LV10499B - Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, dna, vector, plasmid, micro-organism, method for preparing of dna, method for preparing of protein, method for enzymatic analysis, reagent - Google Patents

Abstract

Described recombinant glucose-6-phosphate dehydrogenase characterized by the sequence of SEQ ID NO: 1 and the method of obtaining it. A recombinant vector comprising a glucose-6-phosphate dehydrogenase gene used to transform E. coli, the transformed bacterium is cultured and the desired enzyme is released from the culture medium or cells.

Description

LV 10499

Catecholysis of Dte Giucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P-OH) Schritt im oxidativen Giucose · Metabolism Dace wird Glucose-6-Phcsphat zu Giuconsāure-6-Phosphat oxidiert. Ahahrend NAO * ocerund NAOP as Cosubstrat reduzer vverden Durch die Giucose-Oxidation werden schiieSiicn pentose · zucker fur den Nuc'emsāure-Stoffvvechsei erzeugt 5 Die Giucose-6-Pb. . Oieses Enzym Ks sowohl NAD als auch NADP * als Cofaktor vervquice. im Geger.satz zum Enzym aus Hefe. das lūr NADP spesifiscn ist das Enzym liegt als Dimer, bestehenp aus zwei gle'cnen monomeren Unteremheiten rr.it emem Moleculari gewicht von 55,000 D vor Es besitzt te 25'C eme spez fische Aovitat von 550 U mg. < 0 Nacnteile des Verfahrens zur Gewmnung von G6P-DH aus Baktenen der Gattung LeuCC ^ cstCC bestenen ua carm. dafl die Milchsāure-Baktenen Komple.ve Nāhrstoffansprūche besitzen und daher m den mofltech-mscb ver / vendeten Nahrmedien nur langsam vvachsen und eme gellge Zelldichte presenticher, Zudem ist der Genalt der Biomass an G6P-DH and Leuconostoc nur senr gering (ungefāhr 1 ° b des Gesant-Zellprcteins) Zur Bereitsteilung ausreichender Mengen an G6P-DH smd daher grofle Fermentations-Dimensionen notvven- > 5 dig. Weiterhm Kann / Vegen der Groflen Mengen an Fremdprotem nur eme Enzymation mt germger spezifischer Aktivitat erhalten vveraen.

Dermatologic Nachteii der be * annten G6P-DH aus Leuconostoc-Baktenen besteht jedcch m ihrer genngen Temperature stability

Aufgate der voriiegenden Erfindung war es somit. em Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase fcereitzu-20 stei. Aelche die Nachteile des Štances der Technīk nient mehr aufvveist.

Die erfmdungsgemā / Je Aufgabe * md durch Bereitsteilung emer Giucose-6-Phosphat-Dehydrcgenase geicst. weiche die m SEQ ID NOI dargestellte Ammosāuresequenz enthalt und aus Leuconostoc mesente-roides. Subspezies dextranicus (DSM 20187). im «eiteren als Leuconostoc dextranicus bezeichnet erntal-lich ist. SEQ 10 NO 1 DEGRESTION DIAGNOSE, SEQ ID NO: 10 SEQ 10 NO 1 dargestent oder eme ihr immenen der Degeneration des genetischen Codes entsprechence erfmcungs-gemafle Enzym kcdierende Sequenz enthalt.

Die erfindungsgemaple recombinant DNA wurde durch Mustern einer L. dextranicus (DSM 20187) Genbank is home to emer geeigneten Oligonukieotid-Sonde short. wie vveiter unten ausfuhrlicher beschneben ist 30 Bei Expression der erfmdungsgemāflen recombinant DNA in E. coli Zellen zeigte smn ūberrascren-der-Aise da / 3 bereit germge Fermentium-Voiumma zur Bereitsteilung der gewunschten Enzymmenge ausreichen em vemngerung aes Ferm.entations-Vciumens um den Faktor 1.500 bis 1: 1000 usicht. Uberdies erhālt me bei vemrgertem Aufremigungsauhvand G6P-DH-Prāparationen von hoher Remheit, d.h. lives einer spezifischen Aktivitāt von 35 ca 900 U mg. inscesondere zeichnet sich jedoch das erfindungsgemāfle rekombmante Erzym ce < Isohe-rung aus E. coli rasberraschendervvetse durch eine deutlich verbesserte Temperaturstability gegenLber dem bekannten Enzym aus. Ein zusātzlicher Vorteii des recombinant Enzyms ist, da / 3 and Lucraschendervveise, Gegensatz zum bekannten Enzym aus Leuconostoc mcht, is a Giucose reagiert. Diese cekannte unspezifische Reaktion des Leuconostoc-Enzyms dwells in Glucose (Olive und Levy, Biochemistry 6 (1967) 730) as a war bislang em erheblicher Nachteil and der Durchfurrung von Enzymtests da somit aufg. Serum oder Plasma faische Ergebnisse and Bestimmungen auftreten frog. Schliefliich unterscheidet sich das recombmante Enzym von der bekannten G6P-DH achers unterschiedlichen Km-Wert för NADP und unterschlich Wirkung von Aktivatoren und Inhibitoren (z.B. Phosphat. Glycenn. Magnesium ionene. Hydrogencarbonate). js Weiterhin em Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein recombinant vector. der eme oder mehrere Kopien der erfindungsgemālene recombinant ONA enthalt. Em derartiger Vector step die for Evpres · sion der erfmdungsgemā / 3en recompantant DNA in fremden VVirtsorganismen ermcglichen Der erfm-durgsgemāfle Vector kann ein Vector sem. der sich in die chromosomale DNA der VVireiei mtegr.ert (z 6 Baktenophage Lambda). er kan jedoch auch m der Wirtszelle extrachromosomal vorhegen iP'asmid). 50 Vorzugs «eise ist der erfindungsgemāfle Vector em Plasmid.

