LU86736A1 - LIPOSOMES SENSITIZED TO ANTIGENIC MOLECULES OF INTRACELLULAR PARASITES, METHOD FOR THEIR PREPARATIONS AND THEIR APPLICATIONS AS DIAGNOSTIC MEANS AND AS IMMUNIZING AGENTS - Google Patents
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Description
' *._·— /"*· , BL-3984/vdw'* ._ · - / "* ·, BL-3984 / vdw
‘ I V. GRAND-DUCHE DE LUXEMBOURG‘I V. GRAND DUCHY OF LUXEMBOURG
* · : ' V'* ·: 'V'
Brevet N .............................................................. Monsieur le Ministre du 15janvier 1987 de l’Économie et des Classes Moyennes _ 3¾¾ Service de la Propriété IntellectuellePatent N ................................................ .............. Mr. Minister of January 15, 1987 of the Economy and the Middle Classes _ 3¾¾ Intellectual Property Service
Titre délivré -.................—— | gg| LuxembourgTitle issued -.................—— | gg | Luxembourg
Demande de Brevet d’invention -!— -----------------( « I. RequêtePatent Application -! - ----------------- ("I. Application
Université Libre de Brmce 1 1 pg, 50 «y. F.P, Rnncoyalt_ ( 2) . B - 1050 Bruxelles_____________ ing.cons. en propr lnd., 46 rue du Cimetière, Luxembourg_ (¾) agissant en qualité de mandataires _ déposant) ce 5^.1^^^^BylggLj^il--Aeuf-genfc^,guatr£^yliigt-sept- ( 4) à 15 ?_Ρ 0 heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1.1a présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: "Liposomes sensibilisés â des molécules antigèniques de { 5) parasites intracellulaires » procédé pour les préparations et leurs applications comme moyens de diagnostic et comme agents .......d'immunisation "________ 2. la description en langue ........française_______ de l’invention en trois exemplaires; 3..........................//........-............ .........planches de dessin, en trois exemplaires;· 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le _15rlrl5_82-; 5. la délégation de pouvoir, datée de__________________________________________ le--- 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclareÇnt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeurs) est (sont): ( 6) - ......Mons leur Frana LEGROS,313 chaussé£ ..de...^.QQndaie.l___ ________________________B - 1050 Bruxelles__________ - Monsieur......Jean-Marie .RUYSSCHAE.RT.f.-_.7..-.av........da.....Perce-Neige_— .................................................^__ B - 1640 Rhode-Saint-Genese_:____ revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (7) .................................................//-------------------:------------ ____déposée(s) en (8)_______ le (9)......................... [J------------------ sous le N° (10) .... —LL___________________-____ au nom de (11)__ ______IL__________ élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, a désigné, pour son mandataire, à Luxembourg---—....Free University of Brmce 1 1 pg, 50 "y. F.P, Rnncoyalt_ (2). B - 1050 Brussels_____________ ing.cons. en propr lnd., 46 rue du Cimetière, Luxembourg_ (¾) acting as agents _ depositor) this 5 ^ .1 ^^^^ BylggLj ^ il - Aeuf-genfc ^, guatr £ ^ yliigt-sept- (4 ) at 15? _Ρ 0 hours, at the Ministry of the Economy and the Middle Classes, in Luxembourg: 1.1a this request for obtaining a patent of invention concerning: "Liposomes sensitized to antigenic molecules of {5) intracellular parasites "process for the preparations and their applications as means of diagnosis and as agents ....... of immunization" ________ 2. the description in language ........ French _______ of the invention in three copies; 3 .......................... // ........-............ ......... drawing boards, in triplicate; · 4. the receipt of the taxes paid to the Luxembourg Registration Office, _15rlrl5_82-; 5. the delegation of power, dated__________________________________________ on --- 6. the successor document (authorization); declaring), assuming responsibility for this declaration, that the inventor (s) is (are): (6) - ...... Mons leur Frana LEGROS, 313 Chaussée £ ..de ... ^. QQndaie .l ___ ________________________B - 1050 Bruxelles__________ - Monsieur ...... Jean-Marie .RUYSSCHAE.RT.f.-_. 7 ..-. av ........ da ..... Perce-Neige_ - ................................................. ^ __ B - 1640 Rhode-Saint-Genese _: ____ claims (nt) for the above patent application the priority of one (s) application (s) of (7) ............ ..................................... // ----------- --------: ------------ ____ filed in (8) _______ on (9) ................ ......... [J ------------------ under N ° (10) .... —LL ___________________-____ in the name of (11) __ ______IL__________ elect (elect) domicile for him / her and, appointed, for his / her proxy, in Luxembourg ---—....
46......rue......du Cimetière _______________' _ (12) sollicitefnt) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à___________mois. (13) l mandataire: ^^7-, ------ A·4) MEYERS^Ernest ' Π. Procès-verbal de Dépôt46 ...... rue ...... du Cimetière _______________ '_ (12) is requesting the issue of a patent for the invention for the subject described and represented in the abovementioned appendices, with postponement of this issue a month. (13) the agent: ^^ 7-, ------ A · 4) MEYERS ^ Ernest 'Π. Deposit Minutes
La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Intellectuelle%L^xembourg, en date du: 15 janvier 1987 (T W \ Pr. le Ministre de l’Economie et des Classes Moyennes, V.. Vu V, V. ψ I . p. d.The above application for a patent for invention has been filed with the Ministry of the Economy and the Middle Classes, Intellectual Property Service% L ^ xembourg, dated: January 15, 1987 (TW \ Pr. The Minister of the Economy and the Middle Classes, V .. Vu V, V. ψ I. pd
I;, ' - jg f Le chef du service de la propriété intellectuelle, A 68007_X"4 ι·.Ι."„νγ ^__ - . . i EXPLICATIONS RELATIVES AU FORMULÂÏR&DEJ300T.I ;, '- jg f The head of the intellectual property department, A 68007_X "4 ι · .Ι." „Νγ ^ __ -. . i EXPLANATIONS RELATING TO THE FORM & DEJ300T.
