektor kann ein Vektor sem. der sich in die chromosomale DNA der VVirtszeiie mtegr.ert (z 6 Baktenophage Lambda). er kann jedoch auch m der Wirtszelle extrachromosomal vorhegen iP'asmid). 50 Vorzugs«eise ist der erfindungsgemāfle Vektor em Plasmid.Die erfindungsgemaple recombinant DNA wurde durch Mustern einer L. dextranicus (DSM 20187) Genbank is home to emer geeigneten Oligonukieotid-Sonde short. wie vveiter unten ausfuhrlicher beschneben ist 30 Bei Expression der erfmdungsgemāflen recombinant DNA in E. coli Zellen zeigte smn ūberrascren-der-Aise da / 3 bereit germge Fermentium-Voiumma zur Bereitsteilung der gewunschten Enzymmenge ausreichen em vemngerung aes Ferm.entations-Vciumens um den Faktor 1.500 bis 1: 1000 usicht. Uberdies erhālt me bei vemrgertem Aufremigungsauhvand G6P-DH-Prāparationen von hoher Remheit, d.h. lives einer spezifischen Aktivitāt von 35 ca 900 U mg. inscesondere zeichnet sich jedoch das erfindungsgemāfle rekombmante Erzym ce < Isohe-rung aus E. coli rasberraschendervvetse durch eine deutlich verbesserte Temperaturstability gegenLber dem bekannten Enzym aus. Ein zusātzlicher Vorteii des recombinant Enzyms ist, da / 3 and Lucraschendervveise, Gegensatz zum bekannten Enzym aus Leuconostoc mcht, is a Giucose reagiert. Diese cekannte unspezifische Reaktion des Leuconostoc-Enzyms dwells in Glucose (Olive und Levy, Biochemistry 6 (1967) 730) as a war bislang em erheblicher Nachteil and der Durchfurrung von Enzymtests da somit aufg. Serum oder Plasma faische Ergebnisse and Bestimmungen auftreten frog. Schliefliich unterscheidet sich das recombmante Enzym von der bekannten G6P-DH achers unterschiedlichen Km-Wert för NADP und unterschlich Wirkung von Aktivatoren und Inhibitoren (z.B. Phosphat. Glycenn. Magnesium ionene. Hydrogencarbonate). js Weiterhin em Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein recombinant vector. der eme oder mehrere Kopien der erfindungsgemālene recombinant ONA enthalt. Em derartiger Vector step die for Evpres · sion der erfmdungsgemā / 3en recompantant DNA in fremden VVirtsorganismen ermcglichen Der erfm-durgsgemāfle Vector kann ein Vector sem. der sich in die chromosomale DNA der VVireiei mtegr.ert (z 6 Baktenophage Lambda). er kan jedoch auch m der Wirtszelle extrachromosomal vorhegen iP'asmid). 50 Vorzugs «eise ist der erfindungsgemāfle Vector em Plasmid.
Der erfindungsgemāfle Vektor kann sovvohl em eukaryontischer als auch em prokarycntischer Vektor sem. vorzugsweise ist er jedoch em prokaryontischer Vektor. d.h. zur Vermehrung m prokaryontischen Wirtsorgamsmen geeignet. Besonders bevorzugt besitzt der rekombmante Vektor emen m E coli aktiven Replikationsursprung. d.h. er ist in E. coli vermehrbar. 55 In einer besonders bevor2ugten Ausfuhrungsform enthalt der erfindungsgemāfle rekombmante Vektor die fūr die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Nukleinsāuresequenz unter Kontroiie emer in E.coli funktionsfāhigen Promotorsequenz aus Leuconostoc dextranicus. die in den ersten 122 Nukieotiden (stromaufvvārts des G6P-DH-Gens) der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nuklemsāureseguenz enthalten ist 2Der erfindungsgemāfle Vector kan sovvohl em eukaryontischer als auch em prokarycntischer Vector Ne. vorzugsweise ist er jedoch em prokaryontischer Vector. d.h. zur Vermehrung m prokaryontischen Wirtsorgamsmen geeignet. Besonders stuck besitzt der recombinant Vector emen m E coli aktiven Replikationsursprung. d.h. er ist in E. coli vermehrbar. 55 In einer besonders bevor2ugten Ausfuhrungsform enthalt der erfindungsgemáfle recombinant Vector die-for-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase codereende Nucleic acid equenz unter Controller emer in E.coli funktionsfanh Promotersequenz aus Leuconostoc dextranicus. die in den ersten 122 (stromauffer des G6P-DH-Gens) deres in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nuklemsuresuresenzenz enthalten ist 2
Um Promotoreigenschaften aufzuweisen ist es nicht erforderiich. dafl der DNA-Bereich genau diese Sequen2 von 122 Nukieotiden besitzt Auch abgeieitete Seguenzen oder Fragmente dieser Frequenz. die Promotoreigenschafien besitzen. smd geeignet Unter emer abgeieiteten bioiogisch aktiven Sequenz mn Smne der Erfmdung versteht man daher. dafl emzeine Nukeotide oder kurze Nuklectid-Sequenzen aus der Promctorsequen2 de'etiert. substituiert oder msertiert sem kdnnen. und zwar auf solche We>se. dafl die P'omotor-Aktivitat der Sequenz erhalten bieibt. Dem Facnmann ist ja bekannt. dafl bei emem Promotor n'cnt -;e gesamte Seouenz, sondern nur bestimmte Teiibereiche konservied bieiben mūssen Bei prckary-ΟΓΐ^ο^εη Prcmotcrsequen2en smd dies mscesondere d>e Bereiche bei -35 und bei -10 bezūgiicn des TransKriptionsstartsUm Promotoreigenschaften aufzuweisen ist es nicht erforderiich. dafl der DNA-Bereich genau diese Sequen2 von 122 Nukieotiden besitzt Auch abgeieite Seguenzen oder Fragmente dieser Frequenz. die Promotoreigenschafien besitzen. smd geeignet Unter emer abetie bioiogisch activ Sequenz mn Smne der Erfmdung versteht man daher. dafl emzeine Nukeotide oder kurze Nuklectid-Sequenzen aus der Promctorsequen2 de'etiert. no substitute or msertiert nor kdnnen. und zwar auf solche We > dafl die P'omotor-Aktivitat der Sequenz erhalten bieibt. Dem Facnmann ist and bekannt. dafl bei emem Promotor n'cnt -; e gesamte Seouenz, sondern nur bestimmte Teiibereiche preserved often by ours Bei prckary-ΟΓΐ ^ ο ^ εη
Die Erfmdung bemhaitet somit auch eme rekombman:e DNA, weiche die ersten 122 Nukieotide der m SEQ ID NO 1 dargesteilten Nuklemsāure-Seouenz oder eme davon abgeieitete Sequenz mīt Promotoreigenschaften besitzt C'terraschenderweise ergibt dieser Leuconostoc Promotor auch in E. coli eme gute Proteme<pression. Scmit kann man diesen Promotor auch zur Expression heterologer Gene. d h. vom G6P-DH-Gen verschiedenen Genen m gram-negativen Baktenen. vorzugsvveise E. coli Baktenen verwenaen. VVeiterhm em Gegenstand der vorliegenden Erfmdur.g ist em Mikroorganismus, der mīt emem erfin-dungsgemāflen rekcmomanten Vektor transformiert ist. Vorzugsvveise handelt es smh dabei um em gram-negatives Bakterium. besonders bevorzugt um em E. coli Eaktenum.Die Erfmdung bemhaitet somit auch e recombinant DNA, weiche die ersten 122 Nucleotide der SEQ ID NO: 1 dargesteil Nuklemsure-Seouenz oder eme davon abgeieit Sequenz myth Promotorigenschaften besitzt C'terraschenderweise ergibt dieser Leuconostoc Promotor auch in E. coli eme protem < pression. Promotional auch zur Expression heterologer Gene. d h. vom G6P-DH-Gen verschieden Genen m gram-negativ Baktenen. whirlwind E. coli Baktenen verwenaen. VWatergem em Gegenstand der vorliegenden Erfmdur.g m inorganic microorganism, der emm erfin-dungsgemāle clenomanten Vector transformiert ist. Vorzugsvveise handel es smh dabei um em gram-negatives Bacterium. besonders stubbed um em E. coli Eaktenum.