Der erfindungsgemāfle Vector kan sovvohl em eukaryontischer als auch em prokarycntischer Vector Ne. vorzugsweise ist er jedoch em prokaryontischer Vector. d.h. zur Vermehrung m prokaryontischen Wirtsorgamsmen geeignet. Besonders stuck besitzt der recombinant Vector emen m E coli aktiven Replikationsursprung. d.h. er ist in E. coli vermehrbar. 55 In einer besonders bevor2ugten Ausfuhrungsform enthalt der erfindungsgemáfle recombinant Vector die-for-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase codereende Nucleic acid equenz unter Controller emer in E.coli funktionsfanh Promotersequenz aus Leuconostoc dextranicus. die in den ersten 122 (stromauffer des G6P-DH-Gens) deres in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nuklemsuresuresenzenz enthalten ist 2

Um Promotoreigenschaften aufzuweisen ist es nicht erforderiich. dafl der DNA-Bereich genau diese Sequen2 von 122 Nukieotiden besitzt Auch abgeieite Seguenzen oder Fragmente dieser Frequenz. die Promotoreigenschafien besitzen. smd geeignet Unter emer abetie bioiogisch activ Sequenz mn Smne der Erfmdung versteht man daher. dafl emzeine Nukeotide oder kurze Nuklectid-Sequenzen aus der Promctorsequen2 de'etiert. no substitute or msertiert nor kdnnen. und zwar auf solche We > dafl die P'omotor-Aktivitat der Sequenz erhalten bieibt. Dem Facnmann ist and bekannt. dafl bei emem Promotor n'cnt -; e gesamte Seouenz, sondern nur bestimmte Teiibereiche preserved often by ours Bei prckary-ΟΓΐ ^ ο ^ εη

Die Erfmdung bemhaitet somit auch e recombinant DNA, weiche die ersten 122 Nucleotide der SEQ ID NO: 1 dargesteil Nuklemsure-Seouenz oder eme davon abgeieit Sequenz myth Promotorigenschaften besitzt C'terraschenderweise ergibt dieser Leuconostoc Promotor auch in E. coli eme protem < pression. Promotional auch zur Expression heterologer Gene. d h. vom G6P-DH-Gen verschieden Genen m gram-negativ Baktenen. whirlwind E. coli Baktenen verwenaen. VWatergem em Gegenstand der vorliegenden Erfmdur.g m inorganic microorganism, der emm erfin-dungsgemāle clenomanten Vector transformiert ist. Vorzugsvveise handel es smh dabei um em gram-negatives Bacterium. besonders stubbed um em E. coli Eaktenum.

Die erfmdungsgemāfle recombinant DNA kann man man enamel. mdem man (1) chromium bone Leuconostoc dextranicus DNA short and unmodified genesignant (2) de gespaltene de deranranus DNA men Vector embaut. dm dem Vector emen geeigneten Organismus trarsformiert und auf diese Weise emperor Genbank. (3 'die Genbank aus Schritt (2) was born Emeric Nucleus-Sonde.) Genesis-6-Phosphat-Dehycrogenase-Gen Spezifische Sequenz, vvobei man diese Scnden im Hmolick auf die Ccdon-Vervvertung in Milchsure Bacteria Constructent und (41 der Scnde aus Schntt (3) Positive Reagent Clone der Genbank anaiysier. D > e Isolierung von chromosomaler L. de.vtramcus (DSM 20187) DNA tst durch komcm.ierte Polye: Lysczym-Behandlung und anschiieflence Inkubation is home to Protemase K moghcn

Die Spaltung aer lysherten L. dextranicus DNA dies emem geeigneten Restriktionsenzym. die Lgierung der gespattenen DNA m emen geeigneten Kionierungsvektor. die Transformation emes geeigneten Organismus myt dem recombmanten Kionierungsvektor zur Hersteilung emer Genbank auf em em dem Fach-mann au < dem Gebet der Moiekuiarbioiogie an sich bek-nnte Weise erfolgen. The nachste schntt < st das Mustem der auf cese Weise hergesteilten Genbank is housed by Emer Nuklemsur-Sonde. to give Giuccse-6-Phcsphat-Dehydrogenase-Gen Spezifische Sec.