I (1 ) s'il y a lieu "Demande de certificat d’addition au brevet piâripal, à la demande de brevet principal No............du ........”-(2) inscrire les nom. prénom, profession.I (1) if applicable "Request for certificate of addition to the patent, on main patent application No ............ of ........” - (2) enter the last name, first name, profession.
j adresse du demandeur, lorsque celui-ci est un particulier ou les dénomination sociale, forme juridique, adresse du siège social, lorsque le demandeur est une personne morale -13) inscrirej address of the applicant, when the applicant is an individual or company name, legal form, address of head office, when the applicant is a legal person -13) enter
Irxnnm. nrénnm. adresse du mandataire agréé, conseil en nronti&é industrielle, muni d’un DOuvotrsnédaL s’il va lien: "remésenténar____________ agissant clonalité de mandataire" ! , BL-3984/vdwIrxnnm. nrénnm. address of professional representative, industrial frontier consultant, with a DOuvotrsnédaL if he goes link: "remresenténar ____________ acting clonality of representative"! , BL-3984 / vdw
MEMOIRE DESCRIPTIF déposé à 11 appui d1 une DEMANDE DE BREVET D'INVENTIONDESCRIPTIVE MEMORY filed in support of a PATENT INVENTION APPLICATION
au Luxembourgin Luxembourg
- LIPOSOMES SENSIBILISÉS Â DES MOLÉCULES ANTIGÈNIQUES DE PARASITES INTRACELLULAIRES, PROCÉDÉ POUR LES PRÉPARATIONS ET LEURS APPLICATIONS COMME MOYENS DE DIAGNOSTIC ET COMME AGENTS D'IMMUNISATION- LIPOSOMES SENSITIZED TO ANTIGENIC MOLECULES OF INTRACELLULAR PARASITES, PROCESS FOR THE PREPARATIONS AND THEIR APPLICATIONS AS DIAGNOSTIC MEANS AND AS IMMUNIZING AGENTS
Université Libre de Bruxelles 50 av. F.D. Roosevelt B - 1050 Bruxelles 05 10 Objet de l'inventionFree University of Brussels 50 av. F.D. Roosevelt B - 1050 Bruxelles 05 10 Subject of the invention
La présente invention repose sur la sensibilisation des liposomes à des molécules antigéniques de parasites intracellulaires et ouvre de ce fait des applica-15 tions nouvelles de tels liposomes sensibilisés, comme moyens de détection d'Xg (lytiques ou non lytiques) contre ces antigènes infectieux dans des sera où· autres liquides organiques (pleuraux, péritonéaux,,de lavage bronchoalvéolaire) et comme agents de vaccination capables 20 de susciter une immunité (cellulaire, mais aussi humorale) contre l'agent infectant.The present invention is based on the sensitization of liposomes to antigenic molecules of intracellular parasites and therefore opens new applications of such sensitized liposomes, as means of detection of Xg (lytic or non-lytic) against these infectious antigens in sera where · other body fluids (pleural, peritoneal, bronchoalveolar lavage) and as vaccination agents capable of eliciting immunity (cellular, but also humoral) against the infecting agent.
À titre d'application particulière illustrée par la présente invention, on vise plus spécifiquement à fournir des moyens de diagnostic et d'immunisation pour 25 la tuberculose mais l'invention n'est bien entendu pas limitée à cette application, ainsi qu'il apparaîtra ci-après .As a particular application illustrated by the present invention, the aim is more specifically to provide means of diagnosis and immunization for tuberculosis, but the invention is of course not limited to this application, as will appear. below.
Résumé de l'état de la technique 30 --------------------------------Summary of the state of the art 30 --------------------------------
De nombreux travaux ont été consacrés aux liposomes pour diverses applications pharmacologiques, notamment comme vecteurs de substances à activité médicamenteuse .Numerous studies have been devoted to liposomes for various pharmacological applications, in particular as vectors of substances with medicinal activity.
35 Des molécules antigéniques, naturelles ou hapté niques, ont également été exposées à la surface de liposomes. Ces liposomes dits sensibilisés ont été utilisés soit pour la détection d'immunoglobulines dans les sera Λ 2 d'animaux immunités soit comme adjuvants d'immunité susceptibles d'augmenter l'immunisation humorale, mais aussi cellulaire..Antigenic molecules, natural or haptic, have also been exposed on the surface of liposomes. These so-called sensitized liposomes have been used either for the detection of immunoglobulins in the sera Λ 2 of immunized animals or as immunity adjuvants capable of increasing humoral but also cellular immunization.
Pour ce qui concerne la tuberculose, il existe 05 des extraits protéiques purifiés de différentes Mycobacteria et plus particulièrement de Mycobacterium tuberculoses var. hominis (H37Rv) = PPD H37Rv = Tuberculine H37Rv Les tuberculines sont capables de révéler une immunité cellulaire préexistante chez un homme ou un ani-10 mal vacciné ou infecté (Intradermoréaction ou réaction d'hypersensibilité retardée), mais elle est incapable d'immuniser car elle n'est pas immunogène.With regard to tuberculosis, there are 05 purified protein extracts from different Mycobacteria and more particularly from Mycobacterium tuberculoses var. hominis (H37Rv) = PPD H37Rv = Tuberculin H37Rv Tuberculins are capable of revealing preexisting cellular immunity in a man or an ani-10 poorly vaccinated or infected (intradermoreaction or delayed hypersensitivity reaction), but it is unable to immunize because it is not immunogenic.
Elements caractéristiques de 1'invention 15 --------------;-------------------------- L'invention porte spécifiquement à titre d'agents nouveaux pouvant servir aux fins précitées (immunoessai et vaccination) sur des liposomes sensibilisés à des molécules antigèniques spécifiques de parasites intracel-20 lulaires.Characteristic elements of the invention 15 --------------; -------------------------- The The invention relates specifically as new agents which can be used for the abovementioned purposes (immunoassay and vaccination) on liposomes sensitized to antigenic molecules specific for intracellular parasites.