Die erfmdungsgemāfle rekombmante DNA kann man emalien. mdem man (1) chromcsomale Leuconostoc dextranicus DNA īsoliert und mīt emem geeigneten Re$tr;kticn$enzym spaltet (2) de gespaltene L. dextranicus DNA m emen Vektor embaut. mīt dem Vektor emen geeigneten Organismus trarsformiert und auf diese Weise eme Genbank hersteilt. (3' die Genbank aus Schritt (2) mīt emer Nukieinsāu'e-Sonde mustert. die eme fūr das Giucose-6-Phosphat-Dehycrogenase-Gen spezifische Sequenz besitzt. vvobei man diese Scnden im Hmolick auf die Ccdon-Vervvertung in Milchsāurebakterien konstruient. und (41 pie mīt der Scnde aus Schntt (3) positīv reagierenden Klone der Genbank anaiysiert. D>e Isolierung von chromosomaler L. de.vtramcus (DSM 20187) DNA tst durch komcm.ierte Polye:hy!englykoi Lysczym-Behandlung und anschiieflence Inkubation mīt Protemase K moghcnDie erfmdungsgemāfle recombinant DNA kann man man enamel. mdem man (1) chromium bone Leuconostoc dextranicus DNA short and unmodified genesignant (2) de gespaltene de deranranus DNA men Vector embaut. dm dem Vector emen geeigneten Organismus trarsformiert und auf diese Weise emperor Genbank. (3 'die Genbank aus Schritt (2) was born Emeric Nucleus-Sonde.) Genesis-6-Phosphat-Dehycrogenase-Gen Spezifische Sequenz, vvobei man diese Scnden im Hmolick auf die Ccdon-Vervvertung in Milchsure Bacteria Constructent und (41 der Scnde aus Schntt (3) Positive Reagent Clone der Genbank anaiysier. D > e Isolierung von chromosomaler L. de.vtramcus (DSM 20187) DNA tst durch komcm.ierte Polye: Lysczym-Behandlung und anschiieflence Inkubation is home to Protemase K moghcn
Die Spaltung aer īsoherten L. dextranicus DNA mīt emem geeigneten Restriktionsenzym. die Lgierung der gespattenen DNA m emen geeigneten Kionierungsvektor. die Transformation emes geeigneten Organismus mīt dem rekombmanten Kionierungsvektor zur Hersteilung emer Genbank kann auf eme dem Fach-mann au< dem Gebet der Moiekuiarbioiogie an sich bek-nnte Weise erfolgen. Der nachste Schntt <st das Mustem der auf cese Weise hergesteilten Genbank mīt emer Nuklemsāure-Sonde. die eme fūr das Giuccse-6-Phcsphat-Dehydrogenase-Gen spezifische Sec^enz besitzt.Die Spaltung aer lysherten L. dextranicus DNA dies emem geeigneten Restriktionsenzym. die Lgierung der gespattenen DNA m emen geeigneten Kionierungsvektor. die Transformation emes geeigneten Organismus myt dem recombmanten Kionierungsvektor zur Hersteilung emer Genbank auf em em dem Fach-mann au < dem Gebet der Moiekuiarbioiogie an sich bek-nnte Weise erfolgen. The nachste schntt < st das Mustem der auf cese Weise hergesteilten Genbank is housed by Emer Nuklemsur-Sonde. to give Giuccse-6-Phcsphat-Dehydrogenase-Gen Spezifische Sec.
Aus Haghighi et al.. Biochemistry 21 (1982). 6415-6420 ist eme Peptidsequenz der G6-PDH aus L meserteroides mīt emem pyridoxylierbaren Lysmrest O bekannt Diese Sequenz lautet: Phe-Leu-l5o-Lys'-Ser-Pro-Ser-Tyr-(Aso Val)-Lys. Aus dieser Sequenz korrte jedoch keme Oiīgonukieotid-Sorce acgeieitet «erden mīt der man m der L dextranicus Genbank em H.ondisierungssignai finden kannAus Haghighi et al., Biochemistry 21 (1982). 6415-6420 µl Peptid sequencer G6-PDH aus L meserteroides myth pyridoxylierbaren Lysmrest O bekannt Diese Sequenz rafts: Phe-Leu-15o-Lys'-Ser-Pro-Ser-Tyr- (Aso Val) -Lys. Aus dieser Sequenz jedoch keme Oiīgonukieotid-Sorce acgeieitet «erden myt der man m der L dextranicus Genbank em H.ondisierungssignai finden kannen
Aus Bhaabhade et al.. FEBS Letters 211 (1987). 243-246 ist eme Peptidsequenz aus dem 2ktiven Zemrum der G6P-DH aus L. mesenteroides mīt emer hohen Homologie zur menschnchen G6P-DH bekannt. Aus der Vielzahl von daraus konstruierbaren Ohgonuk eotid-Sonden vvurde die m Beīspie! 2 genannte Oiigonukleotid-Sonce mīt emer Lānge von 72 Basen (SĒC iD NO 2) hergesteilt.Aus Bhaabhade et al., FEBS Letters 211 (1987). 243-246 µM Peptidsequenz aus dem 2ktiven Zemrum der G6P-DH aus L. mesenteroides mycophenol homologie zur menschnchen G6P-DH bekannt. Aus der Vielzahl von Make a Constructor Baren Ohgonuk eotid-Sonden vvurde die m Beīspie! 2 genannte Oiigonukleotid-Sonce is housed in emerald Lane von 72 Basen (SEE iD NO 2) hergesteil.