Aus Haghighi et al., Biochemistry 21 (1982). 6415-6420 µl Peptid sequencer G6-PDH aus L meserteroides myth pyridoxylierbaren Lysmrest O bekannt Diese Sequenz rafts: Phe-Leu-15o-Lys'-Ser-Pro-Ser-Tyr- (Aso Val) -Lys. Aus dieser Sequenz jedoch keme Oiīgonukieotid-Sorce acgeieitet «erden myt der man m der L dextranicus Genbank em H.ondisierungssignai finden kannen

Aus Bhaabhade et al., FEBS Letters 211 (1987). 243-246 µM Peptidsequenz aus dem 2ktiven Zemrum der G6P-DH aus L. mesenteroides mycophenol homologie zur menschnchen G6P-DH bekannt. Aus der Vielzahl von Make a Constructor Baren Ohgonuk eotid-Sonden vvurde die m Beīspie! 2 genannte Oiigonukleotid-Sonce is housed in emerald Lane von 72 Basen (SEE iD NO 2) hergesteil.

Ein Mustern aer. L. dextranicus DNA-Genbank rmt jiesem Oligonucleotides in 5'-endmarker Form erbrachte schiiefliich emen positiven Klon. durch aen they Sequenz des L. dextramcus G6P-DH-Gens ermittelt werden fronden

The DNA Sequenz des G6P-DH-Gens aus L. dexvan.icus wurde nach dem Verfahren von Sanger bestmnmt. SEQ ID NO: 1 dargestell. SEQ ID NO: 1 ebenfalls die dermatelte Ar-.nosāuresequenz der G6P-DH aus L. de * tramcus Daraus «st ersichtlich. dafl die Ammosauresequenz des erfmdungsgemāflen Enzyms m 6 von 42 Positionen mcht myths m. mcem man (1) emen geeigneten d m m emem erfindungsgemālene DNA or emer Vector transfor- mers der eine oder Mehrere Kopien dieser DNA enthal, (2) den transformierten VVisorgamsmus m emem geeigneten Medium culture (3) das Protein aus dem Medium oder den Zellen anrechert.

The Expression des erfindungsgemāflen recombinant Proteins in einem transformierten VVirtsorgams- 3 LV 10499 us. vorzugsweise memem prokaryontischen Wirtsorganismus. besonders bevorzugt m einer E. coli-Zeiie ist prmzīpiell unter Komrpiie jeces geeigneten Promotors mogkch. E moli c B e em Expression der G6P-DH unter Controller wte z B dem tac-Promotor. mgl-Promoter or pft-P'omotor moglich Vcrzugsvveise lysocontin g of lymphatic Expression Constitutive Unterontrol 5 luconostoc-Promotors fcesoncers inconsistent untermined by SEQ ID N01 dermestably or emer oavon abgeleiteten Prcmctor-Seouenz tentprechend den erste 122 Nucleotide von SEQ ID NO: 1) Am bevorzugt .st das Piasmid pUC G6P-DH 1.8. das m Abb. 1 dargestell Ais geeigneter E cdi VVirtsstammhe urce der kommerzeil erhaltthee E. coli Stamm HB 101 ausgewāhit. Bei Transformation von E coii H8 10i is housed in pUC G6P-DH 1.8 wurde gefunden, da / 3 das Plasmid eme hohe Stabilize m der Ze s teitit und die Expression der G6P-DH uber mehrere Passagen auch ohne Seiektionsdruck durchgefūhrt vverden kettle

Die vorliegende Edindung step durch die folgenaen Beispiele in Verbmdung lies in SEQ ID NO: 1 and 2 sowie der Abbildung 1 weiter verdeutiicht vverden. I zeigen: SEQ ID NO: 1 Nuklect'dsequenz der Leuconostoc DNA-lnsertion m pUC G6P-DH 18 .. vvobei die

'5 ersten 122 Basen strcmauf dve des codierend Berernhs den L. dextranicus G6P-DH

The promoter and die Basen 123-1580 die Nucleotide sequences of dextranicus G6P-DH gene darsteilen. das fūr em Protem myth der ebenfalls angegebenen Amminosurese-quenz codes SEQ ID NO: 2 die Oiigonucleotide probe denote G6P-DH Gene aus Leuconostoc mesenteric. der f_r emen Bereich des aktiven Zentrum der G6P-DH von L. mesenteroides codiert. der eme hohe Homologte myth der menschiichen G6P-DH.

Abb. 1 das Plasmid pUC-G6P-DH 1 8.