Ces liposomes sont de préférence du type dit "multilamellaires" (MLV) avec ou sans cholestérol.These liposomes are preferably of the so-called "multilamellar" (MLV) type with or without cholesterol.
On accorde la préférence, selon l'invention, généralement à des liposomes multilamellaires avec choles-25 térol présentant des rapports Egg Pc/Ch compris entre 4/1 et 4/4, ce dernier rapport ou des valeurs proches de celui-ci étant tout particulièrement préférés.Preference is given, according to the invention, generally to multilamellar liposomes with choles-25erol having Egg Pc / Ch ratios between 4/1 and 4/4, the latter ratio or values close to it being entirely particularly preferred.
L'invention porte également sur des procédés de production de liposomes sensibilisés.Also provided are methods of producing sensitized liposomes.
30 Deux variantes opératoires s'offrent à cet effet:30 Two operating variants are available for this purpose:
Il est possible de procéder à une encapsulation directe de molécules antigéniques ou de mettre en contact le liposome préformé avec ces molécules.It is possible to carry out a direct encapsulation of antigenic molecules or to bring the preformed liposome into contact with these molecules.
Les deux types de liposomes sensibilisés sont ca-35 pables de fixer des immunoglobulines dressées contre les molécules antigéniques.Both types of sensitized liposomes are able to bind immunoglobulins raised against antigenic molecules.
On observe généralement dans le premier cas que plus d'immunoglobulines sont liées aux liposomes tandis 3 que les protéines., incorporées par exposition à des vésicules préformêes présentent une affinité plus élevée pour les anticorps correspondants. Il en résulte que le type de sensibilisation des liposomes à un mélange d'im-05 munoglobulines correspond à des quantités variables de molécules antigéniques choisies et exposées à la surface des liposomes et à des différences dans l'exposition et l'affinité de ces antigènes.It is generally observed in the first case that more immunoglobulins are linked to the liposomes while the proteins 3, incorporated by exposure to preformed vesicles have a higher affinity for the corresponding antibodies. As a result, the type of sensitization of the liposomes to a mixture of im-05 munoglobulins corresponds to variable quantities of selected antigenic molecules exposed to the surface of the liposomes and to differences in the exposure and the affinity of these antigens. .
L'administration répétée, sous-cutanée ou intra-10 péritonéale, des deux types de liposomes suscite l'apparition d'une réaction d'hypersensibilité retardée, témoin d'une immunité de type cellulaire, chez le cobaye.The repeated subcutaneous or intraperitoneal administration of the two types of liposomes gives rise to the appearance of a delayed hypersensitivity reaction, witness to cell type immunity, in the guinea pig.
La liste des applications spécifiques relevant de l'invention figure ci-après dans le mémoire descriptif. 15The list of specific applications pertaining to the invention appears below in the description. 15
Description détaillée de mode opératoire en référence à l'application particulière du Mycobacterium tuberculosis Méthode de sensibilisation des liposomes 20 1. Formation des liposomesDetailed description of procedure with reference to the particular application of Mycobacterium tuberculosis Method for sensitizing liposomes 20 1. Formation of liposomes
Concentration totale des lipides ï 10 ou 20 mg/ml. Rapports molaires 1) Egg Pc (ou Egg Pc = 4/Ch = 0) 2) Egg Pc/Ch 4 ; 1 25 4 s 2 4 ; 3 4 : 4Total lipid concentration at 10 or 20 mg / ml. Molar ratios 1) Egg Pc (or Egg Pc = 4 / Ch = 0) 2) Egg Pc / Ch 4; 1 25 4 s 2 4; 3 4: 4
Formation des MLV dans NaCl 0,15 M (= Eau physiologique) stérile avec ou sans PPD.MLV formation in sterile 0.15 M NaCl (= physiological water) with or without PPD.
30 Deux méthodes de sensibilisation sont réalisées s a. Encapsulation directe de la PPD dans les liposomes. Les liposomes sont formés dans une solution de PPD à 0,75 mg/ml de NaCl 150 mM.30 Two awareness-raising methods are used s a. Direct encapsulation of PPD in liposomes. The liposomes are formed in a PPD solution at 0.75 mg / ml of 150 mM NaCl.
La préparation est laissée au repos pendant 30 35 min. à température ambiante.The preparation is left to stand for 30 35 min. at room temperature.
Puis, 5 rinçages dans NaCl 150 mM.Then, 5 rinses in 150 mM NaCl.
b. Mise en contact de liposomes préformês avec la PPD. Les MLV sont formés dans le NaCl 150 mM, 4 laides au,'*repos pendant 30 min., centrifugés à 3500 g pendant 10 min., mis en contact pendant 30 min avec une solution de PPD à 0,75 mg/ml de NaCl 150 mM et rincés 5 fois dans le même solvant.b. Contact of preformed liposomes with PPD. The MLVs are formed in 150 mM NaCl, 4 ug. Laids at rest for 30 min., Centrifuged at 3500 g for 10 min., Brought into contact for 30 min with a PPD solution at 0.75 mg / ml of 150 mM NaCl and rinsed 5 times in the same solvent.
05 2. Radioimmunoessais utilisant des liposomes sensibilisés05 2. Radioimmunoassays using sensitized liposomes
Des liposomes de différentes compositions et sensibilisés selon les deux méthodes sont exposés à un an-10 tiserum de mouton dressé contre H37Rv, radioiodé et non marqué. La préparation et la radioiodation de cet an-tiserum, est décrite dans la demande de brevet de la Demanderesse déposée ce même jour pour s "Procédé de détection rapide d'infections a germes intracellulaires, 15 en particulier de Mycobacterium tuberculosis ou de Mycobacterium leprae et trousse convenant à cet effet”.Liposomes of different compositions and sensitized according to the two methods are exposed to a 10-year-old sheep tiserum raised against H37Rv, radioiodinated and unlabeled. The preparation and radioiodination of this an-tiserum is described in the Applicant's patent application filed the same day for s "Method for rapid detection of infections with intracellular germs, in particular Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium leprae and kit suitable for this purpose ”.