Ein Mustern aer L. dextranicus DNA-Genbank rmt jiesem Oligonukieotid in 5'-endmarkierter Form erbrachte schiiefliich emen positiven Klon. durch aen jie Sequenz des L. dextramcus G6P-DH-Gens ermittelt werden konnteEin Mustern aer. L. dextranicus DNA-Genbank rmt jiesem Oligonucleotides in 5'-endmarker Form erbrachte schiiefliich emen positiven Klon. durch aen they Sequenz des L. dextramcus G6P-DH-Gens ermittelt werden fronden
Die DNA-Sequenz des G6P-DH-Gens aus L. dexvan.icus wurde nach dem Verfahren von Sanger bestmnmt. Sie >st m SEQ ID NO:1 dargestellt. SEQ ID NO:l zeigt ebenfalls die daraus ermittelte Ar-.nosāuresequenz der G6P-DH aus L. de*tramcus Daraus «st ersichtlich. dafl die Ammosāuresequenz des erfmdungsgemāflen Enzyms m 6 von 42 Positionen mcht mīt der m FEBS Letters 211 (19871. 243-246 besc-nebenen Sequenz des L. mesenterc.des-Enzyms ubereinstimmt VVeiterhin bemhaitet die Erfindung em Verfahren zur Gewmnung emer G6P-DH mīt der m SEQ ID NO:1 dargestellten Amincsāuresequenz. mdem man (1) emen geeigneten VVirtsoorganismus mīt emer erfindungsgemāflen DNA oder emem Vektor transfor-miert. der eine oder mehrere Kopien dieser DNA enthālt, (2) den transformierten VVirtsorgamsmus m emem geeigneten Medium kultiviert und (3) das Protein aus dem Medium oder den Zellen anrechert.The DNA Sequenz des G6P-DH-Gens aus L. dexvan.icus wurde nach dem Verfahren von Sanger bestmnmt. SEQ ID NO: 1 dargestell. SEQ ID NO: 1 ebenfalls die dermatelte Ar-.nosāuresequenz der G6P-DH aus L. de * tramcus Daraus «st ersichtlich. dafl die Ammosauresequenz des erfmdungsgemāflen Enzyms m 6 von 42 Positionen mcht myths m. mcem man (1) emen geeigneten d m m emem erfindungsgemālene DNA or emer Vector transfor- mers der eine oder Mehrere Kopien dieser DNA enthal, (2) den transformierten VVisorgamsmus m emem geeigneten Medium culture (3) das Protein aus dem Medium oder den Zellen anrechert.
Die Expression des erfindungsgemāflen rekombinanten Proteins in einem transformierten VVirtsorgams- 3 LV 10499 mus. vorzugsweise m emem prokaryontischen Wirtsorganismus. besonders bevorzugt m einer E. coli-Zeiie ist prmzīpiell unter Komrpiie jeces geeigneten Promotors mogkch. So ist m E coli z B eme Expression der G6P-DH unter Kontroiie von heterologen Promotoren wte z B dem tac-Promotor. mgl-Promotor oder pft-P'omotor moglich Vcrzugsvveise erfolgt jedoch die Expression konstitutīv unter Kontroiie emes 5 Lsuconostoc-Promotors fcesoncers bevorzugt unter Kontroile der m SEQ ID N01 dargesteiiten oder emer oavon abgeleiteten Prcmctor-Seouenz tentsprechend den ersten 122 Nukleotiden von SEQ ID NO:1) Am bevorzugt .st das Piasmid pUC G6P-DH 1.8. das m Abb. 1 dargestellt ist Ais geeigneter E cdi VVirtsstamm ^urce der kommerzeil erhāltliche E. coli Stamm HB 101 ausgewāhit. Bei Transformation von E coii H8 10i mīt pUC G6P-DH 1,8 wurde gefunden, da/3 das Plasmid eme hohe w Stabilitāt m der Zei'e besitzt und die Expression der G6P-DH uber mehrere Passagen auch ohne Seiektionsdruck durchgefūhrt vverden kannThe Expression des erfindungsgemāflen recombinant Proteins in einem transformierten VVirtsorgams- 3 LV 10499 us. vorzugsweise memem prokaryontischen Wirtsorganismus. besonders bevorzugt m einer E. coli-Zeiie ist prmzīpiell unter Komrpiie jeces geeigneten Promotors mogkch. E moli c B e em Expression der G6P-DH unter Controller wte z B dem tac-Promotor. mgl-Promoter or pft-P'omotor moglich Vcrzugsvveise lysocontin g of lymphatic Expression Constitutive Unterontrol 5 luconostoc-Promotors fcesoncers inconsistent untermined by SEQ ID N01 dermestably or emer oavon abgeleiteten Prcmctor-Seouenz tentprechend den erste 122 Nucleotide von SEQ ID NO: 1) Am bevorzugt .st das Piasmid pUC G6P-DH 1.8. das m Abb. 1 dargestell Ais geeigneter E cdi VVirtsstammhe urce der kommerzeil erhaltthee E. coli Stamm HB 101 ausgewāhit. Bei Transformation von E coii H8 10i is housed in pUC G6P-DH 1.8 wurde gefunden, da / 3 das Plasmid eme hohe Stabilize m der Ze s teitit und die Expression der G6P-DH uber mehrere Passagen auch ohne Seiektionsdruck durchgefūhrt vverden kettle
Die vorliegende Edindung soli durch die folgenaen Beispiele in Verbmdung mīt SEQ ID NO:1 una 2 sowie der Abbildung 1 weiter verdeutiicht vverden. Es zeigen: SEQ ID NO l die Nuklect'dsequenz der Leuconostoc DNA-lnsertion m pUC G6P-DH 18.. vvobei dieDie vorliegende Edindung step durch die folgenaen Beispiele in Verbmdung lies in SEQ ID NO: 1 and 2 sowie der Abbildung 1 weiter verdeutiicht vverden. I zeigen: SEQ ID NO: 1 Nuklect'dsequenz der Leuconostoc DNA-lnsertion m pUC G6P-DH 18 .. vvobei die
'5 ersten 122 Basen strcmaufvvārts des kodierenden Berernhs den L. dextranicus G6P-DH'5 ersten 122 Basen strcmauf dve des codierend Berernhs den L. dextranicus G6P-DH
i Promotor und die Basen 123-1580 die Nukleot'dsequenz des L. dextranicus G6P-DH Gēns darsteilen. das fūr em Protem mīt der ebenfalls angegebenen Amminosāurese-quenz kodien SEQ ID NO 2 die Oiigonukleotidsonde lūr den Teii des G6P-DH Gēns aus Leuconostoc mesenterci- 20 des. der f_r emen Bereich des aktiven Zentrums der G6P-DH von L. mesenteroides codiert. der eme hohe Homologte mīt der menschiichen G6P-DH aufvveist.The promoter and die Basen 123-1580 die Nucleotide sequences of dextranicus G6P-DH gene darsteilen. das fūr em Protem myth der ebenfalls angegebenen Amminosurese-quenz codes SEQ ID NO: 2 die Oiigonucleotide probe denote G6P-DH Gene aus Leuconostoc mesenteric. der f_r emen Bereich des aktiven Zentrum der G6P-DH von L. mesenteroides codiert. der eme hohe Homologte myth der menschiichen G6P-DH.