Beispiel 1 25

Isolierung chromosomeer DNA aus Leuconostoc dextranicus

Genomic DNA of Leuconostoc dextramcus wird nach folgendem Verfahren gevvonnen:

Leuconostoc dextramcus (DSM 20187) is in APT-Medium (Merck No. 10454) and 30'C angezogen. Dissolve 30 Zeilen Honest 100 ml of culture bristle blender. m 10 ml of 20 mmol of Three HCl pH 8.0 in 15 ml of dieser Pufferlosung resuspender. Nach Zugabe von 5 ml 24% (wv) Poiyethyiengiykol 6000 and 20 mg Lysozym wird 16 h and 4 C incubator. Dilution with 1 ml of 20 ml of v) SDS was prepared with 2 mg of Protease K zugegeben and 60 mm and 37 ° C of microbubble. Diaitere Remigung cer DNA erfolgt durch sequentielle Phencl- und Chloroform-Extraktic. Behandlung mit RNAse A (0 5 mg 60 35 mm and 37 C). nochmaliger Phenol- and Chloroform-Extraktion und abschlieuer Ethanol

Beispiel 2:

Bestimmung.der Grcfle von genomchen DNA Fragmenten. die fur G6P-DH codieren 10

Zur Hybndisierung wurde das in SEQ ID N0 2 gezeigte Oligonuklectid verwendet.

5 µg of genomic DNA for aus L. dextramcus wira mice verschieden Restrictionsendonukleasen (BcH. Cial. Hindlll, Pstl, Xbal) gespaiten. auf emem 0.8 ° e Agarosegel elecrophoretisch aufgetrennt und danach auf Nitrozellulosefilter transferer. Ein s > cher Filter wird nach Vorhybridisation with emer Ldsung aus 6 x and SSC-buffer. 0.7 ® Magermilchpulver, and 40 'C Uber Nacht m der gleichen Losung Incubator. die zusātzlich cas obige Oligonuklectid. what;: P radioakL'v endmarker. enthālt. Nach Waschen, Trocknen und Autoradio-graphie Kettle Festgesteilt werden. daC em durch das Restriktionsenzym Bell erzeugtes DNA Fragment ca 3.4 kb GrcOe mit dem Oligonucleotide hybridis. 5o Beispiel 3:

Klonierung eines DNA-Fragments. das fur G6P-DH coder 20 µg genomic DNA aus L. dextranicus wird mit Bell geschmtten und emem Gel aus medng-55 schmelzender Agarose aufgetrennt. DNA Fragments with Einer Grofle von ca. 3.4 kb + -0.2 kb vverden aus dem Gel ausgeschmtten Dieses Gelstūck wird mit Ligasepuffer (Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning. 474) equilibriert und bei 65 C verflus. Danach waves 0.1 µg of pUC18 DNA. BamHI-gespalten and 5 U of T4-Ligase zugegeben. 10 min but 37 * dann 16 h and 15 C incubator. Die Restnktionsendonuklease BamHl 4 erzeugt uberhāngende ONA-Enden, die zu den von Bell erzeugten Enden compatible with smd.

Zellen von E coli HB 101 (DSM 1607) * erden m 20 ml Nehrmedium angezogen und durch Caiciumchioridbehandlung m competent Zustand Uberfur (Mamatis et al. 1982. Molecular Clonmg. Pp 250 · 252) Der oben erhaitere Ugationsansatz wird nach Zugabe von emem Volumenteil 50 mmci i Three HCl pH 5 '5 nochmals 5 mm and 65 C ver' ^ ssigt uno zur Transfcrmation emgesetzt. Dissolve the doppler with the LB-Agarpiatt in 50 µl of Ampiollm auspiattiert und 37'C emen Tag bebrutet. D'S ^ ccnge ^ acnsenen Colonies * erden auf neue LB-Agarplatten is home to 50 ul Ampicillin uberstempeft auf den.en Nitrczeiiusosefiiter iiegen. Nacroem die KcOn aoermals hochge * achsen smd, die Ftter rekenocen at Colonie Wie and Grunstem und Hogress Proc, Nati. Acad Sci USA. 72 M975i 3961 to bescnrieben. iysiert uno myth der unter 2 beschriecenen radioactive markierten Oligonukleotidscnde hybndis-n Nach Autoradiographie kdnnen K.cne is housed in a recembmant. G6P-DH-coded Plasmids were identified as urd von den Ausgangsplatten by Nach Isonerung und Charaktensterung der P.'asmid-DNA sC'Cher Klcne. dafl diese em Grofle von ca 6 κρ tesitzen Dies bedeutet. dali em DNA Fragment vpn ca 34 kb Grcfle m die pUCi8-DNA msertied ist Em soiches recombmantes Plasmium * lyssem: s we'tere Bearteitung ausgevvāhit