Des courbes de compétition sont obtenues entre une quantité d'antisérüm 125χ et différentes dilutions de l'antisérum non marqué (de 1/10 à 1/10 000). La proportion de 20 molécules radioiodêes fixées aux. liposomes-PPD et la constante de dissociation des molécules sont mesurées.Competition curves are obtained between a quantity of 125χ antiserum and different dilutions of the unlabeled antiserum (from 1/10 to 1/10 000). The proportion of 20 radioiodic molecules attached to. liposomes-PPD and the dissociation constant of the molecules are measured.
La composition liposomiale qui fixe le plus grand nombre de molécules radioiodêes avec la plus grande affinité semble être Egg Pc/Ch 4 ; 4 avec encapsulation directe 25 de la PPD.The liposomal composition which fixes the greatest number of radioiodine molecules with the greatest affinity seems to be Egg Pc / Ch 4; 4 with direct encapsulation 25 of PPD.
5. Radioimmunoessais sur sera humains.5. Radioimmunoassays on sera humans.
Des compétitions ont été effectuées entre l'antiserum de mouton radioiodé et différentes dilutions de sera humains (1/10 à 1/10 000), Aucune competi-30 tion n'est observée pour les sera de patients non-tuberculeux. Par contre, 6 sera de patients tuberculeux contenaient des Ig entrant en compétition avec l'antiserum- I. La présence d'Ig dans les sera de ces patients a été confirmée par test ELISA. Idem pour l'absence d'Ig dans les sera des patients non-tuberculeux. Liposomes utilisés dans cette étudejEgg Pc/Ch 4:3; encap-Competitions were carried out between the radioiodinated sheep antiserum and different dilutions of human sera (1/10 to 1/10 000). No competition was observed for sera from non-tuberculosis patients. In contrast, 6 sera from tuberculosis patients contained Ig competing with antiserum-I. The presence of Ig in the sera of these patients was confirmed by ELISA test. Ditto for the absence of Ig in sera from non-tuberculosis patients. Liposomes used in this study: Egg Pc / Ch 4: 3; encap-
VV
35 sulation directe de la PPD ou exposition de la PPD à des liposomes prëformes. Ce radioimmunoessai détecte des Ig dans les sera de patients tuberculeux, mais ne renseigne pas·sur la nature de ces Ig.Direct sulation of PPD or exposure of PPD to preformed liposomes. This radioimmunoassay detects Ig in the sera of tuberculosis patients, but does not provide information on the nature of these Ig.
5 ·* 4. Mise au point d’un immunoessai avec marqueur fluorescent « Essai de Lyse Immune des Liposomes.5 · * 4. Development of an immunoassay with fluorescent marker "Liposome Lysis Immune Test.
Un marqueur fluorescent, la calcéine, a été incorporé dans les liposomes Egg Pc/Ch (4 ; 3) sensibilisés à la PPD par encapsulation directe. Tant qu'il 05 est encapsulé, donc "quenché", ce marqueur ne fluoresce pas. Si le liposome est lysé, le marqueur est libéré dans le milieu d'incubation et une fluorescence proportionnelle à l'importance de la lyse liposomiale peut être mesurée.A fluorescent marker, calcein, was incorporated into the Egg Pc / Ch (4; 3) liposomes sensitized to PPD by direct encapsulation. As long as it is encapsulated, therefore "quenché", this marker does not fluoresce. If the liposome is lysed, the marker is released into the incubation medium and a fluorescence proportional to the extent of the liposomal lysis can be measured.
La lyse des liposomes a lieu si des IgG lytiques sont venues se fixer aux »· * antigènes'exposés par les vésicules (ici, des antigènes extraits de la PPD) en ·> 1 .The lysis of the liposomes takes place if lytic IgGs have come to bind to the "· * antigens'exposed by the vesicles (here, antigens extracted from the PPD) in ·> 1.
10 présence de complément. Qualitativement, cet immunoessai est le seul actuelle ment à détecter des Ig lytiques.10 presence of complement. Qualitatively, this immunoassay is the only one currently detecting lytic Ig.
Les faux positifs sont exclus puisque la lyse liposomiale n'a lieu que si lesFalse positives are excluded since liposomal lysis only takes place if the
Ig se sont fixées aux antigènes exposés par les vésicules. En outre, si le ra- / · immunoessai cité en 3 ) nécessite 20 mg de lipides par point de compétition, l'essai de lyse immune avec la calcéine ne nécessite que 0,1 mg pour la même mesure.Ig have attached to the antigens exposed by the vesicles. In addition, if the immunoassay mentioned in 3) requires 20 mg of lipids per competition point, the immune lysis test with calcein requires only 0.1 mg for the same measurement.
_ Des liposomes constitués d'Egg PC et Ch__(4 ; 3), renfermant de 20 la calcéine et sensibilisés à la PPD selon les deux méthodes indiquées plus haut (encapsulation et mise en contact), ont présenté une lyse immune (libération de calcéine et apparition d’une fluorescence mesurable dans le milieu) en présence de sérum de lapine anti-BCG (Dakopatts) ou de sérum de mouton 25 anti Mycobacterium tuberculosis et de complément provenant de sérum de lapin. Cette réaction n'a pas été observée en présence d’un sérum connu comme ne présentant pas d'anticorps an.timycobactérien® nl en l'absence de complément._ Liposomes made up of Egg PC and Ch __ (4; 3), containing calcein and sensitized to PPD according to the two methods indicated above (encapsulation and contacting), presented an immune lysis (calcein release and appearance of measurable fluorescence in the medium) in the presence of anti-BCG rabbit serum (Dakopatts) or anti Mycobacterium tuberculosis sheep serum and complement from rabbit serum. This reaction was not observed in the presence of a serum known to have no an.timycobactérien® nl antibody in the absence of complement.