Abb. 1 das Plasmid pUC-G6P-DH 1 8.Abb. 1 das Plasmid pUC-G6P-DH 1 8.
Beispiel 1 25Beispiel 1 25
Isolierung chromosomaier DNA aus Leuconostoc dextranicusIsolierung chromosomeer DNA aus Leuconostoc dextranicus
Genomische DNA von Leuconostoc dextramcus wird nach folgendem Verfahren gevvonnen:Genomic DNA of Leuconostoc dextramcus wird nach folgendem Verfahren gevvonnen:
Leuconostoc dextramcus (DSM 20187) wird in APT-Medium (Merck Nr 10454) bei 30’C angezogen. Die 30 Zeilen aus 100 ml Kulturbruhe vverden abzentrifugierl. m 10 ml 20 mmol I Trīs HCI pH 8.0 gewaschen und schliefllich in 15 ml dieser Pufferlosung resuspendiert. Nach Zugabe von 5 ml 24 % (wv) Poiyethyiengiykol 6000 und 20 mg Lysozym wird 16 h bei 4 C inkubiert. Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 1 ml 20 S ivv v) SDS Es rverden 2 mg Protease K zugegeben und 60 mm bei 37’ C mkubierf. Die weitere Remigung cer DNA erfolgt durch sequentielle Phencl- und Chloroform-Extrakticn. Behandlung mit RNAse A (0 5 mg 60 35 mm bei 37 C). nochmaliger Phenol- und Chloroform-Extraktion und abschlieūender EthanolprazīpitationLeuconostoc dextramcus (DSM 20187) is in APT-Medium (Merck No. 10454) and 30'C angezogen. Dissolve 30 Zeilen Honest 100 ml of culture bristle blender. m 10 ml of 20 mmol of Three HCl pH 8.0 in 15 ml of dieser Pufferlosung resuspender. Nach Zugabe von 5 ml 24% (wv) Poiyethyiengiykol 6000 and 20 mg Lysozym wird 16 h and 4 C incubator. Dilution with 1 ml of 20 ml of v) SDS was prepared with 2 mg of Protease K zugegeben and 60 mm and 37 ° C of microbubble. Diaitere Remigung cer DNA erfolgt durch sequentielle Phencl- und Chloroform-Extraktic. Behandlung mit RNAse A (0 5 mg 60 35 mm and 37 C). nochmaliger Phenol- and Chloroform-Extraktion und abschlieuer Ethanol
Beispiel 2:Beispiel 2:
Bestimmung.der Grcfle von genomischen DNA-Fragmenten. die fūr G6P-DH kodieren 10Bestimmung.der Grcfle von genomchen DNA Fragmenten. die fur G6P-DH codieren 10
Zur Hybndisierung wurde das in SEQ ID N0 2 gezeigte Oligonuklectid verwendet.Zur Hybndisierung wurde das in SEQ ID N0 2 gezeigte Oligonuklectid verwendet.
Je 5 ug genomischer DNA aus L. dextramcus wira mīt verschiedenen Restriktionsendonukleasen (BcH. Cial. Hindlll, Pstl, Xbal) gespaiten. auf emem 0.8 °e Agarosegel elekrophoretisch aufgetrennt und danach auf Nitrozellulosefilter transferiert. Ein so>cher Filter wird nach Vorhybridisierung mit emer Ldsung aus 6 x js SSC-Puffer. 0,7 ®o Magermilchpulver, bei 40' C ūber Nacht m der gleichen Losung inkubiert. die zusātzlich cas obige Oligonuklectid. mit ;:P radioakL'v endmarkiert. enthālt. Nach Waschen, Trocknen und Autoradio-graphie kann festgesteilt werden. daC em durch das Restriktionsenzym Bell erzeugtes DNA-Fragment von ca 3.4 kb GrcOe mit dem Oligonukleotid hybridisiert. 5o Beispiel 3:5 µg of genomic DNA for aus L. dextramcus wira mice verschieden Restrictionsendonukleasen (BcH. Cial. Hindlll, Pstl, Xbal) gespaiten. auf emem 0.8 ° e Agarosegel elecrophoretisch aufgetrennt und danach auf Nitrozellulosefilter transferer. Ein s > cher Filter wird nach Vorhybridisation with emer Ldsung aus 6 x and SSC-buffer. 0.7 ® Magermilchpulver, and 40 'C Uber Nacht m der gleichen Losung Incubator. die zusātzlich cas obige Oligonuklectid. what;: P radioakL'v endmarker. enthālt. Nach Waschen, Trocknen und Autoradio-graphie Kettle Festgesteilt werden. daC em durch das Restriktionsenzym Bell erzeugtes DNA Fragment ca 3.4 kb GrcOe mit dem Oligonucleotide hybridis. 5o Beispiel 3:
Klonierung eines DNA-Fragments. das fur G6P-DH kodiert 20 ug genomischer DNA aus L. dextranicus wird mit Bell geschmtten und in emem Gel aus medng-55 schmelzender Agarose aufgetrennt. DNA-Fragmente mit einer Grofle von ca. 3.4 kb + -0.2 kb vverden aus dem Gel ausgeschmtten Dieses Gelstūck wird mit Ligasepuffer (Maniatis et al. 1982. Molecular Cloning. p. 474) equilibriert und bei 65 C verflūssigt. Danach wird 0.1 ug pUCl8 DNA. BamHI-gespalten und 5 U T4-Ligase zugegeben. 10 min bet 37* C. dann 16 h bei 15 C inkubiert. Die Restnktionsendonuklease BamHl 4 erzeugt uberhāngende ONA-Enden, die zu den von Bell erzeugten Enden kompatibei smd.Klonierung eines DNA-Fragments. das fur G6P-DH coder 20 µg genomic DNA aus L. dextranicus wird mit Bell geschmtten und emem Gel aus medng-55 schmelzender Agarose aufgetrennt. DNA Fragments with Einer Grofle von ca. 3.4 kb + -0.2 kb vverden aus dem Gel ausgeschmtten Dieses Gelstūck wird mit Ligasepuffer (Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning. 474) equilibriert und bei 65 C verflus. Danach waves 0.1 µg of pUC18 DNA. BamHI-gespalten and 5 U of T4-Ligase zugegeben. 10 min but 37 * dann 16 h and 15 C incubator. Die Restnktionsendonuklease BamHl 4 erzeugt uberhāngende ONA-Enden, die zu den von Bell erzeugten Enden compatible with smd.