Beispiei 4

Einengung und Expression des Geen 20

Durcn Spaitung Myths Restrikticnsenzymen Xbal und Spel kann das oben erhaitene recombinant Piasmid m am Fragment von ca. 2 2 kb and ca ca 3.8 kb Grcfle zeriegt vverden. Dieses 3 8 kb Fragment enthalpy DNA-Seouenzen aus cUC 18 and die Nudeotidsequenz von SEQ ID NO: i. Isonerung und Religation des 3 8 kb Fragments uno nacnfo'gende Transformation m E coli HB1O1 Foamed Zu horn Kion. der das G6P-DH-Gen expnmiert. Das G6P-DH Gen ist m diesem positiven Kicn ais 1 8 kb Fragment (Spel Kpnl) m emem. im Poiylmkerbereicn lives in Xbal und Kpnl geschmttenen commercially pUC 13 Viktor sub-ion. «Obei die Kpnl-Schnmste! E aus dem Vectoranteil des positiven Kons aus der Gentank stammt. Damit s em Spel Bcil-Fragmert aus dem Leuconostoc dextranicus Gencm .erhanden. Dna resuitierence recombinants Piasmid ernaitsa G6P-DH Gen unter Controls des luca ng PUC-G6P-DH ι 8 beze «chnet und ist m Abb 1;

Die E < pressionsrichtung des G6P-DH Gene deactivated gene Gegennchtung zum lac-Promctcr olaCi auf pUC 18

Zur Bestimmung der Enzymactivity and AJremigung der G6P-OH w m em em in s < m > 35 m < 5 > Rsagerzg < / RTI > 5mL ml Ampicillm emgeimpft und uber Na; -t 37 * C argezegen My dieser Kultur wird em Erlenmeyerkolben 1 I LB-Nahhrmedium is home to 50 u. ~, Ampicillm ceimpft und nochmals Uber Nacht.be · 37'C unter Schunem bebrutet. Die Zellen werden durrn Zsntnfuga- ticn geerrtet as Beispie 5

Anreicherung und Characterizationof recombinant G6P-DH aus coli 5 1 Anreicherungsprozedur J5 1 Aufschiufl 5 kg Bicmasse (E coli HB101 PUC-G6P-DH1 8) is present in 25 I of potassium phosphosphat buffer. pH 7 5 predetermined 10 mol / l MgCl: susceptible to doping and no more APV-Gaulin Hochdruckhcmooencer and 800 bar HomogemsierdruCK autsctiliefle ". Resuspend the suspension auf + 4'c kwmen and 5 < j zentnfugieren. 2. Ammomumsulfat-Fraktionierung

Den Rohextrakt what I paint AmmcniumsuHat bis zu emer Koncentration von 1.9 mol I und den ausgefallenen Niederschlag abzertnfugieren. Den (jberstand weiter mit Ammonium sulphate bis emerance) 3.0 molar Ausphal und den Nederschlag Absentrifuger.

Oen zvveiten Ammcnsulfat-Niederschlag mit 20 mmol I Kaliumphosphat buffer, pH 6.0. Enhancer at 1 mmol of EDTA and 20 min at 52 * C for Alarmen. Den ausgefallenen Niederschlag abzentnfugieren. 5 EN 10499 4 Erste Knstallisation

Den Ūberstand von 3 langsam mt I paint Ammomumsulfat bis 2.1 moli; der pH-Wert rr.it NaOH aut 6.0 Korigieren. Uber Nacht crystallized die G6P-DH. Die Knstaliisabcn stool and Raumatemperatur und unter leichtem Rijhren durchgefūhrt werden Die Enzymknstaiie abzertrifugieren ί 5 Z * eite Kristallisation

Den Niederschlag is home to 20 mmol l K'iumphosphatpuffer. pH 6.0. enthaltend 1 mmol I EDTA. hen and moth paint Ammonium sulphate bis 1.9 melel den Den-Wert vviederum auf 6.0 kornerteren und uber Nacht bei Raumtemperatur und leichtem Ruhren das Enzym auskristailisieren lassen. 6 Dialysis Enz '/ mknstallen with 10 mM I Kaliurrphosphatpuffer and den Niederschlag consents. pH 6.0. enthaltend 1 mmol EDTA losen and 24 Stunden gegen gleiChen Puffer dialysieren. 7 Lyophilisation

Die Enzymlosung ohne Zusātze iycphilisieren. I resuitieren ca. 210 g of Lyophilisat: a. 900 U Activity • 5

5.2 Charakterisierung von recombmamem G6P-DH

Die gentechnologisch hergesteilte G6P-DH unterscheidet sich m ihren Eigenschaften ver dem bekann-ten Enzym aus Leuconostoc. 20 Die Nachteile des bekannten Leuc; nostoc-Enzyms smd wie folgt:

Die Langzeitstabilitat ist gering. Weitemm set das Enzym Glucose um. was bei Messungen's Blut. Serum oder Plasma zu falschen Ergebnissen (hhren et al., M. Derartigen Probe immer Glucose enthalten < st Die mangelnde Specified by G6P-DH; Archives of Biochemistry and Biophysics 149 (1972) 102-109 beschrieben. Die Die Unterscheldungsmerkmale sir.d. :

1. Km NADP (in 0.1 mol / l Tris pH 7.8; 25 ° C reco G6P-DH G6P-DH aus Leuconostoc 3.7 · 10 · 5 7.4 • Irish · 6 mol / 1 1 > 5.7 • 10 · 6 mol / 1 3) 55 9.9 • 10- 4 mol / 1 2} 2. Wirkung von Aktivatoren / Inhibitoren rel. Aktivitat (bezogen auf Aktīvi-tat ohne Zusatz) -5