Ces mêmes liposomes sensibilisés à la PPD ont été 30 mis en contact avec des sera humains de patients tuber culeux et non-tuberculeux intradermo-nêgatifs. Les lyses mesurées (L.S.) après 30 minutes ont été comparées à celles trouvées pour des liposomes non sensibilisés à la PPD ni à aucun autre antigène protéique (LNS). Pour cha-35 que sérum, la différence entre les pourcentages L.S. et LNS a été calculée (LILA). Les résultats obtenus sont repris dans le tableau suivant.These same PPD-sensitized liposomes were contacted with human sera from intradermal-negative tuberculosis and non-tuberculosis patients. The lyses measured (L.S.) after 30 minutes were compared with those found for liposomes not sensitized to PPD or to any other protein antigen (LNS). For each serum, the difference between the L.S. and LNS percentages was calculated (LILA). The results obtained are shown in the following table.
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Patients tuberculeux Patients non-tuberculeuxTuberculosis patients Non-tuberculosis patients
LS LNS LILA LS LNS LILALS LNS LILA LS LNS LILA
1 23,7 12,4 11,1 11 11 6,8 4,2 2 31 7 24 12 3,8 3,7 0,1 3 31 13 18 13 12,4 5,2 7,2 4 20 9,5 10,5 14 11 3,6 7,4 5 14,7 10,6 4,1 15 7,7 2,6 5,1 6 39 14 25 16 3,8 1,3 2,5 7 57 15,6 41,4 17 3 2 1 8 32 8 24 18 4,6 2,9 1,5 9 25 12 13 19 6 1 5 10 31 15,8 15,3 20 3 1 2 M 30,4 11,8 18,7 6,6 3 3,6 ±SD ±11 ±2,8 ±10 ±3,5 ±1,8 ±2,41 23.7 12.4 11.1 11 11 6.8 4.2 2 31 7 24 12 3.8 3.7 0.1 3 31 13 18 13 12.4 5.2 7.2 4 20 9, 5 10.5 14 11 3.6 7.4 5 14.7 10.6 4.1 15 7.7 2.6 5.1 6 39 14 25 16 3.8 1.3 2.5 7 57 15, 6 41.4 17 3 2 1 8 32 8 24 18 4.6 2.9 1.5 9 25 12 13 19 6 1 5 10 31 15.8 15.3 20 3 1 2 M 30.4 11.8 18 .7 6.6 3 3.6 ± SD ± 11 ± 2.8 ± 10 ± 3.5 ± 1.8 ± 2.4
S S NS NSS S NS NS
~T~ l ï S = statistiquement significatif selon le test de student NS = statistiquement non significatif selon le test de student 7~ T ~ l ï S = statistically significant according to the student test NS = statistically not significant according to the student test 7
VV
ll
De ces résultats, il ressort que la lyse immune des liposomes porteurs de PPD est significativement plus élevée dans les sera de tuberculeux que dans les sera de non-tuberculeux. De même, la lyse des liposomes non por-05 teurs de PPD est plus grande dans les sera tuberculeux, bien que significativement inférieure à celle des liposomes PPD. Le sérum des patients tuberculeux contient donc des anticorps dirigés contre les composants de la PPD, mais aussi des agents susceptibles de provoquer une 10 lyse de liposomes mais PPD plus grande que chez les non- -tuberculeux. ;On peut donc affirmer que, par la présente invention on a élaboré un test de lyse immune de liposomes sansibilisês à la PPD capable de mettre en évidence . des anticorps antiseracobactériens dans le sérum de pa-15 tients tuberculeux. On peut noter également la rapidité de ce test (30 minutes).From these results, it appears that the immune lysis of liposomes carrying PPD is significantly higher in sera from tuberculosis patients than in sera from non-tuberculosis patients. Likewise, the lysis of liposomes non-carriers of PPD is greater in sera from tuberculosis, although significantly lower than that of liposomes PPD. The serum of tuberculosis patients therefore contains antibodies directed against the components of PPD, but also agents capable of causing a lysis of liposomes but PPD greater than in non-tuberculosis patients. It can therefore be affirmed that, by the present invention, a test for immune lysis of liposomes sansibilisés à la PPD was able to demonstrate. antiseracobacterial antibodies in the serum of tuberculosis patients. We can also note the speed of this test (30 minutes).
Ce test permet de diagnostiquer toutes les maladies infectieuses par mise en évidence d'anticorps sériques au moyen de liposomes porteurs d'antigènes du mi-20 croorganisme infectant.This test makes it possible to diagnose all infectious diseases by demonstrating serum antibodies by means of liposomes carrying antigens of the infecting mi-20 organism.