Zellen von E coli HB 101 (DSM 1607) *erden m 20 ml Nāhrmedium angezogen und durch Caiciumchioridbehandlung m kompetenten Zustand ūberfūhrt (Mamatis et al. 1982. Molecular Clonmg. pp 250 · 252) Der oben erhaitere Ugationsansatz wird nach Zugabe von emem Volumenteil 50 mmci i Trīs HCl 5 pH '5 nochmals 5 mm bei 65 C ver'^ssigt uno zur Transfcrmation emgesetzt. Die SO beharcelten Zellen *erden auf LB-Agarpiatten mīt 50 ug ml Ampiollm auspiattiert und bei 37’C emen Tag bebrutet. D'S ^ccnge^acnsenen Kolonien *erden auf neue LB-Agarplatten mīt 50 ul Ampicillin uberstempeft auf den.en Nitrczeiiuiosefiiter iiegen. Nacroem die KcOnien aoermals hochge*achsen smd, werden die Ftter atgenocen pie Kolonien wie bei Grunstem und Hogress Proc, Nati. Acad Sci USA. 72 M975i 3961 to bescnrieben. iysiert uno mīt der unter 2 beschriecenen radioaktīv markierten Oligonukleotidscnde hybndis-ied Nach Autoradiographie kdnnen K.cne mīt rekembmanten. G6P-DH-kodierenden Plasmiden identifiziert urd von den Ausgangsplatten īsoīien werden Nach Isonerung und Charaktensterung der P.'asmid-DNA sC'Cher Klcne zeigt sich. dafl diese eme Grofle von ca 6 κρ tesitzen Dies bedeutet. dali em DNA-Fragment vpn ca 34 kb Grcfle m die pUCi8-DNA msertied ist Em soiches rekombmantes Plasmio *ird lūr die :s we'tere Bearteitung ausgevvāhitZellen von E coli HB 101 (DSM 1607) * erden m 20 ml Nehrmedium angezogen und durch Caiciumchioridbehandlung m competent Zustand Uberfur (Mamatis et al. 1982. Molecular Clonmg. Pp 250 · 252) Der oben erhaitere Ugationsansatz wird nach Zugabe von emem Volumenteil 50 mmci i Three HCl pH 5 '5 nochmals 5 mm and 65 C ver' ^ ssigt uno zur Transfcrmation emgesetzt. Dissolve the doppler with the LB-Agarpiatt in 50 µl of Ampiollm auspiattiert und 37'C emen Tag bebrutet. D'S ^ ccnge ^ acnsenen Colonies * erden auf neue LB-Agarplatten is home to 50 ul Ampicillin uberstempeft auf den.en Nitrczeiiusosefiiter iiegen. Nacroem die KcOn aoermals hochge * achsen smd, die Ftter rekenocen at Colonie Wie and Grunstem und Hogress Proc, Nati. Acad Sci USA. 72 M975i 3961 to bescnrieben. iysiert uno myth der unter 2 beschriecenen radioactive markierten Oligonukleotidscnde hybndis-n Nach Autoradiographie kdnnen K.cne is housed in a recembmant. G6P-DH-coded Plasmids were identified as urd von den Ausgangsplatten by Nach Isonerung und Charaktensterung der P.'asmid-DNA sC'Cher Klcne. dafl diese em Grofle von ca 6 κρ tesitzen Dies bedeutet. dali em DNA Fragment vpn ca 34 kb Grcfle m die pUCi8-DNA msertied ist Em soiches recombmantes Plasmium * lyssem: s we'tere Bearteitung ausgevvāhit
Beispiei 4Beispiei 4
Einengung und Expression des Gēns 20Einengung und Expression des Geen 20
Durcn Spaitung mīt oen Restrikticnsenzymen Xbal und Spel kann das oben erhaitene rekombinante Piasmid m am Fragment von ca. 2 2 kb und emes von ca 3.8 kb Grcfle zeriegt vverden. Dieses 3 8 kb-Fragment enthālt nur noch DNA-Seouenzen aus cUC 18 und die Nudeotidsequenz von SEQ ID NO i. Isonerung und Religation des 3 8 kb Fragments uno nacnfo'gende Transformation m E coli HB1O1 fuhrt zu zs emem Kion. der das G6P-DH-Gen expnmiert. Das G6P-DH Gen ist m diesem positiven Kicn ais 1 8 kb Fragment (Spel Kpnl) m emem. im Poiylmkerbereicn mīt Xbal und Kpnl geschmttenen kommerziellen pUC 13 Viktor subkioniert. «obei die Kpnl-Schnmste !e aus dem Vektoranteil des positiven Kons aus der Gentank stammt. Damit ist em Spel Bcil-Fragmert aus dem Leuconostoc dextranicus Gencm .erhanden. Die DNA-Seauenz des gesamten sutkiomerlen 1 8 <b Spel Bell Fragments ist in SEQ ID NO 1 cargesteilt oc Das resuitierence rekombinante Piasmid ernait aas G6P-DH Gen unter Kontroiie des eigenen Lauccncstoc-Promctors Es vvurde als PUC-G6P-DH ι 8 beze«chnet und ist m Abb 1 dargesteii;Durcn Spaitung Myths Restrikticnsenzymen Xbal und Spel kann das oben erhaitene recombinant Piasmid m am Fragment von ca. 2 2 kb and ca ca 3.8 kb Grcfle zeriegt vverden. Dieses 3 8 kb Fragment enthalpy DNA-Seouenzen aus cUC 18 and die Nudeotidsequenz von SEQ ID NO: i. Isonerung und Religation des 3 8 kb Fragments uno nacnfo'gende Transformation m E coli HB1O1 Foamed Zu horn Kion. der das G6P-DH-Gen expnmiert. Das G6P-DH Gen ist m diesem positiven Kicn ais 1 8 kb Fragment (Spel Kpnl) m emem. im Poiylmkerbereicn lives in Xbal und Kpnl geschmttenen commercially pUC 13 Viktor sub-ion. «Obei die Kpnl-Schnmste! E aus dem Vectoranteil des positiven Kons aus der Gentank stammt. Damit s em Spel Bcil-Fragmert aus dem Leuconostoc dextranicus Gencm .erhanden. Dna resuitierence recombinants Piasmid ernaitsa G6P-DH Gen unter Controls des luca ng PUC-G6P-DH ι 8 beze «chnet und ist m Abb 1;