Zusatz von rec. G6P-DH Cosubstrat NAD * NADP * G6P-DH aus Leuconostoc Cosubstrat NAD * NADP *

5C 5 imol / l Phosphat 50 rcmol / l Phosphat 30% Glycerin 30 nmol / 1 0.3 mol / 1 Hydrogen carbonate 100% 80% 100% 80% 60% 30% 100% 100% 100% 100%

Assets 2) 107% 1) 118% 1) 30% 1) 30% 1) 80% 1 > 80% 1) 120% 1) 120% 1) 6 55 3. Specification ο G6P-DH aus Leuconostoc Urnsatz5

Specify fiir Glucose4} 2-Desoxy-glucose-enP41 rec G6P-DH mit HAD (P) * kein Ureatz 5% 4. Temperaturstability

Temperatur Rel. Activity (bezogen auf 20 ° C) rec. G6P-DH G6P-DH aus Leuconostoc dextranicus hergestellt nach 1 > O o 100% 100% 50 ° C 100% 97% 60 ° C 100% 90% 70 ° C 43% 4%

Ammonium sulphate pH 6.0 iiber 10 Minuten. 35 (Anfangsaktivitāt des Enzyms 2500 U / ml).

Die Activationbustimmung und Spesifitbestim-mung erfolgte wie in Beispiel 6 beschrieben. 1 > Olive und Levy, Biochem. 6 (1967), 730 2 > DeMoss, in Methods in Enzymology, Vol. 1, S. 328, Acad. -5 Press, New York, 1955

Levy, 626th Meeting Sbeffield, 13 (1988)

Konzentration 0.15 mol / 1 55 Arch.Biochem. and Biophys. 149 (1972), 102-109

Glucose-6-Phosphat-und-NAD * in Gluconat-6-Phosphat und NADH um. Das tildile NADH wird and 340 nm photometrisch gemessen. 7 LV 10499

Zu 3 ml Reagens. bestehend aus Tns-buffer (0.1 mol pH 7.8. 3 mmol MgCl;). 0.1 mmol I ΝΑΟ ', freie salt and 0.15 mol Giucose-6-Phosphat vverden 0 05 ml Probe (G6P-DH. Volumetric activity mcglichst zvvischen 0.3 and 0.5 U ml) and 25 ° C and Zunahme der Extmk! D'e Voiumenaktivitat errechnet sich nach: 3.05 • o

Volume Activation - x ΔΕ min [U / ml] € x 1 x 0.05 oi: = 6.3 [mmor χ I x cm-1] 20 30 -: 5 5 0 8 55 60 SEQ ID NO: 1 ART DER SEQUENZ: Nucleotide mit entsprechendem Protein SEQUENZLANGE: 1696 Basenpaare 5 STRANGFORMrEinzelstrang