8 05 5. Test d'immunoréactivité des liposomes in vivo»8 05 5. In vivo liposome immunoreactivity test ”
On sait que les liposomes sensibilisés par des antigènes sont susceptibles de jouer un rôle dans les mécanismes cellulaires de l'immunité in vivo, soit en imitant l'agent infectieux (bicouche de phospholipide porteuse de molécules immunogènes de cet agent) et en étant captés par les macrophages locaux 10 de l'hôte infecté, soit en imitant ces macrophages qui auraient "processé" l'agent infectieux et qui auraient exposé certaines de ses molécules antigèniques à leur surface. Dans les deux cas, les molécules antigéniques par lesquelles le liposome a été sensibilisé sont présentées aux lymphocytes, reconnues par des récepteurs et les mécanismes d'immunité cellulaire et humorale 15 peuvent être stimulés. A ce titre, le liposome sensibilisé peut constituer le véhicule d'un nouveau type de vaccination, car il représente un modèle quasi naturel de présentation de molécules antigéniques au système immunitaire, . Si cette hypothèse est correcte, le liposome-PPD doit pouvoir induire une réaction positive d'hypersensibilité retardée (intradermoréaction positive) 20 chez des animaux préalablement sensibilisés par le B.C.G,It is known that liposomes sensitized by antigens are capable of playing a role in the cellular mechanisms of immunity in vivo, either by imitating the infectious agent (bilayer of phospholipid carrying immunogenic molecules of this agent) and by being captured by the local macrophages of the infected host, either by imitating those macrophages which have "processed" the infectious agent and which have exposed some of its antigenic molecules on their surface. In both cases, the antigenic molecules by which the liposome has been sensitized are presented to the lymphocytes, recognized by receptors and the mechanisms of cellular and humoral immunity can be stimulated. As such, the sensitized liposome can constitute the vehicle for a new type of vaccination, because it represents an almost natural model of presentation of antigenic molecules to the immune system. If this hypothesis is correct, the liposome-PPD must be able to induce a positive reaction of delayed hypersensitivity (positive skin reaction) 20 in animals previously sensitized by the B.C.G,
On a donc injecté dans le derme des liposomes sensibilisés à la PPD (Egg Pc sensibilisés par encapsulation “directe de la PPD ou par préformation suivie de mise eh contact; Egg Pc/Ch, 4 3, sensibilisés selon les deux mêmes méthodes) à des cobayes immunisés. Les 4 types de liposomes provoquent une in-25 tradermoréaction dont l'intensité et l'évolution sont différentes de celles de la PPD non encapsulée (Voir à ce propos, le projet d'article "Immunological activity of. tuberculin sensitized liposomes", notamment p. 7 et Fig. 1 et 2, pour les liposomes Egg Pc). Par contre, les liposomes npn porteurs d'antigènes de PPD ne suscitent pas d!intradermoréaction positive chez les mêmes animaux 30 (Idem, Fig. 1).We therefore injected into the dermis liposomes sensitized to PPD (Egg Pc sensitized by “direct PPD encapsulation or by preformation followed by contacting; Egg Pc / Ch, 4 3, sensitized according to the same two methods) immune guinea pigs. The 4 types of liposomes cause an in-tradermoreaction whose intensity and evolution are different from those of non-encapsulated PPD (See in this regard, the draft article "Immunological activity of. Tuberculin sensitized liposomes", in particular p. 7 and Fig. 1 and 2, for the Egg Pc liposomes). In contrast, npn liposomes carrying PPD antigens do not elicit a positive intradermal reaction in the same animals (Idem, Fig. 1).
On peut conclure que les liposomes-PPD déposés dans le derme sont phagocytés par les macrophages et que les antigènes dont ces liposomes étaient por-It can be concluded that the liposomes-PPDs deposited in the dermis are phagocytosed by macrophages and that the antigens of which these liposomes were carrying
r Ir I
teurs sont ensuite présentés à et appellent des lymphocytes sensibilisés, suscitant ainsi l'apparition de l'érythème et de l’induration caractéristiques 35 de'l'intradermoréaction positive.They are then presented to and call up sensitized lymphocytes, thereby inducing the onset of the erythema and induration characteristic of positive intradermoreaction.
Cette conclusion permet donc l'utilisation du liposome comme véhicule de vaccination.This conclusion therefore allows the use of the liposome as a vehicle for vaccination.
s · * 9 rs · * 9 r
6. Apparition d'une immunité cellulaire chez le cobaye .sous l'effet de liposomes--PPD6. Appearance of cellular immunity in guinea pigs under the effect of liposomes - PPD
Des cobayes non infectés et non sensibilisés par la mycobactérie tuberculeuse (Intradermoréaction négative à la PPD) ont reçu 3 injections bihebdoma-, 05 daires de liposomes-PPD, soit sous la peau, soit dans la cavité péritonéale (liposomes Egg Pc en Egg Pc/Ch, 4:3, formés dans les deux conditions décrites plus haut, voir 1). Deux semaines après la dernière injection (ou 6 semaines après la première), une intradermoréaction a'été pratiquée, avec''de la PPD seule, avec des liposomes-PPD, ou avec des liposomes. Tout comme des co-1o bayes qui auraient préalablement été sensibilisés par la mycobactérie (vaccination au B.C.G., p. ex,), ces animaux présentent une intradermoréaction positive à la PPD ou aux liposomes-PPD, mais pas aux liposomes non porteurs de PPD. Ces expériences indiquent que les liposomes sensibilisés à la PPD induisent une défense de type immunité cellulaire chez les cobayes. Rappelons que · / 15 la PPD seule'estincapable de susciter la moindre apparition d'une immunité chez un animal (ou un homme) qui n'a pas été préalablement mis en contact avec la mycobactérie.Guinea pigs not infected and not sensitized by tuberculous mycobacteria (PPD negative skin reaction) received 3 biweekly injections, 05 of liposomes-PPD, either under the skin or in the peritoneal cavity (Egg Pc liposomes in Egg Pc / Ch, 4: 3, formed under the two conditions described above, see 1). Two weeks after the last injection (or 6 weeks after the first), an intradermoreaction was performed, with PPD alone, with liposomes-PPD, or with liposomes. Like co-1o bayes which would have been previously sensitized by the mycobacterium (vaccination with B.C.G., for example), these animals present a positive intradermal reaction to PPD or liposomes-PPD, but not to liposomes not carrying PPD. These experiments indicate that liposomes sensitized to PPD induce cell-like defense in guinea pigs. Recall that · / 15 PPD alone is incapable of eliciting the slightest appearance of immunity in an animal (or a man) which has not previously been brought into contact with the mycobacterium.