Die E<pressionsrichtung des G6P-DH Gēns liegt dafcei m Gegennchtung zum lac-Promctcr olaCi auf pUC 18Die E < pressionsrichtung des G6P-DH Gene deactivated gene Gegennchtung zum lac-Promctcr olaCi auf pUC 18
Zur Bestimmung der Enzymaktivitāt unc AJremigung der G6P-OH wird em solcher K>on m em 35 Rsagerzgias mīt 5 ml LB-Nāhrmecium mit 50 ug ml Ampicillm emgeimpft und uber Na;-t bei 37*C argezegen Mīt dieser Kultur wird em Erlenmeyerkolben mīt 1 I LB-Nāhrmedium mīt 50 u.;~, Ampicillm ceimpft und nochmals ūber Nacht.be· 37’C unter Schūnem bebrutet. Die Zellen werden durrn Zsntnfuga- ticn geerrtet jo Beispiei 5Zur Bestimmung der Enzymactivity and AJremigung der G6P-OH w m em em in s < m > 35 m < 5 > Rsagerzg < / RTI > 5mL ml Ampicillm emgeimpft und uber Na; -t 37 * C argezegen My dieser Kultur wird em Erlenmeyerkolben 1 I LB-Nahhrmedium is home to 50 u. ~, Ampicillm ceimpft und nochmals Uber Nacht.be · 37'C unter Schunem bebrutet. Die Zellen werden durrn Zsntnfuga- ticn geerrtet as Beispie 5
Anreicherung und Charakterisierung ven rekombmanter G6P-DH aus E. coli 5 1 Anreicherungsprozedur J5 1 Aufschiufl 5 kg Bicmasse (E coli HB101 PUC-G6P-DH 1 8) mīt 25 I Kaliumphosphatpuffer 10 mmoi i. pH 7 5 entnalte^d 10": mol I MgCl: suscendieren und die Zellen mit emem APV-Gaulin Hochdruckhcmooenisa-tor bei 800 bar HomogemsierdruCK autsctiliefle". Die resuitierende Suspension auf +4’c kwmēn und 5<j zentnfugieren. 2. Ammomumsulfat-FraktionierungAnreicherung und Characterizationof recombinant G6P-DH aus coli 5 1 Anreicherungsprozedur J5 1 Aufschiufl 5 kg Bicmasse (E coli HB101 PUC-G6P-DH1 8) is present in 25 I of potassium phosphosphat buffer. pH 7 5 predetermined 10 mol / l MgCl: susceptible to doping and no more APV-Gaulin Hochdruckhcmooencer and 800 bar HomogemsierdruCK autsctiliefle ". Resuspend the suspension auf + 4'c kwmen and 5 < j zentnfugieren. 2. Ammomumsulfat-Fraktionierung
Den Rohextrakt mit festem AmmcniumsuHat bis zu emer Kon2entration von 1.9 mol I versetzen und den ausgefallenen Niederschlag abzertnfugieren. Den (jberstand weiter mit Ammoniumsulfat bis zu emer Konzentration von 3.0 mol I ausfāllen und den Nederschlag abzentrifugieren. 55 3 ErvvārmungDen Rohextrakt what I paint AmmcniumsuHat bis zu emer Koncentration von 1.9 mol I und den ausgefallenen Niederschlag abzertnfugieren. Den (jberstand weiter mit Ammonium sulphate bis emerance) 3.0 molar Ausphal und den Nederschlag Absentrifuger.
Oen zvveiten Ammcnsulfat-Niederschlag mit 20 mmol I Kaliumphosphatpuffer, pH 6.0. enthaitend 1 mmol l EDTA auflčsen und 20 min auf 52* C erAiārmen. Den ausgefallenen Niederschlag abzentnfugie- ren. 5 LV 10499 4 Erste KnstallisationOen zvveiten Ammcnsulfat-Niederschlag mit 20 mmol I Kaliumphosphat buffer, pH 6.0. Enhancer at 1 mmol of EDTA and 20 min at 52 * C for Alarmen. Den ausgefallenen Niederschlag abzentnfugieren. 5 EN 10499 4 Erste Knstallisation
Den Ūberstand von 3 langsam mt festem Ammomumsulfat bis 2.1 moli versetzen; der pH-Wert rr.it NaOH aut 6.0 korrigieren. Ūber Nacht kristailisiert die G6P-DH aus. Die Knstaliisabcn soiite bei Raumtemperatur und unter leichtem Rijhren durchgefūhrt werden Die Enzymknstaiie abzertrifugieren ί 5 Z*eite KristallisationDen Ūberstand von 3 langsam mt I paint Ammomumsulfat bis 2.1 moli; der pH-Wert rr.it NaOH aut 6.0 Korigieren. Uber Nacht crystallized die G6P-DH. Die Knstaliisabcn stool and Raumatemperatur und unter leichtem Rijhren durchgefūhrt werden Die Enzymknstaiie abzertrifugieren ί 5 Z * eite Kristallisation