TCTAGTCATT TAATCAATT TTGACTTGTT CAACGCTTAA TATGTTTGTG AATCCCGTAC

TTTTCCAGAC CTTTTTGCGT TATAATGGAG AGAINST OPERATING ATTACHMENT AAGGGGAACA

TC 120 122 170 21Θ 266 314 362 410 458 506 554 602 650 o ATG GTT TCA GAA ATC AAA ACG TTG GTA ACT TTC TG GGC GGA ACT GGT '5 Met Is Ser Glu Ile 5 Lys Thr Leu Is Thr 10 Phe Phe Gly Gly Thr 15 Gly GAT TTA GCA AAG CGT AAG CTT TAC CCA TCA GTT TTC AAC CTC TAC AAA Asp Leu Ala Lys 20 Arg Lys Leu Tyr Pro 25 Ser Or Phe Asn Leu 30 Tyr Lys AAA GG A TAC TTA CAA GAA CAC TTT GCC ATT GTT GGG ACA GCA CGT CAA 20 Lys Gly Tyr 35 Leu Gln Glu His Phe 40 Lower Ile Or Gly Thr 45 Lower Arg Gln CAA TTA AGT GAT GAG TTT AAG CAA TTG GTT CGT GAT TCA ATT AAA 25 Gln Leu 50 Ser Asp Asp Glu Phe 55 Lys Gln Leu Or Arg 60 Asp Ser Ile Lys GAC rprprp ACT GAA GAT CAA GCA CAA GCC GAA GCG TTT ATT GCG CAT TTT Aso 6 5 Phe Thr Glu Asp Gln 70 Lower Gln Lower Glu Area 75 Phe Ile Ala His Phe 80 TCT TAC CGT GCG CAC GAT GTC ACA GAT GCC GCT TCT TAT GGT ATC TTG Ser Tyr Arg Ala His 85 Asp Or Thr Asp Ala 90 Lower Ser Tyr Gly Ile 95 Leu AAG TCA GCG ATC GAA GAA GCA ACC AAA TTT GAC ATT GAT GGC A * T JS Lys Ser Ala Ile 100 Glu Glu Ala Lower Thr 105 Lys Phe Asp Ile Asp Gly 110 Asn CGT ATT TTC TAT ATG TCA GTT GCC CCT CGT TTC TTC GGT ACA ATC GCT Arg Ile Phe 115 Tyr Met Ser Or Lower 120 Pro Arg Phe Phe Gly 125 Thr Ile Ala -A A TAT TTG AAA TCA GAA GGT TTG CTA GGT ACT GGC TAC AAT CGT Lys Tyr 130 Leu Lys Ser Glu Gly 135 Leu Leu Ala Glu Thr Gly 140 Tyr Asn Arg TTG ATG GTA AAG CCT TTT GGT ACA TCA TAC GCC ACC GCA GAA GAA J5 Leu 145 Met Glu Lys Pro 150 Phe Gly Thr Ser Tyr 155 Field Thr Ala Glu Glu 160 TTG CAA AGT GAT GAA AAT GCA TTT GAT GAC CAA CTG TTC CGT Leu Gln Ser Asp Leu 165 Glu Asn Ala Phe Asp 170 Asp Asp Gln Leu Phe 175 Arg 5 3 9 55 LV 10499 ATT GAC CAC TAT CTT GGA AAA GAA ATT GAT CAA ATT GCA GCA TTA 693 Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Is Gln Asn Ile Ala Ala Leu 190 CGT TTT GGT AAC CCA ATC TTT GAT GCC GCT TGG AAT AAG GAC TAT ATC 746 Arg Phe Glv Asn Pro Ile Phe Asp Field Lower Trp Asn Lys Asp Tyr Ile 195 200 205 AAA AAC GTA C AA GTA ACT TTG GCT GAA GTT CTA GGT GTT GAA GAG CGT 794 Lys Asn Or Gln Or Thr Leu Ala Glu Or Leu Gly Or Glu Glu Arg 210 215 220 GCT GCT TAC TAC GAT ACC ACT GGC GCC CTT TTG GAT ATG ATT CAA AAC 842 Ala Gly Tyr Tyr Asp Thr Thr Gly Ala Leu Leu Asp Met Ile Gln Asn 225 230 235 240 CAC ACA ATG CAA ATT GTT GGT TGG TTA GCA ATG GAA AAA CCT GAA TCA 890 His Thr Met Gln Ile Is Gly Trp Leu Lower Met Glu Lys Pro Glu Ser 245 250 255 TTC AAT GAT AAG GAT ATC CGT GCA GCT AAA AAC GCC GCC TTC AAT GCA 933 Phe Asn Asp Lys Asp Ile Arg Lower Lys Asn Lower Field Phe Asn Area 260 265 270 TTA AAG ATT TAT AAC GAA GAA GAA GTG AAT AAG TAC TTC GTT CGT GCA 935 Leu Lys Ile Tyr Asn Glu Glu Glu Or Asn Lys Tyr Phe Or Arg Area 275 280 285 CAA TAT GGT GCT GAT GAT ACA GCT GAT TAC AAG CCA TAT TTG GAA GAA 1034 Gln Tyr Gly Ala Gly Asp Thr Ala Asp Tyr Lys Pro Tyr Leu Glu Glu 290 295 300 GCA GAT CCT GCT GAC TCA AAG AAC AAC ACA TTC AT T GCT GGT GAA 1082 Lower Asp Or Pro Field Asp Ser Lys Asn Asn Thr Phe Ile Field Gly Glu 305 310 315 320 TTG CAG TTC GAT TTG CCA TGG TGG GGT GTT CCT TTC TAT GTT CGT 1130 Leu Gln Phe Asp Leu Pro Arg Trp Glu Gly Or Pro Phe Tyr Or Arg 325 330 335 TCA GGT AAG CGT TTG GCT GCC AAG CAA ACA CGT GTT ATT GTA TTT 1178 Ser Gly Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gln Thr Arg Or Asp Ile Or Phe 340 345 350 AAG GCT GGC ACA TTC AAC TTT GGT TCA GAA CAA GAA GCA CAA GAA TCA 1225 Lys Lower Gly Thr Phe Asn Phe Gly Ser Glu Gln Glu Lower Gln Glu Ser 355 360 365 GTA CTC TCA ATC ATC ATT GAT CCA AAG GGT GCT ATT GAA TTG AAG CTT 1274 Or Leu Ser Ile Ile Asp Pro Lys Gly Lower Ile Glu Leu Ly s Leu 370 375 380 AAC GCT AAG TCA GTT GAA GTC TAC AAC ACC CGC ACA ATC AAC TTG 1322 Asn Lys Ser Or Glu Asp Ala Phe Asn Thr Arg Thr Ile Asn Leu 385 390 395 400 10 GAT TGG GCA GTA GAT GAA GAC A G AAG AAC ACA CCA GAA CCA TAC Asd Trp Field Is Ser 405 Asp Glu Asp Lys Lys 410 Asn Thr Pro Glu Pro 415 Tvr GAA CGT ATG ATT CAC GAT ACA ATG GAT GGT GLA TCA AAC TTT GCT Glu Arg Met Ile 420 His Asp Thr Met Asn 425 Gly Asp Gly Ser Asn 430 Phe Ala GAT TGG AAC GGT GTA TCA ATT GCT TGG AAG TTT GTT GAC ATT ACT Asd Trp Asn 435 Gly Or Ser Ile 440 Trp Lys Phe Or Asd 445 Ala Ile Thr GCC GTT TAC GAT GCA GAT AAA GCA CCA TTG GAG ACA TAT AAG TCA GGT Field Or 450 Tyr Asp Area Asp Lys 455 Lower Pro Leu Glu Thr 460 Tyr Lys Ser Glv TCA ATG GGT CCT GAA GCA TCA GAC ATA CTA TTS GCT GAA AAT GGC GAT Ser 465 Met Gly Pro Glu Ala 470 Ser Asp Lys Leu Leu 475 Ala Glu Asn Gly Asd 480 GCT TGG GTA TTT AAA GGA TAAGCACATT TAAAAAGACC ATCAAACAAA Cave Trp Is Phe Lys Gly 485