On peut donc estimer que le liposome-PPD constitue un agent de vaccination plus sûr que l'actuel vaccin B.C.6. où des mycobactéries 20 atténuées sont administrées, car le liposome-PPD ne comporte que des lipides (Egg Pc,Ch) et des protéines extraites de Mycobactéries, à l'exclusion de toute mycobactérie et de son matériel génétique.It can therefore be estimated that the liposome-PPD constitutes a safer vaccination agent than the current B.C.6 vaccine. where attenuated mycobacteria are administered, since the liposome-PPD contains only lipids (Egg Pc, Ch) and proteins extracted from Mycobacteria, to the exclusion of all mycobacteria and its genetic material.
La technique peut s'appliquer autant à la "Old Tuberculin", qui compte les protéines de la bactérie ainsi que ses polysaccharides et glycolipides 25 de surface dont le caractère d'immunogénicité générale et aspécifique est bien connu,qu'à des molécules antigèniques, spécifiques, de Mycobacterium tuberculosi: Un liposome sensibilisé à la "Old Tuberculin" imite donc au mieux la bi-couche phospholipidique de la membrane mycobactérienne portant les protéines, les polysaccharides et les lipides de cet agent infectieux intracellulaire. En 30 suscitant une réaction portant sur l'immunité cellulaire, on dispose ainsi dbn vaccin afficace contre le parasite intracellulaire qu'est Mycobacterium tuberculosis.The technique can be applied as much to the "Old Tuberculin", which counts the proteins of the bacteria as well as its surface polysaccharides and glycolipids, the character of which is general and aspecific immunogenicity, as well as to antigenic molecules, specific, of Mycobacterium tuberculosi: A liposome sensitized to the "Old Tuberculin" therefore imitates at best the phospholipid bilayer of the mycobacterial membrane carrying the proteins, polysaccharides and lipids of this intracellular infectious agent. By eliciting a reaction relating to cellular immunity, there is thus a display vaccine against the intracellular parasite that is Mycobacterium tuberculosis.
t D' aut;re part, on sait que le 35 Mycobacterium leprae (lèpre) est très semblable à M. tuberculosis. Il existe une lépromine, semblable dans sa composition à la Old Tuberculin. La formation de liposomes-lépromine convient comme moyen d'immunisation contre la lèpre, maladie pour laquelle il n'existe, à ce jour, aucun vaccin efficace,t On the other hand, it is known that 35 Mycobacterium leprae (leprosy) is very similar to M. tuberculosis. There is a lepromin, similar in composition to the Old Tuberculin. The formation of liposomes-lepromin is suitable as a means of immunization against leprosy, a disease for which there is, to date, no effective vaccine,
La technique de l'invention trouve également son application comme procédé de . 4q vaccination pour les affections résultant des parasites intracellulaires repris 10 I. Mycoses 1. Cryptococcus neoformans : " Cryptococcose - germe opportuniste - porte d'entrée pulmonaire chez'l'immunodéprimé avec généralisation dans 90 % des cas-méningite grave 05 2, Candida albicans (essentiellement) ; Candidose - germe surtout opportuniste : patients diabétiques, traités aux corticoïdes, par des antibiotiques à large spectre - atteinte d'abord cutanée ou muqueuse (peau, bouche, oesophage, vagin, trac- 10 tus respiratoire); dissémination possible au niveau systémique (localisations préférentielles : reins, yeux, méninges, peau et myocarde) 3. Histoplasma capsulatum : Histoplasmose (USA) - atteinte pulmonaire avec signes généraux importants 15 - dissémination systémique possible 4, Coccidioïdes immitis : Coccidioidomycose - atteinte pulmonaire (kyste - abcès...) II. Bactéries 2o b. Salmonella ; Salmonellose - gastroentérite, atteintes secondaires ; ostéomyélite, anévrysme 6. Listeria monocytogenes : Listériose - septicémie - méningite, affection grave chez les immunodéprimés 25 7. Brucella (suis, melitensis, abortus) ; Brucellose - maladie granulomateuse chronique généralisée (rate, os...) 8. Francisella tularensis ; Tularémie 3q - porte d'entrée cutanée ou pulmonaire, abcédation locale, adénopathies régionales III. Chlamydiae 9. Chlamydiae (Bedsoniae) Psittacose - Pneumonie (rarement hépatite , encéphalite) 35 IV.Rickettsiae 10. Rickettsiae ( prowazekii.,.) Rickettsiose - température, céphalées, rashThe technique of the invention also finds its application as a method of. 4q vaccination for conditions resulting from the intracellular parasites taken up 10 I. Mycoses 1. Cryptococcus neoformans: "Cryptococcosis - opportunistic germ - pulmonary entry point in the immunocompromised with generalization in 90% of severe meningitis 05 2, Candida albicans (mainly); Candidiasis - mainly opportunistic germ: diabetic patients, treated with corticosteroids, with broad spectrum antibiotics - first cutaneous or mucosal involvement (skin, mouth, esophagus, vagina, respiratory tract); possible spread to systemic level (preferred locations: kidneys, eyes, meninges, skin and myocardium) 3. Histoplasma capsulatum: Histoplasmosis (USA) - pulmonary involvement with important general signs 15 - possible systemic dissemination 4, Coccidioides immitis: Coccidioidomycosis - pulmonary involvement (cyst - abscess ...) II Bacteria 2o b Salmonella; Salmonellosis - gastroenteritis, secondary involvement; osteomyelitis, aneurysm 6. List ia monocytogenes: Listeriosis - sepsis - meningitis, serious condition in immunocompromised 25 7. Brucella (suis, melitensis, abortus); Brucellosis - generalized chronic granulomatous disease (spleen, bone, etc.) 8. Francisella tularensis; Tularemia 3q - cutaneous or pulmonary entry point, local abscess, regional lymphadenopathy III. Chlamydiae 9. Chlamydiae (Bedsoniae) Psittacosis - Pneumonia (rarely hepatitis, encephalitis) 35 IV.Rickettsiae 10. Rickettsiae (prowazekii..) Rickettsiosis - temperature, headache, rash
11. Coxiella burnetii Fièvre Q11. Coxiella burnetii Fever Q
40 -température, fièvre, pneumonie, hépatite V. Mycobacterioses 12. Mycobacteria : - tuberculosis, bovis : tuberculose • » π40 -temperature, fever, pneumonia, hepatitis V. Mycobacterioses 12. Mycobacteria: - tuberculosis, bovis: tuberculosis • »π
Dans tous les cas, il convient de noter que le même liposome sensibilisé par les antigènes d'un parasite donné peut servir tant à la vaccination qu'à la détection d'Ig (lytiques ou non lytiques) dans le sérum humain,In all cases, it should be noted that the same liposome sensitized by the antigens of a given parasite can be used both for vaccination and for detection of Ig (lytic or non-lytic) in human serum,
05 1_>_ Vaccin et diagnostic pour le SIDA05 1 _> _ Vaccine and diagnosis for AIDS
L'encapsulation d'un extrait de virus de SIDA (HTLV3) peut se faire au moyen d'octylglucoside. Le mode de préparation ci-après est donné à simple titre d'exemple non limitatif.The encapsulation of an AIDS virus extract (HTLV3) can be done using octylglucoside. The method of preparation below is given by way of non-limiting example.