Den Niederschlag mīt 20 mmol l Kē'iumphosphatpuffer. pH 6.0. enthaltend 1 mmol I EDTA. csen und mīt festem Ammoniumsulfat bis 1.9 meli versetzen Den pH-Wert vviederum auf 6.0 korngteren und ūber Nacht bei Raumtemperatur und leichtem Ruhren das Enzym auskristailisieren lassen. 6 Dialyse ’o Enz'/mknstallisat abzentrifugieren und den Niederschlag konzentnert mīt 10 mmol I Kaliurrphosphatpuf-fer. pH 6.0. enthaltend 1 mmol I EDTA losen und 24 Stunden gegen gleiChen Puffer dialysieren. 7 LyophilisationDen Niederschlag is home to 20 mmol l K'iumphosphatpuffer. pH 6.0. enthaltend 1 mmol I EDTA. hen and moth paint Ammonium sulphate bis 1.9 melel den Den-Wert vviederum auf 6.0 kornerteren und uber Nacht bei Raumtemperatur und leichtem Ruhren das Enzym auskristailisieren lassen. 6 Dialysis Enz '/ mknstallen with 10 mM I Kaliurrphosphatpuffer and den Niederschlag consents. pH 6.0. enthaltend 1 mmol EDTA losen and 24 Stunden gegen gleiChen Puffer dialysieren. 7 Lyophilisation
Die Enzymlosung ohne Zusātze iycphilisieren. Es resuitieren ca. 210 g Lyophilisat mīt :a. 900 U Aktivitāt •5Die Enzymlosung ohne Zusātze iycphilisieren. I resuitieren ca. 210 g of Lyophilisat: a. 900 U Activity • 5
5.2 Charakterisierung von rekombmamem G6P-DH5.2 Charakterisierung von recombmamem G6P-DH
Die gentechnologisch hergesteilte G6P-DH unterscheidet sich m ihren Eigenschaften ver dem bekann-ten Enzym aus Leuconostoc. 20 Die Nachteile des bekannten Leuc;nostoc-Enzyms smd wie folgt:Die gentechnologisch hergesteilte G6P-DH unterscheidet sich m ihren Eigenschaften ver dem bekann-ten Enzym aus Leuconostoc. 20 Die Nachteile des bekannten Leuc; nostoc-Enzyms smd wie folgt:
Die Langzeitstabilitat ist gering. Weitemm setzt das Enzym Glucose um. was bei Messungen n Blut. Serum oder Plasma zu falschen Ergebnissen (ūhren kann. da m derartigen Proben immer Glucose enthalten <st Die mangelnde Spezifitāt der G6P-DH ;st m Archives of Biochemistry and Biophysics 149 (1972) 102-109 beschrieben. zs Die Unterscheldungsmerkmale sir.d:Die Langzeitstabilitat ist gering. Weitemm set das Enzym Glucose um. was bei Messungen's Blut. Serum oder Plasma zu falschen Ergebnissen (hhren et al., M. Derartigen Probe immer Glucose enthalten < st Die mangelnde Specified by G6P-DH; Archives of Biochemistry and Biophysics 149 (1972) 102-109 beschrieben. Die Die Unterscheldungsmerkmale sir.d. :
1. Km NADP (in 0,1 mol/1 Tris pH 7,8; 25°C oo rec G6P-DH G6P- DH aus Leuconostoc 3,7 · 10·5 7,4 • īo·6 mol/1 1> 5,7 • 10·6 mol/1 3) 55 9,9 • 10- 4 mol/1 2} 2. Wirkung von Aktivatoren/Inhibitoren rel. Aktīvitat (bezogen auf Aktīvi-tat ohne Zusatz) -51. Km NADP (in 0.1 mol / l Tris pH 7.8; 25 ° C reco G6P-DH G6P-DH aus Leuconostoc 3.7 · 10 · 5 7.4 • Irish · 6 mol / 1 1 > 5.7 • 10 · 6 mol / 1 3) 55 9.9 • 10- 4 mol / 1 2} 2. Wirkung von Aktivatoren / Inhibitoren rel. Aktivitat (bezogen auf Aktīvi-tat ohne Zusatz) -5
Zusatz von rec. G6P-DH Cosubstrat NAD* NADP* G6P-DH aus Leuconostoc Cosubstrat NAD* NADP*Zusatz von rec. G6P-DH Cosubstrat NAD * NADP * G6P-DH aus Leuconostoc Cosubstrat NAD * NADP *
5C 5 imol/l Phosphat 50 rcmol/l Phosphat 30 % Glycerin 30 nmol/1 0,3 mol/1 Hydrogen-carbonat 100 % 80 % 100 % 80 % 60 % 30 % 100 % 100 % 100 % 100 %5C 5 imol / l Phosphat 50 rcmol / l Phosphat 30% Glycerin 30 nmol / 1 0.3 mol / 1 Hydrogen carbonate 100% 80% 100% 80% 60% 30% 100% 100% 100% 100%
Aktivierung 2) 107 % 1 ) 118 % 1 ) 30 % 1 ) 30 % 1 ) 80 % 1 > 80 % 1) 120 % 1 ) 120 % 1 ) 6 55 3. Spezifitāt ο G6P-DH aus Leuconostoc Urnsatz5} kein UmsatzAssets 2) 107% 1) 118% 1) 30% 1) 30% 1) 80% 1 > 80% 1) 120% 1) 120% 1) 6 55 3. Specification ο G6P-DH aus Leuconostoc Urnsatz5
Spezifitāt fiir Glucose4} 2-Desoxy-glucose-ēP41 rec G6P-DH mit HAD(P)* kein Ureatz 5 % 4. TemperaturstabilitatSpecify fiir Glucose4} 2-Desoxy-glucose-enP41 rec G6P-DH mit HAD (P) * kein Ureatz 5% 4. Temperaturstability
Temperatur rel. Aktivitāt (bezogen auf 20°C) rec. G6P-DH G6P-DH aus Leuconostoc dextranicus hergestellt nach 1 > O o o 100 % 100 % 50 °C 100 % 97 % 60 °C 100 % 90 % 70°C 43 % 4 %Temperatur Rel. Activity (bezogen auf 20 ° C) rec. G6P-DH G6P-DH aus Leuconostoc dextranicus hergestellt nach 1 > O o 100% 100% 50 ° C 100% 97% 60 ° C 100% 90% 70 ° C 43% 4%
Die Bestimmung der Temperaturstabilitat erfolgte in 3,2 mol/1 Ammoniumsulfat pH 6,0 iiber 10 Minuten. 35 (Anfangsaktivitāt des Enzyms 2500 U/ml).Ammonium sulphate pH 6.0 iiber 10 Minuten. 35 (Anfangsaktivitāt des Enzyms 2500 U / ml).