TCTTTGTTTG ACGGTCTTTT TATATTGTCT GATTTAAGAT GCGTTTGGTT TCACGGAAAA CGGC TGACAA ATTGGTGTAT TGATCC SEQ ID NO: 2 Nucleotidsequenz SEQUENZLANGE: 72 Basenin STRANGFORM: Einzelstrang

RTTTTGAACC ATTTCTTTWC CTAAATATG ATCAATWCKA TATCATCAAA AGCGTTTTCA AA 1370 1413 14 66 1514 1562 1610 1670 1696 60 72

Claims (20)

Invention Tormula 1. 'Glucose 6-phosphate dehydrogenase, characterized in that it contains the sequence of amino acids as set forth in SEQ ID NO: 1. A DNA characterized in that it comprises an area encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase after. And having the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 1 or corresponding to said sequence within the degeneration of the genetic code. 3. A recombinant vector according to claim 1, characterized in that it contains one or more copies of the DNA described in paragraph 2. 4. A recombinant vector according to claim 3, characterized in that it is a prokaryotic vector. 5. A recombinant vector according to claim 4, characterized by. that it contains a replication initiation region that is active in E. coli. 6. The recombinant vector of any one of claims 3 to 5. characterized in that the nucleic acid sequence encoding the glucose 6-phosphate dehydrogenase contained therein is located in the bacterium E. coli under the control of the active Leuconosloc promoter sequence. 7. A recombinant vector according to claim 6, wherein the promoter is a native promoter of a glucose 6-phosphate dehydrogenase gene and comprises a nucleic acid sequence of the first 122 of SEQ ID NO: 1, or a sequence derived therefrom with promoter properties; fragment of this area with promoter properties. 8. Plasma pUC-G6P-DH 1.8. 9. A DNA, which is a native promoter of a glucose 6-phosphate dehydrogenase gene and contains a nucleic acid sequence of the first 122 of SEQ ID NO: 1, or a sequence thereof with promoter properties, or a fragment of that region with promoter properties. . A microorganism, characterized in that it is transformed by DNA according to item 2 or by recombinant vector according to any one of claims 3 to 8. points. 11. The microorganism of claim 10, which is a Gram-negative bacterium. 12. The microorganism of claim 11, wherein said bacterium is E. coli. A method for obtaining DNA after 2, characterized in that: 1) the DNA is isolated and cleaved by a suitable restriction enzyme from Leuconosloc dextranicus (DSM 20187); 2) cleaved Leuconostoc dextranicus DNA is incorporated into the vector, transforming the appropriate host organism with this vector, thereby obtaining a gene bank; 3) the gene bank obtained after (2) is tested by a nucleotide probe containing a specific sequence of the glucose 6-phosphate dehydrogenase gene; 4) Analyze with a probe (3) a positively reacted gene bank clone. 14. A method according to claim 13, wherein the probe comprises a nucleotide number of from 50 to 80. 15. A method according to claim 13 or 14, wherein the host organism is E. coli. A method for the preparation of a protein as defined in claim 1, characterized in that: 1) the DNA as described in claim 2 or any of claims 3 to 8; transforms the appropriate host organism with the help of the vector described in points 1.1.3 to 5.8. 2) the transformed organism is cultivated in a suitable environment; 3) isolates the protein from the environment and cells. 17. The method of claim 16, wherein the prokaryotic host organism is used. 18. The method of claim 17, wherein the host organism is E. coli. A method for the enzymatic determination of glucose 6-phosphate in a solution of a solution with glucose 6-phosphate dehydrogenase, characterized in that it uses glucose 6-phosphate dehydrogenase described in paragraph 1. A reagent for enzymatic determination of glucose 6-phosphate in a solution of a solution with glucose 6-phosphate dehydrogenase, characterized in that recombinant glucose 6-phosphate dehydrogenase is used according to claim 1.