10 La préparation des liposomes est effectuée ici en deux temps : a) préparation de liposomes monolamellaires par la méthode d ' in j ection b) fixation dans la bicouche liposomiale de l'extrait 15 d'HTLV3 par ses molécules à composante hydrophobe après formation d'un complexe glycoprotéine - détergent et "fluidification" des liposomes.The preparation of the liposomes is carried out here in two stages: a) preparation of monolamellar liposomes by the injection method b) fixation in the liposomal bilayer of the extract of HTLV3 by its molecules with hydrophobic component after formation of 'a glycoprotein - detergent complex and "thinning" of liposomes.
a) Préparation des liposomes 'Les lipides sont solubilisés dans 1'pctylglucoside 20 (octyl-ß-D-glucopyranoside) à 20°C, dans un tampon tris-HCl pH=7,2 contenant 100 mM d'octylglucoside afin d'obtenir les concentrations suivantes ; 1,5 μM/ml Chol.a) Preparation of the liposomes The lipids are dissolved in pctylglucoside 20 (octyl-ß-D-glucopyranoside) at 20 ° C. in a tris-HCl buffer pH = 7.2 containing 100 mM octylglucoside in order to obtain the following concentrations; 1.5 μM / ml Chol.
21 μM/ml Egg Pc.21 μM / ml Egg Pc.
25 On mélange ensuite 0,375 μM de cholestérol et 3 m d'Egg Pc. Le tout est ensuite injecté doucement dans 3 ml de tampon phosphate (TP) pH=7,4 (NaCl=0,137 M, KC1=8,7 mM, KH2P04=1,47 mM, Na2HP04=8,l mM) refroidi à 4°C, puis dialysé con-30 tre le même tampon (TP). Les liposomes sont ensui te séparés des liquides planaires par filtration sur une colonne Sephadex-G75 préalablement équilibrée avec le tampon (TP).25 0.375 μM of cholesterol and 3 m of Egg Pc are then mixed. The whole is then gently injected into 3 ml of phosphate buffer (TP) pH = 7.4 (NaCl = 0.137 M, KC1 = 8.7 mM, KH2P04 = 1.47 mM, Na2HP04 = 8.1 l mM) cooled to 4 ° C, then dialyzed against the same buffer (TP). The liposomes are then separated from the planar liquids by filtration on a Sephadex-G75 column previously equilibrated with the buffer (TP).
b) Fixation de l'extrait d'HTLV34 sur les liposomes 35 L'HTLV3 a été extrait par 1'octylglucoside (con centration finale 7,5 mM). Les liposomes sont fluidifiés par 1'octylglucoside 1 mM. Les deux solutions sont ensuite mélangées dans des proportions de 500 μg d'extrait de HTLV3//rM de lipides.b) Fixation of the extract of HTLV34 on the liposomes The HTLV3 was extracted with octylglucoside (final concentration 7.5 mM). The liposomes are thinned with 1 mM octylglucoside. The two solutions are then mixed in proportions of 500 μg of HTLV3 // rM lipid extract.
40 Cela signifie que 0,375 μΜ de lipides sont ajoutés à 137 μ g d'extrait d'HTLVS.40 This means that 0.375 μΜ of lipids are added to 137 μ g of HTLVS extract.
» fr 12»En 12
Le complexe extrait-détergent et les liposomes fluidifiés sont dialysés, d'abord contre un gradient de concentration décroissante en octylgluco-side (de 7,5 à 0 mM) pour former des liposomes 05 porteurs de molécules d'HTLV3, puis contre le tam pon (TP) contenant 1 mM de NaN3·The extract-detergent complex and the fluidized liposomes are dialyzed, first against a decreasing octylglucoside concentration gradient (from 7.5 to 0 mM) to form liposomes 05 carrying HTLV3 molecules, then against the tam pon (TP) containing 1 mM NaN3 ·
Les liposomes ainsi obtenus, sensibilisés à des molécules extraites du virus du SIDA, ont été injectés I.v. à des souris. Après 3 injections de 1Q cette préparation, effectuées à 3 semaines d'in tervalle, la présence d'anticorps anti-HTLV3 a été mise en évidence dans leur sérum.The liposomes thus obtained, sensitized to molecules extracted from the AIDS virus, were injected I.v. to mice. After 3 injections of 1Q this preparation, carried out 3 weeks prior, the presence of anti-HTLV3 antibodies has been demonstrated in their serum.
On peut en conclure que cette technique constitue un moyen de vaccination anti-SIDA et de diagnostic 15 'de cette maladie, tout comme dans le cas de la tu berculose ,We can conclude that this technique is a means of AIDS vaccination and 15 'diagnosis of this disease, as in the case of tu berculose,
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1988
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