Die Aktivitātsbestimmung und Spezifitātsbestim-mung erfolgte wie in Beispiel 6 beschrieben. 1 > Olive und Levy, Biochem. 6 (1967), 730 2> DeMoss, in Methods in Enzymology, Vol 1., S. 328, Acad. -5 Press, New York, 1955Die Activationbustimmung und Spesifitbestim-mung erfolgte wie in Beispiel 6 beschrieben. 1 > Olive und Levy, Biochem. 6 (1967), 730 2 > DeMoss, in Methods in Enzymology, Vol. 1, S. 328, Acad. -5 Press, New York, 1955
Levy, 626th Meeting Sbeffield , S. 13 ( 1988)Levy, 626th Meeting Sbeffield, 13 (1988)
Konzentration 0,15 mol/1 55 Arch.Biochem. and Biophys. 149 (1972), 102-109Konzentration 0.15 mol / 1 55 Arch.Biochem. and Biophys. 149 (1972), 102-109
Beispiel 6 55 Bestimmung der Aktivitāt von Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase G6P-DH setzt Glucose-6-Phosphat und NAD* in Gluconat-6-Phosphat und NADH um. Das gebildete NADH wird bei 340 nm photometrisch gemessen. 7 LV 10499Glucose-6-Phosphat-und-NAD * in Gluconat-6-Phosphat und NADH um. Das tildile NADH wird and 340 nm photometrisch gemessen. 7 LV 10499
Zu 3 ml emes Reagenzes. bestehend aus Tns-Puffer (0.1 moli pH 7.8. 3 mmol I MgCl;). 0.1 mmol I ΝΑΟ’, freie Sāure und 0.15 moli Giucose-6-Phosphat vverden 0 05 ml Probe (G6P-DH. Volumenaktivitāt mcglichst zvvischen 0.3 und 0.5 U ml) bei 25 C zugegeben und die Zunahme der Extmk!ion oE mm) verfoigt D'e Voiumenaktivitāt errechnet sich nach: 3,05 •oZu 3 ml Reagens. bestehend aus Tns-buffer (0.1 mol pH 7.8. 3 mmol MgCl;). 0.1 mmol I ΝΑΟ ', freie salt and 0.15 mol Giucose-6-Phosphat vverden 0 05 ml Probe (G6P-DH. Volumetric activity mcglichst zvvischen 0.3 and 0.5 U ml) and 25 ° C and Zunahme der Extmk! D'e Voiumenaktivitat errechnet sich nach: 3.05 • o
Volumenaktivitāt - x ΔΕ min [U/ml]€ x 1 x 0,05 oi: = 6.3 [mmor' χ I x cm-'] 20 30 -:5 5 0 8 55 60 SEQ ID NO:1 ART DER SEQUENZ:Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLANGE:1696 Basenpaare 5 STRANGFORMrEinzelstrangVolume Activation - x ΔΕ min [U / ml] € x 1 x 0.05 oi: = 6.3 [mmor χ I x cm-1] 20 30 -: 5 5 0 8 55 60 SEQ ID NO: 1 ART DER SEQUENZ: Nucleotide mit entsprechendem Protein SEQUENZLANGE: 1696 Basenpaare 5 STRANGFORMrEinzelstrang
TCTAGTCATT TAATCAATTT TTGACTTGTT CAACGCTTAA TATGTTTGTG AATCCCGTACTCTAGTCATT TAATCAATT TTGACTTGTT CAACGCTTAA TATGTTTGTG AATCCCGTAC
TTTTCCAGAC CTTTTTGCGT TATAATGGAG AGTGAATTTA ATTATAATAT AAGGGGAACATTTTCCAGAC CTTTTTGCGT TATAATGGAG AGAINST OPERATING ATTACHMENT AAGGGGAACA
TC 120 122 170 21Θ 266 314 362 410 458 506 554 602 650 o ATG GTT TCA GAA ATC AAA ACG TTG GTA ACT TTC TTT GGC GGA ACT GGT '5 Met Vai Ser Glu Ile 5 Lys Thr Leu Vai Thr 10 Phe Phe Gly Gly Thr 15 Gly GAT TTA GCA AAG CGT AAG CTT TAC CCA TCA GTT TTC AAC CTC TAC AAA Asp 'Leu Ala Lys 20 Arg Lys Leu Tyr Pro 25 Ser Vai Phe Asn Leu 30 Tyr Lys AAA GG A TAC TTA CAA GAA CAC TTT GCC ATT GTT GGG ACA GCA CGT CAA 20 Lys Gly Tyr 35 Leu Gln Glu His Phe 40 Ala Ile Vai Gly Thr 45 Ala Arg Gln CAA TTA AGT GAT GAC GAG TTT AAG CAA TTG GTT CGT GAT TCA ATT AAA 25 Gln Leu 50 Ser Asp Asp Glu Phe 55 Lys Gln Leu Vai Arg 60 Asp Ser Ile Lys GAC rprprp ACT GAA GAT CAA GCA CAA GCC GAA GCG TTT ATT GCG CAT TTT Aso 6 5 Phe Thr Glu Asp Gln 70 Ala Gln Ala Glu Ala 75 Phe Ile Ala His Phe 80 TCT TAC CGT GCG CAC GAT GTC ACA GAT GCC GCT TCT TAT GGT ATC TTG Ser Tyr Arg Ala His 85 Asp Vai Thr Asp Ala 90 Ala Ser Tyr Gly Ile 95 Leu AAG TCA GCG ATC GAA GAA GCA GCA ACC AAA TTT GAC ATT GAT GGC A*T JS Lys Ser Ala Ile 100 Glu Glu Ala Ala Thr 105 Lys Phe Asp Ile Asp Gly 110 Asn CGT ATT TTC TAT ATG TCA GTT GCC CCT CGT TTC TTC GGT ACA ATC GCT Arg Ile Phe 115 Tyr Met Ser Vai Ala 120 Pro Arg Phe Phe Gly 125 Thr Ile Ala -Ό AAA TAT TTG AAA TCA GAA GGT TTG CTA GCT GAG ACT GGC TAC AAT CGT Lys Tyr 130 Leu Lys Ser Glu Gly 135 Leu Leu Ala Glu Thr Gly 140 Tyr Asn Arg TTG ATG ATT GAA AAG CCT TTT GGT ACA TCA TAC GCC ACC GCA GAA GAA J5 Leu 145 Met Īle Glu Lys Pro 150 Phe Gly Thr Ser Tyr 155 Ala Thr Ala Glu Glu 160 TTG CAA AGT GAT TTG GAA AAT GCA TTT GAT GAT GAC CAA CTG TTC CGT Leu Gln Ser Asp Leu 165 Glu Asn Ala Phe Asp 170 Asp Ašp Gln Leu Phe 175 Arg 5 3 9 55 LV 10499 ATT GAC CAC TAT CTT GGA AAA GAA ATG GTA CAA AAT ATT GCA GCA TTA 693 Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Vai Gln Asn Ile Ala Ala Leu 180 185 190 CGT TTT GGT AAC CCA ATC TTT GAT GCC GCT TGG AAT AAG GAC TAT ATC 746 Arg Phe Glv Asn Pro Ile Phe Asp Ala Ala Trp Asn Lys Asp Tyr Ile 195 200 205 AAA AAC GTA CAA GTA ACT TTG GCT GAA GTT CTA GGT GTT GAA GAG CGT 794 Lys Asn Vai Gln 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TCTTTGTTTG ACGGTCTTTT TATATTGTCT GATTTAAGAT GCGTTTGGTT TCACGGAAAA CGGC TGACAA ATTGGTGTAT TGATCC SEQ ID NO:2 ART DER SEQUENZ:Nucleotidsequenz SEQUENZLANGE:72 Basenņaare STRANGFORM:EinzelstrangTCTTTGTTTG ACGGTCTTTT TATATTGTCT GATTTAAGAT GCGTTTGGTT TCACGGAAAA CGGC TGACAA ATTGGTGTAT TGATCC SEQ ID NO: 2 Nucleotidsequenz SEQUENZLANGE: 72 Basenin STRANGFORM: Einzelstrang
RTTTTGAACC ATTTCTTTWC CTAAATAATG ATCAATWCKA AATAATTGRT TATCATCAAA AGCGTTTTCA AA 1370 1413 14 66 1514 1562 1610 1670 1696 60 72RTTTTGAACC ATTTCTTTWC CTAAATATG ATCAATWCKA TATCATCAAA AGCGTTTTCA AA 1370 1413 14 66 1514 1562 1610 1670 1696 60 72
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Family Applications (1)
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-
1993
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